KR20210018206A

KR20210018206A - 항원성 호흡기 세포융합 바이러스 폴리펩타이드

Info

Publication number: KR20210018206A
Application number: KR1020207031417A
Authority: KR
Inventors: 그레이 제이. 나벨; 취-젠 웨이; 커트 스완슨; 프레딥 달; 램 다라니프라가다; 매그너스 베지브
Original assignee: 사노피
Priority date: 2018-04-03
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2021-02-17
Also published as: EP3773704A1; WO2019195291A1; AU2019247034A1; MX2020010199A; JP2021519597A; US20210017237A1; CN112512567A; BR112020019938A2; RU2020135568A; CA3095175A1

Abstract

본 개시내용은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 항체를 유도하는데 사용하기 위한 항원성 RSV 폴리펩타이드에 관한 것이다. RSV 폴리펩타이드 및 페리틴 단백질을 포함하는 항원성 폴리펩타이드도 또한 개시되어 있다.

Description

항원성 호흡기 세포융합 바이러스 폴리펩타이드

본 출원은 2018년 4월 3일자로 출원된 미국 가출원 제62/652,199호의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.　2019년 3월 27일에 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 2019-03-27_01121-0031-00PCT_SL_ST25.txt이며, 용량이 187,354 바이트이다.

백신 분야에서 많은 성공을 거두었지만, 생명을 위협하는 많은 전염병으로부터 인간을 보호하기 위한 새로운 돌파구가 필요하다. 현재 라이선스가 부여된 많은 백신은 10년된 기술에 의존하여 약독화되거나 비활성화된 사멸된 병원균을 생산하는데, 이는 내재된 안전성 문제를 가지고 있으며 많은 경우 여러 번 투여해야 하는 단기적이고 약한 면역 반응만을 자극한다. 유전 및 생화학 공학의 발전으로 인해 도전적인 질병 표적에 대한 치료제를 개발할 수 있었지만, 백신 분야에 대한 이러한 응용은 완전히 실현되지 않았다. 이제 재조합 단백질 기술을 통해 최적의 항원을 설계할 수 있다. 또한, 나노입자는 최적의 항원 제시 및 표적 약물 전달에 대한 잠재력을 점점 더 많이 입증해 왔다. 여러 항원이 부착된 나노입자는 그들의 분자 화물의 다가 표시에 의해 결합력이 증가하고 나노크기로 인해 생물학적 장벽을 보다 효율적으로 통과할 수 있는 능력을 갖는 것으로 나타났다. 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 단백질에 융합된 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori) 페리틴 나노입자는 마우스 인플루엔자 모델에서 항원 안정성을 개선시키고, 면역원성을 증가시켰다(문헌 [Kanekiyo et al., Nature 499:102~106 (2013)] 참조). 이 융합 단백질은 8면체-대칭 나노입자로 자가조립되어 아쥬반트와 함께 사용할 때 다양한 전임상 모델에서 강력한 면역 반응을 제공하기 위해 8개의 삼량체 HA 스파이크를 제공했다.

호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 유아의 중증 호흡기 질환의 주요 원인이고, 노인의 호흡기 질환의 주요 원인이다. 수십년의 연구에도 불구하고 충족되지 않은 백신에 대한 필요성이 여전히 남아있다. 백신의 필요성은 분명하지만, RSV 백신의 개발은 1960년대에 포르말린 불활성화 RSV 바이러스를 사용한 임상 시험에서 RSV 감염 후 영아에서 더 심각한 질환을 일으킴에 따라 지장을 받게 되었다. 문헌 [Hurwitz (2011) Expert Rev Vaccines 10(10): 1415~1433.]을 참고한다. 최근에는 융합후 형태에서 RSV F 항원을 사용하는 임상 프로그램이 성인에서 충분한 효능을 이끌어 내지 못했다. 문헌 [Faloon et al. (2017) JID 216:1362~1370]을 참고한다. 그러나, 사전-융합 형태로 안정화된 RSV F 항원은 임상에서 실패한 융합-후 항원보다 우수한 중화 반응을 이끌어낼 수 있다.

여기서, RSV 폴리펩타이드와 연관된 일련의 새로운 폴리펩타이드, 나노입자, 조성물, 방법 및 용도가 제시된다. 융합전 RSV F와 융합후 RSV F 사이에 공유되는 RSV 폴리펩타이드의 에피토프가, 예를 들어 돌연변이에 의해 추가된 글리코실화 부위에서 N-글리칸에 의해 차단되는 폴리펩타이드를 포함하는 새로운 RSV F 폴리펩타이드가 생성되었다. 또한 이러한 신규 RSV 폴리펩타이드 및 페리틴을 포함하는 항원성 폴리펩타이드 및 나노입자가 생성되었다. RSV G 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 페리틴(ferritin) 폴리펩타이드도 생성되었다. 더욱이, RSV 폴리펩타이드 및 페리틴을 포함하는 자가-아쥬반트 항원성 폴리펩타이드가 개발되었으며, 여기서 면역-자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트가 항원성 폴리펩타이드에 직접 화학적으로 부착되었다. 면역-자극 모이어티를 항원성 폴리펩타이드에 직접 접합하면 단일 거대분자 개체에서 면역-자극 모이어티와 RSV 폴리펩타이드의 표적화된 공동-전달이 가능하며, 이는 항원과 면역-자극 분자, 예컨대, 아쥬반트를 별도의 분자로 포함하는 기존 백신으로 우려되는 전신 독성 가능성을 크게 감소시킬 수 있다. 거대분자 개체에서 RSV 폴리펩타이드와 함께 면역-자극 모이어티의 공동-전달 및 이들의 다가 제시는 또한 보호를 유도하는 데 필요한 전체 용량을 감소시켜 제조 부담과 비용을 줄일 수 있다.

본 개시내용의 목적은 상기 논의된 이점 중 하나 이상을 제공하거나 유용한 선택을 대중에게 적어도 제공할 수 있는 조성물, 키트, 방법 및 용도를 제공하는 것이다. 따라서, 이하의 실시형태가 본원에 개시된다.

실시형태 1은 RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 융합전 RSV F와 융합후 RSV F 사이에 공유되는 RSV 폴리펩타이드의 에피토프가 차단된다.

실시형태 2는 RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 아미노산 잔기 62~69 및 196~209 및 서열 번호 26의 위치 328, 348 또는 507에 상응하는 아스파라긴을 포함한다.

실시형태 3은 실시형태 2의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 융합전 RSV F와 융합후 RSV F 사이에 공유되는 RSV 폴리펩타이드의 에피토프가 차단된다.

실시형태 3b는 실시형태 1 또는 3의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 차단된 에피토프가 RSV F의 항원성 부위 1의 에피토프이다.

실시형태 3c는 실시형태 1 또는 3~3b의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 융합전 RSV F와 융합후 RSV F 사이에 공유되는 2개 이상의 에피토프가 차단된다.

실시형태 3d는 실시형태 1 또는 3~3c의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F의 항원성 부위 1의 2개 이상의 에피토프가 차단된다.

실시형태 3e는 실시형태 1 또는 3~3d의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 차단된 에피토프와 토폴로지적으로(topologically) 오버랩되는 하나 이상의, 또는 모든 에피토프도 차단된다.

실시형태 3f는 실시형태 3e의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 차단된 에피토프가 RSV F의 항원성 부위 1의 에피토프이다.

실시형태 4는 융합전 RSV F를 포함하는, 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드이다.

실시형태 5는 D25 또는 AM14로부터 선택된 융합전 RSV F-특이적 항체에 의해 인식되는, 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드이다.

실시형태 6은 실시형태 4 또는 5의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 융합전 RSV F는 융합후 RSV F에서 발견되지 않는 에피토프를 포함한다.

실시형태 7은 융합후 RSV F를 포함하는, 실시형태 1~3 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드이다.

실시형태 8은 실시형태 1 또는 3~6 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 에피토프는 아스파라긴에 부착된 N-글리칸으로 차단된다.

실시형태 9는 실시형태 7의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 아스파라긴은 야생형 RSV F 서열(서열 번호 26)의 비-아스파라긴 잔기에 상응하고, 선택적으로 비-아스파라긴 잔기는 서열 번호 26의 위치 328, 348 또는 507에 상응한다.

실시형태 10은 페리틴 단백질을 더 포함하는, 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드이다.

실시형태 11은 실시형태 11의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 페리틴은 표면-노출된 아미노산을 시스테인으로 대체하는 돌연변이를 포함한다.

실시형태 12는 RSV F 폴리펩타이드 및 페리틴 단백질을 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 페리틴 단백질은 표면노출된 아미노산을 시스테인으로 대체하는 돌연변이를 포함한다.

실시형태 13은 실시형태 11 또는 12의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 페리틴은 쌍으로 또는 구조적 정렬에 의해 결정된 바와 같이, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 E12C, S26C, S72C, A75C, K79C, S100C, 및 S111C 돌연변이 중 하나 이상 또는 비-헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.

실시형태 14는 표면-노출된 아미노산을 통해 페리틴에 연결된 하나 이상의 면역-자극 모이어티를 포함하는, 실시형태 10~13 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 선택적으로 상기 표면-노출된 아미노산은 돌연변이로 인해 생성되는 시스테인이다.

실시형태 15는 실시형태 10~14 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 페리틴은 표면-노출된 아스파라긴을 비-아스파라긴 아미노산으로 대체하는 돌연변이를 포함하고, 선택적으로 아스파라긴은 쌍으로 또는 구조적 정렬에 의해 결정된 바와 같이 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 위치 19에, 또는 비-헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴에서의 유사한 위치에 있다.

실시형태 16은 실시형태 10~15 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, 페리틴은 내부 시스테인을 비-시스테인 아미노산으로 대체하는 돌연변이를 포함하고, 선택적으로 내부 시스테인은 쌍으로 또는 구조적 정렬에 의해 결정된 바와 같이 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 위치 31에, 또는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 위치 31에 상응하는 위치에 있다.

실시형태 17은 실시형태 12~16 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드는 부위 0 에피토프인 융합후 RSV F에서 발견되지 않은 에피토프를 포함하고, 선택적으로 부위 0 에피토프는 서열 번호 26의 아미노산 잔기 62~69 및 196~209를 포함한다.

실시형태 18은 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 328에 상응하는 위치에 아스파라긴을 포함한다.

실시형태 19는 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 348에 상응하는 위치에 아스파라긴을 포함한다.

실시형태 20은 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 507에 상응하는 위치에 아스파라긴을 포함한다.

실시형태 21은 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 라이신 498에 상응하는 위치에 류신을 포함한다.

실시형태 22는 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 이소류신 217에 상응하는 위치에 프롤린을 포함한다.

실시형태 23은 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 155에 상응하는 위치에 시스테인 이외의 아미노산 및/또는 서열 번호 26의 위치 290에 상응하는 위치에 시스테인 이외의 아미노산을 포함한다.

실시형태 24는 서열 번호 26의 위치 155에 상응하는 위치에 세린을 포함하고/하거나 서열 번호 26의 위치 290에 상응하는 위치에 세린을 포함하는, 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드이다.

실시형태 25는 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드에 푸린 절단 부위가 결여되고, 선택적으로 링커가 푸린 절단 부위 대신 존재한다.

실시형태 26은 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 17의 아미노산 1~478에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

실시형태 27은 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 17의 서열에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

실시형태 28은 서열 번호 17의 아미노산 1~478을 포함하는, 실시형태 20 또는 21의 항원성 RSV 폴리펩타이드이다.

실시형태 29는 실시형태 1~19 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 23의 아미노산 1~478에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

실시형태 30은 실시형태 1~19 또는 23 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드로서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 23의 서열에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

실시형태 31은 서열 번호 23의 아미노산 1~478을 포함하는, 실시형태 23 또는 24의 항원성 RSV 폴리펩타이드이다.

실시형태 32는 서열 번호 3~23 중 어느 하나의 서열을 포함하는, 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드이다.

실시형태 32a는 서열 번호 17의 서열을 포함하는, 청구항 32의 항원성 RSV 폴리펩타이드이다.

실시형태 32b는 서열 번호 23의 서열을 포함하는, 청구항 32의 항원성 RSV 폴리펩타이드이다.

실시형태 33은 실시형태 10~32b 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드를 포함하는 페리틴 입자이다.

실시형태 34는 선행하는 실시형태들 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드 또는 페리틴 입자 및 RSV G 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이다.

실시형태 34b는 실시형태 34의 조성물로서, 조성물은 페리틴 입자를 포함하고 페리틴 입자는 RSV G 폴리펩타이드를 포함하며, 선택적으로 RSV G 폴리펩타이드는 페리틴 입자에 화학적으로 접합된다.

실시형태 34c는 실시형태 34 또는 34b의 조성물로서, RSV G 폴리펩타이드는 글리코실화되지 않는다.

실시형태 35는 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는, 실시형태 1~33 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드 또는 페리틴 입자를 포함하는 조성물, 또는 실시형태 34~34c 중 어느 하나의 조성물이다.

실시형태 36은 RSV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하거나 RSV 감염에 대해 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 실시형태 1~35 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드, 페리틴 입자 또는 조성물이다.

실시형태 37은 실시형태 1~36 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드, 페리틴 입자, 또는 조성물 중 어느 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, RSV에 대한 면역 반응을 유도하거나 대상체를 RSV 감염으로부터 보호하는 방법이다.

실시형태 38은 실시형태 36 또는 37의 항원성 RSV 폴리펩타이드, 페리틴 입자, 조성물 또는 방법으로서, 대상체가 인간이다.

실시형태 39는 실시형태 1~32b 중 어느 하나의 항원성 RSV 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이고, 선택적으로 핵산은 mRNA이다.

실시형태 39b는 실시형태 39의 핵산 및 RSV G 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물 또는 키트이며, 선택적으로 하나 또는 두 핵산 모두 mRNA이다.

추가 목적 및 장점은 후속되는 설명에서 부분적으로 기재될 것이고, 부분적으로 상기 설명으로부터 명백해질 것이거나, 실시에 의해 습득될 수 있다. 목적 및 강점은 특히 첨부된 청구범위에서 언급된 요소 및 조합에 의해 실현되고 이루어진다.

상기 일반적 설명 및 하기 상세한 설명 둘 모두는 단지 예시 및 설명이며, 청구범위를 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다.

본 명세서에 포함되고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면은 여러 실시형태를 예시하며, 상기 설명과 함께 본원에 기재된 원리를 설명하기 위해 제공한다.

도 1a~1d는 예시적인 RSV Pre-F-NP 폴리펩타이드 구조를 보여준다. (도 1a) 각 세그먼트의 N 말단에 해당하는 잔기 번호를 열거하는 선형 다이어그램. 넘버링은 서열 번호 26에 따른다. 도메인 1~3은 각각 DI, DII 및 DIII로 표시되고, 헵타드 반복 영역 A(HRA) 및 헵타드 반복 영역 B(HRB)도 표지된다. C-말단 페리틴은 표지되어 있다(페리틴 나노입자). RSV F 모이어티의 F1 및 F2 단편은 카툰 아래에 표지되어 있다. 펩타이드 27 단편(p27) 융합 펩타이드(FP) 및 푸린 절단 부위(푸린 부위)가 결실되고 가요성 링커로 대체되어 단일 사슬 F 작제물을 형성하는 경우, F1 및 F2 단편 사이의 영역은 선으로 도시되고, 카툰 위에 표지된다. 다이어그램 위의 별은 조작된 글리코실화 부위 E328N, S348N 및 R507N의 대략적인 위치를 나타낸다. (도 1b) D25, AM14, 101F, 및 팔리비주맙 항체에 대한 주요 중화(Nab) 에피토프를 나타내는 융합전 RSV F 모이어티의 구조 모델. 공유된 융합전 및 융합후 구조적 에피토프의 대략적인 영역은 흰색 삼각형으로 표시된다. 예시적인 조작된 글리코실화 부위 E328N, S348N 및 R507N의 위치가 표지되어 있다. 조작된 글리코실화 부위는 융합전 및 융합후 형태 사이에 구조적으로 공유된 영역으로 맵핑되고 D25, AM14, 101F 및 팔리비주맙과 같은 항체에 의해 인식되는 주요 중화 에피토프로부터 떨어져 있다. 이와 같이, 이러한 조작된 글리칸 부위를 함유하는 작제물은 여전히 상기 중화 항체에 결합한다(데이터는 표시되지 않음). (도 1c) HRA 및 HRB 영역이 더 어둡게 음영 처리된 RSV 융합전 F 단백질 나노입자(Pre-F-NP)의 구조 모델. 생성된 접힌 Pre-F-NP 작제물은 도 1b에 열거된 주요 에피토프를 표시하는 24-량체를 형성할 수 있다. (도 1d) 24-량체 페리틴 나노입자 상의 RSV F 삼량체 모이어티의 대칭을 보여주는 RSV Pre-F-NP 작제물 RF8085(서열 번호 1)의 전자 현미경사진의 2D 클래스 평균.
도 2는 D25 항체 웨스턴 블롯에 의해 측정된, 293개의 세포 컨디셔닝된 배지에서 발현된 여러 Pre-F-NP 작제물의 소규모 발현을 보여준다. RF8090은 RF8085와 동일한 서열, 즉 서열 번호 1을 갖는 CHO 발현에 사용되는 클로닝 변이체인 서열 번호 2이다. RF8085 및 RF8090은 페리틴에 N-말단 융합된 도 1a에 기재된 단일 사슬 링커 및 결실을 갖는 DS-CAV의 이황화물 및 공동 충전 돌연변이를 보유하는 Pre-F-NP 작제물이다. RF8100~RF8105 및 RF8108~RF8112는 각각 서열 번호 3~8 및 11~14의 서열을 갖는다. scF-pFerr = RSV F 폴리펩타이드와 페리틴의 융합 단백질. RF8090 벤치마크에 비해 작제물의 발현을 개선하는 것으로 보이는 돌연변이는 웨스턴 블롯 아래에 표시된다. 주목할만한 돌연변이는 E328N, S348N 및 R507N 돌연변이 및 중앙 나선 캡핑 돌연변이 I327P를 통한 글리칸 부위의 추가를 포함하며, 이는 웨스턴 블롯으로 측정된 바와 같이, RSV F 나노입자의 컨디셔닝된 배지로의 발현 및 분비를 증가시켰다.
도 3은 293 발현으로부터의 컨디셔닝된 배지의 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된, RF8085(서열 번호 1; 대조군 작제물) 및 RF8106(서열 번호 9; RF8108에서와 같은 I217P 돌연변이를 포함하고, DS-CAV1의 이황화물(DS) 돌연변이가 없음)의 발현을 보여준다. DS를 중앙 나선 캡핑 돌연변이 I217P로 대체하는 것은 발현을 유의하게 증가시켰다. DS를 중앙 나선 캡핑 돌연변이로 대체하는 것은 융합전-특이적 항체 D25 및 AM14에 대한 작제물의 결합에 영향을 미치지 않는다.
도 4는 RF8106 작제물(서열 번호 9)의 크기 배제 크로마토그래피 정제 결과를 보여준다. Superose 6 예비 SEC 컬럼 상의 대략 65 ml의 RF8106 나노입자의 보유 용량은 접힌 24-량체 나노입자와 일치하며, 이는 RF8106의 돌연변이가 나노입자 형성을 방해하지 않았음을 시사한다.
도 5a 및 5b는 감소되지 않은(5a) 및 감소된(5b) RF8106의 동적 광 산란(DLS) 분석을 보여준다. SEC 분석과 마찬가지로, DLS는 RSV Pre-F-NP가 예상되는, 접힌 나노입자를 형성했음을 입증한다. 감소된 데이터는 또한 입자가 감소에 의해 파괴되지 않았음을 보여주며, 이는 돌연변이에 의해 페리틴에 도입된 표면-노출된 시스테인에 대한 아쥬반트 접합 전에 수행되었다(도 6 참조).
도 6은 TLR9 작용제 CpG에 대한 접합이 있거나 없는 RF8106의 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔 분석을 보여준다. CpG-처리된 나노입자의 증가된 겔 이동은 CpG 아쥬반트가 RSV F 나노입자에 대략 40~50% 완성까지 첨가될 수 있음을 입증하였다. CpG 또는 다른 면역-자극 모이어티, 예컨대 TLR7/8 작용제 SM7/8의 접합은 융합전 특이적 항체 D25 및 AM14를 결합시킬 수 있는 입자의 능력을 억제하지 않았다.
도 7은 (RF8117, 서열 번호 17)이 있고 추가의 글리칸(RF8085, 서열 번호 1; 및 RF8113, 서열 번호 16)이 없는 RSV F를 포함하는 나노입자의 웨스턴 블롯을 보여준다. RF8113은 RF8106과 유사하지만, RF8106으로부터의 S111C 표면-노출된 시스테인(페리틴 잔기 넘버링 사용, 즉 서열 번호 208의 페리틴 서열 위치에 해당)은 K79C 표면-노출된 시스테인(또한, 페리틴 잔기 넘버링 사용)으로 대체되어, Pre-F 모이어티로부터 더 멀리 접합 부위를 배치하였다. RF8106과 마찬가지로, RF8113은 벤치 마크 분자 RF8085에 비해 개선된 발현을 유지한다. RF8117은 RF8113과 유사하지만, 도 2에서 확인된 3개의 글리코실화 돌연변이, 즉 E328N, S348N 및 R507N을 추가로 포함하여 발현을 추가로 개선하고, 도 1b에 기재된 바와 같이 융합전 F 및 융합후 F 형태 사이에 공유되는 비-중화 에피토프를 차단한다.
도 8은 잠재적인 트립신-유사 프로테아제 절단 부위에서 상이한 치환을 갖는 RSV F 작제물의 발현을 보여준다. RF8090의 CHO 세포주 발현(CHO 발현 벡터에 적응된 다른 DNA 서열을 갖는 RF8085와 동일한 단백질 서열)에서 폴리펩타이드가 F와 페리틴 모이어티 사이에 잘려서 발현이 감소되는 것이 관찰되었다. 생성된 F 모이어티의 질량에 의해 단백질 분해가 Pre-F-NP 작제물의 황소 개구리 링커 영역인 HRB 부근에서 발생할 수 있다고 추정되었다. 이 영역(잔기 약 450~550) 내의 라이신 및 아르기닌 잔기의 돌연변이를 조사하여 작제물의 잠재적인 트립신-유사 단백질 분해를 제거했다. RF8117(K498L 및 K508Q)에 비해 RF8122(서열 번호 18)의 돌연변이는 293개의 세포에서 개선된 발현을 제공했으며, CHO 세포에서 단백질 분해를 감소시키거나 제거할 수 있다. 대안적인 돌연변이는 발현을 제한하였다.
도 9a 및 9b. 안정적으로 형질감염된 CHO 세포에서 RF8090, RF8117 및 RF8140의 발현. RF8090(서열 번호 2)의 발현수준이 낮은 수준에서 관찰되었다. DS-CAV1의 이황화물을 대체하기 위한 돌연변이 및 잠재적인 트립신 절단 부위를 제거하기 위한 F 모이어티와 페리틴 모이어티 사이의 링커에 대한 돌연변이를 작제물 RF8117(서열 번호 17) 및 RF8140(서열 번호 23)에 상기 기재된 바와 같이 도입하였으며, 이는 안정적으로 발현되는 CHO 세포로 클로닝되었다. (도 9a) 3개 및 4개의 CHO 세포 풀로부터 CHO 컨디셔닝된 배지로의 RF8117 및 RF8140의 발현을 각각 D25-웨스턴 블롯 분석에 의해 CHO 컨디셔닝된 배지에서의 RF8090의 수율과 비교하였다. RF8117을 위한 3개의 CHO 풀과 RF8140을 위한 4개의 CHO 풀 모두 RF8090보다 높은 수율로 발현한다. (도 9b) Octet에 의한 D25 융합전 F-특이적 항체에 의해 측정된 RF8117의 CHO 컨디셔닝된 배지로의 발현. 왼쪽 패널은 표준 곡선을 제공하는 단백질 A 팁에서 D25에 대한 결합 반응에 대해 플롯된 공지된 농도의 293개의 배지로부터 정제된 RF8140의 반응을 보여준다. 개별 점은 RF8117 CHO 컨디셔닝된 배지로부터의 D25 결합에 대한 반응을 나타낸다. 오른쪽 패널은 D25 결합 반응을 기반으로 CHO 풀 컨디셔닝된 배지에서 RF8117 또는 RF8140의 계산된 수율을 보여준다. D25 및 AM14 결합에 의해 측정된 바와 같이 RF8117 및 RF8140은 모두 배지에서 발현되었으며, 293개의 세포와 마찬가지로 CHO 세포가 융합전 F 삼량체 구조를 유지하는 접힌 방식으로 Pre-F-NP를 발현할 수 있음을 입증했다.
도 10a 및 10b. Pre-F-NP RF8117에 대한 중화 항체 반응. (도 10a) DS-CAV1(Pre-F 삼량체, 서열 번호 25), 융합후 F 삼량체(Post-F 삼량체; 서열 번호 24) 또는 조작된 글리코실화를 갖는 Pre-F-NP(Pre-F-NP; RF8117, 서열 번호 17)의 고용량(1 μg) 및 저용량(0.1 μg) 면역화에 의해 유도된 RSV 중화 역가의 비교는 VERO 세포 분석에 의해 측정되었다. 모든 RSV 폴리펩타이드는 본원에 기재된 바와 같이 아쥬반트 AF03과 함께 투여되었다. 전체적으로, 달리 명시되지 않는 한, AF03은 RSV 폴리펩타이드 또는 나노입자와 함께 투여되었지만, 이에 접합되지는 않았다. RSV 폴리펩타이드 및 용량은 x-축 아래에 표지되어 있다. Pre-F-NP 면역화와 관련된 고용량 반응의 통계적 분석이 표시된다. (도 10b) VERO 세포 분석에 의해 측정된 바와 같은, DS-CAV1 (Pre-F 삼량체), 조작된 글리코실화가 없는 Pre-F-NP(RF8113, 서열 번호 16) 또는 조작된 글리코실화를 갖는 Pre-F-NP(RF8117, 서열 번호 17)에 의한 고용량(1 μg) 및 저용량(0.1 μg) 면역화에 의해 유도된 RSV 중화 역가의 비교. 모든 RSV 폴리펩타이드는 본원에 기재된 바와 같이 아쥬반트 AF03(어떤 폴리펩타이드 또는 나노입자에도 접합되지 않음)와 함께 투여되었다. RSV 폴리펩타이드 및 용량은 x-축 아래에 표지되어 있다.
도 11a~11d. 마우스 또는 비-인간 영장류 모델에서 융합후 F 삼량체(서열 번호 24) 또는 Pre-F-NP(RF8140 서열 번호 23)에 의한 면역화에 의해 유도된 RSV 융합전 F 삼량체(DS-CAV1) 결합 항체 및 RSV 중화 항체의 비교. (도 11a) 융합후 F와 Pre-F-NP(RF8140, 서열 번호 23) 사이의 면역화로부터 마우스에서 유도된 융합전 F 삼량체 결합 항체 반응이 비교된다. (도 11b) 융합후 F와 Pre-F-NP(RF8140, 서열 번호 23)에 의한 면역화로부터 마우스에서 유도된 중화 항체 반응이 도시된다. (도 11c) 아쥬반트(AF03, 아래 괄호안에 표시됨)와 함께 또는 아쥬반트 없이 Pre-F-NP에 의해 비-인간 영장류에서 유도된 융합전 F 삼량체 결합 항체 반응이 비교된다. (도 11d) AF03 아쥬반트와 함께 또는 아쥬반트 없이 Pre-F-NP (RF8140, 서열 번호 23)에 의한 면역화에 의해 유도된 RSV 중화 역가가 비교된다. 마우스에서, Pre-F-NP는 융합후 삼량체에 비해 더 높은 융합전 F 결합 반응 및 RSV 중화 반응을 유도한다. 비-인간 영장류에서, Pre-F-NP는 강력한 중화 반응을 이끌어낸다.
도 12a 및 12b는 조작된 글리코실화 부위가 융합후 에피토프를 차단함을 보여준다. (도 12a) Octet에 의해 측정된 바와 같이 고용량(1 μg) 및 저용량(0.1 μg)의 조작된 글리코실화가 없는 Pre-F-NP(RF8113) 또는 조작된 글리코실화가 있는 Pre-F-NP(조작된 Gly 입자)에 의한 면역화에 의해 유도된 융합전 F(DS-CAV1)에 대한 항체 반응이 도시되어 있다. (도 12b) Octet에 의해 측정된 바와 같이 고용량(1 μg) 및 저용량(0.1 μg)의 조작된 글리코실화가 없는 Pre-F-NP(RF8113) 또는 조작된 글리코실화가 있는 Pre-F-NP(RF8117)에 의한 면역화에 의해 유도된 융합후 삼량체에 대한 항체 반응이 도시된다. 상기와 같이, 모든 RSV 폴리펩타이드는 면역화 동안 AF03과 혼합되었다. RF8113 및 RF8117 모두 융합전 F에 대한 강력한 항체 반응을 유도하는 반면, RF8117에 의해 유도되는 융합후 F 항체 반응은 크게 감소된다. 이는 공유된 융합전 및 융합후 에피토프에 대한 조작된 글리칸 맵핑 때문이다(도 2b).
도 13a~13c는 조작된 글리코실화 부위에 의한 비-중화 에피토프의 차단을 보여준다. (도 13a) VERO 세포 분석에 의해 측정된 바와 같이 마우스 연구에서 0.1 μg 용량으로 야생형 글리코실화 부위를 갖는 Pre-F NP("Wt 글리칸 입자"; RF8113, 서열 번호 16) 대 추가의 조작된 글리코실화 부위를 갖는 Pre-F NP("+글리칸 입자"; RF8117, 서열 번호 17)에 의한 면역화에 의해 유도된 RSV 중화 역가의 비교. (도 13b) 마우스 연구에서 0.1 μg 용량으로 Wt 글리칸 입자(RF8113, 서열 번호 16) 대 +글리칸 입자(RF8117, 서열 번호 17)에 의한 면역화에 의해 유도된 RSV 융합후 F 삼량체-결합 항체 반응의 비교. (도 13c) 패널 A 및 B로부터의 측정된 중화 역가 대 결합 역가의 비율은 조작된 글리칸이 기능적 중화 항체 반응을 감소시키지 않았지만 공유된 융합전/융합후 에피토프로 유도된 비-중화 항체를 감소시켜서(도 1b), 중화/결합 항체 비율을 개선시켰음을 입증한다.
도 14a~14d. 페리틴 나노입자에 접합된 RSV G 중앙 도메인 펩타이드(Gcc)의 특징화. (도 14a) Gcc-NP 항원을 형성하는, 페리틴 나노입자에 대한 RSV G 중앙 도메인(서열 번호 29)의 클릭-접합을 나타내는 쿠마시-염색된 SDS-PGE 겔. (도 14b) Gcc-NP의 구조 모델. (도 14c) 마우스 연구에서 Gcc 펩타이드 단독(Gcc 펩타이드, 서열 번호 29) 대 나노입자(Gcc-NP)에 접합된 Gcc 펩타이드에 의한 면역화에 의해 유도된 Gcc-결합 항체 반응의 비교. 순수 혈청으로부터의 대표적인 반응은 흰색 박스로 표시되는 반면, 제2차 면역화후 반응은 연회색 박스로 표시되고, 제3차 면역화후 반응은 진회색 박스로 표시된다. (도 14d) HAE 세포 분석에 의해 측정된 바와 같은, 3차 주사 후 마우스 연구에서 Gcc 펩타이드(서열 번호 29) 대 Gcc-NP에 의한 면역화에 의해 유도된 RSV 중화 역가의 비교. 순수 동물의 혈청 및 Gcc 펩타이드로 면역화된 동물의 혈청을 풀링하고 역가를 막대로 표시한다.
도 15a~15c. RSV Pre-F-NP(RF8140) 및 Gcc-NP의 공동-투여는 중화 반응을 유도한다. 마우스가 Pre-F-NP(RF8140) 단독, Gcc-NP 단독, 또는 항원당 1 μg 용량으로 조합된 Pre-F-NP 및 Gcc-NP로 면역화되었다. 모든 면역화는 상기와 같이 AF03으로 보조되었다. (도 15a) RF8140 단독(Pre-F-NP) 또는 RF8140 및 Gcc-NP(Pre-F-NP + Gcc-NP)에 의한 마우스의 면역화는 융합전 F 삼량체에 결합하는 항체를 유도하였다. (도 15b) Gcc-NP 단독(Gcc-NP) 또는 RF8140 및 Gcc-NP(Pre-F-NO + Gcc-NP)에 의한 마우스의 면역화는 Gcc 펩타이드에 결합하는 항체를 유도하였다. (도 15c) Pre-F-NP 단독, Gcc-NP 단독, 또는 Pre-F-NP 및 Gcc-NP의 공동-투여로 면역화된 동물은 HAE 중화 분석에 의해 측정된 바와 같이 제2차 및 제3차 면역화후 중화 반응을 유도한다. Pre-F-NP + Gcc-NP의 공동-투여는 Pre-F-NP만으로 면역화되어 유도된 것보다 우수한 중화 반응을 유도하였다.
도 16a 및 16b. Pre-F-NP 및 Gcc-NP의 공동-투여는 융합전 F 삼량체 또는 Gcc-나노입자에 결합하는 항체의 유도를 방해하지 않는다. F-민감성 VERO 세포 분석에 의해 측정된 중화 역가는 도 16a에서 왼쪽에 있고, F- 및 G-민감성 HAE 분석에 의해 측정된 중화 역가는 도 16b에서 오른쪽에 도시되어 있다. 동물 면역화는 도 15에서와 같았다. 면역화에 사용된 RSV 폴리펩타이드는 수평 축 아래에 있다. 검정색 막대는 도 15에 기재된 면역화 그룹으로부터 풀링된 혈청을 나타내며, 유사하게 표지된다. 순수 동물로부터의 혈청도 또한 검정색 막대로 표시되며, 비교를 위해 표지되어 있다. 융합전 F 삼량체로 고갈된 혈청은 해당하는 검정색 막대의 바로 오른쪽에 백색으로 표시된다. G 엑토도메인으로 고갈된 혈청은, 해당하는 검정색 막대의 바로 오른쪽에 사선 줄무늬 막대로 표시된다. 융합전 F 삼량체로 고갈된 후 G 엑토도메인으로 고갈된 혈청은 세로 줄무늬 막대로 표시된다. (도 16a) RF8140 면역화 및 RF8140 + Gcc-NP 공동-투여로부터의 혈청에 대한 VERO 세포 분석에서 중화 역가가 관찰되었지만, Gcc-NP 면역화 단독으로부터의 혈청 또는 순수 혈청에 대한 것에서는 중화 역가가 관찰되지 않았다. 융합전 F 삼량체에 의한 RF8140 또는 RF8140+Gcc-NP 그룹으로부터의 혈청의 고갈은 측정가능한 중화 역가를 감소시켰다. (도 16b) 중화 역가는 RF8140, Gcc-NP, 또는 Gcc-NP와 공동-투여된 RF8140으로 면역화된 동물로부터의 혈청에 대한 HAE 세포 분석에서 관찰되었다. 순수 동물의 혈청은 중화 반응을 보이지 않았다. 융합전 F 삼량체로 고갈된 RF8140으로 면역화된 동물로부터의 혈청은 측정가능한 중화 역가가 감소한다. G 엑토도메인으로 고갈된 Gcc-NP로 면역화된 동물로부터의 혈청은 측정가능한 중화 역가가 감소한다. RF8140 및 Gcc-NP의 공동-투여로 면역화된 동물로부터의 혈청은 융합전 F 삼량체 단독으로 고갈될 때는 측정가능한 중화 역가가 감소되지 않지만, 융합전 F 삼량체 및 G 엑토도메인 둘다로 고갈될때는 측정가능한 중화 역가가 감소된다. 이와 함께, 이러한 데이터는 Pre-F-NP 및 Gcc-NP 와의 공동-투여가 융합전 F 또는 G에 대한 중화 항체를 유도하는 항원의 각각의 능력을 방해하지 않음을 시사한다.
도 17a 및 17b. RF8117 또는 RF8140을 AF03, SPA09 또는 Alum으로 보조하면, 보조되지 않은 RF8117에 비해 마우스에서 우수한 중화 반응을 유도한다. (도 17a) VERO 세포 분석에 의해 측정된 바와 같이 보조되지 않은(아쥬반트 없음), Alum으로 보조된, 또는 AF03으로 보조된 RF8117로 면역화된 마우스로부터의 혈청에 대한 중화 역가가 도시된다. (도 17b) VERO 세포 분석에 의해 측정된 바와 같이 보조되지 않은 RF8117(아쥬반트 없음), SPA09로 보조된 RF8117, 또는 AF03으로 보조된 RF8140으로 면역화된 마우스로부터의 혈청에 대한 중화 역가가 도시된다. RF8117 또는 RF8140의 모든 경우에, 순수 마우스에서 보조된 그룹이 보조되지 않은 그룹보다 더 높은 중화 역가를 유도하였다.
도 18a 및 18b. RF8140을 AF03 또는 SPA09로 보조하면, 보조되지 않은 RF8140 면역화에 비해 비-인간 영장류(NHP)에서 우수한 중화 반응을 유도한다. (도 18a) ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 보조되지 않은(아쥬반트 없음), AF03으로 보조된 또는 SPA09로 보조된 RF8140(아래에 표시된 바와 같이 2회 용량의 SPA09가 사용됨)으로 면역화한 후 NHP 혈청에서 측정된 융합전 F 삼량체 반응. 모든 시점에서 AF03 또는 SPA09로 보조하면, 우수한 중화 반응이 유도된다. (도 18b) VERO 세포 분석에 의해 측정된 바와 같이 보조되지 않은(아쥬반트 없음), AF03로 보조된, SPA09로 보조된(아래에 표시된 바와 같이 2회 용량의 SPA09가 사용됨) RF8140으로 면역화된 NHP로부터의 혈청에 대한 중화 역가. 모든 경우에, RF8140을 아쥬반트로 면역화하면 모든 시점에서 보조되지 않은 그룹보다 더 높은 중화 역가를 유도한다.
도 19a 및 19b. TLR7/8 작용제 SM7/8 또는 TLR9 작용제 CpG에 대한 RF8140의 접합은 보조되지 않은 RF8140 단독에 비해 우수한 융합전 F-결합 역가를 유도한다. (도 19a) 순수 마우스, 보조되지 않은 RF8140으로 면역화된 마우스, SM7/8 아쥬반트와 접합된 RF8140, 130 ng의 SM7/8로 보조된 RF8140 또는 20 μg SM7/8로 보조된 RF8140으로 면역화된 마우스로부터의 혈청에서 측정된 융합전 F 삼량체-결합 반응이 도시된다. SM7/8에 접합된 RF8140은 보조되지 않은 또는 SM7/8 보조된 그룹들보다 높은 융합전 F 삼량체-결합 역가를 유도한다. (도 19b) 순수 마우스, 보조되지 않은 RF8140으로 면역화된 마우스, CpG 아쥬반트와 접합된 RF8140, 680 ng의 CpG로 보조된 RF8140 또는 20 μg SM7/8로 보조된 RF8140으로 면역화된 마우스로부터의 혈청에서 측정된 융합전 F 삼량체-결합 반응이 도시된다. SM7/8에 접합된 RF8140은 보조되지 않은 또는 SM7/8 보조된 그룹들보다 높은 융합전 F 삼량체-결합 역가를 유도한다.
도 20a~20g. F-서브유닛 백신 후보는 MIMIC 시스템에서 전-F 지정 중화 항체 및 Th1 CD4⁺T 세포 반응을 유도한다. (도 20a) MIMIC 시스템에서 항-pre-F 역가는 10 ng/ml의 전-F NP (그룹당 n = 48~49 공여자)로 F의 몰당량 농도에서 각 Ag로 프라이밍한 후 AF에 의해 측정되었다. (도 20b) 미세중화 역가가 측정되고 국제 단위/ml(IU/ml)로 표시된다. (도 20c) 항-융합전(pre-F)와 융합후(post-F) 사이의 비율이 1 초과인 것은 더 높은 수준의 융합전-결합 항체 대 융합후-결합 항체를 나타내는 반면, 1 미만의 비율값은 융합후에 대한 더 큰 Ab 반응을 나타낸다. (도 20d) F 단백질 로딩된 표적 세포로 재자극된 활성화된 CD154⁺/CD4⁺ T 세포에서 TNFα의 생산은 유세포분석을 사용하여 측정되었다, n = 48. 통계적 유의도는 Tukey-Kramer-HSD 다중 비교를 통해 결정되었다. (도 20e) 인간 대상체의 기존 항체 역가(혈청상태)는 MIMIC 시스템에서 RSV 면역 반응의 크기와 밀접한 관련이 있다. 각 공여자로부터의 혈청내 항-융합전 IgG 대 총 항-융합전 IgG 반응을 보여주는 선형 회귀 플롯은 소프트웨어 또는 알고리즘에 의해 생성되었고, 공통 기울기에 대한 p 값은 통계 방법(n= 50)에 의해 분석되었다. Y-축은 RSV로 프라이밍한 후 얻은 항-융합전 IgG 수준을 나타낸다. (도 20f) 도 20e에서와 같이, F 서브유닛 백신 후보로 프라이밍한 후, 각 공여자로부터의 혈청내 항-융합전 IgG 대 총 항-융합전 IgG를 보여주는 선형 회귀 플롯(사각형은 융합후, 원은 융합전-NP, 및 다이아몬드는 DC-Cav1임). 항-융합전 IgG 기존 순환 역가의 범위는 199,800 내지 3,037,600,000이었다. 각 점은 각 개별 공여자의 IgG 값을 나타낸다. (도 20g) Gcc 펩타이드 단독(Gcc 펩타이드) 대 인간 B-세포내 나노입자에 접합된 Gcc 펩타이드(Gcc-NP)에 의한 치료에 의해 유도된 Gcc-결합 항체 반응의 비교. 상기와 같은 비교를 위한 치료 그룹은 나타내지 않는다.
도 21a~20c. 저용량(0.5 μg)의 RSV Gcc-페리틴 나노입자("Gcc-NP")에 의해 유도된 중화 항체 역가. 음성 및 양성 대조군으로서 순수하고 과다면역된 혈청을 사용한, 제2 면역화 후 2주 후(2wp2)(도 21a) 또는 제3 면역화 후 2주 후(2wp3)(도 21b)에 취한 혈청으로부터, (AF03으로 제형화된) RSV A2 Gcc 서열을 함유하는 RSV Gcc-NP에 의한 면역화로부터 유도된 RSV A 균주 HAE 중화 역가가 도시되어 있다. 제3 면역화 후 2주 후(2wp3)(도 21c)에 취한 혈청으로부터, (AF03으로 제형화된) RSV A2 Gcc 서열을 함유하는 RSV Gcc-NP에 의한 면역화로부터 유도된 RSV B 균주 HAE 중화 역가도 또한 도시되어 있다.
도 22a 및 22b. RSV Gcc-NP에 의해 유도된 RSV A2 균주 항원-결합 항체 반응. (도 22a) 고용량(5 μg)의 RSV Gcc-NP에 의해 유도된 제2 주사후 2주(연회색 박스) 및 제3 주사후 2주(진회색 박스)에 측정된 Gcc A2 균주에 유도된 Gcc-결합 항체 반응. 순수 마우스 혈청 반응은 음성 대조군으로 도시된다. (도 22b) 저용량(0.5 μg)의 RSV Gcc-NP에 의해 유도된 제2 주사후 2주(연회색 박스) 및 제3 주사후 2주(진회색 박스)에 측정된 Gcc A2 균주에 유도된 Gcc-결합 항체 반응.
도 23a 및 23b. RSV Gcc-NP에 의해 유도된 RSV B1 균주 항원-결합 항체 반응. (도 23a) 고용량(5 μg)의 RSV Gcc-NP에 의해 유도된 제2 주사후 2주(연회색 박스) 및 제3 주사후 2주(진회색 박스)에 측정된 Gcc B1 균주에 유도된 Gcc-결합 항체 반응. 순수 마우스 혈청 반응은 음성 대조군으로 도시된다. (도 23b) 저용량(0.5 μg)의 RSV Gcc-NP에 의해 유도된 제2 주사후 2주(연회색 박스) 및 제3 주사후 2주(진회색 박스)에 측정된 Gcc B1 균주에 유도된 Gcc-결합 항체 반응.

단독으로 투여되거나, 별도의 분자로서, 및/또는 나노입자(예를 들어, 페리틴 입자 또는 루마진 신타아제 입자)의 일부로서, 아쥬반트와 함께 투여될 때 항원성일 수 있고, 자가-보조될 수 있는 RSV 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 항원성 RSV 폴리펩타이드는 RSV F 폴리펩타이드 및 페리틴, 및/또는 융합전 RSV F와 융합후 RSV F 사이에 공유되는 RSV 폴리펩타이드의 에피토프가 차단되는 RSV F 폴리펩타이드를 포함한다. RSV F의 융합전 형태에 대한 항체의 생산을 지시하는 RSV F 폴리펩타이드는 융합후 RSV F에 비해 융합전 RSV F에 대한 더 높은 생체내 항체 반응을 유도하였다. 또한, RSV G의 전부 또는 일부를 포함하는 RSV G 폴리펩타이드가 기재되어 있으며, 페리틴을 더 포함할 수 있다. RSV G 및 RSV F 단백질은 RSV를 숙주 세포에 부착하고 융합하는 데 필수적이다.

RSV F는 융합전 및 융합후 형태의 두 가지 형태 상태로 존재한다. 원래의 융합전 상태에서, RSV F는 3개의 프로토머로 구성된 삼량체이다. 따라서, 융합전 형태의 RSV F 폴리펩타이드를 사용한 면역화는 개선된 특성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 융합전 입체 형태의 RSV F에 대한 면역을 유도하도록 설계된다. RSV G는 RSV를 인간 기도 상피 세포와 연관시키는 역할을 하는 부착 단백질이다.

A. 정의

본원에 사용된 "항원성 부위 0" 또는 "부위 0 에피토프"는 야생형 RSV F의 아미노산 잔기 62~69 및 196~209(서열 번호 26)를 포함하는, 융합전 RSV F 삼량체의 정점에 위치한 부위를 지칭한다. 부위 0 에피토프는 융합전 RSV F, 예컨대 D25 및 AM14에 대한 특이성을 갖는 항체에 대한 결합 부위이며, 부위 0 에피토프에 대한 항체의 결합은 RSV의 세포-표면 부착을 차단한다(문헌 [McLellan et al., Science 340(6136):1113-1117 (2013)] 참고).

본원에 사용된 "항원 안정성"은 시간에 따른 또는 용액에서의 항원의 안정성을 지칭한다.

본원에 사용된 "공동 충전 치환(cavity filling substitution)"은 융합전 RSV F 삼량체에 존재하는 공동을 충전하기 위한 조작된 소수성 치환을 지칭한다.

"F 단백질" 또는 "RSV F 단백질"은 바이러스 진입 동안 바이러스 외피와 숙주 세포막의 융합을 유도하는 역할을 하는 RSV의 단백질을 지칭한다.

"RSV F 폴리펩타이드" 또는 "F 폴리펩타이드"는 F 단백질의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

본원에 사용된 "글리칸 첨가"는 야생형 RSV F에 존재하지 않는 글리코실화 부위를 도입하는 돌연변이의 추가를 지칭하며, 이는 작제물 발현을 증가시키거나, 작제물 안정성을 증가시키거나, 융합전 및 융합후 형태간에 공유되는 에피토프를 차단하도록 조작될 수 있다. 글리칸 첨가를 포함하는 변형된 단백질은 더 많은 글리코실화를 가지므로 더 높은 분자량을 가질 것이다. 글리칸 첨가는 RSV F 폴리펩타이드가 RSV F의 융합후 형태에 대한 항체를 유도하는 정도를 감소시킬 수 있다.

본원에 사용된 "G 단백질" 또는 "RSV G 단백질"은 RSV를 인간 기도 상피 세포와 연합시키는 역할을 하는 부착 단백질을 지칭한다. 예시적인 야생형 RSV G 아미노산 서열은 서열 번호 27로서 제공된다. RSV G 단백질은 세포 외에 존재하는 엑토도메인(RSV G의 대략 아미노산 66~297(서열 번호 27))을 포함한다. RSV G의 엑토도메인 내에는 중앙 보존 영역(Gcc 또는 CCR, 서열 번호 27의 대략 아미노산 151~193)이 있다. RSV G의 CCR은 CX3C 모티프를 포함한다. CX3C 모티프는 CX3CR1 수용체에 대한 G 단백질의 결합을 매개한다.

본원에 사용된 "나선 PRO 캡핑" 또는 "나선 프롤린 캡핑"은 나선 형성을 안정화할 수 있는, 나선 캡이 프롤린을 포함하는 경우를 지칭한다.

본원에 사용된 "프로토머내 안정화 치환"은 RSV F 삼량체의 프로토머 내 상호작용을 안정화함으로써 융합전 형태를 안정화시키는 RSV F의 아미노산 치환을 기술한다.

본원에 사용된 "프로토머간 안정화 치환"은 RSV F 삼량체의 프로토머가 서로 간의 상호작용을 안정화함으로써 융합전 형태를 안정화시키는 RSV F의 아미노산 치환을 기술한다.

본원에 사용된 "프로테아제 절단"은 폴리펩타이드 서열 내 민감성 잔기(예를 들어, 라이신 또는 아르기닌)의 단백질 분해(종종 당 업계에서 "클리핑"이라고도 함)를 지칭한다.

RSV F와 관련하여 본원에 사용된 "융합후"는 바이러스 및 세포막의 병합 후에 발생하는 RSV F의 안정한 형태를 지칭한다.

RSV F와 관련하여 본원에 사용된 "융합전"은 바이러스-세포 상호작용 전에 채택된 RSV F의 입체 형태를 지칭한다.

본원에 사용된 "프로토머"는 올리고머 단백질의 구조 단위를 지칭한다. RSV F의 경우, RSV F 삼량체의 개별 단위는 프로토머이다.

본원에 사용된 "페리틴" 또는 "페리틴 단백질"은 예를 들어 세포내에 또는 조직 내에 철을 저장하거나 혈류에서 철을 운반하는 역할을 하는, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴(서열 번호 208 또는 209) 또는 본원에 논의된 또 다른 페리틴, 예컨대 파이로코쿠스 푸리오수스(P. furiosus) 페리틴, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 페리틴, 또는 인간 페리틴에 대하여 검출가능한 서열 동일성을 갖는 단백질을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄(예를 들어, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 페리틴 및 인간 페리틴)로 알려진 2개의 폴리펩타이드 사슬로서 발생하는 것들을 포함하는, 상기 예시적인 페리틴들이 하기에 상세히 논의된다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 본원에, 예를 들어 표 1(서열표)에 개시된 페리틴 서열에 대하여 적어도 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 페리틴은 전장 자연-발생 서열의 단편일 수 있다.

본원에 사용된 "야생형 페리틴"은 서열이 자연-발생 서열로 구성된 페리틴을 지칭한다. 페리틴은 또한 전장 페리틴 또는, 야생형 페리틴으로부터의 아미노산 서열과 하나 이상 차이를 갖는 페리틴의 단편을 포함한다.

본원에 사용된 "페리틴 단량체"는 다른 페리틴 분자들과 조립되지 않은 단일 페리틴 분자(또는 적용가능한 경우, 단일 페리틴 중쇄 또는 경쇄)를 지칭한다. "페리틴 다량체"는 다수의 연합 페리틴 단량체들을 포함한다. "페리틴 단백질"은 단량체 페리틴 및 다량체 페리틴을 포함한다.

본원에 사용된 "페리틴 입자"는 구형 형태로 자가-조립된 페리틴을 지칭한다. 페리틴 입자는 때때로 "페리틴 나노입자" 또는 간단히 "나노입자"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 페리틴 입자는 24개의 페리틴 단량체(또는, 적용가능한 경우, 24개의 총 중쇄 및 경쇄)를 포함한다.

본원에 사용된 "하이브리드 페리틴"은 황소개구리 페리틴의 아미노 말단 연장을 갖는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴을 포함하는 페리틴을 지칭한다. 황소개구리 페리틴의 아미노 말단 연장으로 사용되는 예시적인 서열은 서열 번호 217로 나타난다. 하이브리드 페리틴에서, 황소개구리 페리틴의 아미노 말단 연장은 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴에 융합되어, 면역-자극 모이어티 부착 부위가 페리틴 입자 표면에 고르게 분포되도록 할 수 있다. 본원에 사용된 "황소개구리 링커"는 서열 번호 217의 서열을 포함하는 링커이다. 하이브리드 페리틴은 또한, 종종 "bfpFerr" 또는 "bfp 페리틴"으로 지칭된다. 황소개구리 서열을 포함하는 임의의 작제물은, 황소개구리 서열없이, 예를 들어, 예컨대, 링커없이 또는 대안적인 링커와 함께 제공될 수 있다. 예시적인 황소개구리 링커 서열이 표 1에 제공되어 있다. 표 1이 황소개구리 링커를 나타내는 경우, 동일한 작제물은 링커없이 또는 대체 링커를 사용하여 제조될 수 있다.

본원에 사용된 "N-글리칸"은 단백질의 N(아스파라긴) 잔기의 아미드 질소에서 단백질에 부착된 사카라이드 사슬을 지칭한다. 이와 같이, N-글리칸은 N-글리코실화 과정에 의해 형성된다. 이 글리칸은 폴리사카라이드일 수 있다.

본원에 사용된 "글리코실화"는 단백질에 사카라이드 단위를 첨가하는 것을 지칭한다.

본원에 사용된 "면역 반응"은 항원 또는 백신과 같은 자극제에 대한 면역계 세포, 예컨대 B 세포, T 세포, 수지상 세포, 대식세포 또는 다형핵구의 반응을 지칭한다. 면역 반응은 예를 들어 인터페론 또는 사이토카인을 분비하는 상피 세포를 포함하여, 숙주 방어 반응에 관련된 신체의 임의의 세포를 포함할 수 있다. 면역 반응은 타고난 및/또는 적응성 면역 반응을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 본원에 사용된 "보호 면역 반응"은 감염으로부터 대상체를 보호하는 (예를 들어, 감염을 예방하거나 감염과 관련된 질환의 발병을 예방하는) 면역 반응을 지칭한다. 면역 반응을 측정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 림프구(예컨대, B 또는 T 세포)의 증식 및/또는 활성, 사이토카인 또는 케모카인 분비, 염증, 항체 생산 등을 측정하는 것을 포함한다. "항체 반응"은 항체가 생성되는 면역 반응이다.

본원에 사용된 "항원"은 (예를 들어, MHC 분자에 의해 제시될 때)면역 반응을 유도하는 제제 및/또는 T 세포 수용체에 의해 결합되거나, 또는 유기체에 노출되거나 투여될 때 (예를 들어, B 세포에 의해 생성되는) 항체에 결합되는 제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항원은 유기체에서 체액 반응(예를 들어, 항원-특이적 항체의 생성 포함)을 유도한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서, 항원은 유기체에서 (예를 들어, 수용체가 항원과 특이적으로 상호작용하는 T-세포를 포함하는) 세포 반응을 유도한다. 특정 항원은 표적 유기체(예를 들어, 마우스, 토끼, 영장류, 인간)의 하나 또는 여러 구성원에서 면역 반응을 유도할 수 있지만, 표적 유기체 종의 모든 구성원에서 그렇지는 않다. 일부 실시형태에서, 항원은 표적 유기체 종의 구성원의 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%에서 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 항원은 항체 및/또는 T 세포 수용체에 결합하고, 유기체에서 특정 생리학적 반응을 유도할 수 있거나 유도하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 항원은 이러한 상호작용이 생체내에서 발생하는지 여부에 관계없이 시험관내 항체 및/또는 T 세포 수용체에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 이종성 면역원에 의해 유도된 것을 포함하여, 특정 체액성 또는 세포성 면역의 생성물과 반응한다. 항원은 본원에 기재된 페리틴(예를 들어, 하나 이상의 돌연변이 포함)을 포함하는 항원성 페리틴 단백질 및 비-페리틴 폴리펩타이드(예를 들어, RSV 폴리펩타이드)를 포함한다.

본원에 사용된 "면역-자극 모이어티"는 페리틴 또는 항원성 페리틴 폴리펩타이드에 공유결합되고, (단독으로 또는 페리틴 또는 항원성 페리틴 폴리펩타이드에 부착될 때) 면역계의 구성요소를 활성화할 수 있는 모이어티를 지칭한다. 예시적인 면역-자극 모이어티는 톨-유사 수용체(TLR)의 작용제, 예를 들어, TLR 4, 7, 8, 또는 9를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 아쥬반트이다.

본원에 사용된 "아쥬반트"는 항원에 대한 면역 반응을 비특이적으로 향상시키는 물질 또는 비히클을 지칭한다. 아쥬반트는 항원이 흡착된 미네랄(예를 들어, 명반, 수산화 알루미늄 또는 인산염)의 현탁액; 항원 용액이 미네랄 오일 또는 물에 유화된 유중수형 또는 수중유형 에멀젼(예를 들어, 프로인트(Freund)의 불완전 아쥬반트)를 제한없이 포함할 수 있다. 때때로 사멸된 마이코박테리아가 포함되어(예를 들어, 프로인트(Freund)의 완전 아쥬반트), 항원성을 더욱 향상시킨다. 면역-자극 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, CpG 모티프)도 아쥬반트로서 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,194,388호; 제6,207,646호; 제6,214,806호; 제6,218,371호; 제6,239,116호; 제6,339,068호; 제6,406,705호; 및 제6,429,199호 참고). 아쥬반트는 또한 톨-유사 수용체(TLR) 작용제 및 공동자극 분자와 같은 생물학적 분자를 포함할 수 있다. 아쥬반트는 조성물에서 별도의 분자로 투여되거나 페리틴 또는 항원성 페리틴 폴리펩타이드에 공유 결합(접합)될 수 있다.

"항원성 RSV 폴리펩타이드"는 분자가 RSV에 대해 항원성인 충분한 길이의 RSV 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 항원성은 페리틴 및/또는 면역-자극 모이어티와 같은 이종 서열을 더 포함하는 작제물의 일부로서 RSV 서열의 특징일 수 있다. 즉, RSV 서열이 이종성 서열을 더 포함하는 작제물의 일부인 경우, 이종성 서열이 없는 RSV 서열이 항원으로 작용할 수 있는지 여부에 관계없이 작제물이 항-RSV 항체를 생성하는 항원으로 작용할 수 있는 것으로 충분하다.

"항원성 페리틴 폴리펩타이드" 및 "항원성 페리틴 단백질"은 분자가 비-페리틴 폴리펩타이드에 대해 항원성인 충분한 길이의 페리틴 및 비-페리틴 폴리펩타이드(예를 들어, RSV 폴리펩타이드)를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 항원성 페리틴 폴리펩타이드는 면역-자극 모이어티를 더 포함할 수 있다. 항원성은 더 큰 작제물의 일부로서 비-페리틴 서열의 특징일 수 있다. 즉, 페리틴이 없는 비-페리틴 폴리펩타이드 (및 적용가능한 경우 면역-자극 모이어티)가 항원으로 작용할 수 있는지 여부에 관계없이, 상기 작제물이 비-페리틴 폴리펩타이드에 대한 항원으로 작용할 수 있으면 충분하다. 일부 실시형태에서, 비-페리틴 폴리펩타이드는 RSV 폴리펩타이드이며, 이 경우 항원성 페리틴 폴리펩타이드는 또한 "항원성 RSV 폴리펩타이드"이다. 그러나 명확하게 하기 위해, 항원성 RSV 폴리펩타이드는 페리틴을 포함할 필요가 없다. "항원성 폴리펩타이드"는 본원에서 항원성 페리틴 폴리펩타이드 및 항원성 RSV 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두인 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 사용된다.

본원에 사용된 "자가-보조"는 페리틴 및 면역-자극 모이어티가 동일한 분자 개체에 존재하도록 페리틴에 직접 접합된 페리틴 및 면역-자극 모이어티를 포함하는 조성물 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 비-페리틴 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 페리틴 폴리펩타이드는 면역-자극 모이어티에 접합되어, 자가-보조 폴리펩타이드를 생성할 수 있다.

본원에 사용된 "표면-노출된" 아미노산은 적용가능한 경우 단백질이 다량체화후 그의 원래의 3차원 형태로 있을 때 용매 분자에 의해 접촉될 수 있는 측쇄를 가진 단백질(예를 들어, 페리틴)의 아미노산 잔기를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 24-량체를 형성하는 페리틴의 경우, 표면-노출된 아미노산 잔기는 페리틴이 24-량체로서, 예를 들어 페리틴 다량체 또는 페리틴 입자로서 조립될 때 측쇄가 용매에 의해 접촉될 수 있는 잔기이다.

본원에 사용된 "대상체"는 동물계의 모든 구성원을 지칭한다. 일부 실시형태에서, "대상체"는 인간을 지칭한다. 일부 실시형태에서, "대상체"는 비-인간 동물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 새, 파충류, 양서류, 어류, 곤충 및/또는 벌레를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 비-인간 대상체는 포유동물(예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 형질전환 동물, 유전적으로-조작된 동물 및/또는 클론일 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 대상체는 성인, 청소년 또는 유아이다. 일부 실시형태에서, 용어들 "개체" 또는 "환자"가 사용되고, "대상체"와 상호교환될 수 있도록 의도된다.

본원에 사용된 용어 "백신접종" 또는 "백신주사"는 예를 들어 질환-유발제에 대한 면역 반응을 생성하도록 의도된 조성물의 투여를 지칭한다. 백신접종은 질환-유발 제제, 및/또는 하나 이상의 증상의 발현에 대한 노출 전, 동안 및/또는 후에, 일부 실시형태에서는 제제에 노출되기 전, 동안 및/또는 직후에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 백신접종은 백신접종 조성물의 적절한 시간 간격을 둔 다중 투여를 포함한다.

본 개시내용은 각각 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열(참조 서열)에 대해 특정 정도의 동일성을 갖는 핵산 서열 및 아미노산 서열을 기재한다.

두 핵산 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열들 사이에 동일한 뉴클레오타이드의 백분율을 나타낸다. 두 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열들 사이에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다.

용어들 "% 동일한", "% 동일성" 또는 유사한 용어는 특히 비교될 서열 간의 최적 정렬에서 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 백분율을 지칭하는 것으로 의도된다. 상기 백분율은 순전히 통계적이며, 두 서열 간의 차이는 비교될 서열의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포될 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 두 서열의 비교는 일반적으로 상응하는 서열들의 국소 영역을 확인하기 위해, 세그먼트 또는 "비교 창"에 대해 최적 정렬 후에 상기 서열을 비교함으로써 수행된다. 비교를 위한 최적의 정렬은 수동으로 수행될 수 있거나, 문헌[Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443]의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444]의 유사성 검색 알고리즘에 의해, 또는 이러한 알고리즘을 이용하는 컴퓨터 프로그램(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))에 의해 수행될 수 있다.

백분율 동일성은 비교될 서열이 대응하는 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수(예를 들어, 참조 서열의 위치 수)로 나누고, 이 결과에 100을 곱함으로써 획득된다.

일부 실시형태에서, 동일성의 정도는 참조 서열 전체 길이의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 영역에 대해 제공된다. 예를 들어, 참조 핵산 서열이 200개의 뉴클레오타이드로 구성되는 경우, 동일성의 정도는 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 또는 약 200개의 뉴클레오타이드에 대해, 일부 실시형태에서는 연속 뉴클레오타이드에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 동일성의 정도는 참조 서열의 전체 길이에 대해 제공된다.

주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 대해 각각 특정 정도의 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 상기 주어진 서열의 적어도 하나의 기능적 특성을 가질 수 있으며, 예를 들어 일부 경우에는, 상기 주어진 서열과 기능적으로 동일하다. 한 가지 중요한 특성은 특히 대상체에게 투여될 때 사이토카인으로 작용하는 능력을 포함한다. 일부 실시형태에서, 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 대해 특정 정도의 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 상기 주어진 서열과 기능적으로 동등하다.

본원에 사용된 용어 "키트"는 하나 이상의 화합물 또는 조성물과 같은 관련 성분, 및 용매, 용액, 완충제, 지침서 또는 건조제와 같은 하나 이상의 관련 물질의 패키지 세트를 지칭한다.

B. 특정 위치에 하나 이상의 아스파라긴을 포함하는 RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드

RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. RSV F 폴리펩타이드는 RSV F의 전체 서열 또는 RSV F의 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합전 RSV F와 융합후 RSV F 사이에 공유되는 RSV 폴리펩타이드의 에피토프가 차단된다. 에피토프를 차단하면, 항원성 RSV 폴리펩타이드가 대상체에게 투여될 때 에피토프에 대한 항체 생성이 감소하거나 제거된다. 이것은 융합전 형태와 같은 특정 형태의 F에 특이적인 에피토프를 표적으로 하는 항체의 비율을 증가시킬 수 있다. F는 아직 세포에 들어 가지 않은 바이러스에서 융합전 형태를 갖기 때문에, 융합전 F를 표적으로 하는 항체의 증가된 비율은 더 높은 중화도를 제공할 수 있다(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 중화 대 결합 비율로 표현됨). 차단은 공유된 에피토프 근처에서 N-글리칸과 같은 부피가 큰 모이어티를 조작하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 야생형 F에 존재하지 않는 N-글리코실화 부위는 예를 들어 적절한 잔기를 아스파라긴으로 돌연변이시킴으로써 추가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 차단된 에피토프는 RSV F의 항원성 부위 1의 에피토프이다. 일부 실시형태에서, 융합전 RSV F와 융합후 RSV F 사이에 공유되는 2개 이상의 에피토프가 차단된다. 일부 실시형태에서, RSV F의 항원성 부위 1의 2개 이상의 부위가 차단된다. 일부 실시형태에서, 차단된 에피토프와 토폴로지적으로 중첩하는 하나 이상의 또는 모든 에피토프도 차단되며, 선택적으로, 차단된 에피토프는 RSV F의 항원성 부위 1의 에피토프이다.

일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 328, 348, 또는 507에 상응하는 아스파라긴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 328, 348, 또는 507 중 적어도 2개에 상응하는 아스파라긴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 328, 348, 또는 507에 상응하는 아스파라긴을 포함한다. 실시예에서 설명된 바와 같이, 상기 아스파라긴은 글리코실화 부위와 같이 기능할 수 있음이 밝혀졌다. 더욱이, 어떤 특정한 이론에 구속되기를 원하지 않으면서, 이들 부위의 글리칸은 폴리펩타이드가 대상체에게 투여될 때 융합전 및 융합후 RSV F 단백질에 공통적인 에피토프를 포함하는 근처 에피토프에 대한 항체의 발달을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 26의 위치 328, 348, 또는 507에 상응하는 아스파라긴의 글리코실화는 융합전 RSV F와 융합후 RSV F 사이에 공유되는 적어도 하나의 에피토프, 예컨대 항원성 부위 1의 에피토프를 차단한다. 융합전 및 융합후 RSV F 단백질에 공통적인 에피토프에 대한 항체의 개발을 억제하는 것은 부위 0 에피토프와 같은, 융합전 RSV F 단백질에 특이적인 에피토프에 대한 항체 개발을 지시할 수 있기 때문에 유익할 수 있으며, 이는 다른 RSV F 에피토프에 대한 항체보다 더 효과적인 중화 활성을 가질 수 있다. 부위 0 에피토프는 서열 번호 26의 아미노산 잔기 62~69 및 196~209를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 아미노산 잔기 62~69 및 196~209를 포함한다.

본원에 기재된 작제물은 야생형 RSV F에 비해 상이한 길이의 결실 또는 치환을 가질 수 있음을 주목해야 한다. 예를 들어, 서열 번호 23의 작제물 및 다른 작제물에서, 야생형 서열(서열 번호 26)의 위치 98~144는 GSGNVGL(서열 번호 23의 위치 98~104; 또한 서열 번호 31)로 대체되어, 40개의 아미노산이 순 제거(net removal)되어, 서열 번호 26의 위치 328, 348, 또는 507이 서열 번호 23의 위치 288, 308, 및 467에 상응하도록 한다. 일반적으로, 본원에 기재된 작제물의 위치는 예를 들어, 표준 매개변수(EBLOSUM62 매트릭스, 갭 페널티 10, 갭 확장 페널티 0.5)와 함께 Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여, 쌍 정렬에 의해 서열 번호 26의 야생형 서열 상에 매핑될 수 있다. 또한 해당 위치를 확인하기 위한 대안적인 접근방식으로 본원에 제공된 구조적 정렬에 대한 설명을 참조한다.

일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 융합후 RSV F의 표면에 있는 것과 구조적으로 유사한 융합전 항원 상의 에피토프를 차단하는 글리칸을 추가하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, RSV F의 융합후 형태로 존재할 수 있는 에피토프를 특이적으로 차단하기 위해 글리칸이 첨가된다. 일부 실시형태에서, RSV F의 융합후 형태로 존재할 수 있지만 RSV F의 융합전 형태로 존재하는 하나 이상의 에피토프에 영향을 미치지 않는 에피토프, 예컨대 부위 0 에피토프를 차단하는 글리칸이 첨가된다.

일부 실시형태에서, 상기 논의된 하나 이상의 글리코실화 부위에 첨가된 글리칸은 다른 작제물에 비해 포유동물 세포와 같은 발현 시스템에서 분비를 증가시킨다.

일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 17의 아미노산 1~478에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 17의 서열에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 17의 아미노산 1~478을 포함한다. 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 17의 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 23의 아미노산 1~478에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 23의 서열에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 23의 아미노산 1~478을 포함한다. 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 23의 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 DS-CAV1 서열(예를 들어, 문헌 [McLellan, J.S., et al., Science 342(6158):592-598 (2013)]에 기재됨)(서열 번호 25)을 포함하며, 상기 기재된 아스파라긴 중 적어도 1, 2 또는 3개를 포함하는 추가의 변형들이 이루어진다.

일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 페리틴 단백질을 더 포함한다. 페리틴 단백질은 페리틴 또는 이들의 조합에 관한 섹션에서 아래에 설명된 임의의 특징을 추가로 포함할 수 있다.

RSV F 폴리펩타이드는 하기 논의에서 제시된 추가 특징 중 임의의 것, 또는 그러한 특징의 임의의 가능한 조합을 더 포함할 수 있다.

단일 사슬 작제물

일부 실시형태에서, RSV 폴리펩타이드는 단일 사슬 작제물, 예를 들어, 푸린 절단 부위가 결여된 RSV 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, RSV F는 하나 이상의 푸린 절단 부위가 결여되어 있다. 푸린 절단 부위가 결여된 작제물은 천연 F 단백질의 생물학적 F1/F2 단편으로 절단되지 않는 단일 폴리펩타이드로 발현된다.

아미노산 치환

일부 실시형태에서, RSV F는 야생형 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, RSV F는 야생형 서열에 비해 하나 초과의 단일 아미노산 치환, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 치환을 포함한다. 예시적인 야생형 서열은 서열 번호 26이다.

일부 실시형태에서, 아미노산 치환 또는 한 쌍의 아미노산 치환은 프로토머간 안정화 치환(들)이다. 프로토머간 안정화가 될 수 있는 예시적인 치환은 서열 번호 26의 위치 넘버링을 사용하여 V207L; N228F; I217V 및 E218F; I221L 및 E222M; 또는 Q224A 및 Q225L이다.

일부 실시형태에서, 아미노산 치환 또는 한 쌍의 아미노산 치환은 프로토머내 안정화이다. 프로토머내 안정화가 될 수 있는 예시적인 치환은 서열 번호 26의 위치 넘버링을 사용하여 V220I; 및 A74L 및 Q81L이다.

일부 실시형태에서, 아미노산 치환은 나선 안정화이며, 즉 RSV F의 나선 도메인을 안정화하는 것으로 예측된다. 나선 도메인의 안정화는 부위 0 에피토프의 안정성 및 일반적으로 RSV F의 융합전 형태의 안정성에 기여할 수 있다. 나선 안정화가 될 수 있는 예시적인 치환은 서열 번호 26의 위치 넘버링을 사용하여 N216P 또는 I217P이다.

일부 실시형태에서, 아미노산 치환은 나선 캡핑이다. 일부 실시형태에서, 아미노산 치환은 나선 PRO 캡핑이다. 나선 캡핑은 알파 나선에 있는 프롤린 잔기 돌연변이가 나선 형성을 방해할 수 있지만 나선 영역의 N-말단에 있는 프롤린은 PHI/PSI 결합 각도를 안정화하여 나선 형성을 유도하는 데 도움이 될 수 있다는 생물물리학적 관찰을 기반으로 한다. 나선 캡핑이 될 수 있는 예시적인 치환은 서열 번호 26의 위치 넘버링을 사용하여 N216P 또는 I217P이다.

일부 실시형태에서, 아미노산 치환은 DS-CAV1의 이황화 돌연변이를 대체한다. 일부 실시형태에서, DS-CAV1의 조작된 이황화물은 서열 번호 26의 위치 넘버링을 사용하여 야생형(DS-CAV1의 C69S 및/또는 C212S 돌연변이)으로 복귀된다. 일부 실시형태에서, DS-CAV1의 하나 이상의 C 잔기가 S 잔기로 대체되어, 이황화 결합을 제거한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 26의 위치 넘버링을 사용한 C69S 또는 C212S 치환은 이황화 결합을 제거한다. 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 넘버링을 사용한 C69S 및 C212S를 모두 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 시스테인을 대체하여 이황화 결합을 제거하면 RSV F 폴리펩타이드의 감소(즉, 환원제로부터 전자의 수용)를 차단한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 26의 위치 넘버링을 사용한 I217P 치환은 C69 및/또는 C212에서의 치환 대신 항원에 포함된다. 서열 번호 26의 위치 217은 서열 번호 23의 위치 177에 상응한다.

일부 실시형태에서, 아미노산 치환은 트립신 또는 트립신-유사 프로테아제에 의한 단백질분해를 방지한다. 일부 실시형태에서, 이러한 단백질분해를 방지하는 아미노산 치환은 RSV F의 헵타드 반복 영역 B(HRB) 영역에 있다. 야생형 HRB 영역을 포함하는 RSV F-페리틴 작제물의 단백질분해와 일치하는 단편의 출현은 이 영역의 라이신 또는 아르기닌이 단백질분해의 표적이 되었음을 제시하였다. K 또는 R 잔기를 제거하기 위한 아미노산 치환은 녹아웃(KO)이라고 할 수 있다. 일부 실시형태에서, K 또는 R은 L 또는 Q에 대해 치환된다. 일부 실시형태에서, K는 L 또는 Q에 대해 치환된다. 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 넘버링을 사용한 K498L 및/또는 K508Q를 포함한다. 서열 번호 23에서 상응하는 위치는 각각 458 및 468이다. 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 K498L 및 K508Q 둘 다를 포함한다.

일부 실시형태에서, 아미노산 치환은 글리칸을 추가한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 치환은 RSV F 폴리펩타이드에 글리칸을 추가함으로써 글리코실화를 증가시킨다. 글리칸을 추가하기 위한 치환은 천연 글리코실화(추가 글리칸 없음)와 비교하여 조작된 글리코실화라고도할 수 있다.

일부 실시형태에서, 글리칸을 추가하기 위한 아미노산 치환은 N에 의한 치환이었다. 일부 실시형태에서, N에 의한 아미노산 치환은 N-연결 글리코실화를 허용한다. 일부 실시형태에서, N에 의한 치환은 NxT/S 글리코실화 모티프를 형성하는, N에 대한 C-말단의 제2 아미노산 위치에서 T 또는 S에 의한 치환을 수반한다. 일부 실시형태에서, N은 표면-노출된다. 아래의 실시예에 나타난 바와 같이, 글리코실화를 증가시키는 돌연변이는 RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드의 증가된 발현을 제공할 수 있다.

변형에 기반한 RSV F 폴리펩타이드의 특성 변화

RSV F의 아미노 서열에 대한 변형은 RSV F 폴리펩타이드의 특성을 변경할 수 있다. RSV F 폴리펩타이드의 특성은 RSV F 폴리펩타이드의 임의의 구조적 또는 기능적 특성을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 아미노산 서열에 대한 단일 변형은 RSV F 폴리펩타이드의 여러 특성을 변화시킨다. 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 RSV F 폴리펩타이드의 상이한 특성들을 변화시키는 다중 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중 변형은 RSV F 폴리펩타이드의 특성에 있어서 더 큰 변화를 생성한다.

일부 실시형태에서, 다중 변형은 특정 특성에 대한 추가 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리칸을 추가하기 위한 2개의 아미노산 치환은 단일 아미노산 치환에 비해 RSV F 폴리펩타이드의 글리코실화를 더 많이 증가시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중 변형은 RSV F 폴리펩타이드의 상이한 특성에 영향을 미친다. 예를 들어, 글리코실화를 증가시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환은 감소를 차단하기 위해 하나 이상의 아미노산 치환과 함께 이루어질 수 있다.

일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드에 대한 변형은 융합전 형태를 안정화시킨다.

일부 실시형태에서, 변형은 예를 들어, 문헌[McLellan et al., Science 340(6136):1113-1117 (2013)]에 기재된 바와 같이 융합전 RSV F의 부위 0 에피토프(항원성 부위 0으로도 알려져 있음)를 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 부위 0 에피토프를 안정화하는 변형은 프로토머간 안정화이다. 일부 실시형태에서, 부위 0 에피토프를 안정화시키는 변형은 각각 항체 D25 또는 AM14에 대한 결합에 의해 측정된 바와 같이 부위 0 및 부위 V 결합에 의해 측정된 바와 같이 융합전 F를 안정화시킨다.

일부 실시형태에서, 변형은 발현 시스템에서 RSV F의 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 변형은 발현 시스템에서 RSV F의 분비를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 변형은 발현 후 재조합 RSV F의 안정성을 증가시킨다. 이러한 변화는 박테리아, 균류, 곤충 또는 포유류와 같은 모든 유형의 발현 시스템에서 발생할 수 있다.

일부 실시형태에서, 프롤린을 도입하는 아미노산 치환은 다른 작제물에 비해 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 글리칸을 추가하는 아미노산 치환은 다른 작제물에 비해 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 다른 아미노산에 대해 K 또는 R를 치환하는 아미노산 치환은 다른 작제물에 비해 발현을 증가시킨다. 발현의 관찰가능한 증가는 숙주 세포 또는 세포외 환경에서 프로테아제 절단 또는 분해의 상대적 억제 및/또는 안정성의 증가를 포함하여, 발효 실행 또는 기타 생산 공정의 수율을 증가시키는 임의의 메커니즘으로부터 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다른 아미노산에 대해 RSV F의 HRB 영역에서 하나 이상의 K 잔기를 치환하는 아미노산 치환은 다른 작제물에 비해 발현을 증가시킨다.

일부 실시형태에서, 다른 아미노산에 대해 K를 치환하는 아미노산 치환은 RSV F 폴리펩타이드의 안정성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 다른 아미노산에 대해 RSV F의 HRB 영역에서 하나 이상의 K 잔기를 치환하는 아미노산 치환은 RSV F 폴리펩타이드의 안정성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 이러한 증가된 안정성은 프로테아제 절단의 감소로 인한 것이다.

일부 실시형태에서, RSV F는, 예를 들어 환원 후 접합을 방지하기 위해 이황화물을 제거하는 돌연변이(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, I217P 치환은 RSV F 폴리펩타이드의 환원을 차단한다. 일부 실시형태에서, 다른 아미노산에 대해 K를 치환하는 아미노산 치환은 환원제의 존재하에 RSV F 폴리펩타이드의 환원을 차단한다.

일부 실시형태에서, 단일 사슬 작제물은 다른 작제물에 비해 발현을 증가시킨다.

일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는 DS-CAV1 서열(서열 번호 25)을 포함한다(문헌[McLellan, J.S., et al., Science 342(6158):592-598 (2013)]에 기재됨). 일부 실시형태에서, RSV F 폴리펩타이드는, 예를 들어 상기 기재된 아스파라긴 중 적어도 1, 2 또는 3개를 포함하는 추가 변형이 이루어지는 DS-CAV1의 서열을 포함한다.

C. RSV G 폴리펩타이드

본원에 사용된 바와 같이, RSV G 폴리펩타이드는 RSV G의 전체 서열 또는 RSV G의 일부를 포함할 수 있다. RSV G 폴리펩타이드는 야생형 서열과 비교되는 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, RSV G 폴리펩타이드는 야생형 RSV G와 비교하여 변형된 RSV G이다(서열 번호 27).

일부 실시형태에서, 이러한 변형은 야생형 RSV G와 비교하여 RSV G 폴리펩타이드의 아미노산에 대한 변화이다.

일부 실시형태에서, RSV G 폴리펩타이드는 RSV G의 엑토도메인의 전부 또는 일부를 포함한다(서열 번호 28 또는 이에 상응하는 위치). 일부 실시형태에서, RSV G 폴리펩타이드는 Gcc 영역의 전부 또는 일부를 포함한다(RSV G의 아미노산 151~193(서열 번호 27)). 일부 실시형태에서, RSV G 폴리펩타이드는 CX3C 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, RSV G 폴리펩타이드는 CX3CR1 수용체에 결합한다. Gcc 영역은 보존되고 면역원성이므로, RSV 균주에 대해 광범위한 활성을 가진 항체를 유도하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, RSV Gcc 균주 A는 서열 번호 32에 나타낸 바와 같이 제공된다. 일부 실시형태에서, RSV Gcc 균주 B는 서열 번호 33에 나타낸 바와 같이 제공된다.

일부 실시형태에서, RSV G 폴리펩타이드는 글리코실화되지 않는다. 예를 들어, RSV G 폴리펩타이드는 N 또는 S/T 잔기의 절단 또는 돌연변이(예를 들어, 각각 Q 또는 A로), 또는 이들의 조합으로 인해 NXS/TX 당화 부위가 결여될 수 있다.

일부 실시형태에서, RSV G 폴리펩타이드는 항원성 페리틴 폴리펩타이드의 일부이다. 예를 들어, RSV G 폴리펩타이드는 예컨대 페리틴상의 표면-노출된 시스테인을 통해 본 명세서에 기재된 바와 같이 페리틴에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 페리틴 나노입자는 RSV F 폴리펩타이드, 예컨대 RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 임의의 폴리펩타이드 및 상기 기재된 페리틴 단백질을 또한 포함하는 융합 단백질이다.

D. 페리틴을 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드

페리틴 및 RSV 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. RSV 폴리펩타이드는 RSV F 폴리펩타이드, 예컨대 본원에 기재된 임의의 RSV F 폴리펩타이드일 수 있다. RSV F 폴리펩타이드는 RSV F의 전체 서열 또는 RSV F의 일부를 포함할 수 있다. RSV F 폴리펩타이드는 야생형 서열과 비교되는 하나 이상의 변형(예를 들어, 아미노산 치환)을 포함할 수 있다. RSV 폴리펩타이드는 RSV G 폴리펩타이드, 예컨대 본원에 기재된 임의의 RSV G 폴리펩타이드일 수 있다.

일부 실시형태에서, 폴리펩티드 내의 페리틴은 야생형 페리틴이다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 박테리아, 곤충, 진균류, 조류 또는 포유류 페리틴이다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 인간 페리틴이다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 박테리아 페리틴이다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 경쇄 및/또는 중쇄 페리틴이다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 곤충 페리틴, 예컨대 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 중쇄 페리틴(서열 번호 211) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 경쇄 페리틴(서열 번호 212)이다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 인간 페리틴, 예컨대 인간 중쇄 페리틴(서열 번호 214 또는 FTH1, GENE ID No: 2495) 또는 인간 경쇄 페리틴(서열 번호 215 또는 FTL, GENE ID No: 2512)이다. 일부 실시형태에서, 페리틴 나노입자는 인간 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 페리틴 나노입자에서와 같이 중쇄 페리틴 및 경쇄 페리틴의 총 24개의 서브유닛을 포함한다. 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 페리틴 나노입자는 중쇄 페리틴의 12개의 서브유닛 및 경쇄 페리틴의 12개의 서브유닛을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 항원성 RSV 폴리펩타이드는 경쇄 페리틴 및 RSV 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원성 RSV 폴리펩타이드는 중쇄 페리틴 및 RSV 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 경쇄 페리틴 및 RSV 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드는 RSV 폴리펩타이드에 연결되지 않은 중쇄 페리틴과 조립될 수 있다. 일부 실시형태에서, 중쇄 페리틴 및 RSV 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드는 RSV 폴리펩타이드에 연결되지 않은 경쇄 페리틴과 조립될 수 있다. RSV 폴리펩타이드(또는 더욱 일반적으로, 비-페리틴 폴리펩타이드)에 연결되지 않은 페리틴은 "네이키드 페리틴"으로 지칭될 수 있다.

일부 실시형태에서, 중쇄 페리틴 및 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 폴리펩타이드는 경쇄 페리틴 및 RSV 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 폴리펩타이드와 조립되어, 단일 페리틴 나노입자 상의 동일한 또는 상이한 비-페리틴 폴리펩타이드 중 2개의 제시를 허용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 상이한 비-페리틴 폴리펩타이드는 RSV 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 2개의 상이한 비-페리틴 폴리펩타이드는 RSV 및 상이한 감염원에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, 상이한 감염원으로부터의 상이한 비-페리틴 폴리펩타이드는 바이러스 또는 박테리아로부터 유래된다.

일부 실시형태에서, 중쇄 페리틴 및 비-페리틴 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 폴리펩타이드는 경쇄 페리틴 및 비-페리틴 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드와 조립되어, 2가 조성물을 생성할 수 있으며, 여기서 비-페리틴 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다는 RSV 폴리펩타이드, 예컨대 RSV F 또는 G 폴리펩타이드, 예를 들어, 본원에 기재된 RSV F 또는 G 폴리펩타이드이다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 선택적으로 본원에 기재된 것과 같은 하나 이상의 돌연변이를 갖는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴이다(예시적인 헬리코박터 파일로리(H. Pylori) 페리틴 서열의 경우 서열 번호 208 또는 209 참고). 일부 실시형태에서, 헬리코박터 파일로리(H. Pylori) 페리틴(또는 다른 박테리아 페리틴)과 인간 페리틴 사이의 낮은 서열 상동성은 백신 플랫폼으로 사용될 때 자가면역 가능성을 감소시킬 수 있다(문헌 [Kanekiyo et al., Cell 162, 1090-1100 (2015)] 참고).

일부 실시형태에서, 페리틴은 본원에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 파이로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 페리틴이다(NCBI seq WP_011011871.1).

일부 실시형태에서, 페리틴은 야생형 페리틴에 대하여 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, RSV 폴리펩타이드 및 페리틴을 포함하는 본원에 개시된 항원성 RSV 폴리펩타이드를 포함하는 나노입자가 제공된다.

일부 실시형태에서, 나노입자를 형성할 수 있는 상이한 단백질이 페리틴에 대하여 치환된다. 일부 실시형태에서, 이 단백질은 루마진 합성효소이다(문헌[Ra et al., Clin Exp Vaccine Res 3:227-234 (2014)] 참고). 일부 실시형태에서, 이 단백질은 루마진 합성효소 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이다. 예시적인 루마진 합성효소 서열은 서열 번호 216 및 219로 제공된다. 일부 실시형태에서, 루마진 합성효소는 서열 번호 216 또는 219에 대하여 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

1. 접합을 위한 시스테인

일부 실시형태에서, 페리틴은 면역-자극 모이어티 및/또는 RSV 폴리펩타이드의 접합을 위한 화학적 핸들을 제공하도록 돌연변이된다. 이것은 표면-노출된 비-시스테인 아미노산을 시스테인으로 대체하는 돌연변이로 달성될 수 있다. 의심의 여지를 없애기 위해, "표면-노출된 아미노산을 시스테인으로 대체"와 같은 표현은 반드시 야생형 또는 돌연변이전 서열 중의 표면-노출된 아미노산이 시스테인이 아님을 암시한다. 면역-자극 모이어티 또는 RSV 폴리펩타이드의 접합을 위한 화학적 핸들을 제공하기 위한 또 다른 접근법은 아미노산의 세그먼트, 예컨대 페리틴에 대한 링커, N- 또는 C-말단을 포함하며, 아미노산의 세그먼트는 시스테인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 시스테인(표면-노출된 아미노산을 대체하거나, N- 또는 C-말단 링커에서 대체하는)은 짝을 이루지 않으며 이는 이황화 결합을 형성하기 위한 적당한 파트너 시스테인을 갖지 않음을 의미한다. 일부 실시형태에서, 이 시스테인은 페리틴의 2차 구조를 변화시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 이 시스테인은 페리틴의 3차 구조를 변화시키지 않는다.

일부 실시형태에서, 이 시스테인은 페리틴에 제제를, 예컨대 면역-자극 모이어티를 접합시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 시스테인은 반응성인 유리 티올기를 제공한다. 일부 실시형태에서, 페리틴상의 이 시스테인에 접합된 제제는 조립된 페리틴 입자의 표면에 노출된다. 일부 실시형태에서, 이 시스테인은 페리틴 입자가 조립되는 동안 투여 후 대상체의 분자 및 세포와 상호작용할 수 있다.

일부 실시형태에서, 이 시스테인의 존재로 인해 하나 이상의 면역-자극 모이어티, 예를 들어, 아쥬반트가 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티의 접합은 이 시스테인의 부재하에 일어나지 않을 것이다.

일부 실시형태에서, 시스테인으로 대체된 비-시스테인 아미노산은 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 E12, S72, A75, K79, S100, 및 S111로부터 선택된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 시스테인으로 대체되는 표면-노출된 아미노산은 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 E12, S26, S72, A75, K79, S100, 또는 S111에 상응하는 아미노산 잔기이다. 유사한 아미노산은 쌍으로 또는 구조적 정렬에 의해 비-헬리코박터 파일로리(H. Pylori) 페리틴에서 발견될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스테인으로 대체된 비-시스테인 아미노산은 인간 경쇄 페리틴의 S3, S19, S33, I82, A86, A102, 및 A120에 상응하는 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스테인으로 대체될 표면-노출된 아미노산은 천연 아미노산이 시스테인으로 대체되는 경우, 조립된 페리틴 다량체 또는 입자에서 반응성이고/이거나, 이 시스테인이 페리틴 다량체 또는 입자의 안정성을 방해하지 않고/않거나, 이 시스테인이 페리틴의 발현 수준을 감소시키지 않는다는 이해를 기반으로 선택된다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 E12C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, E12C 잔기는 제제(예를 들어, 면역-자극 모이어티 및/또는 RSV 폴리펩타이드)를 페리틴에 접합시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, E12C 잔기는 반응성인 유리 티올기를 제공한다. 일부 실시형태에서, 페리틴 단량체 상의 E12C 잔기에 접합된 제제는 조립된 페리틴 다량체 또는 입자의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 24개의 E12C 잔기들(각 단량체로부터 하나)은 페리틴 다량체 또는 입자의 표면 상에 존재한다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 S26C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, S26C 잔기는 제제(예를 들어, 면역-자극 모이어티 및/또는 RSV 폴리펩타이드)를 페리틴에 접합시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, S26C 잔기는 반응성인 유리 티올기를 제공한다. 일부 실시형태에서, 페리틴 단량체 상의 S26C 잔기에 접합된 제제는 조립된 페리틴 다량체 또는 입자의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 24개의 S26C 잔기들(각 단량체로부터 하나)은 페리틴 다량체 또는 입자의 표면 상에 존재한다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 S72C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, S72C 잔기는 제제(예를 들어, 면역-자극 모이어티 및/또는 RSV 폴리펩타이드)를 페리틴에 접합시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, S72C 잔기는 반응성인 유리 티올기를 제공한다. 일부 실시형태에서, 페리틴 단량체 상의 S72C 잔기에 접합된 제제는 조립된 페리틴 다량체 또는 입자의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 24개의 S72C 잔기들(각 단량체로부터 하나)은 페리틴 다량체 또는 입자의 표면 상에 존재한다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 A75C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, A75C 잔기는 제제(예를 들어, 면역-자극 모이어티 및/또는 RSV 폴리펩타이드)를 페리틴에 접합시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, A75C 잔기는 반응성인 유리 티올기를 제공한다. 일부 실시형태에서, 페리틴 단량체 상의 A75C 잔기에 접합된 제제는 조립된 페리틴 다량체 또는 입자의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 24개의 A75C 잔기들(각 단량체로부터 하나)은 페리틴 다량체 또는 입자의 표면 상에 존재한다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 K79C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, K79C 잔기는 제제(예를 들어, 면역-자극 모이어티 및/또는 RSV 폴리펩타이드)를 페리틴에 접합시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, K79C 잔기는 반응성인 유리 티올기를 제공한다. 일부 실시형태에서, 페리틴 단량체 상의 K79C 잔기에 접합된 제제는 조립된 페리틴 다량체 또는 입자의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 24개의 K79C 잔기들(각 단량체로부터 하나)은 페리틴 다량체 또는 입자의 표면 상에 존재한다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 S100C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, S100C 잔기는 제제(예를 들어, 면역-자극 모이어티 및/또는 RSV 폴리펩타이드)를 페리틴에 접합시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, S100C 잔기는 반응성인 유리 티올기를 제공한다. 일부 실시형태에서, 페리틴 단량체 상의 S100C 잔기에 접합된 제제는 조립된 페리틴 다량체 또는 입자의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 24개의 S100C 잔기들(각 단량체로부터 하나)은 페리틴 다량체 또는 입자의 표면 상에 존재한다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 S111C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, S111C 잔기는 제제(예를 들어, 면역-자극 모이어티 및/또는 RSV 폴리펩타이드)를 페리틴에 접합시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, S111C 잔기는 반응성인 유리 티올기를 제공한다. 일부 실시형태에서, 페리틴 단량체 상의 S111C 잔기에 접합된 제제는 조립된 페리틴 다량체 또는 입자의 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 24개의 S111C 잔기들(각 단량체로부터 하나)은 페리틴 다량체 또는 입자의 표면 상에 존재한다.

2. 내부 시스테인의 제거

일부 실시형태에서, 페리틴은 내부 시스테인을 비-시스테인 아미노산으로 대체하는 돌연변이를 포함한다. 천연 내부 시스테인 잔기를 제거하면 페리틴 단량체 당 하나의 쌍을 이루지 않은 시스테인만 있고 이황화 형성과 같은 원치 않는 반응을 피할 수 있게 되며, 보다 안정적이고 효율적인 결과(예를 들어, 아쥬반트 제시)를 얻을 수 있게 된다. 일부 실시형태에서, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 C31은 비-시스테인 아미노산으로 대체된다. 일부 실시형태에서, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 C31은 세린(C31S)으로 대체되지만, 임의의 비-시스테인 잔기, 예를 들어 알라닌, 글리신, 트레오닌 또는 아스파라긴이 사용될 수 있다. 유사한 아미노산은 쌍으로 또는 구조적 정렬에 의해 비-헬리코박터 파일로리(H. Pylori) 페리틴에서 발견될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 비-시스테인으로 대체되는 내부 시스테인은 헬리코박터 파일로리(H. Pylori) 페리틴의 C31과 정렬되는 아미노산 잔기이다. C31S 돌연변이를 나타내는 예시적인 페리틴 서열은 서열 번호 201~207에 제시되어 있다. 일부 실시형태에서, 하나 초과의 내부 시스테인이 페리틴에 존재할 때, 2개 이상의(예를 들어, 각각의) 내부 시스테인은 비-시스테인 아미노산, 예컨대 세린 또는, 세린, 알라닌, 글리신, 트레오닌 또는 아스파라긴으로부터 선택되는 아미노산으로 대체된다.

3. 글리코실화

인간-적합성 글리코실화는 재조합 약물 제품의 안전성 및 효능에 기여할 수 있다. 규제 승인은 적당한 글리코실화가 중요한 품질 속성임을 입증하는 데 달려있을 수 있다(문헌[Zhang et al., Drug Discovery Today 21(5):740-765 (2016)] 참고). N-글리칸은 아스파라긴 측쇄의 글리코실화로 인해 발생할 수 있으며 인간과 다른 유기체, 예컨대 박테리아 및 효모 사이의 구조가 다를 수 있다. 따라서, 본 개시내용에 따라 페리틴에서 비-인간 글리코실화 및/또는 N-글리칸 형성을 감소시키거나 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 페리틴의 글리코실화를 조절하면 특히 인간 백신접종에 사용될 때 조성물의 효능 및/또는 안전성이 개선된다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 N-글리칸의 형성을 억제하기 위해 돌연변이된다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 페리틴은 그의 상응하는 야생형 페리틴과 비교하여 감소된 글리코실화를 갖는다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 표면-노출된 아스파라긴을 비-아스파라긴 아미노산으로 대체하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표면-노출된 아스파라긴은 쌍으로 또는 구조적 정렬에 의해 결정된 바와 같이 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 N19이거나, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 위치 31에 상응하는 위치이다. 일부 실시형태에서, 상기 아스파라긴, 예를 들어, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 N19를 돌연변이시키면, 페리틴의 글리코실화가 감소된다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 아스파라긴을 글루타민으로 대체한다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 N19Q 돌연변이를 포함하는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴이다. 서열 번호 201~207은 N19Q 돌연변이를 포함하는 예시적인 페리틴 서열이다.

박테리아 또는 효모에서, 주어진 단백질의 글리코실화 패턴이 포유류의 동일한 단백질의 글리코실화 패턴과 다를 수 있기 때문에, 박테리아 또는 효모에서 생성된 글리코실화 단백질에 노출된 포유류는 글리코실화 단백질에 대한 면역 반응을 생성할 수 있다. 따라서 일부 글리코실화된 치료 단백질은 박테리아 또는 효모 생산에 적합하지 않을 수 있다.

일부 실시형태에서, 아미노산 돌연변이에 의한 페리틴의 감소된 글리코실화는 박테리아 또는 효모에서 단백질 생산을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 페리틴의 감소된 글리코실화는 박테리아 또는 효모에서 발현되는 돌연변이된 페리틴의 투여시 포유동물에서 부작용 가능성을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 글리코실화가 감소하기 때문에 박테리아 또는 효모에서 생성된 돌연변이된 페리틴의 인간 대상체에서의 반응원성이 더 낮다. 일부 실시형태에서, 인간 대상체에서 과민 반응의 발생률은 야생형 페리틴에 비해 감소된 글리코실화를 갖는 돌연변이된 페리틴으로 치료한 후 더 낮다.

일부 실시형태에서, 감소된 글리코실화를 갖는 돌연변이된 페리틴을 포함하는 조성물의 대상체에서의 분해는 야생형 페리틴을 포함하는 조성물 또는 야생형 글리코실화를 갖는 상응하는 페리틴을 포함하는 조성물에 비해 더 느리다. 일부 실시형태에서, 감소된 글리코실화를 갖는 돌연변이된 페리틴을 포함하는 조성물은 야생형 페리틴을 포함하는 조성물 또는 야생형 글리코실화를 갖는 상응하는 페리틴을 포함하는 조성물과 비교하여 대상체에서 감소된 클리어런스를 갖는다. 일부 실시형태에서, 감소된 글리코실화를 갖는 돌연변이된 페리틴을 포함하는 조성물은 야생형 페리틴 또는 야생형 글리코실화를 갖는 상응하는 페리틴을 포함하는 조성물에 비해 더 긴 혈청 반감기를 갖는다.

4. 돌연변이의 조합

일부 실시형태에서, 페리틴은 본원에 기재된 하나 이상의 유형의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 하기로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다: 글리코실화를 감소시키기 위한 돌연변이, 내부 시스테인을 제거하기 위한 돌연변이, 및 표면-노출된 시스테인을 생성하기 위한 돌연변이. 일부 실시형태에서, 페리틴은 글리코실화를 감소시키기 위한 돌연변이, 내부 시스테인을 제거하기 위한 돌연변이, 및 표면-노출된 시스테인을 생성하기 위한 돌연변이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 N19Q 돌연변이, C31S 돌연변이, 및 표면-노출된 시스테인을 생성하기 위한 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 N19Q 돌연변이, C31S 돌연변이, 및 E12C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 N19Q 돌연변이, C31S 돌연변이, 및 S72C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 N19Q 돌연변이, C31S 돌연변이, 및 A75C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 N19Q 돌연변이, C31S 돌연변이, 및 K79C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 N19Q 돌연변이, C31S 돌연변이, 및 S100C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 N19Q 돌연변이, C31S 돌연변이, 및 S111C 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 임의의 상기 돌연변이 세트에 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서 상응하는 돌연변이는 N을 Q로, C를 S로 변경하고, 비-시스테인 표면-노출된 아미노산을 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴 아미노산 서열(서열 번호 208 또는 209)에 대한 페리틴 아미노산 서열의 쌍으로의 정렬에 의해 결정된 위치에서 시스테인으로 변경한다.

하나 이상의 유형의 돌연변이를 포함하는 예시적인 페리틴은 서열 번호 201~207에 제공되어 있다.

5. 구조적 정렬

본원에서 논의된 바와 같이, 주어진 폴리펩타이드(예를 들어, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴)와 관련하여 기재된 것들에 상응하는 돌연변이의 위치는 쌍으로 또는 구조적 정렬에 의해 확인될 수 있다. 구조적 정렬은 상당한 서열 변이에도 불구하고 단백질이 유사한 구조를 공유하고 계열의 많은 구성원이 구조적으로 특성화된 페리틴과 같은 큰 단백질 계열과 관련이 있으며, 본원에 기재된 다른 폴리펩타이드, 예컨대 RSV 폴리펩타이드(예를 들어, RSV F 또는 G)의 다른 버전에서 해당 위치를 확인하는 데에도 사용될 수 있다. 단백질 데이터뱅크(PDB)는 그들의 수탁번호와 함께 하기 열거된 페리틴을 포함하여 많은 페리틴에 대한 3D 구조를 포함한다.

2jd6, 2jd7 - PfFR - 파이로코쿠스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus). 2jd8 - PfFR+Zn. 3a68 - 유전자 SferH4로부터의 soFR - 대두. 3a9q - 유전자 SferH4(돌연변이체)로부터의 soFR. 3egm, 3bvf, 3bvi, 3bvk, 3bvl - HpFR - 헬리오박터 파일로리(Heliobacter pylori). 5c6f - HpFR(돌연변이체) + Fe. 1z4a, 1vlg - FR - 써모토가 마리티메(Thermotoga maritime). 1s3q, 1sq3, 3kx9 - FR - 아르케오글로부스 풀기두스(Archaeoglubus fulgidus). 1krq - FR - 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni). 1eum - EcFR - 에스케리치아 콜리(Escherichia coli). 4reu - EcFR + Fe. 4xgs - EcFR (돌연변이체) + Fe2O2. 4ztt - EcFR (돌연변이체) + Fe2O + Fe2 + Fe + O2. 1qgh - LiFR - 리스테리아 이노큐아(Listeria innocua). 3qz3 - VcFR - 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae). 3vnx - FR - 울바 페르투사(Ulva pertusa). 4ism, 4isp, 4itt, 4itw, 4iwj, 4iwk, 4ixk, 3e6s - PnmFR - 슈도-니쯔시아-종(Pseudo-nitschia multiseries). 4zkh, 4zkw, 4zkx, 4zl5, 4zl6, 4zlw, 4zmc - PnmFR (돌연변이체) + Fe. 1z6o - FR - 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni). 4cmy - FR + Fe - 클로로바쿨룸 테피둠(Chlorobaculum tepidum). 페리틴 경쇄(FTL). 1lb3, 1h96 - mFTL - 마우스. 1rcc, 1rcd, 1rci - bFTL+타르트레이트(tartrate) + Mg. 1rce, 1rcg - bFTL + 타르트레이트(tartrate)+Mn. 3noz, 3np0, 3np2, 3o7r - hoFTL(돌연변이체) - 말. 3o7s, 3u90 - hoFTL. 4v1w - hoFTL - cryo EM. 3rav, 3rd0 - hoFTL + 바르비투레이트(barbiturate). 페리틴 경쇄+중쇄: 5gn8 - hFTH + Ca.

구조적 정렬은 (i) 제2 서열의 알려진 구조를 사용하여 제1 서열의 구조를 모델링하거나, (ii) 둘 다 알려져 있는 제1 및 제2 서열의 구조를 비교하고 제2 서열에서 관심있는 잔기에 가장 유사하게 위치된 제1 서열의 잔기를 확인함으로써 2개(또는 그 이상의) 폴리펩타이드 서열에 걸쳐 상응하는 잔기를 확인하는 것을 포함한다. 상응하는 잔기는 중첩된 구조의 알파-탄소 거리 최소화를 기반으로 하는 일부 알고리즘에서 확인된다(예를 들어, 한 쌍의 알파 탄소 세트가 정렬에 대해 최소화된 평균 제곱근 편차를 제공함). 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴과 관련하여 기재된 위치에 상응하는 비-헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 위치를 확인할 때, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴은 "제2" 서열일 수 있다. 관심의 비-헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴이 적용가능한 알려진 구조를 가지고 있지 않지만, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴보다 알려진 구조를 갖는 또 다른 비-헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴과 더 밀접하게 관련되면, 밀접하게 관련된 비-헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 알려진 구조를 사용하여 관심있는 비-헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴을 모델링한 후, 해당 모델을 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴 구조와 비교하여 관심있는 페리틴 내의 원하는 상응하는 잔기를 확인하는 것이 가장 효과적일 수 있다. 구조 모델링 및 정렬에 대한 광범위한 문헌이 있다; 대표적인 개시내용은 미국특허 제6859736호; 미국특허 제8738343호; 및 문헌[Aslam et al., Electronic Journal of Biotechnology 20 (2016) 9-13]에 인용된 것들을 포함한다. 알려진 관련 구조 또는 구조들에 기초한 구조 모델링에 대한 논의는, 예를 들어 문헌 [Bordoli et al., Nature Protocols　4 (2009)　1-13] 및 여기에 인용된 참고문헌들을 참고한다.

6. 면역-자극 모이어티; 아쥬반트; 접합된 RSV 폴리펩타이드

일부 실시형태에서, RSV 폴리펩타이드 및/또는 면역-자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트가 표면-노출된 아미노산에 부착된다. 일부 실시형태에서, 표면-노출된 아미노산은 예를 들어, 상기 논의된 돌연변이로 인한 시스테인이다. 일부 실시형태에서, 표면-노출된 아미노산은 라이신, 아스파르테이트 또는 글루타메이트이다. (라이신을 아미노-보유 링커 또는 모이어티와 접합하기 위한) 글루타르알데하이드 또는 카르보디이미드(예를 들어, 아스파르테이트 또는 글루타메이트를 아미노-보유 링커 또는 모이어티에 접합하거나, 라이신을 카르복실-보유 링커 또는 모이어티에 접합하기 위한 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴린-4-일-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필) 카르보디이미드(EDC; EDAC))를 사용하는 접합 과정들은 예를 들어, www.springer.com에서 입수가능한 문헌 [Holtzhauer, M., Basic Methods for the Biochemical Lab, Springer 2006, ISBN 978-3-540-32785-1]의 챕터 4에 기재되어 있다.

일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트가 페리틴의 표면-노출된 아미노산에 부착된다. 일부 실시형태에서, 하나 초과의 면역-자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트가 페리틴의 표면-노출된 아미노산에 부착된다. 일부 실시형태에서, 24개의 면역-자극 모이어티가 페리틴 다량체 또는 입자에 부착된다(예를 들어, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴 입자의 각 단량체에 대하여 하나의 모이어티). 페리틴 나노입자에 부착된 다중 면역-자극 모이어티를 갖는 일부 실시형태에서, 모든 면역-자극 모이어티는 동일하다. 페리틴 나노입자에 부착된 다중 면역-자극 모이어티를 갖는 일부 실시형태에서, 모든 면역-자극 모이어티는 동일하지 않다.

a) 면역-자극 모이어티의 유형; 아쥬반트

표면-노출된 아미노산(예를 들어, 시스테인)에 부착될 수 있는 임의의 면역-자극 모이어티는 본 개시내용에 따라 페리틴에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 B 세포 작용제이다.

일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 소수성이 아니다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 친수성이다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 극성이다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 수소 결합 또는 이온 결합이 가능하며, 예를 들어 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체, 양이온성 모이어티 또는 음이온성 모이어티를 포함한다. 모이어티는 pH 6, 7, 7.4, 또는 8과 같이 생리학적으로 관련된 pH의 수용액에서 이온화되는 경우 양이온성 또는 음이온성으로 간주된다.

일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 아쥬반트이다. 일부 실시형태에서, 아쥬반트는 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아쥬반트는 톨-유사 수용체(TLR) 작용제 또는 인터페론 유전자의 자극제(STING) 작용제이다. 일부 실시형태에서, 아쥬반트는 B 및/또는 T 세포에서 TLR 신호전달을 활성화한다. 일부 실시형태에서, 아쥬반트는 적응성 면역 반응을 조절한다.

(1) TLR2 작용제

일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 TLR2 작용제이다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 TLR2 신호전달을 자극한다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 TLR2의 합성 소분자 리간드이다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 TLR2 신호전달의 합성 소분자 작용제이다.

일부 실시형태에서, TLR2 작용제는 PAM2CSK4, FSL-1, 또는 PAM3CSK4이다.

(2) TLR7/8 작용제

일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 TLR7 및/또는 TLR8 작용제(즉, TLR7 및 TLR8 중 적어도 하나의 작용제)이다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 TLR7 및/또는 TLR8 신호전달을 자극한다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 TLR7 및/또는 TLR8의 합성 소분자 리간드이다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 TLR7 및/또는 TLR8 신호전달의 합성 소분자 작용제이다.

일부 실시형태에서, TLR7 및/또는 TLR8 작용제는 단일-가닥(ssRNA)이다. 일부 실시형태에서, TLR7 및/또는 TLR8 작용제는 이미다조퀴놀린이다. 일부 실시형태에서, TLR7 및/또는 TLR8 작용제는 뉴클레오사이드 유사체이다.

일부 실시형태에서, TLR7 및/또는 TLR8 작용제는 이미다조퀴놀린아민 톨-유사 수용체(TLR) 작용제, 예컨대 3M-012(3M Pharmaceuticals)이다. 유리 3M-012의 구조는 하기이다:

. 면역-자극 모이어티 예컨대 3M-012 또는 본원에 논의된 임의의 모이어티는, 예를 들어, 표면-노출된 시스테인의 황 또는 이 황에 부착된 링커에서, 모이어티(예를 들어, 수소)의 적당한 주변 원자를 본원에 기재된 페리틴에 대한 결합으로 대체함으로써 페리틴에 접합될 수 있음을 이해한다. 따라서, 페리틴에 접합되면 면역-자극 모이어티의 구조가 유리 분자의 구조와 약간 다를 것이다.

일부 실시형태에서, TLR7 및/또는 TLR8 작용제는 SM 7/8a이다. 유리 SM 7/8a의 구조는 하기이다:

.

예를 들어, 문헌[Nat Biotechnol.　2015 Nov;33(11):1201-10. doi: 10.1038/Nbt.3371]을 참고한다.

(3) TLR9 작용제

일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 TLR9 작용제이다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 TLR9 신호전달을 자극한다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 TLR9의 합성 소분자 리간드이다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 TLR9 신호전달의 합성 소분자 작용제이다.

일부 실시형태에서, TLR9 작용제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)이다. 일부 실시형태에서, TLR9 작용제는 메틸화되지 않은 CpG ODN이다. 일부 실시형태에서, CpG ODN은 일반 DNA에서 발견되는 천연 포스포디에스테르(PO) 백본 대신 부분적 또는 완전한 포스포로티오에이트(PS) 백본을 포함한다.

일부 실시형태에서, CpG ODN은 클래스 B ODN이며, 이는 5’ 퓨린(Pu)-피리미딘(Py)-C-G-Py-Pu 3’을 포함하는 하나 이상의 6mer 모티프를 포함하며; 완전히 인산화된(즉, PS-변형된) 백본을 갖고; 18~28개의 뉴클레오타이드 길이를 가진다. 일부 실시형태에서, CpG ODN은 서열 번호 210의 서열을 포함하며, 백본내에 포스포로티오에이트 연결을 선택적으로 포함한다.

일부 실시형태에서, TLR9 작용제는 면역-자극 서열(ISS)을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR9 작용제는 ISS-1018(Dynavax)(서열 번호 210)이다.

(4) STING 작용제

일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 STING(인터페론 유전자 단백질 자극제, 소포체 IFN 자극제로도 알려짐) 작용제이다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 STING 신호전달을 자극한다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 STING의 합성 소분자 리간드이다. 일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티는 STING 신호전달의 합성 소분자 작용제이다.

일부 실시형태에서, STING 작용제는 사이클릭 디뉴클레오타이드(CDN)이다. 예를 들어, 문헌 [Danilchanka et al., Cell 154:962-970 (2013)]을 참조한다. 예시적인 CDN은 cdA, cdG, cAMP-cGMP, 및 2’-5’,3’-5’ cGAMP를 포함한다(구조에 대해서는 문헌 [Danilchanka et al.] 참조). STING 작용제는 또한 합성 작용제, 예컨대 DMXAA를 포함한다

.

b) 접합된 RSV 폴리펩타이드

일부 실시형태에서, RSV 폴리펩타이드가 페리틴의 표면-노출된 아미노산에 접합된다. 일부 실시형태에서, RSV 폴리펩타이드는 페리틴 단백질을 항원성으로 만든다. 일부 실시형태에서, RSV 폴리펩타이드는 단독으로 항원성인 반면, 일부 실시형태에서, RSV 폴리펩타이드는 페리틴과의 연합때문에 항원성이다. 일부 실시형태에서, RSV 폴리펩타이드는 본원에 기재된 RSV F 또는 G 폴리펩타이드 중 임의의 하나이다.

c) 접합

일부 실시형태에서, 표면-노출된 시스테인(예를 들어, 본원에 기재된 돌연변이로부터 생성됨) 또는 페리틴(예를 들어, 페리틴에 대해 N-말단)에 부착된 펩타이드 링커의 시스테인이 면역-자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트, 또는 RSV 폴리펩타이드를 페리틴에 접합시키는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 링커는 이러한 시스테인에 접합되고, 링커는 후속적으로 면역-자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트 또는 RSV 폴리펩타이드에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 시스테인은 아쥬반트, 링커 또는 RSV 폴리펩타이드를 부착하기 위한 접합 반응을 위한 화학적 핸들을 생성한다. 일부 실시형태에서, 생체접합체가 생성되고, 여기서 면역자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트 또는 RSV 폴리펩타이드가 이러한 시스테인의 감소 후 페리틴에 연결된다. 일부 실시형태에서, 시스테인은 쌍을 이루지 않은 표면-노출된 시스테인이며, 즉 이황화 결합을 형성하기에 적당한 위치에 파트너 시스테인이 결여되어 있다. 일부 실시형태에서, 시스테인은 유리 티올 측쇄를 포함하는 쌍을 이루지 않은 시스테인이다.

(1) 접합 화학의 유형

면역-자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트, 또는 RSV 폴리펩타이드를, 예를 들어 표면-노출된 아미노산, 예컨대 시스테인 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 Lys, Glu, 또는 Asp의 반응을 통해 페리틴에 접합시키는데 임의의 유형의 화학이 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 접합은 클릭 화학을 사용하여 수행된다. 본원에 사용된 "클릭 화학"은 서로 신속하고 선택적으로 반응(즉, "클릭")하는 한 쌍의 작용기 간의 반응을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 클릭 화학은 온화한 수성 조건하에 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 클릭 화학 반응은 페리틴 표면상의 시스테인, 예컨대 표면-노출된 아미노산의 돌연변이로 인한 시스테인의 이점을 취하여 시스테인과 반응할 수 있는 작용기를 사용한 클릭 화학을 수행한다.

클릭 화학에 대한 기준을 충족하는 다양한 반응이 해당 분야에 알려져 있으며, 당업자는 다수의 공개된 방법론 중 어느 하나를 사용할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Hein et al., Pharm Res 25(10):2216-2230 (2008)] 참고). Sigma Aldrich, Jena Bioscience, 또는 Lumiprobe로부터의 시약과 같은, 클릭 화학을 위한 다양한 상용 시약이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접합은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 클릭 화학을 사용하여 수행된다.

일부 실시형태에서, 클릭 화학 반응은 페리틴의 환원 후에 발생한다.

일부 실시형태에서, 클릭 화학은 1-단계 클릭 반응일 수 있다. 일부 실시형태에서, 클릭 화학은 2-단계 클릭 반응일 수 있다.

일부 실시형태에서, 반응(들)은 무-금속 클릭 화학을 포함한다. 일부 실시형태에서, 반응(들)은 티올-말레이미드 및/또는 이황화 교환을 포함한다.

무-금속 클릭 화학

무-금속 클릭 화학은 단백질의 잠재적인 산화를 피하기 위해 접합 반응에 사용될 수 있다. 무-금속 클릭 화학은 항체 접합체를 형성하는 데 사용되었다(문헌 [van Geel et al., Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2233-2242] 참고).

일부 실시형태에서, 무-금속 클릭 화학은 아쥬반트를 페리틴에 부착하기 위한 반응에 사용된다. 일부 실시형태에서, 무-구리 접합은 아쥬반트를 페리틴에 부착하기 위한 반응에 사용된다. 일부 실시형태에서, 무-금속 클릭 화학은 비사이클로[6.1.0]노닌(BCN)을 사용한다. 일부 실시형태에서, 무-금속 클릭 화학은 디벤조아자사이클로옥틴(DBCO)을 사용한다. 일부 실시형태에서 BCN 또는 DBCO는 아지드기와 반응한다.

DBCO는 촉매의 부재하에 변형-촉진 클릭 반응을 통해 아지드기에 대해 높은 특이성을 가지며, 안정된 트리아졸의 높은 수율을 얻는다. 일부 실시형태에서, DBCO는 구리 촉매의 부재하에 아지드와 반응한다.

일부 실시형태에서, 무-금속 클릭 화학은 1-단계 클릭 반응에 사용된다. 일부 실시형태에서, 무-금속 클릭 화학은 2-단계 클릭 반응에 사용된다.

티올-말레이미드 및 이황화물 교환

본원에 기재된 페리틴은 설프하이드릴-반응성 화학 기와의 반응에 이용가능한 (또는 환원을 통해 이용가능하게 될 수 있는) 설프하이드릴로도 알려진 티올을 포함하는 시스테인을 포함할 수 있다. 따라서, 시스테인은 화학선택적 변형을 통해 아쥬반트와 같은 면역-자극 모이어티를 페리틴에 추가할 수 있다. 염기적 조건에서 시스테인은 탈양성자화되어 말레이미드 및 요오도아세트아미드와 같은, 연성 친전자체와 반응할 수 있는 티올레이트 친핵체를 생성할 것이다. 시스테인과 말레이미드 또는 요오도아세트아미드의 반응은 탄소-황 결합을 생성한다.

일부 실시형태에서, 설프하이드릴-반응성 화학 기는 표면-노출된 시스테인 또는 페리틴의 링커 내 시스테인과 반응한다. 일부 실시형태에서, 설프하이드릴-반응성 화학 기는 할로아세틸, 말레이미드, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴화제, 비닐설폰, 피리딜 이황화물, 또는 TNB-티올이다.

일부 실시형태에서, 설프하이드릴-반응성 화학 기는 알킬화(즉, 티오에테르 결합의 형성)에 의해 시스테인의 설프하이드릴에 접합한다. 일부 실시형태에서, 설프하이드릴-반응성 화학 기는 이황화물 교환(즉, 이황화물 결합의 형성)에 의해 시스테인의 설프하이드릴에 접합한다.

일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트를 페리틴에 접합시키는 반응은 티올-말레이미드 반응이다.

일부 실시형태에서, 설프하이드릴-반응성 화학 기는 말레이미드이다. 일부 실시형태에서, 말레이미드와 시스테인의 반응은 예를 들어 가역적이지 않은, 안정한 티오에스테르 결합 형성을 초래한다. 일부 실시형태에서, 말레이미드는 페리틴에서 티로신, 히스티딘 또는 메티오닌과 반응하지 않는다. 일부 실시형태에서, 미반응 말레이미드는 예를 들어 과량으로 유리 티올을 첨가함으로써 반응의 말미에 켄칭된다.

일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트를 페리틴에 접합시키는 반응은 이황화물 교환으로도 알려진 티올-이황화물 교환이다. 일부 실시형태에서, 반응은 원래의 이황화물의 일부를 포함하는 혼합된 이황화물의 형성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원래의 이황화물은 표면-노출된 아미노산의 돌연변이 또는 N-말단 링커의 첨가에 의해 페리틴에 도입된 시스테인이다.

일부 실시형태에서, 설프하이드릴-반응성 화학 기는 피리딜 디티올이다. 일부 실시형태에서, 설프하이드릴-반응성 화학 기는 TNB-티올 기이다.

(2) 접합된 링커

일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트, 또는 RSV 폴리펩타이드는 시스테인과 같은 표면-노출된 아미노산에 공유결합된 링커를 통해 페리틴에 부착된다. 일부 실시형태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어 PEG 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG) 링커는 면역-자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트에 연결된 페리틴의 수용성 및 결찰 효율을 증가시킨다. PEG 링커는 2 내지 18개의 PEG 길이, 예를 들어, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13, PEG14, PEG15, PEG16, PEG17, 및 PEG18이다.

일부 실시형태에서, 링커는 말레이미드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 면역-자극 모이어티(ISM)-링커-말레이미드의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, ISM-링커-말레이미드는 말레이미드와 페리틴의 시스테인과의 반응에 의해 1-단계 클릭 화학 반응에서 페리틴에 접합된다. 일부 실시형태에서, 아쥬반트-링커-말레이미드의 ISM은 SM7/8a이다. 일부 실시형태에서, ISM-링커-말레이미드의 링커는 PEG4이다. 일부 실시형태에서, ISM-링커-말레이미드는 SM7/8a-PEG4-말레이미드이다.

일부 실시형태에서, 2-단계 클릭 화학 프로토콜은 한쪽 끝에 설프하이드릴-반응성 화학 기 및 다른 쪽 끝에 아민-반응성 기를 포함하는 링커와 함께 사용된다. 이러한 2-단계 클릭 화학 프로토콜에서, 설프하이드릴-반응성 화학 기는 페리틴의 시스테인과 반응하는 반면, 아민-반응성 기는 ISM에 부착된 시약과 반응한다. 이러한 방식으로, ISM은 2개의 클릭 화학 시약 세트를 통해 페리틴에 접합된다.

2-단계 클릭 화학 프로토콜의 일부 실시형태에서, 설프하이드릴-반응성 화학 기는 말레이미드이다. 2-단계 클릭 화학 프로토콜의 일부 실시형태에서, 말레이미드는 표면-노출된 아미노산의 돌연변이 또는 N-말단 링커의 첨가에 의해 페리틴에 도입된 시스테인과 반응한다.

2-단계 클릭 화학 프로토콜의 일부 실시형태에서, 아민-반응성 기는 DBCO이다. 2-단계 클릭 화학 프로토콜의 일부 실시형태에서, DBCO는 ISM에 부착된 아지드 기와 반응한다.

일부 실시형태에서, 말레이미드-링커-DBCO가 사용된다. 일부 실시형태에서, 말레이미드-링커-DBCO는 페리틴이 환원된 후 페리틴에 접합된다. 일부 실시형태에서, 말레이미드-링커-시약은 제1 단계에서 페리틴의 시스테인과 말레이미드와의 반응에 의해 페리틴에 접합된다. 일부 실시형태에서, DBCO는 아지드에 부착된 ISM에 연결하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 아지드에 결합된 ISM은 ISS-1018이다. 일부 실시형태에서, 아지드에 결합된 아쥬반트는 3M-012 또는 CpG이다.

일부 실시형태에서, 반응성 기를 갖는 링커가 ISM에 추가된다. 일부 실시형태에서, 링커는 PEG4-아지드 링커 또는 PEG4-말레이미드 링커이다.

일부 실시형태에서, PEG4-아지드 링커는 3M-012에 접합된다. PEG4-아지드 링커에 접합된 3M-012의 예시적인 구조는 하기이다:

일부 실시형태에서, PEG4-아지드 링커는 SM7/8a에 접합된다. PEG4-아지드 링커에 접합된 SM7/8a의 예시적인 구조는 하기이다:

일부 실시형태에서, PEG4-말레이미드 링커는 SM7/8a에 접합된다. PEG4-말레이미드 링커에 접합된 SM7/8a의 예시적인 구조는 하기이다:

일부 실시형태에서, 아지드 기는 ISS-1018에 접합된다. NHS 에스테르-아지드 링커에 접합된 ISS-1018의 예시적인 구조는 하기이다:

E. 링커

일부 실시형태에서, 링커는 페리틴의 아미노산 서열로부터 RSV 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 분리한다. 임의의 링커가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 (예를 들어, 단일 오픈 리딩 프레임(single open reading frame)으로부터) 융합 단백질로서 항원성 페리틴 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있는 펩타이드 링커이다. 일부 실시형태에서, 링커는 글리신-세린 링커이다. 일부 실시형태에서, 글리신-세린 링커는 GS, GGGS(서열 번호 226), 2XGGGS(서열 번호 227)(즉, GGGSGGGS(서열 번호 227)), 또는 5XGGGS(서열 번호 228)이다. 링커는 페리틴에 대한 N- 또는 C-말단일 수 있다.

일부 실시형태에서, 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 약 2~4, 2~6, 2~8, 2~10, 2~12, 또는 2~14개의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 적어도 15개의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 적어도 25개의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 적어도 30개의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 적어도 35개의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 적어도 40개의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 60개 이하의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 50개 이하의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 약 16, 28, 40, 46, 또는 47개의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 가요성이다. 일부 실시형태에서, 링커는 면역-자극 모이어티(예를 들어, 아쥬반트)의 접합을 위한 부위로서 사용하기 위한 시스테인을 포함하며; 시스테인을 포함하는 예시적인 링커는 서열 번호 225로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 링커는 서열 번호 225에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 서열 번호 225의 시스테인에 상응하는 시스테인을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 적어도 25개의 아미노산(예를 들어, 25 내지 60개의 아미노산)을 포함하며, 시스테인은 N-말단으로부터의 8번째 아미노산으로부터, C-말단으로부터의 8번째 아미노산까지, 또는 링커의 중앙 잔기 또는 결합의 10개의 아미노산 이내의 범위의 위치에 위치된다.

일부 실시형태에서, 링커는 글리신(G) 및/또는 세린(S) 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 글리신(G), 세린(S), 아스파라긴(N), 및/또는 알라닌(A) 아미노산, 및 선택적으로 상기 논의된 시스테인을 포함하거나, 이들로 구성된다. 일부 실시형태에서, 링커는 서열 번호 222에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSG(서열 번호 220), GGSGSGSNSSASSGASSGGASGGSGGSG(서열 번호 221), GGSGSASSGASASGSSNGSGSGSGSNSSASSGASSGGASGGSGGSG(서열 번호 222), 또는 GS를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 FR1(서열 번호 223) 또는 FR2(서열 번호 224)를 포함한다.

일부 실시형태에서, 페리틴은 황소개구리 페리틴(하이브리드 페리틴으로 지칭됨)의 아미노 말단 연장을 갖는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 하이브리드 페리틴은 표면 상에 균일하게 분포된 RSV 폴리펩타이드-부착 부위를 갖는 다량체를 형성한다(문헌 [Kanekiyo 2015] 참고). 일부 실시형태에서, 하이브리드 페리틴과의 N-말단 융합 단백질은 페리틴 나노입자 표면 상의 RSV 폴리펩타이드의 제시를 허용한다. 일부 실시형태에서, 페리틴은 서열 번호 208의 위치 13(하이브리드 페리틴, 이 글루타메이트를 포함함) 또는 서열 번호 209의 위치 6(야생형 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴, 위치 6은 이소류신임)에 상응하는 위치에 글루타메이트를 포함한다. 황소개구리 링커와 함께, 이 글루타메이트는 인간과 황소개구리 페리틴(인간 경쇄 및 황소개구리 하부 서브유닛 페리틴 모두에서 6R 및 14E)에서 발견되는 보존된 염 브릿지를 보존하는 것으로 생각된다. 문헌 [Kanekiyo et al., Cell 162, 1090-1100 (2015)]을 참고한다.

일부 실시형태에서, RSV 폴리펩타이드는 시스테인-트롬빈-히스티딘 링커를 통해 페리틴에 연결된다. 일부 실시형태에서, 이 링커는 클릭 화학을 통해 모이어티(예를 들어, 면역-자극 모이어티 또는 RSV 폴리펩타이드)를 페리틴에 직접 접합시키는 데 사용된다. 시스테인-트롬빈-히스티딘 링커를 포함하는 예시적인 서열은 서열 번호 218이다. 시스테인-트롬빈-히스티딘 링커를 포함하는 접합 반응에 적합한 클릭 화학은 위에서 논의되었다.

일부 실시형태에서, 면역-자극 모이어티, 예컨대 아쥬반트를 위한 접합 부위로서 시스테인을 포함하는 링커는 쌍을 이루지 않은, 표면-노출된 시스테인이 결여된 페리틴 분자를 포함하는 작제물에서, 또는 쌍을 이루지 않은, 표면-노출된 시스테인을 포함하는 페리틴 분자를 포함하는 작제물에서 사용된다.

일부 실시형태에서, 작제물은 링커를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 작제물은 하나의 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 작제물은 2개 이상의 링커를 포함한다.

F. 조성물; 백신접종을 위한 용도 및 방법

일부 실시형태에서, 본 발명은 RSV 감염에 대해 대상체를 면역화하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 대상체에서 RSV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 대상체에게 본원에 기재된 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 대상체에게 본원에 기재된 항원성 RSV 폴리펩타이드, 항원성 페리틴 폴리펩타이드, 또는 나노입자의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드, 나노입자, 또는 융합 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 비히클, 아쥬반트, 또는 부형제 중 임의의 하나 이상을 포함하는 조성물이 제공된다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드, 나노입자, 또는 조성물은 RSV로 인한 감염에 대해 면역화하기 위해 인간과 같은 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 RSV에 의한 미래 감염에 대한 보호 면역 반응을 생성하기 위해 인간과 같은 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드, 나노입자 또는 조성물 중 임의의 하나 이상은 RSV로 인한 감염에 대한 면역화에 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드, 나노입자 또는 조성물 중 하나 이상은 RSV에 의한 미래 감염에 대한 보호 면역 반응을 생성하는 데 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 보호 면역 반응은 RSV에 의한 감염, 폐렴, 세기관지염 또는 천식의 발생률을 감소시킨다.

일부 실시형태에서, 조성물은 본원에 기재된 RSV F 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본원에 기재된 RSV G 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본원에 기재된 RSV F 폴리펩타이드 및 RSV G 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본원에 기재된 RSV G 폴리펩타이드 및 RSV F 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본원에 기재된 RSV F 폴리펩타이드 및 본원에 기재된 RSV G 폴리펩타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 융합후 RSV F 폴리펩타이드에 의한 면역화에 비해 RSV에 대하여 우수한 중화 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 RSV F 폴리펩타이드(예를 들어, 본원에 기재된 RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 나노입자)에 의한 면역화는 융합후 RSV F에 의한 면역화에 비해 융합전 RSV F에 대한 항체의 더 높은 역가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 RSV F 폴리펩타이드에 의한 면역화는 융합후 RSV F에 의한 면역화에 비해 융합후 RSV F에 대한 항체의 더 낮은 역가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 RSV F 폴리펩타이드에 의한 면역화는 융합후 RSV F에 의한 면역화에 비해 융합전 RSV F에 대한 전체 항체의 더 높은 비율을 유도한다. 본원에 기재된 RSV 항원에 의한 면역화는 융합후 RSV F에 의한 면역화에 비해 RSV에 대한 더 양호한 보호를 제공할 수 있다. 융합후 RSV F 내에 존재하고 융합전 F와 공유되는 에피토프는 중화되지 않을 수 있으며, 일부 경우에는 RSV 감염을 증가시키는 항체를 유도하는 것으로 제안되었다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 융합후 RSV F에 대한 항체를 감소시키면서, RSV에 대한 더 높은 중화 반응을 유도한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 융합후 F 결합 반응에 대한 더 높은 RSV 중화 역가를 유도한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 RSV 항원에 의한 면역화는 융합후 RSV F에 의한 면역화에 비해 개선된 안전성 프로파일을 생성한다. 이러한 개선된 안전성 프로파일은 융합후 형태로 존재하는 비-중화성 에피토프 또는 거의 중화하지 않는 에피토프를 차단하는 것과 관련될 수 있다. 융합후 형태에 결합하는 항체는 항체 매개 바이러스 감염을 통해 RSV 감염을 증가시킬 수 있다고 보고되었다. 따라서, RSV 바이러스를 유의하게 중화하지 않는 융합후 항체는 융합전 및 융합후 형태를 모두 인식하는 것과 같은 RSV 감염을 증가시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 RSV G 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 RSV에 대한 중화 반응을 유도한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 RSV F 및 RSV G 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 RSV에 대한 중화 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 RSV F 및 RSV G 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 RSV에 대한 개선된 보호, 예를 들어 두 항원을 모두 포함하지 않는 조성물보다 더 높은 중화 역가를 제공한다.

1. 대상체

일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.

일부 실시형태에서, 대상체는 성인(18세 이상)이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 아동 또는 청소년(18세 미만)이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 노인(60세 초과)이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 비-노인 성인(18세 이상 및 60세 이하)이다.

일부 실시형태에서, 조성물의 1 회 초과의 투여가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 부스터 투여는 면역 반응을 개선한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 항원성 폴리펩타이드 또는 조성물은 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들어, 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이(예를 들어, 마카크, 예컨대 레서스 또는 사이노몰구스) 또는 유인원), 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 또는 가축 포유동물(예를 들어 개, 토끼, 고양이, 말, 양, 소, 염소, 낙타 또는 당나귀)에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 항원성 폴리펩타이드 또는 조성물은 새, 예컨대 가금류(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 기니 새 또는 백조)에 사용하기 위한 것이다.

2. 아쥬반트

본원에 기재된 바와 같이, 아쥬반트는 표면 노출된 아미노산, 예를 들어 시스테인을 통해 페리틴에 접합될 수 있다. 접합되지 않은 아쥬반트는 또한 본원에 기재된 항원성 페리틴 폴리펩타이드와 함께 대상체에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원성 페리틴 폴리펩타이드와 함께 아쥬반트를 투여하면, 아쥬반트 없이 RSV 폴리펩타이드 단독, 또는 항원성 페리틴 폴리펩타이드 단독으로 투여하는 것과 비교하여 대상체에서 RSV 폴리펩타이드에 대해 더 높은 역가의 항체가 생성된다. 아쥬반트는 항원성 폴리펩타이드에 대해 더 일찍, 더욱 강력하거나, 더욱 지속적인 면역 반응을 촉진할 수 있다.

일부 실시형태에서, 조성물은 하나의 아쥬반트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 초과의 아쥬반트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 아쥬반트를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 아쥬반트는 알루미늄을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아쥬반트는 인산 알루미늄이다. 일부 실시형태에서, 아쥬반트는 Alum(Alyhydrogel ’85 2%; Brenntag - Cat# 21645-51-2)이다.

일부 실시형태에서, 아쥬반트는 유기 아쥬반트이다. 일부 실시형태에서, 아쥬반트는 유성 아쥬반트이다. 일부 실시형태에서, 아쥬반트는 수중유형 나노에멀젼을 포함한다.

일부 실시형태에서, 아쥬반트는 스쿠알렌을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스쿠알렌을 포함하는 아쥬반트는 Ribi(Sigma 아쥬반트 system Cat #S6322-1vl), Addavax^TM MF59, AS03, 또는 AF03이다(미국 특허 제9703095호 참고). 일부 실시형태에서, 스쿠알렌을 포함하는 아쥬반트는 나노에멀젼이다.

일부 실시형태에서, 아쥬반트는 폴리아크릴산 중합체(PAA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, PAA를 포함하는 아쥬반트는 SPA09이다(국제공개 WO 2017/218819호 참고).

일부 실시형태에서, 아쥬반트는 대사불가능한 오일을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아쥬반트는 불완전 프로인트(Freund) 아쥬반트(IFA)이다.

일부 실시형태에서, 아쥬반트는 대사불가능한 오일 및 사멸된 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아쥬반트는 완전 프로인트(Freund) 아쥬반트(CFA)이다.

일부 실시형태에서, 아쥬반트는 리포폴리사카라이드이다. 일부 실시형태에서, 아쥬반트는 모노포스포릴 A(MPL 또는 MPLA)이다.

3. 약제학적 조성물

다양한 실시형태에서, 본원에 기재된 항원성 페리틴 폴리펩타이드 및/또는 관련 개체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 병원체에 대한 보호 면역 반응과 같은 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)이다.

예를 들어, 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (1) (i) 표면-노출된 아미노산을 시스테인으로 대체하는 돌연변이 및 (ii) RSV 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 페리틴 단백질; (2) (i) 표면 노출된 아미노산을 시스테인 및 시스테인에 연결된 면역-자극 모이어티로 대체하는 돌연변이 및 (ii) RSV 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 페리틴 단백질; (3) (i) 표면-노출된 시스테인, (ii) 페리틴 단백질에 대한 N-말단의 펩타이드 링커, 및 (iii) 펩타이드 링커에 대한 RSV 폴리펩타이드 N-말단을 포함하는 항원성 페리틴 단백질; (4) (i) 표면 노출된 아미노산을 시스테인 및 시스테인에 연결된 면역-자극 모이어티로 대체하는 돌연변이, (ii) 쌍으로 또는 구조적 정렬에 의해 결정된 바와 같이, 비-시스테인 아미노산으로, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 위치 31에서의 내부 시스테인을 대체하는 돌연변이, 또는 비-헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 위치 31과 유사한 위치에서의 내부 시스테인을 대체하는 돌연변이, (iii) 표면-노출된 아스파라긴을 비-아스파라긴 아미노산으로 대체하는 돌연변이, 및 (iv) RSV 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 페리틴 단백질; 또는 (5) 상기 페리틴 단백질 중 임의의 것을 포함하는 페리틴 입자. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드, 및/또는 RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드를 포함하며, 융합전 RSV F와 융합후 RSV F 사이에 공유되는 RSV 폴리펩타이드의 에피토프가 차단되며, 상기 RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 아미노산 잔기 62~69 및 196~209 및 서열 번호 26의 위치 328, 348, 또는 507에 상응하는 아스파라긴을 포함하며, 선택적으로 상기 항원성 RSV 폴리펩타이드는 페리틴을 더 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항원성 폴리펩타이드와 관련된 항체 또는 기타 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본원에 기재된 항원성 폴리펩타이드에 결합하고/하거나 이와 경쟁하는 항체들을 포함한다. 대안적으로, 항체는 본원에 기재된 항원성 폴리펩타이드의 RSV 폴리펩타이드 성분을 포함하는 바이러스 입자를 인식할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 제제, 예를 들어, 상기 기재된 아쥬반트와 조합하여 투여되어 면역 반응을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본원에 기재된 아쥬반트를 더 포함한다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함한다. 본원에 사용된 용어 "담체"는 약제학적 조성물과 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 예시적인 실시형태에서, 담체는 예를 들어 물 및, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등과 같은 석유, 동물성, 식물 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일과 같은, 멸균 액체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체는 하나 이상의 고체 성분이거나, 이를 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 부형제는 예를 들어 원하는 일관성 또는 안정화 효과를 제공하거나, 이에 기여하기 위해 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 임의의 비-치료제이다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다양한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균된다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 안정화제, 완충제 또는 보존제와 같은 다양한 첨가제 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 농축제, 윤활제 및 착색제가 포함될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 임의의 원하는 투여 방식에 접합하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 점적, 정제, 환제, 펠릿, 캡슐, 액체함유 캡슐, 젤라틴 캡슐, 분말, 서방형 제제, 좌약, 에멀젼, 에어로졸, 스프레이, 현탁액, 동결건조된 분말, 동결된 현탁액, 건조된 분말의 형태 또는 사용에 적합한 기타 다른 형태를 취할 수 있다. 약제의 제형화 및 제조에 대한 일반적인 고려 사항은 예를 들어 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에서 찾아볼 수 있으며; 이는 본원에 인용되어 포함된다.

약제학적 조성물은 임의의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여 경로는 예를 들어, 경구, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 점막, 경막외, 설하, 비강내, 뇌내, 질내, 경피, 직장, 기관내 점적, 기관지 점적, 흡입 또는 국소를 포함한다. 투여는 국소적 또는 전신적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 경구로 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 투여는 비경구 주사에 의해 수행된다. 일부 예에서, 투여는 본원에 기재된 항원성 페리틴 폴리펩타이드를 혈류로 방출시킨다. 투여 방식은 의사의 재량에 맡길 수 있다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 근육내, 복강내 및 피하)에 적합하다. 이러한 조성물은 예를 들어 용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼 등으로 제형화될 수 있다. 이들은 또한 사용 직전에 멸균 주사가능한 매질에 용해 또는 현탁될 수 있는 멸균 고체 조성물(예를 들어, 동결건조 조성물)의 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 비경구 투여는 주사에 의해 달성될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 주사제는 통상적인 형태로, 즉 액체 용액 또는 현탁액 또는, 주사 전에 액체의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로서, 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 동결건조 분말 또는 과립으로부터 제조된다.

추가 실시형태에서, 약제학적 조성물은 (예를 들어, 폐 및 호흡기로의 직접 전달을 위해) 흡입에 의한 전달용으로 제형화된다. 예를 들어, 조성물은 비강 스프레이 또는 임의의 다른 공지된 에어로졸 제형의 형태를 취할 수 있다. 일부 실시형태에서, 흡입 또는 에어로졸 전달을 위한 제제는 복수의 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 제제는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 또는 약 13 마이크론의 평균 입자 크기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 흡입 또는 에어로졸 전달을 위한 제제는 건조 분말로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 흡입 또는 에어로졸 전달을 위한 제제는 예를 들어, 습윤제의 포함을 통해, 습윤 분말로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 습윤제는 물, 식염수, 또는 생리학적 pH의 다른 액체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 비강 또는 구강 점적제로서 투여된다. 일부 실시형태에서, 용량은 복수의 점적(예를 들어, 1~100, 1~50, 1~20, 1~10, 1~5, 등)을 포함할 수 있다.

본 약제학적 조성물은 원하는 결과를 얻기 위해 적당한 임의의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 원하는 결과는 조성물에 존재하는 항원성 페리틴 폴리펩타이드에 존재하는 RSV 폴리펩타이드의 공급원에 대한 오래 지속되는 적응 면역 반응의 유도이다. 일부 실시형태에서, 상기 원하는 결과는 하나 이상의 감염 증상의 강도, 중증도, 빈도의 감소 및/또는 발병 지연이다. 일부 실시형태에서, 상기 원하는 결과는 감염의 억제 또는 예방이다. 필요한 용량은 대상체의 종, 연령, 체중 및 일반적인 상태, 예방 또는 치료되는 감염의 중증도, 사용되는 특정 조성물 및 그의 투여 방식에 따라 대상체마다 다를 것이다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 단일 또는 다중 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 상이한 날에 투여되는 다중 용량으로 투여된다(예를 들어, 프라임-부스트(prime-boost) 백신접종 전략). 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 부스터 요법의 일부로 투여된다.

다양한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가 치료제와 함께 공동-투여된다. 공동-투여는 투여 타이밍이 약제학적 조성물의 추가 치료제 및 활성 성분(들)의 약리학적 활성이 시간에 따라 중첩되도록 하여 조합된 치료 효과가 발휘되는 경우, 치료제를 동시에 투여할 필요가 없다. 일반적으로 각 제제는 해당 제제에 대해 결정된 용량과 시간 일정에 따라 투여될 것이다.

4. 핵산/mRNA

또한 본원에 기재된 항원성 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 제공된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA이다. 번역을 거쳐 폴리펩타이드를 생성할 수 있는 임의의 핵산은 본 개시내용의 목적을 위한 mRNA로 간주된다.

5. 키트

또한 본원에는 본원에 기재된 하나 이상의 항원성 폴리펩타이드, 핵산, 항원성 페리틴 입자, 항원성 루마진 합성효소 입자, 조성물 또는 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 용매, 용액, 완충제, 지침서 또는 건조제 중 하나 이상을 더 포함한다.

[표 1]

본 설명 및 예시적인 실시예는 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위의 목적을 위해, 달리 표시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 양, 백분율 또는 비율 및 기타 수치를 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수식되지 않은 경우까지도, 이와 같이 수식된 것으로써 이해되어야 한다. "약"은 예를 들어 10%, 5%, 2%, 또는 1% 내에서, 기재된 주제의 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 변동 정도를 나타낸다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 매개변수는 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한, 보고된 유효 자릿수와 일반적인 반올림 기술을 적용하여 각 수치 매개변수가 적어도 해석되어야 하며, 이는 청구범위에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하고자 하는 것이 아니다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 및 임의의 단어의 임의의 단수 사용은 해당 지시대상에 대해 명시적이고 명백하게 제한되지 않는한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "포함하다" 및 그의 문법적 변형은 비제한적인 것으로 의도되어, 목록에 있는 항목의 인용은, 나열된 항목에 대체되거나 추가될 수 있는 다른 유사한 항목의 제외가 아니다.

실시예

하기 실시예는 특정 개시된 실시형태를 예시하기 위해 제공되며, 어떠한 방식으로든 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

1. RSV F 폴리펩타이드에 대한 변형의 설계 및 특성화

다른 파라믹소 바이러스 F 단백질과 마찬가지로, RSV F는 N-말단 신호 펩타이드, 및 단백질을 바이러스 표면에 고정시키는 C-말단 막횡단 영역을 갖는 전구체 단백질로 발현된다. RSV F는 프로테아제 퓨린에 의해 세포내 절단을 거쳐 소수성 융합 펩타이드(도 1a에서 "FP")를 방출하며, 이는 감염 동안 표적 세포에 부착하는 역할을 한다. 융합 펩타이드에 인접하여 헵타드 반복 영역 A(HRA)가 있는 반면, 헵타드 반복 영역 B(HRB)는 막횡단 도메인에 인접해 있다.

융합전 및 융합후 형태에서 RSV F 엑토도메인 삼량체의 결정 구조는 HRA 및 HRB 영역이 세포 융합 이벤트를 유도하기 위해 어떻게 상당한 재배열을 겪는지 입증한다(도 1b)(문헌[Swanson, K.A., et al., Proc Natl Acad Sci U S A 108(23): p. 9619-24 (2011)]; [McLellan, J.S., et al., Science 342(6158):592-598 (2013)]; [McLellan, J.S., et al., J Virol 85(15):7788-96 (2011)]; 및 [McLellan, J.S., et al., Science 342(6158): p. 592-8 (2013)] 참고). 융합전 형태에서 헵타드 반복 A(HRA) 영역은 구상 헤드와 연합되며, 융합 펩타이드의 끝은 대부분 단백질의 중앙에 매립되어 있다. 융합전 형태는 많은 나선을 포함하고, 프로토머 사이의 특정 접촉을 포함하여 융합전 삼량체를 형성한다.

일련의 아미노산 치환은 프로토머간 안정화되도록 설계되었다. 예시적인 치환은 V207L; N228F; I217V 및 E218F; I221L 및 E222M; 또는 Q224A 및 Q225L을 포함한다. 실시예에서 모든 RSV F 아미노산 서열 넘버링은 서열 번호 26의 넘버링을 사용한다.

아미노산 치환은 나선 안정화가 되도록 설계되었다. 이와 같이, 이러한 치환은 RSV F의 나선 도메인을 안정화시킬 것으로 예상된다. 예시적인 치환은 N216P 또는 I217P를 포함한다.

아미노산 치환은 프로토머내 안정화되도록 설계되었다. 예시적인 치환은 V220I; 또는 A74L 및 Q81L을 포함한다.

아미노산 치환은 나선 캡핑이 되도록 설계되었다. 예시적인 치환은 N216P 또는 I217P를 포함한다.

아미노산 치환은 응집을 감소시키도록 설계되었다. 예시적인 치환은 V192E 및 L61Q를 포함한다.

다른 아미노산 치환은 N228F와 같은 소수성 아미노산을 도입하여 공동을 채우도록 설계되었다.

아미노산 치환 E328N, S348N, 및 R507N은 비-아스파라긴 잔기를 아스파라긴으로 대체하여 글리코실화 부위를 추가하도록 설계되었다. 비-네이티브 글리칸의 추가가 융합전 F 단백질 표면 상의 융합후 RSV F(도 1b)에 노출되는 에피토프를 차단하는 데 사용될 수 있다는 가설을 세웠다.

관심의 RSV F 작제물은 N-말단 황소개구리 페리틴 링커 및 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴(pFerr)을 포함하는 하이브리드 페리틴과 함께 단일 사슬(scF) 융합 단백질로서 생성되었다(도 1a). 페리틴은 K79C 또는 S111C 돌연변이로 인한 표면-노출된 시스테인을 포함했다(페리틴 서열 넘버링은 서열 번호 208에 해당함).

다양한 RSV Pre-F-NP 및 페리틴 코딩 서열의 생성은 해당 분야에 알려진 표준 클로닝 관행을 사용하여 수행되었다. 일반적으로 말해서, 기재된 치환을 갖는 RSV F 작제물에 대한 DNA는 Genscript에 의해 합성되고 포유류 발현 벡터로 클로닝되었다. RSV F DS-CAV1 및 융합후 F 삼량체는 이전에 발표된 프로토콜과 유사하게 생성되었다(문헌[McLellan, J.S., et al., Science 342(6158):592-598 (2013)] 참고). DS-CAV1 작제물은 RSV F의 C 말단 삼량체화 도메인을 보유하고, 이를 공동-충전 소수성 치환과 결합했다. RSV F DS-CAV1은 S155C-S290C 이황화물 멀티네이션(multination)(DS) 및 S190F-V207L(CAV1)을 포함한다.

RSV F-페리틴 나노입자, 네이키드 페리틴(즉 RSV F에 커플링되지 않음), 및 RSV F 삼량체를 암호화하는 벡터들을 293EXPI 세포에 형질감염시키고, 4일 후 컨디셔닝된 배지로부터 발현 생성물을 수확하였다. RSV F 나노입자는 pH 7.0 및 8.5에서 일련의 음이온성 Q 컬럼 정제(GE Healthcare, Cat # 17-1154-01)에 의해 정제된 다음, PBS(GE Healthcare Cat# 90-1000-42)에서 기존의 크로마토그래피 방법을 사용하여 Superose 6 SEC 정제를 수행하였다. DS-CAV1 융합전 삼량체 및 융합후 삼량체를 -80℃에서 저장하고, RSV F 나노입자를 4℃에서 저장하였다.

RSV F나노입자의 형태를 결정하기 위해, 전자 현미경검사를 수행하였다. RSV F나노입자 제제(25 mM Tris, 50 mM NaCl 중의 30 μg/mL)를 400-메시 탄소-코팅된 그리드(Electron Microscopy Sciences) 상에 흡수시키고, 0.75% 우라닐 포르메이트로 염색하였다. 80 kV에서 작동하는 JEOL 1200EX 현미경을 사용하여 샘플을 분석하였다. 현미경사진을 65,000배 배율로 촬영하고, EM company Nanoimaging Services, INC(캘리포니아주 샌디에고 소재)(도 1d)에 의해 현장에서 통상적인 방법을 사용하여 2D 클래스 평균을 제조하였다.

일시적으로 형질감염된 293 EXPI 세포(Invitrogen)에 의한 상기 RSV F 폴리펩타이드 및 페리틴(서열 번호 1~8 및 11~15)을 포함하는 폴리펩타이드의 발현 및 분비를 항-RSV F 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 모든 항-RSV F 웨스턴 블롯은 문헌[McLellan et al., Science 340(6136):1113-1117 (2013)] 및 미국 특허 제8,562,996호에 기재된 부위 0-특이적 D25 항체를 사용하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 많은 작제물이 성공적으로 발현되고 분비되었다.

RF8085 폴리펩타이드(서열 번호 1)는 페리틴 나노입자에 대한 N-말단 융합된 공개된 DS-CAV1 RSV F(문헌[McLellan, J.S., et al., Science 342(6158):592-598 (2013)] 참고)의 단일 사슬 돌연변이체를 나타낸다. 이 작제물은 항원성 부위 0을 보유하는 RSV F의 S155C-S290C 이중 돌연변이체(DS)를 포함한다.

RF8106 폴리펩타이드(서열 번호 9)는 DS-CAV1로 치환된 2개의 시스테인 대신 I217P 치환을 갖는다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, RF8106 작제물은 항-RSV F 웨스턴 블롯에 의해 4일 후에 컨디셔닝된 배지로부터 평가된 바와 같이 일시적으로 형질감염된 293 EXPI 세포에서 훨씬 더 우수한 발현을 가졌다.

RF8106의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 융합 단백질 나노입자와 일치하는 RSV 항원에 융합된 조립된 페리틴 입자와 일치하는 보유 시간에서 주요 피크의 용리를 보여주었다(Pre-F-NP, 도 4). 환원된(도 5b) 및 비-환원 상태(도 5a)에서 RF8106의 동적 광산란(DLS) 분석을 수행하였다. 2 mM TCEP 처리에 의해 환원이 이루어졌다. RF8106은 약 15 nm의 반경을 가지며, 이는 환원 및 비환원 상태 모두에서 나노입자(24-량체)에 통합되는 것과 일치한다. 환원제에 대한 융합 단백질의 안정성은 후술하는 바와 같이 융합 단백질에 아쥬반트의 접합을 촉진하여 자가-보조 나노입자를 형성한다.

다음으로, RSV F 폴리펩타이드 및 페리틴(Pre-F-NP)의 융합 단백질에 대한 아쥬반트의 접합을 평가하였다. 페리틴 상의 유리 표면 시스테인이 scF-pFerr 융합 단백질에 추가 모이어티를 부착하는 데 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 도 6은 쿠마시(Coomassie)-염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 평가된 바와 같이 분자량 증가에 의해 입증된 바와 같이, 서열 T*G*A*C*T*G*T*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*G*A*T*G*A(서열 번호 30; 별표는 포스포로티오에이트 결합을 나타냄)을 갖는 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)와 RF8106의 성공적인 접합을 보여준다.

E328N, S348N, 및 R507N 치환(RF8117, 서열 번호 17)을 사용하여 글리코실화 부위를 추가하는 것의 효과는 페리틴과의 융합 단백질로서(즉, Pre-F-NP 작제물로서), 이 작제물로 일시적으로 형질감염된 293EXPI 세포에서 평가하였다. RF8113에서와 같이 RF8117도 I217P 치환을 함유한다. 도 7에 나타낸 바와 같이, RF8085 대조군 작제물 및 RF8113 작제물(서열 번호 16, I217P의 프롤린 치환을 포함하지만, E328N, S348N, 및 R507N 치환을 포함하지 않음) 둘다와 비교하여 RF8117에 대해 증가된 발현이 보였다. RF8113은 조작된 페리틴 시스테인이 S111C가 아닌 페리틴 잔기 K79C에 있다는 점 외에는, 이전에 설명한 RF8106과 유사하다. RF8117 작제물은 또한 RF8113 및 RF8117의 분자량 증가를 보여줬으며, 이는 글리칸의 성공적인 첨가를 나타낸다.

도 8은 Pre-F-NP의 단백질분해 안정성을 증가시킨 RSV F 나노입자에 대한 변형을 요약한 것이다. 출발 작제물은 RF8117(상기)이었다. 초기 작제물 RF8085가 RF8090으로서 CHO 벡터에 클로닝되고, CHO 세포로 형질감염되었을 때, 일부 물질이 F와 페리틴 모이어티 사이에 클리핑되는 것이 관찰되었다. HRB 영역의 아르기닌 또는 라이신 잔기 또는 F와 페리틴 모이어티 사이의 링커가 트립신-유사 프로테아제에 의해 절단되는 것으로 의심되었다. 영역 내의 라이신 및 아르기닌 잔기에 대한 돌연변이는 293개 세포에서의 발현과 관련하여 테스트되었다. 도 8은 돌연변이 K498L 및 R508Q(RF8122, 서열 번호 18)가 RF8117에 비해 발현에 영향을 미치지 않거나 증가하지 않는 것으로 확인한다. R523Q를 갖는 이들 돌연변이는 RF8117의 본원에 언급된 돌연변이와 조합되어 작제물 RF8140(서열 번호 23)을 형성하였다.

293개 세포 발현(상기 치환을 갖는 예시적인 작제물은 RF8106(서열 번호 9) 및 RF8113(서열 번호 16)을 포함함)에서 단일 사슬 및 프롤린(I217P) 변형의 조합에 의해 큰 발현 개선(대략 5-배)이 보여졌으며, RSV F의 추가된 글리코실화 부위 변형으로부터 발현 및 용해도가 더욱 개선되었다(예시적인 작제물 RF8117(서열 번호 17) 및 RF8140(서열 번호 23). 이들 작제물들은 모두 서열 GSGNVGL(서열 번호 31)로 대체된 융합 펩타이드 및 p27 펩타이드 영역들(서열 번호 26의 아미노산 98~144)을 갖는다. 그러나 RF8090이 CHO 제조 세포주에서 발현되었을 때 웨스턴 블롯내 추가 RSV F 밴드가 관찰되었으며, 이는 작제물이 단백질분해, 아마도 아르기닌 또는 라이신 잔기에서 트립신-유사 절단에 취약하다는 것을 시사한다.

프로테아제 민감성의 잠재적인 역할도 조사하였다. HRB 영역에서, 및 F 모이어티와 페리틴 모이어티 사이의 링커에서, K 잔기(녹아웃 또는 KO)의 치환은 CHO 제조 세포주에서 초기에 관찰된 K-매개 절단의 가능한 부위일 것으로 예측되었기 때문에 이루어졌다. 도 9a 및 9b에 나타낸 바와 같이, RF8117 및 RF8140은 모두 D25 웨스턴 블롯 또는 D25 및 AM14 Octet 분석에 의해 측정된 바와 같이 CHO 제조 세포주에서의 RF8090에 비해 높은 수준으로 발현된다.

이들 데이터는 나선 캡핑, 글리코실화 증가, 프로테아제 절단에 민감한 라이신 또는 아르기닌의 제거를 위한 단일 사슬 작제물 및 아미노산 변형이 RSV Pre-F-NP 항원을 포함하는 RSV F 폴리펩타이드의 발현을 개선할 수 있음을 나타낸다.

2. RSV F 및 페리틴 나노입자의 융합 단백질의 특성화

동물 연구 이전에, DS-CAV1 및 RSV F 나노입자의 농도는 Octet을 사용하여 결합함으로써 분석되었다. 융합전 특이적 항체 D25 및 AM14에 대한 융합전 항원의 결합도 ForteBio Octet 기기를 사용하여 측정했다. 모든 분석은 30℃의 PBS에서 수행하였다. 항체를 단백질 A(ProA) 센서 팁(forteBio #18-5013) 상에 400초간 로딩하여, 포획이 거의 포화 사태에 도달할 수 있도록 하였다. 그런 다음 바이오센서 팁을 PBS에서 90초 동안 평형화한 다음, PBS에서 알려진 농도로 300초 동안 항원 결합을 수행한 다음, PBS에서 항원을 해리하였다. 알려진 농도에서 정제된 Pre-F-NP 결합의 외부 표준 곡선을 사용하여 Octet 데이터 분석 HT10.0 소프트웨어로 1:1 상호작용을 가정한 데이터 분석 및 곡선 피팅을 수행하였다. CHO 컨디셔닝된 배지에서 Pre-F-NP 농도를 결정하기 위한 예시적인 분석 결과가 도 9b에 제시되어 있다.

3. RSV F 폴리펩타이드에 대한 면역 반응의 생체내 특성화

마우스에서 RSV 항원에 대한 생체내 반응을 평가하기 위해 암컷 BALBc 마우스를 0, 3 및 6주에 지정된 용량으로 RSV 항원으로 근육내 면역화했다. 달리 언급하지 않는 한, RSV 항원(예를 들어, 특히 도 10a~b 및 12a~b의 실험에서, 등)은 베드사이드 혼합 전략으로 AF03으로 보조하였다. 즉, 50 μl의 관련 단백질 용액을 50 μl의 Sanofi 아쥬반트 AF03(스쿠알렌 기반 에멀젼; 문헌 [Klucker et al., J Pharm Sci.　2012 Dec;101(12):4490-500] 참고)와 혼합한 직후, 각 뒷다리에 50 μl를 주입하였다. 보조되지 않은 그룹의 경우, 항원을 위와 같이 혼합하였지만, AF03은 동등한 부피의 PBS로 대체하였다. SPA09 또는 Alum과 혼합한 항원의 경우, AF03을 동등한 용량의 SPA09 또는 Alum으로 각각 대체하여 상기 절차를 수행하였다. 어떤 제형에서도 면역화로 인한 부작용은 관찰되지 않았다. 첫 번째 백신접종 1일 전 및 각 주사 후 최소 2주후(즉, 2주, 5주 및 8주)에 혈액을 수집하였다. 달리 명시되지 않는 한, 표시된 데이터는 제3차 주사 후 2주 동안이다(8주차, 2wp3으로도 표시됨). 전형적으로, 혈청은 사전-면역화된 동물(순수한 것으로 표시됨), 제2차 주사 후 2주 후(2주 후 또는 2wp2) 또는 제3차 주사 후 2주 후(제3차 후 또는 2wp3)로부터 분석하였다.

Vero 세포 중화 분석을 위해, 혈청을 56℃에서 30분 동안 열-불활성화시켰다. 2% 소 태아 혈청(FBS), 1% GlutaMAX 및 1% 항생제-항유사분열제가 보충된 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)에서 불활성화된 혈청의 4-배 연속 희석 시리즈를 제조하였다. RSV 바이러스 스톡을 혈청 희석액과 1:1로 결합하고, 37℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. 이어서, 바이러스-혈청 혼합물을 웰당 100 μL의 컨플루언트 Vero 세포 단층을 함유하는 24개의 웰 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 1.5시간 동안 배양하였다. 그 후 접종물을 2% FBS 및 2% GlutaMAX 및 2% 항생제-항유사분열제로 보충된 DMEM내 0.75% 메틸 셀룰로오스 웰당 1 mL로 오버레이하였다. 37℃, 5% CO2에서 5일 배양후, 오버레이를 제거하고 단층을 빙냉 메탄올로 20분 동안 고정하였다.

이어서 플레이트를 물로 1회 세척하고, 부드럽게 교반하면서 실온에서 30분 동안 인산염 완충 식염수(PBS) 중 5% 무지방 분유로 차단하였다. 이어서 차단 용액을 홀스 래디쉬 퍼옥시다제(Abcam AB20686)에 접합된 항-RSV 항체의 1:2,000 희석을 함유하는 PBS 중 2% 분유의 웰당 200 μL로 대체하였다. 실온에서 3시간 동안 배양한 후, 플레이트를 물로 2회 세척하고 TrueBlue HRP 기질로 현상하고 물에서 2회 더 세척하고 공기 건조시켰다.

염색된 플라크는 해부 현미경을 사용하여 계수하였다. 중화 항체 역가는 하기 식을 사용하여 모의 중화 바이러스 대조군의 60% 감소 종점에서 결정되었다: 60% 플라크 감소 역가 = (C/V × 0.4 - 저점)/(고점 - 저점) × (HSD - LSD) + LSD, 상기 식에서 C/V = 모의 중화된 바이러스 대조군 웰에서 RSV 플라크의 평균, 저점 및 고점은 두 희석액의 평균 RSV 플라크 수이며, 괄호의 C/V × 0.4 값은 혈청 샘플의 경우이고, HSD 및 LSD는 더 높고 더 낮은 혈청 희석이다.

HAE 중화 분석을 위해, 혈청을 56℃에서 30분 동안 열-불활성화하였다. 불활성화된 혈청의 4배 연속 희석 시리즈는 PneumaCult™-ALI 10X 보충액(Stem Cell Technologies; 05003) 및 1% 항생제/항균제(따라서 배지)가 보충된 PneumaCult™-ALI 기저 배지(Stem Cell Technologies; 05002)에서 제조하였다. RSV 바이러스 스톡을 혈청 희석액과 1:1로 결합하고, 37℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. 이어서, 바이러스-혈청 혼합물을 웰당 50 μL의 완전히 분화된 HAE 세포를 함유하는 24개의 웰 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 1.5시간 동안 배양하였다. 배양 후, 접종물을 제거하고, 웰을 배지로 2회 세척하여 결합되지 않은 바이러스를 제거하고 37℃, 5% CO₂에서 추가로 20시간 동안 배양하였다. mKate(TagFP635) 리포터를 발현하는 RSV로 감염된 배양물에서 감염 이벤트를 형광 현미경으로 계수하였다.

mKate 리포터를 발현하지 않는 RSV에 의한 감염을 검출하기 위해, 가성층화된 상피를 배지로 광범위하게 세척하여 점액을 제거한 다음, 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.25% Triton X-100으로 30분 동안 투과시키고, 2% FBS가 보충된 DMEM으로 37℃에서 1시간 동안 차단시켰다. 차단 용액을 2% FBS가 보충된 DMEM에 1:200으로 희석된 마우스 항-RSV 단일클론 Ab 혼합물(Millipore; MAB 858-4) 웰당 100 μL로 교체하고, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서 플레이트를 0.05% Tween 20이 보충된 PBS로 3회 세척하였다. 2% FBS가 보충된 DMEM에 1:200으로 희석된 100 μL의 염소 항-마우스 IgG(H+L)(Invitrogen; A11001)을 웰 당 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침, 0.05% Tween 20이 보충된 PBS로 플레이트를 3회 세척하고, 형광 신호를 DAPI(Thermo Fisher Scientific; P36935)와 함께 ProLong Gold AntiFade로 안정화시키고 형광 현미경으로 계수하였다. 중화 항체 역가는 상기와 같이 60% 감소 종점에서 결정되었다.

항-F 결합을 위해, 융합전 F(DS-CAV1) 또는 융합후 F를 Octet 상의 항-HIS 항체 팁에 결합시켰다. 명시되지 않는 한, 모든 항-F 결합은 항-융합전 F 삼량체(DS-CAV1) 결합을 지칭한다. His₆-태그된(서열 번호 230) RSV F 삼량체(DS-CAV1) 또는 융합후 F를 항-Penta-HIS(HIS1K) 센서 팁(FortιBio #18-5122) 상에 400초 동안 사전로드하여, 포화 근처에 도달하도록 캡처를 허용하였다. 그런 다음, 바이오센서 팁을 Octet 세척 완충액에서 90초 동안 평형화한 후, 300초 동안 희석된 혈청 결합을 수행하였다. 결합 곡선 최종 반응은 Octet 데이터 분석 HT10.0 소프트웨어를 사용하여 측정하고, 반응에 희석 인수(100 또는 300)를 곱하여 최종보고된 반응을 얻었다.

항-Gcc 결합을 위해, C-말단 HIS 태그를 갖는 Gcc 펩타이드의 삼량체화된 이량체를 상기와 유사한 Octet 팁에 사용하였다. His₆-태그된(서열 번호 230) Gcc(A2 균주) 육량체를 항-Penta-HIS(HIS1K) 센서 팁(FortιBio #18-5122) 상에 400초 동안 사전로드하여, 포화 근처에 도달하도록 캡처를 허용하였다. 그런 다음, 바이오센서 팁을 Octet 세척 완충액에서 90초 동안 평형화한 후, 300초 동안 희석된 혈청 결합을 수행하였다. 결합 곡선 최종 반응은 Octet 데이터 분석 HT10.0 소프트웨어를 사용하여 측정하고, 반응에 희석 인수(100 또는 300)를 곱하여 최종보고된 반응을 얻었다.

비인간 영장류(NHP) 연구의 경우, NHP를 RSV 반응에 대해 사전 스크리닝하였다(기준선은 모든 분석에 대한 검출 한계 미만인 것으로 밝혀짐). NHP는 상기 마우스 프로토콜과 유사한 표시된 아쥬반트를 갖지만 더 큰 부피의 아쥬반트를 갖는 50 ㎍의 RF8140으로 면역화하였다(도 11c~d 및 도 18).

비-인간 영장류 연구를 위해, VERO 중화 분석을 위에서 설명한대로 수행하였다. 하기 ELISA 분석에 의해 pre-F-결합을 평가하였다.

NHP 혈청 샘플을 2-배 연속 희석(초기 희석 1:100)하고 차단된 RSV 가용성 F(Sinobiological #11049-V08B) 코팅 플레이트(1 μg/mL, 100 μL/웰)에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 항-원숭이 IgG(BioRad AAI42P, 1:10,000 희석)을 사용하여 37℃에서 90분 동안 RSV F-특이적 IgG을 검출하였다. 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘(TMB Tebu-Bio)을 사용하여 플레이트를 현상하고, 1 N 염산(Prolabo #30024290)으로 정지시켰다. 마이크로플레이트 리더(SpectraMax)로 450 nm~650 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다. 적정 곡선(각 플레이트에 놓인 표준 마우스 과다면역 혈청)으로부터 0.2 내지 3.0의 OD 값 범위에 대해 SoftmaxPro 소프트웨어를 사용하여 RSV sF-특이적 IgG 역가를 계산하였다.

임의의 ELISA 단위(EU)로 표현된 이 참조의 IgG 역가는 1.0의 OD를 제공하는 상호 희석의 log10에 해당한다. 항체 검출 임계값은 20(1.3 log10) EU였다. 모든 최종 역가는 그래프를 위해 log10으로 표현되었다. 1.3 log10 미만의 각 역가에 1.0 log10의 임의 역가를 지정하였다.

NHP 연구에서 세포 매개 면역을 평가하기 위해, IFNγ/IL-2 FluoroSpot 키트(FS-2122-10, Mabtech)를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 간단히 말해서, IPFL 플레이트의 막을 35% 에탄올로 미리 습윤시키고 포획 항체(항-IFNγ 및 항-IL-2)를 4℃에서 밤새 코팅하였다.

이어서 10% 소 태아 혈청(FCS)을 함유하는 세포 배양 배지의 200 μL/웰로 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 차단하였다. 배지를 제거하고 자극을 웰에 추가했다: 전장 F 항원(항원-특이적 자극), 항-CD3(양성 대조군) 또는 세포 배양 배지(자극되지 않은 대조군). 마카크 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동하고 수치를 계산하였다. 웰당 400,000개의 세포를 첨가하고 5% CO2가 있는 가습 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

검출을 위해 세포를 제거하고, 검출 항체(접합된 항-IFNγ 및 항-IL-2)를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 형광단-접합 시약을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 비우고 건조하고 분석할 때까지 RT에서 어두운 곳에 보관하였다. 항-CD3 mAb를 양성 대조군으로 사용하였으며, 모든 샘플에서 > 500 스폿 형성 계수(Spot Forming Counts, SFC)/백만 PBMC의 반응들이 발견되어, 허용가능한 샘플 품질을 확인하였다. 자극되지 않은 웰(세포 배양 배지)에서 검출된 스폿을 F-항원 자극 세포로 뺀다.

인간 세포(또는 B-세포) 분석을 위해, 참조 실험(문헌[Dauner, et al. Vaccine 2017　Oct 4;35(41):5487-5494])과 유사한 실험을 수행하였다(도 20). 세포를 처리하지 않았거나(PBS로 처리한), 100 ng 용량으로 표시된 RSV F 또는 RSV G 폴리펩타이드로 처리하였다. pre-F-삼량체(DS-CAV1) 또는 G 엑토도메인으로 각각 코팅된 비드로 문헌에 기재된 루미넥스 분석을 사용하여 F-결합 및 G-결합 반응을 수행하였다.

RF8117(서열 번호 17)은 E328N, S348N 및 R507N에서 조작된 글리코실화 부위를 포함하며, 이는 위에서 언급한 바와 같이 D25 또는 AM14 결합을 방해하지 않는다. 이 융합전 나노입자가 다른 융합전 항원(DS-CAV1)에 대해 유사한 면역 반응을 유도함을 입증하기 위해, 본 발명자들은 5개 그룹에서 마우스를 1 μg 또는 0.1 μg 용량으로 pre-F 삼량체(DS-CAV1), 융합후 F 또는 RF8117로 면역화하고, 모두 주사 사이에 3주 3회 AF03으로 보조하였다. VERO 세포 분석을 사용하여 제3차 면역화 2주 후 역가 중화에 대해 혈청을 테스트하였다. 더 높은 용량의 RF8117은 융합전 대조군과 유사하고 융합후 대조군보다 우수한 중화 역가를 유도하였다. 낮은 용량에서 RF8117은 융합전 대조군 및 융합후 대조군 둘 다 보다 높은 중화 역가를 유도하였다(도 10a).

RSV Pre-F-NP는 융합전 및 융합후 확인 사이에 공유되는 에피토프를 차단하도록 조작된 글리코실화 부위를 보유한다. 이러한 글리칸이 중화 반응을 억제하는지 여부를 평가하였다. 조작된 글리칸(서열 번호 17)을 갖는 RF8117을 RF8113(RF8117과 유사하지만, 조작된 글리칸이 결여되어 있음; 서열 번호 16) 및 융합전 삼량체 대조군(DS-CAV1)과 비교하였다. 5개 그룹의 마우스를 1 μg 또는 0.1 μg 용량으로 면역화하고, 모두 주사 사이에 3주 3회 AF03으로 보조하였다. VERO 세포 분석을 사용하여 제3차 면역화 2주 후 역가 중화에 대해 혈청을 테스트하였다. 역가를 중화하여 판단한 바와 같이 RF8113 및 RF8117 작제물 사이에 양 용량에서 유의한 차이가 없었다(도 10b).

RF8140(서열 번호 23)의 본원에 언급된 라이신 및 아르기닌 녹아웃이 중화 반응을 유도하는 항원의 능력을 뒤집지 않음을 입증하기 위해, RF8140(서열 번호 25)의 면역원성을 마우스에서의 융합후 F 삼량체(서열 번호 24)의 면역원성과 비교하였다(도 11a & b). 저용량(0.1 μg)에서 RF8140(서열 번호 25)은 융합후 삼량체(서열 번호 24)에 대한 우수한 중화 역가를 유도한다. RF8140(서열 번호 23)이 NHP에서 면역 반응을 유도한다는 것을 입증하기 위해, 본 발명자들은 아쥬반트(AF03)를 포함하거나 포함하지 않는 RF8140(서열 번호 25)으로 NHP를 면역화하였다. 도 11c는 RSV F-결합 반응(ELISA 역가)을 보여주는 반면, 도 11d는 Pre-F-NP(RF8140, 서열 번호 23)로 면역화에 의해 유도된 RSV 중화 역가를 비교한다. 보조되지 않은, 및 보조된 RF8140(서열 번호 25) 둘다 NHP에서 면역 반응을 유도한다.

RF8117(서열 번호 17) 및 RF8140(서열 번호 23)의 조작된 글리코실화 부위가 이러한 항원이 중화 반응을 유도하는 것을 막지 않는다는 것을 보여주었으나, 본 발명자들은 이들이 융합전 및 융합후 형태 사이에 공유되는, 중화되지 않거나 불량하게 중화하는 에피토프를 차단한다는 것을 입증하고자 했다(도 12). Octet에 의해 측정된 바와 같이 고용량(1 μg) 및 저용량(0.1 μg)의 조작된 글리코실화가 없는 Pre-F-NP(RF8113, 서열 번호 16) 또는 조작된 글리코실화가 있는 Pre-F-NP(조작된 Gly 입자, RF8117 서열 번호 17)에 의한 면역화에 의해 유도된 융합전 F(DS-CAV1, 서열 번호 25)에 대한 항체 반응(도 12a). 양쪽 Pre-F-NP에 의해 유도된 반응은 유사하였다. Octet에 의해 측정된 바와 같이 고용량(1 μg) 및 저용량(0.1 μg)의 조작된 글리코실화가 없는 Pre-F-NP(RF8113, 서열 번호 16) 또는 조작된 글리코실화가 있는 Pre-F-NP(RF8117, 서열 번호 17)에 의한 면역화에 의해 유도된 융합후 삼량체에 대한 항체 반응(도 12b). RF8117(서열 번호 17)에 의해 유도된 융합후 F-결합 반응은 RF8113(서열 번호 16)에 의해 유도된 것보다 상당히 낮았다. 따라서, RF8113 및 RF8117 모두 융합전 F에 대한 강력한 항체 반응을 유도하는 반면, RF8117에 의해 유도되는 융합후 F 항체 반응은 크게 억제된다. 이는 공유된 융합전 및 융합후 에피토프에 대한 조작된 글리칸 맵핑때문이다(도 2b).

조작된 글리코실화 부위가 비-중화 에피토프를 차단하지만 중화 항체를 비-중화 항체 역가로 편향시킨다는 것을 추가로 입증하기 위해, 상기 데이터를 다른 방식으로 분석하였다(도 13). 마우스 연구에서 야생형 글리코실화 부위를 갖는 Pre-F NP(Wt 글리칸 입자; RF8113, 서열 번호 16) 대 추가의 조작된 글리코실화 부위를 갖는 Pre-F NP(+글리칸 입자; RF8117, 서열 번호 17)에 의한 면역화에 의해 유도된 VERO 세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 RSV 중화 역가의 비교가 측정되었으며, 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 13a). 마우스 연구에서 Wt 글리칸 입자(RF8113, 서열 번호 16) 대 +글리칸 입자(RF8117, 서열 번호 17)에 의한 면역화에 의해 유도된 RSV 융합후 F 삼량체-결합 항체 반응의 비교는 조작된 글리칸을 갖는 Pre-F-NP에 대한 억제된 융합후 F-결합 반응을 나타냈다(도 13b). 조작된 글리칸이 기능적 중화 항체 반응을 감소시키지는 않지만 공유되는 융합전/융합후 에피토프에 유도된 비-중화 항체를 감소시켜, 조작된 글리칸 작제물에 의해 유도되는 총 항체 비율에 대한 중화를 개선한다는 것을 입증하기 위해, F-결합 반응에 대한 중화 역가의 비율을 플롯팅하였다(도 13c). 따라서, 조작된 글리칸이 있는 Pre-F-NP는 마우스 연구에서 결합 항체 프로파일에 대한 우수한 중화를 유도한다.

페리틴 나노입자가 RSV G 중앙 도메인 항원의 면역원성을 향상시키는 데 사용될 수 있음을 입증하기 위해, 본 발명자들은 Gcc 펩타이드(서열 번호 29)를 페리틴 나노입자에 화학적으로 접합하는 방법을 개발하였다. 본원에 기재된 S111C 돌연변이를 보유하는 페리틴은 NHS 그룹을 통해 N-말단에 부착된 PEG4 링커에서 말레이미드 기를 갖는 합성된 Gcc 펩타이드(서열 번호 29)와 접합될 수 있다. N-말단 말레이미드를 갖는 Gcc 펩타이드를 합성하고 Peptides International(미국 켄터키주 루이빌 소재)에 의해 HPLC 정제하였다. 말레이미드-Gcc 항원이 페리틴 S111C 입자에 첨가되면, 말레이미드는 유리 시스테인과 접합하여 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔로 관찰할 수 있는 Gcc-NP를 형성한다(도 14a). 접합이 전형적으로 50% 내지 90% 효율적이지만, Gcc 펩타이드 페리틴 나노입자(100% 접합됨)의 모델이 도 14b에 도시되어 있다.

Gcc-NP가 Gcc 펩타이드(서열 번호 29)보다 우수한 면역 반응을 유도하는지 결정하기 위해, 그룹당 5 마리의 마우스를 Gcc 펩타이드 또는 Gcc-NP(1.3μg 용량, 각 면역화에 대한 RIBI와 1:1 혼합)로 면역화하였다. 제2차 면역화 후 2주 후 및 제3차 면역화 후 2주 후의 Gcc-결합 반응(Octet)을 순수 마우스 혈청의 대표적인 그룹과 비교하였다(도 14c). 제3차 주사후 마우스 연구에서 Gcc 펩타이드(서열 번호 29) 대 Gcc-NP에 의한 면역화에 의해 유도된 중화 반응을 또한 HAE 중화 분석에서 비교하였다(도 14d). Gcc-NP는 Gcc 결합 반응과 중화 반응 모두로 판단할 때 Gcc 펩타이드 단독보다 우수한 면역 반응을 유도한다.

RSV Pre-F-NP(RF8140) 및 Gcc-NP의 공동-투여가 면역 반응을 유도하는 항원의 능력을 방해하지 않음을 입증하기 위해, 마우스를 Pre-F-NP 단독(RF8140, 서열 번호 23), Gcc-NP(Gcc 펩타이드와 접합된 페리틴, 서열 번호 29), 또는 Gcc-NP와 결합된 Pre-F-NP(RF8140, 서열 번호 23)로 면역화하였다(도 15a~c). 모든 면역화는 AF03으로 보조되었다. RF8140 단독(Pre-F-NP) 또는 RF8140 및 Gcc-NP(Pre-F-NP + Gcc-NP)로 면역화된 마우스는 융합전 F 삼량체(DS-CAV1, 서열 번호 25)에 결합하는 항체를 생성하였지만, Gcc-NP로 면역화된 마우스는 그렇지 않았다. Gcc-NP 단독(Gcc-NP) 또는 RF8140 및 Gcc-NP로 면역화된 마우스는 Gcc 펩타이드에 결합하는 항체를 생성하였지만, RF8140만으로 면역화된 마우스는 그렇지 않았다. Pre-F-NP 단독, Gcc-NP 단독, 또는 Pre-F-NP 및 Gcc-NP의 공동-투여로 면역화된 동물은 모두 HAE 중화 분석에 의해 측정된 바와 같이 제2차 및 제3차 면역화후 중화 반응을 일으킨다.

RSV Pre-F-NP 및 Gcc-NP의 공동-투여가 중화 항체를 유도하는 항원의 능력을 방해하는지 결정하기 위해, F 및 G 둘다에 대한 중화 항체를 고갈 분석에서 연구했다(도 16a~b). Gcc-NP의 첨가가 중화 반응을 유도하는 Pre-F-NP의 능력을 방해하지 않음을 입증하기 위해, 상기 언급된 기에 대한 F-민감성 VERO 세포 분석으로 중화 역가를 측정하였다(도 16a). 순수 동물로부터의 혈청도 항원 고갈의 품질을 판단하기 위해 테스트하였다. VERO 분석에서, RF8140(서열 번호 23) 단독 또는 Gcc-NP와 혼합된 RF8140으로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 유사한 중화 반응을 유도한 반면, Gcc-NP는 F-항체 민감성 VERO 분석에서 중화 반응을 유도하는 것으로 보이지 않았다. 융합전 삼량체(DS-CAV1, 서열 번호 25)에 결합하는 항체가 RF8140(서열 번호 23) 단독으로 면역화된, 또는 RF8140(서열 번호 23) 및 Gcc-NP로 면역화된 동물로부터의 풀링된 혈청에서 고갈된 경우 VERO 분석에서 측정가능한 중화 역가의 감소가 관찰되었다. 상기 기들이 HAE 세포 분석에서 중화 역가에 대해 측정되었을 때, 모든 면역화 그룹은 F-및 G-민감성 분석에서 중화 반응을 나타내는 것으로 관찰되었다(도 16b). RF8140(서열 번호 23) 단독으로 면역화된 동물로부터의 풀링된 혈청은 융합전 F 삼량체(DS-CAV1, 서열 번호 25)로 고갈될 수 있는 HAE 분석에서 중화 반응을 유도하였다. Gcc-NP 단독으로 면역화된 동물로부터의 풀링된 혈청은 G 엑토도메인(서열 번호 28)으로 고갈될 수 있는 HAE 분석에서 중화 반응을 유도하였다. Pre-F-NP(RF8140, 서열 번호 23) 및 Gcc-NP 둘 다로 면역화된 동물로부터의 풀링된 혈청은 DS-CAV1(서열 번호 25)에 의해 완전히 고갈되지 않았지만, DS-CAV1 다음에 G 엑토도메인(서열 번호 28)을 사용한 후속 고갈에 의해 완전히 고갈된 HAE 분석에서 중화 반응을 유도하였다. 종합하여, 이들 데이터는 Pre-F-NP 및 Gcc-NP와의 공동-투여가 각각 융합전 F 또는 G에 대한 중화 항체를 유도하는 항원의 능력을 방해하지 않음을 시사한다.

RF8117(서열 번호 17) 또는 RF8140(서열 번호 23)을 보조하는 효과를 입증하기 위해, AF03, SPA09 또는 Alum과 혼합된 상기 작제물을 마우스에 투여하였다. 도 17a에서, 아쥬반트와 혼합된 10 μg 항원으로 마우스를 면역화하고, 반면 도 17b에서, 아쥬반트와 혼합된 1 μg 항원으로 마우스를 면역화하였다. 도 17a에서, 제3차 면역화 시점 후 2주 후에 VERO 세포 분석에 의해 중화 역가를 측정하였다. 보조되지 않은(아쥬반트 없음), Alum으로 보조된, 또는 AF03으로 보조된 RF8117(서열 번호 17)로 면역화된 마우스로부터의 혈청이 도시되어 있다. 도 17b에서, AF03으로 보조된 RF8117(서열 번호 17), SPA09로 보조된 RF8117(서열 번호 17), 또는 AF03으로 보조된 RF8140으로 면역화된 마우스로부터의 혈청에 대해 VERO 세포 분석에 의해 중화 역가를 측정하였다. RF8117(서열 번호 17) 또는 RF8140(서열 번호 23)의 모든 경우에, 순수 마우스에서 보조된 그룹이 보조되지 않은 그룹보다 더 높은 중화 역가를 유도한다. RF8117(서열 번호 17) 또는 AF03와 혼합된 RF8140(서열 번호 23)으로 면역화된 마우스는 유사한 중화 반응을 유도하였으며, 이는 RF8140(서열 번호 23)의 첨가된 라이신 및 아르기닌 돌연변이가 중화 반응을 유도하는 Pre-F-NP의 능력을 방해하지 않음을 시사한다.

AF03 및 SPA09의 보조 효과를 추가로 조사하기 위해, 비-인간 영장류(NHP)를 보조되지 않은, AF03으로 보조된, 또는 2용량의 SPA09로 보조된 RF8140으로 면역화하였다(도 18a). 0일과 29일에 지시된 아쥬반트와 혼합된 50 μg의 항원으로 NHP를 면역화하고, 면역 반응은 지정된 시점에서 ELISA 또는 VERO 중화 반응으로 측정하였다. 보조되지 않은(아쥬반트 없음), AF03으로 보조된, 또는 SPA09로 보조된(500 μg 및 2,000 μg 용량의 SPA09를 사용함) RF8140으로 면역화후, NHP 혈청에서 융합전 F 삼량체 ELISA 반응을 측정하였다. 모든 시점에서 AF03 또는 SPA09로 보조하면, 우수한 중화 반응이 유도된다. 상기 NHP 기에 대한 혈청의 중화 역가는 또한 VERO 세포 분석에 의해 측정하였다(도 18b). 모든 경우에, 아쥬반트를 갖는 RF8140으로 면역화하면 모든 시점에서 보조되지 않은 그룹보다 더 높은 중화 역가를 유도한다.

TLR7/8 작용제 SM7/8 또는 TLR9 작용제 CpG에 대한 RF8140(서열 번호 23)의 직접 접합의 효과를 시험하였다. 항원을 소분자 SM7/8 또는 CpG와 접합시키고, 마우스에 10 μg 용량으로 투여하였다. RF8140은 표면 노출된 아미노산을 시스테인(K79C)으로 대체하는 돌연변이를 페리틴 서열에 포함하며, 이는 클릭 화학에 의한 접합에 사용할 수 있다. 비교를 위해, 보조되지 않은(아쥬반트 없음), 또는 도 19에 표시된 바와 같이 고용량 또는 저용량(접합되지 않음)으로 소분자와 혼합하여 보조된 RF8140을 마우스에 투여하였다. 제2차 면역화후 및 제3차 면역화후 동물로부터의 혈청을 융합전 F 삼량체-결합에 대해 시험하였다.

도 19a에서, 순수 마우스, 보조되지 않은 RF8140(서열 번호 23)으로 면역화된 마우스, SM7/8 아쥬반트와 접합된 RF8140(서열 번호 23), 130 ng의 SM7/8로 보조된 RF8140(서열 번호 23) 또는 20 μg SM7/8로 보조된 RF8140(서열 번호 23)으로 면역화된 마우스로부터의 혈청에서 융합전 F 삼량체-결합 반응을 측정하였다. SM7/8에 접합된 RF8140(서열 번호 23)은 보조되지 않은 또는 SM7/8 보조된 그룹들보다 높은 융합전 F 삼량체-결합 역가를 유도한다.

도 19b에서, 순수 마우스, 보조되지 않은 RF8140(서열 번호 23)으로 면역화된 마우스, CpG 아쥬반트와 접합된 RF8140(서열 번호 23), 680 ng의 CpG로 보조된 RF8140(서열 번호 23) 또는 20 μg CpG로 보조된 RF8140(서열 번호 23)으로 면역화된 마우스로부터의 혈청에서 융합전 F 삼량체-결합 반응을 또한 측정하였다. SM7/8에 접합된 RF8140(서열 번호 23)은 보조되지 않은 또는 SM7/8 보조된 그룹들보다 높은 융합전 F 삼량체-결합 역가를 유도한다.

인간 세포에서 반응을 유도하는 Pre-F-NP 항원 및 Gcc-NP 항원의 능력을 입증하기 위해, MIMIC 플랫폼을 사용하여 실험을 수행하였다(도 20a~d). MIMIC 플랫폼은 접종시에 항원-특이적 선천성 및 적응성 반응을 신속하고 재현가능하게 생성할 수 있는 자가 인간 면역 세포로만 구성된다. 이전 연구는 MIMIC 시스템이 HBV, 파상풍 톡소이드, 단일클론 항체, YF-VAX 및 인플루엔자 B-세포 반응과 같은 다양한 표적에 대한 생체내 면역 프로파일을 재현하는 능력을 입증하였다. Pre-F-NP RF8140(서열 번호 23) 대 융합후 F 삼량체(서열 번호 24)로 처리하여 유도된 RSV 융합전 F 삼량체-결합 항체 반응을 인간 B-세포에서 비교하고, 대표적인 기준선 반응이 비교를 위해 제시된다(처리 없음)(도 20a). 인간 B-세포에서 Pre-F-NP(RF8140, 서열 번호 23) 대 융합후 F(서열 번호 24)에 의한 치료로 유도된 융합전 F 삼량체(DS-CAV1, 서열 번호 25) 대 융합후 F 삼량체(서열 번호 24)에 대한 측정된 결합 반응의 비율이 도 20c에 도시되어 있다. 상이한 F 항원 처리에 의해 유도된 MIMIC로부터의 항체는 VERO 세포 분석을 사용하여 측정하였다(도 20b). 인간 B-세포에서 Pre-F NP(RF8140, 서열 번호 23) 대 융합후 F 삼량체(서열 번호 24)에 의한 치료로 유도된 중화 역가를 비-치료군과 비교하여, 인간 세포에서 RF8140(서열 번호 23)이 우수한 중화 반응을 유도함을 나타내었다.

RSV 감염 또는 F 서브유닛 백신 후보에 대한 Ab 반응의 크기는 선형 회귀 분석에 의해 평가된 MIMIC 연구에서 조사된 인간 대상체의 혈청-상태를 기반으로 결정하였다. 항-pre-F IgG의 기존 순환 역가가 더 높은 공여자는 RSV 처리 후(도 20e, p = 0.0041) 및 post-F 프라이밍 후(도 20f, p = 0.0019) 훨씬 더 많은 항-pre-F IgG를 생성하였다. 상관 관계는 통계적으로 유의하지 않았지만, pre-F는 유도된 Ab 수준과 기존 Ab 수준 사이의 관계도 보여주었다. 다른 치료법과 달리, pre-F-NP는 기존에 존재하는 Ab가 높은 공여자와 마찬가지로 기존 항-pre-F IgG가 낮은 공여자로부터 비교적 높은 수준의 항-pre-F IgG를 유도했다는 점은 주목할 만하다(도 20f). 이는 pre-F-NP가 기존 IgG 수준이 낮은 공여자로부터도 Ab 반응을 효과적으로 구제(또는 향상)할 수 있음을 나타낸다.

Gcc-NP가 Gcc 펩타이드(서열 번호 29) 단독보다 우수한 G 항체 반응을 유도한다는 것을 입증하기 위해, 인간 세포를 Gcc 펩타이드 단독(서열 번호 29) 또는 인간 B 세포에서 나노입자에 접합된 Gcc 펩타이드(Gcc-NP)로 처리하였다. Gcc-NP는 우수한 G-결합 항체 반응을 유도했다(도 20g). 종합하여 이러한 데이터는 Pre-F-NP 및 Gcc-NP가 인간 면역화에서 면역 반응을 유도할 것임을 시사한다.

4. RSV Gcc-페리틴 나노입자에 대한 면역 반응의 생체내 특성화

RSV Gcc-NP는 전술한 바와 같이 제조되었다. 마우스에서 RSV Gcc-NP에 대한 생체내 반응을 평가하기 위해 암컷 BALBc 마우스를 고용량(5 μg) 또는 저용량(0.5 μg)의 항원으로 0, 3 및 6주에 지정된 용량으로 RSV 항원으로 근육내 면역화하였다. 달리 언급하지 않는 한, RSV Gcc-NP는 베드사이드 혼합 전략을 사용하여 AF03으로 보조하였다. 즉, 50 μl의 단백질 용액을 50 μl의 Sanofi 아쥬반트 AF03(스쿠알렌-기반 에멀젼; 문헌[Klucker et al., J Pharm Sci.　2012 Dec;101(12):4490-500] 참고)와 혼합한 직후, 각 뒷다리에 50 μl를 주입하였다. 면역화로 인한 부작용은 관찰되지 않았다. 제1차 면역화 1일 전 및 각 주사 후 최소 2주후(즉, 2주, 5주 및 8주)에 혈액을 수집하였다. 달리 명시되지 않는 한, 표시된 데이터는 제3차 주사 후 2주 동안이다(8주차, 2wp3으로도 표시됨). 전형적으로, 혈청은 사전-면역화된 동물(순수한 것으로 표시됨), 제2차 주사 후 2주 후(2주 후 또는 2wp2) 또는 제3차 주사 후 2주 후(제3차 후 또는 2wp3)로부터 분석하였다.

HAE 중화 분석을 위해, 혈청을 56℃에서 30분 동안 열-불활성화하였다. 불활성화된 혈청의 4배 연속 희석 시리즈는 PneumaCult™-ALI 10X 보충액(Stem Cell Technologies; 05003) 및 1% 항생제/항균제(따라서 배지)가 보충된 PneumaCult™-ALI 기저 배지(Stem Cell Technologies; 05002)에서 제조하였다. RSV 바이러스 스톡을 혈청 희석액과 1:1로 결합하고, 37℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. 이어서, 바이러스-혈청 혼합물을 웰당 50 μL의 완전히 분화된 HAE 세포를 함유하는 24개의 웰 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 접종물을 제거하고, 웰을 배지로 2회 세척하여 결합되지 않은 바이러스를 제거하고 37℃, 5% CO₂에서 추가로 20시간 동안 배양하였다. mKate(TagFP635) 리포터를 발현하는 RSV로 감염된 배양물에서 감염 이벤트를 형광 현미경으로 계수하였다.

mKate 리포터를 발현하지 않는 RSV에 의한 감염(RSV B 균주 중화)을 검출하기 위해, 가성층화된 상피를 배지로 광범위하게 세척하여 점액을 제거한 다음, 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.25% Triton X-100으로 30분 동안 투과시키고, 2% FBS가 보충된 DMEM으로 37℃에서 1시간 동안 차단시켰다. 차단 용액을 2% FBS가 보충된 DMEM에 1:200으로 희석된 마우스 항-RSV 단일클론 Ab 혼합물(Millipore; MAB 858-4) 웰당 100 μL로 교체하고, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서 플레이트를 0.05% Tween 20이 보충된 PBS로 3회 세척하였다. 2% FBS가 보충된 DMEM에 1:200으로 희석된 100 μL의 염소 항-마우스 IgG(H+L)(Invitrogen; A11001)을 웰 당 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침, 0.05% Tween 20이 보충된 PBS로 플레이트를 3회 세척하고, 형광 신호를 DAPI(Thermo Fisher Scientific; P36935)와 함께 ProLong Gold AntiFade로 안정화시키고 형광 현미경으로 계수하였다. 중화 항체 역가는 60% 감소 종점에서 결정되었다.

더 높은 다원자가가 RSV G 항원에 의한 중화 반응의 유도를 향상시킨다는 것을 입증하기 위해, 마우스를 RSV F 항원으로 면역화시켰다. 모든 면역화는 AF03으로 보조되었다. AF03 및 중화 역가로 제형화된 RSV Gcc-NP로 면역화된 마우스를 제2차 주사 후 2주 후 및 제3차 주사 후 2주 후에 측정하였다(도 21a~c). RSV Gcc-NP는 순수 마우스 혈청에 대해 중화 반응을 유도하였다. 제2차 주사 후 2주 후(도 21a) 및 제3차 주사 후 2주 후(도 21b)에서 A2 균주로부터의 Gcc를 함유하는 Gcc-NP로 면역화된 면역화 마우스는 RSV A 균주에 대해 중화 반응을 나타냈다. 제3차 주사 후 2주후에 Gcc-NP는 또한 RSV B1 균주에 대한 중화 반응을 유도했다(도 21c).

항-Gcc 결합을 위해, C-말단 HIS 태그를 갖는 Gcc 펩타이드의 삼량체화된 이량체를 Octet 팁에 사용하였다. His₆-태그된 Gcc(A2 균주) 육량체 또는 His₆-태그된 Gcc(B1 균주) 육량체를 항-Penta-HIS(HIS1K) 센서 팁(FortιBio #18-5122) 상에 400초 동안 사전로드하여, 포화 근처에 도달하도록 캡처를 허용하였다. 그런 다음, 바이오센서 팁을 Octet 세척 완충액에서 90초 동안 평형화한 후, 300초 동안 희석된 혈청 결합을 수행하였다. 결합 곡선 최종 반응은 Octet 데이터 분석 HT10.0 소프트웨어를 사용하여 측정하고, 반응에 희석 인수(100 또는 300)를 곱하여 최종보고된 반응을 얻었다.

RSV Gcc-NP가 Gcc-결합 면역 반응을 유도하는지를 결정하기 위해, 상기 기재된 면역화로부터의 혈청을 Gcc A2 육량체 또는 Gcc B1 육량체에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 고용량(도 22a 및 도 23a) 및 저용량(도 22b 및 도 23b)에서의 Gcc-결합 반응을 제2차 면역화후 2주 후 및 제3차 면역화후 2주 후에 시험하였다. A2 균주(도 22a~b) 및 B1 균주(도 23a~b) 둘다의 경우, RSV Gcc-NP는 순수 마우스 혈청에 대해 결합 반응을 유도하였다.

5. 인간 세포에서 Pre-F-NP 및 Gcc-NP에 대한 반응

인간 세포에서 반응을 유도하는 Pre-F-NP 및 Gcc-NP의 능력을 입증하기 위해, MIMIC 플랫폼을 사용하여 실험을 수행하였다. MIMIC 플랫폼은 접종시에 항원-특이적 선천성 및 적응성 반응을 신속하고 재현가능하게 생성할 수 있는 자가 인간 면역 세포로만 구성된다. 이전 연구는 MIMIC 시스템이 HBV, 파상풍 톡소이드, 단일클론 항체, YF-VAX 및 인플루엔자 B-세포 반응과 같은 다양한 표적에 대한 생체내 면역 프로파일을 재현하는 능력을 입증하였다. Pre-F-NP RF8140(서열 번호 23) 대 융합후 F 삼량체(서열 번호 24)로 처리하여 유도된 RSV 융합전 F 삼량체-결합 항체 반응을 인간 B-세포에서 비교하고, 대표적인 기준선 반응과 비교한다. 인간 B-세포에서 Pre-F-NP(RF8140, 서열 번호 23) 대 융합후 F(서열 번호 24)에 의한 치료로 유도된 융합전 F 삼량체(DS-CAV1, 서열 번호 25) 대 융합후 F 삼량체(서열 번호 24)에 대한 측정된 결합 반응의 비율을 결정한다. 상이한 F 항원 처리에 의해 유도된 MIMIC로부터의 항체는 VERO 세포 분석을 사용하여 측정한다. 인간 B-세포에서 Pre-F NP(RF8140, 서열 번호 23) 대 융합후 F 삼량체(서열 번호 24)에 의한 치료로 유도된 중화 역가를 비-치료군과 비교하여, RF8140(서열 번호 23)이 인간 세포에서 우수한 중화 반응을 유도함을 나타낸다. Gcc-NP가 Gcc 펩타이드(서열 번호 29) 단독보다 우수한 G 항체 반응을 유도한다는 것을 입증하기 위해, 인간 세포를 Gcc 펩타이드 단독(서열 번호 29) 또는 인간 B 세포에서 나노입자에 접합된 Gcc 펩타이드(Gcc-NP)로 처리한다. Gcc-NP는 우수한 G-결합 항체 반응을 유도한다. 따라서, Pre-F-NP 및 Gcc-NP가 인간 면역화에서 면역 반응을 유도할 것이다.

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Claims

RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드로서,
융합전 RSV F와 융합후 RSV F 사이에 공유되는 RSV 폴리펩타이드의 에피토프가 차단되는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
RSV F 폴리펩타이드를 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드로서,
RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 아미노산 잔기 62~69 및 196~209 및 서열 번호 26의 위치 328, 348 또는 507에 상응하는 아스파라긴을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제2항에 있어서,
융합전 RSV F와 융합후 RSV F 사이에 공유되는 RSV 폴리펩타이드의 에피토프가 차단되는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
융합전 RSV F를 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
D25 또는 AM14로부터 선택된 융합전 RSV F-특이적 항체에 의해 인식되는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제4항 또는 제5항에 있어서,
융합전 RSV F는 융합후 RSV F에서 발견되지 않는 에피토프를 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
융합후 RSV F를 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 또는 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
에피토프는 아스파라긴에 부착된 N-글리칸으로 차단되는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제8항에 있어서,
아스파라긴은 야생형 RSV F 서열(서열 번호 26)의 비-아스파라긴 잔기에 상응하고, 선택적으로 비-아스파라긴 잔기는 서열 번호 26의 위치 328, 348 또는 507에 상응하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
페리틴 단백질을 더 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제10항에 있어서,
페리틴은 표면-노출된 아미노산을 시스테인으로 대체하는 돌연변이를 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
RSV F 폴리펩타이드 및 페리틴 단백질을 포함하는 항원성 RSV 폴리펩타이드로서,
페리틴 단백질은 표면노출된 아미노산을 시스테인으로 대체하는 돌연변이를 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제11항 또는 제12항에 있어서,
페리틴은 쌍으로 또는 구조적 정렬에 의해 결정된 바와 같이, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 E12C, S26C, S72C, A75C, K79C, S100C, 및 S111C 돌연변이 중 하나 이상 또는 비-헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
표면-노출된 아미노산을 통해 페리틴에 연결된 하나 이상의 면역-자극 모이어티를 포함하고, 선택적으로 상기 표면-노출된 아미노산은 돌연변이로 인해 생성되는 시스테인인, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
페리틴은 표면-노출된 아스파라긴을 비-아스파라긴 아미노산으로 대체하는 돌연변이를 포함하고, 선택적으로 아스파라긴은 쌍으로 또는 구조적 정렬에 의해 결정된 바와 같이 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 위치 19에, 또는 비-헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴에서의 유사한 위치에 있는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
페리틴은 내부 시스테인을 비-시스테인 아미노산으로 대체하는 돌연변이를 포함하고, 선택적으로 내부 시스테인은 쌍으로 또는 구조적 정렬에 의해 결정된 바와 같이 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 위치 31에, 또는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 페리틴의 위치 31에 상응하는 위치에 있는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV F 폴리펩타이드는 부위 0 에피토프인 융합후 RSV F에서 발견되지 않은 에피토프를 포함하고, 선택적으로 부위 0 에피토프는 서열 번호 26의 아미노산 잔기 62~69 및 196~209를 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 328에 상응하는 위치에 아스파라긴을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 348에 상응하는 위치에 아스파라긴을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 507에 상응하는 위치에 아스파라긴을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 라이신 498에 상응하는 위치에 류신을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 이소류신 217에 상응하는 위치에 프롤린을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 26의 위치 155에 상응하는 위치에 시스테인 이외의 아미노산 및/또는 서열 번호 26의 위치 290에 상응하는 위치에 시스테인 이외의 아미노산을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 26의 위치 155에 상응하는 위치에 세린 및/또는 서열 번호 26의 위치 290에 상응하는 위치에 세린을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV F 폴리펩타이드에 푸린 절단 부위가 결여되고, 선택적으로 링커가 푸린 절단 부위 대신 존재하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 17의 아미노산 1~478에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 17의 서열에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제26항 또는 제27항에 있어서,
서열 번호 17의 아미노산 1~478을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 23의 아미노산 1~478에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제19항 또는 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV F 폴리펩타이드는 서열 번호 23의 서열에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제29항 또는 제30항에 있어서,
서열 번호 23의 아미노산 1~478을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 3~23 중 어느 하나의 서열을 포함하는, 항원성 RSV 폴리펩타이드.
제10항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항원성 RSV 폴리펩타이드를 포함하는 페리틴 입자.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항원성 RSV 폴리펩타이드 또는 페리틴 입자 및 RSV G 폴리펩타이드를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항원성 RSV 폴리펩타이드 또는 페리틴 입자를 포함하는 조성물 또는 제34항의 조성물로서,
약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하거나 RSV 감염에 대해 대상체를 보호하는데 사용하기 위한, 항원성 RSV 폴리펩타이드, 페리틴 입자 또는 조성물.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 항원성 RSV 폴리펩타이드, 페리틴 입자, 또는 조성물 중 어느 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, RSV에 대한 면역 반응을 유도하거나 대상체를 RSV 감염으로부터 보호하는 방법.
제36항 또는 제37항에 있어서,
대상체가 인간인, 항원성 RSV 폴리펩타이드, 페리틴 입자, 조성물 또는 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항원성 RSV 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로서,
선택적으로 핵산이 mRNA인, 핵산.