KR20210005885A - 킬레이트화된 방사성핵종에 대한 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 킬레이트화된 방사성핵종에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 이중특이적 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 방사선면역영상화 및 방사선면역요법과 같은 적용례에서 이중특이적 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 유용한 클리어링제 및 조성물에 관한 것이다.

Description

킬레이트화된 방사성핵종에 대한 항체
본 발명은 킬레이트화된 방사성핵종에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 이중특이적 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 방사선면역영상화(radioimmunoimaging) 및 방사선면역요법(radioimmunotherapy)과 같은 적용례에서 이중특이적 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 유용한 클리어링제(clearing agent) 및 조성물에 관한 것이다.
단일클론 항체는 약물을 암 세포에 대해 표적화시키기 위해 개발되었다. 독성제를 종양-연관 항원에 결합하는 항체에 접합함으로써 주변 조직에 대한 손상을 줄이면서 보다 특이적인 종양 살해를 제공할 가능성이 있다.
사전-표적화된 방사선면역요법(PRIT)에서는 한편으로는 종양-연관 항원에 대한 친화성 및 다른 한편으로는 방사선표지된 화합물에 대한 친화성을 갖는 항체 구축물이 사용된다. 제1 단계에서, 항체가 투여되고 종양 내에 위치한다. 이어서, 방사선표지된 화합물이 투여된다. 방사선표지된 화합물이 작기 때문에 종양으로 빠르게 전달될 수 있고 빠르게 제거되어 종양 외부의 방사선 노출을 줄인다(문헌[Goldenberg et al Theranostics 2012, 2(5), 523-540]). 직접적인 세포-살해 효과 외에도, PRIT는 면역원성 세포 사멸의 유도자, 및 암 면역요법 및 내인성 백신접종 접근을 위한 잠재적인 조합 파트너로서 역할할 수 있다. 유사한 절차를 영상화에도 사용할 수 있다. 사전-표적화는 아비딘-비오틴을 사용하는 이중특이적 항체 또는 시스템을 사용할 수 있지만, 후자는 아비딘/스트렙타비딘이 면역원성이라는 단점이 있다.
PRIT에 사용되는 방사성핵종은 일반적으로 관심 방사성핵종이 로딩된 킬레이트 형태이다.
문헌[Su et al, Nucl Med Biol 2005 32:741-747]은 mAb-스트렙타비딘 및 DOTA-비오틴을 사용한 항체 사전-표적화 시스템을 평가하였다. 방사선표지된 212Pb-DOTA-비오틴은 안정하지 않았고, 212Pb-DOTA에서 30% 초과의 유리 212Bi(212Pb의 붕괴 산물)가 방출되었다.
국제 특허공보 제2010/099536호는 이트륨, 루테튬 및 가돌리늄의 DOTA 복합체에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 설명한다. 그러나, DOTA는 모든 방사성핵종에 안정적으로 결합하지 않고 느린 복합체 형성 속도를 나타낼 수 있다(문헌[Yong and Brechbiel, Dalton Trans. 2001 June 21; 40(23) 6068-6076]). 킬레이터가 방사성핵종에 안정적으로 결합하지 못하면, 독성을 증가시키면서 종양으로의 방사선 전달을 감소시킬 위험이 있다.
본 발명은 DOTAM 및 납(Pb)을 포함하는 금속 킬레이트에 결합하는 항체를 제공한다. DOTAM은 안정된 방식으로 Pb를 킬레이트화하여 Pb[DOTAM] 복합체를 형성 할 수 있다.
본 발명의 항체는 DOTAM 및 Pb를 포함하는 킬레이트에 결합하고, 이때 Pb는 안정한(비-방사성) 동위원소 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 납의 방사성 동위원소는 방사선면역영상화 및 방사선면역요법과 같은 적용례에서 유용한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 pM 내지 fM 범위로 Pb-DOTAM 킬레이트에 대해 매우 높은 친화도를 갖는다.
항체는 DOTAM에 의해 킬레이트화된 비스무스(Bi)에 추가로 결합한다. 212Pb는 212Bi의 모 방사성핵종이고, 212Bi의 생체내 발생기로서 역할할 수 있다. 킬레이트화된 Bi와 킬레이트화된 Pb에 결합하는 항체의 능력은 Bi 동위원소가 Pb 동위원소로부터 붕괴 산물로 생성되는 방사선면역요법과 같은 적용례에서 그 유용성을 증가시킨다. 일부 양태에서, 항체는 Bi-DOTAM 킬레이트 및 Pb-DOTAM 킬레이트 둘 다에 pM 내지 fM 범위의 매우 높은 친화도로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 Cu-DOTAM 킬레이트와 같은 다른 킬레이터-금속 복합체와 비교하여 Bi-DOTAM 킬레이트 및 Pb-DOTAM 킬레이트에 대해 임의적으로 또는 바람직하게는 선택적이다.
한 양태에서, 본 발명은 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 제공하고, 이때 상기 항원 결합 부위는 적어도 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고;
a) 중쇄 CDR1은 아미노산 서열 GFSLSTYSMS(서열번호 1)를 포함하고;
b) 중쇄 CDR2는 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKG(서열번호 2)를 포함하고;
c) 중쇄 CDR3은 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL(서열번호 3)을 포함하고/거나;
항원 결합 부위는 적어도 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고;
d) 경쇄 CDR1을 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA(서열번호 4)를 포함하고;
e) 경쇄 CDR2는 아미노산 서열 QASKLAS(서열번호 5)를 포함하고;
f) 경쇄 CDR3은 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG(서열번호 6)를 포함한다.
일부 양태에서, 항원 결합 부위는 상기 정의된 경쇄 및 중쇄를 둘 다 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 제공하고, 이때 상기 항원 결합 부위는 적어도
a) 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKG(서열번호 2), 또는 서열번호 2에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 상기 치환이 Phe50, Asp56 및/또는 Tyr58을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Gly52 및/또는 Arg54를 포함하지 않는, 중쇄 CDR2;
b) 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL(서열번호 3), 또는 서열번호 3에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 상기 치환이 Glu95, Arg96, Asp97 및 Pro98을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Ala100C, Tyr100D, 및/또는 Pro100E를 포함하지 않고/거나, 임의적으로 또한 Tyr99를 포함하지 않는 중쇄 CDR3;
c) 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA(서열번호 4), 또는 서열번호 4에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 상기 치환이 Tyr28 및 Asp32를 포함하지 않는, 경쇄 CDR1;
d) 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG(서열번호 6), 또는 서열번호 6에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 상기 치환이 Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및 Tyr96을 포함하지 않는, 경쇄 CDR3을 포함한다.
잔기 넘버링(numbering)은 카밧(Kabat)에 따른다.
일부 양태에서, 항체는 추가적으로 임의적으로
i) 아미노산 서열 GFSLSTYSMS(서열번호 1), 또는 서열번호 1에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1;
ii) 아미노산 서열 QASKLAS(서열번호 5), 또는 서열번호 5에서 1, 2 또는 3개 이상의 치환을 갖는, 임의적으로 Gln50을 포함하지 않는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2인 중쇄 CDR1 및 경쇄 CDR2를 포함한다.
전술된 CDR을 포함하는 서열의 변이체에 관한 본 발명의 임의의 양태에서, 단백질은 전술된 하나 이상의 잔기의 변이체일 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 본원에 개시된 항체에 의해 결합된 것과 같은 킬레이트화된 방사성핵종의 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합한다.
일부 양태에서, 항체는 Fab PRIT-0213 또는 PRIT-0214에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 항체는
i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체; 또는
ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체
와 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합할 수 있다.
한 양태에서, 항원 결합 부위는
a) 아미노산 서열 GFSLSTYSMS(서열번호 1)를 포함하는 중쇄 CDR1;
b) 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKG(서열번호 2)를 포함하는 중쇄 CDR2;
c) 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL(서열번호 3)을 포함하는 중쇄 CDR3;
d) 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA(서열번호 4)를 포함하는 경쇄 CDR1;
e) 아미노산 서열 QASKLAS(서열번호 5)를 포함하는 경쇄 CDR2;
f) 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG(서열번호 6)를 포함하는 경쇄 CDR3
으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
임의적으로, 전술된 임의의 양상의 항체는 인간, 키메라 또는 인간화된 항체이다.
임의적으로, 항원 결합 부위는 서열번호 7 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
임의적으로, 항원 결합 부위는 서열번호 8 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
임의적으로, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위는 서열번호 7 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 전술된 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 8 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 전술된 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
항체는 전체 항체 및 항체 단편을 비롯한 임의의 형식일 수 있다. 항체는 단일특이적일 수 있다. 이 형태에서, 항체는, 예를 들어 성공적으로 방사선표지된 모이어티를 분리하는 것과 같은 분류 및 정제 계획에서 유용성을 찾는다.
일부 양상에서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적으로 결합하는 항체는 세포 결합제/표적화 모이어티에 커플링되어 표적화된 제제를 생성한다. 이러한 제제는, 예를 들어 사전-표적화된 방사선면역요법 또는 사전-표적화된 방사선면역영상화에 유용하다.
커플링은 바람직하게는 융합 폴리펩티드 또는 단백질로서 발현에 의해 수행될 수 있다. 융합은 직접 또는 연결기를 통해 수행될 수 있다. 융합 폴리펩티드 또는 단백질은 접합 화학에 대한 필요를 피하면서 재조합적으로 생산될 수 있다.
일부 양태에서, 표적화 모이어티(표적에 대한 항원 결합 부위를 포함함)는 항체 또는 이의 단편이다. 즉, 일부 양태에서, 전술된 항체는 하기 추가로 논의되는 다중특이적(예컨대, 이중특이적) 항체의 형태일 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 또한 Pb-DOTAM 킬레이트를 표적 세포로 표적화하기에 적합한 다중특이적 항체/항체 복합체에 관한 것이다.
따라서, 다른 양상에서, 본 발명은 Pb-DOTAM 킬레이트 및 표적 항원, 예컨대 표적 세포의 표면에서 발현되는 항원 둘 다에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체에 관한 것이다. 이중특이적 항체는 DOTAM-킬레이트화된 납에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 표적 항원에 대한 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 양태에서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위는 전술된 임의의 양태에 따를 수 있다.
표적 항원은 본원에서 추가로 논의되는 임의의 항원, 예컨대 임의의 종양-특이적 항원일 수 있다. 일부 양태에서, 원핵생물 또는 바이러스와 같은 병원체에 의해 발현된 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다.
일부 양태에서, 종양-연관 항원은 CEA(암배아 항원)일 수 있다. 즉, 일부 양태에서, 이중특이적 항체는 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 CEA에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. CEA는 상대적으로 느리게 내재화되기 때문에 본 발명의 맥락에서 유리하고, 따라서, 높은 백분율의 이중특이적 항체가 방사성핵종에 대한 결합을 위해 초기 처리 후 세포 표면에 이용가능하게 남아있을 것이다. 다른 낮은 내재화 표적/종양-연관 항원도 바람직할 수 있고, 본원에 기술된다. 본 발명에서 유용할 수 있는 종양-연관 항원의 다른 예는 CD20 또는 HER2를 포함한다.
표적 항원이 CEA인 일부 양태에서, CEA에 특이적인 항원 결합 부위는 적어도 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄를 포함할 수 있고, 이때
d) 중쇄 CDR1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고;
e) 중쇄 CDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고;
f) 중쇄 CDR3은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고/거나;
CEA에 특이적인 항원 결합 부위가 적어도 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있고,
a) 경쇄 CDR1은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고;
b) 경쇄 CDR2는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고;
c) 경쇄 CDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, CEA에 특이적인 항원 결합 부위는
a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
d) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
e) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;
f) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3
으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개(즉, 모든)의 CDR을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, CEA에 특이적인 항원 결합 부위는 서열번호 17의 아미노산 서열, 또는 서열번호 17과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
임의적으로, 항원 결합 부위는 서열번호 18의 아미노산 서열, 또는 서열번호 18과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
임의적으로, CEA에 특이적인 항원 결합 부위는 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체에 대해 가능한 다양한 형식은 본원에 기술된 것을 비롯해 당업계에 공지된다. 본 발명의 항체는 임의의 이러한 형식을 채택할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 이중특이적 항체는 2가, 3가 또는 4가일 수 있다.
본 발명의 항체가 Fc 영역을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역의 존재는 방사선면역요법 및 방사선영상화의 맥락에서 이로울 수 있고, 예컨대 단백질의 순환 반감기를 연장하고/거나 더 작은 단편에서 관찰될 수 있는 것보다 큰 종양 흡수를 야기한다.
Fc 영역이 존재하는 일부 양태에서, Fc 영역이 효과기 기능을 감소시키도록 엔지니어링(engineering)되는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 하나 이상의 Fc 영역 잔기 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 및/또는 329, 예컨대, 하나 이상의 234, 235 및/또는 329의 치환을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, Fc 영역은 Gly로의 Pro 329의 치환, Ala로의 Leu 234 및/또는 Ala로의 Leu 235의 치환을 포함하도록 엔지니어링될 수 있다(EU 인덱스에 따른 넘버링).
Fc 도메인을 포함하는 다중특이적 항체의 다양한 형식이 공지된다.
한 양태에서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 i) Fc 도메인, ii) Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab, 크로스-Fab, Fv, scFab 또는 scFv 단편 또는 단일 도메인 항체(VHH), 및 iii) 표적 항원에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab, 크로스-Fab, Fv, scFab 또는 scFv 단편, 또는 단일 도메인 항체(VHH)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체가 표적 항원(예컨대, 종양-연관 항원)에 대해 다가, 예를 들어 2가인 것이 바람직할 수 있다. 이것은 증가하는 산염기도의 이점을 갖는다.
일부 양태에서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 Pb-DOTAM에 대해 1가인 것이 바람직할 수 있다. 이것은 클리어링제를 사용할 때 고 분자량 복합체 형성의 위험을 감소시킨다(하기 추가 논의 참조).
따라서, 일부 양태에서, 항체는 3가, 즉 표적 항원에 대해 2가 및 Pb-DOTAM에 대해 1가일 수 있다.
하나의 예시적인 형식에서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 제1 항체 중쇄 및 제2 항체 중쇄 및 제1 항체 경쇄 및 제2 항체 경쇄를 포함하는 전장 항체(예컨대, IgG)를 포함할 수 있고, 이때 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 조립(assembling)되어 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 조립되어 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성한다. 임의적으로, 추가 항원 결합 모이어티는, 예컨대 폴리펩티드 연결기를 통해 제1 중쇄 및/또는 제2 중쇄의 N- 또는 C-말단에 융합되어 하나의 항원 또는 항원 둘 다에 대한 원자가를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 제1 항원에 대한 추가 항원 결합 모이어티는 중쇄 분자 중 하나 또는 둘 다의 N-말단에 융합될 수 있다.
다른 예시적인 형식에서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 제1 항원에 대한 항원 결합 부위(예컨대, 제1 항원에 대해 2가일 수 있음)를 포함하는 전장 항체(예컨대, IgG)를 포함하고, 제2 항원에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 다양한 양태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 단편, 크로스오버-Fab 분자, scFab, Fv 분자, scFv 또는 단일 도메인 항체(VHH)일 수 있거나 제2 전장 항체의 일부일 수 있다. 예를 들어, 항체는 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 전장 항체를 포함하고, 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하는 적어도 제2 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 제1 항원 또는 제2 항원은 Pb-DOTAM 킬레이트이고 다른 항원은 표적 항원이다.
본원의 형식의 일부 양태에서, 제2 항원은 Pb-DOTAM 킬레이트이고, 제1 항원은 표적, 예컨대 종양-연관 항원(일부 양태에서 CEA, CD20 또는 ERBB2)이다.
다른 예시적인 형식에서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 제1 항원에 대한 항원 결합 부위(예컨대, 제1 항원에 대해 2가일 수 있음)를 포함하는 전장 항체를 포함할 수 있고, 이때 중쇄 중 하나의 N- 또는 C-말단은 폴리펩티드 연결기를 통해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드와 회합하여, 제2 항원에 대한 결합 부위를 포함하는 Fab 또는 크로스-Fab를 형성한다. 예를 들어, 이러한 형식은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하도록 i) VL 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합된, VH 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제1 폴리펩티드; 또는 ii) VH 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합된, VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제1 폴리펩티드; 또는 iii) VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합된, VH 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제1 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 융합은 전장 항체의 중쇄 중 하나의 N-말단에서 수행될 수 있다.
다른 특정 양태에서, 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체;
b) i) 항체 중쇄 가변 도메인(VH); 또는 ii) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1); 또는
iii) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드;
c) i) 항체 경쇄 가변 도메인(VL); 또는 ii) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 다른 하나의 C-말단과 융합되는, 폴리펩티드
를 포함하는 이중특이적 항체일 수 있고, 이때 (b)의 펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 및 (c)의 펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인은 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.
이러한 형식에서, 제1 항원 또는 제2 항원은 Pb-DOTAM 킬레이트일 수 있다. 다른 하나는 표적 항원, 예컨대 종양-연관 항원일 것이다.
일부 양태에서, 제2 항원은 Pb-DOTAM 킬레이트이고, 제1 항원은 표적, 예를 들어 종양-연관 항원(일부 양태에서 CEA, CD20 또는 ERBB2)이다.
전술된 항체는 3가일 수 있다. 다른 가능한 양태에서, 추가 항원 결합 모이어티는 본원에서 추가로 논의되는 하나의 항원 또는 항원 둘 다에 대한 원자가를 증가시키기 위해 융합될 수 있다.
임의적으로 상기 연결기(및 본원에 논의된 임의의 연결기)는 적어도 5개의 아미노산, 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산의 펩티드일 수 있다. 연결기는 경질 연결기 또는 가요성 연결기일 수 있다. 일부 양태에서, 이는 Thr, Ser, Gly 및/또는 Ala 잔기를 포함하거나 이로 이루어진 가요성 연결기이다. 예를 들어, Gly 및 Ser 잔기를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 이는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n과 같은 반복 모티프를 가질 수 있고, 이때 n은 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 일부 양태에서, 연결기는 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 26)이거나 이를 포함할 수 있다. 다른 연결기를 사용할 수 있고, 당업자에 의해 식별될 수 있다.
이러한 항체 형식의 추가 세부사항은 국제 특허공보 제2010/115589 A1호[로슈 글리카트 아게(Roche Glycart AG)]에 제공되며, 이는 전문이 본원에 참고로 혼입된다.
임의적으로,
i) a)의 전장 항체의 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링)(하나의 바람직한 양태에서, 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해), a)의 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되거나(카밧 EU 지수에 따른 넘버링);
ii) b)의 제2 경쇄의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(R), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링)(하나의 바람직한 양태에서, 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해), b)의 제2 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링).
한 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 전술된 3가 구조를 가질 수 있고,
a) CEA와 특이적으로 결합하고, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체로서, 중쇄가 서열번호 22 또는 23의 아미노산 1 내지 450(포함적으로 순차적인 넘버링을 사용함)의 중쇄(즉, 연결기 앞의 서열 부분)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 경쇄가 서열번호 21의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는, 전장 항체; 및/또는
b) i) 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1); 또는 iii) 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드; 및/또는
c) i) 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL); 또는 ii) 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 다른 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드
를 포함할 수 있고, 이때 (b)의 펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 및 (c)의 펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인이 함께 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.
한 예에서, 전장 항체의 중쇄 중 하나는 소위 "놉(knob) 돌연변이"(T366W 및 임의적으로 S354C 및 Y349C 중 하나, 바람직하게는 S354C)를 포함하고, 다른 하나는 소위 "홀(hole) 돌연변이"(T366X, L368A 및 Y407V 및 임의적으로 Y349C 또는 S354C, 바람직하게는 Y349C)를 포함한다(EU 인덱스 넘버링에 따름)(예컨대, 문헌[Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73] 참고).
일부 양태에서, (a)의 2개의 항체 중쇄는
i)에 서열번호 23의 아미노산 1 내지 450(포함적, 순차 넘버링 사용)의 중쇄(즉, 연결기 앞의 서열)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 위치 349에서 C, 위치 366에서 S, 위치 368에서 A 및 위치 407에서 V(EU 넘버링)를 갖는 제1 항체 중쇄; 및
ii) 서열번호 22의 아미노산 1 내지 450(포함적, 순차 넘버링 사용)의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 위치 354에서 C 및 위치 366에서 W(EU 넘버링)를 갖는 제2 항체 중쇄를 포함한다.
본원에 언급된 "고정된" 잔기는 CH3의 "놉-인투-홀(knob-into-hole)" 돌연변이이거나, 원하는 분자의 형성을 유리하게 하기 위해 다른 중쇄의 CH3 상의 상응하는 잔기와 쌍을 이루는 다이설파이드 가교 형성 잔기와 같은 다른 잔기이다. 다른 중쇄에 존재할 수 있는 가능한 잔기는 표 2의 서열(예컨대, 서열번호 19 및 20 또는 22 및 23)로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 제1 항체 중쇄가 위치 349에서 C를 가지면, 제2 항체 중쇄는 위치 354에서 C를 갖는다.
임의적으로, 연결기는 전술된 바와 같다.
다른 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 전술된 3가 구조를 가질 수 있고,
a) CEA를 특이적으로 결합하고, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체로서, 중쇄가 서열번호 19 또는 서열번호 20의 아미노산 1 내지 450(포함적이고 순차 넘버링을 기준으로 함: 즉, 연결기 앞의 서열)의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 경쇄가 서열번호 21의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는, 전장 항체;
b) i) 서열번호 9의 중쇄 가변 도메인와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH); 또는 ii) 서열번호 9의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1); 또는 iii) 서열번호 9의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드;
c) i) 서열번호 10의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL); 또는 ii) 서열번호 10의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 서열번호 10의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드
를 포함할 수 있고, (b)의 펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 및 (c)의 펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인이 함께 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.
한 예에서, 전장 항체의 중쇄 중 하나는 소위 "놉 돌연변이"(T366W 및 임의적으로 S354C 및 Y349C 중 하나, 바람직하게는 S354C)를 포함할 수 있고 다른 하나는 소위 "홀 돌연변이"(T366S, L368A 및 Y407V 및 임의적으로 Y349C 또는 S354C, 바람직하게는 Y349C)를 포함할 수 있다(예컨대, 문헌[Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73])(EU 인덱스 넘버링에 따름).
일부 양태에서, (a)의 2개의 항체 중쇄는 i) 서열번호 22의 아미노산 1 내지 450의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 위치 354에서 C 및 위치 366에서 W(EU 넘버링)를 갖는 제1 항체 중쇄; 및 ii) 서열번호 23의 아미노산 1 내지 450의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 위치 349에서 C, 위치 366에서 S, 위치 368에서 A 및 위치 407에서 V(EU 넘버링)를 갖는 제2 항체 중쇄를 포함할 수 있다.
임의적으로, 연결기는 전술된 바와 같다.
다른 양태에서, 이중특이적 항체는
i) 서열번호 22의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄,
ii) 서열번호 23의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 제2 중쇄,
iii) 서열번호 21의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 2개의 항체 경쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항체는
i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄;
ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄; 및
iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 2개의 항체 경쇄
를 포함하는, 본원에서 PRIT-0213으로 지칭되는 분자이다.
다른 양태에서, 이중특이적 항체는
i) 서열번호 19의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄,
ii) 서열번호 20의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 제2 중쇄,
iii) 서열번호 21의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 2개의 항체 경쇄를 포함한다
또 다른 양태에서, 이중특이적 항체는
i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄;
ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄; 및
iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 2개의 항체 경쇄
를 포함하는, 본원에서 PRIT-0214로 지칭되는 분자이다.
한 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 전술된 3가 구조를 가질 수 있고,
a) ERBB2에 특이적으로 결합하고, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체로서, 중쇄가 서열번호 36 또는 37의 아미노산 1 내지 449(포함적, 순차적 넘버링을 사용함)의 중쇄(즉, 연결기 앞의 서열의 부분)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 경쇄가 서열번호 38의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는, 전장 항체; 및/또는
b) i) 서열번호 7 또는 9(일부 양태에서, 바람직하게는 7)의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH); 또는 ii) 서열번호 7 또는 9(일부 양태에서, 바람직하게는 7)의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1); 또는 iii) 서열번호 7 또는 9(일부 양태에서, 바람직하게는 7)의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드; 및/또는
c) i) 서열번호 8 또는 10(일부 양태에서, 바람직하게는 8)의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL); 또는 ii) 서열번호 8 또는 10(일부 양태에서, 바람직하게는 8)의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 서열번호 8 또는 10(일부 양태에서, 바람직하게는 8)의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합에 융합되는, 폴리펩티드
를 포함할 수 있고, (b)의 펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 및 (c)의 펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인은 함께 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.
전술된 바와 같이, 임의의 상기 양태에서, 전장 항체의 중쇄 중 하나는 소위 "놉 돌연변이"(T366W 및 임의적으로 S354C 및 Y349C 중 하나, 바람직하게는 S354C)를 포함할 수 있고 다른 하나는 소위 "홀 돌연변이"(T366S, L368A 및 Y407V 및 임의적으로 Y349C 또는 S354C, 바람직하게는 Y349C)를 포함할 수 있다(예컨대, 문헌[Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73])(EU 인덱스 넘버링에 따름).
한 양태에서, (a)의 2개의 항체 중쇄는 i) 서열번호 37의 아미노산 1 내지 449(포함적, 순차적 넘버링을 사용함)의 중쇄(즉, 연결기 앞의 서열)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 위치 349에서 C, 위치 366에서 S, 위치 368에서 A 및 위치 407에서 V(EU 넘버링)를 갖는 제1 항체 중쇄; 및 ii) 서열번호 36의 아미노산 1 내지 449(포함적, 순차적 넘버링을 사용함)의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 위치 354에서 C 및 위치 366에서 W(EU 넘버링)를 갖는 제2 항체 중쇄를 포함한다.
임의적으로, 연결기는 전술된 바와 같다.
다른 양태에서, 이중특이적 항체는
i) 서열번호 36의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄,
ii) 서열번호 37의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 제2 중쇄,
iii) 서열번호 38의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 2개의 항체 경쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항체는
i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄;
ii) 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄; 및
iii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 2개의 항체 경쇄
를 포함하는, 본원에서 P1AD9827로 지칭되는 분자이다.
다른 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 전술된 3가 구조를 가질 수 있고,
a) CD20에 특이적으로 결합하고, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체로서, 중쇄가 서열번호 47 또는 48의 아미노산 1 내지 448(포함적, 순차적 넘버링을 사용함)의 중쇄(즉, 연결기 앞의 서열의 부분)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 경쇄가 서열번호 49의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는, 전장 항체; 및/또는
b) i) 서열번호 7 또는 9(일부 양태에서, 바람직하게는 7)의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH); 또는 ii) 서열번호 7 또는 9(일부 양태에서, 바람직하게는 7)의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1); 또는 iii) 서열번호 7 또는 9(일부 양태에서, 바람직하게는 7)의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드; 및/또는
c) i) 서열번호 8 또는 10(일부 양태에서, 바람직하게는 8)의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL); 또는 ii) 서열번호 8 또는 10(일부 양태에서, 바람직하게는 8)의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 서열번호 8 또는 10(일부 양태에서, 바람직하게는 8)의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 다른 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드
를 포함할 수 있고, (b)의 펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 및 (c)의 펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인은 함께 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.
한 예에서, 전장 항체의 중쇄 중 하나는 소위 "놉 돌연변이"(T366W 및 임의적으로 S354C 및 Y349C 중 하나, 바람직하게는 S354C)를 포함할 수 있고 다른 하나는 소위 "홀 돌연변이"(T366S, L368A 및 Y407V 및 임의적으로 Y349C 또는 S354C, 바람직하게는 Y349C)를 포함할 수 있다(예컨대, 문헌[Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73])(EU 인덱스 넘버링에 따름).
일부 양태에서, (a)의 2개의 항체 중쇄는 i) 서열번호 48의 아미노산 1 내지 448(포함적, 순차적 넘버링을 사용함)의 중쇄(즉, 연결기 앞의 서열)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 위치 349에서 C, 위치 366에서 S, 위치 368에서 A 및 위치 407에서 V(EU 넘버링)를 갖는 제1 항체 중쇄; 및 ii) 서열번호 47의 아미노산 1 내지 448(포함적, 순차적 넘버링을 사용함)의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 위치 354에서 C 및 위치 366에서 W(EU 넘버링)를 갖는 제2 항체 중쇄를 포함한다.
임의적으로, 연결기는 전술된 바와 같다.
다른 양태에서, 이중특이적 항체는
i) 서열번호 47의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄,
ii) 서열번호 48의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 제2 중쇄,
iii) 서열번호 49의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 2개의 항체 경쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항체는
i) 서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄;
ii) 서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄; 및
iii) 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 2개의 항체 경쇄
를 포함하는, 본원에서 P1AD9826으로 지칭되는 분자이다.
추가 양상에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 집합에 관한 것이다. 추가 양태에서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 발현 벡터 집합, 임의적으로 발현 벡터에 관한 것이다. 추가 목적으로, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 항체를 생산하기 위하여 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법이 제공된다.
본원에 기술된 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 사전-표적화된 방사선면역요법 및 사전-표적화된 방사선면역영상화와 같은 치료 및 진단 적용례를 비롯한 다양한 적용례에서 용도를 찾을 수 있다.
따라서, 추가 양상에서 본 발명은 사전-표적화된 방사선영상화에 사용하기 위한 본원에 기술된 임의의 이중특이적 또는 다중특이적 항체에 관한 것이다. 이러한 양태에서, 킬레이트화된 Pb는 바람직하게는 203Pb이다.
영상화를 위해 방사성 동위원소를 조직 또는 기관에 표적화시키는 방법은
i) 본원에 기술된 다중특이적 항체 또는 이중특이적 항체를 대상에게 투여하는 단계(이때, 항체는 표적 항원에 결합하고, 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 위치됨); 및
ii) 후속적으로, DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종을 개체에게 투여하는 단계(이때, DOTAM으로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종 또는 상기 이의 기능적 변이체는 표적 세포의 표면에 위치하는 항체에 결합함)를 포함할 수 있다.
임의적으로, 단계 i)과 ii) 사이에 클리어링제가 투여되고, 이때 클리어링제는 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위에 결합한다. 클리어링제는 Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위를 차단하고, 순환 항체가 킬레이트화된 Pb 방사성핵종에 결합하는 것을 방지한다. 다르게는 또는 추가적으로, 클리어링제는 신체로부터 항체의 클리어런스를 증가시킨다. "클리어링제"는 다르게는 "차단제"로서 지칭될 수 있고: 이러한 용어는 하기 논의에서 서로 치환될 수 있다.
클리어링제는 금속 이온과 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체의 복합체를 포함할 수 있고, 이때 상기 복합체는 Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위에 의해 인식된다. 바람직하게는, 금속 이온은 안정한 동위원소 또는 본질적으로 안정한 동위원소이다. "안정한 동위원소"는 방사성 붕괴를 겪지 않는 동위원소를 의미한다. "본질적으로 안정된 동위원소"는 반감기가 매우 긴 방사성 붕괴를 겪고 사용하기에 안전한 동위원소를 의미한다. 바람직하게는, 금속 이온은 Pb, Ca 및 Bi의 이온으로부터 선택된다. 예를 들어, 클리어링제는 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체와 복합체화된 Pb, DOTAM 또는 이의 기능적 변이체와 복합체화된 Ca, 또는 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체와 복합체화된 209Bi(반감기가 1.9 x 1019년인 본질적으로 안정한 동위원소)의 안정한 동위원소를 포함할 수 있다. Pb는 안정한(비-방사성) 동위원소 204Pb, 206Pb, 207Pb 및 208Pb의 혼합물인 자연 발생 납일 수 있다.
DOTAM 또는 이의 기능적 변이체는 클리어링 모이어티에 접합된다. 이러한 모이어티는, 예컨대 크기 및/또는 높은 유체역학적 반경으로 인해 종양으로의 낮은 흡수를 갖는 클리어링제를 제공한다. 적합한 클리어링 모이어티는 하기 더 논의된다. 일부 양태에서, 클리어링제는 덱스트란 또는 이의 유도체에 접합된 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체를 포함할 수 있다.
영상화 방법의 다른 양태에서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체는 투여 시에 킬레이트화된 Pb 방사성핵종에 결합될 수 있다.
임의적으로, 임의의 양태에서, 방법은 iii) DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종이 국지화된 조직 또는 기관을 영상화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 표적 항원은 종양-특이적 항원일 수 있고, 영상화는 종양을 영상화하는 방법일 수 있다.
다른 추가 양상에서, 본 발명은 사전-표적화된 방사선면역요법의 방법에 사용하기 위한 본원에 기술된 항체에 관한 것이다. 이러한 양태에서, 킬레이트화된 Pb는 바람직하게는 212Pb이다.
치료법을 위해 방사성 동위원소를 조직 또는 기관으로 표적화시키는 방법은 i) 본원에 기술된 다중특이적 또는 이중특이적 항체를 대상에게 투여하는 단계(이때, 항체는 표적 항원에 결합하고, 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화됨); 및 ii) 후속적으로 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종을 투여하는 단계(이때, DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종은 세포 표면에 국지화된 항체에 결합함)를 포함할 수 있다.
임의적으로, 단계 i)과 ii) 사이에, 전술된 클리어링제가 투여된다.
일부 양태에서, 표적 항원은 종양-연관 항원이고, 방법은 암을 치료하는 방법이다. 다른 양태에서, 표적 항원은 감염과 연관된 항원, 예컨대 원핵생물 또는 바이러스-감염된 세포에 의해 발현된 단백질일 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 항체는 병용 요법의 일부로 투여될 수 있다. 예를 들어, 이들은 하나 이상의 방사선감작제 및/또는 화학요법제와 조합으로 투여될 수 있고, 방사선감작제 또는 화학요법제 및 항체는 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본원에 기술된 방사선영상화 및 방사선면역요법의 방법은, 예컨대 항체 및 203Pb-DOTAM 및 212Pb-DOTAM 둘 다를, 예컨대 혼합물로서 투여함으로써 임의적으로 조합될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 및 다음 중 1, 2, 3, 4개 또는 모두를 포함하는 키트에 관한 것이다:
i) 약학적으로 허용되는 부형제;
ii) DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종;
iii) 본원에 기술된 클리어링제;
iv) 하나 이상의 추가 화학요법제; 및/또는
v) 하나 이상의 방사선감작제.
본 발명의 또 다른 양상에서, 본 발명자들은 신규 클리어링제를 개발하였다. 이러한 클리어링제는 본원에 기술된 진단, 영상화 또는 치료 방법 중 임의의 방법에 사용될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 DOTAM 및 DOTAM의 기능적 변이체로부터 선택되는 킬레이터에 접합된 덱스트란 또는 이의 유도체를 포함하는 클리어링제에 관한 것으로서, 이때 상기 킬레이터는 Pb, Zn, Ca 또는 Bi와 복합체를 형성한다. 클리어링제는 전형적으로 Pb, Zn, Ca 또는 Bi 이온과 같은 킬레이트화된 금속 이온을 포함한다.
클리어링제는 DOTAM 또는 DOTAM의 기능적 변이체에 커플링된 아미노덱스트란를 포함할 수 있다. 예를 들어, 클리어링제는 이소티오시아네이트 커플링으로 아미노덱스트란에 커플링된 DOTAM을 포함할 수 있다(예컨대, 아미노덱스트란을 p-SCN-Bn-TCMC와 반응시킴으로써 수득가능한 화합물).
클리어링제의 사용에 있어 잠재적인 어려움 중 하나는 종양에 들어가 방사성 리간드의 후속 결합에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 것이다.
본 발명자들은 또한 i) 높은 평균 분자량을 갖고, ii) 특정 크기 미만의 단편이 제거되도록 분자량 컷-오프(cut-off)를 거친 덱스트란-기반 클리어링제가 사용될 때, 종양으로의 낮은 클리어링제 침투와 함께 혈액으로부터의 양호한 제거가 달성될 수 있음을 추가로 발견하였다.
따라서, 바람직한 클리어링제는 i) 클리어링제에서 덱스트란 또는 이의 유도체의 평균 분자량이 200 내지 800 kDa, 임의적으로 300, 350, 400 또는 450 kDa 초과, 및 임의적으로 700, 650, 600 또는 550 kDa 미만, 임의적으로 약 500 kDa이고, ii) 특정 분자량 컷-오프 미만의 덱스트란, 덱스트란 유도체 또는 클리어링제가 제거되었고, 이때 분자량 컷-오프는 50 kDa 이상, 100 kDa 이상 또는 200 kDa 이상, 임의적으로 50 내지 250 kDa 또는 50 내지 200 kDa 범위, 임의적으로 100 내지 200 kDa, 임의적으로 약 100 kDa, 150 kDa 또는 200 kDa이다.
추가 양상에서, 본 발명은 클리어링제의 제조 방법 및 방사선면역요법 또는 방사선면역영상화 방법에서 클리어링제의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 양상은 하기 추가로 논의된다.
도 1은 가능한 이중특이적 항체 형식의 개략적 표현을 도시한다. 이러한 형식은 하나의 표적(A)에 대한 2개의 항원 결합 부위와 제2 표적(B)에 대한 하나의 항원 결합 부위(2:1 형식)를 포함한다.
도 2는 Pb-DOTAM과의 복합체인 PRIT-0213의 구조를 도시한다.
도 3은 Pb-DOTAM과의 복합체인 PRIT-0213의 상호작용 부위에 대한 도면(카밧에 따라 넘버링됨)을 도시한다.
도 4는 방사선표지된 DOTAM의 주사 24시간 후 212Pb의 분포(%ID/g ± SD, n = 3)를 도시한다. PRIT-0206, -0207, -0208 및 -0165는 T84.66을 표적으로 하는 반면, PRIT-0186, -0187 및 -0156은 CH1A1A를 표적으로 한다. PRIT-0175는 비-CEA-결합 대조군이다.
도 5는 방사선표지된 DOTAM과 사전-결합된 PRIT 항체의 주사 후 96시간에 분 당 카운트(CPM)로 표현된 203Pb의 분포(CPM ± SD, n = 3)를 도시한다. PRIT-0205, -0206, -0207, -0208 및 -0209는 완전히 인간화된 구축물인 반면, PRIT-0165 및 -0175는 각각 양성 및 음성 대조군이다.
도 6은 방사선표지된 DOTAM과 사전-결합된 PRIT 항체의 주사 후 다양한 시점에서 CPM ± SD(n = 3)로 표현된 BxPC3 종양 및 혈액에서 203Pb-DOTAM-bsAb의 축적/제거를 도시한다. PRIT-0206은 PRIT-0165의 완전히 인간화된 버전이고; PRIT-0175는 비-CEA-결합 대조군이다.
도 7은 MKN45 종양-함유 마우스에서 212Pb-표지된 클리어링제의 주사 후 2시간에 선택되는 조직에서의 방사능 분포(%ID/g + SD, n = 3)를 도시한다.
도 8은 MKN45 종양-함유 마우스에서 212Pb-표지된 클리어링제의 주사 후 24시간에 선택되는 조직 및 소변에서의 방사능 분포(%ID/g ± SD, n = 3)를 도시한다.
도 9는 MKN45 종양-함유 마우스에서 212Pb-표지된 클리어링제의 주사 후 24시간에 선택되는 조직 및 소변에서 기관별 방사능 분포(%ID + SD, n = 3)를 도시한다.
도 10은 종양-부재 마우스에서 203Pb-표지된 클리어링제의 주사 후 1주에 선택되는 조직에서의 방사능 분포(%ID/g + SD, n = 3)를 도시한다.
도 11은 종양-부재 마우스에서 203Pb-표지된 클리어링제의 주사 후 1주에 선택되는 조직에서 기관별 방사능 분포(%ID ± SD, n = 3)를 도시한다.
도 12는 212Pb-DOTAM의 주사 후 4시간에 혈액내 방사능 함량을 도시한다(%ID/g + SD, n = 3). 줄무늬 막대는 모든 후보 시약이 비교된, 비-CA 대조군(클리어링제 없음)을 나타낸다. 별표는 통계적 유의 수준을 낮음(*)에서 높음(***)까지 표시한다.
도 13은 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 혈액내 평균 방사능 함량을 도시한다(%ID/g + SD, n = 3). 줄무늬 막대는 모든 후보 시약이 비교된 비-CA 대조군(클리어링제 없음)을 나타낸다.
도 14는 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 혈액 및 종양의 방사능 함량을 도시한다(%ID/g + SD, n = 3).
도 15는 30 또는 100 μg의 이중특이적 항체 및 100- 또는 30-kDa 여과 컷-오프를 갖는 10 내지 100 μg의 클리어링제를 사용하거나 클리어링제를 전혀 사용하지 않은(PBS), 방사선표지된 DOTAM의 주사 후 24시간에 212Pb의 분포(%ID/g + SD, n = 3)를 도시한다.
도 16은 클리어링제의 양(0 내지 100μg)이 증가함에 따라 혈액 및 종양에서 212Pb의 활성 농도에 대한 효과를 도시한다. 종양은 100 μg의 PRIT-0165, 및 4일 후 100-kDa 컷-오프 또는 PBS로 정용여과된 Dex500을 사용하여 사전-표적화되었다. 212Pb-DOTAM은 클리어링제 후 2시간에 투여되었다. 기호는 방사능 주사 후 24시간에%ID/g을 나타내고, 선은 종양 데이터의 선형 회귀를 나타낸다.
도 17은 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 선택되는 조직의 방사능 분포를 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3). 짙은 회색 및 흑색 막대는 후보 시약과 비교된 비-CA 양성 대조군(클리어링제 없음)을 나타낸다.
도 18은 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 혈액 및 종양의 212Pb 함량(%ID/g + SD, n = 3) 및 상응하는 종양 대 혈액 비를 도시한다. 짙은 회색 및 흑색 막대는 후보 시약과 비교된 비-CA 양성 대조군(클리어링제 없음)을 나타낸다.
도 19는 클리어링제(CA) 양(PJRD08-46) 및 TCMC 포화(9-, 20-, 39- 또는 84-대-1)의 함수로서 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 종양 대 혈액 비를 도시한다. 점선은 각 데이터의 선형 회귀(R2 = 0.82) 및 비선형 곡선 정합(R2 = 0.74)을 나타낸다.
도 20은 방사선표지된 DOTAM의 주사 후 24시간에 212Pb의 분포를 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3). 백색 및 회색 배경의 막대는 각각 T84.66 및 CH1A1A의 표적화를 나타내고; 흑색 막대는 비-CEA-결합 대조군을 나타낸다.
도 21은 BxPC3 모델에서 치료 사이클 1 및 2에 대한 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 선택되는 조직의 방사능 분포(%ID/g + SEM, n = 3)를 도시한다.
도 22는 BxPC3 모델에서 CEA-PRIT 후 군 A 내지 G(n = 8)의 평균 체중을 도시한다. 곡선은 각 군에서 처음 사망할 때 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
도 23은 BxPC3 모델에서 CEA-PRIT 후 군 A 내지 G(n = 8)의 평균 체중 변화를 도시하고, 초기 체중의 백분율로 표현된다. 곡선은 각 군에서 처음 사망할 때 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
도 24는 BxPC3 모델에서 군 A 내지 G(n = 8)에 대한 표준 오차와 함께 종양 성장 평균을 도시한다. 곡선은 각 군에서 처음 사망할 때 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
도 25는 BxPC3 모델에서 군 A 내지 G에 대한 개별 종양 성장 곡선을 도시한다. 수직 점선은 212Pb-DOTAM의 투여를 나타낸다.
도 26은 BxPC3 모델에서 군 A 내지 G(n = 8)의 생존을 나타내는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 도시한다. 수직 점선은 212Pb-DOTAM의 투여를 나타낸다.
도 27은 LS174T 모델에서 치료 사이클 1 및 2에 대한 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 선택되는 조직의 방사능 분포(%ID/g ± SD, n = 3)를 도시한다.
도 28은 LS174T 모델에서 CEA-PRIT 후 군 A 내지 G(n = 8)의 평균 체중을 도시한다. 곡선은 각 군에서 처음 사망할 때 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
도 29는 LS174T 모델에서 CEA-PRIT 후 군 A 내지 G(n = 8)의 평균 체중 변화를 도시하고, 초기 체중의 백분율로 표현된다. 곡선은 각 군에서 처음 사망할 때 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
도 30은 LS174T 모델에서 군 A 내지 G(n = 8)에 대한 표준 오차와 함께 종양 성장 평균을 도시한다. 곡선은 각 군에서 처음 사망할 때 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
도 31은 LS174T 모델에서 군 A 내지 G에 대한 개별 종양 성장 곡선을 도시한다. 수직 점선은 212Pb-DOTAM의 투여를 나타낸다.
도 32는 LS174T 모델에서 군 A 내지 G(n = 8)의 생존을 나타내는 카플란-마이어 곡선을 도시한다. 수직 점선은 212Pb-DOTAM의 투여를 나타낸다.
도 33은 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 선택되는 조직의 방사능 분포를 도시한다(%ID/g + SD, n = 3). 회색 막대는 다양한 양의 Dex500-(50%) 클리어링제(CA)의 주사 후 조직 축적을 나타내고; 흑색 막대는 비-CA 대조군(클리어링제 없음)을 나타낸다.
도 34는 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 혈액 및 종양에서 212Pb 함량(%ID/g ± SD, n = 3) 및 상응하는 종양 대 혈액 비를 도시한다. 회색 막대는 다양한 양의 Dex500-(50%) 클리어링제(CA)의 주사 후 조직 축적을 나타내고; 흑색 막대는 비-CA 대조군(클리어링제 없음)을 나타낸다.
도 35는 212Pb-DOTAM의 주사 후 4시간에 혈액내 방사능 함량(%ID/g ± SD, n = 3)을 도시한다.
도 36은 2차 검출(우측 패널, 알렉사(Alexa) 488) 또는 DOTAM FITC(좌측 패널, FITC-A)를 사용하여 검출하는, MKN-45 세포에 대한 하나의 항체(PRIT-0165)의 결합을 도시한다.
도 37은 예시적인 표적 항원으로서 CEA를 사용하는 이중특이적 항체에 대한 가능한 형식을 도시한다. 다른 표적 항원도 사용될 수 있다.
도 38은 HeR2 결합 능력을 증명하기 위한 KPL-4 세포에 대한 P1AD8927의 결합을 도시한다: 인간 IgG 특이적 2차 항체를 사용한 항체 검출.
도 39는 DOTAM 결합 능력을 증명하기 위한 KPL-4 세포에 대한 P1AD8927의 결합을 도시한다: Pb-DOTAM-FITC를 사용한 이소타입 교정 검출.
도 40은 CD20 결합 능력을 증명하기 위한 Raji 세포에 대한 P1AD8926의 결합을 도시한다: 인간 IgG 특이적 2차 항체를 사용한 항체 검출.
도 41은 DOTAM 결합 능력을 증명하기 위한 Raji 세포에 대한 P1AD8926의 결합을 도시한다: Pb-DOTAM-FITC를 사용한 이소타입 교정 검출.
도 42는 SCID 마우스의 s.c. BxPC3 종양의 CEA-PRIT를 평가하는 프로토콜 103의 연구 개요를 도시한다(h = 시간, d = 일, w = 주).
도 43: 패널 A는 두 치료 사이클 후 수집된 조직에서 212Pb의 평균 축적을 도시한다(%ID/g + SD(n = 3)로 표시됨). 패널 B는 안락사시 상응하는 종양 부피(mm3)와 함께 각 마우스에 대한 212Pb의 개별 종양 흡수를 도시한다.
도 44는 BxPC3 모델에서 군 A 내지 G(n = 10)에 대한 표준 오차와 함께 평균 종양 성장 곡선을 도시한다. 곡선은 n < 5에서 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여(30 또는 10 μCi)를 나타낸다.
도 45는 BxPC3 모델에서 군 A 내지 G(n = 10)에 대한 개별 종양 성장 곡선을 도시한다. 수직 점선은 212Pb-DOTAM(30 또는 10 μCi)의 투여를 나타낸다.
도 46은 BxPC3 모델에서 군 A 내지 G(n = 10)의 생존을 나타내는 카플란-마이어 곡선을 도시한다. 수직 점선은 212Pb-DOTAM(30 또는 10 μCi)의 투여를 나타낸다.
도 47은 BxPC3 모델에서 CEA PRIT 후 군 A 내지 G(n = 10)의 평균 체중 감소를 도시한다. 곡선은 n < 5에서 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
도 48은 s.c. BxPC3 종양을 갖는 SCID 마우스에서 203Pb-BsAb(20 μCi, 100 μg)의 분포를 도시한다. 마우스에 20 μCi의 사전-결합된 203Pb-DOTAM-CEA-DOTAM 또는 203Pb-DOTAM-DIG-DOTAM(음성 대조군)을 주사한 후, 주사 후 1, 4, 7 또는 10일에 장기 수확을 통해 수집된 조직에서 축적된 방사능(%ID/g + SD, n = 5)을 평가하였다.
도 49는 20 μCi/100 μg의 사전-결합된 203Pb-DOTAM-CEA-DOTAM 또는 203Pb-DOTAM-DIG-DOTAM(음성 대조군)의 주사 후 1 내지 10일에 s.c BxPC3 종양에서 203Pb-BsAb의 축적(%ID/g + SD, n = 5)을 도시한다.
도 50은 s.c BxPC3 종양을 갖는 SCID 마우스에서 212Pb의 분포를 도시한다. 방사능 주사(%ID/g + SD, n = 5) 후 5분 내지 48시간에 마우스에 212Pb-DOTAM 투여 전에 CEA-DOTAM BsAb 및 CA를 주사하였다. * 시간 경과에 따른 소변 및 대변의 누적 212Pb 함량(즉, 이전 값을 포함한 각 시점). 소변에서 추정된 %ID/g는 5 마리 마우스에서 모은 소변/세척 용액(50 mL)의 1/5(10 mL)을 기준으로 한다.
도 51은 s.c. BxPC3 종양을 갖는 SCID 마우스에서 5개의 상이한 금속 중 하나(Zn, Gd, Cu, Ca 또는 Pb)로 급랭된 CEA-DOTAM BsAb, Pb-DOTAM-덱스트란-500 CA 및 212Pb-DOTAM을 사용하는 PRIT 후 212Pb의 생체내 분포를 평가하는 프로토콜 131의 연구 개요를 도시한다(d = 일, h = 시간).
도 52는 CEA-DOTAM-사전-표적화된 212Pb-DOTAM의 주사 후 2시간에 종양-함유 SCID 마우스에서 212Pb의 분포(%ID/g ± SD, n = 4)를 도시한다.
도 53은 상이한 금속으로 급랭된 212Pb-DOTAM의 주사 후 2시간에 종양-함유 SCID 마우스의 선택되는 정상 조직에서의 212Pb 분포(%ID/g)를 도시한다.
도 54는 CD20-DOTAM BsAb 또는 음성 대조군 DIG-DOTAM에 의해 사전-표적화된 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 종양-함유 SCID 마우스에서 212Pb의 분포(%ID/g + SD, n = 3)를 도시한다.
도 55는 HeR2-DOTAM BsAb 또는 음성 대조군 DIG-DOTAM에 의해 사전-표적화된 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 종양-함유 SCID 마우스에서 212Pb의 분포(%ID/g + SD, n = 3)를 도시한다.
도 56은 s.c HPAF-II 종양을 갖는 SCID 마우스에서 다양한 BsAb 구축물을 사용하여 CEA-PRIT 후 212Pb-DOTAM의 생체분포를 평가하는 프로토콜 154의 연구 개요를 도시한다(h = 시간, d = 일).
도 57은 음성 대조군 DIG-DOTAM, 표준 CEA-DOTAM BsAb, 또는 대체 BsAb 구축물 중 하나에 의해 사전-표적화된 212Pb-DOTAM의 주사 6시간에 종양-함유 SCID 마우스에서 212Pb의 분포(%ID/g ± SD, n = 3)를 도시한다.
도 58은 음성 대조군 DIG-DOTAM, 표준 CEA-DOTAM BsAb, 또는 대체 BsAb 구축물 중 하나에 의해 사전-표적화된 212Pb-DOTAM의 주사 후 6시간에 212Pb의 혈액 함량 및 종양 축적을 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3).
도 59는 프로토콜 162의 실험 계획을 도시한다. CD20-PRIT는 s.c. WSU-DLCL2 종양을 갖는 SCID 마우스에서 CD20-DOTAM BsAb, Ca-DOTAM-덱스트란-500 CA 및 212Pb-DOTAM을 사용하여 수행되었고; 1-단계 RIT는 s.c. WSU-DLCL2 종양을 갖는 SCID 마우스에서 212Pb-DOTAM(212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM)과 사전-결합된 CD20-DOTAM BsAb를 사용하여 수행되었다.
도 60은 CD20-DOTAM-사전-표적화된 212Pb-DOTAM 또는 사전-결합된 212Pb-DOTAM-CD2O-DOTAM의 주사 후 24시간에 종양-함유 SCID 마우스에서 212Pb의 분포를 도시한다. 기관 및 조직의 방사능 함량은 평균 %ID/g 및 표준 편차(SD, n = 3)로 표시된다.
도 61은 mm3 ± SEM(n = 10)으로 표시된, 군 A 내지 G에 대한 평균 WSU-DLCL2 s.c 종양 성장을 도시한다.
도 62는 초기 체중의 % ± SEM으로 표시된, 다양한 치료 후 마우스 체중의 평균 변화를 도시한다. 점선은 치료 계획에 따라 212Pb 또는 항체 주사을 나타낸다.
정의
본원의 목적을 위한 "수용자 인간 프레임워크"는 하기 정의된 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 일부 양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예컨대, 항체)와 그 결합 파트너(예컨대, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예컨대, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 비롯한 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정 설명적 및 예시적 양태는 이하 기술된다.
"친화도 성숙" 항체는 이러한 변경을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 의미하고, 이러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화도의 개선을 초래한다.
용어 "항-Pb-DOTAM 항체", "Pb-DOTAM에 결합하는 항체", "Pb-DOTAM 킬레이트에 결합하는 항체" 및 등가 용어는, 예컨대, Pb-DOTAM을 세포에 표적화시키기 위해, 항체가 Pb-DOTAM 표지된 모이어티를 분리하기 위한 분류 및/또는 정제 계획에 유용하고/거나 항체가 Pb-DOTAM을 항체 부위에 국지화할 수 있도록 충분한 친화도를 갖는 Pb-DOTAM 킬레이트에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 용어 "항-표적 항체" 및 "표적에 결합하는 항체"는 항체가, 예컨대 세포 표면에서 발현되는 표적으로의 항체의 국지화를 포함하는 치료 및/또는 진단 적용에 유용하도록 충분한 친화 도로 표적에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 양태에서, 관련되지 않은 모이어티 및/또는 관련되지 않은 표적 단백질에 대한 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사선면역검정(RIA)에 의해 측정된 Pb-DOTAM 또는 표적에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 양태에서, 항체는 Pb-DOTAM 및/또는 표적에 대해 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM(예컨대, 10-8 M 이하, 예컨대, 10-8 내지 10-13 M, 예컨대 10-9 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 비제한적으로 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 비롯한 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자(예컨대, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
기준 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 기준 항체의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭할 수 있고, 반대로 기준 항체는 경쟁 검정에서 항체의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차당한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래하고, 중쇄 및/또는 경쇄의 다른 하나가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래하는 항체를 지칭한다.
항체의 "클래스"는 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 클래스가 있고, 이들 중 일부는 서브클래스(이소타입), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, β, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 예방하고/거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 비제한적으로 방사성 동위원소(예컨대, 225Ac, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 213Bi, 32P, 212Pb 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법 제제 또는 약물(예컨대, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소, 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소(이의 단편 및/또는 변이체를 포함함); 및 하기 개시된 다양한 항종양 또는 항암 제제를 포함한다.
"효과기 기능"은 항체 이소타입에 따라 변하는 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체)의 하향조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
제제, 예를 들어 약학 제형의 "효과량"은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 용량으로 및 필요한 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 이 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230에서 중쇄의 카복실-말단까지 연장된다. 그러나 Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같이 EU 인덱스로 지칭되는 EU 넘버링 시스템을 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 4개의 FR 도메인으로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 전장 항체는, 예를 들어 IgG일 수 있다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 이러한 세포의 자손을 비롯한, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하고, 이는 계대 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 포함할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별되거나 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항-코딩 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 구체적으로 배제한다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군에서 나온다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 양태에서, VL의 경우, 하위군은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 양태에서, VH의 경우, 하위군은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같이 하위군 III이다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR의 아미노산 잔기 및 인간 FR의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 양태에서, 인간화된 항체는 HVR(예컨대, CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 항체의 것들에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 항체의 것들에 상응하는 하나 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예컨대 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고/거나 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하고/거나 항원-접촉 잔기("항원 접촉")를 함유하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)인 6개의 HVR을 포함한다. 예시적인 HVR은 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에서 발생하는 초가변 루프(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]);
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)에서 발생하는 CDR(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]);
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2) 및 93-101(H3)에서 발생하는 항원 접촉(문헌[MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및
(d) (a), (b) 및/또는 (c)의 조합, 예컨대 HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3) 및 94-102(H3).
상기 대신, 본원에 기술된 CDR-H1의 서열은 카밧26에서 카밧35로 연장될 수 있다.
한 양태에서, HVR 또는 CDR 잔기는 표 2 또는 명세서의 다른 곳에서 확인된 것들을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, HVR/CDR 잔기 및 가변 도메인의 다른 잔기(예컨대, FR 잔기)는 카밧 등의 상기 문헌에 따라 본원에서 넘버링된다.
"면역접합체"는 하나 이상의 이종 분자, 예컨대 비제한적으로 세포독성제에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예컨대, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정 양태에서, 개체 또는 대상은 인간이다.
본원에 기술된 분자는 "단리"될 수 있다. "단리된" 항체는 자연 환경의 성분으로부터 분리된 항체이다. 일부 양태에서, 항체는, 예를 들어 전기영동(예컨대, SDS-PAGE, 등전 집속(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정된 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도 평가 방법을 검토하려면, 예컨대, 문헌[Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참고한다.
용어 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특히 퓨린 또는 피리미딘 염기(예컨대, 시토신(C), 구아닌(G), 아데닌(A), 티민(T) 또는 우라실(U)), 당(예컨대, 데옥시리보스 또는 리보스) 및 포스페이트 기로 이루어진다. 종종, 핵산 분자는 염기 서열로 기술되고, 이에 의해 염기는 핵산 분자의 1 차 구조(선형 구조)를 나타낸다. 염기의 순서는 일반적으로 5'에서 3'까지 표시된다. 본원에서, 용어 핵산 분자는 데옥시리보핵산(DNA), 예컨대 상보적 DNA(cDNA) 및 게놈 DNA, 리보핵산(RNA), 특히 메신저 RNA(mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태, 및 이들 분자 중 2개 이상을 포함하는 혼합 중합체를 포괄한다. 핵산 분자는 선형 또는 원형일 수 있다. 또한, 용어 핵산 분자는 센스 및 안티센스 가닥, 및 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 둘 다 포함한다. 또한, 본원에 기술된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 비-천연 발생 뉴클레오티드의 예는 유도체화된 당 또는 포스페이트 골격 연결기 또는 화학적으로 변형된 잔기가 있는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 핵산 분자는 또한, 예컨대 숙주 또는 환자에서, 본 발명의 항체의 시험관내 및/또는 생체내 직접 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA 및 RNA 분자를 포괄한다. 이러한 DNA(예컨대, cDNA) 또는 RNA(예컨대, mRNA) 벡터는 변형되지 않거나 변형될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 RNA 벡터의 안정성 및/또는 코딩된 분자의 발현을 향상시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있고, 이에 의해 mRNA는 생체 내에서 항체를 생성하기 위해 대상에 주사될 수 있다(예컨대, 문헌[Stadler et al, Nature Medicine 2017, published online 12 June 2017, doi:10.1038/nm.4356] 또는 유럽 특허공보 제2 101 823 B1호 참고).
"단리된" 핵산은 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 일반적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 자연 염색체 위치와 다른 염색체 위치에 존재한다.
"항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 개별 벡터에서 이러한 핵산 분자 및 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자를 비롯한, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합하지만, 가능한 변이체 항체는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 단일클론 항체 제제의 생산 중에 발생하고, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로, 상이한 결정인자(에피토프)를 지향하는 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 달리, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자를 지향한다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 간주되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 다양한 기술, 예컨대, 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자이식 동물을 이용하는 방법에 의해 제조될 수 있고, 이러한 방법 및 단일클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본원에 기술된다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티(예컨대, 세포독성 모이어티) 또는 방사선표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 약학 제형에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 2개의 동일한 경쇄와 다이설파이드 결합된 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 지칭되는 가변 영역(VH), 및 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 지칭되는 가변 영역(VL), 및 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파(к) 및 람다(λ)로 지칭되는 2개의 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 용량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함된 설명서를 지칭하는 데 사용된다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 보존적 치환을 고려하지 않은, 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯한, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 창작되었고, 소스 코드는 사용자 문서와 함께 미국 저작권 사무소(미국 워싱턴 D.C. 20559 소재)에 제출되었고, 미국 저작권 등록번호 제TXU510087호로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재 제넨텍 인코포레이티드에서 공개적으로 이용가능하거나 소스 코드에서 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 체제에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(다르게는, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 x 분수 X/Y
이때, X는 A와 B의 해당 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 일치로 점수가 매겨진 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 총 아미노산 잔기의 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에 기술된 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여될 대상에게 허용되지 않는 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외의 약학 제형에서 대상에게 비독성인 구성요소를 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
본원에 사용된 "치료"(및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 이의 문법적 변형)는 치료되는 개인의 자연스러운 과정을 변경하려는 시도의 임상 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 도중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발의 예방, 증상 완화, 질병의 임의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질병 진행률의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 경감 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 질병의 발생을 지연시키거나 질병의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는 데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예컨대, 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다(예컨대, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)]; 문헌[Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 참고).
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터, 및 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Pb" 또는 "납"은 이의 이온, 예를 들어 Pb(II)를 포함한다. 따라서, 당업자는, 예를 들어 용어 납, Pb, 212Pb 또는 203Pb가 원소의 이온 형태, 특히 Pb(II)를 포함하도록 의도된다는 것을 이해한다. 본 발명의 다양한 양상에서, Pb는 방사성 동위원소(예컨대, 방사선면역요법 또는 방사선면역영상화에 사용되는 경우)일 수 있거나, 안정한 비-방사성 동위원소(예컨대, 클리어링제의 맥락에서 바람직할 수 있음)일 수 있다.
"DOTAM"의 하기 화학식의 화합물이고, 화학명 1,4,7,10-테트라키스(카바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸을 갖는다:
Figure pct00001
.
212Pb-DOTAM은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00002
.
본 발명은 특정 양상 및 양태에서 또한 금속 이온을 혼입하는 DOTAM의 기능적 변이체 또는 유도체를 사용할 수 있다. DOTAM의 적합한 변이체/유도체는 DOTAM의 구조와 어느 정도 제한적으로 다른 구조를 갖고, 기능하는 능력을 보유한다(즉, 본원에 기술된 목적 중 하나 이상에 사용하기에 충분한 활성을 보유함). 이러한 양상 및 양태에서, DOTAM 또는 DOTAM의 기능적 변이체/유도체는 국제 특허공보 제2010/099536호에 개시된 활성 변이체 중 하나일 수 있다.
적합한 기능적 변이체/유도체는 하기 화학식의 화합물 또는 또는 이의 약학적으로 허용되는 염일 수 있다:
Figure pct00003
상기 식에서,
RN은 H, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알켄일, C2-6 알킨일, C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-4 알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬-C1-4 알킬, 페닐, 페닐-C1-4 알킬, C1-7 헤테로아릴 또는 C1-7 헤테로아릴-C1-4 알킬이고; 이때 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알켄일 및 C2-6 알킨일은 각각 임의적으로 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택되는 Rw 기로 치환되고; C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-4 알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬-C1-4 알킬, 페닐, 페닐-C1-4 알킬, C1-7 헤테로아릴 및 C1-7 헤테로아릴-C1-4-알킬은 각각 임의적으로 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택되는 Rx 기로 치환되고;
L1은 독립적으로 C1-6 알킬렌, C1-6 알켄일렌 또는 C1-6 알킨일렌이고, 각각 임의적으로 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택되는 R1 기로 치환되고;
L2는 C2-4 직쇄 알킬렌이고, 임의적으로 독립적으로 선택되는 R1 기로 치환되고; 임의적으로 C1-4 알킬 및/또는 C1-4 할로알킬로부터 독립적으로 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 기로 치환되고;
R1은 D1-D2-D3, 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록실, C1-6 알콕시, C1-6 할로알콕시, C1-6 알킬티오, C1-6 알킬설피닐, C1-6 알킬설포닐, 아미노, C1-6 알킬아미노, 다이-C1-6 알킬아미노, C1-4 알킬카보닐, 카복시, C1-6 알콕시카보닐, C1-6 알킬카보닐아미노, 다이-C1-6 알킬카보닐아미노, C1-6 알콕시카보닐아미노, C1-6-알콕시카보닐-(C1-6 알킬)아미노, 카밤일, C1-6 알킬카밤일 및 다이-C1-6 알킬카밤일로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 D1은 C6-10 아릴-C1-4 알킬, C1-9 헤테로아릴-C1-4 알킬, C3-10 사이클로알킬-C1-4 알킬, C2-9 헤테로사이클로알킬-C1-4 알킬, C1-8 알킬렌, C1-8 알켄일렌 및 C1-8 알킨일렌으로부터 독립적으로 선택되고; 이때 C1-8 알킬렌, C1-8 알켄일렌 및 C1-8 알킨일렌은 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택되는 R4 기로 치환되고; C6-10 아릴-C1-4 알킬, C1-9 헤테로아릴-C1-4 알킬, C3-10 사이클로알킬-C1-4 알킬 및 C2-9 헤테로사이클로알킬-C1-4 알킬은 각각 임의적으로 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택되는 R5 기로 치환되고;
각각의 D2는 독립적으로 부재하거나 C1-20 직쇄 알킬렌이고, 이때 C1-20 직쇄 알킬렌의 1 내지 6개의 비인접 메틸렌 기는 각각 임의적으로 독립적으로 선택되는 D4 모이어티로 대체되되, C1-20 직쇄 알킬렌의 하나 이상의 메틸렌 단위는 임의적으로 -D4- 모이어티로 대체되지 않고; C1-20 직쇄 알킬렌은 임의적으로 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록실, C1 4 알킬, C1-4 할로알킬, C1-4 알콕시, C1-4 할로알콕시, 아미노, C1-4 알킬아미노, 다이-C1-4 알킬아미노, C1-4 알킬카보닐, 카복시, C1-4 알콕시카보닐, C1-4 알킬카보닐아미노, 다이-C1-4 알킬카보닐아미노, C1-4 알콕시카보닐아미노, C1-4 알콕시카보닐(C1-4 알킬)아미노, 카밤일, C1-4 알킬카밤일 및 다이-C1-4 알킬카밤일로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 치환되고;
각각의 D3은 H, 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록실, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알켄일, C2-6 알킨일, C3-14 사이클로알킬, C3-14 사이클로알킬-C1-4 알킬, C2-14 헤테로사이클로알킬, C2-14 헤테로사이클로알킬-C1-4 알킬, C6-14 아릴, C6-14 아릴-C1-4 알킬, C1-13 헤테로아릴 및 C1-13 헤테로아릴-C1-4 알킬로부터 독립적으로 선택되고; 이때 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알켄일 및 C2-6 알킨일은 각각 임의적으로 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택되는 R6 기로 치환되고; C3-14 사이클로알킬, C3-14 사이클로알킬-C1-4 알킬, C2-14 헤테로사이클로알킬, C2-14 헤테로사이클로알킬-C1-4 알킬, C6-14 아릴, C6-14 아릴-C1-4 알킬, C1-13 헤테로아릴 및 C1-13 헤테로아릴-C1-4 알킬은 각각 임의적으로 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택되는 R7 기로 치환되고;
각각의 D4는 -O-, -S-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=S)-, -NRbC(=O)NRc-, -NRbC(=S)NRc-, -S(=O), -S(=O)2-, -S(=O)NRa-, -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=O)O-, -OC(=O)NRa-, -OC(=S)NRa-, -NRa-, -NRbS(=O)NRc- 및 -NRbS(=O)2NRO-로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R4 및 R6은 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록실, C1-4 알콕시, C1-4 할로알콕시, C1-4 알킬티오, C1-4 알킬설피닐, C1-4 알킬설포닐, 아미노, C1-4 알킬아미노, 다이-C1-4 알킬아미노, C1-4 알킬카보닐, 카복시, C1-4 알콕시카보닐, C1-4 알킬카보닐아미노, 다이-C1-4 알킬카보닐아미노, C1-4 알콕시카보닐아미노, C1-4 알콕시카보닐(C1-4 알킬)아미노, 카밤일, C1-4 알킬카밤일 및 다이-C1-4 알킬카밤일로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R5는 할로겐, 시아노, 시아네이트, 이소티오시아네이트, 니트로, 하이드록실, C1-4 알킬, C2-4 알켄일, C2-4 알킨일, C1-4 알콕시, C1-4 할로알콕시, C1-4 알킬티오, C1-4 알킬설피닐, C1-4 알킬설포닐, 아미노, C1-4 알킬아미노, 다이-C1-4 알킬아미노, C1-4 알킬카보닐, 카복시, C1-4 알콕시카보닐, C1-4 알킬카보닐아미노, 다이-C1-4 알킬카보닐아미노, C1-4 알콕시카보닐아미노, C1-4 알콕시카보닐(C1-4 알킬)아미노, 카밤일, C1-4 알킬카밤일 및 다이-C1-4 알킬카밤일로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R7은 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록실, C1-6 알킬, C2-6 알켄일, C2-6 알킨일, C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-4 알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬-C1-4 알킬, 페닐, 페닐-C1-4 알킬, C1-7 헤테로아릴, C1-7 헤테로아릴-C1-4 알킬, -ORO, -SRO, -S(=O)RP, -S(=O)2RP, -S(=O)NRsRt, -C(=O)RP, -C(=O)ORP, -C(=O)NRsRt, -OC(=O)RP, -OC(=O)NRsRt, -NRsRt, -NRqC(=O)Rr, -NRqC(=O)ORr, -NRqC(=O)NRr, -NRqS(=O)2Rr 및 -NRPS(=O)2NRsRt로부터 독립적으로 선택되고; 이때 C1-6 알킬, C2-6 알켄일 및 C2-6 알킨일은 각각 임의적으로 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택되는 R' 기로 치환되고; C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-4 알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬-C1-4 알킬, 페닐, 페닐-C1-4 알킬, C1-7 헤테로아릴 및 C1-7 헤테로아릴-C1-4 알킬은 각각 임의적으로 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택되는 R" 기로 치환되고;
각각의 Ra, Rb 및 Rc는 H, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알켄일, C2-6 알킨일, C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-4 알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬-C1-4 알킬, 페닐, 페닐-C1-4 알킬, C1-7 헤테로아릴 및 C1-7 헤테로아릴-C1-4 알킬로부터 독립적으로 선택되고; 이때 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알켄일 및 C2-6 알킨일은 각각 임의적으로 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택되는 Rw 기로 치환되고; C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-4 알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬-C1-4 알킬, 페닐, 페닐-C1-4 알킬, C1-7 헤테로아릴 및 C1-7 헤테로아릴-C1-4 알킬은 각각 임의적으로 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택되는 Rx 기로 치환되고;
각각의 Ro, Rp, Rq, Rr, Rs 및 Rt는 H, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알켄일, C2-6 알킨일, C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-4 알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬-C1-4 알킬, 페닐, 페닐-C1-4 알킬, C1-7 헤테로아릴 및 C1-7 헤테로아릴-C1-4 알킬로부터 독립적으로 선택되고; 이때 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알켄일 및 C2-6 알킨일은 각각 임의적으로 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택되는 Ry 기로 치환되고; C3-7 사이클로알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-4 알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬, C2-7 헤테로사이클로알킬-C1-4 알킬, 페닐, 페닐-C1-4 알킬, C1-7 헤테로아릴 및 C1-7 헤테로아릴-C1-4 알킬은 각각 임의적으로 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택되는 Rz 기로 치환되고;
각각의 R', Rw 및 Ry는 하이드록실, 시아노, 니트로, C1-4 알콕시, C1-4 할로알콕시, 아미노, C1-4 알킬아미노 및 다이-C1-4 알킬아미노로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R", Rx 및 Rz는 하이드록실, 할로겐, 시아노, 니트로, C1-4 알킬, C1-4 할로알킬, C1-4 알콕시, C1-4 할로알콕시, 아미노, C1-4 알킬아미노 및 다이-C1-4 알킬아미노로부터 독립적으로 선택되되,
임의적으로 치환된 모이어티에서 각각의 원자의 원자가는 초과되지 않는다.
적합하게는, 상기 화학식의 기능적 변이체/유도체는 본 발명의 항체에 대한 친화도가 DOTAM과 비슷하거나 더 크고, Pb에 대한 결합 강도가 DOTAM과 비슷하거나 더 크다("친화도"는 전술된 바와 같이 해리 상수에 의해 측정됨). 예를 들어, 본 발명의 항체/Pb에 의한 기능성/변이 유도체의 해리 상수는 동일한 항체/Pb에 의한 DOTAM의 해리 상수보다 1.1배 이하, 1.2배 이하, 1.3배 이하, 1.4배 이하, 1.5배 이하 또는 2배 이하이다.
각각의 RN은 H, C1-6 알킬 또는 C1-6 할로알킬; 바람직하게는 H, C1-4 알킬 또는 C1-4 할로알킬일 수 있다. 가장 바람직하게는, 각각의 RN은 H이다.
DOTAM 변이체의 경우, 1, 2 또는 3개, 가장 바람직하게는 각각의 L2가 C2 알킬렌인 것이 바람직하다. 유리하게, DOTAM의 C2 알킬렌 변이체는 Pb에 대해 특히 높은 친화도를 가질 수 있다. L2에 대한 임의적인 치환기는 R1, C1-4 알킬 또는 C1-4 할로알킬일 수 있다. 적합하게, L2에 대한 임의적인 치환기는 C1-4 알킬 또는 C1-4 할로알킬일 수 있다.
임의적으로, 각각의 L2는 비치환된 C2 알킬렌 -CH2CH2-일 수 있다.
각각의 L1은 바람직하게는 C1-4 알킬렌, 더욱 바람직하게는 C1 알킬렌, 예컨대 -CH2-이다.
기능적 변이체/유도체는 또한 하나 이상의 추가 모이어티, 예를 들어 소분자, 폴리펩티드 또는 탄수화물에 접합된 전술된 DOTAM 또는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 부착은 거대환 고리의 골격에 있는 탄소 중 하나를 통해 발생할 수 있다. 소분자는, 예를 들어 염료(예컨대, 알렉사 647 또는 알렉사 488), 비오틴 또는 비오틴 모이어티일 수 있다. 폴리펩티드는, 예를 들어 올리고 펩티드, 예를 들어 치료 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대 항체일 수 있다. 예시적인 탄수화물은 덱스트란, 선형 또는 분지형 중합체 또는 공중합체(예컨대, 폴리알킬렌, 폴리(에틸렌-리신), 폴리메타크릴레이트, 폴리아미노산, 폴리- 또는 올리고-사카라이드, 덴드리머)를 포함한다.
DOTAM의 기능적 변이체/유도체는 하기 화학식의 화합물일 수 있다:
Figure pct00004
상기 식에서,
각각의 Z는 독립적으로 상기 정의된 R1이고;
p, q, r 및 s는 0, 1 또는 2이고;
p+q+r+s는 1 이상이다.
바람직하게는, p, q, r 및 s는 0 또는 1이고/거나 p+q+r+s는 1이다. 예를 들어, 화합물은 p+q+r+s = 1을 가질 수 있고, 이때 Z는 p-SCN-벤질 모이어티이고, 이러한 화합물은 매크로사이클릭스 인코포레이티드(Macrocyclics, Inc.)(미국 텍사스주 플라노 소재)에서 시판 중이다.
상세한 설명
조성 및 방법
항체
한 양상에서, 본 발명은 부분적으로 Pb-DOTAM에 특이적으로 결합하는 항체(즉, Pb와 복합체화된 DOTAM을 포함하는 킬레이트, 본원에서 "Pb-DOTAM 킬레이트"로도 지칭된)의 제공에 기초한다.
특정 양태에서, Pb-DOTAM에 특이적으로 결합하는 항체는 다음 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다:
· Pb-DOTAM 및 Bi-DOTAM에 특이적으로 결합하는 특성;
· Cu-DOTAM과 같은 다른 킬레이트화된 금속에 비해 Pb-DOTAM에 선택적인 특성;
· 매우 높은 친화도로 Pb-DOTAM에 결합하는 특성;
· 본원에 기술된 항체, 예를 들어 PRIT-0213 또는 PRIT-0214와 같은 Pb-DOTAM 상의 동일한 에피토프에 결합하고/거나 상기 항체와 동일한 접촉 잔기를 갖는 특성.
Pb의 방사성 동위원소는 진단 및 치료 방법에 유용하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 납의 특정 방사성 동위원소는 212Pb 및 203Pb를 포함한다. 납의 안정적인 동위원소, 예컨대 204Pb, 206Pb, 207Pb 또는 208Pb는 클리어링제에 사용될 수 있다. Pb는 안정한(비-방사성) 동위원소 204Pb, 206Pb, 207Pb 및 208Pb인 자연 발생 납일 수 있다.
α-입자 방사체인 방사성핵종은 짧은 경로 길이와 높은 선형 에너지 전달의 조합으로 인해 β-방사체보다 주변 조직에 더 적은 손상을 주면서 더 특정한 종양 세포를 죽일 가능성이 있다. 212Bi는 α-입자 방사체이지만 그것의 짧은 반감기는 직접 사용을 방해한다. 212Pb는 212Bi의 모 방사성핵종이고, 212Bi의 생체내 발생기로서 역할을 하여, 212Bi의 짧은 반감기를 효과적으로 극복할 수 있다(문헌[Yong and Brechbiel, Dalton Trans. 2001 June 21; 40(23)6068-6076]).
203Pb는 영상화 동위원소로 유용하다. 따라서, 203Pb-DOTAM에 결합된 항체는 방사선면역영상화(RII)에 유용할 수 있다.
일반적으로, 방사성 금속은 킬레이트화된 형태로 사용된다. 본 발명의 양상에서, DOTAM은 킬레이트화제로서 사용된다. DOTAM은 Pb(II)의 안정한 킬레이터이다(문헌[Yong and Brechbiel, Dalton Trans. 2001 June 21; 40(23)6068-6076]; 문헌[Chappell et al Nuclear Medicine and Biology, Vol. 27, pp. 93-100, 2000]). 따라서, DOTAM은 212Pb 및 203Pb와 같은 상기 논의된 납의 동위원소와 함께 특히 유용하다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명에 따른 항체는 Pb-DOTAM에 결합한다. 일부 양태에서, 항체가 100 pM, 50 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM 이하, 예컨대 0.9 pM 이하, 0.8 pM 이하, 0.7 pM 이하, 0.6 pM 이하 또는 0.5 pM 이하의 결합 친화도의 Kd 값으로 Pb-DOTAM에 결합하는 것이 바람직할 수 있다.
항체는 DOTAM에 의해 킬레이트화된 Bi에 추가로 결합한다. 일부 양태에서, 항체가 Bi-DOTAM(즉, 비스무스와 복합체화된 DOTAM을 포함하는 킬레이트, 본원에서 "Bi-DOTAM 킬레이트"로도 지칭됨)에 1 nM, 500 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM 이하, 예컨대 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM 이하의 결합 친화도의 Kd 값으로 결합하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 양태에서, 항체는 유사한 친화도로 Bi-DOTAM 및 Pb-DOTAM에 결합할 수 있다. 예를 들어, Bi-DOTAM/Pb-DOTAM에 대한 친화도의 비, 예컨대 Kd 값의 비가 0.1 내지 10, 예를 들어 1 내지 10인 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 예시적인 항체(PRIT-0213)에 대한 샘플 친화도 값은 하기 제공된다:
CEA-DOTAM BsAb의 금속-DOTAM 킬레이트 친화도
Figure pct00005
친화도는 킨엑사(KinExA) 평형 측정에 의해 측정되었다.
또한, 본 발명의 항체는 바람직하게는 Cu-DOTAM과 같은 다른 킬레이트화된 금속에 비해 Bi-DOTAM 및/또는 Pb-DOTAM에 선택적이다. 예를 들어, Pb-DOTAM/Cu-DOTAM에 대한 친화도의 비, 예컨대 Kd 값의 비는 100,000 이상일 수 있다.
일부 양태에서, 항체가, i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄; ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄; 및 iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 2개의 항체 경쇄를 갖는 이중특이적 항체(본원에서 PRIT-0213으로 지칭됨)와 동일하거나 더 큰 친화도(예컨대, 친화도의 Kd 값)로 Pb-DOTAM 및/또는 Bi-DOTAM에 결합하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 양태에서, 항체가, i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄; ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄; 및 iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 2개의 항체 경쇄를 갖는 이중특이적 항체(본원에서 PRIT-0214로 지칭됨)와 동일하거나 더 큰 친화도(예컨대, 친화도의 KD 값)로 DOTAM-킬레이트화된 Pb 및/또는 DOTAM-킬레이트화된 Bi에 결합하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 본원에 개시된 항체와 같은, 킬레이트 방사성핵종의 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합한다.
일부 양태에서, 항체는 Fab PRIT-0213과 같은, i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄; ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄; 및 iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 2개의 항체 경쇄를 갖는 Pb-DOTAM 킬레이트(Pb-DOTAM)의 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합한다.
주어진 항체에 의해 결합된 킬레이트화된 방사성핵종(예컨대, Pb-DOTAM)의 에피토프가 결정될 수 있고, 이는 본원에 개시된 항체(예컨대, Fab PRIT-0213)에 의해 결합된 킬레이트화된 방사성핵종의 에피토프와 비교될 수 있다.
실시예 14에서 본 개시내용은 1.40 Å 해상도에서 Pb-DOTAM과의 복합체에서 Fab PRIT-0213의 결정 구조의 결정, 및 단백질 인터페이스 표면 및 조립(PISA) 프로그램을 사용하는 이러한 구조의 분석에 기초하여 Fab PRIT-0213과 Pb-DOTAM 사이의의 결합 상호작용의 특징규명을 기술한다(문헌[Krissinel and Henrick, J Mol Biol (2007) 372(3):774-97]).
일부 양태에서, 본 발명에 따른 항체는, 예컨대 Pb-DOTAM과의 복합체에서 항체의 구조의 PISA 분석에 의해 측정된, Pb-DOTAM과 관련하여 하기 부위 중 하나 이상과의 상호작용을 나타낼 수 있다: 아자사이클로도데칸 고리(예컨대, 테트라사이클로도데칸 고리) 아래의 아자사이클로도데칸 고리 영역에 대한 엣지-투-페이스(edge-to-face), N6, N7, N8, N5 및/또는 C12. 일부 양태에서, 항체는 Pb-DOTAM과 관련하여 하기 부위 중 하나 이상과의 상호작용을 나타낼 수 있다: N7, N8, 아자사이클로도데칸 고리에 대한 엣지-투-페이스, 테트라사이클로도데칸 고리 및/또는 N6.
일부 양태에서, 항체는, 예컨대 Pb-DOTAM과의 복합체에서 항체의 구조의 PISA 분석에 의해 측정된, Pb-DOTAM과 관련하여 하기 상호작용 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 아자사이클로도데칸 고리에 대한 엣지-투-페이스 비극성 상호작용, N8과의 극성 상호작용, N7과의 수소 결합, N8과의 수소 결합, N5와의 극성 상호작용, C12와의 비극성 상호작용, N7과의 극성 상호작용, N6에 대한 극성(수소) 결합, 및/또는 테트라사이클로도데칸 고리와의 비극성 상호작용.
일부 양태에서, 항체는, 예컨대 Pb-DOTAM과의 복합체에서 항체의 구조의 PISA 분석에 의해 측정된, Pb-DOTAM과 관련하여 하기 상호작용 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 항체 중쇄 CDR3 및 N7의 하나 이상의 잔기 사이의 수소 결합, 항체 중쇄 CDR3 및 N8의 하나 이상의 잔기 사이의 수소 결합, 아자사이클로도데칸 고리에 대한 엣지-투-페이스 항체 중쇄 CDR2의 하나 이상의 잔기 사이의 비극성 상호작용, 항체 경쇄 CDR3과 테트라 사이클로도데칸 고리 사이의 비극성 상호작용, 및/또는 항체 경쇄 CDR1과 N6 사이의 비극성 상호작용.
다른 양태에서, 항체는 본원에 기술된 바와 동일한 접촉 잔기를 공유할 수 있다: 예를 들어, 이들 잔기는 불변체일 수 있다. 이러한 잔기는 다음을 포함할 수 있다:
a) 중쇄 CDR2에서: Phe50, Asp56 및/또는 Tyr58, 및 임의적으로 또한 Gly52 및/또는 Arg54;
b) 중쇄 CDR3에서: Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, Tyr99, Ala100C 및/또는 Tyr100D 및 임의적으로 또한 Pro100E;
c) 경쇄 CDR1에서: TyR28 및/또는 Asp32;
d) 경쇄 CDR3에서: Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및/또는 Tyr96;
e) 경쇄 CDR2에서: 임의적으로 Gln50.
본 발명에 따른 항체의 특정 양상 및 양태는 상기 논의된다. 본 발명에 따른 추가의 적절한 양상 및 양태는 하기 논의된다. 모든 양태에서, 항체는 Pb-DOTAM 및 바람직하게는 또한 Bi-DOTAM에 결합하는 능력을 보유하고, 더욱 더 바람직하게는 상기 논의된 친화도 및/또는 선택성을 갖는다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 항-Pb-DOTAM 항체를 제공할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 양태에서, 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 다른 양태에서, 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 추가 양태에서, 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함한다. 추가 양태에서, 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1을 포함한다. 추가 양태에서, 항체는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 양태에서, 항체는 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
일부 양태에서, 항체는 각각 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열과 비교하여 치환, 예컨대, 1, 2 또는 3개의 치환을 갖는 하나 이상의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDR-L3을 포함할 수 있다. 이러한 치환이 전술된 불변 위치에서 발생하지 않는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들어, 일부 양태에서, CDR-H2는 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKG(서열번호 2), 또는 서열번호 2에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있되, 상기 치환은 Phe50, Asp56 및/또는 Tyr58을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Gly52 및/또는 Arg54를 포함하지 않는다(모두 카밧에 따라 넘버링됨).
일부 양태에서, CDR-H2는 하기에 제시된 하나 이상의 위치에서 치환될 수 있다. 여기와 하기 치환 표에서, 치환은 생식선 잔기(밑줄) 또는 이론적으로 입체적으로 적합하고 해당 부위의 결정화된 레퍼토리에서도 발생하는 아미노산에 기반한다. 일부 양태에서, 상기 언급된 잔기는 고정될 수 있고, 다른 잔기는 하기 표에 따라 치환될 수 있다: 다른 양태에서, 임의의 잔기의 치환은 하기 표에 따라 수행될 수 있다.
Figure pct00006
임의적으로, CDR-H3은 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL(서열번호 3), 또는 서열번호 3에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있되, 상기 치환은 Glu95, Arg96, Asp97, Pro98을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Ala100C, Tyr100D, 및/또는 Pro100E를 포함하지 않고/거나 임의적으로 또한 Tyr99를 포함하지 않는다. 예를 들어, 일부 양태에서, 치환은 Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, Tyr99, Ala100C 및 Tyr100D를 포함하지 않는다.
특정 양태에서, CDR-H3은 하기 제시된 하나 이상의 위치에서 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 언급된 잔기는 고정될 수 있고, 다른 잔기는 하기 표에 따라 치환될 수 있다: 다른 양태에서, 임의의 잔기의 치환은 하기 표에 따라 수행될 수 있다.
Figure pct00007
임의적으로, CDR-L1은 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA(서열번호 4), 또는 서열번호 4에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있되, 상기 치환은 Tyr28 및/또는 Asp32(카밧 넘버링)를 포함하지 않는다.
특정 양태에서, CDR-L1은 하기에 제시된 하나 이상의 위치에서 치환될 수 있다. 또한, 일부 양태에서, 상기 언급된 잔기는 고정될 수 있고, 다른 잔기는 하기 표에 따라 치환될 수 있다: 다른 양태에서, 임의의 잔기의 치환은 하기 표에 따라 수행될 수 있다.
Figure pct00008
임의적으로, CDR-L3은 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG(서열번호 6), 또는 서열번호 6에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있되, 상기 치환은 Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및/또는 Tyr96(카밧)을 포함하지 않는다.
특정 양태에서, CDR-L3은 하기 제시된 하기 위치에서 치환될 수 있다(대부분의 잔기가 용매에 노출되고 항원 접촉이 없으므로, 많은 치환이 가능함). 또한, 일부 양태에서, 상기 언급된 잔기는 고정될 수 있고, 다른 잔기는 하기 표에 따라 치환될 수 있다: 다른 양태에서, 임의의 잔기의 치환은 하기 표에 따라 수행될 수 있다.
Figure pct00009
항체는 임의적으로 각각 서열번호 1 또는 서열번호 5의 서열을 갖는 CDR-H1 및 CDR-L2, 또는 이에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 치환, 임의적으로 보존적 치환을 갖는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다 .
임의의 상기 양태에서, 항-Pb-DOTAM 항체는 인간화될 수 있다. 한 양태에서, 항-Pb-DOTAM 항체는 임의의 상기 양태에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 항-Pb-DOTAM 항체는 임의의 상기 양태에서와 같은 CDR을 포함하고, vk 1 39 및/또는 vh 2 26으로부터 유래된 프레임워크 영역을 추가로 포함한다. vk 1 39의 경우, 일부 양태에서, 뒤쪽 돌연변이가 없을 수 있다. vh 2 26의 경우, 생식계열 Ala49 잔기는 Gly49로 역 돌연변이될 수 있다.
임의적으로, 항원 결합 부위는 서열번호 7 또는 서열번호 9, 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대한 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항체는, 바람직하게는 본원에 기술된 친화도로 Pb-DOTAM에 결합하는 능력을 보유한다. VH 서열은 상기 제시된 불변 잔기를 보유할 수 있다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 7 또는 서열번호 9에서 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 밖의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항체는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한 서열번호 7 또는 서열번호 9의 VH 서열을 포함한다. 특정 양태에서, VH는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
다른 양상에서, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-Pb-DOTAM 항체가 제공된다. 특정 양태에서,적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열과 비교하여 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항-Pb-DOTAM 항체는 Pb-DOTAM에, 바람직하게는 본원에 기술된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. VL 서열은 상기 제시된 불변 잔기를 보유할 수 있다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 8 또는 서열번호 10에서 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 밖의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-Pb-DOTAM 항체는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 VL 서열을 포함한다. 특정 양태에서, VL은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
다른 양상에서, 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-Pb-DOTAM 항체가 제공된다. 한 양태에서, 항체는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한, 각각 서열번호 7 및 서열번호 8의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 항체는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한, 각각 서열번호 9 및 서열번호 10의 VH 및 VL 서열을 포함한다.
본 발명의 추가 양상에서, 임의의 상기 양태에 따른 항체는 단일클론 항체, 예컨대 키메라, 인간화된 또는 인간 항체이다. 한 양태에서, 항체는 항체 단편, 예컨대, Fv, Fab, Fab', scFab, scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 항체 단편은 비제한적으로 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, scFv 단편, 및 후술된 다른 단편을 포함한다. 특정 항체 단편의 검토를 위하여, 문헌[Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참고한다. scFv 단편의 검토를 위하여, 예컨대 문헌[Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]; 및 또한 국제 특허공보 제93/16185호; 및 미국 특허공보 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참고한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고, 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의는 미국 특허공보 제5,869,046호를 참고한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, 유럽 특허공보 제404,097호; 국제 특허공보 제1993/01161호; 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참고한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 기술된다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다[도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 왈탐 소재; 예를 들어, 미국 특허공보 제6,248,516 B1호 참고).
항체 단편은 비제한적으로 온전한 항체의 단백질분해효소 분해, 및 본원에 기술된 재조합 숙주 세포(예컨대, 대장균 또는 파지)에 의한 생산을 비롯한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
다른 양태에서, 항체는 전장 항체, 예컨대 온전한 IgG 항체 또는 본원에 정의된 다른 항체 클래스 또는 이소타입이다.
표적화된 제제
일부 양상에서, DOTAM-킬레이트화된 Pb에 특이적으로 결합하는 항체는 세포 결합제/표적화 모이어티에 커플링되어 표적화된 제제를 생성한다. 임의적으로, DOTAM-킬레이트화된 Pb에 특이적으로 결합하는 항체는 전술된 임의의 양태에 따른 항체일 수 있다.
커플링은 바람직하게는 융합 폴리펩티드 또는 단백질로서 발현될 수 있다. 융합은 직접 또는 연결기를 통해 이루어질 수 있다. 융합 폴리펩티드 또는 단백질은 접합 화학에 대한 임의의 요구를 피하면서 재조합적으로 생산될 수 있다. 임의적으로, 상기 연결기는 5개 이상의 아미노산, 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산의 펩티드일 수 있다. 연결기는 경질 연결기 또는 가요성 연결기일 수 있다. 일부 양태에서, 이는 Thr, Ser, Gly 및/또는 Ala 잔기를 포함하거나 이로 이루어진가요성이다. 예를 들어, Gly 및 Ser 잔기를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 이는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n과 같은 반복 모티프를 가질 수 있고, 이때 n은, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 일부 양태에서, 연결기는 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 26)이거나 이를 포함할 수 있다. 다른 연결기가 당업자에 의해 사용될 수 있고 식별될 수 있다.
따라서, Pb-DOTAM 킬레이트 및 다른 표적 항원, 예를 들어 표적 세포의 표면에 존재하는 항원 둘 다에 특이적으로 결합하는 다중특이적(예컨대, 이중특이적) 항체 복합체가 제공된다.
본 발명이 치료 방법 및 치료 방법에 사용하기 위한 제품에 관한 것인 한, 환자의 병든 세포를 표적으로 하는 세포독성 활성에 의해 치료가능한 임의의 병태에 적용가능하다. 치료는 바람직하게는 종양 또는 암(예컨대, 췌장암, 유방암 또는 전립선암)의 치료이다. 그러나, 본 발명의 적용가능성은 종양 및 암에 제한되지 않는다. 예를 들어, 치료는 바이러스 감염의 치료일 수도 있다. 감염된 세포의 표면에 발현되는 바이러스 항원을 지향하는 면역독소는 HIV, 광견병 및 EBV와 같은 다양한 바이러스 감염에 대해 조사되었다. 문헌[Cai and Berger 2011 Antiviral Research 90(3):143-50]은 카포시 육종-연관 헤르페스 바이러스에 감염된 세포의 표적화된 살해를 위해 PE38을 함유하는 면역독소를 사용하였다. 또한 레스이뮨(Resimmune, 등록상표)(A-dmDT390-bisFv(UCHT1))은 인간 악성 T 세포를 선택적으로 살해하고, 정상 T 세포를 일시적으로 고갈시키고, 다발성 경화증 및 이식편-대-숙주 질병과 같은 T 세포 구동된 자가면역 질환, 및 임상 시험 중인 T 세포 혈액 암의 치료가능성이 있는 것으로 간주된다.
따라서, 적합한 표적 항원은 암 세포 항원, 특히 인간 암 세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 표적화된 항체는 세포 표면 항원을 통해 종양 세포와 같은 병든 세포에 결합하도록 디자인된다. 항원은 일반적으로 과발현되거나 비정상적인 시간에 발현되는 정상 세포 표면 항원이다. 이상적으로, 표적 항원은 병든 세포(예컨대, 종양 세포)에서만 발현되지만, 실제로는 거의 관찰되지 않는다. 결과적으로, 표적 항원은 일반적으로 병든 조직과 건강한 조직 사이의 차별적인 발현을 기반으로 선택된다.
따라서, 표적화된 항체는 임의의 적합한 세포 표면 마커에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 표적화 모이어티 및/또는 세포 표면 마커의 선택은 표적화될 특정 세포 집단에 따라 선택될 수 있다. 세포 표면 마커는 당업계에 공지되고(예컨대, 문헌[Mufson et al., Front. Biosci., 11:337-43 (2006)]; 문헌[Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6:326-334 (2000)]; 및 문헌[Kreitman et al., AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006)]), 예를 들어, 단백질 또는 탄수화물일 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 표적화 모이어티(세포-결합제)는 세포 표면 상의 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이다. 예시적인 리간드는 비제한적으로 혈관 내피 성장 인자(VEGF), Fas, TNF-관련 세포자멸-유도 리간드(TRAIL), 사이토카인(예컨대, IL-2, IL-15, IL-4, IL-13), 림포카인, 호르몬 및 성장 인자(예컨대, 형질전환 성장 인자(TGFa), 신경 성장 인자, 표피 성장 인자)를 포함한다.
세포 표면 마커는, 예를 들어 종양-연관 항원일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "종양-연관 항원" 또는 "종양-특이적 항원"은 항원이 종양 및/또는 암과 연관되도록 종양 세포 및/또는 암 세포에 의해 단독으로 또는 우세하게 발현되거나 과발현되는 임의의 분자(예컨대, 단백질, 펩티드, 지질, 탄수화물 등)를 지칭한다. 종양-연관 항원은 추가로 정상, 비-종양 또는 비-암성 세포에 의해 발현될 수 있다. 그러나, 이러한 경우, 정상, 비-종양 또는 비-암성 세포에 의한 종양-연관 항원의 발현은 종양 또는 암 세포에 의한 발현만큼 강력하지 않다. 이와 관련하여, 종양 또는 암 세포는 정상, 비-종양 또는 비-암성 세포에 의한 항원의 발현에 비해 항원을 과발현하거나 항원을 상당히 높은 수준으로 발현할 수 있다. 또한, 종양-연관 항원은 발달 또는 성숙의 상이한 상태의 세포에 의해 추가로 발현될 수 있다. 예를 들어, 종양-연관 항원은 통상적으로 성체 숙주에서 발견되지 않는 배아 또는 태아 단계의 세포에 의해 추가로 발현될 수 있다. 다르게는, 종양-연관 항원은 통상적으로 성체 숙주에서 발견되지 않는 줄기 세포 또는 전구 세포에 의해 추가로 발현될 수 있다.
종양-연관 항원은 본원에 기술된 암 및 종양을 비롯한 임의의 암 또는 종양의 임의의 세포에 의해 발현되는 항원일 수 있다. 종양-연관 항원은 종양-연관 항원이 단지 한 유형의 암 또는 종양과 연관되거나 그 특징이 되도록 단지 한 유형의 암 또는 종양의 종양-연관 항원일 수 있다. 다르게는, 종양-연관 항원은 하나 초과의 유형의 암 또는 종양의 종양-연관 항원(예컨대, 특징적일 수 있음)일 수 있다. 예를 들어, 종양-연관 항원은 유방암 및 전립선암 세포 둘 다에서 발현될 수 있고, 정상, 비-종양 또는 비암 세포에서는 전혀 발현되지 않을 수 있다.
세포-결합제가 특이적으로 결합할 수 있는 예시적인 종양-연관 항원은 비제한적으로 뮤신 1(MUCl; 종양-연관 상피 뮤신), 흑색종의 우선적으로 발현되는 항원(FRAME), 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), PSCA, EpCAM, Trop2, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 수용체(GM-CSFR), CD56, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HeR2/neu)(erbB-2로도 공지됨), CDS, CD7, 티로시나제 관련 단백질(TRP) I 및 TRP2를 포함한다. 바람직한 양태에서, 표적화 모이어티(세포-결합제)가 특이적으로 결합하는 세포 표면 마커는 분화 클러스터(CD) 19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33(시알산 결합 Ig-유사 렉틴 3, 골수 세포 표면 항원), CD79b, CD123(인터루킨 3 수용체 알파), 트랜스페린 수용체, EGF 수용체, 메조텔린, 카드헤린, 루이스 Y, 글리피칸-3, FAP(섬유모세포 활성화 단백질 알파), PSMA(전립선 특이적 막 항원), CA9 = CAIX(탄산 무수화효소 IX), L1 CAM(신경 세포 부착 분자 L 1), 엔도시알린, HER3(표피 성장 인자 수용체 패밀리 구성원 3의 활성화된 형태), Alkl/BMP9 복합체(역형성 림프종 키나제 1/뼈 형태 형성 단백질 9), TPBG = 5T4(영양모세포 당단백질), ROR1(수용체 티로신 키나제-유사 표면 항원), HER1(표피 성장 인자 수용체의 활성화된 형태) 및 CLL1(C-유형 렉틴 도메인 패밀리 12, 구성원 A)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 메조텔린은, 예를 들어 난소암, 중피종, 비소세포 폐암, 폐 선암, 나팔관암, 두경부암, 자궁경부암 및 췌장암에서 발현된다. CD22는, 예컨대, 모양세포 백혈병, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 전림프구성 백혈병 (PLL), 비호지킨 림프종, 소 림프구성 림프종 SLL) 및 급성 림프구성 백혈병(ALL)에서 발현된다. CD25는, 예컨대 백혈병 및 림프종, 예컨대 모양세포 백혈병 및 호지킨 림프종에서 발현된다. 루이스 Y 항원은, 예를 들어 방광암, 유방암, 난소 암, 대장암, 식도암, 위암, 폐암 및 췌장암에서 발현된다. CD33은, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수단핵구성 백혈병(CML) 및 골수증식성 질환에서 발현된다.
본 발명의 한 양태에서, 표적화 모이어티는 표적, 예컨대 종양-연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체(항체 단편을 포함함)이다. 이러한 양태에서, 제제는 이중특이적 또는 다중특이적 항체로 지칭될 수 있다.
종양-연관 항원에 특이적으로 결합하는 예시적인 항체는 비제한적으로 트랜스페린 수용체에 대한 항체(예컨대, HB21 및 이의 변이체), CD22에 대한 항체(예컨대, RFB4 및 이의 변이체), CD25에 대한 항체(예컨대, 항-Tac 및 이의 변이체), 메조텔린에 대한 항체(예컨대, SS 1, MORAb-009, SS, HN1, HN2, MN, MB 및 이의 변이체) 및 루이스 Y 항원에 대한 항체(예컨대, B3 및 이의 변이체)를 포함한다. 이와 관련하여, 표적화 모이어티(세포-결합제)는 B3, RFB4, SS, SSI, MN, MB, HN1, HN2, HB21 및 MORAb-009로 이루어진 군에서 선택되는 항체 및 이들의 항원 결합 부분일 수 있다. 본 발명의 키메라 분자에 사용하기에 적합한 추가의 예시적인 표적화 모이어티는, 예를 들어 미국 특허공보 제5,242,824호(항-트랜스페린 수용체); 제5,846,535호(항-CD25); 제5,889,157호(항-루이스 Y); 제5,981,726호(항-루이스 Y); 제5,990,296호(항-루이스 Y); 제7,081,518호(항-메조텔린); 제7,355,012호(항-CD22 및 항-CD25); 제7,368,110호(항-메조텔린); 제7,470,775호(항-CD30); 제7,521,054호(항-CD25); 및 제7,541,034호(항-CD22); 미국 출원공보 제2007/0189962호(항-CD22); 문헌[Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6: 326-334 (2000)], 및 문헌[Kreitman et al., AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006)](이들 각각은 본원에 참고로 혼입됨)에 개시된다.
크립토(Cripto), CD30, CD19, CD33, 당단백질 NMB, CanAg, HeR2(ErbB2/Neu), CD56(NCAM), CD22[지글렉(Siglec)2], CD33(지글렉3), CD79, CD138, PSCA, PSMA(전립선 특이적 막 항원), BCMA, CD20, CD70, E-셀렉틴, EphB2, 멜라노트랜스페린, Mucl6 및 TMEFF2를 비롯한 특정 종양 관련 항원을 표적으로 하는 항체가 생성되었다.
본 발명의 일부 양태에서, 종양-연관 항원이 암배아 항원(CEA)인 것이 바람직할 수 있다. CEA는 인간 CEA의 아미노산 서열, 특히 유니프롯(UniProt)(www.uniprot.org) 수탁번호 P06731(버전 119) 또는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004354.2에 제시된 암배아 항원-관련 세포 부착 분자 5(CEACAM5)를 가질 수 있다. CEA에 대해 생성된 항체는 T84.66 및 이의 인간화된 및 키메라 버전, 예컨대 국제 특허공보 제2016/075278 A1호 및/또는 제2017/055389호에 기술된 T84.66-LCHA, CH1Ala, 국제 특허공보 제2011/034660호에 기술된 항-CEA 항체, 및 하기 표 2에 기술된 CEA hMN-14(또한, 미국 특허공보 제6,676,924호 및 제5,874,540호 참조)를 포함한다.
CEA는 상대적으로 느리게 내재화되기 때문에 본 발명의 맥락에서 유리하고, 따라서 높은 백분율의 항체가 방사성핵종에 결합하기 위해 초기 처리 후 세포의 표면에 이용가능하게 남아있을 것이다. 다른 낮은 내재화 표적/종양-연관 항원도 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 종양-연관 항원은 CD20 또는 HeR2일 수 있고, 젠뱅크(GenBank) 수탁 번호 NP_001005862, NP_004439, XP_005257196 및 XP_005257197은 젠뱅크가 2013년 10월 4일에 제공한 HeR2 단백질 서열을 개시하고, 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스 엔트리 P11836은 CD20 서열을 개시한다. 또 다른 양태에서, 표적은 EGP-1(영양막-2로도 공지된 상피 당단백질-1), 결장-특이적 항원-p(CSAp) 또는 췌장 뮤신 MUC1일 수 있다(예를 들어, 문헌[Goldenberg et al 2012 (Theranostics 2(5)] 참고, 본원에 참고로 혼입됨]. 이러한 문헌은 또한 CSAp에 결합하는 Mu-9(또한, 문헌[Sharkey et al Cancer Res. 2003; 63: 354-63] 참고), MUC1에 결합하는 hPAM4(또한, 문헌[Gold et al Cancer Res. 2008: 68: 4819-26] 참고), CD20에 결합하는 발투주맙(또한, 문헌[Sharkey et al Cancer Res. 2008; 68: 5282-90] 참고) 및 EGP-1에 결합하는 hRS7(또한, 문헌[Cubas et al Biochim Biophys Acta 2009; 1796: 309-14] 참고)과 같은 항체를 기술한다. 이들 또는 이의 항원 결합 부분 중 임의의 것이 본 발명에서 유용할 수 있고, 즉, 본원에 기술된 항체에 혼입될 수 있다.
다중특이적 항체
상기 논의된 바와 같이, 특정 양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
최근 과거에 다양한 재조합 항체 형식, 예컨대, IgG 항체 형식과 단일-쇄 도메인의 융합에 의한 4가 이중특이적 항체가 개발되었다(예컨대, 문헌[Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163]; 국제 특허공보 제2001/077342호; 및 문헌[Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234]).
또한, 항체 코어 구조(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)가 더 이상 유지되지 않는 신규한 형식, 예컨대, 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 디아-, 트리아- 또는 테트라바디, 미니바디, 여러 단일-쇄 형식(scFv, Bis-scFv)이 개발되었다(문헌[Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136]; 문헌[Fischer, N., Leger, 0., Pathobiology 74 (2007) 3-14]; 문헌[Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74]; 문헌[Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297]).
이러한 모든 형식은 연결기를 사용하여 항체 코어(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)를 추가 결합 단백질(예컨대, scFv)에 결합하거나, 2개의 Fab 단편 또는 scFv를 융합한다(문헌[Fischer, N., Leger, 0., Pathobiology 74 (2007) 3-14]). 예를 들어, 효과기 기능, 예컨대 자연 발생 항체와 높은 수준의 유사성을 유지함으로써, Fc 수용체 결합을 통해 매개되는 보체 의존성 세포독성(CDC) 또는 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 유지하기를 원할 수 있음을 명심해야 한다.
국제 특허공보 제2007/024715호에서, 엔지니어링된 다가 및 다중특이적 결합 단백질로서 이중 가변 도메인 면역글로불린이 보고된다. 생물학적 활성 항체 이량체의 제조 방법은 미국 특허공보 제6,897,044호에 보고된다. 펩티드 연결기를 통해 서로 연결된 4개 이상의 가변 도메인을 갖는 다가 Fv 항체 구축물은 미국 특허공보 제7,129,330호에 보고된다. 이량체 및 다량체 항원 결합 구조는 미국 출원공보 제2005/0079170호에 보고된다. 단백질이 천연 면역글로불린이 아닌, 연결 구조에 의해 서로 공유결합된 3 또는 4개의 Fab 단편을 포함하는 3가 또는 4가 단일특이적 항원 결합 단백질은 미국 특허공보 제6,511,663호에 보고된다. 국제 특허공보 제2006/020258호에서, 원핵성 및 진핵성 세포에서 효율적으로 발현될 수 있고 치료 및 진단 방법에 유용한 4가 이중특이적 항체가 보고된다. 2개 유형의 폴리펩티드 이량체를 포함하는 혼합물로부터 하나 이상의 쇄간 다이설파이드 결합을 통해 연결되지 않은 이량체로부터 하나 이상의 쇄간 다이설파이드 연결기를 통해 연결된 이량체를 분리하거나 우선적으로 합성하는 방법은 미국 출원공보 제2005/0163782호에 보고된다. 이중특이적 4가 수용체는 미국 특허공보 제5,959,083호에 보고된다. 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 엔지니어링된 항체는 국제 특허공보 제2001/077342호에 보고된다.
다중특이적 및 다가 항원 결합 폴리펩티드는 국제 특허공보 제1997/001580호에 보고된다. 국제 특허공보 제1992/004053호는 전형적으로 동일한 항원 결정인자에 결합하는 IgG 클래스의 단일클론 항체로부터 제조된 동종접합체가 합성 가교결합에 의해 공유결합으로 연결된 것을 보고한다. 항원에 대한 높은 산염기도를 갖는 올리고머성 단일클론 항체는 국제 특허공보 제1991/06305호에 보고되고, 이에 의해 함께 연관된 2개 이상의 면역글로불린 단량체를 갖는, 전형적으로 IgG 클래스의 올리고머는 분비되어 4가 또는 6가 IgG 분자를 형성한다. 양-유래 항체 및 엔지니어링된 항체 구축물은 미국 특허공보 제6,350,860호에 보고되고, 인터페론 감마 활성이 병원성인 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 미국 출원공보 제2005/0100543호는 이중특이적 항체의 다가 담체인 표적화가능한 구축물을 보고한다(즉, 표적화가능한 구축물의 각각의 분자는 2개 이상의 이중특이적 항체의 담체로서 역할할 수 있음). 유전자 엔지니어링된 이중특이적 4가 항체는 국제 특허공보 제1995/009917호에 보고된다. 국제 특허공보 제2007/109254호에서, 안정화된 scFv로 이루어지거나 이를 포함하는 안정화된 결합 분자가 보고된다.
다중특이적 항체는 또한 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결합 아암(arm)에서 도메인 교차를 갖는 비대칭 형태로, 즉 VH/VL 도메인(예컨대, 국제 특허공보 제2009/080252호 및 국제 특허공보 제2015/150447호 참고), CH1/CL 도메인(예컨대, 국제 특허공보 제 2009/080253호 참조) 또는 완전한 Fab 아암(예컨대, 국제 특허공보 제2009/080251호, 국제 특허공보 제2016/016299호, 또한 문헌[Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191], 및 문헌[Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20] 참고)을 교환함으로써 제공될 수 있다. 한 양상에서, 다중특이적 항체는 크로스-Fab 단편을 포함한다. 용어 "크로스-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "크로스오버 Fab 단편"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는 Fab 단편을 지칭한다. 크로스-Fab 단편은 경쇄 가변 영역(VL)과 중쇄 불변 영역 1(CH1)로 구성되는 폴리펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성되는 폴리펩티드 쇄을 포함한다. 비대칭 Fab 아암은 또한 정확한 Fab 페어링을 지향하기 위해 하전되거나 하전되지 않은 아미노산 돌연변이를 도메인 계면에 도입함으로써 엔지니어링될 수 있다(예컨대, 국제 특허공보 제2016/172485호 참고).
상기 형식 중 임의의 것이 본 발명에 따른 다중특이적 항체에 사용될 수 있다.
하나의 예시적인 형식에서, 이중특이적 항체는, 예컨대 국제 특허공보 제2014/180754호에 기술된 "삼량체화기"이다. 이것은 인간 연골 기질 단백질(CMP)로부터 유래된 삼량체화 도메인에 융합된 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 각각 포함하는 3개의 융합 폴리펩티드를 포함하는 삼량체성 항원 결합 분자를 지칭하고, 이때 상기 삼량체화 도메인은 삼량체성 항원 결합 분자의 안정한 회합을 매개할 수 있다. 항원 결합 모이어티는, 예를 들어 Fab 분자, 크로스오버-Fab 분자, scFab, Fv 분자, scFv 또는 단일 도메인 항체(VHH)일 수 있다. 일부 양태에서, 융합 단백질은 각각 2개의(제1 및 제2) 항원 결합 모이어티를 포함한다(이때, 제1 항원 결합 모이어티는 임의적으로 펩티드 연결기를 통해 상기 삼량체화 도메인의 N-말단 아미노산에 융합되고, 제2 항원 결합 모이어티는 상기 삼량체화 도메인의 C-말단 아미노산에 융합된다. 이러한 형식에서, 제1 항원 또는 제2 항원 결합 모이어티는 Pb-DOTAM 킬레이트에 결합할 수 있다. 다른 하나는 표적 항원, 예컨대 종양-연관 항원에 결합할 수 있다. C-말단에 융합된 3개의 항원 결합 분자는 각각 동일한 항원에 대해 특이적일 수 있고; N-말단에 융합된 3개의 항원 결합 분자는 각각 서로 특이적일 수 있다.
이때, 유용한 CMP 삼량체화 도메인은 하기 제시된 인간 연골 단백질로부터 유래되었고, 한 양태에서, 하기 제시된 삼량체화 도메인의 서열과 적어도 95%의 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 양태에서, 상기 삼량체화 도메인은 상기 삼량체화 도메인의 서열을 포함한다.
인간 연골 단백질 서열(496aa)
MRVLSGTSLM LCSLLLLLQA LCSPGLAPQS RGHLCRTRPT DLVFVVDSSR
SVRPVEFEKV KVFLSQVIES LDVGPNATRV GMVNYASTVK QEFSLRAHVS
KAALLQAVRR IQPLSTGTMT GLAIQFAITK AFGDAEGGRS RSPDISKVVI
VVTDGRPQDS VQDVSARARA SGVELFAIGV GSVDKATLRQ IASEPQDEHV
DYVESYSVIE KLSRKFQEAF CVVSDLCATG DHDCEQVCIS SPGSYTCACH
EGFTLNSDGK TCNVCSGGGG SSATDLVFLI DGSKSVRPEN FELVKKFISQ
IVDTLDVSDK LAQVGLVQYS SSVRQEFPLG RFHTKKDIKA AVRNMSYMEK
GTMTGAALKY LIDNSFTVSS GARPGAQKVG IVFTDGRSQD YINDAAKKAK
DLGFKMFAVG VGNAVEDELR EIASEPVAEH YFYTADFKTI NQIGKKLQKK
ICVEEDPCAC ESLVKFQAKV EGLLQALTRK LEAVSKRLAI LENTVV
삼량체화 도메인의 예시적인 서열(39aa)
CACESLVKFQ AKVEGLLQAL TRKLEAVSKR LAILENTVV
다른 예시적인 형식은 제1 항체 중쇄 및 제2 항체 중쇄 및 제1 항체 경쇄 및 제2 항체 경쇄를 포함하는 전장 항체(예컨대, IgG)를 포함하고, 이때 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 조립되어 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 조립되어 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.
이종이량체 중쇄의 올바른 조립은, 예컨대 하기 추가로 논의되는 놉-인투-홀 돌연변이 및/또는 다른 변형의 사용에 의해 지원될 수 있다.
경쇄와 각각의 중쇄의 올바른 조립은 크로스-mab 기술을 사용하여 지원될 수 있다. 이러한 접근법에서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄 또는 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 조립되어 크로스-Fab 단편을 형성할 수 있다(다른 것들은 조립되어 통상적인 Fab를 형성함). 따라서, 한 양태에서, 제1 중쇄는 VH 도메인 대신에 VL 도메인을 포함할 수 있고(예컨대, VL-CH1-힌지-CH2-CH3), 제1 경쇄는 VL 도메인을 교환한 VH 도메인을 포함할 수 있거나(예컨대, VH-CL), 제1 중쇄는 HC1 도메인 대신 CL 도메인을 포함할 수 있고(예컨대, VH-CL-힌지-CH2-CH3), 제1 경쇄는 CL 도메인 대신에 CH1 도메인을 포함할 수 있다(예컨대, VL-CH1). 이러한 양태에서, 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 통상적인 도메인 구조(예컨대, 각각 VH-CH1-힌지-CH2-CH3 및 VL-CL)를 갖는다. 다른 양태에서, 제2 중쇄는 VH 도메인 대신에 VL 도메인을 포함할 수 있고(예컨대, VL-CH1-힌지-CH2-CH3), 제2 경쇄는 VL 도메인 대신에 VH 도메인을 포함할 수 있거나(예를 들어, VH-CL), 제2 중쇄는 HC1 도메인 대신에 CL 도메인을 포함할 수 있고(예컨대, VH-CL-힌지-CH2-CH3), 제2 경쇄는 CL 도메인 대신 CH1 도메인을 포함할 수 있다(예컨대, VL-CH1). 이러한 양태에서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 통상적인 도메인 구조를 갖는다.
일부 양태에서, 경쇄와 각각의 중쇄의 정확한 조립은 추가로 또는 다르게는 하기 추가로 논의되는 전하 변형을 사용함으로써 지원될 수 있다.
이러한 항체 중 하나는 P1AE1768로 도 37에 도시된다. 이때, 제2 중쇄는 HC1 도메인 대신에 CL 도메인을 포함하고(예컨대, VH-CL-힌지-CH2-CH3), 제2 경쇄는 CL 도메인 대신에 CH1 도메인(예컨대, VL-CH1)을 포함하고; 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 통상적인 도메인 구조를 갖는다. 통상적인 구조를 갖는 Fab는 전하 변형을 포함한다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명의 항체는 각각 서열번호 59 및 58의 제1 중쇄 및 제2 중쇄, 및 각각 서열번호 57 및 60의 제1 경쇄 및 제2 경쇄를 포함한다.
상기 형식의 일부 양태에서, 형식은 2가일 수 있다. 다른 가능한 양태에서, 추가 항원 결합 모이어티는, 예컨대 제1 중쇄 및/또는 제2 중쇄에 융합되어 하나 또는 두 항원에 대한 원자가를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 제1 항원에 대한 추가 항원 결합 모이어티는 중쇄 분자 중 하나 또는 둘 다의 N-말단에 융합될 수 있다. 항체는 제1 항원(예컨대, 종양-연관 항원)에 대해 다가, 예컨대 2가일 수 있고, 제2 항원(예컨대, DOTAM-킬레이트화된 Pb)에 대해 1가일 수 있다.
추가 항원 결합 모이어티는, 예를 들어, 제1 항원(예컨대, 종양-연관 항원)에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 scFab일 수 있다. scFab는 단일-쇄로 발현되도록 폴리펩티드 연결기를 통해 VL 도메인 및 CL 도메인에 연결된 VH 및 CH1 도메인을 포함한다. 즉, scFab는 Fd와 경쇄 사이에 폴리펩티드 연결기를 포함한다.
다른 양태에서, 추가 항원 결합 모이어티는 Fab 또는 크로스-Fab이다. 예를 들어, 중쇄 중 하나의 N- 또는 C-말단은 폴리펩티드 연결기를 통해 VH 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제1 폴리펩티드에 연결될 수 있고, VL 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합하여 Fab를 형성한다. 다른 양태에서, 중쇄 중 하나의 N- 또는 C-말단은 폴리펩티드 연결기를 통해 VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제1 폴리펩티드에 연결될 수 있고, 이는 VH 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합한다. 다른 양태에서, 중쇄 중 하나의 N- 또는 C-말단은 폴리펩티드 연결기를 통해 VH 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제1 폴리펩티드에 연결될 수 있고, 이는 VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합한다.
이러한 형식에서, 동일한 항원 특이성의 결합 아암이 동일한 경쇄와의 회합에 의해 형성되는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 제1 항원에 대한 항원 결합 모이어티/아암은 크로스-Fab일 수 있고, 제2 항원에 대한 항원 결합 모이어티/아암은 통상적인 Fab일 수 있다. 다르게는, 제1 항원에 대한 항원 결합 모이어티/아암은 통상적인 Fab일 수 있고, 제2 항원에 대한 항원 결합 모이어티/아암은 크로스-Fab일 수 있다.
이러한 형식은 또한 하기 추가로 논의되는 전하 변형을 혼입할 수 있다.
이 형식의 한 양태에서, 제1 항체 중쇄 및 제2 항체 중쇄 및 제1 항체 경쇄 및 제2 항체 경쇄를 포함하는 전장 항체를 포함하는 다가 항체가 제공되고, 이때 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 조립되어 제1 항원(예컨대, 종양 특이적 항원, 예컨대, CEA)에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 Fab를 형성하고, 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 조립되어 제2 항원(예컨대, DOTAM-킬레이트화된 Pb)에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 크로스-Fab를 형성하고(예컨대, 제2 중쇄는 VH 도메인 대신에 VL 도메인을 갖고, 제2 경쇄는 VL 도메인 대신에 VH 도메인을 가짐); 제1 항체 중쇄 또는 제2 항체 중쇄는 연결기를 통해 CH1 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 융합되고, 상기 제1 폴리펩티드가, CL 및 VL을 포함하는 제2 폴리펩티드와 조립되어 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 Fab를 형성한다.
융합은 전장 항체의 중쇄 중 하나, 임의적으로 제2 중쇄의 N-말단에 있을 수 있다.
임의적으로, 전하 변형도 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 Fab는 하기 논의된 바와 같이 전하-변형 치환을 포함할 수 있다.
이러한 형식의 예는 도 37에 도시된 P1AE1769이다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명의 항체는 각각 서열번호 64 및 63의 제1 중쇄 및 제2 중쇄, 및 각각 서열번호 62 및 61의 제1 경쇄 및 제2 경쇄를 포함한다.
다른 예시적인 형식은 제2 항원에 대한 항원 결합 모이어티에 연결된, 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 IgG와 같은 전장 항체(예컨대, 제1 항원에 대해 2가일 수 있음)를 포함한다.
예를 들어, 제2 항원에 대한 항원 결합 모이어티는 제2 항원(예컨대, Pb-DOTAM 킬레이트)에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 scFab일 수 있다. 일부 양태에서, scFab는 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단, 예를 들어 이의 CH3 도메인의 C-말단에 융합될 수 있다. 이종이량체 중쇄의 올바른 조립은, 예컨대 놉-인투-홀 돌연변이 및/또는 하기 추가로 논의되는 다른 변형의 사용에 의해 지원될 수 있다. 이러한 항체 중 하나는 P1AE1770으로 도 37에 예시된다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 66 및 67의 중쇄, 및 서열번호 65의 경쇄를 포함한다.
다른 예시적인 형식은 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 전장 항체(예컨대, 제1 항원에 대해 2가일 수 있음)를 포함하고, 이때 중쇄 중 하나의 N- 또는 C-말단은 폴리펩티드 연결기를 통해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 이때 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드와 회합하여 제2 항원에 대한 결합 부위를 포함하는 Fab 또는 크로스오버-Fab를 형성한다. 예를 들어, 이러한 형식은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하도록 다음을 포함할 수 있다:
i) VL 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합된 VH 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제1 폴리펩티드; 또는
ii) VH 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합된 VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제1 폴리펩티드; 또는
iii) VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합된 VH 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제1 폴리펩티드.
이종이량체 중쇄의 올바른 조립은, 예를 들어, 놉-인투-홀 돌연변이 및/또는 하기 추가로 논의되는 다른 변형, 예컨대 전하 변형을 사용함으로써 지원될 수 있다. 예를 들어, 전장 항체의 Fab 도메인은 전하 변형을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 제1 폴리펩티드는 폴리펩티드 연결기를 통해 중쇄 중 하나의 C-말단, 예를 들어 이의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된다. 제1 폴리펩티드는 N-말단 VL 도메인 및 C-말단 CH1 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 융합을 갖는 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로 VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VL-CH1을 포함할 수 있다. 경쇄는 VH-CL을 포함할 수 있다. 전장 항체의 Fab는 전하 변형 치환을 포함할 수 있다. 하나의 이러한 양태는 P1AE1767로서 도 37에 도시된다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 63 및 64의 중쇄, 및 서열번호 61 및 62의 경쇄를 포함한다.
다른 양태에서, 제1 폴리펩티드는 폴리펩티드 연결기를 통해 중쇄의 VH 도메인의 N-말단에 연결된다. 제1 폴리펩티드는 N-말단 VL 도메인 및 C-말단 CH1 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 융합된 중쇄는 N-말단에서 C-말단까지 VL-CH1-연결기-VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함할 수 있다. 경쇄는 VH-CL을 포함할 수 있다.
다른 예시적인 형식에서, 항체는 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체를 포함할 수 있고, 이때 각각의 중쇄의 C-말단은 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티에 융합된다.
한 양태에서, 제1 항원은 표적, 예를 들어 종양-특이적 항원이고, 제2 항원은 Pb-DOTAM 킬레이트이지만, 이들은 또한 반대가 될 수 있다.
다른 예시적인 형식에서, 항체는 다음을 포함하는 이중특이적 항체일 수 있다:
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체;
b) i) 항체 중쇄 가변 도메인(VH); 또는 ii) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1); 또는 iii) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드;
c) i) 항체 경쇄 가변 도메인(VL); 또는 ii) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드
(이때, (b)의 펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인(VL) 및 (c)의 펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인은 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성함).
이러한 형식에서, 제1 폴리펩티드가 b(i)에 제시된 바와 같은 경우, 제2 폴리펩티드는 c(i)에 제시된 바와 같고; 제1 폴리펩티드가 b(ii)에 제시된 바와 같은 경우, 제2 폴리펩티드는 c(ii)에 제시된 바와 같고; 제1 폴리펩티드가 b(iii)에 제시된 바와 같은 경우, 제2 폴리펩티드는 c(iii)에 제시된 바와 같다. 전하 변형 치환이 또한, 예컨대, 전장 항체의 Fab에서 사용될 수 있다.
이러한 형식에서 제1 항원 또는 제2 항원은 DOTAM-킬레이트화된 Pb일 수 있다. 다른 하나는 표적, 예컨대 종양-연관 항원, 예컨대 CEA, CD20 또는 ERBB2일 수 있다. 일부 양태에서, 제2 항원은 DOTAM-킬레이트화된 Pb이고, 제1 항원은 표적이다.
전술된 항체는 3가일 수 있다. 다른 가능한 양태에서, 추가 항원 결합 모이어티는 하나의 항원 또는 항원 둘 다에 대한 원자가를 증가시키기 위해 융합될 수 있다. 예를 들어, 제1 항원에 대한 추가 항원 결합 모이어티는, 예컨대 항체가 제1 항원에 대해 4의 원자가(중쇄 둘 다의 카복시 말단에 융합된 경우) 및 제2 항원에 대해 1의 원자가를 갖도록, 전장 항체(예컨대, 종양-연관 항원)의 중쇄 중 하나 또는 둘 다의 카복시 말단에 융합될 수 있다.
(b)의 항체가 VH 도메인으로 이루어지고, (c)의 항체가 VL 도메인으로 이루어진 상기 형식의 예는 PRIT-213 및 PRIT-214이다. (b)가 VH 도메인과 CL 도메인으로 이루어지고, (c)가 VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 상기 형식의 예는 도 37에 도시된 P1AE1766이다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명의 항체는 각각 서열번호 51 및 52의 제1 중쇄 및 제2 중쇄, 및 서열번호 50의 경쇄를 포함한다.
임의적으로, 본 발명의 다중특이적 항체에 사용되는 형식은 국제 특허공보 제2010/115589 A1호(로슈 글리카트 아게)(이의 전문은 본원에 참고로 혼입됨)에 기술된 3가 형식일 수 있다.
국제 특허공보 제2010/115589호는 구조의 임의적인 안정화를 기술하고, 이에 의해 (b)의 폴리펩티드의 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 (c)의 폴리펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은 연결되고, 예컨대 하기 위치 사이에 다이설파이드 결합을 도입하여 쇄간 다이설파이드 가교를 통해 안정화된다:
i) 중쇄 가변 도메인 위치 44 내지 경쇄 가변 도메인 위치 100,
ii) 중쇄 가변 도메인 위치 105 내지 경쇄 가변 도메인 위치 43, 또는
iii) 중쇄 가변 도메인 위치 101 내지 경쇄 가변 도메인 위치 100(항상 카밧의 EU 인덱스에 따른 넘버링).
국제 특허공보 제2010/115589호는 또한 본 발명에 따른 상기 전장 항체의 CH3 도메인이, 예컨대 국제 특허공보 제96/027011호, 문헌[Ridgway, J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621]; 및 문헌[Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681]에서 여러 실시예와 함께 상세하게 기술되는 "놉-인투-홀" 기술에 의해 변경될 수 있음을 기술한다.
따라서, 일부 양태에서, 상기 3가 이중특이적 항체는 또는 전장 항체의 하나의 중쇄의 CH3 도메인 및 전장 항체의 다른 중쇄의 CH3 도메인이 각각 항체 CH3 도메인 사이의 원래 계면을 포함하는 계면에서 만나고, 상기 계면이 3가 이중특이적 항체의 형성을 촉진하도록 변경되는 것을 특징으로 하고, 이때 변경은 다음을 특징으로 한다:
a) 3가 이중특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3 도메인의 원래 계면과 만나는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 원래의 계면 내에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내의 공동에 위치가능한 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에 돌기를 생성하도록 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변경되는 것, 및
b) 3가 이중특이적 항체 내의 제1 CH3 도메인의 원래 계면과 만나는 제2 CH3 도메인의 원래 계면 내에서, 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제1 CH3 도메인의 계면 내의 돌기가 위치가능한 제2 CH3 도메인의 계면 내에 공동을 생성하도록 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변경되는 것.
더 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 임의적으로 선택될 수 있다. 더 작은 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 임의적으로 선택될 수 있다.
임의적으로, 일부 양태에서, 두 CH3 도메인 사이에 다이설파이드 가교가 형성되도록 각각의 CH3 도메인의 상응하는 위치에 아미노산으로서 시스테인(C)을 도입함으로써 CH3 도메인이 둘 다 추가로 변경된다.
국제 특허공보 제2010/115589 A1호에 기술된 이중특이적 3가 항체 형식의 이들 및 기타 세부사항이 본 발명에서 이용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "전장 항체"는 2개의 "전장 항체 중쇄" 및 2개의 "전장 항체 경쇄"로 이루어진 항체를 나타낸다. "전장 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 중쇄 도메인 1(CH1), 항체 힌지 영역(HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 항체 중쇄 불변 도메인 3(CH3)(VH-CH1-HR-CH2-CH3으로 약칭됨); 및 임의적으로 서브클래스 IgE의 항체의 경우 항체 중쇄 불변 도메인 4(CH4)로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 바람직하게는 "전장 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3으로 이루어진 폴리펩티드이다. 크로스-Mab 형성의 가능성은 "전장"에 대한 언급에 의해 배제되는 것으로 의도되지 않고, 따라서 중쇄는 VH 도메인 대신에 VL 도메인 또는 CH1 도메인 대신에 CL 도메인을 가질 수 있다. "전장 항체 경쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다(VL-CL로 약칭됨). 다르게는, 크로스-Mab의 경우, VL 도메인은 VH 도메인으로 교환되거나, CL 도메인은 CH1 도메인으로 교환될 수 있다. 항체 경쇄 불변 도메인(CL)은 k(카파) 또는 λ(람다)일 수 있다. 2개의 전장 항체 쇄는 CL 도메인과 CH1 도메인 사이 및 전장 항체 중쇄의 힌지 영역 사이의 폴리펩티드간 다이설파이드 결합을 통해 함께 연결된다. 전형적인 전장 항체의 예는 IgG(예컨대, IgG1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 천연 항체이다. 본 발명에 따른 전장 항체는 단일 종, 예컨대 인간으로부터 유래될 수 있거나, 키메라화된 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본원에 기술된 전장 항체는 각각 한 쌍의 VH 및 VL에 의해 형성된 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 상기 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 있는 마지막 아미노산을 나타낸다.
b)의 폴리펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인(VH)의 N-말단, 및 c)의 폴리펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은 VH 또는 VL 도메인의 N-말단에 있는 마지막 아미노산을 나타낸다.
전술된 임의의 형식에서, 제1 항원은 종양-연관 항원일 수 있고, 제2 항원은 Pb-DOTAM일 수 있다(그러나, 이들은 또한 일부 양태에서 반대일 수 있음).
전술된 임의의 형식에서, 중쇄 이종이량체의 올바른 조립은 중쇄의 서열에 대한 변형에 의해 지원될 수 있다. 한 양태에서, 놉-인투-홀 기술이 사용된다. 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이러한 2개의 CH3 도메인을 함유하는 두 중쇄의 이종이량체화를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. (2개의 중쇄의) 2개의 CH3 도메인 각각은 "놉"일 수 있고, 다른 하나는 "홀"이다. 예컨대, 하나는 소위 "놉 돌연변이"(T366W 및 임의적으로 S354C 및 Y349C 중 하나, 바람직하게는 S354C)를 포함하고, 다른 하나는 소위 "홀 돌연변이"(T366S, L368A 및 Y407V 및 임의적으로 Y349C 또는 S354C, 바람직하게는 Y349C)를 포함한다(EU 인덱스 넘버링에 따름)(예컨대, 문헌[Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73] 참고).
다이설파이드 가교의 도입은 추가로 또는 다르게는 이종이량체를 안정화시키고(문헌[Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681]; 문헌[Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35]), 수율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예는 하기 위치 사이에서 다이설파이드 결합의 도입을 포함한다:
i) 중쇄 가변 도메인 위치 44 내지 경쇄 가변 도메인 위치 100,
ii) 중쇄 가변 도메인 위치 105 내지 경쇄 가변 도메인 위치 43, 또는
iii) 중쇄 가변 도메인 위치 101 내지 경쇄 가변 도메인 위치 100(항상 카밧의 EU 인덱스에 따른 넘버링).
전하 변형
본 발명의 다중특이적 항체는 결합 아암 중 하나(또는 2개 초과의 항원 결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우에는 그 이상)에서 VH/VL 교환을 갖는 Fab-기반 이중/다중특이적 항원 결합 분자의 생산에서 발생할 수 있는 비-매칭(non-matching) 중쇄[벤스-존스(Bence-Jones)-유형 부산물]와 경쇄의 미스페어링(mispairing)을 감소시키는 데 특히 효율적인, 다중특이적 항체에 포함되는 Fab 분자에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다(국제 특허공보 제2015/150447호, 특히 실시예 참고)(이의 전문이 본원에 참고로 혼입됨). 원하지 않는 부산물, 특히 이들의 결합 아암 중 하나에서 발생하는 벤스-존스-유형 부산물과 비교되는 목적 다중특이적 항체의 비는 Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인의 특정 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산을 도입함으로써 개선될 수 있다(본원에서 "전하 변형"으로 지칭됨).
따라서, 일부 양태에서, Fab 분자를 포함하는 본 발명의 항체는 본원에 기술된 전하 변형을 포함하는 중쇄 불변 도메인 CH1 도메인 및 본원에 기술된 전하 변형을 포함하는 경쇄 불변 CL 도메인을 갖는 하나 이상의 Fab를 포함한다.
전하 변형은 본 발명의 항체에 포함된 통상적인 Fab 분자(예컨대, 도 37에 도시된 바와 같이, P1AE1766, P1AE1767 P1AE1768, P1AE1769), 또는 본 발명의 항체에 포함된 크로스오버 Fab 분자(둘 다는 아님)에서 수행된다. 특정 양태에서, 전하 변형은 본 발명의 항체에 포함된 통상적인 Fab 분자(특정 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합함)에서 수행된다.
따라서, 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 a) 제1 항원(예컨대, 종양-연관 항원)에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티, 및 b) 제2 항원(예컨대, Dotam-Pb)에 결합하는 제2 결합 모이어티를 포함하고, 이때 이중특이적 항원 결합 분자의 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 둘 다 Fab 분자이고, 항원 결합 모이어티 중 하나(일부 양태에서, 특히 제2 항원 결합 모이어티)는 크로스-Fab 단편이고, Fab 분자 중 하나는 본원에 기술된 전하 변형을 포함하는 CH1 도메인 및 본원에 기술된 전하 변형을 포함하는 CL 도메인을 포함한다. 전하 변형을 포함하는 Fab가 통상적인(비-크로스) Fab이고, 예컨대, 일부 양태에서, 제1 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티인 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자를 추가로 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 제3 Fab 분자는 a)의 제1 Fab 분자와 동일하다. 이들 양태에서, 하기 양태에 따른 아미노산 치환(전하 변형)은 제1 Fab 분자 및 제3 Fab 분자 각각의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 수행될 수 있다. 다르게는, 하기 양태에 따른 아미노산 치환은 b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 수행될 수 있지만, 제1 Fab 분자 및 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서는 수행되지 않는다.
일부 양태에서, 전하 변형을 포함하는 경쇄 불변 도메인 CL 및 전하 변형을 포함하는 중쇄 불변 도메인 CH1을 포함하는 Fab 분자에서, 경쇄 불변 도메인 CL의 전하 변형은 위치 124 및 임의적으로 위치 123(카밧에 따른 넘버링)에 있고, 중쇄 불변 도메인 CH1의 전하 변형은 위치 147 및/또는 213(카밧에 따른 넘버링)에 있다.
일부 양태에서, 경쇄 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(하나의 바람직한 양태에, 독립적으로 리신(K))에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 중쇄 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산 및/또는 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링).
다른 양태에서, 경쇄 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(하나의 바람직한 양태에서, 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R))에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 중쇄 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링).
추가 양태에서, 경쇄 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)(하나의 바람직한 양태에서, 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R))에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 중쇄 불변 도메인 CH1에서, 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링).
추가 양태에서, 경쇄 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(하나의 바람직한 양태에서, 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R))에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 중쇄 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링).
추가 양태에서, 경쇄 불변 도메인에서, 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(하나의 바람직한 양태에서, 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R))에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 위치 123의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(하나의 바람직한 양태에서, 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R))에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 중쇄 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 치환되고(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링), 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링).
추가 양태에서, 경쇄 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 중쇄 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링), 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링).
추가 양태에서, 경쇄 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 위치 123의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 중쇄 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링), 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링).
추가 양태에서, 경쇄 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 리신(K) (카밧에 따른 넘버링)에 의해 치환되고 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 중쇄 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링), 위치 213의 아미노산은 아스파르트산(D)에 의해 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링).
추가 양태에서, 경쇄 불변 도메인에서, 위치 124의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 위치 123의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 중쇄 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링), 위치 213의 아미노산은 아스파르트산(D)에 의해 치환된다(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링).
한 양태에서, 항체는 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄, 및 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함하고, 이때 a) 제1 경쇄의 불변 도메인 CL 및 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1은 본원에 기술된 전하 변형 치환을 포함하고; b) 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 경쇄 불변 도메인 CL 및 중쇄 불변 도메인 CH1은 서로 대체된다(따라서, 크로스-Fab를 형성함). 이러한 배열의 예는 P1AE1768에 대해 도시된다.
다른 양태에서, 항체는 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 전장 항체(이때, 전장 항체의 2개의 중쇄 불변 도메인 CH1 및 2개의 경쇄 불변 도메인 CL은 본원에 기술된 전하 변형을 포함함); 및 폴리펩티드 연결기를 통해 VL 도메인 및 CL 도메인에 연결된 VH 및 CH1 도메인을 포함하는 scFab(VH-CH1-연결기-VL-CL)(이때, scFab는 중쇄 중 하나의 N-말단에 융합되고, scFab는 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성함)를 포함한다. 이러한 배열의 예는 P1AE1770이다.
다른 양태에서, 다중특이적 항체는 제1 항원에 대한 항원 결합 부위(예컨대, 제1 항원에 대해 2가일 수 있음)를 포함하는 전장 항체를 포함하고, 이때 전장 항체의 2개의 중쇄 불변 도메인 CH1 및 2개의 경쇄 불변 도메인 CL은 본원에 기술된 전하 변형을 포함하고, 중쇄 중 하나의 C-말단(예컨대, 이의 CH3 도메인의 C-말단)은 폴리펩티드 연결기를 통해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드와 회합하여 제2 항원에 대한 결합 부위를 포함하는 크로스-Fab를 형성한다.
제1 폴리펩티드는 N-말단 VL 도메인 및 C-말단 CH1 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 융합을 갖는 중쇄는 N-말단에서 C-말단까지 VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VL-CH1을 포함할 수 있다. 경쇄는 VH-CL을 포함할 수 있다. 이러한 배열의 예는 P1AE1767이다.
추가 양태에서, 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체로서, 중쇄의 CH1 도메인 및 경쇄의 CL 도메인이 본원에 기술된 전하 변형을 포함하는, 전장 항체;
b) i) 항체 중쇄 가변 도메인(VH); 또는 ii) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1); 또는 iii) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드;
c) i) 항체 경쇄 가변 도메인(VL); 또는 ii) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드
를 포함하되, (b)의 펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 및 (c)의 펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인이 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하는, 이중특이적 항체일 수 있다. 이러한 배열의 예는 PRIT-213 및 plAE1766이다.
일부 양태에서, 본 발명의 항체는 a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티, b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 모이어티, 및 c) 제1 항원에 결합하는 제3 항원 결합 모이어티를 포함하고, 이때 항체의 제1, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 모두 Fab 분자이고, 항원 결합 모이어티 중 하나(특히 제2 항원 결합 모이어티)에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 각각 서로 대체되고, i) 상기 양태에 따른 아미노산 치환은 각각의 제1 Fab 분자 및 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 수행되지만, b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서는 수행되지 않거나; ii) 상기 양태에 따른 아미노산 치환은 b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 수행되지만, 제1 Fab 분자 및 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서는 수행되지 않는다. 일부 양태에서, 전하 변형은 통상적인(교환되지 않은) Fab에 존재하고: 따라서, 예컨대 제2 항원 결합 모이어티가 크로스-Fab인 경우, 옵션 (i)이 바람직하다.
한 특정 양태에서, 본 발명의 다가 항체는 제1 항체 중쇄 및 제2 항체 중쇄 및 제1 항체 경쇄 및 제2 항체 경쇄를 포함하는 전장 항체를 포함하고, 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 조립되어 제1 항원(예컨대, 종양 특이적 항원, 예컨대 CEA)에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 Fab를 형성하고, 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 조립되어 제2 항원(예컨대, DOTAM-킬레이트화된 Pb)에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 크로스-Fab를 형성하고(예컨대, 제2 중쇄는 VH 도메인 대신에 VL 도메인을 갖고, 제2 경쇄는 VL 도메인 대신에 VH 도메인을 가짐); 제1 항체 중쇄 또는 제2 항체 중쇄는 연결기를 통해 CH1 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 융합되고, 상기 제1 폴리펩티드는 CL 및 VL을 포함하는 제2 폴리펩티드와 조립되어 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 Fab를 형성하도록 하고, 제1 중쇄의 CH1 도메인 및 제1 경쇄의 CL 도메인은 본원에 기술된 전하 변형을 포함한다.
제1 폴리펩티드의 CH1 도메인 및 제2 폴리펩티드의 CL 도메인은 또한 본원에 기술된 전하 변형을 포함할 수 있다.
융합은 전장 항체의 중쇄 중 하나, 임의적으로 제2 중쇄의 N-말단에 있을 수 있다. 이러한 배열의 예는 P1AE1769이다.
Pb-DOTAM 및 CEA에 결합하는 다중특이적 항체
일부 양태에서, 본 발명의 항체가 Pb-DOTAM 및 CEA 둘 다에 결합하는 다중특이적, 예컨대 이중특이적 항체인 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 이들은 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 항원 결합 부위와 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다. 이러한 양태에서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위는 본원에 기술된 임의의 양태에 따를 수 있다. 형식은 본원에 기술된 형식 중 하나일 수 있다.
임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 1가 결합에 대해 1 nM 이하, 500 pM 이하, 200 pM 이하, 또는 100 pM 이하의 Kd 값으로 결합할 수 있다.
임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열; (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.
임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열; (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 항체는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 다른 양태에서, 항체는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 추가 양태에서, 항체는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함한다. 추가 양태에서, 항체는 (a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열; (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함한다. 한 양태에서, 항체는 (a) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, (ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하다.
다른 양상에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열; (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
임의의 상기 양태에서, 다중특이적 항체는 인간화될 수 있다. 한 양태에서, 항-CEA 항원 결합 부위는 임의의 상기 양태에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예컨대. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열을 기준으로 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열은 포함하는 항원 결합 부위는 CEA에 결합하는 능력, 바람직하게는 상기 제시된 친화도를 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 17에서 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한 서열번호 17의 VH 서열을 포함한다. 특정 양태에서, VH는 (a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
다른 양태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열을 기준으로 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CEA에 결합하는 능력, 바람직하게는 상기 제시된 친화도를 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 18에서 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, CEA에 대한 항원 결합 부위는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한 서열번호 18의 VL 서열을 포함한다. 특정 양태에서, VL은 (a) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
다른 양태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 양태에서, 항체는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한 서열번호 17 및 서열번호의 VH 및 VL 서열을 각각 포함한다.
일부 양태에서, 다중특이적 항체는 본원에 제공된 PRIT-0213 또는 PRIT-0214 항체와 동일한 CEA-에피토프에 결합할 수 있다.
Pb-DOTAM 및 ERBB2에 결합하는 다중특이적 항체
일부 양태에서, 본 발명의 항체는 Pb-DOTAM 및 ERBB2 둘 다에 결합하는 다중특이적, 예컨대 이중특이적 항체인 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 이들은 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 항원 결합 부위와 ERBB2에 대한 항원 결합 부위를 포함한다. 이러한 양태에서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위는 본원에 기술된 임의의 양태에 따를 수 있다. 형식은 본원에 기술된 임의의 형식일 수 있다.
임의적으로, ERBB2에 결합하는 항원 결합 부위는 1가 결합에 대해 1 nM 이하, 500 pM 이하, 200 pM 이하 또는 100 pM 이하의 Kd 값으로 결합할 수 있다.
임의적으로, ERBB2에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.
임의적으로, ERBB2에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함한다. 한 양태에서, 항체는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 다른 양태에서, 항체는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 추가 양태에서, 항체는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함한다. 추가 양태에서, 항체는 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
임의적으로, ERBB2에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함한다. 한 양태에서, 항체는 (a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
임의적으로, ERBB2에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
다른 양상에서, ERBB2에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
임의의 상기 양태에서, 다중특이적 항체는 인간화될 수 있다. 한 양태에서, 항-ERBB2 항원 결합 부위는 임의의 상기 양태에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예컨대. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, ERBB2에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 34의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열을 기준으로 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 ERBB2에 결합하는 능력, 바람직하게는 상기 제시된 친화도를 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 34에서 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, ERBB2에 결합하는 항원 결합 부위는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한 서열번호 34의 VH 서열을 포함한다. 특정 양태에서, VH는 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
다른 양태에서, ERBB2에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 35의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열을 기준으로 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 ERBB2에 결합하는 능력, 바람직하게는 상기 제시된 친화도를 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 35에서 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, CEA에 대한 항원 결합 부위는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한 서열번호 35의 VL 서열을 포함한다. 특정 양태에서, VL은 (a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
다른 양태에서, ERBB2에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 양태에서, 항체는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한 각각 서열번호 34 및 서열번호 35의 VH 및 VL 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 다중특이적 항체는 본원에 제공된 P1AD9827 항체와 ERBB2-에피토프에 결합한다.
Pb-DOTAM 및 CD20에 결합하는 다중특이적 항체
일부 양태에서, 본 발명의 항체는 Pb-DOTAM 및 CD20 둘 다에 결합하는 다중특이적, 예컨대 이중특이적 항체인 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 이들은 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 항원 결합 부위와 CD20에 대한 항원 결합 부위를 포함한다. 이러한 양태에서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위는 본원에 기술된 임의의 양태에 따를 수 있다. 형식은 본원에 기술된 임의의 형식일 수 있다.
임의적으로, CD20에 결합하는 항원 결합 부위는 1가 결합을 위해 1 nM 이하, 500 pM 이하, 200 pM 이하, 또는 100 pM 이하의 Kd 값으로 결합할 수 있다.
임의적으로, CD20에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.
임의적으로, CD20에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 항체는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 다른 양태에서, 항체는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 추가 양태에서, 항체는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함한다. 추가 양태에서, 항체는 (a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
임의적으로, CD20에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함한다. 한 양태에서, 항체는 (a) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
임의적으로, CD20에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
다른 양상에서, CD20에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
임의의 상기 양태에서, 다중특이적 항체는 인간화될 수 있다. 한 양태에서, 항-CD20 항원 결합 부위는 임의의 상기 양태에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예컨대. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, CD20에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 45의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열을 기준으로 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CD20에 결합하는 능력, 바람직하게는 상기 제시된 친화도를 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 45에서 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, CD20에 결합하는 항원 결합 부위는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한 서열번호 45의 VH 서열을 포함한다. 특정 양태에서, VH는 (a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
다른 양태에서, CD20에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 46의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열을 기준으로 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CD20에 결합하는 능력, 바람직하게는 상기 제시된 친화도를 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 46에서 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실되었다. 특정 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, CD20에 대한 항원 결합 부위는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한 서열번호 46의 VL 서열을 포함한다. 특정 양태에서, VL은 (a) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
다른 양태에서, CD20에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 양태에서, 항체는 이러한 서열의 번역후 변형을 비롯한 각각 서열번호 45 및 서열번호 46의 VH 및 VL 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 다중특이적 항체는 본원에 제공된 P1AD9826 항체와 동일한 CD20-에피토프에 결합할 수 있다.
항체 변이체
특정 양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 목적 특징, 예컨대 항원 결합을 보유한다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 최종 구축물에 도달하도록 수행될 수 있다.
치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR(CDR) 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 항목으로 표 1에 제시된다. 보다 실질적인 변화는 "예시적인 치환"이라는 항목으로 표 1에 제공되고, 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 추가로 후술된다. 아미노산 치환은 관심 항체 및 원하는 활성, 예컨대 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별된 생성물에 도입될 수 있다.
[표 1]
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아미노산은 일반적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Iie;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 기본: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 수 있다.
한 유형의 치환 변이체는 모 항체(예컨대, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택되는 생성 변이체는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성(예컨대, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)에서 변형(예컨대, 개선)을 가지고/거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 수 있다. 예시적인 치환 변이체는, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙된 항체이다. 간단히 말해서, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고 변이체 항체가 파지에 표시되고 특정 생물학적 활성(예컨대, 결합 친화도)에 대해 선별된다.
예컨대, 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 변경(예컨대, 치환)이 수행될 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기(예컨대, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)]), 및/또는 결합 친화도에 대해 시험되는 생성 변이체 VH 또는 VL를 갖는, 항원과 접촉하는 잔기에서 수행될 수 있다. 2차 라이브러리를 구성하고 재선택함에 의한 친화도 성숙은, 예컨대, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 기술되었다. 친화도 성숙의 일부 양태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법(예컨대, 오류가 발생하기 쉬운 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-지향된 돌연변이유발)에 의해 성숙을 위해 선택되는 가변 유전자에 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서, 라이브러리를 선별하여 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 여러 HVR 잔기(예컨대, 한 번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위화되는 HVR-지향된 접근법을 포함한다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는, 예컨대 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 식별될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 그러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예컨대, 본원에 제공된 보존적 치환)이 HVR에서 수행될 수 있다. 이러한 변경은, 예를 들어 HVR의 항원 접촉 잔기 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하는 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기술된 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 지칭된다. 이러한 방법에서, 표적 잔기의 잔기 또는 기(예컨대, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기)는 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 식별되고 대체되어 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 결정한다. 추가 치환이 아미노산 위치에 도입되어 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 증명할 수 있다. 다르게는 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 식별하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 원하는 특성을 함유하는지 측정하기 위해 선별될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N- 또는 C-말단에 효소(예컨대, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 융합을 포함한다.
글리코실화 변이체
특정 양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키기 위해 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착된 분지형 이중안테나 올리고당을 포함한다(예컨대, 문헌[Wright et al. TIBTECH 15 : 26-32 (1997)] 참고). 올리고당은 다양한 탄수화물, 예컨대 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알 산, 및 이중안테나 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형이 수행될 수 있다.
한 양태에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1 내지 80%, 1 내지 65%, 5 내지 65% 또는 20 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어, 국제 특허공보 제2008/077546호에 기술된 바와 같이. MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 측정된, Asn 297에 부착된 모든 당구조(예컨대, 복합체, 하이브리드 및 고도 만노스 구조)의 합계를 기준으로 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 위치 297에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만(Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링); Asn297은 또한 항체의 경미한 서열 변이로 인해, 위치 297의 상류 또는 하류 약 ± 3개의 아미노산, 즉 위치 294 내지 300에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다.(예컨대, 미국 출원공보 제2003/0157108호[프레스타 엘(Presta, L.)]; 제2004/0093621호[쿄와 하코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)] 참고). "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 문헌의 예는 다음을 포함한다: 미국 출원공보 제2003/0157108호; 국제 특허공보 제2000/61739호; 제2001/29246호; 미국 출원공보 제2003/0115614호; 제2002/0164328호; 제2004/0093621호; 제2004/0132140호; 제2004/0110704호; 제2004/0110282호; 제2004/0109865호; 국제 특허공보 제2003/085119호; 제2003/084570호; 제2005/035586호; 제2005/035778호; 제2005/053742호; 제2002/031140호; 문헌[Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lecl3 CHO 세포(문헌[Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 출원공보 제2003/0157108 A1호(프레스타 엘); 및 국제 특허공보 제2004/056312 A1호[아담스(Adams) 등, 특히 실시예 11], 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6 푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예컨대, 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]; 문헌[Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 국제 특허공보 제2003/085107호)를 포함한다.
예컨대, 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고당이 GlcNAc에 의해 이등분된 올리고사카라이드와 함께 항체 변이체가 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예컨대 국제 특허공보 제2003/011878호[장-마이레(Jean-Mairet) 등]; 미국 특허공보 제6,602,684호[우마나(Umana) 등]; 및 미국 출원공보 제2005/0123546호(우마나)를 참고한다. Fc 영역에 부착된 올리고당에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예컨대 국제 특허공보 제1997/30087호[파텔(Patel) 등]; 국제 특허공보 제1998/58964호[라주 에스(Raju, S.)]; 및 국제 특허공보 제1999/22764호(라주 에스)에 기술된다.
항체가 글리코실화 정도를 감소시키기 위해 변형되는 것이 바람직할 수 있다. 일부 양태에서 항체는 비글리코실화되거나 탈글리코실화될 수 있다. 항체는 N297에서의 치환, 예컨대 N297D/A를 포함할 수 있다.
Fc 영역 변이체
특정 양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 감소된 효과기 기능, 예컨대 감소된 또는 제거된 CDC, ADCC 및/또는 FcγR 결합을 갖는 항체 변이체를 고려한다. 특정 양상에서, 본 발명은 모든 효과기 기능이 아니라 일부 효과기 기능을 갖는 항체 변이체를 고려하고, 이것은 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정 효과기 기능(예컨대, 보체-의존성 세포독성(CDC) 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC))은 불필요하거나 유해한 적용례를 위한 바람직한 후보군으로 만든다.
시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합이 결여된 것(따라서, ADCC 활성이 결여되었을 가능성이 있음)을 확인하기 위해 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FCγRII 및 FCγRIII를 발현한다. 조혈 세포에 대한 FCR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu, Rev, Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적인 예는 미국 특허공보 제5,500,362호(예컨대, 문헌[Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참고) 및 문헌[Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 미국 특허공보 제5,821,337호(문헌[Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참고)에 기술된다. 다르게는, 비-방사성 검정 방법을 사용할 수 있다[예컨대, 유세포 분석을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 검정(셀테크놀로지 인코포레이티드(CelITechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 검정(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)]. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 킬러(NK) 세포가 포함된다. 다르게는 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 문헌[Clynes et al. Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같이, 생체내, 예컨대 동물 모델에서 평가될 수 있다. C1q 결합 검정은 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 없음을 확인하기 위해 수행될 수도 있다(예컨대, 국제 특허공보 제2006/029879호 및 제2005/100402호의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참고). 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(예컨대, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. 202:163 (1996)]; 문헌[Cragg, MS et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg, MS 및 MJ Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참고). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예컨대, 문헌[Petkova, SB et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)]; 국제 특허공보 제2013/120929 Al호 참고).
효과기 기능이 감소된 항체는 하나 이상의 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329(미국 특허공보 제6,737,056호), 예컨대 P329G의 치환을 갖는 항체를 포함한다. 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환된 Fc 돌연변이체, 예컨대 알라닌에 대해 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허공보 제7,332,581호).
특정 양상에서, 항체 변이체는 FcγR 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대 Fc 영역의 위치 234 및 235에서의 치환(잔기의 EU 넘버링)을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 치환은 L234A 및 L235A(LALA)이다. 특정 양상에서, 항체 변이체는 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 D265A 및/또는 P329g을 추가로 포함한다. 한 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 L234A, L235A 및 P329G(LALA-PG)이다(예컨대, 국제 특허공보 제2012/130831호 참고). 다른 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역의 L234A, L235A 및 D265A(LALA-DA)이다.
다른 양태에서, IgG4 또는 IgG2와 같은 감소된 효과기 기능을 갖는 IgG 아형을 사용하는 것이 가능할 수 있다.
FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 특정 항체 변이체가 기술된다(예컨대, 미국 특허공보 제6,737,056호; 국제 특허공보 제2004/056312호 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참고).
일부 양태에서, 예컨대, 미국 특허공보 제6,194,551호, 국제 특허공고 제99/51642호 및 문헌[Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기술된 바와 같이 변경된(즉, 개선되거나 감소된, 바람직하게는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 초래하는 변경이 Fc 영역에서 수행된다.
일부 양태에서, FcRn 결합은, 예컨대 더 짧은 반감기를 위해 감소될 수 있다. 다른 양태에서, FcRn의 결합은 정상일 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 정상 FcRn 결합은 클리어링제를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
특정 양상에서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대 Fc-영역의 위치 253 및/또는 310 및/또는 435에서의 치환(잔기의 EU 넘버링)을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상에서, 항체 변이체는 위치 253, 310 및 435에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 I253A, H310A 및 H435A이다(예컨대, 문헌[Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508] 참고).
특정 양상에서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역, 예컨대 Fc 영역의 위치 310 및/또는 433 및/또는 436에서의 치환(잔기의 EU 넘버링)을 포함한다. 특정 양상에서, 항체 변이체는 위치 310, 433 및 436에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 H310A, H433A 및 Y436A이다(예컨대, 국제 특허공보 제2014/177460호 참고). 예를 들어, 일부 양태에서, 정상적인 FcRn 결합이 사용될 수 있다.
또한, Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 문헌[Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허공보 제5,648,260호; 미국 특허공보 제5,624,821호; 및 국제 특허공보 제94/29351호를 참고한다.
본원에 보고된 항체 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK로 종결하는 완전한 C-말단일 수 있다. 중쇄의 C-말단은 C-말단 아미노산 잔기 중 1 또는 2개가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 하나의 바람직한 양상에서, 중쇄의 C-말단은 단축된 C-말단 종결 PG이다.
본원에 보고된 모든 양상의 한 양상에서, 본원에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 C-말단 글리신 잔기(G446, 아미노산 위치의 EU 인덱스 넘버링)를 포함한다. 이것은 본원에서 사용된 용어 "전장 항체" 또는 "전장 중쇄"에 여전히 명시적으로 포함된다.
항체 유도체
특정 양태에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예에는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독 중합체 또는 랜덤 공중합체), 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온 알데하이드는 물에서의 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착된 경우, 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 비제한적으로 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건 하의 치료법에 사용될 것인지 여부를 비롯한 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.
다른 양태에서, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 비제한적으로 일반 세포에 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포가 살해되는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함한다.
재조합 방법 및 조성물
항체는, 예컨대 미국 특허공보 제4,816,567호에 기술된 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 한 양태에서, 본원에 기술된 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예컨대, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예컨대, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 양태에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다(예컨대, 다음으로 형질전환됨): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터.
다중특이적 항체의 경우, 특정 항체 형식의 중쇄 및 경쇄 성분 각각을 코딩하는 핵산이 제공될 수 있다. 이러한 핵산을 포함하는 벡터 또는 벡터 집합도 제공된다.
한 양태에서, 숙주 세포는, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프 세포(예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)와 같이 진핵성이다. 한 양태에서, 본 발명에 따른 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 이때 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 제공된 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의적으로 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 매질)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
항체의 재조합 생산을 위해, 예컨대 전술된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산은 단리되고, 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 사용하여(예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기술된 원핵성 또는 진핵성 세포를 포함한다. 예컨대, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서, 예컨대 미국 특허공보 제5,648,237호, 제5,789,199호 및 제5,840,523호를 참고한다(또한, 대장균에서 항체 단편의 발현을 기술하는 문헌[Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참고). 발현 후, 항체는 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 이외에, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 글리코실화 경로가 "인간화"된 진균 및 효모 균주를 비롯한 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이고, 부분적으로 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 생성한다(문헌[Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), and Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)] 참고).
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추 동물 및 척추 동물)로부터 유래한다. 무척추 동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기퍼다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 식별되었다.
식물 세포 배양물도 숙주로 이용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허공보 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호 및 제6,417,429호[유전자이식 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES, 상표) 기술을 기재함]를 참고한다.
척추 동물 세포도 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인; 인간 배아 신장 라인(예컨대, 문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예컨대, 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기술된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); 예컨대, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기술된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 DHFR- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예컨대 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참고한다.
검정
본원에 제공된 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 이들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 식별, 선별 또는 특징규명될 수 있다.
결합 검정 및 기타 검정
한 양상에서, 본 발명의 항체는, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 이의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
다른 양상에서, 경쟁 검정은, 예컨대 Pb-DOTAM 또는 CEA에 대한 결합에 대해 PRIT-0213 또는 PRIT-0214와 경쟁하는 항체를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 이러한 경쟁 항체는 PRIT-0213 또는 PRIT-0214에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예컨대, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하는 상세한 예시적인 방법은 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공된다.
예시적인 경쟁 검정에서, 부동태화된 항원은 항원에 결합하는 제1 표지된 항체(예컨대, PRIT-0213 및 PRIT-0214) 및 항원에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험되는 비표지된 제2 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 부동태화된 항원은 표지된 제1 항체를 포함하지만 비표지된 제2 항체를 포함하지 않는 용액에서 항온처리된다. 항원에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 항온처리한 후, 결합되지 않은 과잉의 항체가 제거되고, 부동태화된 항원과 회합된 표지의 양이 측정된다. 부동태화된 항원과 회합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소하는 경우, 이는 제2 항체가 항원에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁하고 있음을 나타낸다(문헌[Harlow and Lane (1988) Antibody: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 참고).
항체 친화도
특정 양태에서, 본원에 제공된 항체는 1 nM 이하, 500 pM 이하, 200 pM 이하, 100 pM 이하, 50 pM 이하, 20 pM 이하, 10 pM 이하, 5 pM 이하 또는 1 pM 이하, 또는 본원에서 달리 언급된 바와 같은 해리 상수(Kd)를 갖는다.
한 양태에서, Kd는 방사선표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정된다. 한 양태에서, RIA는 관심 항체의 Fab 버전 및 이의 항원으로 수행된다. 예컨대, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 표지되지 않은 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시키고, 이어서 결합된 항원을 항-Fab 항체가 코팅된 플레이트로 포획하여 측정된다(예컨대, 문헌[Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)]). 검정 조건을 설정하기 위해 마이크로티터(MICROTITER, 등록상표) 다중-웰 플레이트[써모 사이언티픽(Thermo Scientific)]를 밤새 50 mM 나트륨 카보네이트(pH 9.6) 중 5 μg/mL의 포획 항-Fab 항체[카펠 랩스(Cappel Labs)]로 코팅하고, 후속적으로 실온(약 23℃)에 2 내지 5시간 동안 PBS 중 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 비-흡착 플레이트[눈크(Nunc) #269620]에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석액과 혼합하였다(예컨대, 문헌[Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 항온처리하지만; 항온처리는 평형에 도달하기 위해 더 긴 기간(예컨대, 약 65시간) 동안 계속될 수 있다. 이어서, 혼합물을 실온에서 항온처리하기 위해(예컨대, 1시간 동안) 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20[트윈(TWEEN)-20(등록상표)]으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면, 150 μL/웰의 섬광체[마이크로신트(MICROSCINT)-20(상표); 패커드(Packard)]를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT, 상표) 감마 계수기(패커드)에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도가 경쟁 결합 검정에 사용하기 위해 선택된다.
다른 양태에 따르면, Kd는 비아코어(BIACORE, 등록상표) 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 예컨대, 비아코어(등록상표)-2000 또는 비아코어(등록상표)-3000(비아코어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하는 검정은 약 10 반응 단위(RU)로 부동태화된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 수행된다. 한 양태에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)은 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화된다. 항원은 커플링된 단백질의 약 10 반응 단위(RU)를 달성하기 위해 5 μL/분의 유량으로 주사 전에 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)로 5 μg/mL(약 0.2 μM)까지 희석된다. 항원 주사 후 1 M 에탄 아민을 주사하여 미반응된 기를 차단한다. 동력학 측정을 위해 Fab의 2배 연속 희석액(0.78 내지 500 nM)을 0.05% 폴리소르베이트 20(트윈-20, 상표) 계면활성제(PBST)와 함께 PBS에 25℃에서 약 25 μL/분의 유량으로 주사한다. 회합률(kon) 및 해리율(koff)은 회합 및 해리 센서그램을 동시에 정합하여 간단한 일대일 랑뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산된다. 평형 해리 상수(Kd)는 koff/kon 비로 계산된다(예컨대, 문헌[Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)] 참고). 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 온-레이트(on-rate)가 106 M-1 s-1을 초과하면, 스탑-플로우(stop-flow) 장착된 분광계[아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)] 또는 교반 큐벳(cuvette)이 장착된 8000-시리즈 SLM-AMINCO(상표) 분광계[써모스펙트로닉스(ThermoSpectronic)]와 같은 분광계에서 측정된 증가하는 항원 농도의 존재 하에 PBS(pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 25℃ 형광 방출 강도(여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 급랭 기술을 사용하여 온-레이트를 측정할 수 있다.
다른 양태에서, Kd는 SET(용액 평형 적정) 검정을 사용하여 측정된다. 이러한 검정에 따라, 시험 항체는 전형적으로 일정한 농도로 적용되고, 시험 항원의 연속 희석액과 혼합된다. 평형을 확립하기 위한 항온처리 후, 유리 항체의 일부는 항원 코팅된 표면에 포획되고, 일반적으로 전자화학발광(예컨대, 문헌[Haenel et al Analytical Biochemistry 339 (2005) 182-184]에 기술된 바와 같이)을 사용하여 표지/태깅(tagging)된 항-종 항체로 검출된다.
예를 들어, 한 양태에서 384-웰 스트렙타비딘 플레이트[눈크, 마이크로코트(Microcoat) # 11974998001]를 20 ng/mL의 농도의 PBS-완충액 중 25 μL/웰의 항원-비오틴-이성질체 혼합물과 함께 4℃에서 밤새 항온처리한다. 유리 항원과 항체 샘플의 평형화를 위해, 0.01 내지 1 nM의 항체를 2,500 nM, 500 nM 또는 100 nM의 농도에서 시작하여 1:3, 1:2 또는 1:1.7 희석 단계에서 관련 항원으로 적정한다. 샘플을 밀봉된 REMP 스토리지(Storage) 폴리프로필렌 마이크로플레이트[브룩스(Brooks)]에서 밤새 4℃에서 항온처리한다. 밤새 항온처리한 후, 스트렙타비딘 플레이트를 웰 당 90 μL PBST로 3회 세척한다. 평형 플레이트의 각각의 샘플 15 μL를 검정 플레이트로 옮기고 실온에서 15분 동안 항온처리하고, 이어서 PBST 완충액으로 3회 90 μL 세척 단계를 수행한다. 25 μL의 염소 항-인간 IgG 항체 -POD 접합체(문헌[Jackson, 109-036-088, 1:4000 in OSEP])를 첨가하고, 이어서 PBST 완충액으로 6회 90 μL 세척 단계를 수행하여 검출을 수행한다. 25 μL의 TMB 기질[로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 카탈로그 번호 11835033001]을 각각의 웰에 첨가한다. 측정을 사파이어(Safire)2 판독기[테칸(Tecan)]에서 370/492 nm으로 수행한다.
다른 양태에서, Kd는 킨엑사(동역학적 배제) 검정을 사용하여 측정된다. 이러한 검정에 따라, 항원은 전형으로 일정한 농도의 항체 결합 부위로 적정되고, 샘플은 평형에 도달하고, 이어서 항원-포화된 항체 복합체의 세척과 함께, 항원 코팅된 비드에서 유리 항체 결합 부위가 포획되는 플로우 셀을 통해 신속하게 추출된다. 이어서, 비드-포획된 항체는 표지된 항-종 항체, 예컨대 형광 표지된 항체로 검출된다(문헌[Bee et al PloS One, 2012; 7(4): e36261]). 예를 들어, 한 양태에서, 킨엑사 실험은 실행 완충액으로 PBS(pH 7.4)를 사용하여 실온(RT)에서 수행된다. 샘플은 1 mg/mL BSA("샘플 완충액")가 보충된 실행 완충액에서 준비된다. 0.25 mL/분의 유량이 사용된다. 결합 부위 농도가 5 pM인 일정한 양의 항체를 100 pM에서 시작하여 2배 연속 희석(농도 범위 0.049 pM 내지 100 pM)하여 항원으로 적정한다. 항원이 없는 항체 샘플 하나는 100% 신호로 사용된다(즉, 억제 없음). 항원-항체 복합체는 평형에 도달하도록 24시간 이상 동안 실온에서 배양된다. 이어서, 평형화된 혼합물을 킨엑사 시스템의 항원 결합 비드 컬럼을 통해 5 mL 부피로 추출하여 결합되지 않은 항체가 용액의 평형 상태를 교란하지 않고 비드에 포획되도록 한다. 포획된 항체는 샘플 완충액에서 250 ng/mL 딜라이트(Dylight 650)(등록상표)-접합된 항-인간 Fc-단편 특이적 2차 항체를 사용하여 검출된다. 각각의 샘플은 모든 평형 실험에 대해 중복 측정된다. KD는 "표준 분석" 방법을 사용하여 킨엑사 소프트웨어(버전 4.0.11)에 포함된 단일-부위 동종 결합 모델을 사용하여 데이터의 비선형 회귀 분석에서 수득된다.
치료 방법 및 조성물
상기 논의된 바와 같이, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 방사성핵종을 표적에 전달하는 것이 바람직한 임의의 치료에 적합하다. 따라서, 본 발명은 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 기술된 다중특이적 또는 이중특이적 항체와 같은 표적화된 항체를 제공한다. 더욱 구체적으로, 사전-표적화된 방사선면역요법의 방법에 사용하기 위한 본원에 기술된 표적화된 항체(예컨대, 다중특이적 또는 이중특이적 항체)가 제공된다. 이러한 양태에서, 킬레이트화된 Pb는 바람직하게는 212Pb이다.
상기 언급된 바와 같이, 치료는 환자의 병든 세포를 표적으로 하는 세포독성 활성에 의해 치료될 수 있는 임의의 병태의 치료일 수 있다. 치료는 바람직하게는 종양 또는 암의 치료이다. 그러나, 본 발명의 적용가능성은 종양 및 암으로 제한되지 않는다. 예컨대, 치료는 또한 바이러스 감염, 또는 다른 병원성 유기체, 예컨대 원핵생물에 의한 감염의 치료일 수 있다. 임의적으로, 표적화는 또한 T 세포 구동된 자가면역 질환 또는 T 세포 혈액암의 치료를 위한 T 세포에 대한 것일 수 있다. 따라서, 치료할 병태는 HIV, 광견병, EBV 및 카포시 육종-연관 헤르페스 바이러스와 같은 바이러스 감염과 다발성 경화증 및 이식편-대-숙주 질환 약물과 같은 자가 면역 질환을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "암"은 고형암 및 혈액 암 둘 다, 예컨대 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비소세포 폐암(NSCL), 세기관지 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암을 포함한다. 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위장암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관의 암, 신세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담도암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 뇌척수종, 수모세포종, 수막종, 편평 세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종, 예컨대 임의의 상기 암의 난치성 버전, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합을 포함한다.
치료법을 위해 방사성 동위원소를 조직 또는 기관으로 표적화시키는 방법은 다음을 포함할 수 있다:
i) 본원에 기술된 다중특이적 또는 이중특이적 항체를 대상에게 투여하는 단계로서, 항체가 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화하는, 단계; 및
ii) 후속적으로, DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종을 개체에게 투여하는 단계로서, 이때 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종이 세포 표면에 국지화된 항체에 결합하는, 단계.
임의적으로, 단계 i)과 ii) 사이에 클리어링/차단제가 투여된다. 클리어링/차단제는 Pb-DOTAM에 특이적인 항원 결합 부위에 결합하고, 킬레이트화된 방사성핵종에 의한 후속 결합을 차단할 수 있다. 클리어링제는 금속 이온으로 킬레이트화되고 클리어링 모이어티에 접합된 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체를 포함할 수 있다.
적합한 클리어링 모이어티의 예는 분자의 크기 및/또는 유체역학적 반경을 증가시켜, 분자가 순환 중에 항체에 결합하는 분자의 능력을 방해하지 않으면서 종양에 접근하는 분자의 능력을 방해하는 모이어티를 포함할 수 있다. 예시적인 모이어티는 친수성 중합체를 포함한다. 모이어티는, 예컨대 덱스트란, 덱스트린, PEG, 폴리시알산(PSA), 히알루론산, 하이드록시에틸-전분(HES) 또는 폴리(2-에틸 2-옥사졸린)(PEOZ)의 중합체 또는 공중합체일 수 있다. 다른 양태에서, 모이어티는 비구조화된 펩티드 또는 단백질, 예컨대 XTEN 폴리펩티드(비구조화된 친수성 단백질 중합체), 호모-아미노산 중합체(HAP), 프롤린-알라닌-세린 중합체(PAS), 엘라스틴-유사 펩티드(ELP) 또는 젤라틴-유사 단백질(GLK)을 포함할 수 있다. 중합체에 적합한 분자량은, 예컨대 50 kDa 이상, 예컨대 50 내지 2,000 kDa의 범위일 수 있다. 예컨대, 분자량은 200 내지 800 kDa, 임의적으로 300, 350, 400 또는 450 kDa 초과, 임의적으로 700, 650, 600 또는 550 kDa 미만, 임의적으로 약 500 kDa일 수 있다.
일부 양태에서, 클리어링제는, 예컨대 후술된 바와 같이 덱스트란 또는 이의 유도체에 접합된 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체(금속 이온으로 킬레이트됨)일 수 있다.
일부 양태에서, 항체 대 클리어링제의 중량비는 1:1, 2:1, 3:1 또는 4:1로부터 20:1, 15:1, 10:1, 8:1, 6:1 또는 5:1까지의 범위, 예컨대 1:1 내지 20:1, 1:1 내지 10:1, 2:1 내지 8:1 또는 2:1 내지 6:1의 범위일 수 있다.
일부 양태에서, 클리어링제는 다중특이적 항체로 처리하고 수 시간 또는 수 일 후에 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 클리어링제가 다중특이적 항체의 투여 후 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 22 또는 24시간 이상 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 이상 후에 투여되는 것이 바람직할 수 있다. 일부 양태에서, 클리어링제가 항체의 투여 후 14일 이내, 예컨대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2일 이내에 투여되는 것이 바람직할 수 있다.
임의적으로, 클리어링제는 다중특이적 항체의 투여 후 4 내지 10일, 4 내지 7일, 2 내지 7일, 또는 2 내지 4일의 기간 내에 투여된다.
일부 양태에서, Pb 방사성핵종은 클리어링제의 투여 후 수 분, 수 시간 또는 수 일 후에 투여된다. 일부 양태에서, Pb 방사성핵종은 클리어링제의 투여 후 30분 이상 후, 임의적으로 클리어링제의 투여 후 48시간, 24시간, 8시간 또는 4시간 이내에 투여되는 것이 바람직할 수 있다. 일부 양태에서, Pb 방사성핵종은 클리어링제의 투여 다음날 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 항체는 병용 요법의 일부로 투여될 수 있다. 예를 들어, 이들은 하나 이상의 화학요법제와 병용으로 투여될 수 있다: 화학요법제 및 항체는 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 항체는 추가적으로 또는 다르게는 방사선감작제와 병용으로 투여될 수 있다. 방사선감작제 및 항체는 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
약학 제형
본원에 기술된 항-Pb-DOTAM 항체, 예컨대 다중특이적 또는 이중특이적 항체의 약학 제형은 원하는 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]). 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 비제한적으로 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐 피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 또한 간질성 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20[하일레넥스(HYLENEX, 등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.)]을 포함한다. rHuPH20을 비롯한 예시적인 특정 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 출원공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기술된다. 한 양상에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가 글리코스아미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 미국 특허공보 제6,267,958호에 기술된다. 수성 항체 제형은 미국 특허공보 제6,171,586호 및 국제 특허공보 제2006/044908호에 기술된 것들을 포함하고, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않는 보완적인 활성을 갖는 성분을 함유할 수 있다. 예컨대, 상기 논의된 화학요법제 및/또는 방사선감작제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적절하게 존재한다.
활성 성분은, 예컨대 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐에 포획될 수 있다[예를 들어, 각각 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마이크로에멀젼 중 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐]. 이러한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시된다.
서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 매트릭스는 성형된 제품, 예컨대 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은, 예컨대 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
본 발명은 대상에 대해 수행되는 진단 방법에 사용하기 위한 표적 항체, 예컨대 본원에 기술된 다중특이적 항체를 추가로 제공한다. 진단 방법은, 예컨대 증식성 장애 또는 감염성 질환을 앓고 있는 것으로 의심되는 대상를 진단하기 위한 사전-표적화된 방사선면역영상화 방법일 수 있다. 이러한 양태에서, 킬레이트화된 Pb는 바람직하게는 203Pb이다.
영상화을 위해 조직 또는 기관에 방사성 동위원소를 표적화시키는 방법은 다음을 포함할 수 있다:
i) 본원에 기술된 다중특이적 또는 이중특이적 항체를 대상에게 투여하는 단계로서, 이때 항체가 표적 항원에 결합하고, 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되는, 단계; 및
ii) 후속적으로 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종을 개체에게 투여하는 단계로서, DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종이 세포의 표면에 국지화된 항체에 결합하는, 단계.
다른 양태에서, 본원에 기술된 다중특이적 또는 이중특이적 항체는 투여 시에 킬레이트화된 Pb 방사성핵종과 결합될 수 있다.
임의적으로, 방법은 다음을 추가로 포함할 수 있다:
iii) DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종이 국지화되거나 국지화될 것으로 예상되는 조직 또는 기관을 영상화하는 단계.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 대상의 조직 또는 기관을 영상화하는 단계를 포함할 수 있고, 대상은 이전에 i) 본원에 기술된 다중특이적 또는 이중특이적 항체(이때, 항체는 표적 항원에 결합하고, 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화됨); 및 ii) 개체에 대한 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종(이때, DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종은 세포 표면에 국지화된 항체에 결합함)이 투여되었다.
임의적으로, 단계 i)과 ii) 사이에 클리어링/차단제가 투여된다. 클리어링제, 클리어링제에 대한 투여 섭생법 및 클리어링제에 대한 항체의 중량비는 전술된 바와 같다.
표적 항원은 본원에 논의된 임의의 표적 항원일 수 있다. 일부 양태에서, 표적 항원은 상기 논의된 종양-특이적 항원일 수 있고, 영상화는 종양을 영상화하는 방법일 수 있다. 개인은 종양이 있는 것으로 알려져 있거나 의심될 수 있다.
예컨대, 상기 방법은 폐암, 비소세포 폐암(NSCL), 세기관지 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암을 포함한다. 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위장암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관의 암, 신세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담도암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 뇌척수종, 수모세포종, 수막종, 편평 세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종, 예컨대 임의의 상기 암의 난치성 버전, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합을 앓고 있거나 의심되는 개체에서 종양을 영상화하는 방법일 수 있다.
클리어링제
본 발명의 다른 양상에서, 본 발명자들은 신규한 클리어링제를 개발하였다. 이러한 클리어링제는 본원에 기술된 임의의 진단, 영상화 또는 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 M-DOTAM 또는 이의 기능적 변이체에 접합된 덱스트란 또는 이의 유도체를 포함하는 덱스트란-기반 클리어링제에 관한 것이다.
일부 양태에서, 클리어링제는 하기 화학식의 화합물일 수 있다:
덱스트란-(연결기-(M-DOTAM))x
상기 식에서,
덱스트란은 덱스트란 또는 이의 유도체이고;
연결기는 연결 모이어티이고;
M-DOTAM은 금속 이온을 혼입하는 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체이고;
x ≥ 1이다.
일부 양태에서, 연결 모이어티는 우레아 기(-NH-C(O)-NH-), 치환된 우레아 기(-NRx-C(O)-NRx-, 이때, 1 또는 2개의 Rx 기는 H가 아님), 티오우레아 기(-NH-C(S)-NH-), 치환된 티오우레아 기(-NRx-C(S)-NRx-, 이때 1 또는 2개의 Rx 기는 H가 아님), 아미드 기(-C(O)-NH-), 치환된 아미드 기(-C(O)-NRx-, 이때 Rx는 H가 아님), 티오아미드 기(-C(S)-NH-), 치환된 아미드 기(-C(S)-NRx-, 이때 Rx는 H가 아님), 트라이아졸 기 또는 치환된 트라이졸로부터 선택되는 하나 이상의 2가 작용기이거나 이를 포함할 수 있다. 이러한 양태에서, 연결 모이어티는 하나 이상의 추가 2가 작용기, 예컨대 알킬렌 기, 아릴렌 기, 헤테로아릴렌 기, 아르알킬렌 기 및 헤테로아르알킬렌 기를 임의적으로 포함할 수 있다. 치환기 Rx는 특별히 제한되지 않는다. 특정 양태에서, Rx는 존재하는 경우 C1-C6 알킬, C5-C12 아릴, C5-C12 헤테로아릴 및 할로 기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 연결 모이어티는 우레아 기, 티오우레아 기, 아미드 기, 티오아미드 기 및 트라이아졸 기로부터 선택되는 하나 이상의 2가 작용기이거나 이를 포함할 수 있다.
바람직한 양태에서, 연결 모이어티는 2가 티오우레아 작용기 또는 2가 티오아미드 작용기를 포함한다.
일부 양태에서, 연결 모이어티는 2가 티오우레아 작용기 및 임의적으로 치환된 아릴렌 기를 포함한다. 일부 양태에서, 연결 모이어티는 2가 티오우레아 작용기, 임의적으로 치환된 아릴렌 기 및 임의적으로 치환된 알킬렌 기를 포함한다. 특정 양태에서, 연결 모이어티는 질소 원자 중 하나를 통해 임의적으로 치환된 아릴렌 기에 공유 결합된 2가 티오우레아 작용기를 포함한다. 추가 양태에서, 연결 모이어티는 질소 원자 중 하나를 통해 임의적으로 치환된 아릴렌 기에 공유 결합된 2가 티오우레아 작용기를 포함하고, 임의적으로 치환된 아릴렌 기는 임의적으로 치환된 알킬렌 기에 공유 결합된다. 바람직한 양태에서, 아릴렌 기는 비치환된다. 특정 양태에서, 아릴렌 기는 페닐렌 기이다. 바람직한 양태에서, 알킬렌 기는 비치환된다. 특정 양태에서, 알킬렌 기는 C1-C6 알킬렌 기이다. 특히 바람직한 양태에서, 알킬렌 기는 메틸렌 및 에틸렌으로부터 선택된다. 연결 모이어티에 존재하는 경우, 아릴렌 기 및 알킬렌 기는 비치환될 수 있다. 특정 양태에서, 연결 모이어티는 질소 원자 중 하나를 통해 아릴렌 기에 공유 결합된 2가 티오우레아 작용기로 이루어지고, 아릴렌 기는 알킬렌 기에 공유 결합된다.
일부 양태에서, 연결 모이어티는 2가 티오아미드 작용기 및 임의적으로 치환된 아릴렌 기를 포함한다. 일부 양태에서, 연결 모이어티는 2가 티오아미드 작용기, 임의적으로 치환된 아릴렌 기 및 임의적으로 치환된 알킬렌 기를 포함한다. 특정 양태에서, 연결 모이어티는 질소 원자 중 하나를 통해 임의적으로 치환된 아릴렌 기에 공유 결합된 2가 티오아미드 작용기를 포함한다. 추가 양태에서, 연결 모이어티는 질소 원자 중 하나를 통해 임의적으로 치환된 아릴렌 기에 공유 결합된 2가 티오아미드 작용기를 포함하고, 임의적으로 치환된 아릴렌 기는 임의적으로 치환된 알킬렌 기에 공유 결합된다. 바람직한 양태에서, 아릴렌 기는 비치환된다. 특정 양태에서, 아릴렌 기는 페닐렌 기이다. 바람직한 양태에서, 알킬렌 기는 비치환된다. 특정 양태에서, 알킬렌 기는 C1-C6 알킬렌 기이다. 특히 바람직한 양태에서, 알킬렌 기는 메틸렌 및 에틸렌으로부터 선택된다. 연결 모이어티에 존재하는 경우, 아릴렌 기 및 알킬렌 기는 비치환될 수 있다. 특정 양태에서, 연결 모이어티는 질소 원자 중 하나를 통해 아릴렌 기에 공유 결합된 2가 티오아미드 작용기로 이루어지고, 아릴렌 기는 알킬렌 기에 공유 결합된다.
일부 양태에서, 연결 모이어티는 하기 화학식의 기이거나 이를 포함할 수 있다:
Figure pct00011
상기 식에서,
y는 1 내지 6(바람직하게는 1 또는 2)이고;
*는 덱스트란 또는 이의 유도체에 대한 부착점을 나타내고;
**는 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체의 고리 원자에 대한 부착점을 나타낸다.
일부 양태에서, 연결 모이어티는 아민(바람직하게는 1차 아민)과 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트의 접합으로부터 형성될 수 있다. 이러한 접합은 각각 2가 우레아 작용기와 티오우레아 작용기를 형성한다. 이러한 양태에서, 이소시아네이트가 반응물 중 하나인 경우, 연결 모이어티는 적절하게 2가 우레아 작용기 또는 2가 아미드 작용기를 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 이러한 양태에서, 이소티오시아네이트가 반응물 중 하나인 경우, 연결 모이어티는 적절하게 2가 티오우레아 작용기 또는 2가 티오아미드 작용기를 포함하는 것으로 간주될 수 있다.
바람직하게는, x는 1 초과이므로, 각각의 덱스트란은 분자 당 평균 1개 초과의 M-DOTAM 또는 이의 기능적 변이체를 갖는다. 예컨대, x는 2 이상, 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 바람직하게는 50 이상일 수 있다. 본 발명자들은 다중 M-DOTAM 기로 표지된 덱스트란을 사용하여 개선된 클리어링이 달성될 수 있음을 발견했다.
DOTAM 또는 이의 기능적 변이체는 덱스트란의 가교결합을 방지하기 위해 단 하나의 연결기를 혼입할 수 있다.
클리어링제에서 사용될 수 있는 덱스트란의 유도체는 덱스트란이 하나 이상의 아민에 의해 치환된 아미노덱스트란을 포함한다. 덱스트란의 하나 이상의 하이드록실 기가 아미노-치환된 카복시메틸 아미드 기에 의해 치환된 아미노덱스트란이 특히 사용된다. 이러한 화합물은 덱스트란을 카복시메틸 기로 변형하고(예컨대, 클로로아세트산과 반응시킴으로써), 이어서 임의적으로 치환된 다이아민(바람직하게는 알킬다이아민, 예컨대 α,ω-알킬렌다이아민, 예컨대 에틸렌다이아민)과 추가로 반응시켜 생성될 수 있다.
아미노 기는 연결기에 대한 부착점을 제공한다. 이용가능한 아미노 기의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 치환될 수 있다.
바람직하게는, 상기 화학식에서 "덱스트란"은 그 자체가 에틸렌다이아민에 의해 치환된 하나 이상의 카복시메틸 기에 의해 치환된 덱스트란에 상응하는 아미노덱스트란이다.
덱스트란은 하나 이상의 화학식 -CH2C(=O)NH(CH2)fNHRF(이때, RF는 수소, 또는 DOTAM에 대한 연결기이고, f는 1 내지 6, 가장 바람직하게는 2임)의 기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 상기 기는 하기 화학식을 가질 수 있다:
Figure pct00012
상기 식에서,
물결선은 덱스트란 상의 산소에 대한 부착점을 나타낸다.
아미노덱스트란은 주로 α(1,6)-연결된 글루코피라노실 반복 단위를 갖고, 임의적으로, 예를 들어 α(1,2), α(1,3) 또는 α(1,4) 글리코시드 결합을 통해 연결된 다른 글루코피라노실의 분지를 갖는 골격을 갖는다. 하이드록실 기의 적어도 일부는 상기 논의된 아미노-치환된 카복시메틸 아미드의 기(특히, 화학식 -CH2C(=O)NHCH2CH2NHRF의 기)에 의해 치환된다. 즉, 아미노덱스트란은 하기 화학식의 단위를 포함할 수 있다:
Figure pct00013
상기 식에서,
각각의 RG는 H, 아미노-치환된 카복시메틸 아미드 기(예컨대, -CH2C(=O)NHCH2CH2NHRF), 또는 주로 α(1,6)-연결기를 통한 추가 글루코피라노실 단위에 대한 결합이고, 점선은 인접한 단위에 대한 결합을 나타낸다.
클리어링제는 하나 이상의 하기 단위를 포함할 수 있다:
Figure pct00014
상기 식에서,
**는 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체에 대한 부착점을 나타내고, y는 상기 정의된 바와 같다.
덱스트란의 유도체는 아미노산 및 글루코스 이외의 사카라이드로부터 선택되는 하나 이상의 기로 변형된 덱스트란 또는 아미노덱스트란을 포함할 수 있다. 예컨대, 덱스트란은 하나 이상의 글루탐산 또는 폴리글루탐산 단위, 예컨대 Glu, (Glu)2, (Glu)3 또는 (Glu)4로 변형(예컨대, 캡핑)될 수 있다. 추가적으로 또는 다르게는, 덱스트란은 글루코스 이외의 사카라이드, 예컨대 N-아세틸갈락토사민(GalNAc), 또는 트라이-GalNAc와 같은 사카라이드로부터 형성된 폴리사카라이드로 변형(예컨대, 캡핑)될 수 있다.
일부 양태에서, 덱스트란 성분의 분자량은 50 kDa 이상, 예컨대 50 내지 2,000 kDA일 수 있다. 예컨대, 분자량은 200 내지 800 kDa, 임의적으로 300, 350, 400 또는 450 kDa 초과, 임의적으로 700, 650, 600 또는 550 kDa 미만, 임의적으로 약 500 kDa일 수 있다.
덱스트란 또는 이의 덱스트란 유도체의 글루코스 단위 수의 백분율로서 아미노 기의 수(아미노 기에 의한 글루코스 단위의 "포화도")가 0.5% 이상, 1% 이상, 2% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100%일 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 일부 양태에서, 아미노 기에 의한 덱스트란의 포화도가 약 1% 또는 10% 이상, 예컨대 1 내지 10%인 것이 바람직할 수 있다.
덱스트란 유도체의 아미노 단위 수의 백분율로서의 DOTAM 기의 수(DOTAM에 의한 아미노덱스트란 성분의 "포화")는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100%일 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 일부 양태에서, DOTAM에 의한 덱스트란 유도체의 이용가능한 아미노 기의 포화도가 약 40% 또는 50% 이상, 예컨대 40 내지 60%인 것이 바람직할 수 있다.
클리어링제의 사용에 있어 잠재적인 어려움 중 하나는 종양에 도입되어 종양-연관 항체에 결합하여 방사성 리간드의 후속 결합에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 것이다.
본 발명자들은 또한 i) 높은 평균 분자량을 갖고, ii) 특정 크기 미만의 단편이 제거되도록 분자량 컷-오프를 거친 덱스트란-기반 클리어링제가 사용될 때, 종양으로의 낮은 클리어링제 침투와 함께 혈액으로부터의 양호한 클리어런스가 달성될 수 있음을 발견하였다. 컷-오프는 접합 단계 전에 덱스트란 또는 덱스트란-유도체에 적용될 수 있고/거나; 접합 후 클리어링제에 적용될 수 있고/거나; 금속과의 복합체화 후에 클리어링제에 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 유용한 클리어링제는 금속 킬레이트에 접합된 덱스트란 또는 이의 유도체(예컨대, 상기 정의된 바와 같은, 바람직하게는 아미노덱스트란)를 포함하는 덱스트란-기반 클리어링제일 수 있고, 이때 i) 덱스트란 또는 이의 유도체의 평균 분자량은 바람직하게는 200 내지 800 kDa, 임의적으로 300, 350, 400 또는 450 kDa 초과, 임의적으로 700, 650, 600 또는 550 kDa 미만, 임의적으로 약 500 kDa이고, ii) 분자량 컷-오프 미만의 덱스트란, 덱스트란 유도체 또는 클리어링제는 제거되고, 이때 분자량 컷-오프는 50 kDa 이상, 100 kDa 이상 또는 200 kDa 이상, 임의적으로 50 내지 250 kDa 또는 50 내지 200 kDa, 임의적으로 100 내지 200 kDa, 임의적으로 약 100 kDa 또는 150 kDa 또는 200 kDa이다(의심을 피하기 위해, 컷-오프가 50 kDa 이상으로 언급되는 경우, 컷-오프가 50 kDa 또는 50 kDa를 초과하는 임의의 값일 수 있지만, 여전히 제거된 컷-오프 미만의 덱스트란, 덱스트란 유도체 또는 클리어링제임을 지칭함에 유의한다).
컷-오프 미만의 분자량을 갖는 종의 양은, 예를 들어 클리어링제의 중량%로서 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1 중량% 이하, 0.5 중량% 이하, 0.4 중량% 이하, 0.3 중량% 이하, 0.2 중량% 이하, 0.1 중량% 이하 또는 0.01 중량% 이하일 수 있다. 바람직하게는, 클리어링제는 컷-오프 미만의 분자량을 갖는 종이 본질적으로 없다.
분자량 컷-오프는 여과, 예컨대 정용여과, 한외여과, 접선 유동 여과 또는 교차 유동 여과에 의해 달성될 수 있다. 바람직하게는, 2개 이상, 임의적으로 3개 이상의 여과 단계가 수행된다. "평균 분자량"은 SEC-MALS 분석에 의해 측정된 중량 평균 분자량을 의미한다.
DOTAM 또는 이의 기능적 변이체에 혼입되는 경우, 금속이 금속 이온으로 존재할 것이고 산화 상태는 특정 원소에 따라 달라질 것임을 알 수 있을 것이다. 따라서, 당업자는, 예컨대 용어 납, Pb 또는 206Pb가 원소의 이온 형태, 즉 Pb(II)를 포괄하도록 의도된다는 것을 이해한다.
클리어링제에 존재하는 금속은, 금속 이온-DOTAM 복합체가 항체에 의해 높은 친화도로 인식되는 한, 납의 안정한(비-방사성) 동위원소이거나 상이한 금속 이온의 안정하거나 본질적으로 안정한 동위원소일 수 있다. 예를 들어, 다른 적합한 금속은 Zn(Zn2+), Ca(Ca2+) 또는 209Bi(Bi2+)일 수 있고, 후자는 방사성이지만 반감기가 매우 길기 때문에 사실상 안정한 것으로 간주된다.
추가 양상에서, 본 발명은 덱스트란 또는 덱스트란 유도체를 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체 또는 유도체에 접합하는 단계를 포함하는 클리어링제의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체를 덱스트란에 접합하기 전 및/또는 후에 DOTAM을 Pb 또는 전술된 상이한 금속 이온[예컨대, Pb(II)]으로 킬레이트화시킴을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체 또는 유도체를 덱스트란 또는 덱스트란 유도체에 접합함으로써 접합체를 형성하는 단계를 포함하는, 클리어링제의 제조 방법에 관한 것으로서, 접합 전에 덱스트란 또는 덱스트란 유도체는, 예컨대 50 kDa 이상, 100 kDa 이상 또는 200 kDa 이상, 임의적으로 50 내지 250 kDa 또는 50 내지 200 kDa, 임의적으로 100 내지 200 kDa의 분자량 컷-오프/역치 미만의 종, 예컨대 100 kDa, 150 kDa 또는 200 kDa 미만의 종을 제거하기 위해 여과 단계를 거치게 되거나, 상기 방법은 예컨대, 50 kDa 이상, 100 kDa 이상 또는 200 kDa 이상, 임의적으로 50 내지 250 kDa 또는 50 내지 200 kDa, 임의적으로 100 내지 200 kDa의 분자량 컷-오프/역치 미만의 종, 예컨대 100 kDa, 150 kDa 또는 200 kDa 미만의 종을 제거하기 위해 접합체를 여과 단계에 적용하는 것을 추가로 포함한다.
전술된 바와 같이, 본 발명자들은 특정 크기 미만의 단편을 제거하기 위해 분자량 컷-오프를 적용하는 것이 유리하다는 것을 발견했다. 여과 방법은, 예컨대 정용여과일 수 있다. 당업자는 "분자량 컷-오프/역치 미만의 종을 제거하기"에서 "제거"라는 단어가 "수의 감소"와 동의어이고 사용된 특정 여과 방법에 따라 일부 잔류 저 분자량 종이 남아있을 수 있음을 이해할 것이다. 컷-오프 미만의 분자량을 갖는 종의 양은, 예컨대 클리어링제의 중량%로서 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1 중량% 이하, 0.5 중량% 이하, 0.4 중량% 이하, 0.3 중량% 이하, 0.2 중량% 이하, 0.1 중량% 이하 또는 0.01 중량% 이하일 수 있다. 바람직하게는, 클리어링제는 여과 후 컷-오프/역치 미만의 분자량을 갖는 종이 본질적으로 없다.
DOTAM 기능적 변이체 또는 유도체는 상기 정의된 바와 같을 수 있고, 이때 하나 이상의 R1 기는 연결기 모이어티로서 역할을 한다. 예를 들어, 적합한 (연결기-(M-DOTAM)) 기는 하기 화학식의 화합물을 전술된 아미노덱스트란과 반응시킴으로써 형성될 수 있다:
Figure pct00015
.
이러한 화합물의 합성은 문헌[Chappell et al. Nuclear Medicine and Biology, Vol. 27, pp. 93-100, 2000]에 기술되고, DOTAM 유도체는 매크로사이클릭스 인코포레이티드(미국 텍사스주 플라노 소재)에서 시판 중이다.
DOTAM 또는 이의 기능적 변이체는 과도하게 첨가될 수 있으므로, 각각의 덱스트란 유도체는 평균 1개의 DOTAM을 초과한다. 각각의 덱스트란에 대한 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체의 평균 수는 1개 초과, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 바람직하게는 40개 이상일 수 있다. 본 발명자들은 다수의 M-DOTAM 기에 접합된 덱스트란을 사용하여 개선된 클리어링이 달성될 수 있음을 발견했다.
바람직하게는, 덱스트란은 200 내지 800 kDa, 임의적으로 300, 350, 400 또는 450 kDa 초과, 임의적으로 700, 650, 600 또는 550 kDa 미만, 임의적으로 약 500 kDa의 평균 분자량을 갖는다.
클리어링제의 제조 방법은 또한 금속 이온으로 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체를 킬레이트화시키는 것을 포함하는 킬레이트화 단계를 포함할 수 있다. 금속 이온은 비-방사성 동위원소, 예컨대 Pb, Ca, Zn의 비-방사성 동위원소 또는 209Bi와 같은 사실상 안정한 동위원소일 수 있다.
킬레이트화 단계는 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체를 덱스트란에 접합하기 전 및/또는 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체를 덱스트란에 접합한 후, 임의적으로 여과 단계 전에 수행된다. DOTAM 또는 이의 기능적 변이체에 의한 금속 이온의 킬레이트화는, 예컨대 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체가 항체와 결합하기 위한 올바른 형태를 채택하도록 보장하기 위해 이중특이적 항체가 클리어링제에 적절하게 결합하는 것을 보장하기 위해 필요할 수 있다.
방법이 킬레이트화 단계를 포함하는 경우, 방법은 바람직하게는 결합되지 않은 금속을 제거하는 후속 단계도 포함한다. 이는 여과 단계 동안 덱스트란-결합된 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로부터 후속적으로 분리될 수 있는 추가 킬레이트화제를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 추가 킬레이트화제는 우선적으로 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체와 상이하다. 바람직하게는, 추가 킬레이트화제는 크기-기반 분리를 용이하게 하기 위해 덱스트란-킬레이트화제 접합체보다 분자량이 더 낮다. 예컨대, 추가 킬레이트화제는 폴리아미노카복실산, 예컨대 에틸렌다이아미노테트라아세트산(EDTA) 또는 이의 염일 수 있다.
바람직하게는, 클리어링제를 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
i) DOTAM 또는 이의 기능적 변이체 또는 유도체를 덱스트란 또는 덱스트란 유도체에 접합함으로써 접합체를 형성하는 단계;
ii) 임의적으로, 단계 i의 생성물로부터 저 분자량 종을 제거하는 단계;
iii) 접합체를 금속 이온, 예컨대 Pb, Bi, Zn 또는 Ca 이온으로 킬레이트화시키는 단계;
iv) 추가 킬레이트화제를 첨가하여 결합되지 않은 금속 이온을 킬레이트화시키는 단계; 및
v) 여과 단계를 수행하여 분자량 컷-오프/역치 미만의 종을 제거하는 단계.
DOTAM-킬레이트화된 Pb 방사성핵종
DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종은 본원에 기술된 임의의 진단, 영상화 또는 치료 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법에서 사용되는 경우, DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종이 조성물에 포함된다는 것을 이해할 것이다. 한 특정 양태에서, 조성물은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종, 및 Pb 방사성핵종으로 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 따라서, 다른 양상에서, 본 발명은 이러한 조성물, 및/또는 본원에 기술된 임의의 영상화 또는 치료 방법에 사용하기 위한 이러한 조성물에 관한 것이다. 이러한 방법에서 언급된 DOTAM으로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종은 본원에 기술된 조성물의 형태일 수 있다.
Pb 방사성핵종으로 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체는 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 생체 내에서 사용되는 경우, 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체는 환경으로부터의 금속 이온, 예컨대, 칼슘 이온과 복합체를 형성할 수 있다. DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 이러한 칼슘 이온은 약리학적으로 비활성이고, DOTAM 또는 이의 변이체로 킬레이트화된 약리학적 활성 Pb 방사성핵종을 종양의 표적으로부터 잠재적으로 차단할 수 있고, 이에 따라 치료의 효능 및/또는 영상화 및 진단의 표준화된 흡수 값을 감소시킬 수 있다.
본 발명자들은 정의된 조건 하에서 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체를 급랭함으로써, 킬레이트화된 Pb 방사성핵종의 생체내 제형의 제어가 증가될 수 있고/거나 약학적 활성 킬레이트와 약학적 불활성 킬레이트 사이의 잠재적인 경쟁을 피하거나 줄일 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, Pb 방사성핵종으로 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체는 비-방사성 금속 이온으로 킬레이트화된 DOTAM 또는 기능적 변이체이다.
일부 양태에서, 킬레이트화된 Pb 방사성핵종은 212Pb이다. 일부 양태에서 킬레이트화된 Pb 방사성핵종은 203Pb이다.
DOTAM 또는 이의 기능적 변이체에 혼입되는 경우, Pb 방사성핵종은 금속 이온으로 존재할 것이고, 산화 상태는 특정 원소에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 따라서, 당업자는, 예를 들어 용어 납, Pb 또는 206Pb가 원소의 이온 형태, 특히 Pb(II)를 포괄하도록 의도됨을 이해한다.
조성물에 존재하는 비-방사성 금속은 납의 안정한 (비-방사성) 동위원소, 또는 다른 금속 이온의 안정하거나 본질적으로 안정한 동위원소일 수 있다. 예컨대, 다른 적합한 금속은 Gd(Gd2+), Cu(Cu2+), Zn(Zn2+), Ca(Ca2+) 또는 209Bi(Bi2+)일 수 있고, 후자는 방사성이지만 매우 긴 반감기에 기인하여 사실상 안정한 것으로 간주된다. 일부 양태에서, 금속은 Ca 또는 Cu이고, 일부 양태에서, 금속은 Ca이다.
DOTAM 기능적 변이체 또는 유도체는 상기 정의된 바와 같을 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화된 Pb 방사성핵종을 포함하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다:
i) Pb 방사성핵종 제공하는 단계;
ii) Pb 방사성핵종을 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체로 킬레이트화시키는 단계; 및
iii) 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체를 비-방사성 금속 이온으로 킬레이트화시키는 단계.
단계 iii)에서 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체는 단계 ii)에서 Pb 방사성핵종으로 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체이다.
비-방사성 금속 이온은 Pb, Ca, Zn, Gd 또는 Cu의 이온일 수 있다. 일부 양태에서, 금속 이온은 Ca 또는 Cu의 이온이다. 일부 양태에서, 금속 이온은 Ca의 이온, 특히 Ca2+이다.
일부 양태에서, 단계 ii) 후에 남아있는 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체는 Pb 방사성핵종에 첨가된 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체의 90 몰% 이상, 95 몰% 이상, 99 몰% 이상이다. 한 특정 양태에서, 단계 ii) 후에 남아있는 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체는 99 몰% 이상이다.
일부 양태에서, 단계 iii) 후에 남아있는 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체는 Pb 방사성핵종에 첨가된 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체의 5 몰% 미만, 2 몰% 미만, 1 몰% 미만, 0.1 몰% 미만, 0.01 몰% 미만이다. 한 특정 양태에서, 단계 iii) 후에 남아있는 킬레이트화되지 않은 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체는 1 몰% 미만, 0.1 몰% 미만, 0.01 몰% 미만이다.
단계 a)에서 제공된 Pb 방사성핵종은 관심 Pb 방사성핵종으로 붕괴되는 방사성 물질을 발생기에 배치함으로써 생성될 수 있고, 이때 방사성 물질은 고체 물질에 결합된다. 예컨대, 212Pb 생산에서 이러한 방사성 물질은 224 라듐일 수 있다. 관심 방사성핵종은 방사성 및 화학적 불순물을 포함할 수 있는 수용액에서 발생기로부터 추출된다. 관심 Pb 방사성핵종과 불순물을 포함하는 수용액은 컬럼 상에서 액체 크로마토그래피를 통해 정제된다. 컬럼 상의 액체 크로마토그래피는 추출 크로마토그래피 또는 분할 크로마토그래피일 수 있다. 추출 또는 분할 크로마토그래피는 유기 상 또는 추출제와 수 상 사이에서 분리될 원소의 분포를 기반으로 하고, 이때 추출제는 불활성 지지체에 결합되고, 정지상을 형성하는 반면, 수성 상은 이동상을 나타낸다.
추출 크로마토그래피는 추출제로 에터 크라운, 및 특히 사이클로헥실 또는 벤질 기가 하나 이상의 C1-C12 알킬 기(직쇄 또는 분지 쇄를 가짐)로 치환된 다이사이클로헥사노-1,8-크라운-6 또는 다이벤조-18-크라운-6을 물과 혼화되지 않는 유기 희석제, 전형적으로 장쇄 탄화수소 알코올, 즉 Cx 이상의 쇄 중 용액으로 포함하는 정지상을 사용할 수 있다.
특히, 추출제로서, 바람직하게는 옥탄-1-올에 희석된 4,4'(5')-다이-er-부틸사이클로헥사노-1,8-크라운-6을 포함하는 정지상이 사용될 수 있다. 이러한 정지상은 1.5 약 2.5 몰/L의 강산을 포함하는 수용액에 존재하는 212Pb의 99% 초과를 선택적으로 보유하는 이점을 갖고, 이는 전형적으로 라듐-224 발생기로부터 212Pb를 추출하는 데 사용되는 수용액의 유형에 상응한다. 이러한 유형의 정지상은, 예컨대 상업적인 명칭 "Pb 수지"로 트리스템 인터내셔날(TRISKEM International) 사로부터 이용가능한, 크로마토그래피를 위한 즉시 사용가능한 컬럼 또는 카트리지에 포장된 병에 존재한다.
다르게는, 원하는 방사성핵종 및 불순물을 포함하는 용액은 또한 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 양이온 교환 크로마토그래피로 정제될 수 있다.
212Pb의 생산 및 정제 방법은 국제 특허공보 제2013/174949호에 기술된다.
서열
본원에 언급된 특정 서열이 하기 표에 제공된다.
[표 2]
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 전문이 참조로 명시적으로 혼입된다.
이하, 본 발명은 특정 실시예를 참조하여 추가로 설명된다. 상기 제공된 일반적인 설명이 주어지면 다양한 다른 양태가 실시될 수 있음이 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 면역화의 기술
토끼의 면역화
2개의 거울상 이성질체 Pb-DOTAM-알킬-PEG4-KLH 분획(MS2-DOTAM KLH 분획 1 및 MS2-DOTAM KLH 분획 2)의 1:1 혼합물을 뉴질랜드 백색 토끼, 또는 국제 특허공보 제2000/46251호, 국제 특허공보 제2002/12437호, 국제 특허공보 제2005/007696호, 국제 특허공보 제2006/047367호, 미국 출원공보 제2007/0033661호 및 국제 특허공보 제2008/027986호에 보고된 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 유전자이식 토끼의 면역화에 사용하였다. 각각의 토끼를 완전한 프로인트 항원보강제로 유화된 500 μg의 면역원 혼합물로, 0일에 피내 적용 및 7, 14, 28, 56일에 각각 500 μg의 근육내 및 피하 적용에 의해 면역화시켰다. 이어서, 토끼는 매월 500 μg의 피하 면역화를 수용하였고, 혈청 역가를 결정하기 위해 면역화 7일 후 소량의 혈액 샘플을 채취하였다. 제3 면역화 및 9개월의 면역화 중에 (면역화 후 5 내지 7일에) 더 큰 혈액 샘플(추정된 총 혈액 부피의 10%)을 채취하고, 말초 단핵 세포를 단리하고, B 세포 클로닝 과정에서 항원-특이적 B 세포의 공급원으로 사용하였다(실시예 2).
혈청 역가 측정(ELISA)
2개의 거울상 이성질체 Pb-DOTAM 분획(PJRD05.133F1 또는 PJRD05.133F2)을 96-웰 눈크 맥시소르프(NUNC Maxisorp) 플레이트에서 PBS 중에서 1 μg/mL(100 μL/웰)로 부동태화시키고, 이어서 상기 플레이트를 PBS 중 2% 크로테인(Crotein) C(200 μL/웰)로 차단하고; PBS 중 0.5% 크로테인 C(100 μL/웰)에서 2회 항혈청의 연속 희석액을 적용하고; HRP-접합된 당나귀 항-토끼 IgG 항체[잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)/디아노바(Dianova) 711-036-152; 1/16000] 및 스트렙타비딘-HRP에 의해 검출하고; 각각 PBS 중 0.5% 크로테인 C(100 μL/웰)로 희석하였다. 모든 단계에서 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 모든 단계에서, 플레이트를 PBS 중 0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 신호는 BM 블루(Blue) POD 가용성 기질(로슈)(100 μL/웰)의 첨가에 의해 발생하고; 1 M HC1(100 μL/웰)의 첨가에 의해 중단되었다. 흡광도는 기준으로서 690 nm에 대해 450 nm에서 판독되었다. 역가는 절반-최대 신호를 야기하는 항혈청의 희석으로 정의되었다.
실시예 2: 토끼로부터의 B 세포 클로닝
토끼 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 단리
면역화된 토끼의 혈액 샘플을 채취하였다. 전혈을 함유하는 EDTA를 제조사의 사양에 따라 림포라이트(lympholyte) 포유동물[세다레인 래보러토리즈(Cedarlane Laboratories), 캐나다 온타리오 벌링턴 소재]을 사용하여 밀도 원심 분리 전에 1x PBS(PAA, 오스트리아 파싱 소재)로 2배 희석하였다. PBMC를 1x PBS로 2회 세척 하였다.
EL-4 B5 매질
10% FCS[하이클론(Hyclone), 미국 유타주 로간 소재), 2 mM 글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(PAA, 오스트리아 파싱), 2 mM 나트륨 피루베이트, 10 mM 헤페스(HEPES)[판 바이오텍(Pan Biotech), 독일 아이덴바흐 소재] 및 0,05 mM b-머캅토에탄올(깁코, 스코틀랜드 페이즐리 소재)가 보충된 RPMI 1640(판 바이오텍, 독일 아이덴바흐 소재)을 사용하였다.
플레이트의 코팅
멸균 세포 배양 6-웰 플레이트를 카보네이트 완충액(0.1 M 나트륨 바이카보네이트, 34 mM 다이나트륨수소카보네이트, pH 9,55) 중 2 μg/mL KLH로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 사용 전에 멸균 PBS에서 3회 세척하였다. 멸균 스트렙타비딘 코팅된 6-웰 플레이트(마이크로코트, 독일 번리드 소재)를 PBS 중 비오틴화된 TCMC-Pb-dPEC3-비오틴 이성질체 A(1 μg/mL) 및 B(1 μg/mL)의 1 + 1 거울상 이성질체 혼합물로 실온에서 3시간 동안 코팅하였다. 패닝(panning) 단계 전에 이러한 6-웰 플레이트를 멸균 PBS로 3회 세척하였다.
대식세포/단핵구 고갈
PBMC를 멸균 KLH-코팅된 6-웰 플레이트에 시딩하여 비특이적 접착을 통해 대식세포와 단핵구를 고갈시키고 KLH에 결합하는 세포를 제거하였다. 각각의 웰을 4 mL 매질과 면역화된 토끼로부터의 6 x 106 이하의 PBMC로 최대한 충전하고 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 결합하도록 하였다. 상청액 중 세포[말초 혈액 림프구(PBL)]를 항원 패닝 단계에 사용하였다.
Pb-함유 TCMC 거울상 이성질체 상의 B 세포의 농축
TCMC-Pb-dPEC3-비오틴 이성질체 A 및 B의 거울상 이성질체 혼합물로 코팅된 6-웰 플레이트에 4 mL 매질 당 6 x 106 PBL을 시딩하고, 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 결합되도록 하였다. 1x PBS로 웰을 1 내지 3회 조심스럽게 세척하여 비-부착성 세포를 제거하였다. 나머지 점성 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10분 동안 트립신에 의해 분리하여다. 트립신화를 EL-4 B5 매질로 중단시켰다. 면역형광 염색이될 때까지 세포를 얼음 위에 두었다.
면역형광 염색 및 유세포 분석
단세포 분류에는 항-IgG FITC[AbD 세로텍(Serotec), 독일 뒤셀도르프 소재]를 사용하였다. 표면 염색을 위해, 고갈 및 농축 단계의 세포를 PBS에서 항-IgG FITC 항체와 함께 항온처리하고, 4℃의 어두운 곳에서 45분 동안 항온처리하였다. 염색 후, PBMC를 빙냉 PBS로 2회 세척하였다. 마지막으로, PBMC를 빙랭 PBS에 재현탁하고, 즉시 FACS 분석을 수행하였다. 5 μg/mL 농도의 프로피듐 요오다이드[비디 파밍겐(BD Pharmingen), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재]를 FACS 분석 전에 첨가하여 죽은 세포와 살아있는 세포를 구별하였다.
컴퓨터와 FACSDiva 소프트웨어[비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 소재]가 장착된 벡턴 디킨슨(Becton Dickinson) FACSAria를 단일 세포 분류에 사용하였다.
B 세포 배양
토끼 B 세포의 배양을 문헌[Lightwood et al., J Immunol Methods, 2006, 316: 133-143]에 의해 기술된 방법에 의해 제조하였다. 간단히 말해서, 단일 분류된 토끼 B 세포를 판소르빈(Pansorbin) 세포(1:100,000)[칼바이오켐(머크)(Calbiochem(Merck)), 독일 다름스타트 소재], 5% 토끼 흉선세포 상청액(마이크로코트, 독일 번리드 소재) 및 감마-조사된 뮤린 EL-4 B5 흉선종 세포(5 x 105 세포/웰)를 함유하는 200 μL/웰 EL-4 B5 매질과 함께 96-웰 플레이트에서 37℃에서 7일 동안 항온처리하였다. B 세포 배양의 상청액을 선별을 위해 제거하고, 나머지 세포를 즉시 수확하고, 100 μL RLT 완충액[퀴아젠(Qiagen), 독일 힐덴 소재]에서 -80℃에서 냉동하였다.
실시예 3: 토끼 항체의 발현
V- 도메인의 PCR 증폭
제조사의 프로토콜에 따라 뉴클레오스핀(NucleoSpin) 8/96 RNA 키트[마처리 앤 나겔(Macherey & Nagel); 740709.4, 740698]를 사용하여 B 세포 용해물(RLT 완충액, 퀴아젠 카탈로그 번호 79216에 재현탁됨)에서 전체 RNA를 제조하였다. RNA를 60 μL RNase-부재 물로 용리하였다. 6 mL의 RNA를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 슈퍼스크립트(Superscript) III 퍼스트-스트랜드 신세시스 슈퍼믹스(First-Strand Synthesis SuperMix)(인비트로겐 18080-400)와 올리고 dT-프라이머를 사용하는 역전사 반응에 의해 cDNA를 생성하였다. 모든 단계를 해밀턴(Hamilton) ML 스타 시스템(Star System)에서 수행하였다. 4 mL의 cDNA를 사용하여, 중쇄용 프라이머 rbHC.up 및 rbHC.do 및 경쇄용 rbLC.up 및 rbLC.do를 사용하는 최종 부피 50 μL의 아큐프라임 슈퍼믹스(AccuPrime Supermix)(인비트로겐 12344-040)로 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VL)을 증폭하였다(표 3). 모든 정방향 프라이머는 (각각 VH 및 VL의) 신호 펩티드에 대해 특이적인 반면, 역방향 프라이머는 (각각 VH 및 VL)의 불변 영역에 대해 특이적이다. RbVH + RbVL에 대한 PCR 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 5분 동안 핫 스타트; 94℃에서 20초, 70℃에서 20초, 68℃에서 45초의 35 사이클, 및 68℃에서 7분 동안의 최종 연장.
[표 3]
Figure pct00029
50 μL PCR 용액 중 8 μL를 48 E-Gel 2%(인비트로겐 G8008-02)에 로딩하였다. 양성 PCR 반응은 제조사의 프로토콜에 따라 뉴클레오스핀 익스트랙트 II 키트(마처리 앤 나겔; 740609250)를 사용하여 세척하고 50 μL 용리 완충액에서 용리하였다. 모든 세척 단계를 해밀턴 ML 스타렛 시스템에서 수행하였다.
토끼 단일클론 2가 항체의 재조합 발현
토끼 단일클론 2가 항체의 재조합 발현을 위해, VH 또는 VL을 코딩하는 PCR- 산물을 오버행 클로닝 방법에 의해 발현 벡터로의 cDNA로서 클로닝하였다(문헌[RS Haun et al., Biotechniques (1992) 13, 515-518; MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256]). 발현 벡터는 인트론 A를 포함하는 5' CMV 프로모터 및 3' BGH 폴리아데닐화 서열로 이루어진 발현 카세트를 함유하였다. 발현 카세트 이외에, 플라스미드는 pUC18-유래 복제 기점과 대장균에서 플라스미드 증폭에 대한 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 함유하였다. 기본 플라스미드의 3개의 변이체를 사용하였다: VH 영역을 수용하도록 디자인된 토끼 IgG 불변 영역을 함유하는 하나의 플라스미드, 및 VL 영역을 수용하는 토끼 또는 인간 카파 LC 불변 영역을 함유하는 2개의 추가 플라스미드. 카파 또는 감마 불변 영역 및 VL/VH 삽입물을 코딩하는 선형화된 발현 플라스미드는 중첩 프라이머를 사용하는 PCR로 증폭하였다. 정제된 PCR 산물을 단일-가닥 오버행을 생성하는 T4 DNA-중합효소와 함께 항온처리하였다. dCTP를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 다음 단계에서, 플라스미드와 삽입물을 조합하고, 부위 특이적 재조합을 유도하는 recA와 함께 항온처리하였다. 재조합 플라스미드는 대장균으로 형질전환되었다. 다음날, 성장한 콜로니를 선택하고, 플라스미드 제조, 제한 분석 및 DNA-서열분석에 의해 정확한 재조합 플라스미드에 대해 시험하였다. 항체 발현을 위해, 단리된 HC 및 LC 플라스미드를 시약 공급자가 제안한 절차에 따라 239-유리 형질감염 시약[노바겐(Novagen)]을 사용하여 2 mL(96-웰 플레이트)의 프리스타일(Freestyle) HEK293-F 세포(인비트로겐 R790-07)에 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 상청액을 1주 후에 수확하고, 정제를 위해 전달하였다.
실시예 4: 토끼 단일클론 항체의 선택
하기 표는 다양한 단일클론 2가 토끼 항체의 특성을 나타낸다. PRIT-0128은 킬레이트화된 Pb 및 Bi에 필적하는 결합, 다른 킬레이트화된 금속에 대한 결합 감소 및 높은 친화도(< 100 pM)를 가지므로, 납 후보로 선택되었다.
SET(용액 평형 적정) 검정을 후술한 바와 같이 수행하였다.
검정-플레이트의 제조: 384-웰 스트렙타비딘 플레이트(눈크, 마이크로코트 # 11974998001)를 20 ng/mL 농도의 PBS-완충액 중 25 μL/웰의 DOTAM-비오틴-이성질체 혼합물과 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다.
유리 DOTAM-금속 킬레이트(Pb, Bi, Ca, Cu, Zn, Mg, Fe)에 의한 항-DOTAM 항체 샘플의 평형화: 0.01 내지 1 nM의 항체를 2,500 nM, 500 nM 또는 100 nM의 DOTAM-금속 킬레이트의 농도에서 시작하는 1:3, 1:2 또는 1:1.7 희석 단계로 관련 DOTAM-금속 킬레이트로 적정하였다. 샘플을 밀봉된 REMP 스토리지 폴리프로필렌 마이크로플레이트(브룩스)에서 4℃에서 밤새 항온처리하였다.
밤새 항온처리한 후, 스트렙타비딘 플레이트를 웰 당 90 μL PBST로 3회 세척하였다. 평형화 플레이트의 각각의 샘플 15 μL를 검정 플레이트로 옮기고, 실온에서 15분 동안 항온처리하고, 이어서 PBST 완충액로 3x 90 μL 세척 단계를 수행하였다. 25 μL의 염소 항-인간 IgG 항체-POD 접합체(잭슨, 109-036-088, OSEP에서 1:4,000)를 첨가하고, 이어서 PBST 완충액으로 6x 90 μL 세척 단계를 수행하여 검출을 수행하였다. 25 μL의 TMB 기질(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 카탈로그 번호 11835033001)을 각각의 웰에 첨가하였다. 측정을 사파이어2 판독기(테칸) 상에서 370/492 nm에서 수행하였다.
재료:
1. DOTAM-비오틴-이성질체 혼합물:
하기 성분의 혼합물, 농도 = 20 ng/mL
- Pb-Dotam-Bn-비오틴/TCMC-Pb-dPEG3-비오틴, 이성질체 A
- Pb-Dotam-Bn-비오틴/TCMC-Pb-dPEG3-비오틴, 이성질체 B
- Pb-Dotam-알킬-비오틴 이성질체 A
- Pb-Dotam-알킬-비오틴 이성질체 B
2. PBS: DPBS, PAN, P04-36500
3. BSA: 로슈, 10735086001
4. 트윈 20: 폴리소르바트 20(usb, #20605, 500 mL)
5. PBST: 10x, 로슈, #11666789001/0,1% 트윈 20
6. OSEP: PBS(10x, 로슈, # 11666789001)/0,5% BSA(소 혈청 알부민 분획 V, 지방산-부재, 로슈, # 10735086001)/0,05% 트윈 20
[표 4]
Figure pct00030
실시예 5: 분자 생물학
재조합 DNA 기술
표준 방법은 문헌[Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하는 데 사용되었다. 분자 생물학적 시약을 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.
유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성
원하는 유전자 분절을 게네아르트 게엠베하(Geneart GmbH)(독일 레겐스부크 소재)에서 화학적 합성에 의해 제조하였다. 합성된 유전자 단편을 증식/증폭을 위해 대장균(Escherichia Coli) 플라스미드에 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 염기 서열분석을 통해 검증하였다. 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 어닐링하거나 PCR을 통해 짧은 합성 DNA 단편을 조립하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드를 메타비온 게엠베하(metabion GmbH, 독일 플라네그-마르틴스리드 소재)에 의해 제조하였다.
단백질 결정
정제된 폴리펩티드의 단백질 농도를 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 소광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 결정하였다.
항체 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현을 위한 플라스미드 생성
인간 배아 신장 세포(HEK 293)의 일시적 형질감염에 의해 목적 단백질을 발현시켰다. 원하는 유전자/단백질[예컨대, 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 또는 추가 도메인(예컨대, C-말단에 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인)을 포함하는 전장 항체 중쇄]의 발현을 위해, 하기 기능 요소를 포함하는 전사 단위가 사용되었다:
- 인트론 A를 비롯산 인간 거대세포 바이러스(P-CMV)의 즉각적인 조기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열(SS),
- 발현될 유전자/단백질, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
발현되는 목적 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트에 더하여, 기본/표준 포유동물 발현 플라스미드는 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 함유하였다.
a) 항체 중쇄를 위한 발현 플라스미드
완전하고 기능적인 항체 중쇄를 포함하는 융합 유전자를 포함하는 항체 중쇄 코딩 유전자, 및 이어서 추가 항체 V-중쇄 또는 V-경쇄 도메인은 인간 IgG 분자의 CH3 도메인의 C-말단으로의 G4Sx4 연결기에 의해 각각 분리된 각각의 서열 요소(V-중쇄 또는 V-경쇄)를 코딩하는 DNA 단편을 융합하여 조립되었다(VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VH 또는 VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VL). 2개의 CH3 도메인의 C-말단에 각각 하나의 VH 및 하나의 VL 도메인을 보유하는 재조합 항체 분자를 놉-인투-홀 기술을 사용하여 발현하였다.
HEK293 세포에서 C-말단 VH 또는 VL 도메인을 갖는 항체 중쇄의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는, C-말단 VH 또는 VL 도메인 발현 카세트를 갖는 항체 중쇄 단편 이외에, 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다. C-말단 VH 또는 VL 도메인 융합 유전자를 갖는 항체 중쇄 단편의 전사 단위는 하기 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A를 비롯한 인간 거대세포 바이러스(P-CMV)의 즉각적인 조기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 핵산을 코딩하는 항체 중쇄(VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VH 또는 VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VL), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
표 2에 언급된 모든 중쇄 폴리펩티드/단백질을 코딩하는 발현 플라스미드는 상기 약술된 방법에 따라 구축되었다.
b) 항체 경쇄를 위한 발현 플라스미드
완전하고 기능적인 항체 경쇄를 포함하는 유전자를 코딩하는 항체 경쇄는 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 융합함으로써 조립되었다.
항체 경쇄의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 항체 경쇄 단편 이외에 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점 및 대장균에 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다. 항체 경쇄 단편의 전사 단위는 하기 기능 요소를 포함한다:
- 인트론 A를 비롯한 인간 거대세포 바이러스(P-CMV)의 즉각적인 조기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 핵산을 코딩하는 항체 경쇄(VL-CL), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
표 2에 언급된 모든 경쇄 폴리펩티드/단백질을 코딩하는 발현 플라스미드는 상기 약술된 방법에 따라 구축되었다.
사용된 형식의 개략적 표현은 도 1에 도시된다. 별표는 PGLALA 치환을 나타낸다: 1은 DOTAM 결합제를 지칭하고, 2 및 3은 항-표적(본원에서, CEA) 결합제를 나타낸다.
실시예 6: PRIT 분자의 일시적인 발현
항체 분자의 일시적인 발현
항체 분자를 F17 매질(인비트로겐 코포레이션)에서 배양된 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포(인간 배아 신장 세포주 293-유래)에서 생성하였다. 형질감염을 위해 "293-부재" 형질감염 시약(노바겐)을 사용하였다. 전술된 각각의 항체 중쇄 및 경쇄 분자를 개별 발현 플라스미드로부터 발현시켰다. 제조사의 설명서에 특정된 대로 형질감염을 수행하였다. 면역글로불린-함유 세포 배양 상청액을 형질감염 후 3 내지 7일에 수확하였다. 상청액을 정제할 때까지 감소된 온도(예컨대, -80℃)에서 저장하였다.
예컨대, HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 문헌[Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203]에 제공된다.
실시예 7: 단백질의 정제
수확된 세포 배양 상청액을 5 mL의 단백질 A 수지[맵 실렉트 슈어(Mab Select Sure)]가 충전된 컬럼(1.1 cm 직경, 5 cm 길이)에 5 mL/분의 유량으로 적용하였다. 20 mL PBS 완충액으로 세척한 후, 항체를 25 mL Na 시트레이트 pH 3.0으로 용리하였다.
이어서, 용리액을 1 M 트리스(Tris) pH 9.0으로 pH 5.0까지 조정하고, 밤새 4℃에서 항온처리하였다.
10,000 xg에서 10분 동안 원심분리하고, 0.2 μm 필터를 통해 여과한 후, 여액을 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl을 함유하는 완충액(pH 6.0)에서 사전-평형화된 슈퍼덱스(Superdex) 200 컬럼(2.6 cm 직경, 60 cm 길이)에서 크기 배제 크로마토그래피에 적용하고, 동일한 완충액로 용리하였다.
정제된 항체를 포함하는 주요 용리 피크를 수집하고 최종 순도를 분석하였다.
[표 5]
재료
Figure pct00031
실시예 8: FACS
MKN-45 세포를 트립신을 사용하여 배양병에서 분리하고, 카시(Casy) 세포 계수기를 이용하여 계수하였다. 4℃에서 펠렛화시킨 후, 300 g의 세포를 FACS 완충액(PBS 중 2.5% FCS)에 재현탁하고, 조정 96-웰 PP V-바닥-플라테(Platte)에 배출2.0E+06 세포/mL로 조정하였다[25 μL/웰 = 5.0E+04 젤렌(Zellen)/웰].
- DOTAM-FITC를 사용하는 FACS 염색
1차 CEA 특이적 항체를 FACS 완충액에서 40 μg/mL로 조정하여 10 μg/mL의 최종 농도를 야기하였다. RS-CEA-I12v를 기준으로 사용하였다. FITC와 1차 항체로 표지된 Pb-DOTAM을 등몰비로 사용하였다. 이들을 혼합하고, 실온에서 10분 동안 항온처리하여 Pb-DOTAM에 대한 항체의 결합을 허용하였다. 이어서, 20 μL의 제조된 혼합물을 25 μL의 세포 현탁액에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충액에서 2회 세척하고, FACS 칸토(Canto)(비디, 파밍겐)를 사용하는 측정을 위해 70 μL/웰 FACS 완충액에 재현탁하였다.
- <hu 카파>를 사용하는 FACS 염색
1차 CEA 특이적 항체는 FACS 완충액에서 20 μg/mL로 조정하여 10 μg/mL의 최종 농도를 야기하였다. RS-CEA-I12v를 기준으로 사용하였다. 20 μL를 25 μL 세포 현탁액에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충액에서 2회 세척하였다. 세척 후, 세포를 2차 항체(<huIgG> -알렉사488, c = 10 μg/mL)를 함유하는 50 μL FACS 완충액에 재현탁하고, 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충액에서 2회 세척하고 FACS 칸토(비디, 파밍겐)를 사용하는 측정을 위해 70 μL/웰 FACS 완충액에 재현탁하였다.
도 36은 MKN-45 세포에 대한 하나의 항체(PRIT-0165)의 결합을 나타내는 예이고, 2차 검출(우측 패널, 알렉사 488) 또는 DOTAM FITC(좌측 패널, FITC-A)를 사용하여 검출한다.
실시예 9: 인간화
DOTAM 결합제 PRIT-0128의 인간화 동안 적합한 인간 수용자 프레임워크의 식별을 위해, 2개의 방법론의 조합을 사용하였다. 한편, 모 항체에 대한 높은 서열 상동성을 갖는 수용체 프레임워크를 검색하고, CDR 영역을이 수용체 프레임워크에 이식함으로써 고전적인 접근법을 취했다. 모 항체에 대한 식별된 프레임워크의 각각의 아미노산 차이를 결합제의 구조적 완전성에 대한 영향에 대해 판단하였고, 적절한 경우, 모 서열에 대한 역 돌연변이가 도입되었다.
한편, 사내에서 개발 한 인실리코(in silico) 도구를 사용하여 인간화 버전의 VH 및 VL 도메인의 서로에 대한 배향을 예측하였다(국제 특허공보 제2016/062734호 참고). 이것을 가능한 모든 인간 생식계열 조합에 대한 CDR의 실제 이식편에 대해 수행하였다. 결과를 모 결합제의 VH-VL 도메인 배향과 비교하여 시작 항체에 대한 기하학적 구조에 가까운 프레임워크 조합을 선택하였다.
각각의 경우에, 모 항체의 하기 CDR 영역을 수용자 프레임워크에 이식하였다(카밧에 따른 넘버링):
VH_CDR1: 31-35
VH_CDR2: 50-65
VH_CDR3: 95-102
VL_CDR1: 24-34
VL_CDR2: 50-56
VL_CDR3: 89-97
인간화된 변이체를 VH/VL Fv 융합(각각 CH1 및 Ck 부재)으로서 종양 표적화 IgG의 Fc의 C-말단에 융합된 DOTAM 결합제를 사용하여 최종 형식으로 생산하였다. 최종 형식의 모(인간화되지 않은) DOTAM 결합제 PRIT-0128 유래 분자는 PRIT-0156으로 지칭된다.
허셉틴 프레임워크를 VH/VL 예측의 적합성과 프레임워크의 안정성 증가로 인해 포함하였다. 모든 VH 인간화된 변이체에 대해, 인간 J 요소 hJH2를 사용하였다. 모든 VK 인간화된 변이체에 대해, 인간 J 요소 hJK4를 사용하였다.
HC4는 하나의 역 돌연변이 카밧 A49g을 갖는 인간 생식계열 IGHV3-30-02 상의 PRIT-128의 이식이다.
가변 중쇄 HC5를 얻기 위해, CDR을, 원래 토끼 N-말단을 반영하기 위해 역 돌연변이로서 A49G 및 제1 아미노산의 결실을 갖는 인간 생식계열 hVH_2_26에 이식하였다.
허셉틴 V-영역(인간 생식계열 hVH3_66으로부터 유래함)에 이식되는 경우, 변이체 HC7은 수용자 프레임워크에서 몇 가지 변형을 특징으로 한다: N-말단 E, A49G, A71R 및 S93A의 결실.
HC10의 경우, PRIT-128의 CDR을 인간 생식계열 IGHV4_34_01에 이식하였다.
이때, N-말단을, Q2로 출발하는 원래 토끼 항체를 반영하도록, V2로 출발하여 변형하였다. 또한, G29F 및 F31L은 프레임워크 3에서 V71R 및 F78V뿐만 아니라 역 돌연변이 wrt 카밧 명명법으로 간주되었다.
경쇄 LC1의 경우, CDR을, 임의의 역 돌연변이 없이 인간 생식계열 IGKV1_39_01에 이식하였다. 출발은, A2로 출발하는 원래 토끼 Ab를 반영하기 위해 12로 선택되었다.
경쇄 변이체 LC3을 인간 생식계열 hVK1_5에 CDR을 이식하여 수득하였다. D1이 삭제되고, I2A 역 돌연변이는 새로운 N-말단으로 간주되었다. 추가 역 돌연변이로서, K42Q 및 A43P가 고려되었다.
인간화 매트릭스의 가능한 모든 조합이 생성되지는 않았지만, 제공된 조합의 VH/VL 예측 및 서열 위험과 같은 고려사항을 기반으로 정의된 조합을 선택하였다.
인간화의 목표는 DOTAM에 대한 친화도에 관하여 10의 인자보다 많이 손실되지 않고, 가능한 경우, 증가된 안정성을 나타내는 인간화 결합제를 수득하는 것이 었다. 이는 DOTAM에 필적하거나 더 나은 친화도를 갖는 여러 결합제와 약 10 내지 15℃의 DLS에 의해 측정된 열 안정성의 증가에 의해 달성되었다. 하기 표 7 및 8을 참고한다.
실시예 10: 용액 평형-기반 kd 측정
Pb-DOTAM에 대한 친화도에 대해 더 많은 양의 인간화 후보를 선별하기 위해, 용액 평형 적정(SET)을 사용하였다.
표 6은 Pb-DOTAM에 대한 선택되는 인간화된 DOTAM 결합제의 SET-기반 친화도 측정을 상술한다. 표 6의 모든 항체는 CEA에 대한 2가 결합 및 Pb-Dotam에 대한 1가 결합을 포함하는 이중특이적 항체이다(2:1 형식, 도 1 참고).
[표 6]
Figure pct00032
실시예 11: 킨엑사-기반 kd 측정
보다 상세한 분석, 및 친화도 측정을 위한 직교 방법을 위해, 킨엑사를 사용하였다.
계측 및 재료
오토 샘플러가 있는 사피다인 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments, 미국 인디애나주 보이시 소재)의 킨엑사 3200 기기를 사용하였다. 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 비드는 사피다인에서 구입한 반면, PBS(포스페이트 완충된 염수), BSA(소 혈청 알부민 분획 V) 및 항-DOTAM 항체는 사내(로슈)에서 제조하였다. 딜라이트650(등록상표)-접합된 친화도-정제된 염소 항-인간 IgG-Fc 단편 교차-흡착된 항체를 베틸 래보러토리즈(Bethyl Laboratories, 미국 텍사스주 몽고메리 소재)에서 구입하였다. 비오틴화된 Pb-DOTAM 항원(Pb-DOTAM-알킬-비오틴 이성질체 A 및 B, Pb-DOTAM-Bn-비오틴/TCMC-Pb-dPEG3-비오틴, 이성질체 A 및 B) 및 비-비오틴화된 Pb-DOTAM을 아레바 메드(미국 메릴랜드주 베데스다 소재)에서 수득하였다.
항원 코팅된 비드의 제조
PMMA 비드는 비오틴화된 분자(사피다인)에 대한 킨엑사 핸드북 프로토콜에 따라 코팅되었다. 간단히 말해서, 첫 번째로, 흡착 코팅을 위한 비드의 바이알(200 mg) 당 1 mL PBS(pH 7.4) 중 10 μg의 비오틴-BSA(써모 사이언티픽)를 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 회전시킨 후, 상청액을 제거하고, 비드를 1 mL PBS로 5회 세척하였다. 두 번째로, 10m g/mL BSA를 함유하는 PBS 중 100 μg의 뉴트라비딘(NeutrAvidin) 비오틴 결합 단백질(써모 사이언티픽) 1 mL를 비드에 첨가하고, 실온에서 추가로 2시간 동안 항온처리하여 뉴트라비딘을 비드에 커플링시키고, 비오틴화된 단백질의 후속 결합을 위한 추가 비오틴 결합 부위를 제공한다. 이어서, 뉴트라비딘-코팅된 비드를 1 mL PBS로 5회 세정하였다. 마지막으로, 비드를 PBS에서 200 ng/mL 비오틴화된 Pb-DOTAM-이성질체 혼합물(각각의 이성질체에 대해 50 ng)로 코팅하고, 실온에서 추가로 2시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 비드를 30 mL PBS에 재현탁하고, 즉시 사용하였다.
킨엑사 평형 검정
모든 킨엑사 실험을 PBS pH 7.4를 실행 완충액로 사용하여 실온(RT)에서 수행하였다. 샘플을 1 mg/mL BSA("샘플 완충액")가 보충된 실행 완충액에서 제조하였다. 0.25 mL/분의 유량을 사용하였다. 5 pM 결합 부위 농도를 갖는 일정한 양의 항-DOTAM 항체를 100 pM에서 시작하는 2배 연속 희석(농도 범위 0.049 내지 100 pM)에 의해 Pb-DOTAM 항원으로 적정하였다. 항원이 없는 항체의 한 샘플을 100% 신호로 사용하였다(즉, 억제하지 않음). 항원-항체 복합체를 평형에 도달할 때까지 실온에서 24시간 이상 동안 항온처리하였다. 이어서, 평형화된 혼합물을 킨엑사 시스템의 Pb-DOTAM-커플링된 비드의 컬럼을 통해 5 mL 부피로 추출하여 결합되지 않은 항체가 용액의 평형 상태를 교란시키지 않고 비드에 의해 포획되도록 하였다. 포획된 항체는 샘플 완충액에서 250 ng/mL 딜라이트 650(등록상표)-접합된 항-인간 Fc-단편 특이적 2차 항체를 사용하여 검출하였다. 각각의 샘플을 모든 평형 실험에 대해 중복 측정하였다.
KD는 "표준 분석" 방법을 사용하는 킨엑사 소프트웨어(버전 4.0.11)에 함유된 단일-분위 동종 결합 모델을 사용하는 데이터의 비선형 회귀 분석으로부터 수득하였다. 소프트웨어는 KD를 계산하고, 데이터 포인트를 이론적 KD 곡선에 정합시킴으로써 95% 신뢰 구간을 결정한다. 95% 신뢰 구간[사피다인 테크노트(Sapidyne TechNote) TN207R0]은 KD 낮음 및 KD 높음으로 제공된다.
킨엑사에 의해 측정된 친화도 값에 대한 다른 예는 PRIT-213에 대해 하기 제공된다. PRIT-0213은 다른 CEA 결합 VH/VL을 제외하고는 PRIT-0186과 동일한 분자이다(표 8 참고).
PRIT-213
CEA-DOTAM BsAb의 금속-DOTAM 킬레이트 친화도
Figure pct00033
추가 값은 하기 제시된다:
Figure pct00034
실시예 12: 인간화된 PRIT 분자에 대한 열안정성 측정
방법 및 데이터 분석
최종 형식의 인간화 PRIT 분자의 상이한 변이체(20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0)를 동일한 완충액에서 1 mg/mL로 희석하였다. 30 μL의 각각의 샘플을 384-웰 플레이트 필터 장치로 옮겼다(기준으로서 항 HER3 항체와 함께). 1,000 g로 1분 동안 원심 분리한 후, 웰을 10 μL의 파라핀 오일로 덮었다. 플레이트를 다시 원심분리하고(1분 동안 1,000 g), DLS 플레이트 판독기[디나 프로 플레이트리더(Dyna Pro PlateReader)-II, 와이어트(Wyatt)]로 옮겼다. 25℃에서 시작하여 온도를 0.05℃/분의 속도로 79.9℃까지 증가시켰다. 산란광을 다이나믹스 소프트웨어(Dynamics Software)(V7.0)를 사용하여 기록하였다.
데이터를 엑셀(Excel)[마이크로소프트(Microsoft)]로 전송하고, 샘플 및 온도를 분류하고, 소프트웨어 추가 프로그램을 사용하여 용융 곡선을 생성하였다. 기준선으로부터 분명한 편차가 발생한 온도는 "응집 시작"으로 정의되고, 용융 곡선의 변곡점은 "용융 온도"로 정의되었다.
[표 7]
결과
Figure pct00035
실시예 13: 후보의 선택
PRIT-0156은 CEA 결합제 CH1A1A와 조합된 토끼 DOTAM 결합제 PRIT-0128을 포함하는 2:1 항체이다. PRIT-0178 내지 PRIT-0204는 동일한 CEA 결합제와 동일한 형식의 인간화 변이체이다. PRIT-0205 내지 PRIT-0221은 DOTAM 결합 부분의 PRIT-0178 내지 PRIT-0204 인간화 변이체와 상응하지만, CEA 결합제가 T84.66으로 변경되었다.
하기 표는 다양한 PRIT 분자의 특성을 비교한다.
바람직한 화합물은 PRIT-213 및 PRIT-214였다.
Figure pct00036
[표 8]
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
실시예 14: Fab P1AA1227 Pb-DOTAM 복합체의 결정화, 데이터 수집 및 구조 결정
복합체 형성을 위해, PRIT-0213의 인간화된 VH/VL로부터 유래한 Fab(P1AA1227로 지칭됨) 26 mg/mL를 Pb-DOTAM 분말과 1:4.2의 몰비로 혼합하였다. 4℃에서 2시간 동안 항온처리한 후, 초기 결정화 시험을 JCSG+ 스크린(퀴아젠, 독일 힐덴 소재)을 사용하여 21℃에서 앉은 시팅 드롭(sitting drop) 증기 확산 설정에서 수행하였다. 결정은 0.2 M (NH4)2S04, 0.1 M 비스-트리스 pH 5.5, 25% w/v PEG3350에서 5일 내에 나타났다. 임의의 추가 최적화 단계 없이 선별 플레이트에서 직접 결정을 수확하였다.
데이터 수집 및 구조 결정. 데이터 수집을 위해, 결정을 10% 에틸렌글리콜을 포함하는 침전 용액에서 100K에서 순간 동결시켰다. 스위스 라이트 소스(Swiss Light Source, 스위스 필리겐 소재)의 빔라인(beamLine) X10SA에서 필라투스(PILATUS) 6M 검출기를 사용하여 1.0000 Å의 파장에서 회절 데이터를 수집하였다. 데이터를 XDS(문헌[Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 133-144 (2010)])로 처리하고 사답스(SADABS)[브루커(BRUKER)]로 스케일링(scaling)하였다. 복합체의 결정은 a = 135.63 Å, b = 56.42 Å, c = 64.52 Å 및 β = 108.36°의 셀 축을 갖는 스페이서 기 C2에 속하고 1.40 Å의 해상도로 회절된다. 구조는 검색 모델로 사내 Fab 구조를 사용하는 페이서(PHASER)(문헌[McCoy, A.J, Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Storoni, L.C.] 및 문헌[Read, R.J. J. Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007)])로 분자 대체에 의해 결정되었다. 차이 전자 밀도를 사용하여 Pb-DOTAM을 배치하고, 실제 공간 미세조정을 통해 서열 차이에 따라 아미노산을 변경하였다. 구조를 CCP4 스위트(문헌[Collaborative Computational Project, Number 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994)]) 및 버스터(BUSTER)(문헌[Bricogne, G., Blanc, E., Brandl, M., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P., Sharff, A., Smart, O.S., Vonrhein, C., Womack, T.O . (2011). Buster version 2.9.5 Cambridge, United Kingdom : Global Phasing Ltd.])로부터의 프로그램으로 미세조정하였다. 수동 리빌딩(rebuilding)을 COOT(문헌[Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. and Cowtan, K. Acta Cryst D66, 486-501 (2010)])로 수행하였다.
데이터 수집 및 미세조정 통계는 표 9에 요약된다. 모든 그래픽 프리젠테이션은 파이몰(PYMOL)[더 파이몰 몰리큘러 그래픽스 시스템(The Pymol Molecular Graphics System), 버전 1.7.4. 슈로딩거 엘엘씨(Schrodinger, LLC.)]로 준비하였다.
[표 9]
Fab P1AA1227-Pb-DOTAM 복합체에 대한 데이터 수집 및 미세조정 통계
Figure pct00040
Figure pct00041
Pb-Dotam과의 복합체에서 Fab P1AA1227의 구조
Pb-Dotam과 Fab P1AA.1227의 상호작용 세부사항을 특징규명하기 위해, 1.40 Å의 해상도에서 복합체의 결정 구조를 결정하였다. 구조는 경쇄의 CDR1 및 CDR3 및 중쇄의 CDR2 및 CDR3에 의해 Pb-DOTAM에 결합하는 Fab P1AA1227을 나타낸다.
프로그램 PISA를 사용한 결합 계면의 분석은 3개의 수소 결합, 극성 상호작용 및 반 데르 발스 접촉을 통해 Fab P1AA1227과 Pb-DOTAM의 상호작용 패턴을 나타낸다. Pb-DOTAM은 중쇄와 경쇄로 형성된 포켓에 결합한다. 이러한 포켓은 한 측면이 개방된 상자 형상이다. 포켓의 측벽과 바닥은 비극성 상호작용에 기여하는 반면, 벽의 가장자리에서 극성 상호작용이 지배적이다. 측쇄 수소 결합은 DOTAM 카바모일 질소 원자 N7 및 N8을 갖는 중쇄 Glu95 및 Asp97의 CDR3 잔기 사이에 형성된다. 추가적인 수소 결합은 Arg96의 주쇄 카보닐 원자와 DOTAM의 원자 N7을 통해 확립된다. 복합체는 아자사이클로도데칸 고리에 대향하는 배향된 가장자리인 중쇄 CDR2 Phe50 및 Tyr58 측쇄의 비극성 상호작용을 통해 더욱 안정화된다. 경쇄는 테트라사이클로도데칸 고리에 비극성 접촉을 제공하는 CDR3 잔기 Gly91-Tyr96을 갖는 포켓의 "바닥"에 주로 기여한다. Asp32는 DOTAM의 카바모일 질소 원자 N6에 수소 결합한다(카밧에 따른 넘버링).
도 2는 Pb-DOTAM과의 복합체인 P1AA1227의 구조를 도시한다.
도 3은 상호작용 부위의 도면을 도시한다.
하기 표는 프로그램 PISA에 의한 분석을 기반으로 하는 중쇄 파라토프 잔기를 제시한다.
[표 10]
Figure pct00042
하기 표는 프로그램 PISA에 의한 분석을 기반으로 하는 경쇄 파라토프 잔기를 제시한다.
[표 11]
Figure pct00043
파라토프 잔기는 또한 하기 서열에서 밑줄이 그어져 있다.
> P1AA1227_HC
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLG F IGSRG D T Y YASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR ERDPY GGG AY PPHLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
> P1AA1227_LC
SIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSV Y SDN D LAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLG GYD DESD TY GFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
실시예 15: 생체내 생체분포 및 효능: 재료 및 방법
하기 실시예에 대한 용어 사전
Figure pct00044
Figure pct00045
프로토콜의 재료 및 방법
일반적인 사항
모든 실험 프로토콜은 지역 당국(Comite Regional d'Ethique de l'Expㅹrimentation Animale du Limousin(CREEAL), Laboratoire Departemental d'Analyses et de Recherches de la Haute-Vienne)에 의해 검토되고 승인되었다. 암컷 중증 복합 면역결핍(SCID) 마우스(찰스 리버)는 윤리 지침에 따라 명 및 암(12시간/12시간)의 매일 사이클로 특정 병원체-부재 조건에서 유지되었다. 동물이 새로운 환경에 적응할 수 있도록 도착 후 첫 주 동안 어떠한 조작도 수행하지 않았고, 모든 마우스를 신체 상태 및 일반적인 복지의 평가를 위해 매일 모니터링하였다.
종양 부피를 캘리퍼링을 통해 추정하고, 하기 공식에 따라 계산하였다:
부피 = 0.5 x 길이 x 너비 2 .
프로토콜에 명시된 대로, 후안와 출혈을 사용하여 정맥동에서 종결시 혈액을 수집하고, 이어서 방사능 측정 및/또는 조직학적 분석을 위한 추가 조직 수확을 수행하였다. 예상치 못한 또는 비정상적인 조건이 문서화되었다.
통계 분석을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6[그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad Software, Inc.)] 및 JMP 8[에스에이에스 인스티튜트 인코포레이티드(SAS Institute Inc.)]을 사용하여 수행하였다.
시약
이중특이적 항체를 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 파마 리서치 펜츠베르크(독일 펜츠베르크 소재)에서 제공받고, 주사 일까지 -80℃에서 저장하였다. 이어서, 해동하고, 표준 비히클 완충액(20 mM 히스티딘/히스티딘 HC1, 140 mM NaCl; pH 6.0)에서 희석하였다.
Figure pct00046
클리어링제를 매크로사이클릭스(미국 텍사스주 플라노 소재)에서 제공받았다. 주사 일까지 -80℃에서 저장하고, 이때 해동하고, 원하는 농도까지 PBS에서 희석하였다.
Figure pct00047
Figure pct00048
방사성 표지를 위한 DOTAM 킬레이트를 매크로사이클릭스에서 제공받고, 방사성 표지 전에 -20℃에서 유지하였다. 납-203(203Pb) 또는 납-212(212Pb)를 사용한 후속 표지를 아레바 메드(프랑스 라제 소재)에서 수행하였다. 목적 Pb 투약량/활성 농도를 수득하기 위해 PBS로 희석된 100 μL의 각각의 Pb-DOTAM 용액을 마우스에 정맥내(i.v.) 주사하였다. 203Pb-DOTAM을 이중특이적 항체와 사전-결합된 상태로 사용하는 반면, 212Pb-DOTAM을 PRIT 및 클리어링제 후에 투여하였다. 2470 위자드(WIZARD)2 자동 감마 계수기[퍼킨엘머(PerkinElmer)]를 사용하여 방사능 측정을 수행하였다.
Figure pct00049
BxPC3는 CEA를 자연적으로 발현하는 인간 원발성 췌장 선암 세포주이다. BxPC3 세포를 10% 소 태아 혈청 및 1% 글루타맥스(GlutaMAX)(깁코, 참고 번호 35050-061)가 강화된 RPMI-1640 매질(깁코, 참고 번호 42401-018)에서 배양하였다. LS174T는 CEA를 자연적으로 발현하는 인간 대장 선암 세포주이다. LS174T 세포는 10% 소 태아 혈청이 강화된 DMEM 매질(깁코, 참고 번호 42430-082)에서 배양하였다. MKN45는 CEA를 자연적으로 발현하는 인간 위 선암 세포주이다. MKN45 세포는 20% 소 태아 혈청이 강화된 RPMI-1640 매질(깁코, 참고 번호 42401-018)에서 배양하였다. 코닝(Corning, 등록상표) 마트리겔(Matrigel, 등록상표) 기저 막 매트릭스(성장 인자 감소됨, 카탈로그 번호 354230)와 1:1 혼합된 RPMI 또는 DMEM 매질 중 세포를 우측 옆구리에 피하 주사함으로써 고체 이종이식을 확립하였다.
Figure pct00050
실시예 16: 다양한 CEA-표적화 이중특이적 항체에 의한 사전-표적화(프로토콜 80(a, b, c))
이러한 연구는, 섭생법을 최적화하고 임상 시험으로의 전환에 가장 적합한 후보를 선택하기 위해, 다양한 CEA-표적화 이중특이적 항체에 의한 사전-표적화 후 마우스의 췌장 선암 이종이식편에서 Pb 축적을 평가하는 것을 목표로 하였다. 실험은 i) 80b, ii) 80c 및 iii) 80a 순서로 수행된 3개의 별도 프로토콜로 나뉘었다. 프로토콜 80b는 203Pb-DOTAM으로 사전-결합된 5개의 완전히 인간화된 이중특이적 항체 구축물의 종양 흡수를 평가하였다. 프로토콜 80c는, 사전-표적화된 섭생법에서 PRIT 주사와 CA/킬레이트 주사 사이의 타이밍을 최적화하기 위해, 주사 후 3개의 다른 시점에서 203Pb-DOTAM으로 사전-결합된 이중특이적 항체 구축물의 종양 흡수를 평가하였다. 마지막으로, 프로토콜 80a는 T84.66 또는 CH1A1A를 표적화하는 5개의 완전히 인간화된 이중특이적 항체 구축물을 사용하여 표준 사전-표적화 설정에서 212Pb-DOTAM의 종양 흡수를 평가하였다.
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
각각의 마우스(6 내지 7주령)에 100 μL RPMI/마트리겔 중 BxPC3 세포(계대 30)를 우측 옆구리에 피하(s.c.) 주사하였다. 종양 세포 주사 5일 후, 마우스를 는 160 내지 170 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다. 항체를 100 μL 당 30 μg의 최종 농도로 희석하고, 이어서 단독으로(80a) 또는 203Pb-DOTAM(80b, 80c)으로 사전-결합하여 i.v. 투여하였다. PRIT-0165 및 PRIT-0156을 각각 T84.66 및 CH1A1A를 표적화하는 양성 CEA-결합 대조군으로 사용하였다. PRIT-0175를 비-CEA-결합 대조군으로 사용하였다.
프로토콜 80a에서, 이중특이적 항체의 투여 3일 후 100 μL 당 30 μg의 농도로 클리어링제를 정맥내 주사하고, 이어서 2시간 후에 212Pb-DOTAM을 주사하였다.
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
마우스를 24시간(80a); 96시간(80b); 또는 24, 72 또는 168시간(80c) 후에 생체분포 목적으로 희생시켰다. 프로토콜 80a의 모든 마우스로부터 혈액, 방광, 비장, 신장, 간, 폐, 심장, 근육 및 종양을 수확하였다. 프로토콜 80b 및 80c의 모든 마우스로부터 혈액, 방광, 소장, 결장, 비장, 췌장, 신장, 간, 폐, 심장, 대퇴부, 근육 및 종양을 수확하였다. 수집된 샘플의 칭량하고, 즉시 방사능 측정을 위해 플라스틱 튜브에 넣었다. 방사성 붕괴 및 배경에 대한 교정을 포함하여 조직 1 g 당 주사된 선량 백분율(%ID/g)을 계산하였다.
결과, 80a
모든 CEA-결합 이중특이적 항체는 212Pb-DOTAM의 특정 종양 표적화를 야기하였고, DOTAM 주사 24시간 후 정상 조직에서 거의 또는 전혀 흡수되지 않았다. PRIT-0206, PRIT-0207 및 PRIT-0208의 경우, 평균 종양 흡수 ± SD는 각각 8.62 ± 1.05%ID/g, 7.30 ± 3.84%ID/g 및 7.75 ± 2.61%ID/g였고, 상응하는 T84.66-결합 양성 대조군 PRIT-0165는 9.13 ± 1.82%ID/g였다. CH1AlA-결합제 PRIT-0186 및 PRIT-0187은 종양 값이 17.44 ± 1.39%ID/g 및 16.50 ± 3.25%ID/g였고, 양성 대조군 PRIT-0156은 18.98 ± 1.89%ID/g였다. 비-CEA 결합 PRIT-0175는 종양에서 0.41 ± 0.42%ID/g을 나타냈다.
전반적으로, CH1A1A를 표적으로 하는 이중특이적 항체는 T84.66을 표적으로 하는 것보다 훨씬 더 높은 종양 흡수를 야기하였다(언페어링된 t-검정, p <0.0001); CH1A1A 및 T84.66은 둘 다 음성 대조군과 비교하여 유의하게 더 높은 흡수를 야기하였다(1-방향 ANOVA, p < 0.0001). 결과는 도 4에 도시된다.
결과, 80b
종양의 특이적 표적화는 모든 사전-결합된 CEA-결합 이중특이적 항체로 달성되었지만, %ID/g는 양성 대조군 PRIT-0165와 비교하여 완전히 인간화된 버전에서 약간 더 낮았다. 비-CEA-결합 대조군은 비교적 무시할만한 종양 축적을 야기하였다.
전반적으로, 이러한 사전-결합 실험 설정에서 계산된 %ID/g는 상응하는 PRIT 섭생법보다 약 10배 높은 수준에 도달하였지만, 출력 데이터는 감마 계수기 활동 측정을 반영하고, 계산 오차는 발견되지 않았다. 중요하게는, 종양 대 정상 조직 비는 예상 범위 내에 있었다. 구체적으로, 종양 대 혈액 비(± SD, n = 3)는 PRIT-0205의 경우 6.76 ± 2.95, PRIT-0206의 경우 7.56 ± 2.27, PRIT-0207의 경우 9.33 ± 0.91, PRIT-0208의 경우 10.77 ± 0.84, PRIT-0209의 경우 11.71 ± 0.84, PRIT-0165의 경우 10.78 ± 0.88, PRIT-0175의 경우 0.85 ± 0.12였다. 결과는 도 5에 도시된다.
결과, 80c
두 CEA-결합 항체는 음성 대조군과 비교하여 상당한 종양 축적을 야기하였다. 통계 분석은 연구된 어느 시점에서든 PRIT-0206 또는 PRIT-0165를 사용한 종양 표적화 사이에 유의한 차이가 없었고, 연구된 항체 중 어느 것에도 3일과 7일 사이에 %ID/g에 유의한 차이가 없었다(2-방향 ANOVA, p < 0.05). 프로토콜 80b와 유사하게, 계산된 %ID/g 값은 전반적으로 높았지만, 종양 대 혈액 비는 예상 범위 내에 유지되었다. 종양 대 혈액 율의 유의한 차이는 1일 내지 3일 사이에 나타나지 않았지만, PRIT-0165 및 PRIT-0206의 경우, 7일 대기는 PRIT-0213 d 비를 유의하게 증가시킨다(2-방향향 ANOVA, p < 0.05). 결과는 도 6에 도시된다.
주사 후 다양한 시점에서 203Pb-DOTAM-bsAb의 종양 대 혈액 비(± SD; n = 3).
Figure pct00057
요약 및 결론
T84.66 또는 CH1A1A를 표적으로 하는 모든 완전히 인간화된 이중특이적 항체는 BxPC3 종양에서 각각의 양성 대조군과 비교하여 유의한 방사능 축적을 야기하였다.
종양에서 203Pb-DOTAM-bsAb의 %ID/g는 3일와 7일 사이에 유의한 차이가 없었지만, 상응하는 종양 대 혈액 비는 혈액 방사능 감소로 인해 나중 시점에 유리하였다.
실시예 17: 클리어링제의 생체분포(프로토콜 44)
본 연구의 목적은 상이한 특성(예컨대, 분자 골격, 크기 및 전하)을 갖는 클리어링제 선택의 생체분포, 더욱 구체적으로 종양에서 이들의 존재 및/또는 축적을 처리하는 것이다. 이것은 클리어링제가 잠재적으로 종양에 도입되고, 종양-결합된 항체에 결합하고/거나 종양에서 그들을 끌어내어 방사성 리간드의 후속 결합에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 점에서 흥미로웠다.
Figure pct00058
Figure pct00059
30 μg의 Dex70, Dex250 및 TriGalNac-변형된 클리어링제를 5μCi 212Pb로 급랭시키고, PBS에서 희석하여 i.v. 주사를 위해 100 μL 총 부피 당 30 μg을 수득하였다.
212Pb-CA 주사 후 2 또는 24시간에에 마우스를 희생시키고, 부검하였다. 혈액, 방광, 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 장(십이지장, 공장, 회장), 결장, 췌장, 위, 난소, 뇌, 골수가 있는 대퇴부 및 종양을 수집하고, 칭량하고, 방사능 함량을 측정하고, %ID 및 %ID/g을 이어서 계산하였다. 또한, 24시간 시점에서 소변을 샘플링하였다.
결과, 44
모든 클리어링제는 혈류에서 빠르게 제거되어, 주로 주사 2시간 후에 이미 간과 결장에 축적되었다. 주사된 212Pb의 약 50%는 기관별(%ID) 방사능 분포에 의해 증명되는 바와 같이, 주사 24시간 후에 간에서 발견되었다. TriGalNAc-변형된 클리어링제는 또한 비장에 어느 정도 축적되었고, TriGalNAc 분자의 존재로 설명된다. 일반적으로, 24시간 후 소변에서 방사능이 거의 발견되지 않았다. 그러나, 가장 작은 클리어링제(Dex70)는 예상보다 느리게 배설되었다.
도 7은 MKN45 종양-함유 마우스에서 212Pb-표지된 클리어링제의 주사 2시간 후에 선택되는 조직에서의 방사능 분포를 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3).
도 8은 MKN45 종양-함유 마우스에서 212Pb-표지된 클리어링제의 주사 24시간 후 선택되는 조직 및 소변에서의 방사능 분포를 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3).
도 9는 MKN45 종양-함유 마우스에서 212Pb-표지된 클리어링제의 주사 24시간 후 선택되는 조직 및 소변에서 기관별 방사능 분포를 도시한다(%ID ± SD, n = 3).
요약 및 결론
방사선표지된 CA 중 어느 것도 마우스 당 30 μg의 투약량으로 투여된 212Pb의 종양 흡수를 야기하지 않았다. TriGalNac에 의한 Dex500의 변형은 비-변형된 Dex70 및 Dex250 클리어링제에 비해 유익하지 않았다.
실시예 18: 클리어링제의 장기 생체분포(프로토콜 70)
본 연구는 6개의 상이한 클리어링제의 장기 생체분포를 비교하였다. 생체내 추적을 203Pb에 의한 방사선표지에 의해 수행하였다.
Figure pct00060
Figure pct00061
결과, 70
도 10은 종양-부재 마우스에서 203Pb-표지된 클리어링제의 주사 1주 후에 선택되는 조직에서의 방사능 분포를 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3).
도 11은 종양-부재 마우스에서 203Pb-표지된 클리어링제의 주사 1주 후에 선택되는 조직에서 기관별 방사능 분포를 도시한다(%ID ± SD, n = 3).
실시예 19: 혈액내 클리어링제(프로토콜 83 및 87)
본 파트는 2개의 연구를 다루고, 첫 번째 연구는 혈액내 체류 시간에 관해, 9개의 상이한 덱스트란-기반 클리어링제와 PBS를 비교하는 초기 선별을 포함한다. 목표는 향후 사전-표적화된 실험을 위한 유망한 후보를 식별하여 3주 간격으로 반복 치료를 허용하는 것이었다. 가설은 장기간 순환 상태로 남아있는 클리어링제가 투여된 이중특이적 항체에 결합하여 후속적으로 주사된 방사선표지된 DOTAM의 결합을 효과적으로 차단한다는 것이다. 클리어링제는 크기, 전하 및 1,4,7,10-테트라키스(카바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸(TCMC) 로딩에 관해 다양하였다.
제2 연구는 항체 제거 효율에 관해 9개의 클리어링제를 평가하였다. 실험은 종양-부재 마우스에서 표준 단일-주사 PRIT 요법으로 디자인되었고, CA 투여 후 보유된 bsAb의 표시로서 혈액내 212Pb-DOTAM 체류를 평가하였다.
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
제1 FRIT 주사 당시, 마우스는 7 내지 9주령였다. 연구에 참여한 모든 마우스는 종양이 없었고, 따라서, 모든 DOTAM-결합 이중특이적 항체를 선별 목적으로 사용할 수 있다. 클리어링제는 100 μL 당 30 μg(프로토콜 83) 또는 60 μg(프로토콜 87)의 최종 농도로 PBS에서 희석된 PRIT-0155 투여 1일 후 정맥내 투여되었다. 군 0은 클리어링제 대신 PBS를 수용하였다. 군 A 내지 D의 화합물은 다양한 TCMC 치환과 함께 20, 70, 250 또는 500 kDa의 덱스트란 크기를 기반으로 하였다. 군 J 내지 N의 화합물은 다양한 전하(Glu)를 갖는 캡핑된(즉, 과량의 아민의 중화에 의해) 덱스트란-500(CDex) 또는 단일 버전의 Glu(M(Glu))를 갖는 덱스트란-500 및 덱스트란-20을 기반으로 하였다. -(Glu)4, -(Glu)3 및 -(Glu)2로 캡핑된 덱스트란은 각각 매우 음성, 음성 및 중성 순 전하에 상응하였다. 모노 버전 -M(Glu)2는 음성 내지 약간 양성의 순 전하에 상응하였다.
결과, 83
PBS 대조군(41.1 ± 1.4%ID/g)과 유의하게 상이한 혈액내 방사능 함량 (%ID/g)의 군 평균은 투여 3주 후에 순환 중인 클리어링제의 체류를 나타냈다. 3개의 화합물 캡핑된 Dex500-(Glu)4, Dex500-모노-(Glu)2 및 Dex20-모노-(Glu)3은 대조군과 유의하게 다르지 않았고; 다른 것은 정도에 따라 달랐다.
도 12는 212Pb-DOTAM 주사 4시간 후 혈액내 방사능 함량을 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3). 줄무늬 막대는 모든 후보 시약을 비교한 비-CA 대조군을 나타낸다. 별표는 낮은(*)에서 높은(***)까지의 통계적 유의 수준을 표시한다.
결과, 87
시험된 클리어링제는 일반적으로 잘 수행되었지만, 하나의 예외는 Dex500-M(Glu)2로 24시간 후 혈액에 잔류하는 8.07 ± 0.61%ID/g을 나타냈다.
도 13은 212Pb-DOTAM의 주사 24시간 후에 혈액내 평균 방사능 함량을 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3). 줄무늬 막대는 모든 후보 시약을 비교한 비-CA 대조군을 나타낸다.
요약 및 결론
선별된 시약은 자체-클리어런스에 관해 전반적으로 잘 수행되었고, 순환에서 항체 클리어런스를 달성하였다. CA 주사 사이에 3주 동안 반복된 치료는 212Pb-DOTAM이 이중특이적 항체에 결합할 위험 없이 실행가능함을 증명하였다. 또한, 이중특이적 항체는 대부분의 시험 화합물을 사용하여 CA 주사 후 2시간 내에 클리어링되었다.
실시예 20: 클리어링제의 종양 침투(프로토콜 85)
클리어링제의 종양 침투는, 침투하는 DOTAM-결합된 CA 단편이 항체 사전-표적화된 종양 세포에 대한 결합에서 212Pb-DOTAM과 경쟁할 것이므로, PRIT 섭생법에서 잠재적인 문제이다. 본 연구에서, 종양에 대한 212Pb-DOTAM 회합의 억제에 관해 6개의 다른 클리어링제를 비교하였다. i) 덱스트란 크기, 및 ii) 분자의 전하로부터 종양-회합된 방사능에 대한 영향을 평가하기 위해, 기준선 CA 스크린(프로토콜 83)의 결과를 기반으로 후보를 선택하였다.
Figure pct00065
Figure pct00066
각각의 마우스(7주령)에 100 μL RPMI/마트리겔 중 BxPC3 세포(계대 33)를 우측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 세포 주사 5일 후, 마우스를 200 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다.
클리어링제는 다양한 TCMC 치환과 함께 20, 70 또는 500 kDa의 덱스트란 크기를 기반으로 한다. CDex500-(Glu)4는 음성 순 전하를 갖는 캡핑된(즉, 과량의 아민의 중화에 의해) 덱스트란-500(CDex)을 기반으로 하고; Dex500-M(Glu)2는 모노 버전의 Glu(M(Glu))와 중성 내지 약간 양성의 순 전하를 가졌다. PRIT-0165 투여 3일 후, 모두 100 μL 당 30 μg을 정맥내 투여하였다. 군 G는 클리어링제 대신 PBS를 수용하였다.
마우스를 212Pb-DOTAM의 주사 24시간 후에 희생시켰다. 혈액 및 종양을 수집하고, 샘플 중량 및 방사능 함량으로부터 각각의 %ID/g을 계산하였다.
결과, 85
3개의 후보 Dex20(0.26 ± 0.03%ID/g), Dex70(4.06 ± 2.06%ID/g) 및 CDex500-(Glu)4(2.98 ± 0.73%ID/g)는 종양 흡수가 거의 또는 전혀 나타나지 않았고, 종양으로의 광범위한 CA 침투를 나타낸다. 대조적으로, Dex500-M(Glu)2는 종양(69.39 ± 9.70%ID/g)과 혈액(20.68 ± 1.22%ID/g) 둘 다에서 PBS 대조군과 유사한 수준(종양과 혈액에서 각각 59.02 ± 15.53%ID/g 및 27.92 ± 2.38%ID/g)으로 높은 방사능을 나타냈다(bsAb 클리어런스 실패로 해석됨). Dex500은 종양에서 상당한 방사능 축적(20.78 ± 3.76%ID/g)을 나타내어 종양 침투가 거의 없음을 나타내는 반면, 혈액 클리어런스는 본질적으로 완전하였다(0.17 ± 0.01%ID/g). 그럼에도 불구하고, 비-CA 대조군에서 달성된 종양 흡수는 어느 정도의 저 분자량(MW) DOTAM-덱스트란 단편이 Dex500 배치에도 존재함을 나타냈다.
도 14는 212Pb-DOTAM의 주사 24시간 후에 혈액 및 종양의 방사능 함량을 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3).
요약 및 결론
본 실험은 저-MW CA 종의 존재가 212Pb-DOTAM의 종양 축적을 실질적으로 방해할 수 있다는 개념을 확인하였다. 또한, 특정된 크기에 관계 없이 CA의 모든 배치에 존재하는 광범위한 MW 범위의 분자를 증명하였다. 이 때문에, 특정된 CA 크기가 클수록 종양을 침투할 수 있는 저-MW 단편이 도입될 위험이 낮아진다. 그러나, Dex500의 경우에도, 특정 수준의 침투가 나타났는 데, 이는 비-CA 대조군과 비교되는 종양 흡수의 차이로 나타냈다. 결과적으로, 이러한 용액은 향후 더 높은 MW 컷-오프를 사용하여 정용여과되어 이러한 간섭 단편을 최대한 제거하여야 한다. Dex500의 경우, MW 컷-오프를 30 kDa에서 100 kDa로 증가시키기로 결정하였다.
실시예 21: Dex500을 위한 클리어링제 제조 공정
아미노덱스트란(20.0g)을 H2O(400 mL) 중 0.1 M Na2CO3 및 H2O(400 mL) 중 0.1 M NaHCO3의 혼합물에 용해시켰다. 투명한 무색 용액을 수득한 후, p-SCN-Bn-DOTAM·4HC1(S-2-(4-이소티오시아네이토벤질)-1,4,7,10-테트라아자-1,4,7,10-테트라(2-카바모일메틸)사이클로도데칸 테트라하이드로클로라이드 염, 2.03 g)을 교반 하에 첨가하였다. 생성된 약간 혼탁한 용액을 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 2 M HCl을 첨가하여 pH 6 내지 7로 중화시켰다. 생성된 용액을 100 kDa 컷-오프[사르토리어스 하이드로사르트(Sartorius Hydrosart), 슬라이스(Slice) 200 100 kDa 0.02 m2, 안정화된 셀룰로스 기반 막, 한외여과 카세트)에 의한 접선 유동 여과에 의해 정제하여 저 분자량 불순물을 제거하였다. 생성된 용액을 감압하에 동결건조하여 목적 중간체 17.9 g을 수득하였다.
동결건조에서 수득된 고체 16.1 g을 H2O(60 mL) 중 0.1 M AcOH와 0.1 M Na0Ac·3H2O(540 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 투명한 무색 용액에 Pb(OAc)2·3H2O(744 mg)를 고체로 첨가하였다. 투명한 무색 용액을 60분 동안 교반한 후 자 일레놀 오렌지(H2O 중 1%, 250 μL)의 용액을 첨가하였다. 보라색은 용액 중 유리 Pb(II)의 존재를 나타낸다. 황색으로의 변색이 관찰될 때까지 (65.2 mL) EDTA의 용액(H2O 중 0.01 M)을 첨가하였다. 생성된 용액을 100 kDa 컷-오프(사르토리우스 하이드로사르트, 슬라이스 200 100 kDa 0.2m2, 안정화된 셀룰로스 기반 막, 한외여과 카세트)를 사용하여 접선 유동 여과에 의해 정제하여 저 분자량 불순물을 제거하였다. 생성된 용액을 감압 하에 동결건조하여 14.0 g의 목적 클리어링제를 수득하였다.
생성된 클리어링제는 하기 개략적으로 나타낸 형태의 다수의 Pb-DOTAM 모이어티로 치환된다.
Figure pct00067
실시예 22: 종양 축적에 대한 클리어링제 투약량(프로토콜 90)
본 연구는 클리어링제 투약량이 피하 종양 모델에서 종양 축적에 미치는 영향을 조사하고 클리어링제의 양이 많을수록 클리어링제가 종양에 더 많이 침투하여, 종양-결합 이중특이적 항체의 DOTAM-결합 아암을 차단함으로써 표지된 킬레이트의 후속 흡수를 감소시킬 수 있다는 가설을 세웠습니다. 그러나, 너무 낮은 투약량은 순환하는 DOTAM-결합 이중특이적 항체의 더 높은 수준으로 인해 종양-회합 방사능의 덜 효율적인 축적을 야기할 수 있다.
또한, DOTAM-결합된 덱스트란 단편의 종양 침투를 감소시키기 위해 30 또는 100 kDa의 컷-오프로 저-MW 성분을 제거하기 위해 정용여과된 클리어링제 배치를 비교하였다.
Figure pct00068
Figure pct00069
고형 이종이식편은 코닝(등록상표) 마트리겔(등록상표) 기저 막 매트릭스(성장 인자 감소됨; 카탈로그 번호 354230)와 1:1 혼합된 RPMI 매질에 BxPC3 세포(계대 30)의 피하 주사에 의해 확립되었다. 각각의 마우스(11주령)는 우측 옆구리에 100 μL RPMI/마트리겔 중 5x106 세포를 s.c. 주사하였다. 종양 세포 주사 5일 후, 마우스를 150 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다.
PRIT-0165를 100 μL 당 30 또는 100 μg의 농도로 i.v. 주사하고, 4일 후 100 μL 당 10, 25, 30, 50 또는 100 μg의 농도로 클리어링제(군 A 내지 F)를 i.v. 주사하였다. 212Pb-DOTAM을 CA 투여 2시간 후에 주사하였다. 군 G 및 H는 이중특이적 항체와 방사선표지된 킬레이트의 투여 사이에 클리어링제를 수용하지 않았다.
212Pb-DOTAM의 주사 24시간 후 생체분포 목적을 위해 마우스를 희생시키고, 혈액, 방광, 비장, 신장, 간, 폐, 근육, 꼬리 및 종양을 수집하였다. 샘플을 칭량하고, 방사능을 측정하고, 후속적으로 붕괴 및 배경의 교정을 포함하여 각각의 장기에 대한 %ID/g을 계산하였다.
결과, 90
정상 조직에서 212Pb 축적은 클리어링제를 투여한 모든 군에서 낮았고; 대조적으로, 클리어링제를 수용하지 않은 군은 전반적으로 유의한 수준의 방사능을 나타냈다.
생체분포 데이터는 클리어링제의 양을 변화시키는 효과를 도시한다(100-kDa 컷-오프). 개별 종양 데이터의 선형 회귀는 유의한 기울기를 나타내어, Dex500의 양이 감소함에 따라 더 높은 종양 흡수를 나타낸다(p = 0.03, R2 = 0.31). 혈액내 방사능 함량에 대한 효과는 PBS를 사용하여 31.5 ± 0.2%ID/g에서 10 μg Dex500을 사용하여 1.6 ± 0.5%ID/g로 급감하였다.
두 군은 PRIT-0165와 Dex500을 동등한(1:1) 비(각각의 약제 100 또는 30 μg)로 수용하였다. 종양에서 생성된 %ID/g는 두 군 간에 유의한 차이가 없었다(언페어링된 t-검정, p = 0.726). 중요하게는, 상이한 여과 컷-오프를 사용하는 동일한 양의 Dex500 사이의 비교에서 더 높은 MW 컷-오프(32.5 ± 4.4%ID/g 대신 54.9 ± 6.9%ID/g)를 사용하여 종양 축적에서 상당한 이득을 보였다(언페어링된 t-검정, p = 0.009).
도 15는 30 또는 100 μg의 이중특이적 항체, 및 100 내지 30-kDa 여과 컷-오프를 갖는 10 내지 100 μg의 클리어링제를 사용하거나 클리어링제를 전혀 사용하지 않는 경우(PBS), 방사선표지된 DOTAM의 주사 24시간 후 212Pb의 분포를 도시한다.
도 16은 클리어링제(0 내지 100 μg)의 양이 증가함에 따라 혈액 및 종양에서 212Pb의 활성 농도에 대한 효과를 도시한다. 종양은 100 μg의 PRIT-0165, 이어서 4일 후 100-kDa 컷-오프 또는 PBS로 정용여과된 Dex500을 사용하여 사전-표적화되었다. 212Pb-DOTAM은 CA 투여 2시간 후에 투여되었다. 기호는 방사성 주사 24시간 후 %ID/g을 나타내고, 종양 데이터의 선형 회귀의 선을 나타낸다.
요약 및 결론
본 연구는 낮은 수준의 순환 방사능을 유지하면서 212Pb의 종양 축적의 급격한 증가를 나타냈다. 2개의 주요 발견은 다음과 같이 결론지어졌다: 1) 100 kDa 컷-오프를 사용하는 정용여과는 DOTAM-결합된 덱스트란 단편의 종양 침투를 유의하게 감소시켰고, 2) bsAb에 대한 CA의 비는 절대적인 CA 양보다 큰 결과에 영향을 주었다. 우수한 종양 대 혈액 비는 100 μg의 이중특이적 항체의 투여 후 10:1의 항체:CA 비를 사용하여 달성하였다. 또한, Dex500-기반 클리어링제를 사용하는 모든 향후 연구가 100 kDa 컷-오프를 사용하여 정용여과된 시약을 사용해야 한다는 결론을 내렸다.
실시예 23: 종양-회합 방사능에 대한 영향(프로토콜 95)
본 연구에서, 덱스트란-500을 기반으로 한 9개의 상이한 클리어링제를 종양에 대한 212Pb-DOTAM 회합의 억제에 관해 비교하였다. 더욱 구체적으로, 실험은 i) TCMC 포화, ii) 클리어링제 대 항체 비, 및 iii) 생산/정제 방법으로부터의 종양-회합된 방사능에 대한 영향을 평가하였다. 또한, 사전-표적화 또는 CA 없이 212Pb-DOTAM의 10 또는 30 μCi의 주사 후 종양 흡수를 비교하여 종양의 방사능 포화가 이미 낮은 선량에서 달성되었는지 여부를 평가하였다.
Figure pct00070
Figure pct00071
고형 이종이식편을 코닝(등록상표) 마트리겔(등록상표) 기저 막 매트릭스(성장 인자 감소됨, 카탈로그 번호 354230)와 1:1 혼합된 RPMI 매질에 BxPC3 세포(계대 20)의 피하 주사에 의해 확립하였다. 각각의 마우스(8주령)는 100 μL RPMI/마트리겔 중 5 x 106 세포를 우측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 세포 주사 15일 후, 마우스를 210 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다.
PRIT-0165(100 μL 당 100 μg), 및 이어서 3일 후 다양한 TCMC 치환(10 내지 100%)을 갖는 덱스트란-500-기반 클리어링제(100 μL 당 10 내지 170 μg)를 정맥내 투여하였다. 군 J 및 K는 클리어링제 대신 PBS를 수용하였다. 2시간 후, 마우스에 100 μL의 각각의 212Pb-DOTAM 용액(10 또는 30 μCi)을 i.v. 주사하였다.
212Pb-DOTAM의 주사 24시간 후 마우스를 희생시키고, 부검하였다. 혈액, 방광, 비장, 신장, 간, 폐, 근육, 꼬리 및 종양을 수집하고, 칭량하고, 방사능 함량을 측정하고, 후속적으로 %ID/g을 계산하였다.
결과, 95
생체분포 데이터는 투여된 양에 따라 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 수집된 조직에서 평균 방사능 함량(%ID/g + SD)의 명백한 경향을 나타냈고, 혈액 및 CA 양이 낮은 정상 조직에서 212Pb 농도가 더 높았다. 또한, 더 높은 212Pb 활성은 정상 조직 흡수의 상응하는 증가 없이 종양에서 더 높은 212Pb 축적을 야기하였다.
도 17은 212Pb-DOTAM의 주사 후 24시간에 선택되는 조직의 방사능 분포를 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3). 짙은 회색 및 흑색 막대는 후보 시약이 비교된 비-CA 양성 대조군을 나타낸다.
다중 비교에 대한 교정을 갖는 1-방향 ANOVA는 Dex500-(40%)(76.79 ± 33.28, p < 0.0001) 및 Dex500-(100%)(43.26 ± 24.66, p = 0.0115)만이 종양 대 혈액 비에 관해 10-μCi 음성 대조군(2.26 ± 0.25)과 유의하게 상이한 것으로 나타났다. 종양 대 혈액 비가 가장 높은 클리어링제(Dex500-(40%))와 이전 표준 (Dex500-(100%)) 사이의 인식된 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(언페이링된 t-검정, p = 0.2336).
도 18은 212Pb-DOTAM의 주사 24시간 후 혈액 및 종양의 212Pb 함량 및 상응하는 종양 대 혈액 비를 도시한다(%ID/g + SD, n = 3). 짙은 회색 및 흑색 막대는 후보 시약이 비교된 비-CA 양성 대조군을 나타낸다.
클리어링제(Dex500-(10%)) 양과 TCMC 로딩(비-CA, Dex500-(10%), Dex500-(20%), Dex500-(40%), Dex500-(100%))의 증가로 인한 종양 대 혈액 비에 대한 영향을 분석하기 위해 선형 회귀 및 다항식(입방) 곡선 정합을 수행하였다. 선형 곡선의 기울기는 증가된 종양 대 혈액 비에 대해 더 많은 양의 Dex500-(10%)에 유리하게 통계적으로 유의한 반면(p < 0.0001), 100 μg의 Dex500-(10%)를 기준으로 주사된 특정 양의 TCMC의 경우, 약 60의 TCMC 대 Dex500 비에서 최대 값이 표시되었다. 이러한 결과는 시약 양 또는 TCMC 포화도에 대한 일반적인 결론을 생성하기 위해 문맥에서 벗어나서는 안된다는 점에 유의해야하고, 적용된 설정에 대해서만 유효하다.
도 19는 CA 양(PJRD08-46) 및 TCMC 포화(9 대 1, 20 대 1, 39 대 1 또는 84대-1)의 함수로서 212Pb-DOIAM의 주사 24시간 후 종양 대 혈액 비를 도시한다. 점선은 각각의 데이터의 선형 회귀(R2 = 0.82) 및 비선형 곡선 정합(R2 = 0.74)을 나타낸다.
최종 시험는 항체 또는 클리어링제의 주사 없이 10 μCi의 212Pb-DOTAM 대 30 μCi의 212Pb-DOTAM을 비교하였다. 혈액내 함량은 두 연구 군에서 유사하였지만, 30 μCi는 10 μCi보다 더 높은 종양 축적을 야기하였다: 107.74 ± 14.71%ID/g 대 72.38 ± 10.83%ID/g(± SD, n = 3). 생성된 종양 대 혈액 비는 유의하게 상이하였다: 30 및 10 μCi에 대해 각각 3.20 ± 0.20 대 2.26 ± 0.25(언페어링된 t- 검정, p = 0.007).
요약 및 결론
결론적으로, 분자 당 39개의 TCMC를 갖는 20 μg의 Dex500(Dex500-(40%))은 212Pb-DOTAM 투여 24시간 후 혈액내 낮은 체류와 조합된 사전-표적화된 종양에서 212Pb의 매우 높은 축적을 생성하였다. 분자 당 84개의 TCMC를 갖는 이전 표준 CA인 Dex500-(100%)의 10 μg과 나란히 있는 가장 우수한 성능의 클리어링제였다. 상당한 군내 변동성과 작은 샘플 크기로 인해, 종양 대 혈액 비의 차이는 두 시약 간에 통계적으로 차이가 없었지만, 평균은 Dex500-(100%)가 유리할 수 있음을 나타낸다. 또한, 212Pb-DOTAM의 30 μCi가 10 μCi보다 더 높은 종양 축적을 생성할 수 있다는 결론을 내렸다. 즉, 낮은 투약량에서 포화에 도달하지 않았다.
실시예 24: 종양 축적에 대한 이중특이적 항체 투약량에 대한 영향(프로토콜 91)
본 연구는 피하 종양 모델에서 종양 축적에 대한 이중특이적 항체 용량에 대한 영향을 조사하는 것을 목표로 한다. 가설은 더 많은 양의 이중특이적 항체가 종양 세포에서 이용가능한 결합 부위를 더 용이하게 포화시켜 표지된 킬레이트의 후속 흡수를 증가시킬 수 있다는 것이었다. 반면에, 투약량을 과도하게 늘리면 순환하는 이중특이적 항체의 수준이 높아져 종양-회합 방사능이 덜 효율적으로 축적될 수 있다.
Figure pct00072
Figure pct00073
고형 이종이식편을 코닝(등록상표) 마트리겔(등록상표) 기저 막 매트릭스(성장 인자 감소됨, 카탈로그 번호 354230)와 1:1 혼합된 RPMI 매질에 BxPC3 세포(계대 34)의 피하 주사에 의해 확립하였다. 각각의 마우스(7 내지 12주령)에 100 μL RPMI/마트리겔의 5 x 106 세포를 우측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 세포 주사 5일 후, 마우스를 220 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다.
마우스에 100 μL 당 30 내지 200 μg의 농도의 CEA-결합 이중특이적 항체 PRIT-0165 또는 PRIT-0156 또는 100 μg의 비-CEA-결합 대조군 항체 PRIT-0175를 i.v. 투여하였다. 4일 후, 모든 군에 100 μL(주사된 항체 용량의 1/10) 당 3, 10 또는 20 μg의 농도의 클리어링제를 iv 주사하고, 2시간 후 10 μCi의 212Pb-DOTAM을 주사하였다. 마우스를 24시간 후에 희생시키고, 부검하였다. 혈액, 방광, 비장, 신장, 간, 폐, 근육, 꼬리 및 종양을 수집하였다. 샘플을 칭량하고, 방사능을 측정하고, %ID/g을 각각의 기관에 대해 계산하였다.
결과, 91
100 μg의 CEA-결합 이중특이적 항체를 사용한 사전-표적화는 100 μg의 비-CEA-결합 대조군(언페어링된 t-검정, 각각 PRIT-0156 및 PRIT-0156과의 비교에 대해 p = 0.027 및 0.008)에 비해 종양에서 212Pb의 유의한 축적을 야기하였다. CEA-결합 구축물에 대해 항체 투약량을 30 μg에서 200 μg으로 증가시켰을 때 종양 흡수에서 유의한 차이가 보이지 않았다. 그러나, 전체 방사능 수준은 30 μg 초과의 항체 투약량에 대해 대부분의 정상 조직에서 약간 증가하였다. 중요하게는, 혈액내 %ID/g는 100 내지 200 μg의 PRIT-0156을 제외하고는 각각의 투약량 증분에 대해 유의하게 증가하였다(언페어링된 t-검정, p < 0.05).
도 20은 방사선표지된 DOTAM의 주사 24시간 후의 212Pb의 분포를 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3). 백색 및 회색 배경의 막대는 각각 T84.66 및 CH1A1A의 표적화을 나타내고; 흑색 막대는 비-CEA-결합 대조군을 나타낸다.
요약 및 결론
3개의 항체 투약량 수준(30, 100 및 200 μg)은 모두 시험된 이중특이적 구축물 둘 다에 대한 종양에서 방사능의 높은 특이적인 흡수를 나타냈다. 증가된 투약량에 따른 종양 축적의 차이가 없다는 것은 결합 부위가 더 낮은 용량으로 이미 포화되었거나, FRIT 투여와 클리어링제 주사 사이의 시간(4일)이 추가 종양 축적을 허용하기에 너무 짧다는 것을 나타냈다. 예측한 바와 같이, 혈중 방사능 수준은 투약량 증가에 따라 증가하여 치료의 치료 범위가 약간 좁아졌다.
실시예 25: CEA-PRIT의 효능(프로토콜 93(a, b))
본 연구에서, 2개의 임상 bsAb 후보(FRIT-0213 및 FRIT-0214)를 사용한 CEA-PRIT의 효능은 2개의 병렬 피하 종양 모델인 BxPC3 및 LS174T에서 평가되었다. 이중특이적 항체는 단일- 및 이중-사이클 치료 요법에서 나란히 비교되었다.
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
군 A 내지 G는 효능 평가를 위해 추적된 처리된 마우스를 나타내는 반면, 군 H 내지 L은 마지막 212Pb-DOTAM 주사 24시간 후에 생체분포 목적을 위해 희생된 마우스를 포함한다.
Figure pct00077
Figure pct00078
고형 이종이식편을 코닝(등록상표) 마트리겔(등록상표) 기저 막 매트릭스(성장 인자 감소됨; 카탈로그 번호 354230)와 1:1로 혼합된 RPMI(BxPC3) 또는 DMEM(LS174T) 매질에서 세포의 피하 주사에 의해 확립하였다.
프로토콜 93a의 경우, 마우스(7주령)에 100 μL RPMI/마트리겔 중 5 x 106 BxPC3 세포(계대 33)를 우측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 세포 주사 12일 후, 마우스를 235 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다.
프로토콜 93b의 경우, 마우스(9주령)에 100 μL DMEM/마트리겔 중 1 x 106 LS174T 세포(계대 26)를 우측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 세포 주사 3일 후, 마우스를 150 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다.
각각의 치료 사이클은 인간화된 bsAb(PRIT-0213, PRIT-0214 또는 PRIT-0175)의 주사로 시작되었다. 4일 후, 클리어링제(Dex500)를 투여하고, 2시간 후 212Pb-DOTAM을 투여하였다. 치료 사이클 1 후, 방사성 소변/대변의 재흡수를 최소화시키기 위해, 우리를 212Pb-DOTAM 투여 4시간 후에 교체하고, 이어서 24시간 p.i에 다시 교체하였다. 사이클 2의 경우, 마우스를 212Pb-DOTAM 투여 후 4시간 동안 그릴 바닥이 있는 우리에 넣은 후, 표준 침구가 있는 새 우리로 옮겼다. 이어서, 모든 우리를 사이클 1 이후와 같이 24시간 p.i.에 교체하였다.
마우스의 종양 발생은 매주 3회 반복되는 캘리퍼링을 통해 추적되었다. 필요에 따라, 계획된 측정 사이의 간격에서 추가 캘리퍼링을 수행하였다. 동물의 체중을 동일한 방식으로 반복적으로 측정하였다. 종양 부피가 3,000 mm3에 도달한 마우스를 즉시 안락사시켰다. 윤리적 이유로 안락사를 고려한 다른 인자는 체중 감소, 종양 상태(예컨대, 궤양) 및 동물의 일반적인 외모였다. 모든 개인이 충분히 회복될 때까지 방사선 유발 독성으로 인한 체중의 급격한 손실(집단 또는 개인)이 필요한 경우, 방사능 주사 5일 후부터 모든 동물에게 습식 사료를 제공하였다.
안락사 시에 방광, 난소, 간, 비장, 신장, 대퇴부(골수를 포함함), 결장, 공장, 위, 종양 등의 기관 및 조직을 군 A 내지 G에서 수확하였다. 예상치 못한 또는 비정상적인 상태가 기록되고 촬영되었다. 조직을 즉시 10% 중성 완충된 포르말린(4℃)에 넣고, 이어서 5일 후 PBS(4℃)로 옮겼다. 포르말린-고정 샘플을 추가 처리 및 분석을 위해 로슈 파마 리서치 및 얼리 디벨롭먼트, 로슈 이노베이션 센터 바젤(Roche Pharma Research and Early Development, Roche Innovation Center Basel)로 선적하였다.
군 H, J 및 L의 마우스를 212Pb-DOTAM의 최초 및 유일한 주사 24시간 후에 희생시키고, 부검하였고; 군 I 및 K를 제2 212Pb-DOTAM 주사 24시간 후에 희생시키고, 부검하였다. 하기 기관과 조직을 수확하였다: 혈액, 방광, 소장, 결장, 비장, 췌장, 신장, 간, 폐, 심장, 대퇴부, 근육, 꼬리 및 종양. 수집된 샘플을 칭량하고, 방사능을 측정하고, 후속적으로 붕괴 및 배경에 대한 교정을 포함하여 조직 1 g 당 주사된 선량 백분율(%ID/g)을 계산하였다.
결과, 93a
치료 사이클 1 이후의 결과는 높은 종양 축적(각각 PRIT-0213 및 PRIT-0214에 대해 25.0 ± 9.7%ID/g 및 19.5 ± 6.4%ID/g) 및 정상 조직에서의 낮은 축적과 함께 본 모델에서 이전에 달성된 조직 흡수와 잘 일치하였다. 그러나, 사이클 2는 수집된 모든 조직에서 증가된 방사능 함량과 함께 상이한 212Pb 분포 프로파일을 야기하였다.
도 21은 BxPC3 모델에서 치료 사이클 1 및 2에 대해 212Pb-DOTAM 주사 24시간 후 선택되는 조직의 방사능 분포를 도시한다(%ID/g ± SEM, n = 3).
30 μCi의 212Pb-DOTAM을 주사한 모든 마우스는 제1 방사능 주사 후 10일까지 완화된 체중의 초기 감소를 경험하였다. 제2 30 μCi 주사를 투여받은 군은 방사능의 더 느린 클리어런스와 연관된 사이클-2 생체분포에서 관찰된 정상 조직에서 212Pb의 생성된 축적으로 인해 더욱 뚜렷하고 급격한 체중 감소를 겪었다. 10 μCi의 제2 주기를 수용한 군에서는 이러한 효과가 관찰되지 않았고, 이어서 체중 감소는 보통였다.
도 22는 BxPC3 모델에서 CEA-PRIT 후 군 A 내지 G(n = 8)의 평균 체중을 도시한다. 곡선은 각각의 군에서 처음 사망할 때 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
도 23은 BxPC3 모델에서 CEA-PRIT 후 군 A 내지 G(n = 8)의 평균 체중 변화를 도시하고, 초기 체중의 백분율로 표시된다. 곡선은 각각의 군에서 처음 사망할 때 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
모든 군은 기준선과 비교하여 14 내지 19일까지 종양 부피가 2배로 늘었다. 제1 212Pb-DOTAM 치료는 16일에 제공되었고, 이어서 PRIT-0213 및 PRIT-0214 군의 종양은 약 1주일 동안 계속 성장한 후, 부피의 회귀를 나타냈다. 종양이 완전히 회귀된 것은 없었지만, 부피는 기준선과 비교하여 다시 한 번 2배 부피에 도달할 때, 40 내지 47일까지 낮은 수준에서 비교적 일정하게 유지되었다. 제2 30 μCi 212Pb-DOTAM 주사를 이 시점(44일)에 투여하고, 이는 이전에 논의된 바와 같이 다음 주 내에 대부분의 영향을 받은 마우스에 대해 급성 체중 감소 및 후속 안락사를 야기하였다. 30 μCi의 212Pb-DOTAM(55 일) 대신 10 μCi로 제2 치료 사이클을 제공받은 마우스는 방사선-유발 독성이 더 적었다. 10 μCi 주사는 약 58일과 75일 사이에 지속되는 제2 단계의 종양 퇴행을 야기하였다. 비-특이적 bsAb를 사용한 PRIT는 212Pb-DOTAM 단독 또는 PBS와 비교하여 유의하지만 제한적인 종양 성장 억제를 야기하였다. 던넷(Dunnet)의 방법을 사용한 평균 비교는 PRIT-0213 및 PRIT-0214를 사용하는 모든 치료 섭생법이 23 내지 26일 이후에 두 대조군과 비교하여 모두 유의하게 상이한, 동등한 치료 대 대조군 비를 야기하였다.
모든 치료 군이 여전히 존재하는 마지막 날인 47일에, 종양 성장 억제(TGI)는 군 "PRIT-0213, 30 + 10 μCi", "PRIT-0213, 30 + 30 μCi", "PRIT-0214, 30 + 10 μCi", "PRIT-0214, 30 + 30 μCi", "PRIT-0175, 30 + 30 μCi" 및 "DOTAM 단독, 30 + 30 μCi"에 대해 각각 PBS와 비교하여 87.3, 88.8, 84.1, 88.7, 57.5 및 15.8%였다. 비히클 대조군의 마지막 마우스는 66일에 계산되었고, 이때 TGI는 나머지 3개 군에 대해 각각 87.8, 84.5 및 87.3%였다: "PRIT-0213, 30 + 10 μCi", "PRIT-0214, 각각 30 + 10 μCi" 및 "PRIT-0214, 30 + 30 μCi". 실험이 끝날 때까지 총 6 마리의 마우스가 생존하였다(84일): 군 "PRIT-0213, 30 + 10 μCi"에서 1 마리, 군 "PRIT-0214, 30 + 10 μCi"에서 3 마리, 군 "PRIT-0214, 30 + 30 μCi"에서 2 마리.
도 24는 BxPC3 모델(n = 8)에서 군 A 내지 G에 대한 표준 오차와 함께 종양 성장 평균을 도시한다. 곡선은 각각의 군에서 처음 사망할 때 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
도 25는 BxPC3 모델에서 군 A 내지 G에 대한 개별 종양 성장 곡선을 도시한다. 수직 점선은 212Pb-DOTAM의 투여를 나타낸다.
도 26은 BxPC3 모델(n = 8)에서 군 A 내지 G의 생존을 나타내는 카플란-마이어 곡선을 도시한다. 수직 점선은 212Pb-DOTAM의 투여를 나타낸다.
생존에 관해 유의하게 상이한 군을 특정하기 위해 페어와이즈 시험을 수행하였다: 로그-랭크(Log-Rank) 시험(이후 생존 이벤트에 더 많은 가중치) 및 윌콕슨(Wilcoxon) 시험(초기 생존 시간에 더 많은 가중치), 둘 다 다중 시험을 위한 본페로니(Bonferroni) 교정을 사용함. 방사선-유발 독성으로 인해, "PRIT-0213, 30 + 30 μCi"는 대조군과 같거나 더 나쁘게 수행되었다. 상응하는 PRIT-0214 치료는 PBS 및 비-특이적 항체에 비해 생존율이 증가하면서 약간 더 나은 결과를 달성하였다. 제2 사이클에서 10 μCi의 212Pb-DOTAM에 의한 두 군은 서로 "PRIT-0214, 30 + 30 μCi"를 제외하고 모든 군에 비해 생존율을 크게 증가시켰다.
Figure pct00079
Figure pct00080
결과, 93b
치료 사이클 둘 다 정상 조직에서 높은 212Pb 종양 축적과 낮은 212Pb 축적을 야기하였다. 사이클 1 후 종양 흡수는 PRIT-0213 및 PRIT-0214에 대해 각각 30.9 ± 2.9%ID/g 및 21.4 ± 1.9%ID/g였고; 사이클 2 후, 상응하는 수는 33.2 ± 0.7%ID/g 및 40.1 ± 6.5%ID/g였다.
도 27은 LS174T 모델에서 치료 사이클 1 및 2에 대해 212Pb-DOTAMml 주사 24시간 후 선택되는 조직의 방사능 분포를 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3).
212Pb-DOTAM을 주사한 모든 마우스는 둘 다 30 μCi 치료 사이클 후 유사하게 체중이 완만하게 감소하였다. 그러나, 많은 동물은 불량한 종양 상태로 인해 윤리적인 이유로 조기 안락사되었다.
도 28은 LS174T 모델에서 CEA-PRIT 후 군 A 내지 G(n = 8)의 평균 체중을 도시한다. 곡선은 각각의 군에서 처음 사망할 때 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
도 29는 LS174T 모델에서 CEA-PRIT 후 군 A 내지 G(n = 8)의 평균 체중 변화를 도시하고, 초기 체중의 백분율로 표시된다. 곡선은 각각의 군에서 처음 사망할 때 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
제1 212Pb-DOTAM 치료는 8일에 제공되었다. 기준선에 비해 종양이 퇴행하지 않았지만, PRIT-0213 및 PRIT-0214 군 평균은 비교적 일정하게 유지되어 매우 느리게 증가하였다. 제2 30 μCi 212Pb-DOTAM 주사는 36일에 투여되었지만, 대조군의 빠른 종양 성장과 이전에 논의된 모든 군에서 불량한 종양 상태를 갖는 문제로 인해 많은 마우스가 이미 그 전에 안락사되었다. 212Pb-DOTAM의 제2 30 μCi 주사를 수용한 것들은 종양 조절을 회복하거나 유지했지만, 종양이 완전히 퇴행하지 않았다. 던넷 방법을 사용하는 평균 비교는 PRIT-0213 및 PRIT-0214를 사용하는 모든 치료 섭생법이 4일부터 시작하여, PBS 군과 비교하여 유의하게 상이한 치료군 대 대조군 비를 야기하였음을 나타냈다. 또한, PRIT-0175 및 DOTAM 대조군은 각각 16일 및 22일부터 시작하여 비히클 대조군과 유의하게 달랐다.
모든 치료군이 여전히 존재하는 마지막 날인 22일에, TGI는 PBS와 비교하여, 군 "PRIT-0213, 30 μCi", "PRIT-0213, 30 + 30 μCi", "PRIT-0214, 30 μCi", "PRIT-0214, 30 + 30 μCi", "PRIT-0175, 30 + 30 μCi" 및 "DOTAM 단독, 30 + 30 μCi"에 대해 각각 83.1, 88.8, 87.5, 91.0, 53.0 및 64.7%였다. 비히클 대조군의 마지막 마우스는 30일에 계산되었고, 이때 TGI는 나머지 군 "PRIT-0213, 30 μCi", "PRIT-0213, 30 + 30 μCi", "PRIT-0214, 30 μCi", "PRIT-0214, 30 + 30 μCi" 및 "PRIT-0175, 30 + 30 μCi"에 대해 각각 92.5, 89.5, 90.8, 92.6 및 79.9%였다. 둘 다 군 "PRIT-0214, 30 + 30 μCi"로부터의 2 마리의 마우스는 실험이 끝날 때까지 생존하였다(101일).
도 30은 LS174T 모델에서 군 A 내지 G(n = 8)에 대한 표준 오차와 함께 종양 성장 평균을 도시한다. 곡선은 각각의 군에서 처음 사망할 때 절두되었다. 수직 점선은 연구 디자인에 따른 일부 또는 모든 군에 대한 212Pb-DOTAM 투여를 나타낸다.
도 31은 LS174T 모델에서 군 A 내지 G에 대한 개별 종양 성장 곡선을 도시한다. 수직 점선은 212Pb-DOTAM의 투여를 나타낸다.
도 32는 LS174T 모델(n = 8)에서 군 A 내지 G의 생존을 나타내는 카플란-마이어 곡선을 도시한다. 수직 점선은 212Pb-DOTAM의 투여를 나타낸다.
로그-랭크 및 윌콕슨 검정은 본페로니 교정으로 수행하여 생존에 관하여 유의한 차이가 있는 군을 특정하였다. 주요 발견은 "PRIT-0214, 30 + 30 μCi"가 "PRIT-0213, 30 μCi"를 제외한 모든 군에 비해 생존율을 유의하게 증가시켰다는 것이다. 그러나, 군 "PRIT-0213, 30 + 30 μCi"의 전체 생존율은 "PRIT-0213, 30 μCi"의 생존율과 유의하게 상이하지 않았고, 이에 따라 "PRIT-0214, 30 + 30 μCi"와 단지 약간 달랐다.
Figure pct00081
Figure pct00082
요약 및 결론
2개의 이중특이적 항체 PRIT-0213 및 PRIT-0214 중 하나를 사용하는 CEA-PRIT는 1회 또는 2회 치료 사이클을 갖고, 연구된 종양 모델 둘 다에 대해 유의한 종양 성장 억제 및 생존 증가를 야기하였다. BxPC3 연구에서 예상치 못한 제2 사이클 212Pb 생체분포 및 후속 방사선-유발 독성에 따른 문제해결 노력은 상황이 확인되지 않은 주사-관련 문제로 인해 발생했을 가능성이 높다는 결론을 내렸다. BxPC3 효능 연구를 반복하여 문제가 치료 섭생법에 내재된 것이 아님을 확인해야 한다. LS174T 모델의 향후 실험은 불량한 종양 상태의 문제가 해결될 때까지 수행되지 않아야 한다. 제2 치료 사이클의 효능을 증가시키기 위해, 종양 재성장을 방지하기 위해 두 사이클 사이의 타이밍을 단축하는 것이 제안된다. 또한, 제3 치료 사이클을 섭생법에 추가하는 것도 추가 평가를 위한 옵션일 수 있다.
마지막으로, 종양 성장의 기본 메커니즘에 대한 연구는 종양 성장이 분명히 억제되었지만, 종양이 완전히 퇴행하지 않고, 대신 일정 시간 후에 다시 자라기 시작하는 이유를 명확히 하는 데 큰 관심이 있다.
실시예 26: 클리어링제 투약량(프로토콜 105)
본 연구에서, 50% TCMC 포화를 갖는 덱스트란-500-기반 클리어링제의 투약량 범위는 사전-표적화된 종양에 대한 212Pb-DOTAM 회합에 대한 효과에 관해 평가되었다.
Figure pct00083
Figure pct00084
고형 이종이식편은 코닝(등록상표) 마트리겔(등록상표) 기저 막 매트릭스(성장 인자 감소된, 카탈로그 번호 354230)와 1:1 혼합된 RPMI 매질 중 BxPC3 세포(계대 26)의 피하 주사에 의해 확립하였다. 각각의 마우스(6주령)에 100 μL RPMI/마트리겔 중 5 x 106 세포를 우측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 세포 주사 15일 후, 마우스를 222 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다.
CEA-PRIT(100 μL 당 100 μg)를 정맥내 투여하고, 이어서 3일 후 Dex500- (50%)(100 μL 당 5 내지 250 μg)를 투여하였다. 군 F는 클리어링제 대신 PBS를 수용하였다. 2시간 후, 마우스에 100 μL의 212Pb-DOTAM(10 μCi)을 i.v. 주사하였다.
212Pb-DOTAM의 주사 24시간 후 마우스를 희생시키고, 부검하였다. 혈액, 방광, 비장, 신장, 간, 폐, 근육, 꼬리 및 종양을 수집하고, 칭량하고, 방사능 함량을 측정하고, 후속적으로 %ID/g을 계산하였다.
결과, 105
212Pb의 종양 축적은 250 μg을 제외한 모든 CA 투약량에서 일반적으로 높았다. CEA-PRIT 이중특이적 항체의 혈액 클리어런스는 30, 75 및 250 μg의 CA 투약량에 대해 가장 효율적였다. 결과적으로, 30, 75 및 250 μg의 CA에 대해 각각 187.7, 180.2 및 243.5의 가장 높은 종양 대 혈액 비가 달성되었다. 212Pb의 상응하는 종양 흡수는 91.8 ± 18.9%ID/g, 70.5 ± 11.1%ID/g 및 35.2 ± 17.0%ID/g(± SD, n = 3)였다.
도 33은 212Pb-DOTAM의 주사 24시간 후에 선택되는 조직의 방사능 분포를 도시한다(%ID/g + SD, n = 3). 회색 막대는 다양한 양의 Dex500-(50%) CA 주사 후 조직 축적을 나타내고; 흑색 막대는 비-CA 대조군을 나타낸다.
도 34는 212Pb-DOTAM의 주사 24시간 후 혈액 및 종양의 212Pb 함량 및 상응하는 종양 대 혈액 비를 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3). 회색 막대는 다양한 양의 Dex500-(50%) CA 주사 후 조직 축적을 나타내고; 흑색 막대는 비-CA 대조군을 나타낸다.
요약 및 결론
종양에서 달성된 212Pb 축적, 혈액 클리어런스 및 후속 종양 대 혈액 비에 기초하여, 30 μg의 Dex500-(50%)의 투약량이 BxPC3 모델에서 CEA-PRIT에 유리한 것으로 나타났다.
실시예 27: 덱스트란-500-기반 클리어링제의 혈중 체류 시간(프로토콜 106)
본 연구에서, TCMC 포화도가 50%인 덱스트란-500-기반 클리어링제를 혈중 체류 시간에 관해 평가하였다. 목표는 반복된 치료(1 내지 4주)에 적합한 시간 프레임을 확인하여 투여된 이중특이적 항체에 결합할 수 있는 클리어링제가 순환에 거의 또는 전혀 남아있지 않도록 하여, 후속적으로 주사된 방사선표지된 DOTAM의 결합을 효과적으로 차단하는 것이었다.
Figure pct00085
Figure pct00086
마우스(9주)에 CEA-PRIT(100 μL 당 100 μg), 및 이어서 1일 후에 Dex500-(50%)(100 μL 당 25 μg)를 i.v. 투여하였다. 군 B, D, F 및 H는 클리어링제 대신 PBS를 수용하였다. 1, 2, 3 또는 4주 후, 마우스에 CEA-PRIT(100 μL 당 100 μg), 및 이어서 1일 후, 100 μL의 212Pb-DOTAM(10 μCi)을 i.v. 재주사하였다.
212Pb-DOTAM의 주사 4시간 후 마우스를 희생시켰다. 안락사시 혈액을 수집하고, 샘플을 칭량하고, 방사능 함량을 측정하였다. 붕괴 및 배경에 대한 교정을 포함하여 혈액 1 g 당 주사된 선량 백분율(%ID/g)을 계산하였다.
결과, 106
연구된 시점에 대해 Dex500-(50%) 또는 PBS를 수용한 마우스 사이에 평균 방사능 함량에 통계적으로 유의한 차이가 없었다(1-방향 ANOVA, 사이닥(Sidak)의 다중 비교 시험, p > 0.05).
도 35는 212Pb-DOTAM의 주사 4시간 후 혈중 방사능 함량을 도시한다(%ID/g ± SD, n = 3).
요약 및 결론
결과는 반복된 CEA-PRIT 치료 사이클이 후속적으로 투여된 212Pb-DOTAM과 CEA-DOTAM bsAb의 결합을 차단하지 않고 Dex500-(50%)의 마지막 주사 1주 후에 이미 시작될 수 있음을 도시한다.
실시예 28: 이중특이적 항체의 추가 형식
항체 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현을 위한 플라스미드의 생성
인간 배아 신장 세포(HEK 293)의 일시적 형질감염에 의해 목적 단백질을 발현시켰다. 목적 유전자/단백질[예컨대, 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 또는 추가 도메인(예컨대, C-말단에 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인)을 함유하는 전장 항체 중쇄]의 발현을 위해, 하기 기능적 요소를 포함하는 전사 단위를 사용하였다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 거대세포 바이러스(P-CMV)로부터의 즉각적인 조기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열(SS),
- 발현될 유전자/단백질
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
발현되는 유전자를 포함하는 발현 유닛/카세트 이외에, 기본/표준 포유동물 발현 플라스미드는 플라스미드를 대장균에서 복제할 수 있는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및 대장균에 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 함유하였다.
P1AE1766
완전하고 기능적인 항체 중쇄를 포함하는 C-말단 융합 유전자를 포함하는 항체 중쇄 코딩 유전자, 및 이어서 추가 항체 VL-CH1 또는 VH-C-카파 도메인을 각각 인간 IgG 분자의 CH3 도메인의 C-말단에 대한 G4Sx4 연결기에 의해 분리된 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 융합하여 조립하였다(VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VL-CH1 또는 VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VH-Ck). 두 CH3 도메인의 C-말단에 각각 하나의 VL-CH1 및 하나의 VH-Ck 도메인을 갖는 재조합 항체 분자는 놉-인투-홀 기술을 사용하여 발현되었다.
완전하고 기능적인 항체 경쇄를 포함하는 유전자를 코딩하는 항체 경쇄는 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 융합함으로써 조립되었다.
P1AE1768
CEA 또는 DOTAM을 표적으로 하는 완전하고 기능적인 항체 중쇄를 포함하는 유전자를 코딩하는 항체 중쇄는 놉-인투-홀 기술을 사용하여 조립되었다.
완전하고 기능적인 항체 경쇄를 포함하는 유전자를 코딩하는 항체 경쇄는 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 융합함으로써 조립되었다. 크로스-mab 기술을 사용하여 정확한 연결이 보장되었다(아암 중 하나에 대해 CL 및 CH1 도메인을 교환함).
P1AE1769
융합 유전자는 G4Sx4 연결기를 통해 VH-CH1 도메인을 코딩하는 DNA 단편을 VH 도메인에 대한 VL 도메인의 교환을 포함하는 인간 IgG 분자의 VL 도메인의 N-말단에 융합함으로써 조립되었다(따라서, 구조 VH-CH1-연결기-VL-CH1-힌지-CH2-CH3을 코딩하는 융합 유전자를 제조함). 각각 하나의 VH-CH1을 보유하고 N-말단에서 융합되지 않은 재조합 항체 분자는 놉-인투-홀 기술을 사용하여 발현되었다.
완전하고 기능적인 항체 경쇄를 포함하는 유전자를 코딩하는 항체 VH-C 카파는 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 융합함으로써 조립되었다.
완전하고 기능적인 항체 경쇄를 포함하는 유전자를 코딩하는 항체 경쇄는 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 융합함으로써 조립되었다.
크로스-mab 기술을 사용하여 정확한 회합이 보장되었다.
P1AE1767
완전하고 기능적인 항체 중쇄를 포함하는 C-말단 융합 유전자를 포함하는 항체 중쇄 코딩 유전자, 및 이어서 추가 항체 V-경쇄-CH1 도메인을 G4Sx4 연결기에 의해 각각 분리된 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 인간 IgG 분자의 CH3 도메인의 C-말단에 융합하여 조립하였다(VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VL-CH1). 각각 하나의 VL-CH1을 보유하고 두 CH3 도메인의 C-말단에서 융합되지 않은 재조합 항체 분자를 놉-인투-홀 기술을 사용하여 발현하였다.
완전하고 기능적인 항체 경쇄를 포함하는 유전자를 코딩하는 항체 VH-C 카파는 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 융합함으로써 조립되었다.
완전하고 기능적인 항체 경쇄를 포함하는 유전자를 코딩하는 항체 경쇄는 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 융합함으로써 조립되었다.
크로스-mab 기술을 사용하여 정확한 회합이 보장되었다.
P1AE1770
완전하고 기능적인 항체 중쇄를 포함하는 C-말단 융합 유전자를 포함하는 항체 중쇄 코딩 유전자, 및 이어서 추가 항체 V-경쇄-C-마파-연결기-V-중쇄-CH1 도메인을 포함하는 유전자를 코딩하는 항체 중쇄를, G4Sx4 연결기에 의해 각각 분리된 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 인간 IgG 분자의 CH3 도메인의 C-말단에 융합함으로써 조립하였다(VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VL-Ck-연결기-VH-CH1). 하나의 단일-쇄 Fab를 보유하고 2개의 CH3 도메인의 C-말단에서 각각 융합되지 않은 재조합 항체 분자는 놉-인투-홀 기술을 사용하여 발현되었다.
완전하고 기능적인 항체 경쇄를 포함하는 유전자를 코딩하는 항체 경쇄는 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 융합함으로써 조립되었다.
항체 분자의 일시적인 발현
항체 분자는 F17 매질(인비트로겐 코포레이션)에서 배양된 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포(인간 배아 신장 세포주 293-유래됨)에서 생성되었다. 형질감염 "293-부재"를 위해, 형질감염 시약(노바겐)이 사용하였다. 전술된 각각의 항체 중쇄 및 경쇄 분자는 개별 발현 플라스미드로부터 발현되었다. 제조사의 설명서에 특정된 대로 형질감염을 수행하였다. 면역글로불린-함유 세포 배양 상청액을 형질감염 후 3일 내지 7일에 수확되었다. 상청액은 정제할 때까지 감소된 온도(예컨대, -80℃)에서 저장되었다.
예컨대, HEK293 세포에서 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반 정보는 문헌[Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203]에 제공된다.
Figure pct00087
분자는 맙실렉트 슈어(MabSelect Sure)(친화도 크로마토그래피), 및 이어서 슈퍼덱스 200(크기 배제 크로마토그래피)에 의해 정제되었다.
상이한 형식의 DOTAM-결합 특성의 킨엑사 평가
친화도 결정에 대한 자세한 분석을 위해 킨엑사를 사용하였다.
계측 및 재료
오토 샘플러가 장착된 사피다인 인스트루먼츠(미국 인디애나주 보이시 소재)의 킨엑사 3200 기기를 사용하였다. 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 비드를 사피다인에서 구입한 반면, PBS(포스페이트 완충된 염수), BSA(소 혈청 알부민 분획 V) 및 항-DOTAM 항체를 사내(로슈)에서 제조하였다. 딜라이트650(등록상표)-접합된 친화도-정제된 염소 항-인간 IgG-Fc 단편 교차-흡착된 항체를 베틸 래보러토리즈(Bethyl Laboratories, 미국 텍사스주 몽고메리 소재)에서 구입하였다. 비오틴화된 Pb-DOTAM 항원(Pb-DOTAM-알킬-비오틴 이성질체 A 및 B, Pb-DOTAM-Bn-비오틴/TCMC-Pb-dPEG3-비오틴, 이성질체 A 및 B) 및 비-비오틴화된 Pb-DOTAM을 아레바 메드(미국 메릴랜드주 베데스다 소재)로부터 수득하였다.
항원 코팅된 비드의 제조
PMMA 비드를 비오틴화된 분자(사피다인)에 대한 킨엑사 핸드북 프로토콜에 따라 코팅하였다. 간단히 말해서, 먼저, 흡착 코팅을 위해 1 mL PBS(pH 7.4) 중 10 μg의 비오틴-BSA(써모 사이언티픽)를 비드(200 mg) 바이알 당 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 회전시킨 후, 상청액을 제거하고, 1 mL PBS로 비드를 5회 세척하였다. 두 번째로, 10 mg/mL BSA를 함유하는 PBS 중 100 μg의 뉴트라비딘 비오틴-결합 단백질(써모 사이언티픽) 1 mL를 비드에 첨가하고, 실온에서 추가 2시간 동안 항온처리하여 뉴트라비딘을 비드에 커플링시켜 비오틴화된 단백질의 후속 결합을 위한 추가 비오틴 결합 부위를 제공한다. 이어서, 뉴트라비딘-코팅된 비드를 1 mL PBS로 5회 세정하였다. 마지막으로, 비드를 PBS 중 200 ng/mL 비오틴화된 Pb-DOTAM-이성질체 혼합물(각각의 이성질체에 대해 50 ng)로 코팅하고, 실온에서 추가로 2시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 비드를 30 mL PBS에 재현탁하고, 즉시 사용하였다.
킨엑사 평형 분석
모든 킨엑사 실험을 PBS pH 7.4를 실행 완충액으로 사용하여 실온(RT)에서 수행하였다. 샘플을 1 mg/mL BSA("샘플 완충액")가 보충된 실행 완충액에서 제조하였다. 0.25 mL/분의 유량을 사용하였다. 5 pM 결합 부위 농도를 갖는 일정한 양의 항-DOTAM 항체를 100 pM에서 시작하여 2배 연속 희석하여 Pb-DOTAM 항원으로 적정하였다(농도 범위 0.049 내지 100 pM). 항원이 없는 항체의 한 샘플을 100% 신호(즉, 억제되지 않음)로 사용하였다. 항원-항체 복합체를 평형에 도달할 수 있도록 24시간 이상 동안 실온에서 항온처리하였다. 이어서, 평형화된 혼합물을 킨엑사 시스템에서 5 mL 부피로 Pb-DOTAM-커플링된 비드의 컬럼을 통해 추출하여 결합되지 않은 항체가 용액의 평형 상태를 교란시키지 않고 비드에 의해 포획되도록 하였다. 포획된 항체를 샘플 완충액 중 250 ng/mL 딜라이트 650(등록상표)-접합된 항-인간 Fc-단편 특이적 2차 항체를 사용하여 검출하였다. 각각의 샘플을 모든 평형 실험에 대해 중복으로 측정하였다.
KD는 "표준 분석" 방법을 사용하여 킨엑사 소프트웨어(버전 4.0.11)에 함유된 단일 부위 동종 결합 모델을 사용하여 데이터의 비선형 회귀 분석으로부터 수득하였다. 소프트웨어는 KD를 계산하고, 데이터 포인트를 이론적 KD 곡선에 정합시켜 95% 신뢰 구간을 결정한다. 95% 신뢰 구간(사피다인 테크노트 TN207R0)은 KD 낮음 및 KD 높음으로 제공된다.
Figure pct00088
모든 구축물은 신뢰 구간이 중첩되므로 KD에서 비교할 수 있다.
상이한 형식의 분자 서열:
임의적인 전하 변형은 굵은 글자와 밑줄로 제시된다: EQ->RK 또는 KK->EE
P1AE1766
> CEA 경쇄 RK
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> DOTAM VL/CH1을 갖는 CEA 중쇄
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> DOTAM VH/CK를 갖는 CEA 중쇄
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P1AE1767
> VH/CK를 갖는 DOTAM "LC"
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> CEA 경쇄 RK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD RK LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> DOTAM VL/CH1을 갖는 CEA 중쇄
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> CEA 중쇄
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV E DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD E KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
P1AE1768
> CEA LC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD RK LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> VL/CH1을 갖는 DOTAM 중쇄
IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
> CEA 중쇄
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV E DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD E KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
> DOTAM "LC" VH/CK
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P1AE1769
> VH/CK를 갖는 DOTAM "LC"
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> CEA LC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD RK LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> CEA VH/CH1/DOTAM VL/CH1을 갖는 CEA HC
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV E DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD E KVEPKSCDGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
> CEA HC
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV E DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD E KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
P1AE1770
> CEA LC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD RK LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> DOTAM scFab를 갖는 CEA HC: DOTAM VL/Ck/연결기/VH CH1
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> CEA HC
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV E DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD E KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
실시예 29: Pb-DOTAM 및 CD20 또는 HeR2에 결합하는 이중특이적 항체
항체 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현을 위한 플라스미드의 생성
인간 배아 신장 세포(HEK 293)의 일시적인 형질감염에 의해 목적 단백질을 발현시켰다. 목적 유전자/단백질[예컨대, 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 또는 추가 도메인(예컨대, C-말단의 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인)을 함유하는 전장 항체 중쇄]의 발현을 위해, 하기 기능적 요소를 포함하는 전사 단위를 사용하였다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 거대세포 바이러스(P-CMV)의 즉각적인 조기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열(SS),
- 발현될 유전자/단백질, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
발현되는 목적 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트 이외에, 기본/표준 포유동물 발현 플라스미드는 이러한 플라스미드를 대장균에서 복제할 수 있는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및 대장균에 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 함유하였다.
a) 항체 중쇄를 위한 발현 플라스미드
완전하고 기능적인 항체 중쇄를 포함하는 C-말단 융합 유전자를 포함하는 항체 중쇄 코딩 유전자, 및 이어서 추가 항체 V-중쇄 또는 V-경쇄 도메인을 인간 IgG 분자의 CH3 도메인의 C-말단에 대한 G4Sx4 연결기에 의해 각각 분리된 각각의 서열 요소(V-중쇄 또는 V-경쇄)를 코딩하는 DNA 단편을 융합하여 조립하였다(VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VH 또는 VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VL). 각각 두 CH3 도메인의 C-말단에 하나의 VH 및 하나의 VL 도메인을 갖는 재조합 항체 분자를 놉-인투-홀 기술을 사용하여 발현하였다.
HEK293 세포의 C-말단 VH 또는 VL 도메인을 갖는 항체 중쇄의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 C-말단 VH 또는 VL 도메인 발현 카세트를 갖는 항체 중쇄 단편 이외에 벡터 pUC18로부터의 복제 기점(대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용함), 및 대장균에 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다. C-말단 VH 또는 VL 도메인 융합 유전자를 갖는 항체 중쇄 단편의 전사 단위는 하기 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 거대세포 바이러스(P-CMV)의 즉각적인 조기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 핵산을 코딩하는 항체 중쇄(VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VH 또는 VH-CH1-힌지-CH2-CH3-연결기-VL), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
C-말단 VH 또는 VL 도메인 융합 단백질을 갖는 성숙한 항체 중쇄 단편의 아미노산 서열은 다음과 같다:
P1AD9826 → CD20-DOTAM
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIK
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSS
P1AD9827 → ERBB2-DOTAM
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EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSS
b) 항체 경쇄를 위한 발현 플라스미드
완전하고 기능적인 항체 경쇄를 포함하는 유전자를 코딩하는 항체 경쇄는 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 융합함으로써 조립되었다.
항체 경쇄의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 항체 경쇄 단편 이외에 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및 대장균에 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다. 항체 경쇄 단편의 전사 단위는 하기 기능적 요소를 포함한다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 거대세포 바이러스(P-CMV)의 즉각적인 조기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 핵산을 코딩하는 항체 경쇄(VL-CL), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
P1AD9827 → ERBB2-DOTAM
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P1AD9826 → CD20-DOTAM
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항체 분자의 일시적인 발현
항체 분자는 F17 매질(인비트로겐 코포레이션)에서 배양된 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포(인간 배아 신장 세포주 293-유래됨)에서 생성되었다. 형질감염을 위해, "293-부재" 형질감염 시약(노바겐)을 사용하였다. 전술된 각각의 항체 중쇄 및 경쇄 분자는 개별적인 발현 플라스미드로부터 발현되었다. 제조사의 설명서에 특정된 바와 같이 형질감염을 수행하였다. 면역글로불린-함유 세포 배양 상청액을 형질감염 3 내지 7일 후에 수확하였다. 상청액을 정제할 때까지 감소된 온도(예컨대, -80℃)에서 저장하였다.
예컨대, HEK293 세포에서 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 문헌[Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203]에 제공된다.
항체 분자 P1AD8926 및 P1AD8927의 정제
PRIT 분자를 맙실렉트 슈어(친화도 크로마토그래피), 및 이어서 슈퍼덱스 200(크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다:
Figure pct00089
질량 분석:
PRIT 분자의 정체를 확인하기 위해 ESI-MS를 사용하였다.
Figure pct00090
P1AD8927 기능의 FACS 분석
P1AD8927의 기능을 평가하기 위해, 10분 동안 37℃에서 아쿠타제를 사용하여 KPL-4 세포를 배양 용기에서 분리하였다. 이어서, 세포를 PBS에서 2회 세척하고, 4 x 106 세포/웰의 최종 밀도로 96-웰 v-바닥 플레이트에 시딩하였다.
항체를 제논(Zenon)<인간 IgG>A488로 사전 표지하고, 도 38에 표시된 농도로 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 얼음에서 1시간 동안 항온처리하고, PBS에서 2회 세척하고, FACS 칸토를 사용하는 FITC 형광의 측정을 위해 200 μL PBS/5% FCS에 재현탁하였다.
결과는 도 38에 도시된다.
DOTAM에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위해, KPL-4 세포에 결합한 후, 세포를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 이어서, Pb-DOTAM-FITC를 첨가하여 DOTAM-결합 적격 세포 결합된 항체를 검출하였다(도 39). P1AD8927은 이소타입 교정된 투약량 의존 FITC 신호를 도시한다. 이러한 실험은 DOTAM 결합이 이러한 항체에서 기능적임을 도시한다.
P1AD8926 기능의 FACS 분석
P1AD8926의 기능을 평가하기 위해 Raji 세포를 PBS에서 2회 세척하고, 4 x 106 세포/웰의 최종 밀도로 96-웰 v-바닥 플레이트에 시딩하였다.
항체를 제논<인간 IgG>A488로 사전-표지하고, 도 40에 표시된 농도로 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 얼음에서 1시간 동안 항온처리하고, PBS에서 2회 세척하고, FACS 칸토를 사용하는 FITC 형광의 측정을 위해 200 μL PBS/5% FCS에 재현탁하였다.
DOTAM에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위해, Raji 세포에 결합한 후, 세포를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 이어서, Pb-DOTAM-FITC를 첨가하여 DOTAM-결합 적격 세포 결합된 항체를 검출하였다(도 41). P1AD8927은 이소타입 교정된 투약량 의존 FITC 신호를 도시한다. 이러한 실험은 DOTAM 결합이 이러한 항체에서 기능적임을 도시한다.
실시예 30: 실시예 31 내지 37의 재료 및 방법
본 실시예는 실시예 31 내지 37의 연구를 위한 재료와 방법을 제시한다.
3-단계 PRIT(1 사이클)
단계 1: BsAb의 투여(i.v. 또는 i.p.): 연구에 사용된 BsAb는 높은 친화도로 Pb-DOTAM에 결합하고, 예컨대 CEA를 통해 종양을 표적으로 한다.
단계 2: CA의 투여(i.v. 또는 i.p.): 212Pb-DOTAM의 효율적인 종양 축적을 허용하기 위해, 순환하는 BsAb는 종양에 침투하지 않고 결합되지 않은 BsAb에 대한 212Pb-DOTAM 결합을 차단하는 CA를 사용하여 혈액에서 중화되어야 하고, 결과적으로 사전-표적화된 부위를 차단한다. CA는 일반적으로 4 내지 10일 후, BsAb가 종양에 충분한 정도로 축적되면 투여된다. Pb-DOTAM-덱스트란-500 CA는 500 kDa의 평균 분자량을 갖는 아미노덱스트란을 기반으로 개발되었고, DOTAM은 하기 제시된 바와 같이 티오우레아 연결기를 통해 접합된다.
Figure pct00091
단계 3: 212Pb-DOTAM의 투여(i.v.): 방사능 주사는 일반적으로 CA 주사 24 내지 48시간 후 마지막 단계에서 수행되어 212Pb-DOTAM이 사전-표적화된 종양 부위에 우선적으로 결합하여 전신 방사선 노출을 효율적으로 감소시킨다.
일반적인 재료 및 방법
아르코랩(ARCoLab)에서 수행된 실험 프로토콜은 지역 당국(Comite Regional d'Ethique de 1'Experimentation Animale du Limousin (CREEAL), Laboratoire Departemental d'Analyses et de Recherches de la Haute-Vienne)에 의해 검토되고 승인되었다. 중증 합병 면역결핍(SCID) 및 CD1 마우스는 찰스 리버에 의해 제공되고, 윤리적 지침에 따라 명과 암의 매일 사이클(12시간/12시간)을 갖는 특정 및 기회감염성 무병원체(SOPF) 조건 하에서 유지되었다. 연구 121은 특정 무병원체(SPF) 조건을 사용하였고, 마우스는 엔비고(Envigo)에 의해 제공되었다. 동물이 새로운 환경에 적응할 수 있도록 도착 후 첫 5일 동안 조작을 수행하지 않았다. 모든 마우스를 임상 증상 및 부작용 검출을 위해 매일 제어되었다.
고형 이종이식편을 코닝(등록상표) 마트리겔(등록상표) 기저 막 매트릭스(성장 인자 감소됨; 카탈로그 번호 354230)와 1:1 혼합된 세포 배양 매질에 CEA-발현 종양 세포의 피하(s.c.) 주사에 의해 확립하였다. 종양 부피는 하기 공식에 따라 계산된 수동 캘리퍼링을 통해 추정되었다: 부피 = 0.5 x 길이 x 너비 2 .
방사성 소변/대변의 재흡수를 최소화하기 위해, 모든 효능 연구 마우스를 212Pb-DOTAM 투여 후 4시간 동안 그릴 바닥이 있는 우리에 넣고, 이어서 표준 침구가 있는 새 우리로 옮겼다. 이어서, 주사후(p.i.) 24시간에 모든 우리를 교체하였다. 이러한 과정은 방사능 주사 후 24시간 이내에 생체분포 목적으로 안락사되는 마우스에 대해서는 수행되지 않았다.
연구 동물의 체중(BW)을 건강 상태에 따라 필요에 따라 추가 측정과 함께 주 당 3회 이상 측정하였다. BW 손실이 초기 BW의 25%를 초과하거나 종양 부피가 3,000 mm3에 도달한 마우스를 즉시 안락사시켰다. 윤리적 이유로 안락사가 고려된 다른 인자는 종양 상태(예컨대, 괴사 부위, 혈액/액체 누출, 자해의 징후) 및 동물의 일반적인 외모(예컨대, 모피, 자세, 움직임)였다. 모든 개체가 충분히 회복될 때까지 급성 BW 손실(집합 또는 개체)이 요구되는 경우, 방사능 주사 후 5일부터 모든 마우스에 수분-함유 식품을 제공하였다.
후안와 출혈을 사용하여 정맥동에서 종결시 혈액을 수집하고, 프로토콜에 명시된 대로 방사능 측정 및/또는 조직학적 분석을 위한 추가 조직 수확을 수행하였다. 예상치 못한 또는 비정상적인 조건이 문서화되었다. 포르말린 고정을 위해 수집된 조직을 즉시 10% 중성 완충된 포르말린(4℃)에 넣고, 이어서 5일 후 포스페이트-완충된 식염수(PBS; 4℃)로 옮겼다. 생체분포 목적으로 수집된 기관 및 조직을 칭량하고, 2470 위자드2 자동 감마 계수기(퍼킨엘머)를 사용하여 방사능에 대해 측정하고, 이어서, 붕괴 및 배경의 교정을 포함하여 조직 1 g 당 주사된 투약량의 백분율(%ID/g)을 계산하였다.
그래프패드 프리즘 6(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드) 및 JMP 8[사스 인스티튜트 인코포레이티드(SAS Institute Inc.)]을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 종양 성장 억제(TGI)의 곡선 분석은 하기 공식을 사용하여 평균 종양 부피를 기반으로 수행하였다:
Figure pct00092
이때, d는 치료 일을 나타내고, 0은 기준선 값이다. 비히클(PBS)이 기준 군으로 선택되었다. 종양 회귀(TR)는 하기 공식에 따라 계산되었다:
Figure pct00093
이때, 양의 값은 종양 퇴행을 나타내고, -1 미만의 값은 이중 기준선 값을 초과하는 성장이다.
생존에 관해 유의하게 상이한 군을 특정하기 위해 페어와이즈 시험을 수행하였다: 로그-랭크 시험(나중에 생존 이벤트에 더 많은 가중치) 및 윌콕슨 시험(조기 생존 시간에 더 많은 가중치), 둘 다 다중 시험에 대해 본페로니 교정을 사용함.
시험 화합물
기술된 연구에서 이용된 화합물은 하기 표에 "이중특이적 항체", "클리어링제" 및 "방사선표지된 킬레이트"로 표시된다.
CEA-DOTAM(PRIT-0213)은 CEA의 T84.66 에피토프를 표적으로 하는 완전히 인간화된 BsAb인 반면, DIG-DOTAM(PRIT-0175)은 음성 대조군으로 사용되는 비-CEA-결합 BsAb이다. P1AE1766, P1AE1767, P1AE1768, P1AE1769 및 P1AE1770은 상기 실시예 28에 기술된 바와 같이 CEA의 CH1A1A 에피토프를 표적으로 하는 인간화된 CEA-DOTAM BsAb이다. 항체 구축물을, 해동하고 표준 비히클 완충액(20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl; pH 6.0) 또는 0.9% NaCl에서 정맥내(i.v.) 또는 복강내(i.p.) 투여를 위해 각각의 최종 농도로 희석하는 주사 일까지 -80℃에서 저장하였다.
Ca-DOTAM-덱스트란-500 및 Pb-DOTAM-덱스트란-500 CA를, 해동하고 i.v. 또는 i.p. 투여를 위해 포스페이트-완충된 식염수(PBS)에 희석하는 주사 일까지 -20℃에서 저장하였다.
방사선표지를 위한 DOTAM 킬레이트는 매크로사이클릭스에 의해 제공되고, 방사선표지 전에 -20℃에서 유지되었다. 212Pb-DOTAM은 토륨 발생기에서 DOTAM에 의한 용리에 의해 생성되었고, 이어서 표지 후 Cu, Ca, Zn, Gd 또는 Pb로 급랭되었다. 212Pb-DOTAM 용액을 PBS 또는 0.9% NaCl로 희석하여 i.v. 주사를 위한 목적 212Pb 활성 농도를 수득하였다.
비히클 대조군의 마우스는 BsAb, CA 및 212Pb-DOTAM 대신 PBS를 여러 번 수용하였다.
이중특이적 항체
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
종양 모델
사용된 종양 세포주 및 마우스 접종을 위해 주사된 양은 하기 표에 "종양 세포주"로 표시된다. BxPC3은 CEA를 자연적으로 발현하는 인간 원발성 췌장 선암 세포주이다. BxPC3 세포는 10% 소 태아 혈청[지이 헬스케어 하이클론(GE Healthcare Hyclone) SH30088.03]이 강화된 RPMI-1640 매질, 글루타맥스(상표) 보충제, 헤페스(깁코, 참고 번호 72400-021)에서 배양되었다. HPAF-II(CRL-1997)는 CEA를 자연적으로 발현하는 인간 췌장 선암 세포주이다. HPAF-II 세포는 10% 표준 소 태아 혈청, 1% 글루타맥스 100X, 1% MEM NEAA(최소 필수 매질 비-필수 아미노산) 100X(깁코 11140-035) 및 1% 나트륨 피루브산(100 mM; 깁코 11360-070)이 강화된 EMEM 매질(깁코 31095-029)에서 배양되었다. WSU-DLCL2는 CD20을 자연적으로 발현하는 인간 B 세포 림프종 세포주이다. WSU-DLCL2 세포는 10% 소 태아 혈청이 강화된 RPMI-1640 매질(깁코, 참고 번호 72400-021)에서 배양되었다. NCI-N87은 HER2를 자연적으로 발현하는 위암 세포주이다. NCI-N87 세포는 10% 소 태아 혈청이 강화된 RPMI-1640 매질(깁코, 참고 번호 72400-021)에서 배양되었다. 연구 0일에 각각의 SCID 마우스에 코닝(등록상표) 마트리겔(등록상표) 기저 막 매트릭스(성장 인자 감소됨; 카탈로그 번호 354230)와 1:1로 혼합된 RPMI 또는 DMEM 매질 중 세포를 우측 옆구리에 피하 주사하여 고형 이종이식편을 확립하였다.
Figure pct00097
연구
실시예 31: 종양 모델에서 CEA-PRIT의 효능(프로토콜 103)
본 연구는 마우스의 s.c. BxPC3 종양의 치료를 위해 CEA-DOTAM BsAb를 사용하여 CEA-PRIT의 효능을 평가하였다. 치료법은 10 또는 30 μCi의 212Pb-DOTAM을 사용하는 단일 치료제로 투여되거나, 두 방사능 수준 각각에 대해 3회의 반복된 사이클로 투여되었다. 비-CEA-결합 대조군 항체(DIG-DOTAM), CEA-DOTAM BsAb 단독(방사능 없음) 및 치료 없음(PBS)을 사용하여 PRIT와 비교하였다. 212Pb-DOTAM 표적화 및 클리어런스를 확인하기 위해 제1 및 제2 사이클 후에 생체분포를 수행하고, 치료 효능을 TGI, TR 및 생존에 관해 평가하였다. 상이한 치료 계획의 내약성을 평가하기 위해 연구 내내 마우스를 주의깊게 모니터링하였다. 연구 개요는 도 42에 도시된다.
연구 디자인
프로토콜 103의 시간 경과와 디자인은 하기 표에 제시된다.
프로토콜 103의 시간 경과
Figure pct00098
Figure pct00099
고형 이종이식편을 연구 0일에 각각의 SCID 마우스에서 RPMI/마트리겔 중 5 x 106 세포(계대 24)를 우측 옆구리에 s.c. 주사함으로써 확립하였다. 종양 세포 주사 20일 후, 마우스를 290 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다.
수송 이유에 기인하여, 치료를 상기 표에 기술된 바와 같이 제1일에 군 C, D, E, F, G, J, K 및 L의 BsAb 또는 PBS 주사, 및 이어서 제2일에 군 A, B, H 및 I의 BsAb 주사를 갖는 2일의 과정으로 시작하였다. 4일 후, CA를 주사하고, 이어서 2시간 후 212Pb-DOTAM 또는 PBS를 주사하였다. 30 또는 0 μCi를 수용하는 군을 먼저 주사하고, 이어서 다음 날 10 μCi를 수용하는 군을 주사하였다. 군 B, D, E, F, G, I, K 및 L은 방사능 주사 사이에 2주 동안 여러 번 치료를 수용하였다. 모든 반복된 치료 사이클(제2 및 제3)은 동시에 시작되었고, 즉, 모든 마우스는 동일한 날에 BsAb 또는 PBS 주사를 수용하고, 이어서 4일 후, CA 및 212Pb-DOTAM 또는 PBS를 수용하였다. 안락사 시에 하기 기관 및 조직을 군 A 내지 G에서 수확하였다: 방광, 난소, 간, 비장, 신장, 대퇴부(골수 포함), 결장, 공장, 위 및 종양.
군 H 및 J의 마우스를 212Pb-DOTAM의 최초이자 유일한 주사 후 24시간에 희생시키고, 부검하였고; 군 I, K 및 L은 제2 212Pb-DOTAM 주사 후 24시간에 희생시키고, 부검하였다. 안락사 시에 방사능 측정을 위해 혈액, 방광, 소장, 결장, 비장, 췌장, 신장, 간, 폐, 심장, 대퇴부, 근육, 꼬리 및 종양을 수확하였다.
결과
212Pb 24시간 p.i의 생체내 분포는 도 43에서 볼 수 있듯이 피하 BxPC3 종양에서 높은 흡수와 정상 조직에서의 낮은 축적을 나타냈다. CEA-DOTAM에 의해 사전-표적화된 종양과 비-CEA-결합 BsAb DIG-DOTAM에 의해 사전-표적화된 종양 사이의 유의한 차이는 치료의 높은 특이성을 확인하였다. 시닥(의 다중 비교 시험을 사용한 1-방향 분산 분석(ANOVA)은 1(50.3%ID/g)과 2(43.0%ID/g) 10 μCi 주사 사이, 또는 1(37.6%ID/g)과 2(24.1%ID/g) 30 μCi 주사 사이에서 212Pb의 평균 종양 흡수에 유의한 차이가 없음을 나타냈다. 마찬가지로, 10 μCi의 1 사이클과 30 μCi의 1 사이클 투여 사이에는 유의한 차이가 없었다(p > 0.05). 그러나, 종양 흡수는 10 μCi의 2 사이클과 비교하여 30 μCi의 2 사이클 후 현저히 낮았고, DIG-DOTAM(2.9%ID/g)으로 사전-표적화된 종양에서 30 μCi의 2 사이클 후 종양 흡수는 CEA-DOTAM 치료와 비교하여 마찬가지였다. 도 43의 패널 B는 %ID/g가 다양한 치료군 내에서 상이한 크기의 종양에 필적함을 도시한다.
평균 종양 발달 및 개별적인 종양 성장 곡선은 각각 도 44 및 도 45에 도시된다. 모든 군은 20 내지 24일까지 종양 부피를 2배로 늘렸다. 제1 212Pb-DOTAM 치료는 24일에 제공되고, 이어서 CEA-DOTAM 군의 종양은 약 1주 동안 계속 성장한 후, 수축되기 시작하였다. 종양은 완전히 퇴행하지 않았지만, 다중-치료군(B 및 D)의 부피는 52일의 마지막 치료까지 비교적 일정하게 유지되었다. 10 또는 30 μCi를 1회만 주사한 마우스의 종양은 44일에 다시 성장하기 시작하였지만, 더 높은 활성을 수용한 마우스는 성장률이 약간 느렸다. DIG-DOTAM을 사용한 비-특이적 PRIT는 CEA-DOTAM 단독 또는 비히클과 비교하여 통계적으로 유의하지만 제한된 TGI를 야기하였다. 후자의 두 대조군은 동일한 종양 발달을 나타냈다.
모든 치료군을 평균을 기반으로 분석할 수 있는 마지막 날인 63일에, TGI는 비치료군과 비교하여 군 A, B, C, D, E 및 F에 대해 각각 57.2, 89.8, 77.7, 96.6, -6.2 및 67.3%였다. 비히클 대조군의 마지막 마우스는 74일에 계산되었고, 이때 TGI는 나머지 4개 군인 A, B, C 및 D에 대해 각각 48.5, 83.3, 63.5 및 95.7%였다. 연구는 마지막 남은 마우스(군 D)의 안락사에 의해 세포 주사 후 118일에 종료되었다.
로그-랭크 및 윌콕슨 검사를 생존에 관해 유의한 차이가 있는 군을 특정하기 위해 수행되었고, 결과는 하기 2개의 표에 제시된다. 모든 CEA-DOTAM PRIT 섭생법은 3개의 대조군에 비해 생존율을 유의하게 증가시켰다. 전체 생존은 단일 10 μCi 사이클(p = 0.0110) 후보다 10 μCi의 3 사이클 후 약간 더 좋았지만, 10 μCi 3 사이클과 CEA-DOTAM 사전-표적화를 사용한 30 μCi 섭생법 사이에는 유의한 차이가 없었다. 카플란-마이어 생존 곡선은 도 46에 도시된다.
Figure pct00100
Figure pct00101
부작용 및 독성
윤리적인 이유로 마우스의 희생을 유도하는 관찰된 부작용은 두 군으로 분류할 수 있다: 1) 종양 상태, 및 2) 방사선-유발 독성. 제1군은 괴사성 및/또는 궤양성 종양을 나타내고, 마우스가 자신이나 우리 동료의 종양 영역을 "청소"하도록한다. 이러한 단계에 도달한 마우스는 고통을 피하기 위해 즉시 안락사되었다.
부작용의 제2군은 방사선-유발 독성의 전형적인 증상, 예컨대 BW 손실, 설사 및 무기력을 포함하였다. 도 47은 치료군의 BW 발달을 도시한다. 30 μCi의 212Pb-DOTAM을 주사한 모든 마우스는 제1 방사능 주사 후 8일까지 완화된 초기 BW 강하를 경험하였다. 다수의 30 μCi 주사를 투여한 군(D 및 F)은 더 연장된 BW 손실로 고통받았다. BW 손실은 여러 번 주사한 경우에도 10 μCi를 수용한 군(A 및 B)에서 경미하였다. 따라서, 10 및 30 μCi의 212Pb-DOTAM을 수용한 마우스 사이에 명백한 차이가 감지되었다. 반복된 10 μCi 치료 후에도 마우스는 일반적으로 유해한 독성의 주요 징후가 나타나지 않았다. 30 μCi의 1 사이클로 치료된 마우스는 일시적인 체중 감소를 나타냈지만 회복되었다. 그러나, 제2 및 제3 30 μCi사이클은 더 광범위한 유해 독성을 야기하여, BW 손실과 통증 및/또는 불편의 징후의 조합으로 인해 많은 동물을 희생시켰다. 이로부터 10 μCi가 적용된 조건 하에 안전한 방사능 수준인 반면, 30 μCi는 최대 허용 활성에 근접하고 있다는 결론을 내릴 수 있다.
결론
본 발명자들은 단일요법으로 주어진 10 또는 30 μCi의 212Pb-DOTAM에 의한 반복된 CEA-PRIT가 생존 및 TGI를 유의하게 증가시켰지만, 이러한 설정에서 완전한 종양 제거나 지속적인 종양 제어를 제공하지는 않았다고 결론지었다. 시간이 지남에 따라 종양 제어를 유지하면서 방사선-유발 독성을 방지하기 위해, 이러한 결과는 212Pb-DOTAM의 30 μCi 미만 및 10 μCi 초과를 사용하는 것을 제안한다.
실시예 32: CEA-PRIT에 대한 BsAb와 CA 주사 사이의 적절한 시간의 선택(프로토콜 116 및 121)
프로토콜 116 및 121은 높은 종양 흡수 및 균질한 종양 내 BsAb 분포를 기반으로 CEA-PRIT에 대한 BsAb와 CA 주사 사이의 적절한 시간의 선택을 안내하도록 디자인되었다. 프로토콜 116은 i.v. 주사 후 4, 7 및 14일에 BxPC3 모델에서의 CEA 발현과 비교하여 종양내 BsAb 분포를 평가하였다(면역형광 염색으로 검출됨). 프로토콜 121은 1, 4, 7 및 10일 후 BxPC3 종양에서 납-203(203Pb)으로 직접 표지된 BsAb의 축적을 평가하였다. BsAb는 Pb 동위원소 203Pb로 표지되어(반감기 2.2일), 212Pb(반감기 10.6시간)에 비해 더 긴 기간에 걸쳐 발달을 추적할 수 있다.
연구 디자인
프로토콜 116 및 121의 시간 경과와 디자인은 하기 4개의 표에 제시된다.
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
고형 이종이식편을 s.c. BxPC3 세포 주사를 통해 확립하였다. 접종 19일 후, 프로토콜 116의 마우스를 227 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다. 프로토콜 121에서, 평균 종양 부피는 20일 후 203 mm3였다.
면역형광 염색
프로토콜 116의 마우스를 안락사 후 부검하고, 비장, 신장, 간, 근육 및 종양을 수확하였다. 수집한 조직을 2개의 조각으로 분할하였다: 하나는 티슈-텍(Tissue-Tek, 등록상표) 최적 절단 온도(OCT) 포매 화합물을 함유하는 크라이오몰드(cryomold)에 넣고 급속 동결을 위해 드라이아이스에 위치시키고, 다른 하나는 10% 중성 완충된 포르말린(NBF)에 24시간 동안 고정하고, 이어서 PBS로 옮겨 파라핀-포매까지 저장하였다. OCT에서 냉동 샘플은 절편 전에 -80℃에서 유지하였다. 조직학적 염색을 하기 표에 나열된 시약을 사용하여 수행하였다.
Figure pct00106
CEA를 위한 염색
동결된 종양을 라이카(Leica) CM1850 UV 절편기를 사용하여 12 μg 슬라이스로 절편하고, 슬라이드를 -20℃에서 저장하였다. 염색 전에, 슬라이드를 실온(RT)에서 1시간 동안 해동하고, 이어서 PBS(1X, pH 7.4)로 5분 동안 세척하고, 이어서 차가운 아세톤(-20℃)에서 5분 동안 세척하고, 5분 동안 PBS로 1회 더 세척하였다. 슬라이드를 조직 주위의 종이 조각으로 건조하고, 소수성 펜[다코(Dako); 아길런트(Agilent)]을 사용하여 조직 주위에 원을 그렸습니다. 실온에서 1시간 동안 400 μL의 차단 혈청(염소)으로 섹션의 항온처리를 수행하였다. 차단 혈청을 제거하고, 200 μL의 1차 항체(토끼 IgG 항-인간 CEA)를 섹션에 첨가하고, 이어서 어두운 챔버에서 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 2일에, 섹션을 PBS로 10분 동안 2회 세척하고, 400 μL의 차단 혈청을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, 차단 혈청을 제거하고, 2차 항체(알렉사 플루오르 488-표지된 염소 항-토끼 IgG) 및 카운터스테이닝(counterstaining)(획스트)을 섹션에 추가하고, 이어서 실온에서 2시간 동안 어두운 챔버에서 항온처리하였다. 이어서, 슬라이드를 PBS로 10분 동안 2회 세척하였다. 마지막으로, 형광 마운팅 매질(다코 S3023; 아길런트)과 커버 슬립(coverslip)을 슬라이드에 첨가하고, 이어서 공기 건조하고, -20℃ 어둠 속에서 저장하였다. 제이스 악시오 스코프(Zeiss Axio Scope).A1 모듈 현미경을 사용하여 염색된 슬라이드의 분석을 수행하였다.
CEA-DOTAM을 위한 염색
동결된 종양 섹션을 저장하고, 상기 CEA-염색에 대해 기술된 바와 같이 처리했지만, 1차 항체 대신 PBS를 사용하였다. 2차 항체는 알렉사 플루오르 555로 표지된 염소 항-인간 IgG였다.
H&E 염색
프로토콜 116의 동결된 종양 섹션의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 라이카 오토스테이너 XL 자동 슬라이드 염색기를 사용하여 수행하였다.
생체분포
프로토콜 121의 마우스를 생체분포 목적을 위해 희생시키고, 종결 전에 후안와 출혈을 통해 혈액을 수집하였다. 또한, 안락사 후 방광, 소장, 결장, 비장, 췌장, 신장, 위, 간, 폐, 심장, 뇌, 대퇴부, 근육, 피부, 꼬리 및 종양을 수확하여 방사능을 측정하였다.
결과
면역형광 염색 - 프로토콜 116
비치료 대조군은 수집된 종양에 균일하게 분포된 높은 수준의 CEA를 나타냈다. CEA-DOTAM BsAb에 대한 대조군 염색은 예상대로 신호가 발생하지 않았다.
CEA-DOTAM BsAb를 주사한 마우스의 종양은 p.i 4, 7 및 14일에 채취되었다. 4일에, BsAb는 조직내 종양 세포 결절의 경계를 완전히 덮고 있었지만, 더 큰 결절로 완전히 침투되지는 않았다. 이것은 밝은 적색 경계 세포 층으로 둘러싸인 더 어두운 획스트 염색 영역의 존재로 제시된다. 7일 후, CEA-DOTAM 염색의 신호는 더 균질하게 분포된 것처럼 나타났고, 어두운 내부 영역을 갖는 종양 세포 구조가 더 적었다. 1주 후, p.i. 14일에, 형광 신호의 분포는 7일 시점과 유사하게 남아있었지만, 전체적으로 더 낮은 신호로 유지되었다.
212Pb-DOTAM의 조사를 포함하여 전체 PRIT 사이클을 투여한 두 군으로부터의 종양 샘플은 방사선-유발 세포 사멸로 인한 괴사 영역을 나타냈다. 발견은 세포 부종, 세포 세부사항(유령 세포) 손실, 일부 핵 이형성 및 간질성 섬유증의 잠재적 증가를 포함하였다. 제1 BsAb 주사 2주 후 제2 투약량의 CEA-DOTAM을 수용한 군 F의 마우스의 종양은 높고 균질한 CEA 발현을 유지하였고, 제2 BsAb 주사 4일 후 CEA-DOTAM 분포는 비-조사된 종양과 유사하였고, 즉 BsAb는 종양의 모든 CEA-발현 부분에 분포하지만, 더 큰 특정 구조로의 침투가 제한되어 영상의 어두운 영역을 야기하였다. 초기 PRIT 사이클 후 제2 BsAb 주사을 수용하지 않은 군 G에서 상응하는 대조군 샘플을 동시에 획득하였다. 이러한 종양 섹션에서, CEA-DOTAM 염색에 대해 희미한 신호가 보일 수 있고, 이는 특정 양의 BsAb가 주사 18일 후에도 여전히 종양-결합됨을 나타낸다.
생체분포 - 프로토콜 121
BxPC3 종양-함유 SCID 마우스에서 평균 203Pb 축적 및 클리어런스는 도 48에 표시된다. 혈액 클리어런스는 CA의 도움 없는 항체에서 예상한 대로 느렸다. 표지된 BsAb의 예상치 못한 흡수는 정상 기관 또는 조직에서 나타나지 않았다. 시간 경과에 따른 종양 축적은 도 49에 도시되고, 주사 1일 후 평균 49%ID/g에서 시작하여 4, 7 및 10일에 각각 130, 189 및 197%ID/g로 증가한다. 표지된 음성 대조군은 주사 4일 후에 3%ID/g로 종양 축적이 없었다.
통계학적 분석은 시닥의 다중 비교 시험을 사용하여 1-방향 분산 분석(ANOVA)에 의해 수행되어 상이한 시점에서 종양 흡수의 인지된 차이가 유의한지 여부를 평가하였다. 시험에 따라서, 203Pb 축적의 유의한 증가는 1일과 7일 사이 및 1일과 10일 사이에만 달성되었고, 다른 시점은 서로 유의하게 상이하지 않았다. 언페어링된 t-검정을 사용하여 4일 대 7일만 시험한 결과 7일에 통계적으로 유의한 증가를 야기하였지만(p = 0.0468), 7일 대 10일에 대한 상응하는 시험은 그렇지 않았다(p = 0.8316).
결론
결과는 주사 후 4일과 7일 사이에 종양의 203Pb-BsAb 흡수에서 전반적인 증가를 나타냈지만, 시간 간격을 10일로 연장했을 때 더 이상 개선되지 않았다. 현미경으로 볼 때, 종양으로의 BsAb 침투는 4일에 비해 7일 후에 개선되었다. 14일 시점에서는 어떠한 이점도 보이지 않았고, 이때 전체 형광 신호는 종양내 분포를 개선하지 않고 감소하는 것처럼 보였다. 본 연구는 4일보다 7일의 BsAb-CA 시간 간격을 선택하도록 지지한다.
실시예 33: 생체분포(종양 및 정상 조직에 대한 흡수된 방사능 선량을 추정하기 위한 생체내 212 Pb-DOTAM 분포 데이터)(프로토콜 146)
프로토콜 146은 s.c BxPC3 종양을 운반하는 SCID 마우스에서 종양 및 정상 조직에 대한 흡수된 방사능 선량을 추정하기 위해 PRIT 후 생체내 212Pb-DOTAM 분포 데이터를 제공하도록 디자인되었다. 212Pb-DOTAM의 급랭을 Ca를 사용하여 수행하였다(실시예 34 참고).
사전-표적화를 CEA-DOTAM BsAb의 주사, 및 이어서 7일 후 CA의 주사에 의해 수행하였다. 24시간 후, 212Pb-DOTAM을 투여하였다. 마우스의 군을 방사능 주사 후 5분 내지 48시간의 여러 시점에서 희생시키고, 방사능 측정을 위해 혈액 및 기관을 수확하였다. 방사성 화합물의 배설 속도를 평가하기 위해 대사 우리를 사용하여 선택되는 시점에서 배설물을 샘플링하였다. 흡수된 선량을 최종적으로 생성된 시간-활성 곡선을 사용하여 확립된 방법을 통해 계산하였다.
연구 디자인
프로토콜 146의 시간 경과 및 디자인을 하기 2개의 표에 제시된다.
Figure pct00107
Figure pct00108
고형 이종이식편을 8주령의 SCID 마우스(엔비고)로의 BxPC3 세포의 s.c. 주사에 의해 확립하였다. 접종 28일 후, 마우스를 310 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다.
군 E 및 F의 마우스를 그릴 바닥 대사 우리에 개별적으로 수용하였다(즉, 우리 당 1 마리의 마우스). 방사능 주사 2, 6 및 24시간 후 각각의 우리에서 소변 및 대변을 수집하고, 이어서 개별 샘플의 방사능을 측정하였다. 군 F의 마우스를 p.i. 24시간에 일반 우리로 옮겼다.
종결 전에 후안와 출혈을 통해 모든 마우스로부터 혈액/혈청을 수집하였다. 안락사 후, 방사능 측정 및 %ID/g의 계산을 위해 하기 추가 기관 및 조직을 수확하였다: 방광, 자궁, 소장, 결장, 비장, 췌장, 신장, 위, 간, 폐, 심장, 뇌, 대퇴부, 피부, 근육, 복부 지방, 꼬리 및 종양.
방사선 선량 측정
흡수 선량은 의학용 내부 방사선 선량(MIRD) 위원회의 팜플렛 21에 요약된 형식에 따라 계산되었다(문헌[Bolch WE, Eckerman KF, Sgouros G and Thomas SR. J Nucl Med 2009; 50:477-484]). 공식적으로, 표적 조직 또는 영역 rT의 흡수 선량 D(rT)는 활성의 시간-적분A(rS, t)에 단위 활성 당 흡수 선량률 S(rT ← rS)(모든 공급원 영역 rS에 걸친 합계)를 곱한 값으로 계산된다. 212Pb 붕괴 쇄에 의해 방출되는 대부분의 에너지가 알파 방사선, 및 또한 알파 방사선의 훨씬 더 높은 생물학적 효능(상대적인 생물학적 효능 RBE에 의해 특징지어짐)으로부터 유래하는 경우, 2개의 접근법이 만들어졌다:
1. 에너지는 알파 입자의 짧은 범위로 인해 국소적으로 흡수되고, 단지 S(rT ← rS) 항이 고려됨을 의미하고,
2. 베타 및 감마 방사선의 기여는 무시된다.
Δα가 알파 붕괴에 의해 방출되는 에너지이거나, 오히려 212Pb의 붕괴 쇄에서 알파 붕괴에 의해 방출되는 평균 에너지의 합[본원에서, 단위 J/(μCi·h)로 표시됨]인 경우, 표적 조직 또는 영역 rT의 흡수 선량은 다음 공식에 의해 계산된다:
Figure pct00109
.
계산은 시간 t에서의 복합 (평균) 붕괴-교정된 방사능 농도([%ID/g]t로 표시됨)를 기반으로 한다. 제1 단계에서, 이들은 표적 조직 rT에 대해 조직 중량 1 kg 당 μCi의 방사능 농도로 변환된다:
Figure pct00110
.
A0[μCi]는 주사된 활성이고, λ는 212Pb의 지수적인 붕괴율 0.0651 h-1(10.6시간 반감기에 상응함)이다.
제2 단계에서, 방사능 농도는 각각의 조직에 대해 시간이 지남에 따라 통합되었다. 이것은 약동학 소프트웨어 피닉스 윈놀린(Phoenix WinNonlin) 6.4[카타라 유에스에이 인코포레이티드(Certara USA, Inc.), 미국 뉴저지주 08540 프린스콘 오버룩 센터 1000 스위트 101 소재]에서 "선형 로그 사다리꼴 계산 방법"을 사용하여 달성되었다. 모델 유형 "플라즈마"를 균일 가중치와 함께 사용하였다.
최종 단계에서, 흡수 선량을 방사능 농도의 시간 적분을 에너지 방출 Δα = 170·10-6 J/(μCi·h)과 곱하여 계산하였다. 추가적으로, MIRD 팜플렛 22에 제안된 바와 같이 RBE-가중된 흡수 선량은 5의 RBE를 사용하여 계산되었다(문헌[Sgouros G, Roeske JC, McDevitt MR, et al. J Nucl Med 2010; 51 : 311-328]).
결과
생체분포
종양이 있는 SCID 마우스의 평균 212Pb 축적 및 클리어런스는 도 50에 도시된다. 방사능 축적은 종양에서 높았고, 주사 5분 후에 이미 17%ID/g이고, p.i. 6시간까지 40% 초과로 증가하였고, 48시간 이상 동안 그 수준을 유지하였다. 종양-부재 상태와 비교하여 정상 조직에서는 큰 차이가 발견되지 않았다.
흡수 선량
프로토콜 146에 대해 계산된 Gy의 평균 흡수 선량은 절대값(RBE = 1) 및 알파 방사체의 더 높은 세포독성에 대해 교정된 값(RBE = 5) 둘 다로 표 24에 제시된다. SCID 마우스의 경우, 평균 체중은 18.5 g였고; 20 μCi의 주사된 212Pb 활성으로 이것은 1.1 μCi/g 체중의 정규화된 주사된 활성을 야기하였다.
약 20 Gy의 흡수 선량은 종양에서 달성되었지만, 흡수 선량은 방광을 제외한 대부분의 정상 조직에서 2 Gy 미만으로 잘 유지되었다. 방광의 212Pb 함량은 개별 마우스 사이에서 유의하게 상이하였고, 이는 이러한 조직에 대한 높은 가변성을 나타낸다. RBE-교정된 선량은 외부 감마 방사선을 사용하는 방사선요법과 비교할 수 있도록 제공되었고, 주사된 212Pb-DOTAM의 20 μCi 당 약 100 Gy의 종양에 대한 추정 흡수 선량을 생성하였다.
Figure pct00111
결론
대부분의 정상 조직에서 흡수된 선량은 2 Gy 미만으로 유지되는 동안, 종양에서 약 20 Gy의 흡수 선량이 달성되었다. 전반적으로, 본 연구는 평가된 PRIT 섭생법을 사용하는 투약량-제한 독성의 주요 위험을 나타내지 않았다.
실시예 34: 킬레이트화되지 않은 DOTAM의 급랭(프로토콜 131)
알파 방사체 212Pb는 토륨-함유 수지에서 용리된 후 DOTAM에 킬레이트화되어 약리학적 활성 212Pb-DOTAM을 생성한다. 방사선표지 후, 과량(> 99%)의 유리 비-킬레이트화된 DOTAM은 용액에 잔류하고, 포획 금속 이온을 환경으로부터 용이하게 포획한다. 환자에게 주사하면, 순환하는 Ca2+에 빠르게 결합하여 약리학적으로 비활성인 Ca-DOTAM을 형성할 수 있다. CEA-DOTAM BsAb가 Pb-DOTAM에 우선적으로 결합하도록 디자인되었지만, 필적하는 정도로 Ca-DOTAM과 안정적인 복합체를 또한 형성할 수 있다. 결과적으로, 사전-표적화된 종양 부위에서 212Pb-DOTAM의 차단은 포화 상태에서 발생할 수 있고, PRIT 치료의 효능을 잡재적으로 감소시킨다. 따라서, 잠재적인 경쟁을 피하기 위해, 212Pb-DOTAM 용리 공정에 급랭 단계가 추가되고, 이때 금속 이온("X")이 도입되어 유의하게 높은 해리 상수(Kd)로 "X-DOTAM"의 형성을 제어한다. 킨엑사(동역학 배제 검정) 평형 측정에 의해 측정된 다양한 X-DOTAM 킬레이트에 대한 DOTAM-결합제의 친화도는 하기 표에 제시된다.
Figure pct00112
급랭을 위한 초기 선택은 Cu였고, 이에 따라 킬레이트화되지 않은 DOTAM을 급랭된 비-경쟁 Cu-DOTAM으로 대체하고, 이러한 조건을 사용하여 CEA-PRIT 프로그램 내에서 많은 연구가 실행되었다. 그러나, 나중에 Cu-DOTAM 복합체가 실제로 생체 내에서 안정적이지 않았음이 발견되었고, 인간 및 마우스 혈청, 혈장 및 혈액에서 대안적인 급랭 이온과 비교하여 안정성을 평가하기 위한 연구가 수행되었다. 선택되는 이온은 한편으로 유사한 친화도를 갖는 Pb 및 Ca이고, 다른 한편으로 유의하게 낮은 친화도를 갖는 Zn 및 Cu였다. 본 연구는 인간 및 마우스 혈액에서 Cu-DOTAM에 비해 유의하게 높은 Zn-DOTAM 안정성을 증명하였고(p.i. 35분에 자발적인 Ca-DOTAM 형성에 의해 측정됨), Zn-DOTAM의 경우 0% 및 0%, Pb-DOTAM의 경우 4% 및 4%와 비교하여, 초기에 주사된 Cu-DOTAM에 대해, 각각 마우스 및 인간 혈액에서 약 25% 및 30%에 도달하였다.
프로토콜 131은 CEA-DOTAM으로 사전-표적화하고 Pb-DOTAM-덱스트란-500으로 클리어링한 후 212Pb-DOTAM의 종양 및 정상 조직 축적에 미치는 영향을 비교하여 생체내 DOTAM 급랭 후보 금속을 평가하도록 디자인되었다. DOTAM과 합리적인 시험관내 복합체 안정성을 갖는 Zn 및 Gd를 Cu와 나란히 평가하였다. 또한, Ca 및 안정한 Pb를 대조군으로 사용하였다. 연구 개요는 도 51에 도시된다.
프로토콜 131의 시간 경과 및 디자인은 하기 2개의 표에 제시된다.
Figure pct00113
Figure pct00114
고형 이종이식편은 BxPC3 세포를 5 내지 7주령의 SCID 마우스의 우측 옆구리에 s.c. 주사하여 확립하였다. 종양 세포 주사 18일 후, 마우스를 200 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다. 212Pb-DOTAM을 접종 후 26일에 주사하고, 이때 평균 종양 부피는 350 mm3였다.
항체를 20 mM His/His-HCl, 140 mM NaCl, pH 6.0에서 표 "프로토콜 131의 연구 군" 및 도 51에 따른 i.v. 투여를 위해 100 μL 당 100 μg의 최종 농도로 희석하였다. CA를 해동하고, BsAb 주사 7일 후, PBS에서 i.v. 투여를 위해 100 μL 당 25 μg의 최종 농도로 희석하였다. 추가 24시간 후, 5개의 상이한 금속 중 하나를 사용하여 급랭된 212Pb-DOTAM을 i.v. 주사하였다(100 μL 0.9% NaCl 중 10 μCi).
마우스를 212Pb-DOTAM의 주사 2시간 후에 생체분포 목적을 위해 희생시키고, 하기 조직 및 기관을 수확하였다: 혈액, 방광, 비장, 신장, 간, 폐, 근육, 꼬리 및 종양.
결과
212Pb-DOTAM 주사 2시간 후 수집된 모든 조직에서의 평균 212Pb 축적 및 클리어런스는 도 52에 도시된다. Pb 대조군과 비교하여 임의의 급랭 금속 사이의 평균 %ID/g에서 통계적으로 유의한 차이가 없었다(2개 던넷의 다중 비교 시험에 의한 2-방향 ANOVA). 종양 및 선택되는 정상 조직에 대한 개별 값은 도 53에 도시된다. Zn 및 Gd로 급랭한 후 비장 및 근육의 212Pb 함량에서 다른 금속과 비교하여 더 큰 개별 변화가 관찰되었지만, 상이한 치료군 사이의 평균 %ID/g의 차이는 유의하지 않았다[투키(Tukey)의 다중 비교 시험을 사용하는 1-방향 ANOVA].
결론
프로토콜 131은 Ca- 또는 Pb-급랭과 비교하여 DOTAM의 Zn-, Gd- 또는 Cu-급랭으로부터 사전-표적화된 212Pb-DOTAM의 종양 및 정상 조직 축적에 대한 효과를 평가하였다. 212Pb의 종양 흡수의 차이는 관찰되지 않았고, 이는 적용된 실험 조건 하에서 대조군 Ca 및 Pb를 사용하여 사전-표적화된 결합 부위의 유의한 차단이 없음을 나타낸다. Zn 및 Gd로 급랭한 후 비장 및 근육에서 212Pb 함량의 증가된 변화가 관찰되었고, 이는 212Pb-DOTAM과 경쟁하는 금속-DOTAM 복합체가 비-표적화된 조직에서 비-CA-결합된 CEA-DOTAM의 중화에 기여할 수 있음을 나타낸다. Cu를 사용한 급랭은 Ca 급랭과 유사한 결과를 야기하였고, Cu-DOTAM의 표시된 생체내 불안정성을 추가로 확인하였다. Ca는 3개의 주요 이유로 최종적으로 DOTAM의 급랭을 위해 선택되었다: Cu 급랭과 비교하여 212Pb-DOTAM 용액의 생체내 제형의 증가된 제어; 비-CA-결합된 BsAb의 중화를 증가시켜 212Pb의 정상 조직 흡수의 변화를 감소시킬 가능성; 및 가정적인 "결합 부위 장벽" 현상의 효과를 감소시켜, 하위-포화 조건 하에서 용이하게 접근할 수 있는 표적에 대한 즉각적인 결합으로 인해 항원에 대한 친화도가 높은 분자의 침투가 제한될 수 있는 가능성.
실시예 35: PRIT에 대한 CD20-DOTAM 및 HER2-DOTAM의 평가(프로토콜 151 및 152)
프로토콜 151 및 152는 각각 완전히 인간화된 BsAb CD20-DOTAM 및 HER2-DOTAM에 의해 사전-표적화된 마우스에서 피하 종양에 대한 212Pb-DOTAM의 결합을 평가하는 것을 목표로 하였다. 항체 구축물, 및 이어서 7일 후 Ca-DOTAM-덱스트란-500 CA, 및 마지막으로 24시간 후 212Pb-DOTAM의 주사에 의해 3-단계 PRIT를 수행하였다. 방사능 주사 24시간 후 마우스를 희생시키고, 방사능 측정을 위해 혈액 및 기관을 수확하였다.
연구 디자인
프로토콜 151 및 152의 시간 경과 및 디자인은 하기 4개의 표에 제시된다.
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
Figure pct00118
고형 이종이식편을, DMEM 매질 중 CD20-발현 WSU-DLCL2 인간 B 세포 림프종 세포를 9주령의 SCID 마우스에 s.c. 주사함으로써, 프로토콜 151에서 확립하였다. 종양 세포 주사 4일 후, 마우스를 105 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다. 212Pb-DOTAM은 접종 후 13일에 주사되었고, 이때 평균 종양 부피는 242 mm3였다.
프로토콜 152에서, 10주령의 SCID 마우스를 RPMI 1640 매질 중 HER2-발현 NCI-N87 인간 위 암종 세포의 s.c. 주사에 의해 이종이식하였다. 종양 세포 주사 14일 후, 마우스를 74 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다. 212Pb-DOTAM을 접종 후 22일에 주사하고; 21일에 평균 종양 부피는 61 mm3이다.
방사능 주사 24시간 후 생체분포 마우스를 희생시켰다. 마취 하에 후안와 출혈을 통해 종결 전에 혈액을 수집하였다. 모든 마우스를 안락사 후 부검하였고, 피부, 방광, 위, 소장, 결장, 비장, 췌장, 신장, 간, 폐, 심장, 대퇴부, 근육, 꼬리 및 종양을 추가로 수집하였다.
결과
생체분포 - 프로토콜 151
주사 24시간 후 수집된 모든 조직의 평균 212Pb 함량은 도 54에 도시된다. 음성 대조군 BsAb DIG-DOTAM은 WSU-DLCL2 종양에서 방사능 축적이 없는 반면(0.4 ± 0.3%ID/g), CD20-DOTAM BsAb는 25.0 ± 3.7%ID/g을 야기하였다. 방광(12.5 ± 4.5%ID/g), 신장(3.1 ± 0.3%ID/g) 및 폐(2.2 ± 0.2%ID/g)를 제외하고는 정상 조직/기관에서 유의한 212Pb 흡수가 관찰되지 않았다.
생체분포 - 프로토콜 152
주사 24시간 후 수집된 모든 조직의 평균 212Pb 함량은 도 55에 도시된다. 음성 대조군 BsAb DIG-DOTAM은 NCI-N87 종양에서 방사능 축적을 나타내지 않은 반면(0.8 ± 0.4%ID/g), HER2-DOTAM BsAb는 24.6 ± 1.5%ID/g을 나타냈다. 신장(1.6 ± 0.1%ID/g) 및 폐(1.4 ± 0.2%ID/g)에서 매우 낮은 값을 제외하고는 정상 조직/기관에서 유의한 212Pb 흡수가 관찰되지 않았다.
결론
프로토콜 151 및 152의 결과는 CEA-PRIT를 위해 개발된 3-단계 사전-표적화 접근법을 사용하여 CD20-PRIT 및 HER2-PRIT의 특이적인 표적화 및 생체내 개념 증명을 나타냈다.
실시예 36: 다른 형식에 대한 생체내 분포 및 종양 축적 데이터(프로토콜 154)
프로토콜 154는 PRIT에 대한 5개의 신규한 CEA-DOTAM BsAb 구축물의 사용을 평가하는 것을 목표로 한다. 피하 HPAF-II 이종이식편을 운반하는 SCID 마우스에서 212Pb-DOTAM의 생체내 분포 및 종양 축적 데이터를 제공하도록 디자인되었다. CEA-DOTAM 구축물, 이어서 7일 후 Ca-DOTAM-덱스트란-500 CA, 및 마지막으로 CA 24시간 후 212Pb-DOTAM의 주사에 의해 3-단계 PRIT를 수행하였다. 방사능 주사 6시간 후 마우스를 희생시키고, 방사능 측정을 위해 혈액 및 기관을 수확하였다. 표준 CEA-DOTAM BsAb 및 비-CEA-결합 BsAb를 사용하여 PRIT와 비교하였다. 연구 개요는 도 56에 도시된다.
연구 디자인
프로토콜 154의 시간 경과 및 디자인은 하기 2개의 표에 제시된다.
Figure pct00119
Figure pct00120
고형 이종이식편을 9주령의 마우스의 우측 옆구리에 HPAF-II 세포를 s.c. 주사함으로써 확립하였다. 종양 세포 주사 11일 후, 마우스를 79 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다. 212Pb-DOTAM을 접종 후 20일에 주사하였고, 이때 평균 종양 부피는 230 mm3였다.
모든 항체를 20 mM His/His-HCl, 140 mM NaCl, pH 6.0에서 표 "프로토콜 154의 연구 군" 및 도 56에 따른 i.v. 투여를 위해 100 μL 당 100 μg의 최종 농도로 희석하였다. CA를 해동하고, BsAb 주사 7일 후, PBS에서 i.v. 투여를 위해 100 μL 당 25 μg의 최종 농도로 희석하였다. 추가 24시간 후, Ca로 급랭된 212Pb-DOTAM을 i.v. 주사하였다(100 μL 0.9% NaCl 중 10 μCi).
마우스를 212Pb-DOTAM의 주사 6시간 후 생체분포 목적을 위해 희생시키고, 하기 조직 및 기관을 수확하였다: 혈액, 피부, 방광, 위, 소장, 결장, 비장, 췌장, 신장, 간, 폐, 심장, 대퇴부, 근육, 뇌, 꼬리 및 종양.
결과
주사 6시간 후 수집된 모든 조직에서의 평균 212Pb 축적 및 클리어런스는 도 57에 도시된다. 혈액 함량 및 종양 축적은 도 58에 더 자세히 도시된다. 음성 대조군 BsAb DIG-DOTAM은 종양에서 방사능 축적을 나타내지 않은 반면(1.4 ± 0.1%ID/g), 표준 CEA-DOTAM BsAb는 36.8 ± 3.4%ID/g을 야기하였다. 신규한 구축물의 경우, 상응하는 수는 31.8 ± 3.1%ID/g(P1AE1766), 35.0 ± 8.5%ID/g(P1AE1767), 14.2 + 6.7%ID/g(P1AE1768), 38.8 ± 10.1%ID/g(P1AE1769) 및 39.5 ± 6.8%ID/g(P1AE1770)였다. P1AE1768의 유의하게 낮은 종양 축적은 이러한 항체 구축물의 CEA 단일 원자가로 설명될 수 있다.
이러한 PRIT 섭생법에 대하여, 방사능이 6시간 p.i에서 일반적으로 보이는 수준에 도달한 방광을 제외하고는 정상 조직/기관에서 유의한 212Pb 흡수가 관찰되지 않았다.
결론
연구 결과는 3-단계 PRIT에 대해 시험된 모든 CEA-DOTAM 항체 구축물(P1AE1766, P1AE1767, P1AE1768, P1AE1769 및 P1AE1770)의 생체내 개념 증명을 나타냈다.
실시예 37: CD20-PRIT 효능(프로토콜 162)
본 연구의 목적은 대안적인 표적인 분화 클러스터 20(CD20)을 지향하는 CEA-PRIT를 위해 개발된 치료 섭생법의 개념 증명을 나타내는 것이었다. 치료 효능은 피하 WSU-DLCL2 종양을 갖는 마우스에서 CD20-PRIT의 3 사이클 후에 평가되었다.
또한, 다음과 비교되었다: 주사 전에 212Pb-DOTAM과 함께 사전-항온처리 BsAb를 사용하는 1-단계 CD20-RIT; CD20 및 CD20+ 질환의 치료에 대한 기준을 지향하는 유형 I 단일클론 항체인 리툭시맙; 및 CD20을 지향하는 유형 II 단일클론 항체인 GA101.
Figure pct00121
Figure pct00122
동물은 도 59에 설명된 실험 계획에 따라 치료되었다. 고형 WSU-DLCL2 이종이식편은 연구 0일에 8주령의 SCID 마우스에서 우측 옆구리에 1.5 x 105 세포를 피하 주사함으로써 확립하였다. 종양 세포 주사 7일 후, 마우스를 144 mm3의 평균 종양 부피를 갖는 실험 군으로 분류하였다. 212Pb-DOTAM을 접종 15일 후에 주사하고; 평균 종양 부피는 14일에 306 mm3였다.
군 A 내지 G의 마우스를 추적하여 치료의 효능을 평가하였다. PRIT의 경우, 투여된 활성은 사이클 당 20 μCi이었고, 1-단계 RIT에 대한 상응하는 활성은 10 μCi였고, 이러한 섭생법을 사용하여 혈액 및 정상 조직에서 더 긴 체류 시간으로 인한 급성 방사선-유발 독성을 방지하였다.
군 H, I 및 L의 마우스를 212Pb-DOTAM 또는 212Pb-DOTAM-BsAb의 최초 및 유일한 주사 24시간 후에 생체분포 목적을 위해 희생시키고 부검하고; 군 J 및 K를 각각 제2 및 제3 212Pb-DOTAM 주사 24시간 후에 희생시키고 부검하였다. 이러한 마우스에서 하기 기관 및 조직을 수확하였다: 혈액, 방광, 비장, 신장, 간, 폐, 근육, 꼬리, 피부 및 종양. 수집된 샘플을 칭량하고, 이어서 2470 위자드2 자동 감마 계수기(퍼킨엘머)를 사용하여 방사능을 측정하고, 후속적으로 붕괴 및 배경 교정을 포함하여 조직 1 g 당 주사된 선량 백분율(%ID/g)을 계산하였다.
PRIT의 경우, CEA-DOTAM BsAb 또는 DIG-DOTAM(음성 대조군 BsAb)을 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6.0)에서 i.p 투여를 위한 200 μL 당 100 μg의 최종 농도로 희석하였다. Ca-DOTAM-덱스트란-500 CA를 BsAb 주사 7일 후 i.p. 투여하고(200 μL 당 25 μg), 24시간 후 Ca-급랭된 212Pb-DOTAM(100 μL 중 20 μCi)을 투여하였다.
1-단계 RIT로 치료된 마우스는 i.v. 주사 전에 37℃에서 10분 동안 212Pb-DOTAM을 CD20-DOTAM BsAb와 함께 항온처리하여 제조된 사전-결합된 212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM을 수용하였다(0.9% NaCl의 100 μL 중 20 μCi/20 μg BsAb).
리툭시맙[맙테라(MabThera, 등록상표)] 또는 GA101(오비누투주맙)으로 치료된 마우스에 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6.0)에서 200 μL 중 600 μg의 최종 농도로 희석된 각각의 항체를 i.v. 주사하였다. 주사는 PRIT- 및 RIT-치료군에 대한 방사능 주사와 같은 날에 수행하였다.
예비 결과, 162
본 실시예를 작성하는 시점에 연구가 아직 진행 중이지만, 이에 따라 예비 결과를 보고할 수 있다.
주사 24시간 후 모든 수집된 조직에서 평균 212Pb 축적 및 클리어런스는 도 60의 제1 치료 사이클에 대해 도시된다. 음성 PRIT 대조군은 종양에서 흡수가 없었다(0.7%ID/g). 종양 흡수는 CD20-PRIT 및 CD20-RIT 둘 다에 대해 22%ID/g였다.
평가된 치료에 대한 평균 종양 발달은 도 61에 도시된다. 비-치료 비히클 군, DIG-DOTAM 군 및 항체-기반 치료군의 종양은 꾸준히 성장하였다. 대조적으로, CD20-RIT 및 CD20-PRIT 군의 종양은 제1 치료 사이클 후에 크기가 감소하였다.
모든 치료군의 BW 발달은 도 62에 도시된다. 212Pb-DOTAM의 20 μCi의 다중 주사는 잘 견딜 수 있었지만, 사전-결합된 212Pb-DOTAM-CD20-DOTAM의 10 μCi는 BW의 유의한 강하를 야기하였다.
요약 및 결론
본 연구는 이전에 CEA-PRIT에 대해 증명된 바와 필적하는 종양 성장 억제의 표시와 함께 CD20-PRIT의 개념 증명을 나타냈다. CD20-PRIT 치료는 잘 견디어졌고, 1-단계 CD20-RIT 치료에서는 그렇지 않았다.
본 발명의 추가 양태
하기 넘버링된 문단은 본 발명의 특정 추가 양상 및 양태를 나타낸다.
1. DOTAM 및 DOTAM의 기능적 변이체로부터 선택되는 킬레이트화제에 접합된 덱스트란 또는 이의 유도체를 포함하는 클리어링제로서, 상기 킬레이트화제가 금속 이온과 복합되는, 클리어링제.
2. 문단 1에 있어서, 하기 화학식의 화합물인 클리어링제:
덱스트란-(연결기-(M-DOTAM))x
상기 식에서,
덱스트란은 덱스트란 또는 이의 유도체이고;
연결기는 연결 모이어티이고;
M-DOTAM은 금속 이온을 혼입하는 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체이고;
x ≥ 1이다.
3. 문단 1에 있어서, x가 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상 또는 50 이상인, 클리어링제.
4. 문단 2 또는 문단 3에 있어서, 연결 모이어티가 하기 화학식의 2가 기인, 클리어링제:
Figure pct00123
상기 식에서,
y는 1 내지 6이고;
*는 덱스트란에 대한 부착점을 나타내고;
**는 DOTAM의 고리 원자 또는 이의 기능적 변이체에 대한 부착점을 나타낸다.
5. 상기 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 덱스트란의 유도체가 아미노산, 및 글루코스 이외의 사카라이드로부터 선택되는 하나 이상의 기로 임의적으로 치환된 아미노덱스트란인, 클리어링제.
6. 상기 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 덱스트란 또는 덱스트란 유도체의 글루코스 단위의 수의 백분율로서 DOTAM 기의 수가 1% 이상, 1.5% 이상, 2% 이상, 2.5% 이상, 3% 이상, 5% 이상인, 클리어링제.
7. 상기 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 덱스트란의 평균 분자량이 200 내지 800 kDa, 임의적으로 300, 350, 400 또는 450 kDa 초과, 임의적으로 700, 650, 600 또는 550 kDa 미만, 임의적으로 약 500 kDa인, 클리어링제.
8. 문단 7에 있어서, 분자량 컷-오프 미만의 덱스트란 성분 또는 클리어링제가 제거되고, 이때 분자량 컷-오프가 50 kDa 이상, 100 kDa 이상 또는 200 kDa 이상인, 클리어링제.
9. 문단 8에 있어서, 분자량 컷-오프가 50 내지 250 kDa 또는 50 내지 200 kDa, 임의적으로 100 내지 200 kDa, 임의적으로 약 100 kDa, 150 kDa 또는 200 kDa인, 클리어링제.
10. 문단 7 내지 문단 9 중 어느 한 문단에 있어서, 평균 분자량이 450 내지 550 kDa, 예컨대 약 500 kDa인, 클리어링제.
11. 상기 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 금속 이온이 안정한 동위원소 또는 본질적으로 안정한 동위원소인, 클리어링제.
12. 상기 문단 중 어느 한 문단에 있어서, 금속 이온이 Pb, Bi 또는 Ca 이온인, 클리어링제.
13. 덱스트란 또는 덱스트란 유도체를 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체 또는 유도체에 접합하는 단계를 포함하는 클리어링제의 제조 방법으로서, DOTAM을 덱스트란에 접합하기 전에 및/또는 후에 DOTAM을 금속 이온으로 킬레이트화시키는 단계를 포함하는, 방법.
14. 문단 l3에 있어서, 금속 이온이 안정하거나 본질적으로 안정한 금속 이온인, 방법.
15. 문단 13 또는 문단 14에 있어서, 금속 이온이 Pb, Bi 또는 Ca 이온인, 방법.
16. 문단 13 내지 문단 15 중 어느 한 문단에 있어서, 접합 전에 덱스트란 또는 덱스트란 유도체가 50 kDa 이상, 100 kDa 이상 또는 200 kDa 이상의 분자량 컷-오프/역치 미만의 종을 제거하는 여과 단계에 적용되고/거나. 방법이 50 kDa 이상, 100 kDa 이상 또는 200 kDa 이상의 분자량 컷-오프/역치 미만의 종을 제거하기 위해 접합체를 여과 단계에 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
17. 문단 1 내지 12 중 어느 한 문단에 있어서, 방사선면역요법 또는 방사선면역영상화의 방법에 사용하기 위한 클리어링제.
18. 문단 1 내지 12 중 어느 한 문단에 있어서,
i) Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 표적 항원에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적 또는 이중특이적 항체를 대상에게 투여하는 단계로서, 투여 후 항체가 표적 항원에 결합하고, 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되는, 단계;
ii) 문단 1 내지 문단 11 중 어느 한 문단에 따른 클리어링제를 투여하는 단계로서, 상기 클리어링제가 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 결합 부위에서 항체에 결합할 수 있고 클리어런스를 증가시키고/거나 세포의 표면에 국지화되지 않은 항체의 항원 결합 부위를 차단하는, 단계
를 포함하는 사전-표적화된 방사선영상화 방법으로서, 임의적으로 iii) 후속적으로, Pb 방사성 동위원소로 킬레이트화된 DOTAM을 포함하는 복합체를 투여하는 단계로서, 상기 복합체가 세포의 표면에 국지화된 항체에 결합하는 단계를 추가로 포함하고; 임의적으로 iv) 킬레이트화된 방사성핵종이 국지화된 조직 또는 기관을 영상화하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 사용하기 위한 클리어링제.
19. 문단 1 내지 12 중 어느 한 문단에 있어서,
i) Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 표적 항원에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적 또는 이중특이적 항체를 대상에게 투여하는 단계로서, 투여 후 항체가 표적 항원에 결합하고, 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되는, 단계;
ii) 문단 1 내지 12 중 어느 한 문단에 따른 클리어링제를 투여하는 단계로서, 상기 클리어링제가 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 결합 부위에서 항체에 결합할 수 있고, 항체의 클리어런스를 증가시키고/거나 세포의 표면에 국지화되지 않은 항체의 항원 결합 부위를 차단하는, 단계
를 포함하는, 사전-표적화된 방사선면역요법의 방법으로서, 임의적으로 iii) 후속적으로 Pb 방사성 동위원소로 킬레이트화된 DOTAM을 포함하는 복합체를 투여하는 단계로서, 상기 복합체가 세포의 표면에 국지화된 항체에 결합하는, 단계를 추가로 포함하는 방법에 사용하기 위한 클리어링제.
20. i) Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 표적 항원에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적 또는 이중특이적 항체를 대상에게 투여하는 단계로서, 투여 후 항체가 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되는 단계;
ii) 문단 1 내지 12 중 어느 한 문단에 따른 클리어링제를 투여하는 단계로서, 상기 클리어링제가 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 결합 부위에서 항체에 결합할 수 있고, 항체의 클리어런스를 증가시키고/거나 세포의 표면에 국지화되지 않은 항체의 항원 결합 부위를 차단하는, 단계
를 포함하고, 임의적으로 iii) 후속적으로 Pb 방사성 동위원소로 킬레이트화된 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 복합체를 투여하는 단계로서, 상기 복합체가 세포의 표면에 국지화된 항체에 결합하는, 단계를 추가로 포함하고; 임의적으로 iv) 킬레이트화된 방사성핵종이 국지화된 조직 또는 기관을 영상화하는 단계를 추가로 포함하는, 사전-표적화된 방사선영상화 방법.
21. i) Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 표적 항원에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적 또는 이중특이적 항체를 대상에게 투여하는 단계로서, 투여 후 항체가 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되는, 단계;
ii) 문단 1 내지 12 중 어느 한 문단에 따른 클리어링제를 투여하는 단계로서, 상기 클리어링제가 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 결합 부위에서 항체에 결합할 수 있고 항체의 클리어런스를 증가시키고/거나 세포의 표면에 국지화되지 않은 항체의 항원 결합 부위를 차단하는, 단계
를 포함하고, 임의적으로 iii) 후속적으로 Pb 방사성 동위원소로 킬레이트화된 DOTAM 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 복합체를 투여하는 단계로서, 상기 복합체가 세포의 표면에 국지화된 항체에 결합하는, 단계를 추가로 포함하는, 사전-표적화 방사선면역요법의 방법.
22. Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위가 적어도
a) 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKG(서열번호 2), 또는 서열번호 2에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 상기 치환이 Phe50, Asp56 및 Tyr58을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Gly52 및/또는 Arg54를 포함하지 않는, 중쇄 CDR2;
b) 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL(서열번호 3), 또는 서열번호 3에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 상기 치환이 Glu95, Arg96, Asp97 및 Pro98을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Ala100C, Tyr100D 및/또는 Pro100E를 포함하지 않고/거나 임의적으로 또한 Tyr99를 포함하지 않는, 중쇄 CDR3;
c) 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA(서열번호 4), 또는 서열번호 4에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 상기 치환이 Tyr28 및 Asp32를 포함하지 않는, 경쇄 CDR1;
d) 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG(서열번호 6), 또는 서열번호 6에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 상기 치환이 Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및 Tyr96을 포함하지 않는, 경쇄 CDR3
을 포함하고, 넘버링이 카밧에 따르는, 문단 18 또는 문단 19에 따른 클리어링제 또는 문단 20 또는 문단 21에 따른 방법.
23. 문단 22에 있어서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위가 중쇄 CDR1 및 경쇄 CDR2를 추가로 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
24. 문단 23에 있어서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위가 i) 아미노산 서열 GFSLSTYSMS(서열번호 1), 또는 서열번호 1에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환, 임의적으로 보존적 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1; 및/또는 ii) 아미노산 서열 QASKLAS(서열번호 5), 또는 서열번호 5에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환, 임의적으로 보존적 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2를 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
25. 문단 18 내지 문단 24 중 어느 한 문단에 있어서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위가
a) 아미노산 서열 GFSLSTYSMS(서열번호 1)를 포함하는 중쇄 CDR1;
b) 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKWG(서열번호 2)를 포함하는 중쇄 CDR2;
c) 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL(서열번호 3)을 포함하는 중쇄 CDR3;
d) 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA(서열번호 4)를 포함하는 경쇄 CDR1;
e) 아미노산 서열 QASKLAS(서열번호 5)를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
f) 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG(서열번호 6)를 포함하는 경쇄 CDR3
으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
26. 문단 18 내지 문단 25 중 어느 한 문단에 있어서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위가
i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체; 또는
i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체
와 동일한 Pb-DOTAM 킬레이트의 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는, 클리어링제 또는 방법.
27. 문단 18 내지 문단 26 중 어느 한 문단에 있어서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위가 인간, 키메라 또는 인간화된 것인, 클리어링제 또는 방법.
28. 문단 18 내지 문단 27 중 어느 한 문단에 있어서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 7 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
29. 문단 18 내지 문단 28 중 어느 한 문단에 있어서, Pb-DOTAM에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 8 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
30. 문단 18 내지 문단 29 중 어느 한 문단에 있어서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
31. 문단 18 내지 문단 30 중 어느 한 문단에 있어서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
32. 문단 18 내지 문단 30 중 어느 한 문단에 있어서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위가 Pb-DOTAM 킬레이트에 100 pM, 50 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM 이하의 Kd 값으로 결합하는, 클리어링제 또는 방법.
33. 문단 18 내지 문단 32 중 어느 한 문단에 있어서, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위가 Pb-DOTAM 킬레이트 및 Bi-DOTAM 킬레이트에 결합하고, Bi-DOTAM 킬레이트/Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 Kd 값의 비가 0.1 내지 10 또는 1 내지 10인, 클리어링제 또는 방법.
34. 문단 18 내지 문단 33 중 어느 한 문단에 있어서, 표적 항원이 종양-특이적 항원인, 클리어링제 또는 방법.
35. 문단 18 내지 문단 34 중 어느 한 문단에 있어서, 종양-특이적 항원이 CEA, HER2 및 CD20으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 클리어링제 또는 방법.
36. 문단 18 내지 문단 35 중 어느 한 문단에 있어서, 종양-특이적 항원이 암배아 항원(CEA)인, 클리어링제 또는 방법.
37. 문단 18 내지 문단 36 중 어느 한 문단에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 CEA에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고,
CEA에 특이적인 항원 결합 부위가 적어도 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하고, d) 중쇄 CDR1이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, e) 중쇄 CDR2가 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, f) 중쇄 CDR3이 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고/거나,
CEA에 특이적인 항원 결합 부위가 적어도 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하고, a) 경쇄 CDR1이 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, b) 경쇄 CDR2가 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고, c) 경쇄 CDR3이 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
38. 문단 37에 있어서, CEA에 특이적인 항원 결합 부위가
a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
d) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
e) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
f) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3
으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의(즉, 모든) CDR을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
39. 문단 18 내지 문단 38 중 어느 한 문단에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 CEA에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고,
CEA에 특이적인 항원 결합 부위가
i) 서열번호 17의 아미노산 서열, 또는 서열번호 17과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및/또는
ii) 서열번호 18의 아미노산 서열, 또는 서열번호 18과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인
을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
40. 문단 39에 있어서, CEA에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
41. 문단 18 내지 문단 35 중 어느 한 문단에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 ERBB2에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, ERBB2에 특이적인 항원 결합 부위가 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
42. 문단 18 내지 문단 35 및 문단 41 중 어느 한 문단에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 ERBB2에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, ERBB2에 특이적인 항원 결합 부위가
i) 서열번호 34의 아미노산 서열, 또는 서열번호 34와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및/또는
ii) 서열번호 35의 아미노산 서열, 또는 서열번호 35와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인
을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
43. 문단 42에 있어서, ERBB2에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
44. 문단 18 내지 문단 35 중 어느 한 문단에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 CD20에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, CD20에 특이적인 항원 결합 부위가 (a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
45. 문단 18 내지 문단 35 및 문단 44 중 어느 한 문단에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 CD20에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, CD20에 특이적인 항원 결합 부위가
i) 서열번호 45의 아미노산 서열, 또는 서열번호 45와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및/또는
ii) 서열번호 46의 아미노산 서열, 또는 서열번호 46과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인
을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
46. 문단 45에 있어서, CD20에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
47. 문단 18 내지 문단 46 중 어느 한 문단에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Fc 영역을 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
48. 문단 47에 있어서, Fc 영역이 효과기 기능을 감소시키도록 엔지니어링되는, 클리어링제 또는 방법.
49. 문단 47에 있어서, Fc 영역이 하나 이상의 잔기 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 및/또는 329의 치환에 의해 엔지니어링되는, 클리어링제 또는 방법.
50. 문단 47 내지 문단 49 중 어느 한 문단에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 제1 항체 중쇄 및 제2 항체 중쇄 및 제1 항체 경쇄 및 제2 항체 경쇄를 포함하는 전장 항체를 포함하되, 제1 항체 중쇄 및 제1 항체 경쇄가 조립되어 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, 제2 항체 중쇄 및 제2 항체 경쇄가 조립되어 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, 제1 항원 또는 제2 항원이 Pb-DOTAM 킬레이트이고, 다른 하나가 표적 항원인, 클리어링제.
51. 문단 50에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 제1 항원에 대한 추가 항원 결합 모이어티를 추가로 포함하는, 클리어링제.
52. 문단 51에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 제1 항체 중쇄 및 제2 항체 중쇄 및 제1 항체 경쇄 및 제2 항체 경쇄를 포함하는 전장 항체를 포함하되, 제1 항체 중쇄 및 제1 항체 경쇄가 조립되어 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 Fab를 형성하고, 제2 항체 중쇄 및 제2 항체 경쇄가 조립되어 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 크로스-Fab를 형성하고, 제1 항체 중쇄 또는 제2 항체 중쇄가 연결기를 통해, CH1 및 VH 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드에 융합되고, 제1 폴리펩티드가, CL 및 VL을 포함하는 제2 폴리펩티드와 조립되어 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 Fab를 형성하는, 클리어링제.
53. 문단 52에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 제2 항체 중쇄의 N-말단이 연결기를 통해 제1 폴리펩티드에 융합되는, 클리어링제.
54. 문단 47 내지 문단 49 중 어느 한 문단에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 i) 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 전장 항체; 및 ii) 적어도, 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 함께 형성하는 제2 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 제1 항원 또는 제2 항원이 Pb-DOTAM 킬레이트이고, 다른 하나가 표적 항원인, 클리어링제.
55. 문단 54에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 전장 항체를 포함하되, 하나의 중쇄의 N-말단 또는 C-말단이 폴리펩티드 연결기를 통해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 회합되어 제2 항원에 대한 결합 부위를 포함하는 Fab 또는 크로스-Fab를 형성하는, 클리어링제.
56. 문단 55에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하도록,
i) VH 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어지고, VL 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합되는 제1 폴리펩티드;
ii) VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어지고, VH 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합되는 제1 폴리펩티드; 또는
iii) VH 도메인 및 CL 도메인으로 이루어지고, VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합되는 제1 폴리펩티드
를 포함하는, 클리어링제.
57. 문단 56에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 전장 항체를 포함하되, 중쇄 중 하나의 C-말단이 폴리펩티드 연결기를 통해, VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제1 폴리펩티드에 연결되고, VH 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합되는, 클리어링제.
58. 문단 44에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체;
b) i) 항체 중쇄 가변 도메인(VH); ii) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 불변 도메인(CH1); 또는 iii) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드; 또는
c) i) 항체 경쇄 가변 도메인(VL); ii) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드
를 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
59. 문단 50 내지 문단 58 중 어느 한 문단에 있어서, 제1 항원이 표적 항원이고, 제2 항원이 Pb-DOTAM 킬레이트인, 클리어링제 또는 방법.
60. 문단 59에 있어서, 제1 항원이 CEA인, 클리어링제 또는 방법.
61. 문단 60에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 a) CEA를 특이적으로 결합하고, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체로서, 중쇄가 서열번호 22 또는 23의 아미노산 1 내지 450의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 경쇄가 서열번호 21의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는, 전장 항체; 및/또는
b) i) 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH); ii) 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1); 또는 iii) 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드; 및/또는
c) i) 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL); ii) 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 다른 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드
를 포함하되, (b)의 펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 및 (c)의 펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인이 함께 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 항원 결합 부위를 형성하는, 클리어링제 또는 방법.
62. 문단 60에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 a) CEA를 특이적으로 결합하고, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체로서, 상기 항체 중쇄가 서열번호 19 또는 서열번호 20의 아미노산 1 내지 450의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 상기 항체 경쇄가 서열번호 21의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는, 전장 항체;
b) i) 서열번호 9의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH); ii) 서열번호 9의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1); 또는 iii) 서열번호 9의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드; 및
c) i) 서열번호 10의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL); ii) 서열번호 10의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 서열번호 10의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드
를 포함하되, (b)의 펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 및 (c)의 펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인이 함께 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 항원 결합 부위를 형성하는, 클리어링제 또는 방법.
63. 문단 62에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가
i) 서열번호 22의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄;
ii) 서열번호 23의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 제2 중쇄;
iii) 서열번호 21의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 2개의 항체 경쇄
를 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
64. 문단 62에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄;
ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄; 및
iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 2개의 항체 경쇄
를 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
65. 문단 62에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 i) 서열번호 19의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄;
ii) 서열번호 20의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 제2 중쇄; 및
iii) 서열번호 21의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 2개의 항체 경쇄
를 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
66. 문단 62에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항체가 i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄;
ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄; 및
iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 2개의 항체 경쇄
를 포함하는, 클리어링제 또는 방법.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> ANTIBODIES FOR CHELATED RADIONUCLIDES <130> 007470503 <140> PCT/EP2019/059856 <141> 2019-04-16 <150> US 62/658,468 <151> 2018-04-16 <160> 82 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 <Pb-Dotam> PRIT-213 <400> 1 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 <Pb-Dotam> PRIT-213 <400> 2 Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 <Pb-Dotam> PRIT-213 <400> 3 Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 <Pb-Dotam> PRIT-213 <400> 4 Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 <Pb-Dotam> PRIT-213 <400> 5 Gln Ala Ser 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Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable domain <Pb-Dotam> PRIT-214 <400> 10 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn 20 25 30 Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu 85 90 95 Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 <CEA> <400> 11 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His 1 5 10 <210> 12 <211> 17 <212> 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Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 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Ser 580 585 590 <210> 20 <211> 581 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain 2 of bispecific, trivalent<CEA/Pb-Dotam> PRIT-214 VL_84.66 <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln 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Artificial Sequence <220> <223> heavy chain 1 of bispecific, <CEA/Pb-Dotam> Rabbit Dotam _84.66 <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 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Rabbit Dotam_84.66 <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 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chain 1 (knob) of bispecific, trivalent ERbB2/Pb-Dotam (P1AD9827) <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr 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ERbB2/Pb-Dotam (P1AD9827) <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 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Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Ser Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Pro 465 470 475 480 Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser His Ser Val 485 490 495 Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro 500 505 510 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Ser 515 520 525 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile 530 535 540 Ser Gly Val Gln Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly 545 550 555 560 Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val 565 570 575 Val Val Lys <210> 75 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC1 <400> 75 Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp 20 25 30 Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp 85 90 95 Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 76 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC3 <400> 76 Ala Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn 20 25 30 Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu 85 90 95 Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 77 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC7 <400> 77 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 35 40 45 Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 78 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1A1A VH <400> 78 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 79 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1A1A VL <400> 79 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 80 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P1AA1227_HC <400> 80 Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser 20 25 30 Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly 35 40 45 Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr 65 70 75 80 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 <210> 81 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P1AA1227_LC <400> 81 Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp 20 25 30 Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp 85 90 95 Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 82 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunomedics hNM14 <400> 82 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (57)

  1. 납(Pb)-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 항체로서,
    상기 항원 결합 부위가 적어도
    a) 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKG(서열번호 2), 또는 서열번호 2에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 상기 치환이 Phe50, Asp56 및 Tyr58을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Gly52 및/또는 Arg54를 포함하지 않는, 중쇄 CDR2;
    b) 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL(서열번호 3), 또는 서열번호 3에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 상기 치환이 Glu95, Arg96, Asp97 및 Pro98을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Ala100C, Tyr100D 및/또는 Pro100E를 포함하지 않고/거나 임의적으로 또한 Tyr99를 포함하지 않는, 중쇄 CDR3;
    c) 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA(서열번호 4), 또는 서열번호 4에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 상기 치환이 Tyr28 및 Asp32를 포함하지 않는, 경쇄 CDR1;
    d) 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG(서열번호 6), 또는 서열번호 6에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 상기 치환이 Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및 Tyr96을 포함하지 않는, 경쇄 CDR3
    을 포함하고, 넘버링(numbering)이 카밧(Kabat)에 따르는, 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    중쇄 CDR1 및 경쇄 CDR2를 추가로 포함하는 항체.
  3. 제2항에 있어서,
    i) 아미노산 서열 GFSLSTYSMS(서열번호 1), 또는 서열번호 1에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환, 임의적으로 보존적 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1; 및/또는
    ii) 아미노산 서열 QASKLAS(서열번호 5), 또는 서열번호 5에서 1, 2 또는 3개 이하의 치환, 임의적으로 보존적 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2
    를 포함하는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 부위가
    a) 아미노산 서열 GFSLSTYSMS(서열번호 1)를 포함하는 중쇄 CDR1;
    b) 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKWG(서열번호 2)를 포함하는 중쇄 CDR2;
    c) 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL(서열번호 3)을 포함하는 중쇄 CDR3;
    d) 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA(서열번호 4)를 포함하는 경쇄 CDR1;
    e) 아미노산 서열 QASKLAS(서열번호 5)를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    f) 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG(서열번호 6)를 포함하는 경쇄 CDR3
    으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는,
    항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체; 또는
    i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체
    와 동일한 Pb-DOTAM 킬레이트의 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간, 키메라 또는 인간화된 항체인 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 부위가 서열번호 7 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 부위가 서열번호 8 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 부위가 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 부위가 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 부위가 Pb-DOTAM 킬레이트에 100 pM, 50 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM 또는 1 pM 이하의 Kd 값으로 결합하는, 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 부위가 Pb-DOTAM 킬레이트 및 Bi-DOTAM 킬레이트에 결합하고, Bi-DOTAM 킬레이트/Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 Kd 값의 비가 0.1 내지 10 또는 1 내지 10인, 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    전장 항체, 또는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체 또는 단일-쇄 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 항원에 특이적으로 결합하는 모이어티에 커플링되는 항체.
  15. 제14항에 있어서,
    표적 항원이 종양 특이적 항원인, 항체.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    다중특이적 또는 이중특이적 항체, 임의적으로 제17항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 다중특이적 또는 이중특이적 항체안 항체.
  17. Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 표적 항원에 대한 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  18. 제17항에 있어서,
    Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위가 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    표적 항원이 종양 특이적 항원인, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  20. 제19항에 있어서,
    종양 특이적 항원이 CEA, HER2 및 CD20으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  21. 제20항에 있어서,
    종양 특이적 항원이 암배아 항원(CEA)인, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 CEA에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고,
    CEA에 특이적인 항원 결합 부위가 적어도 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하고, d) 중쇄 CDR1이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, e) 중쇄 CDR2가 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, f) 중쇄 CDR3이 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고/거나,
    CEA에 특이적인 항원 결합 부위가 적어도 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하고, a) 경쇄 CDR1이 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, b) 경쇄 CDR2가 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고, c) 경쇄 CDR3이 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는,
    다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  23. 제22항에 있어서,
    CEA에 특이적인 항원 결합 부위가
    a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
    b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
    c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    d) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
    e) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    f) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3
    으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의(즉, 모든) CDR을 포함하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 CEA에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고,
    CEA에 특이적인 항원 결합 부위가
    i) 서열번호 17의 아미노산 서열, 또는 서열번호 17과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및/또는
    ii) 서열번호 18의 아미노산 서열, 또는 서열번호 18과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인
    을 포함하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  25. 제24항에 있어서,
    CEA에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  26. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 ERBB2에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, ERBB2에 특이적인 항원 결합 부위가 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  27. 제17항 내지 제20항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 ERBB2에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, ERBB2에 특이적인 항원 결합 부위가
    i) 서열번호 34의 아미노산 서열, 또는 서열번호 34와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및/또는
    ii) 서열번호 35의 아미노산 서열, 또는 서열번호 35와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인
    을 포함하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  28. 제27항에 있어서,
    ERBB2에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  29. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 CD20에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, CD20에 특이적인 항원 결합 부위가 (a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  30. 제17항 내지 제20항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    다중특이적 또는 이중특이적 항체가 Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 CD20에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, CD20에 특이적인 항원 결합 부위가
    i) 서열번호 45의 아미노산 서열, 또는 서열번호 45와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및/또는
    ii) 서열번호 46의 아미노산 서열, 또는 서열번호 46과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인
    을 포함하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  31. 제30항에 있어서,
    CD20에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  32. 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역을 포함하는 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  33. 제32항에 있어서,
    Fc 영역이 효과기 기능을 감소시키도록 엔지니어링(engineering)된, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  34. 제33항에 있어서,
    Fc 영역이 하나 이상의 Fc 영역 잔기 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 및/또는 329의 치환에 의해 엔지니어링되는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항체 중쇄 및 제2 항체 중쇄 및 제1 항체 경쇄 및 제2 항체 경쇄를 포함하는 전장 항체를 포함하되, 제1 항체 중쇄 및 제1 항체 경쇄가 조립(assembling)되어 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, 제2 항체 중쇄 및 제2 항체 경쇄가 조립되어 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, 제1 항원 또는 제2 항원이 Pb-DOTAM 킬레이트이고, 다른 하나가 표적 항원인, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  36. 제35항에 있어서,
    제1 항원에 대한 추가 항원 결합 모이어티를 추가로 포함하는 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  37. 제36항에 있어서,
    제1 항체 중쇄 및 제2 항체 중쇄 및 제1 항체 경쇄 및 제2 항체 경쇄를 포함하는 전장 항체를 포함하되, 제1 항체 중쇄 및 제1 항체 경쇄가 조립되어 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 Fab를 형성하고, 제2 항체 중쇄 및 제2 항체 경쇄가 조립되어 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 크로스-Fab를 형성하고, 제1 항체 중쇄 또는 제2 항체 중쇄가 연결기를 통해, CH1 및 VH 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드에 융합되고, 제1 폴리펩티드가, CL 및 VL을 포함하는 제2 폴리펩티드와 조립되어 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 Fab를 형성하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  38. 제37항에 있어서,
    제2 항체 중쇄의 N-말단이 연결기를 통해 제1 폴리펩티드에 융합되는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  39. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 전장 항체; 및
    ii) 적어도, 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 함께 형성하는 제2 중쇄 가변 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인
    을 포함하되, 제1 항원 또는 제2 항원이 Pb-DOTAM 킬레이트이고, 다른 하나가 표적 항원인, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  40. 제39항에 있어서,
    제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 전장 항체를 포함하되, 하나의 중쇄의 N-말단 또는 C-말단이 폴리펩티드 연결기를 통해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 회합되어 제2 항원에 대한 결합 부위를 포함하는 Fab 또는 크로스-Fab를 형성하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  41. 제40항에 있어서,
    제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하도록,
    i) VH 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어지고, VL 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합되는 제1 폴리펩티드;
    ii) VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어지고, VH 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합되는 제1 폴리펩티드; 또는
    iii) VH 도메인 및 CL 도메인으로 이루어지고, VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합되는 제1 폴리펩티드
    를 포함하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  42. 제41항에 있어서,
    제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 전장 항체를 포함하되, 중쇄 중 하나의 C-말단이 폴리펩티드 연결기를 통해, VL 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 제1 폴리펩티드에 연결되고, VH 도메인 및 CL 도메인으로 이루어진 제2 폴리펩티드와 회합되는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  43. 제39항에 있어서,
    a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체;
    b) i) 항체 중쇄 가변 도메인(VH); ii) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 불변 도메인(CH1); 또는 iii) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드; 또는
    c) i) 항체 경쇄 가변 도메인(VL); ii) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드
    를 포함하는 다중특이적 또는 이중특이적 항체로서,
    (b)의 펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 및 (c)의 펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인이 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, 제1 항원 또는 제2 항원이 Pb-DOTAM 킬레이트이고, 다른 하나가 표적 항원인, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  44. 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원이 표적 항원이고, 제2 항원이 Pb-DOTAM 킬레이트인, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  45. 제44항에 있어서,
    제1 항원이 CEA인, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  46. 제45항에 있어서,
    a) CEA를 특이적으로 결합하고, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체로서, 중쇄가 서열번호 22 또는 23의 아미노산 1 내지 450의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 경쇄가 서열번호 21의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는, 전장 항체;
    b) i) 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH); ii) 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1); 또는 iii) 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드; 및
    c) i) 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL); ii) 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 다른 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드
    를 포함하되, (b)의 펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 및 (c)의 펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인이 함께 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 항원 결합 부위를 형성하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  47. 제45항에 있어서,
    a) CEA를 특이적으로 결합하고, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체로서, 상기 항체 중쇄가 서열번호 19 또는 서열번호 20의 아미노산 1 내지 450의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 상기 항체 경쇄가 서열번호 21의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는, 전장 항체;
    b) i) 서열번호 9의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH); ii) 서열번호 9의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1); 또는 iii) 서열번호 9의 중쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VH 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드; 및
    c) i) 서열번호 10의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL); ii) 서열번호 10의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL); 또는 iii) 서열번호 10의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 불변 도메인(CH1)으로 이루어진 폴리펩티드로서, VL 도메인의 N-말단이 펩티드 연결기를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 다른 하나의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드
    를 포함하되, (b)의 펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 및 (c)의 펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인이 함께 Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 항원 결합 부위를 형성하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  48. 제45항에 있어서,
    i) 서열번호 22의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄;
    ii) 서열번호 23의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
    iii) 서열번호 21의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 2개의 항체 경쇄
    를 포함하는, 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  49. 제48항에 있어서,
    i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄;
    ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄; 및
    iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 2개의 항체 경쇄
    를 포함하는 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  50. 제45항에 있어서,
    i) 서열번호 19의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄;
    ii) 서열번호 20의 중쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 제2 중쇄; 및
    iii) 서열번호 21의 경쇄와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 2개의 항체 경쇄
    를 포함하는 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  51. 제50항에 있어서,
    i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄;
    ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄; 및
    iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 2개의 항체 경쇄
    를 포함하는 다중특이적 또는 이중특이적 항체.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 단리된 폴리뉴클레오티드 집합.
  53. 제52항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 단리된 폴리뉴클레오티드 집합을 포함하는 벡터.
  54. 벡터 집합을 포함하고, 제52항에 따른 폴리뉴클레오티드 집합을 함께 포함하는 키트 또는 조성물.
  55. 발현 벡터인 제53항에 따른 벡터 또는 제54항에 기재된 벡터 집합.
  56. 제52항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 단리된 폴리뉴클레오티드 집합을 포함하고, 임의적으로 제53항에 따른 벡터 또는 제54항에 기재된 벡터 집합을 포함하는 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포.
  57. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 항체를 제56항에 따른 숙주 세포로부터 발현하는 단계를 포함하는, 상기 항체의 제조 방법.
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