KR20210005116A - 모의 장내 환경 - Google Patents
모의 장내 환경 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210005116A KR20210005116A KR1020207033453A KR20207033453A KR20210005116A KR 20210005116 A KR20210005116 A KR 20210005116A KR 1020207033453 A KR1020207033453 A KR 1020207033453A KR 20207033453 A KR20207033453 A KR 20207033453A KR 20210005116 A KR20210005116 A KR 20210005116A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- simulated intestinal
- intestinal environment
- bacteria
- bacterial population
- species
- Prior art date
Links
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 title claims description 224
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 73
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 50
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 32
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 198
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 136
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 94
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 62
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 61
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 61
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 61
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 57
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 54
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 51
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims description 49
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims description 48
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 claims description 44
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 32
- 231100000517 death Toxicity 0.000 claims description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 29
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 28
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 26
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims description 25
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 claims description 24
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 21
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 17
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 claims description 16
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 13
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 13
- 241000186394 Eubacterium Species 0.000 claims description 12
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 12
- 241000702460 Akkermansia Species 0.000 claims description 10
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 claims description 10
- 241001531188 [Eubacterium] rectale Species 0.000 claims description 10
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 claims description 10
- 241000605861 Prevotella Species 0.000 claims description 9
- 239000011888 foil Substances 0.000 claims description 9
- 241001202853 Blautia Species 0.000 claims description 8
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 8
- 241001167556 Catena Species 0.000 claims description 7
- 241001464948 Coprococcus Species 0.000 claims description 7
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 7
- 241000220010 Rhode Species 0.000 claims description 7
- 241000605947 Roseburia Species 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- -1 propio Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 241001308653 Bariatricus Species 0.000 claims description 5
- 241000016537 Dorea longicatena Species 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 241001015936 Longicatena Species 0.000 claims description 5
- 241000385060 Prevotella copri Species 0.000 claims description 5
- 241000605036 Selenomonas Species 0.000 claims description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 5
- 125000005504 styryl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 5
- 241001584951 Anaerostipes hadrus Species 0.000 claims description 4
- 241001136167 Anaerotignum propionicum Species 0.000 claims description 4
- 241000220677 Coprococcus catus Species 0.000 claims description 4
- 241000605716 Desulfovibrio Species 0.000 claims description 4
- 241001143779 Dorea Species 0.000 claims description 4
- 241000186398 Eubacterium limosum Species 0.000 claims description 4
- 241001531190 Eubacterium ramulus Species 0.000 claims description 4
- 241001531275 Faecalitalea cylindroides Species 0.000 claims description 4
- 241000398180 Roseburia intestinalis Species 0.000 claims description 4
- 241000985249 [Clostridium] indolis Species 0.000 claims description 4
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 claims description 4
- 230000001431 metabolomic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000696 methanogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000186018 Bifidobacterium adolescentis Species 0.000 claims description 3
- 241000123777 Blautia obeum Species 0.000 claims description 3
- 241001464894 Blautia producta Species 0.000 claims description 3
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 claims description 3
- 241000949098 Coprococcus comes Species 0.000 claims description 3
- 241000872832 Roseburia hominis Species 0.000 claims description 3
- 241001394655 Roseburia inulinivorans Species 0.000 claims description 3
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 claims description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 claims description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 3
- 241001135230 Alistipes putredinis Species 0.000 claims description 2
- 241001227086 Anaerostipes Species 0.000 claims description 2
- 241001505572 Anaerostipes caccae Species 0.000 claims description 2
- 241000100356 Anaerostipes rhamnosivorans Species 0.000 claims description 2
- 241001105998 Bacteroides dorei Species 0.000 claims description 2
- 241001195773 Bacteroides massiliensis Species 0.000 claims description 2
- 241000606219 Bacteroides uniformis Species 0.000 claims description 2
- 241000606215 Bacteroides vulgatus Species 0.000 claims description 2
- 241000605059 Bacteroidetes Species 0.000 claims description 2
- 241000985922 Bariatricus massiliensis Species 0.000 claims description 2
- 241000186560 Blautia coccoides Species 0.000 claims description 2
- 241000301580 Butyricicoccus pullicaecorum Species 0.000 claims description 2
- 241000605900 Butyrivibrio fibrisolvens Species 0.000 claims description 2
- 241001464956 Collinsella Species 0.000 claims description 2
- 241001464949 Coprococcus eutactus Species 0.000 claims description 2
- 241000604463 Desulfovibrio piger Species 0.000 claims description 2
- 241001624700 Dialister invisus Species 0.000 claims description 2
- 241000605980 Faecalibacterium prausnitzii Species 0.000 claims description 2
- 241000604448 Megasphaera elsdenii Species 0.000 claims description 2
- 241000202985 Methanobrevibacter smithii Species 0.000 claims description 2
- 241001464921 Phascolarctobacterium Species 0.000 claims description 2
- 241000872831 Roseburia faecis Species 0.000 claims description 2
- 241000192031 Ruminococcus Species 0.000 claims description 2
- 241000192029 Ruminococcus albus Species 0.000 claims description 2
- 241000605031 Selenomonas ruminantium Species 0.000 claims description 2
- 241001261005 Verrucomicrobia Species 0.000 claims description 2
- 241000193462 [Clostridium] innocuum Species 0.000 claims description 2
- 241001531197 [Eubacterium] hallii Species 0.000 claims description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 claims 1
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 claims 1
- 241000801571 Phascolarctobacterium succinatutens Species 0.000 claims 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 claims 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 claims 1
- 241001148134 Veillonella Species 0.000 claims 1
- RZEKVGVHFLEQIL-UHFFFAOYSA-N celecoxib Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C1=CC(C(F)(F)F)=NN1C1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 RZEKVGVHFLEQIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960000590 celecoxib Drugs 0.000 claims 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 41
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 17
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 16
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 16
- 235000021391 short chain fatty acids Nutrition 0.000 description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 150000004667 medium chain fatty acids Chemical class 0.000 description 7
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 6
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 6
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 4
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 4
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000701474 Alistipes Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710174876 Probable triosephosphate isomerase 2 Proteins 0.000 description 3
- 101710174758 T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 3
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 3
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical compound CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 3-Methylbutanoic acid Natural products CC(C)CC([O-])=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- LKDRXBCSQODPBY-JDJSBBGDSA-N D-allulose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O LKDRXBCSQODPBY-JDJSBBGDSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 241000735552 Erythroxylum Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 241000906683 Nantis Species 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N beta-methyl-butyric acid Natural products CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 235000008957 cocaer Nutrition 0.000 description 2
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N ***e Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 2
- RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M cyanocobalamin Chemical compound N#C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 2
- 244000005702 human microbiome Species 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- BJHIKXHVCXFQLS-PQLUHFTBSA-N keto-D-tagatose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-PQLUHFTBSA-N 0.000 description 2
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 2
- QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N propionyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000012358 sourcing Methods 0.000 description 2
- 239000007143 thioglycolate medium Substances 0.000 description 2
- 229940005605 valeric acid Drugs 0.000 description 2
- FBOUIAKEJMZPQG-AWNIVKPZSA-N (1E)-1-(2,4-dichlorophenyl)-4,4-dimethyl-2-(1,2,4-triazol-1-yl)pent-1-en-3-ol Chemical compound C1=NC=NN1/C(C(O)C(C)(C)C)=C/C1=CC=C(Cl)C=C1Cl FBOUIAKEJMZPQG-AWNIVKPZSA-N 0.000 description 1
- XYHKNCXZYYTLRG-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole-2-carbaldehyde Chemical compound O=CC1=NC=CN1 XYHKNCXZYYTLRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 208000034309 Bacterial disease carrier Diseases 0.000 description 1
- 241000606126 Bacteroidaceae Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 241001557932 Butyricicoccus Species 0.000 description 1
- 241000605902 Butyrivibrio Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N Caprylic acid Natural products CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-CBPJZXOFSA-N D-Gulose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-CBPJZXOFSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-WHZQZERISA-N D-aldose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-WHZQZERISA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-IVMDWMLBSA-N D-allopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N D-ribulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-WUJLRWPWSA-N D-xylulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 241001535083 Dialister Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241001608234 Faecalibacterium Species 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VSOAQEOCSA-N L-altropyranose Chemical compound OC[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VSOAQEOCSA-N 0.000 description 1
- IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N L-cysteine hydrochloride Chemical compound Cl.SC[C@H](N)C(O)=O IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- 241000604449 Megasphaera Species 0.000 description 1
- 241000202987 Methanobrevibacter Species 0.000 description 1
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 1
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000692844 Prevotellaceae Species 0.000 description 1
- 239000004146 Propane-1,2-diol Substances 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000692845 Rikenellaceae Species 0.000 description 1
- 241000095588 Ruminococcaceae Species 0.000 description 1
- 241001486234 Sciota Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001148135 Veillonella parvula Species 0.000 description 1
- 241001430183 Veillonellaceae Species 0.000 description 1
- 241001183271 Verrucomicrobiaceae Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N acetoacetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-STGXQOJASA-N alpha-D-lyxopyranose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-STGXQOJASA-N 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 108010054176 apotransferrin Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 210000001815 ascending colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 210000003323 beak Anatomy 0.000 description 1
- GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N benzyl(trichloro)silane Chemical compound Cl[Si](Cl)(Cl)CC1=CC=CC=C1 GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 229940046414 biotin 1 mg Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- JEJBBWQXAMSBQT-UHFFFAOYSA-N butanedioic acid;propanoic acid Chemical compound CCC(O)=O.OC(=O)CCC(O)=O JEJBBWQXAMSBQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JSHMCUNOMIZJDJ-UHFFFAOYSA-N butanoyl dihydrogen phosphate Chemical compound CCCC(=O)OP(O)(O)=O JSHMCUNOMIZJDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000480 butynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N butyryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 229960002104 cyanocobalamin Drugs 0.000 description 1
- 235000000639 cyanocobalamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011666 cyanocobalamin Substances 0.000 description 1
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001731 descending colon Anatomy 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012912 drug discovery process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229940019142 folic acid 5 mg Drugs 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000005095 gastrointestinal system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 229910052732 germanium Inorganic materials 0.000 description 1
- GNPVGFCGXDBREM-UHFFFAOYSA-N germanium atom Chemical compound [Ge] GNPVGFCGXDBREM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011121 hardwood Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- BTIJJDXEELBZFS-UHFFFAOYSA-K hemin Chemical compound [Cl-].[Fe+3].[N-]1C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C)C(=C4)[N-]3)C=C)=N2)C=C)=C(C)C(CCC(O)=O)=C1C=C1C(CCC(O)=O)=C(C)C4=N1 BTIJJDXEELBZFS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002454 idoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000008986 metabolic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- BDRTVPCFKSUHCJ-UHFFFAOYSA-N molecular hydrogen;potassium Chemical compound [K].[H][H] BDRTVPCFKSUHCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 1
- 239000006880 nzcym-medium Substances 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004063 propylene glycol Drugs 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 125000002568 propynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229940047034 riboflavin 5 mg Drugs 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000020046 sherry Nutrition 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 210000003384 transverse colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 229940070710 valerate Drugs 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 239000002912 waste gas Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5038—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving detection of metabolites per se
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 시험관내에서 관심 대상 세포의 대사 특성들을 결정하기 위한 조성, 공정 및 키트를 제공한다.
Description
본 발명은 시험관내에서 관심 대상 세포의 대사 특성들을 결정할 수 있게 하는 모의 장내 환경을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 환경을 이용하는 시스템, 및 이러한 환경과 시스템이 이용되는 공정에 관한 것이다.
인간 장관(intestine)은 자궁 내에서는 멸균 상태인 것으로 생각되나, 출생 직후 매우 다양한 모체 및 환경 미생물에 노출된다. 그 이후, 미생물 콜로니화 및 계대의 역동적인 시기가 발생하며, 이는 전달 모드, 환경, 식이 및 숙주 유전형과 같은 인자들에 의해 영향을 받고, 이들 모두는 특히 삶의 초기 동안 소화관 미생물총(gut microbiota)의 조성에 대해 영향을 준다. 이후, 미생물총은 안정화되고, 성인과 유사한 상태가 된다. 인간 소화관 미생물총은 본질적으로 2가지 주요 박테리아 강목(divisions)인 박테리오데테스(Bacteroidetes) 및 퍼미쿠테스(Firmicutes)에 속하는 500-1000 가지가 넘는 상이한 계통형들을 함유한다.
인간 소화관의 박테리아 콜로니화로부터 발생하는 성공적인 공생 관계로 인해, 매우 다양한 대사, 구조, 보호 및 다른 유리한 기능들을 얻었다. 콜로니화된 소화관의 대사 활성들의 개선은, 그렇지 않았다면 난용성인 식이 성분들을 분해하여, 숙주에 대해 중요한 영양원을 제공하는 부산물들이 방출되도록 보장한다. 유사하게, 소화관 미생물총의 면역학적 중요성은 잘-인지되어 있다.
건강 유지에 대한 이들 공생 관계의 중요성을 고려할 때, 특정 세포(예를 들어, 박테리아 또는 진균 세포)의 마이크로바이옴(microbiom)의 운영에 대한 효과를 확인하는 것에 대해 상당한 흥미가 있으며, 이는 이들 세포가 건강에 유리한 지 아니면 병원성으로 간주되는 지와는 무관하다. 또한, 단순한 시험관내 검정에서 관찰된 관심 대상 세포의 특성들이 상당히 복잡한 장내 환경 내에서도 여전히 부여되는 지를 입증하는 것도 중요하다.
생체내 연구는 관심 대상 세포의 효과를 조사하는데 사용될 수 있다. 동물 모델은 특정 세포의 효과를 평가할 수 있도록 하는 종래의 방식이다. 이러한 연구에 사용된 동물들은 건강할 수 있고, 또는 특정 질병의 증상을 나타내도록 조작되거나 또는 면역 처리(challenged)될 수 있으며, 관심 대상 세포에 의해 부여된 거동 또는 질병 상태의 변화가 관찰될 수도 있다. 추가적으로, 관심 대상 세포의 효과는 또한 다른 수단을 통해, 예를 들어 (조사 중인 세포의 투여가 마이크로바이옴의 조성에 대해 임의의 변화 또는 변동을 유발하는지를 보기 위한) 대변 분석 및/또는 (세포의 투여가 위장관(G.I. tract) 또는 말단(distal) 조직 중 어느 하나에서 대사물질의 특성에 대해 임의의 변화를 일으키는지를 보기 위한) 대사체학적 분석에 의해 결정될 수도 있다.
그러나, 동물 연구에 의한 하나의 문제는, 이들이 무수히 많은 복잡한 생물학적 반응에 의해 영향을 받는 생체 내에서 수행되기 때문에, 관심 대상 세포의 투여 이후 관찰되는 생리학적 변화가 반드시 그 투여의 결과로서 일어나는지 아니면 일부 다른 이유 때문에 일어나는지를 확정적으로 결정하는 것이 항상 가능하지는 않다는 점이다.
이러한 연구 결과의 성과(outcome) 및 신뢰성에 영향을 미칠 수 있는 추가적인 인자들은, 이용되는 동물들 간의 유전적 차이 및 모순된 환경 조건들을 포함한다. (예를 들어, 동물들의 교배 조건 및 유전적 스크리닝의 조절을 통해, 및/또는 동물들의 저장 및 급식에서 일관성을 보장함으로서) 이들 차이점의 영향을 최소화하는 것이 가능한 반면, 이러한 단계들은 특히 다수의 부위에서 수행된 경우, 연구에 비용 및 복잡성을 더한다.
동물 연구에 의한 추가적인 문제는, 연구 디자인의 개시로부터 의미있는 데이터의 생성까지 취해야 하는 다수의 단계들이 있다는 점인데, 이는 이것이 수 개월 아니면 수 주가 걸릴 수 있다는 것을 의미한다.
동물 모델에 대한 대안적인 접근으로서, 모의 위장관내 환경을 개발하기 위한 시도가 있었다. 예를 들어, 문헌[Impact of Food Bioactives on Health (2015)의 페이지 305 내지 317]에서 논의된 인간 장내 미생물 생태계의 모의실험 장치(SHIME®: Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem)는, 위, 소장 및 결장의 상이한 부위들을 포함하는 위장관의 다양한 부위들을 모방하기 위해 일련의 발효조들이 가동되는 인간 소화관의 모의실험 장치이다.
소화관을 모방하기 위하여, SHIME® 시스템의 개발자들은 위장관의 결장 부위를 대표하는 각 발효조에 인간 대상체에 존재하는 것에 가능한한 근접하는 접종원을 포함시켰다. 생체내 상황을 가장 정확하게 반영하기 위하여, 대변 샘플들로부터 유래된 물질이 사용된다. 그러나, "정상적인(normal)" 마이크로바이옴을 모방하려는 목적은 심지어 소수의 대상체들에 대해서조차도 단순하지 않으며, 마이크로바이옴의 조정은 실질적으로 달라질 것이다. 심지어 단일의 대상체 내에서도 시간의 경과에 따라 마이크로바이옴 조성이 실질적으로 달라질 것이다. 따라서, 박테리아 조성의 복잡성 뿐만 아니라 샘플들 간의 가변성 때문에, 관심 대상 제제의 투여 이후 관찰된 변화가 그 투여에 의해 유발되었는지, 아니면 미생물 접종원의 일부 다른 가변성에 의해 유발되었는지를 확실히 반복가능하게 결론 내리는 것은 어렵다.
문헌[The Impact of Food Bioactives on Health]의 상기-언급된 챕터에서 설명한 바와 같이, SHIME® 시스템에 사용된 접종원이 단일 공여체로부터 유래해야 하는지 아니면 공여체들의 풀(pool)로부터 유래해야 하는지에 대한 논쟁이 있었으며, 양쪽 접근법에는 장점과 단점이 모두 있다.
또한, 그 챕터에는, SHIME® 시스템에서 단쇄 지방산 생산의 관점에서 안정한 기능성을 얻기 위하여 20일 아니면 적어도 15일의 적응 시기가 필요하다고 보고되어 있다. 일단 대사물질 생산의 안정성이 달성된 때에만, 시험 물질이 접종원에 도입될 수 있다.
Venema(2015, The Impact of Food Bioactives on Health, 페이지 293 내지 304)에 의해 TIM-2라고 지칭된 소화관 마이크로바이옴에 대한 다른 시험관내 모델은 더 짧은 셋-업 시간을 갖기는 하나, 이러한 샘플들의 소싱(sourcing), 공여체들 간의 가변성 및 이러한 접종물 내의 병원체에 기인한 안전성의 염려 때문에, 재차 문제가 있는 지원자의 대변 접종물을 다시 사용한다.
인간 미생물총은 적어도 1000개의 상이한 종들의 박테리아를 함유하는 것으로 알려져 있다(Lozupone 등 (2012) Nature 489 (7415) 220-230). 마이크로바이옴은 개체들 간에 매우 변화가 심하며, 연령, 식이, 질병 및 환경에 반응하여 변화될 수 있다. 하나의 대상체로부터 얻은 샘플들은 시간이 경과함에 따라 상이한 대상체로부터 얻은 것들보다 더욱 유사해지는데, 이는 각 개인이 상대적으로 구별되는 마이크로바이옴을 갖는다는 것을 암시한다. TIM-2 및 SHIME 시스템에는 인간 대변 샘플들이 접종된다. 따라서, 이들 시스템에 접종하는데 사용된 박테리아 개체군은 매우 변화가 심한 개체군들이며, 이들은 예를 들어 시스템들 간에 대사물질 생산의 주요한 차이를 유발할 수 있다.
따라서, 당업계에는 상기 개략된 선행기술의 단점들 중 하나 이상을 해결하는 더욱 조절된 모의 위장관내 환경이 필요하다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에 의하면, 액체 배지, 영양 에너지원, 및 5 내지 200개 종의 박테리아를 본질적으로 포함하는 박테리아 개체군을 포함하는 모의 장내 환경이 제공되는데, 상기 박테리아 개체군은 상기 영양 에너지원으로부터 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개를 생산할 수 있다.
유리하게도, 모의 장내 환경은 결정될 세포의 대사 상호작용을 선행 기술의 시스템보다 더 간단하고 더욱 조절되고, 더욱 반복가능한 방식으로 결정할 수 있게 한다. 예상치 못하게, 본 발명자들은 생체내 대사 활성의 정확한 예측이, 종래에 이러한 평가가 이루어지는데 필요하다고 생각되었던 것보다 훨씬 더 적은 종의 유기체들을 포함하는 모의 장내 환경 내에서도 이루어질 수 있다는 것을 발견하였다. 당업계의 숙련자들은, 200개 이하의 상이한 종들(species)을 포함하는 박테리아 개체군이, 수 천가지 상이한 종들의 박테리아를 함유한 대변 샘플에서 유래한 물질보다 유의하게 덜 복잡하며 더욱 조절된다는 것을 인지할 것이다.
사실, 이하의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명자들은, 200개 미만의 박테리아 종을 실질적으로 포함하는 박테리아 개체군을 포함하는 모의 장내 환경이 관심 대상 세포의 대사 활성에 대한 가치있는 통찰력을 제공하는데 사용될 수 있다는 것을 입증하였다. 특히, 200개 미만의 박테리아 종을 실질적으로 포함하는 박테리아 개체군은 관심 대상 세포의 대사 활성에 대한 가치있는 통찰력을 제공하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 박테리아 개체군은 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 또는 16개 이상의 종의 박테리아를 본질적으로 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 박테리아 개체군은 150개 이하, 120개 이하, 100개 이하, 90개 이하, 80개 이하, 70개 이하, 60개 이하, 50개 이하, 40개 이하, 30개 이하, 25개 이하, 또는 20개 이하의 종의 박테리아를 본질적으로 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 5 내지 50개 종의 박테리아를 본질적으로 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 10 내지 30개 종의 박테리아를 본질적으로 포함한다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 10 내지 20개 종의 박테리아를 본질적으로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 박테리아 개체군은 200개를 초과하는 종의 박테리아를 함유하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 모의 장내 환경은 SHIME 또는 TIM-2 시스템이 아니다. 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군에는 대변 샘플, 예컨대 인간 대변 샘플이 접종되지 않는다.
모의 장내 환경은 일반적으로 시험관내 모의 장내 환경일 것으로 이해된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 박테리아 개체군은 5 내지 200개의 상이한 균주(strains)의 박테리아를 본질적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리아 개체군은 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 또는 16개 이상의 균주의 박테리아를 본질적으로 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 박테리아 개체군은 150개 이하, 120개 이하, 100개 이하, 90개 이하, 80개 이하, 70개 이하, 60개 이하, 50개 이하, 40개 이하, 30개 이하, 또는 25개 이하의 균주의 박테리아를 본질적으로 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 5 내지 50개 균주의 박테리아를 본질적으로 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 10 내지 30개 균주의 박테리아를 본질적으로 포함한다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 10 내지 20개 균주의 박테리아를 본질적으로 포함한다. 박테리아 개체군은 5 내지 50개 균주의 박테리아를 본질적으로 포함할 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 10 내지 30개 균주의 박테리아를 본질적으로 포함한다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 10 내지 20개 균주의 박테리아를 본질적으로 포함한다.
박테리아 개체군은: 박테로이다세애 ( Bacteroidaceae ), 프레보텔라세 애(Prevotellaceae), 리케넬라세애 ( Rikenellaceae ), 루미노코카세애 (Ruminococcaceae), 베일로넬라세애 ( Veillonellaceae ) 및/또는 베루코마이크로비아세애 (Verrucomicrobiaceae)로 이루어지는 군으로부터 선택된 과(family) 유래의 하나 이상의 박테리아 종을 포함할 수 있다. 박테리아 개체군은 알리스티페스 ( Alistipes ), 악케르만시아 (Akkermansia), 아내로스티페스 ( Anaerostipes ), 박테 로이데스(Bacteroides) 박테리오데테스 , 바리아트리쿠스 ( Bariatricus ), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 블라우티아 ( Blautia ), 부티리비브리오 ( Butyrivibrio ), 부 티리치코쿠스 ( Butyricicoccus ), 코프로코쿠스 ( Coprococcus ), 클로스트리디움 (Clostridium), 콜린셀라 ( Collinsella ), 디알리스터(Dialister), 데술포 비브리오(Desulfovibrio), 도레아 ( Dorea ), 에쉐리키아 ( Escherichia ), 유박테리 움(Eubacterium), 퍼미쿠테스 , 패칼리박테리움 ( Faecalibacterium ), 락토바실러스 (Lactobacillus), 메가스패라 ( Megasphaera ), 메타노브레비박터 ( Methanobrevibacter ), 파스콜락토박테리움 ( hascolarctobacterium ), 프 레보텔라 ( Prevotella ), 루미노코쿠스 ( Ruminococcus ), 로세 부리아(Roseburia), 셀레노모나스 ( Selenomonas ) 및/또는 베루코마이크로비아(Verrucomicrobia) 속(genus) 유래의 종들을 포함할 수 있다.
본 발명의 박테리아 개체군은: 알리스티페스 푸트레디니스 ( Alistipes putredinis ), 악케르만시아 뮤시니치필라(Akkermansia municiphilla ), 아내로스티페스 칵캐 ( Anaerostipes caccae ), 아내로스티페스 콜리(Anaerostipes coli ), 아내로스티페스 하드루스 ( Anaerostipes hadrus ), 아내로스티페스 람노시보란 스(Anaerostipes rhamnosivorans ), 박테로이데스 코코이데스 ( Bacteroides coccoides), 박테로이데스 도레이 ( Bacteroides dorei ), 박테로이데스 마실리엔시 스(Bacteroides massiliensis ), 박테로이데스 테타이오타마이크론 ( Bacteroides thetaiotamicron), 박테로이데스 유니포르미스 ( Bacteroides uniformis ), 박테로이데 스 불가투스 ( Bacteroides vulgatus ), 바리아트리쿠스 마실리엔시스 ( Bariatricus massiliensis ), 비피도박 테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ), 비피도박테리움 롱굼 ( Bifidobacterium longum ), 블라우티아 프로둑타 ( Blautia producta ), 블라우티아 코코이데스 ( Blautia coccoides ), 블라우티아 오베움 ( Blautia obeum ), 부티리치코쿠스 풀리캐코룸 (Butyricicoccus pullicaecorum ), 부티리비브리오 피브리솔벤스 ( Butyrivibrio fibrisolvens ), 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum ), 클로스트리디움 인돌리스 (Clostridium indolis), 클로스트리디움 인노쿰 (Clostridium innocuum ), 클로스트리디움 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum ) 코프로코쿠스 카투스 ( Coprococcus catus ), 코프로코쿠스 코메스 ( Coprococcus comes), 코프로코쿠스 유탁투스 ( Coprococcus eutactus ), 디알리스터 인비수스 ( Dialister invisus ), 데술포비브리오 피게르 ( Desulfovibrio piger ), 도레아 론기카테나 ( Dorea longicatena ), 에쉐리키아 콜리 ( Escherichia coli ), 유박테리움 실린드로이데스 ( Eubacterium cylindroides ), 유박테리움 할리 ( Eubacterium hallii ), 유박테리움 리모 숨 ( Eubacterium limosum ), 유박테리움 라물루스 ( Eubacterium ramulus ), 유박테리움 렉탈레 (Eubacterium rectale ), 패칼리박테리움 프라우스니치 ( Faecalibacterium prausnitzii ), 락토바실러스 살 리바리우스 (Lactobacillus salivarius ), 메가스패라 엘스데니 ( Megasphaera elsdenii ), 메타노브레비박터 스미시 ( Methanobrevibacter smithii ), 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스 ( Phascolarctobacterium succinatutens ), 프레보텔라 코프리 ( Prevotella copri ), 루 미노코쿠스 알부스(Ruminococcus albus ), 로세부리아 패시스 ( Roseburia faecis ), 로세부리아 호미니스 ( Roseburia hominis ), 로세부리아 인테스티날리스 ( Roseburia intestinalis ), 로세부리아 이눌리니보란스 ( Roseburia inulinivorans ), 셀레노모나스 루미난티움 (Selenomonas ruminantium ) 및/또는 베일로넬라 파르불라(Veillonella parvula)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 종들을 포함할 수 있다.
더욱 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 이하의 종들로 이루어진다: 박테로이데스 도레이 , 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데스 테타이오타오마이크론 , 박테로이데스 불가투스 , 비피도박테리움 롱굼 , 블라우티아 프로둑타 , 블라우티아 종, 바리아트리쿠스 마실리엔시스 , 클로스트리디움 인노쿰 , 도레아 론기카테 나, 유박테리움 할리 , 에쉐리키아 콜리 , 유박테리움 렉탈레 , 락토바실러스 살리바루스 , 프레보텔라 종 및 로세부리아 패시스. 이들 종들을 함유하는 박테리아 개체군은, 단쇄 지방산들에 대한 모든 주요 대사 경로를 포함하며, 이는 본 발명자들이 관심 대상 세포의 대사 활성을 평가하는데 중요하다고 확인하였다.
본 발명의 모의 장내 환경 내에 포함된 박테리아 개체군을 설명하기 위해 본원에 기재된 용어 "~을 본질적으로 포함하는(consisting essentially of)" 및 "~으로 이루어지는(consist of)"은, 모의 장내 환경이 추가적인 박테리아 균주 또는 종을 배제하거나, 또는 단지 최소한의(de minimis ) 또는 생물학적으로 관련없는 양의 다른 박테리아 균주 또는 종만을 포함하는 것을 특징화하는데 사용된다.
소화관 미생물총 내의 주요 단쇄 지방산 생성물은, 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 락테이트 및 부티레이트를 포함한다(Douglas 및 Preston (2016) Gut Microbes, 7, (3), 189-200.). 상기 언급된 바와 같이, 박테리아 개체군은 영양 에너지원으로부터 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개를 생산할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 모두를 생산할 수 있다. 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 모두를 생산할 수 있는 박테리아 개체군은, 단쇄 지방산에 대한 주요 대사 경로를 포함한다. 이로 인해 박테리아 개체군은 장내 환경을 정확하게 모방할 수 있게 되는데, 이는 본 발명자들이 관심 대상 세포의 대사 활성을 평가하는데 중요한 것으로 확인하였다.
의심의 여지를 없애기 위해, 이것은 반드시 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및/또는 포르메이트가 다수의 박테리아 개체군에 의해 직접 생산되어야 한다는 것을 의미하지는 않는다; 이 화합물들은 간접적으로 생산될 수도 있다. 예를 들어, 제1 박테리아 균주는 영양 에너지원으로부터 그 제1 대사물질(예를 들어, 락테이트 또는 숙시네이트)을 생산할 수 있고, 박테리아 개체군 내에 존재하는 제2 박테리아 균주는 상기 제1 대사물질로부터 단쇄 지방산 (예를 들어, 프로피오네이트, 부티레이트, 아세테이트 및/또는 포르메이트)을 생산할 수 있다.
추가적으로, 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및/또는 포르메이트의 각각이 모의 장내 환경 내에서 최종 생성물로서 생산되는 것은 필수적인 것이 아니어서, 일단 안정화가 달성되면 이 화합물들은 각각 측정가능한 수준으로 모의 장내 환경 내에 존재할 것이다. 예를 들어, 이 화합물들 중 하나 이상(예를 들어, 숙시네이트 및/또는 아세테이트)은 박테리아 개체군 내의 하나 이상의 균주에 의해 제1 대사물질로서 생산될 수 있고, 이는 이후 추가적인 수의 박테리아 개체군에 의해 단쇄 지방산(예를 들어, 프로피오네이트, 부티레이트, 아세테이트 및/또는 포르메이트)으로 변환될 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 모의 장내 환경은 하나 이상의 단쇄 지방산을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 모의 장내 환경은 부티레이트, 프로피오네이트, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 3개, 적어도 4개 또는 5개 모두를 포함한다.
존재하는 경우, 이들 성분들 중 일부 또는 모두는 박테리아 개체군에 의해 생산될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이들 성분들 중 일부 또는 모두는 액체 배지에 직접 첨가될 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서는, 부티레이트, 락테이트 및/또는 포르메이트는 박테리아 개체군에 의해 생산될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 프로피오네이트 및/또는 아세테이트는 액체 배지에 직접 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 아세테이트 및 프로피오네이트는 (존재하는 경우) 액체 배지에 직접 첨가되고, 또한 박테리아 개체군에 의해 생산될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개는, 박테리아 개체군에 의해 생산될 수 있다. 본 발명자들은, 박테리아 개체군에 의해 생산된 단쇄 지방산을 갖는 것이 유리하며, 이는 이것이 장내 환경을 모방하기 때문이라는 것을 발견하였다.
모의 장내 환경이 부티레이트를 포함하는 구현예에서, 부티레이트는 적어도 약 0.5mM, 약 1.0mM, 약 1.5mM, 약 2.0mM, 약 3.0mM, 약 4.0mM 또는 약 5.0mM의 농도로 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 부티레이트는 약 10.0mM 이하, 약 8.0mM 이하, 약 6.0mM 이하, 또는 약 5.0mM 이하의 농도로 존재할 수 있다. 모의 장내 환경이 부티레이트를 포함하는 바람직한 구현예에서, 부티레이트는 약 1.0mM 내지 약 5.0mM의 농도로 존재한다.
모의 장내 환경이 프로피오네이트를 포함하는 구현예에서, 프로피오네이트는 적어도 약 0.5mM, 약 1.0mM, 약 1.5mM, 약 2.0mM, 약 3.0mM, 약 4.0mM 또는 약 5.0mM의 농도로 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 프로피오네이트는 약 10.0mM 이하, 약 8.0mM 이하, 약 6.0mM 이하 또는 약 5.0mM 이하의 농도로 존재할 수 있다. 모의 장내 환경이 프로피오네이트를 포함하는 바람직한 구현예에서, 프로피오네이트는 약 2.0mM 내지 약 7.0mM의 농도로 존재한다.
모의 장내 환경이 아세테이트를 포함하는 구현예에서, 아세테이트는 적어도 약 0.1mM, 약 0.2mM, 약 0.5mM, 약 1.0mM, 약 1.5mM 또는 약 2.0mM의 농도로 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 아세테이트는 약 5.0mM 이하, 약 4.0mM 이하, 약 3.0mM 이하 또는 약 2.0mM 이하의 농도로 존재할 수 있다. 모의 장내 환경이 아세테이트를 포함하는 바람직한 구현예에서, 아세테이트는 약 0.2 내지 약 2.0mM의 농도로 존재한다.
모의 장내 환경이 락테이트를 포함하는 구현예에서, 락테이트는 적어도 약 0.1mM, 약 0.2mM, 약 0.5mM, 약 1.0mM, 약 1.5mM 또는 약 2.0mM의 농도로 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 락테이트는 약 5.0mM 이하, 약 4.0mM 이하, 약 3.0mM 이하 또는 약 2.0mM 이하의 농도로 존재할 수 있다. 모의 장내 환경이 락테이트를 포함하는 바람직한 구현예에서, 락테이트는 약 0.2 내지 약 2.0mM의 농도로 존재한다.
모의 장내 환경이 포르메이트를 포함하는 구현예에서, 포르메이트는 적어도 약 0.01mM, 약 0.02mM, 약 0.05mM, 약 0.1M, 약 0.2mM, 또는 약 0.5mM의 농도로 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 포르메이트는 약 2.0mM 이하, 약 1.5mM 이하, 또는 약 1.0mM 이하의 농도로 존재할 수 있다. 모의 장내 환경이 포르메이트를 포함하는 바람직한 구현예에서, 포르메이트는 약 0.01 내지 약 0.5mM의 농도로 존재한다.
본원에서 모의 장내 환경의 성분들의 농도가 정량화되는 경우, 달리 특정된 바 없는 경우, 이들은 액체 배지 중의 의문의 성분의 몰량으로서 제공된다. 이 화합물들을 측정하기 위한 수단은 당업계에 잘 알려져 있는데, 액체 크로마토그래피, HP-LC, LC-MS 및 기체 크로마토그래피를 포함한다. 실시예에 나타난 바와 같이, 모의 장내 환경의 성분들의 정량화는 기체 크로마토그래피를 사용하여 실시될 수도 있다.
모의 장내 환경이 부티레이트, 프로피오네이트, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개, 적어도 4개 또는 5개 모두를 포함하는 구현예에서, 프로피오네이트 또는 부티레이트는 최고 농도로 존재할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이러한 구현예에서, 아세테이트, 포르메이트 또는 락테이트는 최저 농도로 존재할 수 있다.
박테리아 개체군의 조성에 대하여, 당업계의 숙련자들은 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및/또는 포르메이트를 생산할 수 있는 박테리아에 익숙할 것이다. 임의의 이러한 박테리아는 박테리아 개체군 내에 포함될 수 있다.
구현예에서, 부티레이트 생산 박테리아가 박테리아 개체군 내에 포함되는 경우, 이들은 이하의 중간 대사물질들 중 하나 이상을 통해 부티레이트를 생산할 수 있다: 포스포에놀피루베이트, 피루베이트, 아세틸 CoA, 아세토아세틸 CoA, 부티릴 CoA, 부티릴 포스페이트.
인간 소화관 박테리아는 3개의 상이한 경로: 1) 숙시네이트 경로; 2) 아크릴레이트 경로; 및 3) 프로판디올 경로를 통해 프로피오네이트를 생산하는 것으로 알려져 있다(Reichardt 등 (2014) ISME J. 8(6): 1323-1335). 본 발명의 특정 구현예에서, 박테리아 개체군 내에 포함된 박테리아는 하나, 둘 또는 세 개 모두의 경로를 통해 프로피오네이트를 생산할 수 있다. 구현예에서, 프로피오네이트 생산 박테리아가 박테리아 개체군 내에 포함되는 경우, 이들은 이하의 중간 대사물질들 중 하나 이상을 통하여 프로피오네이트를 생산할 수 있다: 디히드록시아세톤 포스페이트, L-락트알데히드, 프로판-1,2-디올, 프로피오닐 CoA, PEP, 옥살로아세테이트, 숙시네이트, 석시닐 CoA, 프로피오닐 CoA, 피루베이트, 락테이트 또는 락토일 CoA.
특정 구현예에서, 숙시네이트 경로를 통해 생산된 프로피오네이트는, 박테로이데스 및/또는 프레보텔라 속으로부터 유래한 박테리아에 의해 생산될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 숙시네이트 경로를 통해 생산된 프로피오네이트는 이하의 종들 중 어느 것에 의해 생산될 수 있다: 박테로이데스 도레이 박테로이데스 불가투스 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데스 테타이오타오마이크론 및/또는 프레보텔라 코프리.
특정 구현예에서, 아크릴레이트 경로를 통해 생산된 프로피오네이트는, 유박테리움 , 아내로스티페스 , 비피도박테리움 및/또는 락토바실러스 속으로부터 유래한 박테리아에 의해 생산될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 아크릴레이트 경로에 의해 생산된 프로피오네이트는 이하의 종들 중 어느 것에 의해 생산될 수 있다: 유 박테리움 할리 , 아내로스티페스 하드루스 , 비피도박테리움 롱굼 및/또는 락토바실러스 살리바리우스.
구현예에서, 숙시네이트 생산 박테리아가 박테리아 개체군 내에 포함되는 경우, 이들은 이하의 중간 대사물질들 중 하나 이상을 통해 숙시네이트를 생산할 수 있다: 포스포에놀피루베이트, 옥살로아세테이트.
특정 구현예에서, 프로판디올 경로를 통해 생산된 프로피오네이트는, 블라우티아 및/또는 유박테리움 속으로부터 유래한 박테리아에 의해 생산될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 프로판디올 경로를 통해 생산된 프로피오네이트는 블라우티아 오베움 및/또는 유박테리움 할리에 의해 생산될 수 있다.
구현예에서, 에탄올 생산 박테리아가 박테리아 개체군 내에 포함되는 경우, 이들은 이하의 중간 대사물질들 중 하나 이상을 통해 에탄올을 생산할 수 있다: 포스포에놀피루베이트, 피루베이트, 아세틸 CoA, 아세트알데히드. 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군 내의 에탄올 생산 박테리아는 락토바실러스 살리바리우스이다.
구현예에서, 아세테이트 생산 박테리아가 박테리아 개체군 내에 포함되는 경우, 이들은 이하의 중간 대사물질들 중 하나 이상을 통해 아세테이트를 생산할 수 있다: 포스포에놀피루베이트, 피루베이트, 포르메이트, 아세틸 CoA.
구현예에서, 락테이트 생산 박테리아가 박테리아 개체군 내에 포함되는 경우, 이들은 이하의 중간 대사물질들 중 하나 이상을 통해 락테이트를 생산할 수 있다: 포스포에놀피루베이트, 피루베이트.
구현예에서, 포르메이트 생산 박테리아가 박테리아 개체군 내에 포함되는 경우, 이들은 이하의 중간 대사물질들 중 하나 이상을 통하여 포르메이트를 생산할 수 있다: 포스포에놀피루베이트, 피루베이트.
일부 구현예에서, 박테리아 개체군은 라크노스피라세애 및/또는 루미노코카세애 과 중 하나 이상으로부터 유래하는 부티레이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리아 개체군은 부티 리치코쿠스 , 유박테리움 , 아내로스티페스 , 코프로코쿠스 , 부티리비브리오 , 로세부리아 , 패칼리박테리움 , 바리아트리쿠스 , 메가스패라, 및/또는 클로스트리디움 속 중 하나 이상으로부터 유래하는 부티레이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 이하의 부티리치코쿠스 풀리캐코룸 , 부티리비브리오 피브리솔벤스 , 유박테리움 렉탈레 , 유박테리움 라물루스 , 클로스트리디움 부티리쿰, 유박테리움 리모숨 , 코프로코쿠스 카투스 , 코프로코쿠스 유탁투스 , 코프로코쿠 스 코메스 , 도레아 론기카테나 , 유박테리움 실린드로이데스 , 유박테리움 할리 , 패칼리박테리움 프라우스 니치, 아내로스티페스 하드루스 , 아내로스티페스 람노시보란스 , 아내로스티페스 칵캐 , 클로스트리디움 인노쿰 , 로세부리아 호미니스 , 로세부리아 패시스, 로세부리아 이눌리니 보란스, 메가스패라 엘스데니 , 로세부리아 패시스, 로세부리아 인테스티날리스 및/또는 바리아트리쿠스 마실리엔시스 종 중 하나 이상으로부터 유래하는 부티레이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다. 부티레이트는 인간의 장내 환경에 존재하는 주요 단쇄 지방산이며, 본 발명자들은 부티레이트 생산 종들의 존재가 장내 환경을 정확하게 모의화하는데(simulated) 중요하다는 것을 발견하였다. 이러한 바람직한 종들의 박테리아는 부티레이트를 생산하는 것으로 알려져 있어서, 장내 환경을 모의화하는데 유용하다.
더욱 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 이하의 박테로이데스 마실리엔시스 , 클로스트리디움 인노쿰, 바리아트리쿠스 마실리엔시스 유박테리움 할리 , 도레아 론기카테나 , 아내로스티페스 하드루스 , 패칼리박테리움 프라우스니치 , 로세부리아 패시스 및/또는 유박테리움 렉탈레 종 중 하나 이상으로부터 유래하는 부티레이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다. 실시예에 나타난 바와 같이, 바리아트리쿠스 마실리엔시스, 클로스트리디움 인노쿰 , 유박테리움 할리 , 도레아 론기카테나 , 로세부리아 패시스 및 유박테리움 렉탈레를 포함하는 박테리아 개체군은, 본 발명의 모의 장내 환경에서 부티레이트를 생산할 수 있다.
일부 구현예에서, 박테리아 개체군은 박테로이다세애 , 프레보텔라세애 , 리케넬라세애 , 루미노코카세애 , 베일로넬라세애 및/또는 베루코마이크로비아세애 과 중 하나 이상으로부터 유래한 프로피오네이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 박테리아 개체군은 퍼미쿠테스 , 베루코마이크로비아 , 박테리오데테스 , 박테로이데스 , 블라우티아 , 프레보텔라 , 및/또는 유박테리움 속 중 하나 이상으로부터 유래한 프로피오네이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 박테리아 개체군은 이하의 종들 중 하나 이상으로부터 유래한 프로피오네이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다: 악케르만시아 뮤시니치필 라, 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데스 불가투스 , 박테로이데스 도레이 , 박 테로이데스 테타이오타마이크론 , 프레보텔라 코프리 , 도레아 론기카테나 , 알리스티 페스 푸트레디니스 , 로세부리아 이눌리니보란스 , 유박테리움 할리 , 블라우티아 오베움 , 블라우티아 종, 코프로코쿠스 카투스 , 디알리스터 인비수스 , 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스 , 악케르만시아 뮤시니필라 , 셀레노모나스 루미난티움 , 클로스트 리디움 프로피오니쿰 및/또는 베일로넬라 파르불라.
더욱 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 이하의 종들 중 하나 이상으로부터 유래한 프로피오네이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다: 도레아 론기카테나 , 박테로이데스 테타이오타오마이크론 , 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데스 불가투스 , 박테로이데스 도레이 , 비피도박테리움 롱굼 , 블라우티아 종, 유박테리움 할리, 프레보텔라 코프리 , 프레보텔라 종 및/또는 락토바실러스 살리바리우스 .
프레보텔라 코프리 , 블라우티아 오베움 , 박테로이데스 도레이 , 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데스 테타이오타마이크론 및/또는 박테로이데스 불가투스는, 본 발명의 모의 장내 환경에서 이용될 수 있는 유기체의 예이다.
일부 구현예에서, 박테리아 개체군은 박테리오데테스 문(phylum)으로부터 유래한 아세테이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 박테리아 개체군은 이하의 박테로이데스 , 비피도박테리움 , 프레보텔라 , 블라우티아 , 셀레노모나스 및/또는 클로스트리디움 속 중 하나 이상으로부터 유래한 아세테이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 박테리아 개체군은 이하의 종들 중 하나 이상으로부터 유래한 아세테이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다: 비피도박테 리움 롱굼 , 프레보텔라 코프리 , 프레보텔라 종, 블라우티아 코코이데스 , 박테로이 데스 코코이데스 , 박테로이데스 도레이 , 블라우티아 프로둑타 , 박테로이데스 불가 투스, 박테로이데스 테타이오타마이크론 , 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데 스 테타이오타오마이크론 , 셀레노모나스 루미난티움 , 락토바실러스 살리바리우스 및/또는 박테로이데스 도레이.
더욱 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 이하의 종들 중 하나 이상으로부터 유래한 아세테이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다: 비피도박테리움 롱굼, 프 레보텔라 코프리 , 박테로이데스 도레이 , 블라우 티아 프로둑타 , 박테로이데스 불가투스 , 박테로이데스 테타이오타마이크론 , 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데스 테타이오타오마이크론 및/또는 락토바실러스 살리바리우스 .
박테로이데스 테타이오타오마이크론 , 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데스 불가투스 , 박테로이데스 코코이데스 , 박테로이데스 도레이 , 비피도박테리움 롱굼, 락토바실러스 살리바리우스 및 프레보텔라 코프리, 그리고 이들은 본 발명의 모의 장내 환경에 이용될 수 있는 유기체의 예이다.
추가적으로 또는 대안적으로, 박테리아 개체군은 비피도박테리움 , 박테로이데스 , 아내로스티페스, 코프로코쿠스 , 클로스트리디움 , 콜린셀라 , 셀레노모나스 , 로세부리아 및/또는 락토바실러스 속 중 하나 이상으로부터 유래한 락테이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 박테리아 개체군은 이하의 종들 중 하나 이상으로부터 유래된 락테이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다: 셀레노모나스 루미난티움 , 비피도박테리움 아돌레센티스 , 유박테리움 렉탈레, 패칼리박테리움 프라우스니치 , 아내로스티페스 칵캐 , 아내로스티페스 콜리 , 비피도박테리움 롱굼, 아내로스티페스 하드루스 , 도레아 론기카테나 , 락토바실러스 살리바루스 , 코프로코쿠스 카투스 , 바리아트리쿠스 마실리엔시스 및/또는 클로스트리디움 인돌리스.
더욱 바람직한 구현예에서, 박테리아 개체군은 이하의 종들 중 하나 이상으로부터 유래된 락테이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다: 유박테리움 렉탈레 , 비피도박테리움 롱굼 , 락토바실러스 살리바루스 및/또는 바리아트리쿠스 마실리엔시 스.
비피도박테리움 롱굼 및/또는 락토바실러스 살리바루스는, 본 발명의 모의 장내 환경에 이용될 수 있는 유기체의 예이다.
구현예에서, 박테리아 개체군은 에쉐리키아, 루미노코쿠스 및/또는 비피도박테리움 속으로부터 유래된 포르메이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 박테리아 개체군은 이하의 종들 중 하나 이상으로부터 유래된 포르메이트-생산 박테리아를 포함할 수 있다: 루미노코쿠스 알부스 , 비피도박 테리움 롱굼 및/또는 에쉐리키아 콜리 . 에쉐리키아 콜리 및 비피도박테리 움 롱굼은, 본 발명의 모의 장내 환경에 이용될 수 있는 유기체의 예이다.
단쇄 지방산-생산 박테리아 외에, 추가적인 기능들을 갖는 유기체가 박테리아 개체군 내에 포함될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 구현예에서, 박테리아 개체군은 이하의 것들을 포함할 수 있다:
ⅰ) 설페이트 방출 박테리아, 예컨대 악케르만시아 속으로부터 유래된 설페이트-방출 박테리아. 악케르만시아 뮤시니필리아는, 본 발명의 모의 장내 환경에 이용될 수 있는 유기체의 예이다.
ⅱ) 뮤신 분해 박테리아, 예컨대 악케르만시아 속으로부터 유래한 뮤신 분해 박테리아. 악케르만시아 뮤시니필리아는, 본 발명의 모의 장내 환경에 이용될 수 있는 유기체의 예이다.
ⅲ) 설페이트 환원 박테리아, 예컨대 데술포비브리오 속으로부터 유래한 설페이트-환원 박테리아. 데술포비브리오 피게르는, 본 발명의 모의 장내 환경에 이용될 수 있는 유기체의 예이다.
ⅳ) 메탄생성 박테리아, 예컨대 메타노브레비박터 속으로부터 유래한 메탄생성 박테리아. 메타노브레비박터 스미시는, 본 발명의 모의 장내 환경에 이용될 수 있는 유기체의 예이다.
ⅴ) 에탄올 생산 박테리아, 예컨대 에쉐리키아 속으로부터 유래한 박테리아. 에쉐리키아 콜리는 본 발명의 모의 장내 환경에 이용될 수 있는 유기체의 예이다.
본 발명의 구현예에서, 본 발명의 모의 장내 환경 내에 존재하는 박테리아 개체군은, 원칙적으로 또는 배타적으로 건강한 공여체의 인간 장관으로부터 분리된 공생 유기체인 유기체를 포함한다. 이러한 구현예에서, 박테리아 개체군에 존재하는 박테리아 종들의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%는, 건강한 공여체의 인간 장관으로부터 분리된 공생 유기체이다. 모의 장내 환경 내의 박테리아 개체군에 대해 건강한 공여체의 인간 장관으로부터 분리된 공생 유기체를 사용할 때의 장점은, 이들 유기체가 인간 소화관 마이크로바이옴의 더욱 정확한 모델을 제공할 수 있다는 점이다. 공생 박테리아 종을 분리하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
미생물총 조성에서의 극적인 변화는, 다수의 질병들, 예컨대 위장관 장애, 예를 들어 염증성 장 질환(IBD)에 대해 문서화되어 있다(Frank 등 (2007) PNAS 104(34):13780-5). 본 발명의 다른 구현예에서, 박테리아 개체군은 건강하지 못한 그리고/또는 질병에 걸린 공여체(예컨대, 과민성 대장증후군을 갖는 공여체)의 인간 장관으로부터 분리된 공생 유기체인 유기체를 포함한다. 건강하지 못한 그리고/또는 질병에 걸린 공여체로부터 분리된 박테리아 개체군을 사용하는 것이 유리할 수 있는데, 이는 이로 인해 모의 장내 환경이 질병 상태를 모방하게 되기 때문이다. 이는 건강하지 못한 인간의 소화관 마이크로바이옴을 모방한 장내 환경에서 관심 대상 유기체의 생체내 대사 활성을 정확히 예측할 수 있게 한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 박테리아 유기체는 관심 대상인 단일의 건강한 공여체, 또는 관심 대상인 다수의 건강한 공여체들의 인간 장관으로부터 분리될 수 있다. 다른 구현예에서, 박테리아 유기체는 관심 대상인 단일의 건강하지 못한 그리고/또는 질병에 걸린 공여체, 또는 관심 대상인 다수의 건강하지 못한 그리고/또는 질병에 걸린 공여체의 인간 장관으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리아 종들은 적어도 2명 이상, 3명 이상, 4명 이상, 5명 이상, 6명 이상, 7명 이상, 8명 이상, 9명 이상, 10명 이상, 11명 이상, 12명 이상, 13명 이상, 14명 이상, 15명 이상, 또는 16명 이상의 관심대상인 개별 공여체로부터 분리될 수 있다.
건강한 공여체의 인간 장관으로부터 분리한 공생 유기체는, 개별적인 종들의 박테리아로서 또는 박테리아 종들의 조합으로서 분리될 수 있다. 건강한 공여체의 인간 장관으로부터 분리한 공생 유기체는, 개별적인 균주의 박테리아로서 또는 박테리아 균주의 조합으로서 분리될 수 있다. 개별적인 종들 또는 균주들의 박테리아는 이들의 대사 기능 또는 생장 특성에 따라서, 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어, NMR, 액체 크로마토그래피, 기체 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피 질량 분광분석 또는 기체 크로마토그래피 질량 분광분석을 사용하여 분리될 수 있다.
일단 개별적인 종들 또는 균주들의 박테리아, 또는 박테리아 종들 또는 균주들들의 조합이 관심 대상인 건강한 또는 건강하지 못한 공여체의 인간 장관으로부터 분리되면, 이들은 모의 장내 환경에 접종되도록 사용될 수 있고, 또는 박테리아는 당업계에 잘-알려진 방법들을 사용하여 저장될 수 있어서, 예를 들어 박테리아의 글리세롤 스톡이 제조되어 -80℃에서 저장되거나, 또는 박테리아는 동결건조될 수 있다. 모의 장내 환경은 건강한 공여체의 인간 장관으로부터 새롭게 분리된 박테리아 유기체와 함께 시작할 수 있거나, 또는 모의 장내 환경은 분리 후 동결건조된 박테리아 유기체와 함께 시작할 수 있다.
모의 장내 환경에는 별도의 개별 종들의 박테리아 또는 박테리아 종들의 조합이 접종될 수 있다. 다른 구현예에서, 모의 장내 환경에는 별도의 개별 균주의 박테리아 또는 박테리아 균주들의 조합들이 접종될 수 있다. 박테리아 균주들의 조합은 동일한 종들로부터 유래된 박테리아 균주들을 포함할 수 있거나, 또는 상이한 종들로부터 유래된 박테리아 균주를 포함할 수도 있다. 당업계의 숙련자는 모의 장내 환경에 접종하기 위해 사용된 특정 종들의 박테리아를 선택할 수 있다. 이로 인해 모의 장내 환경의 더 나은 조절이 가능해진다.
본 발명의 모의 장내 환경은 예컨대, 예를 들어, 소장, 상행 결장, 횡행 결장 또는 하행 결장과 같은 인간 위장관 시스템의 상이한 구획들을 모의화하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 모의 장내 환경은 이들 구획 각각에서 발견된 미생물총을 모의화하는데 사용될 수 있다. 상이한 위장관내 구획들 내의 인간 소화관 미생물총을 모의화하는 이러한 능력은, 이것이 인간 내장의 상이한 구획들 내의 관심 대상 세포의 대사 활성에 대해 가치있는 통찰력을 제공할 수 있어서 유용하다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 모의 장내 환경 내에 존재하는 박테리아 개체군은 원칙적으로 또는 배타적으로 유전자 조작된 유기체가 아닌 유기체를 포함한다. 이러한 구현예에서, 박테리아 개체군에 존재하는 박테리아 개체군의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%는 유전자 조작된 유기체가 아니다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 모의 장내 환경 내에 존재하는 박테리아 개체군은 원칙적으로 또는 배타적으로 병원성이 아닌 유기체를 포함한다. 이러한 구현예에서, 박테리아 개체군에 존재하는 박테리아의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%는 병원성이 아니다.
본 발명의 모의 장내 환경의 하나의 장점은, 이것이 박테로이데스:퍼미쿠테스의 비를 신뢰가능하게 조절할 수 있게 한다는 점이다. 따라서, 본 발명의 구현예에서, 모의 장내 환경은 박테리오데테스:퍼미쿠테스의 비가 5 내지 50:50 내지 95, 10 내지 45:55 내지 90, 15 내지 40:60 내지 85, 또는 20 내지 35:65 내지 80인 박테리아 개체군을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 박테리오데테스: 퍼미쿠테스의 비는 30-35:65-70, 예컨대 30:65, 30:70, 35:65 또는 35:70이다.
일부 구현예에서, 모의 장내 환경 내에 존재하는 박테리아 개체군은, 그람 음성 및 그람 양성 박테리아를 둘 다 함유한다. 특정 구현예에서, 그람 음성 박테리아 대 그람 양성 박테리아의 비는, 20%:80%, 30%:70%, 40%:60%, 50%:50%, 60%:40%, 70%:30% 또는 80%:20%이다. 바람직한 구현예에서, 그람 음성 박테리아 대 그람 양성 박테리아의 할당량(ration)은, 40%:60%, 50%:50% 또는 60%:40%이다. 대안적인 구현예에서, 박테리아 개체군은 단지 그람 음성 박테리아만을 함유한다. 다른 구현예에서, 박테리아 개체군은 단지 그람 양성 박테리아만을 함유한다.
액체 배지 조성의 관점에서, 이것은 액체 생장 배지를 제조하기 위해 종래에 사용된 물질들을 포함할 수 있다. 배지의 정확한 조성은 크게 중요하지는 않다. 오히려, 박테리아 개체군의 안정화를 허용하는 어떠한 배지도 사용가능하다.
사용될 수 있는 액체 배지의 예는 이하의 것들을 포함한다: YFCA, 포스트게이트 배지(Postgate's medium), 쿡트 미트 배지(Cooked meat broth)(예를 들어, 로버슨의 쿡트 미트 배지(Robertson's Cooked Meat broth)), 펩톤-효모 추출물 포도당 배지, 티오글리콜레이트 배지, 리소제니 브로스(LB) 배지, 최소염(M9) 배지, 테리픽 배지(Terrific broth), SOB 배지, SOC 배지, 2X YT 배지, NZCYM 배지, NZYM 배지, NZM 배지, 트립틱 소이 배지(Tryptic soy broth) 및 SIEM 배지. 바람직한 구현예에서, 배지는 YFCA, 포스트게이트 배지, 쿡트 미트 배지(예를 들어, 로버슨의 쿡트 미트 배지), 펩톤-효모 추출물 포도당 배지, 티오글리콜레이트 배지 및 SIEM 배지이다. 가장 바람직하게는, 배지는 YCFA이다.
특정 구현예에서, YFCA 배지는 리터당 카제인 가수분해물 10.0g, 효모 추출물 2.5g, 탄산수소나트륨 4.0g, 포도당 2.0g, 셀로비오스 2.0g, 가용성 전분 2.0g, 인산 수소 이-칼륨 0.45g, 인산 이-수소 칼륨 0.45g, 레사주린(Resazurin) 0.001g, L-시스테인 HCl 1.0g, 황산암모늄 0.9g, 염화나트륨 0.9g, 황산마그네슘 0.09g, 염화칼슘 0.09g, 헤민(Haemin) 0.01g, SCFA 3.1㎖(아세트산 2.026 ㎖/ℓ, 프로피온산 0.715 ㎖/ℓ, n-발레르산 0.119 ㎖/ℓ, 이소-발레르산 0.119 ㎖/ℓ, 이소-부티르산 0.119 ㎖/ℓ), 비타민 믹스 1: 1㎖(비오틴 1mg/100㎖, 시아노코발라민 1mg/100㎖, p-아미노벤조산 3mg/100㎖, 피리독신 15mg/100㎖), 비타민 믹스 2: 1㎖(티아민 5mg/100㎖, 리보플라빈 5mg/100㎖), 비타민 믹스 3: 1㎖(엽산 5mg/100㎖)을 함유한다.
추가적인 성분들은 액체 배지 내에 포함될 수 있다. 이들의 목적은 위장관내 상태를 모방하는 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 뮤신은 예를 들어 액체 배지의 약 0.001 중량%, 약 0.002 중량%, 또는 약 0.005 중량% 내지 약 0.05 중량%, 약 0.1 중량%, 약 0.2 중량%, 약 0.5 중량% 또는 약 1 중량%의 수준으로 포함될 수 있다.
박테리아 개체군의 생존 및 가동을 위한 최적 조건을 유지하기 위하여, 본 발명의 모의 장내 환경은 바람직하게는 4 이상, 4.5 이상, 5 이상, 5.5 이상 또는 6 이상의 pH를 갖는다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 모의 장내 환경은 바람직하게는 8 이하, 7.5 이하, 7.0 이하, 또는 6.5 이하의 pH를 갖는다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 모의 장내 환경은 바람직하게는 혐기성 조건 하에서, 예를 들어, 약 500 ppm 미만, 약 200 ppm 미만, 100 ppm 미만, 50 ppm 미만, 또는 약 20 ppm 미만의 산소를 포함하는 대기 중에서 저장된다.
본 발명의 모의 장내 환경 내에 포함된 영양 에너지원은, 박테리아 개체군에 의해 (직접적으로 또는 간접적으로) 대사되어, 부티레이트, 프로피오네이트, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개를 생산할 수 있는 임의의 화합물을 포함할 수 있다.
예를 들어, 영양 에너지원은 단당류, 이당류 및/또는 올리고당류를 포함하는 당류를 포함할 수 있다. 본 발명에서 영양 에너지원에 포함될 수 있는 이러한 당류의 바람직한 예는, 과당(fucose), 람노스(rhamnose), 육탄당(hexose), 오탄당(pentose)을 포함한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 오탄당 당류의 특정 예는, 아라비노스(arabinose), 릭소스(lyxose), 리보스(ribose), 자일로스(xylose), 리불로스(ribulose), 자일룰로스(xylulose), 및 데옥시리보스(deoxyribose)이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 육탄당 당류의 특정 예는, 알로스(allose), 알트로스(altrose), 포도당(glucose), 만노스(mannose), 굴로스(gulose), 이도스(idose), 갈락토스(galactose), 탈로스(talose), 사이코스(psicose), 과당(fructose), 소르보스(sorbose) 및 타가토스(tagatose)이다. 본 발명의 구현예에서, 영양 에너지원은 액체 배지의 약 2 중량% 미만, 약 1 중량% 미만, 약 0.5 중량% 미만, 약 0.2 중량% 미만, 또는 0.1 중량% 미만의 양으로 존재할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 영양 에너지원은 액체 배지의 약 0.001 중량% 초과, 약 0.002 중량%, 약 0.005 중량%, 약 0.01 중량%, 0.02 중량% 또는 0.05 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 모의 장내 환경은 유리하게도 관심 대상 세포의 대사 활성을 조절된 그리고 간단한 방식으로 평가할 수 있게 한다.
실시예들은 메가스패라 마실리엔시스가 본 발명의 모의 장내 환경에 첨가될 때, 이 균주의 대사물질 및 특이적인 HDAC 저해 효과가 박테리아 핵심 집단으로 전달된다는 것을 입증한다. 이것은 관심 대상 세포의 대사 활성이 본 발명의 모의 장내 환경으로 성공적으로 전달됨으로서, 관심 대상 세포의 대사 특성들이 조절된 환경 내에서 분석될 수 있게 된다는 것을 입증한다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명에 의하여 상기 기재된 바와 같은 안정화된 모의 장내 환경을 제조하기 위한 공정이 제공된다. 상기 공정은 액체 배지에 5 내지 200개 종의 박테리아를 본질적으로 포함하는 박테리아 개체군을 접종하는 단계를 포함하며, 상기 박테리아 개체군은 상기 영양 에너지원으로부터 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개를 생산할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 액체 배지에 5 내지 20개 종의 박테리아를 본질적으로 포함하는 박테리아 개체군을 접종하는 단계를 포함하는 안정화된 모의 장내 환경을 제조하기 위한 공정. 바람직한 구현예에서, 박테리아의 균주는 이하의 종들로부터 선택된다: 알리스티페스 푸트레디니스 , 악케르만시아 뮤시니치필라 , 아내로스티페스 칵캐 , 아내로스티페스 콜리 , 아내로스티페스 하드루스, 아내로스티페스 람노시보란스 , 박테로이데스 코코이데스 , 박테로이데스 도레이, 박테로이데스 마실리엔시스 , 박테로 이데스 테타이오타마이크론 , 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데스 불가투스 , 바리아트리쿠스 마실리엔시스 , 비피도박테리움 아돌레센티스 , 비피도박테리움 롱굼 , 블라우티아 프로둑타 , 블라우티아 코코이데 스, 블라우티아 오베움 , 부티리치코쿠스 풀리캐코룸 , 부티리비브리오 피브리솔벤스 , 클로스트리디움 부티리쿰 , 클로스트리디움 인돌리스, 클로스트리디움 인노쿰, 클로스트리디움 프로피오니쿰 코프로코쿠스 카투 스, 코프로코쿠스 코메스, 코프로코쿠스 유탁투스 , 디알리스터 인비수스, 데술포비브리오 피게르, 도레아 론기카테나, 에쉐리키아 콜리 , 유박테리움 실린드로이데스, 유박테리움 할리, 유박테리움 리모숨 , 유박테리움 라물루스 , 유박테리움 렉탈레 , 패칼리박테리움 프라우스니치, 락토바실러스 살리바리우스 , 메가스패라 엘스데니 , 메타노브레비박터 스미 시, 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스 , 프레보텔라 코프리 , 루미노코쿠스 알부스 , 로세부리아 패시스, 로세부리아 호미니스 , 로세부리아 인테스티날리스 , 로세부리아 이눌리니보란스, 셀레노모나스 루미난티움 및/또는 베일로넬라 파르불라.
이 공정은 일반적으로 시험관내 공정일 것으로 이해된다.
실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 박테리아 종들이 모의 장내 환경에 첨가되는 순서가 중요할 수 있다는 것을 보여주었다. 박테리아 종들이 접종되는 순서는, 박테리아 종들의 민감성 및 생장 특성에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 어떠한 조건에서도 매우 잘 자라고 빨리 생장하는 박테리아(예컨대, E. 콜리)는 나중에 접종되어, 더 경쟁력 있는 박테리아 종들이 첨가되기 전에, 더욱 민감성 또는 엄격하게 혐기성인 박테리아(예컨대, 유박테리움 렉탈레 , 로세부리아 패시스 , 도레아 론기카테나 , 유박테리움 할리 및/또는 바리아트리쿠스 마실리엔시스)가, 모의 장내 환경 내에서 확립되도록 보장한다. 이 공정은, 모의 장내 환경이 단일의 또는 소수의 박테리아 종들에 의해 장악되는 것을 방지하고, 본 발명의 단순화된 장내 환경이 넓은 범위의 박테리아 종들을 함유하는 인간 마이크로바이옴을 더욱 정확하게 모의화할 수 있도록 하기 때문에 유리하다.
박테리아 종들의 특정 생장 속도를 계산하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 분광계는 박테리아 현탁액의 탁도 또는 광학 밀도를 측정하기 위해 사용될 수 있고, 여기에서 탁도의 증가는 박테리아 생물량(biomass)의 증가를 나타낸다.
따라서, 특정 구현예에서, 모의 장내 환경에는 상기 기재된 본 발명의 박테리아 종들이 순차적으로 접종된다. 특히, 본 발명의 모의 장내 환경을 제조하기 위한 공정은 5 내지 200개 종의 박테리아를 접종하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 박테리아 종들은 이들의 생장 특성을 기준으로 순차적으로 첨가되고, 여기에서 더 늦은 생장 특성을 나타내는 상기 박테리아 종들은 더 빠른 생장 특성을 갖는 박테리아 종들에 앞서 우선적으로 첨가된다. 당업계의 숙련자는 개별적인 종들의 생장 특성이 안정화된 모의 장내 환경에서 발견되는 생장 조건 하에서 평가된다는 것을 이해할 것이다. 이것은 대조군 실험에서 안정화된 모의 장내 환경에서 상이한 박테리아의 생장 특성들을 평가함으로서 용이하게 결정될 수 있다. 이러한 문맥에서 "우선적으로(Preferentially)"는 또한 박테리아가 엄격히 이들의 생장 특성의 순서대로 첨가되어야 한다는 것을 의미하지는 않는다. 오히려, 이는 더 느린 생장 특성을 갖는 대부분의 박테리아(예를 들어, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%)가 더 빠른 생장 특성을 갖는 박테리아에 앞서 첨가된다는 것을 의미한다.
특정 구현예에서, 모의 장내 환경에는 개별적인 종들의 박테리아가 접종된다. 다른 구현예에서, 모의 장내 환경에는 적어도 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상 또는 15개 이상의 그룹의 박테리아가 접종된다. 특정 구현예에서, 박테리아의 그룹은 유사한 생장 특성들을 갖는데, 예를 들어 한 그룹 내의 박테리아의 종들은 모두 엄격한 혐기성이다. 바람직한 구현예에서, 모의 장내 환경에는 적어도 7개 또는 그 이상의 그룹의 박테리아가 접종된다.
따라서, 본 발명의 추가적인 양태에 의하면, 이하의 단계들을 포함하는 관심 대상 세포의 대사 활성을 평가하기 위한 공정이 제공된다:
ㆍ 상기 기재된 액체 배지, 상기 기재된 박테리아 개체군 및 또한 상기 기재된 영양 에너지원을 포함하는 안정화된 모의 장내 환경을 제공하는 단계,
ㆍ 상기 관심 대상 세포를 상기 모의 장내 환경에 첨가하는 단계, 및
ㆍ 상기 관심 대상 세포의 첨가 후, 상기 모의 장내 환경의 조성을 평가하는 단계.
특정 구현예에서, 공정은 장내 환경의 안정화가 달성될 때까지, 모의 장내 환경을 안정화 조건 하에서 유지하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 관심 대상 세포의 유기체는 장내 환경의 안정화가 달성되기 전에 모의 장내 환경에 첨가될 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 박테리아 개체군 내의 박테리아 종들은 순차적으로 다수의 그룹들로서 첨가될 수 있다. 관심 대상 세포는 이들 그룹 중 어느 하나에 첨가될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 실시예에 나타난 바와 같이, 관심 대상 세포는 마지막 그룹으로서 모의 장내 환경에 첨가된다. 박테리아 종들이 엄격히 혐기성이거나 또는 그리 잘 생장하지 않는 경우, 관심 대상 세포를 모의 장내 환경, 예를 들어 그룹 2, 3 또는 4에 먼저 첨가하는 것이 유리할 수도 있다.
모의 장내 환경의 조성은 관심 대상 세포의 첨가 후에 발생하는 변화를 관찰하기 위해 평가될 수 있다. 이들 변화는 모의 장내 환경에 의해 생산된 대사물질, 예컨대 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트의 수준을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 대사물질을 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들어, NMR, 액체 크로마토그래피, 기체 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피 질량 분광분석 또는 기체 크로마토그래피 질량 분광분석을 사용한다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 관심 대상 세포의 첨가(addition on the cell of interest)는 모의 장내 환경에 의해 추가적인 대사물질이 생산되도록 유도한다. 본 발명의 공정으로 단순화된 모의 장내 환경에서 관심 대상인 유기체의 대사 활성이 설명될 수 있다.
따라서 특정 구현예에서, 본 발명은 이하의 단계들을 포함하는 관심 대상 세포의 대사 활성을 평가하기 위한 공정을 제공한다:
ㆍ 상기 기재된 액체 배지, 상기 기재된 박테리아 개체군 및 또한 상기 기재된 영양 에너지원을 포함하는 모의 장내 환경, 및 관심 대상 세포를 제공하는 단계, 및
ㆍ 상기 관심 대상 세포의 첨가 후, 상기 모의 장내 환경의 조성을 평가하는 단계.
특정 구현예에서, 공정은 장내 환경의 안정화가 달성될 때까지 모의 장내 환경을 안정화 조건 하에서 유지하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 공정은 대사 활성을 조사하고, 잠재적으로는 원핵 또는 진핵 세포를 포함하는 임의의 유형의 세포의 작용 메커니즘을 설명하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 관심 대상 세포는 박테리아 세포, 진균 세포, 고세포 또는 바이러스일 수 있다. 관심 대상 세포는 병원성일 수 있다. 대안적으로, 관심 대상 세포는 건강에 유익할 수 있다; 이러한 구현예에서, 본 발명은 유리하게는 약물 발견 공정의 일부로서의 유용성이 발견된다.
본 발명의 공정으로 단순화된 모의 장내 환경 내에서 관심대상 유기체의 대사 활성을 설명할 수 있다. 분리된 관심대상 유기체는 개별적으로 연구될 때, 특정 대사 특성을 가질 것이다. 그러나, 인간 소화관 마이크로바이옴은 서로 상호작용을 하는 수 천가지 상이한 박테리아 종들로 구성되며, 이들은 예를 들어 영양분을 두고 경쟁하거나, 또는 공생 작용을 한다. 그러나, 본 발명자들은 모의 장내 환경 내의 마이크로바이옴을 연구할 때, 대사물질인 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및/또는 포르메이트가 특히 중요하다는 것을 확인하였다.
본 발명의 공정은 장내 환경을 모의화한 조절된 환경 내에서 유기체의 대사 활성을 설명할 수 있도록 한다. 본 발명의 공정은 소화관 미생물 집단 내의 관심 대상 유기체의 생체내 대사 특성들을 신뢰가능하게 예측할 수 있게 한다.
본 발명의 구현예에서, 예를 들어 사용자가 특정 기질 또는 제2 관심 대상 세포에 의한 대사 활성을 조사하기를 바라는 상황에서, 본 발명의 공정은 기질 및/또는 제2 관심 대상 세포를 모의 장내 환경에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 제2 관심 대상 세포는 모의 장내 환경의 안정화가 달성된 후 모의 장내 환경에 첨가될 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 본 발명의 공정은 모의 장내 환경 내에서 특정 대사물질 활성에 대해 관심 대상인 유기체를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 특정 대사물질 활성에 대해 이런 방식으로 스크리닝을 함으로서, 소화관 미생물 집단에서 관심 대상 유기체의 생체내 대사 특성들을 신뢰가능하게 예측할 수 있게 된다. 다른 구현예에서, 모의 장내 환경과 관심대상 대사물질의 공동-배양은 예를 들어, 제2 식물 대사물질과 함께 수행될 수 있다. 본 발명의 공정은 인간 소화관 마이크로바이옴에 대해 관심대상인 대사물질이 가질 수 있는 생체내 효과를 신뢰가능하게 예측할 수 있도록 한다.
기질은 모의 장내 환경의 안정화를 달성하기 전 또는 후에 모의 장내 환경에 첨가될 수 있다. 기질이 당류인 경우, 이는 바람직하게는 박테리아 개체군에 의해 대사되는 당류가 아니고/아니거나, 영양 에너지원 내에 포함된 당류가 아니다.
당업계의 숙련자들이 이해하는 바와 같이, 모의 장내 환경이 가능한한 빨리 안정화를 달성하는 것이 바람직하며, 따라서 셋-업 시간은 최소화되고, 관심 대상 세포의 대사 특성들의 분석은 가능한한 신속하게 개시될 수 있다. 이하의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 모의 장내 환경의 안정화는 선행 기술의 방식(arrangements)에 의한 것보다 유의하게 더 신속히 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 구현예에서, 안정화는 2주 이하 내에, 10일 이하 내에, 1주 이하 내에, 또는 5일 이하 내에, 또는 4일 이하 내에, 또는 3일 이하 내에, 또는 2일 이하 내에, 또는 1일 이하 내에 달성된다.
어떠한 안정화 조건도 이용될 수 있으나, 단 모의 장내 환경의 안정화는 달성된다. 본 발명의 구현예에서, 안정화 조건은 이하 것들 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
ㆍ 온도 조절 - 모의 장내 환경의 온도는 약 20℃, 약 25℃ 또는 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 45℃ 또는 약 50℃의 온도로 유지될 수 있다.
ㆍ pH 조절 - 모의 장내 환경의 pH는 4 이상, 4.5 이상, 5 이상, 5.5 이상 또는 6 이상의 pH 내지 약 8 이하, 7.5 이하, 7.0 이하, 또는 6.5 이하의 pH로 유지될 수 있다.
ㆍ 대기 조절 - 모의 장내 환경이 안정화 조건 하에 유지되는 환경은 혐기성일 수 있는데, 예를 들어, 모의 장내 환경은 약 500 ppm 미만, 약 200 ppm 미만, 약 100 ppm, 50 ppm 미만, 또는 약 20 ppm 미만의 산소를 포함하는 대기 중에서 유지될 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, 모의 장내 환경의 안정화가 달성될 때까지는 모의 장내 환경이 안정화 조건에서 유지된다. 본 발명의 목적을 위해서는, 일단 부티레이트, 프로피오네이트, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개가 모의 장내 환경에서 존재하고, 이 화합물들 각각의 농도가 24시간 기간에 대해 20%만큼 변화하지 않는 경우, 안정화가 달성되었다고 간주된다.
일부 구현예에서, 모의 장내 환경은 부티레이트, 프로피오네이트, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개를 포함하며, 이는 박테리아 개체군에 의해 생산되고/되거나 액체 배지에 직접 첨가될 수 있다. 안정화에 앞서, 모의 장내 환경 내의 박테리아 개체군에 의해 생산된 대사물질, 예컨대 부티레이트, 프로피오네이트, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트의 총 수준은 변화된다. 안정화가 달성될 때, 부티레이트, 프로피오네이트, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개는 조성 내의 박테리아에 의해 생산되고, 이 화합물들 각각의 농도는 24시간 기간, 18시간 기간, 12시간 기간, 또는 6시간 기간 동안 20%만큼 변화되지 않는다.
안정화의 달성 후, 모의 장내 환경이 부티레이트를 포함하는 구현예에서, 부티레이트는 적어도 약 0.5mM, 약 1.0mM, 약 1.5mM, 약 2.0mM, 약 3.0mM, 약 4.0mM 또는 약 5.0mM의 농도로 존재할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 부티레이트는 약 10.0mM 이하, 약 8.0mM 이하, 약 6.0mM 이하, 또는 약 5.0mM 이하의 농도로 존재할 수 있다. 안정화의 달성 후, 모의 장내 환경이 부티레이트를 포함하는 바람직한 구현예에서, 부티레이트는 약 1.0mM 내지 약 5.0mM의 농도로 존재한다.
안정화의 달성 후, 모의 장내 환경이 프로피오네이트를 포함하는 구현예에서, 프로피오네이트는 적어도 약 0.5mM, 약 1.0mM, 약 1.5mM, 약 2.0mM, 약 3.0mM, 약 4.0mM 또는 약 5.0mM의 농도로 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 프로피오네이트는 약 10.0mM 이하, 약 8.0mM 이하, 약 6.0mM 이하, 또는 약 5.0mM 이하의 농도로 존재할 수 있다. 안정화의 달성 후, 모의 장내 환경이 프로피오네이트를 포함하는 바람직한 구현예에서, 프로피오네이트는 약 2.0mM 내지 약 7.0mM의 농도로 존재한다.
안정화의 달성 후, 모의 장내 환경이 아세테이트를 포함하는 구현예에서, 아세테이트는 적어도 약 0.1mM, 약 0.2mM, 약 0.5mM, 약 1.0mM, 약 1.5mM, 또는 약 2.0mM의 농도로 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 아세테이트는 약 5.0mM 이하, 약 4.0mM 이하, 약 3.0mM 이하, 또는 약 2.0mM 이하의 농도로 존재할 수 있다. 안정화의 달성 후, 모의 장내 환경이 아세테이트를 포함하는 바람직한 구현예에서, 아세테이트는 약 0.2 내지 약 2.0mM의 농도로 존재한다.
안정화의 달성 후, 모의 장내 환경이 락테이트를 포함하는 구현예에서, 락테이트는 적어도 약 0.1mM, 약 0.2mM, 약 0.5mM, 약 1.0mM, 약 1.5mM, 또는 약 2.0mM의 농도로 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 락테이트는 약 5.0mM 이하, 약 4.0mM 이하, 약 3.0mM 이하, 또는 약 2.0mM 이하의 농도로 존재할 수 있다. 안정화의 달성 후, 모의 장내 환경이 락테이트를 포함하는 바람직한 구현예에서, 락테이트는 약 0.2 내지 약 2.0mM의 농도로 존재한다.
안정화의 달성 후, 모의 장내 환경이 포르메이트룰 포함하는 구현예에서, 포르메이트는 적어도 약 0.01mM, 약 0.02mM, 약 0.05mM, 약 0.1M, 약 0.2mM, 또는 약 0.5mM의 농도로 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 포르메이트는 약 2.0mM 이하, 약 1.5mM 이하, 또는 약 1.0mM 이하의 농도로 존재할 수 있다. 모의 장내 환경이 안정화의 달성 후 포르메이트를 포함하는 바람직한 구현예에서, 포르메이트는 약 0.01 내지 약 0.5mM의 농도로 존재한다.
관심 대상 세포의 첨가 후 모의 장내 환경의 조성의 평가는, 당업계의 숙련자들에게 알려진 기술들을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 대사체학적 분석이 예를 들어 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 이소부티레이트, 발레레이트, 이소발레레이트, 헥사노에이트, 옥타노에이트, 데카노에이트, 도데카노에이트를 포함하는 단쇄 지방산 및 중간쇄 지방산의 농도를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 대사체학적 분석은 당업계의 숙련자들에게 알려진 임의의 기술, 예를 들어 HPLC을 사용하여 수행될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 모의 장내 환경의 조성의 평가는 관심 대상 세포의 수를 정량화하는 것을 포함할 수 있어서, 사용자는 그 세포의 생장 속도 및 최적 생장 조건을 평가할 수 있다.
박테리아 개체군에 대한 변화는 또한 모의 장내 환경 평가의 일부로서 평가될 수도 있다. 예를 들어, 상이한 수의 개체군들의 비율은 공생 박테리아를 관심 대상 세포에 노출시킬 때의 효과를 예측하기 위해 평가될 수 있다. 이러한 평가는 예를 들어, 당업계의 숙련자들에게 익숙한 기술인 16S 메타게놈 시퀀싱(metagenomic sequencing)을 사용하여 이루어질 수 있다. 당업계의 숙련자는 또한 이러한 시퀀싱, 예를 들어 Illumina MiSeq을 수행하는데 사용될 수 있는 장비에 익숙할 것이다.
조성의 평가는 모의 장내 환경의 안정화의 달성 후 어느 시점에서나 수행될 수 있다. 그러나, 당업계의 숙련자들은 관심 대상 세포가 조성에 영향을 주기에 충분한 시간을 갖는 시점까지 평가 수행을 늦추는 것이 바람직할 것이라고 인지할 것이다. 예를 들어, 조성의 평가는 관심 대상 세포를 모의 장내 환경에 첨가한 지 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 후에 이루어질 수 있다.
그 이후, 추후의 평가는 선택적으로는 주기적인(예를 들어, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 18시간 또는 24시간) 간격으로 이루어질 수 있다.
모의 장내 환경의 평가/들(assessment/s)은 모의 장내 환경 자체 내에서 (예를 들어, 발효조 내에 있는 동안 모의 장내 환경을 분석함으로서) 직접적으로 이루어질 수 있거나, 또는 본 발명의 방법이 모의 장내 환경의 샘플을 추출하고, 그 샘플에 대해 평가를 실시하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 공정은 대조군 연구의 단계를 추가로 포함하는데, 여기에서는 모의 장내 환경에 상응하는 제2 모의 장내 환경이 제공되고, 모의 장내 환경의 안정화를 달성하는데 사용되는 것들에 상응하는 안정화 조건 하에 유지되어, 제2 모의 장내 환경의 안정화가 달성되며, 상기 제2 모의 장내 환경의 조성은 모의 장내 환경과 동일한 방식으로 평가되며, 관심 대상 세포는 제2 모의 장내 환경에 첨가되지 않고, 모의 장내 환경 평가의 결과는 제2 모의 장내 환경 평가의 결과와 비교된다.
이러한 구현예에서, 모의 장내 환경 및 제2 모의 장내 환경은 모의 장내 환경의 통상의 스톡으로부터 취할 수 있다. 대안적으로, 모의 장내 환경 및 제2 모의 장내 환경은 별도로 제조될 수도 있다.
본 발명의 공정은 조절된 조건에서 박테리아 개체군을 유지할 수 있게 하는 임의의 적합한 장비 내에서 수행될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 공정은 가열 수단(예를 들어, 자석 히터), pH 센서, 및/또는 온도 센서를 포함하는 발효조(예를 들어, 스테인레스 스틸, 플라스틱 또는 유리 발효조)에서 수행된다. 발효조에는 액체 배지, 박테리아 개체군, 관심 대상 세포, 기질, 첨가제/들(additive/s), 불활성 기체, 예컨대, 질소, 및/또는 산과 염기를 포함하는 pH 조절제 중 하나 이상이 첨가될 수 있는 하나 이상의 유입구가 제공될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 발효조에는 액체 용출물 및/또는 폐 기체를 시험하기 위해, 모의 장내 환경의 샘플들을 추출하기 위한 하나 이상의 유출구가 제공될 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 공정은 유리하게는 연속적 기준으로 가동된다. 예를 들어, 액체 배지는 박테리아 개체군이 조절된 조건으로 유지되는 장비로 연속적으로 또는 간헐적으로 공급될 수 있다. 액체 배지가 박테리아 개체군이 조절된 조건으로 유지되는 장비로 공급되는 속도는, 약 0.1 ㎖/분, 0.2 ㎖/분, 0.3 ㎖/분, 약 0.4 ㎖/분 또는 약 0.5 ㎖/분 내지 약 1 ㎖/분, 2 ㎖/분, 3 ㎖/분, 4 ㎖/분 또는 약 5 ㎖/분일 수 있다
추가적으로 또는 대안적으로, 샘플들은 박테리아 개체군이 조절된 조건으로 유지되는 장비로부터 연속적으로 또는 간헐적으로 추출될 수 있다. 박테리아 개체군이 조절된 조건으로 유지되는 장비로부터 샘플들이 추출되는 속도는, 약 0.1 ㎖/분, 0.2 ㎖/분, 0.3 ㎖/분, 약 0.4 ㎖/분 또는 약 0.5 ㎖/분 내지 약 1 ㎖/분, 2 ㎖/분, 3 ㎖/분, 4 ㎖/분 또는 약 5 ㎖/분일 수 있다.
본 발명의 추가적인 양태에는, 본원에 기재된 박테리아 개체군, 및 본원에서 논의된 모의 장내 모델을 제조하기 위한 지침을 포함한 키트가 제공된다. 특정 구현예에서, 박테리아 개체군은 동결건조된 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 키트는 본원에 기재된 영양 에너지원 및/또는 본원에 기재된 액체 배지를 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1 - 박테리아 개체군의 이론적인 디자인
박테리아 개체군은 (선행 기술의 모의 위장관내 환경에 이용된 박테리아 개체군에 비해) 단순화되고, 안정화를 신속히 달성할 수 있게 하려는 목적으로 디자인되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 박테리아 개체군은 본 발명자들이 관심 대상 세포의 대사 활성을 평가하는데 중요하다고 확인한 단쇄 지방산의 모든 주요 대사 경로를 포함하도록 디자인되었다. 추가로, 개체군을 구성하는 박테리아는 특정 유기체의 과다 생장을 피하고, 더 느리게 생장하는 균주에 대한 더 빨리 생장하는 균주의 우세한-경쟁(out-competition)을 피하도록 선택되었다.
실시예 2 - 모의 장내 환경의 안정화
도 2에서 개략적으로 나타낸 장비가 셋업되었다. 예시된 장비는 모의 장내 환경(3)이 제공된 유리 발효조(1)를 포함한다. 모의 장내 환경(3)은 실시예 1에서 디자인된 박테리아 개체군, 액체 배지, 그리고 과당, 람노스, 육탄당 및 오탄당을 포함하는 영양 에너지원을 포함한다.
발효조(1)는 밀봉되고, 혐기성 조건(질소 블랭킷) 하에서 가동된다. 장비는 유리하게는 연속적으로 가동되도록 구성되며, 따라서 발효조(1)에는 모의 장내 환경이 일정 부피로 유지되게 해주는 배지 유입구(5), 및 산과 염기의 첨가로 pH를 조절할 뿐만 아니라 질소가 혐기성 환경을 유지하도록 하는 제어 유입구(7)도 또한 제공된다. 센서 유입구(9)는 pH 및 온도 센서가 발효조(1)의 내부로 삽입되게 해준다. 발효조(1)에는 또한 자석 히터(11)도 제공된다.
유출구(13)는 평가를 위한 모의 장내 환경 샘플의 추출, 뿐만 아니라 용출물의 제거도 가능하게 한다.
액체 배지, 박테리아 개체군 및 영양 에너지원을 발효조(1)에 첨가한 후, 모의 장내 환경(3)을 안정화 조건(pH 6 내지 6.5, 37℃의 온도)에서 5일 동안 유지하였다. 부티레이트, 프로피오네이트, 아세테이트 및 포르메이트의 수준은, 박테리아 개체군을 모의 장내 환경에 첨가할 때 평가된 후, 이로부터 24 시간 기간 후에 평가되었고, 이들 평가의 결과는 도 3에 나타나 있다. 나타난 바와 같이, 모의 장내 환경의 안정화는 4 내지 5일 이후에 달성되었는데, 이는 선행 기술의 방식에 비해 상당히 더 빠른 것이다.
실시예
3 - 인간 소화관 미생물총의 단순화 모델(
SimMi
)에서의
MRX0029의
효능 평가
메가스패라 마실리엔시스 균주 MRx0029은, 발레르산 및 중간쇄 지방산 (MCFA) 헥산산도 또한 생산할 수 있는 부티레이트 생산 박테리아 균주이다(도 4 참고).
확립된 박테리아 집단에서 이의 단쇄 지방산 SCFA 및 MCFA의 생산과 HDAC 활성을 유지하는 MRx0029의 능력은, 본 발명의 모의 장내 환경(본원에서, SimMi라고도 지칭됨) 내에서 시험되었다. 이 시스템은 MRx0029의 생체내 대사 특성들을 예측하기 위해 사용되었다.
방법
건강한 공여체의 인간 대변 샘플들로부터 이전에 분리된 16개 박테리아 균주들의 안정된 집단은, 실시예 1 및 2에 기재된 인간 소화관 미생물총의 핵심 대사 기능들을 모방하기 위해 연속 배양으로 개발되었다.
SimMi 환경 내의 박테리아 균주는, 박테로이데스 도레이 , 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데스 테타이오타오마이크론 , 박테로이데스 불가투스 , 비피도박테리움 롱굼 , 블라우티아 프로둑타 , 블라우티아 종, 바리아트리쿠스 마실리엔시스 , 클로스트리디움 인노쿰 , 도레아 론기카테나 , 유박테리움 할리 , 에쉐리키아 콜리 , 유박테리움 렉탈레 , 락토바실러스 살리바루스 , 프레보텔라 종 및 로세부리아 패시스였다.
SimMi 환경 내의 박테리아 종들은 주로 SCFA 생산에 포커스를 맞추었지만, 또한 교차-섭식(cross-feeding), 박테리아 풍부성 및 분화성도 고려하여, 넓은 범위의 대사 경로를 포함한다.
박테리아 집단은 7개 그룹으로 접종되었다.
모의 장내 환경에 접종을 하고, 메가스패라 마실리엔시스 균주 MRx0029을 접종하기에 앞서, 이를 1시간 동안 확립되도록 두었다. 최종 접종 이후에, 모의 박테리아 환경을 2시간 동안 방치한 후, 반응조 용기에 깨끗한 배지를 0.5 ㎖/분의 유속으로 펌핑하였다.
MRX0029을 포함하거나 또는 불포함하는 SimMi 배양액을 13일 동안 생장시켰다.
박테리아
상청액의
SCFA
및
MCFA
정량화
두 가지 콘소시움(consortia)의 대사 작용을 13일 동안 분석하였다. 박테리아 상청액으로부터 단쇄 지방산(SCFA) 및 중간쇄 지방산(MCFA)을 분석하여, MS Omics APS(덴마크)에 의해 정량화하였다. 염산(hydrochloride acid)을 사용하여 샘플들을 산성화하고, 중수소 표지된 내부 기준품을 첨가하였다. 모든 샘플들은 무작위 순서로 분석되었다. 분석은 4중극(quadropole) 검출기(59977B, Agilent)가 커플링된 기체 크로마토그래피(7890B, Agilent)에 장착된 고 극성 컬럼(Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 컬럼 30m × 0.25㎜ × 0.25㎛)을 사용하여 실시하였다. 시스템은 ChemStation(Agilent)에 의해 조절되었다. 데이터가 들어오기 전에, 미가공 데이터를 Chemstation(Agilent)를 사용하여 netCDF 포멧으로 변환시키고, 이를 문헌[Johnsen, L.G 등 (2017). J Chromatogr A, 1503: p. 57-64]에 기재된 PARADISe 소프트웨어를 사용하여 Matlab R2014b(Mathworks, Inc.)에서 가공하였다.
HDAC 활성 검정
12일 차에 2개의 SimMi 배양액(MRX0029 포함 및 불포함) 배양 2개의 콘소시움으로부터 배양액 2개의 컨소시움으로부터의 샘플들의 HDAC 활성을 분석하였다.
MRX0029를 포함 및 불포함하는 SimMi 배양액들로부터의 무세포 상청액(CFS)을, HDAC 활성 분석을 위해 분리하였다. (MRX0029 포함 및 불포함하는) 2개의 SimMi 배양액의 분획을 5000 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 무세포 상청액(CFS)을 0.2 μM 필터(Millipore, UK)를 사용하여 여과한 후, CFS의 1㎖ 분획들을 사용 전까지 -80℃에 저장하였다.
세포 배양: HT-29 인간 대장 선암종 세포는 유럽 세포 배양 컬렉션(ECACC: European Collection of Cell Cultures)으로부터 입수하였다(162-173 계대). 세포는 10% FBS, 4 mM L-글루타민, 1% 비-필수 아미노산 및 항진균제 및 항생제(Sigma, UK)를 함유하는 둘베코 최소 필수 배지(DMEM) 배지에서 생장하였다. 컨플루언시(confluency)에 도달한 지 3일 후, 세포를 행크의 균형 염 용액(HBSS: Hank's Balanced Salt Solution)으로 2회 씻어내고, 4mM L-글루타민, 1% 비-필수 아미노산, 5 μgml-1 아포-트랜스페린 및 0.2 μgml-1 소듐 셀레나이트(Sigma Aldrich, UK)를 갖는 1㎖의 DMEM 중에 현탁하였다(stepped down). 실험의 개시 24 시간 전에, 세포를 현탁하였다.
HDAC
검정
HT-29 세포를 CO2 배양기 내에서 48시간 동안, MRX0029를 포함하거나 불포함하는 SimMi 배양액으로부터의 100㎕의 CFS와 함께 배양하였다.
핵 단백질
추출
처리 후, 세포를 PBS로 2회 씻어낸 후, 웰로부터 세포를 긁어내어 이를 수집하였다. 세포를 5분 동안 450 x g로 원심분리하였다. 이후, NXTRACT NuCLEAR 키트(Sigma Aldrich, UK)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 핵 추출을 수행하였다. 일단 추출되면, 핵 단백질은 스냅-동결(snap-frozen)하고, HDAC 활성 분석을 위해 -80℃에 보관한다.
총 HDAC 활성 분석
히스톤 데아세틸라제 검정 키트(Sigma Aldrich, UK)를 사용하여, HDAC 활성을 분석하였다. 15㎕의 추출된 HT-29 핵 단백질을 사용하여, 제조자의 지침에 따라 검정을 수행하였다.
추가적으로, 비처리된 세포의 HT-29 핵 단백질을 추출하고, NXTRACT NuCLEAR 키트(Sigma Aldrich, UK)에 제공된 HeLa 세포 용해물의 단백질 농도에 맞게 정규화하였다. 단백질 농도는 Pierce Bicinchoninic 단백질 검정(BCA) 키트 A (Thermo Fisher, UK)를 사용하여 결정하였다. 10% CFS의 배양 후, 15㎕의 이 추출물을 HDAC 활성 분석을 위해 사용하여, 전체 세포에서의 HDAC 저해를 확인하였다.
결과
SimMi 배양액에 대한 MRx0029의 첨가는, 배양에 대한 추가적인 경로를 도입한다. 발레르산 및 헥산산은 SimMi의 원래의 핵심 컨소시움에서는 생산되지 않았으나, MRx0029가 첨가된 SimMi에서는 가동의 전 기간(13일) 동안 생산되었다(도 5-7).
12개의 SimMi 및 SimMi+MRX0029 배양액으로부터의 분획들을 총 HDAC 저해성에 대해 시험하였고, YCFA는 대조군으로 작용하였다. 결과에서는, 전체 HT-29 세포(p<0.001) 및 HT-29 세포 용해물(p<0.05)에 대해 SimMi＋MRX0029 배양액이 표준 컨소시움보다 더욱 강력한 총 HDAC 저해성을 갖는 것으로 입증되었다(도 8). 이것은, 부티레이트 및 발레르산 생산 박테리아로서, 확립된 박테리아 집단 내에서 HDAC 저해성을 모의화하기 위한 MRx0029의 생리적 관련 가능성이 SimMi 배양액 내에서 유지된다는 것을 나타낸다.
M. 마실리엔시스 MRx0029을 시험관내 단순화된 인간 소화관 미생물총 컨소시움에 첨가하면, 이 균주의 대사물질 및 특정 HDAC 저해 효과가 박테리아 핵심 집단으로 전달되는 것으로 나타났다.
이들 결과는 관심 대상 세포의 효능에 대한 집단의 영향력 및 그 반대의 영향력을 입증한다. 이로 인해 생체내 연구를 수행하지 않고도 관심 대상 세포가 생체내에서 약학적 특징에 대해 어떠한 영향을 미치는 것인지를 평가할 수 있게 된다.
Claims (51)
- 액체 배지, 영양 에너지원, 및 5 내지 200개 종의 박테리아로 이루어진 박테리아 개체군을 포함하는 모의 장내 환경으로서, 상기 박테리아 개체군은 상기 영양 에너지원으로부터 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개를 생산할 수 있는, 모의 장내 환경.
- 제1항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 5 내지 50개 종의 박테리아로 이루어지는, 모의 장내 환경.
- 제2항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 5 내지 30개 종의 박테리아로 이루어지는, 모의 장내 환경.
- 제3항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 5 내지 20개 종의 박테리아로 이루어지는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 아내로스티페스 (Anaerostipes), 박테리오데테스 ( Bacteroidetes ), 박테로이데스(Bacteroides), 비피도박테리움 ( Bifidobacterium ), 블라우티아 ( Blautia ), 클로스 트리디움(Clostridium), 콜린셀라 ( Collinsella ), 코프로코쿠스 ( Coprococcus ), 에쉐리키아 (Escherischia), 유박테리움 ( Eubacterium ), 퍼미쿠테스 ( Firmicutes ), 락토바실러스(Lactobacillus), 프레보텔라 ( Prevotella ), 파스콜락토박테리움 ( Phascolarctobacterium ), 로세부리아 ( Roseburia ), 루미노코쿠스 ( Ruminococcus ), 셀레노모나스(Selenomonas) 및/또는 베루코마이크로비아 ( Verrucomicrobia ) 속(genus) 유래의 박테리아로 이루어지는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은: 알리스티페스 푸트레디니스 (Alistipes putredinis ), 악케르만시아 뮤시니치필라 ( Akkermansia municiphilla ), 아내로스티페스 칵캐(Anaerostipes caccae ), 아내로스티페스 콜리 ( Anaerostipes coli ), 아내로스티페스 하드루 스(Anaerostipes hadrus ), 아내로스티페스 람노시보란스 ( Anaerostipes rhamnosivorans ), 박테로이데스 코코이데스(Bacteroides coccoides ), 박테로이데스 도레이 ( Bacteroides dorei ), 박테로이데스 마실리엔시 스(Bacteroides massiliensis), 박테로이데스 테타이오타마이크론( Bacteroides thetaiotamicron ), 박테로이데스 (Bacteroides uniformis ), 박테로이데스 불가투스 ( Bacteroides vulgatus ), 바리아트리쿠스 마실리엔시 스(Bariatricus massiliensis ), 비피도박테리움 아돌레센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ), 비피도박테 리움 롱굼 ( Bifidobacterium longum ), 블라우티아 프로둑타 ( Blautia producta ), 블라우티아 코코이데 스(Blautia coccoides ), 블라우티아 오베움 ( Blautia obeum ), 부티리치코쿠스 풀리캐코룸( Butyricicoccus pullicaecorum), 부티리비브리오 피브리솔벤스 ( Butyrivibrio fibrisolvens ), 클로스트리디움 부티리 쿰(Clostridium butyricum ), 클로스트리디움 인돌리스 (Clostridium indolis ), 클로스트리디움 인노 쿰(Clostridium innocuum ), 클로스트리디움 프로피오니쿰 (Clostridium propionicum ) 코프로코쿠스 카투 스(Coprococcus catus ), 코프로코쿠스 코메스 ( Coprococcus comes), 코프로코쿠스 유탁투스 ( Coprococcus eutactus), 디알리스터 인비수스 ( Dialister invisus ), 데술포비브리오 피게르 ( Desulfovibrio piger ), 도레 아 론기카테나 ( Dorea longicatena ), 에쉐리키아 콜리 ( Escherichia coli ), 유박테리움 실린드로이데 스(Eubacterium cylindroides ), 유박테리움 할리 ( Eubacterium hallii ), 유박테리움 리모숨 ( Eubacterium limosum), 유박테리움 라물루스 ( Eubacterium ramulus ), 유박테리움 렉탈레 ( Eubacterium rectale ), 패칼리박테리움 프라우스니치 ( Faecalibacterium prausnitzii ), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 메가스패라 엘스데니 ( Megasphaera elsdenii ), 메타노브레비박터 스미 시(Methanobrevibacter smithii ), 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스 ( Phascolarctobacterium succinatutens), 프레보텔라 코프리 ( Prevotella copri ), 루미노코쿠스 알부스 ( Ruminococcus albus ), 로세부리아 패시스( Roseburia faecis ), 로세부리아 호미니스 ( Roseburia hominis ), 로세부리아 인테스티날리스 ( Roseburia intestinalis ), 로세부리아 이눌리니보란스 ( Roseburia inulinivorans ), 셀레노모나스 루미난 티움(Selenomonas ruminantium ) 및/또는 베일로넬라 파르불라(Veillonella parvula)로 이루어지는 군으로부터의 적어도 5종, 적어도 10종, 적어도 15종, 적어도 20종 또는 이상의 박테리아로 이루어지는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 박테로이데스 도레이 , 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데스 테타이오타오마이크론 , 박테로이데스 불가투스, 비피도박테리움 롱굼, 블라우티아 프로둑타 , 블라우티아 종, 바리아트리쿠스 마실리엔시스, 클로스트리디움 인노쿰, 도레아 론기카테나, 유박테리움 할리, 에쉐리키아 콜리 , 유박테리움 렉탈레, 락토바실러스 살리바루스, 프레보텔라 종 및/또는 로세부리아 패시스로 이루어지는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 5개를 생산할 수 있는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트를 모두 생산할 수 있는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모의 장내 환경은 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개 또는 모두를 포함하는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모의 장내 환경은 선택적으로 약 1.0mM 내지 약 5.0mM의 농도로 부티레이트를 포함하는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모의 장내 환경은 선택적으로 약 2.0mM 내지 약 7.0mM의 농도로 프로피오네이트를 포함하는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모의 장내 환경은 선택적으로 약 0.2mM 내지 약 2.0mM의 농도로 아세테이트를 포함하는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모의 장내 환경은 선택적으로 약 0.2mM 내지 약 2.0mM의 농도로 락테이트를 포함하는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모의 장내 환경은 선택적으로 약 0.01mM 내지 약 0.5mM의 농도로 포르메이트를 포함하는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모의 장내 환경은 부티레이트, 프로피오네이트, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 4개를 포함하고, 프로피오네이트 또는 부티레이트는 최고 농도로 존재하고/하거나, 아세테이트, 포르메이트 또는 락테이트는 최저 농도로 존재하는, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 박테리아 개체군은 이하에서 정의된 a. 내지 e. 중 적어도 3개를 포함하는, 모의 장내 환경:
a. 부티리치코쿠스 , 유박테리움 , 아내로스티페스, 코프로코쿠스 , 부티리비브리오 , 로세부리아 , 패칼리박테리움, 바리아트리쿠스 , 메가스패라, 및/또는 클로스트리디움 속 중 하나 이상으로부터 유래된 부티레이트-생산 박테리아,
b. 퍼미쿠테스 , 베루코마이크로비아, 박테리오데테스 , 박테로이데스 , 블라우티아, 프레보텔라, 및/또는 유박테리움 속 중 하나 이상으로부터 유래된 프로피오네이트-생산 박테리아
c. 박테로이데스 , 비피도박테리움 , 프레보텔라 , 블라우티아 , 셀레노모나스 및/또는 클로스트리디움 속 중 하나 이상으로부터 유래된 아세테이트-생산 박테리아,
d. 비피도박테리움 , 박테로이데스 , 아내로스티페스, 코프로코쿠스 , 클로스트리디움 , 콜린셀라 , 로세부리아 및/또는 락토바실러스 속 중 하나 이상으로부터 유래된 락테이트-생산 박테리아,
e. 에쉐리키아, 루미노코쿠스 및/또는 비피도박테리움 속으로부터 유래된 포르메이트-생산 박테리아. - 제17항에 있어서,
a. 상기 부티레이트-생산 박테리아는 이하의 종들 중 어느 것으로부터 선택될 수 있고: 박테로이데스 마실리엔시스 , 클로스트리디움 인노쿰 , 유박테리움 할리 , 아내로스티페스 하드루스, 도레아 론기카테나 , 패칼리박테리움 프라우스니치 , 로세부리아 패시스 및/또는 유박테리움 렉탈레;
b. 상기 프로피오네이트-생산 박테리아는 이하의 종들 중 어느 것으로부터 선택될 수 있고: 아내로스티페스 하드루스 , 도레아 론기카테나 , 박테로이데스 테타이오타오마이크론 , 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데스 불가투스 , 박테로이데스 도레이 , 비피도박테리움 롱굼 , 블라 우티아 오베움 , 유박테리움 할리 , 및/또는 락토바실러스 살리바리우스;
c. 상기 아세테이트-생산 박테리아는 이하의 종들 중 어느 것으로부터 선택될 수 있고: 박테로이데스 테타이오타오마이크론, 박테로이데스 유니포르미스 , 박테로이데스 불가투스 , 박테로이데스 코코 이데스, 박테로이데스 도레이 , 비피도박테리움 롱굼 , 락토바실러스 살리바리우스 및/또는 프레보텔라 코프리;
d. 상기 락테이트-생산 박테리아는 이하의 종들 중 어느 것으로부터 선택될 수 있고: 비피도박테리움 롱굼 및/또는 락토바실러스 살리바루스; 그리고/또는
e. 상기 포르메이트-생산 박테리아는 에쉐리키아 콜리일 수 있는, 모의 장내 환경. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 설페이트 환원 박테리아, 뮤신 분해 박테리아, 설페이트 방출 박테리아 및/또는 메탄생성 박테리아를 포함하는, 모의 장내 환경.
- 제19항에 있어서,
a. 상기 설페이트 환원 박테리아는 데술포비브리오 속으로부터 유래되며, 바람직하게는 상기 박테리아는 데술포비브리오 피게르 종으로부터 유래되고;
b. 상기 뮤신 분해 박테리아는 악케르만시아 속으로부터 유래되며, 바람직하게는 상기 박테리아는 악케르만시아 뮤시니필리아 종으로부터 유래되고;
c. 상기 설페이트 환원 박테리아는 악케르만시아 속으로부터 유래되며, 바람직하게는 상기 박테리아는 악케르만시아 뮤시니필리아 종으로부터 유래되고;
d. 상기 메탄생성 박테리아는 메타노브레비박터 속으로부터 유래되며, 바람직하게는 상기 박테리아는 메타노브레비박터 스미시 종으로부터 유래되는, 모의 장내 환경. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 개체군 내에 존재하는 박테리아의 적어도 99%는 한 명 이상의 건강한 공여체의 인간 장관으로부터 분리된 공생 유기체인, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 개체군 내에 존재하는 박테리아의 적어도 99%는 한 명 이상의 건강하지 못한 공여체의 인간 장관으로부터 분리된 공생 유기체인, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 개체군 내의 박테리오데테스:퍼미쿠테스의 비는 30:65, 30:70, 35:65 또는 35:70인, 모의 장내 환경.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영양 에너지원은 단당류를 포함하는, 모의 장내 환경.
- 안정화된 모의 장내 환경을 만들기 위한 시험관내 공정으로서, 5 내지 200개의 종 또는 균주의 박테리아로 이루어지는 박테리아 개체군을 액체 배지에 접종하는 단계를 포함하되, 상기 박테리아 개체군은 상기 영양 에너지원으로부터 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개를 생산할 수 있는, 시험관내 공정.
- 제25항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 5 내지 20개의 종 또는 균주의 박테리아로 이루어지는, 시험관내 공정.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 제2항 내지 제9항, 및 제17항 내지 제23항에서 정의된 바와 같은 박테리아로 이루어지는, 시험관내 공정.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 제8항 내지 제16항에서 정의된 바와 같은 대사물질을 생산할 수 있는, 시험관내 공정.
- 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모의 장내 환경에는 순차적으로 박테리아가 접종되는, 시험관내 공정.
- 제29항에 있어서, 상기 박테리아 종들은 이들의 생장 특성을 기준으로 순차적으로 첨가되고, 여기에서 더 느린 생장 특성을 나타내는 박테리아 종들은 더 빠른 생장 특성을 갖는 박테리아 종들에 앞서 우선적으로 첨가되는, 시험관내 공정.
- 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모의 장내 환경에는 적어도 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상 또는 15개 이상의 그룹의 박테리아가 접종되는, 시험관내 공정.
- 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 배지는 YCFA인, 시험관내 공정.
- 관심 대상 세포의 대사 활성을 평가하기 위한 시험관내 공정으로서,
a. 액체 배지, 영양 에너지원, 및 5 내지 200개 종의 박테리아로 이루어진 박테리아 개체군을 포함하는 안정화된 모의 장내 환경을 제공하되, 상기 박테리아 개체군은 상기 영양 에너지원으로부터 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개를 생산할 수 있는 단계,
b. 상기 관심 대상 세포를 상기 모의 장내 환경에 첨가하는 단계, 및
c. 상기 관심 대상 세포의 첨가 후, 상기 모의 장내 환경의 조성을 평가하는 단계를 포함하는, 시험관내 공정. - 관심 대상 세포의 대사 활성을 평가하기 위한 시험관내 공정으로서:
a. 액체 배지, 영양 에너지원, 및 5 내지 200개 종의 박테리아로 이루어지는 박테리아 개체군을 포함하는 모의 장내 환경을 제공하되, 상기 박테리아 개체군은 상기 영양 에너지원 및 관심 대상 세포로부터 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개를 생산할 수 있는 단계, 및
b. 상기 관심 대상 세포의 첨가 후, 상기 모의 장내 환경의 조성을 평가하는 단계를 포함하는, 시험관내 공정. - 제33항 또는 제34항에 있어서, 장내 환경의 안정화가 달성될 때까지, 상기 모의 장내 환경을 안정화 조건 하에서 유지하는 단계를 추가로 포함하는, 시험관내 공정.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모의 장내 환경의 안정화를 달성한 후 상기 모의 장내 환경의 샘플을 추출하는 단계, 및 상기 샘플에 대해 조성의 평가를 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 시험관내 공정.
- 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화는 한 주 이하 내에 달성되는, 시험관내 공정.
- 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 제2항 내지 제 9항, 및 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 박테리아로 이루어지는, 시험관내 공정.
- 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화 조건은 이하에 정의된 a. 내지 c. 중 하나, 둘 또는 셋을 포함하는, 시험관내 공정:
a. 상기 모의 장내 환경의 온도는 약 20℃ 내지 약 50℃의 온도로 유지되고,
b. 상기 모의 장내 환경의 pH는 pH 5 이상 내지 약 pH 7.0 이하로 유지되며,
c. 상기 모의 장내 환경은 약 100 ppm 미만의 산소를 포함하는 대기 중에 유지된다. - 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화의 달성 후, 상기 모의 장내 환경은 선택적으로 약 1.0mM 내지 약 5.0mM의 농도로 부티레이트를 포함하는, 시험관내 공정.
- 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화의 달성 후, 상기 모의 장내 환경은 선택적으로 약 2.0mM 내지 약 7.0mM의 농도로 프로피오네이트를 포함하는, 시험관내 공정.
- 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화의 달성 후, 상기 모의 장내 환경은 약 0.2mM 내지 약 2.0mM의 농도로 아세테이트를 포함하는, 시험관 내 공정.
- 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화의 달성 후, 상기 모의 장내 환경은 선택적으로 약 0.2mM 내지 약 2.0mM의 농도로 락테이트를 포함하는, 시험관내 공정.
- 제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화의 달성 후, 상기 모의 장내 환경은 선택적으로 약 0.01mM 내지 약 0.5mM의 농도로 포르메이트를 포함하는, 시험관내 공정
- 제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화는 3일 이하 내에 달성되는, 시험관내 공정.
- 제33항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 대상 세포의 첨가 이후 모의 장내 환경의 평가는, 대사체학적 분석, 관심 대상 세포의 정량화, 및/또는 박테리아 개체군에 대한 변화의 평가 중 하나 이상을 포함하는, 시험관내 공정.
- 제33항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 연구를 추가로 포함되는데, 여기에서는 상기 모의 장내 환경에 상응하는 제2 모의 장내 환경이 제공되고, 이것이 상기 모의 장내 환경의 안정화를 달성하는데 사용된 것들에 상응하는 안정화 조건 하에서 유지되어, 상기 제2 모의 장내 환경의 안정화가 달성되며, 상기 제2 모의 장내 환경의 조성은 상기 모의 장내 환경과 동일한 방식으로 평가되며, 상기 관심 대상 세포는 상기 제2 모의 장내 환경에는 첨가되지 않고, 상기 모의 장내 환경 평가의 결과는 상기 제2 모의 장내 환경 평가의 결과와 비교되는, 시험관내 공정.
- 5 내지 200개의 종 또는 균주의 박테리아로 이루어지는 박테리아 개체군을 포함하는 키트로서, 상기 박테리아 개체군은 영양 에너지원으로부터 부티레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 및 포르메이트 중 적어도 세 개를 생산할 수 있는, 키트.
- 제48항에 있어서, 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 모의 장내 환경을 제조하거나, 또는 제25항 내지 제47항 중 어느 한 항의 시험관내 공정을 가동하기 위한 지침을 추가로 포함하는, 키트.
- 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 박테리아 개체군은 동결건조된 조성물의 형태로 제공되는, 키트.
- 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 영양 에너지원을 포함하는, 키트.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18170880 | 2018-05-04 | ||
| EP18170880.1 | 2018-05-04 | ||
| PCT/EP2019/061446 WO2019211469A1 (en) | 2018-05-04 | 2019-05-03 | Simulated intestinal environment |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210005116A true KR20210005116A (ko) | 2021-01-13 |
Family
ID=62222388
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020207033453A KR20210005116A (ko) | 2018-05-04 | 2019-05-03 | 모의 장내 환경 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210214676A1 (ko) |
| EP (1) | EP3788134A1 (ko) |
| JP (1) | JP2021521871A (ko) |
| KR (1) | KR20210005116A (ko) |
| CN (1) | CN112154202A (ko) |
| AU (1) | AU2019264214A1 (ko) |
| CA (1) | CA3098968A1 (ko) |
| SG (1) | SG11202010935VA (ko) |
| WO (1) | WO2019211469A1 (ko) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210355431A1 (en) * | 2018-10-15 | 2021-11-18 | Pharmabiome Ag | Method of manufacturing a consortium of bacterial strains |
| WO2021102313A1 (en) * | 2019-11-22 | 2021-05-27 | Assembly Biosciences, Inc. | Compositions comprising bacterial species and methods related thereto |
| CN114681492B (zh) * | 2020-12-28 | 2024-04-19 | 中国科学院上海营养与健康研究所 | 改善代谢性疾病的肠道益生菌及其应用 |
| BE1030583B1 (nl) * | 2022-06-02 | 2024-01-08 | Prodigest | Dunne darm microbiota model |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3052111B1 (en) * | 2013-10-03 | 2020-12-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions comprising a defined microbiome and methods of use thereof |
| JP6482135B2 (ja) * | 2014-03-12 | 2019-03-13 | 国立大学法人神戸大学 | 腸内細菌叢シミュレーション培養方法、装置および培養菌叢 |
| WO2016049932A1 (en) * | 2014-09-30 | 2016-04-07 | Bgi Shenzhen Co., Limited | Biomarkers for obesity related diseases |
| ES2960781T3 (es) * | 2016-02-04 | 2024-03-06 | Univ Gent | Uso de comunidades microbianas para la salud humana y animal |
-
2019
- 2019-05-03 SG SG11202010935VA patent/SG11202010935VA/en unknown
- 2019-05-03 AU AU2019264214A patent/AU2019264214A1/en not_active Abandoned
- 2019-05-03 EP EP19722591.5A patent/EP3788134A1/en active Pending
- 2019-05-03 CA CA3098968A patent/CA3098968A1/en active Pending
- 2019-05-03 JP JP2020561084A patent/JP2021521871A/ja active Pending
- 2019-05-03 KR KR1020207033453A patent/KR20210005116A/ko not_active Application Discontinuation
- 2019-05-03 CN CN201980034317.8A patent/CN112154202A/zh active Pending
- 2019-05-03 WO PCT/EP2019/061446 patent/WO2019211469A1/en active Application Filing
-
2020
- 2020-11-04 US US17/089,370 patent/US20210214676A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3098968A1 (en) | 2019-11-07 |
| WO2019211469A1 (en) | 2019-11-07 |
| EP3788134A1 (en) | 2021-03-10 |
| US20210214676A1 (en) | 2021-07-15 |
| JP2021521871A (ja) | 2021-08-30 |
| SG11202010935VA (en) | 2020-12-30 |
| AU2019264214A1 (en) | 2020-12-17 |
| CN112154202A (zh) | 2020-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20210005116A (ko) | 모의 장내 환경 | |
| Yu et al. | Effects of taurine on gut microbiota and metabolism in mice | |
| Kashyap et al. | Complex interactions among diet, gastrointestinal transit, and gut microbiota in humanized mice | |
| Nyangale et al. | Gut microbial activity, implications for health and disease: the potential role of metabolite analysis | |
| JP2022033885A (ja) | 設計された細菌組成物 | |
| Bligh et al. | A rapid method of total lipid extraction and purification | |
| Rogers et al. | Dynamic responses of B acteroides thetaiotaomicron during growth on glycan mixtures | |
| Zhang et al. | Metabolite interactions between host and microbiota during health and disease: Which feeds the other? | |
| MAeKIVUOKKO et al. | Effects of lactose on colon microbial community structure and function in a four-stage semi-continuous culture system | |
| IL258881B1 (en) | Faecalibacterium prausnitzii ו– desulfovibrio piger לשימוש בטיפול או מניעת סכרת ומחלות מעיים | |
| US11738056B2 (en) | Compositions and methods for improving mitochondrial function | |
| EP2932265B1 (fr) | Souches probiotiques pour le traitement et/ou la prévention de la diarrhée | |
| Rajpal et al. | Modulating the human gut microbiome as an emerging therapeutic paradigm | |
| Lee et al. | Analysis of in vitro digestion using human gut microbiota in adult and elderly individuals | |
| Marzorati et al. | Effects of combined prebiotic, probiotic, IgG and amino acid supplementation on the gut microbiome of patients with inflammatory bowel disease | |
| Tong et al. | Effect of a prawn (Macrobrachium rosenbergii)-plant eco-symbiotic culture system (PECS) on intestinal microbiota, organic acids, and ammonia | |
| Edirisuriya | Characterization of Clostridium cochlearium as a Potential Probiotic for Obesity Management | |
| EP4309662A1 (en) | Microorganisms converting inositol to butyrate | |
| JP7422388B2 (ja) | アクアポリン３の発現亢進能を有する短鎖脂肪酸 | |
| CA3045073C (en) | Nutritional composition useful in the treatment of neoplastic diseases | |
| Li et al. | In-vitro dynamic fermentation simulation colon reactor for gut microbiota incubation | |
| Shintani et al. | In vitro human colon microbiota culture model for drug research | |
| Glowacki et al. | A genetically adaptable strategy for ribose scavenging in a human gut symbiont plays a diet-dependent role in colon colonization | |
| Dix | The Development of a SCFA Analysis Method and the Examination of Factors Affecting Listeria Pathogenesis | |
| Kumar | Effects of Vitamin B12 on Spore Germination and Biofilm Formation of Bacillus Licheniformis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |