KR20210008561A - 합성 간-향성 아데노-연관 바이러스 캡시드 및 그의 용도 - Google Patents

합성 간-향성 아데노-연관 바이러스 캡시드 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간을 표적으로 하는 합성 아데노-연관 바이러스 캡시드 및 이를 포함하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 벡터를 사용하여 간을 표적화하고 간-특이적 발현을 제공하며, 인간 일차 간세포 및 세포주에 형질도입시키는 방법을 제공한다.

Description

합성 간-향성 아데노-연관 바이러스 캡시드 및 그의 용도
우선권의 진술
본 출원은 참조에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된, 2018년 6월 12일에 제출된 미국 임시 출원 제62/683,868호의 이익을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 간을 표적으로 하는 합성 아데노-연관 바이러스 캡시드(adeno-associated virus capsid) 및 그를 포함하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 간을 표적화하고 간-특이적 발현을 제공하며, 인간 일차 간세포(human primary hepatocyte) 및 세포주에 형질도입시키기 위해 상기 벡터를 이용하는 방법에 관한 것이다.
아데노-연관 바이러스(AAV)는 다양한 조직에서 효율적인 유전자 전달 및 지속적인 형질전환 유전자 발현 때문에 인 비보 유전자 치료제(in vivo gene therapy)를 위한 유망한 벡터이다. AAV 벡터는 유전자 치료제 임상 시험에서 우수한 안전성 프로파일을 보였고 치료 효과를 달성했다. 전신적 유전자 전달에 의해 크게 개선된 심장, 근육 및 CNS 형질도입 효율을 갖는 일부 새로운 AAV 혈청형이 규명되었다. 일부 다른 혈청형들은 소형 동물에서 간 유전자 전달에서 효과적이다. 이러한 발견은 다양한 유전성 및 대사성 질환의 유전자 치료에 대한 정보를 제공했다. 새로운 혈청형의 확인 외에, 유전적 변형이 또한 AAV 벡터의 임상적 적용을 위해 AAV 벡터를 더 개선할 수 있다. AAV 벡터의 이용에서 하나의 이슈는 그의 광범위한 조직 향성(broad tissue tropism)이고, 이는 종종 원치않는 조직에서의 유전자 전달을 초래하고 이소성(ectopic) 유전자 발현에 대한 잠재적인 안전성 우려를 제기한다. AAV 바이러스 입자의 조직-특이성 및 조직-표적화 능력을 개선하기 위해, 추론 공학(rational engineering) 외에, 캡시드 유전자에 대한 랜덤 돌연변이 생성(random mutagenesis)이 캡시드 다양성을 향상시키고 의도된 조직에 대한 캡시드 향성을 변경하는 가장 강력한 방법들 중 하나이다. DNA 셔플링(DNA shuffling)과 같은 방향성 진화(directed evolution)가 AAV 캡시드 유전자의 유전자 조작을 위한 최근에 개발된 방법들 중 하나이다.
DNA 셔플링은 부분적 상동성 재조합(patchy homologous recombination)에 의해 유전자에 새로운 유전적 돌연변이를 도입하거나 또는 교환하기 위한 랜덤 단편화(random fragmentation) 및 뒤이은 PCR 재조립(reassembly)의 방법이다. AAV는 자연적으로 다양한 조직 향성 또는 면역원성을 갖는 상이한 혈청형으로 진화한다. 이러한 혈청형의 AAV cap 유전자들은 또한 그들의 DNA를 셔플링하는 것에 의한 신규한 재조합체의 생성 및 기능적으로 생존 가능한 돌연변이체 및 변이체를 선택하기 위한 이상적인 주형이다. 변형된 AAV cap 유전자는 고도로 다양화된 생물학적 특성을 갖는 키메라 바이러스 라이브러리의 생성 및 그들의 조직 향성의 추가적인 규명을 위해 적합한 플라스미드 벡터 내로 클로닝된다.
배양된 세포주에 기반한 다수의 인 비트로 시스템이 DNA 셔플링 후 바이러스 벡터의 패닝(panning)을 위해 이용되었다. 그러나, 유전자 치료 응용에서, AAV 벡터는 인간 및 동물 신체 내에서 보다 복잡한 생리학적 환경, 예를 들면, 다수의 혈청 단백질, 잠재적인 중화 및 비-중화 항체, 내피 장벽, 표적화된 세포로의 직접적인 향성 및 감염성, 등에 직면해야 한다. 종종, 인 비트로에서 테스트될 때, 간-향성인 것으로 보이는 변형된 벡터들이 인 비보에서 사용 시, 적절하게 간을 표적화하지 않는다.
인 비보 사용을 위한 유익을 제공하는 개선된 간-향성 AAV 벡터를 위한 요구가 당해 기술 분야에 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 부분적으로, 상이한 천연 AAV 혈청형의 cap 유전자가 DNA 셔플링을 이용한 인 비트로 재조합에 의해 크게 다양화되는 것인 전략의 이용에 기초한다. 돌연변이체와 변이체(variant)의 광범위한 치환(permutation)을 포함하는, 결과적으로 수득되는 AAV 캡시드 유전자 라이브러리를 먼저 마우스에서 인 비보로 직접적으로 스크리닝했다. 인 비보에서 효과적인 벡터를 확인하기 위한 장벽을 고려하여, AAV 라이브러리를 전임상 또는 임상 상황에서 인 비보의 현실적인 환경을 모사하는 간에서 C57BL/6J 마우스에서 인 비보로 직접 스크리닝했다. 예비적으로 농축된(preliminarily enriched) 캡시드 유전자를 뒤이어 간-향성 캡시드를 포함한 세포-유형 및 조직-향성 신규한 AAV 캡시드의 추가적인 선택을 위해, 배양된 세포들에서 선택했다. 하나의 캡시드 유전자가 마우스 간에서 고도로 농축되고, 또한 인간 간암 세포주 및 일차 인간 간세포에 대해 고도로 감염성인 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 AAV 캡시드를 코딩하는 핵산으로서, 상기 핵산은: (a) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열; 또는 (b) 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일한 AAV 캡시드 코딩 서열을 포함하는 것인 핵산, 및 상기 핵산을 포함하는 세포 및 바이러스 입자(viral particle)에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드, 및 AAV 벡터 게놈 및 본 발명의 AAV 캡시드를 포함하는 AAV 입자에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 AAV 캡시드를 포함하는 재조합 AAV 입자를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은: 인 비트로에서 세포에 본 발명의 핵산, AAV rep 코딩 서열, 이종 핵산(heterologous nucleic acid)을 포함하는 AAV 벡터 게놈, 및 생산적 AAV 감염(productive AAV infection)을 생성하기 위한 헬퍼 기능을 제공하는 단계; 및 상기 AAV 캡시드를 포함하는 재조합 AAV 입자의 조립을 가능하게 하는 단계, 및 상기 AAV 벡터 게놈을 캡시드로 둘러싸는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 본 발명의 핵산, 바이러스 입자, AAV 캡시드, 또는 AAV 입자를 포함하는 약제학적 제형(pharmaceutical formulation)에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 목적 핵산(nucleic acid of interest)을 간세포에 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포를 본 발명의 AAV 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 포유동물 개체의 간세포에 목적 핵산을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 본 발명의 AAV 입자 또는 약제학적 제형의 유효량을 포유동물 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 질병의 치료를 필요로 하는 포유동물 개체에서 질병을 치료하는 방법으로서, 상기 질병은 상기 개체의 간에서 산물을 발현시키는 것에 의해 치료가능하고, 상기 방법은 포유동물 개체에게 본 발명의 AAV 입자 또는 약제학적 제형의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 양태들 및 기타 양태들이 하기에서 본 발명의 설명에서 보다 상세하게 기재된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 부분적으로, 인 비보 및 인 비트로에서 간세포에 형질도입시킬 수 있는 합성 AAV 캡시드 서열의 개발에 근거한다. 상기 합성 캡시드는 다른 기관으로의 광범위한 벡터 생체 분포(biodistribution) 없이 간-특이적 유전자 전달이 요구되는 연구 또는 치료 응용에서 사용하기 위한 AAV 벡터를 생성하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 하기에서 보다 상세하게 설명된다. 이 설명은 본 발명이 구현될 수 있는 모든 상이한 방법, 또는 본 발명에 첨가될 수 있는 모든 특징들의 상세한 목록으로 의도되지 않는다. 예를 들면, 일 구체예와 관련하여 예시된 특징들은 다른 구체예로 결합될 수 있고, 특정한 구체예에 대해 예시된 특징들이 그 구체예로부터 결실될 수 있다. 또한, 본 발명으로부터 벗어나지 않는 본 명세서에서 시사된 다양한 구체예에 대한 다수의 변형 및 첨가가 본 개시를 고려하여, 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 하기 명세서는 본 발명의 일부 특정한 구체예를 예시하는 것으로 의도되며, 그들의 모든 치환, 조합, 및 변형을 완전하게 특정하는 것으로 의도되지 않는다.
문맥이 달리 표시하지 않으면, 본 명세서에 기재된 본 발명의 다양한 특징들은 임의의 조합으로 이용될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 특징 또는 특징들의 조합이 배제되거나 또는 생략될 수 있다는 것을 고려한다. 예시하기 위해, 본 명세서가 복합체가 성분 A, B, 및 C를 포함하는 것으로 기재하는 경우, A, B, 또는 C, 또는 이들의 조합이 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략되고 포기(disclaim)될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 발명의 설명에서 사용된 용어는 특정한 구체예를 기술하기 위한 목적만을 위한 것이고, 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
뉴클레오티드 서열은, 달리 특정되지 않으면, 본 명세서에서 좌측에서 우측으로, 5'에서 3' 방향으로 단일 가닥으로만 제시된다. 뉴클레오티드 및 아미노산은 본 명세서에서, 37 C.F.R. §1.822 및 확립된 용법에 따라, IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에 의해 권장되는 방식으로, 또는 (아미노산의 경우) 1-문자 코드 또는 3-문자 코드에 의해 나타낸다.
달리 표시된 경우를 제외하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에게 공지된 표준 방법이 재조합 및 합성 폴리펩티드, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편의 제조, 핵산 서열의 조작, 형질감염된 세포의 제조, rAAV 구조체, 변형된 캡시드 단백질, AAV rep 및/또는 cap 서열을 발현하는 패키징(packaging) 벡터, 및 일시적으로 및 안정적으로 형질감염된 패키징 세포의 작제를 위해 이용될 수 있다. 그러한 기법이 당업자에게 알려져 있다. 예를 들면, SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); F. M. AUSUBEL et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York)를 참조한다.
본 명세서에 기재된 모든 공개문헌, 특허출원, 특허, 뉴클레오티드 서열, 아미노산 서열 및 기타 참고문헌은 그 전체로 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
I. 정의 .
본 발명의 설명 및 첨부된 청구항에서 AAV 캡시드 서브유닛 중 모든 아미노산 위치의 지정은 VP1 캡시드 서브유닛 번호부여(numbering)에 따른다.
본 발명의 설명 및 첨부된 청구항에서 사용된, 단수 형태("a," "an" 및 "the")는, 문맥이 명확하게 달리 표시하지 않으면, 복수 형태도 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용된, "및/또는(and/or)"은 관련하여 열거된 항목들 중 하나 또는 그 이상의 모든 가능한 조합, 및 대안적으로("또는") 해석되는 경우, 조합들의 부재를 의미하고 이들을 포괄한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 특징 또는 특징들의 조합이 배제되거나 또는 생략될 수 있다는 것을 고려한다.
또한, 본 발명의 화합물 또는 작용제의 양, 용량, 시간, 온도, 등과 같은 측정가능한 값을 지칭하는 경우 본 명세서에서 사용된 용어 "약(about)"은 특정된 양의 ± 10%, ± 5%, ±　1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변동량(variation)을 포함하도록 의도된다.
핵산, 단백질, 또는 캡시드 구조와 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 "필수적으로 구성된(consisting essentially of)"은 해당 핵산, 단백질 또는 캡시드 구조가 상기 핵산, 단백질 또는 캡시드 단백질의 목적 기능, 예를 들면, 단백질 또는 캡시드, 또는 핵산에 의해 코딩된 단백질 또는 캡시드의 향성 프로파일(tropism profile)을 유의성 있게(예를 들면, 약 1%, 5%, 또는 10%보다 높게) 변경하는 기재된 요소 이외의 다른 요소를 포함하지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명의 문맥에서 용어 "아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)" (AAV)는 한정 없이, AAV 타입 1, AAV 타입 2, AAV 타입 3 (타입 3A 및 3B 포함), AAV 타입 4, AAV 타입 5, AAV 타입 6, AAV 타입 7, AAV 타입 8, AAV 타입 9, AAV 타입 10, AAV 타입 11, 조류(avian) AAV, 소(bovine) AAV, 개(canine) AAV, 말(equine) AAV, 및 양(ovine) AAV 및 현재 공지되거나 나중에 발견되는 임의의 다른 AAV를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)를 참조한다. 다수의 추가적인 AAV 혈청형 및 클레이드(clade)가 확인되었고 (예를 들면, Gao et al., (2004) J. Virol . 78:6381-6388 및 표 1 참조), 이들도 용어 "AAV"에 의해 포괄된다.
다양한 AAV 및 자발적 파보바이러스(autonomous parvovirus)의 게놈 서열, 및 ITR, Rep 단백질, 및 캡시드 서브유닛의 서열이 당해 분야에서 공지되어 있다. 그러한 서열은 문헌 또는 공공 데이터베이스, 예를 들면, GenBank® 데이터베이에서 찾을 수 있다. 예를 들면, GenBank® 수탁 번호(Accession Number) NC 002077, NC 001401, NC 001729, NC 001863, NC 001829, NC 001862, NC 000883, NC 001701, NC 001510, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC 001358, NC 001540, AF513851, AF513852, AY530579, AY631965, AY631966를 참조하고; 이들의 개시는 그 전체로 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 또한, 예를 들면, Srivistava et al., (1983) J. Virol. 45:555; Chiorini et al., (1998) J. Virol . 71:6823; Chiorini et al., (1999) J. Virol . 73:1309; Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virol . 73:939; Xiao et al., (1999) J. Virol . 73:3994; Muramatsu et al., (1996) Virology 221:208; Shade et al., (1986) J. Virol . 58:921; Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad . Sci . USA 99:11854; 국제 특허출원 공개 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 미국특허 제6,156,303호;를 참조하고, 이들의 개시는 그 전체로 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 또한, 표 1을 참조한다. AAV1, AAV2 및 AAV3 말단 반복 서열(terminal repeat sequence)의 초기 설명이 Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration," Ph.D. Dissertation, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA (그 전체로 본 명세서에 포함됨)에 의해 제공된다.
"키메라(chimeric)" AAV 핵산 캡시드 코딩 서열 또는 AAV 캡시드 단백질은 2개 이상의 캡시드 서열의 부분을 조합한 것이다. "키메라(chimeric)" AAV 비리온 또는 입자는 키메라 AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "향성(tropism)"은 선택적으로 및 바람직하게는 세포 중 바이러스 게놈에 의해 운반되는 서열의 발현(예를 들면, 전사, 및 선택적으로, 번역), 예를 들면, 재조합 바이러스의 경우, 이종 뉴클레오티드 서열의 발현으로 이어지는, 바이러스의 특정한 세포 또는 조직 유형으로의 우선적 진입(preferential entry) 및/또는 특정한 세포 또는 조직 유형으로의 진입을 촉진하는 세포 표면과의 우선적 상호작용을 의미한다. 당업자는 바이러스 게놈으로부터의 이종 핵산 서열의 전사가 트랜스-작용 인자(trans-acting factor), 예를 들면, 유도성 프로모터 또는 달리 조절되는(otherwise regulated) 핵산 서열에 대한 트랜스-작용 인자의 부재시 개시될 수 없다는 것을 이해할 것이다. rAAV 게놈의 경우, 바이러스 게놈으로부터의 유전자 발현은 안정적으로 통합된 프로바이러스 및/또는 비-통합 에피좀(non-integrated episome), 및 바이러스 핵산이 세포 내에서 취할 수 있는 기타 형태로부터일 수 있다.
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용어 "향성 프로파일(tropism profile)"은 하나 이상의 표적 세포, 조직, 및/또는 기관의 형질도입(transduction)의 패턴을 의미한다. 합성 AAV 캡시드의 대표적 예는 다른 기관의 낮은 형질도입을 동반한, 간의 세포의 효율적인 형질도입을 특징으로 하는 향성 프로파일을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "간세포에 특이적인(specific for hepatocytes)"은 인 비보로 투여될 때, 우선적으로 간세포에 형질도입시키고, 간 외부의 세포의 최소(minimal) 형질도입을 갖는 바이러스 벡터를 의미한다. 일부 구체예에서, 형질도입된 세포의 약 80% 이상이 간세포이고, 예를 들면, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 간세포이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "간에서 산물을 발현하는 것에 의해 치료 가능한 질환(disorder is treatable by expressing a product in the liver)"은 간에서 산물(예를 들면, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드)의 발현이 해당 질환의 효과적인 치료 또는 예방을 제공하는 것인 질환, 질병, 또는 손상을 의미한다.
본 명세서에서 사용된, 바이러스 벡터(예를 들면, AAV 벡터)에 의한 세포의 "형질도입(transduction)"은 벡터의 세포로의 진입 및 핵산의 바이러스 벡터로의 결합 및 뒤이은 바이러스 벡터를 통한 세포로의 전달에 의한 유전 물질의 세포 내로의 전달을 의미한다.
달리 표시되지 않으면, "효율적 형질도입(efficient transduction)" 또는 "효율적 향성(efficient tropism)", 또는 유사한 용어는 적절한 양성 또는 음성 대조군을 참조하여 결정될 수 있다 (예를 들면, 개별적으로, 양성 대조군의 형질도입 또는 향성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상, 또는 개별적으로 음성 대조군의 형질도입 또는 향성의 적어도 약 110%, 120%, 150%, 200%, 300%, 500%, 1000% 또는 그 이상).
유사하게, 바이러스가 적절한 대조군을 참조하여 표적 조직에 대해 또는 유사한 용어에 대해 "효율적으로 형질도입하지 않는(does not efficiently transduce)"지 또는 "효율적인 향성을 갖지 않는(does not have efficient tropism)"지 여부를 결정할 수 있다. 특정한 구체예에서, 바이러스 벡터는 간 이외의 조직, 예를 들면, 근육, 신장, 생식선, 및/또는 생식 세포를 효율적으로 형질도입시키지 않는다(즉, 그들에 대해 효율적인 향성을 갖지 않는다). 특정한 구체예에서, 조직(예를 들면, 간)의 원치 않는 형질도입은 원하는 표적 조직(예를 들면, 간세포)의 형질도입의 수준의 20% 또는 그 미만, 10% 또는 그 미만, 5% 또는 그 미만, 1% 또는 그 미만, 0.1% 또는 그 미만이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "폴리펩티드(polypeptide)"는 달리 표시되지 않으면, 펩티드와 단백질을 모두 포함한다.
"핵산(nucleic acid)" 또는 "뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)"은 뉴클레오티드 염기의 서열이고, (천연 및 비-천연 뉴클레오티드 포함하는) RNA, DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드 서열일 수 있으나, 바람직하게는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 서열이다.
본 명세서에서 사용된, "단리된(isolated)" 핵산 또는 뉴클레오티드 서열(예를 들면, "단리된 DNA" 또는 "단리된 RNA")은 천연 개체 또는 바이러스, 예를 들면, 세포 또는 바이러스 구조적 성분, 또는 상기 핵산 또는 뉴클레오티드 서열과 회합된(associated) 것으로 일반적으로 발견되는 기타 폴리펩티드 또는 핵산의 (나머지) 성분들 중 적어도 일부와 분리되거나 또는 이들을 실질적으로 포함하지 않는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
마찬가지로, "단리된" 폴리펩티드는 천연 개체 또는 바이러스, 예를 들면, 세포 또는 바이러스 구조적 성분, 또는 상기 폴리펩티드와 회합된 것으로 일반적으로 발견되는 기타 폴리펩티드 또는 핵산의 성분들 중 적어도 일부와 분리되거나 또는 이들을 실질적으로 포함하지 않는 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "치료하다(treat)", "치료하는(treating)", 또는 "치료(treatment of)" (또는 문법적으로 균등한 용어)에 의해, 개체의 상태의 중증도가 경감되거나 적어도 부분적으로 개선되거나 호전되고 및/또는 하나 이상의 증상에서 일부 경감, 완화 또는 감소가 달성되고 및/또는 질병의 진행의 지연, 및/또는 질병 또는 질환의 발생의 예방 또는 지연이 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "예방하다(prevent, prevents)", 또는 "예방(prevention)" (및 그의 문법적 균등물)은 질환 또는 질병의 발병의 지연 또는 질환 또는 질병의 발병시 증상의 완화를 의미한다. 이 용어들은 질병의 완전한 소멸(abolition)을 암시하는 것으로 의도되지 않으며 질병의 발생율을 낮추거나 질병의 발병 및/또는 진행을 지연시키는 임의의 종류의 예방적 치료(prophylactic treatment)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "유효(effective)"량 또는 "치료적 유효(therapeutically effective)"량은 개체에게 개선 또는 유익을 제공하기에 충분한 양이다. 달리 말하면, "유효"량 또는 "치료적 유효"량은 개체에서 하나 이상의 임상적 증상의 일부 완화, 경감, 또는 감소를 제공할 양이다. 당업자는 일부 유익이 개체에게 제공되는 한, 치료 효과가 완전하거나 근치적(curative)이지 않아도 된다는 것을 이해할 것이다.
"이종 뉴클레오티드 서열(heterologous nucleotide sequence)" 또는 "이종 핵산(heterologous nucleic acid)"은 바이러스에서 자연적으로 발생하지 않는 서열이다. 일반적으로, 이종 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 개방 해독 프레임 및/또는 비번역(nontranslated) RNA를 포함한다.
"치료 폴리펩티드(therapeutic polypeptide)"는 세포 또는 개체에서 단백질의 부재 또는 결함으로부터 초래된 증상을 완화하거나 감소시킬 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, "치료 폴리펩티드"는 개체에게 달리 유익, 예를 들면, 항암 효과 또는 이식 생존력(transplant survivability)의 개선을 부여하는 폴리펩티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "벡터(vector)", "바이러스 벡터(virus vector)", "전달 벡터(delivery vector)" (및 유사한 용어들)는 일반적으로 핵산 전달 비히클로 기능하고, 비리온 내에 패키징된 바이러스 핵산(즉, 벡터 게놈)을 포함하는 바이러스 입자를 의미한다. 본 발명에 따른 바이러스 벡터는 본 발명에 따른 합성 AAV 캡시드를 포함하고 AAV 또는 rAAV 게놈, 또는 바이러스 핵산을 포함하는 기타 핵산을 패키징할 수 있다. 대안적으로, 일부 맥락에서, 용어 "벡터", "바이러스 벡터", "전달 벡터" (및 유사한 용어들)는 비리온의 부재 하의 벡터 게놈(예를 들면, vDNA) 및/또는 캡시드에 고정(tethered)되거나 또는 캡시드 내에 패키징된 분자를 전달하기 위한 트랜스포터로 작용하는 바이러스 캡시드를 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
"재조합 AAV 벡터 게놈(recombinant AAV vector genome)" 또는 "rAAV 게놈"은 하나 이상의 ITR(inverted terminal repeat)(예를 들면, 1개, 2개, 또는 3개의 ITR) 및 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 게놈 (즉, vDNA)이다. rAAV 벡터는 일반적으로 바이러스를 생성하기 위해 시스로(in cis) 145개 염기의 TR(terminal repeat)를 보유한다; 그러나, 부분적 또는 완전한 합성 서열을 포함하는 변형된 AAV TR 및 비-AAV TR이 이 목적을 만족시킬 수 있다. 모든 다른 바이러스 서열은 없어도 되고 트랜스로 공급될 수 있다(Muzyczka, (1992) Curr . Topics Microbiol . Immunol . 158:97). rAAV 벡터는 선택적으로 2개의 TR(예를 들면, AAV TR)을 포함하고, 일반적으로 이종 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 존재할 것이나, 그에 인접할 필요는 없다. TR은 상호 간에 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 벡터 게놈은 또한 그의 3' 또는 5' 말단에 있는 단일 ITR을 포함할 수 있다.
용어 "말단 반복서열(terminal repeat)" 또는 "TR"은 헤어핀(hairpin) 구조를 형성하고 역 말단 반복서열(inverted terminal repeat)로 기능하는(즉, 복제, 바이러스 패키징, 통합(integration), 및/또는 프로바이러스 구제(provirus rescue) 등과 같은 원하는 기능을 매개하는) 임의의 바이러스 말단 반복서열 또는 합성 서열을 포함한다. TR은 AAV TR 또는 비-AAV TR일 수 있다. 예를 들면, 다른 파보바이러스(예를 들면, CPV(canine parvovirus), MVM(mouse parvovirus), 인간 파보바이러스 B-19)의 TR 서열 또는 SV40 복제의 원점으로 작용하는 SV40 헤어핀과 같은 비-AAV TR 서열이 TR로서 사용될 수 있고, 이는 절단(truncation), 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가에 의해 더 변형될 수 있다. 또한, TR은 Samulski 등에 의한 미국특허 제5,478,745호에 기재된 "더블-D 서열(double-D sequence)"과 같이, 부분적으로 또는 완전히 합성일 수 있다.
"AAV 말단 반복서열(terminal repeat)" 또는 "AAV TR"은 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 AAV, 또는 기타 다른 공지되거나 또는 나중에 발견되는 AAV로부터 유래될 수 있다(예를 들면, 표 1 참조). AAV 말단 반복서열은, 말단 반복서열이 원하는 기능, 예를 들면, 복제, 바이러스 패키징, 통합, 및/또는 프로바이러스 구제, 등을 매개하는 한, 원형(native) 말단 반복 서열을 가질 필요는 없다(예를 들면, 원형 AAV TR 서열은 삽입, 결실, 절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있다).
용어 "rAAV 입자"와 "rAAV 비리온"은 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. "rAAV 입자" 또는 "rAAV 비리온"은 AAV 캡시드 내에 패키징된 rAAV 벡터 게놈을 포함한다.
AAV 캡시드 구조가 BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)에 보다 상세하게 기술된다.
특성을 "실질적으로 보유한다(substantially retain)"는 그 특성(예를 들면, 활성 또는 기타 측정가능한 특징)의 적어도 약 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 보유된다는 것을 의미한다.
II. 간으로 표적화된 합성 AAV 캡시드 .
본 발명자들은 다른 기관에 대한 최소 향성을 가지면서, 인 비보 및 인 비트로에서 인간 및 다른 포유동물 간세포의 형질도입을 제공할 수 있는 합성 AAV 캡시드 구조를 확인했다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 개체, 예를 들면, 야생형 개체에서 간 유전자 전달(liver gene transfer)을 제공할 수 있는 합성 AAV 캡시드 구조에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 AAV 캡시드를 코딩하는 핵산으로서, 상기 핵산은 서열번호 1-3 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열; 또는 (b) 서열번호 4-6 중 어느 하나를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;에 90% 이상 동일한 AAV 캡시드 코딩 서열을 포함하거나, 필수적으로 상기 서열로 구성되거나, 또는 상기 서열로 구성되는 것인 핵산, 및 키메라 AAV 캡시드를 포함하는 바이러스에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 상기 AAV 캡시드 코딩 서열은 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열에 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 이상 동일하다. 또 다른 구체예에서, AAV 캡시드 코딩 서열은 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 필수적으로 상기 서열로 구성되거나, 또는 상기 서열로 구성된다.
서열번호 4-6은 VP1 캡시드 단백질 서열을 나타낸다. 본 발명의 설명 및 첨부된 청구항에서 모든 아미노산 위치의 지정은 VP1 번호표기(numbering)를 기준으로 한다. 당업자는 AAV 캡시드가 일반적으로 더 작은 VP2 및 VP3 캡시드 단백질도 포함한다는 것을 이해할 것이다. AAV 캡시드 단백질에 대한 코딩 서열의 중복(overlap) 때문에, VP2 및 VP3 캡시드 단백질의 핵산 코딩 서열 및 아미노산 서열은 개시된 서열에 표시된 VP1 서열로부터 자명할 것이다. 구체적으로, VP2는 서열번호 1의 뉴클레오티드 412 (acg) 및 서열번호 4의 트레오닌 138에서 시작된다. VP3은 서열번호 1의 뉴클레오티드 610 (atg) 및 서열번호 4의 메티오닌 204에서 시작된다. 특정한 구체예에서, 서열번호 4-6의 서열을 포함하는 단리된 VP2 및 VP3 캡시드 단백질 및 VP2 또는 VP3 단백질 또는 둘 모두를 코딩하는 단리된 핵산이 고려된다.
본 발명은 또한 합성 AAV 캡시드 단백질 및 합성 캡시드를 제공하고, 상기 캡시드는 서열번호 4-6 중 어느 하나와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 상기 서열로 구성되거나, 또는 상기 서열로 구성된다. 일부 구체예에서, AAV 캡시드 서열은 서열번호 4-6 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 동일하다. 일부 구체예에서, 상기 캡시드 단백질은 서열번호 4-6에 표시된 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 상기 서열로 구성되거나, 또는 상기 서열로 구성되고, 서열번호 4-6의 캡시드 코딩 서열 내에서 1개, 2개 또는 그 미만, 3개 또는 그 미만, 4개 또는 그 미만, 5개 또는 그 미만, 6개 또는 그 미만, 7개 또는 그 미만, 8개 또는 그 미만, 9개 또는 그 미만, 10개 또는 그 미만, 12개 또는 그 미만, 15개 또는 그 미만, 20개 또는 그 미만, 25개 또는 그 미만, 30개 또는 그 미만, 40개 또는 그 미만, 또는 50개 또는 그 미만의 아미노산이 또 다른 아미노산(천연, 변형, 및/또는 합성 아미노산)에 의해 치환되고, 선택적으로 보존적 아미노산 치환으로 치환되고, 및/또는 결실되고, 및/또는 1개, 2개 또는 그 미만, 3개 또는 그 미만, 4개 또는 그 미만, 5개 또는 그 미만, 6개 또는 그 미만, 7개 또는 그 미만, 8개 또는 그 미만, 9개 또는 그 미만, 10개 또는 그 미만, 12개 또는 그 미만, 15개 또는 그 미만, 20개 또는 그 미만, 25개 또는 그 미만, 30개 또는 그 미만, 40개 또는 그 미만, 또는 50개 또는 그 미만의 아미노산의 삽입(N-말단 연장(extension) 및 C-말단 연장 포함), 또는 치환, 결실, 및/또는 삽입의 조합이 있고, 상기 치환, 결실 및/또는 삽입은 변이체 캡시드 단백질 또는 캡시드를 포함하는 비리온(예를 들면, AAV 비리온)의 구조 및/또는 기능을 과도하게 손상시키지 않는다. 일부 구체예에서, 서열번호 4-6의 캡시드 단백질 코딩 서열 내의 아미노산은 위치 220 및/또는 643 (서열번호 4에 따른 번호부여)에서 또 다른 아미노산에 의해 치환된다. 예를 들면, 본 발명의 대표적인 구체예에서, 합성 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온은 서열번호 4-6으로 표시된 합성 캡시드 단백질을 포함하는 합성 비리온의 하나 이상의 특성을 실질적으로 보유한다. 예를 들면, 상기 합성 캡시드 단백질을 포함하는 비리온은 서열번호 4-6으로 표시된 합성 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 비리온의 간 향성 프로파일을 실질적으로 보유할 수 있다. 바이러스 형질도입과 같은 생물학적 특성을 평가하는 방법이 당해 분야에서 잘 알려져 있다 (예를 들면, 실시예 참조).
보존적 아미노산 치환은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 특정한 구체예에서, 보존적 아미노산 치환은 하기 그룹들 중 하나 또는 그 이상 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및/또는 페닐알라닌, 티로신.
서열번호 4-6의 키메라 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열이 원하는 특성을 부여하기 위해 당해 분야에서 알려진 다른 변형들을 포함하도록 더 변형될 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 비한정적 가능성으로서, 캡시드 단백질은 표적화 서열 (예를 들면, RGD) 또는 정제 및/또는 검출을 촉진하는 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 캡시드 단백질은 융합 단백질을 형성하기 위해 글루타티온-S-트랜스퍼라아제, 말토오스-결합 단백질, 헤파린/헤파란 술페이트 결합 도메인, 폴리-His, 리간드, 및/또는 리포터 단백질(예를 들면, GFP(Green Fluorescent Protein), β-글루쿠로니다아제(glucuronidase), β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 등), 면역글로불린 Fc 단편, 단쇄 항체, 헤마글루티닌, c-myc, FLAG 에피토프, 등의 전부 또는 일부에 융합될 수 있다. 표적화 펩티드를 AAV 캡시드에 삽입하는 방법이 당해 기술 분야에서 알려져 있다(예를 들면, 국제특허공개 WO 00/28004; Nicklin et al., (2001) Mol . Ther . 474-181; White et al., (2004) Circulation 109:513-319; Muller et al., (2003) Nature Biotech. 21:1040-1046 참조).
본 발명의 바이러스는 국제특허 공개 WO 01/92551 및 미국특허 제7,465,583호에 기재된 듀플렉스 바이러스 게놈(duplexed viral genome)을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 합성 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드 및 이를 포함하는 바이러스 입자(즉, 비리온)을 제공하고, 상기 바이러스 입자는 벡터 게놈, 선택적으로 AAV 벡터 게놈을 패키징한다(즉, 캡시드화한다(encapsidate)). 특정한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드를 포함하고, 상기 AAV 캡시드는 AAV 벡터 게놈을 패키징하는 것인 AAV 입자를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 합성 핵산 캡시드 코딩 서열에 의해 코딩된 AAV 캡시드 또는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자를 제공한다.
특정한 구체예에서, 비리온은 목적 이종 핵산, 예를 들면, 세포로의 전달을 위한 목적 이종 핵산을 포함하는 재조합 벡터이다. 따라서, 본 발명은 인 비트로, 엑스 비보, 및 인 비보에서 세포로의 핵산 전달을 위해 유용하다. 대표적인 구체예에서, 본 발명의 재조합 벡터는 핵산을 동물(예를 들면, 포유동물) 세포에 전달 또는 이전시키기 위해 유리하게 이용될 수 있다.
이종 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 전달될 수 있다. 목적 핵산은 폴리펩티드, 선택적으로 치료적 (예를 들면, 의학 또는 수의학 용도를 위한) 및/또는 면역원성 (예를 들면, 백신을 위한) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다.
치료 폴리펩티드는 CFTR(cystic fibrosis transmembrane regulator protein), 디스트로핀(dystrophin)(디스트로핀 미니-유전자 또는 마이크로-유전자의 단백질 산물 포함, 예를 들면, Vincent et al., (1993) Nature Genetics 5:130; 미국특허공개 2003017131; Wang et al., (2000) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:13714-9 [mini-dystrophin]; Harper et al., (2002) Nature Med . 8:253-61 [micro-dystrophin] 참조); 미니-아그린(mini-agrin), 라미닌-α2, 사르코글리칸(sarcoglycan)(α, β, γ 또는 δ), 푸쿠틴-관련 단백질(Fukutin-related protein), 마이오스타틴 프로-펩티드(myostatin pro-peptide), 폴리스타틴(follistatin), 우성 음성 마이오스타틴(dominant negative myostatin), 혈관형성 인자(angiogenic factor)(예를 들면, VEGF, 안지오포이에틴-1 또는 2), 항-아폽토시스 인자(anti-apoptotic factor)(예를 들면, 헴-옥시게나아제(heme-oxygenase)-1, TGF-β, 전-세포사멸 신호(pro-apoptotic signal), 예를 들면, 카스파아제, 프로테아제, 키나아제, 사망 수용체(death receptor)[예를 들면, CD-095]의 억제자, 시토크롬 C 분비의 조절자, 미토콘드리아 기공 개방 및 팽대(mitochondrial pore opening and swelling)의 억제자); 액티빈 타입 II 가용성 수용체, 항-염증성 폴리펩티드, 예를 들면, Ikappa B 우성 돌연변이체(dominant mutant), 사르코스판(sarcospan), 유트로핀(utrophin), 미니-유트로핀, 마이오스타틴 또는 마이오스타틴 프로펩티드에 대한 항체 또는 항체 단편, 세포 주기 조절자(cell cycle modulator), Rho 키나아제 조절자, 예를 들면, 변형된 박테리아 C3 엑소엔자임(exoenzyme)인 세트린(Cethrin)[캐나다, 퀘벡, 세인트-로렌의 BioAxone Therapeutics로부터 입수 가능함], BCL-xL, BCL2, XIAP, FLICEc-s, 우성-음성 카스파아제-8, 우성-음성 카스파아제-9, SPI-6 (예를 들면, 미국특허출원 20070026076 참조), 전사 인자 PGC-α1, Pinch 유전자, ILK 유전자 및 티모신(thymosin) β4 유전자), 응고 인자(예를 들면, 인자(Factor) VIII, 인자 IX, 인자 X, 등), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 카탈라아제, 티로신 히드록실라아제, 세포내 및/또는 세포외 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 렙틴, LDL 수용체, 네프릴리신, 리포프로테인 리파아제, 오르니틴 트랜스 트랜스카르바밀라아제, β-글로빈, α-글로빈, 스펙트린, α1-안티트립신, 메틸 시토신 결합 단백질 2, 아데노신 데아미나아제, 하이포산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase), β-글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase), 스핑고미엘리나아제(sphingomyelinase), 리소좀 헥소스아미니다아제(lysosomal hexosaminidase) A, 분지쇄 케토산 데히드로게나아제(branched-chain keto acid dehydrogenase), RP65 단백질, 사이토카인 (예를 들면, α-인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터루킨-1 내지 인터루킨-14, GMCSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 림포톡신(lymphotoxin), 등), 펩티드 성장 인자, 신경영양 인자(neurotrophic factors) 및 호르몬 (예를 들면, 소마토트로핀, 인슐린, IFG-1 및 IGF-2를 포함한 인슐린-유사 성장 인자(insulin-like growth factor), GLP-1, 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor), 표피 성장 인자(epidermal growth factor), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor), 신경 성장 인자(nerve growth factor), 신경영양 인자-3 및 -4, BDNF(brain-derived neurotrophic factor), 신경교 유래 성장 인자(glial derived growth factor), 전환 성장 인자(transforming growth factor)-a 및 -b, 등), BMP(bone morphogenic protein)(RANKL 및 VEGF 포함), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 글루타메이트 수용체, 림포카인(lymphokine), 가용성 CD4, Fc 수용체, T 세포 수용체, ApoE, ApoC, 단백질 포스파타아제 억제제 1의 억제제 1(inhibitor 1 of protein phosphatase inhibitor 1)(I-1), 포스포람반(phospholamban), serca2a, 리소좀 산성 α-글루코시다아제(lysosomal acid α-glucosidase), α-갈락토시다아제 A, Barkct, β2-아드레날린 수용체(β2-adrenergic receptor), β2-아드레날린 수용체 키나아제(BARK), 포스포이소시티드-3-키나아제(phosphoinositide-3 kinase)(PI3 키나아제), 칼사르신(calsarcin), 수용체(예를 들면, 종양 괴사 성장 인자(tumor necrosis growth factor)-α 가용성 수용체), 항-염증성 인자, 예를 들면, IRAP, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, ECF-SOD, 칼리크레인(kallikrein), 티모신(thymosin)-β4, HIF(hypoxia-inducible transcription factor), 혈관형성 인자(angiogenic factor), S100A1, 파르브알부민(parvalbumin), 아데닐릴 시클라아제 타입 6(adenylyl cyclase type 6), 절단된 항시적 활성 bARKct(truncated constitutively active bARKct)와 같은 G-단백질 결합 수용체 키나아제 타입 2 넉다운(knockdown)을 가져오는 분자; 포스포람반 억제성 또는 우성-음성 분자(dominant-negative molecule), 예를 들면, 포스포람반 S16E, 단일클론 항체(단쇄 단일클론 항체 포함), 또는 자살 유전자 산물(예를 들면, 티미딘 키나아제, 시토신 데아미나아제, 디프테리아 독소, 및 TNF-α와 같은 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor)), 및 필요로 하는 개체에서 치료 효과를 갖는 임의의 다른 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
폴리펩티드를 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열은 리포터 폴리펩티드 (예를 들면, 효소)를 코딩하는 것들을 포함한다. 리포터 폴리펩티드는 당해 기술 분야에서 알려져 있고, 형광 단백질 (예를 들면, EGFP, GFP, RFP, BFP, YFP, 또는 dsRED2), 검출가능한 산물을 생성하는 효소, 예를 들면, 루시페라아제 (예를 들면, 가우시아(Gaussia), 레닐라(Renilla), 또는 포티누스(Photinus)로부터 유래된 루시페라아제)), β-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제, 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 유전자, 또는 직접적으로 검출될 수 있는 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 거의 모든 단백질이 예를 들면, 그 단백질에 대한 특이적 항체를 이용하는 것에 의해 직접적으로 검출될 수 있다. 진핵 세포의 양성 또는 음성 선택(positive or negative selection)에 적합한 추가적인 마커(및 연관된 항체)가 주기적인 업데이트(periodic updates)를 포함한, Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 및 Ausubel et al. (1992), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons에 개시된다.
대안적으로, 이종 핵산은 기능성 RNA(functional RNA), 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임(예를 들면, 미국특허 제5,877,022호에 기재된 리보자임), 스플라이세오좀-매개 트랜스-스플라이싱(spliceosome-mediated trans-splicing)을 수행하는 RNA(Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246; U.S. Patent No. 6,013,487; U.S. Patent No. 6,083,702 참조), 유전자 침묵(gene silencing)을 매개하는 siRNA(small interfering RNA)를 포함한 간섭 RNA(interfering RNA: RNAi)(Sharp et al., (2000) Science 287:2431 참조), microRNA, 또는 기타 비-번역 "기능성" RNA, 예를 들면, "가이드(guide)" RNA (Gorman et al., (1998) Proc . Nat. Acad . Sci . USA 95:4929; U.S. Patent No. 5,869,248 to Yuan et al.), 등을 포함한다. 대표적인 비번역 RNA는 다제 약물 내성(MDR) 유전자 산물에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA (예를 들면, 종양을 치료하고 및/또는 화학요법에 의한 손상을 예방하기 위해 심장으로의 투여를 위한 것), 마이오스타틴(듀쉔 또는 베커 근 이영양증(Duchenne or Becker muscular dystrophy))에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA, (종양을 치료하기 위한) 본 명세서에 구체적으로 기재된 종양 면역원(tumor immunogen)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 종양 면역원 또는 VEGF에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA, 돌연변이된 디스트로핀(듀쉔 또는 베커 근 이영양증)을 표적화하는 RNAi 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, (B형 간염(hepatitis B) 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한) B형 간염 표면 항원 유전자에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA, (HIV를 예방 및/또는 치료하기 위한) HIV tat 및/또는 rev 유전자에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA 및/또는 (병원체로부터 개체를 보호하기 위한) 병원체로부터의 기타 면역원 또는 (질병을 치료하기 위한) 결함이 있는 유전자 산물에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA를 포함한다. 전술된 표적 또는 기타 표적에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA가 또한 연구 시약으로서 이용될 수 있다.
당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 안티센스 핵산 (예를 들면, DNA 또는 RNA) 및 억제성 RNA (예를 들면, microRNA 및 siRNA 또는 shRNA와 같은 RNAi) 서열은 디스트로핀 유전자의 결함으로부터 발생하는 근 이영양증을 가진 환자에서 "엑손 스킵핑(exon skipping)"을 유도하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 이종 핵산은 적절한 엑손 스킵핑을 유도하는 안티센스 핵산 또는 억제성 RNA를 코딩할 수 있다. 당업자는 엑손 스킵핑에 대한 특정한 접근 방식은 디스트로핀 유전자의 기저 결함(underlying defect)의 속성에 의존적이고, 다수의 그러한 전략들이 당해 기술 분야에서 알려져 있다는 것을 이해할 것이다. 대표적인 안티센스 핵산 및 억제성 RNA 서열은 하나 이상의 디스트로핀 엑손(예를 들면, 엑손 19 또는 23)의 상류 분지점(upstream branch point) 및/또는 하류 공여체 스플라이스 부위(downstream donor splice site) 및/또는 내부 스플라이싱 인핸서(internal splicing enhancer)를 표적으로 한다. 예를 들면, 특정한 구체예에서, 이종 핵산은 디스트로핀 유전자의 엑손 19 또는 23의 상류 분지점 및 하류 스플라이스 공여체 부위에 대한 안티센스 핵산 또는 억제성 RNA를 코딩한다. 그러한 서열은 AAV 벡터 내에 내포되어, 변형된 U7 snRNA 및 안티센스 핵산 또는 억제성 RNA를 전달할 수 있다 (예를 들면, Goyenvalle et al., (2004) Science 306:1796-1799 참조). 또 다른 전략으로서, 변형된 U1 snRNA가 디스트로핀 엑손(예를 들면, 엑손 19 또는 23)의 상류 및 하류 스플라이스 부위에 상보적인 siRNA, microRNA, 또는 안티센스 RNA와 함께 AAV 벡터 내로 결합될 수 있다(예를 들면, Denti et al., (2006) Proc . Nat. Acad . Sci . USA 103:3758-3763 참조). 또한, 안티센스 핵산 및 억제성 RNA는 엑손 19, 43, 45, 또는 53 내에 있는 스플라이싱 인핸서 서열을 표적화할 수 있다(예를 들면, 미국특허 제6,653,467호; 미국특허 제6,727,355호; 및 미국특허 제6,653,466호 참조).
리보자임은 부위-특이적 방식으로 핵산을 절단하는 RNA-단백질 복합체이다. 리보자임은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 특이적 촉매 도메인(specific catalytic domain)을 갖는다 (Kim et al., (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:8788; Gerlach et al., (1987) Nature 328:802; Forster and Symons, (1987) Cell 49:211). 예를 들면, 다수의 리보자임이 고도의 특이성으로 포스포에스테르 전달 반응을 가속시키고, 종종 올리고뉴클레오티드 기질 중 수개의 포스포에스테르 중 한 하나만을 절단한다 (Michel and Westhof, (1990) J. Mol . Biol . 216:585; Reinhold-Hurek and Shub, (1992) Nature 357:173). 이 특이성은 기질이 화학 반응 전에 특이적 염기-쌍형성 상호작용을 통해 리보자임의 IGS(intenral guide sequence)에 결합한다는 요건에서 기인된 것으로 여겨진다.
리보자임 촉매 반응은 주로 핵산을 포함하는 서열-특이적 절단/연결(ligation) 반응의 일부로서 관찰되었다(Joyce, (1989) Nature 338:217). 예를 들면, 미국특허 제5,354,855호는 특정한 리보자임이 공지된 리보뉴클레아제의 서열 특이성보다 더 높고, DNA 제한 효소의 서열 특이성에 근접한 서열 특이성을 갖는 엔도뉴클레아제로 작용할 수 있다는 것을 보고한다. 따라서, 핵산 발현의 서열-특이적 리보자임-매개 억제는 치료적 응용에 특히 적합할 수 있다(Scanlon et al., (1991) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 88:10591; Sarver et al., (1990) Science 247:1222; Sioud et al., (1992) J. Mol . Biol . 223:831).
MicroRNA (mir)는 mRNA의 안정성을 제어하는 것에 의해 복수의 유전자의 발현을 조절할 수 있는 천연 세포성 RNA이다. 특정한 microRNA의 과발현 또는 감소가 기능 장애를 치료하기 위해 이용될 수 있고 다수의 질병 상태 및 질병의 동물 모델에서 효과적인 것으로 확인되었다 (예를 들면, Couzin, (2008) Science 319:1782-4 참조). 키메라 AAV가 유전적 및 후천적 질환의 치료를 위해, 또는 특정한 조직의 기능을 강화하고 성장을 촉진하기 위해 microRNA를 세포, 조직, 및 개체 내로 전달하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, mir-1, mir-133, mir-206 및/또는 mir-208이 심장 근육 및 골격 근육 질환을 치료하기 위해 이용될 수 있다(예를 들면, Chen et al., (2006) Genet. 38:228-33; van Rooij et al., (2008) Trends Genet. 24:159-66 참조). MicroRNA는 또한 유전자 전달 후 면역계를 조절하기 위해 이용될 수 있다 (Brown et al., (2007) Blood 110:4144-52).
본 명세서에서 사용된, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)" ("안티센스 RNA" 포함)는 특정된 DNA 또는 RNA 서열에 상보적이고 그에 특이적으로 혼성화되는 핵산을 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이를 코딩하는 핵산은 통상적인 기법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, Tullis의 미국특허 제5,023,243호; Pederson 등의 미국특허 제5,149,797호 참조.
당업자는 서열 유사성의 정도가 안티센스 올리고뉴클레오티드가 (앞서 정의된 바와 같이) 그의 표적에 특이적으로 혼성화되고 단백질 산물의 생성을 (예를 들면, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상) 감소시키기에 충분한 한, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 서열에 완전히 상보적일 필요는 없다는 것을 이해할 것이다.
혼성화의 특이성을 결정하기 위해, 그러한 올리고뉴클레오티드의 표적 서열로의 혼성화가 감소된 엄격성(stringency), 중간 엄격성 또는 높은 엄격성(even stringent) 조건의 조건에서 수행될 수 있다. 감소된, 중간 및 높은 엄격성 혼성화 조건을 위한 적절한 조건은 본 명세서에서 기재된 바와 같다.
대안적으로 말하면, 특정한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 상보체(complement)와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖고 (앞서 정의된 바와 같이) 단백질 산물의 생성을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 서열 대비 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 불일치(mismatch)를 포함한다.
핵산 서열의 퍼센트 동일성(percent identity)을 결정하는 방법이 본 명세서의 다른 부분에서 보다 상세하게 설명된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 의도된 표적에 특이적으로 혼성화되고 (앞서 정의된 바와 같이) 단백질 산물의 생성을 감소시킬 수 있는 한 결정적이지 않고, 통상적인 절차에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 8개, 10개, 또는 12개, 또는 15개의 뉴클레오티드이고 및/또는 길이가 약 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 100개 또는 150개 뉴클레오티드 미만이다.
RNA 간섭(RNAi)은 단백질 산물 (예를 들면, shRNA 또는 siRNA)의 생성을 감소시키기 위한 또 다른 유용한 방식이다. RNAi는 목적 표적 서열에 상응하는 이중가닥 RNA (dsRNA)가 세포 또는 개체 내로 도입되어, 상응하는 mRNA의 분해를 초래하는 것인 전사-후 유전자 침묵(post-transcriptional gene silencing)의 기전이다. RNAi가 유전자 침묵을 달성하는 기전이 Sharp et al., (2001) Genes Dev 15: 485-490; 및 Hammond et al., (2001) Nature Rev. Gen. 2:110-119에서 리뷰된다. RNAi 효과는 유전자 발현이 회복되기 전에 복수의 세포 분열 동안 지속된다. 따라서, RNAi는 RNA 수준에서 표적화 넉아웃(knockout) 또는 "넉다운(knockdown)"을 수행하는 강력한 방법이다. RNAi는 인간 배아 신장 세포 및 HeLa 세포를 포함한, 인간 세포에서 성공적인 것으로 입증되었다(예를 들면, Elbashir et al., Nature (2001) 411:494-8 참조).
포유동물 세포에서 RNAi를 사용하려는 초기의 시도들은 dsRNA 분자에 반응한 PKR을 포함하는 항바이러스 방어 기전을 초래했다(예를 들면, Gil et al., (2000) Apoptosis 5:107 참조). 그 이후, "짧은 간섭 RNA(short interfering RNA)"(siRNA)로 알려진, 약 21개 뉴클레오티드의 짧은 합성 dsRNA가 항바이러스 반응을 유발하지 않으면서 포유동물 세포에서 침묵을 매개할 수 있다는 것이 입증되었다 (예를 들면, Elbashir et al., Nature (2001) 411:494-8; Caplen et al., (2001) Proc . Nat. Acad. Sci. USA 98:9742 참조).
RNAi 분자(siRNA 분자 포함)는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA; Paddison et al., (2002), Proc . Nat. Acad . Sci . USA 99:1443-1448 참조)일 수 있고, shRNA는 RNase III 유사 효소인 다이서(Dicer)의 작용에 의해 세포 내에서 20-25머 siRNA 분자로 가공되는 것으로 사료된다. shRNA는 일반적으로 2개의 역 반복 서열이 루프를 형성하는 짧은 스페이서 서열에 의해 분리된 것인 스템-루프(stem-loop) 구조를 갖는다. 3개 내지 23개 뉴클레오티드 범위의 길이를 갖는 루프를 가진 shRNA의 보고가 있었다. 루프 서열은 일반적으로 중요하지 않다. 대표적인 루프 서열은 하기 모티프를 포함한다: AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC 및 UUCAAGAGA.
RNAi는 또한 양쪽에 2개의 루프 영역을 갖는 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 원형(circular) 분자를 포함할 수 있고, 상기 센스와 안티센스 영역 간에 dsRNA 형성 시 "덤벨(dumbbell)" 형태 구조를 형성한다. 이 분자는 dsRNA 부분, 예를 들면, siRNA를 방출하기 위해 인 비트로 또는 인 비보에서 가공될 수 있다.
국제특허출원 공개 WO 01/77350은 진핵 세포에서 이종 서열의 센스 및 안티센스 전사체를 생성하는 양-방향성 전사를 위한 벡터를 기재한다. 이 기법은 본 발명에 따른 사용을 위한 RNAi를 생성하기 위해 이용될 수 있다.
Shinagawa et al., (2003) Genes Dev . 17:1340은 CMV 프로모터 (pol II 프로모터)로부터 긴 dsDNA를 발현시키는 방법을 보고하며, 이 방법은 또한 조직 특이적 pol II 프로모터에도 적용가능하다. 마찬가지로, Xia et al., (2002) Nature Biotech. 20:1006의 방식은 폴리(A) 테일링(tailing)을 피하고 조직-특이적 프로모터와 함께 이용될 수 있다.
RNAi를 생성하는 방법은 화학적 합성, 인 비트로 전사, 다이서(Dicer)에 의한 긴 dsRNA의 분해(인 비트로 또는 인 비보), 전달 벡터로부터의 인 비보 발현, 및 PCR-유래 RNAi 발현 카세트에서의 발현을 포함한다(예를 들면, TechNotes 10(3) "Five Ways to Produce siRNAs," from Ambion, Inc., Austin TX 참조).
siRNA 분자의 설계에 대한 가이드라인이 이용가능하다(예를 들면, Ambion, Inc., Austin TX로부터의 문헌). 특정한 구체예에서, siRNA 서열은 약 30-50% G/C 함량을 갖는다. 또한, 4개의 T 또는 A 잔기보다 긴 구간들(stretch)은 RNA 폴리머라아제 III이 RNA를 전사하기 위해 이용되는 경우 일반적으로 회피된다. 온라인 siRNA 표적 파인더(target finder)가 이용가능하고, 예를 들면, Ambion, Inc.로부터, 화이트헤드 생물의학 연구소(Whitehead Institute of Biomedical Research)를 통해, 또는 Dharmacon Research, Inc.로부터 입수가능하다.
RNAi 분자의 안티센스 영역은 표적 서열에 완전히 상보적일 수 있으나, 그 분자가 (앞서 정의된 바와 같이) 표적 서열에 특이적으로 혼성화되고 단백질 산물의 생성을 (예를 들면, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상) 감소시킬 수 있는 한 반드시 그럴 필요는 없다. 일부 구체예에서, 그러한 올리고뉴클레오티드의 표적 서열로의 혼성화는 앞서 정의된 바와 같이, 감소된 엄격성, 중간 엄격성, 또는 높은 엄격성(even stringent) 조건에서 수행될 수 있다.
다른 구체예에서, RNAi의 안티센스 영역은 표적 서열의 상보체와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 그보다 높은 서열 동일성(sequence identity)을 갖고 단백질 산물의 생성을 (예를 들면, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상) 감소시킨다. 일부 구체예에서, 안티센스 영역은 표적 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 불일치를 포함한다. 불일치는 일반적으로 dsRNA의 중심 부분보다는 말단에서 더 잘 감수된다(tolerated).
특정한 구체예에서, RNAi는 2개의 별개의 센스 분자와 안티센스 분자 간에 분자간 복합체화에 의해 형성된다. RNAi는 두 개의 별개의 가닥 간에 분자간 염기쌍 형성에 의해 형성된 ds 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, RNAi는 센스 영역과 안티센스 영역을, 통상적으로 역반복 서열(inverted repeat)로 포함하는 단일 핵산 분자 내에서 분자내 염기쌍 형성에 의해 형성된 ds 영역을 포함한다(예를 들면, shRNA 또는 다른 스템 루프 구조(stem loop structure), 또는 원형 RNAi 분자). RNAi는 센스 영역과 안티센스 영역 사이에 스페이서(spacer) 영역을 더 포함할 수 있다.
일반적으로, RNAi 분자는 고도로 선택적이다. 원하는 경우, 당업자는 다른 공지된 서열과 실질적인 서열 상동성(homology)을 갖지 않는 RNAi 서열을 식별하기 위해 적절한 데이터베이스를 검색하는 것에 의해, 예를 들면, BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 이용가능함)를 이용하여 표적이 아닌 핵산의 발현을 방해할 것 같은 후보 RNAi를 용이하게 제거할 수 있다.
RNAi의 제조를 위한 키트가 상업적으로 이용가능하고, 예를 들면, New England Biolabs, Inc. 및 Ambion, Inc.로부터 입수가능하다.
재조합 바이러스 벡터는 또한 숙주 염색체 상의 유전자좌(locus)와 상동성을 공유하고 재조합하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이 방식은 숙주 세포에서 유전적 결함을 교정하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 백신접종(vaccination)을 위한, 면역원성 폴리펩티드를 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 제공한다. 이종 핵산은 HIV(human immunodeficiency virus), 인플루엔자 바이러스, gag 단백질, 종양 항원, 암 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원 등으로부터의 면역원을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당해 분야에서 공지된 목적 면역원(immunogen of interest)을 코딩할 수 있다. 대안적으로, 면역원은 바이러스 캡시드에 제시될 수 있거나 (예를 들면, 그에 포함됨(incorporated)) 또는 바이러스 캡시드에 (예를 들면, 공유결합성 변형에 의해) 고정될 수 있다.
파보바이러스의 백신으로서의 이용이 당해 기술 분야에서 알려져 있다(예를 들면, Miyamura et al., (1994) Proc . Nat. Acad . Sci . USA 91:8507; Young 등의 미국특허 제5,916,563호, Mazzara 등의 미국특허 제5,905,040호, Samulski 등의 미국특허 제5,882,652호, 미국특허 제5,863,541호 참조; 이들의 개시는 참조에 의해 그 전체로 본 명세서에 포함됨). 항원은 바이러스 캡시드에 제시될 수 있다. 대안적으로, 항원은 재조합 벡터 게놈 내로 도입된 이종 핵산으로부터 발현될 수 있다.
면역원성 폴리펩티드, 또는 면역원은 미생물성, 박테리아성, 원생동물성, 기생충성, 균류성, 및 바이러스성 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는 질환으로부터 개체를 보호하기에 적합한 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들면, 면역원은 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus) 면역원(예를 들면, 인플루엔자 바이러스 면역원, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 표면 단백질 또는 인플루엔자 바이러스 핵단백질 유전자, 또는 말(equine) 인플루엔자 바이러스 면역원), 또는 렌티바이러스 면역원 (예를 들면, EIAV(equine infectious anemia virus) 면역원, SIV(Simian Immunodeficiency Virus) 면역원, 또는 HIV(Human Immunodeficiency Virus) 면역원, 예를 들면, HIV 또는 SIV 외피(envelope) GP160 단백질, HIV 또는 SIV 매트릭스/캡시드 단백질, 및 HIV 또는 SIV gag, pol 및 env 유전자 산물)일 수 있다. 면역원은 또한 아레나바이러스 (arenavirus) 면역원(예를 들면, 라싸열 바이러스(Lassa fever virus) 면역원, 예를 들면, 라싸열 바이러스 핵캡시드 단백질 유전자 및 라싸열 외피 당단백질 유전자), 폭스바이러스(poxvirus) 면역원 (예를 들면, 백시니아 L1 또는 L8 유전자와 같은 백시니아), 플라비바이러스(flavivirus) 면역원 (예를 들면, 황열 바이러스(yellow fever virus) 면역원 또는 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus) 면역원), 필로바이러스(filovirus) 면역원 (예를 들면, 에볼라(Ebola) 바이러스 면역원, 또는 마르부르크 바이러스(Marburg virus) 면역원, 예를 들면, NP 및 GP 유전자), 분야바이러스(bunyavirus) 면역원 (예를 들면, RVFV, CCHF, 및 SFS 바이러스), 또는 코로나바이러스(coronavirus) 면역원 (예를 들면, 전염성 인간 코로나바이러스(infectious human coronavirus) 면역원, 예를 들면, 코로나바이러스 외피 당단백질 유전자, 또는 PTGV(porcine transmissible gastroenteritis virus) 면역원, 또는 AIBV(avian infectious bronchitis virus) 면역원, 또는 SARS(severe acute respiratory syndrome) 면역원, 예를 들면, S [S1 또는 S2], M, E, 또는 N 단백질 또는 그의 면역원성 단편)일 수 있다. 면역원은 또한 폴리오(polio) 면역원, 헤르페스(herpes) 면역원(예를 들면, CMV, EBV, HSV 면역원), 이하선염(mumps) 면역원, 홍역(measles) 면역원, 루벨라(rubella) 면역원, 디프테리아 독소 또는 기타 디프테리아 면역원, 백일해(rubella) 항원, 간염(예를 들면, A형 간염, B형 간염, 또는 C형 간염) 면역원, 또는 당해 기술분야에서 공지된 기타 백신 면역원일 수 있다.
대안적으로, 면역원은 임의의 종양 세포 항원 또는 암세포 항원일 수 있다. 선택적으로, 종양 또는 암 항원은 암세포의 표면에 발현된다. 대표적인 암 및 종양 세포 항원이 S.A. Rosenberg, (1999) Immunity 10:281에 기재된다. 예시적인 암 및 종양 항원은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: BRCA1 유전자 산물, BRCA2 유전자 산물, gp100, 티로시나아제, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, β-카테닌(catenin), MUM-1, 카스파아제-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, PRAME, p15, MART-1 (Coulie et al., (1991) J. Exp . Med. 180:35), gp100 (Wick et al., (1988) J. Cutan . Pathol. 4:201) 및 MAGE 항원(MAGE-1, MAGE-2 and MAGE-3) (Van der Bruggen et al., (1991) Science, 254:1643)을 포함한 흑색종 종양 항원(Kawakami et al., (1994) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:3515; Kawakami et al., (1994) J. Exp . Med., 180:347; Kawakami et al., (1994) Cancer Res. 54:3124), CEA, TRP-1; TRP-2; P-15 및 티로시나아제 (Brichard et al., (1993) J. Exp. Med. 178:489); HER-2/neu 유전자 산물 (미국특허 제4,968,603호); CA 125; HE4; LK26; FB5 (엔도시알린); TAG 72; AFP; CA19-9; NSE; DU-PAN-2; CA50; Span-1; CA72-4; HCG; STN (시알릴 Tn 항원); c-erbB-2 단백질; PSA; L-CanAg; 에스트로겐 수용체; 유지방 글로불린(milk fat globulin); p53 종양 억제자 단백질(tumor suppressor protein) (Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623); 뮤신 항원 (국제특허 출원 공개 WO 90/05142); 텔로머라아제; NMP(nuclear matrix protein); PAP(prostatic acid phosphatase); 파필로마(papilloma) 바이러스 항원; 및 하기 암과 연관된 항원들: 흑색종, 선암종(adenocarcinoma), 흉선종(thymoma), 육종(sarcoma), 폐암, 간암, 대장암, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 췌장암, 뇌암, 신장암, 위암, 식도암, 두경부암, 및 기타 암 (예를 들면, Rosenberg, (1996) Annu . Rev. Med. 47:481-91 참조).
대안적으로, 이종 뉴클레오티드 서열은 인 비트로, 엑스 비보, 또는 인 비보로 세포에서 가치있게(desirably) 생성되는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 벡터가 배양된 세포 내로 도입되고, 발현된 단백질 산물이 그로부터 단리될 수 있다.
목적 이종 핵산이 적절한 조절 서열과 작동가능하게 회합될(associated) 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들면, 이종 핵산은 발현 조절 요소들, 예를 들면, 전사/번역 조절 신호, 복제 원점(origin of replication), 폴리아데닐화 신호, 내부 리보좀 도입 부위(internal ribosome entry site: IRES), 프로모터, 인핸서, 등과 작동가능하게 회합될 수 있다.
당업자는 또한 다양한 프로모터/인핸서 요소들이 원하는 발현 수준 및 조직-특이적 발현에 따라 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 프로모터/인핸서는 원하는 발현의 패턴에 따라 항시성(constitutive)이거나 유도성일 수 있다. 프로모터/인핸서는 고유하거나(native) 또는 외래성(foreign)일 수 있고 천연 또는 합성 서열일 수 있다. 외래(foreign)는 전사 개시 영역이 상기 전사 개시 영역이 도입되는 야생형 숙주에서는 발견되지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다.
프로모터/인핸서 요소는 표적 서열 또는 치료 대상 개체에 고유한 것일 수 있고 및/또는 이종 핵산 서열에 고유한 것일 수 있다. 프로모터/인핸서 요소는 일반적으로 목적 표적 세포에서 기능하도록 선택된다. 대표적인 구체예에서, 프로모터/인핸서 요소는 포유동물 프로모터/인핸서 요소이다. 프로모터/인핸서 요소는 RNA 폴리머라아제 II-기반 프로모터 또는 RNA 폴리머라아제 III-기반 프로모터일 수 있다. 프로모터/인핸서 요소는 항시성이거나 유도성일 수 있다.
유도성 발현 조절 요소들은 일반적으로 이종 핵산 서열의 발현에 대한 조절을 제공하는 것이 바람직한 응용들에서 이용된다. 유전자 전달을 위한 유도성 프로모터/인핸서 요소들은 조직-특이적 또는 조직-선호적(tissue-preferred) 프로모터/인핸서 요소일 수 있고 근육 특이적 또는 선호적 (심근, 골격근 및/또는 평활근 포함), 신경 조직 특이적 또는 선호적(뇌-특이적 포함), 눈(망막-특이적 및 각막-특이적 포함), 간 특이적 또는 선호적, 골수 특이적 또는 선호적, 췌장 특이적 또는 선호적, 비장 특이적 또는 선호적, 및 폐 특이적 또는 선호적 프로모터/인핸서 요소를 포함한다. 일 구체예에서, 간세포-특이적 또는 간세포-선호적 프로모터가 사용된다. 간세포-특이적 또는 선호적 프로모터의 예는 아포리포프로테인(apolipoprotein) AII, 알부민, 알파 1-안티트립신, 티록신-결합 글로불린, 시토크롬 P450 CYP3A4, 또는 miroRNA122 또는 합성 간-특이적 조절 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 간세포-특이적 또는 선호적 프로모터의 사용은 이종 핵산의 발현을 간으로 더 한정하는 것에 의해 합성 AAV 벡터에 의해 달성되는 특이성을 증가시킬 수 있다. 기타 유도성 프로모터/인핸서 요소는 호르몬-유도성 및 금속-유도성 요소를 포함한다. 대표적인 유도성 프로모터/인핸서 요소는 Tet 온/오프 요소, RU486-유도성 프로모터, 엑디손(ecdysone)-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터, 및 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
표적 세포에서 이종 핵산 서열이 전사되고 번역되는 것인 구체예에서, 삽입된 단백질 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특이적 개시 신호가 일반적으로 이용된다. ATG 개시 코돈 및 인접 서열(adjacent sequence)을 포함할 수 있는, 이러한 외래 번역 조절 서열은 천연 및 합성인 다양한 기원일 수 있다.
본 발명은 또한 AAV 캡시드 및 AAV 게놈을 포함하는 합성 AAV 입자를 제공하고, 상기 AAV 게놈은 AAV 캡시드에 "상응한다(corresponds to)"(즉, 코딩한다). 또한, 키메라 AAV 입자들의 집합(collection) 또는 라이브러리가 제공되고, 상기 집합 또는 라이브러리는 2개 또는 그 이상, 10개 또는 그 이상, 50개 또는 그 이상, 100개 또는 그 이상, 1000개 또는 그 이상, 104개 또는 그 이상, 105개 또는 그 이상, 또는 106개 또는 그 이상의 상이한 서열들을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 합성 AAV 캡시드 단백질을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 그로 필수적으로 구성된 "공(empty)" 캡시드 입자(즉, 벡터 게놈의 부재)를 포함한다. 본 발명의 합성 AAV 캡시드는 미국특허 제5,863,541호에 기재된 것과 같이 "캡시드 비히클(capsid vehicle)"로 이용될 수 있다. 바이러스 캡시드에 공유결합에 의해 연결되거나, 그에 결합되거나, 또는 그에 의해 패키징되고 세포 내로 전달될 수 있는 분자들은 DNA, RNA, 지질, 탄수화물, 폴리펩티드, 저분자량 유기 분자(small organic molecule), 또는 이들의 조합을 포함한다. 또한, 분자들은 숙주 표적 세포 내로의 전달을 위해 바이러스 캡시드의 외부와 회합될(예를 들면, "고정될(tethered to)") 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 분자는 캡시드 단백질에 공유결합에 의해 연결된다(즉, 접합되거나 또는 화학적으로 결합된다). 공유결합에 의해 분자들을 연결시키는 방법이 당업자에 의해 알려져 있다.
본 발명의 바이러스 캡시드는 또한 신규한 캡시드 구조체에 대한 항체를 생성시키는데 있어서 용도를 갖는다. 또 다른 대안으로서, 외래 아미노산 서열이 세포로의 항원 제시를 위해, 예를 들면, 외래 아미노산 서열에 대한 면역 반응을 생성하기 위한 개체로의 투여를 위해 바이러스 캡시드 내로 삽입될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 합성 바이러스 캡시드 및 합성 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 (예를 들면, 단리된 핵산)을 제공한다. 또한, 핵산을 포함하는 벡터, 및 본 발명의 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 세포(인 비보 또는 배양물)를 제공한다. 그러한 핵산, 벡터, 및 세포가 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바이러스의 생산을 위한 시약(예를 들면, 헬퍼 구조체(helper construct) 또는 패키징 세포)으로서 이용될 수 있다.
대표적인 구체예에서, 본 발명은 서열번호 4-6의 AAV 캡시드를 코딩하거나 또는 서열번호 1-3의 뉴클레오티드 서열에 90% 이상 동일한 핵산 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 전술된 AAV 캡시드 변이체(AAV capsid variant), 캡시드 단백질 변이체, 및 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다. 특정한 구체예에서, 상기 핵산은 당업자에 의해 공지된 표준 조건에서 본 명세서에 구체적으로 개시된 핵산 서열의 상보체에 혼성화되고 변이체 캡시드 및/또는 캡시드 단백질을 코딩한다. 선택적으로, 변이체 캡시드 또는 캡시드 단백질은 서열번호 1-3의 핵산 서열에 의해 코딩된 캡시드 및/또는 캡시드 단백질의 하나 이상의 특성을 보유한다. 예를 들면, 변이체 캡시드 또는 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자는 서열번호 1-3의 핵산 코딩 서열에 의해 코딩된 캡시드 또는 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자의 간 향성 프로파일을 실질적으로 보유할 수 있다.
예를 들면, 그러한 서열의 혼성화는 감소된 엄격성, 중간 엄격성 또는 높은 엄격성 조건 하에서 수행될 수 있다. 감소된 엄격성, 중간 엄격성 및 높은 엄격성 혼성화를 위한 대표적인 조건은 하기와 같다: (예를 들면, 각각 5x 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 0.5% SDS 및 1x SSPE를 포함하는 35-40% 포름아미드, 37℃의 세척 엄격성(wash stringency)에 의해 대표되는 조건; 5x 덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 1x SSPE를 포함하는 40-45% 포름아미드, 42℃의 세척 엄격성에 의해 대표되는 조건; 및 5x 덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 1x SSPE를 포함하는 50% 포름아미드, 42℃의 세척 엄격성에 의해 대표되는 조건). 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)을 참조한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 변이체 캡시드 또는 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1-3의 핵산 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%, 또는 그보다 높은 서열 동일성을 갖고, 선택적으로 서열번호 1-3의 핵산에 의해 코딩되는 캡시드 또는 캡시드 단백질의 하나 이상의 특성을 실질적으로 보유하는 변이체 캡시드 또는 캡시드 단백질을 코딩한다.
당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 핵산 또는 폴리펩티드가 공지된 서열에 대한 서열 동일성을 갖는지 여부를 확인하기 위해 다수의 상이한 프로그램들이 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 퍼센트 동일성(percent identity)은 핵산 또는 그의 단편이, BLASTN을 이용하여, 또 다른 핵산(또는 그의 상보적 가닥)과 (적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 가지고) 최적으로 정렬된 경우, 상기 다른 핵산에 대한 특정된 퍼센트 동일성을 공유한다는 것을 의미한다. 두 개의 상이한 핵산 간에 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 퍼센트 동일성은 BLASTN 프로그램 "BLAST 2 sequences"를 이용하여 결정된다. 이 프로그램은 인터넷에서 NCBI(he National Center for Biotechnology Information)로부터 공공 이용을 위해 이용가능하다(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402). 이용되는 파라미터는 (하기와 같이 계산된) 가장 높은 계산된 퍼센트 동일성을 가져오는 하기 파라미터들의 조합이고, 디폴트 파라미터가 괄호 내에 표시된다: Program--blastn Matrix--0 BLOSUM62 일치에 대한 보상(Reward for a match)--0 또는 1 (1) 불일치에 대한 페널티(Penalty for a mismatch)--0, -1, -2 또는 -3 (-2) 오픈 갭 페널티(Open gap penalty)--0, 1, 2, 3, 4 또는 5 (5) 연장 갭 페널티(Extension gap penalty)--0 또는 1 (1) Gap x_dropoff--0 또는 50 (50) 기대(Expect)--10.
폴리펩티드를 언급할 때, 퍼센트 동일성 또는 유사성(Percent identity or similarity)은 해당 폴리펩티드가 BLASTP를 이용하여 결정된 공통된 길이에 대해 또 다른 단백질 또는 그의 일부와 비교시 특정된 퍼센트 동일성 또는 유사성을 보인다는 것을 나타낸다. 이 프로그램도 인터넷을 통해 NCBI(the National Center for Biotechnology Information)로부터 공공 이용을 위해 입수가능하다 (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402). 폴리펩티드의 퍼센트 동일성 또는 유사성은 통상적으로 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정된다. 예를 들면, the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wis. 53705 참조. 단백질 분석 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 지정된 상동성(homology)의 척도를 이용하여 유사한 서열을 매칭한다. 보존적 치환은 통상적으로 하기 그룹 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.
특정한 구체예에서, 핵산은 플라스미드, 파아지, 바이러스 벡터(예를 들면, AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 또는 바큘로바이러스 벡터), BAC(bacterial artificial chromosome), 또는 YAC(yeast artificial chromosome)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 벡터를 포함하거나, 그로 필수적으로 구성되거나, 또는 그로 구성될 수 있다. 예를 들면, 핵산은 5' 및/또는 3' 말단 반복서열(terminal repeat)(예를 들면, 5' 및/또는 3' AAV 말단 반복서열)을 포함하는 AAV 벡터를 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 그로 필수적으로 구성될 수 있다.
일부 구체예에서, 합성 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산은 AAV rep 코딩 서열을 더 포함한다. 예를 들면, 핵산은 바이러스 스톡(viral stock)을 생성하는 헬퍼 구조체(helper construct)일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 안정적으로 포함하는 세포를 패키징 세포를 제공한다. 예를 들면, 핵산은 세포의 게놈 내로 안정적으로 결합될 수 있거나, 또는 에피좀 형태(episomal form)(예를 들면, "EBV 기반 핵 에피솜(EBV based nuclear episome)")로 안정적으로 유지될 수 있다.
핵산은 전달 벡터, 예를 들면, 바이러스 전달 벡터(viral delivery vector) 내로 결합될 수 있다. 예시하면, 본 발명의 핵산은 AAV 입자, 아데노바이러스 입자, 헤르페스바이러스 입자, 바큘로바이러스 입자, 또는 임의의 다른 적합한 바이러스 입자에 패키징될 수 있다.
또한, 핵산은 프로모터 요소와 작동가능하게 회합될 수 있다. 프로모터 요소가 본 명세서에서 보다 상세하게 설명된다.
본 발명은 또한 본 발명의 바이러스 벡터를 생산하는 방법을 더 제공한다. 대표적인 구체예에서, 본 발명은 재조합 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 인 비트로에서 세포에 (a) (i) 이종 핵산, 및 (ii) AAV 주형의 바이러스 입자 내로의 캡시드화(encapsidation)를 위해 충분한 패키징 신호 서열(예를 들면, 하나 이상(예를 들면, 2개)의 말단 반복서열, 예를 들면, AAV 말단 반복서열(TR))을 포함하는 주형, 및 (b) 상기 주형의 복제 및 바이러스 입자 내로의 캡시드화를 위해 충분한 AAV 서열(예를 들면, AAV rep 및 본 발명의 AAV 캡시드를 코딩하는 AAV cap 서열)을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다. 상기 주형 및 AAV 복제 및 캡시드 서열은 캡시드 내에 패키징된 상기 주형을 포함하는 재조합 바이러스 입자가 세포에서 생산되는 조건에서 제공된다. 상기 방법은 또한 상기 세포로부터 상기 바이러스 입자를 수집하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바이러스 입자들은 배지로부터 및/또는 세포를 용해시키는 것에 의해 수집될 수 있다.
하나의 예시적 구체예에서, 본 발명은 AAV 캡시드를 포함하는 rAAV 입자를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은: 인 비트로에서 세포에 본 발명의 합성 AAV 캡시드를 코딩하는 핵산, AAV rep 코딩 서열, 이종 핵산을 포함하는 AAV 벡터 게놈, 및 생산적 AAV 감염을 생성하기 위한 헬퍼 기능을 제공하는 단계; 및 상기 AAV 캡시드를 포함하는 AAV 입자의 조립을 허용하는 단계, 및 상기 AAV 벡터 게놈을 캡시드화하는 단계를 포함한다.
상기 세포는 일반적으로 AAV 바이러스 복제를 허용하는(permissive) 세포이다. 당해 분야에서 알려진 임의의 적합한 세포, 예를 들면, 포유동물 세포가 이용될 수 있다. 또한, 복제-결함 헬퍼 바이러스(replication-deficient helper virus)로부터 결실된 기능을 제공하는 트랜스-상보적(trans-complementing) 패키징 세포주, 예를 들면, 293 세포 또는 기타 E1a 트랜스-상보적 세포가 적합하다.
AAV 복제 및 캡시드 서열은 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 제공될 수 있다. 현재의 프로토콜은 통상적으로 단일 플라스미드 상에서 AAV rep/cap 유전자를 발현시킨다. AAV 복제 및 패키징 서열은 함께 제공되는 것이 편리할 수 있으나, 함께 제공되지 않아도 된다. AAV rep 및/또는 cap 서열은 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, rep/cap 서열이 하이브리드 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터(예를 들면, 결실된 아데노바이러스 벡터의 E1a 또는 E3 영역에 삽입됨)에 의해 제공될 수 있다. EBV 벡터는 또한 AAV cap 및 rep 유전자를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 이 방법의 하나의 장점은 EBV 벡터가 에피좀이나, 연속적인 세포 분열에서 높은 카피 수를 유지할 것(즉, EBV 기반 핵 에피좀(nuclear episome)으로 지칭된, 염색체-외 요소(extra-chromosomal element)로서 세포 내에 안정적으로 통합됨)이라는 것이다.
추가적인 대안으로서, rep/cap 서열이 세포 내에 안정적으로 (에피좀으로서 또는 통합되어) 운반될 수 있다.
일반적으로, AAV rep/cap 서열은 이러한 서열의 구제(rescue) 및/또는 패키징을 방지하기 위해, AAV 패키징 서열(예를 들면, AAV ITR)에 의해 플랭킹(flank)되지 않을 것이다.
주형(예를 들면, rAAV 벡터 게놈)이 당해 기술 분야에서 공지된 방법을 이용하여 제공될 수 있다. 예를 들면, 주형은 비-바이러스 벡터 (예를 들면, 플라스미드) 또는 바이러스 벡터에 의해 공급될 수 있다. 특정한 구체예에서, 주형은 헤르페스바이러스 또는 아데노바이러스 벡터(예를 들면, 결실된 아데노바이러스의 E1a 또는 E3 영역 내에 삽입됨)에 의해 공급된다. 또 다른 예시로서, Palombo et al., (1998) J. Virol . 72:5025는 AAV ITR에 의해 플랭킹된 리포터 유전자를 운반하는 바큘로바이러스 벡터를 기재한다. EBV 벡터는 또한, rep/cap 유전자에 대해 전술된 바와 같이, 주형을 전달하기 위해 이용될 수 있다.
또 다른 대표적 구체예에서, 주형은 복제성(replicating) rAAV 바이러스에 의해 제공된다. 또 다른 구체예에서, AAV 프로바이러스(provirus)는 세포의 염색체 내에 안정적으로 통합된다.
최대 바이러스 역가를 수득하기 위해, 생산적 AAV 감염에 필수적인 헬퍼 바이러스 기능 (예를 들면, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)이 일반적으로 세포에 제공된다. AAV 복제를 위해 필요한 헬퍼 바이러스 서열이 당해 기술 분야에서 알려져 있다. 일반적으로, 이러한 서열들은 헬퍼 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터에 의해 제공된다. 대안적으로, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 서열들은 또 다른 비-바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터에 의해, 예를 들면, Ferrari et al., (1997) Nature Med . 3:1295, 및 미국특허 제6,040,183호 및 제6,093,570호에 기재된 바와 같이 효율적인 AAV 생성을 위해 요구되는 헬퍼 유전자 모두를 운반하는 비-감염성 아데노바이러스 미니플라스미드로서 제공될 수 있다.
또한, 헬퍼 바이러스 기능이 염색체에 통합되거나 안정한 염색체외 요소(extrachromosomal element)로 유지된 헬퍼 유전자를 갖는 패키징 세포에 의해 제공될 수 있다. 대표적인 구체예에서, 헬퍼 바이러스 서열은 AAV 비리온 내에 패키징될 수 없고, 예를 들면, AAV ITR에 의해 플랭킹되지 않는다.
당업자는 단일 헬퍼 구조체 상에 AAV 복제 및 캡시드 서열과 헬퍼 바이러스 서열 (예를 들면, 아데노바이러스 서열)을 제공하는 것이 유리할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이 헬퍼 구조체는 비-바이러스 구조체 또는 바이러스 구조체일 수 있으나, 선택적으로, AAV rep/cap 유전자를 포함하는 하이브리드 아데노바이러스 또는 하이브리드 헤르페스바이러스이다.
하나의 특정한 구체예에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 제공된다. 이 벡터는 rAAV 주형을 더 포함한다. AAV rep/cap 서열 및/또는 rAAV 주형이 아데노바이러스의 결실된 영역 (예를 들면, E1a 또는 E3 영역)에 삽입될 수 있다.
또 다른 구체예에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 공급된다. rAAV 주형은 플라스미드 주형으로서 제공된다.
또 다른 예시적 구체예에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 제공되고, rAAV 주형은 프로바이러스(provirus)로서 세포 내에 통합된다. 대안적으로, rAAV 주형은 염색체외 요소(extrachromosomal element)(예를 들면, "EBV 기반 핵 에피좀(EBV based nuclear episome)", Margolski, (1992) Curr . Top. Microbiol . Immun . 158:67 참조)로서 세포 내에 유지되는 EBV 벡터에 의해 제공된다.
추가적인 예시적 구체예에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼에 의해 제공된다. rAAV 주형은 별개의 복제성 바이러스 벡터(replicating viral vector)로서 제공된다. 예를 들면, rAAV 주형은 rAAV 입자 또는 제2 재조합 아데노바이러스 입자로서 제공될 수 있다.
전술된 방법에 따르면, 하이브리드 아데노바이러스 벡터는 일반적으로 아데노바이러스 복제 및 패키징을 위해 충분한 아데노바이러스 5' 및 3' 시스(cis) 서열(즉, 아데노바이러스 말단 반복서열 및 PAC 서열)을 포함한다. AAV rep/cap 서열 및, 존재하는 경우, AAV 주형이 아데노바이러스 백본에 내재되고(embedded) 5' 및 3' cis 서열에 의해 플랭킹되어, 이러한 서열들이 아데노바이러스 캡시드 내로 패키징될 수 있다. 전술된 바와 같이, 대표적인 구체예에서, 아데노바이러스 헬퍼 서열 및 AAV rep/cap 서열은 AAV 패키징 서열(예를 들면, AAV ITR)에 의해 플랭킹되지 않아서, 이러한 서열들은 AAV 비리온 내로 패키징되지 않는다.
헤르페스바이러스도 AAV 패키징 방법에서 헬퍼 바이러스로 이용될 수 있다. AAV rep 단백질을 코딩하는 하이브리드 헤르페스바이러스는 보다 확장가능한(scalable) AAV 벡터 제조 계획(scheme)을 유리하게 촉진할 수 있다. AAV-2 rep 및 cap 유전자를 발현하는 하이브리드 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 I(HSV-1)이 개시되었다(Conway et al., (1999) Gene Therapy 6:986 및 WO 00/17377, 이들의 개시는 전체로 본 명세서에 포함됨).
추가적인 대안으로서, 본 발명의 바이러스 벡터는 Urabe et al., (2002) Human Gene Therapy 13:1935-43에 기술된 바와 같이 rep/cap 유전자 및 rAAV 주형을 전달하는 바큘로바이러스 벡터를 이용하여 곤충 세포에서 생산될 수 있다.
AAV를 제조하는 다른 방법들은 안정적으로 형질전환된 패키징 세포를 이용한다 (예를 들면, 미국특허 제5,658,785호 참조).
오염 헬퍼 바이러스를 포함하지 않는 AAV 벡터 스톡이 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, AAV와 헬퍼 바이러스는 크기에 근거하여 용이하게 구별될 수 있다. AAV는 또한 헤파린 기질에 대한 친화도에 근거하여 헬퍼 바이러스로부터 분리될 수 있다 (Zolotukhin et al., (1999) Gene Therapy 6:973). 대표적인 구체예에서, 오염 헬퍼 바이러스가 복제 적격(replication competent)이 되지 않도록, 결실된 복제-결함 헬퍼 바이러스가 사용된다. 추가적인 대안으로서, AAV 바이러스의 패키징을 매개하기 위해 초기(early) 유전자 발현만이 요구되므로, 후기(late) 유전자 발현이 결핍된 아데노바이러스 헬퍼가 이용될 수 있다. 후기 유전자 발현이 결함인 아데노바이러스 돌연변이체가 당해 기술 분야에서 알려져 있다(예를 들면, ts100K 및 ts149 아데노바이러스 돌연변이체).
본 발명의 패키징 방법은 바이러스 입자들의 고 역가 스톡(high titer stock)을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 특정한 구체예에서, 바이러스 스톡은 약 105 tu(transducing units)/ml 이상, 약 106 tu/ml 이상, 약 107 tu/ml 이상, 약 108 tu/ml 이상, 약 109 tu/ml 이상, 또는 약 1010 tu/ml 이상의 역가를 갖는다.
신규한 캡시드 단백질 및 캡시드 구조는 항체를 유도하는데(raising) 있어서, 예를 들면, 진단 또는 치료 용도를 위한 항체, 또는 연구 시약으로서 항체를 유도하는 데 있어서 유용하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 신규한 캡시드 단백질 및 캡시드에 대한 항체를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체(antibody or antibodies)"는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 포함한, 모든 종류의 면역글로불린을 의미한다. 항체는 단일클론성이거나 다중클론성일 수 있고, (예를 들면) 마우스, 랫트, 토끼, 말, 염소, 양, 또는 인간을 포함한 임의의 기원의 종의 항체일 수 있거나, 또는 키메라 항체일 수 있다. Walker et al., Mol . Immunol. 26, 403-11 (1989)를 참조한다. 항체는 재조합 단일클론 항체일 수 있고, 예를 들면, 미국특허 제4,474,893호 또는 미국특허 제4,816,567호에 개시된 방법에 따라 제조된 재조합 단일클론 항체일 수 있다. 항체는 또한, 화학적으로 제조될 수 있고, 예를 들면, 미국특허 제4,676,980호에 개시된 방법에 따라, 화학적으로 제조될 수 있다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 항체 단편은 예를 들면, Fab, F(ab')2, 및 Fc 단편, 및 IgG가 아닌 항체들로부터 수득된 상응하는 단편을 포함한다. 그러한 단편들은 공지된 기법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, F(ab´)2 단편은 항체 분자의 펩신 분해(pepsin digestion)에 의해 제조될 수 있고, Fab 단편은 F(ab´)2 단편의 디술피드 브릿지(disulfide bridge)를 환원시키는 것에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 원하는 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 위해 Fab 발현 라이브러리가 구축될 수 있다 (Huse et al., (1989) Science 254, 1275-1281).
다중클론 항체는 공지된 절차에 따라, 적합한 동물(예를 들면, 토끼, 염소, 등)을 표적에 대한 단일클론 항체가 결합하는 항원으로 면역화시키고, 상기 동물로부터 면역 혈청을 수집하고, 상기 면역 혈청으로부터 다중클론 항체를 분리하는 것에 의해 제조될 수 있다.
단일클론 항체는 Kohler and Milstein, (1975) Nature 265, 495-97의 기법에 따라 하이브리도마 세포주로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 적합한 항원을 포함하는 용액을 마우스에 주사하고, 충분한 시간 후에, 상기 마우스를 희생시키고 비장 세포를 수득할 수 있다. 그 후, 비장 세포를 골수종 세포 또는 림프종 세포와, 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜의 존재 하에 융합시키는 것에 의해 불멸화시켜서, 하이브리도마 세포를 제조한다. 그 후, 하이브리도마 세포를 적절한 배지에서 증식시키고, 원하는 특이성을 갖는 단일클론 항체에 대해 상층액을 스크리닝한다. 당업자에게 알려진 재조합 기법에 의해 대장균에서 단일클론 Fab 단편을 제조할 수 있다. 예를 들면, W. Huse, (1989) Science 246, 1275-81 참조.
표적 폴리펩티드에 특이적인 항체를 당해 기술 분야에서 공지된 파아지 디스플레이(phage display) 기법에 의해 수득할 수 있다.
원하는 특이성을 갖는 항체를 확인하는 스크리닝을 위해 다양한 면역분석법(immunoassay)이 이용될 수 있다. 확립된 특이성을 갖는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체를 이용한 경쟁적 결합 또는 면역방사측정법(immunoradiometric assay)을 위한 다수의 프로토콜이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 그러한 면역분석법은 일반적으로 항원과 그의 특이적 항체 간의 복합체 형성(예를 들면, 항원/항체 복합체 형성)의 측정을 포함한다. 2개의 비-간섭성 에피토프(non-interfering epitopes)를 이용한, 2-부위, 단일클론-기반 면역분석법(two-site, monoclonal-based immunoassay) 및 경쟁적 결합 분석법이 이용될 수 있다.
공지된 기법에 따라, 항체를 고체 지지체(예를 들면, 라텍스 또는 폴리스티렌과 같은 재료로 제조된 비드(bead), 플레이트, 슬라이드, 또는 웰)에 접합시킬 수 있다. 항체는 또한 공지된 기법에 따라, 검출가능한 그룹, 예를 들면, 방사성 표지(예를 들면, 35S, 125I, 131I), 효소 표지(예를 들면, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 및 형광 표지(예를 들면, 플루오레신)에 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 본 발명의 방법에서 항체/항원 복합체의 형성의 결정은 검출에 의해, 예를 들면, 당해 기술 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 침전, 응집(agglutination), 응결(flocculation), 방사성(radioactivity), 발색 또는 변색(color development or change), 형광, 발광, 등의 검출에 의해 이루어질 수 있다.
III. 합성 AAV 캡시드를 이용하는 방법 .
본 발명은 또한 다른 기관으로의 전달을 최소화하면서, 이종 뉴클레오티드 서열을 간으로 전달하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이러스 벡터는 예를 들면, 인 비트로에서 폴리펩티드 또는 핵산을 생성하기 위해, 또는 엑스 비보(ex vivo) 유전자 요법을 위해 목적 뉴클레오티드 서열을 인 비트로에서 간 세포로 전달하기 위해 이용될 수 있다. 벡터는 또한, 예를 들면, 치료적 또는 면역원성 폴리펩티드 또는 핵산을 발현시키기 위해, 필요로 하는 개체로 뉴클레오티드 서열을 전달하는 방법에서 유용하다. 이 방식으로, 폴리펩티드 또는 핵산이, 따라서 개체에서 인 비보로 생산될 수 있다. 개체는 특정 폴리펩티드의 결핍을 갖거나, 개체에서 특정 폴리펩티드 또는 핵산의 생산이 치료 방법으로서 또는 달리(otherwise), 및 하기에서 더 설명하는 바와 같이 치료적 효과를 부여할 수 있기 때문에 상기 개체는 상기 폴리펩티드 또는 핵산을 필요로 할 수 있다.
특정한 구체예에서, 벡터는 개체에게 전반적으로 유용한 효과를 제공하는 폴리펩티드 또는 핵산을 발현시키기에 유용하다. 다른 구체예에서, 벡터는 간에 있는 세포(예를 들면, 간세포)에 유용한 효과를 제공하는 폴리펩티드 또는 핵산을 발현시키기에 유용하다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 간세포에 목적 핵산을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 간세포를 본 발명의 AAV 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물 개체에서 간세포에 목적 핵산을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 포유동물 개체에게 본 발명의 AAV 입자 또는 약제학적 제형의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 그에 의해 상기 포유동물 개체 중 간세포에 목적 핵산을 전달하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 필요로 하는 포유동물 개체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 질환은 상기 개체의 간에서 산물을 발현시키는 것에 의해 치료가능하고, 상기 방법은 상기 개체에게 본 발명의 AAV 입자의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 산물이 발현되어, 상기 질환을 치료하는 것인 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명의 바이러스 벡터는 유전자 발현과 관련된 질환과 연관된 증상을 치료 또는 개선하는 생물학적 효과를 갖는 외래 핵산을 전달하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 치료 폴리펩티드를 전달하는 것이 유용한 질환 상태를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 예시적 질환 상태는 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 낭포성 섬유증 (낭포성 섬유증 막관통 조절자 단백질(cystic fibrosis transmembrane regulator protein)) 및 폐의 기타 질환, A형 혈우병 (인자 VIII), B형 혈우병 (인자 IX), 탈라세미아 (β-글로빈), 빈혈 (에리트로포이에틴) 및 기타 혈액 질환, 알츠하이머병 (GDF; 네프릴리신(neprilysin)), 다발성 경화증 (β-인터페론), 파킨슨병 (GDNF(glial-cell line derived neurotrophic factor)), 헌팅톤병 (반복서열(repeat)을 제거하기 위한 siRNA 또는 shRNA와 같은 RNAi, 안티센스 RNA 또는 microRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 억제성(inhibitory) RNA), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 뇌전증 (갈라닌(galanin), 신경영양 인자(neurotrophic factors)), 및 기타 신경 질환, 암 (엔도스타틴, 안지오스타틴, TRAIL, FAS-리간드, 인터페론을 포함한 사이토카인; VEGF, 다제 내성 유전자 산물 또는 암 면역원(cancer immunogen)에 대한 억제성 RNA를 포함한, RNAi(예를 들면, siRNA 또는 shRNA), 안티센스 RNA, 및 microRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 억제성 RNA), 당뇨병 (인슐린, PGC-α1, GLP-1, 마이오스타틴 프로-펩티드, 글루코오스 트랜스포터(glucose transporter) 4), 듀센(Duchenne) 및 베커(Becker)를 포함한 근 이영양증(예를 들면, 디스트로핀, 미니-디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 인슐린-유사 성장 인자 I(insulin-like growth factor I), 사르코글리칸(sarcoglycan) [예를 들면, α, β, γ], 마이오스타틴 또는 마이오스타틴 프로펩티드, 라미닌-알파2(laminin-alpha2), 후쿠틴-관련 단백질(Fukutin-related protein), 우성 음성 마이오스타틴(dominant negative myostatin), 폴리스타틴(follistatin), 액티빈 타입 II 가용성 수용체(activin type II soluble receptor), 항염증성 폴리펩티드, 예를 들면, Ikappa B 우성 돌연변이체, 사르코스판(sarcospan), 유트로핀(utrophin), 미니-유트로핀에 대한 억제성 RNA [예를 들면, RNAi, 안티센스 RNA 또는 microRNA], 엑손 스킵핑(exon skipping)을 유도하는 디스트로핀 유전자 중 스플라이스 연접(splice junction)에 대한 억제성 RNA [예를 들면, RNAi, 안티센스 RNA 또는 microRNA] [예를 들면, WO/2003/095647 참조], 엑손 스킵핑을 유도하는 U7 snRNA에 대한 억제성 RNA (예를 들면, RNAi, 안티센스 RNA 또는 micro RNA] [예를 들면, WO/2006/021724 참조], 및 마이오스타틴 또는 마이오스타틴 프로펩티드에 대한 항체 또는 항체 단편), 고셔병(Gaucher disease) (글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase)), 헐러병(Hurler's disease) (α-L-이듀로니다아제(iduronidase)), 아데노신 데아미나아제 결핍(adenosine deaminase deficiency) (아데노신 데아미나아제), 글리코겐 축적 질환(glycogen storage diseases)(예를 들면, 파브리병(Fabry disease) [α-갈락토시다아제] 및 폼페병(Pompe disease) [리소좀 산성 α-글루코시다아제(lysosomal acid α-glucosidase)]) 및 기타 리소좀 축적 장애 및 글리코겐 축적 장애를 포함한 기타 대사 장애, 선천성 폐기종 (α1-안티트립신), 레쉬-니한 증후군(Lesch-Nyhan Syndrome)(하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제), 니만-피크병(Niemann-Pick disease) (스핑고미엘리나아제), 단풍시럽뇨증(Maple Syrup Urine Disease)(분지쇄 케토산 데히드로게나아제), 망막 퇴행 질환(retinal degenerative diseases)(및 기타 눈 및 망막의 질환; 예를 들면, 황반변성을 위한 PDGF, 엔도스타틴 및/또는 안지오스타틴), 뇌(파킨슨병 [GDNF], 성상세포종 [엔도스타틴, 안지오스타틴 및/또는 VEGF에 대한 RNAi], 교모세포종 [엔도스타틴, 안지오스타틴 및/또는 VEGF에 대한 RNAi] 포함), 간 (B형 간염 및/또는 C형 간염 유전자에 대한 siRNA 또는 shRNA와 같은 RNAi, microRNA, 또는 안티센스 RNA), 신장, 심부전 또는 말초동맥질환(PAD)을 포함한 심장(예를 들면, 단백질 포스파타아제 억제제 I [I-1], 포스포람반, serca2a(sarcoplasmic endoreticulum Ca2 +-ATPase], 포스포람반 유전자를 조절하는 징크 핑거 단백질(zinc finger proteins), Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, ECF-SOD, 칼리크레인, 티모신-β4, HIF(hypoxia-inducible transcription factor), βarkct, β2-아드레날린성 수용체, βARK(β2-adrenergic receptor kinase), PI3 키나아제(phosphoinositide-3 kinase), 칼사르신(calsarcin), 혈관형성 인자(angiogenic factor), S100A1, 파브알부민(parvalbumin), 아데닐릴 시클라아제 타입 6(adenylyl cyclase type 6), 절단된 항시적 활성 bARKct(truncated constitutively active bARKct)와 같은 G-단백질 결합 수용체 키나아제 타입 2 넉다운을 가져오는 분자, 포스포람반에 대한 억제성 RNA [예를 들면, RNAi, 안티센스 RNA 또는 microRNA]; 포스포람반 S16E와 같은 포스포람반 억제성 또는 우성-음성 분자, 등을 전달하는 것에 의해)과 같은 같은 실질 기관(solid organs)의 질환, 관절염 (인슐린-유사 성장 인자(IGF)), 관절 장애 (인슐린-유사 성장 인자), 내막 과증식(intimal hyperplasia) (예를 들면, enos, inos를 전달하는 것에 의해), 심장 이식의 생존율 개선 (수퍼옥사이드 디스뮤타아제), AIDS (가용성 CD4), 근육 위축(muscle wasting) (IGF-I(insulin-like growth factor I), 마이오스타틴 프로-펩티드, 항-아폽토시스 인자(anti-apoptotic factor), 폴리스타틴(follistatin)), 하지 허혈(limb ischemia) (VEGF, FGF, PGC-1α, EC-SOD, HIF), 신장 결함(kidney deficiency)(에리트로포이에틴), 빈혈(에리트로포이에틴), 관절염(항-염증 인자, 예를 들면, IRAP 및 TNFα 가용성 수용체), 간염 (α-인터페론), LDL 수용체 결핍 (LDL 수용체), 고암모니아혈증 (오르니틴 트랜스카르바밀라아제), SCA1, SCA2 및 SCA3을 포함한 척수소뇌성 실조증(spinal cerebral ataxia), 페닐케톤뇨증 (페닐알라닌 히드록실라아제), 자가면역 질환, 등. 본 발명은 또한 이식의 성공률을 높이고 및/또는 기관 이식 또는 보조 요법(adjunct therapies)의 부정적 부작용을 감소시키기 위해 기관 이식 후에 이용될 수 있다(예를 들면, 사이토카인 생산을 차단하는 면역억제제 또는 억제성 핵산을 투여하는 것에 의해). 또 다른 예로서, 골 형성 단백질(bone morphogenic protein)(RANKL 및/또는 VEGF 포함)이 예를 들면, 암 환자에서 골절(break) 또는 수술적 제거 후에, 동종골 이식(bone allograft)과 함께, 투여될 수 있다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 대표적인 리소좀 축적 질환은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 헐러 증후군(Hurler's Syndrome) (MPS IH), 사이에 증후군(Scheie's Syndrome) (MPS IS), 및 헐러-사이에 증후군(Hurler-Scheie Syndrome)(MPS IH/S) (α-L-이듀로니다아제); 헌터 증후군(Hunter's Syndrome) (MPS II) (이듀로네이트 술페이트 술파타아제(iduronate sulfate sulfatase)); 산필리포 A 증후군(Sanfilippo A Syndrome) (MPS IIIA) (헤파란-S-술페이트 술파미니다아제), 산필리포 B 증후군 (MPS IIIB) (N-아세틸-D-글루코사미니다아제), 산필리포 C 증후군 (MPS IIIC) (아세틸-CoA-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라아제), 산필리포 D 증후군 (MPS IIID) (N-아세틸-글루코사미닌-6-술페이트 술파타아제); 모르키오(Morquio) A 질환 (MPS IVA) (갈락토사민-6-술페이트 술파타아제), 모르키오 B 질환 (MPS IV B) (β-갈락토시다아제 ); 마로토-라미병(Maroteaux-lmay disease) (MPS VI) (아릴술파타아제 B); 슬라이 증후군(Sly Syndrome) (MPS VII) (β-글루큐로니다아제); 히알루로니다아제 결핍 (MPS IX) (히알루로니다아제); 시알산증(sialidosis) (뮤코리피드증(mucolipidosis) I), 뮤코리피드증 II (I-세포 질환) (N-아세틸글루코사미닐-1-포스포트랜스퍼라아제 촉매 서브유닛), 뮤코리피드증 III (가성-헐러 다발성 이영양증(pseudo-Hurler polydystrophy) (N-아세틸글루코사미닐-1-포스포트랜스퍼라아제; 타입 IIIA [촉매 서브유닛] 및 타입 IIIC [기질 인식 서브유닛]); GM1 강글리오시드증(gangliosidosis) (강글리오시드 β-갈락토시다아제), GM2 강글리오시드증 타입 I (테이-삭스병(Tay-Sachs disease)) (β-헥사미니다아제 A), GM2 강글리오시드증 타입 II (샌드호프병(Sandhoff's disease)) (β-헥소스아미니다아제 B); 니만피크병(타입 A 및 B) (스핑고미엘린 분해효소); 고셔병 (글루코세레브로시다아제); 파버병(Farber's disease) (세라미니다아제); 파브리병 (α-갈락토시다아제 A); 크라베병(Krabbe's disease) (갈락토실세라미드(galactosylceramide) β-갈락토시다아제); 이염성 백질 이영양증(metachromatic leukodystrophy) (아릴술파타아제 A); 월만병(Wolman's disease)을 포함한 리소좀 산성 리파아제 결핍증(lysosomal acid lipase deficiency)(리소좀 산성 리파아제); 바텐병(Batten disease) (소아 신경 세로이드 리포푸신증(juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis)) (리소좀 막-관통 CLN3 단백질), 시알산증(sialidosis) (뉴라미니다아제 1); 갈락토시알산증(galactosialidosis) (골드버그 증후군(Goldberg's syndrome)) (보호성 단백질/카텝신(cathepsin) A); α-만노오스 축적증(mannosidosis) (α-D-만노시다아제); β-만노오스 축적증 (β-D-만노시다아제); 푸코오스 축적증(fucosidosis) (α-D-푸코시다아제); 아스파틸글루코사민뇨증(aspartylglucosaminuria) (N-아스파틸글루코사미니다아제); 및 시알루리아(sialuria) (Na 포스페이트 코-트랜스포터(cotransporter)).
본 발명에 따라 치료될 수 있는 대표적인 글리코겐 축적 질환은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 타입 Ia GSD (폰기르케병(von Gierke disease)) (글루코오스-6-포스파타아제), 타입 Ib GSD (글루코오스-6-포스페이트 트랜스로카아제(glucose-6-phosphate translocase)), 타입 Ic GSD (마이크로좀 포스페이트 또는 피로포스페이트 수송체), 타입 Id GSD (마이크로좀 글루코오스 수송체), 폼페병 또는 유아 타입 IIa GSD (리소좀 산성 α-글루코시다아제) 및 타입 IIb (Danon) (리소좀 막 단백질(lysosomal membrane protein)-2)를 포함한 타입 II GSD, 타입 IIIa 및 IIIb GSD (탈분지(Debrancher) 효소; 아밀로글루코시다아제 및 올리고글루카노트랜스퍼라아제(oligoglucanotransferase)), 타입 IV GSD (앤더슨병(Andersen's disease)) (분지 효소(branching enzyme)), 타입 V GSD (맥아들병(McArdle disease)) (근육 포스포릴라아제), 타입 VI GSD (허스병(Hers' disease)) (간 포스포릴라아제), 타입 VII GSD (타루이병(Tarui's disease)) (포스포프럭토키나아제), GSD 타입 VIII/IXa (X-연관(X-linked) 포스포릴라아제 키나아제), GSD 타입 IXb (간 및 근육 포스포릴라아제 키나아제), GSD 타입 IXc (간 포스포릴라아제 키나아제), GSD 타입 IXd (근육 포스포릴라아제 키나아제), GSD O (글리코겐 신타아제), 판코니-비켈 증후군(Fanconi-Bickel syndrome)(글루코오스 수송체(glucose transporter)-2), 포스포글루코이소머라아제(phosphoglucoisomerase) 결핍증, 근육 포스포글리세레이트 키나아제 결핍증, 포스포글리세레이트 뮤타아제 결핍증, 프럭토오스 1,6-디포스파타아제 결핍증, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 결핍증, 및 락테이트 데히드로게나아제 결핍증.
유전자 전달은 질병 상태의 이해 및 질병 상태에 대한 치료법의 제공에 있어서 상당한 잠재적 용도를 갖는다. 결함 유전자가 알려져 있고 클로닝된 것인 다수의 유전성 질환이 있다. 일반적으로, 전술된 질병 상태는 2개의 부류(class)로 분류된다: 일반적으로 열성 형태로 유전되는, 결핍 상태(deficiency states), 통상적으로 효소의 결핍 상태, 및 조절 단백질 또는 구조 단백질을 포함할 수 있고, 일반적으로 우성 형태로 유전되는, 불균형 상태(unbalanced states). 결핍 상태 질환의 경우, 유전자 전달이 대체 요법을 위해 영향받은 조직 내로 정상 유전자를 도입하고, RNAi (예를 들면, siRNA 또는 shRNA), microRNA 또는 안티센스 RNA와 같은 억제성 RNA를 이용하여 질병에 대한 동물 모델을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 불균형 질환 상태의 경우, 유전자 전달이 모델 시스템에 질병 시스템을 생성하기 위해 이용될 수 있고, 상기 모델 시스템은 질병 상태를 제어하기 위한 노력에서 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 바이러스 벡터는 유전성 질환의 치료를 가능하게 한다. 본 명세서에서 사용된, 질병 상태는 질병을 유발하거나 또는 질병을 보다 심각하게 하는 결핍이나 불균형을 부분적으로 또는 완전히 제거하는 것에 치료된다. 돌연변이를 유발하거나 또는 결함을 교정하기 위한 핵산 서열의 부위-특이적 재조합(site-specific recombination)의 이용이 또한 가능하다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터는 또한 인 비트로 또는 인 비보에서 세포에 안티센스 핵산 또는 억제성 RNA (예를 들면, microRNA 또는 RNAi, 예를 들면, siRNA 또는 shRNA)를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 표적 세포에서 억제성 RNA의 발현은 상기 세포에 의한 특정 단백질의 발현을 감소시킨다. 따라서, 그를 필요로 하는 개체에서 특정 단백질의 발현을 감소시키기 위해 억제성 RNA가 투여될 수 있다. 억제성 RNA는 또한 세포 생리를 조절하기 위해, 예를 들면, 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하기 위해 인 비트로에서 세포에 투여될 수 있다.
추가적인 양태로서, 본 발명의 바이러스 벡터는 개체에서 면역 반응을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 이 구체예에 따르면, 면역원을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터가 개체에게 투여될 수 있고, 능동(active) 면역 반응(선택적으로, 보호(protective) 면역 반응)이 상기 개체에 의해 상기 면역원에 대해 일어난다. 면역원은 앞서 기술된 바와 같다.
대안적으로, 바이러스 벡터가 엑스 비보로 세포에 투여될 수 있고, 변경된(altered) 세포가 상기 개체에게 투여된다. 이종 핵산을 세포에 도입하고, 상기 세포를 상기 개체에게 투여하고, 면역원을 코딩하는 이종 핵산이 선택적으로 발현되어 상기 개체에서 상기 면역원에 대한 면역 반응을 유도한다. 특정한 구체예에서, 상기 세포는 항원-제시 세포(예를 들면, 수지상 세포)이다.
"능동 면역 반응(active immune response)" 또는 "능동 면역(active immunity)"은 면역원과의 접촉(encounter) 후 숙주 조직 및 세포의 참여(participation)를 특징으로 한다. 이는 림프세망 조직(lymphoreticular tissue)에서 면역적격(immunocompetent) 세포의 분화 및 증식을 포함하고, 이는 항체의 합성 또는 세포-매개 반응성의 발생, 또는 둘 모두를 가져온다. Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology : Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, in IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). 달리 말하면, 능동 면역 반응은 감염이나 백신 접종에 의해 면역원으로의 노출 후에 숙주에 의해 발생된다. 능동 면역은, 능동적으로 면역화된 숙주로부터 비-면역 숙주로의 미리 형성된 물질(항체, 전달 인자(transfer factor), 흉선 이식물(thymic graft), 인터루킨-2)의 전달"을 통해 획득되는, 수동 면역과 대비될 수 있다. Id.
본 명세서에서 사용된, "보호(protective)" 면역 반응 또는 "보호" 면역은 면역 반응이 질병의 발병(incidence)을 예방하거나 감소시키는 점에서 개체에 상당한 유익을 제공한다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 보호 면역 반응 또는 보호 면역은 질병, 특히, 암 또는 종양의 치료에서 (예를 들면, 암 또는 종양의 퇴화(regression)을 유발하고, 및/또는 전이를 예방하고, 및/또는 전이성 결정(metastatic nodule)의 성장을 예방하는 것에 의해) 유용할 수 있다. 치료의 유익이 그의 불리보다 더 큰 한, 보호 효과는 완전하거나 또는 부분적일 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터는 암세포 항원(또는 면역학적으로 유사한 분자) 또는 암세포에 대한 면역 반응을 생성하는 기타 면역원을 발현하는 바이러스 벡터의 투여에 의해 암 면역요법을 위해 투여될 수 있다. 설명하면, 암세포 항원을 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터를, 예를 들면, 암 환자를 치료하기 위해, 투여하는 것에 의해 개체에서 암세포 항원에 대해 면역 반응이 생성될 수 있다. 바이러스 벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 인 비보로 개체에 투여될 수 있거나 또는 엑스 비보 방법을 이용하여 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "암(cancer)"은 종양-형성 암을 포함한다. 마찬가지로, 용어 "암 조직(cancerous tissue)"은 종양을 포함한다. "암세포 항원(cancer cell antigen)"은 종양 항원을 포함한다.
용어 "암"은 당해 기술 분야에서 그의 이해되는 의미를 갖고, 예를 들면, 신체의 먼 부위까지 확산될(즉, 전이될) 가능성을 갖는 조직의 비제어 증식을 의미한다. 대표적인 암은 백혈병, 림프종 (예를 들면, 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종), 대장암, 신장암, 간암, 유방암, 폐암, 전립선암, 정소암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 뇌암(예를 들면, 신경교종 및 교모세포종), 골암(bone cancer), 육종, 흑색종, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체예에서, 본 발명은 종양-형성 암을 치료 및/또는 예방하기 위해 실시된다.
용어 "종양(tumor)"은 또한 당해 기술 분야에서, 예를 들면, 다세포 개체 내의 미분화 세포들의 비정상적 덩어리로 이해된다. 종양은 악성이거나 또는 양성일 수 있다. 대표적인 구체예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 악성 종양을 예방하고 치료하기 위해 이용된다.
암세포 항원은 전술되었다. 용어 "암을 치료하는(treating cancer)" 또는 "암의 치료(treatment of cancer)"에 의해, 암의 중증도가 감소되거나 또는 암이 예방되거나 적어도 부분적으로 제거된다는 것을 의도한다. 예를 들면, 구체적인 맥락에서, 이러한 용어들은 암의 전이가 예방되거나 또는 감소되거나 또는 적어도 부분적으로 제거된다는 것을 나타낸다. 추가적인 대표적 구체예에서, 이러한 용어들은 전이성 결절의 증식이 (예를 들면, 원발성 종양의 수술적 제거 후에) 예방되거나 감소되거나 또는 적어도 부분적으로 제거된다는 것을 나타낸다. 용어 "암의 예방(prevention of cancer)" 또는 "암을 예방하는(preventing cancer)"에 의해, 그 방법이 암의 발생 또는 발병을 적어도 부분적으로 제거하거나 또는 감소시킨다는 것을 의도한다. 달리 말하면, 개체에서 암의 발병 또는 진행이 둔화되거나, 제어되거나, 그의 가능성 또는 확률이 감소되거나, 또는 지연될 수 있다.
특정한 구체예에서, 암을 가진 개체로부터 세포를 채취하고(remove) 본 발명에 따른 바이러스 벡터와 접촉시킬 수 있다. 그 후, 변형된 세포를 상기 개체에게 투여하고, 그에 의해 암세포 항원에 대한 면역 반응이 유도된다. 이 방법은 인 비보에서 충분한 면역 반응을 일으킬 수 없는(즉, 강화 항체(enhancing antibody)를 충분한 양으로 생성할 수 없는) 면역약화(immunocompromised) 개체에 특히 유리하게 이용된다.
면역 반응이 면역조절성 사이토카인(예를 들면, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, ω-인터페론, τ-인터페론, 인터루킨-1α, 인터루킨-1β, 인터루킨-2, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-6, 인터루킨-7, 인터루킨-8, 인터루킨-9, 인터루킨-10, 인터루킨-11, 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-14, 인터루킨-18, B 세포 성장 인자, CD40 리간드, 종양 괴사 인자(TNF)-α, 종양 괴사 인자-β, MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1), GMCSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 및 림포톡신)에 의해 증가될 수 있다는 것이 당해 분야에서 알려져 있다. 따라서, 면역조절성 사이토카인 (예를 들면, CTL 유도성 사이토카인)이 바이러스 벡터와 함께 개체에게 투여될 수 있다.
사이토카인은 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 투여될 수 있다. 외생 사이토카인(exogenous cytokine)이 개체에게 투여될 수 있거나, 대안적으로, 사이토카인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 적합한 벡터를 이용하여 개체에게 전달되고, 사이토카인이 인 비보로 생성될 수 있다.
바이러스 벡터는 또한 연구 목적을 위해, 예를 들면, 인 비트로에서 또는 동물에서 간 기능의 연구를 위해, 또는 질병의 동물 모델의 생성 및/또는 연구에서 이용하기 위해 간세포를 표적화하기에 유용하다. 예를 들면, 벡터는 간 손상, 예를 들면, 섬유증 또는 경변의 동물 모델 또는 바이러스 감염(예를 들면, 간염 바이러스)과 같은 간 질환의 동물 모델에서 간세포에 이종 핵산을 전달하기 위해 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 바이러스 벡터는 목적 유전자가 세포 배양 시스템, 또는 대안적으로 형질전환 동물 모델에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현되는 것인 진단 및 스크리닝 방법에서 유용하다. 본 발명은 또한 단백질 생산의 목적으로, 예를 들면, 연구, 산업, 또는 상업적 목적을 위해 핵산을 전달하기 위해 실시될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 바이러스 벡터는 수의학 및 의학적 적용 모두에서 용도를 갖는다. 적절한 개체는 조류 및 포유류를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "조류(avian)"는 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조, 꿩, 앵무새, 소형 앵무새(parakeet)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어 "포유류(mammal)"는 인간, 영장류, 비-인간 영장류(non-human primates)(예를 들면, 원숭이 및 개코원숭이), 소, 양, 염소, 돼지, 말, 고양이, 개, 토끼, 설치류(예를 들면, 랫트, 마우스, 햄스터, 등), 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 인간 개체는 신생아, 유아, 청소년, 및 성인을 포함한다. 선택적으로, 개체는, 예를 들면, 개체가 본 명세서에 기재된 것을 포함한 질병에 대한 위험을 갖거나 또는 갖는 것으로 사료되거나, 또는 본 명세서에 기재된 것들을 포함한 핵산의 전달로부터 유익을 얻을 것이기 때문에, 본 발명의 방법을 "필요로(in need of)" 한다. 추가적인 옵션으로서, 개체는 실험 동물(laboratory animal) 및/또는 질병의 동물 모델일 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체에 본 발명의 바이러스 벡터, 및 선택적으로, 기타 약물(medicinal agent), 약제(pharmaceutical agent), 안정화제, 완충제, 담체, 아쥬반트(adjuvant), 희석제, 등을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 주사의 경우, 담체는 일반적으로 액체일 것이다. 기타 투여 방법의 경우, 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 흡입 투여의 경우, 담체는 호흡가능할(respirable) 것이고, 바람직하게는 고체 또는 액체 미립자(particulate) 형태일 것이다.
"약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 무독성이거나 달리 바람직하지 않지 않은 물질을 의미하고, 즉, 해당 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않으면서 개체에 투여될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태는 인 비트로에서 세포에 뉴클레오티드 서열을 전달하는 방법이다. 바이러스 벡터가 특정 표적 세포에 대해 적합한 표준 형질도입 방법에 따라 적절한 감염 다중도(multiplicity of infection)로 세포에 도입될 수 있다. 투여될 바이러스 벡터 또는 캡시드의 역가(titer)는 표적 세포 종류와 개수, 및 특정한 바이러스 벡터 또는 캡시드에 따라 다를 수 있고, 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특정한 구체예에서, 적어도 약 103 감염 단위(infectious unit), 보다 바람직하게는 적어도 약 105 감염 단위가 세포에 도입된다.
바이러스 벡터가 도입될 수 있는 세포는 임의의 종류일 수 있고, 신경 세포(말초 신경계 및 중추 신경계의 세포, 특히, 뇌 세포, 예를 들면, 뉴런, 희소돌기아교세포(oligodendrocyte), 신경교 세포, 성상 세포), 폐 세포, 눈의 세포(망막 세포, 망막 색소 상피, 및 각막 세포), 상피 세포(예를 들면, 소화관 및 호흡 상피 세포), 골격근 세포(근원세포(myoblast), 근관, 및 근섬유 포함), 횡경막근 세포, 수지상 세포, 췌장 세포(섬(islet) 세포 포함), 간 세포, 위장관의 세포(평활근 세포, 상피 세포 포함), 심장 세포(심근세포 포함), 골 세포(예를 들면, 골수 줄기 세포), 조혈 줄기 세포, 비장 세포, 각질 세포, 섬유아세포, 내피 세포, 전립선 세포, 관절 세포(예를 들면, 연골, 반월판, 활막, 및 골수 포함), 생식 세포, 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, 상기 세포는 전구 세포(progenitor cell)일 수 있다. 추가적인 대안으로서, 상기 세포는 줄기 세포 (예를 들면, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포)일 수 있다. 추가적인 대안으로서, 상기 세포는 암 세포 또는 종양 세포일 수 있다(암 및 종양은 전술된다). 또한, 상기 세포는 전술된 바와 같이, 임의의 기원의 종으로부터 유래될 수 있다.
개체에 변형된 세포를 투여하기 위한 목적으로 바이러스 벡터가 인 비트로에서 세포에 도입될 수 있다. 특정한 구체예에서, 개체로부터 세포를 채취하고, 바이러스 벡터를 그에 도입하고, 그 후, 세포를 개체 내로 다시 복귀시킨다. 엑스 비보 치료를 위해 개체로부터 세포를 채취하고, 뒤이어 개체로 다시 재도입하는 방법이 당해 기술 분야에서 알려져있다(예를 들면, 미국특허 제5,399,346호 참조). 대안적으로, 재조합 바이러스 벡터가 또 다른 개체로부터의 세포로, 배양된 세포로, 또는 다른 적합한 출처로부터의 세포로 도입되고, 상기 세포가 그를 필요로 하는 개체에게 투여된다.
엑스 비보 유전자 요법을 위해 적합한 세포들은 전술된 바와 같다. 개체에게 투여되는 세포의 용량은 개체의 연령, 상태, 및 종, 세포의 종류, 상기 세포에 의해 발현되는 핵산, 투여 방식, 등에 따라 변할 것이다. 통상적으로, 적어도 약 102 내지 약 108개 또는 약 103 내지 약 106개 세포가 약제학적으로 허용가능한 담체 중 용량당 투여될 수 있다. 특정한 구체예에서, 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포가 약제학적 담체와 조합되어 유효량으로 개체에게 투여된다.
일부 구체예에서, 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포들이 전달된(예를 들면, 형질전환 유전자로서 발현되거나, 또는 캡시드에 있는) 폴리펩티드에 대한 면역원성 반응을 유발하기 위해 투여될 수 있다. 통상적으로, 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합된 폴리펩티드의 유효량을 발현하는 세포의 충분한 양(a quantity)이 투여된다. 선택적으로, 용량은 (앞서 정의된 바와 같은) 보호 면역 반응을 생성하기에 충분하다. 부여되는 보호의 정도는 면역원성 폴리펩티드 투여의 유익이 그의 불리를 초과하는 한, 완전하거나 영구적이지 않아도 된다.
본 발명의 추가적 양태는 본 발명의 바이러스 벡터 또는 캡시드를 개체에게 투여하는 방법이다. 특정한 구체예에서, 상기 방법은 동물 개체에게 목적 핵산을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은: 동물 개체에게 본 발명에 따른 바이러스 벡터의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법을 포함한다. 필요로 하는 인간 개체 또는 동물로의 본 발명의 바이러스 벡터의 투여는 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 선택적으로, 바이러스 벡터는 약제학적으로 허용가능한 담체 중 유효량으로 전달된다.
본 발명의 바이러스 벡터는 또한 (예를 들면, 백신으로서) 면역원성 반응을 유발하기 위해 개체에게 투여될 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 백신은 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합된 바이러스의 유효량을 포함한다. 선택적으로, 용량은 (앞서 정의된 바와 같은) 보호 면역 반응을 생성하기에 충분하다. 부여되는 보호의 정도는, 면역원성 폴리펩티드 투여의 유익이 그의 불리를 초과하는 한, 완전하거나 또는 영구적일 필요는 없다. 개체 및 면역원은 전술된 바와 같다.
개체에게 투여되는 바이러스 벡터의 용량은 투여 방식, 치료 대상 질환 또는 상태, 개별적인 개체의 상태, 특정한 바이러스 벡터, 및 전달될 핵산에 따라 결정될 것이고, 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 치료 효과를 달성하기 위한 전형적인 용량은 적어도 약 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018 tu(transducing units) 또는 그 이상, 바람직하게는 약 107 또는 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 또는 1015 tu, 훨씬 더 바람직하게는 약 1012 내지 1014 tu의 바이러스 역가(virus titer)이다.
특정한 구체예에서, 다양한 간격, 예를 들면, 일별, 주별, 월별, 연별, 등의 기간에 걸쳐 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 2회 이상의 투여(예를 들면, 2회, 3회, 4회, 또는 그 이상의 투여)가 이용될 수 있다.
전형적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 국소, 비강내(intranasal), 흡입 (예를 들면, 에어로졸을 통한 흡입), 구강(buccal)(예를 들면, 설하(sublingual)), 질, 척수내(intrathecal), 안내(intraocular), 경피(transdermal), 자궁내(in utero)(또는 난내(in ovo)), 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 피내(intradermal), 근육내(intramuscular)[골격근, 횡경막근 및/또는 심근으로의 투여 포함], 피내, 흉막강내(intrapleural), 뇌내(intracerebral), 및 관절내(intraarticular)), 국소 (예를 들면, 기도 표면을 포함한 피부 및 점막 표면으로의 투여, 및 경피 투여), 림프관내(intro-lymphatic) 투여, 등, 및 조직 또는 기관(예를 들면, 간, 골격근, 심근, 횡경막근, 또는 뇌)으로의 직접 주사를 포함한다. 투여는 또한 종양 (예를 들면, 종양 또는 림프절 내 또는 그 주변)으로 이루어질 수 있다. 주어진 경우에서 가장 적합한 경로는 치료 대상 질환의 속성 및 중증도, 및 사용되는 특정한 벡터의 속성에 의존적일 것이다.
일부 구체예에서, 바이러스 벡터가 직접 간으로 투여된다. 직접 투여는 간세포의 형질도입의 높은 특이성을 가져올 수 있고, 예를 들면, 형질도입된 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상이 간세포이다. 당해 기술 분야에서 공지된 간에 직접적으로 벡터를 투여하는 임의의 방법이 이용될 수 있다. 벡터는 간으로의 직접 주사에 의해, 또는 간으로 공급하는 동맥 또는 정맥으로의 주사, 예를 들면, 문맥내 전달(intraportal delivery)에 의해 도입될 수 있다.
일반적으로, 바이러스 벡터는 액체 제형으로 간의 원하는 영역 또는 구획(compartment)으로의 전신 전달에 의해 직접 주사에 의해 투여될 것이다. 일부 구체예에서, 벡터는 저장소(reservoir) 및/또는 펌프를 통해 전달될 수 있다. 다른 구체예에서, 벡터가 원하는 영역으로의 국소 적용에 의해 또는 에어로졸 제형의 비강내 투여에 의해 제공될 수 있다. 눈 또는 귀로의 투여는 액적(liquid droplet)의 국소 적용에 의해 이루어질 수 있다. 또 다른 대안으로서, 벡터는 고체, 서방형 제형으로서 투여될 수 있다. 파보바이러스 및 AAV 벡터의 제어 방출(controlled release)이 국제 특허출원 공개 WO 01/91803에 의해 기재된다.
이러한 조직들로의 전달은 또한 바이러스 벡터를 포함하는 데포(depot)를 전달하는 것에 의해 달성될 수 있고, 상기 데포는 조직 내에 이식될 수 있거나, 또는 조직이 바이러스 벡터를 포함하는 필름 또는 기타 매트릭스와 접촉될 수 있다. 그러한 이식가능한 매트릭스 또는 기재(substrate)의 예가 미국특허 제7,201,898호에 기재된다.
주사제(injectables)는 통상적인 형태로, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사 전에 액체 중에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태로서, 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 대안적으로, 바이러스를 전신적 방식보다 국소 방식으로, 예를 들면, 데포 또는 지속-방출 제형(sustained-release formulation)으로 투여할 수 있다. 또한, 바이러스 벡터는 수술에 의해 이식가능한 매트릭스, 예를 들면, 골 이식 대체재(bone graft substitute), 봉합재, 스텐트, 등(예를 들면, 미국특허 제7,201,898호에 기재된 것들)에 건조 상태로 전달될 수 있다.
경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 각각 본 발명의 조성물의 소정량(predetermined amount)을 포함하는, 캡슐, 카세(cachet), 로젠지(logenze), 또는 정제와 같은 개별 유닛으로; 분말 또는 과립(granule)으로서; 수성 또는 비-수성 액체 중 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유(oil-in-water) 또는 유중수 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 경구 전달은 본 발명의 바이러스 벡터를 동물의 소화관(gut)에서 소화 효소에 의한 분해를 견딜 수 있는 담체에 복합체화시키는 것에 의해 수행될 수 있다. 그러한 담체의 예는 당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 플라스틱 캡슐(plastic capsule) 또는 정제를 포함한다. 그러한 제형은 제약의 적합한 방법에 의해 제조되고, 상기 방법은 조성물과 적합한 담체(전술된 바와 같은 하나 이상의 보조 성분(accessory ingredient)을 포함할 수 있음)를 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 구체예에 따른 약제학적 조성물은 상기 조성물을 액체 또는 미분된(finely divided) 고체 담체, 또는 둘 모두와 균일하고 긴밀하게 혼합하고, 그 후, 필요한 경우, 결과적으로 수득된 혼합물을 성형하는(shape) 것에 의해 제조된다. 예를 들면, 정제는 선택적으로 하나 이상의 보조 성분들과 함께, 상기 조성물을 포함하는 분말 또는 과립을 압착 또는 조형(mold)하는 것에 의해 제조될 수 있다. 압착 정제(compressed tablet)는 적절한 기계에서 자유-유동형(free-flowing form)인 조성물, 예를 들면, 선택적으로 결합제, 윤활제, 비활성 희석제, 및/또는 계면활성제/분산제와 혼합된, 분말 또는 과립을 압착하는 것에 의해 제조된다. 조형된 정제(molded tablet)는 적절한 기계에서 비활성 액체 결합제로 습윤된 분말 화합물을 조형하는 것에 의해 제조된다.
구강(설하) 투여에 적합한 약제학적 조성물은 가미된 기제(flavored base), 일반적으로 수크로오스 및 아카시아(acacia) 또는 트라가간트(tragacanth) 중 본 발명의 조성물을 포함하는 로젠지; 및 젤라틴과 글리세린 또는 수크로오스와 아카시아와 같은 비활성 기제 중 조성물을 포함하는 향정(pastilles)을 포함한다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 본 발명의 조성물의 멸균 수성 및 비-수성 주사 용액을 포함할 수 있고, 이들 제제는 의도된 수용자(recipient)의 혈액과 선택적으로 등장성이다. 이러한 제제는 항-산화제, 완충제, 정균제(bacteriostat) 및 용질을 포함할 수 있고, 이들은 상기 조성물이 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 한다. 수성 및 비-수성 멸균 현탁액, 용액, 및 에멀젼은 현탁제(suspending agent) 및 증점제를 포함할 수 있다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일(vegetable oil), 및 에틸 올리에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체는 생리식염수(saline) 및 완충된 배지(buffered media)를 포함한, 물, 알코올 용액/수용액, 에멀젼, 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클(parenteral vehicle)은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스(Ringer's dextrose), 덱스트로오스 및 염화나트륨, 젖산 링커 수액(lactated Ringer's), 또는 고정유(fixed oil)를 포함한다. 정맥용 비히클(intravenous vehicles)은 유체(fluid) 및 영양분 보충제(nutrient replenisher), 전해질 보충제(예를 들면, 링거 덱스트로오스에 기반한 것들), 등을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제, 예를 들면, 항미생물제(antimicrobials), 항산화제, 킬레이트제, 및 비활성 기체 등도 존재할 수 있다.
조성물은 단일-용량(unit-dose) 또는 복수-용량 용기, 예를 들면, 밀봉된(sealed) 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들면, 생리 식염수 또는 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조 (동결건조(lyophilized)) 조건으로 보관될 수 있다.
즉석(extemporaneous) 주사 용액 및 현탁액은 전술된 종류의 멸균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 밀봉된 용기 중 단위 투여량 제형(unit dosage form)인 본 발명의 주사가능하고, 안정한, 멸균 조성물이 제공될 수 있다. 상기 조성물은 동결건조물(lyophilizate)의 형태로 제공될 수 있고, 이는 개체로의 주사에 적합한 액체 조성물을 형성하기 위해 적절한 약제학적으로 허용가능한 담체를 이용하여 재구성될 수 있다. 단위 투여량 제형은 약 1 ㎍ 내지 약 10 그램의 본 발명의 조성물일 수 있다. 상기 조성물이 실질적으로 수-불용성인 경우, 생리학적으로 허용가능한, 유화제의 충분한 양이 수성 담체에서 상기 조성물을 유화시키기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 하나의 그러한 유용한 유화제는 포스파티딜 콜린이다.
직장 투여에 적합한 약제학적 조성물은 단위 용량 좌제(unit dose suppository)로서 제공될 수 있다. 이들은 상기 조성물을 하나 이상의 통상적인 고체 담체, 예를 들면, 코코아 버터와 혼합하고, 결과적으로 수득된 혼합물을 성형하는 것에 의해 제조될 수 있다.
피부로의 국소 적용에 적합한 본 발명의 약제학적 조성물은 연고, 크림, 로션, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸, 또는 오일의 형태를 취할 수 있다. 사용될 수 있는 담체는 페트롤리움 젤리(petroleum jelly), 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 알코올, 경피흡수 촉진제(transdermal enhancer), 및 이들 중 둘 이상의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 예를 들면, 국소 전달은 본 발명의 약제학적 조성물을 피부 내로 통과될 수 있는 친유성 시약 (예를 들면, DMSO)과 혼합하는 것에 의해 수행될 수 있다.
경피 투여에 적합한 약제학적 조성물은 연장된 기간 동안 개체의 상피와 밀접한 접촉 상태로 유지되도록 개조된 개별적인 패치(patch)의 형태일 수 있다. 경피 투여에 적합한 조성물은 이온영동법에 의해 전달될 수 있고 (예를 들면, Pharm . Res. 3:318 (1986) 참조) 일반적으로 본 발명의 조성물의 선택적으로 완충된(optionally buffered) 수용액의 형태를 취할 수 있다. 적합한 제형은 시트레이트 또는 비스/트리스 완충액 (pH 6) 또는 에탄올/물을 포함할 수 있고, 0.1 내지 0.2M 활성 성분을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바이러스 벡터는 적절한 수단에 의해, 예를 들면, 개체가 흡입하는, 상기 바이러스 벡터를 포함하는 호흡가능한(respirable) 입자의 에어로졸 현탁액을 투여하는 것에 의해 개체의 폐로 투여될 수 있다. 호흡가능한 입자들은 액체 또는 고체일 수 있다. 바이러스 벡터를 포함하는 액체 입자들의 에어로졸은 적합한 수단에 의해, 예를 들면, 당업자에게 알려진 바와 같이, 가압 에어로졸 분무기(pressure-driven aerosol nebulizer) 또는 초음파 분무기에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제4,501,729호 참조. 바이러스 벡터를 포함하는 고체 입자들의 에어로졸은 약학 분야에서 공지된 기법에 의해, 고체 미립자 약제 에어로졸 발생기(solid particulate medicament aerosol generator)에 의해 생성될 수 있다.
본 발명이 기술되었고, 동일한 발명이 하기 실시예들에서 보다 상세하게 설명될 것이고, 실시예들은 예시 목적으로만 본 명세서에 포함되고, 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
도 1a-1b는 간 유전자 전달 효율에 대한 간-향성 AAV 캡시드 XL12 및 XL32와 AAV9의 인 비보 비교를 보여준다. LacZ 및 GFP 리포터 벡터를 AAV9, AAVXL12, 및 AAVXL32에 패키징했다. 벡터를 정제하고, 적정하고(tittered), 5x1012 vg (vector genomes)/kg 체중의 용량으로 성체 C57B/6 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. 3주 후에, 마우스를 희생시키고 간 박편(thin section)을 LacZ 발현에 대한 X-gal로 염색하거나(도 1a); 또는 GFP 발현에 대해, 직접 간 박편을 배치하고 형광 사진을 촬영했다(도 1b).
도 2는 인간 간암 Huh7 세포주에서 유전자 전달 효율에 대한 간-향성 AAV 캡시드 XL12 및 XL32와 AAV9의 인 비트로 비교를 보여준다. AAV9, XL12, 및 XL32에 패키징된 LacZ 리포터 벡터를 이용하여 1x105 vg/세포 및 1x104 vg/세포의 감염 다중도(moi)로 Huh7 세포에 형질도입시켰다. 3일 후에, LacZ 발현을 위해 X-gal 염색을 수행했다.
도 3a-3d는 인간 일차 간세포 배양물에서 유전자 전달 효율에 대한 간-향성 AAV 캡시드 XL12 및 XL32와 기타 혈청형의 AAV의 인 비트로 비교를 보여준다. GFP 리포터 벡터를 AAVXL12, AAVXL32, 및 다수의 기타 일반적으로 사용되는 혈청형의 캡시드에 패키징시켰다. AAV-GFP 벡터를 이용하여 1x105 vg/세포의 moi로 인간 일차 간세포 배양물을 감염시켰다. 24시간 및 48시간차에 또는 최대 7일 동안 매일 그린 형광 사진촬영을 수행했다. 도 3a. 3명의 공여자로부터의 인간 일차 간세포에서 AAV-GFP 벡터에 의한 감염 후 24시간차 GFP 발현. 도 3b. 48시간차 GFP 발현. 도 3c. 공여자 환자 #4021의 간세포에 대한 감염 후 1 내지 7일차 AAVXL12 및 AAVXL32 GFP 유전자 발현. 도 3d. 공여자 환자 #4073의 간세포에 대한 감염 후 1 내지 7일차 AAVXL12 및 AAVXL32 GFP 유전자 발현. GFP 유전자의 매우 효율적이고 증가된 발현이 관찰되었다.
도 4a-4c는 개의 일차 간세포 배양물에 대한 유전자 전달 효율에 대한 간-향성 AAV 캡시드 XL12 및 XL32와 기타 혈청형의 AAV의 인 비트로 비교를 보여준다. GFP 리포터 벡터를 AAVXL12, AAVXL32, 및 다수의 기타 일반적으로 사용되는 혈청형의 캡시드에 패키징시켰다. AAV-GFP 벡터를 이용하여 1x105 vg/세포의 moi로 개의 일차 간세포 배양물을 감염시켰다. 24시간 및 48시간차에 그린 형광 사진촬영을 수행했다. 도 4a. 저온보존된(cryopreserved) 일차 간세포(개 DBCP01)에서 24시간차 및 48시간차 GFP 발현. 도 4b. 신선한 단리된 일차 간세포(개 DBF24)에서 24시간차 GFP 발현. 도 4c. 신선한 단리된 일차 간세포(개 DBF24)에서 48시간차 GFP 발현. AAV6, AAVXL12 및 AAVXL32 감염 세포에서 GFP 유전자의 매우 효율적이고 증가된 발현이 관찰되었다.
도 5는 성체 붉은털 원숭이(rhesus macaque monkey)의 간에서 정맥내 벡터 전달에 의한 AAVXL32 및 AAV8 형질도입 효율의 비교를 보여준다. 1:8 미만의 혈청 중화 항체 역가를 갖는 3-5세의 성체 수컷 붉은털 원숭이에 정맥내로 AAV 벡터를 주사했다. 1x1012 vg/kg 체중의 용량으로, 2마리의 원숭이에 AAVXL32-CB-GFP를 주사하고, 2마리에 AAV-CB-GFP를 주사했다. AAV 벡터 발현 카세트는 보다 신속하고 보다 효율적인 유전자 발현을 위한 이중-가닥(자기-상보적(self-complementary)이라고도 함) 형태였다. 2주 후에, 원숭이들을 안락사시키고, 동결-박편(cryo-thin-sections) 및 그린 형광 사진촬영을 위해 간 조직을 채취하였다. 일부 GFP 양성 간세포가 화살표로 표시된다.
도 6은 AAVXL32 및 AAVXL32.1 캡시드의 단백질 겔 분석을 보여준다. 고도로 정제된 AAVXL32 및 AAVXL32.1을 SDS-PAGE 겔에 래인당 1x1011개 입자의 농도로 로딩하고 분석하고 은 염색에 의해 시각화시켰다. 화살표는 전형적인 AAV 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 표시한다. 백색 화살표(arrowhead)는 AAVXL32 중 추가적인(extra) 캡시드 단백질 VPX를 나타내고, 이는 CTC의 CTG로의 돌연변이에 의해 생성된 더 약한 개시 코돈으로부터 유래된 것일 수 있다. CTG의 CTC로의 복귀가 AAVXL32.1에서 이 단백질을 없앴다.
실시예 1
AAV 캡시드 유전자 셔플 라이브러리(shuffled library)의 구축
AAV 캡시드 유전자 셔플 라이브러리(AAV capsid gene shuffled library)의 구축을 이전에 개시된 바와 같이 수행했다(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(10):3946 (2009); Yang et al., Meth . Mol . Biol . 709:127 (2011)). AAV 혈청형 1, 2, 3B, 4, 6, 7, 8, 및 9의 캡시드 유전자를 AAV2 ITR(inverted terminal repeats) 및 AAV2 Rep 유전자를 포함하는 동일한 벡터 pXX-UF1-AAV 내로 클로닝하였다. ITR, AAV2 Rep 및 8종의 상이한 Cap 유전자 각각을 포함하는 이 플라스미드들을 순서대로 pXX-UF1-AAVn으로 명명하였다. 캡시드 유전자를 프라이머 CAP-5' 5'-CCC-AAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA-3' (서열번호 7) 및 CAP-3' 5'-ATAAGAAT-GCGGCCGC-AGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA-3' (서열번호 8)에 의해 증폭시키고, DNA 셔플링을 위해 동일한 비율로 혼합했다(Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747 (1994)). 요약하면, 4 ㎍의 DNA 주형을 0.04 U의 DNase I으로 15℃에서 단시간(briefly) 처리(digest)하고, pfu DNA 폴리머라아제를 이용하여 캡시드 유전자의 재조립을 위해 300-500 및 500-1000 bp 단편들을 아가로오스 겔로부터 정제하였다. 재조립된 캡시드 유전자를 다시 CAP5'/CAP3' 프라이머를 이용하여 pfu DNA 폴리머라아제로 증폭시키고, HindIII / NotI으로 처리하고, AAV2 Rep 및 Cap 유전자를 플랭킹하는 AAV2 ITR을 포함하는, HindIII / NotI-처리 pXX-UF1-AAV 벡터에 라이게이션시켰다. HindIII / Not I 처리는 간-농축(liver-enriched) Cap 유전자의 PCR 증폭 단편들의 교체(replacement)를 위해 AAV2 캡시드 유전자를 효과적으로 제거했다. PCR 프로그램은 94℃에서 5분; 94℃에서 1분, 핫 스타트(hot start)를 위한 75℃에서 5분, 60℃에서 1분, 72℃에서 4.5분; 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 4.5분으로 이루어진 29회의 사이클; 72℃에서 10분이었다. 재구축된 플라스미드를 E. coli DH10B 세포에 형질감염시키고 재조합 빈도 및 패키징 생존력(packaging viability)을 결정하기 위한 제한효소 분석을 위해 다수의 클론을 무작위로 채취했다. 결과적으로 수득된 ITR-함유 감염성 AAV 플라스미드 라이브러리를 이용하여 자가-패키징(self-packaging) AAV 바이러스 입자 라이브러리를 생성했다.
실시예 2
마우스 간에서 인 비보 농축(in vivo enrichment)
간을 표적으로 하는 AAV 변이체의 인 비보 스크리닝을 위해, 1x1011 vg (vector genomes)/마우스의 키메라 AAV 라이브러리를 꼬리 정맥을 통해 성체 C57BL/6J 마우스에 투여했다. 2주 후에, 페놀/클로로포름 추출을 이용한 게놈 DNA 단리를 위해 간 및 기타 조직을 포함한 마우스 조직들을 수집하였다. 캡시드 유전자에 대한 공통 프라이머(common primer)를 이용하여 전체 간 DNA(total liver DNA)의 PCR 증폭 후에, PCR 산물들을 AAV2 ITR 및 Rep 유전자를 포함하는 AAV 플라스미드 백본 내로 재클로닝하였다. 따라서, 캡시드 유전자 PCR 산물 및 pXX-UF1-AAV 벡터를 클로닝을 위해 모두 HindIII / NotI으로 처리하고 라이게이션시켰다. 감염성 AAV 입자들의 2차 생성은 1차 인 비보 농축으로부터 생성하였고 마우스에 다시 주사했다. 이러한 인 비보 농축 과정을 마우스에서 3회 반복했다.
고도로 농축된 캡시드 유전자의 최종 PCR 산물을 AAV ITR(inverted terminal repeats) 없이 AAV2 Rep 유전자를 포함하는 AAV 패키징 플라스미드의 유니버설 전구체(universal precursor)에 클로닝했다. 캡시드 유전자를 Rep 유전자의 하류 및 AAV 폴리아데닐화 신호 서열(polyadenylation signal sequence)의 상류에 라이게이션시켜서 Rep 및 Cap 유전자 발현 카세트를 재구성했다. 라이게이션 산물을 전기천공에 의해 대장균 균주 DH10B 내로 투과시키고 Amp 저항성 플레이트 상에서 증식시켰다. 개별적인 콜로니를 채취하고 캡시드 유전자의 DNA 서열결정을 위해 미니프렙(miniprep) DNA를 단리했다. 다수의 신규한 캡시드 유전자를 확인했고 이들 중 2개를 고도로 농축시켰다. 이 2개의 캡시드 유전자를 AAVXL32 및 AAVXL12로 명명했다. 그들의 DNA 서열은 서열번호 1 및 2로 표시되고, 아미노산 서열은 서열번호 4 및 5로 표시된다. AAVXL12와 AAVXL32의 DNA 서열은 23개의 뉴클레오티드가 다르나(2214개의 뉴클레오티드 중 23개), 그들의 아미노산 서열은 단 2개의 잔기만 다르다(737개의 아미노산 중 2개). 220번 아미노산이 XL12에서는 S이고 XL32에서는 D이며; 643번 아미노산이 XL12에서는 N이고 XL32에서는 H이다.
실시예 3
리포터 유전자를 포함하는 AAV 벡터의 제조
캡시드-특이적 패키징 플라스미드를 통상적인 대규모 추출(large scale preparation) 방법에 의해 생산하고 CsCl 밀도 초원심분리에 의해 2회 정제했다. 이 플라스미드를 편재성(ubiquitous) 프로모터 CMV 또는 CB (CMV-인핸서 + CB(chicken beta-actin basal promoter))의 전사 제어 하에 있는 GFP(green fluorescent protein) 및 베타-갈락토시다아제 Lac-Z 유전자와 같은 리포터 유전자를 포함하는 AAV 벡터의 패키징을 위해 이용했다. AAV 벡터를 각각의 신규한 캡시드에 패키징하고 통상적인 이중 CsCl 밀도 초원심분리(double CsCl density ultracentrifugation)에 의해 정제하였다. 리포터 벡터의 역가를 해당하는 리포터 벡터 플라스미드 DNA의 공지된 카피 수에 대한 DNA 도트 블롯 방법(DNA dot blot method)에 의해 결정했다. 모든 벡터 수율은 평균적인(normal) 범위에 있었다.
실시예 4
마우스에서 간 농축 AAV 캡시드의 인 비보 검사
인 비보 농축되고 선택된 신규한 캡시드가 간의 형질도입에서 강력한지 여부를 검사하기 위해, AAVXL12 및 AAVXL32을 이용하여 개별적으로 두 개의 리포터 유전자, GFP 및 LacZ를 패키징하였다. 벡터들을 정제하고, 적정하고, 5x1012 vg/kg 체중의 용량으로 C57B/6 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥으로 주사하였다. AAV9 유전자 전달이 마우스 간에서 강력하므로(robust), 동일한 GFP 및 LacZ 유전자를 패키징하는 AAV9 벡터를 양성 대조군으로 이용하였다. 도 1a-1b에 도시된 바와 같이, 결과는 GFP 및 LacZ 리포터 유전자 모두에 대해, AAVXL12 및 AAVXL32가 대조군 AAV9와 본질적으로 동일한 수준의 간 유전자 발현을 달성했다는 것을 밝혀서, 마우스에서 간-향성 캡시드 유전자를 농축시키는 인 비보 선택 전략을 입증했다.
실시예 5
인간 간암 세포주 상의 간 농축 AAV 캡시드의
인 비트로 검사
간-향성 캡시드가 인간 기원의 간 세포에 형질도입될 수 있는지 여부를 보기 위해, 먼저 벡터를 인 비트로에서, Huh7으로 명명된 인간 간암 세포주 상에서 검사했다. Huh7은 간-특이적 프로모터에 의한 AAV 벡터 유전자 발현에 대한 인 비트로 분석을 위해 널리 이용되고 있다. 이 세포주는 인간 간세포의 특징들 중 일부를 보유하고 배양된 일차 인간 간세포와 양의 상관관계(positive correlation)를 보인다. 따라서, 이 세포주는 인간 기원의 세포에 대한 AAV 캡시드의 간 향성의 일차 테스트를 위해 이용될 수 있다. 다시, AAV9를 양성 대조군으로 이용하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, AAVXL12 및 AAVXL32는 모두 1x105 vg/세포 및 1x104 vg/세포의 감염 다중도(moi)에서 고도로 효율적인 유전자 발현을 달성했다. 반면에, AAV9는 Huh7 세포의 형질도입에 효율적이지 않았다. 보다 높은 moi에서 소수의 lacZ 양성 세포들만이 검출되었다. 이러한 결과는 AAVXL12 및 AAVXL32가 마우스 간 세포 외에, 인간 간 세포에 대한 높은 친화도를 가질 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 6
인간 및 개의 일차 간세포 상에서 간 농축 AAV 캡시드의
인 비트로 검사
특정한 AAV 혈청형이 마우스 간에 매우 잘 형질도입되나, 인간 또는 비-인간(원숭이) 간에는 열등하게 형질도입되고(Hurlbut et al., Mol . Ther .18:1983 (2010)), 반면에, 다른 혈청형은 마우스 간에는 열등하게 형질도입되나, 인간화 간의 마우스 모델(Lisowski et al., Nature 506(7488):382 (2014)) 및 원숭이 (Li et al., Mol . Ther . 12:1867 (2015))에서 매우 잘 수행하므로, 이러한 차이가 신규한 간-향성 AAV 캡시드도 개의 일차 간세포 배양물 및 인간 일차 간세포 배양물에 효과적으로 형질도입되는지 여부의 검사를 촉발시켰다.
먼저, 벡터들을 3명의 인간 공여자로부터 단리된 인간 일차 간세포에서 인 비트로 검사하였다. 간세포는 TRL (Triangle Research Laboratories, 현재 Invitrogen 자회사)로부터 구매하고 공급자에 의해 제공된 배지에서 그들의 프로토콜에 따라 배양했다. 편재성 CMV 프로모터의 제어 하에 있는 GFP를 리포터 유전자로 이용하고 AAVXL12, AAVXL32, 및 AAV2, 6, 7, 8, 9, 등에 패키징시켰다. 이 벡터들을 이용하여 약 80% 세포 밀집도(confluence)의 일차 간세포 배양물을 1x105 vg/세포의 moi의 벡터 용량으로 감염시켰다. 그린 컬러를 보이는 GFP 발현에 대해 세포들에서 상이한 시점에 형광 사진촬영을 수행했다. 도 3a-3d에 도시된 바와 같이, 결과는 AAV8 및 AAV9와 같은 널리 보고된 혈청형 캡시드가 마우스 간을 강력하게 형질도입시키나, 이 벡터들은 일차 인간 간세포에 대해서는 매우 열등한 감염성을 보였다는 것을 밝혔다. 대조적으로, 마우스 간에서 농축된 신규한 간-향성 AAV 캡시드도 본 연구에서 테스트된 모든 다른 천연 벡터들 중에서 가장 높은 효율성으로 일차 인간 간세포에 형질도입시켰다. 감염 후 24시간 차에(도 3a), AAV의 다른 혈청형들은 거의 GFP 발현을 갖지 않으나, AAVXL12 및 AAVXL32는 이미 상당한 GFP 발현을 가졌다. 감염 후 48시간 차에(도 3b), AAVXL12 및 AAVXL32는 다시 최고 수준의 GFP 발현을 보였다. 전술된 2종의 벡터에 의해 감염된 간세포는 배양에서 7일 동안 유지되었고 일별로 GFP 사진을 촬영했다. GFP 형광의 강도는 시간의 경과에 따라 증가하고 7일 차에 최고 수준에 도달했다(도 3c 및 3d). 따라서, 신규한 캡시드는, 마우스 간은 매우 열등하게 형질도입시키나, 비-인간 영장류 간 및 인간화 마우스 간의 인간 간세포에 강력하게 형질도입시키는 다른 AAV 캡시드, 예를 들면, AAV3 및 AAVLK03 (Lisowski et al., Nature 506(7488):382 (2014)) 및 원숭이 (Li et al., Mol . Ther . 12:1867 (2015))와 명확하게 대비된다. AAV2 및 AAV5와 같은 다른 AAV 혈청형은 마우스 및 비-인간 영장류 간 모두를 열등하게 형질도입시키는 것으로 보고된다. 전술된 발견은 AAVXL12 및 AAVXL32가 모두 다른 공지된 AAV 캡시드에서 보이지 않는 독특한 특성을 갖는다는 것을 강력하게 암시한다.
후속적으로, 개 일차 간세포를 또한 이용하여 간-향성 AAV의 감염성을 검사하고 GFP 리포터 유전자를 포함하는, 통상적으로 사용되는 AAV 캡시드의 다수와 비교하였다. AAV 벡터 게놈 입자를 1x105 vg/세포의 moi로 사용했다. 2마리의 개로부터의 신선한 간세포 및 저온보존된(cryopreserved) 간세포를 사용했다. 감염 후 24시간 및 48시간 차에, AAV GFP 벡터 감염 세포에서 그린 형광 사진을 촬영했다. 도 4a-4c에 도시된 바와 같이, AAVXL12 및 AAVXL32는 AAV6을 제외하고 테스트된 다른 혈청형들보다 더 높은 유전자 전달 효율을 보였고, AAV6은 AAVXL12 및 AAVXL32와 유사하거나 이들보다 약간 더 높다. 주목되는 것은, AAV6가 개 간세포에서 높은 수준의 유전자 전달을 보였으나, 이는 인간 간세포 배양물에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 AAVXL12 및 AAVXL32 모두 개 간세포에 대해 높은 감염성을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 7
비-인간 영장류 간에서 AAVXL32의 인 비보 검사
간-향성 캡시드가 또한 비-인간 영장류 간에서 효율적인 유전자 전달을 달성할 수 있는지 여부를 검사했다. AAV8과 비교하기 위해 AAVXL32를 선택했다. AAV8은 원숭이 간에 형질도입될 수 있고 또한 B형 혈우병 임상 시험을 위해 인간에서 간-지향성 유전자 요법(liver-directed gene therapy)에서 이용되었다고 이전에 보고된 바 있었다. 3-5세의 성체 수컷 붉은털 원숭이를 이전에 공개된 문헌에 따라 AAVXL32 및 AAV8에 대한 혈청 중화 항체에 대해 스크리닝했다. 1:8보다 낮은 중화 항체 역가를 갖는 4마리의 원숭이를 선택하여 AAV 벡터를 정맥내로 주사했다. 2마리의 원숭이에는 AAVXL32-CB-GFP를, 2마리의 원숭이에는 AAV-CB-GFP를 1x1012 vg/kg 체중의 용량으로 주사했다. AAV 벡터 발현 카세트는 보다 신속하고 보다 효율적인 유전자 발현을 위한 이중-가닥(자가-상보적이라고도 지칭됨) 형태였다. 2주 후에, 원숭이들을 안락사시키고, 동결-박편(cryo-thin-sections) 및 그린 형광 사진촬영을 위해 간 조직을 채취했다. 도 5에 도시된 바와 같이, AAVXL32은 원숭이 간에서 AAV8보다 훨씬 더 높은 수준의 GFP 발현을 달성했다. AAVXL32 처리 원숭이에서 GFP 양성 세포들이 보다 높은 형광 강도로 용이하게 검출되고 (화살표로 표시된) 더 많은 양성 세포들이 검출된다. 반면에, AAV8 처리 원숭이들은 훨씬 더 적은 수의 양성 세포 및 더 약한 형광 강도를 보였다. 이러한 결과는 비-인간 영장류에서 AAVXL32가 AAV8보다 훨씬 더 간-향성이라는 것을 시사한다.
실시예 8
AAVXL32 캡시드 단백질의 특성 규명 및
제3 캡시드 단백질을 위한 약한 개시 코돈의 제거
캡시드 단백질의 특성을 규명하기 위해, 이중 CsCl 초원심분리에 의해 정제되고 DNA 도트 블롯에 의해 적정된 AAVXL32 캡시드를 분석했다. 정제된 벡터들을 SDS PAGE 겔에 로딩하고 은 염색(silver staining) 후에 VP 단백질의 분자량을 결정했다. 도 6에 도시된 바와 같이, AAVXL32는 4개의 밴드를 보였다. 모든 천연 AAV의 전형적인 VP1, VP2, 및 VP3 단백질 외에, VP1과 VP2 사이에 추가 밴드(VPX로 명명됨)가 있었다. 이 추가 밴드는 큰 단백질 VP1 고유 영역(large protein VP1 unique region)에 위치한 XhoI 제한효소 인식 부위(restriction site)에서 AAV7 및 AAV8 캡시드 유전자의 단일 뉴클레오티드 부위-지향성 돌연변이생성의 결과였다. 이 돌연변이를 생성한 원래의 목적은 AAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 및 9의 캡시드 유전자를 포함한, AAV 캡시드 유전자 DNA 셔플링 라이브러리에서 DNA 클로닝의 편리성을 위한 것이었다 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 106(10):3946 (2009)). VP1 개시 코돈으로부터 계수된 219번 뉴클레오티드에서 XhoI 부위에서 하나의 C의 G로의 돌연변이(CTCGAG에서 CTGGAG로의 돌연변이)는 AAV7 및 AAV8 캡시드 유전자 모두에서 아미노산 루이신에 대한 센스 돌연변이를 초래했다. 이는 VP1 단백질 아미노산 서열을 변경시키지 않았다. 그러나, 이 센스 돌연변이가 보다 약한 비-공통(non-consensus) 개시 코돈 CTG(vs. 고전적인 ATG 개시 코돈)를 생성한 것으로 의심되었다. 이는 VP1과 VP2 사이에 추가적인 캡시드 단백질 VPX의 생성을 가져왔을 수 있다. 분명하게, 이 추가적 밴드는 식별할 수 있는 방식으로 벡터 DNA 패키징 및 감염성을 약화시키지 않았다. 센스 돌연변이가 추가적 캡시드 단백질에 대한 약한 개시 코돈을 생성했다는 것을 확인하기 위해, C의 G로의 돌연변이를 야생형 AAV7 및 AAV8 서열의 원래의 C로 다시 복귀시키기 위해 부위-지향성 돌연변이생성을 수행했다. AAVXL32.1로 명명된, 복귀 돌연변이를 갖는 새로운 캡시드 유전자는 실제로 약한 개시 코돈을 불활성화시키고 VP1과 VP2 사이의 추가적 캡시드 밴드를 제거했다(도 6). XL32 또는 XL32.1에 패키딩된 LacZ 리포터 유전자 벡터는 벡터 수율 및 감염성에서 명백한 차이를 보이지 않아서, 추가적 캡시드 밴드가 AAV 캡시드 기능에서 중요하지 않거나 또는 알려지지 않은 역할을 수행했다는 것을 암시했다.
실시예 9
인간 혈청 시료 중 중화 항체의 출현율(prevalence)
인간 집단에서 AAV 캡시드에 대한 기존 중화 항체(pre-existing Nab)가 AAV-매개 인 비보 유전자 요법에 대해 중요한 문제이다. AAV2 및 AAV3과 같은, AAV의 일부 혈청형은 Nab의 매우 높은 출현율을 갖는다 (Ling, J. Integr . Med . 5:341 (2015)). 간-향성 AAVXL32 캡시드에 대한 Nab의 출현율에 대한 예비 평가를 수행하였다. 중국인 환자 그룹의 혈청 시료 중 Nab의 출현율을 그들의 신상에 대한 완전한 맹검 하에 검사하였다. 구체적으로, 100명으로부터의 혈청을 대상으로 AAVXL32 캡시드에 대한 기존 NAb에 대해 테스트했다. Nab 분석은 Ling 등 및 (Ling, J. Integr. Med . 5:341 (2015))에 기재된 문헌에 의해 이전에 공개된 방법에 따라 수행했다. 분비형 루시페라아제(가우시아(Gaussia) 루시페라아제)를 리포터 유전자로 사용하고, 인간 간세포주 Huh7을 테스터(tester) 세포로 이용하는 것에 의해 변형하였다. 요약하면, 5x104개 세포/웰의 Huh7 세포를 둥근 바닥 96-웰 플레이트(round bottom 96-well plate)에 플레이팅했다. 다음날, 개별적인 혈청 시료들을 2-배 증분(increment)로 연속적으로 희석했다. Nab 양성 대조군은 AAVXL32 면역화 마우스로부터의 혼주(pooled) 혈청이었고, 음성 대조군은 시그마(Sigma)로부터 구입한, 미접촉(naive) 마우스 혼주 혈청이었다. 희석된 혈청 시료와 AAV를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고 1일 전에 Huh7 세포를 접종했던 플레이트에 첨가했다. AAVXL32 감염 후 48시간 차에, 루시페라아제 활성 분석을 위해 각 웰로부터 세포 배양 배지의 소량(small aliquot)을 채취했다. 반딧불이 루시페라아제와 달리, 가우시아 루시페라아제는 분비형 효소이고, 효소 활성 측정을 위해 세포를 용해시킬 필요가 없다. 결과는 혈청 시료의 50%를 넘는 비율이 1:8 희석보다 더 낮은 Nab 역가를 갖고, 약 70%가 1:16 희석보다 더 낮은 역가를 갖는다는 것을 보여주었다. 이러한 데이터는 AAVXL32의 Nab 출현율이 중국인 집단에서 AAV2, AAV3, AAVKL3, AAV5 및 AAV8에 대한 이전에 공개된 데이터보다 훨씬 더 낮았다는 것을 나타낸다. 그 연구들에서, AAV2, AAV3 및 AAVK03은 1:20 희석의 혈청 희석 컷오프로, 개체들의 90%를 넘는 비율에서 중화 항체 양성인 것으로 확인되었고, 반면에 AAV8은 1:20의 동일한 희석 컷오프에서 80%보다 높은 Nab 양성률을 보였고, AAV5는 70%보다 높은 Nab 양성률을 보였다.
전술된 내용은 본 발명을 예시하는 것이며, 그를 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 본 발명은 하기의 청구항에 의해 정의되며, 청구항의 균등물은 그에 포함된다.
AAV 캡시드 서열
서열번호 1 AAVXL12 캡시드 유전자 DNA 서열
Figure pct00002
서열번호 2 AAVXL32 캡시드 유전자 DNA 서열
Figure pct00003
서열번호 3 AAVXL32 .1 캡시드 유전자 DNA 서열
Figure pct00004
서열번호 4 AAVXL12 캡시드 아미노산 서열
Figure pct00005
서열번호 5 AAVXL32 캡시드 아미노산 서열
Figure pct00006
서열번호 6 AAV XL32.1 캡시드 아미노산 서열
Figure pct00007
서열번호 7 DNA 프라이머 CAP-5'
Figure pct00008
서열번호 8 DNA 프라이머 CAP-3'
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> The University of North Carolina at Chapel Hill Xiao, Xiao Li, Juan Xiao, Bin Yuan, Zhenhua <120> SYNTHETIC LIVER-TROPIC ADENO-ASSOCIATED VIRUS CAPSIDS AND USES THEREOF <130> 5470-852WO <150> US 62/683,868 <151> 2018-06-12 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2214 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AAVXL12 capsid gene DNA sequence <400> 1 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60 gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctgg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420 ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc 480 ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt ttggtcagac 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<211> 2214 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AAVXL32 capsid gene DNA sequence <400> 2 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60 gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctgg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420 ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc 480 ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt ttggtcagac tggcgactca 540 gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tggtgtggga 600 cctaatacaa tggcttcagg cggtggcgca ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660 ggagtgggta atgcctcagg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720 atcaccacca gcacccgaac atgggccttg cccacctata acaaccacct ctacaagcaa 780 atctccagtg cttcaacggg ggccagcaac gacaaccact acttcggcta cagcaccccc 840 tgggggtatt ttgatttcaa cagattccac tgccatttct caccacgtga ctggcagcga 900 ctcatcaaca acaattgggg attccggccc aagagactca acttcaagct cttcaacatc 960 caagtcaagg aggtcacgac gaatgatggc gtcacgacca tcgctaataa ccttaccagc 1020 acggttcaag tcttctcgga ctcggagtac cagttgccgt acgtcctcgg ctctgcgcac 1080 cagggctgcc tccctccgtt cccggcggac gtgttcatga ttccgcaata cggctacctg 1140 acgctcaaca atggcagcca agccgtggga cgttcatcct tttactgcct ggaatatttc 1200 ccttctcaga tgctgagaac gggcaacaac tttaccttca gctacacctt tgaggaagtg 1260 cctttccaca gcagctacgc gcacagccag agcctggacc ggctgatgaa tcctctcatc 1320 gaccagtacc tgtattacct gaacagaact cagaatcagt ccggaagtgc ccaaaacaag 1380 gacttgctgt ttagccgtgg gtctccagct ggcatgtctg ttcagcccaa aaactggcta 1440 cctggaccct gttaccggca gcagcgcgtt tctaaaacaa aaacagacaa caacaacagc 1500 aactttacct ggactggtgc ttcaaaatat aacctcaatg ggcgtgaatc catcatcaac 1560 cctggcactg ctatggcctc acacaaagac gacaaagaca agttctttcc catgagcggt 1620 gtcatgattt ttggaaagga gagcgccgga gcttcaaaca ctgcattgga caatgtcatg 1680 atcacagacg aagaggaaat caaagccact aaccccgtgg ccaccgaaag atttgggact 1740 gtggcagtca atctccagag cagcagcaca gaccctgcga ccggagatgt gcatgttatg 1800 ggagccttac ctggaatggt gtggcaagac agagacgtat acctgcaggg tcctatttgg 1860 gccaaaattc ctcacacgga tggacacttt cacccgtctc ctctcatggg cggctttgga 1920 cttaagcacc cgcctcctca gatcctcatc aaaaacacgc ctgttcctgc gaatcctccg 1980 gcagagtttt cggctacaaa gtttgcttca ttcatcaccc agtattccac aggacaagtg 2040 agcgtggaga ttgaatggga gctgcagaaa gaaaacagca aacgctggaa tcccgaagtg 2100 cagtatacat ctaactatgc aaaatctgcc aacgttgatt ttactgtgga caacaatgga 2160 ctttatactg agcctcgccc cattggcacc cgttacctca cccgtcccct gtaa 2214 <210> 3 <211> 2214 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AAVXL32.1 capsid gene DNA sequence <400> 3 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60 gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420 ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc 480 ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt ttggtcagac tggcgactca 540 gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tggtgtggga 600 cctaatacaa tggcttcagg cggtggcgca ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660 ggagtgggta atgcctcagg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720 atcaccacca gcacccgaac atgggccttg cccacctata acaaccacct ctacaagcaa 780 atctccagtg cttcaacggg ggccagcaac gacaaccact acttcggcta cagcaccccc 840 tgggggtatt ttgatttcaa cagattccac tgccatttct caccacgtga ctggcagcga 900 ctcatcaaca acaattgggg attccggccc aagagactca acttcaagct cttcaacatc 960 caagtcaagg aggtcacgac gaatgatggc gtcacgacca tcgctaataa ccttaccagc 1020 acggttcaag tcttctcgga ctcggagtac cagttgccgt acgtcctcgg ctctgcgcac 1080 cagggctgcc tccctccgtt cccggcggac gtgttcatga ttccgcaata cggctacctg 1140 acgctcaaca atggcagcca agccgtggga cgttcatcct tttactgcct ggaatatttc 1200 ccttctcaga tgctgagaac gggcaacaac tttaccttca gctacacctt tgaggaagtg 1260 cctttccaca gcagctacgc gcacagccag agcctggacc ggctgatgaa tcctctcatc 1320 gaccagtacc tgtattacct gaacagaact cagaatcagt ccggaagtgc ccaaaacaag 1380 gacttgctgt ttagccgtgg gtctccagct ggcatgtctg ttcagcccaa aaactggcta 1440 cctggaccct gttaccggca gcagcgcgtt tctaaaacaa aaacagacaa caacaacagc 1500 aactttacct ggactggtgc ttcaaaatat aacctcaatg ggcgtgaatc catcatcaac 1560 cctggcactg ctatggcctc acacaaagac gacaaagaca agttctttcc catgagcggt 1620 gtcatgattt ttggaaagga gagcgccgga gcttcaaaca ctgcattgga caatgtcatg 1680 atcacagacg aagaggaaat caaagccact aaccccgtgg ccaccgaaag atttgggact 1740 gtggcagtca atctccagag cagcagcaca gaccctgcga ccggagatgt gcatgttatg 1800 ggagccttac ctggaatggt gtggcaagac agagacgtat acctgcaggg tcctatttgg 1860 gccaaaattc ctcacacgga tggacacttt cacccgtctc ctctcatggg cggctttgga 1920 cttaagcacc cgcctcctca gatcctcatc aaaaacacgc ctgttcctgc gaatcctccg 1980 gcagagtttt cggctacaaa gtttgcttca ttcatcaccc agtattccac aggacaagtg 2040 agcgtggaga ttgaatggga gctgcagaaa gaaaacagca aacgctggaa tcccgaagtg 2100 cagtatacat ctaactatgc aaaatctgcc aacgttgatt ttactgtgga caacaatgga 2160 ctttatactg agcctcgccc cattggcacc cgttacctca cccgtcccct gtaa 2214 <210> 4 <211> 737 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AAVXL12 capsid amino acid sequence <400> 4 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190 Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Ser Gly Val Gly Asn 210 215 220 Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn 260 265 270 His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr 405 410 415 Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn 435 440 445 Arg Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe 450 455 460 Ser Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu 465 470 475 480 Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp 485 490 495 Asn Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu 500 505 510 Asn Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His 515 520 525 Lys Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe 530 535 540 Gly Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met 545 550 555 560 Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu 565 570 575 Arg Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro 580 585 590 Ala Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp 595 600 605 Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro 610 615 620 His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly 625 630 635 640 Leu Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro 645 650 655 Ala Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile 660 665 670 Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu 675 680 685 Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser 690 695 700 Asn Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly 705 710 715 720 Leu Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro 725 730 735 Leu <210> 5 <211> 737 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AAVXL32 capsid amino acid sequence <400> 5 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190 Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn 210 215 220 Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn 260 265 270 His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr 405 410 415 Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn 435 440 445 Arg Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe 450 455 460 Ser Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu 465 470 475 480 Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp 485 490 495 Asn Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu 500 505 510 Asn Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His 515 520 525 Lys Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe 530 535 540 Gly Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met 545 550 555 560 Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu 565 570 575 Arg Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro 580 585 590 Ala Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp 595 600 605 Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro 610 615 620 His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly 625 630 635 640 Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro 645 650 655 Ala Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile 660 665 670 Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu 675 680 685 Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser 690 695 700 Asn Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly 705 710 715 720 Leu Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro 725 730 735 Leu <210> 6 <211> 737 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AAV XL32.1 capsid amino acid sequence <400> 6 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190 Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn 210 215 220 Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn 260 265 270 His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr 405 410 415 Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn 435 440 445 Arg Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe 450 455 460 Ser Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu 465 470 475 480 Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp 485 490 495 Asn Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu 500 505 510 Asn Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His 515 520 525 Lys Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe 530 535 540 Gly Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met 545 550 555 560 Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu 565 570 575 Arg Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro 580 585 590 Ala Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp 595 600 605 Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro 610 615 620 His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly 625 630 635 640 Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro 645 650 655 Ala Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile 660 665 670 Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu 675 680 685 Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser 690 695 700 Asn Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly 705 710 715 720 Leu Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro 725 730 735 Leu <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA Primer CAP-5' <400> 7 cccaagcttc gatcaactac gcagacaggt accaa 35 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA Primer CAP-3' <400> 8 ataagaatgc ggccgcagag accaaagttc aactgaaacg a 41

Claims (35)

  1. AAV 캡시드를 코딩하는 핵산으로서, 상기 핵산은:
    (a) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열; 또는
    (b) 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일한 AAV 캡시드 코딩 서열을 포함하는 것인 핵산.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 AAV 캡시드 코딩 서열은 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 것인 핵산.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 AAV 캡시드 코딩 서열은 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 것인 핵산.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 AAV 캡시드 코딩 서열은 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열과 99.5% 이상 동일한 것인 핵산.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 AAV 캡시드 코딩 서열은 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 플라스미드, 파아지, 바이러스 벡터, 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome), 또는 효모 인공 염색체인 것인 핵산.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 상기 코딩 서열을 포함하는 AAV 벡터인 것인 핵산.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 AAP rep 코딩 서열을 더 포함하는 것인 핵산.
  9. 게놈 내에 안정적으로 결합된, 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는, 인 비트로 세포.
  10. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 바이러스 입자.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 바이러스 입자는 AAV 입자, 아데노바이러스 입자, 헤르페스바이러스 입자, 또는 바큘로바이러스 입자인 것인 바이러스 입자.
  12. 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드.
  13. 청구항 12에 있어서, 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 AAV 캡시드.
  14. 청구항 12에 있어서, 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나와 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 AAV 캡시드.
  15. 청구항 12에 있어서, 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나와 99.5% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 AAV 캡시드.
  16. 청구항 12에 있어서, 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 AAV 캡시드.
  17. 청구항 12 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, DNA 분자, RNA 분자, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질, 및 소형 유기 분자(small organic molecule)로 구성된 군으로부터 선택된 화합물에 공유결합에 의해 연결되거나, 상기 화합물에 결합되거나, 또는 상기 화합물을 캡시드화하는(encapsidating) 것인 AAV 캡시드.
  18. AAV 벡터 게놈; 및
    청구항 12 내지 16 중 어느 한 항의 AAV 캡시드를 포함하는 AAV 입자로서, 상기 AAV 캡시드는 상기 AAV 벡터 게놈을 캡시드화하는 것인 AAV 입자.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 AAV 벡터 게놈은 이종 핵산을 포함하는 것인 AAV 입자.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 이종 핵산은 안티센스 RNA, microRNA, 또는 RNAi를 코딩하는 것인 AAV 입자.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 이종 핵산은 폴리펩티드를 코딩하는 것인 AAV 입자.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 이종 핵산은 치료 폴리펩티드(therapeutic polypeptide)를 코딩하는 것인 AAV 입자.
  23. 청구항 21에 있어서, 상기 이종 핵산은 리포터 단백질을 코딩하는 것인 AAV 입자.
  24. 청구항 18 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 핵산은 RNA 폴리머라아제 II-기반 프로모터 또는 RNA 폴리머라아제 III-기반 프로모터, 예를 들면, 항시성(constitutive) 프로모터 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 AAV 입자.
  25. 청구항 18 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 핵산은 간-특이적 또는 간-선호적(liver-preferred) 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 AAV 입자.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 간-특이적 또는 간-선호적 프로모터는 아포리포프로테인(apolipoprotein) AII, 알부민, 알파-1 안티트립신, 티록신-결합 글로불린, 시토크롬 P450 CYP3A4, 또는 microRNA122, 또는 합성 간-특이적 조절 서열로부터의 프로모터인 것인 AAV 입자.
  27. AAV 캡시드를 포함하는 재조합 AAV 입자를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    인 비트로 세포에 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 따른 핵산, AAV rep 코딩 서열, 이종 핵산을 포함하는 AAV 벡터 게놈, 및 생산적 AAV 감염을 생성하기 위한 헬퍼 기능(helper functions)을 제공하는 단계; 및
    상기 AAV 캡시드를 포함하는 재조합 AAV 입자의 조립을 가능하게 하고, 상기 AAV 벡터 게놈을 캡시드화하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  28. 청구항 27의 방법에 의해 제조된 AAV 입자.
  29. 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 핵산, 청구항 10 또는 11의 바이러스 입자, 청구항 12 내지 17 중 어느 한 항의 AAV 캡시드, 또는 청구항 18 내지 26 중 어느 한 항, 또는 청구항 28의 AAV 캡시드를 포함하는 약제학적 제형.
  30. 목적 핵산을 간세포에 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 간세포를 청구항 18 내지 26 또는 28 중 어느 한 항의 AAV 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  31. 포유동물 개체에서 간세포에 목적 핵산을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은:
    청구항 18 내지 26, 또는 28 중 어느 한 항의 AAV 입자, 또는 청구항 29의 약제학적 제형의 유효량을 포유동물 개체에게 투여하여, 그에 의해 상기 목적 핵산을 상기 포유동물 개체의 간세포에 전달하는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 포유동물 개체는 인간 개체인 것인 방법.
  33. 청구항 31 또는 32에 있어서, 상기 AAV 입자는 간으로 전달되는 것인 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 AAV 입자는 간으로의 주사, 간문맥으로의 주사, 또는 이들의 조합에 의해 간으로 직접 전달되는 것인 방법.
  35. 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 질환은 상기 개체의 간에서 산물을 발현시키는 것에 의해 치료가능하고, 상기 방법은 청구항 18 내지 26, 또는 28 중 어느 한 항의 AAV 입자, 또는 청구항 29의 약제학적 제형의 치료적 유효량을 포유동물 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 산물이 발현되어 상기 질환을 치료하는 것인 방법.
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