KR20200140071A

KR20200140071A - 지골피·우슬 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 표준화를 위한 분석 방법

Info

Publication number: KR20200140071A
Application number: KR1020190066810A
Authority: KR
Inventors: 정선용; 박은국; 박슬비; 조미란
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-06-05
Filing date: 2019-06-05
Publication date: 2020-12-15
Also published as: KR102320679B1

Abstract

본 발명은 지골피·우슬 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 7:3 내지 9:1의 중량비로 혼합한 주정 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 건강기능식품 조성물 및 이의 원료 표준화 분석 방법을 제공한다.
이에 따라, 최적의 비로 혼합된 지골피·우슬 복합추출물을 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물로 이용함으로써 효과적으로 골다공증을 예방, 개선 또는 치료할 수 있고, 상기 분석 방법으로 지골피 추출물 및 우슬 추출물의 유효성분 및 함량을 표준화할 수 있다.

Description

지골피·우슬 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 표준화를 위한 분석 방법{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OSTEOPOROSIS COMPRISING COMPLEX EXTRACT OF LYCII RADICIS CORTEX AND ACHYRANTHES JAPONICA NAKAI, AND ANALYSIS METHOD FOR STANDARDIZATION THEREOF}

본 발명은 지골피·우슬 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 원료 표준화를 위한 분석 방법에 관한 것이다.

골 조직은 골세포와 골세포 주위의 딱딱한 칼슘조직으로 둘러싸인 밀집된 결합조직으로, 지지와 근 부착의 기계적 기능을 하며, 이러한 골 조직에 의해서 뼈가 이루어져 인체의 골격을 형성한다. 또한, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능과 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 이러한 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포 기질과 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast) 및 골세포(osteocyte) 등 여러 종류의 세포들로 구성된다. 골수 내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래한 조골세포는 골 형성에 주된 역할을 담당하며, 조혈모세포로부터 유래되는 파골세포는 파괴되어 노화된 골 흡수를 담당하는데, 이러한 조골세포와 파골세포에 의한 골 형성과 골 흡수의 균형 있는 작용을 통하여 골의 재형성(remodeling)을 유지하게 된다.

골 재형성 유지에 주요 역할을 담당하는 조골세포와 파골세포 간의 평형에 이상이 생겼을 때 골 대사성 질환이 발생한다. 골 대사성 질환의 대표적인 예로써 골다공증이 있는데, 골다공증(osteoporosis)은 조골세포에 의한 골 형성에 비하여 파골세포의 골 흡수 활성이 증가함으로써 결과적으로 총 골량(total bone mass)이 감소하게 되어 경미한 충격에도 골절이 유발되는 질환을 말한다. 현재까지 골다공증 완치를 위한 효과적인 치료법은 없으며 예방이 강조되고 있는 실정이다.

골 형성을 담당하는 조골 세포는 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell)에서 기원 되어 형성되는데 조골 세포 분화에 의해 형성되는 칼슘 등을 포함한 무기질화는 뼈의 세기를 유지시켜줄 수 있을 뿐만 아니라, 신체 전체의 칼슘 및 호르몬 대사의 항상성에도 매우 중요한 기능을 하고 있다. 이러한 조골 세포의 분화에 의한 칼슘 형성은 비타민 D 및 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone) 등에 의해 조절되며, 세포 내에서 뼈 형태 형성 단백질(bone morphogenetic protein; BMP), Wnt, MAP 키나아제, 칼시뉴린-칼모듈린 키나아제(calcineurin-calmodulin kinase), NF-κB, AP-1 등의 다양한 신호 전달 체계의 상호 작용(cross-talk)에 의해 조골 세포의 분화에 관련된 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP)가 초기 분화 단계에서 합성된 후, 무기질화(mineralization)에 관련된 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin, BGLAP 유전자), 타입 I 콜라겐(type 1 collagen) 등이 합성됨으로써 조골 세포의 분화에 의한 골 형성이 이루어진다고 알려져 있다.

최근 생체 외 배양조건에서 조골세포를 생산하고 이를 이용하여 골조직의 기능을 강화하여 예방하거나 골 손상을 치료하고자 하는 노력이 급증하고 있고, 이에 따라 다양한 천연물이 연구되고 있다. 하지만, 천연물의 생리 활성 물질은 동일한 기원종이라도 생육환경, 가공법, 저장조건 등의 다양한 요인에 의해 유효성분 및 함량에 차이가 생길 수 있고, 그에 따른 효능의 차이가 생길 수 있다. 이에 따라, 균일한 유효성분 및 함량으로 일정하게 효능을 발휘할 수 있도록 표준화 또는 규격화하는 방법이 필요하다.

한국공개특허 제10-2016-0098982호 (2016년08월19일 공개)

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 함유하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 지골피·우슬 복합추출물의 원료 표준화 분석 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물은 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 7:3 내지 9:1의 중량비로 혼합한 주정 복합추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 7:3 내지 9:1의 중량비로 혼합한 주정 복합추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 지골피·우슬 복합추출물의 원료 표준화 분석 방법은 표준물질로서 쿠코아민 B(kukoamine B)와 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)을 용매에 각각 용해시키고 희석하여 검량선을 작성하는 단계; 지골피 추출물 분말과 우슬 추출물 분말을 용매에 용해하여 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 7:3 내지 9:1의 중량비로 혼합한 주정 복합추출물을 준비하는 단계; HPLC 및 LC-MS/MS를 수행하여 상기 주정 복합추출물 중 쿠코아민 B와 20-하이드록시엑디손의 함량을 분석하여 검량선을 작성하는 단계; 및 상기 표준물질의 검량선과 상기 주정 복합추출물 중 쿠코아민 B와 20-하이드록시엑디손의 함량에 대한 검량선을 비교하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 복합추출물은 골다공증 치료에 우수한 효능을 나타낼 수 있는 지골피 추출물 및 우슬 추출물의 최적의 비로 혼합되어, 이를 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 이용함으로써, 효과적으로 골다공증을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

본 발명에 따른 분석 방법은 지골피 추출물 및 우슬 추출물의 유효성분 및 함량을 표준화할 수 있고, 품질관리에 활용할 수 있다. 이에 따라 상기 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물은 균일한 효능을 나타낼 수 있다.

도 1a는 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피 추출물 또는 우슬 추출물 단독 처리한 경우의 알칼라인 포스파타제(ALP) 활성을 나타낸 그래프이다.
도 1b는 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 혼합 처리한 경우의 알칼라인 포스파타제(ALP) 활성을 나타낸 그래프이다.
도 1c는 본 발명의 일 실험예에 따른 추출물의 세포 독성을 분석한 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피 추출물 또는 우슬 추출물을 단독 처리한 경우의 Bglap 유전자 mRNA의 발현양을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 혼합 처리한 경우의 Bglap 유전자 mRNA의 발현양을 나타낸 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 혼합 처리한 경우의 골대사 관련 유전자 마커의 발현양을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 알칼라인 포스파타제(ALP) 염색 실험 및 무기질화 분석 실험의 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 지골피·우슬 복합추출물의 지표 및 유효성분인 쿠코아민 B(kukoamine B), 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)의 구조이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 지골피·우슬 복합추출물의 지표 및 유효성분인 쿠코아민 B(kukoamine B), 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)의 표준품과 비교한 검량곡선이다.
도 6은 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피·우슬 복합추출물의 지표 및 유효성분의 크로마토그램이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자는 지골피·우슬 복합추출물에서 골다공증 예방, 개선 또는 치료에 효능을 가지는 최적의 혼합비를 확인하였고, 이를 HPLC-LC-MSMS 방법으로 분석하여 함유량이 가장 높은 지골피의 쿠코아민 B(Kukoamine B) 및 우슬의 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)을 지표 및 유효성분으로 한 원료 표준화 방법을 확립함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서 "지골피(라틴명: Lycii Radicis Cortex, 학명: Lycium chinense Miller)"란, 가지과 식물인 구기자나무(Lycium chinense Mill)의 뿌리껍질을 말린 것으로, 쓴 맛을 가지고 찬 성질을 가지며, '구기근피', '구기근', '기근' 등으로 호환성 있게 사용될 수 있다. 지골피는 몸이 허약하여 생기는 식은땀, 해수, 천식, 토혈, 코피, 소변출혈, 고혈당, 고혈에 좋으며 신경통, 두통, 어깨통증, 근육통, 요통 등의 경우에 사용하는 것으로 알려져 있고, 심혈관 계통의 혈압강하작용, 혈당강하작용의 약리작용이 보고되었다.

본 명세서에서 "우슬(라틴명: Achyranthis Radix, 학명: Achyranthes japonica Nakai)"이란, 비름과에 속하는 여러해살이 초본식물인 쇠무릎의 뿌리로, 형상이 소의 무릎과 비슷하다고 하여 우슬이라고 하며, 무릎의 질환을 치료하는 데에 효과가 있다고 알려져 있다. 또 허리와 다리가 무겁고 통증을 느끼며 때로 근육경련이 있을 때에 많이 활용된다.

본 명세서에서 "추출물"이란, 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고 천연물의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 의미하는 것으로, 천연물의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함할 수 있다.

본 명세서에서 "복합추출물"이란, 두 가지 이상의 천연물을 혼합하여 추출한 물질 또는 두 가지 이상의 천연물의 추출물을 혼합하여 얻어진 물질을 모두 포함할 수 있고, '혼합추출물'과 호환성 있게 사용될 수 있다.

본 명세서에서 "예방"이란, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물의 투여에 의해 골다공증 질환 또는 상기 질환의 적어도 하나 이상의 증상의 발생을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 재발을 예방하거나 방지하기 위해 상기 질병에 차도가 있는 대상의 치료를 포함한다.

본 명세서에서 "치료"란, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 골다공증 질환 또는 상기 질환의 적어도 하나 이상의 증상을 완화, 감소, 또는 소멸시키는 등 그 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 "개선"이란, 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물의 섭취에 의해 골다공증 질환 또는 상기 질환의 적어도 하나 이상의 증상이 완화, 감소, 또는 소멸시키는 등 그 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 "약학 조성물"이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물로, 본 발명의 목적상 골다공증 질환 또는 상기 질환의 적어도 하나 이상의 증상을 예방하거나 또는 치료하기 위해 투여되는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "건강기능식품"이란, 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품으로, 영양 공급 외에도 생체 조절 기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품을 의미하며 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용할 수 있다.

본 발명은 지골피·우슬 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 지골피·우슬 복합추출물은 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 7:3 내지 9:1, 바람직하게는 8:2의 중량비로 혼합한 주정 복합추출물을 포함할 수 있고, 상기 주정 복합추출물은 60 내지 80 중량%, 바람직하게는 70 중량%의 에탄올 수용액으로 추출한 것일 수 있다.

상기 조성물은 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있고, 골세포의 무기질화를 촉진시킬 수 있어, 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 8:2 중량비로 혼합하여 조골모세포 등에 처리한 경우, 조골세포의 분화에 관련된 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP) 활성화가 가장 높게 나타났고, 골대사 관련 유전자 마커 3종(Alp, Runx2, Bglap)의 발현양이 모두 유의적으로 증가하였으며, ALP 염색 세포수 및 결절 형성(무기질화)에 의한 염색 세포수가 더욱 증가하는 것으로 나타났다. 보다 상세한 것은 하기 실험예에 의해 후술될 것이다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한"이란, 상기 약학 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 의미하고, 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 추출물의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D₃ 등을 더 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 골다공증이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 골다공증 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명은 지골피·우슬 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 지골피·우슬 복합추출물은 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 7:3 내지 9:1, 바람직하게는 8:2의 중량비로 혼합한 주정 복합추출물을 포함할 수 있고, 상기 주정 복합추출물은 60 내지 80 중량%, 바람직하게는 70 중량%의 에탄올 수용액으로 추출한 것일 수 있다.

상기 조성물은 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있고, 골세포의 무기질화를 촉진시킬 수 있어, 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 8:2 중량비로 혼합하여 조골모세포 등에 처리한 경우, 조골세포의 분화에 관련된 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP) 활성화가 가장 높게 나타났고, 골대사 관련 유전자 마커 3종(Alp, Runx2, Bglap)의 발현양이 모두 유의적으로 증가하였으며, ALP 염색 세포수 및 결절 형성(무기질화)에 의한 염색 세포수가 더욱 증가하는 것으로 나타났다. 보다 상세한 것은 하기 실험예에 의해 후술될 것이다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있고, 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 음료 및 각종 드링크, 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 잼 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 베이컨 등), 빵류 및 면류, 쿠키 및 스낵류, 유제품(버터, 치즈 등) 등이 가능하며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함할 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용 가능한 식품 첨가제 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 골다공증 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취될 수 있다.

본 발명에 따른 원료 표준화 분석 방법은 표준물질로서 쿠코아민 B(kukoamine B)와 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)을 용매에 각각 용해시키고 희석하여 검량선을 작성하는 단계; 지골피 추출물 분말과 우슬 추출물 분말을 용매에 용해하여 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 7:3 내지 9:1의 중량비로 혼합한 주정 복합추출물을 준비하는 단계; HPLC 및 LC-MS/MS를 수행하여 상기 주정 복합추출물 중 쿠코아민 B와 20-하이드록시엑디손의 함량을 분석하여 검량선을 작성하는 단계; 및 상기 표준물질의 검량선과 상기 주정 복합추출물 중 쿠코아민 B와 20-하이드록시엑디손의 함량에 대한 검량선을 비교하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 검량선 작성 단계에 있어서, 상기 표준물질인 상기 쿠코아민 B(kukoamine B)는 지골피의 지표 및 유효성분이고, 엑디스테로이드(ecdysteroid)의 일종인 상기 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)은 우슬의 지표 및 유효성분이나, 상기 표준물질이 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 지골피·우슬 복합추출물 준비 단계에 있어서, 상기 지골피·우슬 복합추출물은 상기 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 7:3 내지 9:1, 바람직하게는 8:2의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있다.

상기 지골피·우슬 복합추출물의 검량선 작성 단계에 있어서, 상기 주정 복합추출물 중 쿠코아민 B와 20-하이드록시엑디손의 함량은 HPLC 및 LC-MS/MS를 수행하여 얻어진 크로마토그램을 분석함으로써 도출할 수 있다.

본 발명에 따른 분석 방법은 특이성, 직선성, 범위, 정확성, 정밀성 및 시스템 적합도로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항목을 포함하는 검증(validation) 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 검증 단계를 통해 상기 분석 방법을 평가 및 검토할 수 있다.

상기 검증 단계에 있어서, 상기 특이성(specificity)은 상기 지표성분만을 명확하게 식별해낼 수 있는 방법임을 검증하기 위한 것으로, 본 발명의 일 실험예에 따라 크로마토그램의 분리된 피크를 통해 상기 지표성분인 쿠코아민 B와 20-하이드록시엑디손을 확인할 수 있다.

상기 직선성(inearity) 및 범위(range)는 주어진 범위에서 시료 중의 지표성분 농도(양)에 직접 비례하는 분석 결과를 얻을 수 있는 능력으로, 본 발명의 일 실험예에 따라 검량선을 통해 시각적으로 평가할 수 있고, 검량선으로부터 직선식의 상관계수(correlation coefficient, R²)를 구하여 범위의 타당성을 입증할 수 있다.

상기 정확성(accuracy)은 규정된 범위를 포함하여 최소 3 농도에 대해 각 농도당 3회 이상 반복 측정한 결과로부터 평가하며, 회수율(%)로 검토할 수 있다.

상기 정밀성(precision)은 규정된 범위를 포함한 3 농도에 대해 각 농도당 3회 이상 반복 층정한 결과로부터 평가하며, 상대표준편차(변동계수)로 검토할 수 있다.

상기 시스템 적합도(system suitability)는 대칭계수(tailing factor), 용량인자(capacity factor), 이론단(theoretical plates), 분해도(resolution) 등의 파라미터로 평가할 수 있다.

본 발명에 따른 분석 방법에 따르면, 상기 지골피·우슬 복합추출물은 상기 주정 복합추출물 전체 100 중량부에 대하여, 상기 쿠코아민 B의 함량은 5.2 내지 7.8 중량부이고, 상기 20-하이드록시엑디손의 함량은 0.184 내지 0.276 중량부일 수 있다. 상기 범위로 지골피·우슬 복합추출물의 유효성분을 표준화할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 지골피 추출물 및 우슬 추출물 제조

지골피와 우슬을 70% 에탄올 수용액에서 5 시간 진탕한 후에, 약 20 시간 방치한 다음 여과지로 여과하였다. 여과액을 동결 건조의 방법으로 각각의 추출물 분말을 제조하였다. 지골피 및 우슬의 혼합 추출물은 지골피 추출 분말과 우슬 추출 분말을 8:2의 중량 비율로 혼합하여 제조하였다.

<실험예 1> 세포의 배양

마우스 중간엽줄기세포인 C3H10T1/2 세포와 조골모세포인 MC3T3-E1 세포를 10% 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 1mM의 피루브산 나트륨(Sodium Pyruvate), 100unit/L 페니실린(Penicillin) 및 100㎎/L 스트렙토마이신(Streptomycin)이 첨가된 기초배양이글배지(Basal Medium Eagle, BME)와 α-최소필수배지(α-minimun essential medium, α-MEM)에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. MC3T3-E1 세포의 경우에는 조골세포 분화 유도제인 아스코르브산(ascorbic acid, 50ug/ml)과 β-글리세롤포스페이트(β-Glycerophosphate, 10mM)를 첨가하여 3일 동안 분화 유도를 시킨 후, 지골피와 우슬 추출물 단독 또는 혼합 추출물을 첨가하여 48시간 동안 추가 배양하였다. 추출물을 처리하지 않은 상태에서 배양한 세포는 대조군으로 사용하였다.

<실험예 2> 알칼라인 포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP) 활성 분석

상기 실시예 1에 따라 제조된 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 단독 또는 혼합 처리한 실험군과 대조군(무처리)을 48시간 동안 배양 후, 알칼라인 포스파타제(Alkaline phosphatase; 이하, ALP) 분석 키트(ALP Assay Kit)를 이용하여 ALP 효소 활성을 측정하였다. 생리식염수로 세포를 세척한 후, 세포 용해제를 이용하여 용해된 세포에 ALP의 기질인 p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenylphosphate)를 처리하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 반응 중지 용액인 0.5N NaOH를 첨가한 후 405nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

도 1a는 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피 추출물 또는 우슬 추출물을 단독 처리한 경우의 알칼라인 포스파타제(ALP) 활성을 나타낸 그래프이다.

도 1a를 참조하면, 왼쪽 그래프는 지골피 추출물(LRC)을 단독 처리한 경우의 ALP 활성, 오른쪽 그래프는 우슬 추출물(AJ)을 단독 처리한 경우의 ALP 활성을 나타낸 것으로, 지골피 추출물 또는 우슬 추출물을 2, 10 및 50μg/ml 농도로 조골모세포인 MC3T3-E1 세포에 처리한 경우, 상기 두 추출물 모두 10μg/ml 농도에서 가장 좋은 ALP 활성이 나타났다.(* : P < 0.05 VS. Control)

도 1b는 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 혼합 처리한 경우의 알칼라인 포스파타제(ALP) 활성을 나타낸 그래프이다.

도 1b를 참조하면, 지골피 추출물(LRC, 10μg/ml), 우슬 추출물(AJ, 10μg/ml) 및 상기 두 추출물을 9:1, 8:2 및 7:3(LRC : AJ)의 비율로 혼합하여 세포에 처리한 경우, 지골피 추출물 및 우슬 추출물의 8:2 혼합물에서 가장 좋은 ALP 활성이 나타났다.(* : P < 0.05 VS. Control)

<실험예 3> 세포 증식 분석(cell proliferation assay)

세포 증식 분석은 수용성 테트라졸륨 염(Water Soluble Tetrazolium Salts; 이하, WSTs)을 이용한 세포 생존 분석 키트(EZ-Cytox Enhanced Cell Viability Assay Kit 제품)를 사용하여 측정하였다.

구체적으로, 세포(3×10³ cells/well)를 96웰 플레이트에 접종하여 5% CO₂가 공급되는 37℃ 조건으로 성장 배지에서 24시간 배양 후, 지골피 추출물과 우슬 추출물 단독 또는 혼합하여 세포에 처리하고, 48시간 동안 추가 배양하였다. WSTs를 배양 세포 및 샘플에 처리하고 37℃에서 2시간 배양하였다. 흡광도는 450nm에서 참고 파장으로 655nm를 사용하여 측정되었다.

도 1c는 본 발명의 일 실험예에 따른 추출물의 세포 독성을 분석한 그래프이다.

도 1c를 참조하면, 조골모세포인 MC3T3-E1 세포에 지골피 추출물, 우슬 추출물 단독 및 상기 추출물들을 혼합하여 처리한 후 세포 독성을 분석한 결과, 상기 추출물의 처리가 세포 증식에는 영향을 끼치지 않는 것으로 나타났다.

<실험예 4> 조골세포 분화 유전자 마커 발현양 분석

골세포 분화시 발현양의 변화를 보이는 골대사 관련 유전자 마커 중 Alp(Alkaline phosphatase), Runx2(Runt-related transcription factor 2), Bglap(bone gamma-carboxyglutamate protein), (Osteocalcin, Ocn)의 3종에 대해 유전자 발현양을 실시간 PCR(real-time PCR) 방법으로 확인하였다.

대조군 세포(무처리)와 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 혼합하여 처리한 실험군 세포를 수획한 후, 트리졸(Trizol)을 이용하여 전체 RNA를 분리하였고, 유전체 DNA(genomic DNA)를 제거하기 위해 DNA 분해효소 I(DNase I)을 상온에서 15분간 반응 및 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 처리하여 DNA 분해효소 I을 불활성화하였다. 그 후, 올리고 디티(oligo dT) 프라이머를 시발체로 하여 역전사 반응을 유도하여 cDNA를 합성한 후, 각 유전자의 서열 특이적 프라이머와 사이버 그린(SYBR Green)을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 발현양에 대한 분석은 Gapdh(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 대조군으로 한 대상 유전자의 상대 정량법을 사용하였다. 이 방법에 사용한 유전자 특이적 프라이머 서열 정보는 하기 표 1과 같다.

하기 표 1은 골세포 분화 정도를 확인하기 위해 사용한 유전자 마커의 발현양 확인을 위한 프라이머 서열 정보이다.

종류	유전자	서열이름	서열정보(5'→3')
대조군 유전자 마커	Gapdh	Gapdh-F	TGA CCA CAG TCC ATG CCA TC
대조군 유전자 마커	Gapdh	Gapdh-R	GAC GGA CAC ATT GGG GGT AG
조골세포 분화도 측정 유전자 마커	Bglap (Osteocalcin)	Bglap-F	TAG TGA ACA GAC TCC GGC GCT A
	Bglap (Osteocalcin)	Bglap-R	TGT AGG CGG TCT TCA AGC CAT
	Alp	Alp-F	TCC CAC GTT TTC ACA TTC GG
	Alp	Alp-R	CCC GTT ACC ATA TAG GAT GGC C
	Runx2	Runx2-F	TAA AGT GAC AGT GGA CGG TCC C
	Runx2	Runx2-R	TGC GCC CTA AAT CAC TGA GG

도 2a는 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피 추출물 또는 우슬 추출물을 단독 처리한 경우의 Bglap 유전자 mRNA의 발현양을 나타낸 그래프이다.

도 2a를 참조하면, MC3T3-E1 조골모세포에 지골피 추출물(LRC) 10, 20μg/ml, 우슬 추출물(AJ) 10, 20μg/ml를 처리하였을 때, 처리하지 않은 대조군에 비하여 Bglap 유전자 mRNA의 발현양이 유의하게 증가하는 것으로 나타났고, 지골피 추출물의 경우 농도가 10μg/ml일 때, 우슬 추출물의 경우 농도가 20μg/ml일 때 발현양이 높게 나타났다.(* : P < 0.05 VS. Control)

도 2b는 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 혼합 처리한 경우의 Bglap 유전자 mRNA의 발현양을 나타낸 그래프이다.

도 2b를 참조하면, 지골피 추출물 및 우슬 추출물 10, 20μg/ml 농도 각각 9:1, 8:2 및 7:3의 비율로 혼합하여 MC3T3-E1 조골모세포에 처리한 경우, 20μg/ml의 농도의 각 추출물을 8:2의 비율로 혼합했을 때 가장 좋은 Bglap 유전자의 발현양을 나타내었고, 지골피 추출물 또는 우슬 추출물의 단독 처리에 비해 약 50%의 Bglap 유전자 발현양 증가가 나타났다.(* : P < 0.05 VS. Control)

도 2c는 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 혼합 처리한 경우의 골대사 관련 유전자 마커의 발현양을 나타낸 그래프이다.

도 2c를 참조하면, 20μg/ml 농도의 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 8:2 비율로 혼합한 추출물을 C3H10T1/2 중간엽줄기세포와 MC3T3-E1 조골모세포에 처리하여 골대사 관련 유전자 마커 3종(Alp, Runx2, Bglap)의 발현양을 비교한 결과, C3H10T1/2 세포와 MC3T3-E1세포에서 3종의 유전자 마커의 발현양이 모두 통계적으로 유의하게 증가하였고, 보다 상세하게는 대조군에 비해 약 80~170%로 발현양이 증가되는 것으로 나타났다.(* : P < 0.05 VS. Control)

<실험예 5> 조골세포의 ALP 염색 및 무기질화 분석

ALP 염색 실험은 마우스 조골모세포인 MC3T3-E1 세포를 48-웰 플레이트에서 각 20μg/ml 농도의 지골피 추출물, 우슬 추출물 및 상기 추출물을 8:2로 혼합한 추출물로 처리하여 48시간 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 인산 완충용액(PBS buffer)로 세포를 세척한 후, ALP 시약 키트로 세포를 염색하여 현미경으로 ALP 염색된 세포수를 관찰하였다.

무기질화 분석 실험은 마우스 조골모세포인 MC3T3-E1 세포를 48-웰 플레이트에서 지골피 추출물, 우슬 추출물 및 상기 추출물을 8:2로 혼합한 추출물(각 20μg/ml 농도)로 처리하여 21일간 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 세포배양 배지는 3일 마다 교환하였다. 인산 완충용액으로 세포를 세척한 후, 70% 에탄올로 세포를 고정하고 40 mM의 알리자린 레드 에스(Alizarin red S)를 처리하여 염색된 세포수 및 정도를 현미경으로 관찰하였다.

도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 ALP 염색 실험 및 무기질화 분석 실험의 결과이다.

도 3을 참조하면, ALP 염색 실험의 경우, 지골피 추출물 또는 우슬 추출물의 단독 처리에 비해, 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 8:2로 혼합한 추출물의 처리 시에 ALP 염색 세포수가 더 증가되는 것으로 나타났다.

또한, 무기질화 분석 실험의 경우, 지골피 추출물 또는 우슬 추출물의 단독 처리에 비해, 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 8:2로 혼합한 추출물의 처리 시에 결절(nodule) 형성(무기질화)에 의한 알리자린 레스 에스 염색 세포수가 더 증가되는 것으로 나타났다.

<실험예 6> HPLC-UV 분석법을 이용한 지골피·우슬 복합추출물의 지표 및 유효성분의 함량 분석

1. 재료

쿠코아민 B(kukoamine B) 표준품, 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone) 표준품, 지골피 추출물(분말) 및 우슬 추출물(분말)을 준비하였다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 지골피·우슬 복합추출물의 지표 및 유효성분인 쿠코아민 B(kukoamine B), 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)의 구조이다.

2. 전처리

쿠코아민 B(kukoamine B) 표준품은 80μg/mL, 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone) 표준품은 4μg/mL이 되도록 0.2% 포름산을 함유한 25% 메탄올[이하, 25% MeOH(0.2% Formic acid)]을 이용해 용해한 후, 각 표준품을 동일량을 취해 40μg/mL, 2μg/mL가 되도록 하였다. 이를 25% MeOH(0.2% Formic acid)을 이용해 희석하여 쿠코아민 B(kukoamine B)는 20, 16, 10, 5, 2, 1μg/mL, 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)은 1, 0.8, 0.5, 0.25, 0.1, 0.05μg/mL가 되도록 만들었다.

지골피 추출물 분말과 우슬 추출물 분말을 곱게 갈아 균질화 시킨 후 각각의 분말을 칭량하고, 25% MeOH(0.2% Formic acid) 용매로 용해하여 지골피 추출물은 최종 농도 160μg/mL, 우슬 추출물은 최종 농도 40μg/mL가 되도록 하였다. 지골피 추출물 분말 및 우슬 추출물 분말을 섞어 준 후, 2g을 칭량하여 25% MeOH(0.2% Formic acid) 5mL에 충분히 용해시키고, 여과하였다. 이를 25% MeOH(0.2% Formic acid)의 용매로 희석하여 최종농도 200μg/mL가 되도록 하였다.

3. 분석조건

3-1. 초고성능 액체 크로마토그래피(Ultra Performance Liquid Chromatography. UPLC, Acquity UPLC, Waters)

컬럼(Column) : Kinetex® EVOC18(150×2.1mm, 2.6μm)

컬럼 오븐(Column oven): 35℃

주입 용량(Injection volume): 1μL

유속(Flow rate): 0.6mL/min

파장(Wavelength): 254nm

이동상(Mobile phase) A: 0.2% Formic Acid in DW, B: 0.2% Formic Acid in Acetonitrile

하기 표 2는 상기 분석에 사용된 구배를 나타낸다.

	A	B
0	95	5
3	95	5
19	80	20
19.1	5	95
23	5	95
23.1	95	5
25	95	5

3-2. 사중극자 질량 분석(Quadrupole mass, SQ detector, Waters)

이온 소스(Ion source): ES-

데이터 형태(Data type): SIR

모세관 전압(Capillary voltage): 3.5V

소스 온도(Source temperature): 150°C

탈용매 온도(Desolvation temperature): 350°C

탈용매 가스 유량(Desolvation Gas Flow): 550L/hr

4. 분석방법

먼저, 각 시료들을 HPLC와 LC-MSMS(Liquid chromatography tandem-mass spectrometry, SIR mode) 장비에 1μL 주입하여 표준물질과 검량곡선을 비교하고, 지골피·우슬 복합추출물을 HPLC와 LC-MSMS에 주입하여 분석한 지표 및 유효성분에 대한 크로마토그램의 피크 높이를 확인하여 정량하였다.

도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피·우슬 복합추출물의 지표 및 유효성분인 쿠코아민 B(kukoamine B), 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)의 표준품과 비교한 검량곡선이고, 도 6은 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피·우슬 복합추출물의 지표 및 유효성분의 크로마토그램이다.

표 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 지골피·우슬 복합추출물의 분석 방법에 대한 검증(validation) 항목으로, 함량분석방법의 특이성(specificity), 직선성(inearity), 범위(range), 정확성(accuracy), 정밀성(precision) 및 시스템 적합도(system suitability)의 평가 기준을 정하였다.

밸리데이션 항목	판정기준	kukoamine B 밸리데이션 결과	20-hydroxyecdysone 밸리데이션 결과
특이성	1) 희석액, 이동상에서 지표성분 피크 불검출 2) 검액과 표준액은 동일한 시간에 성분 피크 검출 3) 검액과 표준액의 분자량을 비교했을 때 일치	1) 피크불검출 2) 동일한 시간에 피크 검출 3) 분자량 일치	1) 피크불검출 2) 동일한 시간에 피크 검출 3) 분자량 일치
직선성 & 범위	1) 범위 2) R² ≥0.99 3) 시각적으로 볼록한 부분 없음	3.75 ~ 90㎍/㎖ 0.9993 ~ 0.9998 없음/없음	0.0625 ~ 1.5㎍/㎖ 0.9998 ~ 0.9999 없음/없음
정확성	1) 저농도에서 함량의 회수율 : 100 ± 7% 2) 중간농도에서 함량의 회수율 : 100 ± 7% 3) 고농도에서 함량의 회수율 : 100 ± 7%	99.50 ~ 105.1% 100.3 ~ 100.5% 102.5 ~ 106.3%	100.7 ~ 102.0% 101.3 ~ 103.8% 102.0 ~ 103.4%
정밀성	1) 반복 정밀성 저농도에서 면적값의 % RSD ≤ 3.0% 중간농도에서 면적값의 % RSD ≤ 3.0% 고농도에서 면적값의 % RSD ≤ 3.0%	2.82 1.79 1.64	1.66 0.69 0.54
	2) 일간 반복성 중간농도에서 함량의 % 최대 RSD ≤ 3.0%	2.59	1.85
	3) 실내 정밀성 시험자 A 농도의 % RSD ≤ 5.0% 시험자 B 농도의 % RSD ≤ 5.0%	2.59 2.47	0.63 0.86
시스템 적합성	1) RT % RSD ≤ 2.0%	1.31	0.73

5. HPLC-UV 분석법을 이용한 지골피·우슬 복합추출물의 지표 및 유효성분의 함량 결정

표 4는 본 발명의 일 실험예에 따라 원료 표준화된 지골피·우슬 복합추출물의 지표 및 유효성분의 함량을 나타낸 것이다.

시료명	kukoamine B		20-hydroxyecdysone
시료명	함량	RSD (%)	함량	RSD (%)
지골피·우슬 혼합 분말	5.2~7.8%	0.807	0.184~0.276%	2.248

상기 표 4를 참조하면, HPLC-UV 분석법을 이용하여 결정된 지골피·우슬 복합(8:2) 추출물의 쿠코아민 B(kukoamine B)의 함량은 5.2~7.8% 범위 내이고, 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)의 함량은 0.184~0.276% 범위 내로 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

지골피 추출물 및 우슬 추출물을 7:3 내지 9:1의 중량비로 혼합한 주정 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 주정 복합추출물은,
60 내지 80 중량%의 에탄올 수용액으로 추출한 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은,
조골세포의 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은,
골세포의 무기질화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
지골피 추출물 및 우슬 추출물을 7:3 내지 9:1의 중량비로 혼합한 주정 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
표준물질로서 쿠코아민 B(kukoamine B)와 20-하이드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)을 용매에 각각 용해시키고 희석하여 검량선을 작성하는 단계;
지골피 추출물 분말과 우슬 추출물 분말을 용매에 용해하여 지골피 추출물 및 우슬 추출물을 7:3 내지 9:1의 중량비로 혼합한 주정 복합추출물을 준비하는 단계;
HPLC 및 LC-MS/MS를 수행하여 상기 주정 복합추출물 중 쿠코아민 B와 20-하이드록시엑디손의 함량을 분석하여 검량선을 작성하는 단계; 및
상기 표준물질의 검량선과 상기 주정 복합추출물 중 쿠코아민 B와 20-하이드록시엑디손의 함량에 대한 검량선을 비교하는 단계;를 포함하는 지골피·우슬 복합추출물의 원료 표준화 분석 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 주정 복합추출물 전체 100 중량부에 대하여,
상기 쿠코아민 B의 함량은 5.2 내지 7.8 중량부이고,
상기 20-하이드록시엑디손의 함량은 0.184 내지 0.276 중량부인 것을 특징으로 하는 지골피·우슬 복합추출물의 원료 표준화 분석 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 분석 방법은,
특이성, 직선성, 범위, 정확성, 정밀성 및 시스템 적합도로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항목을 포함하는 검증(validation) 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 지골피·우슬 복합추출물의 원료 표준화 분석 방법.