KR20210010555A - 약물 저항성 면역 세포 및 그의 사용 방법 - Google Patents

약물 저항성 면역 세포 및 그의 사용 방법 Download PDF

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마크 제이. 오즈번
켈리 엘. 히펜
브루스 알. 블라자
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리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타
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Abstract

본 개시내용은 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성인, 만능성 줄기 세포, 조혈 전구체 세포, 및 조혈 세포 (예컨대, 변형된 Treg)를 비롯한 변형된 세포를 제공한다. 본 개시내용은 만능성 줄기 세포, 조혈 전구체 세포, 및 조혈 세포를 비롯한, 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성 변형된 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 본원에서는 또한 치료 조성물 및 방법도 제공한다.

Description

약물 저항성 면역 세포 및 그의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 5월 17일 출원된 미국 가출원 번호 62/672,868을 우선권 주장하고, 상기 가출원은 마치 그 전문이 기재된 것과 같이 본원에서 참조로 포함된다.
조절 T 세포 (Treg)는 Treg 집단의 유전적 또는 물리적 제거의 파국적인 결과에 의해 입증되는 바와 같이, 면역 세포 항상성 유지에 중요하다. 구체적으로, Treg 세포는 다른 면역 세포에 대해 우성 음성 조절을 실행함으로써 면역계에서 질서를 유지시킨다. 광범위하게 자연 또는 적응 (유도) Treg로 분류되고; 자연 Treg는 발생하고, 흉선으로부터 이주하여 면역 항상성에서 그의 중요한 역할을 수행하는 CD4+CD25+ T 세포이다. 적응 Treg는 흉선 외부에서 CD25 (IL-2R 알파) 발현을 획득하고, 전형적으로는 염증 및 질환 프로세스, 예컨대 자가면역 및 암에 의해 유도되는, 비-조절 CD4+ T 세포이다.
조절 T 세포 (Treg)는 과도한 면역계 활성화를 억제시키고, 면역 관용을 촉진시킨다. Treg는 선천 면역 및 적응 면역, 둘 모두를 조정하기 때문에, 최근 면역요법을 위해 Treg를 사용하는 것에 관한 깊은 관심이 이어지고 있다. 결과 개선을 위해 임상적 관용을 요구하는 병태 - 자가면역 질환, 고형 기관 이식, 및 조혈 줄기 세포 이식 - 는 Treg 면역요법이 유익할 수 있다. 임상적으로 실행가능한 Treg 면역요법에 대한 장벽으로는 Treg 안정성, 세포에서 벗어난 효과, 및 세포 제제 순도 및 효력 입증을 포함한다. 이식편대숙주질환 (GVHD)을 치료하기 위해 Treg 입양 전달을 포함하는 임상 시험은 예비적으로 인간에서 Treg 면역요법의 안전성 및 효능을 입증하였다. 상기 시험에서, Treg는 GVHD 환자의 혈액에서 2주 초과로 지속되지는 않는 것으로 나타났다.
따라서, 관련 기술분야에서는 짧은 지속성과 같은 장벽을 극복할 수 있는 면역 세포 개발이 요구되고 있다. 특히, 관련 기술분야에서는 생체내에서의 지속성이 증가된 Treg 개발이 요구되고 있다.
스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제는 이식편대숙주질환 (GVHD)을 앓는 대상체를 치료할 때의 표준 치료 예방을 나타내고, Treg 지속성 및 기능을 억제시킬 수 있다. 표준 치료 GVHD 예방 (예컨대, 칼시뉴린 억제제, 스테로이드)과 조합된 T 이펙터 (Teff) 세포의 Treg 억제는 Treg 지속성 및 기능을 직접적으로 억제시킬 수 있다. 본 발명은 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제에 대하여 저항성이 되도록 유전자 변형된 면역 세포 (예컨대, Treg)가 증강된 기능 및 생존능을 갖는다는 발견에 기초한다. 본 발명은 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제 저항성 면역 세포 (예컨대, Treg)를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 유전자 변형된 면역 세포를 제조하는 방법, 및 상기를 사용하여 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제가 예방으로서 사용되는 동종반응 및/또는 동종면역을 치료하는 방법을 제공한다.
제1 측면에서, 본원에서는 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌에 유전자 변형을 포함하는, 스테로이드-저항성 유전자 변형된 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포이며, 여기서 변형은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 변형은 NR3C1의 엑손, 스플라이스 공여자, 또는 스플라이스 수용자에 위치하고, 여기서 변형된 세포는 상기 유전자 변형의 결과로서 스테로이드-저항성이 되는 것인, 상기 스테로이드-저항성 유전자 변형된 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포를 제공한다. 유전자 변형은 CRISPR-Cas 시스템, CRISPR-Cpf1 시스템, Cas9 오르토로그, Cas9 파라로그, Cas-관련 패밀리 구성원, 아연 핑거, TALEN, 또는 메가뉴클레아제에 의해 매개될 수 있다. 변형은 indel일 수 있다. indel은 NR3C1의 엑손 2에 위치할 수 있다. NR3C1에서 indel은 CRISPR 시스템에 의해 매개될 수 있다. CRISPR 시스템은 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 서열식별번호(SEQ ID NO:) 7-10 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 서열식별번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 변형은 염기쌍 치환일 수 있다. NR3C1에서 치환은 CRISPR 시스템에 의해 매개될 수 있다. CRISPR 시스템은 염기 에디터 및 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 염기 에디터는 CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인 또는 그의 변이체, 및 염기-편집 도메인을 포함할 수 있다. CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인은 Cas9 도메인일 수 있다. CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인은 변이체 Cas9 도메인일 수 있다. 변이체 Cas9 도메인은 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인일 수 있다. 염기-편집 도메인은 데아미나제 도메인일 수 있다. 데아미나제 도메인은 시토신 또는 아데닌에 대해 특이성을 가질 수 있다. 데아미나제 도메인은 시티딘 또는 아데노신 데아미나제일 수 있다. 치환은 NR3C1에 조기 정지 코돈을 도입하여 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 가이드 RNA는 NR3C1의 엑손 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 서열식별번호 17-54 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 NR3C1의 스플라이스 수용자 또는 스플라이스 공여자를 포함하는 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. 치환은 NR3C1 mRNA의 스플라이싱을 파괴시켜 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 가이드 RNA는 서열식별번호 55 또는 56 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 변형된 세포는 코르티코스테로이드에 대해 저항성일 수 있다. 변형된 세포는 글루코코르티코스테로이드에 대해 저항성일 수 있다. 글루코코르티코스테로이드는 프로게스테론-타입 글루코코르티코스테로이드, 히드로코르티손-타입 글루코코르티코스테로이드, 메타손-타입 글루코코르티코스테로이드, 및 아세토니드-타입 글루코코르티코스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 글루코코르티코스테로이드는 덱사메타손, 베타메타손, 히드로코르티손 (코르티솔), 프레드니손, 프레드니솔론, 로테프레드놀, 데플라자코트, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 플루드로코르티손, 및 데옥시코르티코스테론으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 세포의 게놈 중 외인성 칼시뉴린 억제제 (CNI) 저항성 유전자를 포함하는 칼시뉴린 억제제 (CNI)-저항성, 유전자 변형된 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포이며, 여기서 CNI-저항성 유전자는 CRISPR-매개된 상동성 지정 수복 (HDR)의 결과로서 삽입되고, 여기서 변형된 세포는 상기 저항성 유전자의 결과로서 CNI-저항성이 되는 것인, 상기 CNI-저항성, 유전자 변형된 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포를 제공한다. 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자는 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌에 삽입될 수 있다. 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자는 PPP3Ca, PPP3Cb 및 PPP3Cc로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 A (CNa) 유전자의 돌연변이체 형태, 또는 PPP3R1 및 PPP3R2로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 B (CNb) 유전자의 돌연변이체 형태일 수 있다. 돌연변이체 칼시뉴린 유전자는 외인성 공여자 DNA 서열을 사용하여 상동성 재조합을 통해 NR3C1 유전자좌 내로 삽입될 수 있다. 외인성 공여자 DNA 서열은 서열식별번호 11에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자는 칼시뉴린 변이체 단백질을 코딩할 수 있다. 칼시뉴린 변이체 단백질은 CNa12, CNa22, 및 CNb30으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 칼시뉴린 변이체는 서열식별번호 3-5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 칼시뉴린 변이체 단백질은 칼시뉴린 억제제에는 결합할 수 있지만, 칼시뉴린에는 결합하지 않고, 이에 의해 칼시뉴린 억제제를 격리시키고, 칼시뉴린 억제를 막을 수 있다. 변형된 세포는 시클로스포린 A (CsA), 보클로스포린(Voclosporin), 타크로리무스(타크로리무스) (FK-506, 후지마이신), 피메크로리무스(Pimecrolimus), 및 그의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 억제제에 대해 저항성일 수 있다.
추가 측면에서, 본원에서는 (1) NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌에 indel을 포함하는 제1 유전자 변형이며, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 것인 제1 유전자 변형, 및 (2) 세포의 게놈 내로 삽입된 외인성 CNI 저항성 유전자를 포함하는 제2 유전자 변형이며, 여기서 CNI 저항성 유전자는 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중의 indel 부위에 잔류하는 것인 제2 유전자 변형을 포함하는, 유전자 변형된, 스테로이드-저항성 및 칼시뉴린 억제제 (CNI)-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포이며, 여기서 변형된 세포는 상기 유전자 변형의 결과로서 스테로이드- 및 CNI-저항성이 되는 것인, 상기 유전자 변형된, 스테로이드-저항성 및 CNI-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포를 제공한다. 유전자의 유전자좌는 NR3C1의 엑손 2에 상응할 수 있다. indel은 서열식별번호 7-10 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템에 의해 매개될 수 있다. indel은 서열식별번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템에 의해 매개될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 (1) NR3C1 유전자의 유전자좌에 변형을 포함하는 제1 유전자 변형이며, 여기서 변형은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 것인 제1 유전자 변형, 및 (2) 세포의 게놈 내로 삽입된 외인성 CNI 저항성 유전자를 포함하는 제2 유전자 변형을 포함하는, 유전자 변형된, 스테로이드-저항성 및 칼시뉴린 억제제 (CNI)-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포이며, 여기서 변형된 세포는 상기 유전자 변형의 결과로서 스테로이드- 및 CNI-저항성이 되는 것인, 상기 유전자 변형된, 스테로이드-저항성 및 CNI-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포를 제공한다. 제1 또는 제2 변형은 CRISPR-Cas9 시스템, CRISPR-Cpf1 시스템, Cas9 오르토로그, Cas9 파라로그, Cas-관련 패밀리 구성원, 아연 핑거, TALEN, 또는 메가뉴클레아제에 의해 매개될 수 있다. 변형은 indel일 수 있다. indel은 NR3C1의 엑손 2에 위치할 수 있다. NR3C1에서 indel은 CRISPR 시스템에 의해 매개될 수 있다. CRISPR 시스템은 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 서열식별번호 7-10 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 서열식별번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 변형은 염기쌍 치환일 수 있다. NR3C1에서 치환은 CRISPR 시스템에 의해 매개될 수 있다. CRISPR 시스템은 염기 에디터 및 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 염기 에디터는 CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인 또는 그의 변이체, 및 염기-편집 도메인을 포함할 수 있다. CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인은 Cas9 도메인일 수 있다. CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인은 변이체 Cas9 도메인일 수 있다. 변이체 Cas9 도메인은 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인일 수 있다. 염기-편집 도메인은 데아미나제 도메인일 수 있다. 데아미나제 도메인은 시토신 또는 아데닌에 대해 특이성을 가질 수 있다. 데아미나제 도메인은 시티딘 또는 아데노신 데아미나제일 수 있다. 치환은 NR3C1에 조기 정지 코돈을 도입하여 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 가이드 RNA는 NR3C1의 엑손 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 서열식별번호 17-54 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 NR3C1의 스플라이스 수용자 또는 스플라이스 공여자를 포함하는 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. 치환은 NR3C1 mRNA의 스플라이싱을 파괴시켜 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 가이드 RNA는 서열식별번호 55-56 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 변형된 세포는 코르티코스테로이드에 대해 저항성일 수 있다. 변형된 세포는 글루코코르티코스테로이드에 대해 저항성일 수 있다. 글루코코르티코스테로이드는 프로게스테론-타입 글루코코르티코스테로이드, 히드로코르티손-타입 글루코코르티코스테로이드, 메타손-타입 글루코코르티코스테로이드, 및 아세토니드-타입 글루코코르티코스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 글루코코르티코스테로이드는 덱사메타손, 베타메타손, 히드로코르티손 (코르티솔), 프레드니손, 프레드니솔론, 로테프레드놀, 데플라자코트, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 플루드로코르티손, 및 데옥시코르티코스테론으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자는 PPP3Ca, PPP3Cb 및 PPP3Cc로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 A (CNa) 유전자의 돌연변이체 형태, 또는 PPP3R1 및 PPP3R2로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 B (CNb) 유전자의 돌연변이체 형태일 수 있다. 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자는 칼시뉴린 변이체 단백질을 코딩할 수 있다. 칼시뉴린 변이체 단백질은 CNa12, CNa22, 및 CNb30으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 칼시뉴린 변이체 단백질은 서열식별번호 3-5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 칼시뉴린 변이체 단백질은 칼시뉴린 억제제에는 결합할 수 있지만, 칼시뉴린에는 결합하지 않고, 이에 의해 칼시뉴린 억제제를 격리시키고, 칼시뉴린 억제를 막을 수 있다. 돌연변이체 칼시뉴린 유전자는 외인성 공여자 DNA 서열을 사용하여 상동성 재조합을 통해 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 돌연변이체 칼시뉴린 유전자는 NR3C1 유전자좌 내로 삽입될 수 있다. 변형된 세포는 시클로스포린 A (CsA), 보클로스포린, 타크로리무스 (FK-506, 후지마이신), 피메크로리무스, 및 그의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 억제제에 대해 저항성일 수 있다. 변형된 세포는 변형된 면역 세포일 수 있다. 변형된 세포는 변형된 조절 T 세포 (Treg)일 수 있다. 변형된 세포는 자가유래 세포일 수 있다. 변형된 세포는 동종이계 세포일 수 있다. 변형된 세포는 인간 대상체로부터 단리된 것일 수 있다. 인간 대상체는 줄기 세포 이식편을 받았을 수 있거나, 또는 줄기 세포 이식 후보이다. 인간 대상체는 고형 기관 이식편을 받았을 수 있거나, 또는 고형 기관 이식 후보이다. 인간 대상체는 자가면역 장애를 앓는 인간 대상체일 수 있다. 인간 대상체는 이식편대숙주질환 (GVHD)을 앓는 인간 대상체일 수 있다. 인간 대상체는 1형 당뇨병을 앓는 인간 대상체일 수 있다.
추가 측면에서, 본원에서는 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌에서 변형을 일으키는 CRISPR 시스템을 세포 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 변형은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 것인, 변형된 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 변형은 NR3C1의 엑손 2 중의 indel일 수 있다. CRISPR 시스템은 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 서열식별번호 7-10 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 서열식별번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 변형은 염기쌍 치환일 수 있다. CRISPR 시스템은 염기 에디터 및 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 염기 에디터는 CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인 또는 그의 변이체, 및 염기-편집 도메인을 포함할 수 있다. CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인은 Cas9 도메인일 수 있다. CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인은 변이체 Cas9 도메인일 수 있다. 변이체 Cas9 도메인은 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인일 수 있다. 염기-편집 도메인은 데아미나제 도메인일 수 있다. 데아미나제 도메인은 시토신 또는 아데닌에 대해 특이성을 가질 수 있다. 데아미나제 도메인은 시티딘 또는 아데노신 데아미나제일 수 있다. 치환은 NR3C1에 조기 정지 코돈을 도입하여 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 가이드 RNA는 NR3C1의 엑손 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 서열식별번호 17-54 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 NR3C1의 스플라이스 수용자 또는 스플라이스 공여자를 포함하는 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. 치환은 NR3C1 mRNA의 스플라이싱을 파괴시켜 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 가이드 RNA는 서열식별번호 55-56 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 뉴클레아제/염기 에디터 및 가이드 RNA는 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체를 포함할 수 있다. CRISPR 뉴클레아제/염기 에디터 및/또는 가이드 RNA는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 벡터 및/또는 합성 mRNA를 포함할 수 있다. RNP 또는 폴리뉴클레오티드는 전기천공에 의해 도입될 수 있다. 본 방법은 외인성 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자의 세포의 게놈 내로의 삽입을 추가로 포함할 수 있다. 외인성 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자의 삽입은 상동성 재조합을 통해 이루어질 수 있다. 삽입은 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중 indel 부위에서 이루어질 수 있다. 삽입은 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중 indel 부위에서 이루어질 수 있다. 삽입은 외인성 공여자 DNA 서열로부터의 상동성 재조합을 통해 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중 indel 부위에서 이루어질 수 있다. 외인성 공여자 DNA 서열은 서열식별번호 11에 기재된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 외인성 공여자 DNA 서열은 바이러스 형질도입을 통해 도입될 수 있다. 외인성 공여자 DNA 서열은 전기천공을 통해 도입될 수 있다. 외인성 공여자 DNA 서열은 리포터 분자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 프로모터 및 리포터 분자를 코딩하는 핵산은 링커에 의해 분리될 수 있다. 링커는 T2A 서열을 포함할 수 있다. 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자는 PPP3Ca, PPP3Cb 및 PPP3Cc로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 A (CNa) 유전자의 돌연변이체 형태, 또는 PPP3R1 및 PPP3R2로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 B (CNb) 유전자의 돌연변이체 형태일 수 있다. 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자는 칼시뉴린 변이체 단백질을 코딩할 수 있다. 칼시뉴린 변이체 단백질은 CNa12, CNa22, 및 CNb30으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 칼시뉴린 변이체 단백질은 서열식별번호 3-5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 변형된 세포는 변형된 면역 세포일 수 있다. 변형된 세포는 변형된 조절 T 세포 (Treg)일 수 있다. 변형된 세포는 자가유래 세포일 수 있다. 변형된 세포는 동종이계 세포일 수 있다. 변형된 세포는 인간 대상체로부터 단리된 것일 수 있다. 인간 대상체는 줄기 세포 이식편을 받았을 수 있거나, 또는 줄기 세포 이식 후보이다. 인간 대상체는 고형 기관 이식편을 받았을 수 있거나, 또는 고형 기관 이식 후보이다. 인간 대상체는 자가면역 장애를 앓는 인간 대상체일 수 있다. 인간 대상체는 이식편대숙주질환 (GVHD)을 앓는 인간 대상체일 수 있다. 인간 대상체는 1형 당뇨병을 앓는 인간 대상체일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 면역억제 효과 달성을 필요로 하는 대상체에게 본원에서 제공되는 바와 같은 변형된 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 면역억제 효과 달성을 필요로 하는 대상체에서 면역억제 효과를 달성하는 방법을 제공한다. 대상체는 동종반응 및/또는 자가면역 반응을 앓는 대상체일 수 있다.
추가 측면에서, 본원에서는 동종반응 및/또는 자가면역 반응 발병 이전에 예방적 치료 효과 달성을 필요로 하는 대상체에게 본원에서 제공되는 바와 같은 변형된 세포의 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 예방적 치료 효과 달성을 필요로 하는 대상체에서 예방적 치료 효과를 달성하는 방법을 제공한다. 동종반응 및/또는 자가면역 반응은 생물학적 물질의 이식 이후에 일어날 수 있다. 생물학적 물질은 세포, 조직, 및 기관으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생물학적 물질은 동종이계일 수 있다. 대상체는 인간일 수 있다. 인간 대상체는 줄기 세포 이식편을 받았을 수 있거나, 또는 줄기 세포 이식 후보이다. 인간 대상체는 고형 기관 이식편을 받았을 수 있거나, 또는 고형 기관 이식 후보이다. 인간 대상체는 자가면역 장애를 앓는 인간 대상체일 수 있다. 인간 대상체는 이식편대숙주질환 (GVHD)을 앓는 인간 대상체일 수 있다. 인간 대상체는 1형 당뇨병을 앓는 인간 대상체일 수 있다. 변형된 세포는 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제와 조합하여 투여될 수 있다. 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제는 변형된 세포 투여 이전에 투여될 수 있다. 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제는 변형된 세포 투여와 동시에 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 스테로이드는 코르티코스테로이드일 수 있다. 스테로이드는 글루코코르티코스테로이드일 수 있다. 글루코코르티코스테로이드는 프로게스테론-타입 글루코코르티코스테로이드, 히드로코르티손-타입 글루코코르티코스테로이드, 메타손-타입 글루코코르티코스테로이드, 및 아세토니드-타입 글루코코르티코스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 글루코코르티코스테로이드는 덱사메타손, 베타메타손, 히드로코르티손 (코르티솔), 프레드니손, 프레드니솔론, 로테프레드놀, 데플라자코트, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 플루드로코르티손, 및 데옥시코르티코스테론으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 칼시뉴린 억제제는 시클로스포린 A (CsA), 보클로스포린, 타크로리무스 (FK-506, 후지마이신), 피메크로리무스, 및 그의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점들은 첨부된 도면과 함께 취해진 예시적인 실시양태에 관한 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 완전하게 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 실시양태의 Treg 뱅킹 프로토콜의 한 버전을 보여주는 개략도를 도시한 것이다.
도 2a-2d는 덱사메타손이 Treg 생존에 미치는 효과를 보여주는 데이터를 도시한 것이다. 4개의 실험을 기술된 바와 같이 수행하였다. 제시된 데이터는 모든 실험으로부터의 집계 데이터이고, 평균 ± 1 평균 표준 오차를 나타낸다. 도 2a는 배양 조건의 타임라인을 보여주는 개략도를 도시한 것이다. 도 2b는 덱사메타손이 생존에 미치는 효과를 보여주는 그래프를 도시한 것이다. 도 2c는 덱사메타손이 FOXP3+CD127- 세포에 미치는 효과를 보여주는 그래프를 도시한 것이다. 도 2d는 덱사메타손이 억제 활성에 미치는 효과를 보여주는 그래프를 도시한 것이다. 각 Treg:PBMC 비에서 두 군 사이의 p 값은 ≤0.05였다.
도 3a-3d는 CRISPR 가이드 RNA 및 Cas9에 의한 NR3C1 글루코코르티코이드 수용체의 유전자 편집 프로세스를 도시한 것이다. 도 3a는 유전자 전달 프로세스를 예시한 개략도를 도시한 것이다. T 세포 또는 Treg를 수확하고, 48 h (신선한 것) 또는 72 h (냉동된 것) 동안 CD3/CD28 비드로 활성화시켰다. 네온(Neon) 전기천공 장치를 사용하여 유전자 특이적 가이드 RNA를 이용하여 Cas9 mRNA 또는 단백질을 전달하였다. 도 3b는 NR3C1 유전자 표적화를 예시한 개략도를 도시한 것이다. 엑손 2 중 4개 부위를 확인하고 시험하였다. 4개 후보를 확인하였다. 서베이어(Surveyor) 방법을 이용하여 후보를 시험하였다. 도 3c는 서베이어 검정법을 예시한 개략도를 도시한 것이다. 변형된 유전자 ("돌연변이체 앰플리콘") 및 비변형된 유전자 ("야생형 앰플리콘")는 하이브리드화되고, 이에 의해 호모듀플렉스 또는 헤테로듀플렉스가 생성된다. 유전자 편집된 및 야생형 서열의 쌍형성에 의해 유발된 헤테로듀플렉스는 서베이어 효소에 의해 절단되고, 이에 의해 예측가능한 DNA 단편이 생성된다.
도 4a-4d는 Treg에서의 CRISPR/Cas9-매개 NR3C1 넉아웃을 도시한 것이다. Cas9 펩티드를 이용하여 가이드 RNA 후보 GR1 및 GR2를, 리보뉴클레오단백질 입자 (RNP)로서 활성화된 Treg 내로 전기천공시켰다. 도 4a는 배양 프로세스를 예시한 개략도를 도시한 것이다. 도 4b는 명시된 조건하에 30 ug/mL의 덱사메타손을 첨가한 후 72 h째에 Treg 생존을 평가하는 플롯을 도시한 것이다. 도 4c 및 도 4d는 NR3C1 유전자좌 덱사메타손 노출 이전 (도 4c) 덱사메타손 노출 이후 (도 4d)의 분자 분석을 보여주는 것이다. NR3C1 유전자좌를 세포 풀로부터 증폭시키고, TIDE에 의해 indel 분석을 수행하였다. 덱사메타손 이전 및 이후의 세포에 대한 전체 유전자 변형률은 각각 35% 및 44%였다. 그래프는 각 집단에서 관찰된 indel 패턴에 상응한다. 어느 이론으로도 제한하지 않으면서, 프레임 밖 indel (예컨대, 3개만큼 비-분열인 것)은 유전자 불활성화될 것으로 예측된다. Y축은 전체 비율로서 indel 수를 나타낸다. X축은 비변형 (위치 0의 막대로 제시) 대비 indel을 나타낸다. 결실은 위치 0 좌측에 제시되어 있고, 각 막대는 표적 부위로부터 1-10 bp만큼 떨어져 있다. +1 bp의 삽입은 위치 0 우측에 제시되어 있다. 별표 표시는 +1, -1, 및 -7 bp 삽입/결실을 나타내고, 이들 이벤트의 빈도는 덱사메타손 노출에 따라 증가하였고 (도 4c와 도 4d 비교), 도 4c-4d에서 진한 검은색 막대는 편집 이벤트가 <0.5%인 것을 나타낸다.
도 5a-5c는 Treg에서의 상동성 지정 수복 (HDR)을 도시한 것이다. 도 5a는 유전자 표적화 전략법을 도시한 것이다. NR3C1 유전자의 엑손 2로 표적화되어 21개의 아미노산을 상실시킬 수 있도록 GFP와 함께 공동 발현되는 칼시뉴린 저항성 유전자를 디자인하였다. 공여자를 AAV-6 입자 내에 캡슐화하고, 표적 유전자좌에서 공여자 내에서 및 공여자 밖에서 프라이머 (수평 화살표로 표시)를 이용하여 인사이드/아웃 PCR을 사용하여 스크리닝을 수행하였다. 도 5b는 유전자 표적화 최적화를 도시한 것이다. 활성화된 Treg를 NR3C1 Cas9 RNP로 전기천공시키고, 상이한 명시된 양의 AAV-6 공여자를 부가하였다. 생어(Sanger) 서열분석을 통해 도 5c에 제시된 공여자와 인접 유전자좌 서열 사이의 접합부를 확인한, 인사이드/아웃 PCR 결과가 제시되어 있다.
도 6a-6d는 최적의 Treg 확장 조건하에 GR2-Cas9 및 AAV를 이용하여 Treg에서 이루어진 HDR이 칼시뉴린 변이체 (CnB mut)의 삽입에 의해 글루코코르티코이드 파괴된 Treg의 생존을 구제한다는 것을 도시한 것이다. 도 6a는 배양 프로세스를 예시한 개략도를 도시한 것이다. 도 6b (p≤0.07)는 2일의 기간 동안에 걸친 대조군 및 칼시뉴린 변이체 (CnB mut) AAV 형질도입된 Treg의 확장 배수를 도시한 것이다. 도 6c는 대조군 (검은색) 또는 칼시뉴린 변이체 (CnB mut; 회색)에 대해 열거된 바와 같은 덱사메타손 부재 또는 덱사메타손 조건하에서의 GFP 발현율(%)을 도시한 것이다. 도 6d는 모의 형질도입 또는 명시된 덱사메타손 농도에 노출된 Treg의 상대적인 생존을 도시한 것이다. p 값은 명시된 바와 같고, 4개의 별개의 배양물로부터의 집계 데이터를 나타낸다.
도 7a-7d는 IL-2 농도와 관련된 Treg 약물 감수성을 도시한 것이다. 도 7a는 도 7b에 대한 데이터를 수득하기 위해 사용된 배양 프로세스를 예시한 개략도를 도시한 것이다. 도 7b는 약물 부재하에 (대조군) 또는 CsA 또는 타크로리무스 (FK506)와 함께 배양된 Treg의 생존율(%)을 보여주는 데이터를 도시한 것이다 (p= 모든 비교에서 비유의적). 약물 부재하인 대조군 Treg 대비 생존율(%)이 제시되어 있다. 300 U/mL의 IL-2 농도를 사용하였다. 도 7c는 도 7d에 대한 데이터를 수득하기 위해 사용된 배양 프로세스를 예시한 개략도를 도시한 것이다. 도 7d는 명시된 바와 같이 30, 100, 또는 300 U/mL의 IL-2의 존재하에 명시된 농도의 약물과 함께 배양된 것과 비교하여, IL-2 300 U/mL에서 약물 부재하의 Treg의 상대적인 생존율(%)을 보여주는 데이터를 도시한 것이다. 평균 값은 3개 (도 7b) 또는 4개 (도 7d)의 별개의 배양물에 대한 평균의 ± 표준 오차로 제시되어 있다.
도 8은 동종이계 BMT 수용자에서의 GVHD 예방을 위한 스테로이드 용량 반응을 도시한 것이다. n = 8마리/군. BALB/c 마우스에 치명적으로 방사선 조사하고, B6 BM + 2 M T 세포, 및 1-28일째까지 명시된 용량의 스테로이드를 제공하였다. 저용량 라파마이신 (0-14일, 27일째까지 주 3회)을 비교군으로서 사용하였다. 각 군은 비히클 대조군과 유의적으로 상이한 것으로 나타났다.
도 9는 동종이계 BMT 수용자에서의 스테로이드 기반 GVHD 요법을 도시한 것이다. n = 8마리/군. BALB/c 마우스에 치명적으로 방사선 조사하고, B6 BM + 1.5 M T 세포, 및 3-28일째까지 또는 4-28일째까지 10 mg/kg/일의 스테로이드를 제공하였다. 3일째 처리는 비히클 대조군보다 유의적으로 우수한 것으로 나타났다 (p = 0.03).
도 10은 동종이계 BMT 수용자에서의 스테로이드 기반 GVHD 요법을 도시한 것이다. n =15 (BM - 동그라미 표시), 16 (비히클 - 사각형 표시) 및 25 (프레드니솔론 - 삼각형 표시). BALB/c 마우스에 치명적으로 방사선 조사하고, B6 BM + 1.5 M T 세포, 및 3-28일째까지 10 mg/kg/일의 스테로이드를 제공하였다. 3일째 처리는 비히클 대조군보다 유의적으로 우수한 것으로 나타났다 (p = 0.0016).
도 11a-11d는 마우스에서의 GVHD의 모니터링을 도시한 것이다. 인간 PBMC (15 x 106)를 방사선 조사된 (50 rad) NSG 마우스 ± 메틸프레드니솔론 (15 mg/kg)에 주사하고, GVHD의 징후를 모니터링하였다. 도 11a는 코호트 (n = 각각 마우스 7마리씩), 투약 스케줄, 및 분석 시점을 나타낸, 실험을 예시한 개략도를 도시한 것이다. 도 11b는 PBMC만 단독, 또는 PBMC + 프레드니솔론을 받은 마우스에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 도시한 것이다 (p = 0.104). 도 11c는 체중 감소에 의한 질환 진행 모니터링을 도시한 것이다 (p = 비유의적). 도 11d는 PBMC-유래 CD45+, CD4+, CD8+, 및 CD4+Foxp3+ T 세포의 개수 (각각 p < 0.03, < 0.05, < 0.03, 및 비유의적)를 정량화함으로써 질환 진행 모니터링을 도시한 것이다. 평가를 위해 19일째에 동물에서 채혈하였다.
도 12a-12d는 마우스에서의 GVHD의 모니터링을 도시한 것이다. 인간 PBMC (15 x 106)를 방사선 조사된 (50 rad) NSG 마우스 ± FK506 (36 또는 12 mg/kg) 또는 CsA (80 mg/kg)에 주사하고, GVHD의 징후를 모니터링하였다. 도 12a는 코호트 (모든 군에서 n = 각각 마우스 7마리씩, 단, 예외적으로, CsA의 경우, n = 5), 투약 스케줄, 및 분석 시점을 나타낸, 실험을 예시한 개략도를 도시한 것이다. 도 12b는 PBMC만 단독, 또는 PBMC + CNI (PBMC만 단독 대 FK506 (36 mg/kg), p≤0.04)를 받은 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 도시한 것이다. 도 12c는 체중 감소에 의한 질환 진행 모니터링을 도시한 것이다 (p = 비유의적). 도 12d는 PBMC-유래 CD45+, CD4+, CD8+, 및 CD4+Foxp3+ T 세포의 개수 (각각 p < 0.03, < 0.05, < 0.02, 및 비유의적)를 정량화함으로써 질환 진행 모니터링을 도시한 것이다. 평가를 위해 18일째에 동물에서 채혈하였다.
도 13은 코호트 (n = 마우스 7마리), 투약 스케줄, 및 분석 시점을 개략적으로 예시한 개략도를 도시한 것이다. 인간 PBMC (15 x 106)를 방사선 조사된 (50 rad) NSG 마우스 ± 프레드니솔론 (10 mg/kg), FK506 (12 mg/kg) 또는 CsA (20 mg/kg)에 주사하고, GVHD의 징후 (생존, 체중, 임상 점수, 및 인간 T 세포 확장 포함)를 모니터링하였다.
도 14a-14c는 명시된 바와 같은 다양한 조작을 수행한 후의 확장에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 15는 칼시뉴린 변이체 단백질을 코딩하는 핵산 공여자 삽입체를 예시한 개략도를 도시한 것이다.
도 16은 치환 도입을 할 수 있는 Cas9-데아미나제 융합 유전자/펩티드인 염기 에디터 플랫폼, 및 표적화 전략법의 일반 스키마 및 본 개시내용의 방법을 사용하는 분자 분석 및 정량화를 보여주는 개략도를 도시한 것이다.
도 17은 Treg에서 염기-편집을 달성하는 일반 단계를 보여주는 흐름도를 도시한 것이다.
도 18은 대조군 세포, 및 NR3C1 내로 조기 정지 코돈을 도입하도록 디자인된 gRNA (서열식별번호 20)가 전기천공된 세포의 게놈 서열분석 데이터를 도시한 것이다. gRNA에 상응하는 게놈 중의 각 위치에서의 T, G, C, 또는 A 뉴클레오티드의 존재율(%)이 제시되어 있다.
도 19는 대조군 세포, 및 NR3C1 내로 조기 정지 코돈을 도입하도록 디자인된 gRNA (서열식별번호 20)가 전기천공된 세포의 게놈 서열분석 데이터를 도시한 것이다. gRNA에 상응하는 게놈 중의 각 위치에서의 T, G, C, 또는 A 뉴클레오티드의 존재율(%)이 제시되어 있다.
도 20은 대조군 세포, 및 NR3C1 내로 조기 정지 코돈을 도입하도록 디자인된 gRNA (서열식별번호 21)가 전기천공된 세포의 게놈 서열분석 데이터를 도시한 것이다. gRNA에 상응하는 게놈 중의 각 위치에서의 T, G, C, 또는 A 뉴클레오티드의 존재율(%)이 제시되어 있다.
도 21은 대조군 세포, 및 NR3C1 내로 조기 정지 코돈을 도입하도록 디자인된 gRNA (서열식별번호 21)가 전기천공된 세포의 게놈 서열분석 데이터를 도시한 것이다. gRNA에 상응하는 게놈 중의 각 위치에서의 T, G, C, 또는 A 뉴클레오티드의 존재율(%)이 제시되어 있다.
도 22는 본 개시내용의 방법을 사용한 스플라이스 부위 내로의 치환 도입을 보여주는 개략도를 도시한 것이다.
도 23은 대조군 세포, 및 NR3C1의 스플라이스 수용자 내로 변형을 도입하도록 디자인된 gRNA (서열식별번호 55)가 전기천공된 세포의 게놈 서열분석 데이터를 도시한 것이다. gRNA에 상응하는 게놈 중의 각 위치에서의 T, G, C, 또는 A 뉴클레오티드의 존재율(%)이 제시되어 있다.
도 24는 대조군 세포, 및 NR3C1의 스플라이스 수용자 내로 변형을 도입하도록 디자인된 gRNA (서열식별번호 55)가 전기천공된 세포의 게놈 서열분석 데이터를 도시한 것이다. gRNA에 상응하는 게놈 중의 각 위치에서의 T, G, C, 또는 A 뉴클레오티드의 존재율(%)이 제시되어 있다.
도 25는 대조군 세포, 및 NR3C1의 스플라이스 공여자 내로 변형을 도입하도록 디자인된 gRNA (서열식별번호 56)가 전기천공된 세포의 게놈 서열분석 데이터를 도시한 것이다. gRNA에 상응하는 게놈 중의 각 위치에서의 T, G, C, 또는 A 뉴클레오티드의 존재율(%)이 제시되어 있다.
도 26은 대조군 세포, 및 NR3C1의 스플라이스 공여자 내로 변형을 도입하도록 디자인된 gRNA (서열식별번호 56)가 전기천공된 세포의 게놈 서열분석 데이터를 도시한 것이다. gRNA에 상응하는 게놈 중의 각 위치에서의 T, G, C, 또는 A 뉴클레오티드의 존재율(%)이 제시되어 있다.
도 27은 2개의 실험에 대한 일반 개요를 도시한 것이다. 한 실험에서는 이펙터 T 세포 (Teff)에서 BE4를 사용하여 글루코코르티코이드 수용체 유전자좌를 염기 편집하였고, 2 라운드의 비드 자극을 수행하였다. 제2 실험에서는 BE4를 사용하여 이펙터 T 세포에서 글루코코르티코이드 수용체 유전자좌를 염기 편집하였지만, 단 1 라운드의 비드 자극만을 수행하였다.
도 28은 덱사메타손의 존재 또는 부재하에서 gRNA GR2 (표 1에서 서열식별번호 8) 또는 BE4 (표 2에서 서열식별번호 20)를 사용하여 변형된 공여자로부터의 글루코코르티코이드 수용체 염기 편집 이후 CD4+ 이펙터 T 세포 (Teff)의 상대적인 생존율(%)을 보여주는 데이터를 도시한 것이다. 제1 공여자의 세포는 2 라운드의 자극을 받았고, 제2 공여자의 세포는 1 라운드의 자극을 받았다. 2 라운드의 자극을 받은 Teff는 덱사메타손 (Dex)에 대하여 매우 높은 감수성을 보였다. 2 라운드의 BE4를 이용하여 이루어진 편집은 두 실험 모두에서 30 ㎍/ml의 GR2보다 더욱 효과적이었다 (각각 p ≤ 0.001, p ≤ 0.01).
본 발명은 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제 저항성인 변형된 조혈 세포 또는 그의 전구체 (예컨대, 변형된 Treg)에 대한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 변형된 세포는 세포 지속성 및 생존의 스테로이드-매개 감소의 원인이 되는 하나 이상의 내인성 유전자를 파괴하도록 유전자 편집된 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 세포는 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자를 도입하도록 유전자 편집된 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 NR3C1 유전자의 유전자좌에 하나 이상의 indel을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 NR3C1 유전자의 유전자좌에 하나 이상의 indel을 포함하고, NR3C1 유전자의 유전자좌 중 하나 이상의 indel 내로 삽입된 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 세포, 조성물 및 방법은 증가된 지속성 및/또는 생존을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 Treg는 증가된 지속성 및/또는 생존을 보인다. 임상 환경에서, 스테로이드 및 칼시뉴린 억제제 투여는 예컨대, 동종이계 세포 이식을 받은 개체를 위한 표준 치료의 예방적 치료를 나타낸다. 조절 T 세포의 입양 전달은 동종이계 세포 이식 이후의 부정적인 효과를 감소시키는 접근법이다. 본원에서 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제가 Treg의 지속성 및 생존에 부정적인 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표준 치료의 예방적 치료의 존재하에서 더욱 잘 지속되고, 장기간 생존한다.
본원에 개시된 특정 방법 및 실험 조건은 달라질 수 있는 바, 본 개시내용에 기술된 방법은 상기 방법 및 조건으로 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다.
추가로, 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기술된 실험은 관련 기술분야 내의 종래의 분자 및 세포 생물 및 면역학적 기술을 사용한다. 상기 기술은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예컨대, 문헌 [Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008), including all supplements, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition) by MR Green and J. Sambrook and Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 2nd edition)]을 참조한다.
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 보편적으로 이해되는 의미를 갖는다. 잠재적 의미가 불확실한 경우, 본원에서 제공된 정의가 어떤 사전 또는 외적 정의보다 우선시된다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수를 포함하여야 하고, 복수형 용어는 단수를 포함하여야 한다. 달리 언급되지 않는 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. "포함하는"이라는 용어 뿐만 아니라, 예컨대 "포함하다" 및 "포함된"이라는 것과 같은 다른 형태의 사용은 제한적인 것이 아니다.
일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전자학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 보편적으로 사용된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 제공된 방법 및 기술은 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 종래 방법에 따라 및 본 명세서 전역에서 인용되고, 논의되는 다양한 일반 참고문헌 및 더욱 구체적인 참고문헌에 기술되어 있는 바와 같이 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 설명서에 따라, 관련 기술분야에서 보편적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명명법, 및 그의 실험실 방법 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 보편적으로 사용되는 것이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 제약 제조, 제제화, 및 전달, 및 환자 치료를 위해 표준 기술이 사용된다.
선택된 용어는 하기에서 정의되며, 이에 의해 본 개시내용은 더욱 쉽게 이해될 수 있다.
본원에서 사용되는 단수 형태 "하나"는 하나 또는 하나 초과의 (즉, 적어도 하나의) 상기 관사의 문법상 대상을 지칭한다. 예로서, "한 요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 측정가능한 값, 예컨대 양, 시간상 지속 기간 등을 언급할 때, "약"은 언급된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게, ±5%, 더욱더 바람직하게, ±1%, 및 더욱더 바람직하게, ±0.1%의 변동을 포함한다는 것을 의미하는 데, 그러한 변동은 본 개시된 방법을 수행하는 데 적절하다.
본원에서 사용되는 바, 질환을 "경감시키다"라는 것은 질환의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "자가유래"라는 용어는 추후에 개체 내로 재도입을 받게 되는 개체와 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하는 것으로 한다.
"질환"은 동물이 항상성을 유지하지 못하는 동물의 건강 상태이며, 여기서 질환이 호전되지 않으면, 이때, 동물의 건강은 계속해서 악화된다. 그에 반해, 동물에서 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있지만, 동물의 건강 상태는 장애를 앓지 않는 경우보다는 덜 바람직한 것인 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치할 경우, 장애는 반드시 동물의 건강 상태를 추가로 감소시키는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바, "하향조절"이라는 용어는 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 감소 또는 제거를 지칭한다.
"유효량" 또는 "치료 유효량"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 특정 생물학적 결과를 달성하거나, 또는 치료 또는 예방적 이익을 제공하는 데 효과적인, 본원에 기술된 바와 같은 화합물, 제제, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다. 상기 결과로는 포유동물에게 투여되었을 때, 본 발명의 조성물의 부재하에서 검출된 면역 반응과 비교하여 검출가능한 수준의 면역 억제 또는 관용을 일으키는 양을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 면역 반응은 관련 기술분야에서 인정받은 다수의 방법에 의해 쉽게 평가될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에서 투여되는 조성물의 양이 달라지고, 이는 다수의 인자, 예컨대 치료되는 질환 또는 병태, 치료되는 포유동물의 연령 및 건강 및 신체 상태, 질환의 중증도, 및 투여되는 특정 화합물 등에 기초하여 쉽게 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
"코딩하는"이란, 정의된 뉴클레오티드 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열을 갖는 생물학적 프로세스에 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 중 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성, 및 그로부터 발생된 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성한다면, 유전자는 단백질을 코딩하는 것이다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고, 일반적으로 서열 목록으로 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥, 이 둘 모두, 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "내인성"이란, 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 유래되거나, 또는 그 내부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "외인성"이라는 용어는 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 밖에서부터 도입되거나, 또는 밖에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "확장시키다"라는 용어는 세포 (예컨대, Treg) 개수 증가와 같이, 개수를 증가시키는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 생체외에서 확장된 세포는 원래 배양물에 존재하는 개수와 비교하였을 때, 증가된 개수를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 생체외에서 확장된 세포는 배양물 중에서 다른 세포 유형과 비교하였을 때, 증가된 개수를 갖는다. 본원에서 사용되는 바, "생체외"라는 용어는 살아있는 유기체 (예컨대, 인간)로부터 제거되고, 유기체 밖에서 (예컨대, 배양 접시, 시험관, 또는 생체반응기에서) 증식된 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "발현"이라는 용어는 특정 뉴클레오티드 서열의 프로모터에 의해 구동되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.
"발현 벡터"란, 발현시키고자 하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위해 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 관련 기술분야에 공지된 것들 모두, 예컨대 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입한, 코스미드, 플라스미드 (예컨대, 네이키드 플라스미드 또는 리포솜에 함유되어 있는 플라스미드) 및 바이러스 (예컨대, 센다이 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "유전자 조작된" 및 "유전자 변형된"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 생성된 비-자연적으로 발생된 핵산 분자를 포함하도록 변형된, 또는 (예컨대, 재조합 또는 유전자 편집 DNA 기술을 사용하여) 인공으로 변형되거나, (예컨대, 전사, 번역 등에 의해) 상기 분자로부터 유래된 세포를 지칭한다. 외인성, 재조합, 합성 및/또는 다르게는 변형된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포는 유전자 변형된 세포로 간주되고, 따라서, 임의의 자연적으로 발생된 대응물과 비교하여 비-자연적으로 발생된 것이다. 일부 경우에, 유전자 변형된 세포는 하나 이상의 재조합 핵산을 함유한다. 다른 경우에, 유전자 변형된 세포는 하나 이상의 합성 또는 유전자 조작된 핵산 (예컨대, 본 핵산의 자연적으로 발생된 대응물에거 발견된 서열과 비교하여 적어도 하나의 인공적으로 생성된 삽입, 결실, 역전, 또는 치환을 함유하는 핵산)을 함유한다.
본원에서 사용되는 바, "동일성"은 두 중합체 분자 사이, 특별히, 두 아미노산 분자 사이, 예컨대 두 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 두 아미노산 서열이 같은 위치에서 같은 잔기를 가질 때; 예컨대, 각각의 두 폴리펩티드 분자 중의 위치가 아르기닌에 의해 점유된다면, 이때 상기 위치에서 동일한 것이다. 동일성, 또는 정렬시 두 아미노산 서열이 같은 위치에서 같은 잔기를 갖는 정도는 대개 비율(%)로 표시된다. 두 아미노산 서열 사이의 동일성은 매칭되거나 또는 동일한 위치의 개수의 직접 함수이고; 예컨대, 두 서열 중 위치의 절반 (예컨대, 길이가 10개의 아미노산 길이인 중합체 중 5개의 위치)이 동일하다면, 두 서열은 50% 동일하고; 위치 중 90% (예컨대, 10개 중 9개)가 매칭되거나, 또는 동일하다면, 두 아미노산 서열은 90% 동일한 것이다.
본원에서 사용되는 바, "면역 반응"이라는 용어는 림프구가 항원성 분자를 외래의 것으로 확인하고, 항체 형성을 유도하고/거나, 림프구를 활성화시켜 항원을 제거할 때 발생하는 항원에 대한 세포 반응으로 정의된다.
본원에서 사용되는 바, "면역억제" 또는 "면역 억제성"은 전반적인 면역 반응을 감소시키는 것을 지칭한다.
보편적으로는 "indel"로 약칭되는, "삽입/결실"은 특정 뉴클레오티드 서열이 게놈 중에 존재 (삽입) 또는 부재 (결실)인 유전자 다형성의 한 유형이다.
"단리된"이란, 자연 상태로부터 변경 또는 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전하게 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 비-천연 환경, 예컨대 예를 들어, 숙주 세포에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "넉다운"이라는 용어는 하나 이상의 유전자의 유전자 발현 감소를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "넉아웃"이라는 용어는 하나 이상의 유전자의 유전자 발현 제거를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "렌티바이러스"는 레트로비리다에(Retroviridae) 과의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 레트로바이러스 중에서 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 독특한 것이고; 이는 상당량의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있으며, 이에 의해 이는 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법들 중 하나가 된다. HIV, SIV, 및 FIV 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 생체내에서 유의적인 수준의 유전자 전달을 달성하기 위한 수단을 제공한다.
본원에서 사용되는 바, "변형된"이라는 용어는 본 발명의 분자 또는 세포의 변형된 상태 또는 구조를 의미한다. 분자는 화학적으로, 구조적으로, 및 기능적으로인 것을 비롯한, 다수의 방식으로 변형될 수 있다. 세포는 핵산 도입을 통해 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 세포는 "유전자 변형된" 또는 "유전자 편집된" 것일 수 있고, 여기서 세포 중 하나 이상의 핵산은 변경된 것이다.
본원에서 사용되는 바, "조정하는"이라는 용어는 치료 또는 화합물 부재하의 대상체에서의 반응 수준과 비교하여, 및/또는 다른 것은 동일하지만, 비처리된 것인 대상체에서의 반응 수준과 비교하여 대상체에서 반응 수준의 검출가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 본 용어는 천연 신호 또는 반응을 변화시키고/거나, 그에 영향을 줌으로써 대상체, 바람직하게, 인간에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포함한다.
본 발명과 관련하여, 일반적으로 발생된 핵산 염기에 대해 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
달리 언급되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴성 버전이고, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있을 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
면역원성 조성물의 "비경구적" 투여는 예컨대, 피하 (s.c.), 정맥내 (i.v.), 근육내 (i.m.), 또는 흉골내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 뉴클레오티드로 이루어진 쇄로서 정의된다. 추가로, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 본원에서 사용되는 바와 같이 상호교환적이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 핵산은 폴리뉴클레오티드이고, 이는 단량체 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있다는 일반적인 지식을 갖고 있다. 단량체 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 폴리뉴클레오티드는 제한 없이, 재조합 수단, 즉, 일반 클로닝 기술 및 PCR 등을 사용하여, 및 합성 수단에 의해 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터 핵산 서열을 클로닝하는 것을 비롯한, 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "펩티드," "폴리펩티드," 및 "단백질"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하고, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 개수에 대해서는 제한을 두지 않는다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 본 용어는 또한 관련 기술분야에서 보편적으로는 예를 들어, 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로 지칭되기도 하는 짧은 쇄, 및 일반적으로, 관련 기술분야에서 단백질로서 지칭되고, 그 중 많은 유형이 존재하는 것인 더욱 긴 쇄, 둘 모두를 지칭한다. "폴리펩티드"는 예를 들어, 그 중에서도 특히, 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 그의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "만능성"이란, 3개의 모든 배엽층 (외배엽, 내배엽, 및 중배엽)의 세포를 비롯한, 신체 또는 체세포의 모든 계통의 형태 (즉, 배아 전구체)로 분화될 수 있는 세포의 능력을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "만능성 줄기 세포"라는 용어는 계속해서 자기-복제할 수 있고, 적절한 조건하에서 3개의 모든 배엽층의 세포로 분화될 수 있는 세포를 지칭한다. 만능성 줄기 세포 (PSC)의 예로는 배아 줄기 세포 (ESC) 및 유도 만능성 줄기 세포 (iPSC)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "배아 줄기 세포" 또는 "ESC"는 배반포의 내부 세포 매스로부터 유래된 만능성 세포 또는 만능성 세포 집단을 의미한다. 예컨대, 문헌 [Thomson et al., Science 282:1145-1147 (1998)]을 참조한다. 상기 세포는 Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81을 발현하고, 시험관내에서 세포질 대비 핵의 비가 높고, 뚜렷한 핵소체를 갖는 조밀한 콜로니로 보인다. 본원에서 사용되는 바, 본원에 기술된 바와 같이, "iPS 세포" 또는 "iPSC"라는 용어는 그의 분화된 체세포의 기점과 관련하여 달라질 수 있고, 효력 결정 인자의 특이적인 세트와 관련하여 달라질 수 있고, 그를 단리시키는 데 사용되는 배양 조건과 관련하여 달라질 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 그의 각각의 분화된 체세포의 기점과 실질적으로는 유전적으로 동일하고, 더 높은 효력을 갖는 세포, 예컨대 ESC와 유사한 특징을 보이는 만능성 세포 또는 만능성 세포 집단을 지칭한다. 예컨대, 문헌 [Yu et al., Science 318:1917-1920 (2007)]을 참조한다. IPSC는 그의 각각의 분화된 체세포의 기점과 실질적으로는 유전적으로 동일하고, 더 높은 효력을 갖는 세포, 예컨대 ES 세포와 유사한 특징을 보이고, 세포는 비-만능성 세포 (예컨대, 다능성 세포, 협능성 세포, 단능성 세포, 및 최종적으로 분화된 세포), 예컨대 체세포를 리프로그래밍함으로써 수득된다. ESC 및 iPSC는 다양한 상업적 공급업체로부터 이용가능하다.
"대상체"라는 용어는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체 (예컨대, 포유동물)를 포함하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 바, "대상체" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다. 비-인간 포유동물은 예를 들어, 가축 및 애완동물, 예컨대 양, 소, 돼지, 개, 고양이 및 뮤린 포유동물을 포함한다. 바람직하게, 대상체는 인간이다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"이란, 결합이 일어나도록 하는 데 충분한 조건하에서 결합 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 결합 대상이 되는 핵산의 일부를 정의하는 게놈 핵산 서열을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "치료(적)"이라는 용어는 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질환 상태의 억제, 완화, 또는 근절에 의해 수득된다.
"이식편"이란, 이식되는 생체적합성 격자 또는 공여자 조직, 기관 또는 세포를 지칭한다. 이식편의 예로는 피부 세포, 또는 조직, 골수, 및 고형 기관, 예컨대 심장, 췌장, 신장, 폐 및 간을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이식편은 또한 숙주에게 투여되는 임의의 물질도 지칭할 수 있다. 예를 들어, 이식편은 핵산 또는 단백질을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"이라는 용어는 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달 또는 도입되게 하는 프로세스를 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산이 형질감염된, 형질전환된 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 1차 대상체 세포 및 그의 자손을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 질환을 "치료하다"라는 용어는 대상체가 경험한 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
"벡터"란, 단리된 핵산을 포함하고, 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다수의 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, "벡터"라는 용어는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 핵산을 세포 내로 전달하는 것을 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예컨대 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예로는 센다이 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다
범위: 본 개시내용 전역에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면이 범위 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 포맷으로 기술된 것을 단지 편의상 및 간결하게 하기 위한 것이며, 본 발명의 범주에 대하여 유연성이 없는 제한으로 해석되지 않아야 함을 이해하여야 한다. 따라서, 범위로 기술된 것은 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라, 상기 범위 내의 개별 수치 값을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 예컨대 1 내지 6과 같이 범위로 기술된 것은 구체적으로 개시된 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등 뿐만 아니라, 상기 범위 내의 개별 수치, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과는 상관없이 적용된다.
B. 변형된 세포
본 발명은 스테로이드 (예컨대, 글루코코르티코이드)의 효과에 대하여 저항성인 변형된 세포 (예컨대, 변형된 만능성 줄기 세포, 변형된 면역 세포, 변형된 조절 T 세포, 변형된 만능성 줄기 세포로부터 유래된 면역 세포)를 제공한다. 본 발명은 칼시뉴린 억제제 (예컨대, CsA, FK506)의 효과에 대하여 저항성인 변형된 세포 (예컨대, 면역 세포, 조절 T 세포)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 스테로이드 (예컨대, 글루코코르티코이드) 및 칼시뉴린 억제제 (예컨대, CsA, FK506), 둘 모두의 효과에 대하여 저항성인 변형된 세포 (예컨대, 면역 세포, 조절 T 세포)를 제공한다. 다른 면역억제제 약물 (예컨대, mTOR 억제제, 미코페놀산, 메토트렉세이트, 플루다라빈, 펜토스타틴, 시클로포스파미드 등)의 효과에 대하여 저항성인 변형된 세포를 또한 제공한다. 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제의 효과에 감수성을 나타내는 변형된 이펙터 T 세포 (Teff)를 또한 제공한다.
스테로이드-저항성 세포
본원에 기술된 바와 같이, 스테로이드 (예컨대, 글루코코르티코이드)는 이식편대숙주질환 (GVHD)을 앓는 대상체를 치료할 때의 표준 치료 예방을 나타내며, 이는 이펙터 T 세포 (Teff) 기능을 감소시킬 뿐만 아니라, Treg 지속성 및 기능을 직접적으로 억제시킬 수 있다. 스테로이드는 세포의 생존에 직접적으로 영향을 줄 수 있고, 예를 들어, 스테로이드 덱사메타손의 존재하에서 Treg의 생존은 크게 감소된다.
본 개시내용은 스테로이드-저항성 세포 (예컨대, 유전자 편집된 스테로이드-저항성 만능성 줄기 세포, 스테로이드-저항성 조절 T 세포 (Treg), 스테로이드-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포)를 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "스테로이드-저항성" 세포란, 스테로이드 (예컨대, 글루코코르티코이드)의 효과에 대하여 저항성인 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 작용제에 대하여 "저항성 또는 내성"인 세포란, 변형되지 않은 세포의 증식을 억제 또는 방해하는 일정량의 작용제의 존재하에서 세포가 증식하도록 유전자 변형된 세포를 의미한다. 본 개시내용의 스테로이드-저항성 세포는 스테로이드와의 접촉시, 최소의 생리학적 변화를 보이거나, 또는 전혀 보이지 않는다. 사실상, 스테로이드-저항성 세포는 스테로이드와 상호작용 (예컨대, 결합)하지 않는다. 스테로이드-저항성 세포가 스테로이드의 효과에 대하여 저항성인지 여부를 평가하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 스테로이드 존재하에서 세포 생존은 세포 계수 기술을 이용하여, 또는 리포터-기반 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 통상의 기술자는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 스테로이드가 스테로이드-저항성 세포에 미치는 효과를 결정할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 스테로이드 저항성은 하나 이상의 내인적으로 발현된 유전자의 유전자 편집에 의해 달성된다. 따라서, 본 개시내용은 유전자 편집된 스테로이드-저항성 세포 (예컨대, 유전자 편집된 스테로이드-저항성 만능성 줄기 세포, 유전자 편집된 스테로이드-저항성 Treg, 변형된 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 내인적으로 발현된 유전자의 발현을 파괴시키도록 유전자 편집되고, 여기서 파괴는 하나 이상의 내인적으로 발현된 유전자의 발현을 감소, 결실, 제거, 넉아웃 또는 파괴시킴으로써 세포에 스테로이드 저항성을 부여한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 세포는 하나 이상의 핵 수용체를 코딩하는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 파괴시키도록 유전자 편집된 것이다. 핵 수용체는 스테로이드 및 갑상선 호르몬, 및 다른 분자를 감지하는 것을 담당하는, 세포 내에서 발견되는 단백질 부류이다. 이들 수용체는 특정 유전자의 발현을 조절하기 위해 다른 단백질과 함께 작용한다. 다양한 핵 수용체가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이는 하기 하위패밀리, 예를 들어: 하위패밀리 1, 갑상선 호르몬 수용체-유사; 하위패밀리 2, 레티노이드 X 수용체-유사; 하위패밀리 3, 에스트로겐 수용체-유사; 하위패밀리 4, 신경 성장 인자 IB-유사; 및 하위패밀리 5, 스테로이드생산성 인자-유사, 하위패밀리 6, 생식 세포 핵 인자-유사로 광범위하게 분류된다. 핵 수용체의 각각의 하위패밀리는 군들로 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어, 하위패밀리 3에 속하는 핵 수용체는 예를 들어: 클래스 A, 에스트로겐 수용체; 클래스 B, 에스트로겐 관련 수용체; 및 클래스 C, 3-케토스테로이드 수용체로 추가로 분류될 수 있다. 하위패밀리 3, 클래스 C에 속하는 핵 수용체의 수개의 구성원이 공지되어 있다. 예를 들어, NR3C1 유전자 (NCBI 참조 서열 NG_009062.1)는 글루코코르티코이드 수용체를 코딩하고, NR3C2 유전자 (NCBI 참조 서열 NG_013350.1)는 미네랄로코르티코이드 수용체를 코딩하고, NR3C3 유전자 (NCBI 참조 서열 NG_016475.1)는 프로게스테론 수용체를 코딩하고, NR3C4 유전자 (NCBI 참조 서열 NG_009014.2)는 안드로겐 수용체를 코딩한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 세포는 NR3C1의 발현을 파괴시키도록 유전자 편집된 것이다. NR3C1은 글루코코르티코이드 수용체 (GR, 또는 GCR)를 코딩한다. 글루코코르티코이드는, 전통적으로는, 글루코스 대사에서의 그의 역할, 및 부신 피질에서의 합성에 대해 공지되어 있는, 글루코코르티코이드 수용체에 결합하는 코르티코스테로이드 부류이다. 본원에서 사용되는 바, "글루코코르티코이드" 및 "글루코코르티코스테로이드"는 상호교환적으로 사용된다. 글루코코르티코이드는 제한 없이, 프로게스테론-타입 글루코코르티코이드, 히드로코르티손-타입 글루코코르티코이드, 메타손-타입 글루코코르티코이드, 및 아세토니드-타입 글루코코르티코이드를 포함한다. 글루코코르티코이드는 제한 없이, 베타메타손, 부데소니드, 코르티손, 데플라자코트, 데옥시코르티코스테론, 덱사메타손, 플루드로코르티손, 히드로코르티손 (코르티솔), 로테프레드놀, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 및 트리암시놀론, 및 그의 유도체 및 유사체를 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 세포 (예컨대, 유전자 편집된 스테로이드-저항성 만능성 줄기 세포, 스테로이드-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포)는 (NR3C1 유전자좌로 표적화되어 NR3C1의 발현을 파괴시키거나, 또는 그를 변화시키는 뉴클레오티드 결합 시약, 예컨대 CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas12a (Cpf1), Cas9 오르토로그, 파라로그, Cas 관련 패밀리 구성원, 아연 핑거, TALEN, 또는 메가뉴클레아제 후보를 통한 (예컨대, (조절 영역, 엑손(들), 및 인트론(들)을 포함하기 위해) indel 및/또는 치환(들)의 NR3C1 유전자좌 내로의 도입을 통한) 하나 이상의 DNA 또는 RNA 염기 변경, 삽입, 결실, 치환, 또는 전환에 의해 정의되는 바와 같이) 유전자 편집되고, 여기서 스테로이드-저항성 세포는 프로게스테론-타입 글루코코르티코이드, 히드로코르티손-타입 글루코코르티코이드, 메타손-타입 글루코코르티코이드, 및 아세토니드-타입 글루코코르티코이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 글루코코르티코이드에 대해 저항성이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 세포는 NR3C1의 발현을 파괴하도록 유전자 편집되고, 여기서 스테로이드-저항성 세포는 베타메타손, 부데소니드, 코르티손, 데플라자코트, 데옥시코르티코스테론, 덱사메타손, 플루드로코르티손, 히드로코르티손 (코르티솔), 로테프레드놀, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 및 트리암시놀론, 및 그의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 글루코코르티코이드에 대해 저항성이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 세포는 NR3C1의 발현을 파괴하도록 유전자 편집되고, 여기서 스테로이드-저항성 세포는 덱사메타손에 대해 저항성이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 세포 (예컨대, 유전자 편집된 스테로이드-저항성 만능성 줄기 세포, 스테로이드-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포)는 스테로이드 (예컨대, 덱사메타손)의 존재하에서 증가된 세포 생존을 나타낸다. 일부 실시양태에서, (예컨대, (조절 영역, 엑손(들), 및 인트론(들)을 포함하기 위해) indel 및/또는 치환(들)의 NR3C1 유전자좌 내로의 도입을 통해) NR3C1의 발현을 파괴시키도록 유전자 편집된 스테로이드-저항성 세포는 스테로이드의 존재하에서 증가된 세포 생존을 나타낸다. 특정 실시양태에서, NR3C1의 발현을 파괴시키도록 유전자 편집된 스테로이드-저항성 세포는 덱사메타손의 존재하에서 증가된 세포 생존을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 세포 생존 증가는 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 205%, 적어도 210%, 적어도 215%, 적어도 220%, 적어도 225%, 적어도 230%, 적어도 235%, 적어도 240%, 적어도 245%, 적어도 250%, 적어도 255%, 적어도 260%, 적어도 265%, 적어도 270%, 적어도 275%, 적어도 280%, 적어도 285%, 적어도 290%, 적어도 295%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 또는 그 초과이다.
칼시뉴린 억제제-저항성 세포
본원에 기술된 바와 같이, 칼시뉴린 억제제 (CNI)는 이식편대숙주질환 (GVHD)을 앓는 대상체를 치료할 때의 표준 치료 예방을 나타내며, 이는 이펙터 T 세포 (Teff) 기능을 감소시킬 뿐만 아니라, Treg 지속성 및 기능을 직접적으로 억제시킬 수 있다. 칼시뉴린 억제제는 세포의 생존에 직접적으로 영향을 줄 수 있고, 예를 들어, 스테로이드 덱사메타손의 존재하에서 Treg의 생존은 크게 감소된다.
본 개시내용은 CNI-저항성 세포 (예컨대, CNI-저항성 만능성 줄기 세포, CNI-저항성 조절 T 세포 (Treg), CNI-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포)를 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "칼시뉴린 억제제-저항성" 세포란, CNI (예컨대, 시클로스포린)의 효과에 대하여 저항성인 세포를 지칭한다. 본 개시내용의 CNI-저항성 세포는 CNI와의 접촉시, 최소의 생리학적 변화를 보이거나, 또는 전혀 보이지 않는다. 사실상, CNI-저항성 세포는 CNI와 상호작용 (예컨대, 결합)하지 않는다. CNI-저항성 세포가 CNI의 효과에 대하여 저항성인지 여부를 평가하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, CNI 존재하에서 세포 생존은 세포 계수 기술을 이용하여, 또는 리포터-기반 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 통상의 기술자는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 CNI가 CNI-저항성 세포에 미치는 효과를 결정할 수 있을 것이다.
칼시뉴린은 T 세포 활성화에 중요한, 이종이량체 칼슘 및 칼모듈린 의존성 세린-트레오닌 포스파타제이다. T 세포 수용체 결합 후, 칼시뉴린은 전사 인자 NFAT (활성화된 T 세포의 핵 인자)를 탈인산화시켜 핵으로 전위될 수 있도록 하고, 중요한 표적 유전자, 예컨대 IL-2 (인터류킨 2)를 활성화시킬 수 있도록 한다. FKBP12 (FK506 결합 단백질)와의 복합체에서 FK506 (타크로리무스; 후지마이신), 또는 CyPA (시클로필린 A)와의 복합체에서 CsA (시클로스포린 A)는 NFAT의 칼시뉴린의 활성 부위에의 접근을 차단하여 그의 탈인산화를 막고, 이에 의해 T 세포 활성화를 억제시킨다. 칼시뉴린은 2개의 서브유닛: 그의 포스파타제 활성을 담당하는 촉매성 서브유닛인 A (CnA), 및 특히 세포내 칼슘에 반응성이고, CnA 활성화를 조절하는 조절 서브유닛인 B (CnB)에 의해 형성된다.
칼시뉴린은, 제한 없이, 시클로스포린, 보클로스포린, 피메크로리무스, 및 타크로리무스, 및 그의 유도체 및 유사체를 포함하는 칼시뉴린 억제제로 불리는 약물 부류의 표적이다. 칼시뉴린 억제제 (CNI)는 이뮤노필린으로 불리는 세포내 단백질에 결합하고: 시클로스포린 A (CsA; 이는 또한 관련 기술분야에 시클로스포린으로도 공지)의 경우, 시클로필린에, 및 타크로리무스 (이는 또한 FK506으로도 공지)의 경우, FK-결합 단백질에 결합한다. 이어서, 상기 복합체는 칼시뉴린에 결합하여 그의 활성을 억제시키고, 이에 의해 T 세포 활성화를 억제시킨다. 시클로스포린은, 분자가 위장관에 의한 불활성화에 대하여 저항성이 되도록 만들고, 이에 의해 경구용 면역억제 약물로서 사용가능하게 만드는 N-메틸화된 아미노산을 갖는 시클릭 운데카펩티드이다. 보클로스포린은 칼시뉴린에 대한 작용이 증강되고, 대사 안정성이 더 큰, 시클로스포린의 유사체이다. 타크로리무스 (FK506; 후지마이신)는 마크롤라이드 항생제이다. 피메크로리무스 및 타크로리무스는 칼시뉴린 경로를 통한 T 세포 활성화 억제 및 다수의 염증성 시토카인의 방출 억제에 의해 작용하는, 마크로락탐 면역억제제 중 아스코마이신 부류에 속한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, CNI 저항성은 세포 내로 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자를 도입함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 CNI에 대해 저항성인 변형된 세포 (예컨대, CNI-저항성 만능성 줄기 세포, 변형된 CNI-저항성 Treg)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자를 발현하도록 변형된다. 세포가 CNI 저항성 유전자를 발현하도록 변형되는 경우, 세포는 내인성 칼시뉴린 유전자의 발현을 파괴시키도록 추가로 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자는 FK506 및/또는 CsA에 대해 저항성인 칼시뉴린 돌연변이체를 생성하기 위해 FK506-FKBP12 및 CsA-CyPA 중 어느 하나 또는 그 둘 모두의 도킹을 파괴시키도록 중요한 아미노산 잔기에서 변형된 칼시뉴린의 변이체를 포함한다. 본 발명의 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자는 칼시뉴린 억제제, 예컨대 FK506 및/또는 CsA에 대해 저항성인 칼시뉴린의 변이체를 코딩하는 핵산 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 칼시뉴린 변이체는 FK506에는 결합하지만, 칼시뉴린에는 결합하지 않고, 이에 의해 약물을 격리시키고, 칼시뉴린 억제를 막을 수 있다.
일부 실시양태에서, 칼시뉴린 변이체는 V314, Y341, M347, T351, W352, L354, 및 K360으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 야생형 칼시뉴린 이종이량체 A의 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 칼시뉴린 변이체는 예를 들어, 위치 T351 및 L354, 또는 V314 및 Y341에 야생형 칼시뉴린 이종이량체 A의 이중 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호 1의 341번 위치의 발린 잔기는 리신 또는 아르기닌 잔기로 대체될 수 있고, 341번 위치의 티로신 잔기는 페닐알라닌 잔기로 대체될 수 있고; 347번 위치의 메티오닌은 글루탐산, 아르기닌 또는 트립토판 잔기로 대체될 수 있고; 351번 위치의 트레오닌은 글루탐산 잔기로 대체될 수 있고; 352번 위치의 트립토판 잔기는 시스테인, 글루탐산 또는 알라닌 잔기로 대체될 수 있고, 353번 위치의 세린은 히스티딘 또는 아스파라긴 잔기로 대체될 수 있고, 354번 위치의 류신은 알라닌 잔기로 대체될 수 있고; 360번 위치의 리신은 알라닌 또는 페닐알라닌 잔기로 대체될 수 있다. 본원에 기술된 아미노산 위치 대응은 빈번하게는 서열식별번호 1 (진뱅크(GenBank): ACX34092.1)에 기재된 야생형 인간 칼시뉴린 이종이량체 A 폴리펩티드 형태의 아미노산의 위치로 표시된다. 일부 실시양태에서, 칼시뉴린 변이체는 V120, N123, L124, 또는 K125로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 야생형 칼시뉴린 이종이량체 B의 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 칼시뉴린 변이체는 예를 들어, 위치 L124 및 K125에 야생형 칼시뉴린 이종이량체 B의 이중 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호 2의 아미노산 서열에서 120번 위치의 발린은 세린, 아스파르트산, 페닐알라닌 또는 류신 잔기로 대체될 수 있고; 123번 위치의 아스파라긴은 트립토판, 리신, 페닐알라닌, 아르기닌, 히스티딘 또는 세린으로 대체될 수 있고; 124번 위치의 류신은 트레오닌 잔기로 대체될 수 있고; 125번 위치의 리신은 알라닌, 글루탐산, 트립토판으로 대체될 수 있거나, 또는 2개의 잔기, 예컨대 류신-아르기닌 또는 이소류신-글루탐산이 125번 위치의 리신 뒤에 부가될 수 있다. 본원에 기술된 아미노산 위치 대응은 빈번하게는 서열식별번호 2 (진뱅크: ACX34095.1)에 기재된 야생형 인간 칼시뉴린 이종이량체 B 폴리펩티드 형태의 아미노산의 위치로 표시된다. 칼시뉴린 변이체는 문헌 [Brewin et al., 2009, Blood, 114(23): 4792-4803] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 CNI-저항성 세포 (예컨대, CNI-저항성 만능성 줄기 세포, CNI-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포)는 칼시뉴린의 변이체를 발현하도록 변형된 것이다. 특정 실시양태에서, 칼시뉴린 변이체는 CNa12 (서열식별번호 3; 진뱅크: GQ463594.1), CNa22 (서열식별번호 4; 진뱅크: GQ463595.1), 및 CNb30 (서열식별번호 5; 진뱅크: GQ463597.1)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
칼시뉴린, 및 따라서, 칼시뉴린 억제제의 표적은 CD28 하류에서 활성화되고, Treg 발생을 위해 요구되는 전사 인자 NFAT이다. 일부 실시양태에서, CNI 저항성은 하나 이상의 내인적으로 발현된 NFAT 유전자의 유전자 편집에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 유전자 편집된 CNI-저항성 세포 (예컨대, 유전자 편집된 스테로이드-저항성 Treg)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 NFAT 유전자의 발현을 파괴시키도록 유전자 편집되고, 여기서 파괴는 하나 이상의 내인적으로 발현된 유전자의 발현을 감소, 결실, 제거, 넉아웃 또는 파괴시킴으로써 세포에 CNI 저항성을 부여한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CNI-저항성 세포 (예컨대, CNI-저항성 만능성 줄기 세포, CNI-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포)는 하나 이상의 NFAT 유전자의 발현을 파괴시키도록 유전자 편집된 것이다. NFAT 전사 인자 패밀리는 5개의 구성원: NFATc1, NFATc2, NFATc3, NFATc4, 및 NFAT5를 포함한다. NFAT들 c1-c4는 칼슘 신호전달에 의해 조절되고, NFAT 패밀리의 고전적 구성원으로서 공지되어 있다. 활성화된 칼시뉴린은 NFAT 단백질의 아미노 말단 중의 세린이 풍부한 영역 및 SP-반복부를 신속하게 탈인산화시키고, 이에 의해 입체구조는 변하고, 핵 국재화 신호를 노출하여 NFAT 핵 유입을 일으킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CNI-저항성 세포는 NFATc1, NFATc2, NFATc3, NFATc4, 및 NFAT5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 내인적으로 발현된 유전자를 파괴시키도록 유전자 편집된 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 CNI-저항성 세포는 NFATc1, NFATc2, 및 NFATc4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 내인적으로 발현된 유전자를 파괴시키도록 유전자 편집된 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CNI-저항성 세포 (예컨대, CNI-저항성 만능성 줄기 세포, CNI-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포)는 모든 NFAT 이소형의 활성을 차단하는 NFAT 억제제를 발현하도록 변형된 것이다. 일부 실시양태에서, CNI-저항성 세포는 VIVIT 펩티드 (서열식별번호 6)을 포함하는 NFAT 억제제를 발현하도록 변형된 것이다. NFAT 활성을 억제시킬 수 있는 작용제를 함유하는 다양한 VIVIT 펩티드가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 작용제를 함유하는 VIVIT 펩티드는 (월드 와이드 웹상의 tocris.com/products/nfat-inhibitor_3930에서 이용가능한) 서열식별번호 67에 기재된 서열을 포함하는 칼시뉴린-매개 NFAT 활성화의 억제제이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CNI-저항성 세포 (예컨대, CNI-저항성 만능성 줄기 세포, CNI-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포)는 CNI (예컨대, CsA)의 존재하에서 증가된 세포 생존을 나타낸다. 일부 실시양태에서, CNI-저항성 세포는 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자를 발현하도록 변형된 것이고, CNI-저항성 세포는 CNI의 존재하에서 증가된 세포 생존을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CNI-저항성 세포는 시클로스포린, 보클로스포린, 피메크로리무스, 및 타크로리무스, 및 그의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 CNI의 존재하에서 증가된 세포 생존을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자를 발현하도록 변형된 CNI-저항성 세포는 CsA 및/또는 타크로리무스 (FK506), 및 그의 유도체 및 유사체의 존재하에서 증가된 세포 생존을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 세포 생존 증가는 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 205%, 적어도 210%, 적어도 215%, 적어도 220%, 적어도 225%, 적어도 230%, 적어도 235%, 적어도 240%, 적어도 245%, 적어도 250%, 적어도 255%, 적어도 260%, 적어도 265%, 적어도 270%, 적어도 275%, 적어도 280%, 적어도 285%, 적어도 290%, 적어도 295%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 또는 그 초과이다.
글루코코르티코이드 및 칼시뉴린 억제제-저항성 세포
본원에 기술된 바와 같이, 글루코코르티코이드 저항성은 내인적으로 발현된 NR3C1 유전자를 파괴시킴으로써 달성될 수 있다. 칼시뉴린 억제제 저항성은 세포 내로 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자 (예컨대, 칼시뉴린의 변이체)를 도입함으로써 달성될 수 있다.
본 개시내용은 글루코코르티코이드 및 칼시뉴린 억제제-저항성 세포 (예컨대, 글루코코르티코이드 및 칼시뉴린 억제제-저항성 만능성 줄기 세포, 글루코코르티코이드 및 칼시뉴린 억제제-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포)를 제공한다. 상기 세포는 (예컨대, (조절 영역, 엑손(들), 및 인트론(들)을 포함하기 위해) indel 및/또는 치환(들)의 NR3C1 유전자좌 내로의 도입을 통해) NR3C1의 발현을 파괴시키도록 변형되고, 그 뿐만 아니라, CNI 저항성 유전자를 발현하도록 변형된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 글루코코르티코이드 및 CNI-저항성 세포는 NR3C1 발현을 파괴시키도록 변형되고, CNI 저항성 유전자 (예컨대, 칼시뉴린 변이체)를 발현하도록 추가로 변형된 세포이다. 일부 실시양태에서, CNI 저항성 유전자는 표적화된 통합 또는 랜덤 통합을 통해서 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 표적화된 통합 및 랜덤 통합을 위한 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 기술되어 있다. 특정 실시양태에서, CNI 저항성 유전자는 NR3C1 유전자좌 내 표적화된 부위 내로 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 실시양태에서, CNI 저항성 유전자는 NR3C1 유전자좌 밖에서 세포의 게놈 내로 통합된다. CNI 저항성 유전자가 NR3C1 유전자좌 밖에서 세포의 게놈 내로 통합되는 경우, CNI 저항성 유전자를 게놈의 코딩 영역 내로 통합시키지 않는 도입 방법을 선택하는 것이 바람직할 수 있다 (예컨대, CNI 저항성 유전자는 게놈의 비-코딩 영역 내로 통합되는 것이 바람직할 수 있다).
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 글루코코르티코이드 및 CNI-저항성 세포 (예컨대, 글루코코르티코이드 및 칼시뉴린 억제제-저항성 만능성 줄기 세포, 글루코코르티코이드 및 칼시뉴린 억제제-저항성 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포)는 (예컨대, (조절 영역, 엑손(들), 및 인트론(들)을 포함하기 위해) indel 및/또는 치환(들)의 NR3C1 유전자좌 내로의 도입을 통해) NR3C1의 발현을 파괴시키도록 변형되고, NR3C1 유전자좌 내에서 CNI 저항성 유전자 (예컨대, 칼시뉴린 변이체)를 발현하도록 추가로 변형된 것이다. 상기 세포는 글루코코르티코이드 (예컨대, 덱사메타손) 및 칼시뉴린 억제제 (예컨대, CsA 및/또는 FK506)에 대하여 저항성이 된다. 일부 실시양태에서, NR3C1의 발현을 파괴시키고, CNI 저항성 유전자 (예컨대, 칼시뉴린 변이체)를 발현하도록 변형된 글루코코르티코이드 및 CNI-저항성 세포는 글루코코르티코이드 및 칼시뉴린 억제제, 및 그의 유도체 및 유사체의 존재하에서 증가된 세포 생존을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 글루코코르티코이드 (예컨대, 덱사메타손) 또는 그의 유도체 및 유사체의 존재하에서 세포 생존 증가는 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 205%, 적어도 210%, 적어도 215%, 적어도 220%, 적어도 225%, 적어도 230%, 적어도 235%, 적어도 240%, 적어도 245%, 적어도 250%, 적어도 255%, 적어도 260%, 적어도 265%, 적어도 270%, 적어도 275%, 적어도 280%, 적어도 285%, 적어도 290%, 적어도 295%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 또는 그 초과이다. 일부 실시양태에서, CNI (예컨대, FK506, CsA) 또는 그의 유도체 및 유사체의 존재하에서 세포 생존 증가는 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 115%, 적어도 120%, 적어도 125%, 적어도 130%, 적어도 135%, 적어도 140%, 적어도 145%, 적어도 150%, 적어도 155%, 적어도 160%, 적어도 165%, 적어도 170%, 적어도 175%, 적어도 180%, 적어도 185%, 적어도 190%, 적어도 195%, 적어도 200%, 적어도 205%, 적어도 210%, 적어도 215%, 적어도 220%, 적어도 225%, 적어도 230%, 적어도 235%, 적어도 240%, 적어도 245%, 적어도 250%, 적어도 255%, 적어도 260%, 적어도 265%, 적어도 270%, 적어도 275%, 적어도 280%, 적어도 285%, 적어도 290%, 적어도 295%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 또는 그 초과이다.
다른 면역억제제 약물 저항성 세포
병에 걸린 대상체에서 GVHD를 치료 및 관리하는 동안 다른 면역억제제 약물이 사용될 수 있다. 글루코코르티코이드 및 CNI와 같이, 상기 면역억제제 약물 또한 Treg 지속성 및 기능을 감소시킬 수 있다.
예를 들어, 시롤리무스 (라파마이신), 에버롤리무스, 및 그의 유사체 및 유도체 (이는 또한 라팔로그로도 공지)는 라파마이신 패밀리에 속하고, 예컨대 고형 기관 이식 및 조혈 줄기 세포 이식을 위한 면역억제 요법에서 사용될 수 있다. 이들 라파마이신 패밀리 면역억제제는 세포내 수용체 FKBP12와의 회합에 의해 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)을 억제시킨다. FKBP12-라파마이신 복합체는 mTOR의 FKBP12-라파마이신 결합 (FRB) 도메인에 직접 결합하여 그의 활성을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 면역억제제 약물 저항성 세포는 mTOR 억제에 대하여 저항성이다 (예컨대, mTOR 억제제-저항성 Treg). 본 개시내용의 mTOR 억제제-저항성 세포는 제한 없이, FKBP12-라파마이신 복합체의 형성을 방해하도록 변형된 세포 (예컨대, FKBP12에서 특이적인 돌연변이), 및 FKBP12-라파마이신 복합체의 FRB 도메인에의 결합을 방해하도록 변형된 세포 (예컨대, FRB 도메인에서 특이적인 돌연변이)를 포함할 수 있다. mTOR 경로는 잘 연구된 생물학적 경로이기 때문에, mTOR 억제에 대한 저항성을 달성하는 다양한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
면역억제제 약물의 또 다른 예로 미코페놀산 (미코페놀레이트)이 있다. 미코페놀산은, 이노신-5'-모노포스페이트 (IMP)로부터 구아노신-5'-모노포스페이트 (GMP)의 신생 합성에 필수적인 효소인 이노신-5'-모노포스페이트 데히드로게나제 (IMPDH)의 강력한 효능을 지니고, 가역성이며, 비-경쟁적인 억제제이다. 또 다른 면역억제제 약물로는 메토트렉세이트 (이전에 아메톱테린으로 공지)가 있다. 메토트렉세이트는 항엽산제 유형의 대사길항제이고, 테트라히드로폴레이트 합성에 참여하는 효소인 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 억제시킨다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 면역억제제 약물 저항성 세포는 미코페놀산 및/또는 메토트렉세이트, 및 그의 유사체 및 유도체에 대해 저항성이다 (예컨대, 미코페놀산 및/또는 메토트렉세이트르-저항성 Treg). 본 개시내용의 미코페놀산 및/또는 메토트렉세이트르-저항성 세포는 예를 들어, 치환 L22F 및 F31S을 함유하는 인간 DHFR의 변이체를 발현하도록 및/또는 치환 T333I 및 S351Y를 함유하는 이노신 모노포스페이트 데히드로게나제 II (IMPDH2)의 변이체를 발현하도록 변형된 세포를 포함할 수 있다.
면역억제제 약물의 다른 예로는 제한 없이, 플루다라빈, 펜토스타틴 (데옥시코포르마이신), 및 시클로포스파미드 (시토포스판)를 포함한다. 플루다라빈은 퓨린 유사체이고, 리보뉴클레오티드 리덕타제 및 DNA 폴리머라제를 간섭함으로써 DNA 합성을 억제시킨다. 펜토스타틴은 퓨린 유사체이고, 뉴클레오시드 아데노신을 모방하고, DNA를 프로세싱할 수 있는 세포의 능력을 간섭하면서, 아데노신 데아미나제를 억제시킨다. 시클로포스파미드는 (예컨대, 시토크롬 P450 시스템의) 기능이 혼합된 옥시다제 효소에 의해, 제한 없이, 4-히드록시시클로포스파미드, 및 포스포라미드 머스타드를 비롯한 활성 대사산물로 전환된다. 포스포라미드 머스타드는 구아닌 N-7 위치에서 DNA 가닥 사이 및 그 내부, 그 둘 모두에서, DNA 가교결합을 형성한다 (이는 각각 가닥간 가교결합 및 가닥내 가교결합으로 공지). 이들 약물에 대한 저항성 기전은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 개시내용의 면역억제제 약물 저항성 세포, 예컨대 플루다라빈, 펜토스타틴, 및/또는 시클로포스파미드에 대해 저항성인 변형된 세포 (예컨대, 변형된 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포)를 생산하는 데 사용될 수 있다.
C. 변형된 세포를 제조하는 방법
본 발명의 세포는 본원에 기술된 내인성 유전자 중 임의의 것의 발현을 파괴시키도록 유전자 편집된 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 변형된 세포 (예컨대, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자를 포함하는 변형된 세포)는 본원에 기술된 내인성 유전자 중 하나 이상의 것의 발현을 파괴시키도록 유전자 편집된 것이다.
다양한 유전자 편집 기술이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 유전자 편집 기술로는 제한 없이, 호밍 엔도뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 (TALE) 뉴클레아제 (TALEN), 군집성의 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)-CRISPR-연관 단백질 9 (Cas9) 게놈 편집 시스템, 및 CRISPR-Cpf1 게놈 편집 시스템을 포함한다. 호밍 엔도뉴클레아제는 일반적으로 이량체인 그의 DNA 기질을 절단하고, 뚜렷한 결합 및 절단 도메인은 갖지 않는다. ZFN은, FokI 절단 도메인에 의해 인식되는 5- 내지 7-염기쌍 (bp) 스페이서 서열에 플랭킹되는 2개의 아연 핑거 결합 부위로 이루어진 표적 부위를 인식한다. TALEN은, FokI 절단 도메인에 의해 인식되는 12- 내지 20-bp 스페이서 서열에 플랭킹되는 2개의 TALE DNA-결합 부위로 이루어진 표적 부위를 인식한다. Cas9 뉴클레아제는 DNA 나선 가닥 중 어느 한 가닥에 존재할 수 있는 화합성 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 상류 방향으로 바로 옆에 위치하는 단일 가이드 RNA (gRNA) 내의 표적화 서열에 상보적인 DNA 서열로 표적화된다. 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 적절한 유전자 편집 기술을 선택할 수 있을 것이다.
일부 측면에서, 파괴는 RNA-가이드된 뉴클레아제를 이용하는 유전자 편집, 예컨대 파괴되는 유전자 (예컨대, NR3C1)에 특이적인 CRISPR-Cas9 시스템 또는 CRISPR-Cpf1 시스템과 같은 CRISPR-Cas 시스템에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, Cas9, 및 유전자의 유전자좌의 영역을 표적화하는 표적화 도메인을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 작용제가 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 작용제는 Cas9 폴리펩티드 및 gRNA로 이루어진 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체 (Cas9/gRNA RNP)이거나, 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 도입은 시험관내에서 작용제 또는 그의 일부를 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 접촉은 세포 및 작용제를 최대 24, 36 또는 48시간 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8일 동안 배양 또는 인큐베이션시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 도입은 추가로 작용제를 세포 내로 전달하는 것을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 방법, 조성물, 및 세포는 예를 들어, 전기천공에 의해 Cas9 및 gRNA로 이루어진 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체를 세포로 직접 전달하는 것을 이용한다. 일부 실시양태에서, RNP 복합체는 3' 폴리- A 테일 및 5' 안티-리버스 캡 아날로그(ARCA: Anti-Reverse Cap Analog) 캡을 포함하도록 변형된 gRNA를 포함한다.
CRISPR/Cas9 시스템은 표적화된 유전자 변경을 유도하는 용이하고, 효율적인 시스템이다. Cas9 단백질에 의한 표적 인식을 위해서는 가이드 RNA (gRNA) 내의 '시드' 서열 및 gRNA-결합 영역 상류의 보존되는 디-뉴클레오티드 함유 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열이 요구된다. 이에 의해, CRISPR/Cas9 시스템은 gRNA 세포를 재디자인함으로써 실제로 임의의 DNA 서열을 절단하도록 조작된다. CRISPR/Cas9 시스템은 2개 이상의 gRNA와 함께 단일 Cas9 단백질을 공동 발현하여 다중 게놈 유전자좌를 동시에 표적화할 수 있고, 이에 의해 상기 시스템은 표적 유전자의 다중 유전자 편집 또는 시너지적인 활성화에 맞게 적합화될 수 있다.
Cas9 단백질 및 가이드 RNA는 표적 서열을 식별하고, 절단하는 복합체를 형성한다. Cas9는 6개 도메인: REC I, REC II, 브릿지 헬릭스(Bridge Helix), PAM 상호작용, HNH, 및 RuvC로 구성된다. REC I 도메인은 가이드 RNA에 결합하는 반면, 브릿지 헬릭스는 표적 DNA에 결합한다. HNH 및 RuvC 도메인은 뉴클레아제 도메인이다. 가이드 RNA는 표적 DNA 서열에 상보적인 5' 단부를 갖도록 조작된다. 가이드 RNA의 Cas9 단백질에의 결합시, 입체구조는 변화하여, 단백질을 활성화시킨다. 일단 활성화되고 나면, Cas9는 그의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열에 매칭되는 서열에 결합하여 표적 DNA를 찾는다. PAM은 가이드 RNA에 상보적인 영역 하류로 1개 뉴클레오티드 내의 2 또는 3개의 뉴클레오티드 염기 서열이다. 한 비-제한적인 예에서, PAM 서열은 5'-NGG-3'이다. Cas9 단백질이 적절한 PAM을 갖는 그의 표적 서열을 찾고 나면, PAM 상류의 염기를 용융시키고, 그를 가이드 RNA 상의 상보적인 영역과 쌍을 형성하게 한다. 이어서, RuvC 및 HNH 뉴클레아제 도메인은 PAM 상류 방향으로 세번째 뉴클레오티드 염기 다음의 표적 DNA를 절단한다.
유전자 발현을 억제시키는 데 사용되는 CRISPR/Cas 시스템의 한 비-제한적인 예인 CRISPR 간섭 (CRISPRi)은 미국 특허 출원 공개 번호 US20140068797에 기술되어 있다. CRISPRi는 엔도뉴클레아제 활성이 없는, 촉매적으로 효력이 없는 Cas9를 이용한다. 가이드 RNA와 함께 공동 발현되었을 때, 전사 신장, RNA 폴리머라제 결합, 또는 전사 인자 결합을 특이적으로 간섭하는 DNA 인식 복합체가 생성된다. 이러한 CRISPRi 시스템은 표적화된 유전자의 발현을 효율적으로 억제시킨다.
표적 유전자에 특이적인 가이드 핵산 서열 및 Cas 엔도뉴클레아제가 세포 내로 도입되고, Cas 엔도뉴클레아제가 표적 유전자에 이중 가닥 파단을 도입할 수 있도록 하는 복합체를 형성하였을 때, CRISPR/Cas 유전자 파괴가 일어난다. 특정 실시양태에서, CRISPR/Cas 시스템은 발현 벡터, 예컨대 제한하는 것은 아니지만, pAd5F35-CRISPR 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, Cas 발현 벡터는 Cas9 엔도뉴클레아제의 발현을 유도한다. Cas12a (Cpf1), T7, Cas3, Cas8a, Cas8b, Cas10d, Cse1, Csy1, Csn2, Cas4, Cas10, Csm2, Cmr5, Fok1, 관련 기술분야에 공지된 다른 뉴클레아제, 및 그의 임의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다른 엔도뉴클레아제가 또한 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, CRISPR/Cas 시스템은 활성이 변경된 Cas9의 변이체를 포함할 수 있다. 예시적인 변이체 Cas9 뉴클레아제로는 Cas9 니카제 (nCas9), 촉매 효력이 없는 Cas9 (dCas9), 초정확 Cas9 (HypaCas9) (Chen et al. Nature, 550(7676), 407-410 (2017)), 고충실 Cas9 (Cas9-HF) (Kleinstiver et al. Nature 529(7587), 490-495 (2016)), 특이성이 증강된 Cas9 (eCas9) (Slaymaker et al. Science 351(6268), 84-88 (2016)), 및 확장형 PAM Cas9 (xCas9) (Hu et al. Nature doi: 10.1038/nature26155 (2018))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, Cas 발현 벡터를 유도하는 것은 세포를, Cas 발현 벡터 중 유도성 프로모터를 활성화시키는 작용제에 노출시키는 것을 포함한다. 상기 실시양태에서, Cas 발현 벡터는 유도성 프로모터, 예컨대 항생제 (예컨대, 테트라시클린 또는 테트라시클린의 유도체, 예를 들어, 독시시클린)에의 노출에 의해 유도성이 되는 프로모터를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 공지된 다른 유도성 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 유도화제는 유도성 프로모터를 유도시키는 선택적 조건 (예컨대, 작용제, 예를 들어, 항생제에의 노출)일 수 있다. 이는 Cas 발현 벡터를 발현시킨다.
본원에서 사용되는 바, "가이드 RNA" 또는 "gRNA"라는 용어는 세포에서 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예컨대 Cas9와 표적 서열 (예컨대, 게놈 또는 에피좀 서열)의 특이적인 회합 (또는 "표적화")을 촉진시키는 임의의 핵산을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 gRNA 서열이 티미딘 또는 "T" 뉴클레오티드 대신으로 우라실 또는 "U" 뉴클레오티드가 언급될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바, "모듈식" 또는 "이중 RNA" 가이드는 1개 초과, 및 전형적으로, 2개의 별개의 RNA 분자, 예컨대 일반적으로는 예를 들어, 듀플렉스 형성에 의해 서로 회합하는 것인 CRISPR RNA (crRNA) 및 전사 활성화 crRNA (tracrRNA)를 포함한다. gRNA 및 그의 성분 부분은 문헌 (예컨대, 문헌 [Briner et al. Mol. Cell, 56(2), 333-339 (2014)] (이는 본원에서 참조로 포함된다) 참조)에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "단분자 gRNA," "키메라 gRNA," 또는 "단일 가이드 RNA (sgRNA)"는 단일 RNA 분자를 포함한다. sgRNA는 함께 연결된 crRNA 및 tracrRNA일 수 있다. 예를 들어, crRNA의 3' 단부는 tracrRNA의 5' 단부에 연결될 수 있다. crRNA 및 tracrRNA는 예를 들어, crRNA (그의 3' 단부에서) 및 tracrRNA (그의 5' 단부에서)의 상보적인 영역을 연결하는 4 뉴클레오티드 (예컨대, GAAA) "테트라루프" 또는 "링커" 서열에 의해 단일 단분자 또는 키메라 gRNA로 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "반복" 서열 또는 영역은 tracrRNA의 역-반복(anti-repeat) 서열에 상보적인, crRNA의 3' 단부에 또는 그에 인접하게 위치하는 뉴클레오티드 서열이다.
본원에서 사용되는 바, "역-반복" 서열 또는 영역은 crRNA의 반복 서열에 상보적인, tracrRNA의 5' 단부에 또는 그에 인접하게 위치하는 뉴클레오티드 서열이다.
게놈 편집을 위한 gRNA/Cas9 복합체를 비롯한, 가이드 RNA 구조 및 기능에 관한 추가의 상세한 설명은 적어도 문헌 [Mali et al. Science, 339(6121), 823-826 (2013)]; [Jiang et al. Nat. Biotechnol. 31(3). 233-239 (2013)]; 및 [Jinek et al. Science, 337(6096), 816-821 (2012)] (상기 문헌들은 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "가이드 서열" 또는 "표적화 서열"은, 편집이 요구되는 세포의 게놈 중 DNA 서열 내의 표적 도메인 또는 표적 폴리뉴클레오티드에 완전히 또는 부분적으로 상보적인, 단분자이든 또는 모듈식이든, 그에 상관없이, gRNA의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 가이드 서열의 길이는 전형적으로, 10-30개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게, 16-24개의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 뉴클레오티드 길이)이고, Cas9 gRNA의 5' 말단에 또는 그에 인접하게 위치한다.
본원에서 사용되는 바, "표적 도메인" 또는 "표적 폴리뉴클레오티드 서열" 또는 "표적 서열"은 gRNA의 가이드 서열에 상보적인, 세포 게놈 중의 DNA 서열이다.
CRISPR 복합체 형성과 관련하여, "표적 서열"이란, 가이드 서열이 그에 대해 어느 정도의 상보성을 갖도록 디자인되는 상보성 대상의 서열이며, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 사이의 하이브리드화가 CRISPR 복합체 형성을 촉진시키는 것인 서열을 지칭한다. 완전한 상보성이 요구되지는 않지만, 단, 하이브리드화를 일으키고, CRISPR 복합체 형성을 촉진시킬 수 있을 정도로 충분한 상보성은 요구된다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치한다. 다른 실시양태에서, 표적 서열은 진핵 세포의 세포기관, 예를 들어, 미토콘드리아 또는 핵 내에 위치할 수 있다. 전형적으로, CRISPR 시스템과 관련하여, (표적 서열에 하이브리드화되고, 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체를 형성하는 가이드 서열을 포함하는) CRISPR 복합체 형성은 표적 서열에서 또는 그에 인접한 위치에서 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 초과의 염기쌍 이내에서) 한 가닥 또는 두 가닥 모두를 절단한다. 표적 서열에서와 같이, 완전한 상보성이 요구되지는 않지만, 단, 기능성일 정도로 충분한 상보성을 가져야 한다.
특정 실시양태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 구동시키는 하나 이상의 벡터가 숙주 세포 (예컨대, 만능성 줄기 세포) 내로 도입되고, 이에 의해 CRISPR 시스템의 요소의 발현은 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시한다. 예를 들어, Cas 뉴클레아제, crRNA, 및 tracrRNA는 각각 별개의 벡터 상의 별개의 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 하나의 기능이 나머지 다른 하나에 의해 영향을 받을 수 있도록 이루어진, 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있을 때 (즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 제어하에 있을 때), 프로모터는 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다.
대안적으로, 동일하거나, 또는 상이한 조절 요소로부터 발현된 2개 이상의 요소는, 제1 벡터에 포함되지 않는 CRISPR 시스템의 임의의 성분을 제공하는 하나 이상의 추가 벡터와 함께 단일 벡터로 조합될 수 있다. 단일 벡터로 조합되는 CRISPR 시스템 요소는 예컨대, 한 요소가 제2 요소 기준으로 5'에 (그의 "상류에") 또는 제2 요소 기준으로 3'에 (그의 "하류에") 위치하는 것과 같이, 임의의 적합한 배향으로 배열될 수 있다. 한 요소의 코딩 서열은 제2 요소의 코딩 서열과 동일 가닥 또는 맞은편 가닥에 위치할 수 있고, 동일 또는 반대 방향으로 배향될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일 프로모터는 CRISPR 효소, 및 가이드 서열, tracr 메이트 서열 (임의적으로, 가이드 서열에 작동가능하게 연결), 및 하나 이상의 인트론 서열 내에 포함된 tracr 서열 (예컨대, 각각이 상이한 인트론 내에, 적어도 하나의 인트론 내에 2개 이상, 또는 모두가 단일 인트론 내에 포함된 것) 중 하나 이상의 것을 코딩하는 전사체의 발현을 구동시킨다.
특정 실시양태에서, CRISPR 효소는 하나 이상의 이종성 단백질 도메인 (예컨대, CRISPR 효소 이외의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 도메인, 또는 그보다 많은 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가 단백질 서열, 및 임의적으로, 임의의 두 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예로는 제한 없이, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 하기 활성: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성 중 하나 이상의 것을 갖는 단백질 도메인을 포함한다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 추가 도메인은 미국 특허 출원 공개 번호 US20110059502 (본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 특정 실시양태에서, 태그부착된 CRISPR 효소는 표적 서열의 위치를 확인하는 데 사용된다.
포유동물 및 비-포유동물 세포 (예컨대, 인간 만능성 줄기 세포) 또는 표적 조직에서 핵산을 도입하는 데 종래의 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법이 사용될 수 있다. 상기 방법은 배양물에서, 또는 숙주 유기체에서 CRISPR 시스템의 성분을 코딩하는 핵산을 세포에 투여하는 데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, RNA (예컨대, 본원에 기술된 벡터의 전사체), 네이키드 핵산, 및 전달 비히클, 예컨대 리포솜과 복합체를 형성한 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은, 세포로의 전달 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는, DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다 ([Anderson, 1992, Science 256:808-813]; 및 [Yu, et al., 1994, Gene Therapy 1:13-26]).
일부 실시양태에서, CRISPR/Cas는 타입 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된 것이다. 다른 실시양태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas9 뉴클레아제로부터 유래된 것이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 예시적인 Cas9 뉴클레아제는 S. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 (SpCas9), S. 아우레우스(S. aureus) Cas9 (SaCas9), S. 써모필루스(S. thermophilus) Cas9 (StCas9), N. 메닌기티디스(N. meningitidis) Cas9 (NmCas9), C. 제주니(C. jejuni) Cas9 (CjCas9), 및 지오바실러스(Geobacillus) Cas9 (GeoCas9)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, Cas 단백질은 적어도 하나의 RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인을 포함한다. RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인은 가이딩 RNA와 상호작용한다. Cas 단백질은 또한 뉴클레아제 도메인 (즉, DNase 또는 RNase 도메인), DNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, RNAse 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인 뿐만 아니라, 다른 도메인을 포함할 수 있다. Cas 단백질은 핵산 결합 친화성 및/또는 특이성을 증가시키도록, 효소 활성을 변경시키도록 및/또는 단백질의 또 다른 특성을 변화시키도록 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질의 Cas-유사 단백질은 야생형 Cas9 단백질 또는 그의 단편으로부터 유래된 것일 수 있다. 다른 실시양태에서, Cas는 변형된 Cas9 단백질로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, Cas9 단백질의 아미노산 서열은 단백질의 하나 이상의 특성 (예컨대, 뉴클레아제 활성, 친화성, 안정성 등)을 변경시키도록 변형될 수 있다. 대안적으로, RNA-가이드된 절단에 관여하지 않는 Cas9 단백질의 도메인은 단백질로부터 제거될 수 있고, 이에 의해 변형된 Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질보다 더 작다. 일반적으로, Cas9 단백질은 적어도 2개의 뉴클레아제 (즉, DNase) 도메인을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질은 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. RuvC 및 HNH 도메인은 함께 작용하여 단일 가닥을 절단하고, 이에 의해 DNA 중 이중 가닥 파단이 형성된다 (Jinek, et al., 2012, Science, 337:816-821). 특정 실시양태에서, Cas9-유래 단백질은 단 하나의 기능성 뉴클레아제 도메인 (RuvC-유사 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인)을 함유하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas9-유래 단백질은 뉴클레아제 도메인 중 하나가 결실되도록 변형될 수 있거나, 또는 더 이상 작용하지 못하도록 (즉, 뉴클레아제 활성이 존재하지 않도록) 돌연변이화될 수 있다. 뉴클레아제 도메인 중 하나가 불활성인 일부 실시양태에서, Cas9-유래 단백질은 이중 가닥 핵산 내로 닉을 도입할 수 있지만 (이로써, 단백질은 "니카제"로 명명된다), 이중 가닥 DNA를 절단하지는 못한다. 상기 기술된 실시양태 중 임의의 것에서, 뉴클레아제 도메인 중 임의의 것 또는 그들 모두는 널리 공지된 방법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발법, PCR-매개 돌연변이유발법, 및 전체 유전자 합성 뿐만 아니라, 관련 기술분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 하나 이상의 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 및/또는 치환 돌연변이에 의해 불활성화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "염기 에디터"는 가이드 RNA에 결합할 수 있고, 결국에는 가닥 하이브리드화를 통해 표적 핵산 서열에 결합하는 CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인을 포함하고, 표적 핵산 서열의 염기를 편집할 수 있는 염기-편집 도메인을 추가로 포함하는 단백질 또는 융합 단백질이다. 특정 실시양태에서, CRISPR 시스템은 염기 에디터 및 가이드 RNA를 포함한다.
"염기 에디터"라는 용어는 "차세대" 염기 에디터, 예컨대 제3 세대 염기 에디터 (BE3 시스템), 제4 세대 염기 에디터 (BE4 시스템), 및 아데닌 염기 에디터를 포함한다. 염기 절제 수복 억제제 UGI가 Cas9 니카제에 융합된 것인, 제3 세대 염기 에디터 (BE3 시스템)는 비변형된 DNA 가닥을 니킹하여 세포가 미스매치 수복을 위해 주형으로서 편집된 가닥을 사용하게 한다. 그 결과, 세포는 염기 편집을 카피하면서, (시티딘 탈아미노화에 의해 도입된) U-함유 가닥을 주형으로서 사용하여 DNA를 수복한다. 제4 세대 염기 에디터 (BE4 시스템)는 2 카피의 염기 절제 수복 억제제 UGI를 사용한다. 높은 생성물 순도 (전형적으로, 적어도 99.9%) 및 낮은 비율의 indel (전형적으로, 0.1% 이하)로 게놈 DNA에서 표적화된 AㆍT 염기쌍을 GㆍC로 효율적으로 전환시키는 (인간 세포에서 효율 0-100%) 아데닌 염기 에디터 (ABE)가 개발되었다. 예를 들어, 문헌 [Gaudelli et al., Nature 551:464-471 (2017)]을 참조한다. 표적화된 유전자의 발현을 파괴시키기 위해 ATG "출발" 코돈에 널 돌연변이를 도입하는 것을 비롯한, 다른 염기 에디터도 본원에 기술된 방법에 따라 사용하는 데 적합하다는 것을 이해할 것이다.
염기 에디터는 가이드 RNA에 결합할 수 있는 임의의 적합한 CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인은 두 DNA 절단 도메인 중 하나가 불활성화된 것인 Cas9 뉴클레아제이고, 즉, Cas9는 니카제이다. 뉴클레아제-불활성화된 Cas9 단백질은 (뉴클레아제-"효력이 없는" Cas9인) "dCas9" 단백질로서 지칭될 수 있다. 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 단백질 (또는 그의 단편)을 생성하는 방법은 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [Jinek et al., Science. 337:816-821(2012)]; [Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28; 152(5):1173-83] (상기 각 문헌은 그 내용 전체가 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 예를 들어, Cas9의 DNA 절단 도메인은 두 하위도메인, HNH 뉴클레아제 하위도메인 및 RuvC1 하위도메인을 포함하는 것으로 공지되어 있다. HNH 하위도메인은 gRNA에 상보적인 가닥을 절단하는 반면, RuvC1 하위도메인은 비-상보적인 가닥을 절단한다. 이들 하위도메인 내의 돌연변이는 Cas9의 뉴클레아제 활성을 침묵화시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 D10A 및 H840A는 S. 피오게네스 Cas9 의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화시킬 수 있다 ([Jinek et al., Science. 337:816-821(2012)]; [Qi et al., Cell. 28; 152(5):1173-83 (2013)]). 적합한 CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인으로는 제한 없이, WO2015089406A1 (이는 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, D10A, D10A/D839A/H840A, 및 D10A/D839A/H840A/N863A 돌연변이체 도메인을 포함하는 뉴클레아제-불활성 변이체 Cas9 도메인을 포함한다.
일단 표적 세포 또는 게놈에 도입되고 나면, CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인 (예컨대, 뉴클레아제-불활성화된 Cas9)은 그의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열과 매치되는 서열에 결합함으로써 표적 DNA를 찾는다. 일부 실시양태에서, CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인은 비-표준 PAM 서열 (예컨대, 비-NGG PAM 서열)을 인식할 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 5'-NGA-3'; 5'-NGCG-3'; 5'-NGAG-3'; 5'-NNGRRT-3'; 및 5'-NNNRRT-3'과 같은, 상기 PAM 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 주어진 CRISPR 뉴클레아제에 의해 인식되는 적절한 PAM 서열을 결정할 수 있을 것이다.
"염기-편집 도메인"은 핵산 서열 (예컨대, DNA 또는 RNA) 내에서 염기 (예컨대, A, T, C, G, 또는 U)를 변형시킬 수 있는 (예컨대, 염기 치환) 폴리펩티드를 포함하는 작용제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 염기-편집 도메인은 DNA-편집 도메인이다. 일부 실시양태에서, 염기-편집 도메인은 핵산 내의 염기를 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 DNA 분자 내의 염기를 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기-편집 도메인은 데아미나제 도메인이다.
일부 실시양태에서, 데아미나제는 아데노신 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 아데닌을 탈아미노화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 DNA의 데옥시아데노신 잔기 중 아데닌을 탈아미노화시킬 수 있다. 아데노신 데아미나제는 임의의 적합한 유기체 (예컨대, E. 콜라이(E. coli))로부터 유래된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데닌 데아미나제는 본원에서 제공된 돌연변이 중 임의의 것에 상응하는 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, ecTadA 중 돌연변이)를 포함하는 자연적으로 발생된 아데노신 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 원핵생물로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 박테리아로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 슈와넬라 푸트레파시엔스(Shewanella putrefaciens), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus), 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 E. 콜라이로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 활성을 획득하도록 또는 그를 증강시키도록 합리적으로 조작 및/또는 진화된다.
특정 예시적인 실시양태에서, 데아미나제는 시티딘 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC1 패밀리 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 활성화-유도된 시티딘 데아미나제 (AID)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 ACF1/ASE 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 아데노신 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 ADAT 패밀리 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 염기-편집 도메인은 Cas9 도메인의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 염기-편집 도메인은 Cas9 도메인의 C말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인 및 염기-편집 도메인은 링커를 통해 융합된다.
염기 에디터 단백질의 다양한 CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인 및 염기-편집 도메인이 미국 특허 공개 번호 US20150166985A1, US20150166980A1, US20150166984A1, US20170121693A1, 및 US20180073012A1; 및 미국 특허 번호 9,068,179 및 9,840,699 (상기 특허는 모두 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
한 비-제한적인 실시양태에서, 벡터는 CRISPR 시스템의 발현을 구동시킨다. 관련 기술분야에는 본 발명에 유용한 적합한 벡터가 충분히 존재한다. 사용되는 벡터는 복제에 적합하고, 임의적으로, 진핵 세포에서 통합에 적합하다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 원하는 핵산 서열의 발현을 조절하는 데 유용한 프로모터를 포함한다. 본 발명의 벡터는 또한 핵산 표준 유전자 전달 프로토콜을 위해 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (미국 특허 번호 5,399,346, 5,580,859 & 5,589,466 (상기 특허들은 그 전문이 본원에서 참조로 포함).
추가로, 벡터는 바이러스 벡터 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (4th Edition, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2012)]에, 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 감마레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 작용성인 복제 기점, 프로모터 서열, 가까운 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선별가능한 마커를 함유한다 (예컨대, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
일부 실시양태에서, 가이드 RNA(들) 및 Cas9 또는 염기 에디터는 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체 (예컨대, Cas9/RNA-단백질 복합체)로서 세포에 전달될 수 있다. RNP는 gRNA와 복합체를 형성하는 정제된 Cas9 단백질 또는 정제된 염기 에디터로 구성되고, 이는 줄기 세포 및 면역 세포 (애드진(Addgene: 미국 매사추세츠주 케임브리지), 미러스 바이오 LLC(Mirus Bio LLC: 미국 위스콘신주 매디슨))를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다중의 세포 유형에 효율적으로 전달되는 것으로 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 또는 염기 에디터/RNA-단백질 복합체는 전기천공에 의해 세포 내로 전달된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 유전자 편집된 세포는 세포 (예컨대, Treg)에서 하나 이상의 내인성 유전자를 파괴시키기 위해 CRISPR/Cas9를 사용하여 편집된다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas9는 내인성 NR3C1을 파괴시켜, NR3C1 발현을 하향조절하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 유전자 편집된 세포는 세포 (예컨대, Treg)에서 하나 이상의 내인성 유전자를 파괴시키기 위해 염기 에디터를 사용하여 염기 편집된다 (예컨대, 치환이 세포 내로 도입된다). 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 내인성 NR3C1을 파괴시켜, NR3C1 발현을 하향조절하는 데 사용된다.
본원에 기술된 바와 같이, NR3C1의 하향조절은 스테로이드, 예컨대 글루코코르티코이드에의 저항성을 일으킨다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은, CRISPR/Cas9가 내인성 NR3C1을 파괴시켜, NR3C1 발현을 하향조절하는 데 사용되는 것인, 스테로이드-저항성 세포 (예컨대, 글루코코르티코이드-저항성 Treg)를 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 CRISPR-변형된 세포는 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌에 CRISPR-매개 삽입(들) 및/또는 결실(들) (indel(들))을 포함하고, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 CRISPR-변형된 세포는 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌에 염기 편집 (예컨대, 표적화된 염기 치환)을 포함하고, 여기서 염기 편집은 NR3C1의 유전자 발현을 제거/하향조절할 수 있다.
NCBI 참조 서열: NM_001018074.1에 따르면, NR3C1 유전자좌는 9개의 엑손을 함유한다. 일부 실시양태에서, NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중 CRISPR-매개 indel은 NR3C1의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 또는 엑손 9에 위치한다. 따라서, 일부 실시양태에서, gRNA는 NR3C1의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 또는 엑손 9 내의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중 indel은 NR3C1의 엑손 2에 위치한다. 특정 실시양태에서, 가이드 RNA는 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 내인성 NR3C1을 파괴시키기 위해 사용하는 데 적합한 gRNA는 하기 표 1에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 가이드 서열은 NR3C1 유전자 중 표적 서열과 충분히 상보적이고, 서열식별번호 7-10 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함한다.
<표 1>:
Figure pct00001
일부 실시양태에서, NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중 S. 피오게네스 CRISPR/Cas9 염기 에디터-매개 치환은 조기 정지 코돈을 도입한다. 따라서, 일부 실시양태에서, gRNA는, 그 내부의 하나 이상의 염기쌍 치환이 정상 야생형 코돈을 정지 코돈으로 전환시키는 것인 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중 치환은 NR3C1의 엑손에 위치한다. 특정 실시양태에서, 가이드 RNA는 NR3C1의 엑손 중에 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 내인성 NR3C1에서 조기 정지 코돈의 도입을 유도하는 치환을 매개하는 데에서 사용하는 데 적합한 gRNA는 하기 표 2에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 가이드 서열은 NR3C1 유전자 중 표적 서열과 충분히 상보적이고, 서열식별번호 17-54 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함한다.
<표 2>:
Figure pct00002
* 소문자 잔기는 탈아미노화 (치환) 부위를 나타낸다.
일부 실시양태에서, NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중 CRISPR-매개 치환은 NR3C1의 스플라이스 수용자 또는 스플라이스 공여자에 위치한다. 따라서, 일부 실시양태에서, gRNA는 NR3C1의 스플라이스 수용자 또는 스플라이스 공여자를 포함하는 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중 치환은 NR3C1의 스플라이스 수용자 또는 스플라이스 공여자에 또는 그에 인접하게 위치하고, 여기서 치환은 NR3C1의 정상적인 스플라이싱을 파괴시켜 NR3C1의 발현을 하향조절/절제할 수 있다. 특정 실시양태에서, 가이드 RNA는 NR3C1의 스플라이스 수용자를 포함하는 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 가이드 RNA는 NR3C1의 스플라이스 공여자를 포함하는 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함한다. NR3C1의 스플라이스 수용자 또는 스플라이스 공여자에 또는 그에 인접하게 위치하는 치환을 매개하는 데에서 사용하는 데 적합한 gRNA는 하기 표 3에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 가이드 서열은 NR3C1 유전자 중 표적 서열과 충분히 상보적이고, 서열식별번호 55-56 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함한다.
<표 3>:
Figure pct00003
* 소문자 잔기는 탈아미노화 (치환) 부위를 나타낸다.
따라서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, 변형된 만능성 줄기 세포, 변형된 Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손 2에 indel을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, 변형된 만능성 줄기 세포, 변형된 Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손 2에 indel을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 서열식별번호 7에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, 변형된 만능성 줄기 세포, 변형된 Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손 2에 indel을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 서열식별번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, 변형된 만능성 줄기 세포, 변형된 Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손 2에 indel을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 서열식별번호 9에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, 변형된 만능성 줄기 세포, 변형된 Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손 2에 indel을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 서열식별번호 10에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함한다.
따라서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, 변형된 만능성 줄기 세포, 변형된 Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손에 치환을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 치환은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, 변형된 만능성 줄기 세포, 변형된 Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손에 치환을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 치환은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 서열식별번호 17-54 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손에 치환을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 치환은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 서열식별번호 20 또는 21에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손에 치환을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 치환은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 서열식별번호 20에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손에 치환을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 치환은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 서열식별번호 21에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함한다.
따라서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, 변형된 만능성 줄기 세포, 변형된 Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 스플라이스 수용자, 또는 스플라이스 공여자에 치환을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 치환은 NR3C1의 정상적인 스플라이싱을 파괴시켜 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, 변형된 만능성 줄기 세포, 변형된 Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 스플라이스 수용자, 또는 스플라이스 공여자에 치환을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 치환은 NR3C1의 정상적인 스플라이싱을 파괴시켜 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 서열식별번호 55 또는 56에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 스플라이스 수용자, 또는 스플라이스 공여자에 치환을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 치환은 NR3C1의 정상적인 스플라이싱을 파괴시켜 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 서열식별번호 55에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드-저항성 변형된 세포 (예컨대, Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 스플라이스 수용자, 또는 스플라이스 공여자에 치환을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 치환은 NR3C1의 정상적인 스플라이싱을 파괴시켜 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 서열식별번호 56에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드- 및 칼시뉴린 억제제-저항성 변형된 세포 (예컨대, Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1에 indel을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 세포의 게놈 내로의 외인성 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자의 삽입을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CNI 저항성 유전자의 삽입은 NR3C1 중 indel 부위에서 일어난다. 일부 실시양태에서, NR3C1 중 indel은 NR3C1의 엑손 2에 위치한다. 일부 실시양태에서, CNI 저항성 유전자는 칼시뉴린 변이체를 코딩하고, 여기서 칼시뉴린 변이체는 PPP3Ca, PPP3Cb, 및 PPP3Cc (촉매성 서브유닛의 3가지 이소형)로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 A (CNa) 유전자의 돌연변이체 형태, 또는 PPP3R1 및 PPP3R2 (조절성 서브유닛의 2가지 이소형)로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 B (CNb) 유전자의 돌연변이체 형태이다. 일부 실시양태에서, 칼시뉴린 변이체는 CNa12 (서열식별번호 3), CNa22 (서열식별번호 4), 및 CNb30 (서열식별번호 5)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 스테로이드- 및 칼시뉴린 억제제-저항성 변형된 세포 (예컨대, Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1에 치환을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 치환은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 세포의 게놈 내로의 외인성 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자의 삽입을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, NR3C1 중 치환은 NR3C1의 엑손에 위치한다. 일부 실시양태에서, NR3C1 중 치환은 NR3C1의 엑손 2에 위치한다. 일부 실시양태에서, NR3C1 중 치환은 NR3C1의 스플라이스 수용자에 위치한다. 일부 실시양태에서, NR3C1 중 치환은 NR3C1의 스플라이스 공여자에 위치한다. 일부 실시양태에서, CNI 저항성 유전자의 삽입은 NR3C1 중 치환 부위에서, 그에 가까운 위치에서, 또는 그의 하류에서 (예컨대, NR3C1 유전자좌 내에서) 일어난다. 일부 실시양태에서, CNI 저항성 유전자의 삽입은 NR3C1 유전자좌 밖에서 일어난다. 일부 실시양태에서, CNI 저항성 유전자는 칼시뉴린 변이체를 코딩하고, 여기서 칼시뉴린 변이체는 PPP3Ca, PPP3Cb, 및 PPP3Cc 로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 A (CNa) 유전자의 돌연변이체 형태, 또는 PPP3R1 및 PPP3R2로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 B (CNb) 유전자의 돌연변이체 형태이다. 일부 실시양태에서, 칼시뉴린 변이체는 CNa12 (서열식별번호 3), CNa22 (서열식별번호 4), 및 CNb30 (서열식별번호 5)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 스테로이드- 및 칼시뉴린 억제제-저항성 변형된 세포 (예컨대, Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손 2에 indel을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, NR3C1 중 indel 부위 내로의 외인성 CNI 저항성 유전자의 삽입을 추가로 포함하고, 여기서 외인성 CNI 저항성 유전자는 서열식별번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 칼시뉴린 변이체를 코딩한다. 따라서, 스테로이드- 및 칼시뉴린 억제제-저항성 변형된 세포 (예컨대, Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손 2에 indel을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, NR3C1 중 indel 부위 내로의 외인성 CNI 저항성 유전자의 삽입을 추가로 포함하고, 여기서 외인성 CNI 저항성 유전자는 서열식별번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 칼시뉴린 변이체를 코딩한다. 따라서, 스테로이드- 및 칼시뉴린 억제제-저항성 변형된 세포 (예컨대, Treg)를 생성하는 방법은 세포 내로, NR3C1의 엑손 2에 indel을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, NR3C1 중 indel 부위 내로의 외인성 CNI 저항성 유전자의 삽입을 추가로 포함하고, 여기서 외인성 CNI 저항성 유전자는 서열식별번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 칼시뉴린 변이체를 코딩한다.
일부 경우에, 변형된 세포는 배아 또는 유도된, 변형된 만능성 줄기 세포이다. 상기 경우에서, 본원에서 제공된 방법은 변형된 만능성 줄기 세포에서 조혈 전구체 세포 또는 조혈 세포로의 분화를 촉진시키는 조건하에서 변형된 만능성 줄기 세포를 분화시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 본 방법은 변형된 조혈 전구체 및 분화된 조혈 세포 유형을 수득하는 데 필요하고, 그에 충분한 분화 인자의 존재하에서 변형된 만능성 줄기 세포를 배양하는 것을 포함한다. 이어서, 변형된 만능성 줄기 세포를 예컨대, 예를 들어, 미국 특허 번호 9574179, 8093049에 기술된 방법과 같은 임의의 적절한 분화 방법에 따라 분화시켜 변형된 만능성 줄기 세포-유래 조혈 세포 또는 그의 전구체를 생산할 수 있다.
따라서, 일부 경우에서, 스테로이드- 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성 변형된 세포 (예컨대, Treg)를 생성하는 방법은 본원에 기술된 바와 같이 만능성 줄기 세포 내로 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌에 치환을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 치환은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 일부 경우에서, 만능성 세포의 게놈 내로의 외인성 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자의 삽입을 도입하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 제공된 조성물 및 방법은 세포 조성물 중 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%, 또는 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과의 세포가 원하는 유전자 변형을 함유하는 것을 포함한다. 예를 들어, 내인성 유전자 (예컨대, NR3C1)의 넉아웃 또는 유전자 파괴 (예컨대, indel 및/또는 치환)를 위한 작용제 (예컨대, gRNA/Cas 뉴클레아제)가 도입된 세포 조성물 중 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 세포는 유전자 파괴를 함유하고; 표적화된 내인성 폴리펩티드를 발현하지 않고, 표적화된 유전자의 인접 및/또는 기능성 카피는 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 방법, 조성물 및 세포는 표적화된 유전자의 넉아웃 또는 유전자 파괴 (예컨대, indel 및/또는 치환)를 위한 작용제 (예컨대, gRNA/Cas 뉴클레아제)가 도입된 세포 조성물 중 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과의 세포가 표적화된 폴리펩티드를 발현하지 않는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화된 유전자의 넉아웃 또는 유전자 파괴 (예컨대, indel 및/또는 치환)를 위한 작용제 (예컨대, gRNA/Cas9)가 도입된 세포 조성물 중 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%, 또는 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과의 세포가 두 대립유전자 모두에서 넉아웃되고, 즉, 상기 비율의 세포에서 이중대립유전자 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화된 유전자에서의 또는 그에 가까운 위치에서의 (예컨대, 절단 부위의 상류 또는 하류로 100개의 염기쌍 내에서의 또는 약 100개의 염기쌍 내에서의, 50개의 염기쌍 내에서의 또는 약 50개의 염기쌍 내에서의, 또는 25개의 염기쌍 내에서의 또는 약 25개의 염기쌍 내에서의, 또는 10개의 염기쌍 내에서의 또는 약 10개의 염기쌍 내에서의) Cas9-매개 절단율 (예컨대, % indel, % 치환)이 표적화된 유전자의 넉아웃 또는 유전자 파괴를 위한 작용제 (예컨대, gRNA/Cas9)가 도입된 세포 조성물 중 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%, 또는 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과의 세포인 조성물 및 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제공된 세포, 조성물 및 방법을 통해 그 결과로, 표적화된 유전자의 넉아웃 또는 유전자 파괴를 위한 작용제 (예컨대, gRNA/Cas 뉴클레아제)가 도입된 세포 조성물 중 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%, 또는 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과의 세포에서 내인성인 것을 통해 전달된 신호는 감소되거나, 또는 파괴된다.
일부 실시양태에서, 동일한 조건하에서 평가되었을 때, 조성물 중 세포는 상응하는 또는 참조 조성물 중 세포의 표현형과 비교하였을 때, 세포 표현형을 유지한다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자를 파괴하는 효과가 세포에 미치는 것을 제외하면, 동일한 조건하에서 평가되었을 때, 조성물 중 세포는 상응하는 또는 참조 조성물 중 세포의 표현형과 비교하였을 때, 세포 표현형을 유지한다.
일부 실시양태에서, 조성물 중 세포는 제한 없이, 나이브 세포, 이펙터 기억 세포, 중심 기억 세포, 줄기 중심 기억 세포, 이펙터 기억 세포, 및 장수 이펙터 기억 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 제한 없이, 면역 억제성 세포, 예컨대 조절 T 세포 (Treg), (예컨대, IL-10 또는 TGF-β의 분비를 통해) 직접적으로 면역 억제성이 되도록 변형된 비-Treg, 및 간접적으로 면역 억제성이 되도록 변형된 비-Treg (예컨대, 항원 제시 세포 (APC)를 사멸시키는 세포독성 T 림프구 (CTL))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 제한 없이, 수지상 세포, 골수양 유래 억제 세포, 면역조절 대식세포, 중간엽 줄기 세포, 다능성 성체 전구 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능성 줄기 세포, 흉선 전구 세포, 면역 조절 B 세포, 면역 조절 NK 세포, 면역 조절 단핵구, 베토(veto) 세포, 선천 림프양 세포, 불변 자연 살해 (NK) T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 조혈 세포 및 그의 전구체 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 본원에 기술된 바와 같이 변형된 이펙터 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 상기 언급된 세포 유형 중 임의의 것의, 시험관내-유래, 만능성 줄기 세포-유래 세포이다.
일부 실시양태에서, 표적화된 유전자 (예컨대, NR3C1)의 유전자 파괴를 포함하는 세포의 비율(%)이 유전자 파괴를 함유하지 않는, 상응하는 또는 참조 집단, 또는 세포 조성물과 동일한 또는 실질적으로 동일한 비-활성화된, 장수 기억 또는 중심 기억 표현형을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 특성, 활성 또는 표현형은 시험관내 검정법에서, 예컨대 세포의 면역억제 활성을 검정함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 평가되는 활성, 특성 또는 표현형 중 임의의 것은 전기천공 후, 또는 작용제의 다른 도입 후의 다양한 시점 (일)에, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7일 후, 또는 최대 3, 4, 5, 6, 7일 후에 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 활성, 특성 또는 표현형은 동일한 조건하에서 평가되었을 때, 표적화된 유전자의 유전자 파괴를 포함하지 않는 세포를 함유하는 상응하는 조성물의 활성화 비교하였을 때, 조성물 중 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 세포에 의해 유지된다.
본원에서 사용되는 바, "상응하는 조성물" 또는 "상응하는 세포 집단" (이는 또한 "참조 조성물" 또는 "참조 세포 집단"으로도 명명된다)이라고 언급하는 것은, 세포 또는 세포 집단에 작용제가 도입되지 않은 것을 제외하면, 동일한 또는 실질적으로 동일한 조건하에서 수득, 단리, 생성, 생산 및/또는 인큐베이션된 세포 (예컨대, Treg, Teff)를 지칭한다. 일부 측면에서, 작용제 도입을 함유하지 않는다는 것을 제외하면, 상기 세포는 작용제가 도입된 세포와 동일하게, 또는 실질적으로 동일하게 처리되고, 이에 의해 억제성 분자의 상향조절 또는 발현을 비롯한, 세포의 활성 또는 특성에 영향을 줄 수 있는 어느 하나 이상의 조건은 작용제 도입 이외에는 세포 간에 달라지지 않거나, 실질적으로 달라지지 않다.
세포 마커 (예컨대, Treg 마커)의 발현 및/또는 수준을 평가하는 방법 및 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 상기 마커의 검출을 위한 항체 및 시약은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 쉽게 이용할 수 있다. 상기 마커를 검출하기 위한 검정법 및 방법으로는 세포내 유세포 분석법을 비롯한 유세포 분석법, ELISA, ELISPOT, 세포분석 비드 어레이 또는 다른 멀티플렉스 방법, 웨스턴 블롯 및 다른 면역친화성-기반 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 세포는 유세포 분석법 또는 다른 면역친화성 기반 방법에 의해 상기 세포에 고유한 마커의 발현에 대해 검출될 수 있고, 이어서, 상기 세포는 또 다른 마커에 대해 공동-염색될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포, 조성물 및 방법은 입양 전달받는 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포 (예컨대, Treg, Teff)에서 표적 유전자의 발현을 결실, 넉아웃, 파괴, 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 생체외에서 대상체로부터의 1차 세포, 예컨대 1차 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포 (예컨대, Treg, Teff)에서 수행된다. 일부 측면에서, 상기 세포를 생산 또는 생성하는 방법은 세포 내로, 표적화되는 내인성 유전자 (예컨대, NR3C1)를 코딩하는 유전자를 파괴시킬 수 있는 작용제 또는 작용제들을 도입하는 단계, 및 세포 내로 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자를 도입하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "도입하는"이라는 용어는 시험관내 또는 생체내에서 세포 내로 DNA를 도입하는 다양한 방법을 포함하고, 상기 방법은 형질전환, 형질도입, 형질감염 (예컨대, 전기천공), 및 감염을 포함한다. 도입이 전기천공을 포함하는 경우, 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 플라스미드, 단일 가닥 DNA, 미니서클 DNA)는 전기천공될 수 있다. 벡터는 DNA 코딩 분자를 세포 내로 도입하는 데 유용하다. 가능한 벡터는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 다른 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-연관 벡터를 포함한다.
세포 집단은 예컨대, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플, 제대혈 샘플, 비분획 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집술 생성물, 또는 백혈구성분채집술 생성물로부터 수득된 것과 같이, 대상체로부터 수득된 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자를 코딩하는 핵산을 도입하는 단계, 및 작용제 (예컨대, Cas/gRNA RNP)를 도입하는 단계는 동시에, 또는 임의 순서로 순차적으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자 및 하나 이상의 유전자 편집 작용제 (예컨대, Cas/gRNA RNP) 도입 후, 세포를, 세포의 확장 및/또는 증식을 자극시키는 조건하에서 배양 또는 인큐베이션시킨다.
따라서, 예컨대 시간이 경과함에 따라 전달된 세포에의 지속성 또는 노출은 유지시키면서, 투여된 변형된 세포의 활성 및 효력을 증가시킴으로써, 또는 예컨대, 투여된 변형된 세포의 지속성 및/또는 생존을 증가시킴으로써, 개선된 효능을 제공하는 것을 비롯한, 입양 세포 요법에서 세포, 예컨대 Treg 기능을 증진시키는 세포, 조성물, 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 변형된 세포는 특정 이용가능한 방법과 비교하면, 생체내에서 대상체에게 투여되었을 때, 증가된 확장 및/또는 지속성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제공된 세포는 생체내에서 대상체에게 투여되었을 때, 증가된 지속성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 예컨대 세포는 내인성 유전자 (예컨대, NR3C1)를 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키거나, 또는 상기 유전자를 파괴시키는 작용제가 도입되지 않은 것인 방법에 의해 유전자 조작된 세포 투여를 포함하는 방법과 같은 대안적 방법에 의해 달성되는 것과 비교하면, 투여시 대상체에서 변형된 세포의 지속성은 더 크다. 일부 실시양태에서, 지속성은 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 또는 그 초과, 또는 적어도 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 또는 그 초과 증가된다.
일부 실시양태에서, 투여된 세포의 지속성 정도 또는 범위는 대상체에게 투여된 이후에 검출 또는 정량화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체의 혈액 또는 혈청 또는 기관 또는 조직 (예컨대, 질환 부위) 중 변형된 세포의 정량을 평가하는 데 정량적 PCR (qPCR)이 사용된다. 일부 실시양태에서, 지속성은 DNA 1 ㎍당 예컨대, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자를 코딩하는 DNA 또는 플라스미드의 카피로서, 또는 예컨대, 혈액 또는 혈청 샘플과 같은 샘플 1 ㎕당, 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 백혈구 총 개수당 CNI 저항성 유전자 발현 세포 개수로서, 또는 샘플 1 ㎕당 Treg의 개수로서 정량화된다. 일부 실시양태에서, 일반적으로 예컨대, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자 코딩된 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 세포를 검출하는 유세포 분석 검정법 또한 수행될 수 있다. 세포 기반 검정법 또한 기능성 세포의 개수 또는 비율(%)을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용은 본 발명의 칼시뉴린 억제제-저항성 변형된 세포 (예컨대, Treg)를 생산 또는 생성하는 방법을 제공한다. 세포는 일반적으로 외인성 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자 생성물을 코딩하는 하나 이상의 유전자 조작된 핵산을 도입함으로써 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포는 또한 외인성 CNI 저항성 유전자 생성물을 코딩하는 핵산이, 표적화된 유전자 (예컨대, NR3C1)를 파괴시킬 수 있는 작용제 (예컨대, Cas9/gRNA RNP)와 함께 동시에, 또는 순차적으로 도입된다.
일부 실시양태에서, (예컨대, 칼시뉴린 변이체를 코딩하는) 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자는 상동성 지정 수복 (HDR)을 통해 게놈 내로 삽입된다. 본원에서 사용되는 바, "상동성 지정 수복" 또는 "HDR"은 세포 중 이중 가닥 DNA 파단을 수복시키는 기전이다. HDR은 일반적으로 상동성 재조합 프로세스에 의존하여, 이에 의해 상동성인 핵산 서열 스트레치가 이중 가닥 DNA 파단을 수복시키는 데 사용된다. HDR 동안, 핵산 공여자의 상동성 서열의 가닥은 절단된 DNA의 절개부를 침범하거나, 또는 그와 하이브리드화한다. 프라이머로서 절개된 DNA를 사용하는 DNA 폴리머라제를 주형으로서 침범된 공여자 서열을 사용하여 절단된 DNA를 신장시킨다. 신장 및 파단 수복 후, 절단된 부위의 새 서열은, 수복 프로세스에서 사용된 핵산 공여자에 존재한 서열이면 무엇이든 그를 갖는다. HDR 프로세스는 문헌 [Jasin et al. (Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013 Nov; 5(11): a012740)] (본원에서 참조로 포함된다)에 추가로 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포의 상동성 표적 핵산 중 특이적인 뉴클레오티드 위치에서의 게놈 조작을 가능하게 하는 데 (예컨대, CNI 저항성 유전자의 삽입을 위한) 핵산 공여자 주형 (예컨대, 특정 대립유전자에서 이형접합성 화합물인 상동성 염색체)이 유전자 편집 복합체 (예컨대, CRISPR/Cas 시스템)와 함께 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 재조합 유전자 편집 복합체가 염색체 중 표적 부위에서 유전자 손상 (예컨대, 닉 또는 이중 가닥 파단)을 유도하고, 본 발명의 공여자 주형이 수복 기전 (예컨대, HDR)을 매개하도록 하는 조건하에서 세포 (예컨대, 질환 대상체의 세포)로 핵산 공여자 주형과 함께 재조합 유전자 편집 복합체의 적어도 하나의 성분을 전달하여 상기 손상을 수복시키는 단계를 포함하는, 표적화된 유전자 편집 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 핵산 공여자 주형 (이는 또한 본원에서 외인성 공여자 DNA 서열로도 지칭된다)은 상동성 재조합을 통한 NR3C1 유전자좌 내로의 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자 (예컨대, 돌연변이체/변이체 칼시뉴린 유전자) 삽입을 촉진시킨다. 따라서, 특정 실시양태에서, 돌연변이체 칼시뉴린 유전자는 서열식별번호 11에 기재된 핵산 서열을 포함하는 외인성 공여자 DNA 서열을 사용하여 상동성 재조합을 통해 NR3C1 유전자좌 내로 삽입된다. 외인성 공여자 DNA 서열의 개략도는 본원 도 15에 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, 공여자 DNA 서열은 전사 제어 요소, 예컨대 제한 없이, MND 프로모터, CMB 프로모터, EF-1알파 프로모터, PGK 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 DNA 서열은 리포터 분자 예컨대, 제한 없이, 형광성 마커 (예컨대, GFP), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 신경 성장 인자 수용체 (NGFR), 유도성 카스파제를 포함할 수 있다. 공여자 DNA 서열이 1차 삽입 요소 (예컨대, CNI 저항성 유전자) 및 2차 요소 (예컨대, 리포터 분자), 둘 모두를 포함하는 경우, 동조 발현이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 유전자의 다양한 동조 발현 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서,1차 삽입 요소 (예컨대, CNI 저항성 유전자) 및 2차 삽입 요소 (예컨대, GFP)는 링커에 의해 분리된다. 본 개시내용에서의 사용을 위한 링커를 통해 다중 단백질이 동일한 핵산 서열 (예컨대, 멀티스트론성 또는 비스트론성 서열)에 의해 코딩될 수 있고, 이는 별개의 단백질 성분으로 해리되는 폴리단백질로서 번역된다. 예를 들어, CNI 저항성 유전자 및 리포터 유전자를 포함하는 본 개시내용의 공여자 핵산에서의 사용을 위한 링커를 통해 CNI 저항성 유전자 생성물 및 리포터 유전자 생성물은, 별개의 CNI 저항성 유전자 생성물 및 리포터 유전자 생성물 성분으로 해리되는 폴리단백질로서 번역될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "내부 리보솜 진입 부위" 또는 "IRES"는 단백질 코딩 영역의 개시 코돈, 예컨대 ATG로 바로 진행되는 내부 리보솜 진입을 촉진시켜 유전자의 캡-비의존 번역을 유도하는 요소를 지칭한다. 제한 없이, 예컨대 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 또는 결합 면역글로불린 단백질 (BiP); 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 섬유모세포 성장 인자 2; 인슐린-유사 성장 인자; 번역 개시 인자 eIF4G; 효모 전사 인자 TFIID 및 HAP4와 같은, 바이러스 또는 세포 mRNA 공급원으로부터 수득가능한 IRES; 및 예컨대, 카디오바이러스, 리노바이러스, 아프토바이러스, HCV, 프렌드 뮤린 백혈병 바이러스 (FrMLV), 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMLV)로부터 수득가능한 IRES를 비롯한, 다양한 내부 리보솜 진입 부위가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에서 사용하는 데 적절한 IRES를 선택할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 링커는 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "자기-절단 펩티드" 또는 "2A 펩티드"는 다중 단백질이, 번역시 성분 단백질로 해리되는 폴리단백질로서 코딩될 수 있도록 하는 올리고펩티드를 지칭한다. "자기-절단"이라는 용어 사용은 단백질분해 절단 반응을 의미하는 것으로 의도되지 않는다. 제한 없이, 피코나비리다에(Picornaviridae) 바이러스 과의 구성원, 예컨대 구제역 바이러스 (FMDV), 말 비염 A 바이러스 (ERAV, 토세아 아시그나 바이러스 (TaV), 및 돼지 테스코 바이러스-1 (PTV-1); 및 카디오바이러스, 예컨대 테일로바이러스 및 뇌심근염 바이러스에서 발견되는 것을 비롯한, 다양한 자기-절단 또는 2A 펩티드가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. FMDV, ERAV, PTV-1, 및 TaV로부터 유래된 2A 펩티드는 본원에서 각각 "F2A," "E2A," "P2A," 및 "T2A"로 지칭된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에서 사용하는 데 적절한 자기-절단 펩티드를 선택할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 링커는 퓨린 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 퓨린은 트랜스-골지에 잔류하고, 단백질 전구체를 그의 분비 이전에 프로세싱하는, 편재하여 발현되는 프로테아제이다. 퓨린은 그의 컨센서스 인식 서열의 COOH- 말단을 절단한다. 제한 없이, Arg-X-Lys-Arg (서열식별번호 12) 또는 Arg-X-Arg-Arg (서열식별번호 13), X1-Arg-X-X1-Arg (서열식별번호 14) 및 Arg-X-X-Arg (서열식별번호 15), 예컨대 Arg-Gln-Lys-Arg (서열식별번호 16) (여기서, X는 임의의 자연적으로 발생된 아미노산이고, X1은 Arg 또는 Lys이다)를 비롯한, 다양한 퓨린 컨센서스 인식 서열 (또는 "퓨린 절단 부위")가 관련 기술분야의 통상의 기술자에 공지되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에서 사용하는 데 적절한 퓨린 절단 부위를 선택할 수 있을 것이다.
본원에서 사용되는 바, "핵산 공여자" 또는 "핵산 공여자 주형" 또는 "공여자 주형" 또는 "공여자 서열" 또는 "공여자" 또는 "핵산 삽입체" 또는 "삽입체"라는 용어는 수복 기전 (예컨대, 상동성 지정 수복 (HDR))에서 수복 주형으로서 사용될 수 있는 임의의 핵산 서열, 예컨대 데옥시리보핵산을 지칭한다. 핵산 공여자는 이중 가닥 또는 단일 가닥, 예컨대 이중 가닥 DNA (dsDNA) 또는 단일 가닥 DNA (ssDNA)일 수 있다. 본 개시내용의 핵산 공여자는 다양한 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 공여자 길이는 약 100개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 100개의 뉴클레오티드 길이, 약 200개의 뉴클레오티드 길이, 약 300개의 뉴클레오티드 길이, 약 400개의 뉴클레오티드 길이, 약 500개의 뉴클레오티드 길이, 약 600개의 뉴클레오티드 길이, 약 700개의 뉴클레오티드 길이, 약 800개의 뉴클레오티드 길이, 약 900개의 뉴클레오티드 길이, 약 1,000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 1,000개 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 길이가 200개 이하의 뉴클레오티드 길이인 핵산 공여자 또한 "짧은" 핵산 공여자로서 지칭될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 공여자는 단일 가닥 공여자 올리고뉴클레오티드 (ssODN)이다. 세포의 게놈 내로 삽입되는 핵산 공여자의 길이는 통상의 기술자의 필요에 따라 임의의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 어느 방식으로든 제한하는 것은 아니지만, 뉴클레오티드 부분은 단일 뉴클레오티드 정도로 짧거나, 또는 10 킬로베이스 초과일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 공여자는 세포의 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 세포의 게놈 내로 삽입되는 외인성 서열을 포함한다. 외인성 서열은 유전자 (예컨대, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자)를 포함할 수 있다. 유전자는 단백질, 예컨대 치료 단백질 또는 선별가능한 마커 단백질 (예컨대, 칼시뉴린 변이체)을 코딩할 수 있다. 특정 실시양태에서, 선별가능한 마커는 세포 성장을 감소시키거나, 또는 세포 사멸을 유발하는 작용제에 대한 내성을 부여하는 선별가능한 마커 단백질을 코딩할 수 있다. 상기 작용제의 예로는 암피실린, 블라스티시딘, 블레오마이신, 클로람페니콜, 젠타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 네오마이신, 포스피노트리신, 퓨로마이신, 테트라시클린, 및 제오신을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 실시양태에서, 선별가능한 마커는 형광성 또는 발광성 단백질 (예컨대, 루시페라제 또는 GFP)을 코딩할 수 있다. 유전자는 유전자가 삽입되는 세포와 동일한 종의 유기체로부터 유래된 것일 수 있다. 유전자는 유전자가 삽입되는 세포와 상이한 종의 유기체로부터 유래된 것일 수 있다. 유전자는 다중 종의 서열을 포함하는 키메라 서열일 수 있다. 핵산 공여자는 비-코딩 RNA를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 비-코딩 RNA의 예로는 전달 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 소형 RNA, 예컨대 siRNA, miRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, 엑소좀 RNA (exRNA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 핵산 공여자는 발현되지 않는 서열을 포함할 수 있다. 핵산 공여자는 세포에서 내인성 유전자의 발현을 감소 또는 제거하는 서열을 포함할 수 있다.
HDR-매개 유전자 편집의 경우, 본 개시내용의 핵산 공여자는 5' 단부 및 3' 단부에 상동성 아암, 예를 들어, 제1 및 제2 상동성 아암을 추가로 포함한다. 상동성 아암은 HDR을 매개할 정도로, 세포의 게놈 중 표적 부위와 충분한 상동성을 공유하는 핵산 서열이다. 각 상동성 아암은 다양한 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상동성 아암 핵산 서열은 상기 기술된 바와 같은 기존 핵산 공여자 서열의 연장부임을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다.
특정 실시양태에서, 제1 상동성 아암의 길이는 약 20개의 뉴클레오티드 길이 내지 약 1,000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 상동성 아암의 길이는 약 20개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 20개의 뉴클레오티드 길이, 약 30개의 뉴클레오티드 길이, 약 40개의 뉴클레오티드 길이, 약 50개의 뉴클레오티드 길이, 약 60개의 뉴클레오티드 길이, 약 70개의 뉴클레오티드 길이, 약 80개의 뉴클레오티드 길이, 약 90개의 뉴클레오티드 길이, 약 100개의 뉴클레오티드 길이, 약 200개의 뉴클레오티드 길이, 약 300개의 뉴클레오티드 길이, 약 400개의 뉴클레오티드 길이, 약 500개의 뉴클레오티드 길이, 약 600개의 뉴클레오티드 길이, 약 700개의 뉴클레오티드 길이, 약 800개의 뉴클레오티드 길이, 약 900개의 뉴클레오티드 길이, 약 1,000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 1,000개 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
특정 실시양태에서, 제2 상동성 아암의 길이는 약 20개의 뉴클레오티드 길이 내지 약 1,000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 제2 상동성 아암의 길이는 약 20개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 20개의 뉴클레오티드 길이, 약 30개의 뉴클레오티드 길이, 약 40개의 뉴클레오티드 길이, 약 50개의 뉴클레오티드 길이, 약 60개의 뉴클레오티드 길이, 약 70개의 뉴클레오티드 길이, 약 80개의 뉴클레오티드 길이, 약 90개의 뉴클레오티드 길이, 약 100개의 뉴클레오티드 길이, 약 200개의 뉴클레오티드 길이, 약 300개의 뉴클레오티드 길이, 약 400개의 뉴클레오티드 길이, 약 500개의 뉴클레오티드 길이, 약 600개의 뉴클레오티드 길이, 약 700개의 뉴클레오티드 길이, 약 800개의 뉴클레오티드 길이, 약 900개의 뉴클레오티드 길이, 약 1,000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 1,000개 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
특정 실시양태에서, 핵산 공여자의 제1 및 제2 상동성 아암은 상이한 길이의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 어느 방식으로든 제한하는 것은 아니지만, 예시적인 목적의 한 예로서, 핵산 공여자의 5' 단부의 상동성 아암 (제1 상동성 아암)의 길이는 100개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 핵산 공여자의 3' 단부의 상동성 아암 (제2 상동성 아암)의 길이는 150개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, (예컨대, 칼시뉴린 변이체를 코딩하는) 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자는 발현 벡터에 의해 세포 내로 도입된다. 본 발명의 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 본원에서 제공된다. 적합한 발현 벡터로는 렌티바이러스 벡터, 감마 레트로바이러스 벡터, 포말상 바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 조작된 하이브리드 바이러스, 네이키드 DNA (제한하는 것은 아니지만, 트랜스포존 매개 벡터, 예컨대 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty), 피기백(Piggybac), 및 인테그라제즈(Integrases), 예컨대 Phi31 포함)를 포함한다. 일부 다른 적합한 발현 벡터로는 단순 포진 바이러스 (HSV) 및 레트로바이러스 발현 벡터를 포함한다.
아데노바이러스 발현 벡터는 게놈 DNA 내로의 통합 능력은 낮지만, 숙주 세포를 형질감염시키는 효율은 높은 아데노바이러스에 기초한다. 아데노바이러스 발현 벡터는 (a) 발현 벡터의 패키징을 지원하고, (b) 궁극적으로는 숙주 세포에서 칼시뉴린 변이체를 발현시키는 데 충분한 아데노바이러스 서열을 함유한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 게놈은 36 kb의, 선형, 이중 가닥 DNA이고, 여기서 본 발명의 발현 벡터를 제조하기 위해, 외래 DNA 서열 (예컨대, 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 핵산)이 삽입되어 큰 아데노바이러스 DNA 조각을 치환할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Danthinne and Imperiale, Gene Therapy (2000) 7(20): 1707-1714] 참조).
또 다른 발현 벡터는 아데노바이러스 커플링된 시스템을 이용하는, 아데노 연관 바이러스에 기초한 것이다. 상기 AAV 발현 벡터의 숙주 게놈 내로의 통합 빈도는 높다. 이는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 이는 예를 들어, 조직 배양물에서 또는 생체내에서 포유동물 세포 내로의 유전자 전달에 유용하게 만든다. AAV 벡터는 감염력에 대하여 광범위한 숙주 범위를 갖는다. 제한 없이, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAVrh10으로부터 유래된 것을 비롯한, 다양한 AAV 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. AAV 벡터의 생성 및 용도에 관한 상세한 설명은 미국 특허 번호 5,139,941 및 4,797,368에 기술되어 있다.
레트로바이러스 발현 벡터는 숙주 게놈 내로의 통합될 수 있고, 다량의 외래 유전 물질을 전달할 수 있으며, 광범위한 스펙트럼의 종 및 세포 유형을 감염시킬 수 있고, 전문 세포주에 패키징될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 핵산 (예컨대, 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 핵산)을 특정 위치에서 바이러스 게놈 내로 삽입하여 복제 결함성인 바이러스를 생성함으로써 구축된다. 비록 레트로바이러스 벡터가 매우 다양한 세포 유형을 감염시킬 수는 있지만, 칼시뉴린 변이체의 통합 및 안정적인 발현을 위해서는 숙주 세포의 분열이 요구된다.
렌티바이러스 벡터는 공통 레트로바이러스 유전자 gag, pol, 및 env 이외에도, 조절 또는 구조 기능을 갖는 다른 유전자를 함유하는 복합 레트로바이러스인, 렌티바이러스로부터 유래된 것이다 (예컨대, 미국 특허 번호 6,013,516 및 5,994, 136 참조). 렌티바이러스의 일부 예로는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1, HIV-2) 및 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV)를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 HIV 병독성 유전자를 다양하게 약독화시킴으로써 생성되었고, 예를 들어, 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef는 결실됨에 따라 벡터는 생물학적으로 안전하다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고, 예컨대 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 핵산의 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 발현, 둘 모두를 위해 사용될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 5,994,136 참조).
본 개시내용의 핵산을 포함하는 발현 벡터는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의 수단에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 발현 벡터는 원하는 경우, 형질감염을 위해 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 발현 벡터는 융합, 전기천공, 바이오리스틱스, 형질감염, 리포펙션 등에 의해 도입될 수 있다. 숙주 세포는 발현 벡터 도입 이전에 배양물 중에서 성장 및 확장될 수 있고, 이어서, 벡터의 도입 및 통합을 위해 적절히 처리될 수 있다. 이어서, 숙주 세포는 확장되고, 벡터에 존재하는 마커에 의해 스크리닝될 수 있다. 사용될 수 있는 다양한 마커가 관련 기술분야에 공지되어 있고, hprt, 네오마이신 내성, 티미딘 키나제, 히그로마이신 내성 등을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "세포," "세포주" 및 "세포 배양물"이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 조혈 세포 또는 그의 전구체, 예컨대 Treg, T 세포, NK 세포, 또는 NKT 세포이다.
본 발명은 또한 본 개시내용의 칼시뉴린 변이체를 포함하고, 그를 안정적으로 발현하는 유전자 조작된 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 유전자 조작된 조절 T 세포 (Treg), T-림프구 (T 세포), 나이브 T 세포 (TN), 기억 T 세포 (예를 들어, 중심 기억 T 세포 (TCM), 이펙터 기억 세포 (TEM)), 자연 살해 세포 (NK 세포), 및 치료상 관련된 자손을 생성할 수 있는 대식세포이다. 한 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 자가유래 세포이다.
(예컨대, 칼시뉴린 변이체를 포함하는) 변형된 세포는 본 개시내용의 핵산을 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 안정적으로 형질감염시킴으로써 생산될 수 있다. 본 개시내용의 변형된 세포를 생성할 수 있는 추가 방법으로는 제한 없이, 화학적 형질전환 방법 (예컨대, 인산칼슘, 덴드리머, 리포솜 및/또는 양이온 중합체 사용), 비화학적 형질전환 방법 (예컨대, 전기천공, 광학적 형질전환, 유전자 전기전달 및/또는 수력학적 전달) 및/또는 입자 기반 방법 (예컨대, 임페일펙션, 유전자 총 사용 및/또는 마그네토펙션)을 포함한다. 본 개시내용의 칼시뉴린 변이체를 발현하는 형질감염된 세포는 생체외에서 확장될 수 있다.
발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 물리적 방법으로는 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격법, 미량주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참조한다. 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 화학적 방법은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합형 미셀, 및 리포솜을 비롯한, 지질 기반 시스템을 포함한다.
사용하기 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 시그마(Sigma: 미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 입수할 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 K & K 라보라토리즈(K & K Laboratories: 미국 뉴욕주 플레인뷰)로부터 입수할 수 있고; 콜레스테롤 ("Choi")은 칼바이오켐-베링(Calbiochem-Behring)으로부터 입수할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 다른 지질은 아반티 폴라 리피즈, 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.: 미국 앨라배마주 버밍엄)로부터 입수할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 보관될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더욱 쉽게 증발되기 때문에, 오직 용매로서만 사용될 수 있다. "리포솜"은 봉입된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포함하는 일반 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포체 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이는 인지질이 과량의 수용액 중에 현탁될 때, 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 자기-재배열을 거친 후, 폐쇄 구조를 형성하고, 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 포획한다 (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 용액 중에서 일반 소포체 구조와 상이한 구조를 갖는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 취할 수 있거나, 또는 단순히 지질 분자의 비균일 응집체로서 존재할 수 있다. 리포펙타민-핵산 복합체가 또한 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나, 또는 다르게는 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키는 데 사용되는 방법과 상관없이, 숙주 세포 중 핵산의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정법이 수행될 수 있다. 예컨대, 검정법은 예를 들어, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 널리 공지된 분자 생물학 검정법, 예컨대 써던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; 생화학 검정법, 예컨대 면역학적 수단에 의해 (ELISA 또는 웨스턴 블롯), 또는 본원에 기술된, 본 발명의 범주 내에 포함되는 작용제를 확인하는 검정법에 의해 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 숙주 세포 내로 도입된 핵산은 RNA이다. 또 다른 실시양태에서, RNA는 시험관내에서 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 mRNA이다. RNA는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)-생성된 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생산될 수 있다. 임의 공급원으로부터의 관심 DNA는 적절한 프라이머 및 RNA 폴리머라제를 사용하여 PCR에 의해 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 직접 전환될 수 있다. DNA의 공급원은 예를 들어, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 DNA의 임의의 다른 적절한 공급원일 수 있다.
PCR은 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하는 데 사용될 수 있고, 상기 주형은 이어서, 세포 내로 도입된다. PCR을 수행하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. PCR에서 사용하기 위한 프라이머는 PCR을 위한 주형으로서 사용되는 DNA 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 디자인된다. 본원에서 사용되는 바, "실질적으로 상보적인"이라는 것은 프라이머 서열 중 염기 대부분 또는 그들 모두가 상보적인 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR을 위해 사용되는 어닐링 조건하에서 의도된 DNA 표적과 어닐링 또는 하이브리드화할 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의 부분에 실질적으로 상보적이도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 보통 세포에서 전사되는 유전자의 일부분 (오픈 리딩 프레임) (5' 및 3' UTR 포함)을 증폭시키도록 디자인될 수 있다. 프라이머는 또한 관심 특정 도메인을 코딩하는 유전자의 일부분을 증폭시키도록 디자인될 수 있다. 한 실시양태에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR 모두 또는 그의 일부분을 포함하는, 인간 cDNA의 코딩 영역을 증폭시키도록 디자인된다. PCR에 유용한 프라이머는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 합성 방법에 의해 생성된다. "정방향 프라이머"는 증폭시키고자 하는 DNA 서열 상류에 위치하는 DNA 주형 상의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. 본원에서 사용되는 바, "상류"란, 코딩 가닥 기준으로, 증폭시키고자 하는 DNA 서열에 대하여 5 방향의 위치를 지칭한다. "역방향 프라이머"는 증폭시키고자 하는 DNA 서열 하류에 위치하는 이중 가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. 본원에서 사용되는 바, "하류"란, 코딩 가닥 기준으로, 증폭시키고자 하는 DNA 서열에 대하여 3' 방향의 위치를 지칭한다.
RNA의 안정성 및/또는 번역률을 촉진시킬 수 있는 능력을 갖는 화학 구조 또한 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게, 5' 및 3' UTR을 갖는다. 한 실시양태에서, 5' UTR 길이는 0 내지 3,000개의 뉴클레오티드 길이이다. 코딩 영역에 부가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 제한하는 것은 아니지만, UTR의 상이한 영역에 어닐링하는 PCR에 대한 프라이머를 디자인하는 것을 포함하는, 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 전사된 RNA의 형질감염 후 최적의 번역률을 달성하는 데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 유전자에 대한 자연 발생, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머 내로 도입함으로써, 또는 주형을 변형시키는 임의의 다른 변형에 의해 부가될 수 있다. 관심 유전자에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열을 사용하는 것은 RNA의 안정성 및/또는 번역률을 변형시키는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열 중의 AU가 풍부한 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다는 것이 공지되어 있다. 그러므로, 3' UTR은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 UTR의 특성에 기초하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나, 또는 디자인될 수 있다.
한 실시양태에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 코작(Kozak) 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자에 대해 내인성이 아닌 5' UTR이 상기 기술된 바와 같이 PCR에 의해 부가될 때, 컨센서스 코작 서열은 5' UTR 서열을 부가함으로써 재디자인될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역률을 증가시킬 수는 있지만, 모든 RNA가 효율적인 번역을 할 수 있도록 하는 데 요구되는 것으로는 보이지 않는다. 다수의 mRNA에 대한 코작 서열의 요건은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 다른 실시양태에서, 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정적인 것인 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 실시양태에서, 다양한 뉴클레오티드 유사체는 3' 또는 5' UTR에서 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하는 데 사용될 수 있다.
유전자 클로닝할 필요없이, DNA 주형으로부터 RNA를 합성할 수 있도록 하기 위해, 전사 프로모터는 전사되는 서열 상류 방향으로 DNA 주형에 부착되어야 한다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터로서 작용하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 단부에 부가될 때, RNA 폴리머라제 프로모터는 전사되는 오픈 리딩 프레임의 상류 방향으로 PCR 생성물 내로 도입된다. 한 실시양태에서, 프로모터는 본원 다른 곳에 기술된 바와 같이, T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터로는 T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 컨센서스 뉴클레오티드 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, mRNA는 리보솜 결합, 번역 개시 및 세포에서의 mRNA 안정성을 결정짓는, 5' 단부 상의 캡 및 3' 폴리(A) 테일, 둘 모두를 갖는다. 고리형 DNA 주형, 예를 들어, 플라스미드 DNA 상에서, RNA 폴리머라제는 진핵 세포에서의 발현에는 적합하지 않은 긴 콘카타머 생성물을 생산한다. 3' UTR의 단부에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사 결과로, 비록 전사 후에 폴리아데닐화되더라도, 진핵성 형질감염에서는 효과가 없는 일반 크기의 mRNA가 생성된다.
선형 DNA 주형 상에서, 파지 T7 RNA 폴리머라제는 전사체의 3' 단부를 주형의 마지막 염기 너머로 연장시킬 수 있다 ([Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)]; [Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)]).
전사 DNA 주형의 폴리A/T 세그먼트는 폴리T 테일, 예컨대 100T 테일 (크기는 50-5,000 T일 수 있다)을 함유하는 역방향 프라이머를 이용함으로써 진행되는 PCR 동안, 또는 DNA 라이게이션 또는 시험관내 재조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 다른 방법에 의한 PCR 이후에 생산될 수 있다. 폴리(A) 테일은 또한 RNA에 대한 안정성을 제공하고, 그의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 테일의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관관계를 갖는다. 한 실시양태에서, 폴리(A) 테일은 100 내지 5,000개의 아데노신이다.
RNA의 폴리(A) 테일은 폴리(A) 폴리머라제, 예컨대 E. 콜라이 폴리A 폴리머라제 (E-PAP)를 사용하여 시험관내 전사 후에 추가로 연장될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리(A) 테일의 길이를 100개의 뉴클레오티드에서 300 내지 400개의 뉴클레오티드로 증가시키면, RNA의 번역률은 약 2배 정도 증가된다. 추가로, 상이한 화학기의 3' 단부에의 부착이 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 압타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라제를 이용하여 폴리(A) 테일 내로 도입될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡 또한 RNA 분자에 대해 안정성을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 관련 기술분야에 공지되고, 본원에서 설명된 기술을 사용하여 제공된다 ([Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)]; [Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)]; [Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)]).
일부 실시양태에서, 예컨대 시험관내 전사된 RNA와 같이 RNA는 세포 내로 전기천공된다. 세포 투과성 및 생존능을 촉진시키는 인자를 함유할 수 있는, 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질, 예컨대 당, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제, 및 계면활성제가 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 핵산은 RNA, 예컨대 시험관내 합성된 RNA가 될 것이다. RNA를 합성하는 시험관내 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고; 임의의 공지된 방법이 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 서열을 포함하는 RNA를 합성하는 데 사용될 수 있다. RNA를 숙주 세포 내로 도입하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Zhao et al. Cancer Res. (2010) 15: 9053]을 참조한다. 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA를 숙주 세포 내로 도입하는 것은 시험관내 또는 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 (예컨대, Treg, NK 세포, 세포독성 T 림프구 등)는 시험관내 또는 생체외에서 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA로 전기천공될 수 있다.
개시된 방법은 기본 연구 및 요법에서, 암, 줄기 세포, 급성 및 만성 감염, 자가면역 질환, 세포 요법, 및 유전자 요법 분야에서 (표적 암 세포를 사멸시킬 수 있는 유전자 변형된 T 세포의 능력을 평가하는 것 포함) T 세포 활성 조정에 적용될 수 있다.
본 방법은 또한 예를 들어, 프로모터 또는 입력 RNA의 양을 변화시켜 발현 수준을 개별적으로 조절할 수 있게 함으로써 광범위한 범위에 걸쳐 발현 수준을 제어할 수 있는 능력을 제공한다. 추가로, mRNA를 생산하는 PCR-기반 기술은 구조 및 그의 도메인 조합이 상이한 mRNA의 디자인을 촉진시킨다.
본 발명의 RNA 형질감염 방법의 한 가지 이점은 RNA 형질감염이 본질적으로 일과성이고, 벡터를 함유하지 않는다는 점이다. RNA 트랜스진은 림프구로 전달될 수 있고, 임의의 추가 바이러스 서열을 필요로 하지 않으면서, 최소 발현 카세트로서, 단기가의 시험관내 세포 활성화 이후에 상기 림프구에서 발현된다. 상기 조건하에서, 트랜스진의 숙주 세포 게놈 내로의 통합은 가능성이 낮다. RNA의 형질감염 효율, 및 전체 림프구 집단을 균일하게 변형시킬 수 있는 그의 능력에 기인하여, 세포의 클로닝은 필요 없다.
시험관내-전사된 RNA (IVT-RNA)를 이용한 세포의 유전자 변형은 2개의 상이한 전략법을 이용하는 데, 그 둘 모두 다양한 동물 모델에서 성공적으로 시험되었다. 세포를 리포펙션 또는 전기천공에 의해 시험관내-전사된 RNA로 형질감염시킨다. 전달된 IVT-RNA의 발현을 연장시키기 위해서 다양한 변형을 이용하여 IVT-RNA를 안정화시키는 것이 바람직할 수 있다.
시험관내 전사를 위한 주형으로서 표준화된 방식으로 사용되고, 안정화된 RNA 전사체가 생산되도록 하는 방식으로 유전자 변형된 일부 IVT 벡터가 문헌에 공지되어 있다. 관련 기술분야에서 현재 사용되는 프로토콜은 하기 구조를 가진 플라스미드 벡터에 기초한다: RNA 전사가 가능한 5' RNA 폴리머라제 프로모터, 이어서, 비번역 영역 (UTR)이 3' 및/또는 5'에 플랭킹된, 관심 유전자, 및 50-70 A 뉴클레오티드를 함유하는 3' 폴리아데닐 카세트. 시험관내 전사에 앞서, 고리형 플라스미드는 타입 II 제한 효소 (인식 서열은 절단 부위에 상응한다)에 의해 폴리아데닐 카세트 하류에서 선형화된다. 따라서, 폴리아데닐 카세트는 전사체에서 후기 폴리(A) 서열에 상응한다. 본 절차의 결과로서, 일부 뉴클레오티드는 선형화 후에 효소 절단 부위의 부위로서 그대로 유지되고, 3' 단부의 폴리(A) 서열을 연장시키거나, 또는 차폐시킨다. 상기 비생리적 오버행이 세포내에서 상기 구축물로부터 생산되는 단백질의 양에 영향을 주는지 여부는 명확하지 않다.
또 다른 측면에서, RNA 구축물은 전기천공에 의해 세포 내로 전달된다. 예컨대, US 2004/0014645, US 2005/0052630A1, US 2005/0070841A1, US 2004/0059285A1, US 2004/0092907A1에 교시된 바와 같은, 핵산 구축물의 제제화, 및 핵산 구축물의 포유동물 세포 내로의 전기천공 방법을 참조한다. 전기장 강도를 비롯한, 임의의 공지된 세포 유형의 전기천공을 위해 요구되는 다양한 파라미터가 일반적으로 관련 연구 문헌 뿐만 아니라, 관련 기술분야의 다수의 특허 및 출원에 공지되어 있다. 예컨대, 미국 특허 번호 6,678,556, 미국 특허 번호 7,171,264, 및 미국 특허 번호 7,173,116을 참조한다. 예컨대, 메드펄서™ DNA 전기천공 요법 시스템(MedPulser™ DNA Electroporation Therapy System) (이노비오/진트로닉스(Inovio/Genetronics: 미국 캘리포니아주 샌디에고))과 같은 전기천공의 치료 적용을 위한 장치가 상업적으로 이용가능하고, 특허, 예컨대 미국 특허 번호 6,567,694; 미국 특허 번호 6,516,223, 미국 특허 번호 5,993,434, 미국 특허 번호 6,181,964, 미국 특허 번호 6,241,701, 및 미국 특허 번호 6,233,482에 기술되어 있고; 전기천공은 또한 예컨대, US20070128708A1에 기술되어 있는 바와 같이, 시험관내에서의 세포 형질감염을 위해 사용될 수 있다. 전기천공은 또한 시험관내에서 핵산을 세포 내로 전달하는 데에도 사용될 수 있다. 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 이용가능한 장치 및 전기천공 시스템 중 임의의 것을 이용하여, 발현 구축물을 포함하는 핵산을 세포 내로 전기천공-매개로 투여하는 것은 관심 RNA를 표적 세포로 전달하기 위한 흥미로운 새로운 수단을 제시한다.
일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, 만능성 줄기 세포, Treg)를, 외인성 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 핵산 분자 및 유전자 편집 작용제 (예컨대, Cas9/gRNA RNP)를 도입하기 전, 그 동안 및/또는 그 이후에 인큐베이션 또는 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, 만능성 줄기 세포, Treg)를 외인성 수용체를 코딩하는 핵산 분자 도입 이전, 그 동안 또는 그 이후에, 예컨대 외인성 수용체를 코딩하는 바이러스 벡터 (예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 이용한 세포의 형질도입 이전, 그 동안 또는 그 이후에 인큐베이션 또는 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, T 세포)를 유전자 편집 작용제 (예컨대, Cas9/gRNA RNP) 도입 이전, 그 동안 또는 그 이후에, 예컨대 세포와 상기 작용제의 접촉 이전, 그 동안 또는 그 이후에, 또는 예컨대, 전기천공을 통한 상기 작용제의 세포 내로의 전달 이전, 그 동안 또는 그 이후에 인큐베이션 또는 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 외인성 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 도입하는 것, 및 유전자 편집 작용제, 예컨대 Cas9/gRNA RNP를 도입하는 것과 관련하여, 둘 모두에서 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자 편집 작용제, 예컨대 Cas9/gRNA RNP를 도입하는 것은 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 도입한 이후에 진행된다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제를 도입하기 이전에, 예컨대 임의의 자극제 또는 활성화제를 제거함으로써 세포를 휴지시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제를 도입하기 이전에, 자극제 또는 활성화제 및/또는 시토카인을 제거하지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하나 이상의 핵산 서열 중 각각의 것이 숙주 세포 내로 도입되는 순서를 결정할 수 있을 것이다.
따라서, 세포 내로, NR3C1의 엑손 2에 indel을 생성하는 CRISPR 시스템을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 것인, 변형된 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 본 방법은 세포의 게놈 내로의 외인성 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자의 삽입을 추가로 포함하고, 여기서 삽입은 indel NR3C1의 부위에서 일어난다.
D. 핵산 및 발현 벡터
본 개시내용은 외인성 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산은 전사 제어 요소, 예컨대 프로모터, 및 인핸서 등에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 프로모터, 및 인핸서 요소는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
박테리아 세포에서의 발현을 위해, 적합한 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P 및 trc를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 진핵 세포에서의 발현을 위해, 적합한 프로모터는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소; 시토메갈로바이러스 최조기 프로모터; 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터; 조기 및 후기 SV40 프로모터; 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부에 존재하는 프로모터; 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터; 및 관련 기술분야에 공지된 다양한 조직 특이적 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 가역성 유도성 프로모터를 비롯한 적합한 가역성 프로모터는 관련 기술분야에 공지있다. 상기 가역성 프로모터는 다수의 유기체, 예컨대 진핵생물 및 원핵생물로부터 단리 및 유래될 수 있다. 예컨대, 제1 원핵생물 및 제2 진핵생물, 제1 진핵생물 및 제2 원핵생물 등과 같이, 제2 유기체에서 사용하기 위한 제1 유기체로부터 유래된 가역성 프로모터의 변형은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 상기 가역성 프로모터, 및 상기 가역성 프로모터에 기초할 뿐만 아니라, 추가의 제어 단백질을 포함하는 시스템은 알콜 조절된 프로모터 (예컨대, 알콜 데히드로게나제 I (alcA) 유전자 프로모터, 알콜 전사활성인자 단백질 (A1cR)에 반응성인 프로모터 등), 테트라시클린 조절된 프로모터, (예컨대, TetActivator, TetON, TetOFF를 포함하는 프로모터 시스템 등), 스테로이드 조절된 프로모터 (예컨대, 래트 글루코코르티코이드 수용체 프로모터 시스템, 인간 에스트로겐 수용체 프로모터 시스템, 레티노이드 프로모터 시스템, 갑상선 프로모터 시스템, 엑디손 프로모터 시스템, 미페프리스톤 프로모터 시스템 등), 금속 조절된 프로모터 (예컨대, 메탈로티오네인 프로모터 시스템 등), 발병-관련 조절된 프로모터 (예컨대, 살리실산 조절된 프로모터, 에틸렌 조절된 프로모터, 벤조티아졸 조절된 프로모터 등), 온도 조절된 프로모터 (예컨대, 열 충격 유도성 프로모터 (예컨대, HSP-70, HSP-90, 대두 열 충격 프로모터 등), 광 조절된 프로모터, 합성 유도성 프로모터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 CD8 세포-특이적 프로모터, CD4 세포-특이적 프로모터, 호중구-특이적 프로모터, 또는 NK-특이적 프로모터이다. 예를 들어, CD4 유전자 프로모터가 사용될 수 있고; 예컨대, 문헌 [Salmon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:7739]; 및 [Marodon et al. (2003) Blood 101:3416]을 참조한다. 또 다른 예로서, CD8 유전자 프로모터가 사용될 수 있다. NK 세포-특이적 발현은 NcrI (p46) 프로모터의 사용에 의해 달성될 수 있고; 예컨대, 문헌 [Eckelhart et al. Blood (2011) 117:1565]를 참조한다.
효모 세포에서의 발현을 위해 적합한 프로모터는 구성적 프로모터, 예컨대 ADH1 프로모터, PGK1 프로모터, ENO 프로모터, PYK1 프로모터 등; 또는 조절가능한 프로모터 예컨대, GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, ADH2 프로모터, PHOS 프로모터, CUP1 프로모터, GALT 프로모터, MET25 프로모터, MET3 프로모터, CYC1 프로모터, HIS3 프로모터, ADH1 프로모터, PGK 프로모터, GAPDH 프로모터, ADC1 프로모터, TRP1 프로모터, URA3 프로모터, LEU2 프로모터, ENO 프로모터, TP1 프로모터, 및 AOX1 (예컨대, 피치아(Pichia)에서 사용하는 경우)이다. 적절한 벡터 및 프로모터 선택은 충분히 관련 기술분야의 통상의 기술 수준 범위 내에 있다. 원핵성 숙주 세포에서 사용하는 데 적합한 프로모터는 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 프로모터; trp 프로모터; lac 오페론 프로모터; 하이브리드 프로모터, 예컨대 lac/tac 하이브리드 프로모터, tac/trc 하이브리드 프로모터, trp/lac 프로모터, T7/lac 프로모터; trc 프로모터; tac 프로모터 등; araBAD 프로모터; 생체내 조절된 프로모터, 예컨대 ssaG 프로모터 또는 관련 프로모터 (예컨대, 미국 특허 공개 번호 20040131637 참조), pagC 프로모터 ([Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol. (1991) 173(1): 86-93]; [Alpuche-Aranda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89(21): 10079-83]), nirB 프로모터 (Harborne et al. Mol. Micro. (1992) 6:2805-2813) 등 (예컨대, 문헌 [Dunstan et al., Infect. Immun. (1999) 67:5133-5141]; [McKelvie et al., Vaccine (2004) 22:3243-3255]; 및 [Chatfield et al., Biotechnol. (1992) 10:888-892] 참조); 시그마70 프로모터, 예컨대 컨센서스 시그마70 프로모터 (예컨대, 진뱅크 수탁 번호(GenBank Accession No.) AX798980, AX798961, 및 AX798183); 고정상 프로모터, 예컨대 dps 프로모터, spv 프로모터 등; 병원성 유전자균 SPI-2로부터 유래된 프로모터 (예컨대, WO96/17951 참조); actA 프로모터 (예컨대, 문헌 [Shetron-Rama et al., Infect. Immun. (2002) 70:1087-1096] 참조); rpsM 프로모터 (예컨대, 문헌 [Valdivia and Falkow Mol. Microbiol. (1996). 22:367] 참조); tet 프로모터 (예컨대, 문헌 [Hillen, W. and Wissmann, A. (1989) In Saenger, W. and Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein--Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162] 참조); SP6 프로모터 (예컨대, 문헌 [Melton et al., Nucl. Acids Res. (1984) 12:7035] 참조) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 원핵생물, 예컨대 에스케리키아 콜라이에서 사용하기에 적합한 강력한 프로모터는 Trc, Tac, T5, T7, 및 PLambda를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 박테리아 숙주 세포에서 사용하기 위한 오퍼레이터의 비-제한적인 예로는 락토스 프로모터 오퍼레이터 (락토스와의 접촉시, LacI 리프레서 단백질은 입체구조를 변화시키고, 이에 의해 Lad 리프레서 단백질이 오퍼레이터에 결합하지 못하게 막는다), 트립토판 프로모터 오퍼레이터 (트립토판과의 착물 형성시, TrpR 리프레서 단백질은 오퍼레이터에 결합하는 입체구조를 갖고; 트립토판 부재시, TrpR 리프레서 단백질은 오퍼레이터에 결합하지 않는 입체구조를 갖는다), 및 tac 프로모터 오퍼레이터 (예컨대, 문헌 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25] 참조)를 포함한다.
적합한 프로모터의 다른 예로는 최조기 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열을 포함한다. 상기 프로모터 서열은 그에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동시킬 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 시미안 바이러스 40 (SV40) 조기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 최조기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, EF-1 알파 프로모터 뿐만 아니라, 인간 유전자 프로모터, 예컨대 제한하는 것은 아니지만, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다른 구성적 프로모터 서열 또한 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명은 구성적 프로모터 사용으로 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터 사용은, 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 요구될 때, 그에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 작동시킬 수 있거나, 또는 발현이 유도되지 않을 때에는 발현 작동을 중단시킬 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예로는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라시클린 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 유전자좌 또는 적합한 프로모터를 함유하는 구축물 또는 트랜스진은 유도 시스템의 유도를 통해 비가역적으로 스위칭된다. 비가역적 스위치 유도에 적합한 시스템은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예컨대 비가역적 스위치의 유도는 Cre-lox-매개 재조합을 사용할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Fuhrmann-Benzakein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 28:e99] (상기 문헌의 개시내용은 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 관련 기술분야에 공지된 리콤비나제, 엔도뉴클레아제, 리가제, 재조합 부위 등의 임의의 적합한 조합이 비가역적으로 스위치가능한 프로모터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 본원 다른 곳에도 기술되어 있는, 부위-특이적 재조합 방법, 기전, 및 요건은 비가역적으로 스위칭된 프로모터 생성에도 사용됨을 알 수 있고, 이는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 문헌 [Grindley et al. Annual Review of Biochemistry (2006) 567-605]; 및 [Tropp, Molecular Biology (2012) (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, Mass.)] (상기 문헌들의 개시내용은 본원에서 참조로 포함된다)을 참조한다.
본 개시내용의 핵산은 발현 벡터 및/또는 클로닝 벡터 내에 존재할 수 있다. 발현 벡터는 선별가능한 마커, 복제 기점 및 벡터 복제 및/또는 유지를 제공하는 다른 특징을 포함할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 예컨대, 플라스미드, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고; 다수는 대상 재조합 구축물을 생성하는 데 상업적으로 이용가능하다. 예로서 하기의 벡터가 제공되며, 어느 방식으로든 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다: 박테리아: pBs, 파지스크립트, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (스트라타진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라호야)); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5 (파마시아(Pharmacia: 스웨덴 웁살라)). 진핵성: pWL네오, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (스트라타진) pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL (파마시아).
발현 벡터는 일반적으로 이종성 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위해 프로모터 서열 인근에 위치하는 가까운 제한 부위를 갖는다. 발현 숙주에서 작동성인 선별가능한 마커가 존재할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 바이러스 벡터 (예컨대, 백시니아 바이러스에 기초한 바이러스 벡터; 폴리오바이러스에 기초한 바이러스 벡터; 아데노바이러스에 기초한 바이러스 벡터 (예컨대, 문헌 [Li et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1994) 35: 2543-2549]; [Borras et al., Gene Ther. (1999) 6: 515-524]; [Li and Davidson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7700-7704]; [Sakamoto et al., H. Gene Ther. (1999) 5: 1088-1097]; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조); 아데노-연관 바이러스에 기초한 바이러스 벡터 (예컨대, 문헌 [Ali et al., Hum. Gene Ther. (1998) 9: 81-86], [Flannery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 6916-6921]; [Bennett et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1997) 38: 2857-2863]; [Jomary et al., Gene Ther. (1997) 4:683 690, Rolling et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10: 641-648]; [Ali et al., Hum. Mol. Genet. (1996) 5: 591-594]; [Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63: 3822-3828]; [Mendelson et al., Virol. (1988) 166: 154-165]; 및 [Flotte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 10613-10617] 참조); SV40; 단순 포진 바이러스에 기초한 바이러스 벡터; 인간 면역결핍 바이러스에 기초한 바이러스 벡터 (예컨대, 문헌 [Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 10319-23]; [Takahashi et al., J. Virol. (1999) 73: 7812-7816] 참조)에 기초한 바이러스 벡터; 레트로바이러스 벡터 (예컨대, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 예컨대, 라우스 육종 바이러스, 하베이 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유방 종양 바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
사용하기 적합한 추가의 발현 벡터로는 예컨대, 제한 없이, 렌티바이러스 벡터, 감마 레트로바이러스 벡터, 포말상 바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 조작된 하이브리드 바이러스 벡터, 트랜스포존 매개 벡터 등이 있다. 바이러스 벡터 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY)]에, 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 작용성인 복제 기점, 프로모터 서열, 가까운 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선별가능한 마커를 함유한다 (예컨대, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
본 발명의 벡터는 자기-불활성화 벡터일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "자기-불활성화 벡터"라는 용어는 3' LTR 인핸서 프로모터 영역 (U3 영역)이 (예컨대, 결실 또는 치환에 의해) 변형된 벡터를 지칭한다. 자기-불활성화 벡터는 바이러스 복제가 제1 라운드를 넘지 못하게 바이러스 전사를 막을 수 있다. 그 결과, 자기-불활성화 벡터는 감염 후, 이어서, 오직 단 한번만 숙주 게놈 (예컨대, 포유동물 게놈) 내로 통합될 수 있고, 추가로 전달되지 못한다. 따라서, 자기-불활성화 벡터는 복제 능력이 있는 바이러스를 생성할 위험을 크게 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 RNA, 예컨대 시험관내 합성된 RNA일 수 있다. RNA의 시험관내 합성 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고; 본 개시내용의 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 서열을 포함하는 RNA를 합성하는 데 임의의 공지 방법이 사용될 수 있다. RNA를 숙주 세포 내로 도입하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Zhao et al. Cancer Res. (2010) 15: 9053]을 참조한다. 본 개시내용의 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA를 숙주 세포로 도입하는 것은 시험관내 또는 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 (예컨대, Treg, NK 세포, 세포독성 T 림프구 등)는 시험관내 또는 생체외에서 본 개시내용의 칼시뉴린 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA로 전기천공될 수 있다.
폴리펩티드 또는 그의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입되는 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염시키고자 하는 발현 세포를 세포 집단으로부터 용이하게 식별 및 선별할 수 있도록 하기 위해 선별가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자, 또는 그 둘 모두를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선별가능한 마커는 별개의 DNA 조각 상에 보유될 수 있고, 공동-형질감염 방법에서 사용될 수 있다. 선별가능한 마커 및 리포터 유전자, 둘 모두 숙주 세포에서 발현 가능하도록 적절한 조절 서열과 플랭킹될 수 있다. 유용한 선별가능한 마커로는 제한 없이, 항생제-저항성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하는 데, 및 조절 서열의 기능성을 평가하는 데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에는 존재하지 않거나, 또는 그에 의해 발현되지 않고, 발현이 일부 쉽게 검출가능한 특성, 예컨대 효소 활성에 의해 표시될 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 평가된다. 적합한 리포터 유전자로는 제한 없이, 루시페라제를 코딩하는 유전자, 베타-갈락토시다제를 코딩하는 유전자, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자, 분비된 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 유전자, 또는 녹색 형광성 단백질 유전자를 포함할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]).
E. 세포 공급원
본 발명에 적합한 세포는 제한 없이, 나이브 세포, 이펙터 기억 세포, 중심 기억 세포, 줄기 중심 기억 세포, 이펙터 기억 세포, 및 장수 이펙터 기억 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 제한 없이, 면역 억제성 세포, 예컨대 조절 T 세포 (Treg), (예컨대, IL-10 또는 TGF-β의 분비를 통해) 직접적으로 면역 억제성이 되도록 변형된 비-Treg, 및 간접적으로 면역 억제성이 되도록 변형된 비-Treg (예컨대, 항원 제시 세포 (APC)를 사멸시키는 세포독성 T 림프구 (CTL))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 제한 없이, 수지상 세포, 골수양 유래 억제 세포, 면역조절 대식세포, 중간엽 줄기 세포, 다능성 성체 전구 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능성 줄기 세포, 선천 림프양 세포, 불변 자연 살해 (NK) T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 조혈 세포 및 그의 전구체 세포를 포함한다.
확장 전, 면역 세포의 공급원은 생체외 조작을 위해 대상체로부터 수득된다. 생체외 조작을 위한 표적 세포의 공급원으로는 또한 예컨대, 자가유래 또는 이종성 공여자 혈액, 제대혈, 또는 골수를 포함한다. 예를 들어, 면역 세포의 공급원은 본 발명의 변형된 면역 세포로 치료하고자 하는 대상체로부터의 것, 예컨대 대상체 혈액, 대상체의 제대혈, 또는 대상체의 골수일 수 있다. 대상체의 비-제한적인 예로는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 그의 트랜스제닉 종을 포함한다. 바람직하게, 대상체는 인간이다.
면역 세포는 혈액, 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 비장 조직, 제대, 림프, 또는 림프양 기관을 비롯한, 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 면역 세포는 면역계의 세포, 예컨대 선천 또는 적응 면역의 세포, 예컨대 골수양 또는 림프양 세포, 예컨대 림프구, 전형적으로, T 세포 및/또는 NK 세포이다. 다른 예시적인 세포로는 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 세포 (ESC) 및 유도 만능성 줄기 세포 (iPSC)를 비롯한, 다능성 및 만능성 줄기 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 세포는 인간 세포이다. 치료하고자 하는 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가유래 세포일 수 있다. 세포는 전형적으로, 1차 세포, 예컨대 대상체로부터 직접 단리된 것 및/또는 대상체로부터 단리되고, 냉동된 것이다.
특정 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포 (예컨대, CD8+ 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 또는 이펙터 기억 T 세포), CD4+ T 세포, 자연 살해 T 세포 (NKT 세포), 조절 T 세포 (Treg), 줄기 세포 기억 T 세포, 림프양 전구 세포 조혈 줄기 세포, 자연 살해 세포 (NK 세포) 또는 수지상 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 단핵구 또는 과립구, 예컨대 골수양 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, 및/또는 호염구이다. 한 실시양태에서, 표적 세포는 유도 만능성 줄기 (iPS) 세포 또는 iPS 세포로부터 유래된 세포, 예컨대 대상체로부터 생성된, 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 변경하도록 (예컨대, 발현에 돌연변이를 유도하도록), 또는 조작하도록 조작되고, 예컨대 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포 (예컨대, CD8+ 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 또는 이펙터 기억 T 세포), CD4+ T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 림프양 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포로 분화된 iPS 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 T 세포 또는 다른 세포 유형의 하나 이상의 하위세트, 예컨대 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 그의 하위집단, 예컨대 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화능, 확장, 재순화, 국재화, 및/또는 지속 능력, 항원 특이성, 항원 수용체 유형, 특정 기관 또는 구획 존재, 마커 또는 시토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화 정도에 의해 정의되는 것을 포함한다. T 세포의, 및/또는 CD4+ T 세포의, 및/또는 CD8+ T 세포의 하위유형 및 하위집단 중에는 나이브 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 기억 T 세포 및 그의 하위유형, 예컨대 줄기 세포 기억 T (TSCM), 중심 기억 T (TCM), 이펙터 기억 T (TEM), 또는 최종적으로 분화된 이펙터 기억 T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막 연관 불변 T (MAIT) 세포, 자연 발생 및 적응 조절 T (Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다. 특정 실시양태에서, 관련 기술분야에사 이용가능한 임의 개수의 T 세포주도 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 대상체로부터 면역 세포를 단리시키는 단계, 면역 세포를 프로세싱, 배양, 및/또는 조작하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포 제조는 1회 이상의 배양 및/또는 제조 단계를 포함한다. 기술된 바와 같이 조작하기 위한 세포는 샘플, 예컨대 생물학적 샘플, 예컨대 대상체로부터의 수득, 또는 그로부터 유래된 것으로 단리된 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포의 단리 기점이 되는 대상체는 질환 또는 병태를 앓고 있거나, 또는 세포 요법을 필요로 하거나, 또는 세포 요법이 투여될 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 특정 치료 개입, 세포가 그를 위해 단리, 프로세스 및/또는 조작되는 것인 입양 세포 요법을 필요로 하는 인간이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 세포는 1차 세포, 예컨대 1차 인간 세포이다. 샘플은 조직, 체액, 및 대상체로부터 직접 채취된 다른 샘플 뿐만 아니라, 예컨대 분리, 원심분리, 유전자 조작 (예컨대, 바이러스 벡터 형질도입), 세척, 및/또는 인큐베이션과 같은, 하나 이상의 프로세싱 단계로부터 생성된 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득된 샘플, 또는 프로세싱된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플로는 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플 (그로부터 유래된 프로세싱된 샘플 포함)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 세포의 유래 또는 단리 기점이 된 샘플은 혈액 또는 혈액-유래 샘플이거나, 또는 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 생성물이거나, 또는 그로부터 유래된 것이다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 연관 림프양 조직, 점막 연관 림프양 조직, 비장, 다른 림프양 조직, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 골, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도선, 또는 다른 기관, 및/또는 그로부터 유래된 세포를 포함한다. 세포 요법, 예컨대 입양 세포 요법과 관련하여, 샘플은 자가유래 및 동종이계 공급원으로부터 유래된 샘플을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 세포주, 예컨대 T 세포주로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 이종 공급원, 예를 들어, 마우스, 래트, 비-인간 영장류, 및 돼지로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 세포 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비-친화성 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 예에서, 세포는 예를 들어, 원치않는 성분을 제거하기 위해, 원하는 성분을 풍부화하기 위해, 특정 시약에 감수성인 세포를 용해 또는 제거하기 위해, 하나 이상의 시약의 존재하에서 세척, 원심분리, 및/또는 인큐베이션된다. 일부 예에서, 세포는 하나 이상의 특성, 예컨대 밀도, 부착 특성, 크기, 특정 성분에 대한 감수성 및/또는 저항성에 기초하여 분리된다.
일부 예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는 예컨대, 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 수득된다. 일부 측면에서, 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포를 비롯한 림프구, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및/또는 혈소판을 함유하고, 일부 측면에서, 적혈구 및 혈소판 이외이 다른 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터 수집된 혈액 세포를 세척하여 예를 들어 혈장 분획을 제거하고, 후속 프로세싱 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지 중에 세포를 배치한다. 일부 실시양태에서, 세포를 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)로 세척한다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조사의 설명서에 따라 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 세포는 세척 후 다양한 생체적합성 완충제 중에 재현탁된다. 특정 실시양태에서, 혈액 세포 샘플의 성분은 제거되고, 세포는 배양 배지 중에 직접 재현탁된다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 밀도 기반 세포 분리 방법, 예컨대 적혈구 용해 및 퍼콜(Percoll) 또는 피콜(Ficoll) 구배를 통한 원심분리에 의해 말초 혈액으로부터 백혈구를 제조하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 면역 세포는 개체의 순환 혈액으로부터 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 수득된다. 성분채집술 생성물은 전형적으로, T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포를 비롯한 림프구, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 후속 프로세싱 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지, 예컨대 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) 중에 세포를 배치할 수 있거나, 세척액은 칼슘을 함유하지 않고, 마그네슘을 함유하지 않을 수 있거나, 또는 모든 2가 양이온이 아닐 경우, 다수를 함유하지 않을 수 있다. 세척 후, 세포를 다양한 생체적합성 완충제, 예컨대 예를 들어, Ca-무함유, Mg-무함유 PBS 중에 재현탁시킬 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플의 비바람직한 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지 중에 직접 재현탁시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리 방법은 하나 이상의 특이적 분자, 예컨대 표면 마커, 예컨대 표면 단백질, 세포내 마커, 또는 핵산의 발현, 또는 그의 세포내 존재에 기초하여 상이한 세포 유형을 분리하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 마커에 기초하여 수행되는 임의의 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분리는 친화성- 또는 면역친화성 기반 분리이다. 예를 들어, 일부 측면에서, 단리는 예를 들어, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와 함께 인큐베이션시킨 후, 일반적으로는 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너에 결합 세포를 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 못한 세포로부터 분리함으로써 하나 이상의 마커, 전형적으로, 세포 표면 마커의 세포 발현 또는 발현 수준에 기초하여 세포 및 세포 집단을 분리하는 것을 포함한다.
상기 분리 단계는, 시약에 결합된 세포가 추후 사용을 위해 보유되는 것인 양성 선택, 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 못한 세포가 보유되는 것인 음성 선택에 기초할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획 모두 추후 사용을 위해 보유된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 어떤 항체도 이용가지 않을 때 특히 유용할 수 있으며, 이에 의해 분리는 원하는 집단 이외의 다른 세포에 의해 발현되는 마커에 기초하여 가장 잘 수행된다. 분리는 특정 마커를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포를 100% 풍부화 또는 제거할 필요는 없다. 예를 들어, 특정 유형의 세포, 예컨대 마커를 발현 세포의 양성 선택 또는 풍부화란, 상기 세포의 개수 또는 비율을 증가시키는 것을 지칭하지만, 마커를 발현하지 않는 세포가 완전히 부재하도록 할 필요는 없다. 유사하게, 특정 유형의 세포, 예컨대 마커를 발현 세포의 음성 선택, 제거, 고갈은 상기 세포의 개수 또는 비율을 감소시키는 것을 지칭하지만, 상기 세포 모두가 완전히 제거될 필요는 없다.
일부 예에서, 한 단계로부터 양성 또는 음성 선택된 분획에서 또 다른 분리 단계, 예컨대 후속 양성 또는 음성 선택이 수행되는, 다회 라운드의 분리 단계가 수행된다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는 예컨대, 각각이 음성 선택을 위해 표적화된 마커에 특이적인 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션시킴으로써 동시에 다중 마커를 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 유사하게, 다중 세포 유형은 다양한 세포 유형에서 발현된 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션시킴으로써 동시에 양성 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, T 세포 집단 중 하나 이상의 것이 하나 이상의 특정 마커, 예컨대 표면 마커에 대하여 양성이거나 (마커+), 또는 그를 높은 수준으로 발현하는 (마커고) 세포, 또는 하나 이상의 마커에 대하여 양성이거나 (마커-), 또는 그를 비교적 낮은 수준으로 발현하는 (마커저) 세포에 대해 풍부화되거나, 또는 고갈된다. 예를 들어, 일부 측면에서, T 세포의 특정 하위집단, 예컨대 하나 이상의 표면 마커, 예컨대 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포에 대해 양성이거나, 또는 그를 높은 수준으로 발현하는 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다. 일부 경우에, 상기 마커는 특정 T 세포 집단 (예컨대, 비-기억 세포)에는 부재 또는 비교적 낮은 수준으로 발현되지만, 특정의 다른 T 세포 집단 (예컨대, 기억 세포)에는 존재 또는 비교적 더 높은 수준으로 발현되는 것이다. 한 실시양태에서, 세포 (예컨대, CD8+ 세포 또는 T 세포, 예컨대 CD3+ 세포)는 CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD 127, 및/또는 CD62L에 대해 양성이거나, 또는 그를 높은 표면 수준으로 발현하는 세포에 대해 풍부화되고/거나 (즉, 그에 대해 양성으로 선택되고/거나), CD45RA에 대해 양성이거나, 또는 높은 표면 수준으로 발현하는 세포는 고갈된다 (즉, 그에 대해 음성으로 선택된다). 일부 실시양태에서, 세포는 CD 122, CD95, CD25, CD27, 및/또는 IL7-Ra (CD 127)에 대해 양성이거나, 또는 높은 표면 수준으로 발현하는 세포는 풍부화되거나, 또는 그는 고갈된다. 일부 예에서, CD8+ T 세포는 CD45RO에 대해 양성 (또는 CD45RA에 대해 음성) 및 CD62L에 대해 양성인 세포에 대해 풍부화된다. 예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 적합된 자기 비드 (예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 세포 익스팬더(T Cell Expander))를 이용하여 양성으로 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, T 세포는 비-T 세포, 예컨대 B 세포, 단핵구, 또는 다른 백혈구 상에 발현된 마커, 예컨대 CD14의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계를 사용하여 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리한다. 상기 CD4+ 및 CD8+ 집단은 하나 이상의 나이브, 기억, 및/또는 이펙터 T 세포 하위집단 상에서 발현되거나, 또는 비교적 더 높은 정도로 발현되는 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위집단으로 추가로 분류될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD8+ 세포는 예컨대, 각 하위집단과 연관된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해 나이브, 중심 기억, 이펙터 기억, 및/또는 중심 기억 줄기 세포에 대해 추가로 풍부화되거나, 또는 그는 고갈된다. 일부 실시양태에서, 중심 기억 T (TCM) 세포에 대한 풍부화는 효능을 증가시키기 위해, 예컨대 투여 후 장기간 생존, 확장, 및/또는 생착을 개선시키기 위해 수행되며, 일부 측면에서, 상기 효능은 상기 하위집단에 트기 강건하다. 일부 실시양태에서, TCM 풍부화 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 조합은 효능을 추가로 증강시킨다.
실시양태에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 하위세트, 둘 모두에 존재한다. PBMC는 예컨대, 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 이용하여 CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획에 대해 풍부화되거나, 또는 그는 고갈될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD4+ T 세포 집단 및 CD8+ T 세포 하위집단, 예컨대 중심 기억 (TCM) 세포에 대해 풍부화된 하위집단. 일부 실시양태에서, 중심 기억 T (TCM) 세포에 대한 풍부화는 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD127에 대한 양성 또는 그의 높은 표면 발현에 기초하고; 일부 측면에서, 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현하거나, 또는 높게 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기초한다. 일부 측면에서, TCM 세포에 대해 풍부화된 CD8+ 집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈에 의해, 또는 CD62L를 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 풍부화에 의해 수행된다. 한 측면에서, 중심 기억 T (TCM) 세포에 대한 풍부화는 CD4 발현에 기초하여 선택되는 세포의 음성 분획으로부터 출발하여 수행되고, 그에 대해 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초하는 음성 선택, 및 CD62L에 기초한 양성 선택이 수행된다. 일부 측면에서, 상기 선택은 동시에 수행되고, 다른 측면에서는 임의 순서도 순차적으로 수행된다. 일부 측면에서, CD8+ 세포 집단 또는 하위집단을 제조하는 데 사용된 동일 CD4 발현 기반 선택 단계는 또한 CD4+ 세포 집단 또는 하위집단을 생성하는 데에도 사용되고, 이에 의해 CD4 기반 분리로부터의 두 양성 및 음성 분획 모두 보유되고, 임의적으로는 1회 이상의 추가 양성 또는 음성 선택 단계 후에, 본 방법의 후속 단계에서 사용된다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 식별함으로써 나이브, 중심 기억, 및 이펙터 세포로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및CD45RO+이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO이다. 한 예에서, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포에 대해 풍부화시키기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로, CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위해 세포를 분리할 수 있도록 하기 위하여 고체 지지체 또는 매트릭스, 예컨대 자기 비드 또는 파라자기 비드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 세포는 유전자 조작 이전에 또는 그와 관련하여 인큐베이션 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양(culture), 배양(cultivation), 자극, 활성화, 및/또는 증식을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재하에서 인큐베이션된다. 상기 조건으로는 집단에서 세포의 증식, 확장, 활성화, 및/또는 생존을 유도하도록, 항원 노출을 모방하도록, 및/또는 유전자 조작을 위해, 예컨대 재조합 항원 수용체의 도입을 위해 세포를 프라이밍하도록 디자인된 조건을 포함한다. 상기 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예컨대 영양소, 아미노산, 항생제, 이온, 및/또는 자극성 인자, 예컨대 시토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포를 활성화시키도록 디자인된 임의의 다른 작용제 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자극 조건 또는 자극제는 TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 작용제, 예컨대 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 작용제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 캐스케이드를 작동시키거나, 또는 개시한다. 상기 작용제는 예컨대, TCR 성분 및/또는 공동 자극성 수용체, 예컨대 항-CD3, 항-CD28, 예를 들어, 고체 지지체, 예컨대 비드에 결합된 것, 및/또는 하나 이상의 시토카인에 대해 특이적인 항체와 같은 항체를 포함할 수 있다. 임의적으로, 확장 방법은 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 배양 배지에 (예컨대, 적어도 약 0.5 ng/ml의 농도로) 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자극제는 IL-2 및/또는 IL-15, 예를 들어, 적어도 약 10 유닛/mL 농도로 IL-2를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, T 세포는 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의한 것과 같이, 적혈구를 용해시키고, 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액으로부터 단리된다. 대안적으로, T 세포는 제대로부터 단리될 수 있다. 어느 경우에서든, T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다.
그렇게 단리된 제대혈 단핵 세포는 CD34, CD8, CD14, CD19, 및 CD56을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 특정 항원을 발현하는 세포가 고갈될 수 있다. 이들 세포의 고갈은 단리된 항체, 항체를 포함하는 생물학적 샘플, 예컨대 복수, 물리적 지치체에 결합된 항체, 및 세포 결합 항체를 이용하여 달성될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단 풍부화는 음성적으로 선택되는 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직한 방법은 음성적으로 선택되는 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 모노클로날 항체의 칵테일을 이용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포에 대해 풍부화시키기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로, CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다.
양성 또는 음성 선택에 의해 원하는 세포 집단을 단리시키기 위한 세포 및 표면 (예컨대, 입자, 예컨대 비드) 농도는 달라질 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포와 비드가 확실하게 최대로 접촉할 수 있도록 비드와 세포를 함께 혼합하는 부피를 유의적으로 감소시키는 것 (즉, 세포 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 20억 개의 세포/ml 농도가 사용된다. 한 실시양태에서, 10억 개의 세포/ml 농도가 사용된다. 추가 실시양태에서, 1억 개 세포/ml 초과의 농도가 사용된다. 추가 실시양태에서, 1,000만, 1,500만, 2,000만, 2,500만, 3,000만, 3,500만, 4,000만, 4,500만, 또는 5,000만 개의 세포/ml인 세포 농도가 사용된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 7,500만, 8,000만, 8,500만, 9,000만, 9,500만, 1억 개의 세포/ml인 세포 농도가 사용된다. 추가 실시양태에서, 1억 2,500만 또는 1억 5,000만 개의 세포/ml인 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용함으로써 세포 수율 증가, 세포 활성화, 및 세포 확장을 일으킬 수 있다.
T 세포는 또한 세척 단계 후 냉동될 수 있고, 이는 단핵구 제거 단계를 필요로 하지 않는다. 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 냉동 및 이어지는 해동 단계는 세포 집단에서 과립구를 제거하고, 단핵구도 어느 정도 제거함으로써 더욱 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포를 냉동 용액 중에 현탁될 수 있다. 다수의 냉동 용액 및 파라미터가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이와 관련해서 유용하겠지만, 비-제한적인 예에서, 한 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 냉동 배지를 사용하는 것을 포함한다. 이어서, 세포를 분당 1℃의 비율로 -80℃까지 냉동시키고, 액체 질소 보관 탱크의 증기상에서 보관한다. -20℃에서 또는 액체 질소에서 비제어 방식으로 급냉시키는 것 이외에도, 제어 방식의 다른 냉동 방법도 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, T 세포 집단은 세포, 예컨대 말초 혈액 단핵 세포, 제대혈 세포, 정제된 T 세포 집단, 및 T 세포주 내에 포함되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 말초 혈액 단핵 세포는 T 세포 집단을 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 정제된 T 세포는 T 세포 집단을 포함한다.
특정 실시양태에서, T 조절 세포 (Treg)는 샘플로부터 단리될 수 있다. 샘플은 제대혈 또는 말초 혈액을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, Treg는 유세포 분석법 분류에 의해 단리된다. 샘플은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 단리 이전에 Treg에 대해 풍부화될 수 있다. 단리된 Treg는 사용 전 냉동보존되고/거나, 확장될 수 있다. Treg를 단리시키는 방법은 미국 특허 번호 7,754,482, 8,722,400, 및 9,555,105, 및 미국 특허 출원 번호 13/639,927 (상기 특허들의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
F. 세포 확장
세포 변형 이전이든 그 이후이든 상관없이, 세포, 예컨대 면역 세포는 예를 들어, 미국 특허 번호 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 공개 번호 20060121005에 기술된 방법을 사용하여 활성화되고, 수적으로 확장될 수 있다.
Treg 세포 확장 방법의 예는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 자기 비드 또는 나노입자에 흡착된, 자극성 항체, 보편적으로는 항-CD3 및 항-CD28의 사용 및 자극성 시토카인 (보편적으로는 IL-2, IL-15 및 IL-4로 이루어진 군으로부터의 것)의 사용; 자극성 항체, 보편적으로는 항-CD3 및 항-CD28의 사용, 자기 비드 또는 나노입자에 흡착된 자극성 항체에 특이적인 리간드 사용 및 자극성 시토카인 (보편적으로는 IL-2, IL-15 및 IL-4로 이루어진 군으로부터의 것)의 사용; 세포 배양 베쓸의 표면 상에 코팅된 자극성 항체, 보편적으로는 항-CD3 및 항-CD28의 사용 및 자극성 시토카인 (보편적으로는 IL-2, IL-15 및 IL-4로 이루어진 군으로부터의 것)의 사용; 및 WO2006/108882 (본원에서 참조로 포함)에 기술된 바와 같은 피더 세포 사용을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. T 세포를 조절 T 세포로 분화시키는 방법의 예는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 제한 없이, 라파마이신, 덱사메타손, IL-10, IFN-알파, 관용성 항원 제시 세포 예컨대, 수지상 세포 등에의 노출을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조절 T 세포는 문헌 [Wakkach et al. (Immunity 2003 May; 18(5):605-17)]에 기술되어 있고, a) 대상체로부터 전구 세포 집단을 단리시키는 단계; b) (배양 배지 중 50 내지 250 U/ml 범위의 농도로, 바람직하게, 100 U/ml로) IL-10 존재하에 전구 세포 집단을 배양함으로써 수지상 세포 집단을 수득하는 단계; c) 특이적 항원의 존재하에 단계 b)의 세포를 대상체로부터 단리된 CD4+ T 림프구 집단과 접촉시켜 상기 항원에 대한 CD4+ T 세포를 조절 T 세포 집단으로 분화시키는 단계; 및 d) 단계 c)로부터 조절 T 세포 집단을 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 본 방법은 또한 단계 b)의 DC 대신 덱사메타손 및 비타민 D3, 또는 관용화된 또는 미성숙 DC를 사용함으로써도 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조절 T 세포는 특허 US6746670에 기술되고, a) 배지 중 대상체로부터 단리된, 특이적 항원에 대한 CD4+ T 세포 집단을 적절한 양의 IFN-알파 (바람직하게, 5 ng/ml 배양 배지)와 함께 배양하는 단계; 및 b) 조절 T 세포 집단을 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 단계 a)에서, 배지는 적절한 양의 IL-10, 바람직하게, 100 U/ml의 것을 추가로 포함할 수 있다. 단계 b)에서, 조절 T 세포 집단은 증식을 위해, 바람직하게는, 배지 중에 5 ng/ml IL-15로 존재하는 IL-15를 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조절 T 세포는 특허 출원 WO02/092793에 기술되어 있고, a) 시험관내에서 인공 항원 제시 세포에 의해 제시되는 특이적 항원의 존재하에 CD4+ T 세포 집단을 활성화시키는 단계; 및 b) 적어도 10%의 조절 T 세포를 포함하는 활성화된 CD4+ T 세포를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인공 항원 제시 세포는 HLA II 시스템 분자 및 인간 LFA-3 분자를 발현하고, 공동-자극 분자 B7-1, B7-2, B7-H1, CD40, CD23 및 ICAM-I은 발현하지 못한다.
일부 실시양태에서, 조절 T 세포는 문헌 [Groux et al. (Nature 1997, 389(6652):737-42)]에 기술되어 있고, a) 시험관내에서 특이적 항원 및 적절한 양의 IL-10 (바람직하게, 100 U/ml 배양 배지)의 존재하에 CD4+ T 세포 집단을 활성화하는 단계; 및 b) 조절 T 세포 집단을 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게, IL-10은 배지 중에 존재한다.
일부 실시양태에서, 조절 T 세포는 특허 출원 WO2007/010406에 기술되어 있고, a) 백혈구 집단 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 집단을 특이적 항원으로 자극시키는 단계; b) 자극받은 집단으로부터 항원-특이적 Treg 세포 집단을 회수하는 단계; 및 c) 임의적으로 항원-특이적 Treg 세포 집단을 확장시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다.
예를 들어 미국 특허 번호 9,228,172 및 미국 공개 번호 US201601571471A1에 기술된 바와 같은, 비-Treg 집단으로부터 Treg의 생성을 유도하는 것을 비롯한, 조절 T 세포를 수득하는 다른 방법도 관련 기술분야에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 생체외 배양-확장된 조절 T 세포는 미국 특허 번호 7,651,855, 8,129,185, 및 9,181,526에 기술된 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절 T 세포는 미국 특허 번호 9,273,282, 및 9,187,727에 기술된 바와 같이, 제대혈로부터 수득된 세포 집단으로부터 단리될 수 있다. 조절 T 세포를 확장시키는 방법 또한 미국 공개 번호 20130101567에 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, Treg는 미국 특허 번호 9,228,172 및 미국 공개 번호 20160151471에 기술된 방법에 따라 비-Treg를 Treg로 전환시킴으로써 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절 T 세포는 미국 특허 번호 9,644,179 및 미국 공개 번호 20170211042에 기술된 방법에 따라 T 세포를 Treg로 전환시킴으로써 수득될 수 있다.
백혈구는 그의 중요도, 그의 분포, 그의 개수, 그의 수명 및 그의 잠재능을 특징으로 하는 여러 유형의 세포를 포함한다. 이러한 유형으로는 하기: 다핵 또는 과립 백혈구 (그 중에 호산구성, 호중구성 및 호염기성 백혈구가 존재한다), 단핵 세포, 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) (이는 큰 백혈구이다)가 있고, 면역계의 주요 세포 유형 (림프구 및 단핵구)으로 구성된다. 백혈구 또는 PBMC는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지된 임의의 방법에 의해 말초 혈액으로부터 분리될 수 있다. 이롭게는, PBMC 분리를 위해, 원심분리, 바람직하게, 밀도 구배 원심분리, 바람직하게, 불연속 밀도 구배 원심분리가 사용될 수 있다. 대안은 특이적 모노클로날 항체를 사용하는 것이다. 특정 실시양태에서, PBMC는 전형적으로, 표준 방법을 이용하여 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)에 의해 전혈 생성물로부터 단리된다. 다른 실시양태에서, PBMC는 백혈구성분채집술에 의해 회수된다.
일부 실시양태에서, 조절 T 세포는 a) 특이적 항원의 존재하에 백혈구 집단 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 집단을 중간엽 줄기 세포와 함께 배양하고; b) Treg 세포 집단을 회수함으로써 수득될 수 있다. 상기 방법은 또한 PBMC 또는 백혈구 대신 나이브 또는 기억 T 세포를 이용하여 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, Treg 세포는 IL-2 및 TGF-베타의 존재하에서 T 세포를 배양함으로써 수득될 수 있다 (Davidson et al. The Journal of Immunology, 2007, 178:4022-4026). 또 다른 실시양태에서, Treg 세포는 TGF-베타의 존재하에서 T 세포를 배양함으로써 수득될 수 있다
본원에 개시된 방법에 의해 세포를 확장하면 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배, 9000배, 10,000배, 100,000배, 1,000,000배, 10,000,000배, 또는 그 초과, 및 그 사이의 임의의 모든 정수 또는 분수 값만큼 증폭될 수 있다.
배양 후, 세포를 일정 기간 동안, 또는 세포가 세포를 또 다른 배양 장치로 계대접종하기 전, 전면생장, 또는 최적의 계대접종을 위한 높은 세포 밀도에 도달할 때까지 배양 장치 중 세포 배지에서 인큐베이션시킬 수 있다. 배양 장치는 시험관내에서 세포를 배양하는 데 보편적으로는 사용되는 임의의 배양 장치일 수 있다. 바람직하게, 세포를 또 다른 배양 장치로 계대접종하기 전, 전면생장 수준은 70% 이상이다. 더욱 바람직하게, 전면생장 수준은 90% 이상이다. 일정 기간은 시험관내에서 세포를 배양하는 데 적합한 임의의 시간일 수 있다. 세포 배지는 세포 배양 동안 어느 시점에든 교체될 수 있다. 바람직하게, 세포 배지는 약 매 2 내지 3일마다 교체된다. 이어서, 세포는 배양 장치로부터 수거되고, 여기서 세포는 즉시 사용될 수 있거나, 또는 추후 사용을 위해 냉동보존으로 보관될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 확장된 세포를 냉동보존하는 것을 포함한다. 냉동보존된 세포는 핵산을 세포 내로 도입하기 이전에 해동된다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 세포를 단리시키고, 세포를 확장시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 확장 전 세포를 냉동보존시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 냉동보존된 세포는 키메라 막 단백질을 코딩하는 RNA로의 전기천공을 위해 해동된다.
본원에 기술된 바와 같은 배양 단계 (본원에 기술된 바와 같은 작용제와 접촉 또는 전기천공 후의 배양 단계)는 매우 단기간 동안, 예를 들어, 24시간 미만, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간 동안 진행될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 배양 단계 (본원에 기술된 바와 같은 작용제와 접촉인 배양 단계)는 더욱 긴 장기간 동안, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 또는 그 초과로 진행될 수 있다.
배양에서 세포를 기술하는 데 다양한 용어가 사용된다. 세포 배양물이란, 일반적으로 살아있는 유기체로부터 채취되고, 제어된 조건하에 성장시키는 세포를 지칭한다. 1차 세포 배양물은 유기체로부터 직접 채취되고, 제1 계대배양 이전인, 세포, 조직, 또는 기관의 배양물이다. 세포는 세포 성장 및/또는 분열을 촉진시키는 조건하에 성장 배지 중에 위치할 때 배양물 중에서 확장되고, 이에 의해 더욱 큰 세포 집단이 생성된다. 세포가 배양물 중에서 확장될 때, 세포 증식률은 전형적으로, 다르게는 배가 시간으로도 공지된, 세포가 수적으로 2배가 되는 데 소요되는 시간량에 의해 측정된다.
각 라운드의 계대배양을 계대접종으로 지칭한다. 세포가 계대배양될 때, 이는 계대접종된 것으로 지칭된다. 세포, 또는 세포주의 특정 집단은 종종 그가 계대접종된 횟수로 지칭되거나, 또는 그를 특징으로 한다. 예를 들어, 10회 계대접종된, 배양된 세포 집단은 P10 배양물로서 지칭될 수 있다. 1차 배양물, 즉, 조직으로부터의 세포 단리 후의 제1 배양물은 P0으로 지정된다. 제1 계대배양 후, 세포는 2차 배양물 (P1 또는 계대접종물 1)로서 기술된다. 제2 계대배양 후, 세포는 3차 배양물 (P2 또는 계대접종물 2)이 되고, 그 다음도 이와 같다. 계대접종 기간 동안 다수 집단은 배가될 수 있고; 그러므로, 배양물의 집단 배가 수는 계대접종 수보다 크다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 계대접종 사이의 시간 동안 세포 확장 (즉, 집단 배가 수)은 시딩 밀도, 기질, 배지, 및 계대접종 사이의 시간을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다수의 인자에 의존한다.
한 실시양태에서, 세포는 수시간 (약 3시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 시간상의 정수 값인 기간 동안 배양될 수 있다. Treg 세포 배양에 적절한 조건은 증식 및 생존능에 필요한 인자 및/또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 공지된 세포 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 함유할 수 있는 적절한 배지를 포함한다. 세포 성장을 위한 다른 첨가제로는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 배지는, 아미노산, 피루브산 나트륨, 및 비타민이 첨가되고, 무혈청이거나, 또는 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트, 및/또는 Treg의 성장 및 확장을 위해 충분한 양의 시토카인(들)이 보충된, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-비보(X-Vivo) 15, 및 X-비보 20, 옵티마이저(Optimizer)를 포함할 수 있다. 항생제, 예컨대 페니실린 및 스트렙토마이신은, 대상체 내로 주입되는 세포 배양물이 아닌, 오직 실험 배양물에만 포함된다. 표적 세포는 성장을 지지하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도 (예컨대, 37℃) 및 대기 (예컨대, 대기 + 5% CO2)하에서 유지된다.
본원에 개시된 방법에 의해 단리된 세포는 대략 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배, 9000배, 10,000배, 100,000배, 1,000,000배, 10,000,000배, 또는 그 초과로 확장될 수 있다. 한 실시양태에서, Treg는 약 20배 내지 약 50배, 또는 그초과의 범위로 확장된다. 한 실시양태에서, 인간 T 조절 세포는 항-CD3 항체 코팅된 KT64.86 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 통해 확장된다. Treg를 확장 및 활성화시키는 방법은 본원에 기술되어 있다.
한 실시양태에서, Treg를 확장시키는 방법은 추가 적용을 위해 확장된 Treg를 단리시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 확장 방법은 확장된 Treg의 후속 전기천공 후, 이어서, 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 후속 전기천공은 예컨대, 확장된 Treg를 형질도입하거나, 확장된 Treg를 형질감염시키거나, 또는 확장된 Treg를 핵산으로 전기천공시키는 것과 같이, 작용제를 코딩하는 핵산을 확장된 Treg 집단으로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 작용제는 Treg를 추가로 자극시킨다. 작용제는 예컨대, 추가 확장, 또는 기능을 자극시킴으로써 Treg를 자극시킬 수 있다.
G. 치료 방법
본원에 기술된 변형된 세포 (예컨대, Treg)는 면역요법, 특히, 억제 면역요법용 조성물에 포함될 수 있다. 조성물은 제약 조성물을 포함할 수 있고, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 치료 유효량의, 변형된 세포를 포함하는 제약 조성물이 투여될 수 있다
한 측면에서, 본 발명은 입양 세포 전달 요법을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 변형된 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 입양 세포 전달 요법을 위한 방법을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 대상체에게 변형된 T 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 포함한다.
질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 대상체에게 유전자 편집된 변형된 세포 (예컨대, 유전자 편집된 변형된 Treg, 유전자 편집된 변형된 Teff)를 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 또한 포함한다. 한 실시양태에서, 질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법은 대상체에게 본 개시내용의 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제 및/또는 면역억제제 약물 저항성 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
입양 세포 요법을 위해 면역 세포를 투여하는 방법은 공지되어 있고, 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법 방법은 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238 (그루언버그(Gruenberg) 등); 미국 특허 번호 4,690,915 (로센버크(Rosenberg)); 문헌 [Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)]에 기술되어 있다. 예컨대, 문헌 [Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933]; [Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9]; [Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 세포 요법, 예컨대 입양 T 세포 요법은 자가유래 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받게 되는 대상체로부터, 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리 및/또는 다르게는 그로부터 제조된 것이다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체, 예컨대 환자로부터 유래된 것이고, 단리 및 프로세싱 후, 세포는 동일한 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 세포 요법, 예컨대 입양 T 세포 요법은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받게 되거나, 또는 최종적으로 세포 요법을 받는 대상체 이외의 다른 대상체, 예컨대 제1 대상체로부터 단리 및/또는 다르게는 그로부터 제조된 것이다. 상기 실시양태에서, 이어서, 세포는 동일 종의 상이한 대상체, 예컨대 제2 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사한 것이다. 일부 실시양태에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 부류 또는 슈퍼타입을 발현한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 세포, 또는 세포를 함유하는 조성물 투여 이전에, 질환 또는 병태, 예컨대 GVHD를 표적화하는 치료제로 치료받은 적이 있는 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 다른 치료제에 대해 불응성이거나, 또는 비-반응성인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 예컨대, 화학요법, 방사선, 및/또는 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT), 예컨대 동종 HSCT를 비롯한 또 다른 치료 개입을 이용한 치료 이후, 지속성 또는 재발성 질환을 앓는 대상체이다. 일부 실시양태에서, 투여는 대상체가 또 다른 요법에 대해 저항성임에도 불구하고, 대상체를 효과적으로 치료한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 GVHD에 대한 표준 치료 예방으로, 예컨대 스테로이드 (예컨대, 글루코코르티코이드) 및/또는 칼시뉴린 억제제 (예컨대, FK506, CsA)로 치료받은 대상체이다.
일부 경우에, 세포는 본원에 기술된 바와 같은 유전자 편집된 Teff이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 대상체에게, 글루코코르티코이드 또는 CaNI로 치료받은 조혈 줄기 세포 이식편 환자에게 유전자 편집된 Teff를 투여하는 단계를 포함한다. 어느 특정 이론으로도 또는 작용 모드로도 제한하지 않으면서, 글루코코르티코이드 수용체 유전자좌가 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제에 대한 감수성을 증가시키도록 변형된 것인 변형된 Teff 투여는 상기 환자에서 Teff 생존을 증가 또는 유지시키는 것으로 간주된다. 일부 경우에, 변형된 Teff는 종양 특이적이거나, 또는 특정 종양 유형에 대해 풍부화된 것이다. 일부 경우에, 변형된 Teff는 병원체 특이적이다 (예컨대, 시토메갈로바이러스 또는 BK 바이러스에 특이적이다)
일부 실시양태에서, 대상체는 다른 치료제에 반응성이고, 치료제를 이용한 치료는 질환 부담을 감소시킨다. 일부 측면에서, 대상체는 초기에는 치료제에 대해 반응성이지만, 시간이 경과함에 따라 질환 또는 병태의 재발을 보인다. 일부 실시양태에서, 대상체는 재발성을 나타내지 않는 대상체이다. 일부 상기 실시양태에서, 대상체는 재발 위험이 있는 것으로, 예컨대 재발 위험이 높은 것으로 결정된 대상체이며, 따라서, 세포는 예방적으로, 예컨대 재발 가능성을 감소시키기 위해, 또는 재발을 예방하기 위해 투여된다. 일부 측면에서, 대상체는 또 다른 치료제를 이용한 선행 치료를 받은 적이 없는 대상체이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 예컨대, 화학요법, 방사선, 및/또는 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT), 예컨대 동종 HSCT를 비롯한 또 다른 치료 개입을 이용한 치료 이후, 지속성 또는 재발성 질환을 앓는 대상체이다. 일부 실시양태에서, 투여는 대상체가 또 다른 요법에 대해 저항성임에도 불구하고, 대상체를 효과적으로 치료한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 줄기 세포 이식편을 받은 대상체이거나, 또는 줄기 세포 이식의 후보자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 고형 기관 이식편,을 받은 대상체이거나, 또는 고형 기관 이식의 후보자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 자가면역 장애를 앓는 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이식편대숙주질환 (GVHD)을 앓는 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 1형 당뇨병을 앓는 대상체이다.
한 실시양태에서, 질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의, 본 발명의 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 질환 또는 병태 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성 Treg를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성 세포는 종래의 표준 치료(들) 면역요법들이 진행되는 상태 동안, 예컨대 림프조혈계의 세포에서 노화 및/또는 세포독성을 억제 및/또는 유도하는 작용을 하는 글루코코르티코이드 및 칼시뉴린 억제제 투여 동안 생착, 생존, 지속 및/또는 증식할 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포는 더욱 장기적이고, 지속되는 기간 동안 그의 치료 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성 세포가 투여될 때, 이식된 조직은 거부로부터 보호된다. 한 실시양태에서, 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성 세포는 지속적인 면역억제를 매개할 수 있다. 한 실시양태에서, 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성 세포는 동종이계 항원에 대한 반응으로 T 세포 증식을 억제시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포, 조직, 및/또는 기관 이식시, 동종이계 항원은 이식된 세포, 조직, 및/또는 기관 상에 편재하여 발현될 수 있다. 상기 경우, 이식된 세포, 조직, 및/또는 기관 내로 상당한 면역 세포 침윤이 발생할 수 있고, 그 결과로 이식된 세포, 조직, 및/또는 기관은 파괴될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성 세포는 면역 세포의 침윤을 감소시키고, 이에 의해 이식된 세포, 조직, 및/또는 기관을 파괴로부터 보호할 수 있다. 일부 경우에, 이식된 세포, 조직, 및/또는 기관은 독성을 매개할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성 세포는 이식된 세포, 조직, 및/또는 기관-매개 독성을 감소시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 예방적 치료를 필요로 하는 대상체에서 예방적 치료 효과를 달성하는 방법, 및/또는 면역억제를 필요로 하는 대상체, 예컨대 동종반응 또는 자가면역 반응을 경험하고 있는 대상체에서 면역억제 효과를 달성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 예방적 치료를 필요로 하는 대상체에서 예방적 치료 효과를 달성하는 방법, 및/또는 동종반응 또는 자가면역 반응을 보이는, 면역억제를 필요로 하는 대상체에서 면역억제 효과를 달성하는 방법은 대상체에게 본 발명의 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 폐, 심장 (예컨대, 심근세포), 심장 판막, 피부 (예컨대, 섬유모세포), 간 (예컨대, 간세포), 손, 신장, 췌장, 장, 위, 흉선, 골, 힘줄, 각막, 고환, 신경, 정맥, 혈액 (예컨대, 전혈, 백혈구, 적혈구, 혈소판, 혈장, 혈청), 골수 (예컨대, 단핵구, 대식세포, 중간엽 줄기 세포), 줄기 세포 (예컨대, 중간엽 줄기 세포 (MSC), 조혈 줄기 세포 (HSC)), 랑게르한스섬 세포, 신경 세포 (예컨대, 뉴런, 대교세포, 소교세포), 면역 세포 (예컨대, T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 또는 NKT (자연 살해 T) 세포), 및 조혈 세포, 및 그의 성분을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의 유형의 이식된 기관, 조직 또는 세포의 거부로부터 보호하는 것을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 방법이 그를 거부로부터 보호할 수 있는 다른 조직 및 세포 유형으로는 제한 없이 상피 세포, 섬유모세포 세포, 신경 세포, 각질형성세포, 조혈 세포, 멜라닌세포, 연골세포, 림프구 (B 및 T), 대식세포, 단핵구, 단핵 세포, 심장 근육 세포, 다른 근육 세포, 과립막 세포, 적세포 세포, 표피 세포, 내피 세포, 랑게르한스섬 세포, 췌장 인슐린 분비 세포, 췌장 알파-2 세포, 췌장 베타 세포, 췌장 알파-1 세포, 골 세포, 골 전구체 세포, 뉴런 줄기 세포, 원시 줄기 세포, 간세포, 대동맥 내피 세포, 미세혈관 내피 세포, 제정맥 내피 세포, 섬유모세포, 간 별모양 세포, 대동맥 평활근 세포, 심장 근육세포, 뉴런, 쿠퍼(Kupffer) 세포, 평활근 세포, 슈완(Schwann) 세포, 적혈구, 혈소판, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염구, 지방세포, 연골세포, 췌장 섬 세포, 갑상선 세포, 부갑상선 세포, 이하선 세포, 신경교 세포, 성상세포, 적혈구, 백혈구, 대식세포, 체세포, 뇌하수체 세포, 부신 세포, 모발 세포, 방광 세포, 신장 세포, 망막 세포, 간상 세포, 원추 세포, 심장 세포, 간 세포, 페이스메이커 세포, 비장 세포, 항원 제시 세포, 기억 세포, T 세포, B 세포, 형질 세포, 근육 세포, 난소 세포, 자궁 세포, 전립선 세포, 질 상피 세포, 정자 세포, 고환 세포, 생식 세포, 난세포, 라이디히 세포, 세관 주위 세포, 세르톨리 세포, 황체 세포, 자궁 세포, 자궁내막 세포, 유방 세포, 여포 세포, 점액 세포, 섬모 세포, 비각질화 상피 세포, 각질화 상피 세포, 폐 세포, 배상 세포, 원주형 상피 세포, 도파민성 세포, 편평 상피 세포, 골세포, 골모세포, 파골세포, 배아 줄기 세포, 섬유모세포 및 섬유모세포를 포함한다. 본 발명의 방법은 또한 이식편대숙주질환 (GVHD)으로부터의 보호를 포함한다.
특정 실시양태에서, 대상체는 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제-저항성 세포 이외에도, 2차적 치료, 예컨대 면역억제 약물을 투여받을 수 있다. 면역억제 약물의 예로는 프레드니손, 아자티오프린, 타크로리무스, 및 시클로스포린 A를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 2차적 치료는 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제이다. 일부 실시양태에서, 스테로이드는 코르티코스테로이드이다. 일부 실시양태에서, 스테로이드는 프로게스테론-타입 글루코코르티코이드, 히드로코르티손-타입 글루코코르티코이드, 메타손-타입 글루코코르티코이드, 및 아세토니드-타입 글루코코르티코이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 글루코코르티코이드이다. 일부 실시양태에서, 글루코코르티코이드는 덱사메타손, 베타메타손, 히드로코르티손 (코르티솔), 프레드니손, 프레드니솔론, 로테프레드놀, 데플라자코트, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 플루드로코르티손, 및 데옥시코르티코스테론, 및 그의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제는 시클로스포린, 보클로스포린, 피메크로리무스, 및 타크로리무스, 및 그의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 2차적 치료를 제공받는다. 2차적 치료로는 화학요법, 방사선, 수술, 및 약물 치료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 세포는 적절한 임상전 및 임상 실험 및 시험에서 결정되는 투여량 및 경로로 및 시점에 투여될 수 있다. 세포 조성물은 상기 범위 내의 투여량으로 다회에 걸쳐 투여될 수 있다. 본 발명의 세포 투여는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정되는 바와 같이 요구되는 질환 또는 병태를 치료하는 데 유용한 다른 방법과 조합될 수 있다.
투여되는 본 발명의 세포는 요법을 받는 대상체와 관련하여 자가유래 세포일 수 있다.
본 발명의 세포 투여는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 발명의 세포는 대상체에게 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 주입, 피하 주입 또는 이식에 의해 투여될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 환자에게 경동맥으로, 피하로, 진피내로, 종양내로, 결절내로, 수내로, 근육내로, 정맥내 (i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 다른 경우에, 본 발명의 세포는 대상체에서 염증 부위로, 대상체에서 국소 질환 부위로, 림프절, 기관, 종양 등으로 직접 주사된다.
일부 실시양태에서, 세포는 원하는 투여량으로 투여되며, 일부 측면에서, 원하는 투여량은 원하는 용량 또는 개수의 세포 또는 세포 유형(들) 및/또는 원하는 비의 세포 유형을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 세포의 투여량은 세포의 전체 개수 (또는 체중 1 kg당 개수) 및 원하는 비의 개별 집단 또는 하위유형에 기초한다. 일부 실시양태에서, 세포의 투여량은 개별 집단 중 세포의, 또는 개별 세포 유형의 원하는 총 개수 (또는 체중 1 kg당 개수)에 기초한다. 일부 실시양태에서, 투여량은 상기 특징들, 예컨대 원하는 개수의 전체 세포, 원하는 비, 및 개별 집단 중 세포의 원하는 총 개수의 조합에 기초한다.
일부 실시양태에서, 세포의 집단 또는 하위유형은 예컨대, 원하는 용량의 T 세포와 같은, 원하는 용량의 전체 세포의 허용되는 차이로 또는 그 범위 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 원하는 세포 개수, 또는 세포를 투여받는 대상체의 체중 단위당 원하는 세포 개수, 예컨대 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 세포의 최소 개수, 또는 체중 단위당 세포의 최소 개수 이상이다. 일부 측면에서, 원하는 용량으로 투여되는 전체 세포 중 개별 집단 또는 하위유형은 원하는 결과 비로, 그에 근사치로, 예컨대 상기 비의 특정의 허용되는 차이 또는 오차 범위 내로 존재한다.
일부 실시양태에서, 세포는 세포의 개별 집단 또는 하위유형 중 하나 이상의 것의 원하는 용량의 허용되는 차이로 또는 그 범위 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 하위유형 또는 집단의 원하는 세포 개수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위당 이러한 세포의 원하는 개수, 예컨대 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 집단 또는 하위유형의 세포의 최소 개수, 또는 체중 단위당 집단 또는 하위유형의 세포의 최소 개수 이상이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 투여량은 전체 세포의 원하는 고정 용량 및 원하는 비에 기초하여 및/또는 개별 하위유형 또는 하위집단 중 하나 이상, 예컨대 그들 각각의 원하는 고정 용량에 기초한다.
특정 실시양태에서, 세포, 또는 세포의 하위유형의 개별 집단은 대상체에게 약 100만 개 내지 약 1,000억 개의 세포, 예로서, 예컨대 100만 개 내지 약 500억 개의 세포 범위로 (예컨대, 약 500만 개의 세포, 약 250만 개의 세포, 약 5억 개의 세포, 약 10억 개의 세포, 약 50억 개의 세포, 약 200억 개의 세포, 약 300억 개의 세포, 약 400억 개의 세포, 또는 상기 값 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위), 예컨대 약 1,000만 개 내지 약 1,000억 개의 세포 (예컨대, 약 2,000만 개의 세포, 약 3,000만 개의 세포, 약 4,000만 개의 세포, 약 6,000만 개의 세포, 약 7,000만 개의 세포, 약 8,000만 개의 세포, 약 9,000만 개의 세포, 약 100억 개의 세포, 약 250억 개의 세포, 약 500억 개의 세포, 약 750억 개의 세포, 약 900억 개의 세포,또는 상기 값 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위), 및 일부 경우에서, 약 1억 개의 세포 내지 약 500억 개의 세포 (예컨대, 약 1억 2,000만 개의 세포, 약 2억 5,000만 개의 세포, 약 3억 5,000만 개의 세포, 약 4억 5,000만 개의 세포, 약 6억 5,000만 개의 세포, 약 8억 개의 세포, 약 9억 개의 세포, 약 30억 개의 세포, 약 300억 개의 세포, 약 450억 개의 세포) 또는 이들 범위 사이의 임의의 값으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 전체 세포의 용량 및/또는 세포의 개별 하위집단의 용량은 1x105개의 세포/kg 내지 1x1011개의 세포/kg 또는 약 1x105개의 세포/kg 내지 약 1x1011개의 세포/kg, 104 내지 1011 또는 약 1011개의 세포/킬로그램 (kg) (체중) 범위, 예컨대 105 내지 106개의 세포/kg (체중) 범위, 예를 들어, 1 x 105개의 세포/kg (체중), 1.5 x 105개의 세포/kg (체중), 2 x 105개의 세포/kg (체중), 또는 1 x 106개의 세포/kg (체중), 또는 약 1 x 105개의 세포/kg (체중), 약 1.5 x 105개의 세포/kg (체중), 약 2 x 105개의 세포/kg (체중), 또는 약 1 x 106개의 세포/kg (체중) 내에 포함된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포는 104개의 T 세포/킬로그램 (kg) (체중) 또는 약 104개의 T 세포/kg (체중) 내지 109개의 T 세포/kg (체중) 또는 약 109개의 T 세포/kg (체중)으로, 또는 그의 특정 오차 범위 내로, 예컨대 105 내지 106개의 T 세포/kg (체중), 예를 들어, 1 x 105개의 T 세포/kg (체중), 1.5 x 105개의 T 세포/kg (체중), 2 x 105개의 T 세포/kg (체중), 또는 1 x 106개의 T 세포/kg (체중), 또는 약 1 x 105개의 T 세포/kg (체중), 약 1.5 x 105개의 T 세포/kg (체중), 약 2 x 105개의 T 세포/kg (체중), 또는 약 1 x 106개의 T 세포/kg (체중)으로, 또는 그의 특정 오차 범위 내로 투여된다. 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에서 사용하기 위한 변형된 세포의 적합한 투여량 범위는 제한 없이, 약 1x105개의 세포/kg 내지 약 1x106개의 세포/kg, 약 1x106개의 세포/kg 내지 약 1x107개의 세포/kg, 약 1x107개의 세포/kg, 약 1x108개의 세포/kg, 약 1x108개의 세포/kg, 약 1x109개의 세포/kg, 약 1x109개의 세포/kg, 약 1x1010개의 세포/kg, 약 1x1010개의 세포/kg, 약 1x1011개의 세포/kg을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에서 사용하는 데 적합한 투여량은 약 1x108개의 세포/kg이다. 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에서 사용하는 데 적합한 투여량은 약 1x107개의 세포/kg이다. 다른 실시양태에서, 적합한 투여량은 약 1x107개의 전체 세포 내지 약 5x107개의 전체 세포이다. 일부 실시양태에서, 적합한 투여량은 약 1x108개의 전체 세포 내지 약 5x108개의 전체 세포이다. 일부 실시양태에서, 적합한 투여량은 약 1.4x107개의 전체 세포 내지 약 1.1x109개의 전체 세포이다. 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에서 사용하는 데 적합한 투여량은 약 7x109개의 전체 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 104개의 세포/킬로그램 (kg) (체중) 또는 약 104개의 세포/kg (체중) 내지 109개의 세포/kg (체중) 또는 약 109개의 세포/kg (체중)으로, 또는 그의 특정 오차 범위 내로, 예컨대 105 내지 106개의 세포/kg (체중), 예를 들어, 1 x 105개의 세포/kg (체중), 1.5 x 105개의 세포/kg (체중), 2 x 105개의 세포/kg (체중), 또는 1 x 106개의 세포/kg (체중), 또는 약 1 x 105개의 세포/kg (체중), 약 1.5 x 105개의 세포/kg (체중), 약 2 x 105개의 세포/kg (체중), 또는 약 1 x 106개의 세포/kg (체중)으로, 또는 그의 특정 오차 범위 내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 1 x 106, 약 2.5 x 106, 약 5 x 106, 약 7.5 x 106, 또는 약 9 x 106개의 세포 초과, 및/또는 적어도 약 1 x 106, 약 2.5 x 106, 약 5 x 106, 약 7.5 x 106, 또는 약 9 x 106개의 세포로, 또는 그의 특정 오차 범위 내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 108 내지 1012, 또는 약 1010 내지 1011개의 T 세포, 약 10s 내지 1012, 또는 약 1010 내지 1011개의 세포로, 또는 그의 특정 오차 범위 내로 투여된다.
일부 실시양태에서, 세포는 다중 세포 집단 또는 하위유형의 원하는 결과 비로, 또는 그의 허용되는 범위 내로 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 비는 특정 비일 수 있거나, 비 범위일 수 있고, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 원하는 비는 5:1 또는 약 5:1 내지 5:1 또는 약 5:1 (또는 약 1:5 초과 내지 약 5:1 미만), 또는 1:3 또는 약 3:1 내지 3:1 또는 약 3:1 (또는 약 1:3 초과 내지 약 3:1 미만), 예컨대 2:1 또는 약 2:1 내지 1:5 또는 약 1:5 (또는 약 1:5 초과 내지 약 2:1 미만, 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5, 또는 약 5:1, 약 4.5:1, 약 4:1, 약 3.5:1, 약 3:1, 약 2.5:1, 약 2:1, 약 1.9:1, 약 1.8:1, 약 1.7:1, 약 1.6:1, 약 1.5:1, 약 1.4:1, 약 1.3:1, 약 1.2:1, 약 1.1:1, 약 1:1, 약 1:1.1, 약 1:1.2, 약 1:1.3, 약 1:1.4, 약 1:1.5, 약 1:1.6, 약 1:1.7, 약 1:1.8, 약 1:1.9: 1:2, 약 1:2.5, 약 1:3, 약 1:3.5, 약 1:4, 약 1:4.5, 또는 약 1:5이다. 일부 측면에서, 허용되는 차이는 원하는 비의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50% (상기 범위 사이의 임의의 값 포함)이다.
일부 실시양태에서, 한 용량의 변형된 세포는 그를 필요로 하는 대상체에게 단일 용량으로 또는 다회 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 한 용량의 변형된 세포는 다회 용량으로, 예컨대 주 1회 또는 매 7일마다 1회, 매 2주마다 또는 매 14일마다 1회, 매 3주마다 또는 매 21일마다 1회, 매 4주마다 또는 매 28일마다 1회 투여된다. 예시적인 실시양태에서, 단일 용량의 변형된 세포가 그를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 예시적인 실시양태에서, 단일 용량의 변형된 세포는 빠른 정맥내 주입에 의해 그를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료하고자 하는 질환의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질환의 중증도 및 진행 과정, 세포가 예방 목적으로 투여되는지 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 대상체의 임상적 병력 및 세포에 대한 반응 및 주치의의 재량에 의존할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 및 세포는 1회 또는 수회의 치료로 대상체에게 적합하게 투여된다.
일부 실시양태에서, 세포는 조합 치료의 일부로서, 예컨대 또 다른 치료 개입, 예컨대 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 작용제, 예컨대 세포독성제 또는 치료제와 함께 동시에, 또는 그와 함께 임의 순서로 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 또는 또 다른 치료 개입과 함께 동시에, 또는 임의 순서로 순차적으로 공동 투여된다. 일부 상황하에서, 세포는 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 증강시킬 수 있도록, 또는 그 반대로 이루어지도록 시간상 충분히 가깝게 또 다른 요법과 함께 공동 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 이전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 이후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 작용제는 예를 들어, 지속성을 증강시키기 위해 시토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 화학요법제의 투여를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 투여 후, 조작된 세포 집단의 생물학적 활성은 예컨대, 다수의 공지된 방법 중 임의의 것에 의해 측정된다. 평가 파라미터는 생체내에서는 예컨대, 영상화함으로써, 또는 생체외에서는 예컨대, ELISA 또는 유세포 분석법에 의한, 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포의 항원에의 특이적 결합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 세포를 파괴시킬 수 있는 조작된 세포의 능력은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대 예를 들어, 문헌 [Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)], 및 [Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기술되어 있는 것과 같은 세포독성 검정법을 이용하여 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포의 생물학적 활성은 하나 이상의 시토카인의 발현 및/또는 분비를 검정함으로써 측정된다. 일부 측면에서 생물학적 활성은 임상적 결과, 예컨대 종양 부담 또는 부하의 감소를 평가함으로써 측정된다.
H. 제약 조성물 및 제제
본 발명의 조혈 세포 또는 그의 전구체 세포의 집단, 상기 세포를 함유하고/거나, 상기 세포가 강화된 조성물, 예컨대 재조합 수용체를 발현하는 세포가 조성물 중 전체 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과를 이루어거나, 또는 특정 유형의 세포, 예컨대 T 세포 또는 CD8+ 또는 CD4+ 세포를 이루어는 것인 조성물 또한 제공한다. 조성물 중에는 투여를 위한, 예컨대 입양 세포 요법을 위한 제약 조성물 및 제제가 있다. 또한 대상체, 예컨대 환자에게 세포 및 조성물을 투여하기 위한 치료 방법도 제공한다.
제약 조성물 및 제제, 예컨대 주어진 용량 또는 그의 일부인 양으로 투여를 위한 개수의 세포를 포함하는 단위 용량 형태 조성물을 비롯한, 투여를 위한 세포를 포함하는 조성물 또한 제공한다. 제약 조성물 및 제제는 일반적으로 하나 이상의 임의적 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.
"제약 제제"라는 용어는 그 안에 함유되어 있는 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태이고, 제제를 투여되게 되는 대상체에게 허용되지 않는 독성을 나타내는 추가 성분은 함유하지 않는 제제를 지칭한다. "제약상 허용되는 담체"란, 제약 제제 중의 활성 성분 이외의 다른 성분으로서, 대상체에게 비독성인 것을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체로는 완충제, 부형제, 안정제, 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 측면에서, 담체의 선택은 부분적으로는 특정 세포에 의해 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 적합한 제제는 다양하게 존재한다. 예를 들어, 제약 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제를 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 그의 혼합물은 전형적으로, 전체 조성물의 약 0.0001중량% 내지 약 2중량%인 양으로 존재한다. 담체는 예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 의해 기술되어 있다. 제약상 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만닛톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예컨대, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온계 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 완충화제가 조성물 중에 포함된다. 적합한 완충화제로는 예를 들어, 시트르산, 시트르산 나트륨, 인산, 인산칼륨, 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 둘 이상의 완충화제의 혼합물이 사용된다. 완충화제 또는 그의 혼합물은 전형적으로, 전체 조성물의 약 0.001중량% 내지 약 4중량%인 양으로 존재한다. 투여가능한 제약 조성물을 제조하는 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
제제는 수용액을 포함할 수 있다. 제제 또는 조성물은 또한 상기 세포로 치료되는 특정 적응증, 질환 또는 병태에 유용한 1 초과의 활성 성분, 바람직하게, 세포에 상호 보완적인 활성을 갖는 것으로서, 각 활성은 서로 유해한 영향을 미치지 않는 것인 활성 성분을 함유할 수 있다. 상기 활성 성분은 적합하게는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 다른 제약상 활성인 작용제 또는 약물, 예컨대 화학요법제, 예컨대 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 및/또는 빈크리스틴을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 효과적인 양으로, 예컨대 치료 유효량 또는 예방 유효량으로 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 치료 또는 예방 효능은 치료받는 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 원하는 투여량은 세포의 단일 볼루스 투여에 의해, 세포의 다회 볼루스 투여에 의해, 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
제제는 경구적, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비내, 협측, 설하, 또는 좌제 투여용 제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 비경구적으로 투여된다. 본원에서 사용되는 바, "비경구적"이라는 용어는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의해 말초 시스템 전달을 이용하여 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 멸균 액체 제제로서, 예컨대 등장성 수성 액제, 현탁제, 에멀젼, 분산제, 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이는 일부 측면에서, 선택된 pH로 완충처리될 수 있다. 보통은 액체 제제가 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조하기 더 쉽다. 추가로, 액체 조성물은 투여하기가, 특히, 주사에 의해 투여하기가 좀더 편리하다. 한편, 점성 조성물은 특이적 조직과 더욱 장기간 동안 접촉할 수 있도록 적절한 점도 범위 내로 제제화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들어, 물, 염수, 포스페이트 완충처리된 염수, 폴리오이(polyoi) (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사용 액제는 예컨대, 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리학적 염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 혼합하여 용매 중 세포를 혼입함으로써 제조될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 원하는 제제에 의존하여, 보조 물질, 예컨대 습윤화제, 분산화제, 또는 유화제 (예컨대, 메틸셀룰로스), pH 완충화제, 겔화 또는 점도 증강 첨가제, 보존제, 향미제, 및/또는 착색제를 함유한다. 일부 측면에서, 적합한 제제를 제조하기 위해 표준 텍스트가 참조될 수 있다.
항미생물성 보존제, 항산화제, 킬레이트제, 및 완충제를 비롯한, 조성물의 안정성 및 멸균성을 증강시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 및 소르브산에 의해 미생물의 작용을 확실하게 방지할 수 있다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용으로 주사용 제약 형태의 흡수는 연장될 수 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은 예컨대, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
J. 동물 모델
본 발명은 (예컨대, 세포 또는 조직의) 이식 후의, 질환 또는 병태의 생체내 동물 모델을 제공한다. 일부 실시양태에서, 동물 모델은 (예컨대, 세포 또는 조직의) 동종이계 이식 후의, 질환 또는 병태의 것이다. 일부 실시양태에서, 동물 모델은 (예컨대, 세포 또는 조직의) 이종 이식 후의, 질환 또는 병태의 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 (예컨대, 세포 또는 조직의) 동종이계 이식 후의, 이식편대숙주질환 (GVHD)의 생체내 동물 모델을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 (예컨대, 세포 또는 조직의) 이종 이식 후의, 이식편대숙주질환 (GVHD)의 생체내 동물 모델을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 동물 모델을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 동종이계 또는 이종 이식 후의, GVHD의 생체내 동물 모델은 동종이계 세포 집단을 포함하는 동물을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "동종이계"라는 용어는 유전적으로는 다르지만, 동일 종의 것이며, 면역학적으로 비화합성일 수 있는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 동종이계 세포 또는 조직은 동일 종으로부터 유래된, 유전적으로 다른 공급원으로부터 유래된 세포 또는 조직이다. 본원에서 사용되는 바, "이종"라는 용어는 상이한 종에 속하는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 이종 세포 또는 조직은 상이한 종으로부터 유래된 세포 또는 조직이다.
본원에서 제공되는 바, GVHD의 생체내 동물 모델은 GVHD의 뮤린 모델이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 세포는 동종이계 혈장 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. 일부 실시양태에서, 이종 세포는 이종 PBMC이다. 일부 실시양태에서, 뮤린 GVHD 모델은 동종이계 (즉, 유전적으로 다른 마우스로부터 유래) 또는 이종 (즉, 상이한 종으로부터 유래) PBMC 집단을 포함하는 면역결핍 마우스를 포함한다.
제한 없이, "누드," "scid," "rag-결핍," 및 "고차원, 다유전자성" 변종의 면역결핍 마우스 계통을 비롯한, 다양한 면역결핍 마우스 계통이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 누드 마우스는 Foxn1nu 돌연변이에 대해 동형접합성이다. Foxn1은 모낭 및 흉선 발생, 둘 모두에 요구되는 전사 인자를 코딩한다. 그의 부재시, 마우스는 털이 없고, 동시에 무흉선이다. 흉선이 형성되지 못하기 때문에, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 분화 및 성숙되지 못하고, 이에 누드 동형접합체는 T 세포-결핍이 된다. Scid 마우스는 Prkdcscid 돌연변이에 대해 동형접합성이다. 유전자 Prkdc는 DNA 수복을 위해, 및 T 세포 수용체 (TCR) 및 면역글로불린 (Ig) 유전자의 체세포 재조합 동안 발생하는 이중 가닥 DNA 파단의 실링을 위해 요구되는, DNA-의존성 단백질 키나제의 촉매성 서브유닛을 코딩한다. Prkdc 단백질 부재시, TCR 및 Ig 유전자는 재배열되지 못하고, 그 결과로, T 세포 및 B 세포, 둘 모두 결핍인 마우스가 생성된다. Rag-결핍 마우스는 기능성 Rag1 또는 Rag2 단백질을 발현하지 못하는 마우스이다. Prkdc 유전자와 같이, Rag1 및 Rag2, 둘 모두, TCR 및 Ig 유전자의 체세포 재조합을 위해 요구되며, 그 중 어느 한 유전자의 부재도 T 및 B 세포 결핍을 초래한다. Rag1tm1Mom 또는 Rag2tm1 . 1Cgn 돌연변이를 보유하는 마우스는 동일하지 않다면, 매우 유사한 표현형을 갖는다. 고차원, 다유전자성 면역결핍 마우스는 Prkdcscid 또는 Rag-결핍 마우스로부터 구축되고, 추가의 면역결핍-증강 돌연변이를 보유한다. 각각 Prkdcscid 및 Rag1tm1Mom과 조합하여 인터류킨 2 수용체 감마 서브유닛 유전자 (Il2rgtm1Wjl) 중에 특정 돌연변이를 보유하는, 본 발명자들의 NSG 및 NRG 마우스는 상기 마우스들 중의 것이다. 이들 마우스는 B, T 및 NK 세포 결핍이다. 추가로, 상기 두 마우스 모두 NOD/ShiLtJ 유전자 배경을 갖기 때문에, 용혈성 보체-결핍이고, 대식세포 및 수지상 세포 기능에 유해한 영향을 미치는 대립유전자를 보유한다. 특정 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 BALB/c 마우스이다. 특정 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 NOD/Scid/IL-2Rg -/- (NSG) 마우스이다.
일부 실시양태에서, 동종이계 PBMC 집단은 유전적으로 다른 공여자 마우스로부터 유래된 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 공여자 마우스는 C57BL/6 마우스이다. 특정 실시양태에서, 동종이계 PBMC 집단은 C57BL/6 마우스의 골수로부터 유래된 것이다. 따라서, 본 발명의 동종이계 GVHD 뮤린 모델은 공여자 C57BL/6 마우스의 골수로부터 유래된 동종이계 PBMC 집단을 포함하는 면역결핍 BALB/c 마우스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종 PBMC 집단은 인간으로부터 유래된 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 이종 GVHD 뮤린 모델은 인간으로부터 유래된 이종 PBMC 집단을 포함하는 면역결핍 NSG 마우스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GVHD 동물 모델을 제조하는 방법은 동종이계 또는 이종 PBMC 집단을 숙주 동물 (예컨대, 마우스) 내로 주사/투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GVHD 뮤린 모델을 제조하는 방법은 동종이계 또는 이종 PBMC 집단을 면역결핍 마우스 내로 주사/투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 동종이계 GVHD 뮤린 모델을 제조하는 방법은 동종이계 PBMC 집단을 면역결핍 마우스 내로 주사/투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이종 GVHD 뮤린 모델을 제조하는 방법은 이종 PBMC 집단을 면역결핍 마우스 내로 주사/투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 동종이계 또는 이종 PBMC 주사 이전에 면역결핍 마우스에 비-치명적으로 방사선 조사한다. 특정 실시양태에서, 면역결핍 마우스에 비-치명적으로 방사선 조사하는 것은 마우스에 약 50 rad 내지 약 200 rad인 선량의 방사선을 가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스에 비-치명적으로 방사선 조사하는 것은 마우스에 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 175, 약 180, 약 185, 약 190, 약 195, 약 200, 약 205, 약 210, 약 215, 약 220, 약 225 rad, 또는 그 사이의 임의의 값인 선량의 방사선을 가하는 것을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 마우스에 투여하는 데 적절한 비-치명적인 방사선 선량을 결정할 수 있을 것이다.
특정 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 약 1 x 106 내지 약 20 x 106개의 동종이계 또는 이종 PBMC를 주사/투여받는다. 일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 약 0.5 x 106, 0.6 x 106, 0.7 x 106, 0.8 x 106, 0.9 x 106, 1 x 106, 1.1 x 106, 1.2 x 106, 1.3 x 106, 1.4 x 106, 1.5 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 10 x 106, 15 x 106, 16 x 106, 17 x 106, 18 x 106, 19 x 106, 19.5 x 106, 19.6 x 106, 19.7 x 106, 19.8 x 106, 19.9 x 106, 20 x 106, 20.1 x 106, 20.2 x 106, 20.3 x 106, 20.4 x 106, 20.5 x 106, 21 x 106, 22 x 106, 23 x 106, 24 x 106, 25 x 106개의 동종이계 또는 이종 PBMC, 또는 또는 그 사이의 임의의 값의 동종이계 또는 이종 PBMC를 주사/투여받는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 면역결핍 마우스 내로 주사하는 데 적절한 개수의 PBMC를 결정할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제로 치료되었을 때, 본 발명의 GVHD 동물 모델의 생존은 야생형 동물과 비교하여 단축된다. 특정 실시양태에서, 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제로 치료되었을 때, 본 발명의 GVHD 뮤린 모델의 생존은 야생형 마우스와 비교하여 단축된다.
본원에서 언급 또는 인용된 논문, 특허, 및 특허 출원의 내용, 및 모든 다른 문서 및 전자식 이용가능 정보는 마치 각각의 개별 공개 문헌이 참조로 인용되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 본 출원인들은 임의의 상기 논문, 특허, 특허 출원, 또는 다른 물리적 및 전자 문서로부터의 임의의 모든 물질 및 정보를 본 출원에 물리적으로 포함시킬 수 있는 권리를 갖고 있다.
본 발명은 그의 구체적인 실시양태를 참조로 하여 기술되었지만, 본 발명의 진실된 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 다양하게 변형될 수 있고, 등가물이 치환될 수 있다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해하여야 한다. 본원에 개시된 실시양태의 범주로부터 벗어남 없이, 적합한 등가물을 이용함으로써 본원에 기술된 방법의 다른 적합한 변형 및 적합화가 이루어질 수 있다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 쉽게 자명해질 것이다. 추가로, 특정 상황, 물질, 물질의 조성물, 프로세스, 프로세스 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 정신 및 범주에 맞게 적합화시키기 위해 다수의 변형이 이루어질 수 있다. 그러한 모든 변형은 본원에 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이제 특정 실시양태를 상세하게 설명하였는 바, 상기 특정 실시양태는 하기의 실시예를 참조함으로써 더욱 명확하게 이해될 것이며, 여기서 실시예는 단지 예시 목적으로 포함되는 것이고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
하기 실험 실시예는 제한하는 것으로 의도되지 않고, 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제 저항성 면역 세포를 생성하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
물질 및 방법:
GMP를 준수하는 Treg
Treg를 2 단계 방법으로 인간 성분채집술 생성물로부터 정제하였고, 상기 방법에 의해 (Treg를 포함하는) CD25+ 세포를 GMP 등급의 mAb-접합된 자기 비드를 이용하여 양성 선택한 후, 나이브 및 기억 Treg PB (각각 CD4+25++127-45RA+ 및 CD4+25++127-45RA-)에 대해 분류하였다 (도 1). 정제된 세포를 GMP-품질의 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로 자극시키고, 고용량 IL-2 (300 U/ml) 중에서 14일 동안 배양하였다. 확장된 Treg를 14일째 뱅킹하였다 (냉동). 본원에 기술된 실험을 위해, Treg를 해동시키고, 7-10일 동안 GMP를 준수하는 항-CD3/28 비드로 재자극시켰다. 배양 종료시 Treg 순도 및 시험관내 억제 기능을 평가하였다. 나이브 및 기억 Treg 배양물은 유사한 개수의 Foxp3+ 세포를 보였고, 모든 배양물은 시험관내에서 억제성이었다.
실시예 1: 덱사메타손이 Treg 생존 및 확장에 미치는 효과
Treg가 글루코코르티코이드 수용체 활성화의 면역억제 효과에 감수성인지 여부를 결정하기 위해, 뱅킹된 Treg의 공급원을 생성하였다. 자기 비드 풍부화된 말초 혈액 세포로부터 뱅킹된 Treg를 생성하였다 (나이브 및 이펙터 기억 세포에 대해 각각 4+25++127lo 및 CD45RA+ 및 CD45RA-의 변형물). 정제된 Treg를 14일 배양으로 IL-2를 사용하여 확장시키고, 반복 실험에서 일관성을 증가시키기 위해 K562-CD64/86 세포에 항-CD3 mAb를 부하하였다. 뱅킹된 tTreg를 해동시키고, 항-CD3/28 mAb 비드를 이용하여 재자극시킨 후, 명시된 바와 같이 4 ± 1일 동안 추가로 확장시켰다. 이어서, Treg를 배양물 ± 덱사메타손 (Dex: 10, 30, 100 ㎍/ml)으로 나누고, 2-3일 후 생존능 염료 및 계수 비드를 이용하여 유세포 분석법에 의해 상대적인 생존을 평가하였다.
Dex는 용량에 의존하는 방식으로 배양물 중 Treg 개수를 감소시켰다 (도 2b). 어느 이론으로도 제한하지 않으면서, 유동 분류보다는 자기 비드를 사용하고, 라파마이신의 부재하에서 배양을 연장시킨 결과로서 Treg 확장 배양물은 10-35% Foxp3- 세포를 함유하였다. 세포 개수 감소는 Treg의 우선적인 손실에 기인하였다는 가능성을 배제시키기 위해, 상기 배양물을 CD127 및 Foxp3으로도 또한 염색하였고, Treg (CD4+CD127-Foxp3+) 및 비-Treg의 Dex에 대한 상대적인 감수성을 결정하였다 (도 2c). Dex 처리는 Treg 배양물의 순도에 유의적인 영향을 미치지 않았고, 이는 Treg 생존능/생존은 Dex에 의해 부정적인 영향을 받았다는 것을 나타낸다. ± 30 ㎍/ml Dex에서 성장된 Treg의 억제 기능을 시험하였다 (도 2d). 재확장 배양물에서 Treg의 Dex에의 노출은 억제 기능을 증가시켰다.
실시예 2: 유전자 표적화 전략법
핵 수용체 하위패밀리 3, 그룹 C, 멤버 1 (NR3C1) 유전자는 코르티솔 및 다른 글루코코르티코이드의 결합 대상이 되는 수용체인 글루코코르티코이드 수용체 (GR, NR3C1로도 공지)를 코딩한다. 표적화 전략법은 프로그램가능한 뉴클레아제 유전자 파괴 및 오류 유발 비상동성 말단 연결 경로 (NHEJ)를 통한 돌연변이원성 DNA 수복을 통해 엑손 2를 파괴시키는 것이었다. Treg에서 유전자 표적화를 적용하기 위한 조건을 명확하게 정의하기 위해, NR3C1의 직접적인 유전자 파괴 뿐만 아니라, 신규의 상동성 지정 수복 접근법을 위해 종합 접근법을 취하였다.
글루코코르티코이드 수용체 유전자좌를 파괴시킨 방식으로 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자의 표적화된 삽입에 의해 이중 약물 (스테로이드 및 칼시뉴린 억제제) 저항성을 생성하는 전략법을 개발하였다. 이를 달성하기 위해, 군집성의 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)/Cas9 시스템으로부터 유래된 4개의 시약을 시험을 위해 디자인하였다. 전달 및 약물 투약 파라미터를 최적화하기 위하여 연구를 Jurkat 세포에서 수행하였다. 세포내 분해를 막기 위해 뉴클레아제 저항성 포스포로티오에이트 결합을 갖도로 특별히 변형된 가이드 RNA (gRNA)와 Cas9 mRNA를 시험하였다. 동시에, 리보뉴클레오단백질 (RNP) 생성물로서 gRNA와 복합체를 형성한 Cas9 단백질을 시험하였다. 유전자 파괴 및 상동성 지정 수복 (HDR)-기반 유전자 편집, 둘 모두에 대해 두 전달 방법을 비교하였다. 완전한 투약, 타이밍, 및 전기천공 조건 최적화 후, Cas9 RNP가 Jurkat 세포에서 최적의 유전자 파괴 및 수복 플랫폼인 것으로 확인되었다. 상기 전략법은 화학적으로 변형된 gRNA를 필요로 하지 않았고, 일부 조건하에서는 연구 및 임상 등급의 게놈 조작 및 세포 제조를 위해 더욱 간소화된 조작, 합성 및 전달 방법을 나타낼 수 있다.
이러한 파라미터를 사용하면서, 도 3a에 제시된 실험 스키마를 이용하는 T 세포의 CRISPR/Cas9 조작 사용이 추구되었다. 인간 1차 T 세포를 IL-2 존재하에 성장시키고, 48-72시간 동안 CD3/CD28 비드로 활성화시켰다. CRISPR/Cas9 시약은 네온 전기천공 장치 (써모피셔(ThermoFisher))를 이용하여 전달된, 가이드 RNA 전사체 (신테고(Synthego)) 및 재조합 Cas9 펩티드 (알데브론(Aldevron))를 이용하였다. 개별 후보는 NR3C1의 엑손 2에 위치하였고, MIT CRISPR 디자인 툴(Design Tool)을 통해 확인하였다 (도 3b). 뉴클레아제 활성을 평가하기 위해 서베이어 뉴클레아제 검정법을 사용하였을 때 (도 3c), 서베이어 DNA 단편화 생성물에 의해 입증된 바와 같인, 4개 후보 모두 활성인 것으로 관찰되었다 (도 3d). GR1 및 GR2로 명명된, 확인된 두 후보는 가장 높은 활성 수준을 보였다 (도 3d).
실시예 3: Treg에서의 CRISPR / Cas9 -매개 NR3C1 넉아웃
GR1 및 GR2 가이드가 또한 임상적으로 관련된 Treg의 배양물 중 NR3C1 유전자좌를 넉아웃시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 뱅킹된 Treg를 해동시키고, 고용량의 IL-2 (300 U/ml) 중 항-CD3/28 비드로 재자극시켰다. 3일째, Treg를 GR1 또는 GR2 GRISPR/Cas9 RNP의 부재 또는 존재하에서 상기와 같이 전기천공시키고, 최적의 확장 조건으로 복귀시켰다. 2일 후, Treg 배양물을 수거하고, 추가 48시간 (총 7일) 동안 ± 덱사메타손 (30 ㎍/ml)하에 재배양하고, 상기 시점에 배양물을 수거하였고, 생존능 염료 및 계수 비드를 이용하여 유세포 분석법에 의해 상대적인 생존을 평가하였다. CRISPR/Cas9 유전자 변형이 수행되고, 0-100 ug/mL의 덱사메타손을 투약받은 Jurkat 및 1차 T 세포에서 베타 시험을 수행함으로써 30 ug/mL의 용량을 확인하였다. 도 4b에 제시된 바와 같이, GR2 CRISPR/Cas9가 전기천공된 Treg는 덱사메타손의 존재하에서 유의적으로 증가된 생존을 보였다. 비상동성 말단 연결에 의한 CRISPR/Cas9 유전자 수복은 gRNA 결합 부위에 인접한 위치에서 삽입 및 결실 (indel)을 일으킨다. 따라서, TIDE (분해에 의한 indel 추적)로 불리는 서열 트레이스 분해 알고리즘을 이용하여 indel 패턴을 평가하였다. 덱사메타손 노출 이전 및 이후 샘플을 분석하였다 (각각 도 4c 및 4d). 덱사메타손 첨가 이전에 Treg에서 유전자 불활성화를 초래하는 것으로 예측된 프레임 밖 indel 빈도는 ~35%였고, 이는 GR2 GRISPR/Cas9 시약으로 처리된 말초 혈액 T 세포에 대해 실험상 관찰된 것과 유사하였다 (~40%). 덱사메타손에서의 배양 후, indel 빈도는 44%로 증가하였다. 어느 이론으로도 제한하지 않으면서, 이는 유전자 변형된 Treg의 우선적 생존을 나타낸다. 덱사메타손 저항성을 획득한 세포는 프레임 밖 indel 풍부화를 보였다.
실시예 4: Treg에서의 상동성 지정 수복
이중 약물 (스테로이드 및 칼시뉴린 억제제) 저항성을 달성하기 위해, Jurkat 및 1차 T 세포를 사용하여 최적의 상동성 지정 수복 (HDR)을 위한 조건을 정의하였다. Cas9 mRNA 및 Cas9 RNP 접근법을 비교하고, 인간 AAVS1 유전자좌에서 리포터 HDR 구축물을 사용하여 HDR을 촉진시킬 수 있는 그의 능력에 대해 평가하였다. 본 연구에서, Cas9 RNP에 이어서, AAV 바이러스 공여자 주형을 발 첨가하였을 때, 최대화되는 것으로 관찰되었다 (>65% HDR 비율). HDR 주형을 디자인하였고, 이는 도 5a에 제시되어 있는 바와 같으며, GFP와 함께 공동 발현되고, MND 프로모터에 의해 구동되는 칼시뉴린 저항성 유전자를 함유하였다. NR3C1 유전자에 상동성인 공여자 표적화 아암이 칼시뉴린 저항성 유전자에 플랭킹되어 있고, 이에 의해 삽입은, 21개의 아미노산 결실을 수반하며, 엑손 2를 파괴시켰다 (도 5a). Treg에서 HDR을 위한 조건을 정의하기 위해, AAV 형질도입에 최적인 배양 조건 (Treg 밀도 2 x 106개의 세포/ml)을 사용하였다. 공여자를 AAV-6 혈청형 바이러스 입자에 패키징하고, GR2 gRNA 및 Cas9 단백질이 전기천공된 Treg에 다양한 다중 감염도 (MOI)로 첨가하였다. 인접한 게놈 유전자좌에서 한 PCR 프라이머는 공여자 내부에 위치하고, 나머지 다른 한 프라이머는 공여자 밖에 위치하는 인사이드-아웃 PCR 전략법을 이용하여 각 MOI에서의 Treg에서 HDR을 관찰하였다 (도 5b). 생어 서열분석 결과, 내인성 유전자좌와 공여자 아암의 접합부가 밝혀졌다 (도 5c).
실시예 5: 최적의 Treg 확장 조건하에 GR2- Cas9 및 AAV를 이용한 Treg에서의 HDR
임상적으로 관련된 배양 환경하에서의 HDR을 최적화하기 위해, 뱅킹된 Treg를 해동시키고, 자극시키고, 2일 동안 확장시킨 후, 이어서, GR2-Cas9를 전기천공시켰다. 전기천공 후, 세포를 MOI 3 x 105로 AAV를 형질도입시키고, 최적의 Treg 확장 조건으로 복귀시켰다. 상기 조건하에서, Treg 확장은 형질도입 후 유의적인 영향을 미치지 않았고 (도 6b), HDR 공여자로부터의 GFP 발현이 관찰되었다 (도 6c). GR2-Cas9 및 CnB mut. AAV로 처리된 Treg 집단은 덱사메타손과 함께 배양되었을 때 생존 증가를 보였다 (도 6d).
실시예 5: 본 발명의 Treg는 >3배 최대 치료 조건에서 CsA 또는 FK506 독성에 대해 비감수성이다
CNI가 Treg 생존 및 확장에 미치는 생체내 억제 효과를 모델링하기 위해, 뱅킹된 Treg를 해동시키고, 재자극시키고, 4 ± 1일 동안 확장시키고, 추가로 2-3일 동안 시클로스포린 (20, 200, 및 2,000 ng/ml) 또는 FK506 (3, 10, 30 ng/ml)으로 처리하거나, 또는 처리하지 않고, 유세포 분석법에 의해 상대적인 생존을 평가하였다. 비-분리 Treg, 나이브 Treg 및 기억 Treg를 이용하여 연구를 수행함으로써 한 하위세트가 Dex 및 CNI에 대해 차별적으로 감수성인지 여부를 결정하고, IL-2 의존도 차이가 더 낮은 IL-2 농도를 허용할 수 있는지 여부를 측정하였다. 3 집단의 결과 파라미터에 있어서 어떤 차이도 관찰되지 않았다.
도 7은 이들 조건하에 시험관내에서 CsA도 FK506도 심지어 최대 치료 값보다 >3배인 농도에서도 Treg 생존에 유의적인 영향을 미지치 않았다. 칼시뉴린, 및 따라서, CNI의 1차 표적들 중 하나는 CD28 하류에서 활성화되고, Treg 발생을 위해 요구되는 전사 인자 NFAT이다. IL-2 신호전달 또한 NFAT를 활성화시킬 수 있다. 어느 이론으로도 제한하지 않으면서, 시험관내에서 Treg에 대해 CsA 및 FK506 독성이 없는 것은 배양물 중 과생리적인 IL-2 농도에 기인할 수 있다. IL-2 농도를 감소시킴으로써 효과를 밝혀낼 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 해동/재자극된 Treg를 최종 3일의 배양 동안 적정된 농도의 IL-2에서 CsA 또는 FK506에 노출시키고, 유세포 분석법에 의해 상대적인 생존을 평가하였다.
실시예 6: Treg의 유전자 변형이 면역억제 환경에서 효능을 증가시킨다는 것을 입증하기 위한 GVHD의 생체내 모델에 대한 글루코코르티코이드 및 칼시뉴린 억제제 플랫폼 확립
유전자 변형된 (GR2-CRISPR/Cas9) 또는 유전자 편집된 (GR2-CRISPR/Cas9/AAV-CaN mut.) Treg가 생체내에서 글루코코르티코이드 존재하에 증가된 효능을 갖는지 여부를 시험하기 위해, 글루코코르티코이드 (메틸-프레드니솔론)가 임상전 마우스 모델에서 어떻게 GVHD에 영향을 주는지를 먼저 결정하였다. 하기와 같은 여러 이유에서 동종이계 GVHD 모델을 사용하였다: 1) Csa의 최적의 GVHD 예방 용량 (80 mg/kg/일 최적 대 20 또는 40 mg/kg/일에서 유익하지 않음) 및 FK506의 최적의 GVHD 예방 용량 [카르복시메틸셀룰로스 중 36 mg/kg/일 (55%-90% 100일째 생존 대 비히클의 경우, 37일째까지 0%], 여기서 수용액 중, 48 mg/kg/일에서 일부 독성 및 12 또는 24 mg/kg/일에서 효능은 더 불량; n = 16-26/군)이 확립되었고; 2) 마우스의 >90%에서 GVHD를 예방하는 최적의 Treg 생성 및 확장 프로토콜, 및 너무 낮아서 GVHD를 균일하게 막지 못한 임계값 Treg:T이펙터 비 (0.75:1이 차선인 것으로 간주되었고; 0.5:1은 <50%의 장기간 생존 수준으로 보호하였다)를 결정하는 추가로 적정된 Treg 용량이 확립되었고; 3) 동종이계 GVHD 모델은 Treg 및 T이펙터 추적, 지속성, 및 기능을 비롯한, GVHD 경로 생리 연구에 맞게 매우 잘 처리될 수 있고, 이는 심도 깊은 Treg 및 T이펙터 연구를 촉진시킨다. 이러한 이유에서 뿐만 아니라, 동종이계 GVHD 모델은 논리적으로 더욱 실현가능하고, 비용 효과면에서 유익하기 때문에, GVHD 예방 및 요법을 위해 동종이계 수용자에서 최적화된 스테로이드 사용을 먼저 시험한 후, 이어서, 이종 모델에 적용하여 인간 Treg 생성물 시험을 가능하게 하였다. 치명적으로 방사선 조사를 받은 C57BL/6 (B6) 공여자 골수의 BALB/c 수용자 + 2 x 106 T 세포를 사용하여, 메틸-프레드니솔론을 1, 3, 및 6 mg/kg/용량인 용량으로 1-28일째에 시험하였고, 그 대비로 라파마이신은 0.5 mg/kg/일로 0-14일째, 이어서, 27일째까지는 3x/주로 시험하였다. 생존 및 p 값은 도 8에 제시되어 있다. T 세포 용량을 1.5 x 106으로 감량시켰고, (1일째 예방보다는) 3일째 또는 4일째를 시작으로 GVHD 요법으로 이동하였고, 비처리를 비히클과 프레드니솔론 (n=8/군)과 비교하였다. 3일째 프레드니솔론을 이용한 GVHD 요법은 결과가 호전되었다 (도 9).
4일째까지 프레드니솔론 처리를 지연시키는 것으로 효과가 없었다. 이어서, 10 mg/kg d3-28 프레드니솔론이 재현가능한지 여부를 결정하는 실험을 수행하였고, 이는 재현가능한 경우인 것으로 관찰되었다 (도 10).
상기 데이터는 스테로이드가 마우스 상당수를 구제할 수 있지만, 치유는 아닌, GVHD의 스테로이드 치료 모델을 제공하며, 스테로이드 저항성 또는 감수성인 Treg 첨가를 시험하기 위한 포럼을 제공한다.
실시예 7: 이종 GVHD 모델에서의 스테로이드 및 칼시뉴린 억제제 기반 GVHD 예방 및 치료 요법 확립
프레드니솔론, Csa 및 FK506의 최적 용량을 결정하기 위해, 비-치명적으로 방사선 조사된 (50 rad), 면역결핍 NOD/Scid/IL-2Rg-/- (NSG) 마우스에 15x106 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 제공하였다. 도 11a에 개요된 바와 같이, 동종이계 GVHD 모델에서는 10 mg/kg에서 오직 불완전한 GVHD가 관찰되었기 때문에, 마우스에 고용량의 프레드니솔론 (30 mg/kg, 0-28일째)을 제공하였다 (도 8-10에 따라). 이러한 프레드니솔론 용량/스케줄은 생존 이점을 제공하지 않았고, 처리된 마우스는 비록 차이가 비유의적이기는 하였지만, 더 낮은 생존 중앙값 (25 대 29일)을 보였다 (도 11b). 생존 이외에도, 체중 감소 및 인간 T 세포 확장이 본 이종-GVHD 모델에서 질환 중증도의 마커로서 제시되었다. 본 실험에서, 프레드니솔론 처리된 것의 평균 체중은 대조군과 유의적으로 상이하지는 않았다 (도 11c). 상기 마우스는 19일째 혈액 중 유의적으로 더 많은 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 가졌다 (도 11d).
CNI가 이종-GVHD 모델에 미치는 효과를 평가하기 위해, 마우스에 일반으로 인간 PBMC를 투약하고, 2개 용량으로 FK506 (36 또는 12 mg/kg) 또는 CsA (80 mg/kg)를 제공하였다 (도 12a). 고용량의 FK506을 받은 마우스는 유의적으로 감소된 생존을 보였고 (p<0.03), 반면, 12 mg/kg FK506을 받은 마우스는 더 낮은 생존 중앙값 (20 대 29일)을 보였고, 생존은 유의적으로 상이하지는 않았다 (도 12b; P=0.45). CsA를 받은 마우스의 경우 성향은 증가된 생존을 보였다 (현재 P=0.15). FK506 및 CsA, 둘 모두 유의적으로 조기에 체중 감소를 초래하였다 (도 12c). FK506 및 CsA, 둘 모두, 인간 CD45+, CD4+ 및 CD8+ 세포의 생체내 확장을 유의적으로 감소시켰다 (도 12d; 각 CNI 코호트에 대해 p<0.05 및 각 세포 유형 대 PBMC만 단독 대조군 동물). 추적 연구 결과, 200 rad + 1 x 107 인간 PBMC로 유도된 이종-GVHD 병상이 더욱 재현가능하고, 생존 중앙값은 ~25일부터 ~20일까지 감소한 것으로 나타났다. 상기 변형된 이종-GVHD 모델에서 저용량의 프레드니손 및 CNI의 효과를 평가하기 위해, 마우스에 방사선 조사하고 (200 rad), 인간 PBMC (iv, 1 x 107)를 주사하고, 프레드니손 (ip, 10 mg/kg), FK506 또는 CsA (ip, 각각 2 mg/kg 또는 20 mg/kg)를 제공하였다 (도 13).
실시예 8: 유전자 편집된 Treg 특징화
전기천공 전 자극성 CD3/28 비드 고갈이 요구되기 때문에, 전기천공이 확장에 대해 부정적인 영향을 미치는지 여부를 평가하였다. 시험관내에서 확장된 나이브 Treg를 해동시키고, CD3/28 비드 (3:1 비드:Treg)로 재자극시키고, 3일째 샘플을 나누고, 한 샘플로부터 비드를 자기적으로 고갈시켰다. 비드 고갈 후, Treg를 복귀시켜 또 다른 4일 동안 배양하였다 (총 7일). 도 14에 제시된 바와 같이, 명시된 바와 같은 다양한 조작 후, 확장에 미치는 어떤 유의적인 영향도 관찰되지 않았다 (n=5).
Treg는 세포외 DNA에 특히 감수성이고, 전기천공이 괴사성 세포 사멸 및 DNA 방출을 유도할 수 있기 때문에, 전기천공이 Treg 확장에 대해 영향을 미치는지 여부를 시험하였다. 시험관내에서 확장된 나이브 Treg를 해동시키고, CD3/28 비드 (3:1 비드:Treg)로 재자극시켰다. 3일째 샘플을 나누고, 비드를 자기적으로 고갈시키고, Treg를 처리 ± 전기천공하고, 이후, 세포를 복귀시켜 또 다른 4일 동안 배양하였다 (총 7일). 전기천공은 확장에 대해 어떤 유의적인 영향도 미치지 않는 것으로 나타났다 (도 14b). 전기천공 효능에 대한 마커로서, Treg의 샘플을 시험관내 전사된 GFP mRNA의 존재하에서 전기천공시켰다. mRNA는 잘 허용되었을 뿐만 아니라, GFP는 모든 세포에서 높은 수준으로 균일하게 발현되었고, 발현은 형질도입 후 적어도 7일 동안 지속되었다 (도 14c 및 14d).
실시예 9: Treg에서의 염기 편집
Treg 세포를 단백질로서 염기 에디터, 또는 상기 염기 에디터를 코딩하는 mRNA의 전기천공에 의해, 상기 염기 에디터를 이용하는 편집을 위한 표적 염기에 대한 가이드 RNA와 함께 하여 염기 편집하였다. 이어서, 편집된 세포의 게놈 DNA를 단리시키고, 표적 유전자좌를 PCR 증폭시켰다. 이어서, PCR 증폭된 유전자좌를 생어 서열분석에 의해 서열분석하였다. 표적 부위에서 다중 피크를 확인함으로써 염기 전환을 관찰하였다. 이어서, EDITR 방법을 이용하여 PCR 앰플리콘 서열 데이터를 분해하여 염기 편집 빈도를 정량화하였다 (문헌 [Kluesner et al. "EditR: A novel base editing quantification software using Sanger sequenceing".DOI: 10.1101/213496. 2017] 참조). 도 19-22, 및 24-27의 경우, 염기 편집된 서열은 적색의 개방형 박스로 표시되어 있다.
도 16은 CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인이 dCas9이고, 염기-편집 도메인이 시티딘 데아미나제인 염기 편집을 보여주는 개략도를 도시한 것이다. 염기 편집은 단리된 Treg에서 도 17에 제시된 흐름도에 따라 수행되었다. 염기 에디터는 RNP 복합체로서 전달될 수 있고, 이에 의해 가이드 RNA는 내인성 RNAse에 의한 세포내 분해를 막기 위해 포스포로티오에이트 결합을 갖도록 변형될 수 있거나, 또는 변형되지 않을 수 있다. 본 출원의 경우, 염기 에디터는 메신저 RNA로서 전달되었고, 가이드 RNA는 세포내 분해를 막기 위해 5' 및 3' 포스포로티오에이트 결합을 함유하도록 합성되었다. 염기 편집 표적화 디자인은 조기 정지 코돈을 도입하도록 뉴클레오티드을 전환시키기 위해 의도/디자인되었다. 추가로, 인트론 절제 및 적절한 오픈 리딩 프레임 배향 및 발현을 위해 요구되는, 스플라이스 공여자 및 수용자로서 정의된 서열 at 엑손:인트론 경계부의 서열 또한 스플라이싱을 파괴시키기 위해서 전환을 위해 표적화하였다. 인트론을 보유하며 적절한 스플라이싱된 RNA는 RNA를 불안정화시킴으로써 단백질을 분해시키고, 단백질 발현을 손실시킨다.
염기 편집을 수행하여 NR3C1의 엑손 2에 조기 정지 코돈을 도입하였다. 서열식별번호 7에 기재된 서열을 갖는 가이드 RNA 및 염기 에디터 mRNA를 이용한 Treg의 전기천공을 수행하였다. 유전자의 유전자좌의 서열분석 결과, 염기 편집으로 게놈 서열 중 시토신 (C)이 티미딘 (T)으로 편집되어 미성숙한 TAA 정지 코돈을 생성한 것으로 나타났다 (도 18 및 19).
염기 편집을 수행하여 NR3C1의 엑손 2에 조기 정지 코돈을 도입하였다. 서열식별번호 8에 기재된 서열을 갖는 가이드 RNA 및 염기 에디터 mRNA를 이용한 Treg의 전기천공을 수행하였다. 유전자의 유전자좌의 서열분석 결과, 염기 편집으로 게놈 서열 중 시토신 (C)이 티미딘 (T)으로 편집되어 미성숙한 TAG 정지 코돈을 생성한 것으로 나타났다 (도 20 및 21).
도 22는 가상 유전자의 스플라이스 부위를 파괴시키는 결과를 나타낸 개략도를 도시한 것이다. 스플라이스 공여자 또는 스플라이스 수용자 부위의 염기 편집이 유전자의 정상적인 스플라이싱을 파괴시킬 수 있고, 그 결과로 유전자 발현은 하향조절될 수 있다.
염기 편집을 수행하여 NR3C1에서 스플라이스 수용자를 파괴시켰다. 서열식별번호 55에 기재된 서열을 갖는 가이드 RNA 및 염기 에디터 mRNA를 이용한 Treg의 전기천공을 수행하였다. 유전자의 유전자좌의 서열분석 결과, 염기 편집으로 게놈 서열 중 아데노신 (A)이 구아닌 (G)으로 편집되어 돌연변이체 GG 스플라이스 수용자 부위를 생성한 것으로 나타났다 (도 23 및 24).
염기 편집을 수행하여 NR3C1에서 스플라이스 공여자를 파괴시켰다. 서열식별번호 56에 기재된 서열을 갖는 가이드 RNA 및 염기 에디터 mRNA를 이용한 Treg의 전기천공을 수행하였다. 유전자의 유전자좌의 서열분석 결과, 염기 편집으로 게놈 서열 중 구아닌 (G)이 아데노신 (A)으로 편집되어 돌연변이체 스플라이스 공여자 부위를 생성한 것으로 나타났다 (도 25 및 26).
실시예 10: 이펙터 T 세포에서의 염기 편집
단백질로서 염기 에디터, 또는 상기 염기 에디터를 코딩하는 mRNA의 전기천공에 의해, 상기 염기 에디터를 이용하여 편집하기 위한 염기를 표적화하는 가이드 RNA와 함께함으로써 이펙터 T 세포 (Teff)를 염기 편집하였다. 도 27은 2개의 실험에 대한 일반 개요를 도시한 것이다. 한 실험에서는 이펙터 T 세포 (Teff)에서 BE4를 사용하여 글루코코르티코이드 수용체 유전자좌를 염기 편집하였고, 2 라운드의 비드 자극을 수행하였다. 제2 실험에서는 BE4를 사용하여 이펙터 T 세포에서 글루코코르티코이드 수용체 유전자좌를 염기 편집하였지만, 단 1 라운드의 비드 자극만을 수행하였다. 도 28은 덱사메타손의 존재 또는 부재하에서 gRNA GR2 (표 1에서 서열식별번호 8) 또는 BE4 (표 2에서 서열식별번호 20)를 사용하여 변형된 공여자로부터의 글루코코르티코이드 수용체 염기 편집 이후 CD4+ 이펙터 T 세포(Teffs)의 상대적인 생존율(%)을 보여주는 데이터를 도시한 것이다. 제1 공여자의 세포는 2 라운드의 자극을 받았고, 제2 공여자의 세포는 1 라운드의 자극을 받았다. 2 라운드의 자극을 받은 Teff는 덱사메타손 (Dex)에 대하여 매우 높은 감수성을 보였다. 2 라운드의 BE4를 이용하여 이루어진 편집은 두 실험 모두에서 30 ㎍/ml의 GR2보다 더욱 효과적이었다 (각각 p ≤ 0.001, p ≤ 0.01).
SEQUENCE LISTING <110> Regents of the University of Minnesota Osborn, Mark J Hippen, Keli L Blazer, Bruce R <120> TREG GENOME ENGINEERING FOR STEROID AND CALCINEURIN INHIBITOR RESISTANCE <130> 920171.00229 <150> US 62/672,868 <151> 2018-05-17 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 521 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Met Ser Glu Pro Lys Ala Ile Asp Pro Lys Leu Ser Thr Thr Asp Arg 1 5 10 15 Val Val Lys Ala Val Pro Phe Pro Pro Ser His Arg Leu Thr Ala Lys 20 25 30 Glu Val Phe Asp Asn Asp Gly Lys Pro Arg Val Asp Ile Leu Lys Ala 35 40 45 His Leu Met Lys Glu Gly Arg Leu Glu Glu Ser Val Ala Leu Arg Ile 50 55 60 Ile Thr Glu Gly Ala Ser Ile Leu Arg Gln Glu Lys Asn Leu Leu Asp 65 70 75 80 Ile Asp Ala Pro Val Thr Val Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Phe Phe 85 90 95 Asp Leu Met Lys Leu Phe Glu Val Gly Gly Ser Pro Ala Asn Thr Arg 100 105 110 Tyr Leu Phe Leu Gly Asp Tyr Val Asp Arg Gly Tyr Phe Ser Ile Glu 115 120 125 Cys Val Leu Tyr Leu Trp Ala Leu Lys Ile Leu 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Asp Val Phe Thr Trp 340 345 350 Ser Leu Pro Phe Val Gly Glu Lys Val Thr Glu Met Leu Val Asn Val 355 360 365 Leu Asn Ile Cys Ser Asp Asp Glu Leu Gly Ser Glu Glu Asp Gly Phe 370 375 380 Asp Gly Ala Thr Ala Ala Ala Arg Lys Glu Val Ile Arg Asn Lys Ile 385 390 395 400 Arg Ala Ile Gly Lys Met Ala Arg Val Phe Ser Val Leu Arg Glu Glu 405 410 415 Ser Glu Ser Val Leu Thr Leu Lys Gly Leu Thr Pro Thr Gly Met Leu 420 425 430 Pro Ser Gly Val Leu Ser Gly Gly Lys Gln Thr Leu Gln Ser Ala Thr 435 440 445 Val Glu Ala Ile Glu Ala Asp Glu Ala Ile Lys Gly Phe Ser Pro Gln 450 455 460 His Lys Ile Thr Ser Phe Glu Glu Ala Lys Gly Leu Asp Arg Ile Asn 465 470 475 480 Glu Arg Met Pro Pro Arg Arg Asp Ala Met Pro Ser Asp Ala Asn Leu 485 490 495 Asn Ser Ile Asn Lys Ala Leu Thr Ser Glu Thr Asn Gly Thr Asp Ser 500 505 510 Asn Gly Ser Asn Ser Ser Asn Ile Gln 515 520 <210> 2 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Met Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Met Cys Ser His Phe Asp 1 5 10 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aaaaacactg atcttacctt gaatagccat 540 tagaaaaaac tgttcgacca gggaagttca gagtccccag agaagtcaag ttgtcatctc 600 cagatccttg gcacctattc caattttcgg aaccaacggg aattggtgga atgacattaa 660 aaataggctt ctgatcctgc tgttgagaaa gggatgctgt attcatgtca tagtggtaca 720 tctgtcctcc agaggtactc acaccatgaa cagaaatggc agacatttta ttaccaatta 780 tatttgctcc aggaaagctt gcctgacagt aaactgtgcc cagtttctct tgcttaatta 840 ccccaggggt gcagagttcg atgaaatctt ctttttctgt tttcacttgg ggcagtgtta 900 cattactggg gcttgacaaa accagatctc cattatcctt aattttgggt ttagtgtccg 960 gtaaaatgag aggcttgcag tcctcattcg agtttccttc caaaaggaat gaatcgtctt 1020 ctcccgccag aggagaaagc aaacagtttt catctatcaa caggtctgat ctccaaggac 1080 tctcattcgt ctctttacct ggggacccag aagaaaactc caaatcctgc aaaatgtcaa 1140 aggtgctttg gtctgtggta tacaatttca cattgccacc gttggtgcca gtctggccct 1200 tcaaatgttg ctgttctgaa gatacatcag agtgagtttt tggaaactcc ttctctgtgg 1260 gggcagcaga cacagcagtg gatgctgaac tcttggggtt ctctggaaca ctggtcgacc 1320 tattgaggtt tgcaatgctt tcttccaaaa gctttaagtc 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tgatcgacat cttcgacacc 2220 gacggcaacg gcgaggtgga cttcaaggag ttcatcgagg gcgtgagcca gttcagcgtg 2280 aagggcgaca aggagcagaa gctgcggttc gccttccgga tctacgatat ggataaagat 2340 ggctatattt ctaatggcga gctgttccag gtgctgaaga tgatggtggg caacaatacc 2400 aagctggccg atacccagct gcagcagatc gtggacaaga ccatcatcaa cgccgacaag 2460 gacggcgacg gcagaatcag cttcgaggag ttctgtgccg tggtgggagg cctggatatt 2520 cacaaaaaaa tggtggtgga cgtgctcgag ggcggcggag agggcagagg aagtcttcta 2580 acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc cctagggtaa gcaaggggga ggagctgttc 2640 accggcgtag tacctatact ggtcgagttg gatggggacg tgaacggcca taaattctct 2700 gtgtctgggg agggcgaagg tgatgcgacc tacggaaagc tcaccctcaa attcatttgt 2760 acaacgggta agctgcctgt tccgtggccc accttggtaa ctaccttgac ttatggtgtc 2820 cagtgcttct ccaggtaccc agatcacatg aagcagcacg acttcttcaa atccgccatg 2880 cctgaaggct atgtgcaaga gcggacaatt ttttttaagg acgatggcaa ctataagact 2940 cgagccgaag ttaaatttga gggagacacc cttgtcaata ggatcgagct taaaggcatt 3000 gattttaagg aagacggaaa tatattgggc cataagctgg agtataacta caatagtcat 3060 aacgtgtaca tcatggctga caagcagaag aacgggatta aggtaaattt taagatcagg 3120 cataacatag aggacgggag cgtccaactt gccgaccact accagcaaaa taccccgata 3180 ggcgatggtc ctgtactgtt gccggataat cactacctct ctacgcaatc cgcgcttagt 3240 aaggatccta acgagaaacg cgaccacatg gtgcttctgg agttcgtaac tgctgctggc 3300 atcacacttg gcatggacga attgtacaaa tagcgctgat cagcctcgac tgtgccttct 3360 agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc 3420 actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt 3480 cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat 3540 agcaggcatg ctggggaagc tcgattgaga agcgacagcc agtgagggtg aagacgcaga 3600 aaccttcaca gtagctcctc ctcttagggt tttatagaag tccatcacat ctcccctctc 3660 ctgagcaagc acactgctgg ggttttcttc tctaccagga gttaatgatt ctttggagtc 3720 catcagtgaa tatcaactac aaaacaaaaa acaaaaacgg ggggaaaaca tcataagctc 3780 taaagtcaca ttatcttcct gatccgatta gtaagaggca gcttgttaaa tgaacctttt 3840 agttaactcc gaatcaaatt ctttgttacc agaagagtag tttctatctt ccagaataaa 3900 aagccatgtc ccctgctccc attcagcatg ccacatttaa aagtacaatg caatccattt 3960 gcacagctga gggcaaaagt gtatcgaact aagcttggct attcatcctg ccgctcactg 4020 aacgtgtagc tttgttaatc acagacatta taattcatta catctgatta ttctgaaggt 4080 tcaagttgat gtcaaagtat ttaatttcaa aaaaaggaag tgtgatcatt aaaattccta 4140 cctcttttca atcacggctg tttgcttttc tgagaaccaa tacatataac atttgataaa 4200 tactatgcta gaattctcaa tccctaatta cttccaaatt tccctcctac cagctagtca 4260 cacatccaaa cctttgagta caaccaactg gtgaaccatg cacgttttct ttgaaaaata 4320 aacaatgctg atctgcttat cttccgacag gctgggaaaa ggctttttaa cccatacttc 4380 tgactggatg tgcctacctc caaattttgg atatatgaaa tgagatacac tttatatagg 4440 ccaactaaaa tttagatttt aaagagcaga agagaaggtg tagtagtttc tcactacgtt 4500 gttagcttac ataacttaaa tatagctgac ccttatcata actcacaaaa acatctagat 4560 taagctacat ttgtttacat tgcttgagat cctcaatatg aaatgctatt acatctctaa 4620 gttctttcct ttccaaacaa atatcgaagt actgaaaaat ggaaaaacac agaaccgtaa 4680 aatcacattc atataaattc aggtacaact gtatccagta aaatgttcaa aataattttc 4740 tctgccttca cctatccaaa ccttcaccta tcccaattct cagcctattc tcaagagagt 4800 aagactgtta gtatatcgtt aatcagggtg ttttaagaga tgggctaaga cggagaagcg 4860 catttgggac actatagtca aatcccgtcc aataaaaggt aacttttcct atgcgatgac 4920 gttaggcagc ataaatgtca ctggccctca ctgaaaagtg aatatgaagg tagagagagg 4980 ggtgtggact tgccactaca aatcttgagg gtaaactgct tatctcccca cctctctgcc 5040 ccgtttatct gaggcgataa cgatctctaa acacgag 5077 <210> 67 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 67 Met Ala Gly Pro His Pro Val Ile Val Ile Thr Gly Pro His Glu Glu 1 5 10 15

Claims (172)

  1. NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌에 유전자 변형을 포함하는, 스테로이드-저항성 CRISPR-변형된 세포이며, 여기서 변형은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고, 여기서 변형은 NR3C1의 엑손, 스플라이스 공여자, 또는 스플라이스 수용자에 위치하고, 여기서 변형된 세포는 상기 유전자 변형의 결과로서 스테로이드-저항성이 되는 것인, 스테로이드-저항성 CRISPR-변형된 세포.
  2. 제1항에 있어서, 세포가 만능성 줄기 세포, 조혈 전구체 세포, 또는 조혈 세포인 변형된 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 변형이 CRISPR-Cas9 시스템, CRISPR-Cpf1 시스템, Cas9 오르토로그, Cas9 파라로그, Cas-관련 패밀리 구성원, 아연 핑거, TALEN, 또는 메가뉴클레아제에 의해 매개되는 것인 변형된 세포.
  4. 제1항에 있어서, 변형이 indel인 변형된 세포.
  5. 제4항에 있어서, indel이 NR3C1의 엑손 2에 위치하는 것인 변형된 세포.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, NR3C1에서 indel이 CRISPR 시스템에 의해 매개되는 것인 변형된 세포.
  7. 제3항 또는 제6항에 있어서, CRISPR 시스템이 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 것인 변형된 세포.
  8. 제7항에 있어서, 가이드 RNA가 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  9. 제7항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호(SEQ ID NO:) 7-10 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  10. 제7항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  11. 제1항에 있어서, 변형이 염기쌍 치환인 변형된 세포.
  12. 제11항에 있어서, NR3C1에서 치환이 CRISPR 시스템에 의해 매개되는 것인 변형된 세포.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, CRISPR 시스템이 염기 에디터 및 가이드 RNA를 포함하는 것인 변형된 세포.
  14. 제13항에 있어서, 염기 에디터가 CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인 또는 그의 변이체, 및 염기-편집 도메인을 포함하는 것인 변형된 세포.
  15. 제14항에 있어서, CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인이 Cas9 도메인인 변형된 세포.
  16. 제14항에 있어서, CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인이 변이체 Cas9 도메인인 변형된 세포.
  17. 제16항에 있어서, 변이체 Cas9 도메인이 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인인 변형된 세포.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 염기-편집 도메인이 데아미나제 도메인인 변형된 세포.
  19. 제18항에 있어서, 데아미나제 도메인이 시토신 또는 아데닌에 대해 특이성을 갖는 것인 변형된 세포.
  20. 제18항에 있어서, 데아미나제 도메인이 시티딘 또는 아데노신 데아미나제인 변형된 세포.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 치환이 NR3C1에 조기 정지 코돈을 도입하여 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절하는 것인 변형된 세포.
  22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 NR3C1의 엑손 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  23. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  24. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호 17-54 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  25. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 NR3C1의 스플라이스 수용자 또는 스플라이스 공여자를 포함하는 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  26. 제25항에 있어서, 치환이 NR3C1 mRNA의 스플라이싱을 파괴시켜 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 것인 변형된 세포.
  27. 제25항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호 55 또는 56 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 코르티코스테로이드에 대해 저항성인 변형된 세포.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 글루코코르티코스테로이드에 대해 저항성인 변형된 세포.
  30. 제29항에 있어서, 글루코코르티코스테로이드가 프로게스테론-타입 글루코코르티코스테로이드, 히드로코르티손-타입 글루코코르티코스테로이드, 메타손-타입 글루코코르티코스테로이드, 및 아세토니드-타입 글루코코르티코스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변형된 세포.
  31. 제29항에 있어서, 글루코코르티코스테로이드가 덱사메타손, 베타메타손, 히드로코르티손 (코르티솔), 프레드니손, 프레드니솔론, 로테프레드놀, 데플라자코트, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 플루드로코르티손, 및 데옥시코르티코스테론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변형된 세포.
  32. 세포의 게놈에 외인성 칼시뉴린 억제제 (CNI) 저항성 유전자를 포함하는 칼시뉴린 억제제 (CNI)-저항성, 유전자 변형된 세포이며, 여기서 CNI-저항성 유전자는 CRISPR-매개된 상동성 지정 수복 (HDR)의 결과로서 삽입되고, 여기서 변형된 세포는 상기 저항성 유전자의 결과로서 CNI-저항성이 되는 것인, 칼시뉴린 억제제 (CNI)-저항성, 유전자 변형된 세포.
  33. 제32항에 있어서, 세포가 만능성 줄기 세포, 조혈 전구체 세포, 또는 조혈 세포인 변형된 세포.
  34. 제32항에 있어서, 유전자 변형이 CRISPR-Cas9 시스템, CRISPR-Cpf1 시스템, Cas9 오르토로그, Cas9 파라로그, Cas-관련 패밀리 구성원, 아연 핑거, TALEN, 또는 메가뉴클레아제에 의해 매개되는 것인 변형된 세포.
  35. 제32항에 있어서, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자가 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌에 삽입되는 것인 변형된 세포.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자가 PPP3Ca, PPP3Cb 및 PPP3Cc로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 A (CNa) 유전자의 돌연변이체 형태, 또는 PPP3R1 및 PPP3R2로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 B (CNb) 유전자의 돌연변이체 형태인 변형된 세포.
  37. 제36항에 있어서, 돌연변이체 칼시뉴린 유전자가 외인성 공여자 DNA 서열을 사용하여 상동성 재조합을 통해 NR3C1 유전자좌 내로 삽입되는 것인 변형된 세포.
  38. 제37항에 있어서, 외인성 공여자 DNA 서열이 서열식별번호 11에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  39. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자가 칼시뉴린 변이체 단백질을 코딩하는 것인 변형된 세포.
  40. 제39항에 있어서, 칼시뉴린 변이체 단백질이 CNa12, CNa22, 및 CNb30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변형된 세포.
  41. 제39항에 있어서, 칼시뉴린 변이체가 서열식별번호 3-5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 칼시뉴린 변이체 단백질이 칼시뉴린 억제제에는 결합하지만, 칼시뉴린에는 결합하지 않고, 이에 의해 칼시뉴린 억제제를 격리시키고, 칼시뉴린 억제를 막는 것인 변형된 세포.
  43. 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 시클로스포린 A (CsA), 보클로스포린, 타크로리무스 (FK-506, 후지마이신), 피메크로리무스, 및 그의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 억제제에 대해 저항성인 변형된 세포.
  44. (1) NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌에 indel을 포함하는 제1 유전자 변형이며, 여기서 indel은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 것인 제1 유전자 변형, 및 (2) 세포의 게놈 내로 삽입된 외인성 칼시뉴린 억제제 (CNI) 저항성 유전자를 포함하는 제2 유전자 변형이며, 여기서 CNI 저항성 유전자는 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중의 indel 부위에 잔류하는 것인 제2 유전자 변형을 포함하는, 유전자 변형된, 스테로이드-저항성 및 CNI-저항성 세포이며, 여기서 변형된 세포는 상기 유전자 변형의 결과로서 스테로이드- 및 CNI-저항성이 되는 것인, 유전자 변형된, 스테로이드-저항성 및 CNI-저항성 세포.
  45. 제44항에 있어서, 세포가 만능성 줄기 세포, 조혈 전구체 세포, 또는 조혈 세포인 변형된 세포.
  46. 제44항에 있어서, 유전자의 유전자좌가 NR3C1의 엑손 2에 상응하는 것인 변형된 세포.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, indel이 서열식별번호 7-10 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템에 의해 매개되는 것인 변형된 세포.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, indel이 서열식별번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템에 의해 매개되는 것인 변형된 세포.
  49. (1) NR3C1 유전자의 유전자좌에 변형을 포함하는 제1 유전자 변형이며, 여기서 변형은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 것인 제1 유전자 변형, 및 (2) 세포의 게놈 내로 삽입된 외인성 칼시뉴린 억제제 (CNI) 저항성 유전자를 포함하는 제2 유전자 변형을 포함하는, 유전자 변형된, 스테로이드-저항성 및 CNI-저항성 세포이며, 여기서 변형된 세포는 상기 유전자 변형의 결과로서 스테로이드- 및 CNI-저항성이 되는 것인, 유전자 변형된, 스테로이드-저항성 및 CNI-저항성 세포.
  50. 제49항에 있어서, 세포가 만능성 줄기 세포, 조혈 전구체 세포, 또는 조혈 세포인 변형된 세포.
  51. 제49항에 있어서, 제1 또는 제2 변형이 CRISPR-Cas9 시스템, CRISPR-Cpf1 시스템, Cas9 오르토로그, Cas9 파라로그, Cas-관련 패밀리 구성원, 아연 핑거, TALEN, 또는 메가뉴클레아제에 의해 매개되는 것인 변형된 세포.
  52. 제49항에 있어서, 변형이 indel인 변형된 세포.
  53. 제52항에 있어서, indel이 NR3C1의 엑손 2에 위치하는 것인 변형된 세포.
  54. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, NR3C1에서 indel이 CRISPR 시스템에 의해 매개되는 것인 변형된 세포.
  55. 제54항에 있어서, CRISPR 시스템이 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 것인 변형된 세포.
  56. 제55항에 있어서, 가이드 RNA가 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호 7-10 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  59. 제49항에 있어서, 변형이 염기쌍 치환인 변형된 세포.
  60. 제59항에 있어서, NR3C1에서 치환이 CRISPR 시스템에 의해 매개되는 것인 변형된 세포.
  61. 제60항에 있어서, CRISPR 시스템이 염기 에디터 및 가이드 RNA를 포함하는 것인 변형된 세포.
  62. 제61항에 있어서, 염기 에디터가 CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인 또는 그의 변이체, 및 염기-편집 도메인을 포함하는 것인 변형된 세포.
  63. 제62항에 있어서, CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인이 Cas9 도메인인 변형된 세포.
  64. 제62항에 있어서, CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인이 변이체 Cas9 도메인인 변형된 세포.
  65. 제64항에 있어서, 변이체 Cas9 도메인이 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인인 변형된 세포.
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 염기-편집 도메인이 데아미나제 도메인인 변형된 세포.
  67. 제66항에 있어서, 데아미나제 도메인이 시토신 또는 아데닌에 대해 특이성을 갖는 것인 변형된 세포.
  68. 제66항에 있어서, 데아미나제 도메인이 시티딘 또는 아데노신 데아미나제인 변형된 세포.
  69. 제59항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 치환이 NR3C1에 조기 정지 코돈을 도입하여 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절하는 것인 변형된 세포.
  70. 제61항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 NR3C1의 엑손 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  71. 제61항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  72. 제61항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호 17-54 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  73. 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 NR3C1의 스플라이스 수용자 또는 스플라이스 공여자를 포함하는 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  74. 제73항에 있어서, 치환이 NR3C1 mRNA의 스플라이싱을 파괴시켜 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 것인 변형된 세포.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호 55 또는 56 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  76. 제49항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 코르티코스테로이드에 대해 저항성인 변형된 세포.
  77. 제49항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 글루코코르티코스테로이드에 대해 저항성인 변형된 세포.
  78. 제77항에 있어서, 글루코코르티코스테로이드가 프로게스테론-타입 글루코코르티코스테로이드, 히드로코르티손-타입 글루코코르티코스테로이드, 메타손-타입 글루코코르티코스테로이드, 및 아세토니드-타입 글루코코르티코스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변형된 세포.
  79. 제77항에 있어서, 글루코코르티코스테로이드가 덱사메타손, 베타메타손, 히드로코르티손 (코르티솔), 프레드니손, 프레드니솔론, 로테프레드놀, 데플라자코트, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 플루드로코르티손, 및 데옥시코르티코스테론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변형된 세포.
  80. 제49항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자가 PPP3Ca, PPP3Cb 및 PPP3Cc로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 A (CNa) 유전자의 돌연변이체 형태, 또는 PPP3R1 및 PPP3R2로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 B (CNb) 유전자의 돌연변이체 형태인 변형된 세포.
  81. 제49항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자가 칼시뉴린 변이체 단백질을 코딩하는 것인 변형된 세포.
  82. 제81항에 있어서, 칼시뉴린 변이체 단백질이 CNa12, CNa22, 및 CNb30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 변형된 세포.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 칼시뉴린 변이체 단백질이 서열식별번호 3-5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 변형된 세포.
  84. 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 칼시뉴린 변이체 단백질이 칼시뉴린 억제제에는 결합하지만, 칼시뉴린에는 결합하지 않고, 이에 의해 칼시뉴린 억제제를 격리시키고, 칼시뉴린 억제를 막는 것인 변형된 세포.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 칼시뉴린 유전자가 외인성 공여자 DNA 서열을 사용하여 상동성 재조합을 통해 세포의 게놈 내로 삽입되는 것인 변형된 세포.
  86. 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 칼시뉴린 유전자가 NR3C1 유전자좌 내로 삽입되는 것인 변형된 세포.
  87. 제49항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 시클로스포린 A (CsA), 보클로스포린, 타크로리무스 (FK-506, 후지마이신), 피메크로리무스, 및 그의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 억제제에 대해 저항성인 변형된 세포.
  88. 제49항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 변형된 면역 세포인 변형된 세포.
  89. 제49항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 변형된 조절 T 세포 (Treg)인 변형된 세포.
  90. 제49항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 변형된 이펙터 T 세포 (Teff)인 변형된 세포.
  91. 제49항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 자가유래 세포인 변형된 세포.
  92. 제49항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 동종이계 세포인 변형된 세포.
  93. 제49항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 인간 대상체로부터 단리된 것인 변형된 세포.
  94. 제93항에 있어서, 인간 대상체가 줄기 세포 이식편을 받았거나 또는 줄기 세포 이식 후보인 변형된 세포.
  95. 제93항에 있어서, 인간 대상체가 고형 기관 이식편을 받았거나 또는 고형 기관 이식 후보인 변형된 세포.
  96. 제93항에 있어서, 인간 대상체가 자가면역 장애를 앓는 것인 변형된 세포.
  97. 제93항에 있어서, 인간 대상체가 이식편대숙주질환 (GVHD)을 앓는 것인 변형된 세포.
  98. 제93항에 있어서, 인간 대상체가 1형 당뇨병을 앓는 것인 변형된 세포.
  99. NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌에서 변형을 일으키는 유전자 편집 시스템을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 변형은 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 것인, 변형된 세포를 생성하는 방법.
  100. 제99항에 있어서, 세포가 만능성 줄기 세포, 조혈 전구체 세포, 또는 조혈 세포인 방법.
  101. 제99항에 있어서, 변형이 NR3C1의 엑손 2 중의 indel인 방법.
  102. 제99항에 있어서, 유전자 편집 시스템이 CRISPR 시스템인 방법.
  103. 제102항에 있어서, CRISPR 시스템이 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 것인 방법.
  104. 제103항에 있어서, 가이드 RNA가 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 방법.
  105. 제103항 또는 제104항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호 7-10 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  106. 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호 8에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  107. 제99항에 있어서, 변형이 염기쌍 치환인 방법.
  108. 제102항에 있어서, CRISPR 시스템이 염기 에디터 및 가이드 RNA를 포함하는 것인 방법.
  109. 제108항에 있어서, 염기 에디터가 CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인 또는 그의 변이체, 및 염기-편집 도메인을 포함하는 것인 방법.
  110. 제109항에 있어서, CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인이 Cas9 도메인인 방법.
  111. 제109항에 있어서, CRISPR 비활성화된 또는 니킹 DNA 결합 도메인이 변이체 Cas9 도메인인 방법.
  112. 제111항에 있어서, 변이체 Cas9 도메인이 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인인 방법.
  113. 제109항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 염기-편집 도메인이 데아미나제 도메인인 방법.
  114. 제113항에 있어서, 데아미나제 도메인이 시토신 또는 아데닌에 대해 특이성을 갖는 것인 방법.
  115. 제113항에 있어서, 데아미나제 도메인이 시티딘 또는 아데노신 데아미나제의 것인 방법.
  116. 제107항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 치환이 NR3C1에 조기 정지 코돈을 도입하여 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절하는 것인 방법.
  117. 제108항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 NR3C1의 엑손 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 방법.
  118. 제108항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 NR3C1의 엑손 2 중의 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 방법.
  119. 제108항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호 17-54 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  120. 제108항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 NR3C1의 스플라이스 수용자 또는 스플라이스 공여자를 포함하는 표적 서열과 충분히 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 방법.
  121. 제120항에 있어서, 치환이 NR3C1 mRNA의 스플라이싱을 파괴시켜 NR3C1의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 것인 방법.
  122. 제120항 또는 제121항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호 55-56 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  123. 제99항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR 뉴클레아제/염기 에디터 및 가이드 RNA가 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체를 포함하는 것인 방법.
  124. 제99항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR 뉴클레아제/염기 에디터 및/또는 가이드 RNA가 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
  125. 제124항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 벡터 및/또는 합성 mRNA를 포함하는 것인 방법.
  126. 제123항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, RNP 또는 폴리뉴클레오티드가 전기천공에 의해 도입되는 것인 방법.
  127. 제99항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자의 세포의 게놈 내로의 삽입을 추가로 포함하는 방법.
  128. 제127항에 있어서, 외인성 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자의 삽입이 상동성 재조합을 통해 이루어지는 것인 방법.
  129. 제127항 또는 제128항에 있어서, 삽입이 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중 indel 부위에서 이루어지는 것인 방법.
  130. 제127항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입이 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중 indel 부위에서 이루어지는 것인 방법.
  131. 제127항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입이 외인성 공여자 DNA 서열로부터의 상동성 재조합을 통해 NR3C1을 코딩하는 유전자의 유전자좌 중 indel 부위에서 이루어지는 것인 방법.
  132. 제131항에 있어서, 외인성 공여자 DNA 서열이 서열식별번호 11에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  133. 제131항 또는 제132항에 있어서, 외인성 공여자 DNA 서열이 바이러스 형질도입을 통해 도입되는 것인 방법.
  134. 제131항 또는 제132항에 있어서, 외인성 공여자 DNA 서열이 전기천공을 통해 도입되는 것인 방법.
  135. 제131항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 공여자 DNA 서열이 리포터 분자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인 방법.
  136. 제135항에 있어서, 프로모터 및 리포터 분자를 코딩하는 핵산이 링커에 의해 분리되어 있는 것인 방법.
  137. 제136항에 있어서, 링커가 T2A 서열을 포함하는 것인 방법.
  138. 제132항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자가 PPP3Ca, PPP3Cb 및 PPP3Cc로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 A (CNa) 유전자의 돌연변이체 형태, 또는 PPP3R1 및 PPP3R2로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼시뉴린 B (CNb) 유전자의 돌연변이체 형태인 방법.
  139. 제132항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 칼시뉴린 억제제 저항성 유전자가 칼시뉴린 변이체 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  140. 제139항에 있어서, 칼시뉴린 변이체 단백질이 CNa12, CNa22, 및 CNb30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  141. 제139항 또는 제140항에 있어서, 칼시뉴린 변이체 단백질이 서열식별번호 3-5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  142. 제99항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 변형된 면역 세포인 방법.
  143. 제99항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 변형된 조절 T 세포 (Treg)인 방법.
  144. 제99항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 변형된 이펙터 T 세포 (Teff)인 방법.
  145. 제99항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 자가유래 세포인 방법.
  146. 제99항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 동종이계 세포인 방법.
  147. 제99항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 인간 대상체로부터 단리된 것인 방법.
  148. 제147항에 있어서, 인간 대상체가 줄기 세포 이식편을 받았거나 또는 줄기 세포 이식 후보인 방법.
  149. 제147항에 있어서, 인간 대상체가 고형 기관 이식편을 받았거나 또는 고형 기관 이식 후보인 방법.
  150. 제147항에 있어서, 인간 대상체가 자가면역 장애를 앓는 것인 방법.
  151. 제147항에 있어서, 인간 대상체가 이식편대숙주질환 (GVHD)을 앓는 것인 방법.
  152. 제147항에 있어서, 인간 대상체가 1형 당뇨병을 앓는 것인 방법.
  153. 면역억제 효과 달성을 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 변형된 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 면역억제 효과 달성을 필요로 하는 대상체에서 면역억제 효과를 달성하는 방법.
  154. 제153항에 있어서, 대상체가 동종반응 및/또는 자가면역 반응을 앓는 것인 방법.
  155. 동종반응 및/또는 자가면역 반응 발병 이전에 예방적 치료 효과 달성을 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 변형된 세포의 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 예방적 치료 효과 달성을 필요로 하는 대상체에서 예방적 치료 효과를 달성하는 방법.
  156. 제155항에 있어서, 동종반응 및/또는 자가면역 반응이 생물학적 물질의 이식 이후에 일어나는 것인 방법.
  157. 제156항에 있어서, 생물학적 물질이 세포, 조직, 및 기관으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  158. 제156항 또는 제157항에 있어서, 생물학적 물질이 동종이계인 방법.
  159. 제153항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  160. 제159항에 있어서, 인간 대상체가 줄기 세포 이식편을 받았거나 또는 줄기 세포 이식 후보인 방법.
  161. 제159항에 있어서, 인간 대상체가 고형 기관 이식편을 받았거나 또는 고형 기관 이식 후보인 방법.
  162. 제159항에 있어서, 인간 대상체가 자가면역 장애를 앓는 것인 방법.
  163. 제159항에 있어서, 인간 대상체가 이식편대숙주질환 (GVHD)을 앓는 것인 방법.
  164. 제159항에 있어서, 인간 대상체가 1형 당뇨병을 앓는 것인 방법.
  165. 제153항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포가 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제와 조합하여 투여되는 것인 방법.
  166. 제165항에 있어서, 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제가 변형된 세포 투여 이전에 투여되는 것인 방법.
  167. 제165항에 있어서, 스테로이드 및/또는 칼시뉴린 억제제가 변형된 세포 투여와 동시에 또는 그 이후에 투여되는 것인 방법.
  168. 제165항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 스테로이드가 코르티코스테로이드인 방법.
  169. 제165항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 스테로이드가 글루코코르티코스테로이드인 방법.
  170. 제169항에 있어서, 글루코코르티코스테로이드가 프로게스테론-타입 글루코코르티코스테로이드, 히드로코르티손-타입 글루코코르티코스테로이드, 메타손-타입 글루코코르티코스테로이드, 및 아세토니드-타입 글루코코르티코스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  171. 제169항에 있어서, 글루코코르티코스테로이드가 덱사메타손, 베타메타손, 히드로코르티손 (코르티솔), 프레드니손, 프레드니솔론, 로테프레드놀, 데플라자코트, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 플루드로코르티손, 및 데옥시코르티코스테론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  172. 제165항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 칼시뉴린 억제제가 시클로스포린 A (CsA), 보클로스포린, 타크로리무스 (FK-506, 후지마이신), 피메크로리무스, 및 그의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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