KR20210024986A - Urinary exosome-derived miRNA gene biomarkers for diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney allografts and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신장이식 후 항체 매개성 거부반응(antibody-mediated rejection, ABMR)과 관련된 바이오마커, 항체 매개성 거부반응 진단용 조성물, 키트, 이를 이용한 항체 매개성 거부반응의 진단을 위한 정보제공방법 및 항체 매개성 거부반응 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a urine exosome-derived miRNA gene biomarker and its use for diagnosis of antibody-mediated rejection after kidney transplantation, and more particularly, antibody-mediated rejection (ABMR) after kidney transplantation. It relates to a biomarker, a composition for diagnosing an antibody-mediated rejection reaction, a kit, a method for providing information for diagnosis of an antibody-mediated rejection reaction using the same, and a screening method for an antibody-mediated rejection treatment agent.
장기이식 분야는 서서히 정밀 의료의 일부가 되고 있다. 현재의 표준 면역 억제 치료를 사용할 때 여전히 신장 이식을 받은 환자의 15 ~ 20%에서 급성 거부 반응이 발생하며, 현재까지는 혈청 크레아티닌의 농도 증가 또는 새로운 단백뇨의 발현 등이 생길 경우 조직 생검을 통해 진단된다. 혈청 크레아티닌 농도 증가 또는 새로운 단백뇨 발현이 있는 시점에서의 신장 상태는 이미 염증이 꽤 진행된 상태이기 때문에, 무증상의 거부반응(subclinical acute rejection)을 조기 발견할 수 있는 바이오마커의 필요성이 대두된다. 선천적/후천적 면역 반응은 조직학적 수준에서 나타나기 전에 분자 수준에서 먼저 나타난다고 알려져 있다. 따라서 신장이식 후에 임상적 상태를 미리 진단하고 모니터링하기 위한 비침습적 바이오마커의 개발은 정밀 의료에 필수적인 단계이다.The field of organ transplantation is slowly becoming a part of precision medicine. Acute rejection reactions still occur in 15 to 20% of patients receiving kidney transplants when using the current standard immunosuppressive treatment, and until now, if there is an increase in serum creatinine concentration or the expression of new proteinuria, it is diagnosed through tissue biopsy. . Since the renal condition at the time when there is an increase in serum creatinine concentration or new proteinuria expression is a condition in which inflammation is already quite advanced, there is a need for a biomarker capable of early detection of subclinical acute rejection. It is known that innate/acquired immune responses appear first at the molecular level before appearing at the histological level. Therefore, the development of non-invasive biomarkers for pre-diagnosing and monitoring clinical conditions after kidney transplantation is an essential step for precision medicine.
과거에는 신장이식 후 거부반응을 거부반응의 발생 시기에 따라 초급성, 급성 및 만성 거부반응으로 각각을 구분하였으나 최근에는 발생기전과 신생검 소견에 따라 거부반응을 분류한 Banff 분류를 주로 사용하고 있다. Banff 분류 이전의 이식신장의 병리진단 분류는 매우 간단하였는데, 특히 급성 및 만성 거부반응은 주로 염증세포 침윤의 위치에 따라 분류하여 간질에서 관찰되면 세포성(cellular), 혈관 내에 침윤한 경우는 혈관성(vascular) 거부반응으로 분류하였다. 즉, 이는 현재의 관점에서 보자면 초급성 거부반응을 제외하고는 모두 T 세포 매게 거부반응에 대한 진단 분류이며, 당시에는 초급성의 임상상이 아닌 항체 매개성 거부반응 (ABMR)의 존재 자체가 인식되지 못하였고 진단적 근거도 없었다. 현재 초급성 거부반응은 급성 ABMR의 가장 심한 형태로 이해되고 있다.In the past, rejection reactions after kidney transplantation were classified into superacute, acute and chronic rejection reactions according to the time of occurrence of the rejection reaction, but recently, the Banff classification, which classified rejection reactions according to the mechanism of development and the findings of a new biopsy, is mainly used. Prior to Banff classification, the classification of pathologic diagnosis of transplanted kidney was very simple.In particular, acute and chronic rejection reactions were mainly classified according to the location of inflammatory cell infiltration. vascular) rejection. In other words, from the current point of view, this is a diagnostic classification for T cell-specific rejection except for superacute rejection, and at the time, the existence of antibody-mediated rejection (ABMR) itself was not recognized, not the clinical picture of superacute. And there was no diagnostic evidence. Currently, superacute rejection is understood as the most severe form of acute ABMR.
신장이식 후 거부반응의 진단과 관련하여 신장이식 후 급성거부반응을 진단하기 위한 소변 바이오마커가 알려져 있다(Suthanthiran et al., Urinary-Cell mRNA Profile and Acute Cellular Rejection in Kidney Allografts. The New England Journal of Medicine(2013) 369;1). 그러나, T 세포 매개성 거부반응과 항체 매개성 거부반응을 구별하여 진단하거나, 이를 동시에 진단할 수 있는 바이오마커, 나아가 신장이식 후 합병증인 BK 바이러스 신병증과 이식거부반응을 구별하여 진단하거나 이들을 동시에 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하고 이를 신장이식 후 치료 방향의 선택 및 치료 경과 판단에 활용하고자 하는 연구는 전무한 실정이다.Regarding the diagnosis of rejection after kidney transplantation, urine biomarkers for diagnosing acute rejection after kidney transplantation are known (Suthanthiran et al., Urinary-Cell mRNA Profile and Acute Cellular Rejection in Kidney Allografts. The New England Journal of Medicine (2013) 369;1). However, T cell-mediated rejection and antibody-mediated rejection can be distinguished and diagnosed, or biomarkers that can be diagnosed at the same time. There is no research to discover biomarkers that can be diagnosed and to use them for selection of treatment directions and determination of treatment progress after kidney transplantation.
한편, 엑소좀(exosome)은 세포에서 유래하는 소포체로써 표면에 마커를 가지며 그의 내부에는 지질, 단백질, 마이크로RNA 등의 핵산 등을 함유하고 있어서 이를 이용한 정상적인 기능과 질병에 대한 기능을 연구가 활발히 진행되고 있다. 엑소좀은 세뇨관 내강 (renal tubule lumen)에 존재하는 상피세포 혹은 사구체 발세포 (glomerular podocyte)에서 분비되어 엑소좀에 있는 특이 인자가 이식된 신장세포의 상태를 반영하여 신장 이식 후 거부반응을 진단하기 위한 바이오마커로의 활용 가치가 높은 것으로 알려져 있다 (Hua Zhou, Peter S. T. Yuen, Trairak Pisitkum et al. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney International, 2006, 69(8) 1471-76).On the other hand, exosomes are endoplasmic reticulums derived from cells and have markers on the surface and contain nucleic acids such as lipids, proteins, and microRNAs inside them, so studies on normal functions and disease functions using them are actively progressing. Has become. Exosomes are secreted from epithelial cells or glomerular podocytes present in the renal tubule lumen, and a specific factor in exosomes reflects the state of transplanted kidney cells to diagnose rejection after kidney transplantation. (Hua Zhou, Peter ST Yuen, Trairak Pisitkum et al. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney International, 2006, 69(8)) 1471-76).
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 신장이식 후 항체 매개성 거부반응을 진단할 수 있는 miRNA 유전자 바이오마커, 신장이식 후 항체 매개성 거부반응을 T 세포 매개성 거부반응 및 BK 바이러스 신병증과 구분하여 진단할 수 있는 miRNA 유전자 바이오마커, 및/또는 신장이식 거부반응과 신장 이식 후 BK 바이러스 신병증을 구분하여 진단할 수 있는 miRNA 바이오마커를 선별 및 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Under this background, the present inventors can diagnose miRNA gene biomarkers capable of diagnosing antibody-mediated rejection after kidney transplantation, and antibody-mediated rejection after kidney transplantation by distinguishing between T cell-mediated rejection and BK virus nephropathy. The present invention was completed by selecting and confirming a possible miRNA gene biomarker, and/or a miRNA biomarker capable of distinguishing and diagnosing BK virus nephropathy after kidney transplant rejection and kidney transplantation.
본 발명의 목적은 신장이식 후 항체 매개성 거부반응을 진단하기 위한 miRNA 유전자 바이오마커, 이를 이용하여 신장이식 후 항체 매개성 거부반응을 진단하기 위한 조성물, 키트, 정보제공방법 및 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is a miRNA gene biomarker for diagnosing antibody-mediated rejection after kidney transplantation, a composition, kit, information providing method, and antibody-mediated after kidney transplantation for diagnosing antibody-mediated rejection after kidney transplantation using the same It is to provide a method for screening a therapeutic agent for sexual rejection.
본 발명의 다른 목적은 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증과 구분하여 항체 매개성 거부반응을 진단하기 위한 바이오마커 조성물, 이를 이용하여 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증과 구분하여 항체 매개성 거부반응을 진단하기 위한 조성물, 키트, 정보제공방법 및 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is a biomarker composition for diagnosing antibody-mediated rejection after kidney transplantation, distinct from T cell-mediated rejection or BK virus nephropathy, and T-cell-mediated rejection or BK after kidney transplantation using the same It is to provide a composition, a kit, a method of providing information for diagnosing antibody-mediated rejection, and a method for screening a therapeutic agent for antibody-mediated rejection after kidney transplantation, in distinction from viral nephropathy.
본 발명의 또 다른 목적은 신장이식 거부반응과 BK 바이러스 신병증을 구분하여 진단하기 위한 miRNA 유전자 바이오마커, 이를 이용하여 신장이식 거부반응과 BK 바이러스 신병증을 구분하여 진단하기 위한 조성물, 키트, 정보제공방법 및 신장이식 거부반응 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is a miRNA gene biomarker for distinguishing and diagnosing kidney transplant rejection and BK virus nephropathy, and a composition, kit, and information for distinguishing and diagnosing kidney transplant rejection and BK virus nephropathy using the same It is to provide a method of providing and screening for a treatment for renal transplant rejection.
본 발명의 또 다른 목적은 신장이식 후 예후 예측을 위한 바이오마커 조성물, 이를 이용하여 신장이식 후 예후 예측을 위한 조성물, 키트, 정보제공방법 및 신장이식 거부반응 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a biomarker composition for predicting the prognosis after a kidney transplant, a composition for predicting the prognosis after a kidney transplant using the same, a kit, a method of providing information, and a screening method for a treatment for renal transplant rejection.
상술한 과제를 해결하기 위한 제1 양태로, 본 발명은 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자를 포함하는, 항체 매개성 거부반응(Antibody mediated rejection, ABMR)을 진단하기 위한 바이오마커 조성물을 제공한다.In a first aspect for solving the above problems, the present invention hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR Any one or more miRNAs selected from the group consisting of -103a-3p , hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221-3p It provides a biomarker composition for diagnosing an antibody mediated rejection (ABMR) comprising a gene.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장이식 후 항체 매개성 거부반응을 진단하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.With respect to the first aspect, the present invention provides hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, The expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221-3p It provides a composition for diagnosing antibody-mediated rejection after kidney transplantation, including an agent to be measured, and a kit including the same.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p , hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-221-3p The agent for measuring may include a primer or probe that specifically binds to the gene.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 실시간 PCR (RT-PCR) 키트, 마이크로어레이 키트 또는 SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the kit may be a real-time PCR (RT-PCR) kit, a microarray kit, or a Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) kit.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다:With respect to the first aspect, the present invention also provides a method of providing information for diagnosis of antibody mediated rejection after kidney transplant comprising the following steps:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및(a) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, in biological samples isolated from individuals The expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221-3p Measuring; And
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.(b) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a- measured in step (a) Expression of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of 3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221-3p Comparing the level to a normal control sample.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the biological sample of step (a) may be urine or urine-derived exosomes.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, 신장이식 후 항체 매개성 거부반응으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the information providing method is (c) measured in step (a), hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328- 5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR- When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of 221-3p is higher than the expression level in the normal control sample, diagnosis of antibody-mediated rejection after kidney transplantation may be further included.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:With respect to the first aspect, the present invention also provides a method of screening for a therapeutic agent for antibody mediated rejection after kidney transplant comprising the following steps:
(a) 시료에 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및(a) treating the sample with a candidate substance for an antibody-mediated rejection treatment after kidney transplantation; And
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.(b) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p in the sample treated with the candidate substance , hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-221-3p Steps to measure.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the sample of step (a) may be urine or urine-derived exosomes.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 스크리닝 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (a) 단계에서 처리한 후보물질을 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the screening method is (c) measured in step (b), hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p. , hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221 When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of -3p is more suppressed in a sample not treated with a candidate substance, the candidate substance treated in step (a) is used as a therapeutic agent for antibody-mediated rejection after kidney transplantation. It may further include the step of determining as.
상술한 과제를 해결하기 위한 제2 양태로, 본 발명은 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자를 포함하는, 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응(T cell mediated rejection, TCMR) 또는 BK 바이러스 신병증과 구분하여 항체 매개성 거부반응(Antibody mediated rejection, ABMR)을 진단하기 위한 바이오마커 조성물을 제공한다.As a second aspect for solving the above-described problem, the present invention is hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR Antibody-mediated rejection reaction (T cell mediated rejection, TCMR) or BK virus nephropathy, including any one or more miRNA genes selected from the group consisting of -103a-3p. Antibody mediated rejection (ABMR) provides a biomarker composition for diagnosing.
제2 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증과 구분하여 항체 매개성 거부반응을 진단하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.With respect to the second aspect, the present invention also provides hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p. A composition for diagnosing antibody-mediated rejection by distinguishing from T cell mediated rejection or BK virus nephropathy after kidney transplant, comprising an agent measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of, and A kit containing this is provided.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 또는 hsa-miR-103a-3p miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p or hsa-miR-103a-3p The agent for measuring the expression level of the miRNA gene may include a primer or probe that specifically binds to the gene.
제2 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증과 구분하여 항체 매개성 거부반응을 진단하기 위한 정보 제공방법을 제공한다:With respect to the second aspect, the present invention also provides a method for diagnosing antibody-mediated rejection after kidney transplantation, distinct from T cell mediated rejection or BK virus nephropathy, comprising the following steps:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및(a) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p in biological samples isolated from individuals Measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of; And
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.(b) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a- measured in step (a) Comparing the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of 3p with a normal control sample.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증을 동반하지 않는 항체 매개성 거부반응으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the information providing method comprises (c) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p measured in step (a). , When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p is higher than that in the normal control sample, T cell mediated after kidney transplantation It may further comprise the step of diagnosing rejection or antibody mediated rejection not accompanied by BK virus nephropathy.
제2 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:With respect to the second aspect, the present invention also provides a method of screening for a therapeutic agent for antibody-mediated rejection after kidney transplant comprising the following steps:
(a) 시료에 신장이식 거부반응 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및(a) treating the sample with a candidate substance for a therapeutic agent for kidney transplant rejection; And
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.(b) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p in the sample treated with the candidate substance Measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 스크리닝 방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (a) 단계에서 처리한 후보물질을 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the screening method comprises (c) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, measured in step (a), When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p is suppressed than in the sample not treated with the candidate substance, the treatment in step (a) above. It may further include the step of determining one candidate substance as a therapeutic agent for antibody-mediated rejection after kidney transplantation.
상술한 과제를 해결하기 위한 제3 양태로, 본 발명은 hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자를 포함하는, 신장이식 거부반응과 BK 바이러스 신병증을 구분하여 진단하기 위한 miRNA 유전자 바이오마커 조성물을 제공한다.In a third aspect for solving the above-described problem, the present invention is hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR -455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223 It provides a miRNA gene biomarker composition for distinguishing and diagnosing kidney transplant rejection and BK virus nephropathy, including any one or more miRNA genes selected from the group consisting of -3p.
제3 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장이식 거부반응과 BK 바이러스 신병증을 구분하여 진단하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.Regarding the third aspect, the present invention also provides hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p , hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p It provides a composition for diagnosing and diagnosing kidney transplant rejection and BK virus nephropathy, including an agent for measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group, and a kit including the same.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p , hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p The agent for measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group may include a primer or probe that specifically binds to the gene.
제3 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는, 신장이식 거부반응과 BK 바이러스 신병증을 구분하여 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다:With respect to the third aspect, the present invention also provides a method for providing information for distinguishing and diagnosing kidney transplant rejection and BK virus nephropathy, comprising the following steps:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및(a) hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, in biological samples isolated from individuals The group consisting of hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p Measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from; And
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.(b) hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455- measured in step (a) 3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p Comparing the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of a normal control sample.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, BK 바이러스 신병증을 동반하지 않는 신장이식 거부반응으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the information providing method is (c) hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, measured in step (a). , hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa -If the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p is higher than that in the normal control sample, kidney not accompanied by BK virus nephropathy It may further comprise the step of diagnosing transplant rejection.
제3 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는, 신장이식 거부반응 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:In connection with the third aspect, the present invention also provides a method of screening for a therapeutic agent for renal transplant rejection, comprising the steps of:
(a) 시료에 신장이식 거부반응 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및(a) treating the sample with a candidate substance for a therapeutic agent for kidney transplant rejection; And
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.(b) hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p in the sample treated with the candidate substance , hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p Measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 스크리닝 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (a) 단계에서 처리한 후보물질을 신장이식 거부반응 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the screening method is (c) measured in step (b), hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa- When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p is more suppressed in the sample not treated with the candidate substance, the candidate treated in step (a) above It may further include the step of determining the substance as a treatment for kidney transplant rejection.
상술한 과제를 해결하기 위한 제4 양태로, 본 발명은 hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자를 포함하는, 신장이식 후 예후 예측을 위한 바이오마커 조성물을 제공한다.In a fourth aspect for solving the above-described problem, the present invention hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p , hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa -miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR -223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and any one selected from the group consisting of hsa-miR-125b-5p It provides a biomarker composition for predicting prognosis after kidney transplantation, including the above miRNA gene.
제4 양태와 관련하여, 본 발명은 hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장이식 후 예후 예측을 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.With respect to the fourth aspect, the present invention provides hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR- 31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455- 3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, Expression of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR-125b-5p It provides a composition for predicting prognosis after kidney transplantation, including an agent for measuring the level, and a kit including the same.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR -31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455 -3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p , hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR-125b-5p of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of The agent for measuring the expression level may include a primer or probe that specifically binds to the gene.
제4 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 신장이식 후 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다:With respect to the fourth aspect, the present invention also provides a method of providing information for predicting prognosis after kidney transplantation comprising the following steps:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및(a) hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR- in biological samples isolated from individuals 31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455- 3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, Expression of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR-125b-5p Measuring the level; And
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.(b) measured in the step (a), hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa- miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR- 455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223- Any one or more miRNA genes selected from the group consisting of 3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR-125b-5p Comparing the expression level of the normal control sample.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, 신장이식 후 불량한 예후를 갖는 것으로 예측하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the information providing method is (c) measured in step (a), hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa -miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328 -5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p , hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of -125b-5p is higher than the expression level in the normal control sample, predicting that a kidney transplant has a poor prognosis may be further included.
또한, 제4 양태로서 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 신장이식 후 불량한 예후의 환자의 신장이식 거부반응 치료제 및/또는 BK 바이러스 신병증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:In addition, as a fourth aspect, the present invention provides a screening method for a treatment for kidney transplant rejection and/or a treatment for BK virus nephropathy in a patient with a poor prognosis after a kidney transplant, comprising the following steps:
(a) 시료에 신장이식 거부반응 치료제 및/또는 BK 바이러스 신병증 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및(a) treating the sample with a candidate substance for the treatment of kidney transplant rejection and/or the treatment of BK virus nephropathy; And
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.(b) hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR in the sample treated with the candidate substance -31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455 -3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p , hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR-125b-5p of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of Measuring the expression level.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 스크리닝 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된, hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (a) 단계에서 처리한 후보물질을 신장이식 거부반응 치료제 및/또는 BK 바이러스 신병증 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the screening method is (c) measured in step (b), hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa- miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328- 5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR- When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of 125b-5p is more suppressed in the sample not treated with the candidate material, the candidate material treated in step (a) is used as a kidney transplant rejection treatment agent and/or It may further include the step of determining as a therapeutic agent for BK virus nephropathy.
본 발명에 따른 다양한 조합의 miRNA 유전자를 포함하는 바이오마커 조성물은 신장이식 후 항체 매개성 거부반응을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 신장이식 후 항체 매개성 거부반응을 T 세포 매개성 거부반응 및/또는 BK 바이러스 신병증과 구분하여 진단하는 것이 가능하고, 신장이식 거부반응과 신장 이식 후 BK 바이러스 신병증을 구분하여 진단하는 것 또한 가능하여, 신장이식 거부반응의 원인을 보다 세밀하고 정확하게 진단할 수 있고, 이에 따라 환자 맞춤별 치료방법을 제공함으로써 신장이식 후에 나타나는 다양한 증상을 원인에 따라 효과적으로 치료할 수 있다.The biomarker composition comprising various combinations of miRNA genes according to the present invention can diagnose antibody-mediated rejection after kidney transplantation, as well as T cell-mediated rejection and/or antibody-mediated rejection after kidney transplantation. It is possible to diagnose BK virus nephropathy separately, and it is also possible to diagnose kidney transplant rejection reaction and BK virus nephropathy after kidney transplantation, so that the cause of kidney transplant rejection can be diagnosed more precisely and accurately. Accordingly, by providing a treatment method tailored to each patient, various symptoms appearing after a kidney transplant can be effectively treated according to the cause.
도 1은 항체 매개성 거부반응군 (ABMR), T 세포 매개성 거부반응군 (TCMR) 및 BK 바이러스 신병증군 (BKVN)을 대표하는 바이오마커의 선발 과정을 나타낸 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 중요 데이터에 대하여, 발현 수준이 유사한 샘플 및 성숙 miRNA를 그룹화하는 계층적 군집 분석 (유리클리드 방법, 완전 연관)을 수행하고, 이를 히트맵으로 나타낸 것이다.
도 3은 1차 및 2차 선별 과정을 통해 선별된 miRNA 유전자를 나타낸 것으로, 도 3(A)는 정상 대조군 (NOMOA)을 기준으로 발현이 2배 이상 증가한 miRNA 유전자는 빨간색으로 표시하였고, 정상 대조군 (NOMOA)을 기준으로 발현이 2배 이상 감소한 miRNA 유전자는 녹색으로 표시하여 나타낸 것이고, 도 3(B)는 정상 대조군 (NOMOA)과 비교하여 각각 항체 매개성 거부반응군 (ABMR), T 세포 매개성 거부반응군 (TCMR) 및 BK 바이러스 신병증군 (BKVN)에서 발현 수준이 2배 이상 차이나는 상향 조절된 miRNA 유전자를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4(A)는 항체 매개성 거부반응군 (ABMR)의 바이오마커 후보 중, 항체 매개성 거부반응군 (TCMR) 및 BK 바이러스 신병증군 (BKVN)과 비교하여 현저한 발현 양상의 차이를 보이는 5종의 miRNA 유전자를 나타낸 것이고, 도 4(B)는 상기 5종의 miRNA 유전자가 정상 대조군 (NOMOA) 대비 항체 매개성 거부반응군 (ABMR)에서 2배 이상 증가된 발현 수준을 나타낸다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 5(A)는 T 세포 매개성 거부반응군 (TCMR)의 바이오마커 후보 중, 항체 매개성 거부반응군 (ABMR) 및 BK 바이러스 신병증군 (BKVN)과 비교하여 현저한 발현 양상의 차이를 보이는 5종의 miRNA 유전자를 나타낸 것이고, 도 5(B)는 상기 5종의 miRNA 유전자가 정상 대조군 (NOMOA) 대비 T 세포 매개성 거부반응군 (TCMR)에서 2배 이상 증가된 발현 수준을 나타낸다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 6(A)는 BK 바이러스 신병증군 (TCMR)의 바이오마커 후보 중, 항체 매개성 거부반응군 (ABMR) 및 T 세포 매개성 거부반응군 (TCMR)과 비교하여 현저한 발현 양상의 차이를 보이는 5종의 miRNA 유전자를 나타낸 것이고, 도 6(B)는 상기 5종의 miRNA 유전자가 정상 대조군 (NOMOA) 대비 BK 바이러스 신병증군 (TCMR)에서 2배 이상 증가된 발현 수준을 나타낸다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 7은 통계분석 후 정상 대조군(NOMOA)과 비교하여 항체 매개성 거부반응군(ABMR), T 세포 매개성 거부반응군(TCMR) 및 BK 바이러스 신병증군(BKVN)에서 각각 다른 군과 유의적으로 상이하게 발현되는 소변 엑소좀 miRNA 유전자를 확인하여 벤다이어그램으로 나타낸 것이다.
도 8은 건장한 대조군, 정상 대조군 (NOMOA) 및 항체 매개성 거부반응군(ABMR)에서 3종의 miRNA 유전자 바이오마커 miRNA-445-3p, miRNA-126-3p 및 miRNA-221-3p의 발현 수준 및 각 miRNA 유전자 바이오마커의 ROC (Receiver-Operating Characteristic) 곡선을 나타낸 것이다.1 is a schematic diagram showing the selection process of biomarkers representing antibody-mediated rejection group (ABMR), T cell mediated rejection group (TCMR), and BK virus nephropathy group (BKVN).
2 is a hierarchical cluster analysis (Uriclid method, fully correlated) for grouping samples with similar expression levels and mature miRNAs for important data, and this is shown as a heat map.
3 shows the miRNA genes selected through the first and second screening processes, and FIG. 3(A) shows the miRNA genes whose expression increased by more than 2 times based on the normal control (NOMOA) is shown in red, and the normal control The miRNA gene whose expression was reduced by more than 2 times based on (NOMOA) is shown in green, and FIG. 3(B) shows the antibody-mediated rejection group (ABMR) and T-cell mediated compared to the normal control group (NOMOA), respectively. It shows the result of confirming the upregulated miRNA gene whose expression level differs by more than 2 times in the sexual rejection group (TCMR) and BK virus nephropathy group (BKVN).
Figure 4(A) is five kinds of biomarker candidates in the antibody-mediated rejection group (ABMR) showing a significant difference in expression patterns compared to the antibody-mediated rejection group (TCMR) and the BK virus nephropathy group (BKVN). 4(B) is a graph showing that the 5 types of miRNA genes exhibit a 2-fold or more increased expression level in the antibody-mediated rejection group (ABMR) compared to the normal control (NOMOA). .
Figure 5 (A) is a T cell mediated rejection group (TCMR) of the biomarker candidates, compared to the antibody-mediated rejection group (ABMR) and BK virus nephropathy group (BKVN) 5 showing a significant difference in expression patterns. It shows the miRNA gene of the species, Figure 5 (B) shows that the expression level of the five miRNA genes increased more than two times in the T cell mediated rejection group (TCMR) compared to the normal control (NOMOA). It is a graph.
6(A) is 5 showing a significant difference in expression patterns compared to the antibody-mediated rejection group (ABMR) and the T cell mediated rejection group (TCMR) among biomarker candidates for BK virus nephropathy (TCMR). Species miRNA genes are shown, and FIG. 6(B) is a graph showing that the 5 types of miRNA genes exhibit a 2-fold or more increased expression level in the BK virus nephropathy group (TCMR) compared to the normal control (NOMOA).
Figure 7 is significantly different from the other groups in the antibody-mediated rejection group (ABMR), T cell mediated rejection group (TCMR), and BK virus nephropathy group (BKVN) compared to the normal control group (NOMOA) after statistical analysis. The urine exosome miRNA gene expressed differently was identified and shown as a Venn diagram.
Figure 8 shows the expression levels of the three miRNA gene biomarkers miRNA-445-3p, miRNA-126-3p, and miRNA-221-3p in the robust control, normal control (NOMOA), and antibody-mediated rejection group (ABMR). It shows the ROC (Receiver-Operating Characteristic) curve of each miRNA gene biomarker.
상술한 바와 같이, 신장이식 후 항체 매개성 거부반응을 진단할 수 있는 miRNA 유전자 바이오마커, 신장이식 후 항체 매개성 거부반응을 T 세포 매개성 거부반응 및 BK 바이러스 신병증과 구분하여 진단할 수 있는 miRNA 유전자 바이오마커, 및/또는 신장이식 거부반응과 신장 이식 후 BK 바이러스 신병증을 구분하여 진단할 수 있는 miRNA 바이오마커를 발굴하고 이를 신장이식 후 치료 방향의 선택 및 치료 경과 판단에 활용하고자 하는 연구는 전무한 실정이다. 이에, 본 발명자들은 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 (ABMR), T 세포 매개성 거부반응 (TCMR) 및 BK 바이러스 신병증 (BKVN)을 구분하여 진단할 수 있는 특정 소변 엑소좀 miRNA 유전자 바이오마커를 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명에 따른 다양한 조합의 miRNA 유전자를 포함하는 바이오마커 조성물은 신장이식 후 항체 매개성 거부반응을 T 세포 거부반응 및/또는 BK 바이러스 신병증과 구분하여 진단하는 것이 가능하여, 신장이식 거부반응의 원인을 보다 세밀하고 정확하게 진단할 수 있고, 이에 따라 환자 맞춤별 치료방법을 제공함으로써 신장이식 후에 나타나는 다양한 증상을 원인에 따라 효과적으로 치료할 수 있다.As described above, a miRNA gene biomarker that can diagnose antibody-mediated rejection after kidney transplantation, and antibody-mediated rejection after kidney transplantation can be diagnosed separately from T cell-mediated rejection and BK virus nephropathy. Research to discover miRNA gene biomarkers and/or miRNA biomarkers that can differentiate and diagnose BK virus nephropathy after kidney transplant rejection and kidney transplantation, and use them for selection of treatment directions and treatment progress after kidney transplantation. There is no situation. Accordingly, the present inventors have developed a specific urine exosome miRNA gene biomarker capable of distinguishing and diagnosing antibody-mediated rejection (ABMR), T cell-mediated rejection (TCMR) and BK virus nephropathy (BKVN) after kidney transplantation By providing it, a solution to the above-described problem was sought. The biomarker composition comprising various combinations of miRNA genes according to the present invention can diagnose antibody-mediated rejection after kidney transplantation by distinguishing it from T cell rejection and/or BK virus nephropathy. The cause can be diagnosed more precisely and accurately, and accordingly, various symptoms that appear after kidney transplant can be effectively treated according to the cause by providing a treatment method tailored to the patient.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.All technical terms used in the present invention, unless otherwise defined, are used in the same meaning as those of ordinary skill in the art generally understand in the related field of the present invention. In addition, although preferred methods or samples are described in the present specification, those similar or equivalent are included in the scope of the present invention.
본 발명의 제1 양태는 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자를 포함하는, 항체 매개성 거부반응(Antibody mediated rejection, ABMR)을 진단하기 위한 바이오마커 조성물에 관한 것이다.The first aspect of the present invention is hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR -192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221-3p comprising any one or more miRNA genes selected from the group consisting of, antibody-mediated It relates to a biomarker composition for diagnosing antibody mediated rejection (ABMR).
상기 10종의 miRNA 유전자 바이오마커에 대한 정보는 표 1과 같다.Information on the 10 miRNA gene biomarkers is shown in Table 1.
본 발명에서, 용어 "miRNA"는 특별히 언급하지 않는 한, 헤어핀 모양 구조의 RNA 전구체로서 전사되고, RNase III 절단 활성을 갖는 dsRNA 절단 효소에 의해 절단되어 RISC라고 칭하는 단백질 복합체에 도입되고, mRNA의 번역 억제에 관여하는 15~25염기의 비코딩 RNA를 의도하여 사용된다. 또한, 본 발명에서 사용하는 miRNA는 특정 염기서열(또는 서열번호)로 나타내어지는 miRNA뿐만 아니라 상기 miRNA의 전구체(pre-miRNA, primiRNA), 이들과 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들면 동족체(즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자다형 등의 변이체, 및 유도체도 포함한다. 이러한 전구체, 동족체, 변이체 또는 유도체로서는 구체적으로는 miRBase release 20(http://www.mirbase.org/)에 의해 동정할 수 있고, 엄격한 조건 하에서 miRNA의 상보서열과 혼성화되는 염기서열을 갖는 miRNA를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 언급된 miRNA는 miR 유전자의 유전자산물일 수 있고, 그러한 유전자산물은 성숙 miRNA(예를 들면, 상기와 같은 mRNA의 번역 억제에 관여하는 15~25염기 또는 19~25염기의 비코딩 RNA) 또는 miRNA 전구체(예를 들면, 상기와 같은 pre-miRNA 또는 pri-miRNA)를 포함한다.In the present invention, the term "miRNA" is transcribed as an RNA precursor having a hairpin-like structure, and is cleaved by a dsRNA cleavage enzyme having RNase III cleavage activity, and introduced into a protein complex called RISC, unless otherwise noted, translation of mRNA Non-coding RNA of 15 to 25 bases involved in inhibition is intended and used. In addition, the miRNA used in the present invention is not only a miRNA represented by a specific nucleotide sequence (or sequence number), but also a precursor of the miRNA (pre-miRNA, primiRNA), a miRNA having a biological function equivalent to these, for example, a homologue (i.e. Homologs or orthologs), polymorphisms, and other variants, and derivatives. As such a precursor, homologue, variant or derivative, it can be specifically identified by miRBase release 20 (http://www.mirbase.org/), and a miRNA having a base sequence that hybridizes with the complementary sequence of miRNA under stringent conditions Can be lifted. In addition, the miRNA mentioned in the present invention may be a gene product of the miR gene, and such a gene product is a mature miRNA (e.g., a ratio of 15 to 25 bases or 19 to 25 bases involved in the translational inhibition of such mRNA. Coding RNA) or miRNA precursors (eg, pre-miRNA or pri-miRNA as above).
본 발명에서, 용어"핵산"이란 RNA, DNA, 및 RNA/DNA(키메라) 모두 포함하는 핵산에 대하여 사용된다. 또한, 상기 DNA에는 cDNA, 게놈DNA, 및 합성DNA 모두가 포함된다. 또한, 상기 RNA에는 total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, 비코딩(non-coding)RNA 및 합성RNA 모두가 포함된다. 본 발명에 있어서 "합성DNA" 및 "합성RNA"는 소정의 염기서열(천연형 서열 또는 비천연형 서열 중 어느 것이어도 좋음)에 의거하여, 예를 들면 자동핵산 합성기를 사용하여 인공적으로 제작된 DNA 및 RNA를 말한다. 본 발명에 있어서 "비천연형 서열"은 광의의 의미로 사용하는 것을 의도하고 있고, 천연형 서열과 상이한, 예를 들면 1 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 서열(즉, 변이 서열), 1 이상의 수식 뉴클레오티드를 포함하는 서열(즉, 수식 서열) 등을 포함한다. 또한, 본 발명에서는 폴리뉴클레오티드는 핵산과 호환적으로 사용된다.In the present invention, the term "nucleic acid" is used for a nucleic acid including both RNA, DNA, and RNA/DNA (chimera). In addition, the DNA includes all of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. In addition, the RNA includes all of total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, non-coding RNA, and synthetic RNA. In the present invention, "synthetic DNA" and "synthetic RNA" are artificially produced using, for example, an automatic nucleic acid synthesizer based on a predetermined nucleotide sequence (either natural sequence or non-natural sequence may be used). Refers to DNA and RNA. In the present invention, the "non-natural sequence" is intended to be used in a broad sense, and different from the native sequence, for example, a sequence including substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more nucleotides (ie , A variant sequence), a sequence containing one or more modified nucleotides (ie, a modified sequence), and the like. In addition, in the present invention, polynucleotides are used interchangeably with nucleic acids.
본 발명에서 용어 "신장이식 거부반응(renal allograft rejection)"은 공여자의 신장을 이식받은 수여자의 면역 체계가 이식된 신장을 외부 항원으로 인식하여 일어나는 일련의 면역 반응을 의미하며, 발생기전과 신생검 소견에 따라 항체-매개성 거부반응(Antibody mediated rejection, ABMR), T 세포 매개성 거부반응(T cell mediated rejection, TCMR), 및 이들 모두가 복합적으로 나타나는 혼합 거부반응(mixed rejection)으로 분류될 수 있다.In the present invention, the term "renal allograft rejection" refers to a series of immune reactions that occur when the recipient's immune system, who has received the donor's kidney, recognizes the transplanted kidney as an external antigen. Depending on the findings, it can be classified into antibody-mediated rejection (ABMR), T cell mediated rejection (TCMR), and mixed rejection in which all of them appear in combination. have.
본 발명에서 상기 신장이식의 거부반응은 항체 매개성 거부반응, T 세포 매개성 거부반응 및 혼합 거부반응을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 급성 T 세포 매개 거부 반응(Acute T cell mediated rejection, TCMR), 만성 항체-매개 거부반응(chronic antibody mediated rejection, CAMR), 활성형 항체-매개 거부반응(active antibody mediated rejection), 만성 활성형 T 세포 매개 거부반응(chronic active T cell mediated rejection) 및 혼합 거부반응(mixed rejection)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.In the present invention, the rejection reaction of the kidney transplant may include both antibody-mediated rejection, T cell-mediated rejection, and mixed rejection, and preferably, acute T cell mediated rejection (TCMR). ), chronic antibody mediated rejection (CAMR), active antibody mediated rejection, chronic active T cell mediated rejection, and mixed rejection It may be selected from the group consisting of reactions (mixed rejection).
본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 바이오마커는 신장이식 후 거부반응이 나타나는지 또는 BK 바이러스 신병증이 나타나는지 확인할 수 있는 miRNA 유전자 또는 신장이식 후 예후가 양호하거나 불량한 환자를 예측해내는 기준이 되는 유전자를 지칭한다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.The term "biomarker" of the present invention refers to a molecule that is quantitatively or qualitatively associated with the presence of a biological phenomenon, and the biomarker of the present invention is a miRNA gene that can confirm whether a rejection reaction or BK virus nephropathy appears after a kidney transplant. Or it refers to a gene that is a criterion for predicting a patient with a good or poor prognosis after a kidney transplant. The term includes a nucleic acid sequence that is complementary to or flanked by a marker sequence, such as a nucleic acid used as a probe or primer pair capable of amplifying the marker sequence.
본 발명에 있어서, 용어 "예후"는 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 또는 불량한 예후)를 포함하며, 본 발명에서 상기 음성적 예후는 신장이식 후에 나타나는 다양한 거부반응 또는 질환이 발생하는 것을 포함하고, 양성적 예후는 신장이식 후 거부반응 또는 질환이 발생하지 않는 것을 의미한다.In the present invention, the term "prognosis" means a prediction for medical consequences (eg, long-term viability, disease-free survival rate, etc.), and includes a positive prognosis (positive prognosis) or a negative prognosis (negative or poor prognosis), In the present invention, the negative prognosis means that various rejection reactions or diseases occur after kidney transplantation, and the positive prognosis means that rejection reactions or diseases do not occur after kidney transplantation.
본 발명에 있어서, 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 신장이식을 받은 환자의 반응(다양한 신장이식 거부반응, BK 바이러스 감염성 질환 등의 발병 등)을 미리 짐작하는 것을 의미한다.In the present invention, the term "prediction" means a preliminary guess for medical consequences, and for the purposes of the present invention, reactions of patients who have undergone a kidney transplant (various kidney transplant rejection reactions, onset of BK virus infectious diseases, etc.) It means to guess in advance.
본 발명자들은 신장이식 환자들 중에서 조직검사 상 주요한 이상소견이 없는 정상 대조군(no major abnormality, NOMOA)과 비교하여 항체 매개성 거부반응(ABMR)을 나타내는 환자의 소변에서 전술한 10종의 miRNA 유전자 발현이 2배 이상 증가하며, 통계분석 결과 p-value 값이 0.05 이하로 유의성을 나타내므로, 이들 miRNA 유전자 바이오마커를 항체 매개성 거부반응의 진단 마커로서 활용할 수 있음을 알 수 있었다.The present inventors expressed the above-described 10 kinds of miRNA genes in the urine of patients with antibody-mediated rejection (ABMR) compared to a no major abnormality (NOMOA) among kidney transplant patients. This increases by more than two times, and the statistical analysis shows that the p-value value is less than 0.05, indicating that these miRNA gene biomarkers can be used as diagnostic markers for antibody-mediated rejection.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장이식 후 항체 매개성 거부반응을 진단하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.With respect to the first aspect, the present invention provides hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, The expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221-3p It provides a composition for diagnosing antibody-mediated rejection after kidney transplantation, including an agent to be measured, and a kit including the same.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p , hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-221-3p The agent for measuring may include a primer or probe that specifically binds to the gene.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 miRNA 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 신장이식의 거부반응을 진단하거나 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 본 발명에서, 상기 유전자의 mRNA 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머 서열은 miRNA 유전자 바이오마커의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다.In the present invention, the term "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3'hydroxyl group, which can form a complementary template and a base pair, and serves as a starting point for copying a template. It refers to a short functional nucleic acid sequence. In the present invention, PCR amplification is performed using the sense and antisense primers of the miRNA gene, and the rejection reaction of a kidney transplant can be diagnosed or the prognosis can be predicted through whether a desired product is generated. The PCR conditions, the length of the sense and antisense primers can be modified based on those known in the art. In the present invention, the primers used to amplify the mRNA of the gene are appropriate conditions in an appropriate buffer (e.g., 4 different nucleoside triphosphates and a polymerization agent such as DNA, RNA polymerase or reverse transcriptase) and an appropriate temperature. It may be a single-stranded oligonucleotide that can serve as a starting point for template-directed DNA synthesis under, and the appropriate length of the primer may vary depending on the purpose of use. The primer sequence need not be completely complementary to the polynucleotide of the miRNA gene biomarker or the polynucleotide complementary thereto, and can be used as long as it is sufficiently complementary to hybridize.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 miRNA 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 신장이식의 거부반응을 진단 또는 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.In the present invention, the term "probe" refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a short number of bases to several hundred bases capable of specific binding to mRNA, and is labeled You can check the presence or absence of a specific mRNA. The probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like. In the present invention, hybridization is performed using a probe complementary to the miRNA gene, and the rejection reaction of a kidney transplant can be diagnosed or the prognosis can be predicted through hybridization. Selection of suitable probes and conditions for hybridization can be modified based on those known in the art.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The primer or probe of the present invention can be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support method or other well known method. Such nucleic acid sequences can also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution with one or more homologues of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers (e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoro Amidates, carbamates, etc.) or with charged linkers (eg phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
본 발명에서 이용되는 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 염기서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, miRNA 유전자에 특이적으로 결합하는 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 특정 서열을과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 동일성, 더욱 구체적으로 70%의 동일성, 더더욱 구체적으로 80%의 동일성, 가장 구체적으로 90%의 동일성을 나타내는 서열을 의미한다.The base sequence of the agent for measuring the expression level of the miRNA gene used in the present invention is a sequence diagram showing substantial identity with the sequence that specifically binds to the miRNA gene, considering a mutation having biologically equivalent activity. Is to be interpreted as including. The term,'substantial identity', is aligned to match a specific sequence and any other sequence as much as possible, and when the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art, at least 60 % Identity, more specifically 70% identity, even more specifically 80% identity, most specifically 90% identity.
본 발명의 키트는 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)과 같은 실시간 PCR (RT-PCR) 키트, 마이크로어레이 키트 또는 SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 예로, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, miRNA 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 DNA, RNA 또는 miRNA에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.The kit of the present invention may be a real-time PCR (RT-PCR) kit such as quantitative real-time PCR (qRT-PCR), a microarray kit, or a Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) kit, but is not limited thereto. As a specific example, the kit may be a kit including essential elements necessary to perform RT-PCR. For example, RT-PCR kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers (varies in pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), didioxynucleotides (ddNTPs), in addition to each primer specific for the miRNA gene. ), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitor, DEPC-water, sterile water, and the like. In addition, a primer pair specific for DNA, RNA or miRNA used as a quantitative control may be included.
본 발명의 키트에는 체액, 세포 또는 조직으로부터 핵산(예를 들면, total RNA)을 추출하기 위한 키트, 표지용 형광물질, 핵산 증폭용 효소 및 배지, 사용 설명서 등을 포함시킬 수 있다.The kit of the present invention may include a kit for extracting a nucleic acid (eg, total RNA) from a body fluid, cell or tissue, a fluorescent substance for labeling, an enzyme and a medium for amplifying nucleic acid, and instructions for use.
본 발명의 키트는 상기 핵산이, 예를 들면 고상에 결합 또는 부착된 파킨슨병 마커 측정을 위한 디바이스이다. 고상의 재질의 예는 플라스틱, 종이, 유리, 실리콘 등이며, 가공의 용이함으로부터 바람직한 고상의 재질은 플라스틱이다. 고상의 형상은 임의이며, 예를 들면 사각형, 원형, 직사각형, 필름형 등이다.The kit of the present invention is a device for measuring a Parkinson's disease marker to which the nucleic acid is bound or attached to, for example, a solid phase. Examples of the solid material are plastic, paper, glass, silicone, and the like, and the preferred solid material from the ease of processing is plastic. The shape of the solid phase is arbitrary, for example, a square, a circle, a rectangle, a film shape, etc.
본 발명의 키트는 상기 miRNA의 적어도 1개와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함할 수 있다.The kit of the present invention may contain a nucleic acid capable of specifically binding to at least one of the miRNAs.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:With respect to the first aspect, the present invention also provides a method of providing information for diagnosis of antibody mediated rejection after kidney transplantation comprising the following steps:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및(a) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, in biological samples isolated from individuals The expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221-3p Measuring; And
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.(b) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a- measured in step (a) Expression of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of 3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221-3p Comparing the level to a normal control sample.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 용어 "개체"는 신장이식 거부반응이 나타나거나 BK 바이러스 신병증이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 인간, 침팬지를 포함한 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 마우스, 래트 등의 설치 류 등의 포유동물을 포함하는 의미로 해석된다.In the information providing method of the present invention, the term "individual" refers to humans, primates including chimpanzees, dogs, cats, etc., and cattle with a possibility of developing kidney transplant rejection or developing BK virus nephropathy. , It is interpreted to include domestic animals such as horses, sheep and goats, and mammals such as rodents such as mice and rats.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 분석을 위해 사용되는 "시료"는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 복수, 질 분비물, 소변, 대변 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 신장이식 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증에 특이적인 miRNA 유전자를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변일 수 있으며, 가장 바람직하게는 소변 또는 소변 유래 엑소좀일 수 있다.In the information providing method of the present invention, the "sample" used for analysis is a kidney transplant rejection reaction that can be distinguished from normal conditions such as blood, plasma, serum, saliva, nasal fluid, sputum, ascites, vaginal discharge, urine, and feces. Or a biological sample capable of identifying a miRNA gene specific for BK virus nephropathy. Preferably, it may be a biological liquid sample, such as blood, serum, plasma or urine, and most preferably, it may be a urine or urine-derived exosome.
본 발명에서 용어 "엑소좀"은 세포에서 유래된 지질 이중층의 소낭(vesicle)을 의미한다. 엑소좀은 세포 또는 조직으로부터 유래한 고유의 단백질 및 핵산 등을 포함하고 있으며, 다양한 질환의 진단 등에 사용될 수 있는 RNA, miRNA 등의 바이오마커가 다량 포함되어 있다.In the present invention, the term "exosomes" refers to vesicles of a lipid bilayer derived from cells. Exosomes contain unique proteins and nucleic acids derived from cells or tissues, and contain a large amount of biomarkers such as RNA and miRNA that can be used for diagnosis of various diseases.
본 발명의 정보제공방법은 공지된 다양한 시험방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 혼성화법, 면역분석(immunoassay) 방법 또는 유전자 증폭방법을 이용하여 실시할 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.The information providing method of the present invention may be performed using a variety of known test methods, for example, a hybridization method, an immunoassay method, or a gene amplification method, but is not limited thereto.
상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 miRNA의 존재를 확인하는 것일 수 있다.The hybridization method may be to confirm the presence of miRNA using a probe.
본 발명의 정보제공방법이 혼성화 방식 중 마이크로어레이 방식으로 실시되는 경우, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화 된다. 바람직한 기질은 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기질 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예컨대, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.When the information providing method of the present invention is implemented in a microarray method among hybridization methods, the probe is used as a hybridizable array element and is immobilized on a substrate. Preferred substrates are rigid or semi-rigid supports, including, for example, membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries. The hybridization array element is arranged and immobilized on the substrate. Such immobilization is carried out by a chemical bonding method or a covalent bonding method such as UV. For example, the hybridization array element can be bonded to a glass surface modified to contain an epoxy compound or an aldehyde group, and can also be bonded to a polylysine coated surface by UV. In addition, the hybridization array element may be bonded to the substrate through a linker (eg, ethylene glycol oligomer and diamine).
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 변경할 수 있다. 또한, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.Meanwhile, the sample DNA applied to the microarray of the present invention may be labeled and hybridized with the array element on the microarray. Hybridization conditions can be changed in various ways. In addition, detection and analysis of the degree of hybridization may be performed in various ways depending on the labeling material.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 또는 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.The label of the probe can provide a signal to detect hybridization, which can be linked to an oligonucleotide. Suitable labels are fluorophores (e.g., fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia)), terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), chromophore, chemiluminescence. However, magnetic particles, radioactive isotopes (P32 or S35), mass labels, electron condensing particles, enzymes (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase), cofactors, substrates for enzymes, heavy metals (eg, gold), and Antibodies, streptavidin, biotin, digoxigenin, and haptens having specific binding partners such as a chelating group are included, but are not limited thereto. Labeling can be carried out by various methods commonly practiced in the art, such as nick translation method, random priming method (Multiprime DNA labeling systems booklet, "Amersham" (1989)) and kineation method (Maxam & Gilbert, Methods. in Enzymology, 65:499 (1986)). The label provides a signal that can be detected by fluorescence, radioactivity, colorimetric measurement, gravimetric measurement, X-ray diffraction or absorption, magnetic, enzymatic activity, mass analysis, binding affinity, high frequency hybridization, and nanocrystals.
혼성화 방법에서 분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료(biosamples)에서 얻은 RNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생물학적 시료는, 바람직하게는 장상피세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.A nucleic acid sample to be analyzed in the hybridization method can be prepared using RNA obtained from various biosamples. The biological sample is preferably intestinal epithelial cells. Instead of a probe, a hybridization reaction-based analysis may be performed by labeling the cDNA to be analyzed.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.When using a probe, the probe is hybridized with a cDNA molecule. In the present invention, suitable hybridization conditions can be determined in a series of processes by an optimization procedure. This procedure is performed as a series of procedures by a person skilled in the art to establish a protocol for use in the laboratory. For example, conditions such as temperature, concentration of components, hybridization and washing times, buffer components, and their pH and ionic strength depend on various factors such as the length of the probe and the amount of GC and the target nucleotide sequence. Detailed conditions for hybridization include Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); And M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. It can be found in N.Y. (1999).
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.After the hybridization reaction, a hybridization signal generated through the hybridization reaction is detected. The hybridization signal can be performed in various ways depending on the type of label bound to the probe, for example. For example, when the probe is labeled with an enzyme, it is possible to confirm whether or not hybridization has occurred by reacting a substrate of this enzyme with a result of hybridization reaction. Combinations of enzymes/substrates that can be used include peroxidase (e.g. horseradish peroxidase) and chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methylacridinium nit Rate), resorupine benzyl ether, luminol, amplex red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2, 2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD) and naphthol/pyronine; Alkaline phosphatase and bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate and ECF substrate; Glucose oxidase, nitroblue tetrazolium (t-NBT) and phenzaine methosulfate (m-PMS). When the probe is labeled with gold particles, it can be detected by a silver staining method using silver nitrate.
생물학적 시료에서 상기 miRNA의 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료보다 상향 조절 (up-regulation)되는 경우에는 신장이식 후 항체 매개성 거부반응으로 진단된다.When the hybridization signal for the miRNA sequence in a biological sample is up-regulated than that of a normal sample, it is diagnosed as antibody-mediated rejection after kidney transplantation.
본 발명의 정보제공방법은 면역분석 방법에 의해 실시될 수 있다. 상기 면역분석 방법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA), inMethodsinMolecularBiology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, UsingAntibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.The information providing method of the present invention can be carried out by an immunoassay method. The immunoassay methods include radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), capture-ELISA, inhibition or hardwood analysis, sandwich analysis, flow cytometry, immunofluorescence staining, and immunohistochemistry. Including, but not limited to, chemical tablets. The immunoassay method was described in Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA), in Methodsin Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; And Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, which is incorporated herein by reference.
본 발명의 정보제공방법은 유전자 증폭방법에 의해 실시될 수 있다. 유전자 증폭방법을 이용한 miRNA의 검출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 이 경우 miRNA의 프라이머 또는 프로브가 이용될 수 있다. 프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 상기 miRNA의 유전자의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 miRNA 유전자의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 소변 유래 엑소좀)에서 마커의 mRNA 양을 조사하여 마커의 유전자의 발현 정도를 결정한다. 따라서 본 발명은 원칙적으로 생물학적 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.The information providing method of the present invention can be implemented by a gene amplification method. The detection of miRNA using the gene amplification method may be performed using various methods known in the art, and in this case, a miRNA primer or probe may be used. In the case of using a primer, a gene amplification reaction is performed to examine the level of expression of the miRNA gene. Since the present invention analyzes the level of expression of the miRNA gene, the level of expression of the gene of the marker is determined by examining the amount of mRNA of the marker in a sample to be analyzed (eg, exosomes derived from urine). Therefore, in principle, the present invention performs a gene amplification reaction using mRNA in a biological sample as a template and using a primer that binds to mRNA or cDNA.
우선, mRNA를 얻기 위하여 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., MolecularCloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold pring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., PlantMol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., CurrentProtocolsinMolecularBiology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다.First, total RNA is isolated from the sample to obtain mRNA. Isolation of total RNA can be carried out according to conventional methods known in the art (see: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold pring Harbor Press (2001); Tesniere, C. et al., PlantMol. Biol. Rep., 9:242 (1991); Ausubel, FM et al., Current Protocol in Molecular Biology, John Willey & Sons (1987); And Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156 (1987)). For example, it is possible to easily isolate total RNA in cells using Trizol.
이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A LaboratoryManual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다. 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, MolecularCloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A PracticalApproach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.Then, cDNA is synthesized from the isolated mRNA, and this cDNA is amplified. Since the total RNA of the present invention is isolated from a human sample, it has a poly-A tail at the end of the mRNA, and cDNA can be easily synthesized using oligo dT primers and reverse transcriptase using such sequence properties ( See: PNAS USA, 85:8998 (1988); Libert F, et al., Science, 244:569 (1989); And Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press. (2001)). Then, the synthesized cDNA is amplified through a gene amplification reaction. The primer used in the present invention is hybridized or annealed at one site of the template to form a double-chain structure. Conditions for nucleic acid hybridization suitable for forming such a double-stranded structure are Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) and Haymes, BD, et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcusfuriosus(Pfu)를 포함한다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실상, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.Various DNA polymerases can be used for the amplification of the present invention, and include the "Klenow" fragment of E. coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase and bacteriophage T7 DNA polymerase. Polymerases are thermostable DNA polymerases that can be obtained from various bacterial species, including Thermus aquaticus (Taq), Thermusthermophilus (Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis, and Pyrococcusfuriosus (Pfu). When carrying out the polymerization reaction, it is preferable to provide the reaction vessel with the components necessary for the reaction in excess. The excessive amount of components required for the amplification reaction means an amount such that the amplification reaction is not substantially limited to the concentration of the component. Cofactors such as Mg2+, dATP, dCTP, dGTP and dTTP are preferably provided to the reaction mixture to the extent that the desired degree of amplification can be achieved. All enzymes used in the amplification reaction may be active under the same reaction conditions. In fact, the buffer allows all enzymes to approach optimal reaction conditions. Therefore, the amplification process of the present invention can be carried out in a single reactant without changing conditions such as addition of reactants.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 표적 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.In the present invention, annealing or hybridization is performed under stringent conditions that allow specific binding between the target nucleotide sequence and the primer. Stringent conditions for annealing are sequence-dependent and vary according to environmental variables.
본 명세서의 용어"증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A LaboratoryManual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. 본 발명의 유전자 증폭방법은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시될 수 있다.As used herein, the term "amplification reaction" refers to a reaction to amplify a nucleic acid molecule. Various amplification reactions have been reported in the art, which are polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR) (U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,800,159), reverse transcription-polymerase chain reaction (hereinafter referred to as RT-PCR). (Sambrook et al., Molecular Cloning.A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), Miller, HI (WO 89/06700) and Davey, C. et al. (EP 329,822), ligase chain reaction (ligase chain reaction; LCR) (17, 18), Gap-LCR (WO 90/01069), repair chain reaction (EP 439,182), transcription-mediated amplification (TMA) (19) (WO 88/10315), self sustained sequence replication (20) (WO 90/06995), selective amplification of target polynucleotide sequences (U.S. Patent No. 6,410,276), Consensus sequence primed polymerase chain reaction (CP-PCR) (U.S. Patent No. 4,437,975) and loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Other amplification methods that can be used are described in U.S. Patent Nos. 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617 and U.S. Patent No. 09/854,317. The gene amplification method of the present invention may be carried out according to a polymerase chain reaction (PCR) disclosed in U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,800,159.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.PCR is the most well-known nucleic acid amplification method, and its many modifications and applications have been developed. For example, touchdown PCR, hot start PCR, nested PCR and booster PCR have been developed by modifying traditional PCR procedures to enhance the specificity or sensitivity of PCR. In addition, real-time PCR, differential display PCR (DD-PCR), rapid amplification of cDNA ends (RACE), multiplex PCR, inverse polymerase chain reaction chain reaction (IPCR), vectorette PCR, thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR), and multiplex PCR have been developed for specific applications. For more information on PCR, see McPherson, M.J., and Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000), the teachings of which are incorporated herein by reference.
본 발명에서 유전자 증폭방법에 이용되는 프라이머는 상기 miRNA의 cDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.The primer used in the gene amplification method in the present invention is an oligonucleotide having a sequence complementary to the cDNA sequence of the miRNA. Suitable lengths of primers are typically 15-30 nucleotides, although varying depending on various factors such as temperature and application of the primer. Short primer molecules generally require lower temperatures to form sufficiently stable hybrid complexes with the template.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머 세트는 주형인 상기 마커의 cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프라이머는 상기 마커의 cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 갖는 것일 수 있다.The sequence of the primer does not need to have a sequence that is completely complementary to some of the sequences of the template, and it is sufficient to have sufficient complementarity within the range capable of hybridizing with the template to perform a unique function of the primer. Therefore, the primer set in the present invention does not need to have a sequence that is completely complementary to the cDNA sequence of the marker, which is a template, and it is sufficient if it has sufficient complementarity within a range capable of hybridizing to this sequence and acting as a primer. Preferably, the primer used in the present invention may have a sequence perfectly complementary to the cDNA sequence of the marker.
이러한 프라이머의 디자인은 상기 miRNA의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.The design of such a primer can be easily carried out by a person skilled in the art by referring to the cDNA sequence of the miRNA, for example, it can be done using a primer design program (eg,
이렇게 증폭된 상기 마커의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 조사한다.The cDNA of the marker thus amplified is analyzed by a suitable method to examine the level of expression of the gene of the marker. For example, gel electrophoresis is performed on the result of the amplification reaction described above, and the resulting band is observed and analyzed to examine the level of expression of the gene of the marker.
상기 정상 대조군이란 신장이식을 받지 않은 정상인 또는 신장이식을 받았지만 안정적인 신장 기능이 발휘되며, 조직검사 상 주요한 이상소견이 없고, 항체 매개성 거부반응, T 세포 매개성 거부반응, 혼합 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증이 나타나지 않는 상태의 신장이식 환자 등이며, 이들 환자로부터 채취한 시료와 신장이식의 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증의 존재 또는 예후를 알고자 하는 환자로부터 채취한 시료에서 유전자 발현수준 또는 발현패턴을 수득하고, 비교함으로써 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.The normal control group is a normal person who has not received a kidney transplant or a person who has received a kidney transplant, but exhibits stable kidney function, has no major abnormal findings on histologic examination, antibody-mediated rejection, T cell-mediated rejection, mixed rejection or BK virus. Gene expression levels or expression patterns in samples collected from kidney transplant patients, etc. who do not show nephropathy, and samples collected from patients who want to know the presence or prognosis of kidney transplant rejection or BK virus nephropathy. By obtaining and comparing, it is possible to accurately predict the prognosis of the patient.
본 발명의 제1 양태와 관련된 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, 신장이식 후 항체 매개성 거부반응으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.The information providing method related to the first aspect of the present invention includes (c) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa- measured in step (a). With miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221-3p When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of is higher than the expression level in the normal control sample, the step of diagnosing antibody-mediated rejection after kidney transplantation may be further included.
구체적으로, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 100% 이상, 바람직하게는 200% 이상 상향조절 되어 있는 경우, 항체 매개성 거부반응으로 진단할 수 있다.Specifically, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p , hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485, and the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-221-3p is the expression level in the normal control sample If it is upregulated by more than 100%, preferably more than 200%, it can be diagnosed as antibody-mediated rejection.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:With respect to the first aspect, the present invention also provides a method of screening for a therapeutic agent for antibody mediated rejection after kidney transplant comprising the following steps:
(a) 시료에 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및(a) treating the sample with a candidate substance for an antibody-mediated rejection treatment after kidney transplantation; And
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.(b) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p in the sample treated with the candidate substance , hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-221-3p Steps to measure.
본 발명의 치료제 스크리닝 방법에 있어서, 분석을 위해 사용되는 "시료"는 정보제공방법에 사용되는 시료와 동일하다.In the therapeutic agent screening method of the present invention, the "sample" used for analysis is the same as the sample used in the information providing method.
본 발명의 용어, "항체 매개성 거부반응 치료제의 후보물질", "T 세포 매개성 거부반응 치료제의 후보물질""신장이식 거부반응 치료제의 후보물질" 또는 "BK 바이러스 신병증 치료제의 후보물질"은 항체 매개성 거부반응, T 세포 매개성 거부반응, 신장이식 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질로서, 직접 또는 간접적으로 신장이식 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증을 호전 또는 개선 시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 치료가능 예상물질을 모두 포함한다.The terms of the present invention, "candidate for the treatment of antibody-mediated rejection reaction", "candidate for the treatment of T cell-mediated rejection reaction", "candidate for the treatment of kidney transplant rejection", or "candidate for the treatment of BK virus nephropathy" Is a substance expected to treat antibody-mediated rejection, T cell-mediated rejection, kidney transplant rejection, or BK virus nephropathy, and directly or indirectly ameliorates or ameliorates kidney transplant rejection or BK virus nephropathy. It can be used without limitation as long as it is expected to be able to be made, and includes all expected therapeutic substances such as compounds, genes or proteins.
본 발명의 치료제 스크리닝 방법에서, miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 상기 (b) 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열복제, 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA), 공동-면역침전 어세이(Co-Immunoprecipitation assay), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 실시간 RT-PCR 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the therapeutic agent screening method of the present invention, the step (b) of measuring the expression level of the miRNA gene may be performed by any method known to those skilled in the art. Specific examples include PCR, ligase chain reaction (LCR), transcription amplification, self-maintained sequence replication, nucleic acid-based sequence amplification (NASBA), co-immunoprecipitation assay, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), real-time RT-PCR, and the like may be used, but are not limited thereto.
본 발명의 제1 양태와 관련된 치료제 스크리닝 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (a) 단계에서 처리한 후보물질을 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.The therapeutic agent screening method related to the first aspect of the present invention includes (c) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa- measured in step (b). With miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221-3p When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of is suppressed in a sample not treated with a candidate material, the candidate material treated in step (a) is determined as an antibody-mediated rejection treatment after kidney transplantation. It may further include steps.
본 발명의 제2 양태는 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자를 포함하는, 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응(T cell mediated rejection, TCMR) 또는 BK 바이러스 신병증과 구분하여 항체 매개성 거부반응(Antibody mediated rejection, ABMR)을 진단하기 위한 바이오마커 조성물에 관한 것이다.The second aspect of the present invention is from the group consisting of hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p. Diagnosis of antibody-mediated rejection (ABMR) by distinguishing from kidney transplantation, T cell mediated rejection (TCMR) or BK virus nephropathy, including any one or more selected miRNA genes. It relates to a biomarker composition for the following.
상기 5종의 miRNA 유전자 바이오마커에 대한 정보는 상기 표 1에 기재된 바와 같다.Information on the five kinds of miRNA gene biomarkers is as described in Table 1 above.
본 발명의 용어, "BK 바이러스 신병증 (BK virus nephropathy; BKVN)"은 BK 바이러스에 의해 야기되는 신장병을 의미하며, BK 바이러스 신장병 또는 신장병증 등으로 불린다. 신병증은 신장에 병변이 생긴 상태를 의미하는데, 질환의 단위가 확립되지 않거나 병변이 분류불능인 경우를 모두 총칭한다. 주로, 신장이식 환자에서 면역억제제 투여에 의한 합병증으로 발병되며, BK 바이러스는 이식선의 상피 세포를 침범하여 염증을 일으키고, 결국 이식된 신장의 기능 저하를 야기한다. The term of the present invention, "BK virus nephropathy (BKVN)" means kidney disease caused by the BK virus, and is referred to as BK virus nephropathy or nephropathy. Nephropathy refers to a condition in which a lesion has occurred in the kidney, and it refers to all cases in which the unit of the disease is not established or the lesion is unclassified. Mainly, it occurs as a complication of the administration of immunosuppressants in kidney transplant patients, and the BK virus invades epithelial cells of the graft gland, causing inflammation, and eventually causing a decrease in the function of the transplanted kidney.
본 발명의 용어, "BK 바이러스 (BKV)"는 파포바바이러스(papovavirus)에 속하는 바이러스를 의미한다. 주로, 화학요법을 받고 있는 암환자, 비스코트-올드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군 환자의 소변에서 분리되고 있다.As used herein, the term "BK virus (BKV)" refers to a virus belonging to papovavirus. It is mainly isolated from the urine of cancer patients undergoing chemotherapy and patients with Wiskott-Aldrich syndrome.
본 발명자들은 신장이식 환자들 중에서 조직검사 상 주요한 이상소견이 없는 정상 대조군(no major abnormality, NOMOA), T 세포 매개성 거부반응군 (TCMR) 및 BK 바이러스 신병증군 (BKVN)과 비교하여 항체 매개성 거부반응(ABMR)을 나타내는 환자의 소변에서 전술한 5종의 miRNA 유전자 발현이 2배 이상 증가하며, 통계분석 결과 p-value 값이 0.05 이하로 유의성을 나타내므로, 이들 miRNA 유전자 바이오마커를 T 세포 매개성 거부반응 및/또는 BK 바이러스 신병증군을 동반하지 않는 항체 매개성 거부반응의 진단 마커로서 활용할 수 있음을 알 수 있었다.Among kidney transplant patients, the present inventors compared antibody mediated with no major abnormality (NOMOA), T cell mediated rejection group (TCMR) and BK virus nephropathy group (BKVN) among kidney transplant patients. In the urine of patients with rejection reaction (ABMR), the expression of the aforementioned 5 miRNA genes was increased by more than 2 times, and the p-value value was less than 0.05 as a result of statistical analysis, so these miRNA gene biomarkers were used as T cells. It was found that it can be used as a diagnostic marker for antibody-mediated rejection without mediated rejection and/or BK virus nephropathy.
제2 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증과 구분하여 항체 매개성 거부반응을 진단하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.With respect to the second aspect, the present invention also provides hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p. A composition for diagnosing antibody-mediated rejection by distinguishing from T cell mediated rejection or BK virus nephropathy after kidney transplant, comprising an agent measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of, and A kit containing this is provided.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 또는 hsa-miR-103a-3p miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p or hsa-miR-103a-3p The agent for measuring the expression level of the miRNA gene may include a primer or probe that specifically binds to the gene.
제2 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증과 구분하여 항체 매개성 거부반응을 진단하기 위한 정보 제공방법을 제공한다:With respect to the second aspect, the present invention also provides a method for diagnosing antibody-mediated rejection after kidney transplantation, distinct from T cell mediated rejection or BK virus nephropathy, comprising the following steps:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및(a) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p in biological samples isolated from individuals Measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of; And
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.(b) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a- measured in step (a) Comparing the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of 3p with a normal control sample.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증을 동반하지 않는 항체 매개성 거부반응으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the information providing method comprises (c) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p measured in step (a). , When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p is higher than that in the normal control sample, T cell mediated after kidney transplantation It may further comprise the step of diagnosing rejection or antibody mediated rejection not accompanied by BK virus nephropathy.
구체적으로, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 100% 이상, 바람직하게는 200% 이상 상향조절 되어 있는 경우, T 세포 매개성 거부반응 및/또는 BK 바이러스 신병증을 동반하지 않는 항체 매개성 거부반응으로 진단할 수 있다.Specifically, any one selected from the group consisting of hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p When the expression level of the above miRNA gene is upregulated by 100% or more, preferably 200% or more than the expression level in the normal control sample, T cell mediated rejection and/or antibody mediated without BK virus nephropathy It can be diagnosed as sexual rejection.
제2 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:With respect to the second aspect, the present invention also provides a method of screening for a therapeutic agent for antibody-mediated rejection after kidney transplant comprising the following steps:
(a) 시료에 신장이식 거부반응 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및(a) treating the sample with a candidate substance for a therapeutic agent for kidney transplant rejection; And
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.(b) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p in the sample treated with the candidate substance Measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 스크리닝 방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (a) 단계에서 처리한 후보물질을 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the screening method comprises (c) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, measured in step (a), When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p is suppressed than in the sample not treated with the candidate substance, the treatment in step (a) above. It may further include the step of determining one candidate substance as a therapeutic agent for antibody-mediated rejection after kidney transplantation.
본 발명의 제2 양태와 관련하여, 제1 양태와 동일한 부분은 설명을 생략한다.With respect to the second aspect of the present invention, descriptions of the same portions as those of the first aspect are omitted.
본 발명의 제3 양태는 hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자를 포함하는, 신장이식 거부반응과 BK 바이러스 신병증을 구분하여 진단하기 위한 miRNA 유전자 바이오마커 조성물에 관한 것이다.The third aspect of the present invention is hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR -126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p It relates to a miRNA gene biomarker composition for distinguishing and diagnosing kidney transplant rejection and BK virus nephropathy, including any one or more miRNA genes.
상기 11종의 miRNA 유전자 바이오마커 중 표 1에 기재되지 않은 바이오마커의 정보는 표 2에 기재하였다.Among the 11 kinds of miRNA gene biomarkers, information on biomarkers not listed in Table 1 is shown in Table 2.
본 발명자들은 신장이식 환자들 중에서 조직검사 상 주요한 이상소견이 없는 정상 대조군(no major abnormality, NOMOA)과 비교하여, 항체 매개성 거부반응군 (ABMR) 및 T 세포 매개성 거부반응군 (TCMR)을 나타내는 환자의 소변에서 전술한 11종 miRNA 유전자 발현이 2배 이상 증가하며, 통계분석 결과 p-value 값이 0.05 이하로 유의성을 나타내지만, 이들 11종의 miRNA 유전자는 BK 바이러스 신병증군 (BKVN)에서는 유의적인 발현 증가가 나타나지 않으므로, 이들 miRNA 유전자 바이오마커를 신장이식 거부반응과 BK 바이러스 신병증을 구분하여 진단하는 마커로서 활용할 수 있음을 알 수 있었다.The present inventors compared an antibody-mediated rejection group (ABMR) and a T cell-mediated rejection group (TCMR) to a no major abnormality (NOMOA) among kidney transplant patients. In the urine of the indicated patient, the expression of the aforementioned 11 miRNA genes increased more than twice, and the p-value value was 0.05 or less as a result of statistical analysis, but these 11 miRNA genes were found in the BK virus nephropathy group (BKVN). Since there was no significant increase in expression, it was found that these miRNA gene biomarkers can be used as markers to differentiate between kidney transplant rejection and BK virus nephropathy.
제3 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장이식 거부반응과 BK 바이러스 신병증을 구분하여 진단하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.Regarding the third aspect, the present invention also provides hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p , hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p It provides a composition for diagnosing and diagnosing kidney transplant rejection and BK virus nephropathy, including an agent for measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group, and a kit including the same.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p , hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p The agent for measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group may include a primer or probe that specifically binds to the gene.
제3 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는, 신장이식 거부반응과 BK 바이러스 신병증을 구분하여 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다:With respect to the third aspect, the present invention also provides a method for providing information for distinguishing and diagnosing kidney transplant rejection and BK virus nephropathy, comprising the following steps:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및(a) hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, in biological samples isolated from individuals The group consisting of hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p Measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from; And
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.(b) hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455- measured in step (a) 3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p Comparing the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of a normal control sample.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, BK 바이러스 신병증을 동반하지 않는 신장이식 거부반응으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the information providing method is (c) hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, measured in step (a). , hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa -If the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p is higher than that in the normal control sample, kidney not accompanied by BK virus nephropathy It may further comprise the step of diagnosing transplant rejection.
구체적으로, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 100% 이상, 바람직하게는 200% 이상 상향조절 되어 있는 경우, BK 바이러스 신병증을 동반하지 않는 신장이식 거부반응으로 진단할 수 있다.Specifically, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p , hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and any one or more miRNAs selected from the group consisting of hsa-miR-223-3p When the expression level of the gene is upregulated by 100% or more, preferably 200% or more than the expression level in the normal control sample, it can be diagnosed as kidney transplant rejection without BK virus nephropathy.
제3 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는, 신장이식 거부반응 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:In connection with the third aspect, the present invention also provides a method of screening for a therapeutic agent for renal transplant rejection, comprising the steps of:
(a) 시료에 신장이식 거부반응 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및(a) treating the sample with a candidate substance for a therapeutic agent for kidney transplant rejection; And
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.(b) hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p in the sample treated with the candidate substance , hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p Measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 스크리닝 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (a) 단계에서 처리한 후보물질을 신장이식 거부반응 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the screening method is (c) measured in step (b), hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa- When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p is more suppressed in the sample not treated with the candidate substance, the candidate treated in step (a) above It may further include the step of determining the substance as a treatment for kidney transplant rejection.
본 발명의 제3 양태와 관련하여, 제1 양태와 동일한 부분은 설명을 생략한다.With respect to the third aspect of the present invention, descriptions of the same parts as those of the first aspect are omitted.
본 발명의 제4 양태는 hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자를 포함하는, 신장이식 후 예후 예측을 위한 바이오마커 조성물에 관한 것이다.The fourth aspect of the present invention is hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p , hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa -miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR -205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR-125b-5p It relates to a biomarker composition for predicting prognosis after transplantation.
상기 23종의 miRNA 유전자 바이오마커 중 표 1 및 2에 기재되지 않은 바이오마커의 정보는 표 3에 기재하였다.Among the 23 kinds of miRNA gene biomarkers, information on biomarkers not listed in Tables 1 and 2 is shown in Table 3.
본 발명자들은 신장이식 환자들 중에서 조직검사 상 주요한 이상소견이 없는 정상 대조군(no major abnormality, NOMOA)과 비교하여, 항체 매개성 거부반응 (ABMR), T 세포 매개성 거부반응 (TCMR) 및 BK 바이러스 신병증 (BKVN)을 나타내는 환자의 소변에서 전술한 23종의 miRNA 유전자 발현이 2배 이상 증가하며, 통계분석 결과 p-value 값이 0.05 이하로 유의성을 나타내므로, 이들 miRNA 유전자 바이오마커를 신장이식 후 예후 예측을 위한 마커로서 활용할 수 있음을 알 수 있었다.The present inventors compared to the normal control group (no major abnormality, NOMOA) without major abnormalities on histological examination among kidney transplant patients, antibody-mediated rejection (ABMR), T cell-mediated rejection (TCMR) and BK virus. In the urine of patients with nephropathy (BKVN), the expression of the aforementioned 23 miRNA genes increased by more than 2 times, and the p-value value was less than 0.05 as a result of statistical analysis, so these miRNA gene biomarkers were renal transplanted. It was found that it can be used as a marker for predicting the posterior prognosis.
제4 양태와 관련하여, 본 발명은 hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장이식 후 예후 예측을 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.With respect to the fourth aspect, the present invention provides hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR- 31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455- 3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, Expression of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR-125b-5p It provides a composition for predicting prognosis after kidney transplantation, including an agent for measuring the level, and a kit including the same.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR -31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455 -3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p , hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR-125b-5p of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of The agent for measuring the expression level may include a primer or probe that specifically binds to the gene.
제4 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 신장이식 후 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다:With respect to the fourth aspect, the present invention also provides a method of providing information for predicting prognosis after kidney transplantation comprising the following steps:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및(a) hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR- in biological samples isolated from individuals 31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455- 3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, Expression of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR-125b-5p Measuring the level; And
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.(b) measured in the step (a), hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa- miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR- 455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223- Any one or more miRNA genes selected from the group consisting of 3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR-125b-5p Comparing the expression level of the normal control sample.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, 신장이식 후 불량한 예후를 갖는 것으로 예측하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the information providing method is (c) measured in step (a), hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa -miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328 -5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p , hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of -125b-5p is higher than the expression level in the normal control sample, predicting that a kidney transplant has a poor prognosis may be further included.
구체적으로, hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 100% 이상, 바람직하게는 200% 이상 상향조절 되어 있는 경우, 신장이식 후 불량한 예후를 갖는 것으로 예측할 수 있다.Specifically, hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR -17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126 -3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p , hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR-125b-5p. When the expression level is upregulated by 100% or more, preferably 200% or more, it can be predicted to have a poor prognosis after kidney transplantation.
제4 양태의 정보제공방법에 있어서, "신장이식 후 불량한 예후"는 항체 매개성 거부반응 및 T 세포 매개성 거부반응을 포함하는 신장이식 거부반응 및/또는 BK 바이러스 신병증이 나타나는 것을 의미한다.In the information providing method of the fourth aspect, "poor prognosis after kidney transplantation" means that kidney transplant rejection including antibody-mediated rejection and T cell-mediated rejection and/or BK virus nephropathy appear.
제4 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는, 신장이식 후 불량한 예후의 환자의 신장이식 거부반응 치료제 및/또는 BK 바이러스 신병증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:In connection with the fourth aspect, the present invention also provides a method of screening for a treatment for kidney transplant rejection and/or a treatment for BK virus nephropathy in a patient with a poor prognosis after a kidney transplant, comprising the steps of:
(a) 시료에 신장이식 거부반응 치료제 및/또는 BK 바이러스 신병증 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및(a) treating the sample with a candidate substance for the treatment of kidney transplant rejection and/or the treatment of BK virus nephropathy; And
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.(b) hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR in the sample treated with the candidate substance -31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455 -3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p , hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR-125b-5p of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of Measuring the expression level.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 스크리닝 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된, hsa-miR-8485 , hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p 및 hsa-miR-125b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (a) 단계에서 처리한 후보물질을 신장이식 거부반응 치료제 및/또는 BK 바이러스 신병증 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the screening method is (c) measured in step (b), hsa-miR-8485, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-331-3p, hsa- miR-1290, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328- 5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-4449, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-514a-3p and hsa-miR- When the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of 125b-5p is more suppressed in the sample not treated with the candidate material, the candidate material treated in step (a) is used as a kidney transplant rejection treatment agent and/or It may further include the step of determining as a therapeutic agent for BK virus nephropathy.
본 발명의 제4 양태와 관련하여, 제1 양태와 동일한 부분은 설명을 생략한다.With respect to the fourth aspect of the present invention, descriptions of the same parts as those of the first aspect are omitted.
이하 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, since the present invention can be modified in various ways and has various forms, specific examples and descriptions described below are only to aid understanding of the present invention, and limit the present invention to a specific disclosure form. I'm not trying to do it. It is to be understood that the scope of the present invention includes all changes, equivalents, and substitutes included in the spirit and scope of the present invention.
시료의 준비Preparation of the sample
1-1. 환자의 선발 및 소변 시료의 준비1-1. Selection of patients and preparation of urine samples
신장이식 환자의 항체 매개성 거부반응을 진단하기 위한 바이오마커를 발굴하기 위하여, 신장이식 후 5년 이내 징후 생검 (indication biopsy)을 시행받은 환자 15명을 대상으로 생검 2~3 시간 전에 소변 시료를 수집하였다. 또한 생체 신장 기증자로부터 신장 기증수술 직전에 소변 시료를 수집하였다. 환자들은 표 4와 같이 생검의 병리학적인 진단에 따라 4 군으로 분류되었다; 항체 매개성 거부반응 (ABMR) 군 4개, T 세포 매개성 거부반응 (TCMR) 군 4개, BK 바이러스 신병증 (BKVN) 군 3개 및 주요 이상이 없는 (NOMOA) 군 4개, 혼합된 동종 이병성 병변을 가진 환자의 소변은 제외하였다. 수집된 소변 시료는 프로테아제 저해제 혼합물을 넣어 4,000 rpm, 4℃에서 15분 간 원심분리하였고 상층액을 모아 사용시까지 동결보관하였다. 이 연구는 아산 병원 의료기관 평가위원회의 승인을 받아 진행하였으며, 모든 환자에게서 서면 동의를 받았다.To find biomarkers for diagnosing antibody-mediated rejection in kidney transplant patients, urine samples were collected 2-3 hours before biopsy in 15 patients who underwent an indication biopsy within 5 years after kidney transplantation. Collected. In addition, urine samples were collected from living kidney donors immediately before kidney donation surgery. Patients were classified into 4 groups according to the pathological diagnosis of biopsy as shown in Table 4; 4 antibody-mediated rejection (ABMR) groups, 4 T cell mediated rejection (TCMR) groups, 3 BK virus nephropathy (BKVN) groups, and 4 no major abnormalities (NOMOA) groups, mixed homologs Urine from patients with heterologous lesions was excluded. The collected urine sample was centrifuged for 15 minutes at 4,000 rpm and 4° C. by putting the protease inhibitor mixture, and the supernatant was collected and stored frozen until use. This study was conducted with the approval of the Asan Hospital Medical Institution Evaluation Committee, and written consent was obtained from all patients.
1-2. 소변 유래 엑소좀 분리 및 엑소좀내 miRNA 분리1-2. Isolation of urine-derived exosomes and miRNA in exosomes
동결보관 중인 소변을 실온 (RT)에서 녹이고 4℃에서 17,000xg로 15분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거한 후 상청액을 450nm 필터로 여과하였다. 초고속 원심분리기를 이용하여 200,000xg에서 1시간 동안 원심분리하여 침전물을 얻은 후 PBS로 200,000xg에서 1시간 동안 원심분리하여 세척하고 200ul 볼륨의 PBS에 풀어 엑소좀을 모은 후 small RNA isolation kit (miRNeasy mini kit, Quiagen)을 이용하여 제시되어 있는 방법에 따라 RNA 를 분리하여 80℃에 보관하였다.Urine in cryopreservation was dissolved at room temperature (RT) and centrifuged at 17,000xg at 4° C. for 15 minutes to remove cell debris, and the supernatant was filtered through a 450 nm filter. Centrifuge at 200,000xg for 1 hour using an ultra-high-speed centrifuge to obtain a precipitate, centrifuge for 1 hour at 200,000xg with PBS, wash, dissolve in 200ul of PBS, collect exosomes, and collect small RNA isolation kit (miRNeasy mini kit, Quiagen) was used to separate RNA according to the suggested method and stored at 80°C.
miRNA 유전자 바이오마커 후보 선발 및 확인Selection and identification of miRNA gene biomarker candidates
각각의 병리학적 그룹을 대표하는 특정 바이오마커를 선발하기 위해, t-테스트를 사용하여 ABMR, TCMR 및 BKVN을 각각 NOMOA 그룹과 비교하였을 때 2배 이상의 차이를 보이고, P<0.05인 miRNA 유전자를 선정했다. RNA는 RNA bioanalyzer pico 6000 chip을 이용하여 RNA-seq 수행업체에 의뢰하여 QC 진행 후 Illumnia smarter kit로 라이브러리를 제작했다. RNA-seq은 크기 분할 (size fractionation)을 통하여 20nt 사이즈의 유전체(genome)에 어댑터 결합 (adaptor ligation), RT-RCR 방법으로 증폭 후 Hi-seq으로 시퀀싱 (sequencing) 하였다. 이의 결과로 정상인 그룹에 비해 발현도가 2배 이상이며 통계적으로 유의하게 발현한 miRNA를 선별하였다.In order to select a specific biomarker representing each pathological group, a t-test was used to select a miRNA gene that showed a difference of more than 2 times when compared with the NOMOA group, respectively, using a t-test. did. For RNA, using the RNA bioanalyzer pico 6000 chip, we commissioned an RNA-seq company to perform QC, and then produced a library with Illumnia smarter kit. RNA-seq was amplified by an adapter ligation to a genome of 20 nt size through size fractionation, amplified by RT-RCR, and then sequenced with Hi-seq. As a result of this, miRNAs that expressed statistically significant expression with more than twice the expression level compared to the normal group were selected.
보다 구체적인 miRNA 유전자 바이오마커 후보 선발과정은 다음과 같다.A more specific process of selecting candidates for miRNA gene biomarkers is as follows.
도 1에 나타낸 바와 같이, 첫 번째 단계로 상기 실시예 1에서 준비된 15개의 샘플에서 2,588개의 성숙 (mature) miRNA를 선별하였다. 두 번째 단계로 중요 데이터에 대하여, 발현 수준이 유사한 샘플 및 성숙 miRNA를 그룹화하는 계층적 군집 분석 (유리클리드 방법, 완전 연관)을 수행하고, 이를 도 2에 히트맵 (Heatmap)으로 나타내었다. 각 성숙 miRNA 별, 전체 15개 샘플에서 총 2,588개 성숙 miRNA 중에서 모두 0인 카운트 (Count) 값을 가지는 성숙 miRNA는 분석에서 제외하여 892개의 성숙 miRNA를 대상으로 통계분석을 진행하였다.As shown in FIG. 1, as a first step, 2,588 mature miRNAs were selected from the 15 samples prepared in Example 1 above. As a second step, for important data, a hierarchical cluster analysis (Uriclidean method, fully correlated) grouping samples with similar expression levels and mature miRNAs was performed, and this was shown as a heatmap in FIG. 2. For each mature miRNA, among a total of 2,588 mature miRNAs in a total of 15 samples, the mature miRNAs having a count value of 0 were excluded from the analysis. Statistical analysis was performed on 892 mature miRNAs.
1차 및 2차 선별과정을 통해 NOMOA 그룹을 기준으로 발현이 2배 이상 증가하거나 또는 감소하고, 통계분석 결과 p-value 값이 0.05 이하인 유전자를 선택하여 유전자를 필터링함으로써 NOMOA에 비해 ABMR, TCMR 및 BKVN 환자에서 상향 혹은 하향 조절되는 miRNA를 확인하였다. 발현 수준이 증가한 miRNA는 빨간색으로 표시하고 발현도가 감소한 miRNA는 초록색으로 표시하여 도 3(A)에 나타내었다. 특히 도 3(B)에 나타낸 바와 같이 NOMOA 그룹 대비 ABMR 그룹에서 발현 수준이 증가한 miRNA 유전자는 10개, TCMR 환자에서 11개, BKVN에서 12개를 최종 선발하였고, 그 목록을 표 5에 나타내었다.Compared to NOMOA, ABMR, TCMR and compared to NOMOA by selecting genes with a p-value of 0.05 or less, and filtering genes by selecting genes whose expression increases or decreases by more than two times based on the NOMOA group through the first and second screening processes. Up- or down-regulated miRNAs were identified in BKVN patients. MiRNAs with increased expression levels are indicated in red, and miRNAs with decreased expression levels are indicated in green, as shown in FIG. 3(A). In particular, as shown in FIG. 3(B), 10 miRNA genes with increased expression levels in the ABMR group compared to the NOMOA group were selected, 11 from TCMR patients, and 12 from BKVN, and the list is shown in Table 5.
hsa-miR-221-3p
hsa-miR-331-3p
hsa-miR-1290
hsa-miR-192-5p
hsa-miR-126-5p
hsa-miR-328-5p
hsa-miR-103a-3p
hsa-miR-455-3p
hsa-miR-126-3phsa-miR-8485
hsa-miR-221-3p
hsa-miR-331-3p
hsa-miR-1290
hsa-miR-192-5p
hsa-miR-126-5p
hsa-miR-328-5p
hsa-miR-103a-3p
hsa-miR-455-3p
hsa-miR-126-
hsa-miR-221-3p
hsa-miR-19b-3p
hsa-miR-31-5p
hsa-miR-17-5p
hsa-miR-192-5p
hsa-miR-345-5p
hsa-miR-215-5p
hsa-miR-1273g-3p
hsa-miR-19a-3p
hsa-miR-223-3phsa-miR-8485
hsa-miR-221-3p
hsa-miR-19b-3p
hsa-miR-31-5p
hsa-miR-17-5p
hsa-miR-192-5p
hsa-miR-345-5p
hsa-miR-215-5p
hsa-miR-1273g-3p
hsa-miR-19a-3p
hsa-miR-223-
hsa-miR-221-3p
hsa-miR-331-3p
hsa-miR-1290
hsa-miR-19b-3p
hsa-miR-31-5p
hsa-miR-17-5p
hsa-miR-205-5p
hsa-miR-4449
hsa-miR-106a-5p
hsa-miR-514a-3p
hsa-miR-125b-5phsa-miR-8485
hsa-miR-221-3p
hsa-miR-331-3p
hsa-miR-1290
hsa-miR-19b-3p
hsa-miR-31-5p
hsa-miR-17-5p
hsa-miR-205-5p
hsa-miR-4449
hsa-miR-106a-5p
hsa-miR-514a-3p
hsa-miR-125b-5p
선발된 miRNA 유전자 바이오마커에 따른 병리학적 그룹의 확인Identification of pathological groups according to selected miRNA gene biomarkers
3-1. TCMR 그룹 및 BKVN 그룹 대비 ABMR 그룹에서 증가된 발현 수준을 나타내는 miRNA 유전자 바이오마커의 확인3-1. Identification of miRNA gene biomarkers showing increased expression levels in the ABMR group compared to the TCMR group and the BKVN group
실시예 2에서 선발된 NOMOA 그룹 대비 ABMR 그룹에서 발현 수준이 증가한 miRNA 유전자 중에서, TCMR 그룹 및 BKVN 그룹 대비 현저한 발현 양상 차이를 나타내는 5종의 miRNA 유전자를 선발하였고, 그 결과를 도 4(A)에 나타냈다. 도 4(A)에서 확인되는 바와 같이, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p의 5종의 miRNA 유전자는 TCMR 그룹 및 BKVN 그룹 대비 현저한 발현 양상의 차이가 있었다. 또한, 도 4(B) 및 표 6에 나타낸 바와 같이 상기 5종의 miRNA 유전자는 NOMOA 그룹 대비 ABMR 그룹에서 발현 수준이 2배 이상 증가하고, p<0.05 로 통계적 유의성이 있음을 확인하였다.Among the miRNA genes whose expression levels were increased in the ABMR group compared to the NOMOA group selected in Example 2, five miRNA genes showing a significant difference in expression patterns compared to the TCMR group and the BKVN group were selected, and the results are shown in FIG. 4(A). Showed. 4(A), hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p There were significant differences in expression patterns of the 5 miRNA genes in the TCMR group and the BKVN group. In addition, as shown in Fig. 4(B) and Table 6, it was confirmed that the expression level of the five miRNA genes increased more than two times in the ABMR group compared to the NOMOA group, and had statistical significance as p<0.05.
raw.pvalraw.pval
이와 같은 결과를 통해, 상기 5종의 miRNA 유전자는 정상 그룹뿐만 아니라 TCMR 또는 BKVN과 구분하여 ABMR을 진단하는 바이오마커로서 활용 가능함을 확인할 수 있다.Through these results, it can be confirmed that the five miRNA genes can be used as a biomarker for diagnosing ABMR by distinguishing from TCMR or BKVN as well as normal groups.
3-2. ABMR 그룹 및 BKVN 그룹 대비 TCMR 그룹에서 증가된 발현 수준을 나타내는 miRNA 유전자 바이오마커의 확인3-2. Identification of miRNA gene biomarkers showing increased expression levels in TCMR group compared to ABMR group and BKVN group
실시예 2에서 선발된 NOMOA 그룹 대비 TCMR 그룹에서 발현 수준이 증가한 miRNA 유전자 중에서, ABMR 그룹 및 BKVN 그룹 대비 현저한 발현 양상 차이를 나타내는 5종의 miRNA 유전자를 선발하였고, 그 결과를 도 5(A)에 나타냈다. 도 5(A)에서 확인되는 바와 같이, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p 및 hsa-miR-223-3p의 5종의 miRNA 유전자는 ABMR 그룹 및 BKVN 그룹 대비 현저한 발현 양상의 차이가 있었다. 또한, 도 5(B) 및 표 7에 나타낸 바와 같이 상기 5종의 miRNA 유전자는 NOMOA 그룹 대비 TCMR 그룹에서 발현 수준이 2배 이상 증가하고, p<0.05 로 통계적 유의성이 있음을 확인하였다.Among the miRNA genes whose expression levels were increased in the TCMR group compared to the NOMOA group selected in Example 2, five miRNA genes showing a significant difference in expression patterns compared to the ABMR group and the BKVN group were selected, and the results are shown in FIG. 5(A). Showed. 5(A), hsa-miR-345-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-19a-3p and hsa-miR-223-3p There were significant differences in expression patterns of the five miRNA genes in the ABMR group and the BKVN group. In addition, as shown in Fig. 5(B) and Table 7, the expression level of the 5 miRNA genes increased by more than 2 times in the TCMR group compared to the NOMOA group, and it was confirmed that there is statistical significance as p<0.05.
raw.pvalraw.pval
이와 같은 결과를 통해, 상기 5 종의 miRNA 유전자는 정상 그룹뿐만 아니라 ABMR 또는 BKVN과 구분하여 ABMR을 진단하는 바이오마커로서 활용 가능함을 확인할 수 있다.Through these results, it can be confirmed that the five miRNA genes can be used as a biomarker for diagnosing ABMR by distinguishing not only from the normal group but also from ABMR or BKVN.
3-3. ABMR 그룹 및 TCMR 그룹 대비 BKVN 그룹에서 증가된 발현 수준을 나타내는 miRNA 유전자 바이오마커의 확인3-3. Identification of miRNA gene biomarkers showing increased expression levels in the BKVN group compared to the ABMR group and the TCMR group
실시예 2에서 선발된 NOMOA 그룹 대비 BKVN 그룹에서 발현 수준이 증가한 miRNA 유전자 중에서, ABMR 그룹 및 TCMR 그룹 대비 현저한 발현 양상 차이를 나타내는 5종의 miRNA 유전자를 선발하였고, 그 결과를 도 6(A)에 나타냈다. 도 6(A)에서 확인되는 바와 같이, hsa-miR-4449, hsa-miR-514a-3p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-205-5p 및 hsa-miR-125b-5p의 5종의 miRNA 유전자는 ABMR 그룹 및 TCMR 그룹 대비 현저한 발현 양상의 차이가 있었다. 또한, 도 6(B) 및 표 8에 나타낸 바와 같이 상기 5종의 miRNA 유전자는 NOMOA 그룹 대비 BKVN 그룹에서 발현 수준이 2배 이상 증가하고, p<0.05 로 통계적 유의성이 있음을 확인하였다.Among the miRNA genes whose expression levels were increased in the BKVN group compared to the NOMOA group selected in Example 2, five miRNA genes showing a significant difference in expression patterns compared to the ABMR group and the TCMR group were selected, and the results are shown in FIG. 6(A). Showed. 6(A), 5 of hsa-miR-4449, hsa-miR-514a-3p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-205-5p and hsa-miR-125b-5p There were significant differences in the expression patterns of species miRNA genes compared to the ABMR group and TCMR group. In addition, as shown in Fig. 6(B) and Table 8, the expression level of the five miRNA genes increased more than twice in the BKVN group compared to the NOMOA group, and it was confirmed that there is statistical significance as p<0.05.
raw.pvalraw.pval
이와 같은 결과를 통해, 상기 5 종의 miRNA 유전자는 정상 그룹뿐만 아니라 ABMR 또는 TCMR과 구분하여 BKVN을 진단하는 바이오마커로서 활용 가능함을 확인할 수 있다.Through these results, it can be confirmed that the five miRNA genes can be used as biomarkers for diagnosing BKVN by distinguishing them from ABMR or TCMR as well as normal groups.
3-4. 병리학적 그룹에 따른 바이오마커의 그룹핑3-4. Grouping of biomarkers by pathological group
상기 결과를 바탕으로, 표 2의 바이오마커 목록을 표 9와 같이 재그룹핑하였고, 이를 도 7에 벤다이어그램으로 나타내었다.Based on the above results, the list of biomarkers in Table 2 was regrouped as shown in Table 9, and this is shown as a Venn diagram in FIG. 7.
hsa-miR-221-3phsa-miR-8485
hsa-miR-221-
hsa-miR-1290hsa-miR-331-3p
hsa-miR-1290
hsa-miR-31-5p
hsa-miR-17-5phsa-miR-19b-3p
hsa-miR-31-5p
hsa-miR-17-5p
hsa-miR-328-5p
hsa-miR-103a-3p
hsa-miR-455-3p
hsa-miR-126-3phsa-miR-126-5p
hsa-miR-328-5p
hsa-miR-103a-3p
hsa-miR-455-3p
hsa-miR-126-
hsa-miR-215-5p
hsa-miR-1273g-3p
hsa-miR-19a-3p
hsa-miR-223-3phsa-miR-345-5p
hsa-miR-215-5p
hsa-miR-1273g-3p
hsa-miR-19a-3p
hsa-miR-223-
hsa-miR-4449
hsa-miR-106a-5p
hsa-miR-514a-3p
hsa-miR-125b-5phsa-miR-205-5p
hsa-miR-4449
hsa-miR-106a-5p
hsa-miR-514a-3p
hsa-miR-125b-5p
상기와 같이 그룹핑된 바이오마커를 활용하여, 신장이식 후 항체 매개성 거부반응, T 세포 거부반응 및 BK 바이러스 신병증을 각각 구분하여 진단할 수 있다.Using the biomarkers grouped as described above, antibody-mediated rejection, T cell rejection, and BK virus nephropathy after kidney transplantation can be distinguished and diagnosed.
선발된 miRNA 바이오마커의 검증Validation of selected miRNA biomarkers
표 9의 그룹핑된 바이오마커에서 ABMR 그룹에서 특이적으로 발현 수준이 증가하는 miRNA-445-3p 및 miRNA-126-3p와 ABMR, BKVN 및 TCMR 그룹에서 모두 발현 수준이 증가하는 miRNA-221-3p에 대한 검증을 실시하였다.In the grouped biomarkers of Table 9, miRNA-445-3p and miRNA-126-3p, whose expression levels specifically increase in the ABMR group, and miRNA-221-3p, which increase expression levels in all of the ABMR, BKVN, and TCMR groups, The verification was carried out.
실시예 1과 마찬가지로 신장이식 후 5년 이내 징후 생검 (indication biopsy)을 시행 받은 환자를 대상으로 생검 2~3 시간 전에 소변 시료를 수집하였고, 생체 신장 기증자로부터 신장 기증수술 직전에 소변 시료를 수집하였다. 환자들을 표 4와 같이 생검의 병리학적인 진단에 따라 4 군으로 분류하고 혼합된 동종 이병성 병변을 가진 환자의 소변은 제외하였다. 생체 신장 기증자를 건장한 대조군으로 선정하여 신장 기증 수술 직전에 소변 시료를 수집하였다.As in Example 1, urine samples were collected 2 to 3 hours before the biopsy from patients who underwent an indication biopsy within 5 years after kidney transplantation, and urine samples were collected immediately before kidney donation surgery from a living kidney donor. . As shown in Table 4, patients were classified into 4 groups according to the pathological diagnosis of biopsy, and urine of patients with mixed allopathic lesions were excluded. A living kidney donor was selected as a robust control, and urine samples were collected immediately before kidney donation surgery.
각 바이오마커의 검증을 위해 사용된 시료의 개수는 표 10에 나타내었다.The number of samples used for verification of each biomarker is shown in Table 10.
수집된 소변 시료는 프로테아제 저해제 혼합물을 넣어 4,000 rpm, 4℃에서 15분 간 원심분리 하였고 상층액을 모아 사용시까지 동결보관 하였다. 이 연구는 아산 병원 의료기관 평가위원회의 승인을 받아 진행하였으며, 모든 환자에게서 서면 동의를 받았다.The collected urine sample was centrifuged at 4,000 rpm and 4° C. for 15 minutes by adding the protease inhibitor mixture, and the supernatant was collected and stored frozen until use. This study was conducted with the approval of the Asan Hospital Medical Institution Evaluation Committee, and written consent was obtained from all patients.
이후, 소변 유래 엑소좀 분리 및 엑소좀내 miRNA 분리를 위해 실시예 1-2와 동일하게 시료를 처리한 후, 표 10의 3종의 miRNA에 대해 RT-PCR을 수행하였다. 유전자 발현량은 QuantStudioTM Real-Time PCR software (Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다.Thereafter, for separation of urine-derived exosomes and miRNAs in exosomes, samples were treated in the same manner as in Example 1-2, and then RT-PCR was performed on the three miRNAs of Table 10. Gene expression levels were analyzed using QuantStudio TM Real-Time PCR software (Applied Biosystems).
도 8에서 확인되는 바와 같이, miRNA-445-3p, miRNA-126-3p 및 miRNA-221-3p는 모두 NOMOA 그룹에 비해 ABMR 그룹에서 유의적으로 높은 발현 수준을 나타냈다. 이러한 결과에 대해 ROC (Receiver-Operating Characteristic) 곡선을 그리고 AUC (Area under the ROC curve; AUC) 값을 구한 결과, 표 11에 나타난 바와 같이 miRNA-445-3p는 0.825, miRNA-126-3p는 0.944, miRNA-221-3p는 0.887로 매우 높은 값을 나타내어 3 종의 바이오마커 모두 임상적으로 ABMR 진단에 매우 유용함을 확인하였다.8, miRNA-445-3p, miRNA-126-3p, and miRNA-221-3p all showed significantly higher expression levels in the ABMR group than in the NOMOA group. For these results, a ROC (Receiver-Operating Characteristic) curve was drawn and the AUC (Area under the ROC curve; AUC) value was calculated. As shown in Table 11, miRNA-445-3p was 0.825 and miRNA-126-3p was 0.944. , miRNA-221-3p showed a very high value of 0.887, confirming that all three biomarkers are clinically very useful for ABMR diagnosis.
SEQUENCE LISTING <110> THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Urinary exosome-derived miRNA gene biomarkers for diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney allografts and use thereof <130> 1067970 <150> KR 10-2019-0104723 <151> 2019-08-26 <160> 23 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-126-3p <400> 1 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-126-5p <400> 2 cauuauuacu uuugguacgc g 21 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-328-5p <400> 3 gggggggcag gaggggcuca ggg 23 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-455-3p <400> 4 gcaguccaug ggcauauaca c 21 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-103a-3p <400> 5 agcagcauug uacagggcua uga 23 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-192-5p <400> 6 cugaccuaug aauugacagc c 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-331-3p <400> 7 gccccugggc cuauccuaga a 21 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-1290 <400> 8 uggauuuuug gaucaggga 19 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-8485 <400> 9 cacacacaca cacacacgua u 21 <210> 10 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-221-3p <400> 10 agcuacauug ucugcugggu uuc 23 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-345-5p <400> 11 gcugacuccu aguccagggc uc 22 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-215-5p <400> 12 augaccuaug aauugacaga c 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-1273g-3p <400> 13 accacugcac uccagccuga g 21 <210> 14 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-19a-3p <400> 14 ugugcaaauc uaugcaaaac uga 23 <210> 15 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-223-3p <400> 15 ugucaguuug ucaaauaccc ca 22 <210> 16 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-19b-3p <400> 16 ugugcaaauc caugcaaaac uga 23 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-31-5p <400> 17 aggcaagaug cuggcauagc u 21 <210> 18 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-17-5p <400> 18 caaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-205-5p <400> 19 uccuucauuc caccggaguc ug 22 <210> 20 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-4449 <400> 20 cgucccgggg cugcgcgagg ca 22 <210> 21 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-106a-5p <400> 21 aaaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-514a-3p <400> 22 auugacacuu cugugaguag a 21 <210> 23 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-125b-5p <400> 23 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 SEQUENCE LISTING <110> THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Urinary exosome-derived miRNA gene biomarkers for diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney allografts and use thereof <130> 1067970 <150> KR 10-2019-0104723 <151> 2019-08-26 <160> 23 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-126-3p <400> 1 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-126-5p <400> 2 cauuauuacu uuugguacgc g 21 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-328-5p <400> 3 gggggggcag gaggggcuca ggg 23 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-455-3p <400> 4 gcaguccaug ggcauauaca c 21 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-103a-3p <400> 5 agcagcauug uacagggcua uga 23 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-192-5p <400> 6 cugaccuaug aauugacagc c 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-331-3p <400> 7 gccccugggc cuauccuaga a 21 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-1290 <400> 8 uggauuuuug gaucaggga 19 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-8485 <400> 9 cacacacaca cacacacgua u 21 <210> 10 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-221-3p <400> 10 agcuacauug ucugcugggu uuc 23 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-345-5p <400> 11 gcugacuccu aguccagggc uc 22 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-215-5p <400> 12 augaccuaug aauugacaga c 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-1273g-3p <400> 13 accacugcac uccagccuga g 21 <210> 14 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-19a-3p <400> 14 ugugcaaauc uaugcaaaac uga 23 <210> 15 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-223-3p <400> 15 ugucaguuug ucaaauaccc ca 22 <210> 16 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-19b-3p <400> 16 ugugcaaauc caugcaaaac uga 23 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-31-5p <400> 17 aggcaagaug cuggcauagc u 21 <210> 18 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-17-5p <400> 18 caaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-205-5p <400> 19 uccuucauuc caccggaguc ug 22 <210> 20 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-4449 <400> 20 cgucccgggg cugcgcgagg ca 22 <210> 21 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-106a-5p <400> 21 aaaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-514a-3p <400> 22 auugacacuu cugugaguag a 21 <210> 23 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> hsa-miR-125b-5p <400> 23 ucccugagac ccuaacuugu ga 22
Claims (22)
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 진단을 위한 정보 제공방법.(a) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, in biological samples isolated from individuals The expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221-3p Measuring;
(b) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a- measured in step (a) Expression of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of 3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and hsa-miR-221-3p A method of providing information for diagnosis of antibody-mediated rejection after kidney transplant, comprising the step of comparing the level with a normal control sample.
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 및 hsa-miR-221-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 치료제의 스크리닝 방법.(a) treating the sample with a candidate substance for the treatment of antibody-mediated rejection after kidney transplantation; And
(b) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-103a-3p in the sample treated with the candidate substance , hsa-miR-192-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-1290, hsa-miR-8485 and the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of hsa-miR-221-3p A method of screening for a therapeutic agent for antibody-mediated rejection after kidney transplant, comprising the step of measuring.
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증과 구분하여 항체 매개성 거부반응의 진단을 위한 정보 제공방법. (a) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p in biological samples isolated from individuals Measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of;
(b) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a- measured in step (a) Comprising the step of comparing the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of 3p with a normal control sample, T cell mediated rejection after kidney transplantation or antibody-mediated rejection in distinction from BK virus nephropathy How to provide information for diagnosis.
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p 및 hsa-miR-103a-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 항체 매개성 거부반응 치료제의 스크리닝 방법.(a) treating the sample with a candidate substance for a therapeutic agent for kidney transplant rejection; And
(b) hsa-miR-126-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-328-5p, hsa-miR-455-3p and hsa-miR-103a-3p in the sample treated with the candidate substance A method for screening an antibody-mediated rejection therapeutic agent after kidney transplant, comprising measuring the expression level of any one or more miRNA genes selected from the group consisting of.
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MATZ 등, PloS One, 제13권, 제8호, e0201925, 페이지 1-15 (2018)* * |
Zhang 등, Genomics Proteomics Bioinformatics, 제13권, 페이지 17-24 (2015)* * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023244735A3 (en) * | 2022-06-15 | 2024-01-18 | Natera, Inc. | Methods for determination and monitoring of transplant rejection by measuring rna |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR102505618B1 (en) | 2023-03-03 |
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