KR20210025460A - Extracelluar matrix derived from animal adipose and preservative solution of extracelluar matrix derived from animal adipose - Google Patents

Extracelluar matrix derived from animal adipose and preservative solution of extracelluar matrix derived from animal adipose Download PDF

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Abstract

The present invention relates to an animal fat-derived extracellular matrix comprising: decellularized cells; and certain growth factors decellularized, thereby controlling the physiological activity of cells.

Description

동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액{Extracelluar matrix derived from animal adipose and preservative solution of extracelluar matrix derived from animal adipose}Extracelluar matrix derived from animal adipose and preservative solution of extracelluar matrix derived from animal adipose}

본 발명은 동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액 에 관한 것으로 보다 상세하게는 매우 우수한 생체 적합성과 생리적 기능을 가지는 동물지방 유래 세포외기질에 관한 것이다. The present invention relates to an animal fat-derived extracellular matrix and an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution, and more particularly, to an animal fat-derived extracellular matrix having very excellent biocompatibility and physiological functions.

세포외기질(Extracelluar matrix)은 주로 동물의 구조적 지지 등을 담당하는 조직으로, 단순한 세포 간 연결체로서 구조적인 역할과 함께 세포의 분열과 분화 그리고 사멸과 같은 세포생리 조절인자로 매우 중요한 역할을 수행할 수 있다. The extracelluar matrix is a tissue that is mainly responsible for structural support of animals, and plays a very important role as a structural role as a simple intercellular linker and as a regulatory factor for cell physiology such as division, differentiation, and death of cells. can do.

세포외기질은 결합조직섬유와 무형질의 성분, 세포외액으로 이루어진다.The extracellular matrix consists of connective tissue fibers, intangible components, and extracellular fluid.

결합조직섬유는 3중 나선구조로 형성되며, 콜라겐과 엘라스틴이 주성분으로 세포외기질에 강도와 탄성을 제공한다. Connective tissue fibers are formed in a triple helix structure, and collagen and elastin are the main components, providing strength and elasticity to the extracellular matrix.

무형질 성분은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans; GAGs)과 단백질(core protein)이 결합한 프로테오글리칸(proteoglycan)이 주 성분으로 음의 전하 때문에 다량의 물과 결합하여 세포외기질에 겔을 형성한다. The intangible component is a proteoglycan, in which glycosaminoglycans (GAGs) and a core protein are bound, as the main component, and because of the negative charge, it combines with a large amount of water to form a gel in the extracellular matrix.

이러한 결합조직섬유와 무형질의 성분은 세포외기질의 완충작용을 돕는다. These connective tissue fibers and intangible components help buffer the extracellular matrix.

세포외액은 이온과 지방, 글루코즈, 아미노산 등이 있어서 세포들이 생존하고 특정기능을 수행하게 하는데 프로타제(protease), 성장인자(growth factor) 등의 생리인자가 존재한다. The extracellular fluid contains ions, fat, glucose, and amino acids, so that cells survive and perform specific functions, and physiological factors such as protease and growth factors exist.

성장인자는 각종 세포 분열이나 생장 분화를 촉진하는 폴리펩티드의 총칭이다. Growth factor is a generic term for a polypeptide that promotes various cell division or growth differentiation.

여러 종류가 발견되었으며, 기능도 다양하고, 세포의 신호전달계에 관여하는 것으로 알려져 있다. Several types have been discovered, functions are diverse, and they are known to be involved in the signaling system of cells.

생물체의 기본적 구성성분이 되는 영양물질 이외에 세포의 증식, 생물체의 증식 및 발육에 필요한 물질로서 세포가 성장하고 분화하는데 필수적 요소이다. In addition to nutrients that are the basic constituents of an organism, it is a material necessary for cell proliferation, proliferation and development of organisms, and is an essential element for cell growth and differentiation.

이를 저장하고 적절하게 공급해 주고 세포가 인식할 수 있는 물리적 환경을 제공할 수 있으면 세포의 생존, 성장, 이동 및 분화 등을 매우 촉진시킬 수 있다. If it can be stored and properly supplied and provided with a physical environment that can be recognized by cells, the survival, growth, migration, and differentiation of cells can be greatly promoted.

이러한 세포외기질의 특성을 이용하여 최근에는 세포외기질로부터 유래한 생물지지체 재료가 조직공학과 재생의학에서 널리 이용되고 있다. In recent years, using the characteristics of the extracellular matrix, biological support materials derived from the extracellular matrix have been widely used in tissue engineering and regenerative medicine.

특히 세포외기질을 이용한 조직수복제, 드레싱 밴드 등 다양한 생체소재들이 소개되고 있으나, 현재 상용화된 제품은 세포외기질의 일부 구성 성분만을 이용하고 있다.In particular, various biomaterials such as tissue repair agents and dressing bands using extracellular matrix have been introduced, but currently commercialized products use only some components of the extracellular matrix.

세포외기질을 추출하기 위하여 다양한 화학적 생물학적 방법이 개발되었으나, 동물 지방조직을 통한 추출과정에서 세포의 생리활성에 가장 중요한 성장인자(growth factor)를 손실하지 않고 그대로 함유하는 세포외기질은 아직 공개된 바가 없다. Various chemical and biological methods have been developed to extract the extracellular matrix, but the extracellular matrix containing the growth factor, which is the most important for the physiological activity of the cell in the process of extraction through animal adipose tissue, has not been disclosed. There is no bar.

이와 관련된 선행문헌으로는 대한민국 특허 제 10-1772316호 (공고일: 2017.08.29.)에 개시된 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물이 있다. Prior literature related to this includes a method for preparing a biocompatible porcine cartilage-derived extracellular matrix membrane with adjustable in vivo degradation rate and physical properties disclosed in Korean Patent No. 10-1772316 (announcement date: Aug. 29, 2017), and the extracellular matrix derived from porcine cartilage. There is an anti-adhesion composition containing as an active ingredient.

대한민국 등록특허공보 제10-1772316호(2017.08.29. 공고)Korean Registered Patent Publication No. 10-1772316 (announced on August 29, 2017)

따라서, 본 발명은 동물지방으로부터 세포외기질을 효과적으로 추출하되 탈세포 및 탈지시켜 생체안전성 및 생체적합성을 증가시키고, 세포의 생리활성을 조절할 수 있는 성장인자를 다량으로 함유하는 세포외기질 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다. Accordingly, the present invention effectively extracts the extracellular matrix from animal fat, but increases biosafety and biocompatibility by decellularizing and degreasing, and containing a large amount of growth factors capable of regulating the physiological activity of cells, and preparation thereof. It is in providing a way.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The problem to be solved by the present invention is not limited to the problem(s) mentioned above, and another problem(s) not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 탈세포 및 탈지되고, 일정 성장인자를 함유하는 동물지방 유래 세포외기질을 제공한다.In order to solve the above problems, according to an aspect of the present invention, the present invention provides an animal fat-derived extracellular matrix containing decellularized and degreased, and certain growth factors.

또한 상기 탈세포 및 탈지와 성장인자의 함유는 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 수행될 수 있다. In addition, the decellularization and degreasing and the inclusion of growth factors may be performed through solvent extraction using a supercritical fluid.

또한 상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 상기 동물지방에 잔류된 지질을 제거하고, 멸균시켜 생체적합성을 증가시킬 수 있다. In addition, solvent extraction using the supercritical fluid may increase biocompatibility by removing and sterilizing lipids remaining in the animal fat.

또한 상기 동물지방은 지방흡입술을 통하여 추출된 폐지방조직일 수 있다. In addition, the animal fat may be lung adipose tissue extracted through liposuction.

또한 상기 성장인자는 AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 및 VEGF-D로 이루어질 수 있다. In addition, the growth factors are AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 and VEGF-D.

또한 상기 성장인자는 세포외기질 1 g 당 0.52 내지 11.19 ng으로 함유될 수 있다.In addition, the growth factor may be contained in 0.52 to 11.19 ng per 1 g of the extracellular matrix.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 탈세포 및 탈지되고, 일정 성장인자를 함유하는 동물지방 유래 세포외기질 0.1 내지 5 중량부; 및 분산액95 내지 99.9 중량부로 포함하고, 여과된 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질 보존액을 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention is decellularized and degreased through solvent extraction using a supercritical fluid, 0.1 to 5 parts by weight of an animal fat-derived extracellular matrix containing a certain growth factor; And it contains 95 to 99.9 parts by weight of the dispersion, it provides an animal fat-derived extracellular matrix preservation liquid, characterized in that the filtered.

또한 상기 성장인자는 AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 및 VEGF-D로 이루어지며, 여과되어 세포외기질 1g 당 0.21 내지 6.86 ng으로 함유될 수 있다. In addition, the growth factors are AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, Consisting of PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 and VEGF-D, filtered and per 1g of extracellular matrix It may contain 0.21 to 6.86 ng.

또한 상기 성장인자는 상기 여과를 통하여 bFGF(Basic fibroblast growth factor) 함량이 40 내지 50 % 범위로 감소될 수 있다. In addition, the growth factor may have a basic fibroblast growth factor (bFGF) content in the range of 40 to 50% through the filtration.

본 발명에 따르면, 탈지 및 탈세포화 되어 생체적합성이 매우 증가되고, 성장인자가 함유되어 세포의 생리활성을 조절할 수 있는 세포외기질 및 이의 제조방법을 제공한다. According to the present invention, biocompatibility is greatly increased by degreasing and decellularization, and an extracellular matrix capable of controlling the physiological activity of cells by containing growth factors and a method for producing the same is provided.

또한 초임계유체를 이용한 용매추출과정으로 세포외기질을 효과적으로 수득할 수 있다. In addition, the extracellular matrix can be effectively obtained through a solvent extraction process using a supercritical fluid.

또한 산, 효소처리 및 방사선 처리하지 않아도 멸균되어 세포외기질의 생체안전성을 증가시킬 수 있으며, 탈세포 및 탈지되어 생체적합성을 증가시킬 수 있다. In addition, it is sterilized without acid, enzyme treatment, and radiation treatment, so that the biosafety of the extracellular matrix can be increased, and biocompatibility can be increased by decellularization and degreasing.

또한 세포외기질의 성분 중 성장인자가 보존된 세포외기질을 제공하며, 성장인자의 함량을 조절하여 세포 생리활성의 조절을 기대할 수 있으며, 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있다.In addition, it provides an extracellular matrix in which growth factors are preserved among the components of the extracellular matrix, and it is possible to expect the regulation of cell physiological activity by adjusting the content of growth factors, and it is possible to quickly induce tissue regeneration.

또한 세포외기질의 구조적 특성을 그대로 유지할 수 있어서, 이식 부위의 형태에 따라 성형이 가능한 조직 구조 모사체를 쉽게 제조할 수 있다. In addition, since the structural characteristics of the extracellular matrix can be maintained as it is, a tissue structure mimetic that can be molded according to the shape of the implantation site can be easily manufactured.

또한 인체유래 폐지방을 효과적으로 처리하여 세포외기질을 효과적으로 추출하여 제공할 수 있다. In addition, it is possible to effectively extract and provide extracellular matrix by effectively treating human waste fat.

또한 세포외기질을 함유하는 보존액은 오염을 방지하여 장시간 보존이 가능하며, 취급성이 증가되어 세포외기질의 활용성을 매우 증가시킬 수 있다. In addition, the preservation solution containing the extracellular matrix prevents contamination and can be stored for a long time, and the handling property is increased, so that the utility of the extracellular matrix can be greatly increased.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.The effects of the present invention are not limited to the above effects, and should be understood to include all effects that can be inferred from the configuration of the invention described in the detailed description or claims of the present invention.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 제조방법의 공정흐름도이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 공정흐름도이다.
도 3 은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 단백질 정량분석에 따른 전기영동 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 DNA잔존량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 헤마톡실린 및 에오진 염색사진이다
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 주사전자현미경 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외기질 시료, 1 wt% 분산액 및 여과되어 제조된 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 VEGF 기준 효소 결합 면역 흡착 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질이 분산된 분산액 내의 VEGF 함량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질이 분산된 분산액의 여과 전후의 DNA함량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 여과 전후의 싸이토카인 항체 어레이 결과에 따른 이미지이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 여과 전후의 성장인자 종류 및 선명도(intensity)를 나타낸 것이다.
도 13 은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 여과 전후의 성장인자 종류 및 함량(ng/g)을 나타낸 것이다. 1 is a process flow diagram of a method for producing an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
2 is a process flow diagram of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to another embodiment of the present invention.
3 is an electrophoresis photograph according to the quantitative analysis of protein in an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
4 is a graph showing the amount of DNA remaining in the extracellular matrix derived from animal fat according to an embodiment of the present invention.
5 is a photograph of hematoxylin and eosin staining of an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
6 is a scanning electron micrograph of an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
7 is a photograph of an extracellular matrix sample, a 1 wt% dispersion, and an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution prepared by filtration according to an embodiment of the present invention.
8 is a graph showing the result of an enzyme-linked immunosorbent assay based on VEGF of an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
9 is a graph showing the content of VEGF in a dispersion in which an animal fat-derived extracellular matrix is dispersed according to an embodiment.
10 is a graph showing DNA content before and after filtration of a dispersion in which an animal fat-derived extracellular matrix is dispersed according to an embodiment of the present invention.
11 is an image according to the results of the cytokine antibody array before and after filtration of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to an embodiment of the present invention.
12 shows the types and intensity of growth factors before and after filtration of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to an embodiment of the present invention.
13 shows the types and contents (ng/g) of growth factors before and after filtration of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to an embodiment of the present invention.

이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부된 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.Advantages and features of the present invention, and a method of achieving the same will become apparent with reference to the embodiments described below in detail together with the accompanying drawings.

그러나 본 발명은 이하에 개시되는 실시예들에 의해 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.However, the present invention is not limited by the embodiments disclosed below, but will be implemented in a variety of different forms, only these embodiments are intended to complete the disclosure of the present invention, and common knowledge in the technical field to which the present invention pertains. It is provided to completely inform the scope of the invention to those who have, and the invention is only defined by the scope of the claims.

또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지 기술 등이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그에 관한 자세한 설명은 생략하기로 한다.In addition, in describing the present invention, when it is determined that related known technologies or the like may obscure the subject matter of the present invention, a detailed description thereof will be omitted.

본 발명의 발명자들은 종래 동물지방에서 세포외기질(extracellular matrix; ECM) 을 추출하는 방법들이 주로 화학적 처리 및 생물학적 처리와 함께 방사선 조사를 통하여 세포외기질을 추출하고 처리하여 생체안전성, 생체적합성 기계적 성질 등의 물성을 증가시키고 있으나, 세포외기질이 함유하는 성장인자는 화학적 처리, 생물학적 처리 및 방사선처리에 따라 쉽게 파괴될 수 있는 문제가 있으며, 해당 공정은 다량의 산과 효소를 사용하고, 방사선을 사용하여 공정 제어의 위험성이 크고 효율이 매우 감소되어 세포외기질을 효과적으로 수득하기에 적합하지 않는 것을 확인하였다. The inventors of the present invention believe that conventional methods for extracting an extracellular matrix (ECM) from animal fat are mainly chemical treatment and biological treatment, as well as extracting and processing the extracellular matrix through radiation irradiation, thereby providing biosafety, biocompatible mechanical properties. However, the growth factor contained in the extracellular matrix has a problem that can be easily destroyed by chemical treatment, biological treatment, and radiation treatment, and the process uses a large amount of acids and enzymes, and radiation is used. Thus, it was confirmed that the risk of process control was large and the efficiency was greatly reduced, and thus it was not suitable for effectively obtaining an extracellular matrix.

한편 초임계유체를 이용한 용매추출은 초임계상태의 용매를 통하여 추출대상의 물리적 변화 없이 효과적으로 추출하여 추출대상의 기계적 성질(mechanical performance properties)을 유지할 수 있으며, 특히 동물지방에 대하여 일정 조건으로 초임계유체 용매추출을 적용하는 경우 탈세포 및 탈지되어 생체안정성 및 생체적합성이 매우 증가되고, 세포외기질의 특유 성분인 성장인자(growth factor)의 함량이 조절되어 세포 생리활성의 조절이 가능한 세포외기질을 효과적으로 수득할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다. On the other hand, solvent extraction using a supercritical fluid can be effectively extracted through a solvent in a supercritical state without physical change of the object to be extracted, thereby maintaining the mechanical performance properties of the object to be extracted. In particular, it is possible to maintain the mechanical performance properties of the object to be extracted under certain conditions. When fluid solvent extraction is applied, biostability and biocompatibility are greatly increased due to decellularization and degreasing, and the content of growth factor, which is a unique component of the extracellular matrix, is adjusted to create an extracellular matrix capable of controlling cell physiological activity. The present invention was completed by confirming that it can be obtained effectively.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에 따른 동물지방 유래 세포외기질은 탈세포 및 탈지되고, 일정 성장인자를 함유한다. The animal fat-derived extracellular matrix according to the present invention is decellularized and degreased, and contains certain growth factors.

상기 동물지방은 돼지 지방일 수 있으나, 지방흡입술을 통하여 추출된 폐지방인 것이 바람직하다.The animal fat may be pork fat, but it is preferable that it is lung fat extracted through liposuction.

최근 미용성형을 위한 지방흡입술이 다수 시행되고 있어서 다량의 인체 유래 지방을 획득할 수 있으나, 이러한 지방흡입술에서 줄기세포 및 세포외기질의 유용 물질을 추출하는 경우에는 혈액, 지질 등 불필요한 성분이 함유되어 있어 추출된 인체 지방은 활용이 어렵기 때문에 초임계유체를 이용한 용매추출과정으로 탈세포 및 탈지하여 생체안정성 및 생체적합성을 증가시키는 경우에는 안전하고 효과적으로 인체 이식이 가능하다. Recently, a lot of liposuction for cosmetic plastic surgery has been performed, so it is possible to obtain a large amount of human-derived fat.However, in the case of extracting useful substances of stem cells and extracellular matrix in such liposuction, unnecessary components such as blood and lipids are contained. Since extracted human fat is difficult to utilize, it is possible to safely and effectively transplant the human body when decellularizing and degreasing through a solvent extraction process using a supercritical fluid to increase biostability and biocompatibility.

상기 동물지방은 조직 내에 세포외기질을 포함하는 것이면 제한되지 않는다. The animal fat is not limited as long as it contains extracellular matrix in the tissue.

상기 탈세포 및 탈지는 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 수행될 수 있다. The decellularization and degreasing may be performed through solvent extraction using a supercritical fluid.

상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 초임계유체 용매 제조 시 압력, 추출대상인 동물지방 조직에 도입하는 유량, 반응 공정 온도 및 시간이 조절되어 상기 동물지방 조직을 탈세포 및 탈지할 수 있다. The solvent extraction using the supercritical fluid can decellularize and degrease the animal adipose tissue by controlling the pressure, the flow rate introduced into the animal fat tissue to be extracted, the reaction process temperature and time during the production of the supercritical fluid solvent.

상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 상기 동물지방에 잔류된 혈액을 제거하고, 멸균시켜 생체적합성을 증가시킬 수 있다. Solvent extraction using the supercritical fluid may increase biocompatibility by removing and sterilizing blood remaining in the animal fat.

상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 에탄올을 공용매로 첨가하여 동물지방에 대한 초임계유체의 용해도를 증가시키는 한편 동물지방에 잔류하는 혈액 및 오염물질을 효과적으로 제거하고 멸균할 수 있다. Solvent extraction using the supercritical fluid increases the solubility of the supercritical fluid in animal fat by adding ethanol as a co-solvent, while effectively removing and sterilizing blood and contaminants remaining in animal fat.

상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 동물지방에서 세포외기질을 추출하며, 상기 세포외기질에서 일정 성장인자가 함유되도록 할 수 있다. Solvent extraction using the supercritical fluid extracts the extracellular matrix from animal fat, and may contain a certain growth factor in the extracellular matrix.

상기 세포외기질이 성장인자를 함유하는 경우에는 세포 생리활성의 조절이 가능하며, 조직수복재 등의 형태로 인체 조직에 투입되는 경우 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있다.When the extracellular matrix contains growth factors, it is possible to control the physiological activity of cells, and when injected into human tissues in the form of tissue repair materials, it is possible to induce tissue regeneration quickly.

상기 성장인자는 앰피레귤린(AR, amphiregulin), 염기성 섬유모세포성장인자(b-FGF, basic fibroblast growth factor), 베타-신경성장인자(b-NGF, beta nerve growth factor), 상피세포성장인자(EGF, epidermal growth factor), 상피세포성장인자수용기(EGFR, epidermal growth factor receptor), 섬유모세포성장인자-6(FGF-6, fibroblast growth factor-6), 섬유모세포성장인자-7(FGF-7, fibroblast growth factor-7), 과립구집락자극인자(G-CSF, granulocyte colony-stimulating factor), 신경 아교세포계 신경영양인자(GDNF, glial cell line-derived neurotrophic factor), 과립구 포식세포 집락자극인자(GM-CSF, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), 헤파린결합성 EGF유사성장인자(HB-EGF, heparin-binding EGF-like growth factor), 간세포성장인자(HGF, hepatocyte growth factor), 인슐린유사 성장인자 결합단백질-1(IGFBP-1, insulin-like growth factor binding protein-1), 인슐린유사 성장인자 결합단백질-2(IGFBP-2, insulin-like growth factor binding protein-2), 인슐린유사 성장인자 결합단백질-3(IGFBP-3, insulin-like growth factor binding protein-3), 인슐린유사 성장인자 결합단백질-4(IGFBP-4, insulin-like growth factor binding protein-4), 인슐린유사 성장인자 결합단백질-6(IGFBP-6, insulin-like growth factor binding protein-6), 인슐린유사 성장인자-1(IGF-I, insulin-like growth factor 1), 인슐린유사 성장인자 인슐린수용기(IGF-ISR, insulin-like growth factor-insulin receptor), 인슐린유사 성장인자-2(IGF-II, insulin-like growth factor 2), 대식세포집락자극인자(M-CSF, macrophage colony-stimulating factor), 대식세포집락자극인자 수용기(M-CSFR, macrophage colony-stimulating factor receptor), 뉴로트로핀-3(NT-3, neurotrophin-3), 뉴로트로핀-4(NT-4, neurotrophin-4), 혈소판유래 성장인자수용체-A(PDGFR A, platelet-derived growth factor receptor A), 혈소판유래 성장인자수용체-B(PDGFRb, platelet-derived growth factor receptor B), 혈소판유래 성장인자-AA(PDGFAA, platelet-derived growth factor-AA), 혈소판유래 성장인자-AB(PDGF-AB, platelet-derived growth factor-AB), 혈소판유래 성장인자-BB(PDGF-BB, platelet-derived growth factor-BB), 태반성장인자(PIGF, placental growth factor), 줄기세포성장인자(SCF, stem cell factor), 줄기세포성장인자 수용체(SCFR, stem cell factor receptor), 전환성장인자 알파(TGF-a, transforming growth factor alpha), 전환성장인자 베타1(TGF-b, transforming growth factor beta 1), 전환성장인자 베타2(TGF-b2, transforming growth factor beta 2), 전환성장인자 베타3(TGF-b3, transforming growth factor beta 3), 혈관내피성장인자(VEGF, vascular endothelial growth factor), 혈관내피성장인자 수용체-2(VEGFR2, VEGF receptor-2), 혈관내피성장인자 수용체-3(VEGFR3, VEGF receptor-3) 및 혈관내피성장인자 D(VEGF-D, vascular endothelial growth factor D)로 이루어진다.The growth factors include amphiregulin (AR), basic fibroblast growth factor (b-FGF), beta-nerve growth factor (b-NGF), and epithelial cell growth factor ( EGF, epidermal growth factor), epidermal growth factor receptor (EGFR), fibroblast growth factor-6 (FGF-6), fibroblast growth factor-6, FGF-7, fibroblast growth factor-7), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), granulocyte phagocytic colony-stimulating factor (GM-CSF) , granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF, heparin-binding EGF-like growth factor), hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor-binding protein- 1 (IGFBP-1, insulin-like growth factor binding protein-1), insulin-like growth factor binding protein-2 (IGFBP-2, insulin-like growth factor binding protein-2), insulin-like growth factor binding protein-3 ( IGFBP-3, insulin-like growth factor binding protein-3), insulin-like growth factor binding protein-4 (IGFBP-4), insulin-like growth factor binding protein-6 (IGFBP- 6, insulin-like growth factor binding protein-6) , Insulin-like growth factor 1 (IGF-I), insulin-like growth factor insulin receptor (IGF-ISR), insulin-like growth factor-2 (IGF- II, insulin-like growth factor 2), macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), macrophage colony-stimulating factor receptor (M-CSFR), neurotrophin- 3 (NT-3, neurotrophin-3), neurotrophin-4 (NT-4, neurotrophin-4), platelet-derived growth factor receptor-A (PDGFR A, platelet-derived growth factor receptor A), platelet-derived growth factor Receptor-B (PDGFRb, platelet-derived growth factor receptor B), platelet-derived growth factor-AA (PDGFAA, platelet-derived growth factor-AA), platelet-derived growth factor-AB (PDGF-AB, platelet-derived growth factor- AB), platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB, platelet-derived growth factor-BB), placental growth factor (PIGF), stem cell factor (SCF), stem cell growth factor Receptor (SCFR, stem cell factor receptor), transforming growth factor alpha (TGF-a), transforming growth factor beta 1 (TGF-b), transforming growth factor beta 1 (TGF-) b2, transforming growth factor beta 2), transforming growth factor beta 3 (TGF-b3, transforming growth factor beta 2) factor beta 3), vascular endothelial growth factor (VEGF), vascular endothelial growth factor-2 (VEGFR2, VEGF receptor-2), vascular endothelial growth factor-3 (VEGFR3, VEGF receptor-3), and It consists of vascular endothelial growth factor D (VEGF-D).

상기 세포외기질은 초임계유체를 이용한 용매추출 과정을 통하여 인체 성장인자(human growth factor) 중 FGF-4(fibroblast Growth Factor-4)를 제외한 40가지의 성장인자를 함유한다. The extracellular matrix contains 40 kinds of growth factors excluding fibroblast growth factor-4 (FGF-4) among human growth factors through a solvent extraction process using a supercritical fluid.

상기 FGF-4는 동물지방을 초임계유체를 이용한 용매추출에 따라 탈세포 및 탈지하는 과정에서 제거되며, 본 발명의 실시예에 따른 세포외기질은 상기 FGF-4성장인자가 배제된 것을 특징으로 한다. The FGF-4 is removed in the process of decellularizing and degreasing animal fat by solvent extraction using a supercritical fluid, and the extracellular matrix according to an embodiment of the present invention is characterized in that the FGF-4 growth factor is excluded. do.

상기 성장인자는 세포외기질 1 g 당 0.52 내지 11.19 ng으로 함유될 수 있다. The growth factor may be contained in an amount of 0.52 to 11.19 ng per 1 g of the extracellular matrix.

상기 초임계유체를 이용한 용매추출 과정을 통하여 수득한 세포외기질은 탈세포 및 탈지하여도 일정 함량 이상의 성장인자를 함유하여 생체적합성이 매우 증가될 뿐만 아니라, 세포의 생리활성을 조절하고, 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있다. The extracellular matrix obtained through the solvent extraction process using the supercritical fluid contains a certain amount or more of growth factor even after decellularization and degreasing, so that biocompatibility is greatly increased, as well as regulating the physiological activity of cells, and It can induce regeneration quickly.

상기 동물지방을 상기 초임계유체를 이용한 용매추출 과정이 아닌 산, 효소 처리 및 방사선 처리를 통하여 회수하는 경우 상기 40 종의 성장인자를 모두 회수하기 어려우며, 특히 효소처리 방법은 펩타이드인 성장인자를 쉽게 분해하여 상기 범위 내의 유효 함량을 가지는 세포외기질을 수득할 수 없다. When the animal fat is recovered through acid, enzyme treatment, and radiation treatment rather than solvent extraction using the supercritical fluid, it is difficult to recover all of the 40 kinds of growth factors. By decomposition, an extracellular matrix having an effective content within the above range cannot be obtained.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 탈세포 및 탈지되고, 일정 성장인자를 함유하는 동물지방 유래 세포외기질 0.1 내지 5중량부; 및 분산액 95내지 99.9 중량부로 포함하고, 여과된 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질 보존액을 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention is decellularized and degreased through solvent extraction using a supercritical fluid, 0.1 to 5 parts by weight of an animal fat-derived extracellular matrix containing a certain growth factor; And it provides an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution comprising 95 to 99.9 parts by weight of the dispersion, and filtered.

초임계유체를 이용한 용매추출방법으로 회수된 세포외기질은 기계적 특성을 유지할 수 있으나, 고체 상태로 다양한 어플리케이션(applications)을 제조하기에 용이하지 않다. The extracellular matrix recovered by the solvent extraction method using a supercritical fluid can maintain mechanical properties, but it is not easy to manufacture various applications in a solid state.

상기 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 수득한 세포외기질을 분산액에 분산시키고 여과하는 경우 분자량이 높은 단백질 제거에 의한 생체안전성 및 생체적합성이 증가되고, 0.1 내지 5 wt% 이하의 세포외기질을 분산액에 분산시켜 취급성이 증가되고 활용성이 매우 증가된다. When the extracellular matrix obtained through solvent extraction using the supercritical fluid is dispersed in a dispersion and filtered, biosafety and biocompatibility are increased due to the removal of high molecular weight proteins, and an extracellular matrix of 0.1 to 5 wt% or less is obtained. By dispersing in the dispersion, the handling property is increased and the usability is greatly increased.

상기 범위 내로 초임계유체를 이용한 용매추출방법으로 회수된 세포외기질을 함유하는 경우 세포외기질 내의 성장인자의 함량을 변화시키지 않고 장시간 보존이 가능하다. When the extracellular matrix recovered by the solvent extraction method using a supercritical fluid is contained within the above range, it can be stored for a long time without changing the content of the growth factor in the extracellular matrix.

상기 성장인자는 AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 및 VEGF-D로 이루어진다. The growth factors are AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P -3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF -AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 and VEGF-D.

상기 동물지방 유래 세포외기질 보존액은 인체 성장인자(human growth factor) 중 FGF-4(fibroblast Growth Factor-4)를 제외한 40가지의 성장인자를 함유한다.The animal fat-derived extracellular matrix preservation solution contains 40 kinds of growth factors excluding fibroblast growth factor-4 (FGF-4) among human growth factors.

상기 성장인자는 여과되어 세포외기질 1g 당 0.21 내지 6.86 ng으로 함유할 수 있다. The growth factor may be filtered and contained in an amount of 0.21 to 6.86 ng per 1 g of the extracellular matrix.

상기 동물지방 유래 세포외기질 보존액은 여과되어 성장인자의 함량이 조절된다. The animal fat-derived extracellular matrix preservation solution is filtered to adjust the content of growth factors.

상기 여과는 세포외기질 내의 단백질을 제거하여 보존액이 오염되는 것을 방지할 수 있으며, 상기 범위 내로 성장인자를 함유할 수 있다.The filtration may prevent contamination of the preservative by removing proteins in the extracellular matrix, and may contain growth factors within the above range.

상기 동물지방 유래 세포외기질 보존액은 동물지방 유래 세포외기질 함량 대비 상기 범위 내로 성장인자 함량이 감소되나, 세포외기질을 효과적으로 보존할 수 있으며, 활용성을 크게 증가시킨다. The animal fat-derived extracellular matrix preservation solution has a reduced content of growth factors within the above range compared to the animal fat-derived extracellular matrix content, but can effectively preserve the extracellular matrix and greatly increases its utility.

상기 분산액은 탈이온수일 수 있다. The dispersion may be deionized water.

상기 분산액을 탈이온수로 선택하는 경우 세포외기질을 분산시킬 때 오염을 방지하여 보존성을 증가시킬 수 있다. When the dispersion is selected as deionized water, contamination can be prevented when the extracellular matrix is dispersed, thereby increasing preservability.

상기 여과는 0.2내지 0.45 ㎛ 포어 사이즈(pore sizes)의 필터를 사용하여 여과된 것일 수 있다. The filtration may be filtered using a filter having a pore size of 0.2 to 0.45 µm.

상기 범위 내의 필터를 이용하여 세포외기질에 잔류하는 분자량이 높은 단백질을 제거하여 오염 위험성을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 보존액을 멸균할 수 있으며, 잔존하는 DNA를 효과적으로 제거할 수 있다. By using a filter within the above range, the high molecular weight protein remaining in the extracellular matrix can be removed effectively to reduce the risk of contamination, the preservative can be sterilized, and the remaining DNA can be effectively removed.

상기 범위를 벗어나는 경우 보존액 중에 성장인자의 감소되거나, 단백질 외에 세포외기질이 함께 제거될 우려가 있으며, 감염 위험 및 DNA가 잔존하여 생체적합성을 감소시킬 우려가 있다. If it is out of the above range, there is a concern that growth factors may be reduced in the preservation solution, or extracellular matrix other than proteins may be removed together, and there is a risk of infection and DNA remaining, thereby reducing biocompatibility.

상기 성장인자는 상기 여과를 통하여 bFGF(Basic fibroblast growth factor) 함량이 40 내지 50 % 범위로 감소될 수 있다. The growth factor may have a basic fibroblast growth factor (bFGF) content in the range of 40 to 50% through the filtration.

상기 bFGF 는 단백질에 포함되거나 결합되어 있으며, 상기 여과를 통하여 보존액 중에 단백질을 여과하여 제거하는 경우 함께 여과되어 함량이 감소된다. The bFGF is included in or bound to a protein, and when the protein is removed by filtration in the preservation solution through the filtration, the content is reduced by filtering together.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 동물지방 유래 세포외기질 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing an extracellular matrix derived from animal fat.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 제조방법의 공정흐름도이다. 1 is a process flow diagram of a method for producing an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.

도 1을 참조하면, 동물지방 유래 세포외기질 제조방법은, Referring to Figure 1, the method for producing an animal fat-derived extracellular matrix,

(1) 동물지방을 세척하고 분쇄하여 지방조직을 준비하는 단계;(1) washing and grinding animal fat to prepare adipose tissue;

(2) 준비된 상기 지방조직을 원심분리 하여 수분과 지질을 제거하여 전처리 하는 단계;(2) performing pretreatment by centrifuging the prepared adipose tissue to remove moisture and lipids;

(3) 초임계유체를 이용한 용매추출로 전처리된 상기 지방조직을 탈세포 및 탈지하여 세포외기질을 회수하는 단계; 및(3) decellularizing and degreasing the adipose tissue pretreated by solvent extraction using a supercritical fluid to recover extracellular matrix; And

(4) 상기 세포외기질에서 성장인자를 확인하는 단계;를 포함한다. (4) identifying a growth factor in the extracellular matrix; includes.

우선 동물지방을 세척하고 분쇄하여 지방조직을 준비한다(S100).First, the animal fat is washed and pulverized to prepare adipose tissue (S100).

상기 동물지방은 돼지 지방일 수 있으나, 지방흡입술을 통하여 추출된 폐지방인 것이 바람직하다.The animal fat may be pork fat, but it is preferable that it is lung fat extracted through liposuction.

상기 동물지방이 인체에서 유래된 폐지방인 경우에는 세척을 통하여 잔류된 혈액과 같은 오염물질을 제거할 수 있고, 분쇄하는 경우에 이후의 단계에서 원심분리의 효율을 증가시킬 수 있다.When the animal fat is waste fat derived from the human body, contaminants such as residual blood may be removed through washing, and the efficiency of centrifugation may be increased in a subsequent step in the case of pulverization.

준비된 상기 지방조직(adipose tissue)을 원심분리하고 수분과 지질을 제거하여 전처리 한다(S110). The prepared adipose tissue is centrifuged and pretreated by removing moisture and lipids (S110).

상기 원심분리를 통하여 동물지방을 하층의 수분과 상층의 지질로 분리할 수 있으며, 하층의 수분 및 상층의 지질을 제거하여 중층의 고형분을 용매추출 하는 경우 이후의 초임계유체를 이용한 용매추출과정의 효율을 크게 증가시킬 수 있다. Animal fat can be separated into water in the lower layer and lipid in the upper layer through the centrifugation. In the case of solvent extraction of the solid content in the middle layer by removing the water in the lower layer and the lipid in the upper layer, the solvent extraction process using a supercritical fluid The efficiency can be greatly increased.

초임계유체를 이용한 용매추출로 전처리된 지방조직을 탈세포 및 탈지하여 세포외기질을 회수한다(S120). The adipose tissue pretreated by solvent extraction using a supercritical fluid is decellularized and degreased to recover the extracellular matrix (S120).

상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 상기 지방조직을 탈세포 및 탈지하기 위하여 용매추출 조건을 변경할 수 있다.Solvent extraction using the supercritical fluid may change the solvent extraction conditions in order to decellularize and degrease the adipose tissue.

본 발명의 일시예에서 상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 이산화탄소를 200 내지 600 bar로 가압하여 초임계유체로 제조하고, 상기 초임계유체를 18 내지 70 mL/min의 유량으로, 30 내지 35 ℃에서 2 내지 12시간 동안 상기 동물지방에 침투시켜 세포외기질을 추출할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the solvent extraction using the supercritical fluid is prepared as a supercritical fluid by pressurizing carbon dioxide at 200 to 600 bar, and the supercritical fluid at a flow rate of 18 to 70 mL/min, 30 to 35°C The extracellular matrix can be extracted by infiltrating the animal fat for 2 to 12 hours at.

상기 범위로 가압되어 제조된 초임계유체는 지방조직의 세포벽을 침투하여 세포 내 지질을 용해시켜 탈지시킬 수 있으며, 상기 범위 내의 유량으로 지방조직에 침투시키는 경우 세포외기질의 기계적 특성을 유지시키면서, 탈세포 및 탈지시킬 수 있다. The supercritical fluid produced by being pressurized within the above range can penetrate the cell wall of adipose tissue and dissolve the intracellular lipids to degrease, and when penetrating into the adipose tissue at a flow rate within the above range, while maintaining the mechanical properties of the extracellular matrix, Cells and can be degreased.

상기 초임계유체를 이용한 용매추출과정은 지방조직에 잔류된 오염물질이 한 번 더 제거되어 오염방지 및 멸균 효과가 증대된다. In the solvent extraction process using the supercritical fluid, contaminants remaining in the adipose tissue are removed once more, thereby increasing the contamination prevention and sterilization effect.

상기 세포외기질에서 성장인자를 확인한다(S130).Growth factors are identified in the extracellular matrix (S130).

상기 초임계유체를 이용한 용매추출과정으로 탈세포 및 탈지된 세포외기질을 효과적으로 수득할 수 있으며, 세포외기질 중 세포외액에 존재하는 성장인자 또한 다량으로 잔류시킬 수 있다. Decellularized and degreased extracellular matrix can be effectively obtained by the solvent extraction process using the supercritical fluid, and growth factors present in the extracellular fluid among the extracellular matrix can also be retained in a large amount.

상기 성장인자의 확인과정을 통하여 세포의 생리활성을 조절하고, 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있는 성장인자가 다량으로 함유되어 있는 세포외기질을 수득할 수 있다. Through the process of identifying the growth factors, an extracellular matrix containing a large amount of growth factors capable of controlling the physiological activity of cells and rapidly inducing tissue regeneration can be obtained.

상기 성장인자의 확인은 성장인자 중 VEGF, bFGF, IGF-1 및 EGF로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 성장인자의 수준을 효소 결합 면역 흡착 분석(Enzyme-Linked Immunosorbent assay)으로 성장인자의 함량을 확인할 수 있다. Confirmation of the growth factor is the level of any one growth factor selected from the group consisting of VEGF, bFGF, IGF-1 and EGF among the growth factors by enzyme-linked immunosorbent assay to confirm the content of growth factors. I can.

상기 효소 결합 면역 흡착 분석은 VEGF, bFGF, IGF-1 및 EGF로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 성장인자를 기준으로 세포외기질이 함유하는 성장인자의 함량을 확인할 수 있어서 매우 바람직하나, 성장인자의 함량을 확인할 수 있는 방법이면 특별하게 제한되지는 않는다. The enzyme-linked immunosorbent assay is very preferable because it is possible to confirm the content of growth factors contained in the extracellular matrix based on any one growth factor selected from the group consisting of VEGF, bFGF, IGF-1, and EGF. As long as it is a method by which the content can be checked, it is not particularly limited.

한편 본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 동물지방 유래 세포외기질 보존액 제조방법을 제공한다. Meanwhile, according to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for preparing an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution.

도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 공정흐름도이다. 2 is a process flow diagram of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to another embodiment of the present invention.

도 2를 참조하면, 동물지방 유래 세포외기질 보존액 제조방법은Referring to Figure 2, the method for preparing an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution

(a) 동물지방을 세척하고 분쇄하여 지방조직을 준비하는 단계;(a) washing and grinding animal fat to prepare adipose tissue;

(b) 준비된 상기 지방조직을 원심분리 하여 수분과 지질을 제거하여 전처리 하는 단계;(b) performing pretreatment by centrifuging the prepared adipose tissue to remove moisture and lipids;

(c) 초임계유체를 이용한 용매추출로 전처리된 상기 지방조직을 탈세포 및 탈지하여 세포외기질을 회수하는 단계; (c) decellularizing and degreasing the adipose tissue pretreated by solvent extraction using a supercritical fluid to recover extracellular matrix;

(d) 회수된 세포외기질을 탈이온수에 분산시켜 분산액을 제조하는 단계; (d) dispersing the recovered extracellular matrix in deionized water to prepare a dispersion;

(e) 상기 분산액을 여과하는 단계; 및 (e) filtering the dispersion; And

(f) 상기 여과된 분산액 중의 성장인자 함량을 확인하는 단계;를 포함한다. (f) checking the content of the growth factor in the filtered dispersion.

우선 동물지방 조직을 세척하고 분쇄하여 지방조직을 준비한다(S200).First, the animal fat tissue is washed and pulverized to prepare adipose tissue (S200).

준비된 상기 준비된 상기 지방조직을 원심분리 하여 수분과 지질을 제거하여 전처리한다(S210).The prepared adipose tissue is centrifuged to remove moisture and lipids to pretreat (S210).

초임계유체를 이용한 용매추출로 전처리된 상기 지방조직을 탈세포 및 탈지하여 세포외기질을 회수한다(S220).The adipose tissue pretreated by solvent extraction using a supercritical fluid is decellularized and degreased to recover the extracellular matrix (S220).

상기 S200 내지 S220은 동물지방 유래 세포외기질 제조방법과 동일한 과정이므로 이하에서 반복되는 설명은 생략하기로 한다. Since S200 to S220 are the same process as the method for producing an animal fat-derived extracellular matrix, a repeated description below will be omitted.

회수된 상기 세포외기질을 탈이온수에 분산시켜 분산액을 제조한다(S230).The recovered extracellular matrix is dispersed in deionized water to prepare a dispersion (S230).

상기 탈이온수에 분산시켜 분산액을 제조하는 경우 이후의 여과가 용이하고, 성장인자의 함량을 쉽게 확인하여 세포외기질 보존액을 제조할 수 있다. When the dispersion is prepared by dispersing in the deionized water, subsequent filtration is easy, and the content of the growth factor can be easily checked to prepare an extracellular matrix preservation solution.

상기 분산은 고압 호모게나이저(High pressure homogenizer)를 사용하여 15 ℃에서 15,000 내지 25,000 psi의 압력으로 분산할 수 있다. The dispersion can be dispersed at 15° C. at a pressure of 15,000 to 25,000 psi using a high pressure homogenizer.

상기 범위 내에서 분산하는 경우 세포외기질의 기계적 특징을 유지하고 세포외기질에 잔류된 단백질이 용출되어 분산액 내로 분산되게 할 수 있다. When dispersed within the above range, the mechanical properties of the extracellular matrix can be maintained, and proteins remaining in the extracellular matrix can be eluted and dispersed into the dispersion.

이 때 분산은 현탁 상태에 따라 1 내지 5회 반복 수행할 수 있다. In this case, dispersion may be repeated 1 to 5 times depending on the suspended state.

상기 분산액을 여과한다(S240).The dispersion is filtered (S240).

상기 분산액은 현탁액으로 세포외기질의 단백질이 잔류되어 있기 때문에 오염 및 감염의 위험이 존재한다. Since the dispersion is a suspension, there is a risk of contamination and infection because proteins of the extracellular matrix remain.

상기 여과를 통하여 잔류된 단백질을 제거하여 세포외기질 보존액의 오염 및 감염을 방지하여 생체안전성을 증가시킬 수 있으며, 취급성 및 활용성 또한 증가시킬 수 있다. By removing the remaining protein through the filtration, contamination and infection of the preservative solution of the extracellular matrix can be prevented, thereby increasing biosafety, and handling and utility can also be increased.

상기 여과는 상기 분산액을 0.2내지 0.45 ㎛ 포어 사이즈(pore sizes)의 시린지 필터를 통과시켜 여과할 수 있다. The filtration may be performed by passing the dispersion through a syringe filter having a pore size of 0.2 to 0.45 µm.

상기 포어 사이즈 내의 필터를 이용하여 세포외기질과 함께 잔류하는 단백질을 효과적으로 제거할 수 있으며, 보존액을 멸균상태로 유지시킬 수 있고, 잔존하는 DNA를 효과적으로 제거할 수 있다. By using the filter within the pore size, proteins remaining together with the extracellular matrix can be effectively removed, the preservation solution can be maintained in a sterile state, and remaining DNA can be effectively removed.

상기 범위를 벗어나는 경우에는 세포외기질 함량이 감소되어 성장인자가 감소되거나 감염 위험으로 멸균할 수 없으며 잔존하는 DNA 제거가 어렵다. If it is out of the above range, the extracellular matrix content is reduced, so that growth factors are reduced or sterilization cannot be performed due to infection risk, and it is difficult to remove the remaining DNA.

상기 여과된 분산액 중의 성장인자 함량을 확인한다(S250).Check the content of the growth factor in the filtered dispersion (S250).

상기 여과를 통하여 상기 성장인자는 상기 여과를 통하여 bFGF(Basic fibroblast growth factor) 함량이 40 내지 50 % 범위로 감소될 수 있다.Through the filtration, the growth factor may have a basic fibroblast growth factor (bFGF) content in the range of 40 to 50% through the filtration.

상기 bFGF 는 단백질에 포함되거나 결합되어 있으며, 상기 여과를 통하여 보존액 중에 단백질을 여과하여 제거하는 경우 함께 여과되어 함량이 감소되기 때문에 상기 bFGF의 함량 감소를 확인하여 보존액 내의 단백질이 제거되는 것을 확인할 수 있으며, 생체안전성이 증가된 동물지방 유래 세포외기질 보존액을 제조할 수 있다. The bFGF is contained or bound to a protein, and when the protein is filtered and removed in the preservative through the filtration, the content is reduced by filtering together, so it can be confirmed that the protein in the preservative is removed by confirming the decrease in the content of bFGF. , An animal fat-derived extracellular matrix preservation solution with increased biosafety can be prepared.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to aid in the understanding of the present invention, but the following examples are only illustrative of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples.

실시예 1. 초임계유체 추출 세포외기질 Example 1. Supercritical fluid extraction extracellular matrix

동물지방으로부터 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 세포외기질을 수득하기 위하여 지방흡입술과정에서 수득한 폐지방을 오염 방지 처리하여 이송한 이후에 지방에 포함된 혈액을 육안으로 완전하게 씻겨 낼 정도로 분액 깔대기를 이용하여 탈이온수를 충분히 주입하여 혼합 후 20분 방치하여 세척하였다. 총 5회 세척을 실시하였다. In order to obtain extracellular matrix from animal fat through solvent extraction using supercritical fluid, the waste fat obtained during liposuction is treated to prevent contamination and transferred, and then the blood contained in the fat is completely washed away with the naked eye. Deionized water was sufficiently injected using a funnel, mixed, and allowed to stand for 20 minutes for washing. Washing was performed a total of 5 times.

세척한 지방을 1000 mL를 플라스크에 담고 교반기를 이용하여 50 rpm으로 분산시킨 후 펌프(120 rpm 펌핑)를 사용하여 일정한 유속으로 초음파 처리 장치를 통과하도록 하여, 전체 지방에 균일하게 초음파가 투과될 수 있도록 하였다. 1000 mL of washed fat is placed in a flask, dispersed at 50 rpm using a stirrer, and then passed through the ultrasonic treatment device at a constant flow rate using a pump (120 rpm pumping), so that ultrasonic waves can be uniformly transmitted to the entire fat. Made it possible.

상기 초음파의 출력은 400 W에서 진폭 70 %로 조절하여 6 분 동안 지방을 분쇄하여 지방조직을 수득하였다. The output of the ultrasonic wave was adjusted to 70% amplitude at 400 W, and the fat was crushed for 6 minutes to obtain adipose tissue.

초음파 처리 동안 칠러(chiller)를 사용하여 지방조직을 3 ℃로 유지하였다. The adipose tissue was maintained at 3° C. using a chiller during sonication.

초음파 처리한 지방조직을 원심분리기로 옮겨 4,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하고 하층의 수분과 상층의 지질을 분리하여 제거하였다. The sonicated adipose tissue was transferred to a centrifuge, centrifuged at 4,000 rpm for 20 minutes, and the water in the lower layer and the lipid in the upper layer were separated and removed.

중층의 고형분을 회수하여 반응기에 배치하였다. The solid content of the intermediate layer was recovered and placed in the reactor.

상기 반응기는 일측에 이산화탄소 실린더가 구비되고, 이산화탄소가 배출되는 라인을 따라 냉각기와 펌프가 구비되어 이산화탄소를 가압하여 초임계유체인 용매를 제조하였다. The reactor was provided with a carbon dioxide cylinder on one side, a cooler and a pump along a line through which carbon dioxide was discharged to pressurize carbon dioxide to prepare a solvent as a supercritical fluid.

상기 이산화탄소 실린더 일측에는 공용매인 에탄올 탱크가 구비되고, 에탄올이 배출되는 라인에는 펌프가 구비되어, 상기 에탄올은 상기 초임계유체인 용매에 합류되어 용매의 용해도를 증가시키고, 지방조직에 잔류된 오염물질을 소독하여 멸균 효과를 나타낼 수 있도록 조절하였다. One side of the carbon dioxide cylinder is provided with an ethanol tank as a common solvent, and a pump is provided in the line through which ethanol is discharged, and the ethanol is joined to the solvent, which is the supercritical fluid, to increase the solubility of the solvent, and to remove contaminants remaining in adipose tissue. It was sterilized and adjusted to exhibit a sterilization effect.

상기 반응기에 300 bar로 가압되고 공용매인 에탄올과 혼합된 용매를 32 ℃에서 20 mL/min의 유량으로 도입하여 용매추출하였다. The solvent was extracted by introducing a solvent mixed with ethanol as a co-solvent and pressurized to 300 bar into the reactor at a flow rate of 20 mL/min at 32°C.

추출시간을 2 시간에서 12 시간까지 수행하고, 추출이 완료된 이후에 반응기에 구비된 트랩챔버의 벤트를 개방하여 용매를 증발시켜 제거하여 흰색 고형분인 세포외기질을 수득하였다. The extraction time was performed from 2 hours to 12 hours, and after the extraction was completed, the vent of the trap chamber provided in the reactor was opened to evaporate and remove the solvent to obtain an extracellular matrix as a white solid.

실험예 1. 세포외기질 물성Experimental Example 1. Physical properties of extracellular matrix

초임계유체를 이용한 용매추출에 의하여 수득한 세포외기질에서 단백질 함량을 확인하기 위하여 단백질 정량분석(Bicinchonic Acid Assay; BCA)을 수행하였다. Protein quantitative analysis (Bicinchonic Acid Assay; BCA) was performed to confirm the protein content in the extracellular matrix obtained by solvent extraction using a supercritical fluid.

단백질 정량분석 방법에 따라 전체적으로 주입한 단백질의 함량을 70 ug으로 맞춘 후, 전기영동을 수행하였다. According to the protein quantitative analysis method, the total amount of the injected protein was adjusted to 70 ug, and then electrophoresis was performed.

도 3 은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 단백질 정량분석에 따른 전기영동 사진이다. 3 is an electrophoresis photograph according to the quantitative analysis of protein in an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.

도 3을 참조하면, 좌측부터 마커, 추출 전 지방시료, 추출 후 시료 2종이며 추출 후에도 밴드(Band)의 변화가 없이 유지 되었다. Referring to FIG. 3, from the left, the marker, the fat sample before extraction, and the two samples after extraction were maintained without any change in the band even after extraction.

동일한 양의 단백질을 주입했을 때 Band가 유지되므로 초임계 추출 후 탈지되고, 단백질은 변화 없이 유지된 것을 확인하였다. When the same amount of protein was injected, the band was maintained, so it was confirmed that the protein was degreased after supercritical extraction, and the protein remained unchanged.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 DNA잔존량을 나타낸 그래프이다. 4 is a graph showing the amount of DNA remaining in the extracellular matrix derived from animal fat according to an embodiment of the present invention.

추출시간Extraction time DNA 함량(ng/mg)DNA content (ng/mg) 2 시간 2 hours 70.7221170.72211 6 시간6 hours 31.0787531.07875 12 시간 12 hours 35.6073129435.60731294

상기 표 1은 동물지방의 초임계용매를 이용한 용매추출에 있어서 용매추출 시간에 따라 세포외기질에 잔존하는 DNA의 함량을 나타낸 것이다. 도 4 및 표1을 참조하면, 2시간 동안 초임계추출을 진행하는 경우 DNA 함량이 약70 ng/mg으로 확인되었으나, 12 시간 동안 초임계추출을 진행하는 경우 약 35 ng/mg의 DNA 잔존량을 나타내어, 면역반응을 일으킬 수 있는 DNA함량을 효과적으로 감소시킬 수 있으며, 세포 내 핵이 파괴되어 탈세포화 된 것을 확인하였다. Table 1 shows the amount of DNA remaining in the extracellular matrix according to the solvent extraction time in the solvent extraction using the supercritical solvent of animal fat. 4 and Table 1, when supercritical extraction was performed for 2 hours, the DNA content was confirmed to be about 70 ng/mg, but when supercritical extraction was performed for 12 hours, the remaining amount of DNA was about 35 ng/mg. As shown, it was confirmed that the DNA content that can cause an immune response can be effectively reduced, and that the intracellular nucleus is destroyed and decellularized.

한편 초임계유체를 이용한 용매추출에 의하여 수득한 세포외기질이 탈세포화된 것을 확인하기 위하여 헤마톡실린 및 에오진 염색(Hematoxylin and E osin staining)을 수행하였다. Meanwhile, hematoxylin and eosin staining was performed to confirm that the extracellular matrix obtained by solvent extraction using a supercritical fluid was decellularized.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 헤마톡실린 및 에오진 염색사진이다. 5 is a photograph of hematoxylin and eosin staining of an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.

도 5를 참조하면, 초임계유체를 이용한 용매추출의 효과를 비교하기 위하여 초임계추출 전 지방조직의 염색사진을 좌측에 나타내고 초임계유체를 이용한 용매추출 후 수득한 세포외기질의 염색사진을 우측에 나타내었다. 5, in order to compare the effect of solvent extraction using a supercritical fluid, a stained picture of adipose tissue before supercritical extraction is shown on the left, and a stained picture of the extracellular matrix obtained after solvent extraction using a supercritical fluid is shown on the right. Indicated.

초임계유체를 이용한 용매추출 후 세포외기질에서는 세포핵을 관찰할 수 없었고 세포가 형태를 유지하지 못하고 있는 것을 확인하여 탈세포된 것을 확인하였다. After solvent extraction using a supercritical fluid, the cell nucleus could not be observed in the extracellular matrix, and it was confirmed that the cell did not maintain its shape, thereby confirming that the cell was decellularized.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 주사전자현미경 사진이다. 6 is a scanning electron micrograph of an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.

도 6을 참조하면, 초임계유체를 이용한 용매추출 과정에서 세포의 변화를 확인하기 위하여 좌측에 추출 전 지방조직의 주사전자현미경의 세포사진을 좌측에 나타내고, 추출 후 조직의 주사전자현미경 사진을 우측에 나타내었다. Referring to FIG. 6, in order to confirm the change of cells in the solvent extraction process using a supercritical fluid, a cell picture of the adipose tissue before extraction is shown on the left on the left, and a scanning electron microscope picture of the tissue after extraction is shown on the right. Shown in.

초임계유체를 이용한 용매추출 후 세포는 모두 제거되었으며, 섬유질 모양이 확인되어 세포외기질이 탈세포된 것을 확인하였다.After solvent extraction using a supercritical fluid, all cells were removed, and the fibrous shape was confirmed, confirming that the extracellular matrix was decellularized.

실시예 2. 동물지방 유래 세포외기질 보존액 제조Example 2. Preparation of animal fat-derived extracellular matrix preservation solution

실시예 1에서 수득한 세포외기질 시료를 탈이온수에 1 wt%로 첨가하여 혼합하고, 고압 호모게나이저를 사용하여 15 ℃에서 20,000 psi의 압력으로 분산시켰다. The extracellular matrix sample obtained in Example 1 was added to deionized water in an amount of 1 wt%, mixed, and dispersed at 15° C. at a pressure of 20,000 psi using a high-pressure homogenizer.

5회 반복하여 분산시켜 분산액을 제조하였다. 제조한 분산액을 포어 사이즈(Pore size) 0.2 ㎛인 시린지 필터(Syringe Filter)를 사용해 여과하여 투명한 상태의 동물지방 유래 세포외기질 보존액을 제조하였다. Dispersion was repeated 5 times to prepare a dispersion. The prepared dispersion was filtered using a syringe filter having a pore size of 0.2 μm to prepare a transparent animal fat-derived extracellular matrix preservation solution.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외기질 시료, 1 wt% 분산액 및 여과되어 제조된 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 사진이다. 7 is a photograph of an extracellular matrix sample, a 1 wt% dispersion, and an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution prepared by filtration according to an embodiment of the present invention.

도 7을 참조하면 세포외기질 시료를 분산하여 투명 액체 상태의 동물지방 유래 세포외기질 보존액을 제조할 수 있는 것을 확인하였다. Referring to FIG. 7, it was confirmed that an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution in a transparent liquid state could be prepared by dispersing an extracellular matrix sample.

실험예 2. 성장인자 확인Experimental Example 2. Growth factor confirmation

실시예 1에 따라 수득한 세포외기질이 성장인자를 함유하고 있는지 확인하기 위하여 효소 결합 면역 흡착 분석(Enzyme-Linked Immunosorbent assay; 이하 ELISA)을 수행하였다. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to confirm whether the extracellular matrix obtained according to Example 1 contained growth factors.

실시예 2에 따라 제조된 1 wt% 분산액 준비하고, 사용할 플레이트 웰(Plate Well) 각각에 세척용액(Washing Solution)을 투입하여 세척하였다. 표준용액(Standard) 및 시료(Sample)를 각 Well에 넣고 상온에서 2 시간 반응시켰다. A 1 wt% dispersion prepared according to Example 2 was prepared, and a washing solution was added to each of the plate wells to be used for washing. The standard solution (Standard) and the sample (Sample) were put into each well and reacted at room temperature for 2 hours.

미반응 표준용액과 시료를 세척용액으로 세척하였다. The unreacted standard solution and sample were washed with a washing solution.

각 웰에 검출항체(Detection Antibody)를 주입하고, 상온에서 2 시간 동안 배양하고 세척하였다. Each well was injected with a detection antibody, incubated at room temperature for 2 hours, and washed.

Streptavidin-HRP를 주입하고, 상온에서 30 분간 배양한 이후에 다시 세척하였다. Streptavidin-HRP was injected, incubated for 30 minutes at room temperature, and then washed again.

TMB Solution을 주입 후 발색될 때까지 배양하고, 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. After injecting the TMB Solution, it was incubated until color development, and absorbance was measured at 450 nm wavelength.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 VEGF 기준 효소 결합 면역 흡착 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 8 is a graph showing the result of an enzyme-linked immunosorbent assay based on VEGF of an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.

도 9는 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질이 분산된 분산액 내의 VEGF 함량을 나타낸 그래프이다. 9 is a graph showing the content of VEGF in a dispersion in which an animal fat-derived extracellular matrix is dispersed according to an embodiment.

도 8 및 도 9를 참조하면, 1 wt% 분산액 내 VEGF의 농도는 40.34 pg/ml이고, 실시예 1에 따른 세포외기질 시료 내의 VEGF 함량은 4.03 ng/g인 것을 확인하여 동물지방에 대한 초임계유체를 이용한 용매추출로 수득한 세포외기질 시료에서 성장인자가 존재하는 것을 확인하였다. 8 and 9, it was confirmed that the concentration of VEGF in the 1 wt% dispersion was 40.34 pg/ml, and the VEGF content in the extracellular matrix sample according to Example 1 was 4.03 ng/g. It was confirmed that the growth factor was present in the extracellular matrix sample obtained by solvent extraction using the critical fluid.

실험예 3. 여과에 따른 DNA 함량변화Experimental Example 3. Change of DNA content according to filtration

실시예 2에 따른 보존액의 여과 전후 DNA 함량을 분석하였다. The DNA content of the preservative according to Example 2 was analyzed before and after filtration.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질이 분산된 분산액의 여과 전후의 DNA함량을 나타낸 그래프이다. 10 is a graph showing the DNA content before and after filtration of a dispersion in which an animal fat-derived extracellular matrix is dispersed according to an embodiment of the present invention.

도 10을 참조하면, 여과 전 5.57 ng/μl에서 0.13 ng/μl로 감소되어 초임계유체를 이용한 용매추출 방법으로 수득한 세포외기질을 분산시켜 여과하는 경우에 잔존 DNA를 더 감소시킬 수 있는 것을 확인하였다. Referring to Figure 10, it is reduced from 5.57 ng/μl before filtration to 0.13 ng/μl, and it is possible to further reduce residual DNA when the extracellular matrix obtained by the solvent extraction method using a supercritical fluid is dispersed and filtered. Confirmed.

실험예 4. 성장인자의 종류 및 함량 확인Experimental Example 4. Confirmation of the type and content of growth factors

실시예 1에 따른 세포외기질에 다양한 성장인자가 다량으로 함유되어 있는 것을 확인하기 위하여 인체 성장인자 항체 어레이(Human Growth Factor Antibody Array) 멤브레인, Abcam 키트를 사용하여 분석을 수행하였다. In order to confirm that the extracellular matrix according to Example 1 contains a large amount of various growth factors, analysis was performed using a Human Growth Factor Antibody Array membrane and Abcam kit.

시료의 처리는 키트의 프로토콜에 따라 진행하였으며 시료에 존재하는 단백질의 농도를 조절하기 위하여 1/10으로 희석하였다. The sample was processed according to the protocol of the kit, and diluted to 1/10 in order to control the concentration of protein present in the sample.

한편 실시예 2에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액에 함유되어 있는 성장인장의 종류 및 함량을 확인하기 위하여 싸이토카인 항체 어레이(Cytokine Antibody Array)로 분석하였다. Meanwhile, in order to confirm the type and content of growth tensile contained in the animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to Example 2, it was analyzed with a cytokine antibody array.

1 wt% 분산액(Control) 및 여과용액(Filter Solution)을 1/10로 희석하여 준비하고, 멤브레인(Membrane)을 버퍼용액(Washing buffer)으로 세척 후 상온에서 30 분간 대기(Blocking)하였다. A 1 wt% dispersion (Control) and a filter solution were prepared by diluting 1/10, and the membrane (Membrane) was washed with a washing buffer and then blocked at room temperature for 30 minutes.

희석한 분석 대상액을 멤브레인(Membrane)에 도포하고, 4 ℃에서, 24 시간 동안 배양 후 아스피레이터로 분석 대상액을 제거하였다. The diluted analysis target solution was applied to a membrane, and after incubation at 4° C. for 24 hours, the analysis target solution was removed with an aspirator.

버퍼용액으로 잔여 분석 대상액을 세척하고, 상온에서 바이오틴-콘쥬게이트 항싸이토카인(Biotin-Conjugated Anti-Cytokine)을 주입하고, 2 시간동안 배양 후 액체를 제거하고 잔여물을 세척하였다. The remaining analysis target solution was washed with a buffer solution, biotin-conjugated anti-cytokine was injected at room temperature, and after incubation for 2 hours, the liquid was removed and the residue was washed.

상온에서 HRP-Conjugated Streptavidin을 주입하고, 2 시간 동안 배양 후 액체를 제거하고 잔여물을 세척하였다. HRP-Conjugated Streptavidin was injected at room temperature, and after incubation for 2 hours, the liquid was removed and the residue was washed.

검출 버퍼(Detection buffer) 도포 후 5분 이내 화학발광 검출 카메라(Chemiluminescence Detection Camera)로 촬영하여 이미지 J 프로그램(ImageJ Program)을 이용해 분석하였다. Within 5 minutes after the detection buffer was applied, a photograph was taken with a chemiluminescence detection camera and analyzed using the ImageJ Program.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 여과 전후의 싸이토카인 항체 어레이 결과에 따른 이미지이다. 11 is an image according to the results of the cytokine antibody array before and after filtration of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to an embodiment of the present invention.

이미지 J 프로그램을 이용하여 도 10 내 흑색 점의 선명도(Intensity)를 측정하였다. Using the image J program, the intensity of the black point in FIG. 10 was measured.

싸이토카인 어레이(Cytokine array)를 통해 측정된 이미지 내 해당 항체에 대한 신호의 세기를 측정하여 시료 내 해당 물질이 얼마나 들어있는지에 대한 상대적 값을 확인하였다. The intensity of the signal for the antibody in the image measured through the cytokine array was measured to determine the relative value of how much the corresponding substance was contained in the sample.

Positive Control인 VEGF 에 대한 상대적인 값을 기준으로 검출된 나머지 성장인자의 상대값을 환산하여 계산하였다. Based on the relative value of VEGF, which is a positive control, the relative value of the remaining growth factors detected was converted and calculated.

도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 여과 전후의 성장인자 종류 및 선명도(intensity)를 나타낸 것이다. 12 shows the types and intensity of growth factors before and after filtration of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to an embodiment of the present invention.

도 11 및 도 12를 참조하면, 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 수득한 세포외기질에서 총 40가지의 성장인자를 확인할 수 있으며, 세포외기질을 함유한 보존액의 여과 후에 성장인자 함량이 감소된 것을 확인하였다. 11 and 12, a total of 40 growth factors can be identified in the extracellular matrix obtained through solvent extraction using a supercritical fluid, and the growth factor content decreases after filtration of the preservative containing the extracellular matrix. It was confirmed.

도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 여과 전후의 성장인자 종류 및 함량(ng/g)을 나타낸 것이다. 13 shows the types and contents (ng/g) of growth factors before and after filtration of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to an embodiment of the present invention.

도 13을 참조하면, 실시예 1에 따른 세포외기질은 인체 성장인자 41가지 중 총 40가지의 성장인자를 함유하고 있으며, FGF-4는 초임계유체를 이용한 용매추출과정에서 제거되는 것을 확인하였다. 13, it was confirmed that the extracellular matrix according to Example 1 contains a total of 40 growth factors out of 41 human growth factors, and FGF-4 is removed in the solvent extraction process using a supercritical fluid. .

초임계유체를 이용한 용매추출과정의 탈세포 및 탈지효과는 성장인자의 함량에 영향을 미치는 것을 확인하였으며, 초임계유체를 이용한 용매추출과정의 추출조건에 따라 성장인자가 함량 및 종류가 조절된 세포외기질을 수득할 수 있는 것을 확인하였다. It was confirmed that the decellularization and degreasing effect of the solvent extraction process using the supercritical fluid had an effect on the content of the growth factor, and the cell whose content and type were adjusted according to the extraction conditions of the solvent extraction process using the supercritical fluid. It was confirmed that external substrates could be obtained.

한편 실시예 2에 따라 제조된 동물지방 유래 세포외기질 보존액은 세포외기질 1g 당 0.21 내지 6.86 ng으로 여과에 따라 성장인자가 감소되는 것을 확인하여 보존액 중의 성장인자의 함량을 조절할 수 있는 것을 확인하였다. On the other hand, it was confirmed that the animal fat-derived extracellular matrix preservative solution prepared according to Example 2 was 0.21 to 6.86 ng per 1 g of extracellular matrix, and it was confirmed that the growth factor was decreased by filtration, and the content of the growth factor in the preservative solution could be controlled .

또한 성장인자 중 여과과정을 통하여 bFGF(Basic fibroblast growth factor)의 함량이 40 내지 50 % 범위로 감소된 것을 확인하여 1 wt%의 분산액 중에 잔류하는 단백질이 존재하나, 상기 단백질에 포함되어 있는 bFGF가 여과를 통하여 제거되기 때문에 상기 보존액 중의 단백질을 제거할 수 있는 것을 확인하였다. In addition, it was confirmed that the content of bFGF (Basic fibroblast growth factor) was reduced in the range of 40 to 50% through the filtration process among growth factors. Since it is removed through filtration, it was confirmed that the protein in the preservative can be removed.

이는 상기 보존액 중의 단백질을 제거하여 세포외기질 보존액이 감염 및 오염 위험성을 감소시켜 생체안전성을 증가시키고, 여과 과정에서 멸균할 수 있으며, 잔존하는 DNA를 제거할 수 있는 것을 나타내어 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 취급성 및 보존성을 증가시킬 수 있는 것을 확인하였다.This indicates that the extracellular matrix in the preservative solution is removed to reduce the risk of infection and contamination to increase biosafety, can be sterilized in the filtration process, and the remaining DNA can be removed. It was confirmed that the handling and storage properties of the preservation solution can be increased.

본 발명의 발명자들은 최근 증가되는 지방흡입술에 따라 인체지방이 다량으로 폐기되는 점을 주목하고 이를 활용할 수 있는 방안을 모색하던 중 지방조직에 초임계유체를 이용한 용매추출방법을 사용하여 추출조건을 조절하는 경우 세포외기질의 기계적 특성을 유지하면서, 탈세포 및 탈지되어 생체안전성과 생체적합성을 증가시킨 세포외기질을 수득할 수 있는 것을 확인하였다. The inventors of the present invention note that a large amount of human fat is discarded according to the recently increased liposuction, and while seeking a way to utilize it, the extraction conditions were adjusted by using a solvent extraction method using a supercritical fluid in adipose tissue. In this case, it was confirmed that the extracellular matrix with increased biosafety and biocompatibility can be obtained by decellularizing and degreasing while maintaining the mechanical properties of the extracellular matrix.

특히 초임계유체를 이용한 용매추출에서 세포외기질에 성장인자가 다량으로 잔류하여 세포의 생리활성을 조절하고 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있는 것을 확인하였으며, 초임계유체를 이용한 용매추출과정에서 특정 성장인자가 배제되는 특징을 확인하여 종래 화학적, 생물학적 처리를 통한 세포외기질과 성장인자의 구성이 상이한 세포외기질을 효과적으로 추출할 수 있는 것을 확인하였다. In particular, in the solvent extraction using a supercritical fluid, it was confirmed that a large amount of growth factors remained in the extracellular matrix, thereby controlling the physiological activity of cells and inducing rapid tissue regeneration. By confirming the feature that the growth factor is excluded, it was confirmed that the extracellular matrix and the extracellular matrix different in the composition of the growth factor can be effectively extracted through conventional chemical and biological treatment.

지금까지 본 발명에 따른 동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.Until now, specific examples of the animal fat-derived extracellular matrix and the animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to the present invention have been described, but it is obvious that various implementation modifications are possible within the limit not departing from the scope of the present invention.

그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.Therefore, the scope of the present invention should not be defined by being limited to the described embodiments, and should be defined by the claims and equivalents as well as the claims to be described later.

즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지고, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.That is, it should be understood that the above-described embodiments are illustrative in all respects and not limiting, and the scope of the present invention is indicated by the claims to be described later rather than the detailed description, and the meaning and scope of the claims and All changes or modified forms derived from the equivalent concept should be construed as being included in the scope of the present invention.

Claims (4)

탈세포 및 탈지되고, 성장인자를 함유하는 동물지방 유래 세포외기질로서;
상기 탈세포 및 탈지와 성장인자의 함유는 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 수행되며;
상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 이산화탄소를 200 내지 600 bar로 가압하여 초임계유체로 제조하고;
상기 초임계유체를 18 내지 70 mL/min의 유량으로, 2 내지 12 시간 동안 처리하여 세포외기질을 추출하는 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질.
Decellularized and defatted, as an animal fat-derived extracellular matrix containing growth factors;
The decellularization and degreasing and the inclusion of growth factors are performed through solvent extraction using a supercritical fluid;
Solvent extraction using the supercritical fluid is prepared as a supercritical fluid by pressurizing carbon dioxide at 200 to 600 bar;
Animal fat-derived extracellular matrix, characterized in that the supercritical fluid is treated for 2 to 12 hours at a flow rate of 18 to 70 mL/min to extract the extracellular matrix.
 제1항에 있어서,
상기 동물지방은
지방흡입술을 통하여 추출된 폐지방인 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질.
The method of claim 1,
The animal fat is
Animal fat-derived extracellular matrix, characterized in that the lung fat extracted through liposuction.
 제1항에 있어서,
상기 성장인자는
AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 및 VEGF-D로 이루어진 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질.
The method of claim 1,
The growth factor is
AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF -BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 and VEGF-D, characterized in that consisting of animal fat-derived extracellular matrix.
 제3항에 있어서,
상기 성장인자는
세포외기질 1 g 당 0.52 내지 11.19 ng으로 함유되는 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질.
The method of claim 3,
The growth factor is
Animal fat-derived extracellular matrix, characterized in that contained in 0.52 to 11.19 ng per 1 g of the extracellular matrix.
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