KR20210021767A - 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 - Google Patents
유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체에 관한 것으로써,
조류독감 경구용 바이러스 백신 입자, 상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자상에 형성되는 유드라짓(Eudragit)층, 및 상기 유드라짓(Eudragit)층 상에 형성되는 가지형태들의 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 현재 혈청아형(subtype)이 다양하고 변이가 쉽게 일어나며, 자연생태계의 야생조류에도 다양한 종류의 바이러스가 분포하고 있는 조류독감을 간단하게 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체를 섭취하는 것만으로 체내에 조류독감 항체가 생기도록 함으로써, 조류가 조류독감에 걸리지 않도록 예방하는 효과가 있다.
조류독감 경구용 바이러스 백신 입자, 상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자상에 형성되는 유드라짓(Eudragit)층, 및 상기 유드라짓(Eudragit)층 상에 형성되는 가지형태들의 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 현재 혈청아형(subtype)이 다양하고 변이가 쉽게 일어나며, 자연생태계의 야생조류에도 다양한 종류의 바이러스가 분포하고 있는 조류독감을 간단하게 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체를 섭취하는 것만으로 체내에 조류독감 항체가 생기도록 함으로써, 조류가 조류독감에 걸리지 않도록 예방하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 고분자 소재를 이용한 백신 전달체와 백신과 전달체를 복합체화하는 기술에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 가금류에 적용이 가능한 경구용 조류독감 백신을 소화기관의 강한 산성, 소화효소 등의 환경에서 안정적으로 보호하고 소장과 같은 흡수기관에서 백신을 용출시키는 고분자 전달체 및 이를 백신과 복합체화 하는 기술이다.
조류독감은 조류인플루엔자 바이러스에 의해 조류가 감염되는 전염성 급성호흡기 질병으로 닭, 칠면조, 오리 등 가금류의 피해가 심각하게 나타난다. 바이러스 병원성에 따라 저병원성(H1N1등)과 고병원성(H5N1, H5N8, H5N6등)조류인플루엔자로 구분되며 고병원성 조류인플루엔자에 감염된 가금류는 급성 호흡기증상을 보이며 100%에 가까운 폐사를 나타내는 것이 특징이다.
매년 국내에서 발생하는 조류독감으로 인해 해마다 1000만마리 이상의 가금류가 살처분되고 특히 2016~2017년에는 2000만마리 이상 살처분 되는 역사이래 최악의 피해가 발생하기도 하였다.
조류인플루엔자 바이러스는 혈청아형(subtype)이 다양하고 변이가 쉽게 일어나며, 자연생태계의 야생조류에도 다양한 종류의 바이러스가 분포되어 있다.
현재까지 국내에 유행된 조류인플루엔자 바이러스는 H5N1형, H5N8형, H5N6형이고 독감 바이러스의 특성상 빈번한 변이로 인해 새로운 바이러스의 유행에 대처가 어려운 상황이다.
국내외 연구 개발 현황을 살펴보면, 바이러스 유사입자를 이용한 단일 조류 인플루엔자 감염을 방어하는 근육경로 접종, 또는 흡입경로 접종 방식의 연구개발은 있다. 그러나 동시에 여러 종류 변형 바이러스 감염을 방어하는 범용 바이러스 유사입자 백신 및 상기 백신의 경구용 백신 전달체에 대한 연구개발이 전무한 상황이다.
이에 따라 본 발명은 바이러스와 유사한 캡시드 (capsid) 단백질 또는 매트릭스 단백질을 과발현시켜, 바이러스 유사입자를 대량으로 생산하는 유전자재조합 기술(바이러스 유사입자 기술)을 도입하여, 감염원의 항원성을 지닌 단백질 또는 당단백질을 바이러스 유사입자 표면에 노출되게 하였다. 이렇게 제조된 바이러스 유사입자는 바이러스와 거의 유사한 특징을 가지지만 바이러스의 유전자 및 복제능이 전혀 없는 바이러스이다. 이러한 바이러스를 경구용 백신 전달체로 캡슐화하여 구강으로 간편하게 섭취할 수 있게 함으로써, 바이러스를 직접 이용하는 기술임에도 불구하고 매우 안전하면서도 빠른 대처가 가능하도록 하는 백신 전달체를 개발하였다.
Virus-Like Particle Vaccine Induces Protective Immunity against Homologous and Heterologous Strains of Influenza Virus. Journal of Virology, 2007
Stability Kinetics of Influenza Vaccine Coated onto Microneedles During Drying and Storage. Pharmaceutical Research, 2011
Incorporation of Membrane-Anchored Flagellin into Influenza Virus-Like Particles Enhances the Breadth of Immune Responses. Journal of Virology, 2008)
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 조류가 섭취하는 물, 사료 등에 혼합하여 사용할 수 있는 전달체를 포함하는 조류독감 백신 복합체에 관한 것으로, 닭을 비롯한 조류에 주사를 통한 백신의 예방접종이 현실적으로 어려우므로, 소화기관에서 안정성을 유지하고 최종 목적 기관에서 조류독감 백신이 효과적으로 용출되는 전달체-백신 복합체와 그 제조방법 발명을 통해 조류독감을 사전에 예방하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체를 제공한다.
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체의 경구용 바이러스 백신은 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자이고, 상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자상에 형성되는 고분자 유드라짓(Eudragit)층, 및 상기 유드라짓(Eudragit)층 상에 형성되는 가지형태들의 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체를 제공함으로써, 현재 혈청아형(subtype)이 다양하고 변이가 쉽게 일어나며, 자연생태계의 야생조류에도 다양한 종류의 바이러스가 분포하고 있는 조류독감을 간단하게 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체를 섭취하는 것만으로 체내에 조류독감 항체가 생기도록 유도하여, 조류가 조류독감에 걸리지 않도록 예방하는 효과가 있다.
도 1 은 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)가 pH(수소이온농도)에 따라 전달되는 과정 및 백신 방출 모식도를 도시하였다.
도 2 는 소태아혈청(BSA)을 이용하여 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)를 제조하는 방법을 도시하였다.
도 3 은 소태아혈청(BSA)을 이용하여 제조한 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)의 pH 안정성과 pH에 따른 BSA 방출 결과를 도시하였다.
도 4 는 H1N1 조류독감 백신(PR8)을 이용하여 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)를 제조하는 방법을 도시하였다.
도 5 는 백신을 포함하지 않은 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle) 및 H1N1 조류독감 백신(PR8)을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)의 Scanning Electron Microscope(SEM) 촬영 결과를 도시하였다.
도 6 은 H1N1 조류독감 백신(PR8)을 이용하여 제조한 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)의 pH 안정성과 pH에 따른 H1N1 조류독감 백신 방출 결과를 도시하였다.
도 7 은 H1N1 조류독감 백신(PR8)을 이용하여 제조한 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)의 H1N1 조류독감 백신 방출을 재확인한 결과를 도시하였다.
도 8 은 M2e 조류독감 바이러스 유사입자 백신을 이용하여 제조한 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(virus-like particle, VLP)의 Poly Dispersity Index (PDI)값과 z-potential 값을 도시하였다.
도 9 는 M2e 조류독감 바이러스 유사입자 백신을 이용하여 제조한 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(virus-like particle, VLP)의 pH 안정성과 pH에 따른 M2e 조류독감 바이러스 유사입자 백신 방출 결과를 도시하였다.
도 10 은 본원발명의 조류독감 경구용 바이러스 백신의 HA(Hemagglutinin) Activity를 확인하기 위한 HA Titer test 결과를 도시하였다.
도 2 는 소태아혈청(BSA)을 이용하여 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)를 제조하는 방법을 도시하였다.
도 3 은 소태아혈청(BSA)을 이용하여 제조한 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)의 pH 안정성과 pH에 따른 BSA 방출 결과를 도시하였다.
도 4 는 H1N1 조류독감 백신(PR8)을 이용하여 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)를 제조하는 방법을 도시하였다.
도 5 는 백신을 포함하지 않은 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle) 및 H1N1 조류독감 백신(PR8)을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)의 Scanning Electron Microscope(SEM) 촬영 결과를 도시하였다.
도 6 은 H1N1 조류독감 백신(PR8)을 이용하여 제조한 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)의 pH 안정성과 pH에 따른 H1N1 조류독감 백신 방출 결과를 도시하였다.
도 7 은 H1N1 조류독감 백신(PR8)을 이용하여 제조한 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)의 H1N1 조류독감 백신 방출을 재확인한 결과를 도시하였다.
도 8 은 M2e 조류독감 바이러스 유사입자 백신을 이용하여 제조한 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(virus-like particle, VLP)의 Poly Dispersity Index (PDI)값과 z-potential 값을 도시하였다.
도 9 는 M2e 조류독감 바이러스 유사입자 백신을 이용하여 제조한 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(virus-like particle, VLP)의 pH 안정성과 pH에 따른 M2e 조류독감 바이러스 유사입자 백신 방출 결과를 도시하였다.
도 10 은 본원발명의 조류독감 경구용 바이러스 백신의 HA(Hemagglutinin) Activity를 확인하기 위한 HA Titer test 결과를 도시하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 형태에 따라 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체를 제공한다.
상기 경구용 바이러스 백신은 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자이고, 상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자상에 형성되는 유드라짓(Eudragit)층, 및 상기 유드라짓(Eudragit)층 상에 형성되는 가지형태들의 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층을 포함한다.
상기 유드라짓(Eudragit)층은 pH(수소이온지수) 감응성 고분자층으로 pH 2 내지 6 미만에서는 잘 이온화되지 않고, pH 6 내지 8에서 잘 이온화 되어 유드라짓이 감싸고 있는 조류독감 경구용 백신 입자가 중성pH에서 잘 방출 될 수 있도록 한다.
상기 유드라짓(Eudragit)층은 유드라짓(Eudragit)의 소수성 부분과 백신 단백질의 소수성 부분이 서로 만나 결합하여 형성된 층이고, 백신 단백질의 친수성 부분이 유드라짓과 결합하여 유드라짓(Eudragit) 층의 외각에 돌출될 수 있다.
상기 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층은 상기 유드라짓(Eudragit)층 외각에 돌출된 유드라짓(Eudragit)과 백신 단백질 복합체의 단백질 친수성 부분을 감싼다. 상기 유드라짓(Eudragit)층 외각에 돌출된 유드라짓(Eudragit)과 백신 단백질 복합체의 단백질 친수성 부분을 PVA가 감싸면서 백신단백질 보호 및 입자의 견고성을 유지한다.
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 수용액 상태에서 안정적으로 존재할 수 있으며, 이는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체의 최외각부위인 친수성 가지형태의 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층으로 인한 것이다.
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 그 크기가 250 내지 550nm 크기일 수 있다.
조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 pH7에서 전위차(Z-potential)값이 -30 내지 -40 mV 일수 있다.
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 다 분산 지수(Poly Dispersity Index)가 평균 0.03 내지 0.05일 수 있다.
본 발명의 다른 형태에 따라 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법을 제공한다.
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법은 1) 조류독감 경구용 바이러스 백신을 소수성 용매인 디클로로메탄(dichloro methane, DCM)에 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계, 2) 상기 혼합물을 고분자 유드라짓(Eudragit)이 녹아 있는 수용액과 혼합하여 초음파 처리하는 단계, 3) 상기 초음파 처리한 혼합물을 폴리바이닐알콜(Polyvinyl-alcohol, PVA) 용액과 다시 혼합 후 초음파 처리하여 W/O/W 에멀젼을 제조하는 단계, 4) 상기 W/O/W 에멀젼에 들어있는 디클로로메탄(dichloro methane, DCM)을 제거한 후 나노파티클을 수거하는 단계, 및 5) 상기 나노파티클을 세척하는 단계를 포함한다.
상기 2)단계의 초음파 처리는 2분동안 수행할 수 있다.
상기 3)단계의 초음파 처리는 10분동안 수행할 수 있다.
상기 4)단계의 W/O/W 에멀젼에 들어있는 디클로로메탄(dichloro methane, DCM) 제거는 W/O/W 에멀젼을 12시간 흔들어서 제거할 수 있다.
상기 W/O/W 에멀젼은 물 성분, 기름 성분, 물 성분의 순서로 첨가하여 제조되는 에멀젼을 의미할 수 있다.
상기 4)단계의 나노파티클을 수거는 상기 디클로로메탄(dichloro methane, DCM)이 제거된 W/O/W 에멀젼을 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액은 버리고 가라앉은 침전물을 수거하는 것이다.
상기 5)단계의 나노파티클을 세척하여 수거하는 것은 상기 나노파티클을 증류수(distilled water, DW)로 용해한 후 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액과 침전물 분리를 총 2회 수행하는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1.
소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA) 5㎎을 포함한 수용액을 소수성 용매인 디클로로메탄(dichloro methane, DCM) 2㎖에 혼합하고 고분자 유드라짓 50mg이 녹아 있는 수용액과 혼합하여 2분간 초음파 처리하고, 폴리바이닐알콜(Polyvinyl-alcohol, PVA)용액과 다시 혼합하여 10분간 초음파 처리하여 W/O/W 에멀젼을 제조한다.
상기 W/O/W 에멀젼을 12시간 흔들어서 DCM을 제거하고, 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 분리하고, 튜브 바닥에 생성된 침전물을 3차 증류수 (distilled water, DW)로 용해한 후 다시 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 분리하며 이 과정을 총 2번 진행 하여 얻어진 침전물을 회수하여 최종 나노파티클을 획득함으로써 바이러스 백신 전달체를 제조한다.
실시예 2.
불활성화 인플루엔자백신 H1N1 (inactivated H1N1 Vaccine) 500μg을 포함한 수용액을 소수성 용매인 디클로로메탄(dichloro methane, DCM) 2㎖에 혼합하고 고분자 유드라짓 50mg이 녹아 있는 수용액과 혼합하여 2분간 초음파 처리하고, 폴리바이닐알콜(Polyvinyl-alcohol, PVA) 용액과 다시 혼합하여 10분간 초음파 처리하여 W/O/W 에멀젼을 제조한다.
상기 W/O/W 에멀젼을 12시간 흔들어서 DCM을 제거하고, 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 분리하고, 튜브 바닥에 생성된 침전물을 3차 증류수 (distilled water, DW)로 용해한 후 다시 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 분리하며, 상기 3차 증류수로 침전물을 용해 후 원심 분리하는 과정을 전체 총 2번 진행 하여 얻어진 침전물을 회수하여 최종 나노파티클을 획득함으로써 바이러스 백신 전달체를 제조한다.
실시예 3.
M2e 바이러스 유사입자 (virus-like particle, VLP)백신 500μg을 포함한 수용액을 소수성 용매인 디클로로메탄(dichloro methane, DCM) 2㎖에 혼합하고 고분자 유드라짓 50mg이 녹아 있는 수용액과 혼합하여 2분간 초음파 처리하고, 폴리바이닐알콜(Polyvinyl-alcohol, PVA) 용액과 다시 혼합하여 10분간 초음파 처리하여 W/O/W 에멀젼을 제조한다.
상기 W/O/W 에멀젼을 12시간 흔들어서 DCM을 제거하고, 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 분리하고, 튜브 바닥에 생성된 침전물을 3차 증류수 (distilled water, DW)로 용해한 후 다시 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 분리하며, 상기 3차 증류수로 침전물을 용해 후 원심 분리하는 과정을 전체 총 2번 진행 하여 얻어진 침전물을 회수하여 최종 나노파티클을 획득함으로써 바이러스 백신 전달체를 제조한다.
측정예 1.
상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 최종 바이러스 백신 전달체(나노파티클) 샘플을 pH7의 버퍼용액에 용해 후 12시간 방치 후 동적 광 산란법 (DLS, Dynamic Light Scattering)으로 파티클의 사이즈, 다분산지수 (PDI, Polydispersity Index), 제타전위(Z-potential)를 측정하였다.
측정결과는 하기 표 1에 도시하였다.
BSA-NP | H1N1-NP | M2e-NP | |
Particle size (nm) | 378.73±10.49 | 273.26±1.31 | 282.91±2.14 |
PDI | 0.05±0.017 | 0.02±0.019 | 0.03±0.007 |
z-potential (mV) | -35.78±1.42 | -36.78±3.65 | -31.26±1.88 |
Encapsulation Efficiency (%) | 48.29±6.45 | 91.25±4.33 | 87.67±9.13 |
상기 표 1을 참조하면 M2e VLP 백신으로 제조한 바이러스 백신 전달체(나노파티클)의 사이즈는 282.91nm로 이상적인 나노사이즈를 형성하였다.
PDI 측정값 범위는 0 내지 1사이로, 0.5 이하면 비교적 균질화된 샘플인데, M2e VLP 백신으로 제조한 바이러스 백신 전달체(나노파티클)의 PDI는 0.03으로 매우 균질화된 나노파티클이 만들어졌음을 확인할 수 있었다.
z-potential은 0에 가까울수록 분산이 안되고 엉겨붙을 가능성이 높지만 M2e VLP 백신으로 제조한 바이러스 백신 전달체(나노파티클)의 측정값은 -31.26mV로 각 나노입자간의 반발력이 크고 안정하여 분산이 잘되어 있음을 확인할 수 있었다.
측정예 2.
상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 최종 바이러스 백신 전달체(나노파티클)샘플을 pH2, pH5, pH7의 버퍼용액에 용해 후 12시간 방치 후 동적 광 산란법(DLS, Dynamic Light Scattering)으로 파티클의 사이즈, 다분산지수 (PDI, Polydispersity Index), 제타전위(Z-potential)를 측정하여 pH stability를 비교하였다. 결과는 도 3, 도 6, 도 9에 각각 도시하였다.
도 3, 도 6, 도 9의 pH stbility 결과를 참조하면, 상기 도 3은 실시예 1, 상기 도 6은 실시예 2, 상기 도 9는 실시예 3에서 제조한 최종 바이러스 백신 전달체(나노파티클) 샘플의 파티클의 크기와 제타전위(Z-potential) 가 pH 조건에 따라 변화하는 특성을 나타내고 있으며, 도 3, 도 6, 도 9의 pH stbility에서 pH7 버퍼용액 실험결과의 경우 입자간의 사이가 벌어져서 파티클의 사이즈가 증가하고, 이로 인해 백신 방출이 용이하여지며, 또한 제타전위(Z-potential)값은 감소하는 특성을 확인 할 수 있었다.
측정예 3.
상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 최종 바이러스 백신 전달체(나노파티클) 샘플을 pH2, pH5, pH7의 용액에 용해후 0시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 5시간, 8시간, 20시간에 각각 샘플을 취하여 원심분리 후 상등액에 들어 있는 각 실시예들의 입자(실시예 1은 BSA, 실시예 2는 H1N1, 실시예 3은 M2e)의 농도를 측정하여 pH에 따라 시간대별로 바이러스 백신 전달체(나노파티클)에서 용출되는 입자의 양을 측정한다.
결과는 도 3, 도 6, 도 9에 pH Release Test에 도시하였다.
도 3, 도 6, 도 9의 pH Release Test 결과를 참조하면, 상기 도 3은 실시예 1, 상기 도 6은 실시예 2, 상기 도 9는 실시예 3에서 제조한 최종 바이러스 백신 전달체(나노파티클)들이 각각 pH 환경하에서 바이러스 백신 전달체(나노파티클)에서 용출되는 입자의 양을 확인하고 pH2, pH5의 용출정도가 pH7에 비하여 훨씬 낮음을 확인하였다. 이는 해당 바이러스 백신 전달체(나노파티클)가 낮은 pH에서 단백질을 보호 할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
측정예 4.
실시예 1의 제조방법으로 제조된 바이러스 백신 전달체(나노파티클)과 실시예 1의 제조방법에서 BSA없이 제조된 바이러스 백신 전달체(나노파티클)를 SEM(Scanning Electron Microscope) 주사전자현미경을 이용하여 각 나노파티클 입자를 촬영하였다.
촬영 결과는 도 5에 도시하였다.
도 5를 참조하면, 도 5는 물에 분산된 바이러스 백신 전달체(나노파티클) 시료를 촬영한 것이 아닌 동결건조 후의 시료를 촬영한 것으로 바이러스 백신 전달체(나노파티클)들이 균일하게 형성되어 있음을 확인 할 수 있었다.
측정예 5.
사독백신 H1N1 바이러스 백신 전달체(나노파티클)의 항원성을 측정하기 위하여 NP20㎍ (H1N1 nanoparticle 20㎍), NPFD20㎍ sucrose O (sucrose를 첨가하여 동결건조(Freeze-dried)된 H1N1 nanoparticle 20㎍), NPFD20㎍ sucrose X(sucrose를 첨가하지 않고 동결건조(Freeze-dried)된 H1N1 nanoparticle 20㎍), PR8 inact 20μg(대조군으로써 일반 H1N1사독백신 20㎍)을 이용하여 혈구응집반응실험 (hemagglutination assay)을 진행하였다.
결과는 도 10에 도시하였다.
도 10을 참조하면, 대조군인 PR8 inact 20μg군의 HA Titer가 1:8인 것에 비해 NP20㎍은 HA Titer가 1:64, NPFD20㎍ sucrose O 군은 HA Titer가 1:256로 더 좋은 항원성을 가진 것으로 확인되었다.
이는 바이러스 백신 전달체(나노파티클) 제조과정에서 백신의 항원성이 감소되지 않았음을 확인할 수 있고, 동결건조(Freeze-dried)시에는 Sucrose을 사용하면 백신의 항원성이 감소되지 않음을 확인 할 수 있었다. 반대로 Sucrose을 사용하지 않으면 동결건조시 백신의 항원성이 없어짐을 확인 할 수 있었다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (14)
- 경구용 바이러스 백신 전달체에 있어서,
상기 경구용 바이러스 백신은 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자이고;
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자상에 형성되는 유드라짓(Eudragit)층; 및
상기 유드라짓(Eudragit)층 상에 형성되는 가지형태들의 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층을 가지는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자는 불활성화 조류독감 인플루엔자 백신 또는 조류독감 바이러스 유사입자인 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 유드라짓(Eudragit)층은 유드라짓(Eudragit)의 소수성 부분과 상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자의 백신 단백질의 소수성 부분이 서로 만나 결합하여 형성되는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 유드라짓(Eudragit)층은 pH(수소이온지수) 감응성 고분자층으로 pH 2 내지 5에서는 이온화되지 않는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층은 상기 유드라짓(Eudragit)층 외각에 돌출된 유드라짓(Eudragit)과 백신 단백질 복합체의 단백질 친수성 부분을 감싸는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 250 내지 550nm 크기인 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
- 제1항에 있어서,
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 pH7에서 전위차(Z-potential)값이 -30 내지 -40 mV인 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
- 제1항에 있어서,
기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 다 분산 지수(Poly Dispersity Index)가 평균 0.03 내지 0.05인 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
- 1) 조류독감 경구용 바이러스 백신을 소수성 용매에 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계,
2) 상기 혼합물을 고분자 유드라짓(Eudragit)이 녹아 있는 수용액과 혼합하여 초음파 처리하는 단계,
3) 상기 초음파 처리한 혼합물을 폴리바이닐알콜(Polyvinyl-alcohol, PVA) 용액과 다시 혼합 후 초음파 처리하여 W/O/W 에멀젼을 제조하는 단계,
4) 상기 W/O/W 에멀젼에 들어있는 디클로로메탄(dichloro methane, DCM)을 제거한 후 나노파티클을 수거하는 단계, 및
5) 상기 나노파티클을 세척하여 수거하는 단계를 포함하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법.
- 제9항에 있어서,
상기 1)단계의 소수성 용매는 디클로로메탄(dichloro methane, DCM)인 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법.
- 제9항에 있어서,
상기 2)단계의 초음파 처리는 2분동안 수행하는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법.
- 제9항에 있어서,
상기 3)단계의 초음파 처리는 10분동안 수행하는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법.
- 제9항에 있어서,
상기 4)단계의 W/O/W 에멀젼에 들어있는 디클로로메탄(dichloro methane, DCM) 제거는 W/O/W 에멀젼을 12시간 흔들어서 제거하는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법.
- 제9항에 있어서,
상기 5)단계의 나노파티클을 세척하여 수거하는 것은 상기 나노파티클을 증류수(distilled water, DW)로 용해한 후 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액과 침전물 분리하는 것을 총 2회 수행하는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법.
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Incorporation of Membrane-Anchored Flagellin into Influenza Virus-Like Particles Enhances the Breadth of Immune Responses. Journal of Virology, 2008) |
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