KR20200139679A

KR20200139679A - 면역관용성 리포솜 및 그의 사용 방법

Info

Publication number: KR20200139679A
Application number: KR1020207027609A
Authority: KR
Inventors: 아디티 자베리; 빈센트 피. 주니어 스탠턴
Original assignee: 안톨알엑스, 인크.
Priority date: 2018-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2020-12-14
Also published as: AU2019225251A1; IL276957B2; EP3758682A4; IL276957A; US20200405642A1; IL276957B1; EP3758682A1; CN112384204A; JP2021515037A; WO2019165436A1; CA3092372A1; CN112384204B

Abstract

본 발명은 병리학적 면역 반응과 연관된 질환 및 병태를 치료하기 위한 조성물 (예를 들어, 리포솜), 및 이러한 조성물의 제형화 및 투여 방법을 제공한다.

Description

면역관용성 리포솜 및 그의 사용 방법

본 발명의 분야

본 발명은 병리학적 면역 반응과 연관된 질환 및 병태를 치료하기 위한 면역관용성 리포솜 (예를 들어, 나노-크기 리포솜), 및 이러한 조성물의 제형화 및 투여 방법을 특색으로 한다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출되고 이에 의해 전문이 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2019년 2월 26일에 생성된 ASCII 카피는 파일명이 51172-002WO3_Sequence_Listing_2.26.19_ST25이고, 크기는 20,219 바이트이다.

배경

인간 면역계는 선천적 아암 및 적응성 아암을 포함하고, 후자는 체액성 (항체-매개) 및 세포성 성분으로 이루어진다. 적응 면역 반응은 면역 반응의 적합한 표적인 질환-야기 미생물, 예컨대 기생충, 박테리아 및 바이러스와 연관된 항원과 면역계에 의해 표적화되지 않아야 하는 자신과 연관된 항원을 구별하여야 한다. 적응 면역계의 다양성-생성 메커니즘은 이러한 구분을 하지 않는다. 오히려, 관용화로 지칭되는 프로세스가 자가-반응성 면역 세포가 발달 초기에 제거되도록 야기한다. 관용이 발생하지 못하는 것, 또는 이후에 숙주 (자가) 항원에 대한 관용이 상실되는 것은 1개의 기관 또는 여러 기관 (예를 들어, 뇌, 말초 신경계, 간, 신장, 췌장, 위장관, 관절, 피부, 눈, 및 귀)에 영향을 미칠 수 있는 병태의 다양한 선집인 자가면역 질환과 연관된다.

자가면역 질환 환자에서 자가 항원에 대한 관용이 복원되는 것이 오랫 동안 추구되었지만, 아직까지는 달성하기 어려운 치료 목표이다. 다양한 제형 및 투여 경로의 질환과 연관된 자가-항원의 투여는 자가면역 질환의 동물 모델 (예를 들어, 마우스 및 래트에서의 실험적 자가면역 뇌척수염; 자가면역 당뇨병의 NOD 마우스 모델)에서 질환을 억제하는데 효과적이지만, 인간 환자에서 테스트되는 경우에는 실망스러웠다.

면역관용성 신호를 면역 세포에 전달하는 것, 또는 항원 및 면역관용성 신호의 공동-전달은 동물 데이터에 의해 지지되는 유망한 접근법이지만, 잠재적인 치료적 유용성에 관한 결론을 도출하기에는 아직 인간에서 충분히 테스트되지 않았다.

자가면역 질환에 대한 기존의 요법은 전체적으로 면역을 억제하거나 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아자티오프린 또는 레플루노미드와 같은 항증식제), 적응 면역계의 한쪽 아암을 표적화하거나 (예를 들어, B-세포 고갈 항체 리툭시맙), 또는 전체적으로 염증유발성 신호를 억제한다 (예를 들어, 인플릭시맙 및 아달리무맙과 같은 항-종양 괴사 인자 알파 항체). 따라서, 병원성 면역, 예컨대 자가면역 질환, 이식 거부, 및 이식편-대-숙주 질환의 경우에 하나 이상의 자가항원에 대한 관용을 선택적으로 복원시키기 위한 개선된 치료 전략이 관련 분야에서 요구된다.

펩티드 및 단백질 치료제 및 유전자 요법 (종종 바이러스 벡터를 사용하여 전달됨)을 포함하는 다양한 혁신적인 의학적 치료는 환자의 면역계를 종종 외래물로 인식되는 새로운 항원 (신생항원)에 노출시키는 것을 수반한다. 이러한 비-천연 치료 조성물이 환자에게 반복적으로 투여되는 것은 면역 인식 및 후속적인 치료 유효성 상실을 유발할 수 있고, 아나필락시스와 같은 위험한 부작용을 유도할 수 있다. 신생항원의 면역 인식을 방지하고/거나 이러한 면역원성 치료 조성물에 대한 면역학적 관용을 선택적으로 강화하기 위한 개선된 방법 및 조성물이 요구된다.

개요

본 발명은 치료 중인 질환에 따라 또는 효능을 강화하기 위해 이에 대한 면역 관용이 유도되어야 하는 치료 단백질 또는 바이러스 벡터에 따라 선택되는, 항원-제시 세포 (예를 들어, 면역계의 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포)에 의한 흡수용으로 제형화될 수 있거나, 또는 하나 이상의 항원(들)과 함께 공동-전달될 수 있는 친지성 아릴 탄화수소 수용체 효능제 (예를 들어, ITE)의 효율적인 전달에 의한, 면역계의 병리, 예컨대 자가면역의 치료를 위한, 치료 단백질 또는 유전자 요법 벡터와 연관된 신생항원의 면역 인식을 방지하거나 또는 역전시키기 위한, 그리고 그렇지 않으면 잠재적으로 면역원성인 치료 조성물에 대한 관용의 유도 또는 유지를 위한 면역관용성 리포솜 (예를 들어, 나노-크기 리포솜)을 특색으로 한다.

첫번째 측면에서, 본 발명은 리포솜 집단을 포함하는 조성물을 특색으로 한다. 리포솜 집단은 50 내지 250 나노미터 (nm; 예를 들어, 50 내지 250 nm, 50 내지 200 nm, 50 내지 150 nm, 75 내지 125 nm, 80 내지 120 nm, 90 내지 110 nm, 또는 95 내지 105 nm, 예를 들어, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 약 95 nm, 약 100 nm, 약 105 nm, 약 110 nm, 약 120 nm, 또는 약 125 nm)의 평균 직경을 가질 수 있다. 리포솜 집단은 추가로 0.3 이상 (예를 들어, 0.4 이상)의 평균 탈포화 지수 및 리포솜 당 평균 200-15,000개의 분자의 2-(1H-인돌-3-일카르보닐)-4-티아졸카르복실산 메틸 에스테르 (ITE), 또는 그의 염을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포솜 집단은 0℃ 내지 70℃의 평균 상 전이 온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜 집단은 포화 지질 종 및 불포화 지질 종 (예를 들어, 단일불포화 지질 종)을 포함하고, 여기서 불포화 지질 종이 불포화 결합을 갖고 지질 혼합물의 적어도 50% (예를 들어, 몰 백분율 기준으로 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70% 또는 적어도 75%)를 차지하는 것인 지질 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불포화 지질 종은 2개의 지질 꼬리를 갖고, 여기서 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리는 단일 불포화 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불포화 지질 종은 천연 공급원 예컨대 난 또는 대두로부터 유래되고, 지질들 (예를 들어, 지방산 쇄 길이가 상이함)의 혼합물을 포함할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 불포화 지질 종은 합성으로 생산되고, 단일한 규정된 인지질 화합물로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 리포솜 집단은 -60℃ 내지 80℃의 평균 상 전이 온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜 집단은 포화 지질 종 및 불포화 지질 종 (예를 들어, 단일불포화 지질 종)을 포함하고, 여기서 불포화 지질 종이 불포화 결합을 갖고 지질 혼합물의 적어도 20% (예를 들어, 질량 기준으로 또는 몰 백분율 기준으로 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 이를 초과하는 %)를 차지하는 것인 지질 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불포화 지질 종은 2개의 지질 꼬리를 갖고, 여기서 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리는 단일 불포화 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불포화 지질 종은 천연 공급원 예컨대 난 또는 대두로부터 유래되고, 지질들의 혼합물을 포함할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 불포화 지질 종은 합성으로 생산되고, 단일한 규정된 인지질 화합물로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 50 내지 250 nm (예를 들어, 75-125 nm, 또는 90-120 nm)의 평균 직경을 갖는 리포솜들의 집단을 포함하고, 여기서 리포솜 집단이 0℃ 내지 70℃의 평균 상 전이 온도; 및 리포솜 당 평균 150-15,000개 (예를 들어, 200-15,000개)의 분자의 ITE, 또는 그의 염을 갖는 조성물을 특색으로 한다. 일부 실시양태에서, 리포솜 집단은 0.3 이상 (예를 들어, 0.4 이상)의 평균 탈포화 지수를 갖는다. 한 실시양태에서, 리포솜 집단은 포화 지질 종 및 불포화 지질 종을 포함하고, 여기서 불포화 지질 종이 불포화 결합을 포함하고 지질 혼합물의 적어도 20% (예를 들어, 적어도 50%)를 차지하는 것인 지질 혼합물로부터 생산된다. 일부 실시양태에서, 불포화 지질 종은 2개의 지질 꼬리를 포함하고, 여기서 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리는 단일 불포화 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 인지질 종의 머리 기가 적어도 20개의 에틸렌 글리콜 단위의 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄의 공유결합 부착에 의해 변형된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 50 내지 250 nm (예를 들어, 75-125 nm, 또는 90-120 nm)의 평균 직경을 갖는 리포솜들의 집단을 포함하는 조성물을 특색으로 한다. 이러한 리포솜 집단은 포화 지질 종 및 불포화 지질 종을 갖고, 여기서 불포화 지질 종이 불포화 결합을 포함하고 지질 혼합물의 적어도 50%를 차지하는 것인 지질 혼합물을 포함할 수 있다. 이러한 리포솜 집단은 리포솜 당 평균 150-15,000개의 분자의 ITE를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포솜 집단은 0℃ 내지 70℃의 평균 상 전이 온도를 갖는다. 추가적으로 또는 대안적으로, 리포솜 집단은 0.3 이상의 평균 탈포화 지수를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 불포화 지질 종은 2개의 지질 꼬리를 포함하고, 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리는 단일 불포화 결합을 갖는다. 일부 실시양태에서, 불포화 탄소-탄소 결합은 지질의 유리 말단 (예를 들어, 글리세롤에 공유결합으로 결합되지 않은 말단)으로부터 적어도 세번째의 탄소-탄소 결합 (예를 들어, 세번째, 네번째, 다섯번째, 일곱번째, 여덟번째, 아홉번째, 열번째, 열한번째, 또는 열두번째 탄소-탄소 결합)이다. 일부 실시양태에서, 불포화 탄소-탄소 결합은 난 PC에서와 같이, 지질의 유리 말단으로부터 아홉번째의 탄소-탄소 결합이다.

이전 측면들 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 리포솜 집단은 추가로 1:10 내지 100:1 (예를 들어, 1:10 내지 10:1)의 항원-대-ITE의 질량비로 항원을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 리포솜 집단은 추가로 25:1 내지 1:200의 항원-대-ITE의 몰비 (항원이 아미노산 8 - 50개의 길이의 펩티드인 경우) 또는 4:1 내지 1:5000의 몰비 (항원이 단백질인 경우)로 항원을 포함할 수 있다. 다중단백질 조립체 (예를 들어, 바이러스 캡시드)의 경우, 질량비 또는 몰비가 이러한 범위를 초과할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 50 내지 250 나노미터 (nm; 예를 들어, 75-125 nm, 또는 90-120 nm)의 평균 직경을 갖는 리포솜들의 집단의 조성물이고, 여기서 리포솜 집단이 (i) 리포솜 당 평균 150-15,000개의 분자의 ITE, 또는 그의 염, 및 (ii) 1:10 내지 100:1 (예를 들어, 1:10 내지 10:1)의 항원-대-ITE의 질량비의 항원을 갖는 조성물을 특색으로 한다. 일부 실시양태에서, 리포솜 집단은 0.3 이상의 평균 탈포화 지수를 갖는다. 추가적으로 또는 대안적으로, 리포솜 집단은 0℃ 내지 70℃의 평균 상 전이 온도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜 집단은 포화 지질 종 및 불포화 지질 종을 포함하고, 여기서 불포화 지질 종이 불포화 결합을 갖고 지질 혼합물의 적어도 50%를 차지하는 것인 지질 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불포화 지질 종은 2개의 지질 꼬리를 포함하고, 여기서 각각의 지질 꼬리는 단일 불포화 결합을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항원은 펩티드 항원 (예를 들어, 자가면역 장애, 예컨대 류머티스성 관절염, 다발 경화증, I형 당뇨병, 중증 근무력증, 염증성 장 질환, 또는 복강 질환과 연관된 펩티드 항원)이다. 펩티드는 하나 이상의 번역후 변화 예컨대 글리코실화, 지질화, 또는 아미노산 측쇄의 변형 (예를 들어, 아르기닌 또는 라이신을 시트룰린으로 변화시킴)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펩티드 항원은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-81 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 항원은 서열식별번호: 1-81 중 임의의 것에 대한 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 류머티스성 관절염과 연관된다 (예를 들어, 시트룰린화 베타 피브리노겐 펩티드, 시트룰린화 II형 콜라겐 펩티드, 시트룰린화 필라그린 펩티드, 또는 시트룰린화 비멘틴 펩티드이고, 예를 들어, 서열식별번호: 1-4 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는다). 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 펩티드는 1형 당뇨병 또는 성인의 잠복성 자가면역 당뇨병 (LADA)과 연관된다 (예를 들어, 프리프로인슐린 펩티드, IA-2 펩티드, 포그린 펩티드, IGRP 펩티드, GAD65 펩티드, 또는 크로모그라닌 A 펩티드, 예를 들어, 서열식별번호: 5-81 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 항원).

일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체를 치료제 (예를 들어, 재조합 단백질 예컨대 인자 VIII)에 대해 관용화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 치료제에 대해 지시된 면역 반응 (예를 들어, 사이토카인 분비, 항체 생성 등)을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이에 대한 관용이 확립될 항원은 치료제, 예를 들어, 치료용 재조합 단백질 또는 그의 일부분이다.

일부 실시양태에서, 항원은 핵산을 전달하는 데 사용되는 벡터 (즉, 유전자 요법 벡터)로부터 유래된다. 유전자 요법 벡터는 핵산을 포장하고 뉴클레아제로부터 보호하는 데 및/또는 핵산을 특정 기관 또는 세포 유형으로 표적화하는 데 사용되는 천연 및 조작 바이러스 벡터, 뿐만 아니라 비-바이러스 단백질, 당단백질, 지질, 다당류 및 기타 천연 또는 비-천연 중합체를 포함한다. 핵산은 유전자 또는 유전자의 일부분을 코딩할 수 있거나, 또는, 예를 들어, CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복물) 유전자 편집 기술에서와 같이, 내인성 유전자를 수정하는 데 사용되는 DNA 단편을 포함할 수 있다. 치료 (즉, 임의의 신생항원)를 받고 있는 환자의 면역계에 의해 인식될 수 있는 유전자 요법 벡터의 임의의 성분이 이에 대한 면역 관용의 유도가 유전자 요법의 유용성을 개선시킬 수 있는 항원을 구성한다.

일부 실시양태에서, 치료제는 면역원성이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 치료 단백질 또는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 바이러스 또는 그의 캡시드 단백질이다. 다른 실시양태에서, 치료제는 치료 단백질 또는 펩티드 및/또는 바이러스 또는 그의 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

일부 실시양태에서, 치료제는 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV, 또는 그의 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV는 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA는 단일 가닥 DNA (ssDNA), 예컨대 cDNA 또는 그의 단편 (예를 들어, 인간 cDNA 또는 그의 단편)이다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV는 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA는 마이크로RNA (miRNA)이다.

이전 실시양태 중 임의의 것에서, 리포솜 집단은 -10 내지 -50 mv의 평균 제타 전위를 갖는다. 대안적 실시양태에서, 리포솜 집단은 +10 내지 +40 mv의 평균 제타 전위를 갖는다. 대안적으로, 리포솜 집단은 -50 내지 +40 mv의 평균 제타 전위를 갖는다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 자가면역 장애에 걸린 대상체를 치료하는 방법을 특색으로 한다. 이러한 방법은 대상체에게 이전 실시양태 중 임의의 것의 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 투여는 경구, 정맥내, 피하, 피내 (예를 들어, 표피내), 경피, 관절내, 폐, 또는 점막 투여일 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여되는 조성물의 용량은 50 ㎍ 내지 15 mg ITE (예를 들어, 75 ㎍ 내지 10 mg, 75 ㎍ 내지 7.5 mg, 100 ㎍ 내지 7.5 mg, 150 ㎍ 내지 5 mg, 200 ㎍ 내지 5 mg, 또는 250 ㎍ 내지 2.5 mg ITE, 예를 들어, 50 ㎍ 내지 100 ㎍, 100 ㎍ 내지 150 ㎍, 150 ㎍ 내지 200 ㎍, 200 ㎍ 내지 250 ㎍, 250 ㎍ 내지 300 ㎍, 300 ㎍ 내지 350 ㎍, 350 ㎍ 내지 400 ㎍, 400 ㎍ 내지 450 ㎍, 450 ㎍ 내지 500 ㎍, 500 ㎍ 내지 600 ㎍, 600 ㎍ 내지 700 ㎍, 700 ㎍ 내지 800 ㎍, 800 ㎍ 내지 900 ㎍, 900 ㎍ 내지 1.0 mg, 1.0 mg 내지 5.0 mg, 5.0 mg 내지 10 mg 또는 10 mg 내지 15 mg ITE)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 자가면역 질환, 예를 들어, I형 당뇨병, 류머티스성 관절염 또는 복강 질환에 걸렸거나, 또는 (예를 들어, 유전적 소인, 가족력 또는 혈청학적 바이오마커를 기초로) 이러한 질환이 발달될 위험에 처했을 수 있거나, 또는 잠재적으로 항원성인 치료용 펩티드, 단백질, 바이러스 벡터, 핵산 또는 세포 조성물로 치료될 것이다. 이러한 실시양태 중 임의의 것에서, 리포솜 또는 그의 조성물은 치료 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 항체), 또는 그의 일부분 (예를 들어, 도 13에 기술된 치료 단백질 또는 그의 일부분)을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 투여되는 조성물의 용량은 1 ㎍ 내지 10 mg ITE (예를 들어, 10 ㎍ 내지 10 mg, 50 ㎍ 내지 5 mg, 100 ㎍ 내지 1 mg, 150 ㎍ 내지 500 ㎍, 200 ㎍ 내지 400 ㎍, 또는 250 ㎍ 내지 250 ㎍ ITE, 예를 들어, 1 ㎍ 내지 10 ㎍, 10 ㎍ 내지 50 ㎍, 50 ㎍ 내지 100 ㎍, 100 ㎍ 내지 150 ㎍, 150 ㎍ 내지 200 ㎍, 200 ㎍ 내지 250 ㎍, 250 ㎍ 내지 300 ㎍, 300 ㎍ 내지 350 ㎍, 350 ㎍ 내지 400 ㎍, 400 ㎍ 내지 450 ㎍, 450 ㎍ 내지 500 ㎍, 500 ㎍ 내지 600 ㎍, 600 ㎍ 내지 700 ㎍, 700 ㎍ 내지 800 ㎍, 800 ㎍ 내지 900 ㎍, 900 ㎍ 내지 1.0 mg, 1.0 mg 내지 5.0 mg, 또는 5.0 mg 내지 10 mg ITE)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 류머티스성 관절염 또는 1형 당뇨병에 걸렸거나 또는 류머티스성 관절염 또는 1형 당뇨병이 발달될 위험에 처해있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 조성물 (예를 들어, 도 13에 열거된 조성물 중 임의의 것)과 연관된 하나 이상의 신생항원에 대한 면역 관용을 유도하고, 이에 의해 치료 (예를 들어, 도 13에 열거된 조성물 중 임의의 것)의 약동학 (예를 들어, 반감기를 연장시킴), 전달 (예를 들어, 바이러스 형질도입의 효율을 증가시킴), 다중 용량 치료 레지멘 (그렇지 않으면 이는 차단 면역 반응을 유도할 것이다)의 효능, 및 안전성 (예를 들어, 알레르기 반응을 방지함)을 개선하는 것에 의해 펩티드, 단백질 또는 유전자 요법의 효능 및 안전성을 개선하는 방법을 특색으로 한다. 이러한 방법은 대상체에게 이전 실시양태 중 임의의 것의 조성물을 이전 실시양태 중 임의의 것의 투여 경로를 통해 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 면역관용성 리포솜 (예를 들어, 나노-크기 리포솜)의 집단을 합성 또는 제작하는 방법을 특색으로 한다. 이러한 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다: (i) 2개 이상의 지질 종을 혼합하여 지질 혼합물을 형성시키고, 여기서 지질 혼합물이 (a) 0.3 이상의 평균 탈포화 지수; (b) 0℃ 내지 70℃의 평균 상 전이 온도; 또는 (c) 포화 지질 종, 및 불포화 결합을 포함하고 지질 혼합물의 적어도 50%를 차지하는 불포화 지질 종을 갖는 단계. 단계 (ii)는 건조 분말로서 ITE를 지질 혼합물에 첨가하거나, 또는 ITE가 용매, 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO)에 용해되어 지질 혼합물 (에탄올에 용해됨)에 지질의 질량 기준 0.4% 내지 1%, 예를 들어, 0.5% 내지 1%, 0.55% 내지 0.95%, 0.6% 내지 0.85%, 또는 0.65% 내지 0.75%의 ITE의 양으로 첨가되는 것을 포함한다. 단계 (iii)은 ITE를 함유하는 지질 혼합물 (에탄올계 용액에 용해됨)을 수성 상에 첨가하고 혼합하여, 조질 리포솜을 형성시키는 것을 포함한다. 다음으로, 단계 (iv)는 조질 리포솜을 (예를 들어, 선택된 세공 크기의 필터를 통해) 압출하여, 면역관용성 나노미립자 리포솜 (예를 들어, 규정된 크기 범위, 예를 들어, 직경 50 - 250 nm)의 집단을 형성시키는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 나노미립자 리포솜의 집단은 이전 측면 중 임의의 것의 조성물이다. 일부 실시양태에서, 리포솜의 수성 내부는 하나 이상의 항원을 포함한다.

도면의 간단한 설명
도 1a는 PEG2000-DSPE의 다양한 농도에 걸친 PEG2000-DSPE 마이셀 내의 ITE 캡슐화 효율을 나타내는 차트이다. 도 1b는 ITE 로딩에 대한 다양한 콜레스테롤 몰 백분율 및 난 PC 농도의 효과를 나타내는 차트이다 (실시예 5 참조).
도 2는 TPGS의 다양한 농도에 걸친 TPGS 마이셀 내의 ITE 캡슐화 효율을 나타내는 그래프이다.
도 3a 및 3b는 마우스 비장으로부터 단리된 수지상 세포에서 난 PC 리포솜으로부터의 ITE 또는 대조군에 의해 유도된 Cyp1a1 mRNA 발현 (도 3a) 및 Cyp1b1 mRNA 발현 (도 3b)을 나타내는 그래프 세트이다. ITE가 없는 리포솜이 ITE 리포솜에 대해 입자 농도 면에서 정규화되었다.
도 4는 MOG-로딩 나노입자로의 시험관내 자극 후의 2D2 마우스의 비장세포의 증식을 나타내는 그래프이다. MOG가 없는 리포솜이 그의 MOG-보유 대응물에 대해 입자 농도 면에서 정규화되었다.
도 5는 실시예 6에 기술된 바와 같은, 비어있는 (즉, 플레인) 난 PC 리포솜 (흑색 원); ITE를 보유하는 난 PC 리포솜 (청색 사각형); 또는 ITE 및 MOG를 보유하는 난 PC 리포솜 (녹색 삼각형)으로 처리된 마우스에서의 EAE의 진행을 나타내는 그래프이다. 간략하게, 리포솜을 헤페스(Hepes) 완충제에 현탁시키고, 제7일에 마우스 5마리의 군에 150 ㎕로 정맥 내로 (안와 후방에) 투여하였다. ITE-로딩 리포솜은 용량 당 7 ㎍의 ITE를 함유하였다. MOG35-55-로딩 리포솜은 용량 당 4 ㎍의 펩티드를 함유하였다. 제10일에 시작하여 실험 마지막 날인 제24일까지 계속하여 마우스를 EAE의 임상 징후에 대해 매일 모니터링하였다. EAE를 하기와 같이 채점하였다: 0, 질환 징후 없음; 1, 꼬리 긴장 상실; 2, 뒷다리 불완전마비; 3, 뒷다리 마비; 4, 사지마비; 및 5, 빈사 상태. 평균 점수 및 평균의 표준 오차를 마우스 5마리의 각각의 군에 대해 계산하였다.
도 6은 상기 및 실시예 6에서 기술된 바와 같이, 비어있는 난 PC 리포솜 (흑색 원), ITE를 보유하는 난 PC 리포솜 (청색 사각형), 또는 ITE 및 MOG를 보유하는 난 PC 리포솜 (녹색 삼각형)으로 생체내 처리한 후 MOG_35-55로의 생체외 재자극 시의 비장으로부터의 세포의 증식을 나타낸다.
도 7a 및 7b는 IL-17-양성 T 세포 (도 7a) 및 IFNγ-양성 T 세포 (도 7b)의 퍼센트에 의해 측정된 바와 같은, CNS 내로의 이펙터 T 세포 침윤에 대한 실시예 6에 기술된 처리의 효과를 나타내는 그래프 세트이다.
도 8a 및 8b는 실시예 6에 기술된 바와 같이 처리된 마우스의 CNS에서의 항원-특이적 Treg (도 8a) 및 Tr1 세포 (도 8b)의 증가를 나타내는 그래프 세트이다.
도 9a 및 9b는 질환 개시 제-1일에 시작된 리포솜 (플레인, II형 콜라겐 로딩, ITE 로딩, 및 ITE + II형 콜라겐 로딩)으로의 질환 예방에 대한 콜라겐-유도 관절염에 걸린 마우스의 누적 중증도 점수 및 관절염 사지의 수를 나타내는 그래프이다 (질환 예방 모델).
도 10a, 10b, 10c, 및 10d는 질환 개시 제-1일에 처리된 마우스에서의 혈청 내의 항-II형 콜라겐 IgG2a 항체 역가, 관절 내의 qPCR에 의해 정량된 FoxP3 및 IL10의 mRNA 발현 수준, 및 비장 내의 CII-반응성 CD4⁺ 이펙터 T 세포의 빈도에 대한 ITE+CII가 로딩된 리포솜으로의 치료의 효과를 각각 나타내는 그래프 세트이다 (질환 예방 모델).
도 11a, 11b, 및 11c는 질환 개시 후 제32일에 시작된 리포솜 (플레인, II형 콜라겐 로딩, ITE 로딩, 및 ITE + II형 콜라겐 로딩)으로의 요법에 대한 콜라겐-유도 관절염에 걸린 마우스의 반응을 나타내는 그래프 세트이다 (질환 요법 모델). 누적 중증도 점수 (11a), 관절염 사지의 수 (11b) 및 평균 발 두께 (11c)가 제시된다.
도 12a 및 12b는 질환 개시 후 제32일에 처리된 마우스의 혈청 내의 항-II형 콜라겐 IgG2a 및 IgG2b 항체 역가에 대한 ITE+CII가 로딩된 리포솜으로의 치료의 효과를 나타내는 그래프 세트이다 (질환 요법 모델).
도 13은 다양한 승인된 치료 항체를 표로 요약한 것이다.

상세한 설명

본 발명은 질환, 예컨대 자가면역 질환 (예를 들어, 류머티스성 관절염, 다발 경화증, I형 당뇨병, 중증 근무력증, 염증성 장 질환, 및 복강 질환)에 대한 치료로서 유용한 면역관용성 리포솜 (예를 들어, 나노미립자 리포솜)을 특색으로 한다. 추가로, 본 발명은 치료용 펩티드 및 단백질, 바이러스 유전자 요법 벡터, 핵산 치료제 및 세포 요법 (예를 들어, 수혈을 통한 것)을 포함하는 잠재적으로 면역원성인 치료 조성물의 안전하고 효율적인 투여 (반복 투여 포함)를 제공한다. 면역관용성 리포솜은 이식된 기관 (예를 들어, 신장, 간, 폐, 심장, 또는 골수 이식물)의 거부를 감소시키거나 예방하는 데, 그리고 이식편 대 숙주 질환을 예방하거나 치료하는 데 또한 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 관련된 항원과 함께, 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포에 대한 면역관용성 작용제로서 관용-유도 아릴 탄화수소 수용체 리간드 2-(1H-인돌-3-일카르보닐)-4-티아졸카르복실산 메틸 에스테르 (ITE), 또는 그의 염을 효율적으로 보유하도록 구성된 지질 조성물을 갖는 리포솜을 특색으로 한다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해, 그리고 관련 분야의 통상의 기술자에게 본 출원에서 사용된 다수의 용어에 대한 일반적인 지침을 제공하는 공개된 문서를 참조로 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 참조된 간행물의 것 사이의 임의의 상충되는 정의의 경우, 본원에서 제공된 정의가 우선할 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "나노-크기 리포솜" 및 "리포솜"은 50 내지 250 나노미터 (nm)의 직경을 갖는 구형 막-결합 소포를 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 리포솜은 단층이지만, 다층 리포솜 또한 유용하고, 본 발명에 포함된다. 관련 분야에 공지되어 있는 임의의 적절한 방법, 예컨대 동적 광 산란 (DLS; 예를 들어, 제타사이저(ZetaSizer) 기구 (말번 파날리티칼(Malvern Panalytical), 영국 말번)를 사용함), 브라운 운동 분석 (예를 들어, 나노사이트(NanoSight) 기구 (말번 파날리티칼, 영국 말번)가 제공하는 바와 같은, 나노입자 추적 분석) 등을 사용하여 리포솜의 직경을 측정할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "마이셀"은 양친매성 분자 (예를 들어, 양친매성 중합체)의 어셈블리에 의해 형성된 소수성 코어 및 친수성 쉘을 특징으로 하는 실질적으로 구형인 입자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 양친매성 중합체가 적절한 용매 (예를 들어, 수성 용액)에서 임계 역치 농도를 초과하면 마이셀이 코어-쉘 형상으로 자가-어셈블리된다. 외부 (친수성) 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG-500, PEG-1000, PEG-2000, PEG-3000, PEG-5000 [여기서 숫자는 대략적인 분자량을 지칭한다])일 수 있다. (폴리[에틸렌 글리콜]의 각각의 에틸렌 글리콜 단위는 44 돌턴을 제공하고, 비-반복 말단 기가 더해지며, 따라서 PEG-1000은 약 22개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유한다). 양친매성 물질의 내부 모이어티는 지질, 중합체, 아미노산, 방향족 화합물, 또는 조합물일 수 있다. 마이셀의 예는 중합체-지질 마이셀 (예를 들어, 외부에 폴리에틸렌 글리콜이 있고, 내부에 지방산, 예컨대 올레산이 있음), 중합체-인지질-마이셀 (예를 들어, 하이브리드 중합체성 마이셀 (예를 들어, 외부에 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜이 있고, 내부에 비교적 소수성인 중합체, 예컨대 폴리(D,L-락티드)가 있음)을 포함한다. 양친매성 물질의 소수성 및 친수성 모이어티는 표준 부착 화학을 사용하여 다양한 화학 기에 의해 연결될 수 있다. 예를 들어, PEG가 포스포글리세롤을 통해 지질에 연결될 수 있다. 아미드, 에스테르, 및 기타 연결이 관련 분야에 또한 공지되어 있다. 마이셀을 형성시키는데 적절한 양친매성 물질이 다양한 판매자 (예를 들어, 아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids), 밀리포어-시그마(Millipore-Sigma))로부터 상업적으로 입수가능하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "콜레스테롤"은 리포솜을 형성하도록 인지질과 조합될 수 있는 콜레스테롤, 관련된 스테롤 및 그의 유도체를 광범위하게 지칭한다. 즉, "콜레스테롤"은 콜레스테롤-유사 분자 예컨대 파이토스테롤 (예를 들어 β-시토스테롤 또는 스티그마스테롤)을 포괄한다. 용어 "콜레스테롤"은 글리세롤의 sn-1 또는 sn-2 위치가 (링커를 통해) 콜레스테롤에 공유결합으로 부착되고, 다른 위치는 지방산 쇄에 부착된 스테롤-변형 인지질을 또한 포괄한다. 전문이 이에 의해 본원에 포함된 문헌 [Huang and Szoka, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130(46): 15702-15712]을 참조한다. 리포솜을 형성하기에 적절한 스테롤-변형 인지질이 아반티 폴라 리피즈 (앨라배머주 앨라배스터)로부터 상업적으로 입수가능하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "지질 혼합물"은 리포솜 조제법에서 사용되는, 모노- 및/또는 디아실인지질 (총괄적으로 인지질)과 콜레스테롤의 혼합물을 지칭한다. 원하는 특성 (예를 들어, 효율적이고 안정적인 ITE 로딩)이 있는 리포솜을 생산하기 위해 상이한 머리 기 (글리세롤에 부착됨) 또는 상이한 아실 쇄 (글리세롤에 에스테르화됨)가 있는 인지질이 상이한 비로 콜레스테롤과 조합될 수 있다. 지질 혼합물 내의 지질 성분은 퍼센트 항목 (즉, 리포솜의 지질 성분의 합계가 100%인 경우)으로 표현되는, 지질 종의 몰비의 관점에서 특성화될 수 있다. 예를 들어, 39 mM 인지질 A (65%), 3 mM 인지질 B (5%) 및 18 mM 콜레스테롤 (30%)로 이루어진 리포솜 혼합물은 65:5:30 혼합물이다. 유용한 지질 혼합물에 대한 범위가 본원에서 제공된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "탈포화 지수"는 모든 인지질 종뿐만 아니라 콜레스테롤 (즉, 지질 혼합물의 모든 성분)을 고려하여, 지방산 당 이중 결합의 수의 가중 평균을 지칭한다. 지방산 쇄의 첫번째 이중 결합에는 완전한 가중치 (1)이 할당된다. 두번째 이중 결합에는 동일한 인지질의 제2 지방산에 존재하는 경우의 0.4의 가중치, 또는 상이한 인지질에 존재하는 경우의 0.5의 가중치가 할당된다. 동일한 지방산 내의 추가적인 이중 결합에는 첫번째 불포화 결합의 가중치의 1/4, 1/8, 1/16 등 (즉, 1, 0.5 또는 0.4의 1/4, 1/8, 1/16 등)에 주어진다. 예를 들어, 등몰량의 2개의 인지질 종을 갖고, 여기서 한 종은 2개의 포화 지방산 꼬리를 갖고, 다른 종은 1개의 포화 꼬리 및 1개의 단일불포화 꼬리를 갖는 리포솜 (즉, 4개의 지방산 꼬리 중 1개가 단일 결합에서 불포화이다)은 탈포화 지수가 0.25이다. 동일한 2개의 인지질로부터 제조되고, 30%의 콜레스테롤과 조합되어, 35:35:30의 몰비를 이루는 리포솜은 탈포화 지수가 0.175이다. 등몰량의 2개의 지질 종을 갖고, 여기서 하나의 종은 2개의 포화 지방산 꼬리를 갖고, 다른 종은 2개의 단일불포화 꼬리를 갖는 리포솜은 탈포화 지수가 0.35이다 (0.25 + 0.10; 즉, 제1 불포화 지방산 꼬리가 1 × 0.25 가중치에, 제2 꼬리가 0.4 × 0.25 가중치에 기여한다). 등몰량의 2개의 지질 종을 갖고, 여기서 하나의 종은 2개의 포화 지방산 꼬리를 갖고, 다른 종은 1개의 단일불포화 꼬리 및 1개의 이중불포화 꼬리를 갖는 리포솜은 탈포화 지수가 0.375 (0.25 + 0.10 + 0.025)이다. 추가적인 예가 상세한 설명에서 제공된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 본원에 기술된 치료 또는 예방 방법을 필요로 하는 임의의 포유동물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 이러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 다른 포유동물은 개, 고양이, 또는 다른 사육 동물, 말, 가축, 실험 동물 (비-인간 영장류 포함) 등을 포함한다. 대상체는 남성/수컷 또는 여성/암컷일 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 자가면역 질환에 걸렸다. 다른 실시양태에서, 대상체는 잠재적으로 면역원성인 펩티드, 단백질 또는 유전자 요법을 받아야 한다. 대상체는 치료 또는 예방 요법이 이로울 수 있는 임의의 나이일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체는 0-5세, 5-10세, 10-20세, 20-30세, 30-50세, 50-70세, 또는 70세 초과이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "신생항원"은 면역계에 의해 인식되고 면역 반응을 유도할 수 있는 치료제 (예를 들어 펩티드, 단백질 또는 유전자 요법)와 연관된 분자 또는 분자의 일부분을 지칭한다. 면역 반응의 성질은 체액성 (예를 들어, 기능을 억제하거나, 반감기를 단축시키거나, 분해를 촉발하는 신생항원에 대한 중화 항체), 세포성 (예를 들어, 신생항원으로부터 유래된 펩티드의 T 세포 수용체 인식), 또는 양쪽 모두일 수 있다. 신생항원에 대한 면역 반응은 일반적으로 치료 효능을 방해한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 요법"은 내인성 유전자의 발현을 대체하거나, 수정하거나 (예를 들어, 유전자 편집 또는 표적화된 재조합에 의해), 또는 변경시키도록 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드-유도 엑손 스키핑 또는 RNA 간섭에 의해), 또는, 암 요법의 경우, 암 세포의 취약성을 활용하도록 디자인된 신규 기능을 제공하도록 디자인된 임의의 핵산-기반 치료제 (천연 뉴클레오티드로 구성되는지 또는 비-천연 뉴클레오티드로 구성되는지 여부와 관계없음)를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 요법 벡터"는 유전자 요법을 (예를 들어, 뉴클레아제로부터) 보호하거나, 이를 (예를 들어, 표적화된 세포 또는 조직으로) 조종하거나, 이의 세포 투과를 (예를 들어, 바이러스 형질도입에 의해) 강화하거나, 또는 다른 방식으로 이의 효능을 개선하도록 디자인된 유전자 요법 조성물의 성분을 지칭한다. 종종 유전자 요법 벡터의 하나 이상의 성분이 면역 반응을 유도할 수 있는 비-천연 요소를 포함한다. 바이러스 유전자 요법 벡터가 유전자 요법 벡터의 한 중요한 카테고리를 이룬다. 가장 널리 사용되는 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 단순 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 레트로바이러스 및 우두 바이러스를 포함하고, 이들 모두 다중 변이체가 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 본원의 조성물의 "유효량" 또는 "유효 용량"은, 예를 들어, 선택된 투여 형태, 경로 및/또는 일정에 따라 세포 또는 생물에 전달되었을 때, 원하는 생물학적 (예를 들어, 면역학적) 및/또는 약리학적 효과를 달성하기에 충분한 양을 지칭한다. 이러한 분야의 통상의 기술자가 이해할 바와 같이, 효과적인 특정 조성물의 절대량은 원하는 생물학적 또는 약리학적 종점 (예를 들어, 개선된 치료 효능, 또는 치료 효과의 연장), 전달될 작용제, 표적 조직, 투여 경로, 치료 중인 대상체의 나이 및 체격, 질환 단계 등과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 관련 분야의 통상의 기술자는 "유효량"이 단일 용량으로 또는 다중 용량의 사용을 통해 세포와 접촉되거나 또는 대상체에게 투여될 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료" 또는 이의 문법적 파생물은 질환의 진행을 감소시키는 것, 질환 증상의 중증도를 감소시키는 것, 질환 증상의 진행을 지연시키는 것, 질환 증상을 제거하는 것, 또는 질환 발병을 지연시키는 것 등으로 정의된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 질환 또는 장애의 "예방"이라는 용어 또는 이의 문법적 파생물은 질환 발병의 위험을 감소시키는 것, 질환 발병을 지연시키는 것, 또는 질환의 중증도를 감소시키는 것, 또는 이의 임의의 조합으로 정의된다. 전형적으로 예방 요법은 장애, 예를 들어, 자가면역 장애가 발달될 위험이 (일반 집단에 비교하여) 증가되었지만, 아직 질환 진단에 대한 기준은 충족시키지 않는 대상체에게 투여된다. 대상체는 관련 분야에 공지되어 있거나 또는 본원에 기술된 임의의 적절한 방법에 따라 장애와 연관된 DNA 변이체 (돌연변이 포함) (예를 들어, HLA 일배체형)를 확인하는 것에 의해 장애가 발달될 "위험에 처한" 것으로 특성화될 수 있다. 대안적으로, 대상체가 추후의 장애 발달과 연관된 임의의 바이오마커 (예를 들어, 자가항체)에 대해 양성이면 대상체는 장애가 발달될 "위험에 처한" 것으로 특성화될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 대상체에 장애의 가족력이 있으면 대상체는 장애가 발달될 "위험에 처한" 것으로 특성화될 수 있다. 치료용 펩티드, 단백질, 바이러스 유전자 요법 벡터, 핵산 또는 세포에 대한 면역 반응의 "예방"은 치료제 또는 이의 임의의 조합물에 대한 면역 반응을 차단하거나, 감소시키거나, 또는 지연시키는 것을 의미한다.

용어 "제약상 허용되는"은 포유동물, 예컨대 인간에게 투여하기에 안전한 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 조성물은 동물, 더욱 특히 인간에서의 사용에 대해 연방 정부 (예를 들어, 미국 식약청) 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나, 또는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에서 열거된다.

용어 "담체"는 희석제, 아주반트, 보존제, 또는 다른 부형제, 또는 본 발명의 리포솜 조성물이 이와 함께 저장 및/또는 투여되는 비히클을 지칭한다. 적절한 제약 담체의 예가 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA., 2^nd edition, 2005]에서 기술된다.

용어 "하나"는 "하나 이상"을 의미한다. 예를 들어, "유전자"는 하나 이상의 이러한 유전자를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상의", 및 "적어도 1개의"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "약"은 기준 값으로부터 ±10% 변동성 이내의 값을 지칭한다.

다양한 출처 또는 참고문헌 사이에서 정의가 충돌하는 임의의 경우에, 본원에서 제공되는 정의가 우선할 것이다.

조성물

본 발명은 이에 대한 관용이 유도되어야 하는 하나 이상의 항원을 보유할 수 있는, 대상체의 면역계의 관용화를 위한 ITE의 효율적인 로딩을 위해 구성된 지질 조성물을 갖는 나노미터 크기 범위의 리포솜을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 상이한 수단에 의해 (예를 들어, 유리 약물로서) 전달될 때 치료적으로 효과적일 것에 비해 더 적은 총 ITE를 대상체에게 전달하는 것을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 리포솜 집단은 리포솜 당 평균 150-15,000개의 분자의 ITE (예를 들어, 200-12,500개의 분자의 ITE, 250-10,000개의 분자의 ITE, 300-7,500개의 분자의 ITE, 350-5,000개의 분자의 ITE, 400-2,500개의 분자의 ITE, 또는 450-1,000개의 분자의 ITE, 예를 들어, 100-200개의 분자의 ITE, 200-500개의 분자의 ITE, 500-1,000개의 분자의 ITE, 1,000-2,500개의 분자의 ITE, 2,500-5,000개의 분자의 ITE, 5,000-7,500개의 분자의 ITE, 7,500-10,000개의 분자의 ITE, 또는 10,000-15,000개의 분자의 ITE)를 갖는다.

본 발명의 리포솜은 나노-크기 리포솜일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 리포솜 집단은 50 내지 500 nm (예를 들어, 60 내지 250 nm, 70 내지 200 nm, 80 내지 150 nm, 85 내지 125 nm, 90 내지 110 nm, 또는 95 내지 105 nm, 예를 들어, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 약 95 nm, 약 100 nm, 약 105 nm, 약 110 nm, 약 120 nm, 또는 약 125 nm)의 평균 (예를 들어, 평균값 또는 중앙값) 직경을 갖는다.

면역관용성 리포솜은 -10 mv 내지 -50 mv (예를 들어, -15 mv 내지 -45 mv, -20 mv 내지 -40 mv, 또는 -25 mv 내지 -35 mv, 예를 들어, -10 mv 내지 -15 mv, -15 mv 내지 -20 mv, -20 mv 내지 -25 mv, -25 mv 내지 -30 mv, -30 mv 내지 -35 mv, -35 mv 내지 -40 mv, -40 mv 내지 -45 mv, 또는 -45 mv 내지 -50 mv, 예를 들어, 약 -10 mv, 약 -15 mv, 약 -20 mv, 약 -25 mv, 약 -30 mv, 약 -35 mv, 약 -40 mv, 약 -45 mv, 또는 약 -50 mv)의 표면 전하 (즉, 제타 전위)를 가질 수 있다. 대안적으로, 면역관용성 리포솜은 +10 mv 내지 +50 mv (예를 들어, +15 mv 내지 +45 mv, +20 mv 내지 +40 mv, 또는 +25 mv 내지 +35 mv, 예를 들어, +10 mv 내지 +15 mv, +15 mv 내지 +20 mv, +20 mv 내지 +25 mv, +25 mv 내지 +30 mv, +30 mv 내지 +35 mv, +35 mv 내지 +40 mv, from+-40 mv 내지 +45 mv, 또는 +45 mv 내지 +50 mv, 예를 들어, 약 +10 mv, 약 +15 mv, 약 +20 mv, 약 +25 mv, 약 +30 mv, 약 +35 mv, 약 +40 mv, 약 +45 mv, 또는 약 +50 mv)의 양성 표면 전하를 가질 수 있다. 면역관용성 리포솜은 또한 -10 mv 내지 +10 mv의 제타 전위로 중성 범위에 있을 수 있다.

지질

본 발명의 리포솜은 ITE가 효율적으로 로딩되고, (예를 들어, 면역계의 수지상 세포로) 전달되는 것을 가능하게 하는 지질 조성물을 특징으로 한다. 본 발명가들은 (i) 높은 분율의 1개 이상의 불포화 (예를 들어, 단일불포화) 지방산 꼬리 (예를 들어, 한쪽 또는 양쪽 꼬리가 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 경우), 및 (ii) 좁은 농도 범위의 콜레스테롤을 갖는 지질 혼합물로부터 제조된 리포솜이 독특하게 지질 이중층 내의 치료적으로 효과적인 농도의 ITE를 제공하는 한편, 장기간 (예를 들어, 3개월 이상 동안)의 리포솜 안정성과도 양립성이라는 것을 발견하였다. 불포화 지방산 꼬리를 갖는 이러한 지질은, 예를 들어, 난 포스포콜린 (난 PC), 대두 포스포콜린 (대두 PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (DOPS), 뿐만 아니라 인지질 (예를 들어, 올레산, 팔미톨레산 및 시스-바센산을 함유함)을 포함한다. 난 PC는 이의 2개의 지방산 꼬리 중 하나에 이중 결합을 갖는 반면, DOPC, DOPS, 올레산, 팔미톨레산, 및 시스-바센산 각각은 이의 2개의 지방산 꼬리 양쪽 모두에 1개의 이중 결합을 갖는다. 대두 PC는 1개의 지방산 쇄 상에 2개의 이중 결합을 갖는다. 난 PC, DOPC, 및 DOPS의 대표적인 구조가 하기에서 제시된다.

ITE-로딩 면역관용성 리포솜의 합성에서 유용한 지질은 탄소 10-25개의 길이 (예를 들어, 탄소 10-20개, 12-18개, 또는 14-16개의 길이, 예를 들어, 탄소 10-12개, 12-14개, 14-16개, 16-18개, 18-20개, 또는 20-25개의 길이, 예를 들어, 탄소 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 초과의 길이)의 지방산 꼬리를 갖는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 리포솜의 지질은 각각 탄소 14개 초과의 길이의 1개 또는 2개의 지방산 꼬리를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 지질 혼합물의 적어도 50%가 불포화 지질 (즉, 이의 지방산 꼬리 중 적어도 1개에 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합이 있음)을 포함한다. 이러한 불포화 지질은, 예를 들어, 난 PC, 대두 PC, DOPC, 및 DOPS를 포함한다.

불포화 단일 지방산 쇄 인지질 또한 ITE를 제형화하는 데 유용하고, 이는, 예를 들어, 단일불포화 라이소-포스파티딜콜린 (라이소 PC) 종 예컨대 1-(10Z-헵타데케노일)-2-히드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (17:1 라이소 PC) 및 1-히드록시-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (2-18:1 라이소 PC)을 포함한다.

리포솜의 탈포화 지수는 인지질 (모노- 또는 디-아실) 및 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 대안물을 포함하여 존재하는 모든 지질을 기초로, 지질 혼합물 내의 불포화 지질의 양을 정량하도록 본원에서 사용되는 용어이다. 탈포화 지수는 혼합물 내에 존재하는 불포화 결합의 분율을 기초로 하지만, (i) 첫번째 불포화 결합을 후속 불포화 결합보다 더 과하게 칭량하고, (ii) 동일한 인지질의 양쪽 지방산 내의 단일 불포화 결합을 동일한 지방산 쇄 내의 2개의 불포화 결합보다 더 많이 칭량하며, (iii) 상이한 인지질 내의 불포화 결합을 단일 인지질 내에서보다 더 많이 칭량한다. 탈포화 지수에 대한 인지질 기여를 계산하기 위한 가중 인자가 하기 표에서 요약된다. 인지질 1 및 2는 리포솜을 만들도록 1:1로 조합된 2개의 가설 디아실인지질을 지칭한다 (콜레스테롤로부터의 임의의 기여를 무시함). FA1 및 FA2는 각각의 인지질의 2개의 지방 아실 쇄를 지칭한다. 모노아실 인지질 (예를 들어 라이소 PC)은 FA2 = 0으로 채점될 것이다. 표의 채점 가중치는 다른 인지질 조성물로 확장될 수 있다.

탈포화 지수는 리포솜을 제조하는 데 사용된 지질 혼합물의 모든 지질 성분을 고려한다. 바람직한 실시양태에서, 리포솜은 하나 이상의 인지질에 더하여 콜레스테롤을 함유한다. 하기의 표는 모두 콜레스테롤이 30% (몰비)인 여러 예시적인 리포솜 조제법에 대해 탈포화 지수를 계산하는 방법을 나타낸다. 불포화 C=C 결합에 대한 가중 인자는 상기에 제시되어 있다. 예를 들어, 표의 제1행에서, DSPE는 불포화 결합이 없고 (점수: 0), 난 PC는 2개의 지방산 쇄 중 1개에 단일 불포화 결합이 있고 (점수 1 × 0.5 = 0.5), 65%의 몰비로 존재하는 한편, 콜레스테롤은 총 지질에 대해서는 계산되지만 탈포화 지수에는 기여하지 않는다 (점수: 0). 0.5 (난 PC 점수) × 0.65 (난 PC 몰비) = 0.325이고, 이는 제1행의 지질 혼합물의 탈포화 지수이다.

본원에 기술된 리포솜의 일부분으로부서 유용한 단일불포화 지방산의 요약이 하기에서 요약된다.

본 발명의 리포솜을 제형화하는 데 유용할 수 있는 다른 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리-에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2000-DSPE); 및 D-알파-토코페롤 폴리(에틸렌 글리콜)-1000 숙시네이트 (TPGS-1000)를 포함한다.

바깥쪽을 향하는 인지질 머리 기가 면역 세포와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, L-세린으로 종결되는 인지질 (포스파티딜세린 종)은 면역 세포에서 관용을 유도할 수 있다. 이러한 성질은 아팝토시스에서의 포스포-L-세린 인지질의 천연 역할을 반영한다. 일반적으로, 포스파티딜세린은 세포막의 내엽 (내층)에 위치한다. 그러나, 이는 아팝토시스 세포 또는 세포 단편의 외엽에서 나타나며, 여기에서 포식 세포에서의 면역관용성 반응을 유도한다. 따라서, 특정 실시양태에서, L-세린으로 종결되는 인지질, 예컨대 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (DOPS)은 면역관용성 리포솜의 유용한 성분이다.

특정 라이소-인지질 (라이소 PL, 예를 들어, 라이소 포스파티딜콜린, 또는 라이소 PC)이 DC에 면역관용성 신호를 제공할 수 있다 (각각 본원에 전문이 참조로 포함된 문헌 [Kabarowski et al., Biochem. Pharmacol. 2002, 64: 161-167]; [Peter et al., J. Biol. Chem. 2008, 283: 5296-5305]). 따라서, 특정 실시양태에서, 라이소 PL, 특히 불포화 측쇄가 있는 라이소 PL 또한 면역관용성 리포솜을 제형화하는 데 유용하다.

하나 이상의 불포화 (예를 들어, 단일불포화) 지질 종은 (몰 기준으로) 총 지질의 적어도 50%를 차지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 불포화 (예를 들어, 단일불포화) 지질 종은 리포솜의 총 지질의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% (예를 들어, 리포솜의 총 지질의 50% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 또는 75% 내지 80%, 예를 들어, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 또는 약 80%)를 차지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 불포화 지질 종은 총 지질의 적어도 25%를 차지한다.

탈포화 지수는 지질 혼합물 내의 불포화 결합의 정도의 대안적인 척도이다. 일부 실시양태에서, 리포솜 집단은 0.3 이상 (예를 들어, 적어도 0.3, 적어도 0.35, 적어도 0.4, 적어도 0.45, 적어도 0.5, 적어도 0.55, 적어도 0.6, 또는 적어도 0.65, 예를 들어, 0.3 내지 0.4, 0.4 내지 0.5, 0.5 내지 0.6, 0.6 내지 0.7, 예를 들어, 약 0.3, 약 0.35, 약 0.4, 약 0.45, 약 0.5, 약 0.55, 약 0.6, 또는 약 0.65)의 평균 탈포화 지수를 갖는다.

추가적으로 또는 대안적으로, 리포솜은 ITE의 로딩 및 전달, 및 ITE-로딩 리포솜의 장기 안정성에 적합한 특정한 상-전이 온도를 특징으로 하는 지질 조성물을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포솜 집단의 지질 조성물의 평균 상 전이 온도는 0℃ 내지 70℃ (예를 들어, 0℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 -10℃, 10℃ 내지 20℃, 20℃ 내지 30℃, 30℃ 내지 40℃, 40℃ 내지 50℃, 50℃ 내지 60℃, 또는 60℃ 내지 65℃, 예를 들어, 약 0℃, 약 5℃, 약 10℃, 약 20℃, 약 30℃, 약 40℃, 약 50℃, 약 60℃, 약 65℃, 또는 약 70℃)이다.

면역관용성 리포솜은 관련 분야에 공지되어 있거나 또는 본원에 기술된 임의의 적절한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마이셀 전달에 의해 (예를 들어, 실시예 2에 기술된 바와 같이) ITE가 리포솜 내로 로딩된다. 다른 실시양태에서, 에탄올 주입에 의해 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이) ITE가 리포솜 내에 제형화된다. 예를 들어, 지질을 원하는 비로 조합하고, 에탄올에 용해시킨 후, DMSO 내의 ITE를 첨가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가된 ITE의 부피는 지질/에탄올 용액의 부피의 10%를 초과하지 않는다 (예를 들어, 9%, 8%, 7%, 6%, 또는 5%를 초과하지 않는다). 진탕하면서 35-65℃ (지질 혼합물을 기초로 선택되는 온도)에서 가열함으로써 10-30분 내에 ITE가 지질 혼합물 내에 용해될 수 있다. 그 후, 생성된 지질/ITE/에탄올 용액을 항원 (예를 들어, 0.001 내지 10 mg/mL, 예를 들어, 0.005 내지 5 mg/mL, 예를 들어, 약 0.05 mg/mL, 0.10 mg/mL, 0.15 mg/mL, 0.20 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.7 mg/mL, 0.8 mg/mL, 0.9 mg/mL, 1.0 mg/mL, 2.0 mg/mL, 3.0 mg/mL, 4.0 mg/mL, 5.0 mg/mL, 6.0 mg/mL, 7.0 mg/mL, 8.0 mg/mL, 9.0 mg/mL, 또는 10 mg/mL의 농도)을 함유하는 미리 가온된 HBS 용액 내로 전달할 수 있다. 수성 항원 용액을 둘러싸고 (즉 캡슐화하여) 리포솜이 형성되게 허용하면서 35-65℃ (지질 혼합물을 기초로 함)에서 교반한 후, 혼합물을 통상적인 압출 기술을 사용하여 일련의 폴리카르보네이트 막을 통과시켜, 다층 막을 규정된 크기 (막의 세공 크기를 기초로 함) 및 균일한 크기 분포의 단층 리포솜으로 전환시킨다. 리포솜을 다중 200 nm- 및/또는 100 nm-세공 크기 막에 연속적으로 통과시키면 직경이 대략 90-110 nm인 좁은 분포 (다분산성 지수 <0.05)를 갖는 나노미립자 리포솜이 산출될 수 있다. 리포솜 코어 외부에 있는 가용성 항원을 임의의 적절한 방법 (예를 들어, 여과, 투석 또는 원심분리)에 의해 리포솜 현탁액으로부터 세정할 수 있다.

자가면역 질환에 대한 항원

일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 리포솜은 하나의 또는 소수의 특이적인 항원에 대한 관용화에 초점을 맞추도록 (예를 들어, 리포솜의 수성 코어 내에) ITE와 함께 공동-제형화된 항원을 포함한다. 질환-야기 면역 반응 또는 다른 방식으로 원치 않는 면역 반응을 유발하는 항원은 펩티드 또는 단백질 (번역후 변형을 포함함), 지질, 바이러스 유전자 요법 벡터 및 핵산으로 이루어진다. 하나 이상의 항원이 리포솜 내에 ITE와 함께 공동-제형화될 수 있거나, 또는 대안적으로, 2개의 항원이 화학적으로 비-혼화성인 경우, 각각 적어도 1개의 항원이 있고 모두 ITE가 있는 2개 이상의 리포솜 집단이 생산될 수 있다.

류머티스성 관절염 항원

리포솜은 조성물이 이를 치료하도록 구성되는 병원성 면역 반응과 연관된 임의의 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 류머티스성 관절염 환자에서 자가면역 T 및 B 세포 반응을 개시시키는 단백질은 비멘틴 (돌연변이된 비멘틴 포함), 피브리노겐, 알파 에놀라제, 및 콜라겐을 포함하고, 이들 중 임의의 것이 아르기닌 또는 라이신 대신 번역 후에 생성된 시트룰린을 함유할 수 있다. 면역 반응은 종종 이러한 단백질의 번역 후에 변형된 변이체에 대해 지시된다. 이러한 가장 통상적인 단백질 변형은 아르기닌의 (펩티딜아르기닌 데아미나제에 의한) 비-표준 아미노산 시트룰린으로의 효소적 탈이민화, 또는 라이신의 카르바밀화로부터 초래된다. 류머티스성 관절염이 진단을 위한 시트룰린화 펩티드의 용도가 널리 공지되어 있다. 예를 들어, WO 2007/123976는 류머티스성 관절염의 진단을 위한, 시트룰린화 펩티드를 포함하는 비멘틴 펩티드를 개시하고, WO 2007/017556은 류머티스성 관절염의 진단을 위한, 시트룰린화 펩티드를 포함하는 II형 콜라겐 펩티드를 개시하며, WO 2008/090360은 류머티스성 관절염의 진단을 위한, 시트룰린화 펩티드를 포함하는 에놀라제 펩티드의 용도를 개시한다. 본 발명의 항원으로서 사용될 수 있는 류머티스성 관절염-연관 항원은 아그레칸, 알파 에놀라제, II형 콜라겐, 베타 피브리노겐, 필라그린 및 비멘틴 단백질을 포함한다. 이러한 단백질을 제형화하는 것에 대한 대안으로서, T 세포 반응의 표적으로 확인된 면역원성 펩티드가 면역관용성 리포솜 내에 제형화될 수 있다. 관련된 펩티드 서열이 문헌에서 제공된다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호. 2016/0024183). 상기 언급된 간행물 각각은 전문이 본원에 참조로 포함된다.

US 2016/0024183에 개시된 특이적 류머티스성 관절염 펩티드는 시트룰린화 베타 피브리노겐 펩티드 CitPAPPPISGGGYCitACit (서열식별번호: 1), 시트룰린화 II형 콜라겐 펩티드 ACitGLTGCitPGDAK (서열식별번호: 2), 시트룰린화 필라그린 펩티드 HQCHQESTCitGRSRGRCGRSGS (서열식별번호: 3), 시트룰린화 비멘틴 펩티드 SAVRACitSSVPGVRK (서열식별번호: 4) 및 그의 단편 및 조합물을 포함한다.

1형 당뇨병 항원

1형 당뇨병 및 성인의 잠복성 자가면역 당뇨병 (LADA)과 연관된 항원은 프리프로인슐린 및 그의 프로세싱된 형태인 프로인슐린 및 인슐린; 글루탐산 데카르복실라제 65 및 67 (GAD65 및 GAD67); 이모젠-38; 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛-관련 단백질 (IGRP); 타이로신 포스파타제 유사 자가항원 또는 인슐린종 항원-2 (동의어: IA-2; ICA512, PTPRN); IA-2β (동의어: 포그린, ICA512, PTPRN2); 섬 세포 항원-69 (ICA69); 카르복시펩티다제 H; 아연 수송체 8 (ZnT8); 크로모그라닌 A 단백질을 포함한다.

이들 중 일부는 재조합 시스템에서 발현되거나 또는 리포솜 내에 제형화되는 것이 어려울 수 있는 상기 열거된 단백질에 추가적으로 또는 이에 대한 대안으로서, 펩티드가 1형 당뇨병 및 LADA의 치료를 위한 리포솜을 관용화시키는 것에서 사용될 수 있다.

유용한 프리프로인슐린 펩티드가 미국 6,562,943에 개시되어 있고, QPLALEGSLQK (서열식별번호: 5), 뿐만 아니라 이러한 서열과 중첩되는 펩티드, 예를 들어, GGGPGAGSLQPLALEGSLQK (서열식별번호: 6), GSLQPLALEGSLQKRGIV (서열식별번호: 7) (C19-A3으로 공지됨), 또는 QPLALEGSLQKRGIVEQ (서열식별번호: 8)를 포함한다.

추가적인 프리프로인슐린 펩티드가 미국 2007/0129307에 개시되어 있고, ALWMRLLPL (서열식별번호: 9); HLVEALYLV (서열식별번호: 10); SHLVEALYLVCGERG (서열식별번호: 11) (B9-23으로 공지됨); 또는 DLQVGQVEL (서열식별번호: 12)을 포함한다.

유용한 IA-2 펩티드가 미국 6,562,943에 개시되어 있고, VSSQFSDAAQASP (서열식별번호: 13), 뿐만 아니라 최대 5개의 N-말단 아미노산 및/또는 최대 11개의 C-말단 아미노산이 플랭킹된 VSSQFSDAAQASP (서열식별번호: 13)을 함유하는 펩티드, 예를 들어, SRVSSVSSQFSDAAQASPSSHSST (서열식별번호: 14); SSVSSQFSDAAQASP (서열식별번호: 15); SVSSQFSDAAQASPS (서열식별번호: 16); SVSSQFSDAAQASPSSHSS (서열식별번호: 17); SVSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWC (서열식별번호: 18); VSSQFSDAAQASPSS (서열식별번호: 19); VSSVSSQFSDAAQASPSSHSS (서열식별번호: 20); VSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWCE (서열식별번호: 21)를 포함한다.

대안적으로 IA-2 펩티드는 TQETRTL (서열식별번호: 22), 또는 최대 8개의 N-말단 아미노산 및/또는 최대 5개의 C-말단 아미노산이 플랭킹된 TQETRTL (서열식별번호: 22), 예를 들어, SFYLKNVQTQETRTLTQFH (서열식별번호: 23); FYLKNVQTQETRTLTQFHF (서열식별번호: 24); YLKNVQTQETRTL (서열식별번호: 25); YLKNVQTQETRTLTQ (서열식별번호: 26); LKNVQTQETRTLTQF (서열식별번호: 27); KNVQTQETRTLTQFH (서열식별번호:28); VQTQETRTLTQFHF (서열식별번호: 29); or TQETRTLTQFHF (서열식별번호: 30)일 수 있다.

대안적으로 IA-2 펩티드는 AYQAEPNT (서열식별번호: 31), 또는 최대 9개의 N-말단 아미노산 및/또는 최대 11개의 C-말단 아미노산이 플랭킹된 AYQAEPNT (서열식별번호: 31), 예를 들어, LAKEWQALCAYQAEPNT (서열식별번호: 32); LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE (서열식별번호: 33); WQALCAYQAEPNTCATAQ (서열식별번호: 34); LCAYQAEPNTCATAQG (서열식별번호: 35); AYQAEPNTCATAQ (서열식별번호: 36); 또는 AYQAEPNTCATAQGEGNIK (서열식별번호: 37)일 수 있다.

대안적으로 IA-2 펩티드는 CTVIVMLT (서열식별번호: 38), 또는 최대 10개의 N-말단 아미노산 및/또는 최대 8개의 C-말단 아미노산이 플랭킹된 CTVIVMLT (서열식별번호: 38), 예를 들어, DFWQMVWESGCTVIVMLT (서열식별번호: 39); FWQMVWESGCTVIVMLTPLV (서열식별번호: 40); WQMVWESGCTVIVMLT (서열식별번호: 41); MVWESGCTVIVMLTPL (서열식별번호: 42); MVWESGCTVIVMLTPLVEDGV (서열식별번호: 43); ESGCTVIVMLTPLVEDG (서열식별번호: 44); ESGCTVIVMLTPLVEDGV (서열식별번호: 45); SGCTVIVMLTPLVEDGVK (서열식별번호: 46); GCTVIVMLTPLVED (서열식별번호: 47); 또는 CTVIVMLTPLVEDG (서열식별번호: 48)일 수 있다.

대안적으로 IA-2 펩티드는 FEFALTAVAEE (서열식별번호: 49), 또는 최대 4개의 N-말단 아미노산 및/또는 최대 7개의 C-말단 아미노산이 플랭킹된 FEFALTAVAEE (서열식별번호: 49), 예를 들어 SKDQFEFALTAVAEEVNA (서열식별번호: 50); SKDQFEFALTAVAEEVNAILK (서열식별번호: 51); DQFEFALTAVAEE (서열식별번호: 52); DQFEFALTAVAEEVNAI (서열식별번호: 53); 또는 FEFALTAVAEEVNAILKA (서열식별번호: 54)일 수 있다.

대안적으로 IA-2 펩티드는 KVESSPSRSDY (서열식별번호: 55), 또는 최대 2개의 N-말단 아미노산 및/또는 최대 11개의 C-말단 아미노산이 플랭킹된 KVESSPSRSDY (서열식별번호: 55), 예를 들어, KLKVESSPSRSDYINAS (서열식별번호: 56); KLKVESSPSRSDYINASPIIEHDP (서열식별번호: 57); LKVESSPSRSDY (서열식별번호: 58); LKVESSPSRSDYINASPII (서열식별번호: 59); KVESSPSRSDYI (서열식별번호: 60); 및 KVESSPSRSDYINASPIIEHDP (서열식별번호: 61)일 수 있다.

대안적으로 IA-2 펩티드는 SLSPLQAEL (서열식별번호: 62); LLPPLLEHL (서열식별번호: 63); GLLYLAQEL (서열식별번호: 64); VLAGYGVEL (서열식별번호: 65); TLLTLLQLL (서열식별번호: 66); SLAAGVKLL (서열식별번호: 67); 또는 VLLTLVALA (서열식별번호: 68)를 포함하는 미국 2007/0129307A1에 개시된 펩티드 중 하나일 수 있다.

이러한 펩티드는 또한 포그린 펩티드, IGRP 펩티드, IAPP 펩티드, GAD65 펩티드, 또는 크로모그라닌 A 펩티드일 수 있다.　 유용한 포그린 펩티드가 미국 2007/0129307A1에 개시되어 있고, LLLLLLLLL (서열식별번호: 69); LLLLLPPRV (서열식별번호: 70); GMAELMAGL (서열식별번호: 71); LMAGLMQGV (서열식별번호: 72); RLYQEVHRL (서열식별번호: 73), 및 SLLDFRRKV (서열식별번호: 74)를 포함한다. 유용한 IGRP 펩티드가 미국 2007/0129307A1에 개시되어 있고, FLWSVFMLI (서열식별번호: 75); FLFAVGFY (서열식별번호: 76); 및 RLLCALTSL (서열식별번호: 77)을 포함한다.　 유용한 IAPP 펩티드가 미국 2007/0129307A1에 개시되어 있고, KLQVFLIVL (서열식별번호: 78) 및 FLIVLSVAL (서열식별번호: 79)을 포함한다.　 유용한 GAD65 펩티드가 WO2016162495에 개시되어 있다: TVYGAFDPLLAVAD (서열식별번호: 80), 뿐만 아니라 크로모그라닌 A 펩티드 WSKMDQLAKELTAE (서열식별번호: 81) (WE-14로 공지됨).

상기 언급된 간행물 각각은 이에 의해 전문이 참조로 포함된다.

항원은 또한 상기 항원 중 임의의 것에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 함유하는 단백질, 또는 그의 단편일 수 있다.

상기 항원 (또한 하기 표에 열거됨)이 리포솜 내에 ITE와 함께 공동-제형화될 수 있고, 1형 당뇨병이 발달될 위험이 높거나 또는 1형 당뇨병이 최근에 발병되었거나 또는 LADA에 걸린 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.

펩티드, 단백질, 및 유전자 요법에 대해 관용화시키기 위한 항원

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물 및 방법은 항원 (예를 들어, 치료제, 예컨대 치료 단백질, 바이러스 벡터 또는 나노입자와 연관된 항원)을 포함하는 (예를 들어, 캡슐화하는) 리포솜을 특색으로 한다. 이러한 실시양태는, 예를 들어, 그렇지 않으면 대상체에서 이에 대한 유해한 면역 반응이 발달될 수 있는 항원에 대해 대상체를 관용화시키는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원이 특색으로 하는 리포솜 내에 캡슐화되는 항원은 신생항원이다. 일부 실시양태에서, 신생항원에 대한 면역은 치료적 노출에 선행할 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 및 헤르페스 바이러스는 편재성이다. 따라서, 이러한 바이러스 또는 그의 변형된 버전이 유전자 요법 벡터로서 사용되는 경우, 이들은 바이러스 형질도입을 방해할 수 있는 선재 면역과 마주칠 수 있다. 또한, (유전자 요법 형태의) 바이러스에 대한 재노출이 종종 더욱 강건한 면역 반응을 유발한다.

일부 실시양태에서, 신생항원은 치료제의 임의의 일부분 (예를 들어, 펩티드, 단백질, 유전자 요법 또는 나노입자의 임의의 일부분)으로부터 유래될 수 있다. 신생항원의 특이적인 구조 (예를 들어, 펩티드 서열)가 충분히 규정되지 않은 경우, 치료제의 더 큰 분획이 리포솜 내에 제형화되어 신생항원을 제공할 수 있다. 대안적으로, 전체 치료용 펩티드, 단백질, 바이러스 코트 단백질 또는 바이러스가 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 치료제 (예를 들어, ITE를 또한 보유하는 본 발명의 리포솜 내에 캡슐화된 항원을 포함하는 치료제)에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애는 자가면역 질환, 알레르기 질환 (예를 들어, 환경 인자 예컨대 동물 비듬, 꽃가루, 먼지 진드기, 벌레 물림 등에 대한 알레르기, 뿐만 아니라 견과류, 난 제품, 해산물, 곡물 등에 대한 음식 알레르기), 유전 질환 (단백질 대체 요법 또는 유전자 요법에 의해 치료됨), 장기 이식 (면역 거부와 연관되거나, 또는 골수 이식의 경우 이식편 대 숙주 질환과 연관됨), 및 펩티드 또는 단백질 치료제에 의해 치료되는 광범위한 다른 질환 (예를 들어, 당뇨병)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 치료제 (예를 들어, ITE를 또한 보유하는 본 발명의 리포솜 내에 캡슐화된 항원을 포함하는 치료제), 조성물 (예를 들어, 본 발명의 리포솜 조성물) 또는 방법에 의해 치료될 수 있는 자가면역 질환은 관절 및 및 결합 조직에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 강직성 척추염, 류머티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염 및 혼합형 결합 조직 질환), 뿐만 아니라 뇌에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 다발 경화증 및 시신경 척수염), 내분비 기관에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, I형 당뇨병, 성인의 잠복성 자가면역 당뇨병 (LADA), 자가면역 갑상선 질환, 그레이브병, 하시모토 갑상선염 및 애디슨병), 위장관에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 자가면역 위축 위염, 악성 빈혈, 복강 질환, 및 염증성 장 질환 (크론병 및 궤양성 결장염 포함)), 피부에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 건선, 경피증, 원형 탈모증, 아토피성 피부염, 보통 천포창 및 물집 유사천포창), 근육에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 중증 근무력증, 길랑-바레 증후군 및 다발/피부근육염), 심장에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 류머티스성 열), 간에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 자가면역 간염 및 원발성 경화 담관염), 감각 기관에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 자가면역 포도막염 및 베체트병), 혈액 또는 골수에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소 자색반증 및 특발성 백혈구감소증), 폐에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 굿파스처 증후군), 신장에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 사구체신염을 포함하는 자가면역 신염), 혈관계에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 베게너 육아종증), 말초 신경계에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 만성 염증성 말이집탈락 다발신경근병증), 및 다기관 수반을 특색으로 하는 질환 (예를 들어, 전신 홍반 루푸스 및 쇼그렌 증후군)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다

유전자 요법에 의한 치료를 위한 질환

일부 실시양태에서, 유전자 요법에 의해 (예를 들어, 바이러스 유전자 요법 벡터의 투여에 의해) 치료될 수 있고, 따라서 ITE 및 항원을 포함하는 관용화 리포솜 조성물로의 예비-치료 또는 현행 치료 또는 요법-후 치료가 이로울 수 있는 질환 또는 장애는 리소좀 축적병/장애, 예컨대 산타부오리-할티아병 (1형 유아 신경원성 세로이드 지질갈색소증), 얀스키-빌쇼스키병 (2형 영아 후기 신경원성 세로이드 지질갈색소증), 배튼병 (3형 소아 신경원성 세로이드 지질갈색소증), 쿠프스병 (4형 신경원성 세로이드 지질갈색소증), 폰기르케병 (Ia형 글리코겐 축적병), Ib형 글리코겐 축적병, 폼페병 (II형 글리코겐 축적병), 포브스병 또는 코리병 (III형 글리코겐 축적병), 점액지질증 II (I-세포 질환), 점액지질증 III (가성-헐러 다발성이영양증), 점액지질증 IV (시알로지질증), 시스틴증 (성인 비-신경병증성 유형), 시스틴증 (유아 신경병증성 유형), 시스틴증 (소아 또는 청소년 신경병증성), 살라병/유아 시알산 축적 장애, 및 사포신 결핍증; 지질 및 스핑고지질 분해 장애, 예컨대 GM1 강글리오시드증 (유아, 유아 후기/소아, 및 성인/만성), 테이-삭스병, 샌드호프병, GM2 강글리오시드증, Ab 변이체, 파브리병, I, II 및 III형 고셰병, 이염성 백색질형성장애증, 크라베병 (초기 및 후기 발병), A, B, C1, 및 C2형 니만-피크병, 파버병, 및 월만병 (콜레스테릴 에스테르 축적병); 점액다당류 분해 장애, 예컨대 헐러 증후군 (MPSI), 샤이에 증후군 (MPS IS), 헐러-샤이에 증후군 (MPS IH/S), 헌터 증후군 (MPS II), 산필리포 A 증후군 (MPS IIIA), 산필리포 B 증후군 (MPS IIIB), 산필리포 C 증후군 (MPS IIIC), 산필리포 D 증후군 (MPS IIID), 모르키오 A 증후군 (MPS IVA), 모르키오 B 증후군 (MPS IVB), 마로토-라미 증후군 (MPS VI), 및 슬라이 증후군 (MPS VII); 당단백질 분해 장애, 예컨대 알파 만노시드증, 베타 만노시드증, 푸코시드축적증, 아스파르틸글루코사민뇨, 점액지질증 I (시알산증), 갈락토시알산증, 쉰들러병, 및 쉰들러병, II형/간자키병; 및 백색질형성장애증 질환/장애, 예컨대 무베타지질단백혈증, 신생아 부신백색질형성장애증, 카나반병, 뇌건성 황색종증, 펠리체우스 메르츠바허병, 탄지에르병, 레프숨병 (영아 및 고전적 형태), 산 말타제 결핍증 (예를 들어, 폼페병, 2형 글리코겐증, 리소좀 축적병), 카르니틴 결핍증, 카르니틴 팔미틸 트랜스퍼라제 결핍증, 탈분지 효소 결핍증 (예를 들어, 코리병 또는 포브스병, 3형 글리코겐증), 락테이트 데히드로게나제 결핍증 (예를 들어, 11형 글리코겐증), 미오아데닐레이트 데아미나제 결핍증, 포스포프룩토키나제 결핍증 (예를 들어, 타루이병, 7형 글리코겐증), 포스포글리세레이트 키나제 결핍증 (예를 들어, 9형 글리코겐증), 포스포글리세레이트 뮤타제 결핍증 (예를 들어, 10형 글리코겐증), 포스포릴라제 결핍증 (예를 들어, 맥아들병, 미오포스포릴라제 결핍증, 5형 글리코겐증), 고셰병 (예를 들어, 1번 염색체, 글루코세레브로시다제 효소가 영향을 받음), 연골무형성증 (예를 들어, 4번 염색체, 섬유모세포 성장 인자 수용체 3이 영향받음), 헌팅톤병 (예를 들어, 4번 염색체, 헌팅틴), 혈색소증 (예를 들어, 6번 염색체, HFE 단백질), 낭성 섬유증 (예를 들어, 7번 염색체, CFTR), 프리드리히 운동실조증 (9번 염색체, 프라탁신), 베스트병 (11번 염색체, VMD2), 겸상 적혈구병 (11번 염색체, 헤모글로빈), 페닐케톤뇨증 (12번 염색체, 페닐알라닌 히드록실라제), 마르판 증후군 (15번 염색체, 피브릴린), 근긴장성 디스트로피 (19번 염색체, 디스토피아 미오토니카 단백질 키나제), 부신백색질형성장애증 (x-염색체, 페록시솜 내의 리그노세로일-CoA 리가제), 뒤시엔느 근육 퇴행위축 (x-염색체, 디스트로핀), 레트 증후군 (x-염색체, 메틸CpG-결합 단백질 2), 레베르 유전성 시신경병증 (미토콘드리아, 호흡 단백질), 미토콘드리아 뇌병증, 락트산 산증 및 뇌졸증 (MELAS) (미토콘드리아, 전달 RNA), 및 요소 사이클의 효소 결핍증, 겸상 적혈구 빈혈, 근세관성 근육병증, 혈우병 B, 지질단백질 리파제 결핍증, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증, 크리글러-나자르 증후군, 점액지질증 IV, 니만-피크 A, 산필리포 A, 산필리포 B, 산필리포 C, 산필리포 D, 베타-지중해빈혈, 뒤시엔느 근육 퇴행위축, 및 지질 및 스핑고지질 분해, 점액다당류 분해, 당단백질 분해의 결함의 결과인 질환 또는 장애, 백색질형성장애증 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

바이러스 벡터

본 발명이 제공하는 리포솜은 하나 이상의 바이러스 (예를 들어, 바이러스 벡터), 또는 그의 일부분, 예컨대 캡시드 단백질 또는 캡시드 단백질의 면역원성 펩티드 단편을 포함 (예를 들어, 캡슐화)할 수 있다. (예를 들어, 본 발명의 방법이 대상체에서 이에 대한 관용을 제공하는 치료제에서) 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 예가 관련 분야에 공지되어 있고/거나 본원에서 기술된다. 적절한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)-기반 벡터, 아데노바이러스-기반 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV)-기반 벡터, AAV-아데노바이러스 키메라 벡터, 우두 바이러스-기반 벡터 및 센다이 바이러스-기반 벡터를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바이러스 벡터는 레트로바이러스를 기반으로 할 수 있다. 레트로바이러스 (예를 들어, 레트로비리다에(Retroviridiae) 과에 속하는 바이러스)는 단일-가닥 양성 센스 RNA 게놈을 갖고, 광범위한 숙주 세포를 감염시킬 수 있다. 감염 시, 레트로바이러스 게놈은 자신의 RNA 게놈으로부터 DNA를 생산하도록 자신의 역전사효소를 사용하여, 자신의 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 그 후, 바이러스 DNA가 숙주 세포 DNA와 함께 복제되고, 이는 바이러스 및 숙주 유전자를 번역 및 전사한다. 레트로바이러스 벡터는 바이러스 복제를 무능하게 하도록 조작될 수 있다. 이와 같이, 레트로바이러스 벡터는 생체내에서의 안정적인 유전자 전달에 특히 유용한 것으로 생각된다. 본 발명에서 유용한 레트로바이러스 벡터의 예를, 예를 들어, 미국 공개 번호 20120009161, 20090118212, 및 20090017543에서 확인할 수 있고, 이러한 바이러스 벡터 및 그의 제조 방법은 전문이 본원에 참조로 포함된다.

렌티바이러스 벡터는 본원에서 제공된 바와 같은 바이러스 벡터의 생산을 위해 사용될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 예이다. 렌티바이러스는 유전자 전달 벡터의 더욱 효율적인 방법을 구성하는 성질인 비-분열 세포를 감염시키는 능력이 있다 (예를 들어, 문헌 [Durand et al., Viruses. 2011 February; 3(2): 132-159]을 참조한다). 렌티바이러스의 예는 HIV (인간), 원숭이 면역결핍증 바이러스 (SIV), 고양이 면역결핍증 바이러스 (FIV), 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV) 및 비스타 바이러스 (양 렌티바이러스)를 포함한다. 다른 레트로바이러스와 달리, HIV-기반 벡터는 자신의 패신저 유전자를 비-분열 세포 내로 혼입시키는 것으로 공지되어 있다. 본 발명에서 유용한 렌티바이러스 벡터의 예를, 예를 들어, 미국 공개 번호 20150224209, 20150203870, 20140335607, 20140248306, 20090148936, 및 20080254008에서 확인할 수 있고, 이러한 바이러스 벡터 및 그의 제조 방법은 전문이 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)-기반 바이러스 벡터가 본원에서 제공된 바와 같이 사용하기에 적절하다. 다수의 복제 결손 HSV 벡터가 복제를 방지하기 위해 하나 이상의 중-초기 유전자를 제거하도록 결실을 함유한다. 헤르페스 벡터의 장점은 잠복 단계에 진입할 수 있는 능력 (이는 장기 DNA 발현을 초래할 수 있다), 및 대형 바이러스 DNA 게놈 (이는 외인성 DNA를 25 kb까지 수용할 수 있다)이다. 본 발명에서 유용한 HSV-기반 벡터의 설명에 대해, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,837,532, 5,846,782, 5,849,572, 및 5,804,413, 및 국제 특허 출원 WO 91/02788, WO 96/04394, WO 98/15637, 및 WO 99/06583을 참조하고, 이러한 바이러스 벡터 및 그의 제조 방법의 설명은 전문이 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바이러스 벡터는 아데노바이러스 (Ad)를 기반으로 할 수 있다. 아데노바이러스는 생체내에서 DNA를 다양한 상이한 표적 세포 유형으로 전달할 수 있는, 외피가 없는 바이러스이다. 바이러스 복제에 필요한 선택 유전자를 결실시킴으로써 이러한 바이러스를 복제-결손으로 만들 수 있다. 복제에 필수적이지 않은 소모성 E3 영역 또한 종종 결실되어, 더 큰 DNA 삽입물에 대한 추가적인 공간을 허용한다. 아데노바이러스 벡터는 높은 역가로 생산될 수 있고, 효율적으로 DNA를 복제 및 비-복제 세포로 전달할 수 있다. 렌티바이러스와 달리, 아데노바이러스 DNA는 게놈 내로 통합되지 않고, 따라서 세포 분열 동안 복제되지 않고, 그 대신 숙주의 복제 기구를 이용하여 숙주 세포의 핵에서 복제된다.

본원이 특색으로 하는 바이러스 벡터가 기반으로 할 수 있는 아데노바이러스는 임의의 기원, 임의의 하위군, 임의의 하위유형, 하위유형의 혼합물, 또는 임의의 혈청형으로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 하위군 A (예를 들어, 혈청형 12, 18, 및 31), 하위군 B (예를 들어, 혈청형 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 및 50), 하위군 C (예를 들어, 혈청형 1, 2, 5, 및 6), 하위군 D (예를 들어, 혈청형 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 및 42-48), 하위군 E (예를 들어, 혈청형 4), 하위군 F (예를 들어, 혈청형 40 및 41), 미분류 혈청군 (예를 들어, 혈청형 49 및 51), 또는 임의의 다른 아데노바이러스 혈청형의 것일 수 있다. 아데노바이러스 혈청형 1 내지 51은 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC, 버지니아주 매너서스)으로부터 입수가능하다. 비-C군 아데노바이러스, 및 심지어 비-인간 아데노바이러스를 이용하여 복제 결손 아데노바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 본 발명에서 유용한 비-C군 아데노바이러스 벡터, 비-C군 아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법, 및 비-C군 아데노바이러스 벡터를 사용하는 방법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,801,030, 5,837,511, 및 5,849,561, 및 국제 특허 출원 WO 97/12986 및 WO 98/53087에 개시되어 있다. 임의의 아데노바이러스, 심지어 키메라 아데노바이러스를 아데노바이러스 벡터를 위한 바이러스 게놈의 공급원으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 아데노바이러스를 복제 결손 아데노바이러스 벡터를 위한 바이러스 게놈의 공급원으로서 사용할 수 있다. 본 발명에서 유용한 아데노바이러스 벡터의 추가 예를 미국 공개 번호 20150093831, 20140248305, 20120283318, 20100008889, 20090175897 및 20090088398에서 확인할 수 있고, 이리헌 바이러스 벡터 및 그의 제조 방법의 설명은 전문이 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바이러스 벡터는 또한 AAV를 기반으로 할 수 있다. AAV 벡터는 치료 용도 예컨대 본원에 기술된 것들에서 사용하기에 특히 흥미롭다. AAV는 인간 질환을 야기하는 것으로 공지되지 않은 DNA 바이러스이다. 일반적으로, AAV는 효율적인 복제를 위해 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)와의 공동-감염, 또는 헬퍼 유전자의 발현을 필요로 한다. AAV는 특정 부위에서 숙주 세포 게놈을 안정적으로 감염시키는 능력이 있어서, 이들을 레트로바이러스보다 예측가능하게 만든다; 그러나, 일반적으로, 이러한 벡터의 클로닝 용량은 4.9 kb이다. 일반적으로, 유전자 요법 용도에서 사용된 AAV 벡터는 DNA 복제 및 패키징을 위한 인식 신호를 함유하는 말단 반복물 (ITR)만 남도록 모체 게놈의 약 96%가 결실되었다. 본 발명에서 유용한 AAV-기반 벡터의 설명을 위해, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,679,837, 8,637,255, 8,409,842, 7,803,622, 및 7,790,449, 및 미국 공개 번호 0150065562, 20140155469, 20140037585, 20130096182, 20120100606, 및 20070036757을 참조하고, 이러한 바이러스 벡터 및 그의 제조 방법은 전문이 본원에 참조로 포함된다. AAV 벡터는 재조합 AAV 벡터일 수 있다. AAV 벡터는 또한 자가-상보성 (sc) AAV일 수 있고, 이는, 예를 들어, 미국 특허 공개 2007/01110724 및 2004/0029106, 및 미국 특허 번호 7,465,583 및 7,186,699에 기술되어 있고, 이러한 벡터 및 그의 생산 방법은 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물에서 포함되는 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV 벡터)는 RNA 분자를 전달하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 소형 간섭 RNA (siRNA)를 전달하도록 구성된다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), mRNA, 또는 소형 활성화 RNA (saRNA)를 전달하도록 구성된다. 대안적 실시양태에서, 바이러스 벡터는 cDNA 또는 그의 단편을 코딩할 수 있는, 단일 가닥 DNA (ssDNA)를 포함하는 DNA 분자를 전달하도록 구성된다.

바이러스 벡터가 기반으로 할 수 있는 AAV는 임의의 혈청형 또는 혈청형의 혼합물의 것일 수 있다. AAV 혈청형은 AAV1, AAV 2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 및 AAV11을 포함한다. 예를 들어, 바이러스 벡터가 혈청형의 혼합물을 기반으로 하는 경우, 바이러스 벡터는 하나의 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 및 11 중 어느 하나로부터 선택됨)으로부터 취해진 캡시드 신호 서열 및 상이한 혈청형 (예를 들어, AAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 및 11 중 어느 하나로부터 선택됨)으로부터의 패키징 서열을 함유할 수 있다. 따라서, 본원에서 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV 2/8 벡터이다. 본원에서 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 다른 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV 2/5 벡터이다.

일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바이러스 벡터는 알파바이러스를 기반으로 할 수 있다. 알파바이러스는 신드비스(Sindbis) (및 VEEV) 바이러스, 아우라(Aura) 바이러스, 바반키(Babanki) 바이러스, 바마 포레스트(Barmah Forest) 바이러스, 베바루(Bebaru) 바이러스, 카바소우(Cabassou) 바이러스, 치쿤군야(Chikungunya) 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 에버글레이즈(Everglades) 바이러스, 포트 모건(Fort Morgan) 바이러스, 게타(Getah) 바이러스, 하이랜드 제이(Highlands J) 바이러스, 키질라가흐(Kyzylagach) 바이러스, 마야로(Mayaro) 바이러스, 메 트리(Me Tri) 바이러스, 미델부르크(Middelburg) 바이러스, 마소 다스 페드라스(Masso das Pedras) 바이러스, 무캄보(Mucambo) 바이러스, 엔두무(Ndumu) 바이러스, 오뇽뇽(O'nyong-nyong) 바이러스, 피슈나(Pixuna) 바이러스, 리오 네그로(Rio Negro) 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스, 연어 췌장 질환 바이러스, 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스, 남방 바다코끼리 바이러스, 토네이트(Tonate) 바이러스, 트로카라(Trocara) 바이러스, 우나(Una) 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, 및 화타로아(Whataroa) 바이러스를 포함한다. 일반적으로, 이러한 바이러스의 게놈은 숙주 세포의 세포질에서 번역될 수 있는 비-구조 (예를 들어, 레플리콘) 및 구조 단백질 (예를 들어, 캡시드 및 외피)을 코딩한다. 로스 리버 바이러스, 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 (SFV), 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 모두가 트랜스진 전달을 위한 바이러스 벡터를 개발하는 데 사용되었다. 알파바이러스 외피 당단백질 및 레트로바이러스 캡시드를 조합함으로써 슈도타입 바이러스가 형성될 수 있다. 알파바이러스 벡터의 예를 미국 공개 번호 20150050243, 20090305344, 및 20060177819에서 확인할 수 있고, 이러한 벡터 및 그의 제조 방법은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 바이러스 벡터는 유전자 편집을 포함하는 다양한 목적으로 트랜스진을 전달하는 데 사용될 수 있고, 본원에서 제공되는 방법 및 조성물 또한 적용가능하다.

바이러스 벡터: 치료 단백질 또는 그의 일부분

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 본원에서 제공되는 바와 같은 치료 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다. 이러한 단백질의 예는 주입가능하거나 주사가능한 치료 단백질, 효소, 효소 보조인자, 호르몬, 혈액 또는 혈액 응고 인자, 사이토카인 및 인터페론, 성장 인자, 아디포카인, 모노클로날 항체 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 (예를 들어, 효소 대체 요법을 위해) 효소를 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다. 이러한 효소의 예는 라이소자임, 옥시도리덕타제, 트랜스퍼라제, 가수분해효소, 리아제, 아이소머라제, 아스파라기나제, 유리카제, 글리코시다제, 프로테아제, 뉴클레아제, 콜라게나제, 히알루로니다제, 헤파리나제, 헤파라나제, 키나제, 포스파타제, 라이신 및 리가제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 효소의 다른 예는 이미글루세라제 (예를 들어, 세레자임(CEREZYME)™), a-갈락토시다제 A (a-gal A) (예를 들어, 아갈시다제 베타, 파브리자임(FABRYZYME)), 산 a-글루코시다제 (GAA) (예를 들어, 알글루코시다제 알파, 루미자임(LUMIZYME)™, 마이오자임(MYOZYME)™), 및 아릴술파타제 B (예를 들어, 라로니다제, 아둘라자임(ALDURAZYME)™, 이두르술파제, 엘라프라제(ELAPRASE)™, 아릴술파타제 B, 나글라자임(NAGLAZYME)™)를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 효소 대체 요법에 사용되는 것들을 포함한다.

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 혈액 또는 혈액 응고 인자를 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다. 이러한 혈액 또는 혈액 응고 인자의 예는 인자 I (피브리노겐), 인자 II (프로트롬빈), 조직 인자, 인자 V (프로악셀레린, 불안정한 인자), 인자 VII (안정적인 인자, 프로콘버틴), 인자 VIII (항혈우병성 글로불린), 인자 IX (크리스마스 인자 또는 혈장 트롬보플라스틴 성분), 인자 X (스튜어트-프라워 인자), 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XII (하게만 인자), 인자 XIII (피브린-안정화 인자), 폰 빌레브란트 인자, 폰 헬데브란트 인자, 프리칼리크레인 (플레처 인자], 고분자량 키니노겐 (HMWK) (피츠제럴드 인자), 피브로넥틴, 피브린, 트롬빈, 항트롬빈, 예컨대 항트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 억제제 (ZPI), 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA), 유로키나제, 플라스미노겐 활성화제 억제제-I (PAIi), 플라스미노겐 활성화제 억제제-2 (PAI2), 암 응고유발제, 및 에포에틴 알파 (에포겐(Epogen), 프로크리트(Procrit))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 사이토카인을 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 인터루킨, 및 케모카인, 1형 사이토카인, 예컨대 IFN-y, TGF-b, 및 2형 사이토카인, 예컨대 IL-4, IL-10, 및 IL-13을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 성장 인자를 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다. 이러한 성장 인자의 예는 아드레노메둘린 (AM), 안지오포이에틴 (Ang), 자가분비 운동성 인자, 뼈 형태형성 단백질 (BMP), 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), 표피 성장 인자 (EGF), 에리트로포이에틴 (EPO), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 신경교 세포주-유래 신경영양 인자 (GDNF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 성장 분화 인자-9 (GDF9), 간세포 성장 인자 (HGF), 간세포암-유래 성장 인자 (HDGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 이동-자극 인자, 미오스타틴 (GDF-8), 신경 성장 인자 (NGF) 및 기타 뉴트로핀, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 전환 성장 인자 알파 (TGF-a), 전환성장 인자 베타 (TGF-b), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-a), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), Wnt 신호전달 경로, 태반 성장 인자 (PlGF), [(태아 소 소마토트로핀)] (FBS), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-7을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아디포카인을 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다. 이러한 아디포카인의 예는 렙틴 및 아디포넥틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 수용체, 신호전달 단백질, 세포골격 단백질, 스캐폴드 단백질, 전사 인자, 구조 단백질, 막 단백질, 세포질 단백질, 결합 단백질, 핵 단백질, 분비 단백질, 골지 단백질, 세포질세망 단백질, 미토콘드리아 단백질, 및 소포 단백질 등 중 하나 이상을 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다.

추가적으로, 바이러스 벡터는 다른 치료 단백질, 예컨대 지질 및 스핑고지질 분해의 장애 (예를 들어, 갈락토시다제-1, 헥소스아미니다제 A, 헥소스아미니다제 A 및 B, GM2 활성화제 단백질, 8-갈락토시다제 A, 글루코세레브로시다제, 글루코세레브로시다제, 글루코세레브로시다제, 아릴술파타제 A, 갈락토실세라미다제, 스핑고미엘리나제, 스핑고미엘리나제, NPCl, 산 세라미다제, 리소좀 산 리파제); 점액다당류 분해의 장애 (예를 들어, L-이두로니다제, 이두로네이트 술파타제, 헤파란 N-술파타제, N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸-CoA-글루코사미니다제, 아세틸트랜스퍼라제, 아세틸글루코사민-6-술파타제, 갈락토사민-6-술파타제, 아릴술파타제 B, 글루쿠로니다제); 당단백질 분해의 장애 (예를 들어, 만노시다제, 만노시다제, 1-푸코시다제, 아스파르틸글리코사미니다제, 뉴라미니다제, 리소좀 보호 단백질, 리소좀 8-N-아세틸갈락토사미니다제, 리소좀 8-N-아세틸갈락토사미니다제); 리소좀 축적병 (예를 들어, 적어도 4가지 하위유형의 팔미토일-단백질 티오에스테라제, 미지의 리소좀 막 단백질, 글루코스-6-포스파타제, 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제, 산 말타제, 탈분지 효소 아밀로-1,6 글루코시다제, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제, 강글리오시드 시알리다제 (뉴라미니다제), 리소좀 시스틴 수송 단백질, 리소좀 시스틴 수송 단백질, 리소좀 시스틴 수송 단백질, 시알산 수송 단백질 사포신, A, B, C, D) 및 백색질형성장애증 (예를 들어, 마이크로솜 트리글리세리드 수송 단백질/아포지질단백질 B, 페록시솜 막 수송 단백질, 페록신, 아스파르토아실라제, 스테롤-27-히드록실라제, 프로테오지질 단백질, ABC 수송체, 페록시솜 막 단백질 3 또는 페록시솜 생물발생 인자 1, 피탄산 옥시다제)와 연관된 기능성 버전의 단백질을 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다.

바이러스 벡터: 유전자 편집

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바이러스 벡터 (예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 이에 대한 관용이 유도될 수 있는 치료제로서 사용될 수 있는 바이러스 벡터)는 유전자 편집을 위해 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 바이러스 벡터의 트랜스진은 유전자 편집 트랜스진이다. 이러한 트랜스진은 유전자 편집 프로세스에서 수반되는 성분을 코딩한다. 일반적으로, 이러한 프로세스는 게놈 DNA에 대한 오래 지속되거나 또는 영구적인 변형, 예컨대 표적화된 DNA 삽입, 교체, 돌연변이유발 또는 제거를 초래한다. 유전자 편집은 관심 DNA 서열을 코딩하는 핵산의 전달, 및 관심 서열을 엔도뉴클레아제를 사용하여 게놈 DNA 내의 표적화된 부위에 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 유전자 편집 트랜스진은 삽입을 위한 관심 DNA 서열을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 삽입을 위한 DNA 서열은 본원에서 제공되는 치료 단백질 또는 그의 일부분 중 어느 하나를 코딩하는 DNA 서열이다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 유전자 편집 트랜스진은 유전자 편집 프로세스를 수행하는 하나 이상의 성분을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 유전자 편집 트랜스진은 엔도뉴클레아제 및/또는 가이드 RNA 등을 코딩할 수 있다.

엔도뉴클레아제는 게놈 내의 원하는 위치에서 이중-가닥 DNA 내에 파손을 생성시키고, 상동 재조합, 비-상동 말단-연결 등을 사용하여 이러한 파손을 복구하도록 숙주 세포의 메커니즘을 사용할 수 있다. 유전자 편집에 사용될 수 있는 엔도뉴클레아제의 클래스는 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복물(들) (CRISPR) 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공되는 바이러스 벡터의 유전자 편집 트랜스진은 본원에서 제공되는 엔도뉴클레아제 중 어느 하나를 코딩할 수 있다.

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 메가뉴클레아제를 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다. 메가뉴클레아제는 일반적으로 DNA 서열 (14-40개의 염기쌍)을 인식하고 절단하는 이의 능력에 의해 특성화된다. 추가적으로, 공지된 기술, 예컨대 돌연변이유발 및 고-처리량 스크리닝 및 조합형 어셈블리를 사용하여, 단백질 서브유닛이 회합 또는 융합된 맞춤 메가뉴클레아제를 생성시킬 수 있다. 메가뉴클레아제의 예를 미국 특허 번호 8,802,437, 8,445,251 및 8,338,157; 및 미국 공개 번호 20130224863, 20110113509 및 20110033935에서 확인할 수 있고, 이들의 메가뉴클레아제는 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아연 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다. 전형적으로 아연 핑거 뉴클레아제는 핵산 분자 내의 특정 표적 부위에 결합하는 아연 핑거 도메인, 및 결합 도메인이 결합한 표적 부위 내에서 또는 표적 부위 부근에서 핵산 분자를 절단하는 핵산 절단 도메인을 포함한다. 전형적인 조작된 아연 핑거 뉴클레아제는 3 내지 6개의 개별적인 아연 핑거 모티프가 있고 염기쌍 9개 내지 염기쌍 18개 범위의 표적 부위에 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 아연 핑거 뉴클레아제는 절단을 위한 소정의 핵산 분자 내의 임의의 원하는 서열을 실질적으로 표적화하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 공지된 특이성의 개별적인 아연 핑거 모티프들을 조합함으로써 원하는 특이성을 갖는 아연 핑거 결합 도메인이 디자인될 수 있다. DNA에 결합된 아연 핑거 단백질 Zif268의 구조가 이러한 분야의 많은 연구에 정보를 제공하였고, 64개의 가능한 염기쌍 삼중체 각각에 대한 아연 핑거를 수득한 후, 이러한 모듈형 아연 핑거를 혼합하고 매칭시켜 임의의 원하는 서열 특이성을 갖는 단백질을 디자인하는 개념이 기술되었다 (전체 내용이 본원에 포함된 문헌 [Pavletich N P, Pabo C O (May 1991). "Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A". Science 252 (5007): 809-17]). 일부 실시양태에서, 박테리아 또는 파지 디스플레이가 원하는 핵산 서열, 예를 들어, 원하는 엔도뉴클레아제 표적 부위를 인식하는 아연 핑거 도메인을 개발하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 링커, 예를 들어, 폴리펩티드 링커를 통해 서로 융합되거나 또는 다른 식으로 접합된 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함한다. 링커의 길이가 아연 핑거 도메인이 결합한 핵산 서열로부터의 절단의 길이를 결정할 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제의 예를 미국 특허 번호 8,956,828; 8,921,112; 8,846,578; 8,569,253에서 확인할 수 있고, 이들의 아연 핑거 뉴클레아제는 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다. TALEN은 특이적인 DNA 결합 도메인을 일반적인 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 생산된 인공 제한 효소이다. 임의의 원하는 DNA 서열에 결합하도록 디자인될 수 있는 DNA 결합 도메인은 식물을 감염시키는 특정 박테리아가 분비하는 DNA-결합 단백질인 전사 활성화제-유사 (TAL) 이펙터로부터 유래될 수 있다. 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE)는 실질적으로 모든 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있거나, 또는 DNA 절단 도메인과 조합되어 어레이로 함께 연결될 수 있다. TALEN은 아연 핑거 뉴클레아제를 디자인하는 데 유사하게 사용될 수 있다. TALEN의 예를 미국 특허 번호 8,697,853, 뿐만 아니라 미국 공개 번호 20150118216, 20150079064, 및 20140087426에서 확인할 수 있고, 이들의 TALEN은 본원에 참조로 포함된다.

CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복물)/Cas 시스템 또한 유전자 편집을 위한 도구로서 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템에서, 가이드 RNA (gRNA)는 게놈에 의해 또는 에피솜에 의해 (예를 들어, 플라스미드 상에서) 코딩된다. 전사 후, gRNA가 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성한다. 그 후, gRNA의 특이성 결정 서열 (SDS)에 의해 복합체가 전형적으로 세포의 게놈 내에 위치하는 DNA 표적 서열로 안내된다. Cas9 또는 Cas9 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질 또는 그의 단편 (예를 들어, Cas9의 활성 또는 불활성 DNA 절단 도메인 또는 부분적으로 불활성인 DNA 절단 도메인 (예를 들어, Cas9 니카제), 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 지칭한다. Cas9는 CRISPR 반복물 서열 내의 짧은 모티프 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식하여 자가 대 비-자가를 구별하는 것을 돕는다. Cas9 엔도뉴클레아제 서열 및 구조는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J. J., McShan W. M., Ajdic D. J., Savic D. J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A. N., Kenton S., Lai H. S., Lin S. P., Qian Y., Jia H. G., Najar F. Z., Ren Q., Zhu H., Song L. expand/collapse author list McLaughlin R. E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)]; ["CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C. M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z. A., Eckert M. R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607 (2011)]; 및 ["A programmable dual-RNA-guidedDNAendonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)]을 참조한다). crRNA 및 tracrRNA 양쪽 모두의 측면을 단일 RNA 종 내로 혼입하도록 단일 가이드 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gNRA")가 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821 (2012)]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 Cas9 엔도뉴클레아제를 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다.

Cas9 오르토로그가 에스. 피오게네스(S. pyogenes) 및 에스. 써모필루스(S. thermophilus)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 종에서 기술되었다. 추가적인 적절한 Cas9 엔도뉴클레아제 및 서열이 관련 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이러한 Cas9 엔도뉴클레아제 및 서열은 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737]에 개시된 생물 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 트랜스진은 야생형 Cas9,단편 또는 Cas9 변이체를 코딩한다. "Cas9 변이체"는 자연에서 발생하는 바와 같은 Cas9 야생형 엔도뉴클레아제와 동일하지 않은 Cas9 기능을 갖는 임의의 단백질이다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 야생형 Cas9, 또는 그의 단편과 상동성을 공유한다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 또는 에스. 써모필루스 Cas9 단백질에 대한 적어도 40%의 서열 동일성을 갖고, Cas9 기능성을 유지한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 적어도 90%, 95%, 또는 이를 초과하는 ％이다. 더욱 바람직하게는, 서열 동일성은 적어도 98% 또는 99%의 서열 동일성이다. 본원에서 제공되는 방법 중 어느 하나에서 사용하기 위한 Cas9 변이체 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 아미노산 서열 동일성이다. Cas9 변이체는 Cas9 이량체, Cas9 융합 단백질, Cas9 단편, 최소화된 Cas9 단백질, 절단 도메인이 없는 Cas9 변이체, gRNA 도메인이 없는 Cas9 변이체, Cas9-재조합효소 융합물, fCas9, FokI-dCas9 등을 또한 포함한다. 이러한 Cas9 변이체의 예를, 예를 들어, 미국 공개 번호 20150071898 및 20150071899에서 확인할 수 있고, 이들의 Cas9 단백질 및 Cas9 변이체의 설명은 본원에 참조로 포함된다. Cas9 변이체는 Cas9 내의 단일 엔도뉴클레아제 도메인을 불활성화시키는 돌연변이(들)를 포함하는 Cas9 니카제를 또한 포함한다. 이러한 니카제는 이중 가닥 파손과 반대로 표적 핵산에서 단일 가닥 파손을 유도할 수 있다. Cas9 변이체는 1개의 뉴클레아제 도메인이 돌연변이에 의해 불활성화된 Cas9 변이체인 Cas9 무효 뉴클레아제를 또한 포함한다. 추가적인 Cas9 변이체의 예 및/또는 추가의 Cas9 변이체를 확인하는 방법을 미국 공개 번호 20140357523, 20150165054 및 20150166980에서 확인할 수 있고, Cas9 단백질, Cas9 변이체 및 그의 확인 방법에 관한 이들의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

Cas9 변이체의 또 다른 예는 니카제 활성만 있는, Cas9D10A로 공지된 돌연변이체 형태를 포함한다. Cas9D10A는 인접한 DNA 닉을 생성시키도록 디자인된 쌍을 이룬 Cas9 복합체에 의해 유전자좌가 표적화되는 경우에 표적 특이성 관점에서 매력적이다. Cas9 변이체의 또 다른 예는 뉴클레아제-결손 Cas9 (dCas9)이다. HNH 도메인 내의 H840A 및 RuvC 도메인 내의 D10A 돌연변이는 절단 활성은 불활성화시키지만, DNA 결합을 방지하지는 않는다. 따라서, 이러한 변이체는 절단 없이 게놈의 임의의 영역을 서열 특이적으로 표적화하는 데 사용될 수 있다. 그 대신, 다양한 이펙터 도메인과 융합시킴으로써, dCas9를 유전자 침묵화 또는 활성화 도구로서 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 트랜스진은 본원에서 제공되는 Cas9 변이체 중 어느 하나를 코딩할 수 있다.

(예를 들어, 게놈을 변형시키기 위해) 부위-특이적 절단을 위해 RNA-프로그래밍가능 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 사용하는 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)]; [Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)]; [Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)]; [Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)]; [Dicarlo, J.E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)]; [Jiang, W. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)]을 참조한다).

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 귀소 엔도뉴클레아제를 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다. 귀소 엔도뉴클레아제는, 소수의 위치 또는 단일 위치에서, 이들을 합성하는 데 사용된 게놈 DNA의 가수분해를 촉매할 수 있고, 이에 의해 이들의 유전자를 숙주 내에서 수평으로 전달하여, 이들의 대립유전자 빈도를 증가시킨다. 귀소 엔도뉴클레아제는 일반적으로 긴 인식 서열을 갖고, 이에 의해 낮은 무작위 절단 가능성을 갖는다. 한 대립유전자는 전파 전에 유전자를 보유하는 한편 (귀소 엔도뉴클레아제 유전자+, HEG+), 다른 대립유전자는 그렇지 않고 (HEG-), 효소 절단에 대해 취약성이다. 일단 효소가 합성되면, 이는 HEG-대립유전자 내의 염색체를 파손시켜, 세포 DNA 복구 시스템으로부터의 반응을 개시시키고, 이러한 시스템은 재조합을 사용하여, 엔도뉴클레아제에 대한 유전자를 함유하는 HEG+인 반대되는 손상되지 않은 DNA 대립유전자의 패턴을 취한다. 따라서, 유전자가 초기에는 이를 갖지 않는 또 다른 대립유전자로 복사되고, 연속적으로 증식된다. 귀소 엔도뉴클레아제의 예를, 예를 들어, 미국 공개 번호 20150166969 및 미국 특허 번호 9,005,973에서 확인할 수 있고, 이들의 귀소 엔도뉴클레아제는 본원에 참조로 포함된다.

트랜스진의 서열은 발현 제어 서열을 또한 포함할 수 있다. 발현 제어 DNA 서열은 프로모터, 인핸서, 및 오퍼레이터를 포함하고, 일반적으로, 발현 구축물이 활용될 발현 시스템을 기초로 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로모터 및 인핸서 서열은 유전자 발현을 증가시키는 능력을 위해 선택되는 한편, 오퍼레이터 서열은 유전자 발현을 조절하는 능력을 위해 선택될 수 있다. 트랜스진은 숙주 세포에서의 상동 재조합을 용이하게 하는, 바람직하게는 촉진하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 트랜스진은 숙주 세포에서의 복제에 필요한 서열을 또한 포함할 수 있다.

예시적인 발현 제어 서열은 프로모터 서열, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 프로모터; 라우스 육종 바이러스 프로모터; 및 원숭이 바이러스 40 프로모터; 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에서 개시되거나 또는 다르게는 관련 분야에 공지되어 있는 임의의 다른 유형의 프로모터를 포함한다. 일반적으로, 프로모터는 원하는 발현 생성물을 코딩하는 서열의 상류 (즉, 5')에 작동적으로 연결된다. 트랜스진은 코딩 서열의 하류 (즉, 3')에 작동가능하게 연결된 적절한 폴리아데닐화 서열 (예를 들어, SV40 또는 인간 성장 호르몬 유전자 폴리아데닐화 서열)을 또한 포함할 수 있다.

항원 대 ITE 화학량론

항원 및 치료 중인 질환의 유형에 따라 다양한 항원-대-ITE 비가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 항원-대-ITE의 질량비는 1:10 내지 100:1 (예를 들어, 1:5 내지 50:1, 1:4 내지 20:1, 또는 1:3 내지 10:1, 예를 들어, 1:10 내지 1:8, 1:8 내지 1:6, 1:6 내지 1:4, 1:4 내지 1:2, 1:2 내지 1:1, 1:1 내지 2:1, 2:1 내지 3:1, 3:1 내지 4:1, 4:1 내지 5:1, 5:1 내지 10:1, 10:1 내지 20:1, 20:1 내지 30:1, 30:1 내지 40:1, 40:1 내지 50:1, 50:1 내지 60:1, 60:1 내지 80:1, 또는 80:1 내지 100:1, 예를 들어, 약 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20: 1:10, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 또는 100:1)이다. 일부 실시양태에서, 항원-대-ITE의 몰비는 1:5000 내지 25:1 (예를 들어, 1:2000 내지 20:1, 1:1000 내지 15:1, 또는 1:500 내지 10:1, 예를 들어, 1:2000 내지 1:1000, 1:1000 내지 1:500, 1:500 내지 1:200, 1:200 내지 1:50, 1:50 내지 1:30, 1:30 내지 1:20, 1:20 내지 1:10, 1:10 내지 1:5, 1:5 내지 1:4, 1:4 내지 1:3, 1:3 내지 1:2, 1:2 내지 1:1, 1:1 내지 2:1, 2:1 내지 3:1, 3:1 내지 4:1, 4:1 내지 5:1, 5:1 내지 10:1, 10:1 내지 20:1, 20:1 내지 50:1, 50:1 내지 100:1, 100:1 내지 500:1, 500:1 내지 2000:1, 또는 2000:1 내지 5000:1, 예를 들어, 약 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20: 1:10, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 또는 100:1)이다.

치료 및 예방 방법

본원에 기술된 조성물 및 방법은 치료적 면역조정이 이로울 환자 (예를 들어, 인간) (예를 들어,억제된 면역 반응을 필요로 하는 환자, 예를 들어, 자가면역 장애에 걸린 대상체)를 치료하는 데, 또는 장애 (예를 들어, 자가면역 장애)가 발달되기 시작하는 것을 예방하는 데 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물 (예를 들어, 리포솜 조성물) 및 방법에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애는 자가면역 질환, 알레르기 질환 (예를 들어, 환경 인자 예컨대 동물 비듬, 꽃가루, 먼지 진드기, 벌레 물림 등에 대한 알레르기, 뿐만 아니라 견과류, 난 제품, 해산물, 곡물 등에 대한 음식 알레르기), 유전 질환 (단백질 대체 요법 또는 유전자 요법에 의해 치료됨), 장기 이식 (면역 거부와 연관되거나, 또는 골수 이식의 경우 이식편 대 숙주 질환과 연관됨), 및 펩티드 또는 단백질 치료제에 의해 치료되는 광범위한 다른 질환 (예를 들어, 당뇨병)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물 (예를 들어, 본 발명의 리포솜 조성물) 또는 방법에 의해 치료될 수 있는 자가면역 질환은 관절 및 및 결합 조직에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 강직성 척추염, 류머티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염 및 혼합형 결합 조직 질환), 뿐만 아니라 뇌에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 다발 경화증 및 시신경 척수염), 내분비 기관에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, I형 당뇨병, 성인의 잠복성 자가면역 당뇨병 (LADA), 자가면역 갑상선 질환, 그레이브병, 하시모토 갑상선염 및 애디슨병), 위장관에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 자가면역 위축 위염, 악성 빈혈, 복강 질환, 및 염증성 장 질환 (크론병 및 궤양성 결장염 포함)), 피부에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 건선, 경피증, 원형 탈모증, 아토피성 피부염, 보통 천포창 및 물집 유사천포창), 근육에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 중증 근무력증, 길랑-바레 증후군 및 다발/피부근육염), 심장에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 류머티스성 열), 간에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 자가면역 간염 및 원발성 경화 담관염), 감각 기관에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 자가면역 포도막염 및 베체트병), 혈액 또는 골수에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소 자색반증 및 특발성 백혈구감소증), 폐에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 굿파스처 증후군), 신장에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 사구체신염을 포함하는 자가면역 신염), 혈관계에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 베게너 육아종증), 말초 신경계에 영향을 미치는 질환 (예를 들어, 만성 염증성 말이집탈락 다발신경근병증), 및 다기관 수반을 특색으로 하는 질환 (예를 들어, 전신 홍반 루푸스 및 쇼그렌 증후군)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 방법은 치료를 필요로 하는 환자를 선택하고, 환자에게 하나 이상의 본원에 기술된 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 치료를 필요로 하는 대상체가, 예를 들어, 이들의 의사에 의해 확인될 수 있다.

치료 유효량의 본원에 기술된 조성물 중 하나 이상을 표준 방법에 의해, 예를 들어, 하나 이상의 투여 경로에 의해, 예를 들어, 미국 식품의약청 (FDA: 예를 들어, 월드와이드웹 주소 fda.gov/cder/dsm/DRG/drg00301.htm을 참조한다)에 의해 현재 승인된 투여 경로 중 하나 이상에 의해 투여할 수 있다. 면역관용성 리포솜 또는 그의 제약 제약 조성물은 전신으로 또는 국소적으로, 예를 들어, 정맥내, 피하, 피내 (표피내 포함), 관절내, 폐 또는 점막 (코 포함) 경로를 통해 비경구적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 간내로, 뇌내로, 근육내로, 경피로, 동맥내로, 복막내로, 병변내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 기관내로, 경막내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 종양내로, 피하로, 결막하로, 폐포내로, 점막으로, 심막내로, 제대내로, 경구로, 국소적으로, 피부통과로, 흡입에 의해, 에어로졸화에 의해, 주사에 의해, 이식에 의해, 주입에 의해 (예를 들어, 연속 주입에 의해), 카테터에 의해, 세척에 의해, 또는 크림으로 투여될 수 있다.

환자에게 투여되는 리포솜의 양은 항원 및/또는 ITE의 농도에 의존적으로 변할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 용량의 리포솜 내의 ITE의 양은 약 50 ㎍ 내지 15 mg (예를 들어, 75 ㎍ 내지 100 ㎍, 100 ㎍ 내지 150 ㎍, 150 ㎍ 내지 300 ㎍, 300 ㎍ 내지 500 ㎍, 500 ㎍ 내지 750 ㎍, 750 ㎍ 내지 1500 ㎍, 1500 ㎍ 내지 5000 ㎍, 또는 5000 ㎍ 내지 15000 ㎍)이다. 예를 들어, 단일 용량의 리포솜 내의 ITE의 양은 100 ㎍ 내지 1000 ㎍ (예를 들어, 200 ㎍ 내지 800 ㎍, 예를 들어, 약 200 ㎍, 약 300 ㎍, 약 400 ㎍, 약 500 ㎍, 약 600 ㎍, 약 700 ㎍, 약 800 ㎍, 약 1000 ㎍, 또는 약 1500 ㎍)일 수 있다.

면역관용성 리포솜의 제약 조성물은 의도되는 투여 경로를 위한 임의의 적절한 농도일 수 있다.

일부 실시양태에서, 면역관용성 리포솜의 단일 단위 용량 (예를 들어, 상기 언급된 양 중 임의의 것의 ITE를 함유하는 단일 용량)은 10¹¹ 내지 10¹⁶개의 리포솜 (예를 들어, 10¹¹ 내지 10¹⁶개의 리포솜, 10¹¹ 내지 10¹⁵개의 리포솜, 10¹² 내지 10¹⁴개의 리포솜, 또는 약 10¹³개의 리포솜, 예를 들어, 10¹¹ 내지 10¹²개의 리포솜, 10¹² 내지 10¹³개의 리포솜, 10¹³ 내지 10¹⁴개의 리포솜, 10¹⁴ 내지 10¹⁵개의 리포솜, 또는 10¹⁵내지 10¹⁶개의 리포솜, 예를 들어, 10¹² 내지 10¹⁵개의 리포솜, 5.0×10¹³ 내지 1.0×10¹⁴개의 리포솜, 예를 들어, 약 8×10¹³개의 리포솜)을 포함할 수 있다.

조성물은 1회 또는 다회로 수 주, 수 개월 또는 수 년의 치료 기간의 과정에 걸쳐 (예를 들어, 질환-관련 자가항원에 대한 관용이 유도될 때까지) 투여될 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 1일 1회, 주 당 5회, 주 당 4회, 주 당 3회, 주 당 2회, 2주 당 1회, 3주 당 1회, 매월, 격월, 년 당 5회, 년 당 4회, 년 당 3회, 년 당 2회, 또는 년 당 1회로 대상체에게 투여된다.

하기의 실시예는 본원에 기술된 실시양태의 범주를 제한하지 않는다. 관련 기술 분야의 숙련된 기술자는 하기의 실시예로부터 변형이 이루어질 수 있고, 이는 본 발명의 취지 및 범주에 포함되도록 의도된다는 것을 이해할 것이다.

실시예

하기 실시예에 기술된 바와 같이, ITE 및/또는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG) 항원을 함유하는 나노미립자 리포솜의 다양한 제형을 합성하고, 특성화하고, 자가면역의 동물 모델에서 테스트하였다:

실시예 1. ITE-로딩 마이셀의 제형화 및 특성화

2-(1H-인돌-3-일카르보닐)-4-티아졸카르복실산 메틸 에스테르 (ITE)는 나노미립자 형태 (예를 들어, 금 및 PLGA 나노입자, 및 다수의 통상적인 리포솜 조성물을 포함함)로 제형화하기가 어려운 강력한 아릴 탄화수소 수용체 효능제이다. 한 기여 인자는 물 (~115 마이크로몰), 메탄올 (~3 밀리몰) 및 에탄올 (~3.3 밀리몰)을 포함하는 다수의 통상적인 용매에서의 친지성 ITE의 낮은 용해도이다. 또한 ITE는 고도의 자가 응집 경향이 있다.

이러한 실시예는 DSPE-PEG, TPGS, 및 그의 혼합물을 사용하여 ITE를 마이셀 내로 로딩하는 예시적인 방법들을 제공하고, 각각의 특성화가 본원에서 제공된다.

방법 1: DSPE-PEG 마이셀

1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG2000-DSPE, 아반티 폴라 리피즈 카탈로그 #880120)을 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 mM의 농도 (각각 배치 1-6)로 붕규산염 유리관 내의 클로로포름에 용해시켰다. ITE (1 mg 분말)을 0.5 ml의 각각의 PEG2000-DSPE/클로로포름 용액에 첨가하고, ITE가 완전히 용해되고 투명한 용액이 수득될 때까지 와동 및 50℃에서의 간헐적인 가열에 의해 혼합하였다. 그 후, 클로로포름을 질소 하에 증발시켜, 유리관의 내측에 얇은 필름을 남겼다. 관을 철야로 냉동-건조시켜 미량의 클로로포름을 모두 제거하였다. 0.5 ml HEPES 완충 염수 (HBS; pH 6.5)를 첨가함으로써 유리 벽 상의 건조된 PEG2000-DSPE/ITE 필름을 수화시켰다. 와동시키고, 배스-유형 초음파처리기 (FS20D, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))에서 간략하게 초음파처리하는 것에 의해 지질 필름의 완전한 현탁액이 달성되었다. 생성된 마이셀을 10,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 0.2 ㎛ 폴리에테르술폰 (PES) 필터에 통과시켜, 임의의 캡슐화되지 않은 또는 침전된 ITE를 제거하였다. 그 후, 말번 제타사이저를 사용하여 마이셀을 크기, 다분산성, 및 전하에 관하여 특성화하였다. 로딩된 ITE의 양을 마이셀 제제를 메탄올:아세트산 (99:1 v/v)에 용해시킴으로써 결정하였다. ITE는 지질은 흡수하지 않는 파장인 355 나노미터에서 빛을 흡수하여, ITE 농도의 분광광도 측정을 가능하게 한다. ITE 농도 대 355 나노미터에서의 흡광도에 관한 표준 곡선이 생산되었고, 이를 사용하여 ITE 로딩을 측정하였다. 마이셀 내에 캡슐화된 출발 ITE (1 mg)의 분율로서 ITE 캡슐화를 계산하였다. ITE가 기여한 최종 마이셀 질량의 퍼센트로서 ITE 로딩을 계산하였다. 결과가 하기 표 1에서 요약되고, 도 1에서 도해된다.

표 1. PEG2000-DSPE 마이셀 내의 ITE의 캡슐화

마이셀 크기는 PEG2000-DSPE 농도에 따라 유의하게 변하지 않았지만, 다분산성은 더 높은 지질 농도에서 더 낮았다. 육안 관찰은 더 높은 PEG2000-DSPE 농도가 더 많은 ITE를 보유할 수 있었다는 것을 나타냈는데, 배치 1에는 가시적인 ITE 침전이 있었지만, 배치 6에는 그렇지 않았기 때문이다. ITE 측정에서 이러한 관찰이 확증되었는데, 도 1에 나타난 바와 같이, 배치 1 마이셀 (15 mM 지질)이 가장 낮은 캡슐화 효율 (11.3%)을 갖고, 배치 4 (30 mM 지질)이 가장 높은 캡슐화 효율 (29.8%)을 가졌기 때문이다.

방법 2: TPGS 마이셀

D-α-토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 1000 숙시네이트 (TPGS-1000; 밀리포어-시그마(Millipore-Sigma) 카탈로그 #57668)를 15, 25, 35, 45, 55, 65 및 75 mg/ml (각각 배치 1-7)의 농도로 붕규산염 유리관 내의 0.5 ml 클로로포름에 용해시켰다. 1 밀리그램의 ITE를 각각의 관에 첨가하여, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 1.33% 내지 6.67% (w/w)의 다양한 ITE:TPGS-1000 비를 산출시켰다. ITE 및 TPGS를 와동에 의해 클로로포름에 용해시켰다. 클로로포름을 질소 기류 하에 증발시켜, 유리관의 벽에 ITE 및 지질의 얇은 필름을 침착시켰다. 샘플을 철야로 냉동-건조시켜 임의의 미량의 클로로포름을 제거하였다. 샘플을 와동, 간헐적 가열, 및 초음파처리에 의해 1 ml HBS로 완전히 재수화시켜, 필름을 충분히 용해시켰다. 샘플을 50℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 마이셀을 10,000 g에서 10분 동안 원심분리한 후, 0.22 ㎛ PES 필터를 통해 여과하여 임의의 캡슐화되지 않은 ITE를 제거하였다. 방법 1에서와 같이 마이셀을 크기, 전하 및 ITE 로딩에 대해 특성화하였다.

표 2. TPGS-1000 마이셀 내의 ITE의 캡슐화

표 2에 나타난 바와 같이, 마이셀 크기 (~12.5-17 nm 직경)는 TPGS-1000 농도 또는 ITE 로딩에 따라 유의하게 변화되지 않았지만, TPGS-1000 농도가 증가함에 따라 다분산성이 감소되었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 마이셀에 로딩된 ITE의 양 및 퍼센트 양쪽 모두가 TPGS-1000 농도에 따라 점진적으로 증가되었다. 테스트된 최고 TPGS-1000 농도 (75 mg/mL; 49.6 mM)에서, 703 마이크로그램의 ITE가 로딩되었다 (출발량의 70.3%).

TPGS-1000 마이셀 (크기, ITE 로딩)의 전반적인 특성이 PEG2000-DSPE 마이셀과 유사하였다. 그러나, 상위 TPGS-1000 지질 농도가 임의의 마이셀 제형 중 가장 높은 ITE 로딩을 산출하였고, 분산성이 가장 낮았다.

방법 3: 혼합 마이셀

방법 1 및 2에서 사용된 2개의 지질 (PEG2000-DSPE 및 TPGS-1000)을 다양한 비로 조합하여 혼합 마이셀을 합성하였다. 총 지질 농도는 50 mg/마이셀 mL로 고정하였다. 하기의 PEG2000-DSPE:TPGS-1000 비 (w/w)를 제조하였다: 0.1, 0.25, 0.5, 1, 1.5 및 2. 먼저, 2개의 지질을 칭량하고, 유리관 내의 0.5 mL 클로로포름에 용해시켰다. 다음으로, 1 mg ITE를 클로로포름 용액에 첨가하고, 격렬한 와동, 50℃로의 간헐적 가열, 및 필요한 경우의 초음파처리에 의해 용해시켰다. ITE가 완전히 용해되면, 클로로포름을 실온에서 질소 기체의 기류 하에 증발시키고, 건조된 유리관을 철야로 냉동-건조시켜, 임의의 잔존하는 미량의 클로로포름을 제거하였다. 지질/ITE 필름을 상기와 같이 1.0 mL HBS에 재수화시켰다. 1시간 후, 제제를 10,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 0.22 ㎛ PES 필터를 통해 여과하였다. 상기 기술된 바와 같이 마이셀 특성화를 수행하였다.

하기 표 3에 나타난 바와 같이, 크기 및 분산성은 배치 간에 유의하게 변하지 않았다. TPGS-1000 분율이 더 높을수록 마이셀 내의 ITE 로딩이 더 큰 경향이 있었다. 2개의 가장 높은 로딩 (40.1% 및 37%)이 상위 2개의 TPGS-1000 수준 (배치 1 및 2)에서 달성되었다.

표 3. 혼합 마이셀 내의 ITE의 캡슐화

PEG2000-DSPE 및 TPGS-1000로 구성된 혼합 마이셀은 이들의 단일-지질 대응물과 실질적으로 상이하지 않았다. 그러나, 지질 농도 (50 mg/ml)를 고려하면, 2개 (또는 이를 초과하는 개수)의 지질로 구성된 마이셀이 제약 성질, 예를 들어, 생체내 반감기, 약물 방출 속도, 상이한 세포 구획으로의 약물 방출 (예를 들어, 세포질액 대 엔도솜), 및 수지상 세포의 표면과의 상호작용을 최적화하는 것에서의 융통성 증가를 제공한다.

실시예 2. 마이셀 전달을 사용한 ITE-로딩 리포솜

응집 경향이 있는 분자인 ITE가 수성 용액과의 접촉 시 침전하였기 때문에, 포화 지질 (예를 들어 DMPC:콜레스테롤, 또는 DSPC:콜레스테롤)로 구성된 리포솜 내의 ITE의 캡슐화에서 만족스러운 결과가 산출되지 않았다. 소량의 DMSO (최종 부피의 1% 미만)가 첨가된 경우에도, ITE가 침전되었다. ITE를 용매화시키기 위한 다양한 조치, 예컨대 pH 변동 또는 (ITE에 대한 결합 표면으로서의) 소 혈청 알부민의 첨가를 테스트하였지만, 이러한 방법 중 어느 것도 ITE를 가용화시킬 수 없었다. 이러한 문제를 우회하기 위해, ITE-로딩 마이셀과 미리 형성된 리포솜의 융합이 시도되었다.

마이셀을 실시예 1 (배치 6, 표 1)에서와 같이 제조하였다. 문헌 [Batzri and Korn, Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes 1973, 298(4): 1015-19]에 기술된 바와 같이, 에탄올 주입 방법을 사용하여 DSPC:콜레스테롤 (3:2 w/w)로 리포솜을 제조하였다. 지질을 0.250 mL 에탄올에 용해시켰다. 그 후, 에탄올계 용액을 HEPES 완충 염수, pH 6.5 (2 mL)에 주입하고, 30분 동안 교반하였다. 생성된 다층 소포를 65℃에서 400, 200, 및 100 nm 폴리카르보네이트 필터를 통해 순차적으로 압출하고, PD-10 칼럼에서 정제하였다. 그 후, 리포솜을 65℃에서 지질 농도를 기초로 (PEG:DSPC 12:1) 몰비로 ITE-로딩 PEG-DSPE 마이셀과 혼합하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 리포솜을 실시예 1에서와 같이 크기 및 전하에 대해 분석하였다. 리포솜을 메탄올:아세트산 (99:1 v/v)에 용해시킴으로써 ITE 함량을 측정하였다. 355 나노미터에서의 흡광도를 사용하여 ITE 농도를 정량하였다. 리포솜 내의 ITE의 양을 리포솜을 제조하는 데 사용된 마이셀 내의 ITE의 양으로 나누고, 이러한 분율에 100을 곱하여, 퍼센트 ITE 전달 (즉, 리포솜으로의 ITE의 마이셀 전달의 효율)을 수득하였다.

리포솜 내로의 마이셀 전달 후, 평균 크기가 133.7±34.5 nm인 나노입자의 단일한 집단이 관찰되었고, 이는 전달 절차 후의 임의의 유리 마이셀의 성공적인 제거를 가리킨다. 리포솜의 크기 및 크기 분포가 마이셀 전달 단계에 의해 본질적으로 변화되지 않았다. 마이셀에서 리포솜으로의 ITE 전달의 효율은 97.6%였다. 마이셀 전달 전의 리포솜의 전하는 -4.28 밀리볼트 (mv)였고, 마이셀 첨가 후 -28.2 mv로 감소하였으며, 이는 리포솜 표면 상의 음으로 하전된 PEG의 존재를 가리킨다. 결과가 하기 표 4에서 요약된다.

표 4. 리포솜으로의 ITE의 마이셀 전달의 특성화

주로 포화 지질로 구성된 리포솜 내의 ITE의 캡슐화가 실현가능하다. ITE를 이러한 리포솜 내로 직접적으로 로딩하려고 시도했을 때 관찰된 ITE 침전은 비교적 느린 속도의 지질에 의한 ITE 용매화에 대비된 ITE 자가-회합의 급속한 동역학을 반영할 수 있고, 이는 마이셀 전달을 사용하여 우회될 수 있는 제작 장애물이다.

실시예 3. ITE +/- MOG _35-55 가 로딩된 난 포스파티딜콜린 (PC) 리포솜

ITE가 마이셀 내로, 그리고 마이셀 전달 절차를 통해 리포솜 내로 로딩될 수 있어, 지질 선택에서의 융통성을 제공하는 한편, ITE를 직접적으로 리포솜 내로 로딩하는 방법 또한 장점이 있을 것이다. ITE (질량 기준으로 지질의 1%)가 완전히 포화된 지질 (예를 들어, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린; DMPC 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린; DSPC)로 주로 (>50 질량%) 구성된 리포솜 내로 로딩되는 초기 실험에서 일관되지 않은 ITE 로딩 및 빈번한 ITE 침전이 산출되었다. 난 포스파티딜콜린 (난 PC)은 2개의 지방산이 있는 분자의 비균질 집단으로 이루어지고, 그 중 하나는 이의 물리화학적 성질에 영향을 미치는 불포화 탄소-탄소 이중 결합을 함유한다. 이러한 이유로, 난 PC를 함유하는 리포솜은 포화 지방산 쇄로 제조된 리포솜보다 막 유동성이 더 크고, "더 누출되기 쉬운" 경향이 있다.

30:15:2의 몰비의 난-PC, 콜레스테롤 및 PEG2000-DSPE의 3가지 지질을 사용하여 에탄올 주입에 의해 리포솜을 제조하였다. 지시된 비의 총 92.61 mg의 지질을 칭량하고 (61.61 mg 난-PC, 15.47 mg 콜레스테롤, 및 14.96 mg PEG2000-DSPE), 깨끗한 4 mL 유리 바이알에 첨가하였다. 무수 에탄올 (250 ㎕)을 지질에 첨가하고, 혼합물을 약 5분 동안 소형 자기 교반 막대를 사용하여 37-45℃의 핫 플레이트에서 교반하였다. 혼합물을 핫 플레이트로부터 제거하고, 또 다른 20-30분 동안 교반하였다. 지질이 용해되었으면, DMSO 내의 스톡 용액으로부터 파이펫팅함으로써 ITE를 총 지질 중량의 1%와 등가인 양 (926 ㎍)으로 첨가하였다 (15.34　㎕를 첨가하였다). 최대 DMSO 부피는 출발 에탄올 부피의 8% (이러한 경우 20 ㎕)를 초과하지 않았다. 지질/ITE 혼합물을 15분 동안 또는 ITE가 용해될 때가지 간헐적으로 진탕하면서 35-40℃에서 가열하였다. ITE가 용해되기를 기다리는 동안, 2 mL의 HEPES 완충 염수 용액 (HBS, pH 6.5)을 35-40℃로 가온하였다.

ITE 및 MOG_35-55를 리포솜에 공동-제형화하기 위해, ITE/MOG_35-55 리포솜을 제조하도록 MOG_35-55 (아미노산 서열: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)를 0.05, 0.2, 0.5, 및 1 mg/ml의 농도로 HBS에 용해시켰다.

지질/ITE/에탄올 용액을 교반하면서 미리 가온된 파스퇴르 파이펫으로 가온된 HBS (MOG_35-55가 존재 또는 부재함) 내로 신속하게 옮겼다. 혼합물을 37-45℃에서 30분 동안 교반하였다. 압출기 (미니-익스트루더(Mini-Extruder), 아반티 폴라 리피즈)를 사용하여 리포솜을 약 100 nm 직경의 원하는 크기 범위로 감소시켰다. 리포솜 용액을 가온된 압출기 (35-40℃)에서 순차적으로 400, 200, 및 100 nm 단일 폴리카르보네이트 (PC) 막에 각각 11회 통과시켰다. 압출된 리포솜을 얼음물 배스에 함침시킴으로써 냉각시켰다. 45분 후, 리포솜을 PD-10 칼럼 (세파덱스(Sephadex) G25M, GE 헬스케어(GE Healthcare))을 사용하여 크로마토그래피로 정제하고, 4 mL HBS의 최종 부피로 용출시켰다. 리포솜을 0.2 ㎛ PES 필터를 통해 멸균-여과하고, 4℃에서 HBS에서 보관하였다.

말번 제타사이저를 사용하여 리포솜을 크기, 크기 분포 및 전하에 대해 특성화하였다. 각각 4가지 유형의 리포솜을 포함하는 3개의 리포솜 배치를 제조하였다 (B1, B2, B3): ITE 또는 MOG35-55가 없는 비어있는 (플레인) 리포솜 (약어: PL), ITE가 로딩된 리포솜 (ITE-L), MOG35-55가 로딩된 리포솜 (MOG-L) 및 ITE + MOG35-55가 로딩된 리포솜 (ITE-MOG-L). 하기 표 5에 나타난 바와 같이, 배치 1, 2, 및 3 내의 리포솜의 크기, 크기 분포 및 전하가 꽤 유사하였다. 입자 직경은 90-110 nm 범위였고, ITE-MOG-L에서 작지만 일관된 크기 감소가 있었다. 제타 전위 또한 MOG가 로딩된 리포솜에서 중등도로 덜 음성이었다 (전자의 -20 내지 -24 mV 대 후자의 -25 내지 -32 mV).

표 5. ITE + MOG_35-55 리포솜의 물리적 특성화

페이로드 분자 (ITE, MOG_35-55)의 로딩을 측정하기 위해, 리포솜을 메탄올:아세트산 (99:1 v/v)에 용해시키고, ITE를 실시예 1에 기술된 바와 같이 분광광도측정으로 정량하였다. 마이크로BCA 키트 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 카탈로그 번호 23235) 또는 CBQCA 단백질 정량 키트 (써모피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 C6667)를 사용하여 MOG_35-55 농도를 측정하였다. 표 6에 나타난 바와 같이, ITE 캡슐화가 배치에 걸쳐 일관되었고 (출발 ITE의 17-24%가 캡슐화되었다), MOG35-55의 공동-캡슐화가 ITE 로딩을 방해하지 않았다 (ITE-L에서의 평균 ITE 캡슐화: 19.8%; ITE-MOG-L에서의 평균 ITE 캡슐화: 23.5%).

표 6. ITE + MOG_35-55 리포솜의 ITE 로딩 특성화

배치 1로부터의 리포솜을 1개월 동안 4℃에서 HBS에서 보관하고 다시 분석한 안정성 평가를 수행하였다. 하기 표 7 및 8에 나타난 바와 같이, 1개월 보관 후의 배치 1 리포솜의 재분석에서 물리적 파라미터의 유의한 변화가 드러나지 않았다.

표 7. 보관 시의 배치 1 리포솜의 특성화

표 8. 1개월 보관 후의 배치 1 리포솜의 안정성 평가

캡슐화 효율에 대한 ITE의 출발 농도의 효과를 평가하였고, 결과가 하기 표 9에서 제공된다.

표 9. ITE 캡슐화 효율

결론

ITE를 리포솜 (예를 들어, DSPC, DMPC, 또는 HEPC 및 콜레스테롤을 사용함) 내에 직접접으로 캡슐화하려는 기존의 시도는 ITE 캡슐화의 낮은 효율 (2% 이하)로 인해 성공적이지 않았고, 리포솜 형성 동안 또는 그 직후의 ITE 침전이 종종 동반되었다. 그러나, 난 PC 리포솜의 특성이 ITE (및 MOG_35-55)의 직접적인 제형화를 허용한다. 100 마이크로리터 (즉, 마우스에 대한 전형적인 용량 부피) 당 로딩된 ITE의 양이 치료 역치를 초과한다. 추가로, 난 PC 리포솜은 2-8℃에서 냉장되는 경우에 6개월에 걸쳐 안정적이다.

실시예 4. ITE가 로딩된 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC) 리포솜

적어도 50%의 난 PC로 제조된 리포솜은 난 PC 내의 1개의 불포화 탄소-탄소 이중 결합의 결과로서 포화 인지질로 제조된 리포솜보다 막 유동성이 더 크다. 2개의 불포화 결합이 있는 인지질을 사용하여 제조된 리포솜이 더욱 더 큰 유동성을 나타내고, ITE를 더욱 효율적으로 로딩할지를 결정하기 위해, 각각의 지방산 쇄 내에 단일 불포화 결합이 있는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 리포솜에 사용하였다. 실시예 3에 기술된 방법을 사용하여 30:15:2 몰비의 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 콜레스테롤, 및 PEG2000-DSPE의 3가지 지질을 사용하여 에탄올 주입 방법에 의해 리포솜을 제조하였다.

DOPC 리포솜의 2개의 배치를 ITE를 출발 지질의 0.5% 또는 1.0% (w/w)로 첨가하여 제조하였다. ITE 로딩을 비교하기 위해 병행으로 난 PC 리포솜의 2개의 배치를 제조하였다. 하기 표 10에 나타난 바와 같이, 양쪽 모두의 ITE에서 난 PC 리포솜보다 DOPC 리포솜에 더 많은 ITE가 캡슐화되었다. 0.75% ITE:지질 (w/w)에서, 캡슐화 효율은 난-PC 리포솜에서의 34.1% 대 DOPC 리포솜에서의 51.8%였다. 0.5% ITE:지질 (w/w)에서, 캡슐화 효율은 난-PC 리포솜에서의 54.1% 대 DOPC 리포솜에서의 66.7%였다. 따라서, ITE 로딩에 대한 막 유동성의 긍정적인 영향이 1개의 단일불포화 지방산이 있는 인지질 (총 지질의 >50%를 차지함)의 존재를 넘어서 2개의 단일 불포화 지방산 쇄가 있는 인지질 (총 지질의 >50%를 차지함)의 존재로 확장된다.

표 10. DOPC와 난 PC 사이의 ITE 로딩 비교

난 PC를 불포화 인지질로 하는 후속 실험은 0.5중량% ITE에서의 재현가능한 60-65% ITE 로딩 효율을 나타낸다. 또한, (이전 실험에서의 40 mM에 대비된) 60 또는 65 mM의 지질 농도는 이제 더 큰 리포솜 배치의 생산을 허용한다.

실시예 5. 리포솜 내의 ITE의 캡슐화에 대한 포화 및 불포화 지질의 효과의 비교

이러한 연구의 목적은 규정된 지질 농도 범위 내의 다양한 몰비를 테스트하고, 약물 로딩 및 장기 안정성을 위한 최상의 리포솜 특성을 산출하는 난 PC, 콜레스테롤 및 mPEG2000-PE의 조합을 확인하는 것이었다. 추가로, ITE 캡슐화에 대한 포화 대 불포화 지질을 사용하는 것의 효과를 더 잘 이해하기 위해, 수소화 형태의 난 PC (HEPC) (18:0)를 사용하여 리포솜을 제조하였고, 이는 HEPC 내의 불포화 탄소-탄소 결합의 부재에 의해서만 난 PC와 상이하다 (즉, 난 PC에는 1개의 단일불포화 지방산이 있는 것에 대비하여 HEPC에는 2개의 포화 지방산 쇄가 있다).

연구 디자인:

각각의 지질에 대해 하기 범위로 지질 비가 다양하였다:

난 PC 또는 HEPC: ~53-72 mol%

콜레스테롤: ~25-44 mol%

PEG2000-PE: 1.5 내지 6.25 mol%

ITE는 테스트된 모든 배치의 경우에 총 지질 질량에 대해 0.5 중량%로 고정되었다. ITE는 DMSO 스톡으로부터 첨가되었다. 임의의 침전/응집 징후에 대해 배치를 매일 관찰하였다.

표 11

방법

추가적인 지질의 임의의 효과를 제거하기 위해, 40 mM의 지질 농도를 사용하여 난 PC를 사용하는 표준 조제법 (표 참조)과 동일한 몰비 (HEPC:콜레스테롤:PEG2000PE (3:1.5:0.2))를 사용하여 HEPC 리포솜을 제형화하였다. 난 PC를 사용하여 제조되는 일상적인 배치에 대한 것처럼 ITE를 0.5% w/w로 로딩하였다. LIPEX 압출기를 사용하여 HEPC 리포솜을 제조하였다 (3 mL, 40 mM). 압출 후, 폴리카르보네이트 막을 압출 동안의 ITE 침전에 대해 점검하였다.

관찰

압출이 순조롭게 진행되었음에도 불구하고, 대부분의 ITE가 폴리카르보네이트 막 상에 침전되는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 본 발명가들이 이전에 DSPC 및 DMPC로 관찰한 것과 일관되었다. 동일한 방식으로 제조된 난 PC 배치에서, 60 및 65 mM의 지질 농도를 사용한 경우에도, ITE 침전의 증거가 없었다. 압출 후, HEPC 리포솜을 PD-10 정제 단계에 적용하고, 최종적으로 0.22 ㎛ PES 필터로 여과하였다. 최종 여과 단계에서, HEPC 리포솜을 사용하는 경우에 ITE가 필터 상에 침전되는 것으로 확인되었다. 또 다시, 이는 0.5% ITE (w/w)의 난 PC 리포솜에서는 발생하지 않았다. 최종적으로, HEPC 리포솜 내의 ITE 로딩을 측정하였다. 난 PC 배치는 일상적으로 약 60% ITE 로딩을 나타내는 반면, HEPC 리포솜은 2.37%에 불과한 ITE 로딩을 나타냈다. 표 11은 결과 요약을 나타낸다.

표 12. 리포솜 내의 ITE 캡슐화에 대한 포화 및 불포화 지질의 효과

콜레스테롤의 효과

콜레스테롤의 몰비가 ITE 로딩 효율에 영향을 미친다. 하기 표는 표 11의 9개의 리포솜 배치의 콜레스테롤 및 난 PC 농도 (퍼센트로 표현된 몰비)를 나타낸다.

표 13: 각각의 성분의 최고 몰%에서 최저 몰%로 순위가 매겨진 배치

결과

표 14: 배치의 특성화 데이터 (크기, PDI, 제타 전위 및 약물 로딩)

표 14 및 도 1b에 나타난 바와 같이, 약물 로딩이 콜레스테롤 몰 퍼센트가 30% - 32%인 리포솜 배치에서 가장 높고, 콜레스테롤 몰 퍼센트 (43.86%)가 가장 높은 배치 CL-1에서 가장 낮았고, 콜레스테롤 몰 퍼센트 (38.17%)가 두번째로 높은 배치 CL-7에서 두번째로 낮았다. ITE가 이러한 리포솜 배치들 양쪽 모두로부터 1주 이내에 침전되었다. ITE가 침전된 세번째 배치는 36% 콜레스테롤 몰비의 CL-4였다. 이러한 배치에서 ITE 로딩이 비교적 효율적이었지만, 높은 콜레스테롤이 리포솜 안정성을 제한한다. 가장 효율적인 ITE 로딩이 30.07% 콜레스테롤의 배치 CL-3에서 관찰되었고, 이는 또한 1개월 이상 (관찰 한계) 동안 안정적이었다.

결론

표 11에 요약된 관찰로부터 명백한 바와 같이, 포화 지질은 리포솜 내의 ITE의 캡슐화에 불리하다. 제형 내의 다른 지질의 비 및 상대적인 양이 동일하게 유지되는 경우, 포화 지질이 효율적이고 안정적인 ITE 캡슐화에 바람직하다.

추가적으로, 30% 콜레스테롤 몰비에 가깝게 최적의 결과가 관찰되면서, 콜레스테롤 농도가 ITE 로딩 효율에 영향을 미친다.

실시예 6. ITE가 로딩된 리포솜이 시험관내에서 수지상 세포에서의 아릴 탄화수소 수용체 (AHR)-조절 유전자의 발현을 유도한다

수지상 세포 (DC)를 CD11c에 대한 항체로 코팅된 자기 비드 (범-DC 단리 키트, 밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 사용하여 건강한 C57Bl/6J 마우스의 전체 비장 세포 집단으로부터 단리하였다. DC를 계수하고, 플라스틱 조직 배양 웰에 웰 당 100,000-200,000개의 세포로 플레이팅하였다. 리포솜 (비어있는 또는 ITE-로딩 리포솜), 또는 유리 ITE를 1 nM ITE의 농도로 DC에 첨가하고, 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, DC를 용해시키고, mRNA를 단리하고, AHR-조절 유전자인 Cyp1a1 및 Cyp1b1의 발현을 RT-PCR로 측정하였다. 데이터는 6개의 샘플의 평균 ± SEM을 나타낸다. 난 PC ITE 로딩 리포솜의 결과가 도 3에서 제시된다.

실시예 7. 펩티드가 로딩된 리포솜이 시험관내에서 T 세포 증식을 유도한다

비장세포를 MOG_35-55에 대해 특이적인 트랜스제닉 2D2 T 세포 레퍼토리 (TCR)를 발현하는 2D2 마우스로부터 수확하고, 시험관내에서 유리 상태로 전달되거나 (유리 MOG), 난-PC 리포솜 단독에 로딩되어 전달되거나 (MOG-L), 또는 난-PC 리포솜에 로딩되고, 추가적으로 ITE-로딩 난-PC 리포솜 (1 ㎍ ITE의 용량)으로 자극되어 전달되는 10 ㎍의 MOG로 자극하였다. 셀 타이터 블루(Cell Titer Blue) 세포 증식 검정법을 사용하여 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한 후 세포 증식을 평가하였다. 데이터는 4개의 샘플의 평균 ± SEM을 나타낸다. 결과가 도 4에서 제시된다. 유리 MOG 또는 MOG-단독 리포솜으로 자극된 비장세포가 2D2 세포 증식을 유도하였고, 이는 T 세포로의 MOG 펩티드 제시를 가리킨다. MOG 리포솜 및 ITE 리포솜과 함께 인큐베이션된 2D2 비장세포는 T 세포 증식을 유도하지 않았고, 이는 ITE가 증식성 T 세포 반응을 억제할 수 있다는 것을 가리킨다.

실시예 8. 면역관용성 리포솜으로의 실험적 자가면역 뇌척수염의 치료

실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)은 광범위한 자가면역 장애와 다수의 병원성 토대를 공유하는, 다발 경화증의 마우스 모델이다. 본 실시예는 본 발명의 나노미립자 리포솜으로의 EAE의 치료를 예시하고, "결론" 섹션에서 논의된 바와 같이, 본 발명이 CD4 T 이펙터 세포의 억제 및 조절 T 세포 (Treg) 및 Tr1 세포의 유도를 특징으로 하는 면역 관용을 생성시키는 것에 의해 공지된 기술에 비교하여 질환 진행에 대한 뜻밖의 효능을 제공한다는 것을 밝힌다.

방법

완전 프로인트 아주반트 (CFA) 내의 200 ㎍ MOG_35-55를 피하 주사함으로써 C57BL/6 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)을 유도하였다. 추가적으로, 200 ng의 백일해 독소 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 제0일 및 제2일에 복막내로 (i.p.) 투여하였다.

헤페스 완충제에 현탁된 난-PC 리포솜 (비어있음, ITE-로딩, 또는 ITE + MOG_35-55-로딩)을 마우스 5마리의 군에 제7일에 150 ㎕로 정맥 내로 (안와 후방에) 투여하였다. 용량 당 7 ㎍의 ITE가 전달되도록 ITE 및 ITE+MOG 로딩 리포솜을 투여하였고, ITE+MOG 로딩 리포솜은 4 ㎍의 MOG_35-55 펩티드를 함유하였다. 제10일에 시작하여 실험 마지막 날인 제24일까지 계속하여 마우스를 EAE의 임상 징후에 대해 매일 모니터링하였다. EAE를 하기와 같이 채점하였다: 0, 질환 징후 없음; 1, 꼬리 긴장 상실; 2, 뒷다리 불완전마비; 3, 뒷다리 마비; 4, 사지마비; 및 5, 빈사 상태. 평균 점수 및 평균의 표준 오차를 마우스 5마리의 각각의 군에 대해 계산하였다. 실험 마지막에, 뇌, 림프절 및 비장을 최근에 안락사된 마우스로부터 수확하고 (달리 언급되지 않는 한 각각의 군으로부터의 모든 마우스를 분석하였다), 3가지 상이한 리포솜 제형의 면역학적 효과를 평가하기 위해 하기의 실험을 수행하였다:

(i) 비장을 단일 세포 현탁액으로 해리시키고, 1, 10, 또는 100 ㎍/mL의 농도의 MOG_35-55 펩티드로 자극하여, 면역학적 회상을 측정하였다. MTT 세포 증식 검정법을 사용하여 72시간 후에 세포 증식을 측정하였다.

(ii) 뇌 및 척수를 수확하고, 단일 세포 현탁액으로 해리시켰다. CD4+ T 세포를 자기 비드를 사용하여 단리하고, 투과화 및 고정시키고, 인터루킨 17 (IL-17) 및 인터페론 감마 (IFNγ)에 대한 항체로 염색하고, 유동 세포측정법으로 분석하였다. 군 당 4-5마리의 마우스로부터의 세포를 분석하였다.

(iii) 상기 (ii)로부터의 뇌 및 척수-유래 CD4+ T 세포를 MOG_35-55-특이적 사량체 (MOG_35-55가 로딩된 다량체화 MHCII 단백질) 및 FoxP3, CD25, Lag3 및 CD49b에 대한 항체로 염색하고, 유동 세포측정법으로 분석하였다. 군 당 4-5마리의 마우스로부터의 세포를 분석하였다.

결과

도 5에 나타난 바와 같이, 비어있는 리포솜 (플레인-L)로 처리된 마우스에 비교하여, ITE 리포솜 단독으로의 처리는 미미한 효과만을 나타낸 반면, ITE+MOG 리포솜으로의 처리는 EAE 증상을 유의하게 호전시켰다. ITE 및 MOG_35-55-로딩 리포솜으로 처리된 마우스에서의 적응 면역 세포의 관용을 확인하기 위해, 비장 및 림프절로부터의 림프구를 수확하고, 생체외에서 MOG_35-55 펩티드로 다시 자극하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, ITE 및 MOG_35-55-로딩 리포솜으로 처리된 마우스로부터 수확된 비장세포가 대조군 리포솜으로 처리된 마우스로부터의 림프구보다 덜 증식하였다.

ITE 및 MOG_35-55-로딩 리포솜이 림프구 프로파일을 이펙터에서 조절 표현형으로 빗나가게 했는지 여부를 해명하기 위해 다양한 조직으로부터의 림프구의 표현형을 평가하였다. ITE 및 MOG_35-55-로딩 리포솜으로 처리된 마우스가 비어있는 리포솜으로 처리된 마우스 및 ITE-로딩 리포솜으로 처리된 마우스에 비교하여 이펙터 IL-17⁺ 및IFNγ⁺ T 세포의 CNS 내로의 침윤의 유의한 감소를 나타냈다 (도 7a 및 7b). 추가로, ITE 및 MOG_35-55-로딩 리포솜으로 처리된 마우스는 뇌 및 척수에서의 항원-특이적 FoxP3⁺ 조절 T 세포 및 FoxP3^- Tr1 조절 T 세포의 확장을 나타냈다.

결론

ITE 및 MOG_35-55가 로딩된 리포솜이 중추신경계에서의 이펙터 T 세포 침윤의 억제 및 T 조절 세포의 확장과 연관되어 마우스에서 EAE 증상을 호전시켰다. 리포솜 내의 ITE의 캡슐화가 이전에 기술된 금 나노입자보다 실질적으로 더 강력하였다. 문헌 [Yeste et al. (PNAS 2012)]에서 EAE를 치료하기 위해 ITE 및 MOG_35-55-로딩 금 나노입자가 사용되었다. 또한, 문헌 [Quintana et al. (PNAS 2010)]은 본원에서 사용된 것보다 28배 더 높은 용량인 마우스 당 200 ㎍의 ITE의 매일 투여 (복막내 또는 경구)에 의해 동일한 마우스 모델에서 EAE가 호전되었음을 나타냈다. 마지막으로, 문헌 [Quintana et al. (Nature 2008)]은 가장 강력한 공지된 AHR 효능제인 2,3,7,8-테트라클로로디벤조-p-디옥신 (TCDD)이 1 ㎍의 용량에서 EAE를 호전시켰지만, 100 ng에서는 그렇지 않았음을 나타냈다. ITE를 TCDD에 비교하는 대부분의 생체내 연구에서, 후자가 ~1,000배 더 강력하다. 따라서, 제형화되지 않은 TCDD에 대비하여 리포솜 ITE의 ~10배 더 큰 효능이 또한 놀랍고, 본 발명의 리포솜 제형의 효능을 강조한다.

실시예 9. 면역관용성 나노입자의 투여에 의한 마우스에서의 콜라겐-유도 관절염의 예방.

콜라겐-유도 관절염은 이의 단순성 및 재현성으로 인해 널리 사용되는, 인간 류머티스성 관절염의 동물 모델이다. 동물을 II형 콜라겐 (CII) (정상적으로 관절 연골에서 발현됨)으로 면역화시킨다 (하기 기술된 실험에서는 소 CII가 사용되었다). 이러한 모델은 인간 류머티스성 관절염을 특징짓는 다수의 선천 및 적응 면역 메커니즘을 개괄하고, 후속적으로 인간 요법으로 개발되는 치료 (예컨대 종양 괴사 인자 항체)를 테스트하는 데 사용되었다.

방법

관절염의 질환 예방 모델을 C57/Bl6 마우스에서 3단계로 유도하였다. 제0일에, 피하 (s.c.) 투여된 완전 프로인트 아주반트 내의 소 CII (bCII)로 마우스를 면역화시켰다. 불완전 프로인트 아주반트에 현탁된 bCII로의 2차 s.c. 면역화가 제21일에 이어졌고, 제24일에 지질다당류 (25 마이크로그램)를 복막내 주사를 통해 투여하였다. 관절염의 질환 요법 모델을 C57/Bl6 마우스에서 2단계로 유도하였다. 제0일에 피하 (s.c.) 투여된 완전 프로인트 아주반트 내의 소 CII (bCII)로 마우스를 면역화시켰다. 불완전 프로인트 아주반트에 현탁된 bCII로의 2차 s.c. 면역화가 제21일에 이어졌다.

(달리 언급되지 않는 한) 마우스 8-10마리의 군 4개에 플레인 리포솜, bCII만 로딩된 리포솜, ITE만 로딩된 리포솜, 및 ITE 및 bCII가 로딩된 리포솜 (군 E)을 꼬리 정맥을 통해 주 당 2회로 투약하였다. 나이브 마우스는 CII로 면역화하지 않았고, 처리를 제공하지 않았다. 제-1일에 (질환 예방 실험), 또는 제30일-제35일에, 20% 내지 30%의 마우스에서 관절염이 발달된 후에 (질환 요법 실험), 처리를 시작하였다.

질환의 존재 (군 당 발생률) 및 누적 질환 점수에 대해 마우스를 매일 평가하였다. 처음 3주 동안은 주 1회, 그 후에는 제24일에 시작하여 주 2회로 마우스를 칭량하였다. 발 두께를 주 2회 측정하였다. 양쪽 실험에서 동일한 척도를 수집하였다.

질환 예방 실험에서는 마우스를 제46일에 안락사시키고, 질환 치료 실험에서는 마우스를 제88일에 안락사시켰다. 혈액 내의 항-CII 항체의 역가, 관절에서의 FoxP3 발현 수준, 및 CII 펩티드를 검출하는 Tr1 (T 조절) 세포의 수 (CII 사량체 및 Tr1 마커에 대한 조합 염색에 의해 측정됨)를 포함하는 조직병리학 및 면역학적 분석을 위해 혈액, 림프절, 비장 및 관절을 수확하였다.

군 간의 통계적으로 유의한 차이 (일원 ANOVA를 기초로 함)가 별표로 표시된다. 1개의 별표는 P <0.05 수준의 유의성을 가리킨다. 2개의 별표는 P <0.01 수준의 유의성을 가리키고, 3개의 별표는 P <0.001 수준의 유의성을 가리킨다.

결과

질환 예방 모델에서, ITE 및 CII가 로딩된 리포솜으로 처리된 마우스가 최소 누적 점수 및 관절염 사지의 수를 경험하였다 (모든 측정 간격에서 통계적으로 유의함) (도 9a 및 9b). ITE 및 CII가 로딩된 리포솜으로 처리된 마우스는 또한 다른 처리 군보다 더 낮은 IgG2a 항체 역가 (도 10a), 및 관절 내의 FoxP3 및 IL10 mRNA의 발현 증가 (도 10b 및 10c)를 나타냈다. CII-반응성 이펙터 CD4⁺ T 세포의 빈도 또한 비어있는 리포솜에 비교하여 ITE 및 CII가 로딩된 리포솜으로 처리된 마우스의 비장에서 감소되었다 (도 10d).

요법 모델에서, 처리는 마우스의 20-30%에서 관절염이 발달된 후에 시작되었다. 예방 모델과 같이, ITE 및 CII가 로딩된 리포솜으로의 처리가 진행 중인 콜라겐-유도 관절염을 호전시킨다. 구체적으로, ITE 및 CII가 로딩된 리포솜으로 처리된 마우스가 더 낮은 누적 중증도 점수 (도 11a), 관절염 사지의 수 (도 11b) 및 평균 발 두께 (도 11c)를 나타냈다. ITE 및 CII가 로딩된 리포솜으로 처리된 마우스는 또한 다른 처리 군보다 더 낮은 IgG2a 및 IgG2b 항체 역가를 나타냈다 (도 12a 및 12b).

결론

ITE 및 CII가 로딩된 리포솜이 콜라겐-유도 관절염의 질환 예방 및 요법 모델에서 효과적이었다. 작용 메커니즘은 T 조절 세포의 자극, T 이펙터 세포 및 자가항체 수준의 억제를 수반하였다.

기타 실시양태

본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 독립적인 간행물 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로, 그리고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

본 발명이 이의 구체적인 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 이는 추가의 변형이 가능하고, 본 출원이 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고, 본 발명이 속하는 기술 분야 내의 공지된 또는 관례적인 관행 내에 속하고 이전에 기재된 본질적인 특색에 적용될 수 있는 본 개시내용으로부터의 변경을 포함하는 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 개조를 포함하도록 의도되며, 청구범위의 범주에서 이어진다는 것이 이해될 것이다.

기타 실시양태는 청구범위 내에 속한다.

SEQUENCE LISTING <110> AnTolRx <120> TOLEROGENIC LIPOSOMES AND METHODS OF USE THEREOF <130> 51172-002WO3 <150> US 62/755,946 <151> 2018-11-05 <150> US 62/635,376 <151> 2018-02-26 <160> 81 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Citrulline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Citrulline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is Citrulline <400> 1 Xaa Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Xaa Ala Xaa 1 5 10 15 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Citrulline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Citrulline <400> 2 Ala Xaa Gly Leu Thr Gly Xaa Pro Gly Asp Ala Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Citrulline 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Claims

50 내지 250 나노미터 (nm)의 평균 직경을 갖는 리포솜들의 집단을 포함하고, 여기서 리포솜 집단이
(i) 0.3 이상의 평균 탈포화 지수; 및
(ii) 리포솜 당 평균 200-15,000개의 분자의 2-(1H-인돌-3-일카르보닐)-4-티아졸카르복실산 메틸 에스테르 (ITE), 또는 그의 염
을 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 리포솜 집단이 포화 지질 종, 불포화 지질 종, 및 콜레스테롤을 포함하는 지질 혼합물을 포함하고, 여기서 불포화 지질 종이 불포화 결합을 포함하고 지질 혼합물의 적어도 50%를 차지하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 불포화 지질 종이 2개의 지질 꼬리를 포함하고, 여기서 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리가 적어도 1개의 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포화 지질 종이 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)에 접합된 것인 조성물.
제4항에 있어서, 포화 지질 종이 PEG2000-DSPE인 조성물.
제5항에 있어서, PEG2000-DSPE가 적어도 20개의 (에틸렌 글리콜) 단위의 길이를 갖는 PEG 쇄를 포함하는 것인 조성물.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리가 단일 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리가 다중 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 지질 혼합물의 26% 내지 34%가 콜레스테롤인 조성물.
50 내지 250 nm의 평균 직경을 갖는 리포솜들의 집단을 포함하고, 여기서 리포솜 집단이
(i) 26% 내지 34%가 콜레스테롤인 지질 혼합물; 및
(ii) 리포솜 당 평균 200-15,000개의 분자의 ITE, 또는 그의 염
을 포함하는 것인 조성물.
제10항에 있어서, 리포솜 집단이 0.3 이상의 평균 탈포화 지수를 포함하는 것인 조성물.
제10항 또는 제11항에 있어서, 리포솜 집단이 포화 지질 종 및 불포화 지질 종을 포함하는 지질 혼합물을 포함하고, 여기서 불포화 지질 종이 불포화 결합을 포함하고 지질 혼합물의 적어도 50%를 차지하는 것인 조성물.
제12항에 있어서, 불포화 지질 종이
(i) 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리가 적어도 1개의 불포화 결합을 포함하는 2개의 지질 꼬리; 또는
(ii) 지질 꼬리가 적어도 1개의 불포화 결합을 포함하는 1개의 지질 꼬리
를 포함하는 것인 조성물.
제13항에 있어서, 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리가 단일 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제13항에 있어서, 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리가 다중 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 포화 지질 종이 PEG에 접합된 것인 조성물.
제16항에 있어서, 포화 지질 종이 PEG2000-DSPE인 조성물.
50 내지 250 nm의 평균 직경을 갖는 리포솜들의 집단을 포함하고, 여기서 리포솜 집단이
(i) 포화 지질 종, 불포화 지질 종, 및 콜레스테롤을 포함하고, 여기서 불포화 지질 종이 불포화 결합을 포함하고 지질 혼합물의 적어도 50%를 차지하는 것인 지질 혼합물; 및
(ii) 리포솜 당 평균 200-15,000개의 분자의 ITE, 또는 그의 염
을 포함하는 것인 조성물.
제18항에 있어서, 콜레스테롤이 지질 혼합물의 26% 내지 34%를 구성하는 것인 조성물.
제18항 또는 제19항에 있어서, 리포솜 집단이 0.3 이상의 평균 탈포화 지수를 포함하는 것인 조성물.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 불포화 지질 종이 2개의 지질 꼬리를 포함하고, 여기서 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리가 적어도 1개의 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제21항에 있어서, 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리가 단일 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제21항에 있어서, 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리가 다중 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 포화 지질 종이 PEG에 접합된 것인 조성물.
제24항에 있어서, 포화 지질 종이 PEG2000-DSPE인 조성물.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 불포화 지질 종이 1개의 지질 꼬리를 포함하고, 여기서 지질 꼬리가 적어도 1개의 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜 집단이 1:10 내지 100:1의 항원-대-ITE의 질량비로 항원을 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜 집단이 1:200 내지 25:1의 항원-대-ITE의 몰비로 펩티드 항원을 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜 집단이 1:5000 내지 4:1의 항원-대-ITE의 몰비로 단백질 항원을 추가로 포함하는 것인 조성물.
50 내지 250 나노미터 (nm)의 평균 직경을 갖는 리포솜들의 집단을 포함하고, 여기서 리포솜 집단이
(i) 리포솜 당 평균 200-15,000개의 분자의 ITE, 또는 그의 염, 및
(ii) 1:10 내지 100:1의 항원-대-ITE의 질량비의 항원
을 포함하는 것인 조성물.
제30항에 있어서, 리포솜 집단이 0.3 이상의 평균 탈포화 지수를 포함하는 것인 조성물.
제30항 또는 제31항에 있어서, 리포솜 집단이 콜레스테롤 몰 분율이 26% 내지 34%인 지질 혼합물을 포함하는 것인 조성물.
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜 집단이 포화 지질 종 및 불포화 지질 종을 포함하는 지질 혼합물을 포함하고, 여기서 불포화 지질 종이 불포화 결합을 포함하고 지질 혼합물의 적어도 50%를 차지하는 것인 조성물.
제33항에 있어서, 불포화 지질 종이 2개의 지질 꼬리를 포함하고, 여기서 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리가 적어도 1개의 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제34항에 있어서, 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리가 단일 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제34항에 있어서, 한쪽 또는 양쪽 지질 꼬리가 다중 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 불포화 지질 종이 1개의 지질 꼬리를 포함하고, 여기서 지질 꼬리가 적어도 1개의 불포화 결합을 포함하는 것인 조성물.
제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 포화 지질 종이 PEG에 접합된 것인 조성물.
제38항에 있어서, 포화 지질 종이 PEG2000-DSPE인 조성물.
제27항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 서열식별번호: 1-81로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 항원인 조성물.
제27항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 자가면역 장애와 연관된 것인 조성물.
제41항에 있어서, 자가면역 장애가 류머티스성 관절염, 다발 경화증, I형 당뇨병, 중증 근무력증, 크론병, 궤양성 결장염, 및 복강 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제27항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 치료 단백질 또는 그의 일부분인 조성물.
제27항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 바이러스 유전자 요법 벡터의 표면 성분인 조성물.
제44항에 있어서, 항원이 아데노바이러스-연관 바이러스 (AAV) 캡시드, 캡시드 단백질, 또는 그의 펩티드 단편인 조성물.
제27항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 치료제를 포함하고, 여기서 치료제가
(i) 치료 단백질 또는 펩티드;
(ii) 바이러스 또는 캡시드 단백질 또는 펩티드; 및/또는
(iii) (i) 및/또는 (ii)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
인 조성물.
제45항 또는 제46항에 있어서, AAV가 DNA를 포함하는 조성물.
제47항에 있어서, DNA가 단일 가닥 DNA (ssDNA)인 조성물.
제48항에 있어서, ssDNA가 cDNA 또는 그의 단편을 코딩하는 것인 조성물.
제49항에 있어서, ssDNA가 인간 cDNA 또는 그의 단편을 코딩하는 것인 조성물.
제45항 또는 제46항에 있어서, AAV가 RNA를 포함하는 것인 조성물.
제51항에 있어서, RNA가 마이크로RNA (miRNA)인 조성물.
제27항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 치료 단백질인 조성물.
제53항에 있어서, 치료 단백질이 항체 또는 그의 단편인 조성물.
제54항에 있어서, 치료 단백질이 IgG1, IgG2, IgG4, 단일쇄 가변 단편 (scFv) 또는 그의 단편을 포함하는 것인 조성물.
제55항에 있어서, 치료 단백질이 IgG1/κ 또는 그의 단편인 조성물.
제55항에 있어서, 치료 단백질이 IgG2/κ 또는 그의 단편인 조성물.
제55항에 있어서, 치료 단백질이 IgG4/κ 또는 그의 단편인 조성물.
제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 단백질이 이중특이적 항체 또는 그의 단편인 조성물.
제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 단백질이 키메라 항체 또는 그의 단편인 조성물.
제60항에 있어서, 치료 단백질이 인플릭시맙, 오빌톡삭시맙, 실툭시맙, 브렌툭시맙, 세툭시맙, 바실릭시맙, 리툭시맙, 및 압식시맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 단백질이 인간화 항체 또는 그의 단편인 조성물.
제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 단백질이 뮤린 항체 또는 그의 단편인 조성물.
제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜 집단이 -10 내지 -50 mv의 평균 제타 전위를 갖는 것인 조성물.
자가면역 장애에 걸린 대상체에게 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 장애에 걸린 대상체를 치료하는 방법.
제65항에 있어서, 투여가 정맥내, 피하, 피내, 경피, 관절내, 폐, 또는 점막 투여인 방법.
제65항 또는 제66항에 있어서, 투여되는 조성물의 용량이 50 ㎍ 내지 15 mg ITE를 포함하는 것인 방법.
제67항에 있어서, 투여되는 조성물의 용량이 500 ㎍ 내지 10 mg ITE를 포함하는 것인 방법.
제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 장애가 류머티스성 관절염, 다발 경화증, I형 당뇨병, 중증 근무력증, 염증성 장 질환, 및 복강 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제69항에 있어서, 자가면역 장애가 류머티스성 관절염인 방법.
(i) 2개 이상의 지질 종을 혼합하여,
(a) 0.3 이상의 평균 탈포화 지수;
(b) 26% 내지 34%의 콜레스테롤 몰 분율; 및/또는
(c) 포화 지질 종, 및 불포화 결합을 포함하고 지질 혼합물의 적어도 50%를 차지하는 불포화 지질 종
을 포함하는 지질 혼합물을 형성시키는 단계;
(ii) ITE를 지질 혼합물에 첨가하는 단계이며, 여기서 ITE가 용매에 용해되고, 지질의 0.4 질량% 내지 0.7 질량%의 양으로 지질 혼합물에 첨가되는 것인 단계;
(iii) ITE를 함유하는 지질 혼합물을 에탄올계 용액에 용해시키고, 이를 수성 상에 첨가하여, 조질 리포솜을 형성시키는 단계; 및
(iv) 조질 리포솜을 2개 이상의 필터를 통해 압출하고, 이에 의해 면역관용성 리포솜의 집단을 합성하는 단계
를 포함하는, 면역관용성 리포솜의 집단을 합성하는 방법.
제71항에 있어서, 면역관용성 리포솜의 집단이 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 조성물인 방법.
제71항 또는 제72항에 있어서, 지질 혼합물에 첨가하기 전에 ITE가 용해되는 용매가 DMSO이고, 지질 혼합물 및 ITE가 용해되는 용매가 적어도 50%의 에탄올인 방법.
제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 에탄올계 용액 내의 지질 혼합물의 최종 지질 농도가 40 밀리몰 내지 80 밀리몰인 방법.
제74항에 있어서, 수성 상이 항원을 포함하는 것인 방법.
치료제로 치료될 대상체에게 제43항 내지 제64항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에서 치료제에 대한 면역원성을 감소시키는 데 충분한 양으로 투여하고, 이에 의해 간섭 면역 반응의 위험을 감소시키는 것을 포함하는, 치료제로 치료될 대상체에서 간섭 면역 반응의 위험을 감소시키는 방법.