KR20210002199A - 미세먼지에 의한 피부 손상 진단용 조성물 및 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법 - Google Patents

미세먼지에 의한 피부 손상 진단용 조성물 및 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210002199A
KR20210002199A KR1020190077017A KR20190077017A KR20210002199A KR 20210002199 A KR20210002199 A KR 20210002199A KR 1020190077017 A KR1020190077017 A KR 1020190077017A KR 20190077017 A KR20190077017 A KR 20190077017A KR 20210002199 A KR20210002199 A KR 20210002199A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fine dust
gene
skin damage
skin
mrna
Prior art date
Application number
KR1020190077017A
Other languages
English (en)
Inventor
김형준
서영록
Original Assignee
(주)아모레퍼시픽
동국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)아모레퍼시픽, 동국대학교 산학협력단 filed Critical (주)아모레퍼시픽
Priority to KR1020190077017A priority Critical patent/KR20210002199A/ko
Publication of KR20210002199A publication Critical patent/KR20210002199A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6881—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법을 개시한다. 구체적으로, 본 발명의 스크리닝 방법은 기타 외부 환경 자극에는 반응하지 않으면서 미세먼지에 특이적으로 발현량 변화를 나타내는 유전자를 마커로 사용함으로써 미세먼지에 의한 피부 세포의 손상을 억제 또는 완화하는 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

Description

미세먼지에 의한 피부 손상 진단용 조성물 및 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법{COMPOSITION FOR DIAGNOSING SKIN DAMAGE CAUSED BY FINE DUST, AND SCREENING METHOD FOR SUBSTANCES INHIBITING OR ALLEVIATING SKIN DAMAGE CAUSED BY FINE DUST}
본 발명은 미세먼지에 의한 피부 손상 여부를 진단하는데 사용될 수 있는 바이오마커와 이를 포함하는 조성물, 이를 포함하는 키트, 이를 이용한 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단 방법, 및 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
피부의 구성층 중 표피는 인체 내부의 수분 증발을 방지하는 중요한 역할을 한다. 표피는 외부로부터 순서대로 각질층, 과립층, 유극층, 기저층으로 구분되며, 각질층의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고 각질세포 사이의 세포간 지질들은 모르타르와 같은 역할로 작용하여 피부 장벽을 구성한다(J. Invest. Dermatol. 80(Suppl.), 44-49, 1983).
한편, 미세먼지는 대기 중에 부유하는 입자상 물질로서, 주로 자동차의 배기가스, 화석 연료의 연소, 도로의 먼지 등으로부터 발생하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 미세먼지는 평균 입경 10μm 이하의 크기를 가진 것을 의미하며 미세먼지에 노출될 경우 호흡기 및 심혈관 질환뿐만 아니라 피부, 안질환 등의 문제가 발생할 수 있다. 특히, 황사, 먼지 또는 미세먼지가 많은 지역에 주거하는 사람들의 피부에서는 색소 침착과 팔자 주름 등이 늘어나는 것이 관찰된 바 있다.
미세먼지는 그 크기가 매우 미소하기 때문에 육안으로 존재 여부를 식별하기 어려운 특징을 가지며 인체 건강에 직결되는 대기오염 물질로서, 미세먼지에 대한 노출 여부를 명확하게 확인하는 방법에 대한 요구가 증가하는 실정이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2016-0119703호
일 측면에서, 본 발명은 미세먼지에 의한 피부 손상 여부를 진단하는데 사용할 수 있는 바이오마커 및 이를 함유하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 미세먼지에 의한 피부 손상 여부를 진단하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여,
일 측면에서, 본 발명은, AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단용 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 피험자의 피부세포 시료로부터,
1) AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
2) 상기 발현 정도를, 미세먼지에 의해 손상되지 않은 피부세포 시료 내에서의 상기 유전자의 mRNA 또는 이로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 피부세포에 미세먼지를 처리하는 단계;
상기 미세먼지를 처리한 피부세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
상기 시험 물질을 처리한 피부세포에서, 시험 물질 처리 전후의 AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
일 측면에 있어서, 본 발명에 의한 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 여부 진단용 바이오마커와 이를 포함하는 조성물을 이용하면, 미세먼지에 의한 피부 세포의 손상 여부에 따라서 발현량이 변화하는 유전자의 발현량을 확인함으로써 피부 세포의 손상 여부를 간편하면서 빠르게 진단할 수 있으며, 상기 유전자의 발현 정도를 확인하여 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질을 용이하게 스크리닝 할 수 있다.
도 1은 미세먼지 추출액의 처리에 의한 세포생존율(cell survival ratio, %)을 나타낸 것이며, 여기서 PM2.5(Particulate matter 2.5)는 입자크기가 2.5μm인 미세먼지를 나타낸다.
도 2는 미세먼지에 의해 자극된 피부 세포에서 특정 유전자의 발현량이 증가함을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브(probe)"란 유전자의 표적 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 또는 폴리뉴클레오티드와 이에 결합된 표지 물질을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"란 유전자의 표적 부위에 해당하는 특정 영역을 PCR을 이용하여 증폭하기 위하여 사용하는 유전자 특정 영역의 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 변이체를 의미한다. 상기 프라이머는 특정 영역 말단과 완전히 상보적일 것을 요구하지 않으며, 상기 말단에 혼성화되어 이중사슬 구조를 형성할 정도로 상보적이라면 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화(hybridization)"란 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match)뿐 아니라 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "미세먼지"는, 인간의 눈에 보이지 않는 아주 작은 물질로 대기 중에 오랫동안 떠다니거나 흩날리는 입자상의 물질로서, 입경 10μm 이하의 물질을 의미할 수 있다. 특히 입경이 2.5μm 이하인 입자상의 물질은 "초미세먼지"라고 하는데, 본 명세서에서 "미세먼지"는 "초미세먼지"도 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명은, 일 측면에서, 특정 유전자 및 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단용 바이오마커에 관한 것이다. 이때, 피부 손상은 피부 세포의 손상일 수 있으며, 상기 피부 세포는 각질형성세포일 수 있다.
상기 특정 유전자는 AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자일 수 있다.
상기 유전자 중 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상 또는 3개 이상, 또는 상기 유전자 전부가 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단용 바이오마커로서 이용될 수 있다.
본 발명은, 다른 측면에서, 상기 유전자들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단용 조성물에 관한 것이다.
일 구현 예에서, 상기 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 상기 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 단일클론 항체(monoclonal antibody) 또는 다중클론 항체(polyclonal antibody)일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단용 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키트를 사용함으로써, 미세먼지에 의한 피부 손상 여부를 빠르고 간편하게 진단할 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 키트를 이용하여, 피험자의 피부세포로부터 측정된 AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도가 미세먼지에 의해 손상되지 않은 피부세포 시료 내에서보다 높은 경우, 미세먼지에 의해 피부 세포가 손상된 것으로 판단할 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 키트는 AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상의 유전자 또는 이들 유전자 전부에 의하여 암호화되는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 하나 이상 포함할 수 있고, 진단 대상 피부 세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양을 측정하여, 미세먼지에 의한 피부의 손상 여부를 판단할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, 미세먼지에 의한 피부 손상 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 방법은, 1) AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 2) 상기 발현 정도를, 미세먼지에 의해 손상되지 않은 피부세포 시료 내에서의 상기 유전자의 mRNA 또는 이로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 방법은, 피험자의 피부세포 시료로부터 측정된, AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도가 상기 미세먼지에 의해 손상되지 않은 피부세포 시료 내에서보다 높은 경우, 미세먼지에 의해 피부 세포가 손상된 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), 노던블로팅(northern blotting), 웨스턴블로팅(western blotting) 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 유전자 발현량 등의 "정상 수준"이라 함은, 미세먼지에 의해 자극받지 않은 정상적인 피부 세포에서의 유전자 발현량을 의미하는 것이다. 본 명세서에서는 진단 대상 피부 세포에서 상기 유전자들 중 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 양을 측정하고, 그 측정 값을 미세먼지에 의해 자극받지 않은 정상적인 피부 세포에서의 발현량과 비교함으로써, 피부 세포의 손상 여부를 평가하게 된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "많거나 적음", "높거나 낮음"은 기준이 되는 양과 비교하여 차이가 있음을 의미하는 것으로서, 그 양이 기준이 되는 양에 비하여 1.5배 이상, 2배 이상, 바람직하게는 2.2배 이상 증가 또는 감소되어 양에 차이가 생긴 경우를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는, 미세먼지에 의해 발현량이 증가하는 유전자는 하기 표 1에 제시되어 있다. 표 1에서 Name은 NCBI의 genebank accession ID를 의미하는 것이고, Gene Symbol은 공식 유전자 심볼을 의미하며, Gene title은 각 유전자의 이름을 의미한다.
Name Gene Symbol Gene title
NM_205845 AKR1C2 aldo-keto reductase family 1, member C2
NM_014903 NAV3 neuron navigator 3
NM_016354 SLCO4A1 solute carrier organic anion transporter family, member 4A1
NM_006290 TNFAIP3 tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3
본 발명의 키트에서 프로브로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 미세먼지에 의한 자극에 의해 발현량이 증가하는 마커 유전자의 전장(full length) 또는 이의 단편을 포함한다. 단편의 길이는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직한데, 이는 프로브의 길이가 10bps 이하이면 비특이적으로 결합되기 때문이다.
본 발명의 키트에서 프라이머로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 크게 제한되지는 않지만, 바람직하게는 18~22개인 프라이머를 사용하는 것이 유리하다.
본 발명의 키트에 포함되는, 마커 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드에 대한 단일클론 항체는 일반적인 단일클론 항체 제조방법으로 제조될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 미세먼지에 의해 손상된 피부 세포에서 특정 유전자의 발현량을 정상 수준으로 조절함으로써 미세먼지에 의한 피부 세포 손상을 억제 또는 완화하는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 스크리닝 방법은, 피부세포에 미세먼지를 처리하는 단계; 상기 미세먼지를 처리한 피부세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험 물질을 처리한 피부세포에서, 시험 물질 처리 전후의 AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 스크리닝 방법은, 상기 시험 물질 처리 전에 비하여 시험 물질 처리 후에, AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도가 감소하는 경우, 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
즉, 시험 물질 처리 시, 미세먼지에 의해 발현량이 증가하는 상기 유전자의 발현량이 정상 수준으로 감소하는 경우, 상기 시험 물질을 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질로 판단할 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 피부세포는 각질형성세포일 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 정도는 상기 유전자의 mRNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 상기 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나 이상을 사용하여 측정할 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), 노던블로팅(northern blotting), 웨스턴블로팅(western blotting) 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이러한 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1] 미세먼지 포집 및 추출
미세먼지의 포집은 로우 볼륨 에어 샘플러(Sensidyne, Gillian, Low Volume Air Sampler, FL, U.S.A.)를 이용하였고, Filter pack은 매 측정일 오전 10시 전후에 필터와 디누더를 교체하여 약 24시간 동안 시료를 채취하였다. 2014년 2월 1일부터 2014년 2월 28일까지 서울의 풍하지역(경기도 용인시 처인구 소재, 한국외국어대학교 외국학 종합연구센터 생활관 6층 옥상)에서 매일 미세먼지를 포집하였으며, 측정시간은 진공펌프를 켜면서 타이머를 작동시키고 진공펌프를 끌 때 타이머의 시간을 기록하였다. 채취 유량은 16.7L/min으로 하여 측정 시작시 유량계(Model 4143, TSI Inc.)로 유량을 측정하고 측정이 끝날 때 다시 유량을 측정하였다. filter pack에 들어가는 Teflon 필터는 시료 채취 전과 후에 무게를 측정하였다. Teflon 필터의 무게를 측정하기 전 24 시간 동안 상대습도 40%의 데시케이터(NIKKO, Japan)에 항량시킨 후 소수점 5자리가 표시되는 전자저울(DVG215CD, Ohaus)에 무게를 두 번 측정하여 평균값을 기록하였다. 시료를 채취한 후에도 무게를 측정하기 전에 데시케이터에서 24시간 항량시킨 후 무게를 두 번 측정하여 채취 전에 측정한 무게와 비교하여 질량농도를 산출하였다. 미세먼지의 추출은 Teflon 필터를 1mL의 에탄올에 적신 후 14mL의 DW를 넣어 필터의 에어로졸 포집면이 수면에 닿도록 한 상태에서 뚜껑을 닫은 후 초음파 세척기로 30분간 초음파를 주어 실행하였다. 여과단계에서 수분에 의한 오차를 최소화하기 위하여 건조기(decicator)에서 48시간 동안 필터의 수분을 완전히 제거한 후, 0.1mg까지 측정할 수 있는 초정밀저울계(Mettler Toledo Company)를 이용하여 필터의 무게를 칭량하여 필터의 추출 전, 후 무게를 칭량하였다.
[실시예 2] 인간 정상 각질형성세포의 배양
인간 정상 각질형성세포(Human normal epidermal keratinocyte cells)는 론자사(Lonza, Inc. 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)에서 구입하여 계대배양한 후 CO2 배양기(CO2 incubator)에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포 배양액은 론자사의 지침서에 따랐다. 500ml의 KBM-2(KBMTM-2, CC-3103) 배지에 KGM-2 불렛 키트 CC-4152(KGMTM-2 Bullet kit, CC-4152)(성분: BPE(Bovine pituitary extract)), 인간표피 성장인자(human epidermal growth factor, hEGF), 인슐린(Insulin), 하이드로코티손(Hydrocortisone), 트랜스페린(Transferrin), 에피네프린(Epinephrine), 및 젠타마이신 설페이트+암포페리신-B(Gentamycin Suflate + Amphofericin-B: GA-1000))를 첨가한 KGM-2 불렛키트 CC-3107(KGMTM-2 Bullet Kit, CC-3107)을 사용하였다.
[실시예 3] 인간 정상 각질형성세포에 미세먼지의 처리
미세먼지 처리를 통한 세포독성 여부 확인을 위하여, Mossman 등(J.Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 인간 정상 각질형성세포를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 구체적으로, 24-웰 플레이트를 사용하고 상기 실시예 1에서 얻은 직경이 2.5㎛인 미세먼지를 정제수에 분산시켜서 미세먼지 분산액을 제조한 다음, 실시예 2의 세포배양조건으로 2.5 Х 105 웰 세포수인 조건에서 배양한 세포에 상기 미세먼지 분산액을 처리하여 24시간 동안 배양한 후, MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5㎎/㎖을 혼합하여 37℃에서 3시간 동안 추가 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500㎕에 용해하였다. 그 용해물을 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540nm에서 OD값을 측정하였다. 측정 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 세포주에서 직경 2.5μm 미세먼지를 분산시킨 분산액에 의한 세포독성에 대하여 80% 생존율을 보이는 농도(IC20)값은 12.5㎍/㎖ 임을 확인할 수 있었다.
[실시예 4] 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS)을 통한 미세먼지에 의한 피부 세포 유전자 변화 확인
RNA-염기서열 데이터 처리 및 분석을 위해, Trapnell et al.(2012)에 의해 개발된 일반적인 분석 단계를 참조하였다. FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)를 사용하여 RNA-seq 데이터 품질을 확인하였고, FASTX(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)를 사용하여, 정확도가 떨어지는 베이스 및 어탭터 서열을 제거하였다. 이후 Tophat(Trapnell et al., 2009)과 인간 유전체(hg19)를 사용하여 얼라인먼트를 수행하였고, 각 샘플의 데이터량을 RSeQC로 재명명된 EVER-seq을 사용하여 확인하였다(Wang et al., 2012). 또한, Cufflinks를 사용하여 전사체(transcript)의 발현 수준을 정량하였고, 2가지 미세먼지 분산액 처리 샘플과 정상 샘플의 사이에서 전사 수준을 비교하였다(Trapnell et al., 2010). FDR adjusted p-value<0.05로, =2.0 fold-change의 엄격한 컷오프를 적용하여, 직경이 2.5㎛인 미세먼지의 분산액 및 직경이 10㎛인 미세먼지의 분산액의 처리 시 유의미한 발현 차이를 나타내는 유전자를 결정하였다. 측정 결과는 하기 표 2에 나타내어져 있다.
Name Gene Symbol 배수 변화량
NM_205845 AKR1C2 2.06
NM_014903 NAV3 2.029
NM_016354 SLCO4A1 2.036
NM_006290 TNFAIP3 2.219
[실시예 5] 실시간 RT-PCR 정량
실시예 1에서 추출한 직경이 2.5㎛인 미세먼지를 실시예 2에서 배양한 인간 정상 각질형성세포에 세포배양배지 1ml에 12.5㎍의 양으로 처리하고, 하기 표 3에 나타낸 유전자의 프라이머(applied biosystems TaqMan® Primers)로 상대적 mRNA 발현양을 측정하였다.
Name Gene Symbol TaqMan® 프라이머
NM_205845 AKR1C2 Hs00912742_m1
NM_014903 NAV3 Hs00372108_m1
NM_016354 SLCO4A1 Hs00249583_m1
NM_006290 TNFAIP3 Hs00234713_m1
24시간 경과 후, 배양액을 제거하고, 2ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 상기 표 3의 프라이머를 이용한 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(Q-RT-PCR: real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 정량적으로 분석하였다. 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 세포의 유전자 변화를 실시간 PCR로 평가하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 이용한 Q-RT-PCR과 실시간 PCR은 모두 라이프테크놀로지에서 배포하는 표준 프로토콜에 따라서 실행하였으며, 구체적으로 95℃에서 20초 동안 처리한 후, 95℃에서 3초 및 60℃에서 30초를 처리하는 공정을 40주기 진행하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, 미세먼지에 의해 자극된 피부 세포에서 상기 표 3의 네 가지의 유전자가 모두 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (13)

  1. AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 상기 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인, 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 조성물을 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단용 키트.
  4. 피험자의 피부세포 시료로부터,
    1) AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    2) 상기 발현 정도를, 미세먼지에 의해 손상되지 않은 피부세포 시료 내에서의 상기 유전자의 mRNA 또는 이로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 방법은,
    피험자의 피부세포 시료로부터 측정된, AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도가 상기 미세먼지에 의해 손상되지 않은 피부세포 시료 내에서보다 높은 경우, 미세먼지에 의해 피부 세포가 손상된 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), 노던블로팅(northern blotting), 웨스턴블로팅(western blotting) 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 미세먼지에 의한 피부 손상 여부 진단 방법.
  7. 피부세포에 미세먼지를 처리하는 단계;
    상기 미세먼지를 처리한 피부세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 시험 물질을 처리한 피부세포에서, 시험 물질 처리 전후의 AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 방법은,
    상기 시험 물질 처리 전에 비하여 시험 물질 처리 후에,
    AKR1C2(NM_205845) 유전자, NAV3(NM_014903) 유전자, SLCO4A1(NM_016354) 및 TNFAIP3(NM_006290) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도가 감소하는 경우, 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질로 판단하는 단계를 더 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 피부세포는 각질형성세포인, 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 정도는 상기 유전자의 mRNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 상기 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나 이상을 사용하여 측정하는 것인, 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), 노던블로팅(northern blotting), 웨스턴블로팅(western blotting) 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 미세먼지는 평균 입경 10μm 이하의 미세먼지인, 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법.
  13. 제7항에 있어서,
    상기 미세먼지는 평균 입경 2.5μm 이하의 초미세먼지인, 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법.
KR1020190077017A 2019-06-27 2019-06-27 미세먼지에 의한 피부 손상 진단용 조성물 및 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법 KR20210002199A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190077017A KR20210002199A (ko) 2019-06-27 2019-06-27 미세먼지에 의한 피부 손상 진단용 조성물 및 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190077017A KR20210002199A (ko) 2019-06-27 2019-06-27 미세먼지에 의한 피부 손상 진단용 조성물 및 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210002199A true KR20210002199A (ko) 2021-01-07

Family

ID=74126698

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190077017A KR20210002199A (ko) 2019-06-27 2019-06-27 미세먼지에 의한 피부 손상 진단용 조성물 및 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20210002199A (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160119703A (ko) 2015-04-06 2016-10-14 (주)아모레퍼시픽 미세먼지에 의한 피부 손상 진단용 조성물 및 갈랑긴을 유효성분으로 포함하는 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160119703A (ko) 2015-04-06 2016-10-14 (주)아모레퍼시픽 미세먼지에 의한 피부 손상 진단용 조성물 및 갈랑긴을 유효성분으로 포함하는 조성물

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Olivry et al. Early activation of Th2/Th22 inflammatory and pruritogenic pathways in acute canine atopic dermatitis skin lesions
Shibata et al. Mutant IDH1 confers an in vivo growth in a melanoma cell line with BRAF mutation
Kim et al. TNF-α downregulates filaggrin and loricrin through c-Jun N-terminal kinase: role for TNF-α antagonists to improve skin barrier
Wang et al. Validation of putative genomic biomarkers of nephrotoxicity in rats
Matoso et al. Expression microarray analysis identifies novel epithelial-derived protein markers in eosinophilic esophagitis
Kim et al. Transcriptome analysis of airborne PM2. 5-induced detrimental effects on human keratinocytes
US20140302042A1 (en) Methods of predicting prognosis in cancer
WO2014059178A1 (en) Differential expression of novel protein markers for the diagnosis and treatment of eosinophilic esophagitis
EP2715366A1 (en) Biomarkers for hedgehog inhibitor therapy
Huang et al. Overexpression of aldo‐keto reductase 1C2 is associated with disease progression in patients with prostatic cancer
Degoricija et al. The dynamics of the inflammatory response during BBN-induced bladder carcinogenesis in mice
Du et al. Loss of DMBT1 expression in human prostate cancer and its correlation with clinical progressive features
CN109415767B (zh) 用于确认是否暴露于细微灰尘中的生物标记物及利用其的确认方法
Mantovani et al. Different expression of protein kinase A (PKA) regulatory subunits in cortisol-secreting adrenocortical tumors: relationship with cell proliferation
Yang et al. Changes in gene expression in lungs of mice exposed to traffic-related air pollution
Kim et al. Aldo-keto reductase activity after diethylhexyl phthalate exposure in eutopic and ectopic endometrial cells
Shen et al. NUDT1: A potential independent predictor for the prognosis of patients with oral squamous cell carcinoma
KR20210002199A (ko) 미세먼지에 의한 피부 손상 진단용 조성물 및 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법
US10203330B2 (en) Methods and materials for identifying and treating mammals having lung adenocarcinoma characterized by neuroendocrine differentiation
Jeong et al. Proteomic analysis of peripheral T-lymphocytes in patients with asthma
KR20210002200A (ko) 미세먼지에 의한 피부 손상 진단용 조성물 및 미세먼지에 의한 피부 손상 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법
EP1611252B1 (en) In vitro method to detect bladder transitional cell carcinoma
WO2016097031A1 (en) Gsk3b and uses thereof in the diagnostic and treatment of hypopigmentation disorders
Diggle et al. Identification of genes up-regulated in urothelial tumors: the 67-kd laminin receptor and tumor-associated trypsin inhibitor
WO2015082880A1 (en) Methods of selecting treatment regimens