KR20210008941A - 인간 마이크로바이옴 및 그의 성분의 분석을 위한 무세포 핵산 - Google Patents

인간 마이크로바이옴 및 그의 성분의 분석을 위한 무세포 핵산 Download PDF

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Abstract

개체에서의 마이크로바이옴 또는 그의 개별 성분의 분석을 위한 방법, 장치, 조성물 및 키트가 제공된다. 본 방법은 감염의 결정, 마이크로바이옴 구조의 분석, 개체의 면역적격의 측정 등에 있어서 용도가 발견된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 개체는 치료적 처방, 예를 들어 약물, 식이, 방사선 요법 등으로 치료된다.

Description

인간 마이크로바이옴 및 그의 성분의 분석을 위한 무세포 핵산 {CELL-FREE NUCLEIC ACIDS FOR THE ANALYSIS OF THE HUMAN MICROBIOME AND COMPONENTS THEREOF}
정부 권리
본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 허가 RC4AI092673 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 있어서 특정 권리를 갖는다.
인간 마이크로바이옴은 현재 인체 건강의 중요한 성분으로서 인식된다. 군집 수준 분석은 마이크로바이옴의 박테리아 및 바이러스 성분의 구조를 형태화하는 인자, 예컨대 연령, 식이, 지리적 위치, 항생제 치료 및 질환을 해명하였다. 예를 들어, 개체 마이크로바이옴은 병원성 유기체로의 감염에 의해 변경될 수 있어, 전신적으로 또는 바람직하지 않은 조직에서 그 유기체의 증가된 보유도가 있게 된다. 마이크로바이옴은 또한 개체의 면역적격의 변화에 의해 변경될 수 있다.
다양한 목적을 위해, 특정 마이크로바이옴 성분, 예를 들어 개체 마이크로바이옴 중의 공생적, 상리공생적, 기생적, 기회감염성 및 병원성 유기체의 존재 및 보유도의 신속한 확인; 뿐만 아니라 전체 마이크로바이옴 구조의 분석을 위한 방법을 갖는 것이 바람직할 것이다. 본 발명은 임상적 샘플 중의 마이크로바이옴 조성을 모니터링하는 민감하고 신속한 비-침습적 방법을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 개체에서의 마이크로바이옴 또는 그의 개별 성분의 분석을 위한 방법, 장치, 조성물 및 키트를 제공한다. 본 방법은 감염의 결정, 마이크로바이옴 구조의 분석, 개체의 면역적격의 결정 등에 있어서 용도가 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (i) 개체로부터의 무세포 핵산, 즉 DNA 및/또는 RNA의 샘플을 제공하는 단계; (ii) 예를 들어 샘플 당 약 105에서부터 약 109 이상까지의 리드의 고-처리량 시퀀싱을 수행하는 단계; (iii) 생물정보학 분석을 수행하여 숙주 서열, 즉 인간, 고양이, 개 등을 분석으로부터 제감하는 단계; 및 (iv) 예를 들어 미생물 참조 서열에 맵핑하는 서열의 커버리지를 숙주 참조 서열의 커버리지에 대해 비교함으로써 미생물 서열의 존재 및 보유도를 결정하는 단계를 포함하는, 개체에서의 미생물의 존재 및 보유도의 결정 방법을 제공한다.
숙주 서열의 제감(subtraction)은 참조 숙주 서열을 확인하는 단계, 및 참조 숙주 게놈에 존재하는 미생물 서열 또는 미생물 모방 서열을 마스킹하는 단계를 포함할 수 있다. 유사하게, 미생물 참조 서열에 대한 비교에 의해 미생물 서열의 존재를 결정하는 것은 참조 미생물 서열을 확인하는 단계, 및 참조 미생물 게놈에 존재하는 숙주 서열 또는 숙주 모방 서열을 마스킹하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 특징은 개체로부터의 무세포 핵산의 비편향 분석이다. 본 발명의 방법은 일반적으로 예를 들어 유니버셜 프라이머를 사용한 PCR의 수행에 의한, 또는 핵산에 대한 어댑터의 라이게이션 및 어댑터에 특이적인 프라이머를 사용한 증폭에 의한 비편향 증폭 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 전형적으로 미생물 서열의 서열 특이적 증폭의 부재 하에서 수행된다. 이 접근법의 이점은 분석이 그러면 모든 이용가능한 마이크로바이옴 서열을 포함한다는 점이지만, 이는 숙주 서열에 의해 우세화된 복잡한 데이터세트에서 관심의 서열을 확인하는 생물정보학 분석을 요구한다.
본 발명의 방법의 추가의 이점은 개체 마이크로바이옴의 신속한 평가를 제공하는 능력이며, 예를 들어 분석은 약 3일 미만, 약 2일 미만, 약 1일 미만, 예를 들어 약 24시간 미만, 약 20시간 미만, 약 18시간 미만, 약 14시간 미만, 약 12시간 미만, 약 6시간 미만, 약 2시간 미만, 약 30분 미만, 약 15분 미만, 약 1분 미만에 완료될 수 있다.
일부 실시양태에서, 무세포 핵산의 분석은 병원성 점수를 컴퓨팅하는 데 사용되며, 여기서, 병원성 점수는 예를 들어 보건 종사자에 의한 해석의 용이성을 위해 유기체의 전체적인 병원성을 요약하는 수치 또는 알파벳 값이다. 마이크로바이옴에 존재하는 상이한 미생물은 상이한 점수가 할당될 수 있다.
미생물 서열의 존재 및 보유도의 분석은 항-미생물 치료, 예컨대 항생제, 항-바이러스제, 면역화, 수동 면역요법 등으로의 치료; 식이; 면역억제 등을 비롯한 요법에 대한 반응의; 임상 시험 등에서의 반응의 감염 판정을 제공하는데 사용된다. 분석으로부터 얻어진 정보는 상태를 진단하고, 치료를 모니터링하고, 치료적 처방을 선택하거나 변형하고, 요법을 최적화하는 데 사용될 수 있다. 이 접근법으로, 치료적 및/또는 진단적 처방은 치료의 과정에 걸쳐 상이한 시간에 얻어진 특이성 데이터에 따라 개별화되고 조정됨으로써, 개별적으로 적절한 처방을 제공할 수 있다. 또한, 환자 샘플은 치료 과정 동안; 병원체에의 노출 후; 감염의 과정 등의 임의의 시점에서 분석을 위해 얻어질 수 있다. 미생물 서열의 존재 및 보유도의 분석은 보고서로서 제공될 수 있다. 보고서는 개인에게, 건강 관리 전문가 등에게 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 무세포 핵산은 혈액, 혈청, 뇌척수액, 활액, 뇨 및 대변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 샘플로부터 얻어진다. 핵산은 샘플의 무세포 부분으로부터 추출되며, 예를 들어 혈액의 혈청 또는 혈장 부분이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA 헤어핀, DNA/RNA 하이브리드, 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 RNA 및 RNA 헤어핀으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA 및 cDNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 순환 무세포 DNA이다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 하나 이상의 핵산을 정량하여 샘플 중의 미생물의 보유도의 결정을 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미리 결정된 역치 값을 초과하는 하나 이상의 핵산의 양은 감염 또는 변경된 보유도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상이한 미생물 유기체에 대한 상이한 미리 결정된 역치 값이 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산의 양의 시간적 차이는 감염의 변화, 변경된 보유도, 요법에 대한 반응 등을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (i) 대상체로부터의 무세포 핵산의 샘플에서 검출된 하나 이상의 핵산으로부터의 고 처리량 시퀀싱 데이터를 취득하는 단계; (ii) 생물정보학 분석을 수행하여 숙주 서열, 즉 인간, 고양이, 개 등을 분석으로부터 제감하는 단계; 및 (iii) 예를 들어 미생물 참조 서열에 맵핑하는 서열의 커버리지를 숙주 참조 서열의 커버리지에 대해 비교하여 미생물 서열의 존재 및 보유도를 결정하는 단계를 컴퓨터가 수행하도록 기록된 명령어들의 세트를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 방법을 실시하기 위한 시약 및 그의 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 마이크로바이옴의 분석에 의한, 예를 들어 바이롬의 분석에 의한 개체, 특히 개체 인간의 면역적격의 평가를 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 개체는 면역억제 요법, 예를 들어 약물, 방사선 요법 등으로 치료된다. 일부 실시양태에서, 개체는 면역억제 요법으로 치료되는 이식편 수용자이다. 일부 실시양태에서, 개체는 면역억제 요법으로 치료되는 자가면역 질환을 갖는다. 다른 실시양태에서, 개체는 면역억제 요법의 부재 하에서 면역적격에 대해 평가된다.
일부 실시양태에서, 개체로부터의 측정은 2개 이상의 시점에서 취해지며, 여기서, 바이러스 적재량(virus burden)의 변화는 면역적격의 변화를 나타낸다. 개체는 면역적격의 평가에 따라 치료될 수 있는데, 예를 들어 이식 환자에서의 바람직하지 않은 증가된 면역적격의 지시는 증가된 수준의 면역억제제로 치료되거나; 또는 면역적격의 바람직하지 않은 감소는 치료제, 예를 들어 항-바이러스제 등으로 치료된다.
핵산 분석은 환자로부터 수집된 샘플 중의 비인간 무세포 핵산을 확인하고 정량화하는데 사용된다. 마이크로바이옴의 성분의 조성은 상기 기재된 바와 같이 수행된다. 마이크로바이옴의 바이러스 성분 (바이롬)의 구조는 면역적격의 예측을 허용한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 면역억제 요법 전, 면역억제 요법의 개시 시, 또는 면역억제 요법의 과정 동안 개체 바이롬의 변화에 대한 참조로서 사용되는 바이롬 프로파일을 확립하는 것을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 순환 무세포 DNA는 아넬로바이러스 DNA이다.
특히, 아넬로비리다에 과의 바이러스의 적하량은 기관 이식 거부의 가능성과 상관되는 면역 강도의 예측인자이다. 다른 바이러스도 또한 예측적일 수 있지만, 환자는 이러한 바이러스의 적하량에 영향을 주는 항바이러스제로 치료되는 것이 통상적이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (i) 공여자로부터 이식을 받은 대상체로부터의 샘플을 제공하는 단계; (ii) 하나 이상의 바이롬 핵산의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및 (iii) 바이롬 적하량에 기초하여 이식 상태 또는 결과를 진단하거나 예측하는 단계를 포함하는, 이식 상태 또는 결과의 진단 또는 예측 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이식 상태 또는 결과는 거부, 내성, 비-거부 기재 동종이식편 손상, 이식 기능, 이식 존속, 만성 이식 손상, 또는 역가 약물학적 면역억제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 미리 결정된 역치 값을 초과하는 하나 이상의 핵산의 양은 바이러스 적하량(viral load) 및 면역적격을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 역치는 이식 거부 또는 다른 병리의 증거를 갖지 않는 임상적으로 안정한 이식후 환자에 대한 표준 값이다. 일부 실시양태에서, 상이한 이식 결과 또는 상태에 대한 상이한 미리 결정된 역치 값이 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산의 양의 시간적 차이는 면역적격을 나타낸다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 이식 이식편은 임의의 고형 기관, 골수 또는 피부 이식일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이식은 신장 이식, 심장 이식, 간 이식, 췌장 이식, 폐 이식, 장 이식 및 피부 이식으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 방법을 실시하기 위한 시약 및 그의 키트를 제공한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함되는 것을 지시하는 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 특별히 설명된다. 본 발명의 특징 및 이점의 보다 양호한 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시양태를 설명하는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참고로 얻어질 것이다:
도 1. 연구 설계, 리드 통계 및 계통발생적 분포. A. 면역억제는 이식에서 거부의 위험을 감소시키지만, 감염의 위험을 증가시킨다. B. 연구의 설계. 656개의 혈장 샘플을 수집하고, 무세포 DNA를 정제하고, 샘플 당 1.2 Gbp의 평균 깊이로 시퀀싱하였다. C. 연구의 상이한 환자 군 부분에 대한 시간의 함수로서 수집된 샘플의 수. D. 연구 코호트에서 환자에 대한 치료 프로토콜, 모든 환자는 유지 면역억제로 치료된다 (성인 심장 및 폐 이식 수용자에 대해 타크롤리무스-기재 (TAC) 및 소아 환자에 대해 시클로스포린 (CYC)). CMV 양성 (공여자 또는 수용자, CMV+) 이식 케이스는 항-CMV 예방, 발간시클로버 (VAL)로 치료된다. TAC-기재 프로토콜로 치료된 이식 수용자의 혈액에서 측정된 타크롤리무스의 평균 수준 (파선 실제, 실선 윈도우 평균 필터). E. 저급 품질 및 사본 리드의 필터링 후 (평균 86％, 좌측) 및 인간 및 저 복잡성 리드의 제거 후 (평균 2％, 우측) 남아 있는 리드의 분율. F. 인간 리드의 제거 후 분류학적 분류의 상이한 수준에서의 상대적 게놈 풍부도 (모든 기관 이식 수용자로부터의 모든 샘플에 걸친 평균 (n = 656)).
도 2. 약물 용량의 함수로서의 상대적 바이러스 게놈 풍부도 및 건강한 참조물에 대한 비교. A. 항바이러스 약물 용량 (발간시클로버) 및 혈액에서 측정된 타크롤리무스 농도의 함수로서의 면역억제제 타크롤리무스로 치료된 환자 (47명의 환자, 380개의 샘플)에 대한 평균 바이롬 조성. 약물 용량에 대한 바이롬 조성의 지연 효과를 해명하기 위해, 약물 용량에 대한 데이터를 윈도우 평균 필터링하였다 (윈도우 크기 45일, 도 1C 참조). 헤르페스비랄레스 및 카우도비랄레스는 환자가 면역억제제 및 항바이러스 약물의 저 용량을 받을 경우 바이롬에 우세하다. 반대로, 아넬로비리다에는 환자가 이들 약물의 고 용량을 받을 경우 바이롬에 우세하다. B. 건강한 참조물 (n = 9), 저 약물 노출을 갖는 이식후 제1일 샘플 (n=13), 및 고 약물 노출에 상응하는 샘플 (타크롤리무스 ≥ 9 ng/ml, 발간시클로버 ≥ 600 mg, n = 68)에 상응하는 바이롬 조성의 비교. 제1일 샘플에 대한 바이롬 구조 (1) 및 건강한 개체의 세트에 대해 측정된 바이롬 구조 (H)는 고 약물 용량에 상응하는 샘플에 대해 측정된 아넬로바이러스-우세한 분포 (D)와 구별된다. 파이차트는 평균 분율, 즉 만-휘트니 (Mann-Whitney) 검정에 기초한 박스플롯에서의 p-값을 나타낸다. C. 모든 샘플에 대한, 동일한 이식 유형 (심장 또는 폐)을 갖는 환자 중에서, 대상체 내, 유사한 약물 투여량 (타크롤리무스 수준 ± 0.5 ng/ml, 발간시클로버 ± 50 mg)으로 치료된 환자에 대한, 및 1-개월 기간 내에 동일한 대상체로부터 수집된 샘플에 대한 브레이-커티스 (Bray-Curtis) 베타 다양성.
도 3. 이식후 마이크로바이옴 조성의 시간적 동역학. A. 상이한 기간에 대한 dsDNA 및 ssDNA 바이러스의 상대적 풍부도 (모든 샘플에 대한 평균). ssDNA 바이러스의 상대적 풍부도는 이식후 약물 요법의 개시 후 급속하게 증가한다. 6개월 후, 반대 경향이 관찰된다. B. 상이한 기간에 대한 분류학적 분류의 과 및 목 수준에서의 바이러스 게놈 풍부도. 아넬로비리다에의 분율은 이식후 첫번째 몇 개월에 급속하게 확대된다. 헤르페스비랄레스, 카우도비랄레스 및 아데노비리다에의 분율은 그 동일한 기간에 감소한다. 6개월 후, 반대 경향이 관찰된다. C. 박테리아 문의 상대적 풍부도의 시간-변동. 바이러스 풍부도에 비해, 상이한 박테리아 문의 출현은 관찰된 이식후 기간에 걸쳐 상대적으로 변화되지 않는다. D. 시간의 함수로서의 박테리아 및 바이러스 속에 대한 샘플 내 알파-다양성의 측정으로서의 샤논 (Shannon) 엔트로피 (1개월 기간 당 그룹핑된 데이터).
도 4. 항바이러스 예방의 부재 및 존재 하에서의 바이롬 조성 및 총 바이러스 적재량. A. 시퀀싱에 의해 검출된 인간 게놈 카피 당 바이러스 게놈 카피로서 측정된 시간의 함수로서의 절대적 바이러스 적하량. 기간의 중앙이 x-축 상에 마킹된 상이한 기간에 대한 박스 플롯을 나타낸다. 모든 환자 부류에 대해, 총 바이러스 적하량은 이식후 첫번째 주에 증가한다 (흑색 선은 S자형 핏임, 적하량의 변화 7.4 ± 3). B. 면역억제제 및 항바이러스 약물 둘 다로 치료된 CMV+ 케이스에 대한 바이러스 적하량 및 조성 (78명의 환자, 543개의 샘플). C. 면역억제제로만 치료된 CMV -/- 케이스에 대한 바이러스 적하량 및 조성 (12명의 환자, 75개의 샘플).
도 5. 이식편 거부를 앓고 있는 환자에서의 보다 낮은 아넬로바이러스 적재량. A. 심각한 거부 에피소드를 앓고 있는 환자의 하위군에서 (생검 등급 ≥ 2R/3A, 적색 데이터, 20명의 환자, 177개의 시점) 및 심각한 거부가 없는 이식후 과정을 앓고 있지 않은 환자의 하위군에서 (청색 데이터, 40명의 환자, 285개의 시점) 아넬로바이러스 적하량의 시간 의존성. 기간의 중앙이 x-축 상에 마킹된 상이한 기간에 대한 박스 플롯을 나타낸다. 실선은 3차 스플라인이다 (평활 파라미터 0.75). 삽도는 면역적격에 따른 거부 및 감염의 발생의 예상되는 반대 연관성의 그림을 나타낸다. B. 동일한 시점에서의 모든 샘플에 대해 측정된 평균 적하량에 상대적인 아넬로바이러스 적하량. 비-거부 환자 (N = 208)에 대한 시간-정규화된 적하량을 온건한 거부 사건을 앓고 있는 환자 (생검 등급 1R, N = 102) 및 심각한 거부 에피소드를 앓고 있는 환자 (생검 등급 ≥ 2R/3A, N = 22)에 대해 측정된 적하량과 비교한다. p-값은 중앙값 바이러스 적하량이 거부의 보다 많은 위험의 하위군에 대해 보다 높을 확률을 반영한다. p-값은 보다 많은 양의 측정 시점을 갖는 집단의 랜덤 샘플링에 의해 계산된다. N-배 랜덤 샘플링, p = 합계(중앙값(Arej) ＞ 중앙값(Anon-rej))/N), 여기서, N=104이고, Arej 및 Anon-rej는 각각 거부 및 비-거부의 보다 큰 및 보다 작은 위험의 집단에 대한 상대적 바이러스 적하량이다. C. 비-거부 대 심각한 거부로서 환자를 분류하는 데 있어서 상대적 아넬로바이러스 적하량의 성능의 시험, 수용자-작용 특성 곡선, 곡선하 면적 = 0.72.
도 6. 게놈 크기 및 히트 통계, qPCR 어세이 및 분류학적 분류의 상이한 수준에서의 종의 측정된 상대적 풍부도에 대한 리드 길이의 영향. (A) 1401개의 바이러스 게놈, 32개의 진균 게놈 및 1980개의 박테리아 게놈을 갖는 참조 데이터베이스에서의 게놈 크기의 분포. (B) 시퀀싱된 100만개 고유 분자 당 고유 블라스트 히트의 분포 (x 축 표지에서 특정된 히트의 평균 수). (C) 바이러스, 박테리아 및 진균에 대한 게놈 당량 (감염제/이배체 인간)의 분포 (x 축 표지에서 특정된 게놈 당량의 평균 수). (D) qPCR을 사용하여 검출된 바이러스 카피의 수에 대한 시퀀싱된 총 리드의 100만개 당 발견된 시퀀싱 히트의 비교. qPCR 어세이를 위해, DNA를 혈장 1 ml로부터 정제하고, 100 μl 부피로 용리시켰다. (E) 선택된 케이스에 대한 CMV 및 파르보바이러스 적재량의 측정. 모든 샘플에 대해 측정된 CMV 바이러스의 최고 적하량 (게놈 당량, 바이러스/인간 이배체, G.E.)은 임상적으로 진단된 전파된 CMV 감염의 2가지 케이스에 상응하였다 (a 및 b, 음영화된 영역은 임상적 진단의 시간-윈도우를 나타냄, *는 사망 시간을 나타냄). (c)는 CMV 바이러스혈증을 앓은 소아 환자의 시간 추적을 나타낸다. 파르보바이러스는 이식후 즉시 1명의 소아 심장 이식 환자에서 검출되었다 (d).* (F) 분류학적 분류의 상이한 수준에서의 종의 측정된 상대적 풍부도에 대한 리드 길이의 영향 (n = 52). 50 및 100 bp 데이터 세트로부터 추출된 가장 풍부한 노드의 풍부도에 대한 스피어먼 (Spearman) 샘플-대-샘플 상관관계, r, 및 p 값, p, (2-샘플 만-휘트니 U 검정): r = 0.80, p = 0.8 (a), r = 0.86, p = 0.4 (b), r = 0.92, p = 0.6 (c), r = 0.84, p = 0.5 (d), r = 0.7, p = 0.28 (e), r = 0.99, p = 1 (f).
도 7. 이식 후 성인 심장 및 폐 이식 환자에 대한 평균 약물 용량 및 측정된 수준 및 바이롬 조성에 대한 약물 투여량의 영향. (A 내지 C) 본 연구의 성인 심장 및 폐 이식 환자 부분에 대한 투여된 발간시클로버 및 프레드니손의 평균 용량 (A 및 C) 및 혈액 중의 타크롤리무스의 측정된 수준 (B). (D) 바이러스 성분에 비해, 마이크로바이옴의 박테리아 성분의 조성은 항바이러스제 및 면역억제제에 대해 상대적으로 비민감성이다. (E) 항-CMV 약물 (발간시클로버) 및 면역억제제 (프레드니손)의 용량의 함수로서의 바이롬 조성.
도 8. 이식후 마이크로바이옴의 박테리아 성분의 시간적 동역학, (A) 시간의 함수로서의 박테리아 문의 상대적 풍부도. (B) 시간의 함수로서의 박테리아 속의 상대적 풍부도.
도 9. 상이한 환자 부류에 대한 바이롬 조성 및 총 바이러스 적재량, (A 및 B) 면역억제제 및 항바이러스제 둘 다로 치료된 CMV 양성 성인 심장 (A), 성인 폐 (B) 및 소아 심장 (C) 이식 수용자에 대한 바이러스 적하량 및 조성.
도 10. CMV-감염 유도된 동종이식편 손상. A. 임상 시험 일자에 매칭된 공여자 기관 cfdDNA 신호와 특정 체액 (BAL 및 혈청)으로부터의 CMV (인간 헤르페스 바이러스 5, HHV-5) 감염의 임상적 보고 사이의 상관관계 (p-값; 만-휘트니 U 검정). B. 하나 초과의 임상적 양성 시험 결과를 갖는 감염에 대한 감염의 임상적 진단 및 무세포 DNA 수준 사이의 상관관계에 대한 P-값. C. CMV-양성 및 CMV-음성 환자에서의 CMV 유래된 무세포 DNA 수준의 성능을 시험하는 ROC 곡선 (AUC=0.91).
도 11. 인펙톰의 모니터링. A. 시퀀싱에서 검출된 바이러스 감염의 발생에 비교한 임상 시험 빈도. B. 비-시험된 환자에 상대적인, 특정 감염에 대해 양성으로 시험된 환자 (적색 화살표)에 대한 시간-계열 데이터. (1) 비시험된 환자 (L34)에 상대적인, 임상적 양성이 강조된 L78에서의 아데노바이러스 신호. (2) 비-시험된 환자 (L57)에서의 지속적인 신호에 상대적인, 하나의 양성 시험을 갖는 L69에서의 폴리오마바이러스 신호. (3) CMV (HHV-5)에 대한 양성 (적색) 및 음성 (흑색) 시험 둘 다가 강조된 L58에서의 3가지 헤르페스바이러스 감염 (HHV-4, 5 및 8). (4) 미포자충증의 증상을 갖지만 비-시험된 L78에서 관찰된 신호에 상대적인 4가지 양성 시험이 나타내어진 I6에서의 미포자충 신호. 데이터는 0 값이 어세이의 검출 한계로 대체된 인간에 상대적인, 로그화된 게놈 당량이다 (표적 게놈에 할당된 단일 서열 리드와 일치하는 게놈 당량의 수).
이하, 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 대해 참고가 상세하게 이루어질 것이다. 바람직한 실시양태의 실시예는 하기 실시예 섹션에서 예시된다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 특허 및 간행물은 그 전문이 참고로 포함된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 내용이 명백하게 달리 나타내지 않는다면 그 범위의 상한 및 하한 및 그 언급된 범위 중의 임의의 다른 언급된 또는 개재하는 값 사이의 하한의 단위의 1/10까지의 각각의 개재하는 값이 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 보다 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 적용되어 본 발명 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계의 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계의 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위는 또한 본 발명에 포함된다.
특정 범위는 본원에서 용어 "약"이 선행하는 수치 값으로 제시된다. 용어 "약"은 본원에서 그것이 선행하는 정확한 수, 뿐만 아니라 그 용어가 선행하는 수 부근 또는 대략의 수에 대한 문자적 지지를 제공하기 위해 사용된다. 수가 구체적으로 언급된 수 부근 또는 대략인지를 결정하는 데 있어서, 부근 또는 대략의 비언급된 수는 그것이 제시되는 내용에서 구체적으로 언급된 수의 실질적 등가물을 제공하는 수일 수 있다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는다면 관련 기술분야의 기술 내에 있는 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 게놈 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 채용한다. 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989)]; [CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987))]; [the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))], [Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL], 및 [ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987))]을 참조한다.
본 발명은 개체에서의 마이크로바이옴 또는 그의 개별 성분의 분석을 위한 방법, 장치, 조성물 및 키트를 제공한다. 본 방법은 감염의 측정, 마이크로바이옴 구조의 분석, 개체의 면역적격의 측정 등에서 용도가 발견된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 환자 또는 대상체가 면역적격을 나타내는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "개체", "환자" 또는 "대상체"는 인간 뿐만 아니라 다른 포유동물을 포함한다.
정의.
본원에 사용된 용어 상태 또는 결과를 "진단하다" 또는 "진단"은 상태 또는 결과의 예측 또는 진단, 상태 또는 결과에 대한 소인의 결정, 환자의 치료의 모니터링, 환자의 치료적 반응의 진단, 및 상태 또는 결과, 진행, 및 특정 치료에 대한 반응의 예측을 포함한다.
미생물군. 본원에 사용된 용어 미생물군은 개체, 통상적으로 개체 포유동물 및 보다 통상적으로 인간 개체 내에 존재하는 미생물의 세트를 지칭한다. 미생물군은 병원성 종; 하나의 조직, 예를 들어 피부, 구강 등의 정상적 식생을 구성하는 종을 포함할 수 있지만, 다른 조직, 예를 들어 혈액, 폐 등; 질환의 부재 하에서 발견되는 공생 유기체 등에서는 바람직하지 않다. 마이크로바이옴의 하위세트는 마이크로바이옴의 바이러스 성분을 포함하는 바이롬이다.
본원에 사용된 용어 "마이크로바이옴 성분"은 개별 균주 또는 종을 지칭한다. 성분은 바이러스 성분, 박테리아 성분, 진균 성분 등일 수 있다.
건강한 동물에서, 내부 조직, 예를 들어 뇌, 근육 등은 통상적으로 박테리아 종이 상대적으로 없는 것으로 추정되지만, 표면 조직, 즉 피부 및 점막은 환경 유기체와 일정하게 접촉하며, 다양한 미생물 종에 의해 용이하게 콜로니화된다. 인간에서 임의의 해부학적 부위에서 발견되는 것으로 공지되거나 추정되는 유기체의 혼합물은 토착 미생물군의 다양한 성분을 포함하는 "토착 미생물군"으로 지칭된다. 토착 미생물 외에 다양한 전이 성분, 예컨대 병원성 또는 기회 감염이 있다. 하기 기재된 유기체의 참조 서열은 공개적으로 이용가능하며, 예를 들어 진뱅크 (Genbank) 데이터베이스에서 공지되어 있다.
인간의 장내 미생물군은 2개의 박테리아 문 내에서 발견되는 종에 의해 우세화된다: 의간균류 (Bacteroidetes) 및 후벽균류 (Firmicutes)의 구성원은 박테리아 집단의 90％ 초과를 구성한다. 몇몇 다른 문 중에서 방선균류 (Actinobacteria) (예를 들어, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속의 구성원) 및 프로테오박테리아 (Proteobacteria)는 보다 덜 현저하게 나타난다. 관심의 통상적인 종은 이 군집의 현저한 또는 보다 덜 풍부한 구성원을 포함하며, 제한 없이, 박테로이데스 테타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron); 박테로이데스 카카에 (Bacteroides caccae); 박테로이데스 프라길리스 (Bacteroides fragilis); 박테로이데스 멜라니노게니쿠스 (Bacteroides melaninogenicus); 박테로이데스 오랄리스 (Bacteroides oralis); 박테로이데스 우니포르미스 (Bacteroides uniformis); 락토바실루스 (Lactobacillus); 클로스트리듐 페르프링겐스 (Clostridium perfringens); 클로스트리듐 셉티쿰 (Clostridium septicum); 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani); 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum); 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus); 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis); 에스테리키아 콜라이 (Escherichia coli); 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis); 클레브시엘라 종 (Klebsiella sp.); 엔테로박터 종 (Enterobacter sp.); 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis); 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa); 펩토스트렙토코쿠스 종 (Peptostreptococcus sp.); 펩토코쿠스 종 (Peptococcus sp.), 패칼리박테리움 종 (Faecalibacterium sp.); 로세부리아 종 (Roseburia sp.); 루미노코쿠스 종 (Ruminococcus sp.); 도레아 종 (Dorea sp.); 알리스티페스 종 (Alistipes sp.) 등을 포함할 수 있다.
피부 마이크로바이옴에서, 대부분의 박테리아는 4가지 상이한 문에 속한다: 방선균류, 후벽균류, 의간균류 및 프로테오박테리아. 일반적으로 피부 콜로나이저로 간주되는 미생물은 방선균류 문의 코리네형 (코리네박테리움 속 (Corynebacterium), 프로피오니박테리움 속 (Propionibacterium), 예컨대 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes); 및 브레비박테리움 속 (Brevibacterium)), 미크로코쿠스 속 (Micrococcus) 및 스타필로코쿠스 종 (Staphylococcus spp.)을 포함한다. 가장 통상적으로 단리되는 진균 종은 특히 피지선 영역에 보유되는 말라세지아 종 (Malassezia spp.)이다. 데모덱스 (Demodex) 진드기 (예컨대 데모덱스 폴리쿨로룸 (Demodex folliculorum) 및 데모덱스 브레비스 (Demodex brevis))가 또한 존재할 수 있다. 피부 상에서 자라는 것으로 생각되는 다른 유형의 진균으로는 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 및 크립토코쿠스 (Cryptococcus) 종을 들 수 있다. 비-공생자로서, 화상 상처는 통상적으로 에스. 피오게네스 (S. pyogenes), 엔테로코쿠스 종 (Enterococcus spp.) 또는 슈도모나스 애루기노사로 감염되며, 또한 진균 및/또는 바이러스로 감염된다. 에스. 에피데르미디스 (S. epidermidis)는 매우 통상적인 피부 공생자이지만, 이는 또한 내주성 의학 장치, 예컨대 카테터 또는 심장 판막 상의 병원에서 획득된 감염의 가장 빈번한 원인이다. 검토를 위해, 문헌 [Nat Rev Microbiol. (2011) Apr;9(4):244-53]을 참조한다.
병원성 종은 박테리아, 바이러스, 원생 기생충, 진균 종 등일 수 있다. 박테리아로는 브루셀라 종 (Brucella sp.), 트레포네마 종 (Treponema sp.), 미코박테리움 종 (Mycobacterium sp.), 리스테리아 종 (Listeria sp.), 레지오넬라 종 (Legionella sp.), 헬리코박터 종 (Helicobacter sp), 스트렙토코쿠스 종 (Streptococcus sp), 네이세리아 종 (Neisseria sp), 클로스트리듐 종 (Clostridium sp), 스타필로코쿠스 종 (Staphylococcus sp.) 또는 바실루스 종 (Bacillus sp.)을 들 수 있으며; 제한 없이, 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum), 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 레프래 (Mycobacterium leprae), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori), 스트렙토코쿠스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae), 네이세리아 메닝기티스 (Neisseria meningitis), 클로스트리듐 노비이 (Clostridium novyi), 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 바실루스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 등을 들 수 있다.
기생충 병원체로는 트리코모나스 (Trichomonas), 톡소플라스마 (Toxoplasma), 기아르디아 (Giardia), 크립토스포리듐 (Cryptosporidium), 플라스모듐 (Plasmodium), 레이쉬마니아 (Leishmania), 트리파노소마 (Trypanosoma), 엔타모에바 (Entamoeba), 스키스토소마 (Schistosoma), 필라리애 (Filariae), 아스카리아 (Ascaria), 파스키올라 (Fasciola)를 들 수 있으며, 제한 없이, 트리코모나스 바기날리스 (Trichomonas vaginalis), 톡소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii), 기아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis), 크립토스포리듐 파르바 (Cryptosporidium parva), 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi), 엔타모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 기아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 파스키올라 헤파티카 (Fasciola hepatica) 등을 들 수 있다.
인간을 감염시키는 바이러스로는 예를 들어 아데노 (Adeno)-관련 바이러스; 아이치 (Aichi) 바이러스; 호주 박쥐 리사바이러스; BK 폴리오마바이러스; 바나 (Banna) 바이러스; 바르마 (Barmah) 삼림 바이러스; 부니암웨라 (Bunyamwera) 바이러스; 부니아바이러스 라 크로세 (Bunyavirus La Crosse); 부니아바이러스 스노우슈 하레 (Bunyavirus snowshoe hare); 세르코피테신 (Cercopithecine) 헤르페스바이러스; 칸디푸라 (Chandipura) 바이러스; 치쿤구니아 (Chikungunya) 바이러스; 코사바이러스 (Cosavirus) A; 우두 바이러스; 콕사키에바이러스 (Coxsackievirus); 크리민-콩고 (Crimean-Congo) 출혈열 바이러스; 뎅기 (Dengue) 바이러스; 도리 (Dhori) 바이러스; 더그비 (Dugbe) 바이러스; 듀벤헤이즈 (Duvenhage) 바이러스; 동부 말 뇌염 바이러스; 에볼라바이러스 (Ebolavirus); 에코바이러스 (Echovirus); 뇌심근염 바이러스; 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스; 유럽 박쥐 리사바이러스; GB 바이러스 C/G형 간염 바이러스; 한탄 (Hantaan) 바이러스; 헨드라 (Hendra) 바이러스; A형 간염 바이러스; B형 간염 바이러스; C형 간염 바이러스; E형 간염 바이러스; 델타 간염 바이러스; 마두 바이러스; 인간 아데노바이러스; 인간 아스트로바이러스; 인간 코로나바이러스; 인간 시토메갈로바이러스; 인간 엔테로바이러스 68, 70; 인간 헤르페스바이러스 1; 인간 헤르페스바이러스 2; 인간 헤르페스바이러스 6; 인간 헤르페스바이러스 7; 인간 헤르페스바이러스 8; 인간 면역결핍 바이러스; 인간 유두종바이러스 1; 인간 유두종바이러스 2; 인간 유두종바이러스 16,18; 인간 파라인플루엔자; 인간 파르보바이러스 B19; 인간 호흡기 융합 바이러스; 인간 리노바이러스; 인간 SARS 코로나바이러스; 인간 스푸마레트로바이러스; 인간 T-림프친화 바이러스; 인간 토로바이러스; A형 인플루엔자 바이러스; B형 인플루엔자 바이러스; C형 인플루엔자 바이러스; 이스파한 (Isfahan) 바이러스; JC 폴리오마바이러스; 일본 뇌염 바이러스; 주닌 (Junin) 아레나바이러스; KI 폴리오마바이러스; 쿤진 (Kunjin) 바이러스; 라고스 (Lagos) 박쥐 바이러스; 빅토리아 호수 마버그바이러스; 랑가트 (Langat) 바이러스; 라사 (Lassa) 바이러스; 로즈데일 (Lordsdale) 바이러스; 도약병 바이러스; 림프구성 맥락수막염 바이러스; 마추포 (Machupo) 바이러스; 마야로 (Mayaro) 바이러스; MERS 코로나바이러스; 홍역 바이러스; 멩고 (Mengo) 뇌심근염 바이러스; 머켈 (Merkel) 세포 폴리오마바이러스; 모콜라 (Mokola) 바이러스; 몰루스쿰 콘타기오숨 (Molluscum contagiosum) 바이러스; 원숭이두창 바이러스; 볼거리 바이러스; 머레이 (Murray) 계곡 뇌염 바이러스; 뉴욕 (New York) 바이러스; 니파 (Nipah) 바이러스; 노르워크 (Norwalk) 바이러스; 오뇽-뇽 (O'nyong-nyong) 바이러스; 양아구창 바이러스; 오로퓨스 (Oropouche) 바이러스; 피킨데 (Pichinde) 바이러스; 폴리오바이러스 (Poliovirus); 푼타 (Punta) 토로 플레보바이러스; 푸우말라 (Puumala) 바이러스; 광견병 바이러스; 리프트 (Rift) 계곡 열 바이러스; 로사바이러스 (Rosavirus) A; 로스 (Ross) 강 바이러스; 로타바이러스 (Rotavirus) A; 로타바이러스 B; 로타바이러스 C; 풍진 바이러스; 사기야마 (Sagiyama) 바이러스; 살리바이러스 (Salivirus) A; 모래파리 열 시칠리아 바이러스; 삿뽀로 (Sapporo) 바이러스; 셈리키 (Semliki) 삼림 바이러스; 서울 (Seoul) 바이러스; 원숭이 거품 바이러스; 원숭이 바이러스 5; 신드비스 (Sindbis) 바이러스; 사우샘프톤 (Southampton) 바이러스; 세인트 루이스 (St. louis) 뇌염 바이러스; 틱-본 (Tick-borne) 포와산 바이러스; 토르크 테노 (Torque teno) 바이러스; 토스카나 (Toscana) 바이러스; 우우쿠니에미 (Uukuniemi) 바이러스; 종두증 바이러스; 수두-대상포진 바이러스; 천연두 바이러스; 베네주엘라 (Venezuelan) 말 뇌염 바이러스; 수포성 구내염 바이러스; 서부 말 뇌염 바이러스; WU 폴리오마바이러스; 웨스트 나일 (West Nile) 바이러스; 야바 (Yaba) 원숭이 종양 바이러스; 야바-유사 질환 바이러스; 황열 바이러스; 지카 (Zika) 바이러스를 들 수 있다.
아넬로비리다에. 아넬로비리다에 과는 비-외피성 원형 단일-가닥 DNA 바이러스로 이루어진다. 아넬로바이러스의 3개의 속, 즉 TTV, TTMDV 및 TTMV는 인간을 감염시키는 것으로 공지되어 있다.
토르크 테노 바이러스 (Torque Teno Virus) (TTV)는 원형의 음성-센스 게놈을 갖는 비-외피성 단일-가닥 DNA 바이러스이다. 후속으로 토르크 테노-유사 미니 바이러스 (Torque Teno-like Mini Virus) (TTMV)로 명명된 유사한 바이러스도 또한 특성화되었고, TTV 및 TTMV 사이의 게놈 크기를 갖는 제3 바이러스가 발견되었으며, 후속으로 토르크 테노-유사 미디 바이러스 (Torque Teno-like Midi Virus) (TTMDV)로 명명되었다. 명명법의 최근의 변화는 인간을 바이러스의 아넬로비리다에 과의 알파토르크바이러스 (Alphatorquevirus) (TTV), 베타토르크바이러스 (Betatorquevirus) (TTMV) 및 감마토르크바이러스 (Gammatorquevirus) (TTMDV) 속으로 감염시킬 수 있는 3가지의 아넬로바이러스를 분류하였다. 지금까지 아넬로바이러스는 여전히 인간 질환에 관련이 있을 것으로 대기하는 "고아" 바이러스로 간주된다.
인간 아넬로바이러스는 TTV에 대해 3.8 내지 3.9 kb, TTMDV에 대해 3.2 kb, 및 TTMV에 대해 2.8 내지 2.9 kb 범위의 게놈 크기에서 상이하다. 아넬로바이러스의 특징적인 특징은 아넬로바이러스 종 내 및 사이 둘 다에서 발견되는 극도의 다양성이며; 이들은 뉴클레오티드 수준에서 33％ 내지 50％ 만큼의 분기도를 나타낼 수 있다. 뉴클레오티드 서열 다양성에도 불구하고, 아넬로바이러스는 보존된 게놈 조직화, 전사 프로파일, 비-코딩 GC 풍부 영역, 및 공유된 비리온 구조 및 유전자 기능을 초래하는 서열 모티프를 공유한다.
아넬로바이러스 감염은 일반적인 집단에서 고도로 만연한다. 일본에서의 연구는 시험된 환자의 75 내지 100％가 3가지 인간 아넬로바이러스 중 적어도 하나로 감염되었으며, 다수는 다중 종으로 감염되었음을 밝혀내었다. 아넬로바이러스는 유아를 감염시킬 수 있으며, 최초로 문헌화된 감염은 생후 1개월 내에 일어난다. 이들 바이러스는 혈액 혈장, 혈청, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 비인두 흡입물, 골수, 타액, 모유, 대변을 비롯한 시험된 거의 모든 신체 부위, 체액 및 조직, 뿐만 아니라 갑상선, 림프절, 폐, 간, 비장, 췌장 및 신장을 비롯한 다양한 조직에서 발견되었다. 아넬로바이러스의 복제 동역학은 이들 바이러스를 배양물 중에서 전파할 수 없기 때문에 사실상 알려져 있지 않다. 국소 바이러스 복제를 나타내는 양성-가닥 TTV DNA는 간세포, 골수 세포 및 순환 PBMC에서 기재되었다.
아넬로바이러스는 분변-경구 전염을 통해 주로 확산되지만, 모자 및 호흡관 전염도 또한 보고되었다. 제대혈 검체 중의 TTV의 존재에 관해서는 상충하는 보고가 있다.
아넬로바이러스에 대한 참조 서열은 진뱅크에서 접근될 수 있으며, 예를 들어 토르크 테노 미니 바이러스 1, 수탁번호: NC_014097.1; 토르크 테노 미니 바이러스 6, 수탁번호:NC_014095.1; 토르크 테노 미디 바이러스 2, 수탁번호:NC_014093.1; 토르크 테노 미디 바이러스 1, 수탁번호:NC_009225.1; 토르크 테노 바이러스 3, 수탁번호:NC_014081.1; 토르크 테노 바이러스 19, 수탁번호:NC_014078.1; 토르크 테노 미니 바이러스 8, 수탁번호:NC_014068.1이다.
본원에 사용된 용어 "항생제"는 모든 통상적으로 사용되는 정균 및 살균 항생제, 통상적으로 경구적으로 투여되는 것들을 포함한다. 항생제로는 아미노글리코시드, 예컨대 아미카신, 겐타미신, 카나마이신, 네오마이신, 스트렙토마이신 및 토브라마이신; 세팔로스포린, 예컨대 세파만돌, 세파졸린, 세팔렉신, 세팔로글리신, 세팔로리딘, 세팔로틴, 세파피린 및 세프라딘; 마크롤리드, 예컨대 에리트로마이신 및 트롤레안도마이신; 페니실린, 예컨대 페니실린 G, 아목시실린, 암피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 페네티실린 및 티카르실린; 폴리펩티드 항생제, 예컨대 바시트라신, 콜리스티메테이트, 콜리스틴, 폴리믹신 B; 테트라시클린, 예컨대 클로르테트라시클린, 데메클로시클린, 독시시클린, 메타시클린, 미노시클린, 테트라시클린 및 옥시테트라시클린; 및 기타 항생제, 예컨대 클로람페니콜, 클린다마이신, 시클로세린, 린코마이신, 리팜핀, 스펙티노마이신, 반코마이신 및 비오마이신을 들 수 있다. 추가의 항생제는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences," 16th Ed., (Mack Pub. Co., 1980), pp. 1121-1178]에 기재되어 있다.
항바이러스제. 개체는 요법에 의해 영향을 받는 바이러스에 대한 바이러스 적하량을 변경시키는 항바이러스 요법을 받을 수 있다. 이렇게 치료되는 바이러스 감염의 예로는 HIV, 보웬양 구진증, 수두, 아동기 HIV 질환, 인간 우두, C형 간염, 뎅기, 엔테로바이러스, 사마귀 표피형성이상, 감염 홍반 (제5병), 부쉬케 뢰벤슈타인의 거대 첨형 콘딜로마, 수족구병, 단순 헤르페스, 헤르페스 바이러스 6, 대상포진, 카포시 수두양 발진, 홍역, 착유자 결절, 전염 물렁종, 원숭이두창, 양아구창, 돌발성 발진, 풍진, 천연두, 바이러스성 만연출혈열, 생식기 사마귀 및 비생식기 사마귀를 들 수 있다.
항바이러스제로는 아지도우리딘, 아나스마이신, 아만타딘, 브로모비닐데옥수시딘, 클로로비닐데옥수시딘, 시타르빈, 디다노신, 데옥시노지리마이신, 디데옥시시티딘, 디데옥시이노신, 디데옥시뉴클레오시드, 데스시클로비어, 데옥시아시클로비어, 에독수이딘, 엔비록심, 피아시타빈, 포스카메트, 피알루리딘, 플루오로티미딘, 플록수리딘, 히페리신, 인터페론, 인터류킨, 이세티오네이트, 네비라핀, 펜타미딘, 리바비린, 리만타딘, 스타비르딘, 사르그라모스틴, 수라민, 트리코산틴, 트리브로모티미딘, 트리클로로티미딘, 비다라빈, 지도비리딘, 잘시타빈 및 3-아지도-3-데옥시티미딘, 및 그의 유사체, 유도체, 제약학적으로 허용되는 염, 에스테르, 프로드러그, 코드러그 및 보호된 형태를 들 수 있다.
본원에 사용된 면역억제 또는 면역억제 요법은 자가항원 또는 이식편에 대한 숙주 면역계의 면역 반응을 감소시키는 제제를 사용한 개체, 예를 들어 이식편 수용자의 치료를 지칭한다. 예시적인 면역억제 요법은 본원에 보다 상세히 기재되어 있다.
주요 면역억제제로는 결합 단백질과 조합하여 칼시뉴린 활성을 억제하는 칼시뉴린 억제제를 들 수 있으며, 예를 들어 타크롤리무스, 시클로스포린 A 등을 들 수 있다. 시클로스포린 및 타크롤리무스 둘 다의 수준은 주의깊게 모니터링되어야 한다. 초기에, 수준은 10 내지 20 ng/mL 범위로 유지될 수 있지만, 3개월 후, 수준은 신장독성의 위험을 감소시키기 위해 보다 낮게 유지될 수 있다 (5 내지 10 ng/mL).
보조제는 통상적으로 칼시뉴린 억제제와 조합되며, 스테로이드, 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸 및 시롤리무스를 들 수 있다. 관심의 프로토콜은 칼시뉴린 억제제와 미코페놀레이트 모페틸을 포함한다. 보조제의 사용은 임상의가 개별 제제의 용량 및 독성을 감소시키면서 적당한 면역억제를 달성하는 것을 허용한다. 신장 이식 수용자에서의 미코페놀레이트 모페틸은 몇몇 임상 시험이 아자티오프린에 비교한 급성 세포 거부의 현저하게 감소된 보유도 및 1-년 치료 실패의 감소를 나타낸 후 면역억제에서 중요한 역할을 하는 것으로 추정되었다.
항체-기재 요법은 모노클로날 (예를 들어, 무로모납-CD3) 또는 폴리클로날 항체 또는 항-CD25 항체 (예를 들어, 바실릭시맙, 다클리주맙)를 사용할 수 있으며, 초기 이식후 기간 (8주 이하)에 투여된다. 항체-기재 요법은 아마도 신장독성의 위험을 감소시켜 칼시뉴린 억제제의 회피 또는 용량 감소를 허용한다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 부작용 프로파일은 일부 환자에서 그의 사용을 제한한다.
본원에 사용된 용어 "핵산"은 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이는 DNA 또는 RNA일 수 있다. "변이체" 핵산은 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된 것, 예를 들어 각각 결실, 삽입 또는 대체된 것을 제외하고는 그의 원래 핵산과 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드이다. 변이체는 원래 핵산의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 동일성의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
순환 또는 무세포 DNA는 1948년에 인간 혈액 혈장에서 처음 검출되었다 (Mandel, P. Metais, P., C R Acad. Sci. Paris, 142, 241-243 (1948)). 그 이후로, 질환에 대한 그의 관련은 몇몇 지역에서 확립되었다 (Tong, Y.K. Lo, Y.M., Clin Chim Acta, 363, 187-196 (2006)). 연구는 혈액 중의 많은 순환 핵산이 괴사 또는 아폽토시스 세포에서 일어나며 (Giacona, M.B., et al., Pancreas, 17, 89-97 (1998)), 아폽토시스로부터의 핵산의 매우 상승된 수준이 암과 같은 질환에서 관찰됨 (Giacona, M.B., et al., Pancreas, 17, 89-97 (1998); Fournie, G.J., et al., Cancer Lett, 91, 221-227 (1995))을 밝혔다. 특히, 순환 DNA가 종양유전자에서의 돌연변이, 미세위성 변경을 비롯한 질환의 특징 징후를 갖는 암에 대해, 및 특정 암에 대해, 혈장 중의 바이러스 게놈 서열, DNA 또는 RNA는 질환에 대한 잠재적 바이오마커로서 더욱 연구되게 되었다. 예를 들어, 디엘 (Diehl) 등은 최근 총 순환 DNA 중의 순환 종양 DNA의 저 수준에 대한 정량적 어세이가 임상적으로 사용되는 표준 바이오마커인 암배아성 항원과 비교하여 결장직장암의 재발을 검출하기 위한 보다 양호한 마커로서 기능할 수 있음을 입증하였다 (Diehl, F., et al., Proc Natl Acad Sci, 102, 16368-16373 (2005); Diehl, F., et al., Nat Med, 14, 985-990 (2008)). 마헤스워런 (Maheswaran) 등은 약물 치료에 영향을 주는 폐암 환자에서의 표피 성장 인자 수용체의 활성 돌연변이를 검출하기 위한 혈장에서의 순환 세포의 유전자형 분석의 용도를 보고하였다 (Maheswaran, S., et al., N Engl J Med, 359, 366-377 (2008)). 이들 결과는 집합적으로 암 검출 및 치료에서 유용한 종으로서 혈장에서 유리하는 순환 DNA를 확립한다. 순환 DNA는 또한 건강한 환자에서 성별, 레수스 D 상태, 태아 이수배수체 및 성-연관 장애에 대한 마커로서 기능하는 모체 혈액에서 순환하는 태아 DNA를 사용한 태아 진단을 위해 유용하였다. 판 (Fan) 등은 최근 모체 혈액 샘플로부터 취해진 무세포 DNA의 숏건 시퀀싱에 의해 태아 이수배수체를 검출하는 전략, 즉 보다 침습적이고 위험한 기술, 예컨대 양수천자 또는 융모막 융모 샘플링을 대체할 수 있는 방법론을 입증하였다 (Fan, H.C., Blumenfeld, Y.J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S.R., Proc Natl Acad Sci, 105, 16266-16271 (2008)).
본원에 사용된 용어 "로부터 유래된"은 기원 또는 근원을 지칭하며, 천연 발생, 재조합, 비정제된 또는 정제된 분자를 포함할 수 있다. 원래 핵산으로부터 유래된 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 원래 핵산을 포함할 수 있으며, 원래 핵산의 단편 또는 변이체일 수 있다. 생물학적 샘플로부터 유래된 핵산은 그 샘플로부터 정제될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 "표적 핵산"은 검출되어야 할 핵산, DNA 또는 RNA이다. 유기체로부터 유래된 표적 핵산은 유기체의 것으로부터 유래된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드이며, 유기체에 대해 특이적이다. 병원체로부터 유래된 표적 핵산은 그 특이적 병원체로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 1 pg, 5pg, 10 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 100 pg, 200 pg, 500 pg, 1 ng, 5ng, 10 ng, 20 ng, 30 ng, 40 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng, 500 ng, 1 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 100 μg, 200 μg, 500 μg 또는 1 mg 미만의 핵산이 분석용 샘플로부터 얻어진다. 일부의 경우, 약 1 내지 5 pg, 5 내지 10 pg, 10 내지 100 pg, 100 pg 내지 1 ng, 1 내지 5 ng, 5 내지 10 ng, 10 내지 100 ng, 100 ng 내지 1μg의 핵산이 분석용 샘플로부터 얻어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 관심의 미생물에 상응하는 핵산 서열, 또는 유기체의 마이크로바이옴을 검출 및/또는 정량화하는 데 사용된다. 본원에 기재된 방법은 적어도 1; 2; 3; 4; 5; 10, 20; 50; 100; 200; 500; 1,000; 2,000; 5,000; 10,000, 20,000; 50,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 106, 5x106, 107, 5x107, 108, 5x108, 109 이상의 서열 리드를 분석할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 예를 들어 미생물로부터의 mRNA의 존재를 그 미생물로부터의 DNA와 관련하여 결정함으로써 유전자 발현을 검출 및/또는 정량화하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 다중 유전자의 고 식별적 및 정량적 분석을 제공한다. 본원에 기재된 방법은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 100,000개 이상의 상이한 표적 핵산의 발현을 식별 및 정량할 수 있다.
무세포 핵산을 함유하는 샘플은 대상체로부터 얻어진다. 이러한 대상체는 인간, 가축, 예컨대 소, 닭, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 염소 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용되는 세포는 환자로부터 취해진다. 샘플로는 예를 들어 전체 혈액, 땀, 눈물, 타액, 귀액, 가래, 림프, 골수 현탁액, 림프, 뇨, 타액, 정액, 질액, 뇌척수액, 뇌액, 복수, 유액, 호흡기의 분비물, 장 또는 비뇨생식관액, 조직 또는 기관 (예를 들어 폐) 또는 기관, 예컨대 유방, 폐, 장, 피부, 자궁경부, 전립선, 췌장, 심장, 간 및 위로부터 제거된 조직의 세척액의 비세포성 분획을 들 수 있다. 이러한 샘플은 원심분리, 정화, 밀도 구배 분리, 성분채집, 친화도 선택, 패닝, FACS, 하이패크 (Hypaque)를 사용한 원심분리 등에 의해 분리될 수 있다. 샘플이 얻어지면, 이는 직접, 동결하여, 또는 짧은 기간 동안 적절한 배양 배지에 유지되어 사용될 수 있다.
혈액 샘플을 얻기 위해, 관련 기술분야에 공지된 임의의 기술, 예를 들어 시린지 또는 다른 진공 흡입 장치가 사용될 수 있다. 혈액 샘플은 사용 전에 임의로 전처리되거나 가공될 수 있다. 샘플, 예컨대 혈액 샘플은 본원의 임의의 방법 및 시스템 하에 샘플이 얻어진 시간으로부터 4주, 2주, 1주, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 1일 12시간, 6시간, 3시간, 2시간 또는 1시간, 또는 동결된 경우 보다 긴 시간 내에 분석될 수 있다. 대상체로부터 샘플을 얻을 경우 (예를 들어, 혈액 샘플), 양은 대상체 크기 및 스크리닝되는 조건에 따라 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 10 ml, 5 ml, 1 ml, 0.5 ml, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 μL의 샘플이 얻어진다. 일부 실시양태에서, 1 내지 50, 2 내지 40, 3 내지 30 또는 4 내지 20 μL의 샘플이 얻어진다. 일부 실시양태에서, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 μL 초과의 샘플이 얻어진다.
무세포 분획은 바람직하게는 혈액 혈청 또는 혈액 혈장이다. 본원에 사용된 용어 생물학적 샘플의 "무세포 분획"은 실질적으로 세포가 없는 생물학적 샘플의 분획을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "실질적으로 세포가 없는"은 ml 당 약 20,000 세포 미만, 바람직하게는 ml 당 약 2,000 세포 미만, 보다 바람직하게는 ml 당 약 200 세포 미만, 가장 바람직하게는 ml 당 약 20 세포 미만을 포함하는 생물학적 샘플로부터의 제조물을 지칭한다. 특정 종래 기술의 방법과 대조적으로, 게놈 DNA는 무세포 샘플로부터 배제되지 않으며, 전형적으로 샘플에 존재하는 핵산의 약 50％ 내지 약 90％를 포함한다.
본 발명의 방법은 생물학적 샘플로부터의 무세포 분획을 제조하는 것을 더 포함할 수 있다. 무세포 분획은 관련 기술분야에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플의 무세포 분획은 혈액 샘플을 약 3 내지 30분, 바람직하게는 약 3 내지 15분, 보다 바람직하게는 약 3 내지 10분, 가장 바람직하게는 약 3 내지 5분 동안, 약 200 내지 20,000 g, 바람직하게는 약 200 내지 10,000 g, 보다 바람직하게는 약 200 내지 5,000 g, 가장 바람직하게는 약 350 내지 4,500 g의 저속으로 원심분리함으로써 얻어질 수 있다. 생물학적 샘플은 세포 및 그의 단편을 가용성 DNA 또는 RNA를 포함하는 무세포 분획으로부터 분리하기 위한 한외여과에 의해 얻어질 수 있다. 통상적으로, 한외여과는 0.22 μm 멤브레인 필터를 사용하여 수행된다.
본 발명의 방법은 생물학적 샘플의 무세포 분획 중의 표적 핵산을 농축 (또는 풍부화)시키는 것을 더 포함할 수 있다. 표적 핵산은 관련 기술분야에 공지된 통상적인 기술, 예컨대 고 염 농도의 존재 하에서의 고체상 흡수, 페놀-클로로포름에 의한 유기 추출 후 에탄올 또는 이소프로필 알코올을 사용한 침전, 또는 고 염 농도 또는 70 내지 80％ 에탄올 또는 이소프로필 알코올의 존재 하에서의 직접 침전을 사용하여 농축될 수 있다. 농축된 표적 핵산은 무세포 분획 중의 것보다 적어도 약 2, 5, 10, 20 또는 100배 더 농축될 수 있다. 표적 핵산은 농축되든지 그렇지 않든지 본 발명의 방법에 따른 증폭에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 이식 거부의 진단 또는 예측 방법을 제공한다. 용어 "이식 거부"는 급성 및 만성 이식 거부 둘 다를 포함한다. "급성 거부 또는 AR"은 이식된 조직이 면역학적으로 외래성인 경우 조직 이식 수용자의 면역계에 의한 거부이다. 급성 거부는 그의 효과기 기능을 수행하고 이식된 조직을 파괴하는 수용자의 면역 세포에 의한 이식된 조직의 침윤을 특징으로 한다. 급성 거부의 발생은 급속하며, 일반적으로 인간에서 이식 수술 후 수 주 내에 일어난다. 일반적으로, 급성 거부는 면역억제 약물, 예컨대 라파마이신, 시클로스포린 A, 항-CD40L 모노클로날 항체 등으로 저하 또는 억제된다.
"만성 이식 거부 또는 CR"은 일반적으로 인간에서 이식 후 수 개월 내지 수 년 내에, 심지어 급성 거부의 성공적인 면역억제의 존재 하에서 일어난다. 섬유증은 모든 유형의 기관 이식의 만성 거부에서 통상적인 인자이다. 만성 거부는 전형적으로 특정 기관의 특징인 특정 장애의 범위에 의해 기재될 수 있다. 예를 들어, 폐 이식에서, 이러한 장애로는 기도의 섬유증식성 파괴 (폐쇄 세기관지염)를 들 수 있고; 심장 이식 또는 심장 조직의 이식, 예컨대 판막 대체에서, 이러한 장애로는 섬유성 아테롬성경화증을 들 수 있고; 신장 이식에서, 이러한 장애로는 폐쇄성 신장병증, 신장경화증, 뇨세관간질 신장병증을 들 수 있고, 간 이식에서, 이러한 장애로는 담도 소실 증후군을 들 수 있다. 만성 거부는 또한 허혈성 인설트, 이식된 조직의 신경제거, 면역억제 약물과 관련된 고지질혈증 및 고혈압을 특징으로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 이식, 예를 들어 동종이식편을 받은 대상체에 대한 면역억제 요법의 유효성의 결정 방법을 더 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태는 이식을 받은 대상체에서의 이식 존속의 예측 방법을 제공한다. 본 발명은 이식 환자 또는 대상체에서의 이식이 존속할지 또는 소실될지 여부를 진단하거나 예측하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 장기 이식편 존속의 존재의 진단 또는 예측 방법을 제공한다. "장기" 이식편 존속은 급성 거부의 하나 이상의 이전 에피소드의 발생에도 불구하고 현 샘플링 이후 적어도 약 5년 동안의 이식편 존속을 의미한다. 특정 실시양태에서, 이식 존속은 급성 거부의 적어도 하나의 에피소드가 발생한 환자에 대해 측정된다. 따라서, 이들 실시양태는 급성 거부 후 이식 존속의 결정 또는 예측 방법을 제공한다. 이식 존속은 특정 실시양태에서 이식 요법, 예를 들어 면역억제 요법에 관련하여 결정되거나 예측되며, 여기서, 면역억제 요법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 급성 거부의 부류 및/또는 중증도 (뿐만 아니라 그의 존재)의 측정 방법이 제공된다.
이식 분야에 공지된 바와 같이, 이식 기관, 조직 또는 세포(들)는 동종이식성 또는 이종이식성일 수 있으며, 따라서 이식편이 동종이식편 또는 이종이식편일 수 있다. 대상 방법에 의해 검출되거나 확인되는 이식편 내성 표현형의 특징은 그것이 면역억제 요법 없이 발생하는 표현형이라는 점, 즉, 그것이 면역억제 요법을 받지 않아 면역억제제가 숙주에게 투여되지 않는 숙주에 존재한다는 점이다. 이식 이식편은 고형 기관 및 피부 이식일 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 분석될 수 있는 기관 이식의 예로는 신장 이식, 췌장 이식, 간 이식, 심장 이식, 폐 이식, 장 이식, 신장 후 췌장 이식, 및 동시 췌장-신장 이식을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
마이크로바이옴 검출 및 분석
본 발명의 방법은 개체로부터의 무세포 핵산 샘플의 고 처리량 시퀀싱 후, 미생물 서열의 존재 및 보유도를 측정하기 위한 생물정보학 분석을 포함하며, 여기서, 서열은 토착 유기체, 예를 들어 장, 피부 등의 정상 마이크로바이옴으로부터의 것일 수 있거나, 비-토착, 예를 들어 기회성, 병원성 등 감염일 수 있다. 분석은 완전한 마이크로바이옴에 대해, 또는 그의 성분, 예를 들어 바이롬, 박테리아 마이크로바이옴, 진균 마이크로바이옴, 원생동물 마이크로바이옴 등에 대해 수행될 수 있다. 핵산의 예로는 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA 헤어핀, DNA/RNA 하이브리드, RNA (예를 들어 mRNA 또는 miRNA) 및 RNA 헤어핀을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA이다. 예를 들어, 무세포 RNA 및 DNA는 인간 혈장에 존재한다.
마이크로바이옴 핵산의 유전자형 분석, 및/또는 마이크로바이옴-특이적 핵산의 검출, 확인 및/또는 정량은 일반적으로 샘플의 증폭의 초기 단계를 포함하지만, 충분한 무세포 핵산이 이용가능하고 직접적으로 시퀀싱될 수 있는 예가 있을 수 있다. 핵산이 RNA인 경우, 증폭 단계는 RNA를 DNA로 전환시키는 역전사효소 반응이 선행될 수 있다. 바람직하게는, 증폭은 비편향이며, 즉 증폭용 프라이머는 유니버셜 프라이머이거나, 어댑터는 분석되는 핵산에 라이게이션되고, 증폭 프라이머는 어댑터에 대해 특이적이다. PCR 기술의 예로는 고온 개시 PCR, 네스티드 PCR, 계내 폴로노니 PCR, 계내 롤링 서클 증폭 (RCA), 브리지 PCR, 피코타이터 PCR 및 에멀젼 PCR을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 적합한 증폭 방법으로는 리가제 연쇄 반응 (LCR), 전사 증폭, 자기-지속 서열 복제, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 선택적 증폭, 컨센서스 서열 프라임드 중합효소 연쇄 반응 (CP-PCR), 임의 프라임드 중합효소 연쇄 반응 (AP-PCR), 퇴화 올리고뉴클레오티드-프라임드 PCR (DOP-PCR) 및 핵산 기재 서열 증폭 (NABSA)을 들 수 있다. 특이적 다형성 좌위를 증폭하는 데 사용될 수 있는 다른 증폭 방법으로는 미국 특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 제6,582,938호에 기재된 것들을 들 수 있다.
증폭 후, 증폭된 핵산은 시퀀싱된다. 시퀀싱은 고-처리량 시스템을 사용하여 달성될 수 있으며, 그 중 일부는 성장하는 가닥 내로의 그의 혼입시 또는 직후 시퀀싱된 뉴클레오티드의 검출, 즉 레드 타임 또는 실질적으로 실시간의 서열의 검출을 허용한다. 일부의 경우, 고 처리량 시퀀싱은 시간 당 적어도 1,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 20,000, 적어도 30,000, 적어도 40,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000 또는 적어도 500,000개의 서열 리드를 생성하며; 각각의 리드는 리드 당 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120 또는 적어도 150 염기이다. 시퀀싱은 본원에 기재된 핵산, 예컨대 게놈 DNA, RNA 전사체로부터 유래된 cDNA 또는 주형으로서의 RNA를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 고-처리량 시퀀싱은 헬리코스 바이오사이언시즈 코포레이션 (Helicos BioSciences Corporation) (미국 메사추세츠주 캠브리지)에 의해 이용가능한 기술, 예컨대 합성에 의한 단일 분자 시퀀싱 (SMSS) 방법의 사용을 포함한다. SMSS는 그것이 필요한 예비 증폭 단계 없이 전체 게놈의 시퀀싱을 허용하기 때문에 독특하다. 따라서, 핵산의 측정에서의 왜곡 및 비선형성이 감소된다. SMSS는 미국 공개 출원 제2006002471 I호; 제20060024678호; 제20060012793호; 제20060012784호; 및 제20050100932호에 부분적으로 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 고-처리량 시퀀싱은 454 라이프사이언시즈, 인코포레이티드 (454 Lifesciences, Inc.) (미국 코네티컷주 브랜포드)에 의해 이용가능한 기술, 예컨대 기기 중의 CCD 카메라에 의해 기록되는 시퀀싱 반응에 의해 생성되는 화학발광 신호를 전달하는 섬유 광학 플레이트를 포함하는 피코 타이터 플레이트 (Pico Titer Plate) 장치의 사용을 포함한다. 섬유 광학의 사용은 4.5시간에 최소 2000만 염기쌍의 검출을 허용한다.
비드 증폭 후 섬유 광학 검출을 사용하는 방법은 문헌 [Marguiles, M., et al. "Genome sequencing in microfabricated high-density pricolitre reactors", Nature, doi: 10.1038/nature03959]; 뿐만 아니라 미국 공개 출원 제20020012930호; 제20030058629호; 제20030100102호; 제20030148344호; 제20040248161호; 제20050079510호; 제20050124022호; 및 제20060078909호에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 고-처리량 시퀀싱은 클로날 단일 분자 어레이 (솔렉사, 인코포레이티드 (Solexa, Inc.)) 또는 가역성 종결자 화학을 이용하는 합성에 의한 시퀀싱 (sequencing-by-synthesis) (SBS)을 사용하여 수행된다. 이들 기술은 미국 특허 제6,969,488호; 제6,897,023호; 제6,833,246호; 제6,787,308호; 및 미국 공개 출원 제200401061 30호; 제20030064398호; 제20030022207호; 및 문헌 [Constans, A,, The Scientist 2003, 17(13):36]에 부분적으로 기재되어 있다.
본 측면의 일부 실시양태에서, RNA 또는 DNA의 고-처리량 시퀀싱은 생물학적 공정 (예를 들어, miRNA 발현 또는 대립유전자 변이성 (SNP 검출))의 모니터링을 허용하는 애니도트.칩스 (AnyDot.chips) (게노복스 (Genovoxx), 독일)를 사용하여 일어날 수 있다. 특히, 애니도트-칩스는 뉴클레오티드 형광 신호 검출의 10x 내지 50x 향상을 허용한다. 애니도트.칩스 및 그의 사용 방법은 국제 공개 출원 번호 WO 02088382, WO 03020968, WO 0303 1947, WO 2005044836, PCTEP 05105657, PCMEP 05105655; 및 독일 특허 출원 번호 DE 101 49 786, DE 102 14 395, DE 103 56 837, DE 10 2004 009 704, DE 10 2004 025 696, DE 10 2004 025 746, DE 10 2004 025 694, DE 10 2004 025 695, DE 10 2004 025 744, DE 10 2004 025 745 및 DE 10 2005 012 301에 부분적으로 기재되어 있다.
다른 고-처리량 시퀀싱 시스템으로는 문헌 [Venter, J., et al. Science 16 February 2001]; [Adams, M. et al, Science 24 March 2000]; 및 [M. J, Levene, et al. Science 299:682-686, January 2003]; 뿐만 아니라 미국 공개 출원 제20030044781호 및 제2006/0078937호에 개시된 것들을 들 수 있다. 전체적인 이러한 시스템은 핵산의 분자 상에서 측정되는 중합 반응을 통한 염기의 시간적 첨가에 의해 복수의 염기를 갖는 표적 핵산 분자를 시퀀싱하는 것을 포함하며, 즉, 시퀀싱되는 주형 핵산 분자에 대한 핵산 중합 효소의 활성이 실시간으로 이어진다. 그 후, 서열은 염기 첨가의 순서 중 각각의 단계에서 핵산 중합 효소의 촉매적 활성에 의한 표적 핵산의 성장하는 상보적 가닥 내로 어떤 염기가 혼입되는지를 확인함으로써 추정될 수 있다. 표적 핵산 분자 복합체 상의 중합효소는 표적 핵산 분자를 따라 이동하고, 활성 부위에서 올리고뉴클레오티드 프라이머를 연장하는 데 적합한 위치에 제공된다. 뉴클레오티드 유사체의 복수의 표지된 유형은 활성 부위에 인접하여 제공되며, 뉴클레오티드 유사체의 각각의 구별가능한 유형은 표적 핵산 서열 중의 상이한 뉴클레오티드에 상보적이다. 성장하는 핵산 가닥은 뉴클레오티드 유사체를 활성 부위에서의 핵산 가닥에 첨가하는 중합효소를 사용함으로써 연장되며, 여기서, 첨가되는 뉴클레오티드 유사체는 활성 부위에서의 표적 핵산의 뉴클레오티드에 상보적이다. 중합 단계의 결과로서 올리고뉴클레오티드 프라이머에 첨가되는 뉴클레오티드 유사체가 확인된다. 표지된 뉴클레오티드 유사체를 제공하는 단계, 성장하는 핵산 가닥을 중합하는 단계, 및 첨가된 뉴클레오티드 유사체를 확인하는 단계는 핵산 가닥이 더 연장되고 표적 핵산의 서열이 측정되도록 반복된다.
일부 실시양태에서, 숏건 시퀀싱이 수행된다. 숏건 시퀀싱에서, DNA를 수많은 작은 절편으로 랜덤하게 절단하고, 연쇄 종결 방법을 사용하여 시퀀싱하여 리드를 얻는다. 표적 DNA에 대한 다중 중복 리드는 이 단편화 및 시퀀싱의 몇몇 라운드를 수행함으로써 얻어진다. 그 후, 컴퓨터 프로그램은 상이한 리드의 중복 말단을 사용하여 이들을 연속적인 서열로 조립한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 시퀀싱을 사용한 미생물 서열의 검출 및 정량 방법을 제공한다. 이 경우, 검출의 민감도를 추정할 수 있다. 민감도에는 2가지 성분이 있다: (i) 분석되는 분자의 수 (시퀀싱의 깊이) 및 (ii) 시퀀싱 공정의 오차율. 시퀀싱의 깊이에 관해, 개체 간의 변동에 대한 빈도 추정치는 1000개 당 약 1개의 염기가 상이한 것이다. 현재, 일루미나 게놈 분석기 (Illumina Genome Analyzer)와 같은 시퀀서는 36 염기쌍을 초과하는 리드 길이를 갖는다. 혈액 중의 숙주 DNA의 분율은 개체의 상태에 따라 다양할 수 있지만, 기준선 추정치로서 90％를 취할 수 있다. 이 공여자 DNA의 분율에서, 분석되는 10개의 분자 중 대략 1개가 미생물성일 것이다. 게놈 분석기 상에서, 분석 채널 당 약 1000만개의 분자를 얻을 수 있으며, 기기 구동 당 8개의 분석 채널이 있다. 따라서, 채널 당 하나의 샘플이 적하되면, 미생물성으로 확인되고 마이크로바이옴의 생태에 대해 정보를 줄 수 있는 약 106개의 분자를 검출할 수 있다. 보다 고 민감도는 보다 많은 분자를 시퀀싱함으로써, 즉 보다 많은 채널을 사용함으로써 간단하게 달성될 수 있다.
시퀀싱 오차율은 또한 이 기술의 민감도에 영향을 준다. 염기 치환에 대한 전형적인 시퀀싱 오차율은 플랫폼 간에 다양하지만, 0.5 내지 1.5％이다. 이는 0.16 내지 0.50％의 민감도에 대한 잠재적 한계를 둔다. 그러나, 헬리코스 바이오사이언시즈에 의해 입증된 바와 같이, 샘플 주형을 다회 재시퀀싱함으로써 시퀀싱 오차율을 전반적으로 저하시킬 수 있다 (Harris, T.D., et al., Science, 320, 106-109 (2008)). 재시퀀싱의 단일 적용은 예상되는 오차율을 감소시킬 것이다.
시퀀싱 후, 서열의 데이터세트를 생물정보학 분석을 위한 데이터 프로세서에 업로딩하여, 숙주 서열, 즉, 인간, 고양이, 개 등을 분석으로부터 제감하고, 예를 들어 미생물 참조 서열에 맵핑하는 서열의 커버리지를 숙주 참조 서열의 커버리지에 대해 비교함으로써 미생물 서열의 존재 및 보유도를 측정한다. 숙주 서열의 제감은 참조 숙주 서열을 확인하는 단계, 및 참조 숙주 게놈에 존재하는 미생물 서열 또는 미생물-모방 서열을 마스킹하는 것을 포함할 수 있다. 유사하게, 미생물 참조 서열에 대한 비교에 의한 미생물 서열의 존재의 결정은 참조 미생물 서열을 확인하는 단계, 및 참조 미생물 게놈에 존재하는 숙주 서열 또는 숙주-모방 서열을 마스킹하는 것을 포함할 수 있다.
데이터세트를 임의로 클리닝하여 서열 품질을 점검하고, 시퀀서 특이적 뉴클레오티드 (어댑터 서열)의 나머지를 제거하고, 중복하는 쌍형성된 말단 리드를 합하여 보다 적은 리드 오차로 보다 고 품질 컨센서스 서열을 생성한다. 반복적 서열은 동일한 시작 부위 및 길이를 갖는 것들로서 확인되고, 사본은 분석으로부터 제거될 수 있다.
본 발명의 중요한 특징은 분석으로부터의 인간 서열의 제감이다. 증폭/시퀀싱 단계는 비편향이기 때문에, 샘플 중의 서열의 우세한 것은 숙주 서열일 것이다. 제감 공정은 예를 들어 초기 정렬이 조질 필터에서, 즉 고속 정렬기를 사용하여 설정되는 다중 제감을 수행하고, 미세 필터, 즉 민감성 정렬기를 사용한 추가의 정렬을 수행함으로써, 공정의 속도 및 정확성을 개선하도록 몇몇 방식으로 최적화될 수 있다.
리드의 데이터베이스를 초기에 제한 없이 진뱅크 hg19 참조 서열을 비롯한 인간 참조 게놈에 대해 정렬하여 숙주 DNA를 생물정보학적으로 제감한다. 각각의 서열을 인간 참조 서열 중의 가장 적합한 서열로 정렬한다. 인간으로서 양성으로 확인된 서열은 분석으로부터 생물정보학적으로 제거된다.
참조 인간 서열은 또한 제한 없이 참조 데이터베이스에 잘 나타나지 않는 게놈에 존재하는 고도로 반복적인 서열을 비롯한 고 히트율을 갖는 콘티그에 첨가함으로써 최적화될 수 있다. hg19에 대해 정렬되지 않는 리드 중에서, 인간 서열의 많은 세트를 포함하는 데이터베이스, 예를 들어 전체 NCBI NT 데이터베이스가 사용되는 경우, 유의한 양이 결국 파이프라인의 후기 단계에서 인간으로 확인된다. 분석에서 보다 초기의 이들 리드의 제거는 연장된 인간 참조물을 구축함으로써 수행될 수 있다. 이 참조물은 초기 인간 리드 제감 후 높은 커버리지를 갖는 참조물 이외의 인간 서열 데이터베이스, 예를 들어 NCBI NT 데이터베이스에서 인간 콘티그를 확인함으로써 생성된다. 이들 콘티그를 인간 참조물에 첨가하여 보다 포괄적인 참조 세트를 생성한다. 또한, 코호트 연구로부터의 신규한 조립된 인간 콘티그는 인간-유래된 리드에 대한 추가의 마스크로서 사용될 수 있다.
비-인간 서열을 함유하는 인간 게놈 참조 서열의 영역, 예를 들어 참조 샘플의 게놈 내로 통합된 바이러스 및 박테리아 서열은 마스킹될 수 있다. 예를 들어, 엡스타인-바 바이러스 (EBV)는 hg19 내로 혼입된 그의 게놈의 약 80％를 갖는다.
그 후, 비-인간으로 확인된 서열 리드를 미생물 참조 서열의 뉴클레오티드 데이터베이스에 대해 정렬한다. 데이터베이스는 숙주와 관련되는 것으로 공지된 미생물 서열, 예를 들어 인간 공생자 및 병원성 미생물의 세트에 대해 선택될 수 있다.
미생물 데이터베이스는 오염 서열을 마스킹하거나 제거하도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, 많은 공개 데이터베이스 엔트리는 미생물로부터 유래되지 않는 인공 서열, 예를 들어 프라이머 서열, 숙주 서열 및 다른 오염물을 포함하는 것이 관찰되었다. 데이터베이스에 대해 초기 정렬 또는 복수의 정렬을 수행하는 것이 바람직하다. 다중 샘플이 정렬되는 경우 리드 커버리지의 불규칙성을 나타내는 영역은 인공물로서 마스킹되거나 제거될 수 있다. 이러한 불규칙한 커버리지의 검출은 다양한 계량치, 예컨대 특이적 뉴클레오티드의 커버리지 및 이 뉴클레오티드가 발견되는 전체 콘티그의 평균 커버리지 사이의 비율에 의해 수행될 수 있다. 약 5X, 약 10X, 약 25X, 약 50X, 약 100X 초과로 나타나는 일반적 서열에서, 그 참조 서열의 평균 커버리지는 인공적이다. 대안적으로, 콘티그의 전체 커버리지를 감안한 커버리지의 염기-당 유사성을 제공하기 위해 이항 검정을 적용할 수 있다. 참조 데이터베이스로부터의 오염 서열의 제거는 미생물의 정확한 확인을 허용한다. 본 발명의 방법의 이점은 데이터베이스가 샘플의 정렬로 개선된다는 점이며, 예를 들어 데이터베이스는 1, 10, 20, 50, 100개 이상의 샘플로 정렬되어 상업적 또는 임상적 사용 전에 데이터베이스를 개선시킬 수 있다.
각각의 고 신뢰성 리드는 주어진 미생물 데이터베이스에서 다중 유기체에 대해 정렬될 수 있다. 이 가능한 맵핑 중복성에 기초하여 유기체 풍부도를 정확하게 할당하기 위해, 가장 유사한 유기체를 컴퓨팅하는 알고리듬이 사용되고, 알고리듬이 선택된다 (예를 들어, 문헌 [Lindner et al. Nucl. Acids Res.　(2013) 41　(1):　e10] 참조). 예를 들어, 주어진 리드가 유래된 가장 유사한 유기체를 컴퓨팅하는 GRAMMy 또는 GASiC 알고리듬이 사용될 수 있다. 이들 데이터는 무세포 핵산 샘플 중의 미생물의 존재에 관한 정보를 제공한다.
숙주 서열에 대한 또는 미생물 서열에 대한 정렬 및 할당은 관련 기술분야에서 인지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 50 nt의 리드는 리드의 길이에 걸쳐 1개 이하의 미스매치, 2개 이하의 미스매치, 3개 이하의 미스매치, 4개 이하의 미스매치, 5개 이하의 미스매치 등이 있는 경우 주어진 게놈의 매칭으로서 할당될 수 있다. 상업적 알고리듬은 일반적으로 정렬 및 확인에 사용된다. 이러한 정렬 알고리듬의 비-제한적 예는 bowtie2 프로그램 (존스 홉킨스 유니버시티 (Johns Hopkins University)이다. 예를 들어, 말단-대-말단 방식의 예비-세트 옵션은 바람직한 정렬 속도에 기초하여 선택될 수 있다.
--매우-빠름 동일함: -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50
--빠름 동일함: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50
--민감함 동일함: -D 15 -R 2 -L 22 -i S,1,1.15
--매우-민감함 동일함: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50
비교가능한 설정은 다른 정렬 알고리듬 또는 소프트웨어 패키지에서 사용될 수 있다.
그 후, 유기체에 대한 리드 (즉, 숙주 또는 마이크로바이옴 성분)의 이들 할당을 총합하고, 무세포 핵산 샘플 중의 유기체의 보유도의 결정에서 주어진 샘플 중의 각각의 유기체에 대해 할당된 리드의 추정된 수를 컴퓨팅하는 데 사용한다. 분석은 미생물 게놈의 크기에 대한 카운트를 정규화하여 미생물의 커버리지의 계산을 제공한다. 각각의 미생물에 대한 정규화된 커버리지를 동일한 샘플 중의 숙주 서열 커버리지에 대해 비교하여 샘플 간의 시퀀싱 깊이의 차이를 해명한다.
최종 측정은 샘플 중의 서열에 의해 나타난 미생물 유기체의 데이터세트, 및 그들 미생물의 보유도를 제공한다. 이들 데이터를 임의로 집합하고, 용이한 시각화를 위해, 예를 들어 개체 또는 건강 관리 제공자에게 제공되는 보고서의 형태로; 또는 하이퍼-링크된 데이터를 갖는 브라우저 포맷으로 기재하여 디스플레이한다. 커버리지 추정을 샘플로부터의 메타데이타로 집합하고, 각각의 샘플 또는 샘플의 코호트에 대한 표 및 도면으로 분류할 수 있다.
임의로, 필터링된 숙주 서열은 다른 목적을 위해, 예를 들어 개인 의료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 게놈 중의 특정 SNP는 의사가 주어진 환자에 대한 약물 민감도를 확인하는 것을 허용할 수 있다. 인간-유래된 서열은 숙주의 게놈 내로의 바이러스 (예를 들어 EBV, HPV, 폴리오마바이러스)의 통합을 밝히거나, 상승적인 임상적 적용을 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 무세포 종양 DNA는 화학요법으로 인한 감염에 매우 감수성인 환자에서의 감염 모니터링과 병행하여 암 진행을 모니터링하는 데 사용될 수 있음).
일부 실시양태에서, 무세포 핵산의 분석은 병원성 점수를 컴퓨팅하는 데 사용되며, 여기서, 병원성 점수는 예를 들어 보건 종사자에 의한 해석의 용이성을 위해 유기체의 전체적인 병원성을 요약하는 수치 또는 알파벳 값이다. 마이크로바이옴에 존재하는 상이한 미생물은 상이한 점수가 할당될 수 있다. 최종 "병원성 점수"는 많은 상이한 인자의 조합이며, 전형적으로 예를 들어 0 내지 1, 0 내지 10 또는 0 내지 100 범위의 임의 단위로서; 관심의 미생물에 대한 모든 관찰된 병원성 점수로부터의 퍼센트로서 등으로 제공된다. 특정 파라미터 및 그들 파라미터의 중량은 예를 들어 관찰된 질환 중증도에 대한 함수를 적합화함으로써, 또는 상이한 파라미터 및 범주의 중요성을 수동으로 설정함으로써 실험적으로 측정될 수 있다.
병원성 점수의 계산에 관한 인자로는 제한 없이, 예를 들어 참조 대상체 또는 대상체의 군, 예를 들어 시험 집단 중의 미생물의 풍부도에 상대적인 인간 리드에 상대적인 리드의 수에 의해 컴퓨팅되는 바와 같은 미생물의 풍부도, 공지된 감염, 공지된 비-감염된 개체 등을 포함할 수 있다. 미생물과 관련된 독성, 병원성, 항생제 저항성 등의 데이터베이스를 참고하여 이루어질 수 있으며, 제한 없이, SNP, 인델, 플라스미드 등을 포함하는 미생물 게놈에서 발견되는 특이적 돌연변이. 제한 없이 유기체의 특정 비율 및 군을 포함하는 특정 미생물의 공동-발생. 특정 서열의 발현, 예를 들어 mRNA의 검출은 예를 들어 미생물이 활성적으로 복제하는지 또는 잠재성인지의 여부 등의 정보를 주는 것으로서 병원성 점수와 관련될 수 있다. 지리적 특징이 또한 포함될 수 있으며, 여기서, 지리는 관심의 미생물에의 노출, 예를 들어 숙주의 이동 내력; 감염된 개체와의 상호작용 등을 나타낸다.
또한, 하나 이상의 상기 기재된 방법을 실시하기 위한 시약 및 그의 키트가 제공된다. 대상 시약 및 그의 키트는 매우 다양할 수 있다. 관심의 시약은 상기 기재된 것의 제조에 사용하기 위해 특이적으로 설계된 시약을 포함한다: (i) 마이크로바이옴 및 개체의 프로파일링; (ii) 마이크로바이옴 프로파일의 확인; 및 (ii) 개체로부터 얻어진 샘플 중의 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 검출 및/또는 정량. 키트는 본원에 기재된 방법, 예컨대 PCR 및 시퀀싱을 사용한 핵산 추출 및/또는 핵산 검출을 수행하는 데 필요한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 시험 프로파일과의 비교를 위한 참조 프로파일을 포함할 수 있으며, 특히 상기 기재된 바와 같이 최적화된 참조 데이터베이스를 포함할 수 있는 데이터 분석을 위한 소프트웨어 패키지를 더 포함할 수 있다. 키트는 시약, 예컨대 완충액 및 H2O를 포함할 수 있다.
이러한 키트는 또한 조성물의 활성 및/또는 이점을 지시하거나 확립하고/거나, 용량, 투여, 부작용, 약물 상호작용, 또는 건강 관리 제공자에게 유용한 다른 정보를 기재하는 정보, 예컨대 과학 문헌 참고문헌, 패키지 삽입 물질, 임상 시험 결과, 및/또는 이들의 요약 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 또한 데이터베이스에 접근하기 위한 명령어를 포함할 수 있다. 이러한 정보는 다양한 연구, 예를 들어 생체내 모델을 포함하는 실험 동물을 사용한 연구 및 인간 임상 시험에 기초한 연구의 결과에 기초할 수 있다. 본원에 기재된 키트는 의사, 간호사, 약사, 처방 공무원 등을 비롯한 건강 제공자에게 제공되고/거나, 마케팅되고/거나 프로모션될 수 있다. 키트는 또한 일부 실시양태에서 소비자에게 직접 마케팅될 수 있다.
임의의 상기 방법은 컴퓨터 판독가능한 매체 상에 기록된 컴퓨터 실행가능한 로직을 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 프로그램은 하기 기능의 일부 또는 전부를 실행할 수 있다: (i) 샘플로부터의 핵산의 단리의 제어, (ii) 샘플로부터의 핵산의 예비-증폭, (iii) 샘플 중의 특정 영역의 증폭, 시퀀싱 또는 어레잉, (iv) 샘플 중의 미생물 서열의 확인 및 정량화, (v) 미리 결정된 역치를 갖는 샘플로부터 검출된 미생물 존재 또는 보유도에 대한 데이터의 비교, (vi) 감염, 마이크로바이옴 건강, 면역적격 상태 또는 결과의 측정, (vi) 감염, 마이크로바이옴 건강, 면역적격 등에 관한 샘플 상태의 선포.
컴퓨터 실행가능한 로직은 임의의 다양한 유형의 일반-목적 컴퓨터, 예컨대 퍼스널 컴퓨터, 네트워크 서버, 워크스테이션, 또는 현재 또는 차후 개발될 다른 컴퓨터 플랫폼일 수 있는 임의의 컴퓨터에서 작동할 수 있다. 일부 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램 제품은 그에 저장된 컴퓨터 실행가능한 로직 (프로그램 코드를 포함한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램)을 갖는 컴퓨터 사용가능한 매체를 포함하는 것으로 기재된다. 컴퓨터 실행가능한 로직은 프로세서에 의해 실행될 수 있으며, 프로세서는 본원에 기재된 기능을 수행하게 한다. 다른 실시양태에서, 일부 기능은 예를 들어 하드웨어 상태 기계를 사용하여 하드웨어에서 일차적으로 수행된다. 본원에 기재된 기능을 수행하기 위한 하드웨어 상태 기계의 수행은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
프로그램은 마이크로바이옴 및 개체의 프로파일링 및/또는 개체의 순환에서 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 정량을 반영하는 데이터에 접근함으로써 개체 중의 미생물 상태를 평가하는 방법을 제공할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 컴퓨터 로직을 실행하는 컴퓨터는 또한 디지털 입력 장치, 예컨대 스캐너를 포함할 수 있다. 디지털 입력 장치는 핵산에 대한 정보, 예를 들어 존재 또는 보유도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (i) 샘플에서 검출된 하나 이상의 핵산으로부터 데이터를 취득하는 단계; 및 (ii) 마이크로바이옴 정량에 기초하여 상태를 진단하거나 예측하는 단계를 컴퓨터가 수행하게 하도록 그에 기록된 명령어들의 세트를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공한다.
또한, 미생물 참조 서열의 데이터베이스; 및 인간 참조 서열의 데이터베이스가 제공된다. 이러한 데이터베이스는 전형적으로 상기 기재된 바와 같은 최적화된 데이터세트를 포함할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 감염에 관한 개체의 상태를 제공한다. 일부 이러한 실시양태에서, 미생물 감염은 병원체이며, 여기서, 병원체 서열의 임의의 존재는 임상적으로 관련된 감염을 지시한다. 다른 실시양태에서, 보유도는 미생물 적하량을 나타내며, 여기서, 예비-설정 수준은 임상적 관련성을 나타낸다. 일부 이러한 실시양태에서, 개체는 항미생물 요법, 예를 들어 항생제, 수동 또는 능동 면역요법, 항바이러스제 등을 사용한 치료를 위해 치료되거나 고려된다. 개체는 요법 전, 요법 동안 및 요법 후에 시험될 수 있다.
미생물 감염은 또한 공생 유기체에 대한 적하량에 의해 지시될 수 있으며, 여기서, 혈액 샘플 중의 공생자의 수준은 장 건강, 예를 들어 장 루멘 고장을 나타낸다.
단독으로 또는 미생물 DNA와 관련하여 미생물 RNA의 비교가 이루어질 수 있으며, 여기서, 어느 미생물 서열에 대한 과량의 RNA, 예를 들어 미생물 DNA의 커버리지의 약 5X, 10X, 15X, 20X, 25X는 활성 감염을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 이렇게 분석된 미생물은 잠복 감염이 가능한 것, 예를 들어 헤르페스바이러스, 간염 바이러스 등이다.
다른 실시양태에서, 마이크로바이옴의 전체적인 추정치가 관심의 대상이며, 여기서, 미생물의 부류의 상대적 존재 또는 보유도가 관심의 대상이다. 식이 및 약물, 예를 들어 스타틴, 항생제, 면역억제제 등을 사용한 치료는 마이크로바이옴의 전체적인 건강에 영향을 줄 수 있는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 따라서 마이크로바이옴의 조성을 측정하는 것이 관심의 대상이다.
일부 실시양태에서, 마이크로바이옴으로부터의 상기 하나 이상의 핵산의 양의 시간적 차이는 항-미생물 치료의 유효성을 모니터링하거나 치료를 선택하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 치료 전후에 측정될 수 있다. 치료 후의 미생물로부터의 하나 이상의 핵산의 감소는 치료가 성공적이었음을 지시할 수 있다. 또한, 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 치료, 예를 들어 상이한 강도의 치료 사이를 선택하는 데 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 면역억제 요법을 받는 대상체에서의 면역적격, 이식 상태 또는 결과의 진단 또는 예측 방법을 제공한다. 면역억제 후, 상기 기재된 바와 같은 샘플을 환자로부터 가져오고, 바이롬 핵산을 비롯한 하나 이상의 마이크로바이옴의 존재 또는 부재에 대해 분석할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 뇨이다. 미생물 핵산의 비율 및/또는 양은 시간 경과에 따라 모니터링될 수 있으며, 이 비율의 증가는 면역적격을 측정하는 데 사용될 수 있다. 적하량의 정량은 본원에 기재된 것을 비롯한 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대 시퀀싱, 핵산 어레이 또는 PCR에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역억제된 수용자로부터의 샘플 중의 하나 이상의 마이크로바이옴 핵산의 양은 이식 상태 또는 결과를 측정하는 데 사용된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산을 정량하는 것을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 공여자 샘플로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 샘플 중의 총 핵산의 퍼센트로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 공여자 샘플로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 샘플 중의 총 핵산의 비율로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 공여자 샘플로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 샘플 중의 하나 이상의 참조 핵산에 비교한 비율 또는 퍼센트로서 측정된다. 예를 들어, 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 샘플 중의 총 핵산의 10％인 것으로 측정될 수 있다. 대안적으로, 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 샘플 중의 총 핵산에 비교한 1:10의 비율일 수 있다. 또한, 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 참조 유전자, 예컨대 β-글로빈의 10％ 또는 1:10의 비율일 수 있다. 일부 실시양태에서, 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 농도로서 측정될 수 있다. 예를 들어, 공여자 샘플로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 1 μg/mL인 것으로 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 미리 결정된 역치 값 초과의 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 면역적격 상태를 나타낸다. 예를 들어, 이식 거부 또는 다른 병리의 증거를 갖지 않는 임상적으로 안정한 환자에 대한 표준 값이 측정될 수 있다. 임상적으로 안정한 이식후 환자에 대한 표준 값 미만의 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양의 증가는 안정한 결과를 지시할 수 있다. 한편, 임상적으로 안정한 이식후 환자에 대한 표준 값의 또는 그 초과의 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 증가된 면역적격 또는 이식편 거부의 위험을 지시할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상이한 미리 결정된 역치 값은 상이한 이식 결과 또는 상태를 나타낸다. 예를 들어, 상기 논의된 바와 같이, 임상적으로 안정한 이식후 환자에 대한 표준 값 초과의 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양의 증가는 이식 상태 또는 결과의 변화, 예컨대 이식 거부 또는 이식 손상을 지시할 수 있다. 그러나, 임상적으로 안정한 이식후 환자에 대한 표준 값 초과이지만 미리 결정된 역치 수준 미만의 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양의 증가는 보다 덜 심각한 상태, 예컨대 이식 거부보다는 바이러스 감염을 지시할 수 있다. 보다 높은 역치 초과의 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양의 증가는 이식 거부를 지시할 수 있다.
일부 실시양태에서, 마이크로바이옴으로부터의 상기 하나 이상의 핵산의 양의 시간적 차이는 면역적격도를 나타낸다. 예를 들어, 이식 환자를 시간 경과에 따라 모니터링하여 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양을 결정할 수 있다. 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양이 일시적 감소한 다음 정상 값으로 복귀하는 것은 이식 거부보다는 보다 덜 심각한 상태를 지시할 수 있다. 한편, 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양의 지속된 감소는 심각한 상태, 예컨대 효과적인 면역억제의 결핍 및 이식편 거부를 지시할 수 있다.
일부 실시양태에서, 마이크로바이옴으로부터의 상기 하나 이상의 핵산의 양의 시간적 차이는 면역억제제 치료의 유효성을 모니터링하거나 면역억제제 치료를 선택하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 면역억제제 치료 전후에 측정될 수 있다. 치료 후의 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 감소는 치료가 이식 거부를 예방하는 데 성공적이었음을 지시할 수 있다. 또한, 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 양은 면역억제제 치료, 예를 들어 상이한 강도의 면역억제제 치료 사이를 선택하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 보다 낮은 양은 매우 강력한 면역억제제의 필요가 있음을 지시할 수 있는 반면, 마이크로바이옴으로부터의 하나 이상의 핵산의 보다 높은 양은 보다 덜 강력한 면역억제제가 사용될 수 있음을 지시할 수 있다.
본 발명은 민감성이며 특이적인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이식 상태 또는 결과를 진단하거나 예측하는 본원에 기재된 방법은 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 100％ 민감도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 적어도 50％ 민감도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 적어도 78％ 민감도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 약 70％ 내지 약 100％의 특이도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 약 80％ 내지 약 100％의 특이도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 약 90％ 내지 약 100％의 특이도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 약 100％의 특이도를 갖는다.
본 발명은 비-인간 공급원으로부터의 무세포 DNA 또는 RNA의 서열을 모니터링함으로써, 면역억제 요법으로 치료되는 개체, 항-미생물제로 치료되는 개체 등을 비롯한 개체에 대한 비-침습적 진단을 제공한다. 예를 들어, 개체는 다수의 바이러스를 가지며, 여기서, 바이러스 적하량은 본원에서 개체의 면역적격에 따라 다양한 것으로 나타난다. 면역적격의 모니터링에 바람직한 바이러스는 아넬로바이러스이며, 여기서, 바이러스 적재량은 본원에서 개체의 면역적격과 상관되는 것으로 나타난다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 감염, 면역적격, 이식 상태 또는 결과의 진단, 예측, 검출 및/또는 치료를 위한 통상적으로 혈장에 유리하거나 바이러스 입자로부터의 순환 핵산의 검출 및/또는 정량을 위한 방법, 장치, 조성물 및 키트를 제공한다.
일부 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 다른 외래 공급원으로부터의 DNA로부터의 마이크로키메라 현상의 잠재적인 문제를 회피하고, 성별의 고려 없이 모든 기관 수용자에 대해 일반적인 바이롬 분석에 의한 이식 환자에서의 면역적격의 비침습적 검출에 대한 접근법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 유전 지문은 개체의 바이롬에 대해 생성된다. 이 접근법은 공여자 및 수용자의 성별에 독립적인 방식으로 이루어질 수 있는 서열의 신뢰성있는 확인을 허용한다.
면역억제 요법 후, 예를 들어 이식, 자가면역 질환의 치료 등과 함께, 체액, 예컨대 혈액을 환자로부터 가져오고, 마커에 대해 분석할 수 있다. 체액의 예로는 도말, 가래, 생검, 분비, 뇌척수액, 담즙, 혈액, 림프액, 타액 및 뇨를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바이롬 서열의 검출, 확인 및/또는 정량은 실시간 PCR, 칩, 순환 핵산 (예를 들어 무세포 DNA)의 고-처리량 숏건 시퀀싱, 뿐만 아니라 본원에 기재된 방법을 비롯한 관련 기술분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 바이러스 적하량은 시간 경과에 따라 모니터링될 수 있으며, 이 비율의 증가는 면역적격 상태 또는 결과를 측정하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 이식 이식편은 임의의 고형 기관 또는 피부 이식일 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 분석될 수 있는 기관 이식의 예로는 신장 이식, 췌장 이식, 간 이식, 심장 이식, 폐 이식, 장 이식, 신장 후 췌장 이식, 및 동시 췌장-신장 이식을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 개체 수준에서, 또는 환자의 군의 분석에서, 예를 들어 임상 시험 형식에서 감염을 비롯한 질환의 치료를 위한 요법의 효능을 결정하는 데 사용된다. 이러한 실시양태는 전형적으로 환자 또는 환자의 군에 대한 2개의 시점의 비교를 포함한다. 환자 상태는 치료제, 치료 처방, 또는 치료를 받고 있는 환자에 대한 질환 접종의 결과로서 2개의 시점 사이에 상이할 것으로 예상된다.
이러한 실시양태를 위한 형식의 예로는 제한 없이, 2개 이상의 시점에서 마이크로바이옴을 분석하는 것을 들 수 있으며, 여기서, 제1 시점은 진단되지만 비치료된 환자이고; 제2 또는 추가의 시점(들)은 후보 치료제 또는 처방으로 치료된 환자이다.
또다른 형식에서, 제1 시점은 예를 들어 현재 임상 범주에 의해 후보 치료제 또는 처방의 결과로서 확인된 바와 같은 질환 관해 중의 진단된 환자이다. 제2 또는 추가의 시점(들)은 후보 치료제 또는 처방으로 치료되고, 예를 들어 백신 관련하에 질환-유도제로 접종된 환자이다.
이러한 임상 시험 형식에서, 시점의 각각의 세트는 단일 환자, 환자 군, 예를 들어 코호트 군, 또는 개체 및 군 데이터의 혼합에 상응할 수 있다. 추가의 대조 데이터는 또한 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 이러한 임상 시험 형식, 예를 들어 위약 군, 질환이 없는 군 등에 포함될 수 있다. 관심의 형식은 교차 연구, 랜덤화, 이중-맹검, 위약-대조군을 포함할 수 있으며, 평행 군 시험은 또한 약물 효능 등을 시험할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Clinical Trials: A Methodologic Perspective Second Edition, S. Piantadosi, Wiley-Interscience; 2005, ISBN-13: 978-0471727811]; 및 [Design and Analysis of Clinical Trials: Concepts and Methodologies, S. Chow and J. Liu, Wiley-Interscience; 2003; ISBN-13: 978-0471249856]을 참조하며, 각각은 구체적으로 본원에 참고로 포함된다.
실시예
면역억제 및 항바이러스 요법에 대한 인간 바이롬의 시간적 반응
마이크로바이옴의 바이러스 성분인 인간 바이롬은 상대적으로 연구하에 남아 있으며 (Wylie et al. (2012) Transl Res 160, 283-290), 바이롬 조성에 대한 면역 조절 및 항바이러스 요법의 효과에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 이전에는, 건강한 장 바이롬은 시간 경과에 따라 현저하게 안정하게 유지되는 것으로 (Reyes et al. (2010) Nature 466, 334-338), 그리고 식이와 바이롬 조성 사이의 연관성은 발견되었지만, 변동의 우세한 근원은 대상체 간의 차이로 인한 것으로 제시되었다 (Minot, et al. (2011). Genome Research 21, 1616-1625).
면역억제 요법은 기관 이식에서 이식편 거부의 위험을 유의하게 감소시키지만, 감염에 대한 수용자의 감수성을 증가시킨다. 바이러스 병원체, 특히 헤르페스바이러스 시토메갈로바이러스 (CMV)로의 감염은 빈번하게 발생하며, 수용자의 이식편 기능이상의 위험을 증가시킨다. 따라서, 기관 이식 수용자는 빈번하게 CMV에 대해 지정된 항바이러스 예방 또는 선제 요법으로 처치된다.
면역억제의 수준 및 감염 및 거부의 위험 사이의 역의 관계는 환자 치료에 이용가능한 단지 좁은 치료 윈도우를 남긴다. 이식후 관리는 또한 감염 및 거부의 진단을 위한 현재 이용가능한 방법의 수많은 제한에 의해 복잡해진다. 거부의 진단은 대부분 관찰자간 가변성, 높은 비용 및 환자 불편을 겪는 침습적 생검에 의존한다. 감염의 증상은 면역억제 후에 감소되고, 통상적으로 사용되는 진단 방법, 예컨대 항원-검출 및 PCR-기재 분자 시험은 특이적 표적, 및 따라서 감염의 근원에 대한 우선 가설에 의존한다는 점을 감안하면 감염의 진단은 도전적이다.
마지막 문제로서, 면역억제 약물에 대한 민감도에서의 환자-대-환자 가변성은 각각 감염 또는 거부의 위험의 증가시키는 초과- 및 미만 면역억제를 유발할 수 있다.
면역계의 검강을 측정하는 약간의 실질적인 방법이 있으며, 면역적격 및 마이크로바이옴의 바이러스 성분 사이의 관련은 빈약하게 이해되어 있다. 기관 이식 수용자는 인간 바이롬에 대한 면역 조절의 효과에 윈도우를 제공하는 면역억제 및 항바이러스 약물을 조합하는 이식후 요법으로 치료된다. 본 발명자들은 혈장 중의 무세포 DNA의 시퀀싱을 사용하여 기관 이식 수용자 (656개의 샘플, 96명의 환자)의 코호트에서의 약물-바이롬 상호작용을 조사하였으며, 항바이러스제 및 면역억제제가 혈장 중의 바이롬의 구조에 강하게 영향을 준다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 요법의 개시 시에 현저한 바이롬 조성 동역학을 관찰하였으며, 총 바이러스 적하량이 면역억제와 함께 증가하는 반면, 마이크로바이옴의 박테리아 성분은 크게 영향받지 않은 채로 남아 있음을 발견하였다. 데이터는 인간 바이롬, 면역계의 상태, 및 약물학적 치료의 효과 사이의 관계의 통찰을 제공하며, 면역적격을 예측하기 위한 바이롬 상태의 잠재적인 적용을 제공한다.
이 연구에서, 본 발명자들은 혈장 중에 순환하는 무세포 DNA를 시퀀싱하여 기관 이식 후 약물-마이크로바이옴 상호작용을 조사하였다. 본 발명자들은 면역억제제 및 항바이러스 예방의 조합으로 처치된 심장 및 폐 이식 수용자에서의 감염의 패턴을 연구하였다. 본 발명자들은 면역억제제 및 항바이러스제가 마이크로바이옴의 바이러스 성분의 구조에 대해 강한 영향을 갖지만, 박테리아 성분에 대해서는 그렇지 않음을 발견하였다. 상이한 개체의 바이롬 조성이 유사한 약물-측정된 상태에 수렴함에 따라, 강한 조성 동역학이 약물 요법의 개시 시에 관찰된다. 총 바이러스 적하량은 바이러스, 특히 아넬로바이러스가 면역적격의 감소를 이용함에 따라, 요법에 반응하여 현저하게 증가한다. 마지막으로, 본 발명자들은 아넬로바이러스 적재량의 측정이 거부 및 비-거부 수용자의 계층화를 가능하게 함을 보인다.
656개의 혈장 샘플을 96명의 고형 기관 이식 수용자로부터 종적으로 수집하였다 (41개의 성인 심장, 24개의 소아 심장, 31개의 성인 폐). 무세포 DNA를 혈장으로부터 정제하고, 시퀀싱하였다. 전체적으로, 본 발명자들은 820 기가베이스 (Gbp)의 시퀀싱 데이터, 샘플 당 평균 1.25 Gbp를 얻었다 (일루미나 하이세크 (Illumina HiSeq), 1x50 bp 리드, 도 1B). 기관 이식 수용자를 계속해서 연구에서 2년 초과의 과정에 걸쳐 등록하고, 샘플을 이식후 규칙적인 시점에서 수용자로부터 수집하였으며, 이식 후 첫번째 개월에서 샘플 수집의 최고 빈도를 갖는다. 도 1C는 분석된 샘플의 수를 상이한 환자 부류에 대한 이식후 시간의 함수로서 나타낸다.
코호트 중의 환자를 표준화된 이식후 요법의 일부로서 항바이러스 예방 및 면역억제로 치료하였다 (도 1D). 유지 면역억제는 성인 심장 및 폐 이식 수용자에 대해 타크롤리무스-기재였으며, 미코페놀레이트 모페틸 및 프레드니손으로 보충하였다. 소아 환자를 시클로스포린 기재 항-거부 요법으로 치료하였다. CMV 양성 이식 수용자 (수용자 및/또는 공여자에 대한 CMV 감염 전)를 항바이러스 예방으로 치료하였으나, CMV 음성 수용자는 그렇지 않았다. 프로토콜 설계는 이식후 첫번째 몇 개월에서 면역억제제 및 항바이러스 약물의 고 용량을 수반하며, 그 후 용량은 거부 및 감염의 위험이 감소함에 따라 점차적으로 감소된다. 면역억제에 이용가능한 좁은 치료적 윈도우 및 타크롤리무스의 약물동역학에서의 큰 환자-대-환자 가변성을 감안하여, 타크롤리무스의 농도는 혈액에서 직접적으로 측정되며, 용량은 표적 약물 수준을 유지하도록 조정된다. 도 1D는 타크롤리무스-치료된 환자에 대한 혈액에서 측정된 타크롤리무스의 평균 수준을 나타내며, 약물 치료 프로토콜의 설계를 예시한다.
DNA 서열 분석. 마이크로바이옴-유래된 서열을 인간-유래된 서열의 컴퓨터 제감 후에 확인하였다. 이 목적으로, 사본 및 저 품질 리드를 제거하고, 남아 있는 리드를 인간 참조 게놈, 빌드 hg19 (BWA -(Li and Durbin, 2009), 방법 참조)에 대해 맵핑하였다. 그 후, 비맵핑된 리드를 수집하고, 저 복잡성 리드를 제거하였다. 도 1E는 사본 및 품질 필터를 적용한 후에 남아 있는 리드 분획의 분포 (평균 86％) 및 인간 리드의 제감 후에 남아 있는 분획의 분포 (평균 2％)를 나타낸다.
감염제를 확인하기 위해, 남아 있는 고 품질의 고유한 비-인간 리드를 BLAST를 사용하여 바이러스 (n=1401), 박테리아 (n=1980) 및 진균 (n=32) 게놈의 참조 데이터베이스에 대해 맵핑하였다 (NCBI로부터 다운로드함, 도 6A). 고유하게 시퀀싱된 리드의 0.12％는 표적 게놈의 적어도 하나에 대해 정렬되었다 (도 6B, C). 본 발명자들은 확인된 표적 (헤르페스바이러스 4, 5, 6 및 파르보바이러스)의 시퀀싱의 하위세트에 대해 표적화된 정량적 PCR (qPCR) 어세이를 사용하여 시퀀싱-기재 접근법에 의해 확인된 양성 히트를 입증하였다. 본 발명자들은 시퀀싱 및 qPCR에 의해 측정된 바와 같은 바이러스 카운트 사이의 정량적 일치를 발견하였다 (도 6D).
본 발명자들은 또한 헤르페스바이러스의 검출을 위한 시퀀싱 어세이의 민감도가 qPCR 측정과 동등함을 발견하였다. 따라서, 시퀀싱 어세이에 이용가능한 보다 큰 캡쳐 횡단면 - 완전한 표적 게놈 대 PCR 앰플리콘 표적 영역 - 은 시퀀싱 라이브러리 제조 및 라이브러리 과소샘플링의 한정된 효능에 의해 유발되는 시퀀싱에서의 신호 소실을 극복하는 데 충분하다. 연구에서의 모든 샘플에 걸친 시퀀싱을 사용하여 측정된 최고 CMV 적하량은 임상적으로 진단된 전파된 CMV 감염을 앓은 2명의 성인 심장 이식 환자에 상응하였다 (도 6E 참조).
DNA 추출 및 시퀀싱 라이브러리 제조에 사용되는 시약 중의 잠재적인 오염물의 존재를 시험하기 위해, 본 발명자들은 2가지 대조 실험을 수행하였다. 먼저, 본 발명자들은 공지된 주형 (람다 (Lambda) gDNA, 파크비오 파트 (Pacbio Part) 번호: 001-119-535)을 갖는 2개의 샘플을 제조하고, 상기 기재된 워크플로우 (일루미나 미세크 (Illumina Miseq), 3400만개 및 3500만개 리드)를 사용하여 시퀀싱용 DNA를 정제하였다. 람다-유래된 서열을 제거하고, 남아 있는 서열 (0.4％)을 상기 기재된 BLAST 참조 데이터베이스에 대해 정렬하였다. 이 연구에서 논의된 다양한 감염제에 대한 증거는 발견되지 않았지만, 본 발명자들은 아마도 람다 DNA 배양물의 나머지인 장내세균 박테리아 과 (프로테오박테리아 문), 주로 이. 콜라이 (> 97％), 및 장내세균 파지 (<1％)에 관련된 서열을 검출하지 않았다. 제2 대조군에서, 본 발명자들은 뉴클레아제-무함유 물로부터 시퀀싱용 샘플을 제조하였다. 샘플은 이 연구에 관련되지 않은 샘플과 함께 시퀀싱 구동에 포함되고, 2가지 박테리아 종의 게놈에 대해 맵핑된 단지 제한된 수의 서열, 총 15개만을 채용하였다. 다시, 하기 논의된 감염제에 대한 증거는 발견되지 않았다.
본 발명자들은 종의 상대적 풍부도의 최대 가능성 추정을 수행하기 위해 BLAST로 얻어진 서열-유사성 데이터를 이용하는 도구인 그래미 (Grammy)를 사용하여 분류학적 분류의 상이한 수준에서 혈장 중의 마이크로바이옴 조성을 연구하였다. GRAMMy는 표적 게놈 크기의 차이 및 리드 할당의 모호성을 해명한다. 이 접근법은 단지 게놈 데이터가 참조 데이터베이스에서 이용가능한 종의 풍부도를 추정하는 것을 허용함을 주목한다. 도 1F는 분류학적 분류의 상이한 수준에서의 종의 상대적 풍부도 (모든 샘플에 걸친 평균)를 나타낸다. 본 발명자들은 바이러스 (73％)가 박테리아 (25％) 및 진균 (2％)보다 더 풍부하게 나타남을 발견하였다 (도 1F 패널 a). 바이러스 중에서, 본 발명자들은 ssDNA 바이러스가 dsDNA 바이러스 (28％)보다 더 큰 분율 (72％)을 차지함을 발견하였다. 7개의 별개의 바이러스 과가 발견되었으며 (풍부도 > 0.75％), 하나의 우세한 과는 총 집단의 68％를 설명한 아넬로비리다에이다 (도 1F, 패널 b). 아넬로비리다에 분율은 대부분 (97％) 알파토르크바이러스 속으로부터의 바이러스로 이루어진다 (도 1F, 패널 c). 알파토르크 속은 토르크 테노 바이러스 (TTV)의 속이며, 14개의 상이한 토르크 테노 바이러스유형에 관련된 서열이 확인되었다 (도 1, 패널 d). 폴리오마바이러스로의 감염은 인간 집단에서 만연되어 있으며, 폴리오마바이러스 DNA혈증은 고형 기관 이식 후 첫번째 해에는 흔하지 않다. 폴리오마바이러스-유래된 서열은 존재하는 코호트 중 36명의 환자에 상응하는 75개의 샘플 (11％)에서 발견되었다. BK (41％), JC (27％), TS (4％), WU 폴리오마바이러스 (6％), SV40 (6％) 및 최근에 발견된 HPyV6 (13％) (Schowalter et al., 2010)의 존재에 대한 증거가 발견되었다 (도 1F, 패널 e). 박테리아 중에서, 프로테오박테리아 (36％), 후벽균류 (50％), 방선균류 (10％), 의간균류 (4％)는 샘플에서 가장 풍부하게 나타나는 문이다 (도 1F, 패널 f).
본 연구에 이용가능한 상대적으로 짧은 리드 (50 bp)의 잠재적인 부정확한 할당을 조사하기 위해, 본 발명자들은 샘플 (n=55)의 하위세트에 대해 수집된 보다 긴 쌍형성된-말단 리드 (2x100 bp)에 기초하여 리드 길이에 대한 풍부도 추정치의 의존성을 검사하였다. 본 발명자들은 50 bp 서브리드 및 100 bp 리드에 기초한 풍부도 추정치가 본원에서 보고된 분류학적 분류의 모든 수준에 대해 유사함을 발견하였다 (도 6F).
약물 투여량에 대한 바이롬 조성의 민감도. 약물 투여량에 대한 이용가능한 임상적 데이터를 사용하여 약물-마이크로바이옴 상호작용을 분석하였다. 여기서, 본 발명자들은 타크롤리무스-기재 항-거부 프로토콜로 치료된 성인 심장 및 폐 이식 환자 (47명의 환자 및 380개의 관찰)에 대한 데이터를 검사함으로써, 시클로스포린으로 치료된 소아 환자 및 약물-불내성 문제로 인해 타크롤리무스에서 시클로스포린 면역억제로 전환된 환자를 배제하였다. 처방 항바이러스 약물 용량 (발간시클로버) 및 혈액 중의 타크롤리무스의 측정된 수준에 대한 데이터를 개별 환자 기록으로부터 수집하고, 상이한 약물 수준에 상응하는 샘플에 대한 평균 조성을 추출하였다. 용량 변화에 대한 마이크로바이옴 조성의 지연 효과를 해명하기 위해, 약물 수준 및 용량 데이터를 필터링된 윈도우 평균으로 슬라이딩하였다 (도 1C 및 도 7A 내지 C; 윈도우 크기 45일).
본 발명자들은 마이크로바이옴의 바이러스 성분의 구조가 약물 투여량의 민감한 함수임을 발견하였다 (47명의 환자, 380개의 샘플, 도 2A). 그러나, 마이크로바이옴의 박테리아 성분의 구조는 하기에서 더 논의되는 바와 같이 약물 요법에 의해 유의하게 변경되지 않았다 (도 7D). 환자가 발간시클로버 및 타크롤리무스의 저 용량을 받은 경우, 헤르페스비랄레스 및 카우도비랄레스가 바이롬에 우세하였다. 대조적으로, 면역억제제 및 항바이러스제의 고 용량은 아넬로비리다에가 우세한 바이롬 구조를 유발하였다 (고 약물 수준에서 94％까지의 점유). 항바이러스 예방은 CMV 질환을 예방하기 위해 의도되지만, 다른 헤르페스바이러스도 또한 약물에 대해 감수성이어서, 발간시클로버의 보다 높은 용량이 헤르페스비랄레스 목으로부터의 바이러스의 보다 낮은 분율을 유발하는 것은 놀랍지 않다. 아넬로비리다에가 숙주 면역계의 억제를 이용한다는 관찰은 문헌으로부터의 다양한 관찰과 일치하며: 이전에, 아넬로비리다에의 발생이 HIV 환자에서의 AIDS를 향한 진행과 함께 증가하고, 아넬로바이러스 TTV의 총 적재량이 간 이식 후 증가함이 나타났다. 또한, 열이 있는 소아 환자에서의 아넬로비리다에의 증가된 보유도가 최근 보고되었다.
본 발명자들은 다음으로 면역억제제 또는 항바이러스제에 대해서가 아닌, 기관 이식 수용자에 대해 측정된 바이롬 조성을 건강한 개체에서 관찰되는 조성에 대해 비교하였다 (n = 9, 이전의 연구로부터 이용가능한 시퀀싱 데이터). 여기서, 본 발명자들은 건강한 조성을 최소 약물 노출에 상응하는 약물 요법의 시작에서 기관 이식 수용자에 대해 측정된 조성 (수술후 제1일, n = 13)에 대해, 및 고 약물 수준에 노출된 이식 수용자에 대해 측정된 조성 (이식 절차 훨씬 후, 타크롤리무스 ≥ 9 ng/ml, 발간시클로버 ≥ 600 mg, n = 68)에 대해 비교하였다. 본 발명자들은 건강한 참조 샘플 및 최소 약물 노출에 상응하는 샘플에 대한 바이롬의 유사한 조성을 발견하였다 (도 2B). 그러나, 건강한 참조 및 최소 약물 노출 샘플의 조성은 고 약물 노출 샘플에 대해 측정된 아넬로비리다에-우세한 조성과는 구별된다.
타크롤리무스-기재 면역억제 요법은 이식후 첫번째 3일에 유도 요법으로 보충되며 (항-흉선세포 글로불린, 다클리주맙 또는 바실릭시맙을 사용), 환자는 또한 이식후 요법 전반에 걸쳐 코르티코스테로이드 드레드니손을 받는다. 드레드니손 및 타크롤리무스에 대한 시간-투여량 프로파일은 유사하다: 요법의 개시 시에 고 용량 후 점차적인 용량 감소 (도 7A 내지 C). 따라서, 도 2A에서의 데이터는 프레드니손 및 타크롤리무스의 조합된 효과를 반영한다. 바이롬 조성에 대한 프레드니손 및 발간시클로버의 차등적 효과의 분석 (도 7E)은 도 2A에서 관찰된 동일한 경향을 나타낸다: 보다 높은 프레드니손 용량은 아넬로바이러스의 보다 많은 출현을 초래한다. 마지막으로, 본 발명자들은 환자의 하위세트가 항바이러스 약물로 치료되지 않았음을 주목하였다. 이 환자의 하위세트에 상응하는 데이터는 본 발명자들이 하기 기재된 바와 같은 바이롬의 조성에 대한 항바이러스 약물 및 면역억제제의 차등적 효과를 추가로 구분하는 것을 허용하였다.
마이크로바이옴 다양성의 분할. 본 발명자들은 마이크로바이옴의 박테리아 및 바이러스 성분의 다양성을 연구하였다. 대상체-내 다양성은 박테리아 및 바이러스 둘 다에 대해 대상체-간 다양성보다 낮았다 (브레이-커티스 베타 다양성, 문 수준에서의 박테리아 조성, 과 및 목 수준 바이러스, 도 2C). 이식 유형, 심장 또는 폐, 또는 연령에 따른 환자에 대한 데이터의 분할은 다양성을 감소시키지 않았다. 대상체 내에서, 다양성은 다시 박테리아 및 바이러스 둘 다에 대해 1개월 기간 내에 수집된 샘플에 대해 보다 낮았다. 박테리아에 대해서는 아니지만 바이러스에 대해, 본 발명자들은 다양성은 유사한 약물 투여량에서 수집된 샘플을 비교할 경우 보다 낮음을 발견하였다 (타크롤리무스 수준 ± 0.5 ng/ml, 발간시클로버 ± 50 mg). 따라서, 도 2A에서의 약물 투여량에 대한 집단 평균의 민감도와 함께 취하여, 본 발명자들은 동일한 약물 요법으로 처치된 환자에 대한 바이롬의 조성이 유사한 상태에 수렴함을 발견하였다.
약물 용량 변화에 대한 바이롬의 동역학 반응. 약물 투여량의 변화에 대한 바이롬의 강한 시간적 반응이 관찰되며, 약물 투여량에 대한 바이롬 조성의 민감도와 일치한다. 도 3A는 ssDNA 및 dsDNA 바이러스의 상대적 게놈 풍부도의 시간 의존성을 나타낸다 (모든 환자 군 및 샘플로부터의 데이터, n = 656). ssDNA 바이러스의 분율은 이식후 첫번째 개월 동안 급속하게 확장된 후, 6개월 후에는 반대 경향이 나타난다. 도 3B는 과 및 목 수준에서 그룹핑된 가장 풍부한 바이러스의 시간-의존적 상대적 조성을 나타내며, 바이롬 조성 동역학에 대한 보다 상세사항을 제공한다 (모든 환자 군 및 샘플로부터의 데이터, n = 656). dsDNA 분율은 카우도비랄레스, 아데노비리다에, 폴리오마비리다에 및 헤르페스비랄레스로 이루어지며, 함께 이식후 첫번째 주(들)에 바이롬의 95％를 점유한다. ssDNA 바이러스는 단지 초기 바이롬의 5％를 점유하며, 주로 아넬로비리다에 과의 구성원으로 이루어진다. 아데노비리다에, 카우도비랄레스 및 헤르페스비랄레스에 의해 점유된 분율은 이들 바이러스유형이 항바이러스 예방에 의해 효과적으로 표적화되기 때문에 첫번째 몇 개월에 강하게 감소한다. 대조적으로, 아넬로비리다에의 상대적 풍부도는 이들 바이러스유형이 항바이러스 약물에 의한 표적화를 크게 벗어나며, 환자의 감소된 면역적격을 이용하기 때문에 급속하게 증가한다 (4.5 내지 6개월 동안 최대 84％). 기관 이식 절차 후 6개월에, 반대 경향이 관찰되며, 치료 프로토콜에 의해 처방된 항바이러스제 및 면역억제 약물에서의 감소와 일치한다.
바이러스 성분에 비해, 마이크로바이옴의 박테리아 성분은 시간 경과에 따라 상대적으로 안정하게 남아 있으며, 문, 목 및 속 분류학적 수준에서 이루어진 관찰이다 (도 3C, n = 656, 및 도 S3). 도 3D는 박테리아 및 바이러스 속에 대한 샘플-내 알파 다양성을 시간의 함수로서 나타낸다 (샤논 엔트로피, 1개월 기간, 590개의 박테리아 속, 168개의 바이러스 속이 검사됨). 관찰된 바이러스 속의 다양성은 요법의 개시 시에 감소하는 반면 (제1월에 1.05 ± 0.5 내지 제4월 내지 제5월에 0.31 ± 0.33, p << 10-6, 만-휘트니 U 검정), 박테리아의 알파 다양성은 이식후 요법의 과정 동안 상대적으로 변화하지 않고 남아 있다 (제1월에 2.2 ± 1.14 내지 제4월 내지 제5월에 2.6 ± 0.85, p = 0.1, 만-휘트니 U 검정).
이식후 요법의 개시 시의 총 바이러스 적하량의 증가. 총 바이러스 적하량에 대한 치료 약물의 효과의 통찰을 얻기 위해, 본 발명자들은 바이러스 표적의 게놈 커버리지를 인간 게놈의 커버리지에 대해 정규화함으로써 인간 게놈 카피의 수에 상대적인 모든 바이러스의 절대적 게놈 풍부도를 추출하였다. 본 연구의 모든 환자 군 부분에 대해, 이식 유형 (심장 또는 폐) 또는 연령 (성인 또는 소아)에 무관하게 총 바이러스 적하량의 증가가 요법의 개시 시에 관찰된다 (도 4A) (적하량의 변화, 7.4 ± 3, S자형 피트, 흑색 선). 상대적 풍부도 데이터와 조합되어, 총 바이러스 적하량 데이터는 항바이러스제 및 면역억제제로 동시에 치료된 환자에 대한 이식후 첫번째 3개월에 헤르페스비랄레스 적하량의 순 감소 및 아넬로비리다에 적하량의 순 증가를 밝혀내었다.
따라서, 데이터는 상이한 바이러스유형에 대한 항바이러스제 및 면역억제제의 조합의 차등적 효과를 나타낸다. 데이터는 또한 총 아데노비리다에 적하량의 감소를 나타내며, 이는 아데노비리다에 복제가 발간시클로버에 의해 억제됨을 지시하고, 이는 이전의 연구와 일치한다. 도 4B는 모든 이식 유형에 대한 데이터를 요약하지만, 상이한 이식 유형에 따라 계층화할 경우 동일한 경향이 관찰된다: 성인 심장 이식 수용자 (n = 268, 도 9A), 성인 폐 이식 수용자 (n = 166, 도 8B), 및 타크롤리무스에 반대되는 시클로스포린으로 치료된 소아 환자 (n = 99, 도 9C).
연구 코호트에서의 모든 환자가 항바이러스제 및 면역억제 약물 둘 다를 받지는 않았다: 공여자 및 수용자 둘 다가 CMV 항체 어세이에서 이전의 CMV 감염의 증거를 나타내지 않는 이식 케이스에 대해, 항바이러스 예방으로 인한 합병증의 위험은 새롭게 획득된 CMV 감염의 잠재적인 위험보다 더 큰 것으로 판단되며, 따라서 환자는 항바이러스 예방으로 치료되지 않는다. 따라서, 이들 환자는 단지 면역억제제로 치료된다. 도 9C는 CMV 음성 케이스의 시간 의존적 바이러스 적하량 및 조성을 나타낸다 (n = 75). 면역억제제-유일 요법의 순 효과는 헤르페스비랄레스 및 아데노비리다에를 비롯한 모든 바이러스유형의 확장이다. 면역억제제의 테이퍼링은 총 바이러스 적하량의 감소를 초래한다.
이식편 거부 에피소드를 앓고 있는 환자에서의 보다 낮은 아넬로바이러스 적재량. 아넬로바이러스 적재량과 면역억제의 정도와의 상관관계를 감안하여 (도 2A 및 도 4 참조), 그리고 면역적격 및 거부의 위험 사이의 연관성을 감안하여, 본 발명자들은 아넬로바이러스 적재량이 거부 및 비-거부 이식편 수용자의 분류에 사용될 수 있는지 여부를 질문하였다. 도 5A는 거부 및 비-거부 환자에 대해 측정된 아넬로바이러스 적하량을 이식후 시간의 함수로서 나타낸다. 여기서, 환자는 이들이 적어도 하나의 생검-측정된 중간 또는 심각한 거부 에피소드, 생검 등급 ≥ 2R/3A를 앓고 있는 경우 거부로 분류된다 (적색: 20명의 환자, 177개의 데이터 점). 거부가 없는 환자는 그의 이식후 과정 전반에 걸쳐 중간 또는 심각한 이식편 손상을 앓고 있는 것으로 진단되지 않은 환자에 상응한다 (청색: 생검 등급 < 2R/3A, 40명의 환자, 285개의 데이터 점).
도 5A는 아넬로바이러스 적재량이 거의 모든 시점에서 거부 개체에 대해 유의하게 보다 낮음을 나타낸다. 본 발명자들은 다음으로 거부에서의 환자에 대한 아넬로바이러스 적재량을 거부의 부재 하에서 환자에 대해 측정된 적재량과 직접적으로 비교하였다. 상기 기재된 아넬로바이러스 적하량의 시간 의존성을 해명하기 위해 (도 5A), 본 발명자들은 동일한 시점에서 모든 샘플에 대해 측정된 평균 적하량에 상대적인 아넬로바이러스 적재량을 추출하였다. 도 5B는 온건한 거부 사건을 앓고 있는 환자 (생검 등급 1R, N = 102) 및 심각한 거부 에피소드를 앓고 있는 환자 (생검 등급 ≥ 2R/3A, N = 22)에 대해 측정된 적하량에 비교한 비-거부 환자 (N = 208)에 대한 시간-정규화된 적하량을 나타낸다. 도면은 시간-정규화된 적하량이 거부의 보다 큰 위험의 환자에 대해 유의하게 보다 낮음을 나타낸다. P-값은 측정 시점의 보다 큰 양을 갖는 집단의 랜덤 샘플링에 의해 계산하였다, p = 합계(중앙값(Arej) ＞ 중앙값(Anon-rej))/N, 여기서, N = 104이고, Arej 및 Anon-rej는 각각 거부 및 비-거부의 보다 큰 및 보다 적은 위험의 집단에 대한 상대적 바이러스 적하량이다 (p = 0.011, p = 0.0002 및 p = 0.036).
이들 관찰은 거부의 위험 및 감염의 발생이 환자의 면역적격과 반대 연관성을 갖는다는 관점과 일직선상에 있다 (삽도 도 5A 참조). 따라서, 거부 환자에 대해 관찰된 보다 낮은 바이러스 적하량은 이들 환자가 동일한 면역억제 프로토콜로 치료됨에도 불구하고, 이 환자의 하위군에서의 보다 높은 수준의 면역적격을 나타낸다. 면역 기능의 억제에 대한 민감도에서의 환자-대-환자 가변성이 발생하는 것으로 공지되어 있으며, 면역억제의 예측성의 결핍은 이식에서 중요한 위험 인자이다. 면역적격의 측정을 위해 현재 사용되는 상업적 어세이는 급성 거부 또는 유의한 감염의 예측제인 것으로 밝혀지지 않았다. 따라서, 기존의 어세이를 대체하거나 보충할 수 있는 면역적격의 직접적 측정을 위한 방법의 개발이 중요할 것이다. 기관 이식 수용자에서 기록된 총 아넬로바이러스 적하량은 대안적인 마커로서 기능할 수 있다. 도 5C는 수용자-작용 특징을 나타내며, 비-거부 및 거부 환자를 분류하는 데 있어서 상대적 아넬로바이러스 적하량의 성능을 시험한다 (곡선하 면적 = 0.72).
본 발명자들은 수용자의 혈장 중의 무세포 DNA를 시퀀싱함으로써 고형 기관 이식 후 약물-마이크로바이옴 상호작용을 연구하였다. 데이터는 혈장 중의 인간 바이롬의 기본적인 구조 및 이것이 어떻게 약물학적 섭동에 반응하는지에 대한 많은 것을 밝히며; 이는 또한 마이크로바이옴의 박테리아 성분의 조성의 면역억제에 대한 상대적 비민감도를 나타낸다. 이들 데이터는 이식후 치료 프로토콜의 설계 및 최적화에 유용하다. 예를 들어, 이는 초기 고 용량으로부터의 항바이러스 예방의 점감이 헤르페스비랄레스 분획의 부활을 초래함을 나타낸다. CMV DNA 적하량은 이전에 CMV 질환 재발 및 거부를 예측하는 것으로 나타났으며, 이는 환자가 보다 장기 예방 요법으로부터 이익을 받는지 여부의 질문을 제기한다.
면역억제 시 아넬로비리다에의 풍부도의 현저한 확장은 또한 추가로 고려할 가치가 있다. 아넬로바이러스는 인간 집단에 편재하며, 병원성은 확립되지 않았지만, 아넬로바이러스는 현재 암발생의 잠재적인 공동인자로서 조사 하에 있다. 면역억제에 대한 아넬로비리다에의 민감성은 특히 이식 수용자에서 보여지는 암의 증가된 발생의 관점에서, 기관 이식을 아넬로비리다에의 특성의 연구를 위한 이상적인 설정이 되게 한다. 거부 에피소드를 앓고 있는 환자에서의 아넬로바이러스의 평균보다 낮은 적재량의 관찰은 이들 환자가 프로토콜에 따라 처방되는 면역억제제 수준으로 처치되었음에도 불구하고, 이 환자의 하위군에서의 불충분한 면역억제를 나타낸다. 이는 순환 약물 수준의 측정 외에 환자의 면역적격의 수준을 직접적으로 측정하는 것을 허용하는 어세이를 설계하는 데 있어서 가치가 있을 것임을 암시한다. 이식 수용자의 혈액에서 확인된 아넬로바이러스의 총 적재량은 개별 환자의 면역억제의 전체적인 상태의 하나의 이러한 마커로서 기능할 수 있다.
고 처리량 DNA 시퀀싱은 감염의 가설-자유 진단에서 용도가 발견된다. 이 접근법은 감염이 이식에서 빈번하게 발생하며 면역억제된 개체에서 진단하기 곤란하다는 사실을 감안하고, 서열 분석이 또한 혈장 중에 순환하는 공여자-유래된 인간 DNA의 정량화를 통한 이식편 건강에 대한 정보를 제공할 수 있음을 감안하면, 이식에 관련하여 특히 적절하다. 감염성 질환의 다른 영역에서, 인간 DNA를 제거하고 바이러스 및 미생물 기원의 DNA에 대해 풍부화하는 제감 방법을 개발하는 것은 가치있을 수 있다.
실험 절차
임상 샘플 수집: 환자를 스탠포드 대학 병원 (Stanford University Hospital) (SUH) 또는 루실 패커드 어린이 병원 (Lucile Packard Children's Hospital) (LPCH)에 등록하고, 이들이 다중-기관 이식의 수용자인 경우를 배제하였다. 이 연구는 스탠포드 대학 기관 검토국에 의해 승인되고 (프로토콜 # 17666), 2010년 3월에 등록 시작되었다. 환자 모집 및 환자의 이식후 치료에 대한 상세사항에 대해서는, 확장된 실험 절차 섹션을 참조한다.
혈장 가공 및 DNA 추출: 혈장을 이전에 기재된 바와 같이 (Fan et al., 2008) 샘플 수집의 3시간 내에 전체 혈액 샘플로부터 추출하고, -80℃에서 저장하였다. 분석을 위해 요구될 경우, 혈장 샘플을 해동하고, 순환 DNA를 퀴아앰프 순환 핵산 키트 (QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit) (퀴아젠 (Qiagen))를 사용하여 0.5 내지 1 ml 혈장으로부터 즉시 추출하였다.
시퀀싱 라이브러리 제조 및 시퀀싱: 시퀀싱 라이브러리를 표준 일루미나 인덱스 어댑터를 갖는 일루미나를 위한 네브넥스트 DNA 라이브러리 프렙 마스터 믹스 세트 (NEBNext DNA Library Prep Master Mix Set for Illumina) (IDT로부터 구입함)를 사용하여, 또는 미세유체역학-기재 자동화 라이브러리 제조 플랫폼 (몬드리안 (Mondrian) ST, 오베이션 SP 울트라로우 (Ovation SP Ultralow) 라이브러리 시스템)을 사용하여 정제된 환자 혈장 DNA로부터 제조하였다. 라이브러리를 아질런트 2100 바이오어낼라이저 (Agilent 2100 Bioanalyzer) (고 민감도 DNA 키트)를 사용하여 특성화하고, qPCR에 의해 정량화하였다. 샘플은 26개의 상이한 시퀀싱 구동의 일부였으며, 22개월의 과정에 걸쳐 시퀀싱하였다. 레인 당 평균 6개의 샘플이 시퀀싱되었다.
이식후 모니터링 및 임상 샘플 수집. 이 분석은 흉부 기관 이식 후의 급성 및 만성 거부 및 동종이식편 기능이상의 진단을 위한 공여자-유래된 무세포 DNA 어세이의 임상적 유용성을 연구하기 위해 국립 보건원에 의해 투자된 유망한 코호트 연구의 하위연구를 나타낸다(RC4 AI092673). 환자를 이들이 스탠포드 대학 병원 (SUH) 또는 루실 패커드 어린이 병원 (LPCH)에서 심장 또는 폐 이식을 받은 경우 등록하고, 이들이 다중기관 이식의 수용자인 경우 또는 이들이 SUH 또는 LPCH 이식후 이외의 센터에서 후속조치된 경우 배제하였다. 이 연구는 스탠포드 대학 기관 검토국에 의해 승인되었으며 (프로토콜 # 17666), 2010년 3월에 등록 시작되었다.
이식후 치료 프로토콜, 성인 심장 이식 수용자의 상세사항. 이식후 면역억제는 수술후에 즉시 투여된 메틸프레드니솔론 500 mg, 그 후 3가지 용량에 대해 8시간마다 125 mg으로 이루어졌다. 항흉선세포 글로불린 (rATG) 1 mg/kg을 수술후 제1일, 제2일 및 제3일에 투여하였다. 유지 면역억제는 수술후 제1일에 시작된 매일 2회의 프레드니손 20 mg으로 이루어졌으며, 수술후 6개월까지 < 0.1 mg/kg/일로 점감되고, 심내막심근 생검이 세포 거부의 증거를 나타내지 않은 경우 추가로 점감되었다. 타크롤리무스를 수술후 제1일에 시작하고, 용량을 제0월 내지 제6월 동안 10 내지 15 ng/ml, 제6월 내지 제12월 동안 7 내지 10 ng/ml, 및 그 후 5 내지 10 ng/ml의 수준을 유지하도록 추가로 조정하였다. 미코페놀레이트 모페틸을 수술후 제1일에 매일 2회 1,000 mg에서 시작하고, 필요할 경우 백혈구감소증에 반응하여 용량 조정을 하였다.
모든 환자는 공여자 및 수용자 둘 다가 CMV 음성이 아니라면, 수술후 제1일에 시작하여 12시간마다 신장 기능에 대해 조정된 간시클로버 5 mg/kg IV로 이루어진 표준 CMV (항바이러스) 예방을 받았다. 경구 의약을 견딜 수 있을 경우, 수용자는 2주 동안 매일 2회 발간시클로버 900 mg으로 시작한 후, 이식후 6개월까지 매일 900 mg, 그 후 이식후 12개월까지 매일 450 mg을 받았으며, 이 시점에서 항바이러스 예방을 중단하였다. 발간시클로버 용량 감소는 백혈구감소증의 설정에서 이루어졌다. CMV+ 동종이식편의 CMV- 수용자는 또한 이식의 72시간 내에 150 mg/kg IV, 이식후 제2주, 제4주, 제6주 및 제8주에 100 mg/kg, 및 이식후 제12주 및 제16주에 50 mg/kg의 CMV 과면역 글로불린을 받았다.
CMV- 동종이식편의 CMV- 수용자는 2012년 5월까지 항바이러스 예방으로 치료되지 않았으며; 이어서, 이들 수용자는 1년 동안 매일 2회 아시클로버 400 mg으로 치료되었다. 항진균 예방은 이식후 첫번째 3개월 동안 매일 이트라코나졸 300 mg으로 이루어졌으며, 인간폐포자충 감염에 대한 예방은 매일 트리메토프림/술파메톡사졸, 80 mg TMP 성분으로 이루어졌다. 폐포자충 감염에 대한 예방은 무기한으로 계속되었으며, TMP-SMX에 불내성인 환자는 아토바쿠온, 답손 또는 흡입된 펜타미딘으로 치료되었다.
모든 심장 이식 수용자를 이식 후 스케줄화된 간격으로: 첫번째 개월 동안 매주, 3번째 개월까지 격주로, 6번째 개월까지 매월, 그 후 제9월, 제12월, 제16월, 제20월 및 제24월에 수행된 감시 심내막심근 생검에 의해 급성 세포 거부에 대해 모니터링하였다. 생검은 ISHLT 2004 개정된 등급화 스케일 (0, 1R, 2R, 3R) (29)에 따라 등급화되었다. 혈액 샘플을 이식후 하기 시점에서 심장 이식 수용자로부터 수집하였다: 제2주, 제4주 및 제6주; 제2월, 제2.5월, 제3월, 제4월, 제5월, 제6월, 제8월, 제10월, 제12월, 제16월, 제20월 및 제24월. 심장 이식 수용자의 하위세트는 또한 이식후 제1일에 수집된 혈액 샘플을 가졌다. 혈액 샘플링 및 심내막심근 생검이 동일한 날에 수행되었을 경우, 혈액이 생검 절차 전에 수집되는 것을 보장하기 위한 주의가 기울여졌다.
소아 심장 이식 수용자. 유도 면역억제는 초기에 총 5개의 용량에 대해 2주마다 다클리주맙 1 mg/kg IV로 이루어졌으며, 2011년 8월에 시작하여 수술후 제0일 및 제4일에 바실릭시맙 10 내지 20 mg IV로 전환되었다. 수용자는 또한 즉시 3개 용량에 대해 8시간마다 펄스 메틸프레드니솔론 10 mg/kg IV로, 그 후 이식후 첫번째 14일 동안 매일 2회 프레드니손 0.5 mg/kg으로 치료되었으며; 코르티코스테로이드는 이어서 이식후 첫번째 해 동안 급성 거부의 부재 하에서 점감되었다.
칼시뉴린 억제는 주로 제0월 내지 제3월에 대해 300 내지 350 ng/ml, 제4월 내지 제6월에 대해 275 내지 325 ng/ml, 제7월 내지 제12월에 대해 250 내지 300 ng/ml, 및 이식후 12개월 후 200 내지 250의 목표 수준을 갖는 시클로스포린으로 이루어졌다. 시클로스포린에 불내성인 환자는 타크롤리무스로 치료되었다. 기회 감염에 대한 예방 및 감시 심막내심근 생검에 대한 프로토콜은 성인 심장 이식 수용자와 유사하였다.
폐 이식 수용자. 이식후 면역억제는 수술후 즉시 투여된 메틸프레드니솔론 500 내지 1000 mg, 그 후 매일 2회 0.5 mg/kg IV로 이루어졌다. 제0일 및 제4일에 바실릭시맙 20 mg IV는 유도 면역억제를 위해 주어졌다. 유지 면역억제는 수술후 제0일 및 제3일에 매일 2회 메틸프레드니솔론 0.5 mg/kg IV, 그 후 제30일까지 매일 프레드니손 0.5 mg/kg으로 이루어졌으며, 이어서 2 내지 3개월마다 이식후 제6월 내지 제12월 동안 매일 0.1 mg/kg으로 점감되었다. 타크롤리무스는 수술후 제0일에 시작되었으며, 용량은 제0월 내지 제6월 동안 12 내지 15 ng/ml, 제6월 내지 제12월 동안 10 내지 15 ng/ml, 그 후 5 내지 10 ng/ml의 수준을 유지하도록 조정되었다. 미코페놀레이트모페틸은 수술후 제0일에 매일 2회 500 mg으로 시작하고, 필요할 경우 백혈구혈증에 반응하여 용량 조정이 이루어졌다. 항바이러스, 항진균 및 PCP 예방은 성인 심장 이식 코호트와 유사하였다.
모든 폐 이식 수용자를 이식후 제1.5월, 제3월, 제6월, 제12월, 제18월 및 제24월에 수행된 프로토콜 기관지 생검에 의해 급성 세포 거부에 대해 모니터링하였다. 생검은 또한 임상 반응에 대해 지시될 경우 증상 또는 폐 기능 시험 결과에 기초하여 수행되었다. 혈액 샘플을 하기 간격으로 연구 목적을 위해 폐 이식 수용자로부터 수집하였다: 이식후 제1일에 3회, 제2일에 2회, 및 제3일에 1회, 그 후 제1주 및 제2주, 및 제1.5월, 제2월, 제3월, 제4.5월, 제6월, 제9월, 제12월, 제18월 및 제24월. 혈액 샘플을 프로토콜에 따른 및 임상적으로-지시된 생검의 수행 전에 뽑았다.
병원체-유래된 서열의 확인을 위한 워크플로우. 정확한 사본을 C-기재 유틸리티 fastq.cpp.를 사용하여 제거하였다. 저-품질 리드를 fastx 패키지 (fastq_quality_filter -Q33 -q21 -p50)의 일부인 품질 필터를 사용하여 제거하였다. 남아 있는 리드를 이어서 BWA를 사용하여 인간 참조 게놈 빌드 hg19 (bwaaln - q25)를 사용하여 정렬하였다. 비맵핑된 리드를 샘툴스 (samtools view -f4)를 사용하여 수집하고, 저-복잡성 리드를 세크클린 (seqclean -l 40 -c 1)을 사용하여 제거하였다. 리드를 이어서 바이러스, 박테리아 및 진균 참조 게놈의 선택에 대해 정렬하고, 모든 참조물을 ncbi_fungi에서 다운로드하였다.
도 6A는 게놈 크기의 분포를 나타낸다. 하기 파라미터를 BLAST 정렬을 위해 사용하였다: 리워드 = 1, 페널티 = _3, 워드_사이즈 = 12, 갭오픈 = 5, 갭익스텐드 = 2, e-값 = 10_4, perc_동일성 = 90, 쿨링_한계 = 2. 45보다 짧은 정렬 길이를 갖는 블라스트 히트를 제거하였다. 샘플의 하위세트에 대해 보다 긴 리드가 이용가능하였다 (2 3 100 bp, n = 55). 게놈 풍부도 추정치의 확고함을 시험하기 위해, 조성 측정의 길이 의존성을 검사하였다. 여기서, 리드를 40, 50, 65, 80 및 100 bp 길이로 트리밍하고 (fastx_트리머), 상기 기재된 워크플로우를 사용하여 분석하였다. 여기서, 37, 45, 59, 72 및 80 bp보다 짧은 정렬 길이를 갖는 블라스트 히트를 각각 40, 50, 65, 80 및 100 bp 리드에 대해 제거하였다. 게놈 풍부도 추정. 상대적 게놈 풍부도 추정을 GRAMMy로 계산하였다. 이 도구는 샘플 중의 종의 상대적 풍부도의 최대 가능성 추정을 수행하기 위해 BLAST-유래된 핵산 서열-유사성 데이터를 이용한다. GRAMMy 필터는 BLAST 정렬 계량치에 의해 히트하고 (E-점수, 정렬 길이 및 동일성 비율), 후보 참조 게놈의 상대적 풍부도를 평가하는 데 있어서 표적 게놈 크기 및 리드 할당의 모호성을 해명한다. Grammy는 하기 파라미터를 사용하여 지칭되었다: python grammy_rdt.py; python grammy_pre.py -q "40,40,1" input set; python grammy_em.py -b 5 -t 0.0001 -n 100 input.mtx; grammy_post.py input.est setinput.btp.
통상적인 스크립트를 사용하여 균주-수준 풍부도 추정치를 합하여 보다 높은 분류학적-수준 풍부도로 풍부도를 얻었다. 여기서, 참조 데이터베이스에 대한 최소 분류학은 택스타스틱 (Taxtastic)을 사용하여 수립하였다.
절대적 바이러스 적하량 정량화. 샘플 중의 감염제의 적하량을 정량화하기 위해, 블라스트 히트 결과를 수집하고, 가장 양호한 히트를 통상적인 스크립트 (바이오펄 (Bioperl))를 사용하여 각각의 리드에 대해 선택하였다. 도 6B는 시퀀싱된 100만개 고유 분자 당 고유 바이러스, 박테리아 및 진균 블라스트 히트의 수의 분포를 나타낸다. 도 6C는 샘플에 존재하는 인간 게놈 카피의 수에 상대적인 바이러스, 박테리아 및 진균 게놈 카피의 수를 나타낸다. 감염제의 게놈의 커버리지를 인간 게놈 커버리지에 대해 정규화하였다.
선택된 바이러스 표적에 대한 시퀀싱 결과의 qPCR 확인. 인간 헤르페스 바이러스 4, 5 및 6 및 파르보바이러스의 정량화를 위한 표준 qPCR 키트 (프라이머디자인 (PrimerDesign), 제네시그 (genesig))를 사용하여 무세포 DNA 샘플의 하위세트에 대한 시퀀싱 결과를 확인하였다. qPCR 어세이를 혈장 약 1 ml로부터 추출되고, 100 ml 트리스 (Tris) 완충액 (50 mM [pH 8.1 내지 8.2])에서 용리된 cfDNA에 대해 구동하였다. 혈장 추출 및 PCR 실험을 상이한 설비에서 수행하였다. 주형 없는 대조군을 구동하여 PCR 시약이 모든 실험에 포함되었는지를 확인하였다. 도 6D는 획득된 100만개 리드 당 블라스트 히트의 상대적 수를 qPCR을 사용하여 측정된 바와 같은 바이러스 게놈의 농도에 대해 비교한다.
주형 없는 대조군. 주형 없는 대조군 실험을 수행하였다. 시퀀싱 라이브러리를 뉴클레아제-무함유 물 (S01001, 뉴젠 (Nugen))로부터 생성하였다. 라이브러리를 7개의 추가의 샘플 라이브러리 (무세포 인간 DNA)와 함께 제조하여 라이브러리 제조 동안 가능한 샘플-대-샘플 혼선에 대해 시험하였다. 일루미나 유동 세포에 대한 충분한 밀도를 갖는 클러스트의 형성을 보장하기 위해, 샘플을 연구에 비관련된 샘플과 함께 시퀀싱하였다. 연구에 비관련된 샘플은 1600만 리드를 채용한 반면, 주형 없는 대조군 라이브러리는 참조 데이터베이스 중 2개의 종, 즉 메타노칼코도쿠스 자나스키이 (methanocalcodoccus janaschii) (9 히트) 및 바실루스 수브틸리스 (Bacillus subtillis) (5 히트) 게놈에 맵핑된 단지 15개의 리드를 생성하였다. 인간 관련된 서열에 대한 증거는 발견되지 않았으며, 이는 샘플-대-샘플 오염이 낮았음을 지시한다.
실시예 2
마이크로바이옴의 임상적 모니터링
실시예 1에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여, CMV 게놈에 맵핑하는 1개의 리드를 각각의 샘플에 대해 정량화하였다. 증가된 CMV 풍부도가 감염에 대해 임상적으로 양성인 샘플에서 관찰되었으며 (p=7.10-9, 만-휘트니 U 검정, 도 10C); 본 발명자들의 샘플 중 CMV-유래된 DNA의 수준은 0.91의 AUC를 갖는 CMV의 임상적 보고에 매칭되었다 (도 10C). 이 데이터는 CMV 감시가 동일한 서열 데이터를 사용한 거부 모니터링과 병행하여 수행될 수 있음을 지시하며, 본 발명자들이 다른 바이러스 감염이 유사하게 모니터링될 수 있는지 여부를 검사하게 하였다.
본 발명자들은 잘-특성화된 병원성 및 종양-바이러스 (도 11A) 뿐만 아니라 공생 토르크 테노 바이러스 (TTV, 알파토르크바이러스 속)를 확인하였으며, 이는 면역억제 및 TTV 풍부도 사이의 관련의 이전의 관찰과 일치한다. 이들 바이러스에 대한 임상 시험의 빈도는 다른 병원체에 상대적인 CMV의 빈번한 감시에 따라 상당히 다양하였다 (인간 헤르페스 바이러스 5, HHV-5, 본 발명자들의 코호트 중 n=1082 시험) (도 11A). 본 발명자들은 임상적 스크리닝 빈도에 상대적인 감염의 발생 (주어진 바이러스가 시퀀싱을 통해 검출되는 샘플의 수)을 평가하였다. CMV는 (335개의 샘플)에 대해 가장 빈번하게 스크리닝되었지만, 시퀀싱에 의해 측정된 바와 같은 그의 발생 (22개의 샘플에서 검출됨)은 아데노바이러스 및 폴리오마바이러스 (각각 4가지 경우 및 1가지 경우에 대해 임상적으로 시험됨, 도 11A)를 비롯한 통상적으로 스크리닝되지 않은 다른 병원체와 유사하였다.
아데노바이러스는 폐 이식 수용자에서 이식편 소실을 유발할 수 있으며 소아 환자에 대해 특히 높은 위험을 제기하는 군집-획득된 호흡기 감염이다. 샘플을 아데노바이러스에 대해 양성으로 시험된 1명의 소아 환자 (L78, 도 11B 패널 1)로부터 수집하였다. 이 환자는 또한 전체 코호트에 걸쳐 최고 아데노바이러스-유래된 DNA 적하량을 가졌다. 시험이 전형적으로 소아 폐 이식 케이스에 제한되기 때문에, 지속된 아데노바이러스 적하량은 또한 임상적으로 스크리닝되지 않은 몇몇 다른 성인 이식 환자 (예를 들어, L34, 도 11B 패널 1)에서 관찰되었다.
폴리오마바이러스는 직장 이식 후의 동종이식편 거부의 중요한 원인이지만, 통상적으로 폐 이식후 감시에는 포함되지 않는다. 본 발명자들은 이 병원체에 대해 시험되지 않은 2명의 환자 (L57 및 L15, 도 11B 패널 2)에서 폴리오마바이러스를 검출하였다. 둘 다의 경우, 임상적 기록은 폴리오마바이러스 감염으로부터 초래되었을 수 있는 지속성 신부전증을 지시하였다.
감염의 폭넓은 가설-자유 감염의 스크리닝의 이익의 마지막 예에서, 본 발명자들은 인간 헤르페스 바이러스 (HHV) 8, 즉 고형-기관 이식 후 합병증을 유발할 수 있는 종양바이러스의 고 적하량을 나타낸 환자 (도 11B 패널 3)를 검사하였다. 이 환자 (L58)는 HHV-8 재-활성화를 자극하는 잠재성을 갖는 2가지 다른 헤르페스바이러스 (HHV-4a 및 HHV-5)에 대해 양성인 것으로 시험되었다. HHV-8에 대한 이식후 모니터링은 단지 특정 임상적 상황에서만 추천되지만, 시퀀싱의 사용은 그렇지 않다면 비검출될 비-의심 케이스에서 바이러스의 확인을 가능하게 한다.
마이크로바이옴의 임상적 모니터링. 혈청에서 측정된 바이러스 외에, 본 발명자들은 또한 무세포 측정 및 뇨 배양액을 통해 검출된 클레브시엘라 뉴모니아 감염 (ROC = 0.98) 및 BAL에서 검출된 진균 감염을 비롯한 다른 체액에서 검출된 진균 또는 박테리아 감염 사이의 상관관계를 관찰하였다. 박테리아 및 진균 상관관계에 대한 성능은 감염 유형 및 문의된 체액 둘 다에 대해 민감성이었다. 본 발명자들은 혈액에 대해 보다 긴밀한 결합을 갖는 체액에 대해 보다 양호한 성능을 관찰하였으며, 또한 배경 신호에 대한 민감성을 관찰하였다. 예를 들어, 가장 통상적으로 배양된 박테리아 감염 (슈도모나스)은 본 발명자들의 환자 샘플의 80％에 걸쳐 무세포 측정에서 검출되었으며, 이는 본 발명자들의 환자 샘플의 단지 6％에서 검출된 가장 통상적으로 검출된 바이러스 병원성 종 (CMV)과 극명히 대조적이었다.
이는 정상적인 식생의 일부인 공생자 감염 (슈도모나스 포함) 및 단지 병원성이며 보다 낮은 배경 신호를 갖는 비-공생자 감염 사이의 중요한 구별을 부각시킨다. 이 구별은 비-공생자 (CMV에 대한 AUC=0.91)에 상대적인 통상적으로 배양된 공생자 감염 (예를 들어, 각각 피. 애루기노사 및 이. 콜라이에 대해 AUC=0.66 및 0.62)에 대해 측정된 민감도 및 특이도의 차이를 설명할 수 있다. 공생 박테리아의 경우, 임상적 질문은 존재 또는 부재가 아니라, 부적절한 신체 부위에서의 존재 또는 부재이다.
본 발명자들의 코호트에서, 본 발명자들은 또한 미포자충, 즉 면역억제된 환자에서 장내 감염을 유발할 수 있는 비-공생 진균으로부터 유래된 무세포 DNA를 검출하였다. 본 발명자들은 L78 (도 11B 패널 4), 즉 미포자충증의 고전적 증상을 나타낸 환자에서의 지속적인 미포자충 적하량을 측정하였다. 내시경검사 및 S상결장경검사 결과는 결정적이지 않으며, 대변 샘플은 씨. 디프 (C. diff) 뿐만 아니라 아데노바이러스에 대해 음성으로 시험되었지만, 아데노바이러스 감염 (L78, 도 11B 패널 1)은 의심되는 원인이었다. 본 발명자들의 시퀀싱 데이터에 기초하면, 이 환자에서 측정된 미포자충 신호는 I6, 즉 미포자충에 대해 양성으로 시험된 비관련된 코호트로부터의 환자 (도 11B 패널 4)와 유사하기 때문에, 미포자충증은 환자의 증상에 대한 가장 가능성있는 설명이다.
혈장의 ml 당 100억개 단편 초과로, 순환 무세포 DNA는 암 진단 및 암 치료 모니터링, 유전적 태아 진단, 및 "게놈 이식 동역학" (GTD)을 통한 심장 이식 거부의 모니터링에서 급속하게 확장되는 적용을 갖는 인간 생리학으로의 정보-풍부 윈도우이다. 이 연구에서, 본 발명자들은 폐 이식 -- 특히 낮은 생존율 뿐만 아니라 동종이식편 거부에 대한 부정확하고 침습적인 시험에 의해 제한되는 고형 기관 이식의 도전적인 유형에 대해 GTD의 원리를 적용하였다.
동종이식편 감염 및 급성 거부를 갖는 폐 이식 수용자는 임상적으로 유사한 증상과 함께 나타날 수 있기 때문에, 본 발명자들은 GTD의 범위를 감염성 질환 모니터링으로 확장하였다. 본 발명자들은 먼저 임상 시험 결과 및 CMV로부터 유래된 cfDNA--이식후 이식편 손상의 중요한 원인 사이의 강한 상관관계를 입증하였다. 본 발명자들은 또한 가설-자유 감염 모니터링이 양성 임상 시험 결과 및 관련된 증상을 갖는 환자에 비교하여 유사한 미생물 cfDNA 수준을 가진 환자에서의 아데노바이러스, 폴리오마바이러스, HHV-8 및 미포자충의 비-진단된 케이스를 비롯한 수많은 비-시험된 병원체를 밝혀내었음을 보였다. 이들 예는 병원체 특이적 시험에 반대되는 감염의 폭넓은 시퀀싱-기재 모니터링의 이익을 예시한다. 이 접근법은 감염의 발생 및 근원을 측정하는 데 도움을 줄 수 있는 도구로서 즉시 사용될 수 있다. 이는 감염의 발생이 높고, 거부 및 감염이 공동-발생할 수 있으며, 감염 및 거부의 증상이 구별되기 곤란한 이식에 관련하여 특히 적절할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태를 본원에서 나타내고 기재하였지만, 이러한 실시양태는 단지 예의 방법으로 제공됨이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 수많은 변동, 변화 및 치환이 이제 본 발명을 벗어나지 않고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일어날 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안은 본 발명을 실시하는 데 있어서 채용될 수 있음이 이해되어야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 한정하며, 이들 청구범위 및 그의 등가물의 범위 내의 방법 및 구조는 그에 의해 커버되는 것으로 의도된다.

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  1. 개체의 면역적격의 평가에 따라 개체를 치료하는 방법.
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