KR20210019721A - 측백나무 추출물에서 유래한 다이터페노이드 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 상기 조성물을 사용한 식물병 방제 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 측백나무 추출물에서 유래한 다이터페노이드 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 상기 조성물을 사용한 식물병 방제 방법에 관한 것으로, 상기 화합물은 천연물로서 인체에 무해하고, 자연계에서 생분해되어 환경오염을 유발하지 않으면서, 식물병을 방제하는 효과가 있어 식물병 방제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 식물병 방제용 조성물 및 상기 조성물을 사용한 식물병 방제 방법에 관한 것으로, 구체적으로 측백나무 추출물에서 유래한 다이터페노이드 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다.
작물 생산에 있어서, 식물병은 식물의 건전한 생육을 저해하는 유해인자의 하나로 진균, 세균, 마이코플라스마, 바이러스, 선충 등 미생물적 요인에 의해 발생한다. 대규모 작물재배 지역에 식물병이 대발생하면 수확량이 크게 감소하여 경제적 손실이 발생할 뿐만이 아니라, 안정적인 주곡 생산에 차질이 생길 경우 식량안보 측면의 심각한 사회 문제가 될 수 있다.
근현대농업에 있어서 식물병을 방제하는 주요 수단으로 합성농약이 사용되어왔다. 그러나 기존의 합성농약은 다년간 대량사용되어 약제 저항성 병원균의 출현을 가속시켜 매년 방제비용을 증가시키고 있을 뿐만이 아니라, 잔류농약의 인축독성 및 생태계 교란 문제에 대한 시민사회 및 학계의 우려가 끊이지 않고 있다. 약제 저항성 문제를 해결함과 동시에 합성농약의 사용량과 살포빈도를 줄이는데 있어 생물농약 사용을 골자로 하는 종합적인 병해충 방제가 합성농약에 의존적인 관행농법의 새로운 대안이 될 수 있다.
생물농약은 병해충을 방제하는데 있어 진균, 세균, 바이러스 등 살아있는 미생물을 사용하거나 식물추출물 등 생물소재에서 유래한 천연물질을 기반으로 개발된다. 그러므로 생물농약은 자연에서 유래한 천연물로서 자연친화적인 특징을 가지며, 합성농약과 비교하여 독성이 약하거나 무해하다는 장점을 가지고 있다.
이에, 한국을 포함한 OECD 가입국을 중심으로 합성농약 사용에 대한 정책적인 규제가 강화되고 있다. 미국화학협회 화학정보데이터베이스(CAS)에 등록된 수백만 종의 화합물을 군집분석하면 단지 수백여 종의 선도물질 군으로 분류되는데, 선도물질 기준의 규제가 시행되면, 우리가 사용할 수 있는 합성농약의 종류와 수는 급감할 수밖에 없다. 그러므로 기존의 합성농약을 대체하기 위한 새로운 친환경 식물병 방제 수단의 개발이 필요하다.
식물은 다양한 서식 환경에 적응하기 위하여 알칼로이드(alkaloid), 터페노이드(terpenoid), 플라보노이드(flavonoid), 글라이코사이드(glycoside), 퀴논(quinone), 쿠마린(coumarin), 페놀릭(phenolic), 에센셜오일(essential oil), 파이토알렉신(phytoalexin) 등 다양한 물질들을 생합성할 수 있게 진화해왔으며, 상기 물질들로부터 식물병원균의 침입 및 해충의 섭식을 저해하는 기능을 하는 이차대사산물을 생합성하여 식물체 내에 축적하는바, 식물추출물은 생물농약의 소재로 많이 이용되고 있다.
생물농약으로 님(neem), 카놀라(canola), 제충국(pyrethrin), 리모넨(limonene), 티트리(tea tree), 로테논(rotenone) 유래의 식물추출물 및 에센셜오일이 사용되고 있다. 또한 루바브(Rheum rhabarbarum Nakai) 뿌리 추출물은 보리 흰가루병(Blumeria graminis f. sp. hordei) 및 밀 붉은녹병(Puccinia triticina) 방제에 우수한 효과를 나타냈으며, 감국(Chrysanthemum indicum L.) 에센션오일은 담배 역병균(Phytophthora nicotianae)의 생장을 저해하는 활성을 나타냈으며, 자주개자리(Medicago sativa) 및 트레베지아 팔마타(Trevesia palmata L.) 유래의 사포닌 화합물이 벼도열병균(Magnaporthe oryzae)을 포함한 몇 가지 식물병원균에 살균활성을 나타낸다는 등의 식물추출물이 식물병 방제제로서 이용 가치가 높음을 뒷받침하는 다수의 연구 결과가 보고된 바 있다. 또한, 일본 공개특허 제2012-102023호에서는 측백나무과 식물인 편백(Chamaecyparis obtusa)의 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 항미생물제 및 이의 제조방법을 개시한 바 있다.
한편, 측백나무(Platycladus orientalis (L.) Franco)는 분류학적으로 구과식물의 하나로 측백나무속(Platycladus)의 유일한 종이다. 중국 북부가 원산지로 한국, 일본, 인도, 이란 등 아시아 지역에서 자생한다. 측백나무 추출물은 항염, 항산화, 항미생물, 항암 등 다양한 약리활성을 나타낸다는 보고가 있고, 측백나무 추출물로부터 항섬유화, 함염증 등의 약리작용을 가진 터펜(terpene) 화합물들이 보고된 바 있다.
터펜(terpene)은 이소프렌(isoprene)(C5H8)을 구성단위로 하는 천연 유기화합물의 총칭으로서, 기본골격으로 (C5H8)n을 가지고, 터페노이드(terpenoid)라고도 한다. 터펜은 식물정유의 주성분이고, 식물체 내에서 아세트산이 효소의 작용으로 스쿠알렌을 거쳐 스테로이드(시토스테롤, 스티그마스테롤)가 되는 생합성의 초기단계에서 생성된다. 터펜은 이소프렌 단위수(C5H8)n에 따라 분류되어, 이소프렌 자체는 헤미터펜(hemiterpene), 탄소 수가 10인 것을 모노터펜(monoterpene), 탄소 수가 15인 것을 세스키터펜(sesquiterpene), 탄소 수가 20인 것을 다이터펜(diterpene)으로 분류한다. 또한, 터펜은 사슬 모양 터펜, 단일고리성, 두고리성, 세고리성 터펜으로 분류되고, 이들과 같은 탄소골격을 갖고 알코올, 알데히드, 케톤, 카르복시산이 있는 화합물도 각 분류에 포함된다.
터펜은 자외선으로부터 식물의 열매껍질, 잎사귀, 줄기가 산화되는 것을 막는 기능, 주변에 다른 식물들이 자라나지 못하도록 하는 기능, 식물병원성 곰팡이 또는 세균이 침입을 막고 이들을 직접 공격하는 기능 등이 있다. 본 발명자들은 터펜의 항미생물 활성에 주목하여, 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물로부터 분리한 다이터페노이드(diterpenoid) 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 사용한 식물병 방제 방법을 개발하였다.
본 발명의 목적은 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 식물병에 대해 우수한 방제 효과를 나타내는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 식물병에 대해 우수한 방제 효과를 나타내는 식물병 방제 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명의 제1 측면은 하기 화학식 A 및 화학식 B로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다:
[화학식 A]
(상기 화학식 A에서,
R1은 CH3 또는 H이고, 및
[화학식 B]
(상기 화학식 B에서,
R1은 OH 또는 H이고,
R2는 CH3 또는 CH3OH이고, 및
R3는 부재 또는 OH이다).
본 발명의 제2 측면은 상기 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 측백나무의 추출물에서 유래한 다이터페노이드 화합물은 천연물로서 인체에 무해하고, 자연계에서 생분해되어 환경오염을 유발하지 않으면서, 식물병을 방제하는 효과가 있어 식물병 방제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 측백나무 추출물로부터 살균활성물질을 분리하기 위해 다양한 크로마토그래피 기법을 사용한 공정이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자는 친환경적인 식물병 방제제를 개발하기 위하여 다양한 식물 추출물의 식물병에 대한 방제효과를 조사하던 중 측백나무(Platycladus orientalis (L.) Franco) 추출물이 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae) 및 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina)에 방제효과가 우수하다는 것을 발견하였다.
본 명세서 중에서 “방제”라고 하는 것은 병이나 해충의 예방, 기피뿐만 아니라 제거, 사멸을 포함하는 의미로 이용하는 것으로 한다. 하지만, 식물병 방제는 예방적 처리에 의한 방제효과가 주요 방제 기작이므로 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물, 분획물의 식물병에 대한 방제효과 조사는 예방적 처리로 실험하였다.
본 발명의 일 측면은,
하기 화학식 A 및 화학식 B로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다:
[화학식 A]
(상기 화학식 A에서,
R1은 CH3 또는 H이고, 및
[화학식 B]
(상기 화학식 B에서,
R1은 OH 또는 H이고,
R2는 CH3 또는 CH3OH이고, 및
R3는 부재 또는 OH이다).
상기 화합물은 하기 화학식 1 내지 화학식 8로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
상기 화합물은 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물로부터 유래하는 것일 수 있다. 하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
구체적으로, 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물로부터 용매 분획물을 제조하고, 상기 분획물을 액체크로마토그래피 기법으로 분획하여 상기 화합물을 분리할 수 있다.
상기 액체크로마토그래피 기법은 이동상이 액체인 크로마토그래피 기법을 의미하고, 고정상이 채워진 컬럼(column)이나 고정상이 부착된 평면에서 수행된다. 측백나무(Platycladus orientalis) 분획물은 용매분획물이라면 제한되지 않으나, 에틸아세테이트 분획물 또는 헥산 분획물일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 이동상으로는 물, 헥산, 메탄올, 에탄올, 아세토나이트릴, 아세톤, 클로로포름, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트 등의 유기용매를 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 고정상으로는 실리카겔(silica gel), Diaion HP-20, RP-18 또는 Sephadex LH-20을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 식물병은 벼 도열병, 감자 역병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 호접란 세균성갈색점무늬병, 작물 무름병 및 키위 궤양병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 작물은 배추, 무, 토마토, 고구마, 감자, 양파, 당근 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물병 방제용 조성물은 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae), 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) 및 푸시니아 트리티시나(Puccinia triticina)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병원성 곰팡이의 생장을 억제할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물병 방제용 조성물은 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 딕케야 크리산테마이(Dickeya chrysanthemi), 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) 및 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병원성 세균의 생장을 억제할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 딕케야 크리산테마이 및 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸은 작물무름병균으로서, 상기 작물은 배추, 무, 토마토, 고구마, 감자, 양파, 당근 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화합물은 하기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 7로 표시되는 화합물 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 할 수 있고, 상기 식물병은 벼 도열병, 감자 역병, 토마토 역병 및 밀 붉은녹병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병일 수 있다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 7]
상기 유효성분은 식물병 방제용 조성물에 1 내지 100000 μg/ml의 농도로 포함될 수 있고, 10 내지 10000 μg/ml의 농도로 포함될 수 있고, 50 내지 5000 μg/ml의 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 100 내지 2000 μg/ml의 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도는 식물병이 발생된 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리할 때의 조성물에 포함된 농도를 나타내며, 상기 범위의 하한보다 농도가 낮을 경우, 유효성분의 농도가 너무 낮아 식물병의 방제효과가 떨어지는 문제가 있고, 상기 범위의 상한보다 농도가 높을 경우, 필요 이상으로 유효성분의 농도가 너무 높아 비경제적이며 환경에 대한 부정적 영향이 발생할 수 있다. 하지만, 식물병 방제용 조성물의 사용량이 상기 농도 범위에 제한되는 것은 아니며, 식물병원성 곰팡이 또는 식물병원성 세균의 종류, 발생 정도, 환경 등을 고려하여 적절하게 조절될 수 있다.
상기 화학식 A 내지 B로 표시되는 화합물, 화학식 1 내지 4로 표시되는 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물 및 화학식 5 내지 8로 표시되는 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물은 농약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 농약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 농약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
상기 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물 및 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물을 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 농약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 상기 화학식 A 내지 B의 화합물, 화학식 1 내지 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물 및 화학식 5 내지 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물은 이의 농약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 입체 이성질체, 수화물 등의 형태로 사용될 수 있다.
상기 화학식 A 내지 B의 화합물, 화학식 1 내지 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물 및 화학식 5 내지 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 화학식 A 내지 B의 화합물, 화학식 1 내지 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물 및 화학식 5 내지 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물과 불활성 담체를 혼합하고, 상기 혼합물이 유제, 유액, 유동화제, 습윤성 분말, 과립화 습윤성 분말, 분말제, 과립제 등으로 제형화 될 수 있도록 혼합물에 계면활성제 및 필요한 기타 보조제를 첨가함으로써 제조된다. 상기 언급된 식물병 방제용 조성물은 그 자체로서 또는 다른 불활성 성분을 첨가하여 본 발명은 종자 처리제로도 사용될 수 있다.
제형에서 사용될 수 있는 액체 담체의 예는 물; 알콜, 예로 메탄올 및 에탄올; 케톤, 예로 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예로 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸나프탈렌; 지방족 탄화수소, 예로 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일; 에스테르, 예로 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예로 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예로 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예로 N,N-디메틸 포름아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예로 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예로 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.
제형에서 사용될 수 있는 고체 담체의 예는 미세 분말 또는 과립 예컨대 광물 예컨대 카올린 점토, 애터펄자이트 점토, 벤토나이트, 몬트모릴로나이트, 애시드 화이트 점토, 피로필라이트, 탈크, 규조토 및 탈사이트; 천연 유기 물질 예컨대 옥수수 잎대 분말 및 월넛 껍질 분말; 합성 유기 물질 예컨대 우레아; 염 예컨대 탄산 칼슘 및 황산 암모늄; 합성 무기 물질 예컨대 합성 수화 산화 규소를 포함하며; 액체 담체로서, 방향족 탄화수소 예컨대 자일렌, 알킬벤젠 및 메틸나프탈렌; 알코올 예컨대 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 케톤 예컨대 아세톤, 시클로헥사논 및 이소포론; 식물성 오일 예컨대 대두유 및 면실유; 석유 지방족 탄화수소, 에스테르, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴 및 물을 포함한다.
계면활성제의 예는 음이온성 계면활성제 예컨대 알킬 술페이트 에스테르 염, 알킬아릴 술포네이트 염, 디알킬술포숙시네이트 염, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르 포스페이트 에스테르 염, 리그노술포네이트 염 및 나프탈렌 술포네이트 포름알데히드 중축합물; 및 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬폴리옥시프로필렌 블럭 공중합체 및 소르비탄 지방산 에스테르 및 양이온성 계면활성제 예컨대 알킬트리메틸암모늄 염을 포함한다.
다른 제형 보조제의 예는 수용성 중합체 예컨대 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐피롤리돈, 다당류 예컨대 아라비아 고무, 알긴산 및 이의 염, CMC(카르복시메틸-셀룰로오스), 잔탄 고무, 무기 물질 예컨대 알루미늄 마그네슘 실리케이트 및 알루미나 졸(alumina sol), 보존제, 착색제 및 안정화제 예컨대 PAP(산 포스페이트 이소프로필)및 BHT(부틸하이드록리톨루엔)를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1 내지 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물 및 화학식 5 내지 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물이 식물병원성 곰팡이 또는 식물병원성 세균에 대하여 생장 억제 효과를 나타냄을 확인하였으며(실시예 8 내지 10 참조), 이로부터 상기 화학식 1 내지 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물 및 화학식 5 내지 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 식물병 방제 효과가 있음을 알 수 있다.
나아가, 본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 A 및 화학식 B의 화합물, 화학식 1 내지 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물 및 화학식 5 내지 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.
상기 식물은 벼, 감자, 토마토, 밀, 호접란, 무, 배추, 고구마, 양파, 당근 및 키위로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물병은 벼 도열병, 감자 역병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 호접란 세균성갈색점무늬병, 작물 무름병 및 키위 궤양병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 작물은 배추, 무, 토마토, 고구마, 감자, 양파, 당근 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포일 수 있다.
본 발명의 방제 방법은 식물의 줄기 및 잎의 처리, 식물이 성장하는 장소(예를 들어 토양)의 처리, 종자 멸균/종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.
본 발명의 방제 방법으로의 줄기 및 잎의 처리로서, 특히, 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다. 본 발명의 방제 방법으로의 토양의 처리로서, 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리제의 토양 내로의 살포(액체 처리제의 관개, 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하)가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow) 주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부위, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리. 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다. 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 및 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다. 상기 언급한 토양 처리에서, 유효 성분이 식물이 동시에 적용될 수 있거나, 유효 성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효 성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 예를 들어 관개 시설(관개 튜브, 관개 파이프, 스프링클러 등)에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배지(water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로 휘발 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로의 종자 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 병충해로부터 보호되도록 종자를 처리하는 방법이며, 이의 특정 예는 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 미립화하고 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법; 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액, 유동화제 등을 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법; 종자를 특정 기간 동안 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법; 필름 코팅 처리법 및 펠렛 코팅 처리법을 포함한다.
식물, 또는 식물 성장용 토양이 본 발명에 의한 화합물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간, 기후 조건 등에 따라 변화할 수 있다.
유액, 습윤성 분말, 유동화제 등은 통상 물로 희석된 후 처리를 위해 살포된다. 이러한 경우, 유효 성분의 농도는 통상 0.0001 내지 3 중량%, 바람직하게는 0.0005 내지 1 중량% 의 범위이다. 분말제, 과립제 등은 통상 희석 없이 처리에 사용된다.
본 발명의 방제 방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 화학식 1 내지 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물 및 화학식 5 내지 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물이 식물병에 대하여 방제 효과를 나타냄을 확인하였으며(실시예 8 내지 10 참조), 이로부터 상기 화학식 1 내지 8으로 표시되는 터페노이드 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 식물병 방제 방법에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 식물병 방제에 있어서의, 화학식 A 내지 화학식 B의 화합물, 화학식 1 내지 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물 및 화학식 5 내지 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물 및 이의 분획물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용액을 용매로 사용하여 추출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 C1 내지 C4의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올 또는 부탄올일 수 있고, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올일 수 있고, 더 바람직하게는 메탄올일 수 있다.
또한, 상기 추출물의 분획물은 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용액을 용매로 사용하여 분획될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물병은 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 고추 탄저병, 호접란 세균성갈색점무늬병, 작물 무름병 및 키위 궤양병균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 작물은 배추, 무, 토마토, 고구마, 감자, 양파, 당근 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물병 방제용 조성물은 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae), 푸시니아 트리티시나(Puccinia triticina) 및 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병원성 곰팡이 생장을 억제할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물병 방제용 조성물은 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 딕케야 크리산테마이(Dickeya chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병원성 세균 생장을 억제할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 딕케야 크리산테마이는 작물무름병균으로서, 상기 작물은 배추, 무, 토마토, 고구마, 감자, 양파, 당근 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물 또는 이의 분획물은 하기 화학식 1 내지 8 중 어느 하나로 표시되는 화합물을 하나 이상 포함할 수 있다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
상기 유효성분은 식물병 방제용 조성물에 1 내지 100000 μg/ml의 농도로 포함될 수 있고, 10 내지 10000 μg/ml의 농도로 포함될 수 있고, 100 내지 5000 μg/ml의 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 250 내지 3,000 μg/ml의 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도는 식물병이 발생된 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리할 때의 조성물에 포함된 농도를 나타내며, 상기 범위의 하한보다 농도가 낮을 경우, 유효성분의 농도가 너무 낮아 식물병의 방제효과가 떨어지는 문제가 있고, 상기 범위의 상한보다 농도가 높을 경우, 필요 이상으로 유효성분의 농도가 너무 높아 비경제적이며 환경에 대한 부정적 영향이 발생할 수 있다. 하지만, 식물병 방제용 조성물의 사용량이 상기 농도 범위에 제한되는 것은 아니며, 식물병원균 또는 식물병원성 세균의 종류, 발생 정도, 환경 등을 고려하여 적절하게 조절될 수 있다.
상기 식물병 방제용 조성물은 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물 또는 이의 분획물의 단순 혼합물일 수 있다. 대안적으로는, 식물병 방제용 조성물은 상기 추출물 또는 추출물의 분획물과 불활성 담체를 혼합하고, 상기 혼합물이 유제, 유액, 유동화제, 습윤성 분말, 과립화 습윤성 분말, 분말제, 과립제 등으로 제형화 될 수 있도록 혼합물에 계면활성제 및 필요한 기타 보조제를 첨가함으로써 제조된다. 상기 언급된 식물병 방제용 조성물은 그 자체로서 또는 다른 불활성 성분을 첨가하여 본 발명은 종자 처리제로도 사용될 수 있다.
제형에서 사용될 수 있는 액체 담체의 예는 물; 알콜, 예로 메탄올 및 에탄올; 케톤, 예로 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예로 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸나프탈렌; 지방족 탄화수소, 예로 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일; 에스테르, 예로 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예로 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예로 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예로 N,N-디메틸 포름아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예로 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예로 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.
제형에서 사용될 수 있는 고체 담체의 예는 미세 분말 또는 과립 예컨대 광물 예컨대 카올린 점토, 애터펄자이트 점토, 벤토나이트, 몬트모릴로나이트, 애시드 화이트 점토, 피로필라이트, 탈크, 규조토 및 탈사이트; 천연 유기 물질 예컨대 옥수수 잎대 분말 및 월넛 껍질 분말; 합성 유기 물질 예컨대 우레아; 염 예컨대 탄산 칼슘 및 황산 암모늄; 합성 무기 물질 예컨대 합성 수화 산화 규소를 포함하며; 액체 담체로서, 방향족 탄화수소 예컨대 자일렌, 알킬벤젠 및 메틸나프탈렌; 알코올 예컨대 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 케톤 예컨대 아세톤, 시클로헥사논 및 이소포론; 식물성 오일 예컨대 대두유 및 면실유; 석유 지방족 탄화수소, 에스테르, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴 및 물을 포함한다.
계면활성제의 예는 음이온성 계면활성제 예컨대 알킬 술페이트 에스테르 염, 알킬아릴 술포네이트 염, 디알킬술포숙시네이트 염, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르 포스페이트 에스테르 염, 리그노술포네이트 염 및 나프탈렌 술포네이트 포름알데히드 중축합물; 및 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬폴리옥시프로필렌 블럭 공중합체 및 소르비탄 지방산 에스테르 및 양이온성 계면활성제 예컨대 알킬트리메틸암모늄 염을 포함한다.
다른 제형 보조제의 예는 수용성 중합체 예컨대 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐피롤리돈, 다당류 예컨대 아라비아 고무, 알긴산 및 이의 염, CMC(카르복시메틸-셀룰로오스), 잔탄 고무, 무기 물질 예컨대 알루미늄 마그네슘 실리케이트 및 알루미나 졸(alumina sol), 보존제, 착색제 및 안정화제 예컨대 PAP(산 포스페이트 이소프로필)및 BHT(부틸하이드록리톨루엔)를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물 및 이의 분획물이 식물병원성 곰팡이 또는 식물병원성 세균에 대한 생장 억제 효과를 나타냄을 확인하였으며(실시예 1 내지 4 참조), 이로부터 상기 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 식물병 방제 효과가 있음을 알 수 있다.
상기 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물 또는 분획물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
1) 측백나무(Platycladus orientalis)에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하여 측백나무(Platycladus orientalis)의 추출물을 제조하는 단계; 및
4) 단계 3)의 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 측백나무(Platycladus orientalis) 분획물을 제조하는 단계.
상기 방법에서, 단계 1)의 측백나무(Platycladus orientalis)는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 측백나무(Platycladus orientalis)는 잎, 줄기 또는 뿌리가 모두 이용가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다..
상기 단계 1)의 추출용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용액일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 C1 내지 C4의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올 또는 부탄올일 수 있고, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올일 수 있고, 더 바람직하게는 메탄올일 수 있다.
추출방법으로는 진탕추출, 속슬렛(Soxhlet) 추출 또는 환류 추출을 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출용매를 건조된 측백나무(Platycladus orientalis) 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출할 수 있고, 2 내지 3배 첨가하여 추출할 수 있다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃일 수 있고, 20℃ 내지 40℃일 수 있고, 실온일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간일 수 있고, 15 내지 30시간일 수 있고, 24시간일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 나아가, 추출횟수는 1 내지 5회일 수 있고, 3 내지 4회 반복 추출할 수 있고, 3회일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 유기용매는 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 분획물은 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물을 물에 현탁시킨 후 헥산 및 에틸아세테이트로 분획하여 수득한 용매 분획물 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 분획물은 상기 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회 반복하여 수득할 수 있고, 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압농축할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물 및 이의 분획물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.
상기 식물은 벼, 밀, 고추, 호접란, 무, 배추, 토마토, 고구마, 감자, 양파, 당근 및 키위로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물병은 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 고추 탄저병, 호접란 세균성갈색점무늬병, 작물 무름병 및 키위 궤양병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 작물은 배추, 무, 토마토, 고구마, 감자, 양파, 당근 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포일 수 있다.
본 발명의 방제 방법은 식물의 줄기 및 잎의 처리, 식물이 성장하는 장소(예를 들어 토양)의 처리, 종자 멸균/종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.
본 발명의 방제 방법으로의 줄기 및 잎의 처리로서, 특히, 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다. 본 발명의 방제 방법으로의 토양의 처리로서, 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리제의 토양 내로의 살포(액체 처리제의 관개, 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하) 가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow) 주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부위, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리. 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다. 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 및 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다. 상기 언급한 토양 처리에서, 유효 성분이 식물이 동시에 적용될 수 있거나, 유효 성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효 성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 예를 들어 관개 시설(관개 튜브, 관개 파이프, 스프링클러 등)에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배지(water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로 휘발 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로의 종자 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 병충해로부터 보호되도록 종자를 처리하는 방법이며, 이의 특정 예는 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 미립화하고 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법; 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액, 유동화제 등을 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법; 종자를 특정 기간 동안 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법; 필름 코팅 처리법 및 펠렛 코팅 처리법을 포함한다.
식물, 또는 식물 성장용 토양이 본 발명에 의한 화합물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간, 기후 조건 등에 따라 변화할 수 있다.
유액, 습윤성 분말, 유동화제 등은 통상 물로 희석된 후 처리를 위해 살포된다. 이러한 경우, 유효 성분의 농도는 통상 0.0001 내지 3 중량%, 바람직하게는 0.0005 내지 1 중량% 의 범위이다. 분말제, 과립제 등은 통상 희석 없이 처리에 사용된다.
본 발명의 방제 방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물 및 이의 분획물이 식물병원성 곰팡이 또는 식물병원성 세균에 대한 생장 억제 효과를 나타냄을 확인하였으며(실시예 1 내지 4 참조), 이로부터 상기 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 식물병 방제 방법에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
나아가, 본 발명의 다른 측면은 식물병 방제에 있어서의, 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
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제조예
1> 측백나무 추출물을 유효성분으로 함유하는
식물병
방제용 조성물의 제조
단계 1: 측백나무 추출물의 제조
측백나무(Platycladus orientalis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제조하기 위하여 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물을 제조하였다. 구체적으로, 건조한 측백나무(Platycladus orientalis)의 잎 및 줄기 시료를 잘게 잘라 메탄올을 가하고 상온에서 24시간 동안 추출하여 여과지로 거른 후, 여과물을 감압농축하여 100 g의 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물을 얻었다.
단계 2: 식물병 방제용 조성물의 준비
단계 1에서 제조한 추출물을 60 mg/ml 농도로 메탄올에 용해한 시료 2 ml를 증류수 38 ml로 희석하였다. 상기 희석액에 계면활성제인 트윈 20(Tween 20)을 0.025%(w/v) 농도가 되도록 첨가하여, 3000 μg/ml 농도인 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 용액 40 ml을 준비했다.
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제조예
2> 측백나무 추출물의
분획물을
유효성분으로 함유하는
식물병
방제용 조성물의 제조
단계 1: 측백나무 추출물의 분획물 제조
상기 제조예 1의 단계 1에서 제조한 측백나무 추출물 10 g을 500 ml의 증류수로 용해시킨 후, 500 ml의 헥산(hexane)으로 2회 추출하여 헥산층 및 수용액층을 얻었다. 수용액층을 다시 500 ml의 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올(butanol)로 2회씩 추출하였고 에틸아세테이트층, 부탄올층 및 수용액층을 얻었다. 그리고 이들을 감압농축하여 건조된 헥산 분획물 (3.5 g), 에틸아세테이트 분획물 (2.7 g), 부탄올 분획물 (2.2 g) 및 물 분획물 (1.1 g)을 얻었다.
단계 2: 식물병 방제용 조성물의 준비
단계 1에서 제조한 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물은 20 mg/ml 농도로 메탄올에 용해하고 각각의 시료 4 ml을 증류수 36 ml로 희석하였다. 부탄올 분획물 및 물 분획물은 40 mg/ml 농도로 메탄올에 용해한 각각의 시료 2 ml을 증류수 38 ml로 희석하였다. 상기 희석액에 계면활성제인 트윈 20(Tween 20)을 0.025%(w/v) 농도가 되도록 첨가하여, 2000 μg/ml 농도인 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 용액 40 ml씩 준비했다.
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실시예
1> 측백나무 추출물을 유효성분으로 함유하는
식물병
방제용 조성물의
식물병
방제효과 평가
측백나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물이 식물병 방제효과를 나타내는지 확인하기 위해, 하기의 절차에 따라 실험을 수행하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
구체적으로, 상기 제조예 1에서 제조한 식물병 방제용 조성물이 식물병인 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(원인균: Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina) 및 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes)에 대해 방제효과가 있는지를 확인하기 위해, 온실 조건에서 다음과 같이 실험하였다. 이때, 무처리구는 5%(v/v)의 메탄올 및 0.025%(w/v)의 트윈 20을 함유하는 증류수를 처리하였고, 벼 도열병에 대한 방제효과 평가시에는 대조약제로서 합성농약 살균제인 트리시클라졸(tricyclazole) 10 μg/ml를 처리하였다.
실험에 사용한 식물은 벼(Oryza sativa L.), 토마토(Solanum lycopersicum L.), 밀(Triticum aestivum L.) 보리(Hordeum sativum Jessen) 및 고추(Capsicum annuum L.)이다. 각 식물들은, 지름 4.5 cm의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 후, 종자를 파종하여 온도가 20 내지 30℃인 온실에서 1주 내지 4주간 재배하였다. 상기 재배한 식물에 제조예 1의 단계 2에서 제조한 방제용 조성물 용액을 분무 살포하고 24시간 동안 풍건한 후, 상기 식물병들의 원인균을 각각 접종하였으며, 각 식물병원성 곰팡이당 3개의 포트를 이용하였다.
벼 도열병은 3 내지 4엽기의 유묘에 원인균인 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5×105 spores/ml)을 분무 접종하고, 온도가 25℃인 습실상에서 하루 동안 처리한 후, 온도가 25℃이고 상대습도가 80%인 항온항습실에서 4일간 재배하여 발병을 유도하였다.
벼 잎집무늬마름병은 원인균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani, 한국화학연구원)를 밀기울 90 g, 왕겨 15 g 및 증류수 100 ml를 넣은 배지에서 7일간 배양하여 얻은 배양물을, 5엽기 유묘에 접종하고, 25℃의 습실상에서 4일간 처리한 후, 온도가 25℃인 항온실에서 4일간 재배하여 발병을 유도하였다.
토마토 역병은 3 내지 4엽기 토마토 유묘에 원인균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans, 강릉대학교)의 유주자낭(5×104 sporangia/ml)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무 접종한 후, 온도가 20℃인 습실상에서 2일간 처리하고 온도가 20℃인 항온항습실에서 2일간 배양하여 발병을 유도하였다.
토마토 잿빛곰팡이병은 3 내지 4엽기 토마토 유묘에 원인균인 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5×105 spores/ml)을 처리한 후, 온도가 20℃인 습실상에서 3일간 배양하여 발병을 유도하였다.
밀 붉은녹병은 1엽기 유묘에 원인균인 퍽시니아 트리티시나(Puccinia triticina, 한국화학연구원)의 포자를 0.025%(w/v) 트윈 20 용액에 0.67g spores/ml의 양으로 현탁하여 분무 처리하고, 온도가 20℃인 습실상에서 하루 동안 처리한 후, 온도가 20℃인 항온실로 옮겨 6일간 배양하여 발병을 유도하였다.
보리 흰가루병은 보리의 1엽기 유묘에, 숙주 식물에서 계대배양된 원인균인 블루메리아 그래미니스 포메 스페살리스 홀데이(Blumeria graminis f. sp. hordei, 한국화학연구원)의 포자를 털어서 접종하고, 온도가 20℃인 항온실에서 7일간 배양하여 발병을 유도하였다.
고추 탄저병은 3 내지 4 엽기 고추 유묘에 원인균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes, 고려대학교)의 포자 현탁액(4 × 105 spores/ml)을 분무 접종하고, 온도가 25℃인 습실상에서 2일간 습실처리 후, 온도가 25℃이고 상대습도가 80%인 항온항습실에서 1일간 배양하여 발병을 유도하였다.
토마토 잿빛곰팡이병 및 고추 탄저병은 접종 3일 후, 토마토 역병은 접종 4일 후, 벼 도열병은 접종 5일 후, 밀 붉은녹병 및 보리 흰가루병은 접종 7일 후, 벼 잎집무늬마름병은 접종 8일 후에 병반면적율(%)을 조사하였다. 상기 조사로부터 얻은 병반면적율(%)을 이용하여 하기 수학식 1에 따라 방제가(%)를 계산하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
[수학식 1]
시료 | 농도 (μg/ml) |
방제가(%) | ||||||
RCB | RSB | TGM | TLB | WLR | BPM | PAN | ||
측백나무 추출물 | 3000 | 90 | 25 | 21 | 0 | 90 | 0 | 40 |
(RCB: 벼 도열병, RSB: 벼 잎집무늬마름병, TGM: 토마토 잿빛곰팡이병, TLB: 토마토 역병, WLR: 밀 붉은녹병, BPM: 보리 흰가루병, PAN: 고추 탄저병)
측백나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물이 3000 μg/ml 농도로 처리되었을 때, 벼 도열병 및 밀 붉은녹병에 대하여 90%의 우수한 방제가를 나타냈고, 고추 탄저병에 대하여 40%의 방제가를 나타냈다(표 1 참조). 상기 결과를 통해, 측백나무 추출물이 식물병 방제효과가 있음을 알 수 있고, 이로부터 측백나무 추출물이 식물병 방제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
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실시예
2> 측백나무 추출물의
분획물을
유효성분으로 함유하는
식물병
방제용 조성물의 식물병 방제효과 평가
측백나무 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물이 식물병 방제효과를 나타내는지 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
구체적으로, 상기 제조예 2에서 제조한 식물병 방제용 조성물이 식물병인 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(원인균: Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina) 및 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes)에 대해 방제효과가 있는지를 확인하기 위해, 상기 제조예 2에서 준비한 식물병 방제용 조성물을 처리한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 실험 결과는 표 2에 나타내었다.
시료 | 농도 (μg/ml) |
방제가(%) | ||||||
RCB | RSB | TGM | TLB | WLR | BPM | PAN | ||
헥산 분획물 | 2000 | 88 | 15 | 14 | 0 | 80 | 0 | 30 |
에틸아세테이트 분획물 | 2000 | 75 | 0 | 21 | 0 | 67 | 0 | 0 |
부탄올 분획물 | 2000 | 0 | 5 | 14 | 0 | 20 | 0 | 0 |
물 분획물 | 2000 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
(RCB: 벼 도열병, RSB: 벼 잎집무늬마름병, TGM: 토마토 잿빛곰팡이병, TLB: 토마토 역병, WLR: 밀 붉은녹병, BPM: 보리 흰가루병, PAN: 고추 탄저병)
헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물이 2000 μg/ml 농도로 처리될 때, 벼 도열병에 대하여 88%의 방제가, 밀 붉은녹병에 대하여 80%의 방제가 및 고추 탄저병에 대하여 30%의 방제가를 나타냈다.
에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물이 2,000 μg/ml 농도로 처리될 때, 벼 도열병에 대하여 75%의 방제가, 밀 붉은녹병에 대하여 67%의 방제가를 나타냈다.
부탄올 분획물 또는 물 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 유의미한 방제효과를 나타내지 않았다(표 2 참조).
상기 결과를 통해, 측백나무 추출물의 분획물, 특히 헥산 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물이 식물병 방제효과가 있는바, 식물병 방제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
한편, 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물이 벼 도열병 및 밀 붉은녹병에 대해 높은 방제효과를 보인 것을 토대로, 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물의 살균활성물질은 수용성 물질이 아닌 비극성 물질임을 알 수 있었고, 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물을 살균활성성분의 분리 및 정제에 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
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실시예
3> 측백나무 추출물 또는 이의
분획물의
식물병원성
곰팡이에 대한 생장 억제
효과 확인
측백나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물이 식물병원성 곰팡이 생장 억제 효과를 나타내는지 확인하기 위해, 하기의 절차에 따라 실험을 수행하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 구체적으로, 상기 제조예 1의 단계 1에서 제조한 측백나무 추출물 또는 상기 제조예 2의 단계 1에서 제조한 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물이 벼도열병균인 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae)에 대해 생장 억제 효과가 있는지를 확인하기 위해, in vitro 분석(assay)을 수행하였다.
96-웰 플레이트(well plate)를 사용한 액체배지미량희석법(broth micro-dilution method)으로 최소억제농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 값을 구하여, 식물병원성 곰팡이 생장 억제 효과를 평가하였다.
벼도열병균인 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae)의 균사디스크 5개를 삼각플라스크에 담긴 100 ml PDB 배지(potato dextrose broth medium; 0.4% potato starch, 2% dextrose)에 접종한 후, 7 내지 10일 동안 25℃에서 150 rpm으로 진탕한 배양액을 믹서기(blade mixer)로 갈아서 제조한 균사 현탁액 2 ml을 상기 접종된 100 ml PDB 배지에 잘 섞어서 50 μl 씩 웰(well)에 분주하였다.
최종적으로 100 μl 웰에 제조예 1의 단계 1에서 제조한 측백나무 추출물 및 제조예 2의 단계 1에서 제조한 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물이 각각 250, 500, 1,000 μg/ml의 농도로 포함되도록 하였고, 이때 메탄올의 함량은 5%(v/v)를 초과하지 않았다. 무처리구는 5%(v/v)의 메탄올만 첨가하였다. 이후, 25℃에서 2 내지 3일간 배양하고, 벼도열병균의 생장이 완전히 억제되는 농도를 최소억제농도로 정하였다.
시료 | 최소억제농도 (μg/ml) |
측백나무추출물 | 250 |
측백나무 추출물의 헥산 분획물 | 250 |
측백나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물 | 250 |
측백나무 추출물의 부탄올 분획물 | 500 |
측백나무 추출물의 물 분획물 | >1,000 |
측백나무 추출물, 이의 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물이 각각 250 μg/ml 농도에서 벼도열병균의 생장을 완전히 억제하였고, 부탄올 분획물이 500 μg/ml 농도에서 벼도열병균의 생장을 완전히 억제하였다(표 3 참조). 상기 결과를 통해, 측백나무 추출물 또는 이의 분획물, 특히 헥산 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물이 식물병원성 곰팡이 생장 억제 효과가 있는바, 식물병 방제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
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실시예
4> 측백나무 추출물 또는 이의
분획물의
식물병원성
세균에 대한 생장 억제
효과 확인
측백나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물이 식물병원성 세균 생장 억제 효과를 나타내는지 확인하기 위해, 하기의 절차에 따라 실험을 수행하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
구체적으로, 상기 제조예 1의 단계 1에서 제조한 측백나무 추출물 또는 상기 제조예 2의 단계 1에서 제조한 헥산 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물이 호접란세균성갈색점무늬병균인 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 과수뿌리혹병균인 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 세균성벼알마름병균인 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae), 고추궤양병균인 클라비박터 미시가넨시스 subsp. 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 작물무름병균인 딕케야 크리산테마이(Dickeya chrysanthemi)와 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 키위궤양병균인 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 오이세균모무늬병균인 슈도모나스 시린게 pv. 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 가지과작물풋마름병균인 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 및 복숭아세균성구멍병균인 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni)에 대한 생장 억제 효과가 있는지를 확인하기 위해, in vitro 분석(assay)을 수행하였다.
96-웰 플레이트(96-well plate)를 사용한 액체배지미량희석법(broth micro-dilution method)로 최소억제농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 값을 구하여, 식물병원성 세균 생장 억제 효과를 평가하였다.
상기 10종의 식물병원성 세균들을 TSB 배지(tryptic soy broth medium: 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.25% K2HPO4, 0.5% NaCl)에 접종하고, 키위궤양병균인 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에 및 복숭아세균성구멍병균인 잔토모나스 아르보르콜라 pv. 프루니는 25℃에서 2일 동안 150 rpm으로 진탕배양하고, 나머지 세균들은 30℃에서 2일 동안 150 rpm으로 진탕배양하였다. 이후, TSB 배지로 희석하여 세균농도가 약 1× 107 CFU/ml이 되도록 하였다. 희석한 세균배양액을 접종하여, 최종적으로 약 1 × 105 CFU/ml가 되도록 하였다.
상기 제조예 1의 단계 1에서 제조한 측백나무 추출물 및 상기 제조예 2의 단계 1에서 제조한 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물을 각각 100 mg/ml의 농도로 메탄올에 용해시킨후, 두 배 희석법으로 메탄올에 희석하여 농도별 스탁(stock) 용액을 준비하였다. 96-웰 플레이트를 사용하여, 웰당 100 ml의 TSB 배지에 상기 제조예 1의 단계 1에서 제조한 측백나무 추출물 및 상기 제조예 2의 단계 1에서 제조한 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물이 각각 최종적으로 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 μg/ml의 농도로 포함되도록 농도별 스탁 용액을 분주하였으며, 이때 메탄올의 함량은 1%를 초과하지 않았다. 농도별로 3회 반복하여 실험하였고, 무처리구는 1%의 메탄올만 첨가하였다. 이후, 72시간 동안 배양하고, 식물병원성 세균의 생장이 완전히 억제되는 농도를 최소억제농도로 정하였다.
시료 | 최소억제농도 (μg/ml) | |||||||||
Aaa | At | Bg | Cm | Dc | Pc | Psa | Psl | Rs | Xa | |
측백나무 추출물 | 400 | - | - | - | 400 | - | 400 | - | - | - |
헥산 분획물 | 400 | - | - | - | 400 | - | 400 | - | - | - |
에틸아세테이트 분획물 | 400 | - | - | - | 400 | - | 400 | - | - | - |
(a Aa, 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae); At, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens); Bg, 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae); Cm, 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis); Dc, 딕케야 크리산테마이(Dickeya chrysanthemi); Pc, 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum); Psa, 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae); Psl, 슈도모나스 시린게 pv. 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans); Rs, 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum); Xa, 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni).)
(상기 표에서 수치가 기재되지 않은 경우는 최소억제농도 > 400 μg/ml임)
상기 제조예 1의 단계 1에서 제조한 측백나무 추출물 및 상기 제조예 2의 단계 1에서 제조한 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물은 각각 400 μg/ml의 농도에서 호접란세균성갈색점무늬병균인 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에 및 작물무름병균인 딕케야 크리산테마이 및 키위궤양병균인 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에의 생장을 완전히 억제하였다(표 4 참조). 상기 결과를 통해, 측백나무 추출물 또는 이의 분획물, 특히 헥산 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물이 식물병원성 세균 생장 억제 효과가 있는바, 식물병 방제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 5> 측백나무 추출물로부터 살균활성물질 분리
측백나무 추출물(Platycladus orientalis extract)로부터 살균활성물질을 분리하기 위하여 다양한 크로마토그래피 기법을 사용하여 분리를 수행하였고, 구체적으로 하기의 절차에 따랐다.
도 1에 나타난 바와 같은 공정으로, 상기 제조예 1의 단계 1에서 제조한 측백나무 추출물 100 g으로부터 화합물 1 내지 9를 분리하였다. 먼저, 측백나무 추출물 100 g을 증류수 5 L에 현탁하고, 헥산(hexane) 5 L로 2회 추출한 후, 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 2회 추출하였으며, 헥산층과 에틸아세테이트층을 합하고 감압농축하여 건조된 헥산 및 에틸아세테이트 혼합 분획물 46 g을 제조하였다. 상기 헥산 및 에틸아세테이트 혼합 분획물 46 g을 실리카겔(Kiesel gel 60, 70-230 mesh, 500 g; Merck) 컬럼에 흡착시킨 후, 클로로포름 및 메탄올을 95:5 내지 0:100의 부피비로 혼합한 메탄올수용액으로 순차적으로 용출시켜 12개 분획물로 나누었다(E1 내지 E12).
분획물의 화학적 특징을 조사하기 위하여 박막크로마토그패피(thin layer chromatography; TLC) 기법을 이용하였으며, 시료를 실리카겔 고정상에 흡착시킨 후, 메탄올:에틸아세테이트(95:5, v/v), 메틸렌클로라이드:에틸아세테이트(95:5 v/v) 또는 헥산:에틸아세테이트(8:2 v/v)로 전개시키고, p-아니스알데하이드 시약(p-anisaldehyde reagent)으로 발색시켜 TLC 패턴 분석을 수행하였다. 그 중 E2 분획물 6.4 g을 실리카겔이 충전된 컬럼에 가한 후, 헥산 및 다이클로로메탄을 8:2 내지 0:10의 부피비로 혼합한 용액을 순차적으로 용출시켜 9개 분획물(E21 내지 E29)로 나누었다.
E26 분획물(730 mg)을 고압액체크로마토그래피(high-pressure liquid chromatography; HPLC) 시스템에 연결된 C18 역상컬럼(Phenomenex Capcell Pak C18 UG, 250 mm × 20 mm, 5 μm)에 가하고, 농도구배조건으로 85 내지 100% 메탄올수용액을 분당 5 ml의 유속으로 용출시켜, 44.7 mg의 화합물 3 및 95.1 mg의 화합물 4을 분리하였다.
E27 분획물 432 mg을 석유에테르(petroleum ether) 1 ml에 녹이고, 영하 4℃에서 4시간 동안 결정화시켜 순수한 화합물 9를 정제하였다.
E3 분획물 2.9 g을 MPLC(Medium pressure liquid chromatography, 중압액체크로마토그래피) 시스템에 연결된 순상컬럼(Biotage SNAP KP-Sil)에 가하고, 농도구배조건으로 헥산과 다이클로로메탄을 9:1 내지 0:10의 부피비로 혼합한 용액을 분당 5 ml의 유속으로 용출시켜, 487.8 mg의 화합물 5 및 206.8 mg의 화합물 6을 분리하였다.
E5 분획물 3.2 g을 MPLC 시스템에 연결된 순상컬럼(Biotage SNAP KP-Sil)에 가하고, 농도구배조건으로 다이클로로메탄과 에틸아세테이트를 10:0 내지 9:1의 부피비로 혼합한 용액을 분당 5 ml의 유속으로 용출시켜. 5개의 분획물(E51 내지 E55)로 나누고, E52 분획물로부터 815.4 mg의 화합물 1을 분리하였다.
E54 분획물 393.3 mg을 MPLC 시스템에 연결된 순상컬럼(Biotage SNAP KP-Sil)에 가하고, 농도구배조건으로 헥산과 에틸아세테이트를 93:7 내지 8:2의 부피비로 혼합한 용액을 분당 3 ml의 유속으로 용출시켜, 43.3 mg의 화합물 7과 40.2 mg의 화합물 8을 분리하였다.
E7 분획물 2.4 g을 MPLC 시스템에 연결된 순상컬럼(Biotage ZIP Sphere)에 가하고, 농도구배조건으로 헥산과 다이클로로메탄을 97:3 내지 88:12의 부피비로 혼합한 용액을 분당 5 ml의 유속으로 용출시켜, 449.5 mg의 화합물 2를 분리하였다(도 1 참조).
<실시예 6> 측백나무 추출물로부터 분리한 살균활성물질의 화학구조 규명
상기 실시예 5에서 분리한 살균활성물질의 화학구조를 규명하기 위하여 하기의 절차에 따라 실험을 수행하였고, 그 결과를 표 5 내지 표 13에 정리하여 나타내었다.
시료를 클로로포름-d(CDCl3, 99.96 atom% D, Cambridge Isotope Laboratories)에 녹여 500 MHz NMR 장치(nuclear magnetic resonnance, Bruker AMX-500)에서 13C-NMR 스펙트럼을 얻었다. 13C NMR 스펙트럼에서 나타나는 77.0 ppm의 클로로포름 용매 피크를 기준으로 화학적이동(chemical shift) 값을 δ(ppm)으로 나타내었다. GC-MS(Gas chromatography-mass spectrometry)를 사용하여 분리한 화합물의 질량을 측정하였다. 상기 실험의 결과를 문헌(Chernov et al. 2006)에 나타난 MS와 13C-NMR 데이터와 비교하여, 측백나무 추출물로부터 분리한 화합물들의 화학구조를 규명하였다.
<실시예 6-1> 화합물 1의 화학구조 규명
분석 결과, 화합물 1은 EIMS(electron impact mass spectroscopy)에서 m/z 346 [M+]의 분자이온으로 검출되었으며, 13C NMR 분석 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
13C NMR 데이터를 문헌(Chernov et al. 2006)과 비교하여, 분리된 화합물 1을 하기 화학식 1의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물인 피누솔라이드(pinusolide)로 동정하였다.
[화학식 1]
위치 | 화학적이동 (δ c in ppm)a | |
화합물 1 |
Pinusolide (Chernov et al. 2006) |
|
1 | 39.2 | 39.0 |
2 | 19.9 | 19.7 |
3 | 38.2 | 38.0 |
4 | 44.3 | 44.0 |
5 | 56.3 | 56.1 |
6 | 26.2 | 26.0 |
7 | 38.7 | 38.5 |
8 | 147.4 | 147.0 |
9 | 55.6 | 55.5 |
10 | 40.3 | 40.1 |
11 | 21.8 | 21.7 |
12 | 24.6 | 24.5 |
13 | 134.8 | 134.6 |
14 | 143.9 | 143.2 |
15 | 70.1 | 69.5 |
16 | 174.4 | 173.1 |
17 | 106.7 | 106.7 |
18 | 177.7 | 176.6 |
19 | 28.8 | 28.6 |
20 | 12.6 | 12.4 |
OCH3 | 51.2 | 50.7 |
(a Recorded in CDCl3 at 125 MHz)
<실시예 6-2> 화합물 2의 화학구조 규명
분석 결과, 화합물 2는 EIMS(electron impact mass spectroscopy)에서 m/z 362 [M+]의 분자이온으로 검출되었으며, 13C NMR 분석 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
13C NMR 데이터를 문헌(Chien et al. 2004)과 비교하여, 분리된 화합물 2를 하기 화학식 2의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물인 15-메톡시피누솔리드산(15-methoxypinusolidic acid)으로 동정하였다.
[화학식 2]
위치 | 화학적이동 (δ c in ppm) | |
화합물 2 |
15-Methoxypinusolidic acid (Chien et al. 2004) |
|
1 | 39.1 | 39.0 |
2 | 19.8 | 19.7 |
3 | 37.8 | 37.8 |
4 | 44.2 | 44.0 |
5 | 56.2 | 56.3 |
6 | 26.0 | 25.9 |
7 | 38.6 | 38.4 |
8 | 147.3 | 147.4 |
9 | 55.6 | 55.6 |
10 | 40.5 | 40.4 |
11 | 21.7 | 21.7 |
12 | 24.5 | 24.5 |
13 | 139.1 | 139.1 |
14 | 141.6 | 141.7 |
15 | 102.5 | 102.0 |
16 | 171.4 | 171.0 |
17 | 106.8 | 106.7 |
18 | 184.0 | 183.9 |
19 | 29.0 | 28.8 |
20 | 12.7 | 12.8 |
OCH3 | 57.0 | 57.9 |
(a Recorded in CDCl3 at 125 MHz)
<실시예 6-3> 화합물 3의 화학구조 규명
분석 결과, 실시예 3 화합물은 EIMS(electron impact mass spectroscopy)에서 m/z 316 [M+]의 분자이온으로 검출되었으며, 13C NMR 분석 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
13C NMR 데이터를 문헌(Asili et al. 2004)과 비교하여, 분리된 화합물 3을 하기 화학식 3의 라브단 다이터핀노이드(labdane diterpenoid) 화합물인 램버티안산(lambertianic acid)으로 동정하였다.
[화학식 3]
위치 | 화학적이동 (δ c in ppm)a | |
화합물 3 |
Lambertianic acid (Asili et al. 2004) |
|
1 | 39.2 | 39.1 |
2 | 20.1 | 19.9 |
3 | 38.2 | 38.0 |
4 | 44.3 | 44.1 |
5 | 56.4 | 56.2 |
6 | 26.2 | 26.1 |
7 | 38.8 | 38.7 |
8 | 148.0 | 147.8 |
9 | 55.4 | 55.3 |
10 | 40.5 | 40.4 |
11 | 23.7 | 23.6 |
12 | 24.4 | 24.3 |
13 | 125.6 | 125.5 |
14 | 111.1 | 111.0 |
15 | 142.8 | 142.7 |
16 | 138.9 | 138.7 |
17 | 106.6 | 106.5 |
18 | 182.2 | 182.6 |
19 | 13.0 | 12.8 |
20 | 29.2 | 29.0 |
(a Recorded in CDCl3 at 125 MHz)
<실시예 6-4> 화합물 4의 화학구조 규명
분석 결과, 화합물 4는 EIMS(electron impact mass spectroscopy)에서 m/z 302 [M+]의 분자이온으로 검출되었으며, 13C NMR 분석 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
13C NMR 데이터를 문헌(Smith et al. 2007)과 비교하여, 분리된 화합물 4를 하기 화학식 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpnoid) 화합물인 trans-커뮨산(trans-communic acid)으로 동정하였다.
[화학식 4]
위치 | 화학적이동 (δc in ppm)a | |
화합물 4 |
trans-Communic acid (Smith et al. 2007) |
|
1 | 39.5 | 39.4 |
2 | 20.2 | 20.1 |
3 | 38.3 | 38.3 |
4 | 44.3 | 44.4 |
5 | 56.3 | 56.4 |
6 | 26.1 | 26.1 |
7 | 38.7 | 38.6 |
8 | 148.3 | 148.0 |
9 | 56.5 | 56.5 |
10 | 40.5 | 40.2 |
11 | 23.4 | 23.3 |
12 | 134.2 | 133.9 |
13 | 133.5 | 133.4 |
14 | 141.7 | 141.6 |
15 | 110.0 | 109.9 |
16 | 11.9 | 11.1 |
17 | 107.6 | 107.6 |
18 | 182.3 | 177.7 |
19 | 29.3 | 28.9 |
20 | 13.0 | 12.7 |
(a Recorded in CDCl3 at 125 MHz)
<실시예 6-5> 화합물 5의 화학구조 규명
분석 결과, 화합물 5는 EIMS(electron impact mass spectroscopy)에서 m/z 288 [M+]의 분자이온으로 검출되었으며, 13C NMR 분석 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
하기 표 9에 나타난 바와 같이,
13C NMR 스펙트럼에서 다이터펜(diterpene)을 구성하는 20개의 탄소 시그널이 나타났다. 13C NMR 스펙트럼에서 1개의 쿼터터리 sp2 탄소(δ C 136.6 ppm), 2개의 메틴 sp2 탄소(δ C 149.0, 128.8 ppm), 1개의 메틸렌 sp2 탄소(δ C 110.0 ppm), 3개의 쿼터너리 sp3 탄소(δ C 39.0, 38.6, 37.8 ppm), 3개의 메틴 sp3 탄소(δ C 79.6, 54.2, 50.6 ppm), 6개의 메틸렌 sp3 탄소(δ C 37.9, 36.1, 35.0, 28.4, 22.7, 18.8 ppm), 및 4개의 메틸 탄소(δ C 28.5, 26.0, 16.8, 15.3 ppm) 시그널이 나타났다. 상기 13C NMR 데이터를 문헌(Wong et al. 2010)과 비교하여, 화합물 5을 하기 화학식 5의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물인 15-산다라코피마라다이엔-3β-올(15-sandaracopimaradien-3β-ol)로 동정하였다.
[화학식 5]
위치 | 화학적이동 (δc in ppm)a | |
화합물 5 |
8(14),15-Sandaracopimaradien-3ß-ol (Wong et al. 2010) |
|
1 | 36.1 | 36.3 |
2 | 28.4 | 28.1 |
3 | 79.6 | 79.6 |
4 | 39.0 | 39.4 |
5 | 54.2 | 54.6 |
6 | 18.8 | 19.2 |
7 | 35.0 | 34.9 |
8 | 136.6 | 137.0 |
9 | 50.6 | 50.8 |
10 | 37.8 | 37.8 |
11 | 22.7 | 22.6 |
12 | 37.9 | 37.9 |
13 | 38.6 | 38.5 |
14 | 128.8 | 129.3 |
15 | 149.0 | 149.4 |
16 | 110.0 | 110.5 |
17 | 26.0 | 26.4 |
18 | 28.5 | 28.9 |
19 | 16.8 | 16.1 |
20 | 15.3 | 15.4 |
(a Recorded in CDCl3 at 125 MHz)
<실시예 6-6> 화합물 6의 화학구조 규명
분석 결과, 화합물 6은 EIMS(electron impact mass spectroscopy)에서 m/z 288 [M+]의 분자이온으로 검출되었으며, 13C NMR 분석 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
13C NMR 데이터를 문헌(Block et al. 2004)과 비교하여, 화합물 6을 하기 화학식 6의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물인 7,15-아이소피마라다이엔-3β-올(7,15-isopimaradien-3β-ol)로 동정하였다.
[화학식 6]
위치 | 화학적이동 (δc in ppm)a | |
화합물 6 |
7,15-Isopimaradien-3ß-ol (Block et al. 2004) |
|
1 | 38.6 | 38.6 |
2 | 27.4 | 27.4 |
3 | 79.2 | 79.3 |
4 | 37.9 | 37.8 |
5 | 50.0 | 50.0 |
6 | 23.1 | 23.1 |
7 | 121.4 | 121.4 |
8 | 135.4 | 135.4 |
9 | 51.9 | 51.9 |
10 | 37.3 | 37.3 |
11 | 20.1 | 20.1 |
12 | 36.1 | 36.1 |
13 | 35.3 | 35.3 |
14 | 46.0 | 45.9 |
15 | 150.3 | 150.3 |
16 | 109.3 | 109.2 |
17 | 21.5 | 21.4 |
18 | 28.4 | 28.3 |
19 | 15.7 | 15.6 |
20 | 14.9 | 14.9 |
(a Recorded in CDCl3 at 125 MHz)
<실시예 6-7> 화합물 7의 화학구조 규명
분석 결과, 화합물 7은 EIMS(electron impact mass spectroscopy)에서 m/z 306 [M+]의 분자이온으로 검출되었으며, 13C NMR 분석 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
13C NMR 데이터를 문헌(Kim et al. 2014)과 비교하여, 화합물 7을 하기 화학식 7의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물인 8ß,18-다이하이드록시산다라코피마르-15-엔(8ß,18-dihydroxysandaracopimar-15-ene)로 동정하였다.
[화학식 7]
위치 | 화학적이동 (δc in ppm)a | |
화합물 7 |
8ß,18-Dihydroxysandaracopimar-15-ene (Kim et al. 2014) |
|
1 | 39.0 | 39.2 |
2 | 18.0 | 18.0 |
3 | 35.3 | 35.6 |
4 | 37.0 | 37.3 |
5 | 49.4 | 49.7 |
6 | 17.8 | 17.8 |
7 | 43.1 | 43.4 |
8 | 72.6 | 72.8 |
9 | 56.9 | 57.1 |
10 | 37.6 | 37.9 |
11 | 17.0 | 17.3 |
12 | 38.1 | 38.3 |
13 | 36.5 | 36.7 |
14 | 51.5 | 51.8 |
15 | 151.6 | 151.8 |
16 | 108.6 | 108.8 |
17 | 24.2 | 24.5 |
18 | 72.0 | 72.3 |
19 | 17.6 | 17.7 |
20 | 16.1 | 16.3 |
(a Recorded in CDCl3 at 125 MHz)
<실시예 6-8> 화합물 8의 화학구조 규명
분석 결과, 화합물 8은 EIMS(electron impact mass spectroscopy)에서 m/z 306 [M+]의 분자이온으로 검출되었으며, 13C NMR 분석 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
13C NMR 데이터를 문헌(Asili et al. 2004)과 비교하여, 화합물 8을 하기 화학식 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물인 15-아이소피마렌-3ß,8ß-다이올(15-isopimaren-3ß,8ß-diol)로 동정하였다.
[화학식 8]
위치 | 화학적이동 (δc in ppm)a | |
화합물 8 |
15-Isopimaren-3ß,8ß-diol (Asili et al. 2004) |
|
1 | 37.7 | 37.8 |
2 | 27.1 | 27.2 |
3 | 79.0 | 79.0 |
4 | 38.9 | 38.9 |
5 | 55.5 | 55.5 |
6 | 17.6 | 17.6 |
7 | 43.5 | 43.6 |
8 | 72.4 | 72.4 |
9 | 56.8 | 56.8 |
10 | 37.0 | 37.0 |
11 | 17.1 | 17.2 |
12 | 38.0 | 38.0 |
13 | 36.5 | 36.6 |
14 | 51.4 | 51.5 |
15 | 151.5 | 151.5 |
16 | 108.6 | 108.6 |
17 | 24.2 | 24.3 |
18 | 28.2 | 28.2 |
19 | 15.5 | 15.5 |
20 | 15.7 | 15.7 |
(a Recorded in CDCl3 at 125 MHz)
<실시예 6-9> 화합물 9의 화학구조 규명
분석 결과, 화합물 9는 EIMS(electron impact mass spectroscopy)에서 m/z 222 [M+]의 분자이온으로 검출되었으며, 13C NMR 분석 결과를 하기 표 13에 나타내었다.
13C NMR 데이터를 문헌(Joseph-Nathan et al. 1984)과 비교하여, 화합물 9을 하기 화학식 9의 세스퀴터펜 알코올(sesquiterpene alcohole) 화합물인 세드롤(α-cedrol)로 동정하였다.
[화학식 9]
위치 | 화학적이동 (δc in ppm)a | |
화합물 9 |
α-Cedrol (Joseph-Nathan et al. 1984) |
|
1 | 25.4 | 25.4 |
2 | 37.0 | 37.0 |
3 | 41.5 | 41.5 |
3a | 54.1 | 54.1 |
4 | 31.6 | 31.6 |
5 | 35.4 | 35.3 |
6 | 75.2 | 75.0 |
7 | 61.0 | 61.0 |
8 | 43.4 | 43.4 |
8a | 56.5 | 56.6 |
9 | 42.0 | 42.0 |
10 | 15.6 | 15.6 |
11 | 30.2 | 30.2 |
12 | 27.6 | 27.7 |
13 | 28.9 | 28.9 |
(a Recorded in CDCl3 at 125 MHz)
<
실시예
7> 측백나무 추출물의
헥산
및
에틸아세이트
분획물
내 화합물 1 내지 9의 함량 분석
상기 측백나무 추출물의 헥산 및 에틸아세테이트 혼합 분획물에 포함된 화합물 1 내지 9의 함량(%)을 분석하기 위하여, 하기의 절차에 따라 실험을 수행하였고, 그 결과를 표 14에 나타내었다.
상기 분획물 및 화합물 1 내지 9를 각각 100 μg씩 바이알(vial)에 분주한 후, 20 mg/ml 농도의 메톡시아민 하이드로클로라이드(methoxyamine hydrochloride) 피리딘(pyridine) 용액을 30 μl씩 가하고, 1% 트리에틸클로로실란을 포함한 N,O-비스(트리에틸실리)트리플루오로아세트아마이드(N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) 용액을 50 μl씩 가하고, 250 μg/ml 농도의 2-클로로나프탈렌(2-chloronaphthalene) 피리딘 용액을 내부표준물질로써 10 μl씩 가하고, 60℃에서 1시간 동안 반응시켜 유도체 화합물 시료를 제조하였다.
상기 시료는 GC-MS(gas chromatography mass-spectroscopy; QP5050, Shimadzu) 장치에 연결된 DB-5 컬럼(30 m × 0.25 mm, 필름두께 0.25 μm, Agilent)에 주입하였다. 구체적으로, GC 인렛(inlet) 온도는 250℃였고, 1 mg/ml 농도의 상기 시료를 클로로포름에 녹이고, 1:10의 스플릿모드(split mode)로 1 μl 주입하였다. 이동상으로 헬륨가스를 분당 1 ml의 유속으로 흘려주었고, 검출기의 전압은 1,588 V, 질량범위는 50 내지 500 Da이었고, 풀스캔모드(full scan mode)로 데이터를 수집하였다. 컬럼 오븐온도는 80℃에서 분당 5℃씩 올려 260℃까지 증가시킨후, 분당 3℃씩 올려 300℃까지 증가시키고, 300℃에서 3분간 유지하였다. GC-MS에서 검출된 피크(peak)는 알려진 물질의 RT(retension time) 값과 질량스펙트럼을 비교하였다.
화합물 | 함량(%) | RT(분) |
Pinusolide (화합물 1) | 8.9 | 27.3 |
15-Methoxypinusolidic acid (화합물 2) | 3.3 | 28.8 |
Lambertianic acid (화합물 3) | 1.5 | 16.5 |
trans-Communic acid (화합물 4) | 1.2 | 22.7 |
8(14),15-Sandaracopimaradien-3ß-ol (화합물 5) | 1.1 | 22.1 |
7,15-Isopimaradien-3ß-ol (화합물 6) | 0.5 | 22.4 |
8ß,18-Dihydroxysandaracopimar-15-ene (화합물 7) | 1.4 | 23.0 |
15-Isopimaren-3β,8β-diol (화합물 8) | 2.4 | 23.5 |
α-Cedrol (화합물 9) | 5.1 | 17.0 |
상기 표 14와 같은 분석 결과를 얻었다.
상기 결과는, 측백나무 추출물의 헥산 및 에틸아세테이트분획물이 라브단 다이터페노이드 화합물인 피누솔라이드 및 15-메톡시피누솔리드산 및 세스퀴터펜 알코올 화합물인 α-세드롤을 주요성분으로 포함하고, 다른 여러 다이터페노이드 화합물을 다량 함유하고 있음을 나타낸다.
<
실시예
8> 화합물 1 내지 9의 식물병원성
곰팡이에 대한 생장 억제
효과 평가
상기 실시예 5 및 6에서 분리한 화학식 1 내지 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpenoid) 화합물, 화학식 5 내지 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물 및 화합물 9의 세스퀴터펜 알코올(sesquiterpene alcohole) 화합물이 식물병원성 곰팡이에 대한 생장 억제 효과를 나타내는지 확인하기 위해, 하기의 절차에 따라 실험을 수행하였고, 그 결과를 표 15에 나타내었다.
구체적으로, 상기 화합물들이 배추과작물검은무늬병균인 알터나리아 브라시시콜라(Atlternaria brassicicola), 작물잿빛곰팡이병균인 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea), 고추탄저병균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 토마토시들음병균인 푸자리움 옥시스포룸 f. sp. 라이코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici), 벼도열병균인 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae), 감자역병균 및 토마토역병균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)에 대한 생장 억제 효과가 있는지를 확인하기 위해, in vitro 분석(assay)을 수행하였다.
96-웰플레이트(96-well plate)를 사용한 액체배지미량희석법(broth micro-dilution method)로 최소억제농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 값을 구하여 식물병원성 곰팡이 생장 억제 효과를 평가하였다.
모든 균주는 PDB 배지(potato dextrose broth medium; 0.4% potato starch, 2% dextrose)를 이용하여 포자를 수확하였고, 수확한 포자를 4겹 거즈(gauze)로 걸러서 포자현탁액을 제조하였다.
최종적으로 100 μl 웰에 식물병원성 곰팡이의 포자가 1 × 104 spores/ml의 농도로 포함하도록 하였고, 분리한 터페노이드 화합물(화학식 1 내지 9)이 각각 0.8, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, 200 μg/ml의 농도로 포함되도록 분주하였으며, 이때 메탄올의 함량은 1%를 초과하지 않았다. 농도별로 3회 반복하여 실험하였고, 무처리구는 1%의 메탄올만 첨가하였다. 식물병원성 곰팡이의 생장이 완전히 억제되는 농도를 최소억제농도로 정하였다.
화합물 | 최소억제농도 (μg/ml) | |||||
Aba | Bc | Cc | Fo | Mo | Pi | |
Pinusolide (화합물 1) | - | - | - | - | 100 | - |
15-Methoxypinusolidic acid (화합물 2) | - | - | - | - | 200 | 100 |
Lambertianic acid (화합물 3) | - | - | - | - | - | - |
trans-Communic acid (화합물 4) | - | - | - | - | - | - |
8(14),15-Sandaracopimaradien-3ß-ol (화합물 5) | - | - | - | - | - | - |
7,15-Isopimaradien-3ß-ol (화합물 6) | - | - | - | - | - | - |
8ß,18-Dihydroxysandaracopimar-15-ene (화합물 7) | - | - | - | - | 100 | 100 |
15-isopimaren-3β,8β-diol (화합물 8) | - | - | - | - | - | - |
α-cedrol (화합물 9) | - | - | - | - | 200 | 100 |
(a Ab, 알터나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola); Bc, 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea); Cc, 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes); Fo, 푸자리움 옥시스포룸 f. sp. 라이코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici); Mo, 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae); Pi, 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans).)
(상기 표에서 수치가 기재되지 않은 경우는 최소억제농도 > 200 μg/ml임)
상기 표 15에 나타난 바와 같이,
피누솔라이드(화학식 1), 15-메톡시피누솔리드산(화학식 2), 8ß,18-다이하이드록시산다라코피마르-15-엔(화학식 7) 및 α-세드롤(화학식 9)이 100 내지 200 μg/ml 농도에서 벼도열병균인 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae)의 생장을 완전히 억제하였고, 15-메톡시피누솔리드산(화학식 2), 8ß,18-다이하이드록시산다라코피마르-15-엔(화학식 7), α-세드롤(화학식 9)이 100 μg/ml의 농도에서 감자역병균 및 토마토역병균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)의 생장을 완전히 억제하였다.
<
실시예
9> 분리한
터페노이드
화합물의 식물병원성
세균에 대한 생장 억제
효과 평가
상기 실시예 5 및 6에서 분리한 화학식 1 내지 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpenoid) 화합물, 화학식 5 내지 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물 및 화합물 9의 세스퀴터펜 알코올(sesquiterpene alcohole) 화합물이 식물병원성 세균에 대한 생장 억제 효과를 나타내는지 확인하기 위해, 하기의 절차에 따라 실험을 수행하였고, 그 결과를 표 16에 나타내었다.
구체적으로, 상기 화합물들이 호접란세균성갈색점무늬병균인 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 과수뿌리혹병균인 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 세균성벼알마름병균인 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae), 고추궤양병균인 클라비박터 미시가넨시스 subsp. 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 작물무름병균인 딕케야 크리산테마이(Dickeya chrysanthemi) 및 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 키위궤양병균인 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 오이세균모무늬병인 슈도모나스 시린게 pv. 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 가지과작물풋마름병균인 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 복숭아세균성구멍병균인 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni)에 대한 생장 억제 효과가 있는지를 확인하기 위해, in vitro 분석(assay)를 수행하였다.
96-웰 플레이트(96-well plate)를 사용한 액체배지미량희석법(broth micro-dilution method)로 최소억제농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 값을 구하여 식물병원성 세균 생장 억제 효과를 평가하였다.
상기 10종의 식물병원성 세균들을 TSB 배지(tryptic soy broth medium: 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.25% K2HPO4, 0.5% NaCl)에 접종하고, 키위궤양병균인 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에 및 복숭아세균성구멍병균인 잔토모나스 아르보르콜라 pv. 프루니는 25℃에서 2일 동안 150 rpm으로 진탕배양하고, 나머지 세균은 30℃에서 2일 동안 150 rpm으로 진탕배양하였다. 이후, TSB 배지로 희석하여 세균농도가 약 1 × 107 CFU/ml이 되도록 하였다. 희석한 세균배양액을 접종하여, 최종적으로 약 1 × 105 CFU/ml가 되도록 하였다.
분리된 화합물을 각각 100 mg/ml의 농도로 메탄올에 용해시킨후, 두 배 희석법으로 메탄올에 희석하여 농도별 스탁(stock) 용액을 준비하였다. 96-웰 플레이트를 사용하여, 웰당 100 ml의 TSB 배지에 각각의 분리된 화합물이 최종적으로 0.8, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/ml의 농도가 되도록 농도별 스탁 용액을 분주하였으며, 이때 메탄올의 함량은 1%를 초과하지 않았다. 농도별로 3회 반복하여 실험하였고, 무처리구는 1%의 메탄올만 첨가하였다. 이후, 72시간 동안 배양하고, 식물병원성 세균의 생장이 완전히 억제되는 농도를 최소억제농도로 정하였다.
화합물 | 최소억제농도 (μg/ml) | |||||||||
Aa a | At | Bg | Cm | Dc | Pc | Psa | Psl | Rs | Xa | |
Pinusolide (화합물 1) | - | - | - | - | 100 | - | 200 | - | - | - |
15-Methoxypinusolidic acid (화합물 2) | - | - | - | - | 100 | - | - | - | - | - |
Lambertianic acid (화합물 3) | - | - | - | - | 200 | - | - | - | - | - |
trans-Communic acid (화합물 4) | 200 | - | - | - | 200 | - | - | - | - | - |
8(14),15-Sandaracopimaradien-3ß-ol (화합물 5) | 200 | - | - | - | 200 | - | - | - | - | - |
7,15-Isopimaradien-3ß-ol (화합물 6) | - | - | - | - | 200 | - | - | - | - | - |
8ß,18-Dihydroxysandaracopimar-15-ene (화합물 7) | - | - | - | - | 200 | 200 | - | - | - | - |
15-isopimaren-3β,8β-diol (화합물 8) | - | - | - | - | 200 | - | - | - | - | - |
α-cedrol (화합물 9) | - | - | - | - | 200 | - | - | - | - | - |
(a Aa, 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae); At, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens); Bg, 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae); Cm, 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis); Dc, 딕케야 크리산테마이(Dickeya chrysanthemi); Pc, 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum); Psa, 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae); Psl, 슈도모나스 시린게 pv. 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans); Rs, 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum); Xa, 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni).)
(상기 표에서 수치가 기재되지 않은 경우는 최소억제농도 > 200 μg/ml임)
상기 표 16에 나타난 바와 같이,
피누솔라이드(화학식 1) 및 메톡시피누솔라이드(화학식 2)가 100 μg/ml의 농도에서 작물무름병균인 딕케야 크리산테마이(Dickeya chrysanthemi)의 생장을 완전히 억제하였고, 화학식 3 내지 8 화합물 및 화합물 9가 200 μg/ml의 농도에서 작물무름병균인 딕케야 크리산테마이의 생장을 완전히 억제하였다. 피누솔라이드(화학식 1)가 200 μg/ml의 농도에서 키위궤양병균인 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae )의 생장을 완전히 억제하였고, 8ß,18-다이하이드록시산다라코피마르-15-엔(화학식 7)이 200 μg/ml의 농도에서 작물무름병균인 펙토박테리움 카로토보룸 pv. 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum )의 생장을 완전히 억제하였다. trans-커뮨산(화학식 4) 및 8(14),15-산다라코피마라다이엔-3β-올(화학식 5)이 200 μg/ml의 농도에서 호접란세균성갈색점무늬병균인 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이(Acidovorax avenae subsp. cattleyae)의 생장을 완전히 억제하였다.
<
실시예
10> 분리한
터페노이드
화합물의
식물병
방제효과 평가
상기 실시예 5 및 6에서 제조한 측백나무 추출물로부터 분리한 터페노이드 화합물이 식물병 방제효과를 나타내는지 확인하기 위해, 하기의 절차에 따라 실험을 수행하였고, 그 결과를 표 17에 나타내었다.
구체적으로 상기 화합물들이, 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae) 또는 밀 붉은녹병(원인균 : Puccinia triticina)에 대해 방제효과가 있는지를 확인하기 위해, 온실 조건에서 다음과 같이 실험하였다.
상기 화합물 1 내지 2, 화합물 4 내지 7 및 화합물 9을 각각 메탄올에 용해시킨 후, 0.025%(w/v)의 트윈 20(계면활성제) 용액을 첨가하여 최종농도가 500, 1000, 2000 μg/ml이 되도록 하였다. 화합물 4인 trans-커뮨산은 최종농도가 111, 333, 1,000 μg/ml이 되도록 하는 것을 제외하고는, 상기 방식과 같이 메탄올에 용해시키고, 트윈 20 용액을 첨가하였다. 모든 시료의 최종 메탄올 농도는 5%(v/v)로 하였다. 이때, 무처리구는 5%(v/v) 메탄올 및 0.025%(w/v)의 트윈 20을 함유하는 용액을 처리하였다. 각 식물병당 4개의 포트를 이용하였고, 상기 재배한 식물의 엽면에 상기 시료를 분무 살포하고 24시간 동안 풍건한 후, 상기 식물병들의 원인균을 각각 접종하였다. 이들 벼 도열병 및 밀 붉은녹병에 대한 방제활성은 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조사하였고, 그 결과는 표 17에 나타내었다.
화합물 | 농도 (μg/ml) | 병 방제가 (%) | |
벼 도열병 | 밀 붉은녹병 | ||
Pinusolide (화합물 1) | 500 | 75 | 72 |
1000 | 94 | 80 | |
2000 | 96 | 80 | |
15-Methoxypinusolidic acid (화합물 2) | 500 | 85 | 60 |
1000 | 91 | 72 | |
2000 | 98 | 92 | |
trans-Communic acid (화합물 4) | 111 | 0 | 0 |
333 | 0 | 0 | |
1000 | 19 | 43 | |
8(14),15-Sandaracopimaradien-3ß-ol (화합물 5) | 500 | 0 | - a |
1000 | 0 | - | |
2000 | 38 | - | |
7,15-Isopimaradien-3ß-ol (화합물 6) | 500 | 0 | - |
1000 | 25 | - | |
2000 | 56 | - | |
8ß,18-Dihydroxysandaracopimar-15-ene (화합물 7) | 500 | 94 | - |
1000 | 96 | - | |
2000 | 96 | - | |
α-Cedrol (화합물 9) | 500 | 0 | 0 |
1000 | 0 | 0 | |
2000 | 0 | 0 |
("-" : No data)
상기 표 17에서 나타난 바와 같이,
피누솔라이드(화학식 1), 15-메톡시피누솔리드산(화학식 2)은 500 μg/ml의 농도에서 벼 도열병에 대하여 75% 내지 94%, 밀 붉은녹병에 대하여 60% 내지 72%의 방제가를 나타냈고, 더 높은 농도로 처리하면 방제효과가 더 커졌다. 8ß,18-다이하이드록시산다라코피마르-15-엔(화학식 7)은 500 μg/ml의 농도에서 벼 도열병에 대하여 94%의 방제가를 나타냈고, trans-커뮨산(화학식 4), 8(14),15-산다라코피마라다이엔-3ß-올(화학식 5) 및 7,15-아이소피마라다이엔-3ß-올(화학식 6)은 1000 내지 2000 μg/ml의 농도에서 벼 도열병에 대하여 19% 내지 56%의 방제가를 나타내었고, trans-커뮨산(화학식 4)은 1000 μg/ml 농도에서 밀 붉은녹병에 대하여 43%의 방제가를 나타내었다.
α-세드롤(화학식 9)은 실시예 8(in vitro 분석)에서 벼도열병균인 마그나포르테 오라이제의 생장을 200 μg/ml의 농도에서 완전히 억제하는 효과을 나타낸 반면에, 본 실시예 10(in vivo 분석)에서는 2,000 μg/ml의 농도에서도 식물병 방제효과를 나타내지 않았다. 한편, 상기 화합물들을 처리하였을 때, 벼 식물(Oryza sativa L.) 또는 밀 식물(Triticum aestivum L.)에 약해가 나타나지 않았다.
상기 결과로부터, 측백나무 추출물 또는 이의 분획물이 나타내는 식물병 방제효능은 측백나무 추출물 또는 이의 분획물이 함유하고 있는 피누솔라이드(화학식 1), 15-메톡시피누솔리드산(화학식 2), trans-커뮨산(화학식 4)의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpenoid) 화합물 또는 8(14),15-산다라코피마라다이엔-3ß-올(화학식 5), 7,15-아이소피마라다이엔-3ß-올(화학식 6), 8ß,18-다이하이드록시산다라코피마르-15-엔(화학식 7)의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물에 의한 것임을 확인하였다.
또한, 상기 실시예 1 내지 10의 결과를 바탕으로,
측백나무 추출물, 이의 유기용매 분획물, 분리된 화학식 1 내지 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpenoid) 화합물 또는 화학식 5 내지 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물이 식물추출물 유래 무독성 천연살균제로 개발될 수 있음을 확인하였다, 분리한 화학식 1 내지 4의 라브단 다이터페노이드(labdane diterpenoid) 화합물 및 화학식 5 내지 8의 피마란 다이터페노이드(pimarane diterpenoid) 화합물의 식물병 방제활성은 측백나무 추출물을 처리하였을 때 나타나는 방제스펙트럼과 유사했으며, 더 높은 수준의 방제활성을 보였다.
Claims (11)
- 제1항에 있어서,
상기 화합물은 측백나무(Platycladus orientalis) 추출물로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 식물병은 벼 도열병, 감자 역병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 호접란 세균성갈색점무늬병, 작물 무름병 및 키위 궤양병으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 식물병 방제용 조성물은 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae), 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) 및 푸시니아 트리티시나(Puccinia triticina)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병원성 곰팡이의 생장을 억제하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 식물병 방제용 조성물은 엑시도보락스 아베네 subsp. 캇트레이에(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 딕케야 크리산테마이(Dickeya chrysanthemi), 펙토박테리움 카로토보룸 subsp. 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) 및 슈도모나스 시린게 pv. 액티니디에(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병원성 세균의 생장을 억제하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 유효성분은 식물병 방제용 조성물에 100 내지 2000 μg/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항의 식물병 방제용 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제방법.
- 제9항에 있어서,
상기 식물은 벼, 감자, 토마토, 밀, 호접란, 무, 배추, 고구마, 양파, 당근 및 키위로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물인 것을 특징으로 하는 식물병 방제 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 식물병은 벼 도열병, 감자 역병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 호접란 세균성갈색점무늬병, 작물 무름병 및 키위궤양병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물병인 것을 특징으로 하는 식물병 방제 방법.
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