KR20210020008A - 눈 질환을 치료하는 탈메틸화 - Google Patents

Abstract

노화 관련 눈 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 제공된다. 하나 이상의 탈메틸화 화합물 또는 제제를 투여함으로써 대상체에서 노화 관련 눈 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 제공된다.

Description

눈 질환을 치료하는 탈메틸화

본 발명은 안과학 및 세포 생물학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 노화 관련 황반 변성 (AMD) 및 기타 눈 질환의 치료에 관한 것이다.

인구 관점으로부터, 실제 연령은 논의가능하게 노화 관련 질환의 위험, 정신적 및 신체적 수행 능력 및 사망률을 예측하는 데 가장 중요한 생물학적 형질이다 [1]. 그러나, 실제 연령의 사용은 유사한 연령대 개체 간의 큰 생물학적 차이를 설명하는데 곤란하다. 생물학적 연령은 생활 방식, 유전학, 질환 및 환경에 의해 영향을 받는 다양한 노화 상태를 정량화하려는 개념이다. 또한 흡연 및 식이요법과 같은 환경 및 생활 방식 선택도 노화 관련 질환과 관련하여 분명한 의미를 갖는다 [2]. 역학적 연구는 인간 수명에 미치는 영향에 대한 정량적 평가를 제공하는데 성공하였던 한편, 분자생물학의 진보는 이제 인구의 사망률 문제를 넘어 단일 유기체 내의 노화에 미치는 질환과 기타 요인의 특이적 효과를 조사하는 능력을 제공한다.

광범위한 연령대에 걸친 대규모 인간 집단의 전혈 시료로부터 470,000개의 CpG 마커를 측정함으로써 게놈 차원의 DNA 메틸화 양상을 기반으로 한 노화의 정량적 모델이 개발되었다 [3]. 이러한 방법은 연령을 예측하는데 매우 정확하며, 또한 성별, 유전적 변이 및 질환을 포함한 노화 관련 요인을 구별할 수도 있다 [3, 4]. 이 모델은 다수의 조직에서 작동하여, 메틸롬 (methylome)의 변화에 의해 부분적으로 조절되는 보편적인 분자 시계의 가능성을 제시한다. 또한 이러한 메틸화 양상은 세포성 노화 및 신체 노화와 밀접한 관련이 있다. 여러 유전자는 실제 연령이 증가하면서 점진적으로 더 많이 메틸화되는 것으로 관찰되었다. 구체적으로, ELOVL2 (매우 긴 사슬 지방산의 연장-유사 2)는 노화 모델에 의해 밝혀진 바와 같이, 인간이 노화되면서 매우 신뢰가능하게 메틸화 증가를 나타낸다 [3].

ELOVL2는 긴 (C22 및 C24) ω3 및 ω6 다중불포화 지방산 (VLC-PUFA)의 합성에 관여하는 막통과 단백질을 인코딩한다 [5]. 구체적으로, ELOVL2는 도코사펜타엔산 (DPA) (22 : 5n-3)을 22 : 6n-3, 도코사헥사엔산 (DHA) [6]의 전구체인 24 : 5n-3으로 전환시킬 수 있다. DHA는 망막과 뇌의 주요 다중불포화 지방산 (PUFA)이다. 광 수용체의 존재는 건강한 망막 기능을 촉진하고, 밝은 광 및 산화 스트레스로 인한 손상을 방어한다. 낮은 ELOVL2 발현은 낮은 수준의 DHA와 연관되어 왔으며 [7], 이는 또한 다른 망막 퇴행성 질환 중에서 노화 관련 황반 변성 (AMD)과 관련이 있었다 [8]. 일반적으로, PUFA는 에너지 생산, 염증의 조절 및 세포막 특성의 유지를 포함한 중요한 생물학적 기능에 관여한다. 따라서, ELOVL2 메틸화가 다양한 생물학적 경로의 조절을 통해 노화 과정에서 역할을 담당하는 것이 가능하다.

AMD는 황반의 퇴행성 질환으로 선진국에서 노인 실명의 주요 원인이다. 이것은 유전적, 환경적 및 대사적 요인이 관여하는 다인성 질환이며, 현재까지 이에 대한 완치법 또는 효과적인 예방법은 없다. 많은 유전자가 위험 요인으로서 확인되어 왔지만, 많은 유전자는 아직도 알려지지 않고 있다. AMD가 진행되면서, 시야 중앙이 흐려지고 결국 사각 지대가 발생할 수 있다. AMD는 습성 AMD와 건성 AMD의 두 가지 형태로 발생한다. AMD 환자 중 약 90%가 고생하는 건성 AMD에서, 보통 드루젠으로 불리는 무세포 다형성 잔재물의 초점 침착은 이 질환에서 가장 먼저 관찰되는 임상적 표식이다. ELOVL4는 VLC-PUFA의 합성에 관여하는 또 다른 지방산 연장효소 (elongase)로, 시력 상실을 초래하는 황반 변성의 청소년 형태인 스타르가르트 황반 이영양증과 연루되어 있다 [9, 10].

AMD는 망막의 산화 스트레스와 관련되어 왔다 [11]. 산화 스트레스는 염증을 유발하고, 대식세포 활성화를 발생시킬 수 있다 [12]. 산화된 인지질은 산화 스트레스의 신뢰할만한 마커인 것으로 나타났으며, 이들은 망막 색소 상피 (RPE)와 대식세포에 결합함으로써 염증을 개시하고, 하류의 염증 캐스케이드를 활성화한다 [13]. 또한 산화 변형된 단백질과 지질은 드루젠 및 브루흐 막에서도 발견되었다 [14]. 망막에서 매우 풍부한 인지질인 포스파티딜콜린은 중요한 포스포콜린을 포함한다. 포스포콜린의 산화 에피토프는 포스포콜린에 대한 천연 항체인 TEPC-15에 의해 인식될 수 있으며 [15], 인간 AMD 눈에서 드루젠과 함께 국소화되는 것으로 관찰되었다 [16]. 또한 AMD와 관련된 주요 단백질 중 하나인 HTRA1도 AMD 눈에서 드루젠과 함께 국소화되는 것으로 밝혀졌다 [17]. 또한, C3 보체 단편, C5 및 막 공격 복합체 C5b-9를 포함하여 보체 캐스케이드의 여러 구성요소가 드루젠 내에서 발견되었다 [18].

노화 관련 황반 변성을 치료하는 새로운 방법이 필요하다.

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 2018년 6월 11일 및 2018년 8월 9일에 각각 출원된 미국 가출원 62/683,292 및 62/716,554의 우선권을 주장하며, 이들 출원은 본원에 참고문헌으로 통합되어 있다.

서열목록

본 출원은 ASCⅡ 포맷으로 전자 출원된 서열목록을 포함하며, 이의 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다. 2019년 5월 20일에 작성된 상기 ASCⅡ 사본은 24978-0488_SL.txt로 명명되고, 17,271 바이트의 크기를 갖는다.

본 발명은 노화 관련 눈 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 방법은 하나 이상의 핵산 탈메틸화 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 노화 관련 눈 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 노화 관련 눈 질환 또는 병태가 노화 관련 황반 변성인 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 탈메틸화 화합물이 5-아자사이티딘, 데시타빈, 제불라린, 프로카인아미드, 프로카인, 하이드라라진, 발프로산 및 EGCG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 조성물이 안과 투여를 위해 제형화되는 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 투여가 눈에 비경구로 시행되는 점을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 노화 관련 눈 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, ELOVL2의 발현을 이를 필요로 하는 환자에서 증가시키는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 발현을 ELOVL2 프로모터의 탈메틸화에 의해 증가시키는 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 발현을 아데노 관련 바이러스 전달을 사용하여 ELOVL2 mRNA의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 증가시키는 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 안과적으로 허용가능한 제형물에 핵산 탈메틸화 화합물을 포함하는 안과용 약제학적 조성물을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 탈메틸화 화합물이 5-아자사이티딘, 데시타빈, 제불라린, 프로카인아미드, 프로카인 및 EGCG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 제공한다.

다른 구현예에서, 방법은 아데노 관련 바이러스 전달을 사용하여 ELOVL2 mRNA의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고문헌으로 통합되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고문헌으로 통합된다.

도 1a 내지 1d는 WI-38 세포에서 ELOVL2 발현 및 메틸화를 나타낸다. 도 1a는 WI-38 세포의 PD35, 45, 55에서 qPCR에 의한 ELOVL2 발현을 나타낸다. 더 높은 입력%는 더 높은 DNA 메틸화를 나타낸다. (**p <0.005 ANOVA, *p <0.05, t-테스트). 도 1b는 WI-38 세포에서 ELOVL2 프로모터 영역의 메틸화 수준을 메틸화 DNA 면역 침강에 이어진 qPCR에 의해 나타낸다. 프라이머는 CpG 마커 cg16867657, cg24724428 및 cg21572722를 포함하는 영역을 증폭시킨다. 도 1c는 시간 경과 시 적용된 표면적에 의해 측정된 WI-38 녹다운 세포 및 루시퍼라제 녹다운 대조군의 증식을 나타낸다. 도 1d는 WI-38 녹다운 세포에서 베타-갈락토시다제 염색에 의한 노화 백분율을 나타낸다. (n = 3, *p <0.05, **p <0.005, t-테스트).
도 2a 내지 2c는 WI-38 세포의 PD52에서 DNA 메틸화를 조작하는 것을 나타낸다. 도 2a는 미처리된 대조군 및 5-Aza-dc 처리된 WI-38 세포에서 MeDIP에 이어진 qPCR에 의해 측정된 ELOVL2 프로모터 메틸화를 나타낸다. 도 2b는 미처리된 대조군 및 5-Aza-dc 처리된 WI-38 세포에서 qPCR에 의한 ELOVL2 발현을 나타낸다. 도 2c는 2 μM 5-Aza-dc로 처리된 WI-38 세포에서 베타-갈락토시다제 염색에 의한 노화 백분율을 나타낸다. (n = 3, *p <0.05, t-테스트).
도 3a 내지 3e는 ELOVL2 및 망막을 나타낸다. 도 3a는 다양한 연령의 마우스에서 qPCR에 의한 마우스 망막에서의 ELOVL2 발현을 나타낸다. 도 3b는 다양한 연령의 마우스 망막에서 ELOVL2의 웨스턴 블럿을 나타낸다; 별표 - 비-특이적 밴드. 도 3c는 다양한 연령의 마우스 망막에서 ELOVL2 프로모터 메틸화를 나타낸다. 도 3d는 2, 6, 12 및 24개월령의 야생형 마우스의 자가형광 촬영을 나타낸다. 암순응 반응의 대표적인 ERG 추적이 영상 아래에 표시된다. 도 3e는 ERG b-파동 진폭을 통해 표시된 다양한 연령의 마우스에서 암순응 반응을 나타낸다. (n = 4, **p <0.005, ANOVA).
도 4a 내지 4e는 ELOVL2 운명 교체된 마우스에서 망막 표현형을 나타낸다. 도 4a는 ELOVL2의 기질 특이성을 변경하는 CRISPR-Cas9 매개성 전략을 나타낸다. 도 4a는 순서대로 서열번호 17 내지 20을 각각 개시한다. 도 4b는 야생형 및 동형접합 운명 교체된 마우스 안저의 자가형광 촬영을 나타낸다. 암순응 ERG 반응은 영상 아래의 추적으로 표시된다. 도 4c는 6개월령 야생형 및 프레임시프트 돌연변이 마우스에서 ERG로부터의 암순응 b-파동 진폭을 나타낸다. 도 4d는 WT 및 C217W 마우스 망막에서 Htra1 및 T-15의 면역드루젠-유사염색을 나타낸다. 화살표는 드루젠-유사 응집체를 가리킨다. 도 4e는 HTRA1 및 T-15에 대해 양성인 드루젠-유사 응집체의 정량화를 나타낸다. (n = 4, *p <0.05, **p <0.005, t-테스트).
도 5a 내지 5d는 마우스 눈에 5-Aza-dc 주사를 나타낸다. 도 5a는 PBS 또는 5-Aza-dc로 안구내 주사 이후 마우스 망막에서 MeDIP에 의해 ELOVL2 메틸화를 나타낸다. 도 5b는 PBS 또는 5-Aza-dc로 안구내 주사 이후 마우스 망막에서 qPCR에 의해 ELOVL2 발현을 나타낸다. 도 5c는 PBS 또는 5-Aza-dc로 안구내 주사 이후 마우스 눈에서 암순응 ERG 반응을 나타낸다. 도 5d는 ERG로부터의 암순응 b-파동 진폭을 나타낸다. (n = 4, *p <0.05, t-테스트).
도 6a 내지 6e는 WI-38 세포의 노화 특징을 나타낸다. 도 6a는 개체군 배가 (PD) 35, 45, 55에서 적용된 표면적에 의해 측정된 WI-38 세포의 증식을 나타낸다. 도 6b는 WI-38 세포에서 베타-갈락토시다제 염색에 의한 노화 백분율을 나타낸다. 도 6c는 WI-38 세포의 세포 형태 및 베타-갈락토시다제 염색의 대표적인 영상을 나타낸다. 도 6d는 ELOVL2 녹다운 WI-38 세포의 세포 형태 및 베타-갈락토시다제 염색의 대표적인 영상을 루시퍼라제 녹다운 대조군과 비교하여 나타낸다. 도 6e는 WI-38 세포에서 qPCR에 의해 ELOVL2 녹다운 효율을 나타낸다. (n = 3, **p <0.005, t-테스트).
도 7a 내지 7e는 IMR-90 세포의 노화 특징을 나타낸다. 도 7a는 개체군 배가 (PD) 35, 45, 55에서 적용된 표면적에 의해 측정된 IMR-90 세포의 증식을 나타낸다. 도 7b는 IMR-90 세포에서 베타-갈락토시다제 염색에 의한 노화 백분율을 나타낸다. 도 7c는 IMR-90 세포에서 qPCR에 의해 ELOVL2 발현을 나타낸다. 도 7d는 IMR-90 세포에서 qPCR에 의해 ELOVL2 녹다운 효율을 나타낸다. 도 7e는 IMR-90 세포에서 ELOVL2 녹다운 형태의 대표적인 영상을 루시퍼라제 녹다운 대조군과 함께 나타낸다. (n = 3, *p <0.05, **p <0.005, t-테스트).
도 8a 내지 8d는 WT 마우스 망막의 노화 특징을 나타낸다. 도 8a는 2개월령, 6개월령, 1년령 및 2년령의 WT 마우스 망막의 자가형광 영상을 나타낸다. 도 8b는 2개월령, 6개월령, 1년령 및 2년령의 WT 마우스의 ERG의 암순응 반응을 나타낸다. 도 8c는 3개월령 및 2년령의 야생형 마우스에서 ERG로부터의 진동 전위를 나타낸다. 도 8d는 3개월령 및 2년령의 야생형 마우스에서 ERG로부터의 10Hz 깜박임 반응을 나타낸다.
도 9a 및 9b. 도 9a는 에임즈 마우스의 마우스 망막 MeDIP를 나타낸다. 더 높은 입력%는 더 높은 DNA 메틸화를 나타낸다. Y = 3개월령 WT, O = 2년령 WT, AY = 3개월령 에임즈, AO = 2년령 에임즈. 도 9b는 에임즈 마우스에서 qPCR에 의해 ELOVL2 발현을 나타낸다. (n = 3, *p <0.05, **p <0.005, t-테스트).
도 10a 내지 10e는 ELOVL2 내지 ELOVL5 운명 교체된 마우스를 나타낸다. 도 10a는 인간과 마우스 사이의 ELOVL2 및 ELOVL5 아미노산 서열 유사성을 나타낸다. 적색 화살표은 표적화된 C217W 돌연변이를 나타낸다. 도 10a는 순서대로 서열번호 21 내지 24를 각각 개시한다. 도 10b는 CAS9에 대한 표적 절단 부위를 나타낸다. 도 10c는 ELOVL2 복구 올리고 서열 (서열번호 25)을 나타낸다. 도 10d는 WT 및 C217W의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 돌연변이는 파란색으로 강조 표시된다. 도 10d는 순서대로 서열번호 26 내지 29를 각각 개시한다. 도 10e는 ELOVL2 돌연변이체 마우스의 표적외 분석을 나타낸다. 도 10e는 순서대로 서열번호 30, 31, 30 및 32를 각각 개시한다.
도 11a 내지 11d는 C217W 마우스 망막의 노화 특징을 나타낸다. 도 11a는 4개월령, 6개월령, 8개월령 및 1년령의 WT 대 C217W 마우스 망막의 자가형광 영상을 나타낸다. 도 11b는 4개월, 6개월 및 8개월령의 WT 대 C217W 마우스에서 ERG의 암순응 반응을 나타낸다. 도 11c는 야생형 및 프레임시프트 돌연변이 마우스에서 ERG로부터의 진동 전위를 나타낸다. 도 11d는 야생형 및 프레임시프트 돌연변이 마우스에서 ERG로부터의 10Hz 깜박임 반응을 나타낸다.
도 12a 내지 12d는 드루젠-유사 응집체의 특징을 나타낸다. 도 12a는 WT 및 C217W 마우스 망막에서 Htra1, C3 및 C5b-9의 면역염색을 나타낸다. 화살표는 드루젠-유사 응집체를 가리킨다. 도 12b는 C3 및 C5b-9에 대해 양성인 드루젠-유사 응집체의 정량화를 나타낸다. 도 12c는 WT 및 C217W 마우스 망막에서 C3의 면역염색을 나타낸다. 화살표는 드루젠-유사 응집체를 가리킨다. 도 12d는 C3에 대해 양성인 드루젠-유사 응집체의 정량화를 나타낸다. (n = 4, **p <0.005, t-테스트).
도 13은 PBS 및 5-Aza-dc로 주사된 마우스 눈에서 ERG의 암순응 반응을 나타낸다.

본 발명의 관행은 달리 명시되지 않는 한, 당 업계의 기술 내에 있는 분자생물학 (재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 채용할 것이다. 이러한 기법은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2판 (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 제 20판, (Lippincott, Williams & Wilkins 2003), 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 제 22판, (Pharmaceutical Press and Philadelphia College of Pharmacy at University of the Sciences 2012)에 잘 설명되어 있다.

본 발명의 요소 또는 이의 바람직한 구현예(들)를 소개할 때, 관사, "a", "an", "the" 및 "상기(said)"는 하나 이상의 요소가 존재하는 것을 의미하도록 의도된다. 용어, "포함하는 (comprising)", "포함하는 (including)", 및 "갖는"은 포괄적인 것으로 의도되며, 열거된 요소 이외의 추가적인 요소가 있을 수 있는 것을 의미한다.

두 개 이상 항목의 목록에 사용될 때, 용어 "및/또는"은, 자체로 또는 열거된 항목 중 어느 하나와 조합하여 사용될 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 표현 "A 및/또는 B"는 A 및 B 중 어느 하나 또는 둘 다, 즉 A 단독, B 단독 또는 A 및 B 조합을 의미하도록 의도된다. 용어 표현 "A, B 및/또는 C"는 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 조합, A 및 C 조합, B 및 C 조합 또는 A, B 및 C 조합을 의미하도록 의도된다.

본원에 기술된 본 발명의 양태 및 구현예는 "구성되는" 및/또는 "필수적으로 구성되는" 양태 및 구현예를 포함하는 것으로 이해된다.

범위 형식의 설명은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 범주에 대한 융통성 없는 한정으로서 해석되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 범위에 대한 설명은 가능한 모든 하위범위, 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시하는 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위에 대한 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위, 뿐만 아니라 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 및 6의 해당 범위 내의 개별 숫자를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다. 또한 값 또는 범위는 본원에서, "약" 하나의 특정한 값부터 및/또는 "약" 또 다른 특정한 값까지인, "약"으로서 표현될 수 있다. 이러한 값 또는 범위가 표현될 때, 개시된 다른 구현예는 하나의 특정한 값부터 및/또는 나머지 특정한 값까지인, 언급된 특정한 값을 포함한다. 유사하게, 선행하는 "약"을 사용하여 값이 근사치로 표현될 때, 특정한 값은 또 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 또한, 본원에 개시된 다수의 값이 존재하고, 각각의 값도 역시 자체 값에 추가하여 해당 특정값에 대해 "약"으로서 본원에서 개시되는 것으로 이해될 것이다. 구현예에서, "약"은 예를 들어 언급된 값의 10% 이내, 언급된 값의 5% 이내, 또는 언급된 값의 2% 이내를 의미하는데 사용될 수 있다.

본원에 사용된, "환자" 또는 "대상체"는 치료될 인간 또는 동물 대상체를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "약제학적 조성물"은 약제학적으로 허용가능한 조성물을 말하며, 여기서 조성물은 탈메틸화 화합물(들)을 포함하고, 일부 구현예에서 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 조합물일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 동물, 보다 구체적으로 인간 및/또는 비-인간 포유류에 사용하기에 안전한 다른 제형물에 추가하여 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나, 미국 약전, 기타 일반적으로 인정되는 약전에 등재된 것을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 디메틸화 화합물(들)과 함께 투여되는 부형제, 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 아쥬반트 및/또는 운반체를 말한다. 이러한 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매일 수 있다. 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이팅제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조절용 제제도 담체일 수 있다. 담체와 조합하여 조성물을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 약제학적 투여에 적격한, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하도록 의도된다. 약제학적 활성 물질에 이러한 매질 및 제제의 사용은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예로, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 제 20판 (Lippincott, Williams & Wilkins 2003) 참조. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 함께 배합할 수 없는 경우를 제외하고는, 이러한 조성물로의 사용이 고려된다.

본원에 사용된 바, "치료적으로 유효한"은 이에 한정되지 않지만 노화 관련 황반 변성 (AMD)와 같은 노화 관련 눈 질환과 관련된 증상을 치료하거나, 개선하거나, 일정 방식으로 감소시키기에 충분한 디메틸화 화합물(들)의 양을 말한다. 방법과 관련하여 사용될 때, 방법은 노화 관련 눈 질환과 관련된 증상을 치료하거나, 개선하거나, 일정 방식으로 감소시키기에 충분히 효과적이다. 예를 들어, 노화 관련 눈 질환과 관련한 유효량은 발병을 차단하거나, 예방하거나; 질환 병리학이 시작된 경우라면, 질환의 완화하거나, 개선하거나, 안정화하거나, 역전시키거나, 진행을 지연시키거나, 달리 질환의 병리학적 결과를 감소시키기에 충분한 양이다. 임의의 경우에, 유효량은 단일 또는 분할된 용량으로 제공될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료"는 적어도 환자의 노화 관련 눈 질환과 관련된 증상의 개선을 포함하며, 여기서 개선은 광범위한 의미로 적어도 매개변수, 예로 치료 중인 질환 또는 병태와 관련된 증상의 규모 감소를 말하는데 사용된다. 이와 같이, "치료"는 또한 질환, 장애, 또는 병리학적 병태, 또는 적어도 이와 관련된 증상이 완전히 억제 (예로, 발병의 예방)되거나 정지 (예로, 종료)되어, 환자가 병태 또는 적어도 병태를 특성화하는 증상으로 더 이상 고생하지 않는 상황을 포함한다.

용어 "조합"은 하나의 용량 단위 형태의 고정된 조합, 또는 조합 투여를 위한 부품 키트를 말하며, 여기서 하나 이상의 탈메틸화 화합물 및 조합 파트너 (예로, 하기에 설명된 또 다른 약물, "치료제" 또는 "보조제"로도 지칭됨)는 동시에 독립적으로 또는 시간 간격 내에서 별도로 투여될 수 있다. 일부 상황에서, 조합 파트너는 협력적, 예로 상승작용 효과를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "공동-투여" 또는 "조합 투여" 등은 이를 필요로 하는 단일 대상체 (예로, 환자)에게 선택된 조합 파트너의 투여를 포함하도록 의미하고, 제제가 반드시 동일한 투여 경로에 의해 또는 동시에 투여되는 것이 아닌 치료 요법을 포함하도록 의도된다. 본원에 사용된 용어 "약제학적 조합물"은 하나 이상의 활성 성분의 혼합 또는 조합으로부터 기인한 생성물을 의미하고, 활성 성분의 고정된 및 비-고정된 조합 모두를 포함한다. 용어 "고정된 조합"은 활성 성분, 예로 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 단일 실체 또는 용량 형태로 환자에게 동시에 투여되는 것을 의미한다. 용어 "비-고정된 조합"은 활성 성분, 예로 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 특정한 시간 제한 없이 동시에, 다함께 또는 순차적으로 별개의 실체로 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 여기서 이러한 투여는 환자의 신체에서 2개의 화합물의 치료적 유효 수준을 제공한다. 후자는 또한 칵테일 요법, 예를 들어 3개 이상의 활성 성분의 투여에도 적용된다.

황반 변성은 브루흐 막, 맥락막, 신경 망막 및/또는 망막 색소 상피의 이상과 관련된 중앙 시력의 진행성 상실을 특징으로 하는 질환군을 설명하는 데 사용되는 임상 용어이다. 망막의 중앙에는 직경이 약 1/3 내지 1/2 cm인 황반 루테아가 있다. 황반은 원추체의 밀도가 더 높기 때문에 특히 중앙 (중심와)에서 정밀한 시력을 제공한다. 혈관, 신경절 세포, 내부 핵층, 세포 및 그물형 층은 모두 한쪽으로 변위되어 (하나 위에 놓이는 대신에) 광이 원추체로 바로 이동할 수 있도록 한다. 망막 아래에는 맥락막, 섬유성 조직 내에 내장된 혈관 집합, 및 맥락막 층을 덮는 색소 상피 (PE)가 있다. 맥락막 혈관은 망막 (구체적으로, 이의 시각 세포)에 영양을 공급한다. 맥락막 및 PE는 눈의 후방에서 발견된다.

가장 흔한 황반 변성인 노화 관련 황반 변성 (AMD)은 시야 중앙 부분의 진행성 시력 상실, 색각의 변화, 비정상적 암 순응 및 민감성과 관련이 있다. AMD의 2가지 기본적 임상 소견은 건성 또는 위축성 형태와 습성 또는 삼출성 형태로 설명되어 왔다. 독서, 운전 또는 얼굴 인식과 같은 활동에 사용되는 정밀 시력에 필요한 중앙 망막 또는 황반의 위축성 세포 사망과 건성 형태는 관련이 있다. 이러한 건성 AMD 환자의 약 10 내지 20%는 습성 AMD로 알려진 두 번째 형태의 AMD로 진행된다.

습성 (신생 혈관/삼출성) AMD는 황반 아래에 있는 망막 뒤의 혈관의 비정상적 성장과 혈관 누출에 의해 유발되고, 망막의 변위, 출혈 및 흉터 형성이 발생한다. 이로 인해 수개월 내지 수년에 걸쳐 시력이 저하된다. 그러나, 환자는 신속한 시력 상실로 고생할 수 있다. 모든 습성 AMD 사례는 진행된 건성 AMD으로부터 비롯된다. 습성 형태는 AMD로 인한 실명의 85%를 차지한다. 습성 AMD에서는 혈관이 체액과 혈액을 누출하면서 중앙 망막을 파괴하는 흉터 조직이 형성된다.

녹내장은 실명의 주요 원인이다. 용어 "녹내장"은 눈의 상이한 매우 많은 장애에 적용되지만, 모든 유형의 녹내장에 공통적인 것은 시신경이 파괴되면서 안압이 상승하는 현상이다. 대부분의 녹내장 형태에서 안압 상승은 유의한 시력 상실이 발생할 때까지 통증 또는 시력 저하와 같이 개체에 의해 감지되지 않는다. 건강한 눈에서, 유체 (수용성 체액)는 필터-유사 조직 덩어리 (섬유주 그물망)를 통해 전방 공간부터 공막에 있는 일련의 연결된 정맥으로 전달된다. 가장 공통적으로 접하는 녹내장 (개방각 녹내장) 형태에서 압력 상승은 섬유주 그물망을 통한 유출 경로의 차단으로 인해 발생한다. 녹내장을 치료하는 방법은 두 가지 일반적인 형태, 즉 투약 및 수술을 채택하여 왔다.

당뇨병은 거의 1.6천만 명의 미국인에게 침범한 네 번째 주요 사망 원인이고, 이중 3분의 1은 진단되지 않고 있으며, 연간 1천억 달러가 넘는 미국 의료비의 15%가 되는 비용이 든다. 매년 약 80만 건의 새로운 당뇨병 사례가 발생한다. 2030년까지, 이 숫자는 이 곳에서 5천만 명, 전세계적으로 적어도 3억 명에 도달할 수 있다. 진성 당뇨병은 미국에서 20세 내지 74세 인구 중에서 새로운 실명의 주요 원인이다. 망막병증은 인슐린 의존성 진성 당뇨병 (IDDM) 진단 직후에 발병하기 시작하며, 15년 후 유병률은 거의 100%이다. 미국에서 1백만 명의 사람들이 IDDM 또는 제 1형 당뇨병에 걸린다. 비-인슐린 의존성 당뇨병 (NIDDM) 또는 제 2형 당뇨병에서, 현재 1,5백만 명, 약 21%의 환자가 진단 시 망막병증에 걸려 있으며, 20년 후 60%가 걸린다. 제 2형 당뇨병 환자는 지난 30년 동안 3배로 증가하였으며, 65세 이상의 미국인 절반이 포함된다. 증식성 망막병증은 NIDDM의 10 내지 20%에서 발생한다. Brechner R J, et al, JAMA 1993; 270: 1714-1718.

황반 변성 또는 노화 관련 황반 변성 (AMD)은 망막의 중앙 부분을 침범하며, 미국에서 65세 이상인 사람에서 실명의 주요 원인이다. AMD는 1.3천만 명 사람을 침범하여 약 1.2백만 명에게 장애를 유발시킨다. 75세 이상의 환자 중 약 30%가 AMD에 걸려 있으며, 나머지 23%도 5년 이내에 AMD가 발병시킬 것이다. AMD 유병률은 55세 내지 64세 환자의 16.8%부터 65세 내지 74세 환자의 25.6%, 그리고 75세 이상 환자의 42%까지 증가한다. 현재까지 경질 또는 연질 드루젠 (세포 잔재물의 침전물), 망막 색소 상피 (RPE)의 변화 또는 광 수용체 및 RPE의 위축을 특징으로 하는 형태인 건성 또는 위축성 AMD의 알려진 완치법은 없다. 이러한 양식은 모든 사례의 약 90%를 차지한다. 나머지 AMD 사례는 신생혈관형성 및 삼출을 특징으로 하는 "습성" 형태를 가지고 있다. Pratt S G, Review of Ophthalmology 1998년 8월: 42-50 참조.

본 발명은 노화 관련 황반 변성 (AMD), 당뇨성 망막병증, 안구 혈관형성 (맥락막, 각막 또는 망막 조직을 침범한 안구 신생혈관형성) 및 ELOVL2와 같은 유전자의 메틸화가 관여하는 안구 병태와 같은 안구 관련 병태 또는 질환의 치료를 위한 탈메틸화 제제에 관한 것이다. AMD의 치료에는 건성 및 습성 형태의 AMD가 모두 포함된다.

본 발명은 노화 관련 눈 질환 또는 병태를 치료하거나, 개선하거나, 예방하는 방법으로서, 적어도 하나의 탈메틸화 제제의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 탈메틸화 제제가 매우 긴 사슬 지방산의 연장-유사 2 유전자 (ELOVL2)의 발현을 증가시키고/거나, ELOVL2 효소의 수준을 증가시키고/거나, 망막 22 : 6 (n-3) 도코사헥사엔산 (DHA) 및 22 : 5 (n-6) 도코사펜타엔산 (DPA)의 수준을 증가시키는 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 탈메틸화 제제가 5-아자사이티딘, 데시타빈, 제불라린, 프로카인아미드, 프로카인, 하이드라라진, 발프로산 및 에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 제공한다.

구현예예서, 본 발명은 탈메틸화 제제가 유리체내, 망막하, 결막하, 힘줄하 또는 공막 후방 경로에 의해 눈에 투여되는 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 노화 관련 눈 질환이 노화 관련 황반 변성 (AMD), 당뇨성 눈 질환, 녹내장, 시력 저하 또는 안구 건조인 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 탈메틸화 제제가 시간 방출 제형물로 투여되는 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 노화 관련 눈 질환 또는 병태를 치료하거나, 개선하거나, 예방하는 방법으로서, 눈에서 ELOVL2 효소 및/또는 22 : 6 (n-3) 도코사헥사엔산 (DHA) 및 22 : 5 (n-6) 도코사펜타엔산 (DPA)의 수준을 ELOVL2를 인코딩하는 mRNA의 유효량을 눈에 투여함으로써 증가시키는 단계를 포함하고, mRNA는 바이러스성 벡터를 사용하여 전달되는, 방법을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 바이러스성 벡터가 아데노바이러스성 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 레트로바이러스성 벡터로부터 선택되는 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 mRNA가 리포좀 또는 마이크로/나노 입자와 같은 비-바이러스성 벡터를 사용하여 전달되는 것을 제공한다.

구현예예서, 본 발명은 제제가 유리체내, 망막하, 결막하, 힘줄하 또는 공막 후방 경로에 의해 눈에 투여되는 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 노화 관련 눈 질환이 노화 관련 황반 변성 (AMD), 당뇨성 눈 질환, 녹내장, 시력 저하 또는 안구 건조인 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 노화 관련 눈 질환 및 병태를 치료하거나, 개선하거나, 예방하는 방법으로서, 눈에서 ELOVL2 효소 및/또는 눈에서 22 : 6 (n-3) 도코사헥사엔산 (DHA) 및 22 : 5 (n-6) 도코사펜타엔산 (DPA)의 수준을 ELOVL2 발현 벡터를 사용한 유전자 요법에 의해 증가시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 벡터가 아데노바이러스성 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 레트로바이러스성 벡터로부터 선택되는 것을 제공한다.

구현예예서, 본 발명은 ELOVL2 발현 벡터가 유리체내, 망막하, 결막하, 힘줄하 또는 공막 후방 경로에 의해 투여되는 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 노화 관련 눈 질환이 노화 관련 황반 변성 (AMD), 당뇨성 눈 질환, 녹내장, 시력 저하 또는 안구 건조이고, 노화 관련 눈 질환은 건성 AMD인 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 노화 관련 눈 질환의 치료를 필요로 하는 환자를 선별하는 단계, 및 하나 이상의 탈메틸화 제제 및/또는 ELOVL2를 인코딩하는 mRNA 및/또는 ELOVL2 발현 벡터의 유효량을 환자의 눈에 투여하는 단계를 포함하여 상기 노화 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 환자가 눈에서 ELOVL2의 메틸화 및/또는 ELOVL2 발현을 결정함으로써 선별되는 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 탈메틸화 제제가 데시타빈인 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 노화 관련 눈 질환이 노화 관련 황반 변성 (AMD), 당뇨성 눈 질환, 녹내장, 시력 저하 또는 안구 건조이고, 노화 관련 눈 질환은 건성 AMD인 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 노화 관련 눈 질환, 선택적으로 건성 AMD의 치료에 ELOVL2를 인코딩하는 mRNA를 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 노화 관련 눈 질환, 선택적으로 건성 AMD의 치료에 ELOVL2 발현 벡터를 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 열거된 탈메틸화 제제의 일정 농도를 함유하는 제형물로서, 유리체내 투여 1 μL 내지 100 μL이 5 ng 내지 500 ng의 유효량을 구성하는, 제형물을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 열거된 탈메틸화 제제의 일정 농도를 함유하는 제형물로서, 유리체내 투여 1 μL 내지 100 μL이 500 ng 내지 1,500 ng의 유효량을 구성하는, 제형물을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 열거된 탈메틸화 제제의 일정 농도를 함유하는 제형물로서, 유리체내 투여 1 μL 내지 100 μL이 1,500 ng 내지 4,500 ng의 유효량을 구성하는, 제형물을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 제형물이 실질적으로 수용성인 것을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 제형이 실질적으로 무수성인 것을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 제형물이 즉시 방출성 및/또는 연장 방출성인 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 탈메틸화 제제가 데시타빈인 것을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 투여를 위한 약제의 제조 방법을 제공한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어 및 임의의 두문자어는 본 발명 분야의 당업자가 공통적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 관행에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법, 장치 및 물질이 본원에 기재된다.

본원에서 사용된 바, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 질환 또는 장애의 발병, 재발 또는 확산, 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방을 말한다. 특정 구현예에서, 용어는 구체적으로 본원에 제공된 질환 또는 장애의 위험이 있는 대상체에게 증상의 발병 전에 하나 이상의 다른 추가적인 활성 제제(들)가 있거나 없이 본원에 제공된 화합물 또는 용량 형태로의 치료 또는 이의 투여를 말한다. 이 용어는 특정한 질환의 증상의 억제 또는 감소를 포괄한다. 특정 구현예에서, 질환의 가족력이 있는 대상체는 예방 요법에 대한 잠재적인 후보이다. 특정 구현예에서, 증상 재발의 병력이 있는 대상체는 또한 예방을 위한 잠재적인 후보이다. 이와 관련하여, 용어 "예방"은 용어 "예방적 치료"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바, 달리 명시되지 않는 한, 화합물의 "예방적 유효량"은 질환 또는 장애를 예방하거나, 이의 재발을 예방하기에 충분한 양이다. 화합물의 예방적 유효량은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 제제(들)와 조합하여, 질환의 예방에 예방적 이점을 제공하는 치료제의 양을 의미한다. 용어 "예방적 유효량"은 전반적인 예방을 개선하거나, 또 다른 예방제의 예방적 효능을 증진시키는 양을 포괄할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "대상체"는 본원에서 영장류 (예로, 인간), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트 및 마우스 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유류와 같은 동물을 포함하도록 정의된다. 상세한 구현예에서, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 예를 들어 인간과 같은 포유류 대상체와 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 상세한 구현예에서, AMD에 걸린 대상체는 이전에 노화 관련 황반 변성에 걸린 것으로서 진단되었던 대상체이다.

본원에 사용된 바, 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기재된 화합물은 특정한 입체화학이 명시되지 않는 한 모든 가능한 입체이성질체를 포괄하도록 의도된다. 화합물의 구조적 이성질체가 낮은 에너지 장벽을 통해 상호전환될 수 있는 곳에서, 화합물은 단일 호변 이성질체 또는 호변 이성질체의 혼합물로 존재할 수 있다. 이것은 양성자 상호변이성 또는 예를 들어 방향족 모이어티를 포함하는 화합물에서 소위 원자가 상호변이성의 형태를 채택할 수 있다.

본원에 사용된 바, 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 언급된 유사체, 예컨대 사이티딘은 사이티딘 유사체의 유리 염기, 또는 이의 염, 용매화물, 수화물, 보조결정, 복합체, 전구 약물, 전구체, 대사물 및/또는 유도체를 포괄하도록 의도된다. 특정 구현예에서, 본원에 언급된 사이티딘 유사체는 사이티딘 유사체의 유리 염기, 또는 이의 염, 용매화물, 수화물, 보조결정 또는 복합체를 포괄한다. 특정 구현예에서, 본원에 언급된 사이티딘 유사체는 사이티딘 유사체의 유리 염기, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 포괄한다.

본 발명은 5-아자사이티딘, 데시타빈, 제불라린, 프로카인아미드, 프로카인, 에피갈로카테킨 갈레이트, 발프로산, 하이드라라진 및 유사한 화합물 및 유도체와 같은 특정 화합물을 사용하여 ELOVL2 의 프로모터를 탈메틸화하고, 유전자의 발현을 유도하고, 포유류의 시각 기능을 개선하기 위한 제제의 용도를 특징으로 한다. 종합적으로 이들은 본원에서 "탈메틸화 제제"로서 기술된다.

일 구현예에서, 탈메틸화 제제는 안구내로, 예를 들어 결막하, 유리체내, 망막하 또는 안구후 주사에 의해 주사된다. 결막하 주사의 경우, 약 1 ng/mL 내지 약 500 μg/mL 범위의 농도가 사용될 수 있다. 유리체내 주사의 경우, 약 1 μg/0.1 mL 내지 약 1000 μg/0.1 mL 범위의 농도가 사용될 수 있고, 사용될 수 있는 하나의 농도는 약 50 μg/0.1 mL이다. 망막하 주사의 경우, 약 1 μg/0.1 mL 내지 약 100 μg/0.1 mL 범위의 농도가 사용될 수 있다. 안구후 주사의 경우, 약 20 μg/mL 내지 약 1000 μg/mL 범위의 농도가 사용될 수 있다. 탈메틸화 제제는, 예를 들어 리포좀에 결합된 수용성계 용액으로 투여될 수 있거나, 유기 용매에 용해될 수 있다. 또 다른 대안의 구현예에서, 탈메틸화 제제는 또한 주사에 의해 또는 눈 안에 또는 눈 위에 외과적 이식에 의해 미세구체, 리포좀, 캡슐 또는 중합체 매트릭스와 같은 불활성 생리학적으로 허용가능한 담체에 제공될 수 있다. 사용될 수 있는 수용성 용매는 0.9% 식염수 및 5% 덱스트로스를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 사용될 수 있는 유기 용매는 디메틸설폭사이드 (DMSO) 또는 알코올을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이식물은 일정한 용량의 약물을 얻기 위해 시간 방출 형태의 탈메틸화 제제를 제공할 수 있다. 탈메틸화 제제를 활성 제제로서 단독으로 또는 탈메틸화 제제와 관련된 다른 화합물과 함께 약제학적으로 허용가능한 제형물에 실질적인 독성을 유발하지 않는 유효량으로 포함하는 조성물을 안구내 투여함으로써 당뇨성 망막증, 노화 관련 황반 변성 및/또는 색소성 망막염의 발병 또는 진행을 감소시키는 방법이 또한 개시되어 있다. 조성물은 탈메틸화 제제를 유일한 활성 제제로서 함유할 수 있으며, 나머지 제제는 탈메틸화 제제의 기본 성질에 실질적으로 영향을 주지 않는 것이다. 대안적으로, 조성물은 탈메틸화 제제 이외에도 다른 활성 제제를 함유할 수 있다. 조성물은 눈에 주사되거나 이식될 수 있다. 본 발명은 탈메틸화 제제를 활성 제제로서 실질적인 안구 독성 없이 황반 변성, 망막병증 또는 색소성 망막염을 치료하는데 효과적인 양으로 약제학적으로 허용가능한 제형물에 함유하는 조성물을 안구내 투여함으로써 환자를 치료하는 방법을 포괄한다. 조성물은 눈에 주사되거나 이식되며, 시간 방출 제형물로 투여될 수 있다. 매트릭스와 같은 지속 방출 제형물은 미조절된 속도 또는 치료량 이상으로 방출되면 독성이 될 수 있지만, 일정 기간에 걸쳐 비-독성 치료량의 탈메틸화 제제를 방출하도록 제형화되는 탈메틸화 제제의 양과 함께 로딩될 수 있다. 예를 들어, 매트릭스는 약 1 마이크로그램 내지 10 마이크로그램 이상을 포함할 수 있다. 탈메틸화 제제는 탈메틸화 제제의 비-독성 유지 용량을 지속적으로 방출할 수 있다. 이러한 매트릭스는 확산가능한 벽을 갖는 저장소일 수 있고, 지질, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 아세테이트, 폴리카프로락톤, 폴리(글리콜) 산 및/또는 폴리(락트)산일 수 있다.

탈메틸화 제제는 유리체내 (유리체 내), 결막하 (결막하 내), 망막하 (망막 아래) 또는 안구후 (안구 뒤) 주사를 사용하여 안구내로 주사될 수 있다. 결막하 주사의 경우, 약 1 ng/mL 내지 약 500 μg/mL 범위의 디메틸화 제제의 농도가 사용될 수 있다. 유리체내 주사의 경우, 약 10.0 ng/0.1 mL 내지 약 1000 μg/0.1 mL 범위의 탈메틸화 제제의 용량이 사용될 수 있다. 안구후 주사의 경우, 약 20 μg/mL 내지 약 1000 μg/mL 범위의 탈메틸화 제제의 용량이 사용될 수 있다. 망막하 주사의 경우, 약 1 μg/0.1 mL 내지 약 100 μg/0.1 mL 범위의 탈메틸화 제제의 용량이 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 용량은 즉시 방출 제형물과 관련이 있으며, 더 연장된 방출 제형물에는 더 높은 농도의 탈메틸화 제제가 요구될 것이다. 탈메틸화 제제는 유일한 활성 제제가 되는 조성물로 안구내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 탈메틸화 제제는 관련 화합물과 함께 조성물로 안구내로 투여될 수 있다. 관련 화합물은 타크롤리무스, 사이클로포스파미드, 시롤리무스, 아토포시드, 티오에파, 메토트렉세이트, 아자티오프린 (이뮤란), 인터페론, 인플릭시맙, 에타너셉트, 마이코페놀레이트 모페틸, 15-데옥시스퍼구알린, 탈리도미드, 글라티라머, 레플루노미드, 빈크리스틴, 시타라빈 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 면역억제제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 탈메틸화 제제를 함유하는 조성물은 눈에 실질적인 독성을 생성하지 않는 양 또는 용량으로 투여된다. 본원에 사용된 바와 같이, 실질적인 독성의 결여는 임의의 독성 소견의 부재, 뿐만 아니라 당업자가 치료를 감소시키거나 중단하기에 충분히 해롭지 않는 것으로 고려할 독성의 소견 둘 다를 포함한다. 탈메틸화 제제의 정맥내 용액 형태는 0.9% NaCl 또는 5% 덱스트로스, 또는 디메틸설폭사이드 (DMSO) 또는 알코올과 같은 유기 용매를 사용하여 표시된 농도를 달성하도록 희석될 수 있다. 안구내 투여는 이전에 기재된 임의의 경로 및 제형물에 의해 시행될 수 있다. 주사의 경우, 용액, 유화액, 현탁액, 미세구체의 캡슐 제형물 또는 리포좀 등이 사용될 수 있다. 탈메틸화제제는 안구 이식물로서 외과적으로 투여될 수 있다. 일 예로서, 폴리비닐 알코올 또는 폴리비닐 아세테이트의 확산가능한 벽을 갖고, 밀리그램 정량의 탈메틸화 제제를 함유하는 저장 용기가 공막 안에 또는 공막 위에 이식될 수 있다. 또 다른 예로서, 탈메틸화 제제의 밀리그램 정량이 약 2 mm × 4 mm 크기를 갖는, 폴리카프로락톤, 폴리(글리콜)산, 폴리(락트)산 또는 폴리 무수물과 같은 중합체 또는 피지산과 같은 지질로 제조된 중합체 매트릭스 내에 혼입될 수 있으며, 공막 위에 또는 눈에 이식될 수 있다. 이것은 보통 환자가 국소 또는 국소 마취를 받고, 각막 뒤에 만든 작은 절개 (3 내지 4 mm)를 사용하여 수행된다. 다음으로 탈메틸화 제제를 함유한 매트릭스를 절개를 통해 삽입하고 9-0 나일론을 사용하여 공막에 봉합한다. 탈메틸화 제제는 눈 안에 주사하기 위해 불활성 매트릭스 내에 포함될 수 있다. 불활성 매트릭스의 일 예로서, 리포좀은 낮은 열 전이를 갖는 지질인 계란 포스파티딜콜린 (PC)과 같은 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC)으로부터 제조될 수 있다. 리포좀은 당업자에게 알려진 표준 절차를 사용하여 제조된다. 탈메틸화 제제는 나노그램부터 마이크로그램 내지 밀리그램까지 범위의 양으로 계란 PC 용액에 첨가되고, 친유성 약물은 리포좀에 결합한다. 시간 방출 약물 전달 시스템은 일정 기간에 걸쳐 활성 제제의 지속적인 방출을 유도하기 위해 안구내로 이식될 수 있다. 이식가능한 구조는 임의의 이전에 개시된 중합체 (예를 들어, 폴리카프로락톤, 폴리(글리콜)산, 폴리(락트)산, 폴리무수물) 또는 미세구체로서 제형화될 수 있는 지질의 일정 캡슐 형태일 수 있다. 예시적인 예로서, 탈메틸화 제제를 폴리비닐 알코올 (PVA)과 혼합한 다음, 혼합물을 건조시키고, 에틸렌 비닐아세테이트로 코팅한 다음, PVA로 다시 냉각시킬 수 있다. 안구내 주사를 위한 제형물에서, 리포좀 캡슐은 세포성 소화로 인해 분해되고, 서방성 약물 전달 시스템이 되어, 환자가 시간 경과 시 약물에 일정하게 노출될 수 있다. 시간 방출 제형물에서, 미세구체, 캡슐, 리포좀 등은 볼루스 용량으로서 투여되면 독성이 될 수 있는 탈메틸화 제제 농도를 포함할 수 있다. 그러나, 시간 방출 투여는 임의의 기간 동안 방출된 농도가 독성 양을 초과하지 않도록 제형화된다. 이것은 예를 들어 운반체의 다양한 제형물 (코팅 또는 미코팅된 미세구체, 코팅 또는 미코팅된 캡슐, 지질 또는 중합체 구성성분, 단일적층 또는 다중적층 구조, 및 이들의 조합 등)을 통해 달성된다. 다른 변수에는 환자의 약동학-약력학적 매개변수 (예로, 체질량, 성별, 혈장 청소율, 간 기능 등)가 포함될 수 있다. 제형물에 제공된 탈메틸화 제제의 양에 따라, 환자는 단일 임플란트 또는 주사로부터 일정 기간 동안 투여될 수 있다. 예시적이지만 비-제한적인 예로서, 캡슐에는 1 내지 2 mg의 탈메틸화 제제가 로딩될 수 있고, 캡슐이 하루에 일정 마이크로그램의 약물을 방출하도록 제형화되면, 환자는 약 1,000일 또는 거의 3년 동안 투약될 수 있다. 또 다른 예로서, 캡슐에 5 mg의 약물이 로딩되면 환자는 약 15년 동안 투약될 수 있다. 이러한 제형물은 일부 경우에 10년에 단지 한두 번 또는 훨씬 더 드물게 개입이 요구되기 때문에, 환자 편의성을 높이면서 정확한 투약을 포함하는 이점을 제공한다. 미세구체, 미세캡슐, 리포좀 등의 형성 및 로딩 그리고 이들의 안구 이식은 당업자에게 공지된 표준 기법, 예를 들어 본원에 관련 섹션 전문이 참고문헌으로 통합되는 Vitreoretinal Surgical Techniques, Peyman et al., Eds. (Martin Dunitz. London 2001, chapter 45); Handbook of Pharmaceutical Controlled Release Technology, Wise, Ed. (Marcel Dekker, New York 2000)에 개시된, 사이토메갈로바이러스 망막염을 치료하는데 갱시클로비르 지속 방출 제형물의 사용이다. 탈메틸화 제제는 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여, 이전에 기술된 방법 및 제형물을 사용하여 당뇨 환자, 황반 변성 및 색소성 망막염에서 발생하는 것과 같은 망막병증을 치료하도록 실질적인 독성없이 안구내로 투여될 수 있다.

본원에서는 사이티딘 유사체 또는 이의 염, 용매화물, 수화물, 전구체 및/또는 유도체를 사용하여 AMD를 포함한 눈 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 제공된 특정 방법은 5-아자사이티딘을 포함하는 둘 이상의 활성 제제의 조합물을 사용하여 눈 질환을 치료하는 것을 포함한다.

뉴클레오시드 유사체는 특정 암의 치료를 위해 임상적으로 시험되었지만, 눈 질환에 대해서는 시험되지 않았다. 뉴클레오시드 유사체 5-아자사이티딘 (4-아미노-1-β-D-리보퓨라노실-1,3,5-트리아진-2(1H)-온으로도 알려짐; 국가 서비스 센터 지정 NSC-102816; CAS 등록 번호 320-67-2; 아자사이티딘; Aza 및 AZA; 현재 VIDAZA®로 판매됨) 및 2'-데옥시-5-아자사이티딘 (5-아자-2'-데옥시사이티딘, 데시타빈, Dae 및 DAC로도 알려져 있으며 현재 DACOGEN®로 판매됨)은 골수이형성 증후군 (MDS)의 치료를 위해 미국 식품 의약국에서 승인한 DNA 메틸트랜스퍼라제 (DNMT) 저해제이다. 아자사이티딘과 데시타빈은 사이티딘 유사체이고, 이러한 사이티딘 유사체와 이들의 관련 천연 뉴클레오시드 사이의 구조적 차이는 사이토신 고리의 위치 5번에 탄소 대신에 질소가 존재하는 것이다. 아자사이티딘은 C₈H₁₂N₄O₅의 분자식, 몰 당 244.21 g의 분자량 및 하기에 나타낸 구조를 갖는 것으로서 정의될 수 있다. 데시타빈은 C₈H₁₂N₄O₄의 분자식, 몰 당 228.21 g의 분자량을 갖는 것으로서 정의될 수 있다.

일 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 하나 이상의 사이티딘 유사체의 투여 또는 공동-투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 사이티딘 유사체는 5-아자사이티딘 (아자시티딘)이다. 특정 구현예에서, 사이티딘 유사체는 5-아자-2'-데옥시사이티딘 (데시타빈)이다. 특정 구현예에서, 사이티딘 유사체는 5-아자사이티딘 (아자시티딘) 또는 5-아자-2'-데옥시사이티딘 (데시타빈)이다. 특정 구현예에서, 사이티딘 유사체는 예를 들어 1-β-D-아라비노퓨라노실사이토신 (사이타라빈 또는 ara-C); 슈도이소-사이티딘 (psi ICR); 5-플루오로-2'-데옥시사이티딘 (FCdR); 2'-데옥시-2',2'-디플루오로 사이티딘 (젬시타빈); 5-아자-2'-데옥시-2',2'-디플루오로사이티딘; 5-아자-2'-데옥시-2'-플루오로사이티딘; 1-β-D-리보퓨라노실-2(1H)-피리미디논 (제불라린); 2',3'-디데옥시-5-플루오로-3'-티아사이티딘 (엠트리바); 2'-사이클로사이티딘 (안시타빈); 1-β-D-아라비노퓨라노실-5-아자사이토신 (파자라빈 또는 ara-AC); 6-아자사이티딘 (6-아자-CR); 5,6-디하이드로-5-아자사이티딘 (dH-아자-CR); N4-펜틸옥시-카르보닐-5'-데옥시-5-플루오로사이티딘 (카페시타빈); N4-옥타데실-시타라빈; 또는 엘 라이드산 시타라빈이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 사이티딘 유사체는 사이티딘 또는 데옥시사이티딘과 구조적으로 관련되고 사이티딘 또는 데옥시사이티딘의 작용을 기능적으로 모방하고/거나 길항하는 임의의 화합물을 포함한다.

본원의 특정 구현예는 본원에 제공된 사이티딘 유사체의 염, 보조결정, 용매화물 (예로, 수화물), 복합체, 전구 약물, 전구체, 대사물 및/또는 기타 유도체를 제공한다. 예를 들어, 상세한 구현예는 5-아자사이티딘의 염, 보조결정, 용매화물 (예로, 수화물), 복합체, 전구체, 대사물 및/또는 기타 유도체를 제공한다. 본원의 특정 구현예는 본원에 제공된 사이티딘 유사체의 염, 보조결정 및/또는 용매화물 (예로, 수화물)을 제공한다. 본원의 특정 구현예는 본원에 제공된 사이티딘 유사체의 염 및/또는 용매화물 (예로, 수화물)을 제공한다. 특정 구현예는 본원에 제공된 사이티딘 유사체의 염, 보조결정, 용매화물 (예로, 수화물) 또는 복합체가 아닌 사이티딘 유사체를 제공한다. 예를 들어, 상세한 구현예는 비-이온화, 비-용매화 (예로, 무수), 비-복합체화된 형태의 5-아자사이티딘을 제공한다. 본원의 특정 구현예는 본원에 제공된 둘 이상의 사이티딘 유사체의 혼합물을 제공한다. 본원에 제공된 사이티딘 유사체는 본원에 언급되거나 달리 문헌으로 입수가능한 합성 방법 및 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 5-아자사이티딘을 합성하는 상세한 방법은 예를 들어 미국 특허 7,038,038 및 이에서 논의된 참고문헌에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고문헌으로 통합된다. 본원에서 제공된 다른 사이티딘 유사체는 예를 들어 당 업계에 공지된 절차를 사용하여 제조될 수 있거나, 시판하는 공급처로부터 구입할 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 사용된 화합물은 유리 염기 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다. 일 구현예에서, 유리 염기 또는 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 고체이다. 또 다른 구현예에서, 유리 염기 또는 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 무정형 형태의 고체이다. 또한 또 다른 구현예에서, 유리 염기 또는 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 결정질 형태의 고체이다. 예를 들어, 상세한 구현예는 예를 들어 각각이 본원에 이들 전문이 참고문헌으로 통합되어 있는 미국 특허 6,943,249, 6,887,855 및 7,078,518, 미국 특허 출원 공개 2005/027675 및 2006/247189 그리고 국제특허출원 WO2010/093435에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있는 고체 형태의 5-아자사이티딘을 제공한다. 다른 구현예에서, 고체 형태의 5-아자사이티딘은 당 업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

일 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 사용되는 화합물은 사이티딘 유사체의 약제학적으로 허용가능한 염이고, 이는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트 (베실레이트), 바이설페이트, 부틸레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 고리펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 1,2-에탄디설포네이트 (에디실레이트), 에탄설포네이트 (에실레이트), 포르메이트, 퓨마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 글리콜레이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 염산염, 브롬산염, 요오드산염, 2-하이드로에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트 (메실레이트), 2-나프탈렌설포네이트 (나프실레이트), 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트 또는 운데카노에이트 염을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

약제학적 조성물: 일 구현예에서, 본원에는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 활성 성분으로서 하나 이상의 사이티딘 유사체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 비-방출 조절 부형제 또는 담체를 포함한다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 방출 조절 및 적어도 하나의 비-방출 조절 부형제 또는 담체를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물에 사용되는 사이티딘 유사체는 고체 형태이다. 적합한 고체 형태는 사이티딘 유사체의 유리 염기를 포함하는 고체 형태 및 사이티딘 유사체의 염을 포함하는 고체 형태를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 고체 형태는 다형체, 용매화물 (수화물을 포함함) 및 사이티딘 유사체 및/또는 이의 염을 포함하는 보조결정을 포함한다. 특정 구현예에서, 고체 형태는 사이티딘 유사체의 결정 형태 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다.

일 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 안구, 유리체내, 비경구 및 국소 투여를 위한 다양한 용량 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 지연, 확장, 연장, 지속, 펄스, 조절, 가속 및 신속, 표적, 프로그램 방출 및 위 체류 용량 형태를 포함하는 변형 방출 용량 형태로서 제형화될 수 있다. 이러한 용량 형태는 당업자에게 알려진 통상적인 방법 및 기법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들어, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 제 21판; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Modified-Release Drug Delivery Technology, Rathbone et al, eds., Drugs and the Pharmaceutical Science, Marcel Dekker, Inc.: New York, NY, 2003; Vol. 126 참조). 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 유리체내 투여를 위한 용량 형태로 제공된다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 비경구 투여를 위한 용량 형태로 제공된다. 또한 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 국소 투여를 위한 용량 형태로 제공된다.

일 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 삽입물, 주사제, 이식물, 페이스트, 분말, 드레싱, 크림, 플라스터, 연고, 용액, 유화액, 현탁액, 겔, 폼 또는 스프레이의 형태로 눈에 국소적으로, 또는 유리체내로 투여될 수 있다. 이러한 투여 형태는, 예를 들어 상기 Remington, The Science and Practice of Pharmacy에 기재된 바와 같은 통상적인 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 국소 투여를 위해 본원에 제공된 약제학적 조성물은 지연, 지속, 펄스, 조절, 표적 및 프로그램 방출을 포함하는 즉시 방출 또는 변형 방출이 되도록 제형화될 수 있다.

데시타빈은 현재 만성 골수성 백혈병 (CML), 골수이형성 증후군 (MDS), 비-소세포 폐암 (NSCL), 겸상 적혈구 빈혈, 급성 골수성 백혈병 (AML)의 치료를 위한 의약품으로 개발되고 있다.

데시타빈은 (a) 국제특허출원 WO2013033176의 도 imgf000003_0001에 나타낸 화학식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로; (b) 약 45% 내지 약 85% 프로필렌 글리콜; 약 5% 내지 약 45% 글리세린; 및 0% 내지 약 30% 에탄올을 포함하는 실질적으로 무수 용매에 용해된 것을 포함하는 제형물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 용매는 약 65% 내지 약 70% 프로필렌 글리콜을 포함하고; 약 25% 내지 약 30% 글리세린 및 0% 내지 약 10% 에탄올을 포함한다.

본 발명은 탈메틸화 제제 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 용어 "약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체"는 화합물의 원하는 용량 형태를 제조하는데 사용되는 매질을 말한다. 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체는 하나 이상의 용매, 희석제 또는 기타 액체 운반체; 분산 또는 현탁 보조제; 표면활성제; 등장제; 증점제 또는 유화제; 방부제; 고체 결합제; 및 윤활제 등을 포함할 수 있다. Remington's Pharmaceutical Sciences, 제 15판, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975) 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 제 3판, A. H. Kibbe ed. (American Pharmaceutical Assoc. 2000)는 약제학적 조성물을 제형화하는데 사용되는 다양한 담체 및 이의 제조를 위한 공지된 기법을 개시한다. 일 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 눈에 투여되는 경우 (예로, 안구 주사에 의해) 포유류 (예로, 인간 환자)에게 해롭지 않다. 안구내 투여의 경우, 예를 들어 이에 한정되지 않지만, 치료제는 평형 염 용액 (BSS) 또는 평형 염 용액 플러스 (BSS 플러스) (미국 텍사스, Alcon Laboratories, Fort Worth)으로 투여될 수 있다. 관련 양태에서, 본 발명은 치료적으로 허용가능한 탈메틸화제제, 선택적으로 동결건조된 조제물을 함유하는 멸균 용기, 예를 들어 바이알을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예는 유전자 요법에 의해 메틸화 억제에 효과를 발휘할 수 있는 핵산 구축물의 투여에 관한 것이다.

국제특허출원 WO 2001/58494는 혈관형성 저해제 및 신경 영양제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터와 안구 세포를 접촉시킴으로써 노화 관련 황반 변성과 같은 눈 질환을 치료하거나, 예방하는 것에 관한 것이다. 상세한 구현예에서, 혈관형성 저해제 및 신경 영양제는 색소 상피 유래 인자 (PEDF)와 같이 하나이거나 동일하다. 국제특허출원 WO 2002/13812는 안과 질환과 같은 염증성 질환의 치료를 위한 인슐린 감작제, 바람직하게는 퍼옥시좀 증식인자 활성화된 수용체-γ (PPARγ) 작동제의 사용에 관한 것이다. 국제특허출원 WO 200/52479는 AMD를 포함하여 드루젠 관련 장애 (드루젠 형성을 수반하는 임의의 장애)를 진단하고, 치료하고, 예방하는 것을 다룬다. 상세한 구현예에서, TNF-알파의 길항제와 같이, 면역 세포 증식 또는 분화를 억제하는 제제의 유효량을 제공하는 것에 관한 방법이다.

일 양태에서, 본 발명은 AMD에 걸린 개체 (예를 들어, 증상적 AMD를 발병시킬 위험이 증가된 것을 나타내는 다형성 또는 일배체이 검출된 개체) 또는 변이체 ELOVL2 메틸화 유전자가 관여하는 다른 질환에 걸린 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 방법은 변이체 ELOVL2 메틸화 또는 ELOVL2 메틸화를 인코딩하는 유전자의 발현을 감소시키는 제제를 환자의 질환 증상을 감소시키는데 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 관련 구현예에서, 개체에서 변이체 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드의 저해제 (예를 들어, 불활성인자)의 치료량이 투여된다.

일 구현예에서, 개체의 저해성 핵산 (예를 들어, 변이체 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 상보적인 RNA)가 투여된다. 일 구현예에서, 변이체 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA에 상보적인 정제된 안티센스 RNA가 투여된다.

또 다른 구현예에서, 개체에서 변이체 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드를 부분적으로 불활성화하기에 충분한 항-ELOVL-2 메틸화 항체의 치료량이 투여된다.

일 양태에서, 본 발명은 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 치료 벡터를 제공한다. 벡터는 다수의 세포 유형에서 ELOVL2 메틸화 유전자의 발현을 유도하는 프로모터를 포함할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 특이적 세포 유형, 예를 들어 망막 세포에서만 ELOVL2 메틸화 유전자의 발현을 유도하는 프로모터를 포함할 수 있다. 일 양태에서, ELOVL2 메틸화 단백질을 인코딩하는 유전자 치료 벡터 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 약제학적 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 병원체가 없고 인간 환자에게 투여하기에 적합하다. 일 구현예에서, 인코딩된 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드는 방어적 변이체이다.

일 양태에서, 본 발명은 폴리펩티드가 방어적 변이체인 재조합 또는 정제된 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 제공한다.

관련 양태에서, 본 발명은 재조합 또는 정제된 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드 및 약제학적으로　허용가능한 부형제를 함유하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 병원체가 없고 인간 환자에게 투여하기에 적합하다. 일 구현예에서, 인코딩된 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드는 야생형 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 인코딩된 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드는 방어적 변이체이다.

일 양태에서, 본 발명은 변이체 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드와 특이적으로 상호작용하지만, 야생형 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드와는 상호작용하지 않는 항체를 제공한다. 이들 항체는 다중클론 또는 단일클론일 수 있으며, 차감 기법에 의해 얻을 수 있다. 이들 항체는 변이체 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드를 불활성화하기에 충분할 수 있다. 관련 양태에서, 본 발명은 항-ELOVL2 메틸화 항체 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 병원체가 없고 인간 환자에게 투여하기에 적합하다.

일 양태에서, 본 발명은 AMD를 발병시킬 위험의 증가 또는 감소와 관련된 변이체 ELOVL2 메틸화 단백질을 식별하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 방어적 ELOVL2 메틸화 단백질을 식별하는 방법으로서, (a) 방어적 일배체을 갖는 개체를 식별하는 단계; 및 (b) 개체의 게놈에서 인코딩된 ELOVL2 메틸화의 아미노산 서열(들)을 결정하는 단계에 의하고, 여기서 방어적 ELOVL2 메틸화 단백질은 방어적 일배체을 갖는 대립유전자에 의해 인코딩되는, 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 중립적 ELOVL2 메틸화 단백질을 식별하는 방법으로서, (a) 중립적 일배체을 갖는 개체를 식별하는 단계; 및 (b) 개체의 게놈에서 인코딩된 ELOVL2 메틸화의 아미노산 서열(들)을 결정하는 단계에 의하고, 여기서 중립적 ELOVL2 메틸화 단백질은 중립적 일배체을 갖는 대립유전자에 의해 인코딩되는, 방법을 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 AMD를 발병시킬 위험의 감소와 관련된 ELOVL2 메틸화의 변이체 형태를 식별하는 방법으로서, (a) AMD를 발병시킬 위험의 감소와 관련된 일배체 또는 이배체을 갖는 개체로서 식별하는 단계; (b) 개체로부터 DNA 또는 RAN를 획득하는 단계; 및 (c) 개체의 게놈에서 인코딩된 ELOVL2 메틸화의 아미노산 서열(들)을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 방어적 ELOVL2 메틸화 단백질은 AMD를 발병시킬 위험의 감소와 관련된 일배체을 갖는 대립유전자에 의해 인코딩되는, 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 방어적 또는 중립적 ELOVL2 메틸화 단백질은 야생형 ELOVL2 메틸화 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖지 않는다.

당업자라면 이해할 바와 같이, 유전자 치료 벡터는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함한다 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 기타 조절 요소를 포함할 수 있음). 프로모터는 구성 발현적이거나 유도가능할 수 있다. 프로모터는 RPE와 같은 표적 조직에서 우선적 유전자 발현을 목표로 하도록 선택될 수 있다 (최신 리뷰에 대해, Sutanto et al., 2005, "Development and evaluation of the specificity of a cathepsin D proximal promoter in the eye" Curr Eye Res. 30: 53-61; Zhang et al., 2004, "Concurrent enhancement of transcriptional activity and specificity of a retinal pigment epithelial cell-preferential promoter" Mol Vis. 10: 208-14; Esumi et al., 2004, "Analysis of the VMD2 promoter and implication of E-box binding factors in its regulation" J Biol Chem 279: 19064-73; Camacho-Hubner et al., 2000, "The Fugu rubripes tyrosinase gene promoter targets transgene expression to pigment cells in the mouse" Genesis. 28: 99-105; 및 이들에서의 참고문헌 참조).

적합한 바이러스성 벡터는 DNA 바이러스 벡터 (예컨대, 아데노바이러스성 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 백시니아 바이러스 벡터) 및 RNA 바이러스 벡터 (예컨대, 레트로바이러스성 벡터)를 포함한다. 일 구현예에서, 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터가 사용된다. 최신 리뷰에 대해서는 Auricchio et al., 2005, "Adeno-associated viral vectors for retinal gene transfer and treatment of retinal diseases" Curr Gene Ther. 5: 339-48; Martin et al., 2004, Gene therapy for optic nerve disease, Eye 18: 1049-55; Ali, 2004, "Prospects for gene therapy" Novartis Found Symp. 255: 165-72; Hennig et al., 2004, "AAV-mediated intravitreal gene therapy reduces lysosomal storage in the retinal pigmented epithelium and improves retinal function in adult MPS VII mice" Mol Ther. 10: 106-16; Smith et al., 2003, "AAV-Mediated gene transfer slows photoreceptor loss in the RCS rat model of retinitis pigmentosa" Mol Ther. 8: 188-95; Broderick et al., 2005, "Local administration of an adeno-associated viral vector expressing IL-10 reduces monocyte infiltration and subsequent photoreceptor damage during experimental autoimmune uveitis" Mol Ther. 12: 369-73; Cheng et al., 2005, "Efficient gene transfer to retinal pigment epithelium cells with long-term expression. Retina 25: 193-201; Rex et al., "Adenovirus-mediated delivery of catalase to retinal pigment epithelial cells protects neighboring photoreceptors from photo-oxidative stress. Hum Gene Ther. 15: 960-7; 및 이들에 인용된 참고문헌 참조.

유전자 치료 벡터는 우수한 제조 관행 (GMP)의 요건을 준수하여 제품을 환자에게 투여하기에 적합하도록 생산하여야 한다. 본 발명은 GMP 요건을 준수하여 생산되고 시험되는 유전자 치료 벡터를 포함하여 환자에게 투여하기에 적합한 유전자 치료 벡터를 제공한다. FDA 승인을 받는 유전자 치료 벡터는 효능 및 동질성에 대해 시험되고, 멸균 상태이고, 외래 물질이 없어야 하며, 산물의 모든 성분 (예로, 방부제, 희석제 및 아쥬반트 등)은 순도, 품질 기준을 충족시키고, 환자에게 유해하지 않아야 한다. 예를 들어, 핵산 조제물은 마이코플라스마가 없는 것으로 입증된다. 예로, Islam et al., 1997, An academic centre for gene therapy research and clinical grade manufacturing capability, Ann Med 29, 579-583 참조.

유전자 치료 벡터를 투여하는 방법이 알려져 있다. 일 구현예에서, ELOVL2 발현 벡터는 전신적으로 (예를 들어, 정맥내 로또는 주입에 의해) 도입된다. 일 구현예에서, ELOVL2 발현 벡터는 국소적으로 (즉, 특정한 조직 또는 기관, 예로 눈에 직접적으로) 도입된다. 일 바람직한 구현예에서, ELOVL2 발현 벡터는 눈에 직접적으로 (예를 들어, 안구 주사에 의해) 도입된다. 최신 리뷰에 대해, 예로 Dinculescu et al., 2005, "Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease" Hum Gene Ther. 16: 649-63; Rex et al., 2004, "Adenovirus-mediated delivery of catalase to retinal pigment epithelial cells protects neighboring photoreceptors from photo-oxidative stress" Hum Gene Ther. 15: 960-7; Bennett, 2004, "Gene therapy for Leber congenital amaurosis" Novartis Found Symp. 255: 195-202; Hauswirth et al., "Range of retinal diseases potentially treatable by AAV-vectored gene therapy" Novartis Found Symp. 255: 179-188, 및 이들에 인용된 참고문헌 참조).

따라서 일 양태에서, 본 발명은 ELOVL2 단백질 또는 ELOVL2 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 치료 벡터, 선택적으로 바이러스성 벡터를 포함하는 조제물로서, 유전자 치료 벡터는 인간 대상체에게 투여하기에 적합한 부형제 (예로, GLP 기법을 사용하여 생산됨)에서 인간 대상체에게 투여하기에 적합한, 조제물을 제공한다. 선택적으로, 유전자 치료 벡터는 망막 색소 상피 세포에서 우선적으로 또는 특이적으로 발현되는 프로모터를 포함한다.

포유류의 눈 노화와 관련된 안와 장애의 예방 및 치료 방법은 하나 이상의 침투 증진제 및 기저 조직 내로 및 안와의 혈관 그물망 내로 침투하는 하나 이상의 생체 침범제의 투과 증진량을 포함하는 국소 조성물의 적용을 포함할 수 있다. 본 방법의 목적은 황반 변성, 뿐만 아니라 백내장 형성, 녹내장 및 당뇨성 망막병증과 같은 눈 질환을 이로써 예방하고 치료하는 것이다.

약물이 피부를 통해 확산되고 조직 및 혈류로 진입하는 속도를 증가시키도록 약리학적 활성 제제에 대한 피부의 투과성을 증가시키는 침투 증진제 또는 투과 증진제에 의해 눈으로의 약제 전달이 촉진될 수 있다. 화학적 피부 침투 증진제는 각질층의 물리화학적 특성을 가역적으로 변경하여 이의 확산 저항성을 감소시킴으로써 피부 투과성을 증가시킨다.

많은 화학적 화합물이 피부 침투 증진제로서 알려져 있다. 대부분의 화합물은 일반적으로 제조업자에 의해 종종 불활성으로 고려되는 안전한 (GRAS) 성분으로서 인식된다. Osborne D W, Henke J J, Pharmaceutical Technology, 1997년 11월, pp 58-86. 논문에 인용된 화합물은 참고문헌으로 통합된다. 침투 증진제의 예는 에탄올 및 이소프로판올과 같은 알코올; n-알칸올, 리모넨, 테르펜, 디옥솔란, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 기타 글리콜 및 글리세롤과 같은 폴리올; 디메틸설폭사이드 (DMSO), 디메틸포름아미드, 메틸 도데실 설폭사이드, 디메틸아세트아미드와 같은 설폭사이드; 이소프로필 미리스테이트/팔미테이트, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 메틸 프로피오네이트 및 카프르산/카프릴산 트리글리세리드와 같은 에스테르; 케톤; 아세트아미드와 같은 아미드; 트리올레인과 같은 올레에이트; 소듐 라우릴 설페이트와 같은 다양한 계면활성제; 카프릴산과 같은 다양한 알칸산; 아존과 같은 락탐 화합물; 올레일 알코올과 같은 알칸올; 디알킬아미노 아세테이트; 및 이들의 혼합물을 포함한다.

많은 특허는 약물을 경피로 전달하기 위한 침투 증진제의 사용을 개시한다. 미국 특허 5,837,289는 광범위한 약물 목록을 전달하기 위해 크림에 적어도 2개 별도의 침투 증진제의 사용을 개시하고 있다. 미국 특허 5,238,933는 활성 제제를 투여하기 위해 저급 알칸올과 조합하여 저급 지방족 카르복실산의 저급 지방족 에스테르를 포함하는 피부 투과 증진제 조성물을 개시한다. 미국 특허 5,229,130는 피부를 통해 활성 제제를 전달하는 식물성 오일계 피부 투과 증진제를 개시하고 있다. 미국 특허 4,933,184는 약물을 전달하기 위해 순차적으로 또는 동시에 메탄올을 사용하는 경피 조성물을 개시한다. 미국 특허 4,342,784는 피부 염이 겔을 분해하여 DMSO를 방출할 수 있도록 중화제와 함께 DMSO 및 카르복시 폴리메틸렌 수지를 갖는 겔을 국소 투여하는 방법을 개시한다. 미국 특허 5,482,965는 디옥산을 함유하는 경피 조성물을 개시한다. 미국 특허 5,620,980 및 5,807,957은 탈모를 치료하는 디옥솔란 및 우레탄의 사용을 개시한다.

일 양태에서, 탈메틸화 제제 및 치료적, 약제학적, 생화학적 및 생물학적 제제 또는 화합물의 결막통과 침투는 이들 제제가 전방 공간, 섬유주 그물망, 섬모체, 맥락막 및 망막을 더욱 신속히 진입하는데 사용될 수 있는 증진제에 의해 촉진될 수 있다. 침투 증진제는 막을 효율적으로 통과할뿐만 아니라, 다른 생물활성 제제가 특정한 막을 더욱 효율적으로 통과할 수 있도록 한다. 침투 증진제는 세포내 단백질 및 지질과 상호작용하는 결막 낭 표면의 세포층을 파괴하거나 점막과 접촉할 때 생물활성 제제의 분배를 개선하는 것과 같은 다양한 양식에 의해 효과를 생성한다.

이러한 증진제를 사용하면, 최대 10kDa의 거대분자가 눈의 결막 낭층을 통과하여 혈관과 망막이 병리학적 변화를 겪고 있는 녹내장 부위에 도달할 수 있다. 이러한 증진제는 독성이 없고, 약리학적으로 불활성이며, 알레르기가 없는 물질이어야 한다. 일반적으로 이러한 증진제는 음이온성 계면활성제, 요소, 지방산, 지방 알코올, 테르펜, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 양쪽이온성 계면활성제, 폴리올, 아미드, 락탐, 아세톤, 알코올 및 당을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 10개의 침투 증진제는 디메틸 설폭사이드 (DMSO), 데실 메틸 설폭사이드, 도데실 디메틸 포스핀 옥사이드, 옥틸 메틸 설폭사이드, 노닐 메틸 설폭사이드, 운데실 메틸 설폭사이드, 소듐 도데실 설페이트 및 페닐 피페라진, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 디알킬 설폭사이드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 침투 증진제는 라우릴 알코올, 디이소프로필 세바케이트, 올레일 알코올, 디에틸 세바케이트, 디옥틸 세바케이트, 디옥틸 아젤레이트, 헥실 라우레이트, 에틸 카프레이트, 부틸 스테아레이트, 디부틸 세바케이트, 디옥틸 아디페이트, 프로필렌 글리콜 디펠라고네이트, 에틸 라우레이트, 부틸 라우레이트, 에틸 미리스테이트, 부틸 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 이소스테아레이트, 2-에틸헥실 펠라고네이트, 벤질 벤조에이트, 벤질 살리실레이트, 디부틸 프탈레이트 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 피부 투과성 증진제는 적어도 1%의 부피 당 중량, 중량 당 중량 또는 몰 백분율을 초과한다.

또 다른 양태에서, 점막 투과성 증진제는 적어도 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 최대 50% 부피 당 중량, 중량 당 중량 또는 몰 백분율을 초과할 수 있다. 일 양태에서, 점막 투과성 증진제는 디메틸 설폭사이드이다. 이러한 양태에서, 디메틸 설폭사이드의 양은 2% 내지 10%, 2% 내지 9.5%, 3% 내지 8%, 3% 내지 7% 또는 4% 내지 6% 부피 당 중량, 중량 당 중량 또는 몰 백분율의 범위 또는 임의의 유효 치료량일 수 있다.

또한 치료제 조제물은, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 200, 300, 400 및 600, 카보왁스 1,000, 1,500, 4,000, 6,000 및 10,000, 4차 암모늄 화합물과 같은 항균 성분, 저온 살균 성질을 갖는 것으로 알려진, 사용 시 해롭지 않은 페닐수은염, 메틸 및 프로필 파라벤, 벤질 알코올, 페닐 에탄올, 소듐 보레이트, 소듐 아세테이트, 글루코네이트 완충액과 같은 완충 성분 그리고 소르비탄 모노라우 레이트, 트리에탄올아민, 올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미틸레이트, 디옥틸 소듐 설포숙시네이트, 모노티오글리세롤, 티오소르비톨, 에틸렌디아민 테트라아세트산과 같은 기타 통상적인 성분과 같은, 비-독성 유화제, 보존제, 습윤제, 보딩제를 포함할 수 있다. 또한, 적절한 안과용 운반체가 통상적인 인산염 완충액 운반체 시스템, 등장성 붕산 운반체, 등장성 염화나트륨 운반체 및 등장성 소듐 보레이트 운반체 등을 포함하여 현재의 목적으로 담체로서 사용될 수 있다.

또한 탈메틸화제 치료제 조제물은 폴리소르베이트 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 계면활성제 (BASF 크레마포어), 포스포네이트, 사포닌 및 폴리에톡실화된 피마자유 및 시판되는 폴리에톡실화된 피마자유와 같은 계면활성제를 함유할 수 있다.

약제학적 조제물은 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 글리세린, 만니톨, 폴리비닐 알코올 또는 하이드록시에틸셀룰로스와 같은 안과용 용액에 이미 사용된 습윤제를 포함할 수 있으며, 희석제는 물, 증류수, 멸균수 또는 인공 눈물일 수 있다. 습윤제는 약 0.001% 내지 약 10%의 양으로 존재한다.

본 발명의 안과용 제형물은 pH를 조정하는 산 및 염기; 소르비톨, 글리세린 및 덱스트로스와 같은 긴장성 부여 제제; 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤디돈, 폴리비닐 알코올 및 기타 검과 같은 기타 점도 부여 제제; 계면활성제, 담즙산과 같은 적합한 흡수 증진제; 바이설파이트 및 아스코르베이트와 같은 항산화제와 같은 안정화제; 소듐 EDTA와 같은 금속 킬레이팅제; 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 약물 용해도 증진제를 포함할 수 있다. 이러한 추가 성분은 필요에 따라 배합할 필요가 없도록 안정성이 있는 시판되는 용액을 만드는데 도움이 된다.

안과용 약물 조성물은 눈 및/또는 콘택트렌즈와 양립할 수 있도록 제형화될 것이다. 점안액 조제물은 혈액과 등장성이어야 한다. 눈에 직접적 적용이 의도된 안과용 조성물과 마찬가지로 눈에 적합한 pH 및 긴장성을 갖도록 제형화될 것이다. 이것은 정상적으로 조성물의 pH를 생리적 pH (즉, 7.4) 또는 이의 근처로 유지하도록 완충액이 요구되고, 조성물의 삼투압을 킬로그램 당 210 내지 320 밀리몰 (mOsm/kg) 수준 또는 이의 근처로 조정하는 긴장성 제제를 요구할 수 있다.

실시예

WI-38 및 IMR-90 세포주는 세포성 노화를 연구하는데 광범위하게 사용되는 모델로서 이전에 설명되었다. 둘 다의 세포주는 시간 경과 시 표현형과 집단 배가 (PD) 횟수에 유의한 변화를 보이는 것으로 나타났다 [19, 20]. 촬영 소프트웨어에 의해 충만도로서 측정된 이들의 성장 속도는 낮은 PD부터 높은 PD까지 현저하게 감소한다 (도 6a 및 도 7a). 노화 관련 베타-갈락토시다제 염색 (SA-β-Gal)에 의해 측정된 바, 노화 양성 세포의 백분율은 PD가 증가함에 따라 증가하고 (도 6b 및 도 7b), 이들의 형태는 더 길쭉한 모양부터 더 넓고 평평한 모양으로 변화한다 (도 6c).

인간 노화의 메틸화 프로파일에 관한 연구는 ELOVL2의 프로모터 영역의 메틸화가 지금까지 연령과 가장 유의한 상관관계가 있음을 나타내었다 [3]. 노화된 WI-38 및 IMR-90 세포에서 ELOVL2 프로모터 메틸화 수준의 변화를 조사하기 위하여, 메틸화된 DNA 면역침전 (MeDIP)이 사용되었다. 표 1에 기술된 특이적 CpG를 포함하는 프라이머가 설계되었다. 이러한 접근법을 사용하여, 프로모터 메틸화는 세포 집단 배가가 증가하면서 상승되는 것을 발견하였다 (도 1a). 이전에 프로모터 영역의 메틸화가 전사를 억제하는 것이 밝혀졌던 바와 같이 [21], ELOVL2의 발현 수준이 ELOVL2 프로모터 메틸화와 역으로 상관되는지 여부를 조사하였다. qRT-PCR을 사용하여, PD 횟수가 증가하면서 유전자의 발현 수준이 감소하는 것으로 나타났으며 (도 1b 및 도 7c), ELOVL2 발현이 노화 세포에서 하향조절되고, ELOVL2 프로모터 메틸화 및 배양에서 노화 세포의 백분율의 증가를 수반하는 것으로 결론을 도출하였다.

ELOVL2의 발현을 조정하는 것이 세포성 노화에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하였다. 먼저, 렌티바이러스성 shRNA를 사용하여 WI-38 및 IMR-90 세포에서 ELOVL2 발현이 녹다운되었고 (도 6e 및도 8d), 증식 속도의 유의한 감소 (도 1c)뿐만 아니라 SA-β-Gal 염색에 의해 검출된 배양에서 노화 세포 수의 증가 (도 1d) 및 높은 PD 세포와 부합하는 형태학적 변화 (도 6d)가 관찰되었다. 모든 관찰은 다함께 외관상 섬유아세포 연령의 증가를 나타내었다.

ELOVL2 발현에 미치는 ELOVL2 프로모터 메틸화 수준의 효과를 시험하였다. WI-38 섬유아세포는 DNA 메틸트랜스퍼라제를 저해하는 사이티딘 유사체인 5-아자-2'-데옥시사이티딘 (5-Aza-dc)으로 처리되었다 [22]. 세포를 2 μM 5-Aza-dc로 2일 동안 처리한 이후 화합물 없이 5일 동안 배양하였다. 실험의 종료 시, ELOVL2의 발현은 qRT-PCR에 의해 측정되었다. 5-Aza-dc로 처리 시, ELOVL2 프로모터 메틸화가 감소되는 반면 (도 2a), ELOVL2 발현은 상향조절되는 것으로 밝혀졌다 (도 2b). 더욱이, 5-Aza-dc로 처리 시 더 낮은 노화 세포의 백뷴율이 배양에서 관찰되었다 (도 2c). 이러한 데이터는 ELOVL2 프로모터 메틸화를 감소시키는 것이 ELOVL2 발현 및 섬유아세포의 외관상 연령에 영향을 주는 것을 시사한다.

시력은 노화에 대한 상위 예측인자 중 하나이다. 시각 대비 민감도 점수는 평가된 377개의 변수와 비교하여 연령의 상위 5개 개별 예측인자 중 하나이었다 [23]. ELOVL 단백질은 눈에서 높게 발현되며, 이중 몇 가지는 안구 질환과 연루되어 왔다 [9, 24]. 그러나, 메틸화 모델에서 단지 ELOVL2만이 연령과 높은 상관 관계를 갖는 메틸화 표식을 포함하고 있다 [3]. 따라서, 야생형 (C57BL/6) 마우스 망막에서 ELOVL2 의 발현 수준이 연령에 따라 변화하는지 여부를 조사하였다. qRT-PCR 및 웨스턴 블럿에 의해, 노화된 인간 섬유아세포로부터의 데이터와 유사하게 ELOVL2의 발현 수준이 동물의 연령과 역으로 상관되는 것이 밝혀졌다 (도 3a 및 3b). 가장 중요하게도, MeDIP 분석은 동물의 연령에 따라 망막의 ELOVL2 프로모터 메틸화가 증가하는 것을 나타낸다 (도 3c).

동시에, 에임즈 왜소 마우스 (Prop1 ^df )로부터 해부된 망막에서 ELOVL2 프로모터 메틸화 및 mRNA 발현 수준을 조사하였고, 이는 야생형 마우스와 비교하여 유의하게 더 오래 살고 노화가 지연되는 많은 증상을 나타낸다 [25, 26]. 노화된 에임즈 왜소 망막은 노화된 야생형 마우스와 비교하여 더 낮은 ELOVL2 프로모터 메틸화 및 발현 증가를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 9). 이것은 ELOVL2 발현과 메틸화가 동물 건강을 나타낼 수 있음을 시사한다.

동물의 연구 연령 동안 시각 성능과 눈 구조가 변화하는지 여부를 평가하였다. 먼저, 야생형 C57BL/6 마우스를 2개월령, 6개월령, 1년령 및 2 년령에서 안저의 자가형광 촬영을 이용하여 구조적 변화에 대해 평가하였다. 자가형광 점상 응집체가 1년령의 안저에 출현하기 시작하고 2년령에는 매우 두드러지는 것으로 관찰되었다 (도 3d 및 도 8a). 다음으로 노화된 마우스의 시각 기능을 평가하기 위하여, 망막전위도 (ERG) 분석을 수행하였다. 마우스가 노화하면서, 막대의 수와 민감도가 감소한다 [27]. 실제로, 더 나이든 마우스는 ERG에 의해 암순응 반응 진폭의 감소를 나타내었다 (도 3d 및 3e).

ELOVL2가 눈 노화 및 시각 성능에 역할을 담당하는지 여부를 조사하기 위하여, 상동 재조합이 이루어진 CRISPR-Cas9를 사용하여 ELOVL2 돌연변이 C57BL/6 마우스를 생성하였다. ELOVL2 녹아웃 마우스가 생식능의 감소를 나타내기 때문에 [28], 대신에 시스테인 대 트립토판 치환 (C217W)을 인코딩하는 ELOVL2 돌연변이체 마우스를 생성하였고, 이는 ELOVL2 의 기질 특이성을 ELOVL5의 기질 특이성으로 변경하여, C22 오메가-3 PUFA 도코사펜타엔산 (DPA) (22 : 5n-3)을 24 : 5n-3으로 전환시키는 ELOVL2의 독특한 능력을 효과적으로 파괴하는 것으로 확인되었다 [6]. 코돈 217번 근처의 ELOVL2 및 복구 공여자 올리고뉴클레오티드를 표적으로 하는 2개의 gRNA는 에디팅 후 재절단을 방지하도록 안내 및 전구스페이서-인접 모티프 서열을 파괴하는 침묵 돌연변이와 함께, 돌연변이체 C217W를 생성하는 염기쌍 돌연변이를 사용하여 설계되었다. gRNA, 복구 올리고뉴클레오티드 및 Cas9 mRNA를 C57BL/6N 마우스 접합체 내로 주사하였다 (도 4a 및 도 10a 내지 10d). gRNA 중 하나로부터 정확하게 표적화된 동형접합 개척자가 식별되었다. 표적-외 돌연변이는 발견되지 않았다 (도 10e). C217W 동형접합 마우스는 임의의 외관상 표현형을 나타내지 않지만, 정상적으로 발생하였다.

다음으로 C217W 돌연변이체에서 눈 구조와 시각 성능이 변화하는지 여부를 조사하였다. 흥미롭게도, ELOVL2 돌연변이체 마우스에서는 자가형광 응집체가 야생형 마우스보다 훨씬 일찍 6개월령만에 안저에 출현하고 (도 4b 및 도 3d), 정상적인 ELOVL2 활성이 건강한 망막을 유지하는데 중요한 것을 보여준다. 이러한 표현형은 4, 6, 8 및 12개월령 돌연변이체 동물에서 일관되게 관찰되었다 (도 11a).

다음으로 ERG를 사용하여 이러한 돌연변이체 마우스의 광 수용체 기능을 시험하였다. 야생형 한배 새끼와 비교하여, C217W 돌연변이체 마우스에서 암순응 반응 진폭의 감소가 관찰되었다 (도 4b 및 4c). 이러한 반응 감소는 다른 연령대에서도 일관되게 재현되었다 (도 11b). 가장 영향을 받은 신호는 암순응 반응이었지만, ELOVL2 돌연변이체에서 진동 전위와 깜박임 반응을 포함한 다른 유형의 ERG 측정도 영향을 받았다 (도 11c 및 11d).

C217W 및 WT 마우스의 망막을 면역염색하여 자가형광 안저 촬영에서 점으로서 관찰된 응집체가, 인간에서 AMD를 발병시킬 위험 요인인 드루젠과 유사한지 여부를 조사하였다 [14]. 실제로, 면역염색은 C217W 망막에서만 HTRA1, T-15, C3 및 C5b-9 양성 응집체를 검출하였다 (도 4d, 4e 및 도 12). 돌연변이체 마우스에서 드루젠-유사 응집체의 출현 및 조기 발생을 감안할 때 이들은 잠재적으로 AMD의 모델일 수 있다.

마지막으로, ELOVL2 프로모터를 포함한 DNA 탈메틸화에 의해 마우스 눈의 노화 특징이 회복될 수 있는지 여부를 조사하였다. 이를 위해, 각각의 마우스에게 2 μM 5-Aza-dc를 한쪽 눈에 1 μL, 다른쪽 눈에 PBS 1 μL를 10개월령에 시작하여 2개월에 걸쳐 격주로 주사하였다. MeDIP 방법을 사용하여, ELOVL2 프로모터의 메틸화가 처리 이후 감소하는 것으로 밝혀졌다 (도 5a). 또한 ELOVL2 발현이 치료받은 눈에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다 (도 5b). 마지막으로, 광 수용체 기능을 ERG에 의해 검토하여, 주사된 눈에서 암순응 반응이 개선된 것으로 나타났다 (도 5c 및 도 13). 이러한 데이터는 노화의 표적으로서 ELOVL2 메틸화 상태 그리고 노화된 안구 특징에 영향을 미치는 DNA 메틸트랜스퍼라제 저해제의 사용을 뒷받침한다.

인체 임상 사용 예: 건성 AMD에 걸린 환자에게 3개월에 걸쳐 격주 투여 (20 μM)

양측 건성 노화 관련 황반 변성 (AMD에 걸린 75세 여성을 안과 병원에서 관찰한다. 그녀는 달리 건강하다. 그녀는 탈메틸화 요법 대비 대조군을 비교하는 실험 연구에 동의한다. 기준선에서 양쪽 눈은 자가형광, 광학 간섭 단층촬영 및 망막전위 조영술 상의 암순응 반응에 의해 측정된 바, 시력, 지리적 위축의 크기에 대한 임상 평가에 의해 입증된 바와 유사한 AMD 수준을 나타낸다. 환자는 왼쪽 눈에 유리체내 주사에 의해 투여되는 멸균, 등장성, pH 완충 용액으로 제형화된 100 μL의 데시타빈 (20 μM)으로 치료된다 (활성을 갖는 치료). 그녀는 100 μL의 동일한 멸균, 등장성, pH 완충 용액을 받지만, 오른쪽 눈에 유리체내 주사에 의한 데시타빈을 투여하지 않는다 (대조군 치료). 활성을 갖는 치료 및 대조군 치료의 투여 직후, ELOVL2 발현 및 메틸화 수준의 기준 측정을 위해 각 눈으로부터 유리체내 체액의 시료를 채취한다. ELOVL2는 양쪽 눈에서 유사한 정도로 과다메틸화되는 것으로 관찰된다. ELOVL2 발현 수준도 유사하며, 양쪽 눈에서 낮은 수준의 발현이 관찰된다. 활성을 갖는 치료 및 대조군 치료 둘 다는 3개월 동안 격주로 투여하면서 각각 왼쪽 눈과 오른쪽 눈에서 계속된다. 활성을 갖는 치료 및 대조군 치료 둘 다는 투여 기간 동안 동등하게 잘 견딥니다. 마지막 투여 직후, ELOVL2 유전자 발현 및 메틸화를 측정하기 위해 양쪽 눈에서 유리체내 체액 시료를 획득한다. 기준선에서 수행된 지리적 위축에 대한 동일한 임상 평가가 각각의 눈에 대해 반복된다. 대조군과 비교하여, 데시타빈으로 치료된 눈 사이에 유의한 차이가 관찰된다. 데시타빈 치료된 눈에서, ELOVL2 메틸화는 거의 30% 감소하고 ELOVL2 유전자 발현도 기준선과 비교하여 약 30% 증가한다. 또한, 암순응 반응은 기준선에 비해 약 30% 증가한다. 또한, 기준선과 비교하여 안저 자가 형광에 의해 측정된 바 지리적 위축의 성장은 진행하지 않는다. 현저하게 대조적으로, 임의의 다른 매개 변수에서 대조군 눈은 관찰가능한 변화가 없다. 유전자 메틸화 및 유전자 발현 그리고 암순응 반응 값은 기준선 값에서 관찰된 것과 유사하게 유지된다. 환자는 6개월째에 추적 방문을 위해 병원에 다시 온다. 임상 평가에 따르면 데시타빈으로 치료한 눈의 암순응 반응의 개선이 지속되고, 기준선에 비해 약 20% 내지 30% 개선된 것으로 나타났다. 대조군 눈의 암순응 반응은 기준선 값과 유사하게 유지된다.

인체 임상 사용 예: 지리적 위축증에 걸린 환자에게 12개월 동안 매월 1회 투여 (15 μM)

지리적 위축증과 함께 건성 노화 관련 황반 변성 (AMD)에 걸린 65세 남성을 안과 병원에서 관찰한다. 암순응 반응으로 평가된 바 그의 시력은 저하되고 있다. 지난 2년에 걸쳐 안저 자가형광에 의해 측정된 그의 지리적 위축 영역은 꾸준한 진행을 나타낸다. 그는 달리 건강하다. 환자는 유리체내 주사에 의해 투여되는 멸균, 등장성, pH 완충 용액으로 제형화된 100 μL의 데시타빈 (15 μM)으로 치료된다. 데시타빈 투여 직후 유리체내 시료를 회수하면 ELOVL2 프로모터의 과다메틸화 및 낮은 수준의 ELOVL2 발현이 나타난다. 데시타빈 치료는 12개월에 걸쳐 5주마다 동일한 용량으로 계속 투여되었다. 투여는 부작용이 관찰되지 않고 잘 견딘다. 마지막 데시타빈 투여 이후 유리체액 시료를 얻고 ELOVL2 유전자 메틸화 및 ELOVL2 유전자 발현에 대해 시험한다. 연구에 따르면 ELOVL2 메틸화는 (기준선으로부터) 거의 60%로 감소하였으며, ELOVL2 유전자 발현은 (기준선 값을 초과하여) 약 50%까지 증가하였다. 환자의 암순응 반응은 현저하게 개선되고, 기준선을 초과하여 약 30% 증가한다. 안저 자가형광에 의해 측정된 지리적 위축의 성장은 전혀 없다.

인체 임상 사용 예: ELOVL2 유전자 요법

지리적 위축증과 함께 건성 노화 관련 황반 변성 (AMD)에 걸린 70세 남성을 안과 병원에서 관찰한다. 암순응 반응으로 평가된 바 그의 시력은 여전히 저하되어 왔다. 안저 자가형광에 의해 측정된 그의 지리적 위축 영역은 꾸준한 진행을 나타낸다. 그는 달리 건강하며, ELOVL2 유전자 요법을 사용한 치료에 동의한다. 유전자 요법 절차 1주일 전에 그는 경구 프레드니손 (0.5 mg/kg) 복용을 시작한다. ELOVL2 코딩 서열을 갖는 재조합 아데노 관련 바이러스성 벡터가 제작되고, 우수한 의료 관행 지침에 따라 포장된다.　 0.3 mL 분량의 1.5 × 10¹¹개 게놈의 역가로 완충 식염수 용액에 현탁된다.　 경구 프레드니손의 복용 1주일 후, 표준 유리체 절제술은 일반 마취 하에 표준 유리체 기법을 사용하여 피질 유리체를 제거하도록 수행된다.　　 다음으로 환자는 황반 바로 외부의 특수화된 망막하 원통을 사용하여 망막하 공간에 주입되는 총 1.5 × 10¹¹개 게놈의 역가를 포함하는 완충 식염수 0.3 mL을 투여받는다. 공기 유체 교환이 수행되고, 상처는 표준 방식으로 봉합된다.　 환자는 경구 프레드니손 (0.5 mg/kg)을 계속 복용하고, 수술 후 4주 동안 천천히 테이퍼를 유지한다. 유리체 시료로부터 얻은 세포 분석은 낮은 수준의 ELOVL2 발현을 나타낸다. 유전자 요법 절차 이후 6개월 및 1년에 추적 관찰은 안저 자가형광에 의해 측정된 지리적 위축 영역에서 유의한 진행이 없고, 암순응 반응에 의해 평가된 시력은 약 20% 내지 약 30%로 향상되는 것을 나타낸다.

논의

이전 연구에서는 ELOVL2 프로모터 메틸화와 인간의 연령 사이에 매우 유의한 상관 관계가 있음이 밝혀졌다 [3, 29, 30]. 현재 연구에서는, ELOVL2 메틸화 및 발현이 인간 섬유아세포 및 마우스 망막 모델의 노화 표현형에서 역할을 담당하는지 여부를 조사하였다.

WI-38 섬유아세포는 1960년대에 헤이플릭과 무어헤드에 의해 분리되었으며, 이들은 분열하면서 처음에 지연된 다음 50+/-10회의 집단 배가에서 분열을 멈추는, 헤이플릭 한계로서 나중에 알려진 현상인 노화의 징후를 점진적으로 경험하는 것으로 관찰되었다 [31]. 또한, 세포는 연령이 증가함에 따라 생체내에서 노화하는 것으로 확인되었고 [32], 상이한 종의 일차 세포는 종의 최대 수명과 상관되는 최대 시험관내 수명을 갖는 것으로 밝혀졌다 [33]. 이러한 변화에 덧붙여 ELOVL2 발현은 인간 섬유아세포에서 계대 수가 증가함에 따라 감소하는 것으로 확인되었다. 프로모터 메틸화는 일반적으로 발현과 역으로 상관되기 때문에, 프로모터 메틸화는 세포성 노화와 함께 증가할 것으로 예상되었으며, 이것이 사실임을 확인하였다. 세포의 발현이 감소하고, 연령과 함께 세포와 인간 둘 다에서 프로모터 메틸화가 증가하기 때문에 ELOVL2 녹다운이 노화 표현형의 진행을 유도할 것이라고 가설을 세웠다. 실제로, ELOVL2에게로 안내된 shRNA로 처리된 세포는 대조군 세포과 비교하여 ELOVL2 발현 감소, 증식 능력 감소, 노화 증가 및 노화 관련 형태 변화를 보였다.

노화 표현형을 추가로 조사하기 위하여, ELOVL2 돌연변이체 마우스를 제작하였다. CRISPR-Cas9를 사용하여 C217W 돌연변이가 생성되었으며, 이전에 ELOVL2 촉매 부위의 기질 특이성을 ELOVL5의 동등물로 교체하여, C22 오메가-3 PUFA 도코사펜타엔산 (DPA) (22 : 5n-3)을 24 : 5n-3으로 전환시키는 ELOVL2의 독특한 능력을 효과적으로 파괴하는 것으로 확인되었다 [6]. ELOVL2와 ELOVL5는 모두 에이코사펜타엔산 (EPA; 20 : 5n-3)을 도코사펜타엔산 (DPA; 22 : 5n-3)으로 연장시키는 것으로 밝혀져 왔지만, ELOVL2만이 DPA를 DHA의 전종단 전구체인 24 : 5n-3로 추가로 연장시키는 것으로 알려져 있다 [6]. 따라서 ELOVL2 돌연변이체 마우스의 눈 건강을 조사하였다.

6개월령에 망막 상에 단백질 응집체의 존재가 야생형 마우스의 1년과 비교하여 자가형광 촬영에 의해 관찰되었다. 망막 절편은 노화 관련 황반 변성 (AMD)에 걸린 환자에서 공통적으로 발견되는 드루젠에서 발견되는 모든 단백질인 산화된 포스포콜린 (T-15 항체 포함), HTRA1, C3 및 C5b-9에 대해 염색되었다.

광 수용체 기능은 ERG에 의해 평가되었다. ERG는 광 자극에 반응하여 망막에서 생성되는 전기 신호를 측정하여, 광 수용체의 기능적 이상을 검출할 수 있다. 마우스 망막에는 대부분 간상체 광 수용체가 포함되어 있기 때문에, 이들의 전기 신호의 기능적 차이 (암순응 반응)는 시각 성능을 평가하는 데 가장 적절하다. 암순응 반응 이외에도, 원추체 반응과 10 Hz 깜박임도 조사되었다. 이러한 신호 모두이지만 가장 주목할만한 암순응 반응은 연령이 일치하는 한배 새끼와 비교하여 야생형 마우스와 돌연변이 마우스 둘 다에서 연령으로 인해 진폭이 감소하였다. 드루젠-유사 응집체의 존재와 함께, 이러한 광 수용체의 기능 감소의 지표는 AMD의 징후이다. 따라서 ELOVL2 기능은 드루젠-유사 응집체의 조기 발병을 예방하고 마우스의 건강한 광 수용체 기능을 유지하는데 결정적이라는 결론을 도출하였다. 드루젠-유사 응집체의 가속화된 출현과 조합하여 ELOVL2 돌연변이체 마우스에서 광 수용체의 기능 상실은 ELOVL2가 마우스의 노년기까지 건강한 망막을 유지하는데 중요한 부분임을 보여준다. 또한, ELOVL2는 인간 세포의 노화 표현형에 영향을 미치는 중요한 역할을 담당하며, 잠재적으로 더 광범위한 수준의 노화 과정에 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌다.

ELOVL2 C217W 마우스는 드루젠과 유사한 응집체를 보여주고, 대조군 한배 새끼보다 유의하게 더 조기 단계에서 광 수용체 민감도를 감소시키는 것으로 확인되었다. ELOVL2 C217W 돌연변이는 가속화된 눈 노화 표현형을 부여하는 것으로 결론을 내렸다. 종합하여, 본 연구는 ELOVL2가 노화 특징, 구체적으로 눈 기능에 역할을 담당하는 증거를 나타낸다. 또한, ELOVL2의 프로모터 영역에서 메틸화 수준은 이의 발현과 상관되어 있으며, 노화 특징에 잠재적으로 영향을 미치도록 변경될 수 있다.

방법

세포 배양 및 치료.

WI-38 및 IMR-90 인간 섬유아세포를 10% 소태아 혈청 (오메가사) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (집코)이 보충된 EMEM (ATCC)에서 배양하고, 5% CO₂ 및 37℃에서 가습 인큐베이터에서 유지하였다. 충만도를 시료 당 3개의 시야각 (10x)을 포함하는 ImageJ 촬영 소프트웨어를 통해 계산하였다. 충만 배양 시, 세포는 1 : 3 비율로 분할되어 접종되었다. 집단 배가 (PD)는 세포 계수에 의해 계산되었다. 녹다운 렌티바이러스는 제조사의 지침에 따라 미션 shRNA (시그마사)를 사용하여 생성되었다. 5-Aza-2'-데옥시사이티딘은 TSZ Chem (CAS # 2353-33-5)로부터 구입하여, 2 μM 농도의 세포 배양 배지에 용해시켰다. 세포는 48시간 동안 처리되었다. 다음으로 배지를 정규 세포 배양 배지로 교체하고, 세포를 5일 동안 더 배양하였다.

노화 관련 β-갈락토시다제 (SA-β-gal) 활성.

배양된 세포에서 SA-β-gal 활성은 제조사의 지침에 따라 노화 β-갈락토시다제 염색 키트 (Cell Signaling Technology)를 사용하여 결정되었다. 세포는 나중에 DAPI로 염색하고 양성으로 염색된 세포의 백분율을 3개의 시야각 (10×)을 포함하는 촬영 소프트웨어 (Keyence)로 계산하였다.

핵산 분석.

제조사의 지침에 따라 TRIzol (앰바이온사)을 사용하여 인간 섬유아세포 및 마우스 조직으로부터 DNA와 RNA를 분리하였다. RNA는 iScript cDNA 합성 키트 (바이오래드사)를 사용하여 cDNA로 전환되었다. qPCR은 SsoAdvanced 범용 SYBR 그린 슈퍼믹스 (바이오래드사)를 사용하여 수행되었다.

메틸화된 DNA 면역침전 (MeDIP)은 생물파쇄기 (Bioruptor, 다이아제노드사)에 의해 1 μg DNA를 높은 설정에서 8주기 동안 전단하여 수행하였으며, 각 주기는 30초 켜기 및 30초 끄기로 구성된다. 전단된 DNA를 변성시키고 1 μg 5 mC 항체 MABE146 (밀리포아사)과 함께 2시간 동안 배양한 다음, 슈어비드 단백질 G 비드 (바이오래드시)와 함께 1시간 동안 배양하였다. 세척 이후, DNA를 QIAquick PCR 정제 키트 (퀴아젠사)로 정제하였다. 다음으로 qPCR을 상기와 같이 수행하였다.

웨스턴 블럿팅.

TRIzol (앰바이온사)를 사용하여 다양한 발생 단계의 WT 마우스의 망막으로부터 분리된 총 단백질 10 μg을 SDS-PAGE에 적용하였다. 인정된 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다 (연구에 사용된 항체에 대해 표 2 참조). ELOVL2 단백질 발현 수준은 H3로 정규화되었다.

CRISPR-Cas9 설계.

CRISPR-Cas9 시약은 필수적으로 이전에 설명한 바와 같이 생성되었다 [34]. PCR 증폭에 의해 T7 프로모터를 클로닝된 Cas9 코딩 서열에 첨가하였다. 다음으로 T7-Cas9 산물을 겔 정제하고, mMESSAGE mMACHINE T7 울트라 키트 (Life Technologies)를 사용하여 시험관내 전사 (IVT)를 위한 주형으로서 사용하였다. T7 프로모터와 sgRNA 서열을 긴 올리고뉴클레오티드 (울트라머, IDT)로서 합성하고, PCR에 의해 증폭하였다. 다음으로 T7-sgRNA PCR 산물을 겔 정제하고, MEGAshortscript T7 키트 (Life Technologies)를 사용하여 IVT를 위한 주형으로서 사용하였다. C217W 변이체를 인코딩하는 복구 주형을 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (울트라머, IDT)로서 합성하고, 정제 없이 사용하였다. Cas-OFFinder35를 사용하여 잠재적인 표적 외부를 식별하여, 미스매칭이 가장 적은 표적을 선별하였다 (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). 개척자 마우스와 모든 F1 마우스는 표적 외부에 대해 시퀀싱되었다.

동물 주사 및 분석.

모든 동물 절차는 샌디에이고 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리위원회의 승인을 받아 시행되었다. C57BL/6N 마우스 접합체에 CRISPR-Cas9 구축물을 주사하였다. 올리고는 전핵 단계에서 접합체의 세포질 내로 주사되었다. 마우스는 통상적인 동물 시설의 고정 랙 상에서 사육되었으며, 테크래드 글로벌 2020X 식이가 자유롭게 공급되었다. 5-Aza-dc 주사 연구의 경우, 마우스에 케타민/자일라진 (각각 100 mg/kg 및 10 mg/kg)을 복강내 주사에 의해 마취하고, 진통 점안제 프로파라카인 (0.5%, Bausch & Lomb)을 투여하였다. 동물은 2개월에 걸쳐 격주로 한쪽 눈에 PBS 1 μL, 다른쪽 눈에 PBS에 녹인 2 μM 5-Aza-dc 1 μL를 안구내로 주사하였다.

망막전위도 (ERG)는 이전에 보고된 프로토콜에 따라 수행되었다 [36]. 간략하게, 마우스를 12시간 동안 암소에 적응시키고, 체중을 기준으로 한 케타민/자일라진의 복강내 주사로 마취시키고, 트로피카미드 (1.5%, 알콘사)의 확장 점안액, 뿐만 아니라 프로파라카인 (0.5%, Bausch & Lomb) 점안액을 진통제로서 투여하였다. 마우스를 전체 그란즈펠드 보울 설정 (Diagnosys LLC)으로 검사하고, 전극을 각 각막에 배치하고 피하 접지 바늘 전극을 미단에, 기준 전극을 입에 배치하였다 (Grass Telefactor, F-E2). 전극과 눈을 접촉시키기 위해 윤활제 (고니오비스크 2.5%, HUB 제약사)를 사용하였다. 증폭 (1 내지 1,000Hz 대역 통과, 노치 필러링 없음), 자극 표시 및 데이터 수집은 UTAS-E 3000 시스템 (LKC Technologies)을 사용하여 프로그래밍되고 수행된다. 암순응 ERG의 경우, 망막을 -2 및 -0.5 로그 cd·s/m²에서 제논 램프로 자극하였다. 광순응 ERG의 경우, 마우스를 1 로그 cd·s/m²의 배경 광에 적응시키고, 광 자극을 1.5 로그 cd·s/m²로 설정하였다. 기록이 제조사의 소프트웨어 (Veris, EDI)에서 수집되고, 평균 처리되었으며, 엑셀로 프로세싱되었다.

마우스 망막 분석.

마우스를 희생시킨 직후에 망막을 채취하여 4% 파라포름알데히드에 1시간 동안 고정하고, PBS에서 4℃로 보관하였다. 면역염색의 경우, 망막을 절편화하고, 슬라이드 상에 장착한 다음 5% BSA, 0.1% 트리톤-X PBS 차단 용액과 함께 1시간 동안 배양하였다. 1차 항체 (연구에 사용된 항체에 대해 표 2 참조)를 5% BSA PBS에 1 : 50으로 첨가하고, 4℃에서 16시간 동안 배양하였다. 3× PBS 세척 이후, 2차 항체를 실온에서 30분 동안 5% BSA PBS에 1 : 1000으로 첨가하였다. 다음으로 시료를 PBS로 3회 세척하고, 실온에서 5분 동안 DAPI로 염색하고, 마운팅하여 촬영하였다 (Keyence BZ-X700).

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SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> DEMETHYLATION TO TREAT EYE DISEASE <130> 24978-0488 <140> <141> <150> 62/716,554 <151> 2018-08-09 <150> 62/683,292 <151> 2018-06-11 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 gtaattccgt gatcaccgtc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 ccaataaata acagcagaag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 caatatgctc atcattgtct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 ccacacatgt ctaccttcct 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 cgatttgcag gtccagccg 19 <210> 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Claims (42)

1. 노화 관련 눈 질환 또는 병태를 치료하거나, 개선하거나, 예방하는 방법으로서, 적어도 하나의 탈메틸화 제제의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 탈메틸화 제제는 매우 긴 사슬 지방산의 연장-유사 2 유전자 (ELOVL2)의 발현을 증가시키고/거나, ELOVL2 효소의 수준을 증가시키고/거나, 망막 22 : 6 (n-3) 도코사헥사엔산 (DHA) 및 22 : 5 (n-6) 도코사펜타엔산 (DPA)의 수준을 증가시키는, 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 탈메틸화 제제는 5-아자사이티딘, 데시타빈, 제불라린, 프로카인아미드, 프로카인, 하이드라라진, 발프로산 및 에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCG)로부터 선택되는, 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈메틸화 제제는 상기 눈에 투여되는, 방법.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈메틸화 제제는 유리체내, 망막하, 결막하, 힘줄하 또는 공막 후방 경로에 의해 상기 눈에 투여되는, 방법.
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련 눈 질환은 노화 관련 황반 변성 (AMD), 당뇨성 눈 질환, 녹내장, 시력 저하 또는 안구 건조인, 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 AMD는 건성 또는 습성 AMD인 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 AMD는 건성 AMD인, 방법.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈메틸화 제제는 시간 방출 제형물로서 투여되는, 방법.
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈메틸화 제제는 데시타빈인, 방법.
11. 노화 관련 눈 질환 또는 병태를 치료하거나, 개선하거나, 예방하는 방법으로서, 상기 눈에서 ELOVL2 효소 및/또는 22 : 6 (n-3) 도코사헥사엔산 (DHA) 및 22 : 5 (n-6) 도코사펜타엔산 (DPA)의 수준을 상기 눈에 ELOVL2를 인코딩하는 mRNA의 유효량을 투여함으로써 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 mRNA는 바이러스성 벡터를 사용하여 전달되는, 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스성 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 레트로바이러스성 벡터로부터 선택되는, 방법.
14. 제 11항에 있어서, 상기 mRNA는 리포좀 또는 마이크로/나노 입자와 같은 비-바이러스성 벡터를 사용하여 전달되는, 방법.
15. 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 유리체내, 망막하, 결막하, 힘줄하 또는 공막 후방 경로에 의해 상기 눈에 투여되는, 방법.
16. 제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련 눈 질환은 노화 관련 황반 변성 (AMD), 당뇨성 눈 질환, 녹내장, 시력 저하 또는 안구 건조인, 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 노화 관련 눈 질환은 건성 AMD인, 방법.
18. 노화 관련 눈 질환 및 병태를 치료하거나, 개선하거나, 예방하는 방법으로서, 상기 눈에서 ELOVL2 효소 및/또는 상기 눈에서 22 : 6 (n-3) 도코사헥사엔산 (DHA) 및 22 : 5 (n-6) 도코사펜타엔산 (DPA)의 수준을 ELOVL2 발현 벡터를 사용한 유전자 요법에 의해 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스성 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 레트로바이러스성 벡터로부터 선택되는, 방법.
20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 ELOVL2 발현 벡터는 유리체내, 망막하, 결막하, 힘줄하 또는 공막 후방 경로에 의해 투여되는, 방법.
21. 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련 눈 질환은 노화 관련 황반 변성 (AMD), 당뇨성 눈 질환, 녹내장, 시력 저하 또는 안구 건조인, 방법.
22. 제 21항에 있어서, 상기 노화 관련 눈 질환은 건성 AMD인, 방법.
23. 노화 관련 눈 질환의 치료를 필요로 하는 환자를 선별하는 단계, 및 하나 이상의 탈메틸화 제제 및/또는 ELOVL2를 인코딩하는 mRNA 및/또는 ELOVL2 발현 벡터의 유효량을 상기 환자의 눈에 투여하는 단계를 포함하고, 이로써 상기 노화 관련 질환을 치료하는, 방법.
24. 제 23항에 있어서, 상기 환자는 상기 환자의 눈에서 ELOVL2 메틸화 및/또는 ELOVL2 발현을 결정함으로써 선별되는 방법.
25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 상기 탈메틸화 제제는 데시타빈인, 방법.
26. 제 23항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련 눈 질환은 노화 관련 황반 변성 (AMD), 당뇨성 눈 질환, 녹내장, 시력 저하 또는 안구 건조인, 방법.
27. 제 26항에 있어서, 상기 노화 관련 눈 질환은 건성 AMD인, 방법.
28. 노화 관련 눈 질환, 선택적으로 건성 AMD의 치료에 탈메틸화 제제를 사용하는 것을 포함하는 방법.
29. 제 28항에 있어서, 상기 탈메틸화 제제는 데시타빈인, 방법.
30. 노화 관련 눈 질환, 선택적으로 건성 AMD의 치료에 ELOVL2를 인코딩하는 mRNA를 사용하는 것을 포함하는 방법.
31. 노화 관련 눈 질환, 선택적으로 건성 AMD의 치료에 ELOVL2 발현 벡터를 사용하는 것을 포함하는 방법.
32. 제 3항에 열거된 탈메틸화 제제의 일정 농도를 함유하는 제형물로서, 유리체내 투여 1 μL 내지 100 μL이 5 ng 내지 500 ng의 유효량을 구성하는, 제형물.
33. 제 3항에 열거된 탈메틸화 제제의 일정 농도를 함유하는 제형물로서, 유리체내 투여 1 μL 내지 100 μL이 500 ng 내지 1,500 ng의 유효량을 구성하는, 제형물.
34. 제 3항에 열거된 탈메틸화 제제의 일정 농도를 함유하는 제형물로서, 유리체내 투여 1 μL 내지 100 μL이 1,500 ng 내지 4,500 ng의 유효량을 구성하는, 제형물.
35. 제 32항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형물은 실질적으로 수용성인, 조성물.
36. 제 32항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형물은 실질적으로 무수성인, 조성물.
37. 제 32항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형물은 즉시 방출성 및/또는 연장 방출성인, 조성물.
38. 제 32항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈메틸화 제제는 데시타빈인, 조성물.
39. 제 32항 내지 제 38항 중 어느 한 항의 제형물의 유리체내 투여를 포함하는 노화 관련 눈 질환을 치료하는 방법.
40. 제 39항 또는 제 40항에 있어서, 상기 노화 관련 눈 질환은 노화 관련 황반 변성 (AMD), 당뇨성 눈 질환, 녹내장, 시력 저하 또는 안구 건조인, 방법.
41. 제 39항 또는 제 40항에 있어서, 상기 노화 관련 눈 질환은 건성 AMD인, 방법.
42. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항의 방법에 따른 투여를 위한 약제의 제조 방법.

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