KR20210023261A - 3차원 세포 배양 시스템 - Google Patents

3차원 세포 배양 시스템 Download PDF

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KR20210023261A
KR20210023261A KR1020190103231A KR20190103231A KR20210023261A KR 20210023261 A KR20210023261 A KR 20210023261A KR 1020190103231 A KR1020190103231 A KR 1020190103231A KR 20190103231 A KR20190103231 A KR 20190103231A KR 20210023261 A KR20210023261 A KR 20210023261A
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cell culture
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박규태
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주식회사 엘지화학
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Abstract

본 발명은 3차원 세포 배양 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 세포 배양 환경을 인체 내 환경에 보다 가깝게 모사할 수 있는 3차원 세포 배양 시스템에 관한 것이다.

Description

3차원 세포 배양 시스템{Three dimensional cell culture system}
본 발명은 3차원 세포 배양 시스템에 관한 것이다.
인체의 모든 조직 및 세포는 단층으로 이루어진 것이 아니라 입체적인 형태, 즉 3차원의 형태로 구성되어 있으며, 많은 연구를 통해 3차원 형태의 세포와 단층 세포의 형태에서 분자 생물학적인 발현이 다르다는 것이 밝혀지고 있어 가능한 생체 내와 유사한 환경을 모사하기 위해 3차원 세포 배양을 진행할 필요가 있다.
또한, 생체 내에서의 세포들은 독립적으로 구성되어 있지 않고 세포 외 기질(extracellular matrix)내에 존재하며, 세포는 세포 외 기질과 상호 작용하여 여러 생체 현상들이 일어나게 된다.
이처럼 생체 내의 실제 환경을 고려하여 생체와 보다 유사한 환경에서 세포 배양을 하기 위해 다양한 세포 배양 시스템의 개발이 이루어지고 있다.
예를 들어 미국 공개 특허 제 2018-0141047호에서는, 세포 배양물이 충전된 세포 배양 챔버 및 유체 흐름을 유도하기 위한 상기 세포 배양 챔버와 연통하는 유체 유로를 구비하는 본체부를 포함한, 시험관 내 3D 세포 배양 실험을 위한 마이크로 유체 장치를 제공한다.
그러나 상기 마이크로 유체 장치는 세포 엑세스 포트(access port)를 통해 배양 용기의 오픈된 상부로 세포 및 스케폴드 물질을 직접 주입하게 되어 있어, 세포 배양 용기 내로 세포를 주입한 후 시간이 지남에 따라 세포 외 기질(extracellular matrix) 내에서의 세포 성장에 따른 콜라겐(collagen) 수축 현상에 의해 세포층이 분리되는 현상이 생길 수 있다. 또한, 배양 용기의 상부로 세포를 주입할 경우 세포를 전 영역에 고르게 주입하기가 어렵다. 이는 불균일한 세포 성장과 내구성 저하로 이어지게 된다.
본 발명은 세포 배양 환경을 인체 내 환경에 보다 가깝게 모사할 수 있는 3차원 세포 배양 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 측면에 따르면,
상부면의 적어도 일부가 개방되어 있으며, 세포, 및 배양액이 충전되는 세포 배양 용기(cell culture chamber);
상기 세포 배양 용기의 측면과 연통하여 연결되며, 상기 세포 배양 용기 내부로 배양액(media)을 공급하는 하나 이상의 채널(channel); 및
상기 세포 배양 용기 및 채널을 둘러싸는 하우징;
을 포함하고,
상기 세포 배양 용기의 상부면보다 상기 하우징의 상부면이 더 높은, 3차원 세포 배양 시스템을 제공한다.
본 발명의 3차원 세포 배양 시스템에 따르면, 세포 배양 용기 내부로 배양액을 자동으로 공급하거나 교체해줄 수 있어, 프로그램화된 배양액 공급에 의해 반영구적인 세포 배양이 가능하다.
또한, 상기 세포 배양 용기로 세포, 배양액, 세포 외 기질 등을 자유롭게 주입할 수 있어 다양한 실험 설계가 가능하다.
따라서, 세포의 배양 환경을 인체 내 환경과 보다 유사하게 모사하거나, 실험자가 의도하는 배양 환경에 맞게 다양하게 변경하는 것이 가능하다.
또한, 상기 배양 용기 상부면의 적어도 일부가 개방된 상태로 외부 공기와 접촉한 상태로 유지할 수도 있으므로, 외부 미생물을 검출하기 위한 센서(sensor)로도 활용가능하다.
또한, 개방된 상부면으로 다층의 세포를 주입할 수 있으며, 주입된 세포층이 배양액에 의해 입체적으로 둘러싸는 형태이므로 인체와 유사한 환경을 더욱 안정적으로 구현할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 시스템의 사시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 시스템의 모식도이다.
도 3은 도 1의 A-A'에 따른 단면도이다.
도 4는 실시예 1 및 비교예 1에 따라 배양한 세포의 날짜에 따른 배양 상태의 이미지이다.
도 5는 실시예 1에 따라 40일간 배양한 세포(adipocyte)의 형광 이미지이다.
도 6은 실시예 1 및 비교예 1에 따라 배양한 세포의 혈관 형성에 대한 형광 이미지이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 예시적인 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 실시된 특징, 단계, 구성 요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 구성 요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명의 3차원 세포 배양 시스템에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 3차원 세포 배양 시스템은, 상부면의 적어도 일부가 개방되어 있으며, 세포, 및 배양액이 충전되는 세포 배양 용기(cell culture chamber); 상기 세포 배양 용기의 측면과 연통하여 연결되며, 상기 세포 배양 용기 내부로 배양액(media)을 공급하는 하나 이상의 채널(channel); 및 상기 세포 배양 용기 및 채널을 둘러싸는 하우징을 포함하고, 상기 세포 배양 용기의 상부면보다 상기 하우징의 상부면이 더 높은 것을 특징으로 한다.
인체의 모든 조직 및 세포는 단층으로 이루어진 것이 아니라 입체적인 형태, 즉 3차원의 형태로 구성되어 있으며, 많은 연구를 통해 3차원 형태의 세포와 단층 세포의 형태에서 분자 생물학적인 발현이 다르다는 것이 밝혀지고 있어 가능한 생체 내와 유사한 환경을 모사하기 위해서는 3차원적으로 세포 배양을 할 필요가 있다.
또한, 생체 내에서의 세포들은 독립적으로 구성되어 있지 않고 세포 외 기질(extracellular matrix)내에 존재하며, 세포 외 기질과 상호 작용하여 여러 생체 현상들이 일어나게 된다.
이처럼 생체 내의 실제 환경을 고려하여 생체와 보다 유사한 환경에서 세포 배양을 하기 위한 세포 배양 시스템이 필요하다.
종래의 가장 일반적인 웰 플레이트(well plate) 형태의 세포 배양 시스템은 웰 형태의 세포 배양 용기에 세포 및 배양액을 주입하면 이후 자동적인 배양액의 공급이 어려워 수작업으로 배양액을 공급하거나 교체하여야 한다. 또한 세포 외 기질이나 서로 다른 종류의 세포간의 상호 작용에 따른 현상을 관찰하기 어렵고 단순 세포 배양만이 가능하다.
이러한 단점을 보완하기 위하여 배양액 저장층, 멤브레인 층, 세포 배양층으로 이루어진 3 layer 플랫폼이나, 가운데에 세포 배양층을 두고 세포 배양층 양쪽에 배양액 공급 채널을 구비한 페이즈가이드(phase guide) 플랫폼과 같은 배양 시스템이 제안된 바 있다.
그러나 상기 배양 시스템은 하부층 또는 상하층을 통해서 배양액이 공급되는 형태로 실질적인 3차원 배양 시스템이라 보기 어려우며, 불균일한 영양 공급으로 인해 인체 내의 실제 세포의 증식, 분화, 또는 세포 외 기질과의 상호 작용 등을 인체 내 환경에 가깝게 모사한다고 평가하기 어렵다.
이에, 본 발명의 3차원 세포 배양 시스템에 의하면, 세포 배양 용기의 측면을 연통하여 연결되며, 상기 세포 배양 용기 내부로 배양액을 공급하는 하나 이상의 채널을 구비하여, 배양액을 자동으로 공급하거나 교체해줄 수 있다. 예를 들어, 상기 채널에 공급 펌프 및 센서를 구비하여 필요에 따라 배양액의 간헐적, 연속적, 주기적 공급이 모두 가능하다. 또한 채널의 유로를 따라 배양액이 흐름성을 가질 수 있으므로 세포 성장 속도가 더 빨라질 수 있다.
또한, 상기 세포 배양 용기의 상부면은 커버로 닫아 외부 환경으로부터 차단할 수도 있고, 또는 커버 없이 개방할 수도 있다. 상기 세포 배양 용기의 상부면의 적어도 일부가 개방된 형태일 때, 개방된 상부로 세포, 배양액, 세포 외 기질 등을 자유롭게 주입할 수 있어 다양한 실험 설계가 가능하다.
따라서, 세포의 배양 환경을 인체 내 환경에 보다 유사하게 모사하거나, 실험자가 의도하는 실험 설계에 맞게 다양하게 변경하는 것이 가능하며 종래의 세포 배양 시스템으로는 구현하기 어려웠던 문합(anastomosis) 현상의 구현이 가능하다.
또한, 자동화된 배양액 공급에 의해 반영구적인 세포 배양이 가능하며, 상기 배양 용기 상부면의 적어도 일부가 개방된 상태로 외부 공기와 접촉한 상태로 유지할 수도 있으므로, 이러한 특성을 이용하여 외부 미생물을 검출하기 위한 센서(sensor)로도 활용가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 시스템은, 상부면의 적어도 일부가 개방되어 있으며, 세포, 및 배양액이 충전되는 세포 배양 용기(cell culture chamber); 상기 세포 배양 용기의 측면과 연통하여 연결되며, 상기 세포 배양 용기 내부로 배양액(media)을 공급하는 하나 이상의 채널(channel); 및 상기 세포 배양 용기 및 채널을 둘러싸는 하우징을 포함하고, 상기 세포 배양 용기의 상부면보다 상기 하우징의 상부면이 더 높은 것을 특징으로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 시스템의 사시도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 시스템의 모식도이며, 도 3은 도 1의 A-A'에 따른 단면도이다.
도 1 내지 3을 참조하면, 본 발명의 3차원 세포 배양 시스템(300)은, 상부면(30)의 적어도 일부가 개방되어 있으며, 세포, 및 배양액이 충전되는 세포 배양 용기(100); 세포 배양 용기(100)의 측면과 연통하여 연결되며, 세포 배양 용기(100) 내부로 배양액을 공급하는 하나 이상의 채널(10a, 10b); 및 세포 배양 용기(100) 및 채널(10a, 10b)을 둘러싸는 하우징(200)을 포함하고, 세포 배양 용기(100)의 상부면(30)보다 하우징(200)의 상부면(40)이 더 높은 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 세포 배양 용기(100)는 상부면(30)의 적어도 일부가 개방되어 있으며, 세포 배양 용기(100) 내에는 세포, 및 배양액 등 세포 배양을 위한 물질들이 충전된다.
이때 상기 배양액(media)은 본 발명이 속하는 기술분야에서 세포 배양에 사용될 수 있는 것으로 제한없이 사용가능하다.
세포 배양 용기(100)의 형태는 특별히 제한되지 않으나, 상부면(30)의 적어도 일부가 오픈된 직육면체, 정육면체, 구, 타원구 등의 형태일 수 있으며, 직육면체 또는 정육면체일 경우 각 모서리는 둥근 형태인 것이 바람직하다.
세포 배양 용기(100)가 직육면체일 때, 그 크기는 특별히 제한되지 않으나, 인체 내의 세포가 외부로부터 영양분을 공급받는 거리를 고려하여 이와 유사한 크기인 것이 인체 내 환경 모사에 보다 바람직할 수 있다. 이를 고려할 때, 상기 직육면체의 한 변의 길이는 0.1 mm 이상, 또는 0.4 mm 이상, 또는 1 mm 이상이면서, 또는 15 mm 이하, 또는 12 mm 이하, 또는 10 mm 이하일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포 배양 용기(100)에는 세포, 및 배양액에 더하여 세포 외 기질 성분이 더 충전될 수 있다.
생체 내에서의 세포들은 세포만으로 구성되어 있지 않고 세포 외 기질 내에 존재하므로, 세포 배양 용기(100) 내에 세포 외 기질을 더 충전하여 배양할 때, 실제 세포 배양 환경과 보다 가깝게 배양이 가능하다.
또한, 하나 이상의 채널(10a, 10b)이 포함되는데 채널(10a, 10b)은 세포 배양 용기(100)의 측면과 연통하여 연결되며, 세포 배양 용기(100) 내부로 배양액을 공급, 순환시키는 유체 통로 역할을 한다.
도 1 내지 3에서는 채널이 두 개인 것으로 도시하였으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 필요에 따라 하나, 또는 세 개 이상의 채널을 구비할 수도 있다.
본 발명의 3차원 세포 배양 시스템(300)에서, 배양액 외에 세포 및/또는 세포외 기질은 세포 배양 용기(100)의 개방된 상부면(30)을 통해 주입하거나, 또는 채널과 별도로 세포 배양 용기(100)와 연통하는 주입부를 통해 주입될 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포 배양 용기(100)의 측면과 연통하여 연결되며, 세포 배양 용기 내부(100)로 세포를 주입하는 세포 주입부(20)를 더 포함할 수 있다. 세포 주입부(20)는 채널(10a, 10b)과 나란하게 병렬적으로 위치하거나, 또는 채널(10a, 10b)이 연결된 측면이 아닌 세포 배양 용기(100)의 다른 측면에 위치할 수도 있다.
상기 주입부를 통해 세포를 세포 배양 용기(100) 내부로 주입하면 세포가 상하로 낙하하는 것이 아니라 측면으로 확산(diffusion)하여 채워지므로, 세포 배양 용기(100) 내부의 전 부피 영역에 보다 고르게 채워질 수 있으며, 이에 따라 보다 균일한 세포 성장이 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 채널(10a, 10b)에 배양액을 공급하는 펌프 및 펌프 조절 센서(도면에는 미도시)를 더 포함할 수 있다.
상기 펌프 및 펌프 조절 센서를 구비함에 따라 필요에 따라 배양액의 공급 패턴을 자동화하여 간헐적, 연속적, 또는 주기적으로 공급할 수 있으며, 배양액의 공급 속도도 조절할 수 있다.
다시 도 1 내지 3을 참조하면, 하우징(200)이 하나 이상의 채널(10a, 10b) 및 세포 배양 용기(100)를 둘러싸며, 채널(10a, 10b) 및 세포 배양 용기(100)를 지지한다.
본 발명의 3차원 세포 배양 시스템에 있어, 세포 배양 용기(100)의 상부면(30)보다 하우징(200)의 상부면(40)이 더 높은 특징을 갖는다. 따라서, 세포 배양 용기(100)의 상부면(30)과 하우징(200)의 상부면(40) 사이에 단차(H)가 생기므로, 단차(H)를 채우면서 세포 배양 용기(100)의 개방된 상부면(30)을 통하여 추가적으로 배양액, 세포, 조직, 세포 외 기질 등을 자유롭게 주입할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 단차(H)의 범위는 0.1 mm 이상, 또는 0.5 mm 이상이면서, 15 mm 이하, 또는 10 mm 이하, 또는 5 mm 이하일 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
물론, 도면에는 도시하지 않았지만 필요하면 세포 배양 용기(100)의 상부면(30)을 덮는 커버를 추가함으로써, 세포 배양 용기(100) 내의 세포 배양 환경을 외부 환경으로부터 차단할 수도 있다.
또는, 세포 배양 용기(100)의 상부면(30)을 커버 없이 개방한 상태로 두어 외부 공기와 접촉된 상태로 둘 수도 있다.
도 1에서는 하나의 하우징 내에 하나의 세포 배양 용기가 구비되는 것으로 도시하였으나, 하나의 하우징 내에 복수 개의 세포 배양 용기를 포함하여, 상기 복수 개의 세포 배양 용기는 채널에 의해 서로 연통할 수 있다. 또한, 이때 상기 복수 개의 세포 배양 용기는 동일한 세포를 배양하거나, 서로 다른 종류의 세포를 배양할 수도 있다.
이처럼 하나의 세포 배양 시스템 내에 서로 연통하며, 서로 다른 종류의 세포를 배양하는 복수의 세포 배양 용기를 포함할 때, 서로 다른 세포 배양 용기에서 각각 분비된 세포 분비 물질이 채널을 따라 유동하여, 세포와 세포 간의 상호 작용 현상을 연구할 수도 있다.
또한, 본 발명의 3차원 세포 배양 시스템의 온도를 일정하게 유지하기 위한 온도 조절 장치를 더 포함할 수 있다.
이처럼 본 발명의 3차원 세포 배양 시스템은 자동화된 배양액 공급에 의해 반영구적인 세포 배양이 가능하며, 상기 배양 용기 상부면의 적어도 일부가 개방된 상태로 외부 공기와 접촉한 상태로 유지할 수도 있으므로, 이러한 특성을 이용하여 외부 미생물을 검출하기 위한 센서로도 활용가능하다.
예를 들어, 진공 청소기, 공기 청정기, 방충망, 자동차, 냉장고, 공조기, 클린룸 등에 적용하여 외부 미생물을 검출하는 바이오 센서로 유용하게 이용될 수 있다.
이하 발명의 구체적인 실시예를 통해 발명의 작용, 효과를 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 이는 발명의 예시로서 제시된 것으로 이에 의해 발명의 권리범위가 어떠한 의미로든 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
실시예 1
도 1 내지 3에 도시된 바와 같은 3차원 세포 배양 시스템에 EGM-2 (22011, PromoCell) 와 subcutaneous basal medium (BM-1, ZenBio) 의 1:1 혼합 배양액을 사용하여 human adipose-derived stem cells (hASCs) (7510, ScienCell) and primary human adipose microvascular endothelial cells (hAMECs) (7200, ScienCell) 세포를 온도 37℃, 상대 습도 90%의 조건에서 40일간 배양하였다. 배양한 세포는 Zeiss 사의 Axioscope 5 polarization microscope을 이용하여 이미지를 관측하였다.
비교예 1
실시예 1과 동일한 조건으로 세포 배양을 실시하되, WO2012-120102의 fig. 1과 같은 장치를 이용하여 40일간 배양하였다. 배양한 세포는 Zeiss 사의 Axioscope 5 polarization microscope을 이용하여 이미지를 관측하였다.
실시예 1 및 비교예 1의 날짜에 따른 세포의 배양 상태 이미지를 도 4에 나타내었다(왼쪽이 비교예 1, 오른쪽이 실시예 1, 스케일바 = 20 ㎛).
< 실험예 >
실시예 1 및 비교예 1에서 40일간 배양한 세포에 대해 형광 이미지 분석을 수행하였다.
먼저, hASCs로부터 성장한 adipocyte 임을 확인하기 위하여 실시예 1의 플랫폼 내에서 40일 배양한 시편에 대한 형광 이미지 분석을 수행하였다. 이를 위하여 rabbit polyclonal anti-perilipin-1 antibody (ab3526, 1:100, Abcam)를 이용한 staining을 진행하였다. Staining을 완료 후 Zeiss 사의 Confocal microscope을 이용하여 adipocyte를 관측한 이미지를 도 5(스케일바 = 20 ㎛)에 나타내었다.
추가적으로, 실시예 1 및 비교예 1 각각의 플랫폼 내 hASCs로부터 성장한 adipocyte 외에 40일간의 hAMEC 배양의 결과인 혈관 형성에 대한 형광 이미지 분석을 수행하였다. 이를 위하여 mouse monoclonal anti-CD31 (ab24590, 1:100, Abcam)로 혈관을 staining을 수행하였다. Staining을 완료 후 Zeiss 사의 Confocal microscope을 이용하여 관측한 이미지를 도 6(왼쪽이 비교예 1, 오른쪽이 실시예 1, 스케일바 = 20 ㎛)에 나타내었다.
도 4 내지 6을 참조하면, 실시예 1에서 세포가 훨씬 더 빠르고 안정적으로 배양되었음을 확인할 수 있다.

Claims (9)

  1. 상부면의 적어도 일부가 개방되어 있으며, 세포, 및 배양액이 충전되는 세포 배양 용기(cell culture chamber);
    상기 세포 배양 용기의 측면과 연통하여 연결되며, 상기 세포 배양 용기 내부로 배양액(media)을 공급하는 하나 이상의 채널(channel); 및
    상기 세포 배양 용기 및 채널을 둘러싸는 하우징;
    을 포함하고,
    상기 세포 배양 용기의 상부면보다 상기 하우징의 상부면이 더 높은, 3차원 세포 배양 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양 용기에는 세포 외 기질(extracelluar matrix)이 더 충전되는, 3차원 세포 배양 시스템.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양 용기의 개방된 상부면 상에 배양액 또는 세포를 포함하는, 3차원 세포 배양 시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 채널에 배양액을 공급하는 펌프 및 펌프 조절 센서를 더 포함하는, 3차원 세포 배양 시스템.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양 용기의 측면과 연통하여 연결되며, 상기 세포 배양 용기 내부로 세포를 주입하는 세포 주입부를 더 포함하는, 3차원 세포 배양 시스템.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양 용기의 상부면을 덮는 커버를 더 포함하는, 3차원 세포 배양 시스템.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양 용기는 직육면체, 정육면체, 구, 또는 타원구 형태인, 3차원 세포 배양 시스템.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 세포 배양 용기는 한 변의 길이가 0.1 내지 15 mm인 직육면체인, 3차원 세포 배양 시스템.
  9. 제1항에 있어서,
    복수 개의 세포 배양 용기를 포함하여, 상기 복수 개의 세포 배양 용기는 채널에 의해 서로 연통하는, 3차원 세포 배양 시스템.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350515A (zh) * 2022-01-11 2022-04-15 中国药科大学 用于内皮细胞三维培养灌注的器官芯片及其应用

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