KR20200131867A - 항-cd33 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD33에 대한 항원 특이성을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CAR과 관련된 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 및 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유동물에서 암의 존재를 검출하는 방법, 및 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-CD33 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
관련 출원의 상호참조
본원은 2018년 3월 14일자 출원된 미국 가출원 제62/643,015호(이의 전체내용은 본원에 참고로 혼입됨)를 우선권 주장한다.
연방 지원된 연구 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원, 국립 암 연구소에 의해 ZIA BC 011565의 프로젝트 번호 하에서 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
전자적으로 제출된 자료의 참고도입
본원과 동시에 제출되고 다음과 같이 식별된 컴퓨터-판독가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 그의 전체가 본원에 참고로 혼입된다: 2019년 3월 14일자의 "741580_ST25.txt"라는 명칭의 69,707 바이트 ASCII(텍스트) 파일.
급성 골수성 백혈병은 소아 및 청년 및 젊은 성년(AYA)에서 발생하는 두 번째로 흔한 백혈병을 나타내는 매우 공격적인 급성 백혈병이다. 치유하기 위해 다중-제제 화학요법의 집중 사이클 및 동종이계 공여자 줄기 세포 이식과 자주 통합되는 현재의 치료 섭생법에도 불구하고, AML이 있는 소아 및 AYA의 60%만이 장기적인 완화를 달성할 것이다. 관해율을 높이고 재발을 줄이고 전반적인 생존율을 높이기 위해서는 새로운 치료 전략이 필요하다.
본 발명의 양태는 CD33에 특이적인 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 본 발명의 다른 양태는 본원에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CAR 구축물을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명의 CAR 구축물과 관련된 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 및 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 포유동물에서 암의 존재를 검출하는 방법 및 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
도 1a 및 1b는 본 발명의 특정 CAR 양태의 다이어그램을 제공한다. Mylo: 마일로타르그(Mylotarg), 인간 CD33을 표적으로 하는 인간화된 항체 hP67.6. M195: 살아있는 인간 백혈병 골수모세포로 면역화된 마우스로부터 인간 CD33을 표적으로 하는 인간화된 단일클론 뮤린 IgG2a 항체(M195). Hu195: 인간 CD33을 표적으로 하는 인간화된 항체.
도 2a 내지 2f는 CAR의 형질도입 효율을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 3a 및 3b는 백혈병 세포에서 CD33 및 CD123 표적 항원 발현(형광 강도로 표시됨)의 유세포분석을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 4a 내지 4f는 시험관내 자극 후 CD33 및 CD123 CAR T 세포에 의한 사이토카인 생산을 보여주는 그래프를 제공한다. CD33 또는 CD123 CAR 형질도입된 T 세포를 도면에 표시된 바와 같이 표적 백혈병 세포와 함께 항온처리하였다. ELISA에 의해 상청액의 인터페론 감마 또는 IL-2 수준을 검출하였다.
도 5a 내지 5c는 인큐사이트(IncuCyte) 사멸 검정의 그래프를 제공한다. CD33 CAR 형질도입된 T 세포는 도면에 표시된 바와 같이 표적 백혈병 세포와 함께 항온처리되었다. 원래 평판배양된 세포와 비교하여 살아있는 백혈병 세포의 차이를 도표화하였다.
도 5d 및 5e는 인큐사이트 사멸 검정의 그래프를 제공한다. CD123 CAR 형질도입된 T 세포는 도면에 표시된 바와 같이 표적 백혈병 세포와 함께 항온처리되었다. 살아있는 백혈병 세포의 차이는 종양 전용 대조군으로 정규화되었다. 5d: MOLM14 세포의 살해. 5e: THP1 세포의 살해.
도 6a 내지 6e는 도시된 바와 같이 생체 내에서 상이한 처리로 백혈병 진행을 추적하는 데 사용된 생물발광 이미지를 나타낸다. 항-CD19 CAR은 CD33 항원에 대해 비특이적이다.
도 7a는 생체 내에서 상이한 처리로 백혈병 진행을 추적하는 데 사용되는 생물발광 이미지를 도시한다. 100만개의 PDX 백혈병 세포 JMM117이 -7일에 NSG 마우스에 주사되었다. 마우스는 7일에 CAR T 세포로 처리되었다.
도 7b 및 7c는 2주차에 비장에서 (도 7b) 인간 AML JMML117 세포 및 (도 7c) CD33 CAR T 세포를 보여주는 그래프이다. 두 도면의 수는 도 7b의 범례에 제시된다.
도 8은 백혈병 세포에서 CD33 표적 항원 발현(형광 강도로 표시됨)의 유세포분석을 보여주는 그래프이다. 약어는 실시예 2에 기술된 바와 같다.
도 9a 및 9b는 시험관내 자극 후 CD33Hu195-CD28Z CAR T 세포에 의한 사이토카인 생산을 보여주는 막대 그래프이다. CD33Hu195-CD28Z CAR-형질도입된 T 세포를 16시간 동안 도면에 표시된 바와 같이 표적 백혈병 세포와 함께 항온처리하였다. ELISA에 의해 상청액의 인터페론 감마 또는 IL-2 수준을 검출하였다.
도 10은 도시된 바와 같이 생체 내에서 상이한 처리로 백혈병 진행을 추적하는 데 사용된 생물발광 이미지를 제공한다. MOLM14의 100만 백혈병 세포가 -7일에 NSG 마우스에 주사되었다. 마우스를 식염수로 처리하거나, 처리하지 않거나, 7일 후에 CAR T 세포로 처리하였다(이미지 컬럼 위에 나열된 세포 수). 더 어두운 영역은 더 큰 종양 부담을 나타낸다. "스케일"은 값의 표시 범위를 기반으로 하는 형광 강도와 관련된다(범위가 낮은 값에 위치되는 경우, 형광 강도는 매우 높게 보이지만, 범위가 높은 값에 위치되는 경우, 강도가 어둡게 보임.
도 11a 및 11b: CD33Hu195-CD28z 임상 벡터의 검증. 도 11a: 비오티닐화된 인간 시그렉(Siglec)-3을 사용한 CD33 CAR 발현 검출. 도 11b: 생체 내에서 다양한 처리로 백혈병 진행을 추적하는 데 사용되는 생물발광 이미지. 100만개의 백혈병 세포 MOLM14가 0일에 NSG 마우스에 주사되었다. 마우스는 3일에 5E6 CAR T 세포로 처리되었다.
도 12a 내지 12c: 세포 대사에 대한 CAR 공-자극 도메인의 효과. CD33.2-28z 및 CD33.2-BBz CAR T 세포를 MOML14와 함께 항온처리하고, 7일 후 시호스(Seahorse) 기계를 사용하여 대사 기능에 대해 시험하였다. 도 12a(상단 곡선은 5일-CD33.2-28이고, 하단 곡선은 5일-CD33.2-BB임): 기초 대사 조건 하에서 미토콘드리아 억제제에 대한 반응으로 7일째의 CD33.2-28z 및 CC33.2-BBz CAR T 세포의 산소 소비율(OCR). 도 12b(왼쪽은 CD33.2-28이고, 오른쪽은 CD33.2-BB임): 기본 OCR 수준 대 최대 호흡 수준. 도 12c(왼쪽은 CD33.2-28이고, 오른쪽은 CD33.2-BB임): 양성자 누출-연결 및 ATP 생산-연결에 대한 OCR.
도 12d 내지 12f: 세포 에너지 표현형에 대한 CAR 공-자극 도메인의 효과. CD33.2-28z 및 CD33.2-BBz CAR T 세포를 MOML14와 함께 항온처리하고, 7일 후 시호스 기계로 세포 에너지 표현형에 대해 시험하였다. 도 12d(왼쪽 곡선은 CD33.2-28이고, 오른쪽 곡선은 CD33.2-BB임): 세포 에너지 표현형. 도 12e(왼쪽은 CD33.2-28이고, 오른쪽은 CD33.2-BB임): 산소 소비율. 도 12f(왼쪽은 CD33.2-28이고, 오른쪽은 CD33.2-BB임): 세포외 건조율.
도 13은 도시된 바와 같이 생체 내에서 상이한 처리로 백혈병 진행을 추적하는 데 사용된 생물발광 이미지를 제공한다. 더 어두운 영역은 더 큰 종양 부담을 나타낸다.
급성 골수성 백혈병(AML)은 질병이 세포독성 화학요법에 난치성이 될 때 제한적인 대체 치료 옵션과 함께 집중적인 세포독성 화학요법 섭생법을 사용하여 통상적으로 치료되는 공격적인 악성 종양이다.
CAR은 T 세포 신호전달 도메인에 연결된 하나 이상의 항체의 항원 결합 도메인(예를 들어, 단일 쇄 가변성 단편(scFv))을 함유하는 인공적으로 작성된 하이브리드 단백질 또는 폴리펩티드이다. CAR의 특징으로는 비-MHC-제한된 방식으로 선택된 표적에 대한 반응성 및 T 세포 특이성을 재유도하여 단일클론성 항체의 항원-결합 특성을 촉진시키는 이들의 능력이 포함된다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 T 세포에게 항원 처리와 무관하게 항원을 인식하는 능력을 제공하여, 종양 도피(tumor escape)의 주요 기작을 건너뛰게 한다. 게다가, T 세포에서 발현될 경우, CAR은 유리하게는 내생성 T 세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 쇄와 함께 이량체화하지 않는다. 본원에 사용된 어구 "항원 특이성" 및 "항원-특이적 반응을 유도한다"는 CAR이 항원에 특이적으로 결합하고 면역학적으로 인식할 수 있어 항원에 대한 CAR의 결합이 면역 반응을 유도함을 의미한다.
CD33은 폭발 위기에서 대부분의 AML 모세포 및 만성 골수성 백혈병의 표면에서 발현된다. 또한, T 세포 급성 림프모구성 백혈병의 부분집합에서 비정상적으로 발현된다. 정상 조직 발현은 정상 골수 세포로 제한된다.
본 발명의 한 양태는 hP67.6(문헌[Cowan et al., Front. Biosci. (Landmark Ed.), 18: 1311-1334 (2013)] 및 미국 특허공보 제5,739,116호, 각각 본원에 참고로 혼입됨), M195(문헌[Co et al., J. Immunol., 148: 1149-1154 (1992)], 본원에 참고로 혼입됨), 또는 Hu195(상기 코(Co) 등의 문헌)의 항-CD33 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. 항원 결합 도메인은 CD33에 특이적으로 결합한다. 이와 관련하여, 본 발명의 바람직한 양태는 hP67.6, M195 또는 Hu195의 항원 결합 도메인의 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진 항-CD33 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다.
항-CD33 항원 결합 도메인은, 예컨대 hP67.6의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 중쇄 가변 영역은 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, 항-CD33 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역은 경쇄 CDR1 영역, 경쇄 CDR2 영역 및 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다.
항-CD33 항원 결합 도메인의 중쇄 가변 영역은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 항-CD33 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 항-CD33 항원 결합 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 항-CD33 항원 결합 도메인은 서열번호 3 및 5의 아미노산 서열을 포함한다.
항-CD33 항원 결합 도메인은, 예컨대 M195의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 중쇄 가변 영역은 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, 항-CD33 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역은 경쇄 CDR1 영역, 경쇄 CDR2 영역 및 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다.
항-CD33 항원 결합 도메인의 중쇄 가변 영역은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 항-CD33 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 항-CD33 항원 결합 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 항-CD33 항원 결합 도메인은 서열번호 13 및 14의 아미노산 서열을 포함한다.
항-CD33 항원 결합 도메인은, 예컨대 Hu195의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 중쇄 가변 영역은 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, 항-CD33 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역은 경쇄 CDR1 영역, 경쇄 CDR2 영역 및 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다.
항-CD33 항원 결합 도메인의 중쇄 가변 영역은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 항-CD33 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 항-CD33 항원 결합 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 항-CD33 항원 결합 도메인은 서열번호 15 및 16의 아미노산 서열을 포함한다.
Hu195 내에서, 서열 SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQ(서열번호 31)는 대신에 SGVPSRFSGSGSGTDFTLNISSLQPDDFATYYCQ(서열번호 32)일 수 있다. Mylo 내에서, 서열 AYMELSSLRSEDTAFYYCVNGNPWLA(서열번호 33)는 대신에 AYMELSSLRSEDTDFYYCVNGNPWLA(서열번호 34)일 수 있다.
항-CD33 항원 결합 도메인은 항-CD33 항체의 임의의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 항원 결합 부분은 하나 이상의 항원 결합 부위, 예컨대 Fab, F(ab')2, dsFv, scFv, 디아바디 및 트리아바디를 갖는 임의의 부분일 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 부분은 단일 쇄 가변 영역 단편(scFv) 항체 단편이다. scFv는 합성 펩티드 연결기를 통해 항체 경쇄의 가변(V) 도메인에 연결된 항체 중쇄의 V 도메인을 포함하는 절두된 Fab 단편이고, 일상적인 재조합 DNA 기법 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 유사하게, 다이설파이드-안정화된 가변 영역 단편(dsFv)은 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 항-CD33 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 연결기에 의해 서로 연결될 수 있다. 연결기는 임의의 적합한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 연결기는 약 1 내지 약 100개, 약 3 내지 약 20개, 약 5 내지 약 30개, 약 5 내지 약 18개, 또는 약 3 내지 약 8개 아미노산 길이의 Gly/Ser 연결기이고, 서열에서 글리신 및/또는 세린 잔기로 이루어진다. 따라서, Gly/Ser 연결기는 글리신 및/또는 세린 잔기로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, Gly/Ser 연결기는 GGGGS(서열번호 17)의 아미노산 서열을 포함하고, 다중 서열번호 17이 연결기 내에 존재할 수 있다. 임의의 연결기 서열은 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이의 스페이서로서 사용될 수 있다.
한 양태에서, 항-CD33 항원 결합 도메인은 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역 및 연결기를 포함한다. 이와 관련하여, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역 및 연결기를 포함하는 항-CD33 항원 결합 도메인의 양태는 서열번호 3, 4 및 5; 13, 4 및 14; 또는 15, 4 및 16 모두를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진다.
한 양태에서, 항원 결합 도메인은 하나 이상의 리더 서열(신호 펩티드)을 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, 리더 서열은 CAR 구축물 내의 항-CD33 CAR의 아미노 말단에 위치할 수 있다. 리더 서열은 임의의 적합한 리더 서열을 포함할 수 있고, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 CAR은 본원에 기재된 임의의 리더 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 리더 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진다. 본 발명의 한 양태에서, 리더 서열은 세포 표면 상에서 방출된 CAR의 발현을 촉진할 수 있고, 발현된 CAR에서 리더 서열의 존재가 CAR이 기능하기 위해 필요하지 않는다. 본 발명의 한 양태에서, 세포 표면 상에서 CAR의 발현시, 리더 서열이 절단될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 방출된 CAR에는 리더 서열이 없다. 본 발명의 한 양태에서, CAR 구축물 내의 CAR에는 리더 서열이 없다.
본 발명의 한 양태에서, CAR 구축물은 힌지 도메인을 포함한다. 본 발명의한 양태에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인이다. 바람직한 양태에서, CD8 힌지 도메인은 인간이다. 바람직하게는, CD8 힌지 도메인은 서열번호 6을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진다. 본 발명의 양태에서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인이다. 바람직한 양태에서, CD28 힌지 도메인은 인간이다. 바람직하게는, CD28 힌지 도메인은 서열번호 10을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진다.
본 발명의 한 양태에서, CAR 구축물은 막관통(TM) 도메인을 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, TM 도메인은 CD8 TM 도메인이다. 바람직한 양태에서, CD8 TM 도메인은 인간이다. 바람직하게는, CD8 TM 도메인은 서열번호 7을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진다. 본 발명의 한 양태에서, TM 도메인은 CD28 TM 도메인이다. 바람직한 양태에서, CD28 TM 도메인은 인간이다. 바람직하게는, CD28 TM 도메인은 서열번호 11을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진다.
본 발명의 한 양태에서, CAR 구축물은 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 서열을 포함한다. CD137로도 공지된 4-1BB는 강력한 공-자극 신호를 T 세포에 전달하여 분화를 촉진하고 T 림프구의 장기 생존을 향상시킨다. 바람직하게는, 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 서열은 인간이다. 바람직한 양태에서, 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 서열은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진다.
본 발명의 한 양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 CD3 제타(ζ) 세포내 T 세포 신호전달 서열을 포함한다. CD3ζ는 TCR과 결합하여 신호를 생성하고 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 바람직하게는, CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 서열은 인간이다. 바람직한 양태에서, CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 서열은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진다.
본원에 기재된 CAR은 CAR 구축물이 항-CD19, CD22, TSLPR, CD123, FLT3 CAR 등과 함께 이시스트론성, 삼시스트론성 등이 되도록, 예컨대 자가-절단 펩티드를 갖는 구축물로 제조될 수 있고, 이때 분리된 CAR은 펩티드의 절단시 방출된다.
도 1은 본 발명의 양태에 따른 예시적인 CAR 구축물의 개략도를 제시한다.
본 발명의 추가 양태는 하기 표 1 내지 6에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진 전장 CAR 구축물을 제공한다.
[표 1]
Figure pct00001
[표 2]
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
[표 4]
Figure pct00004
[표 5]
Figure pct00005
[표 6]
Figure pct00006
CDR 서열은 밑줄 친 굵은 글씨체로 하기 제시된다.
Hu195 및 M195:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFT DYNMH WVRQAPGQGLEWIG YIYPYNGGTGYNQKFKSKA TITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR GRPAMDYWGQ GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASESVDNYGISFMN WFQQKPGKAPKLLIY AASNQGS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYC QQSKEVPWT FGQGTKVEIKTSSG(서열번호 35), 이때 Hu195의 상자에 넣어진 T는 M195의 경우 N이다.
CDR:
DYNMH(서열번호 41)
YIYPYNGGTGYNQKFKSKA(서열번호 42)
GRPAMDYWGQ(서열번호 43)
RASESVDNYGISFMN(서열번호 44)
AASNQGS(서열번호 45)
QQSKEVPWT(서열번호 46)
Mylo:
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS GYTITDSN IHWVRQAPGQSLEWIGY IYPYNGGT DYNQKFKNRATLTVDNPTNTAYMELSSLRSEDTAFYYC VNGNPWLAY WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRAS ESLDNYGIRF LTWFQQKPGKAPKLLMY AAS NQGSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC QQTKEVPWS FGQGTKVEVKR(서열번호 36)
CDR:
GYTITDSN(서열번호 47)
IYPYNGGT(서열번호 48)
VNGNPWLAY(서열번호 49)
ESLDNYGIRF(서열번호 50)
AAS(서열번호 51)
QQTKEVPWS(서열번호 52)
한 양태에서, CAR 구축물(본원에서 CD33Mylo-BBZ로 표시됨)은 하기 서열을 갖는다:
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTITDSNIHWVRQAPGQSLEWIGYIYPYNGGTDYNQKFKNRATLTVDNPTNTAYMELSSLRSEDTAFYYCVNGNPWLAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASESLDNYGIRFLTWFQQKPGKAPKLLMYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTKEVPWSFGQGTKVEVKRTSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 18).
한 양태에서, CAR 구축물(본원에서 CD33Mylo-CD28Z로 표시됨)은 하기 서열을 갖는다:
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTITDSNIHWVRQAPGQSLEWIGYIYPYNGGTDYNQKFKNRATLTVDNPTNTAYMELSSLRSEDTAFYYCVNGNPWLAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASESLDNYGIRFLTWFQQKPGKAPKLLMYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTKEVPWSFGQGTKVEVKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 19).
한 양태에서, CAR 구축물(본원에서 CD33M195-BBZ로 표시됨)은 하기 서열을 갖는다:
MALPVTALLLPLALLLHAARPMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLNISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKTSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 20).
한 양태에서, CAR 구축물(본원에서 CD33M195-CD28Z로 표시됨)은 하기 서열을 갖는다:
MALPVTALLLPLALLLHAARPMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLNISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKTSSGAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 21).
한 양태에서, CAR 구축물(본원에서 CD33Hu195-BBZ로 표시됨)은 하기 서열을 갖는다:
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 22).
한 양태에서, CAR 구축물(본원에서 CD33Hu195-CD28Z로 표시됨)은 하기 서열을 갖는다:
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKSGAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 23). RVKFSRSADAPAYQ(서열번호 37)에서 Q는 K로 치환될 수 있다.
GS의 서열은 본원에 기재된 임의의 CAR의 C-말단에 있을 수 있다.
본 발명의 범위에는 본원에 기술된 본 발명의 CAR 구축물의 기능적 부분이 포함된다. CAR과 관련하여 사용될 때, 용어 "기능적 부분"은 본 발명의 CAR 구축물의 임의의 부분 또는 단편을 지칭하고, 이 부분 또는 단편은 그것이 일부인 CAR 구축물(모 CAR 구축물)의 생물학적 활성을 보유한다. 기능적 부분은, 예를 들어, 모 CAR 구축물과 유사한 정도로, 동일한 정도로 또는 더 높은 정도로 표적 세포를 인식하거나, 암을 검출하거나 치료하거나 예방하는 능력을 보유하는 CAR 구축물의 부분을 포함하다. 모 CAR 구축물과 관련하여, 기능적 부분은, 예를 들어 모 CAR의 약 10%, 약 25%, 약 30%, 약 50%, 약 68%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상을 구성한다.
기능적 부분은 부분의 아미노 또는 카복시 말단, 또는 양쪽 말단에 추가 아미노산을 포함할 수 있고, 추가 아미노산은 모 CAR 구축물의 아미노산 서열에서 발견되지 않는다. 바람직하게는, 추가 아미노산은 기능적 부분의 생물학적 기능(예컨대, 표적 세포의 인식, 암의 검출, 암의 치료 또는 예방 등)을 방해하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 추가 아미노산은 모 CAR 구축물의 생물학적 활성에 비해 생물학적 활성을 향상시킨다.
본 발명의 범주에 본원에 기재된 본 발명의 CAR 구축물의 기능적 변이체가 포함된다. 본원에 사용된 용어 "기능적 변이체"는 모 CAR 구축물에 실질적이거나 유의적인 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 CAR 구축물, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭하고, 이러한 기능적 변이체는 모 CAR 구축물의 생물 활성을 보유한다. 기능적 변이체는, 예를 들어, 모 CAR 구축물과 유사한 정도, 동일한 정도 또는 더 높은 정도로 표적 세포를 인식하는 능력을 보유하는 본원에 기재된 CAR 구축물(모 CAR 구축물)의 변이체를 내포한다. 모 CAR 구축물과 관련하여, 기능적 변이체는 아미노산 서열에 있어서, 모 CAR 구축물에, 예를 들어, 적어도 약 30%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상 동일성일 수 있다.
기능적 변이체는, 예를 들어, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모 CAR의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가적으로, 기능적 변이체는 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 모 CAR 구축물의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 비-보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물 활성을 간섭하거나 억제하지 않는 것이 바람직하다. 비-보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물 활성이 모 CAR 구축물과 비교하여 증가하도록 기능적 변이체의 생물 활성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 CAR 구축물의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있고, 특정한 물리적 및/또는 화학적 특성을 갖는 하나의 아미노산이 동일하거나 유사한 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 교환되는 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 산성/음성적으로 하전된 또 다른 극성 아미노산으로 치환되는 산성/음성적으로 하전된 극성 아미노산(예를 들어, Asp 또는 Glu), 극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val 등), 염기성/양성으로 하전된 또 다른 극성 아미노산으로 치환되는 염기성/양성으로 하전된 극성 아미노산(예를 들어, Lys, His, Arg 등), 극성 측쇄를 갖는 또 다른 비하전된 아미노산으로 치환되는 극성 측쇄를 갖는 비하전된 아미노산(예를 들어, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr 등), 베타-분지형 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, Ile, Thr, 및 Val), 방향족 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, His, Phe, Trp, 및 Tyr) 등을 포함한다.
CAR 구축물은, 다른 성분, 예를 들어, 다른 아미노산이 기능적 변이체의 생물 활성을 현저히 변화시키지 않도록, 본원에 기재된 특정화된 아미노산 서열 또는 서열들로 본질적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 양태의 CAR 구축물(기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함함)은 임의의 길이일 수 있고, 즉 임의의 수의 아미노산을 포함할 수 있지만, CAR 구축물(또는 이의 기능적 부분 및 기능적 변이체)은 이들의 생물 활성, 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하거나 포유동물에서 질병 세포를 검출하거나 포유동물에서 질병을 치료하거나 예방하는 능력 등을 보유해야 한다. 예를 들어, CAR은 약 50 내지 약 5,000개 아미노산 길이, 예컨대 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000개 또는 그 이상의 아미노산 길이일 수 있다.
본 발명의 양태의 CAR 구축물(본 발명의 기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함함)은 하나 이상의 천연-발생 아미노산 대신에 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 아미노사이클로헥산 카복실산, 노르류신, α-아미노 n-데칸산, 호모세린(homoserine), S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-하이드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카복시페닐알라닌, β-페닐세린, β-하이드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 사이클로헥실알라닌, 사이클로헥실글리신, 인돌린-2-카복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-리신, N',N'다이벤질--리신, 6-하이드록시리신, 오르니틴, α-아미노사이클로펜탄 카복실산, α-아미노사이클로헥산 카복실산, α-아미노사이클로헵탄 카복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카복실산, α,γ-다이아미노부티르산, α,β-다이아미노프로피온산, 호모페닐알라닌 및 α-tert-부틸글리신을 포함한다.
본 발명의 양태의 CAR 구축물(기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함함)은 글리코실화되거나, 아미드화되거나, 카복실화되거나, 인산화되거나, 에스터화되거나, N-아실화되거나, 예를 들어 다이설파이드 가교를 통해 환화되거나, 산 부가 염으로 전환되고/되거나, 이량체화 또는 중합체화되거나 접합될 수 있다.
본 발명의 양태의 CAR 구축물(이의 기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함함)은 당업계에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. CAR 구축물은 드 노보 합성을 비롯한 폴리펩티드 또는 단백질의 임의의 적합한 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, CAR 구축물은 표준 재조합 방법을 사용하여 본원에 기재된 핵산을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌[Green et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2012] 참고). 또한, 본 발명의 CAR 구축물(이의 기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함함)의 일부의 부분은 식물, 박테리아, 곤충, 포유동물, 예컨대 래트, 인간 등과 같은 공급원으로부터 단리되고/거나 정제될 수 있다. 단리 및 정제 방법은 당업계에 주지되어 있다. 다르게는, 본원에 기술된 CAR 구축물(이의 기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함함)은 신펩(Synpep, 미국 캘리포니아주 더블린 소재), 펩티드 테크놀로지스 코포레이션(Peptide Technologies Corp. 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재), 및 멀티플 펩티드 시스템즈(Multiple Peptide Systems, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)와 같은 회사에 의해 상업적으로 합성될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 CAR 구축물은 합성되고/거나, 재조합되고/거나, 단리되고/거나, 정제될 수 있다.
본 발명의 한 양태에 의해 추가로 제공되는 것은 본원에 기재된 임의의 CAR 구축물(이의 기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함함)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이다. 본 발명의 핵산은 본원에 기재된 임의의 리더 서열, 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 연결기 및/또는 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 핵산은 본원에 기재된 임의의 CAR 구축물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, 핵산은 다음 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있다.
CD33Mylo-BBZ CAR
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CD33Mylo-CD28Z CAR
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CD33M195-BBZ CAR
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CD33M195-CD28Z CAR
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CD33Hu195-BBZ CAR
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CD33Hu195-CD28Z CAR
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본원에 사용된 "핵산"은 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"를 포함하고, 일반적으로 DNA 또는 RNA의 중합체를 의미하고, 이는 단일-가닥 또는 이중-가닥이고, 합성되거나 천연 공급원으로부터 수득될 수 있고(예를 들어, 단리되고/되거나 정제됨), 이는 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 이는 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 사이에서 발견되는 포스포다이에스터 대신에, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드간 연결기, 예컨대 포스포로아미데이트 연결기 또는 포스포로티오에이트 연결기를 함유할 수 있다. 몇몇 양태에서, 핵산은 삽입, 결실, 역위(inversion) 및/또는 치환을 전혀 포함하지 않는다. 그러나, 몇몇 경우에, 본원에 논의된 바와 같이, 핵산이 하나 이상의 삽입, 결실, 역위 및/또는 치환을 포함하는 것이 적합할 수 있다. 일부 양태에서, 핵산은 CAR 구축물의 기능에 영향을 주지 않고 숙주 세포에 의한 핵산의 발현시 번역되거나 번역되지 않을 수 있는 추가 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.
한 양태에서, 본원의 임의의 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화될 수 있다. 임의의 특정 이론 또는 기작에 얽매이는 것은 아니지만, 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화가 mRNA 전사물의 번역 효율을 증가시키는 것으로 여겨진다. 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 동일한 아미노산을 코딩하는 또 다른 코돈으로 고유의 코돈을 치환함을 포함할 수 있지만, 세포 내에서 보다 쉽게 이용할 수 있는 tRNA에 의해 번역될 수 있고, 이에 따라 번역 효율을 증가시킨다. 뉴클레오티드 서열의 최적화는 또한 번역을 간섭할 수 있는 2차 mRNA 구조물을 감소시킴으로써, 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 하나의 양태의 핵산은 재조합적일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "재조합"은 (i) 천연 또는 합성 핵산 분절을 살아있는 세포에서 복제가능한 핵산 분자에 연결시킴으로써 살아있는 세포 밖에서 작성되는 분자, 또는 (ii) 상기 (i)에 기재된 것의 복제로부터 생성되는 분자를 지칭한다. 본원에서 목적을 위해, 복제는 시험관내 복제 또는 생체내 복제일 수 있다.
재조합 핵산은 천연적으로 발생하지 않는 서열을 갖는 핵산 또는 서열의 2개의 다른 별도의 분절의 인공적 조합에 의해 제조된 서열을 갖는 핵산일 수 있다. 인공적 조합은 종종 화학적 합성에 의해, 또는 더욱 흔히는 핵산의 단리된 분절의 인공적 조작에 의해, 예를 들어, 유전자 조작 기법, 예컨대 그린(Green) 등의 상기 문헌에 기재된 기법에 의해 달성된다. 핵산은 당업계에 공지된 절차를 사용하여 화학적 합성 및/또는 효소적 결찰 반응에 기반하여 작성될 수 있다. 예를 들어, 그린 등의 상기 문헌을 참조한다. 예를 들어, 핵산은 천연 발생 뉴클레오티드, 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 하이브리드화시 형성되는 이중물(duplex)의 물리적 안정성을 증가시키도록 고안된 다양하게 변형된 뉴클레오티드[예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘(acridine) 치환된 뉴클레오티드]를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 핵산을 생성하기 위해 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예는 비제한적으로 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 다이하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신(galactosylqueosine), 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-치환된 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스터, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실 및 2,6-다이아미노퓨린을 포함한다. 다르게는, 하나 이상의 본 발명의 핵산은 매크로몰레큘라 리소시즈(Macromolecular Resources)(미국 콜로라도주 포트 콜린스 소재) 및 신테겐(Synthegen)(미국 텍사스주 휴스턴 소재)과 같은 회사로부터 구입될 수 있다.
핵산은 본원에 기재된 임의의 CAR 구축물, 또는 이의 기능적 부분 또는 기능적 변이체를 코딩하는 임의의 단리되거나 정제된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다르게는, 뉴클레오티드 서열은 임의의 서열에 대해 변성된 뉴클레오티드 서열 또는 변성된 서열의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태는 또한 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보성인 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격한 조건 하에 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리되거나 정제된 핵산을 제공한다.
엄격한 조건 하에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열은 매우 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있다. "매우 엄격한 조건"은 뉴클레오티드 서열이 비-특이적 하이브리드화에 비해 검출가능하게 더 강한 양으로 표적 서열(본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열)에 특이적으로 하이브리드화함을 의미한다. 매우 엄격한 조건은, 뉴클레오티드 서열에 부합하는 소수의 작은 영역(예를 들어, 3 내지 10개 염기)을 갖게 된 무작위 서열로부터 정확한 상보성 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 단지 소수의 산란된 부정합을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 구별하는 조건을 포함한다. 상보성의 이러한 작은 영역은 14 내지 17개 이상의 염기의 전장 보체에 비해 더욱 쉽게 용융되고, 매우 엄격한 하이브리드화는 이들이 쉽게 구별될 수 있도록 만든다. 상대적으로 매우 엄격한 조건은, 예를 들어, 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건, 예컨대 약 50 내지 70℃의 온도에서 약 0.02 내지 0.1 M NaCl 또는 등가물에 의해 제공되는 조건을 포함한다. 이러한 매우 엄격한 조건은 뉴클레오티드 서열 및 주형 또는 표적 가닥 사이의, 존재하더라도 극히 적은 부정합을 용인하고, 임의의 본 발명의 CAR 구축물의 발현을 검출하는 데 특히 적합하다. 일반적으로 조건은 포름아미드의 양을 증가시키면서 첨가함으로써 더욱 엄격하게 될 수 있는 것으로 인식된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 핵산에 적어도 약 70% 이상, 예를 들어, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 핵산은 재조합 발현 벡터 내로 혼입될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 하나의 양태는 본 발명의 임의의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본원에서 목적을 위해, "재조합 발현 벡터"라는 용어는, 구축물이 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 벡터가 세포 내에서 발현된 mRNA, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 갖기에 충분한 조건 하에 세포와 접촉되는 경우, 숙주 세포에 의한 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현을 허용하는 유전자-변형된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 구축물을 의미한다. 본 발명의 벡터는 전반적으로 천연-발생성이 아니다. 그러나, 벡터의 일부는 천연-발생성일 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 임의의 유형의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 예컨대 비제한적으로 DNA 및 RNA를 포함하고, 이는 단일-가닥 또는 이중-가닥이고, 합성되거나 천연 공급원으로부터 부분적으로 수득되고, 이는 천연, 비-천연 또는 변경된 일부 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 천연-발생 또는 비-천연-발생의 뉴클레오티드간 연결기, 또는 이들 유형의 연결기 둘 다를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 비-천연 발생 또는 변경된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드간 연결기는 벡터의 전사 또는 복제를 방해하지 않는다. 예시적인 벡터 골격은 서열번호 30의 렌티-벡터 골격이다.
하나의 양태에서, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 숙주 세포를 형질전환하거나 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 적합한 벡터로는 번식 및 확장을 위해 또는 발현을 위해, 또는 이들 둘 다를 위해 고안된 벡터, 예컨대 플라스미드 및 바이러스가 포함된다. 벡터는 pUC 시리즈[페르멘타스 라이프 사이언시즈(Fermentas Life Sciences), 미국 메릴랜드주 글렌 버니 소재], 피블루스크립트(pBluescript) 시리즈[스트라타겐(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라호야 소재], pET 시리즈[노바겐(Novagen), 미국 위스콘신주 매디슨 소재], pGEX 시리즈[파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech), 스웨덴 웁살라 소재], 및 pEX 시리즈[클론테크(Clontech), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재]로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 박테리오파지(bacteriophage) 벡터, 예컨대 λGT10, λGT11, λZapII(스트라타겐), λEMBL4, 및 λMN1149가 또한 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예로는 pBIO1, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(클론테크)가 포함된다. 동물 발현 벡터의 예로는 pEUK-C1, pMAM 및 pMAMneo(클론테크)가 포함된다. 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 재조합 발현 벡터는, 예를 들어, 그린 등의 상기 문헌에 기재된 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 환형 또는 선형인 발현 벡터의 구축물은, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 기능적인 복제 시스템을 함유하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은, 예를 들어, ColE1, 2 μ 플라스미드, λ, SV40, 소 유두종 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.
재조합 발현 벡터는, 적절한 경우, 및 벡터가 DNA-기반인지 또는 RNA-기반인지의 여부를 고려하여, 벡터가 도입되는 숙주의 유형(예를 들어, 세균, 곰팡이, 식물 또는 동물)에 특이적인 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 클로닝을 촉진시키는 제한 자리를 포함할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 표지 유전자를 포함할 수 있다. 표지 유전자는 살생물제 내성, 예를 들어, 항생제, 중금속 등에 대한 내성, 원영양체 조건(prototrophy)을 제공하기 위한 영양요구성 숙주에서의 상보성 등을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터에 적합한 표지 유전자로는, 예를 들어, 네오마이신(neomycin)/G418 내성 유전자, 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자, 히스티디놀(histidinol) 내성 유전자, 테트라사이클린(tetracycline) 내성 유전자, 및 암피실린(ampicillin) 내성 유전자가 포함된다.
재조합 발현 벡터는 CAR 구축물(이의 기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함함)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에, 또는 CAR 구축물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보성이거나 이에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되는 고유의 또는 비-고유의 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 강하거나, 약하거나, 유도가능하거나, 조직-특이적이거나, 발달-특이적인 프로모터의 선택은 당업계의 통상적인 기술 내에 속한다. 유사하게, 프로모터와 뉴클레오티드 서열의 조합은 또한 당업계의 통상적인 기술 내에 속한다. 프로모터는 비-바이러스성 프로모터 또는 바이러스성 프로모터일 수 있고, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV: cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 또는 뮤린 줄기 세포 바이러스의 긴-말단 반복부(long-terminal repeat)에서 발견되는 프로모터이다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 일시적 발현을 위해, 안정한 발현을 위해, 또는 이들 둘 다를 위해 고안될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 구성적 발현 또는 유도성 발현을 위해 만들어질 수 있다.
추가로, 재조합 발현 벡터는 자살 유전자를 포함하도록 만들어질 수 있다. 본원에 사용된 용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현하는 세포가 사멸되도록 하는 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는, 유전자가 발현되는 세포 상에서 제제, 예를 들어, 약물에 대한 감수성을 부여하고, 세포가 제제와 접촉되거나 이에 노출될 때 세포를 사멸시키는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 단순포진 바이러스(HSV: Herpes Simplex Virus) 티미딘 키나제(TK: thymidine kinase) 유전자, 시토신 다미나제(daminase), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(phosphorylase) 및 니트로환원효소(nitroreductase)를 포함한다.
본 발명의 범위에는 임의의 본 발명의 CAR 구축물(이의 임의의 기능적 부분 또는 변이체를 포함함), 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단을 포함하는 접합체, 예컨대 생체접합체가 포함된다. 접합체 및 접합체를 합성하는 방법은 통상적으로 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 하나의 양태는 본원에 기재된 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 재조합 발현 벡터를 함유할 수 있는 임의의 유형의 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 식물, 동물, 곰팡이 또는 조류(algae)이거나, 원핵 세포, 예를 들어, 세균 또는 원생동물일 수 있다. 숙주 세포는 배양된 세포 또는 1차 세포, 즉 유기체, 예를 들어, 인간으로부터 직접 단리된 세포일 수 있다. 숙주 세포는 접착 세포 또는 현탁된 세포, 즉, 현탁액에서 성장하는 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, DH5α 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포, 중국 햄스터 난소 세포, 원숭이 VERO 세포, COS 세포, HEK293 세포 등이 포함된다. 재조합 발현 벡터를 증폭시키고 복제하기 위해, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어, DH5α 세포일 수 있다. 재조합 CAR 구축물을 생산하기 위해, 숙주 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 숙주 세포는 인간 세포일 수 있다. 숙주 세포가 임의의 세포 유형이고, 임의의 유형의 조직으로부터 기원되고, 임의의 발달 단계일 수 있지만, 숙주 세포는 말초 혈액 림프구(PBL: peripheral blood lymphocyte) 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)일 수 있다. 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다.
본원에서 목적을 위해, T 세포는 임의의 T 세포, 예컨대 배양된 T 세포, 예를 들어, 1차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주로부터의 T 세포, 예를 들어, 주르캣(Jurkat), SupT1 등, 또는 포유동물로부터 수득된 T 세포일 수 있다. 포유동물로부터 수득되는 경우, T 세포는 다수의 공급원, 예컨대 비제한적으로 혈액, 골수, 림프절, 흉선, 또는 기타 조직 또는 체액으로부터 수득될 수 있다. T 세포는 또한 강화되거나 정제될 수 있다. T 세포는 인간 T 세포일 수 있다. T 세포는 인간으로부터 단리된 T 세포일 수 있다. T 세포는 임의의 유형의 T 세포일 수 있고, 임의의 발달 단계, 예컨대 비제한적으로, CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 예를 들어, Th1 및 Th2 세포, CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 종양 침투 세포, 기억 T 세포, 나이브(naive) T 세포 등일 수 있다. T 세포는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포일 수 있다.
또한, 본 발명의 하나의 양태에 의해 본원에 기재된 하나 이상의 숙주 세포를 포함하는 세포 집단이 제공된다. 세포 집단은 기재된 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를, 재조합 발현 벡터를 전혀 포함하지 않는 하나 이상의 다른 세포, 예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, T 세포), 또는 T 세포 이외의 세포, 예를 들어, B 세포, 대식세포, 호중구, 적혈구, 간세포, 내피 세포, 상피 세포, 근육 세포, 뇌 세포 등에 더하여 포함하는 이종성 집단일 수 있다. 다르게는, 세포 집단은 실질적으로 동종성 집단일 수 있고, 이때 집단은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 주로 포함한다(예를 들어, 이로 본질적으로 이루어진다). 집단은 또한 세포의 클론성 집단일 수 있고, 이때 집단의 모든 세포는 재조합 발현 벡터를 포함하는 단일 숙주 세포의 클론이어서, 집단의 모든 세포가 재조합 발현 벡터를 포함하게 된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 클론 집단이다.
본 발명의 CAR 구축물(이의 기능적 부분 및 변이체를 포함함), 핵산, 재조합 발현 벡터, 및 숙주 세포(이의 집단 포함)(이들 모두는 이후 집합적으로 "본 발명의 CAR 구축 물질"로서 지칭됨)는 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 그의 천연 환경으로부터 제거됨을 의미한다. 용어 "정제된" 또는 "단리된"은 완전한 정제 또는 단리를 필요로 하는 것은 아니고; 오히려 이는 상대적 용어로서 의도된다. 이에 따라, 예를 들어, 정제된(또는 단리된) 숙주 세포 제조물은, 숙주 세포가 신체 내의 이들의 천연 환경에서의 세포에 비해 더욱 순수한 것이다. 이러한 숙주 세포는, 예를 들어, 표준 정제 기법에 의해 생산될 수 있다. 몇몇 양태에서, 숙주 세포의 제조물은 숙주 세포가 제조물의 총 세포 함량의 적어도 약 50%, 예를 들어, 적어도 약 70%를 나타내도록 정제된다. 예를 들어, 순도는 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 약 80%를 초과할 수 있거나, 약 100%일 수 있다.
본 발명의 CAR 구축 물질은 조성물, 예컨대 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 하나의 양태는 본원에 기재된 임의의 본 발명의 CAR 구축 물질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 임의의 본 발명의 CAR 구축 물질을 함유하는 본 발명의 약학 조성물은 하나 초과의 본 발명의 CAR 구축 물질, 예를 들어, CAR 구축물 및 핵산, 또는 2개 이상의 상이한 CAR 구축물을 포함할 수 있다. 다르게는, 약학 조성물은 본 발명의 CAR 구축 물질을, 다른 약학적으로 활성인 제제 또는 약물, 예컨대 화학요법제, 예를 들어, 아스파라기나제(asparaginase), 부설판(busulfan), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 플루오로우라실, 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아, 메토트렉세이트(methotrexate), 파클리탁셀(paclitaxel), 리툭시맙(rituximab), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 등과 조합하여 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 약학 조성물은 본 발명의 숙주 세포 또는 이의 집단을 포함한다.
약학 조성물과 관련하여, 약학적으로 허용되는 담체는 통상적으로 사용되는 임의의 것일 수 있고, 용해도 및 활성제와의 반응성 결핍과 같은 화학적-물리적 고려사항 및 투여 경로에 의해서만 제한된다. 본원에 기술된 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 비히클, 보조제, 부형제 및 희석제는 당업자에게 주지되고 대중이 쉽게 이용할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체가 사용 조건 하에서 유해한 부작용 또는 독성이 없는 것이 바람직하다.
담체의 선택은 부분적으로 본 발명의 특정 CAR 구축 물질, 및 본 발명의 CAR 구축 물질을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물의 다양한 적합한 제형이 존재한다. 투여가능한(예컨대, 비경구적으로 투여가능한) 조성물의 제조 방법은 당업자에게 공지되거나 명백하고, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Pharmaceutical Press; 22nd ed. (2012)]에 더욱 상세히 기술된다.
본 발명의 CAR 구축 물질은 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 CAR 구축 물질은 주사(예를 들어, 피하, 정맥내, 종양내, 동맥내, 근육내, 피내, 복강내 또는 척수강내)에 의해 투여된다. 바람직하게는, 본 발명의 CAR 구축 물질은 정맥 내로 투여된다. 주사를 위한 본 발명의 CAR 구축 물질을 위한 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 임의의 등장성 담체, 예를 들어, 일반 염수(약 0.90% w/v의 물 중 NaCl, 약 300 mOsm/L의 물 중 NaCl, 또는 물 1 L 당 약 9.0 g의 NaCl), 노르모졸(NORMOSOL) R 전해질 용액[애보트(Abbott), 미국 일리노이주 시카고 소재], 플라스마-라이트(PLASMA-LYTE) A[박스터(Baxter), 미국 일리노이주 디어필드 소재], 물 중 약 5% 덱스트로스, 또는 링거(Ringer)의 락테이트가 포함된다. 하나의 양태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 인간 혈청 알부민으로 보충된다.
"효과량" 또는 "치료에 효과적인 양"은 개체에서 암을 예방하거나 치료하기에 적절한 투약량을 지칭한다. 치료학적 또는 예방학적 용도에 효과적인 양은, 예를 들어, 치료되는 질병 또는 질환의 단계 및 중증도, 환자의 연령, 체중, 및 일반적 건강 상태, 및 처방 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 투약량의 크기는 또한 선택된 작용제, 투여 방법, 투여 시간 및 빈도, 특정 작용제의 투여와 동반될 수 있는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도, 및 원하는 생리학적 효과에 의해 결정될 것이다. 당업자라면, 다양한 질병 또는 질환은, 아마도 각각의 투여 또는 다양한 투여 라운드에서 본 발명의 CAR 구축 물질을 사용하는 다중 투여를 비롯한 장기간의 치료를 필요로 할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 비제한적으로 본 발명의 CAR 구축 물질이 숙주 세포인 경우, 숙주 세포의 예시적인 투약량은 100만개 세포(1 x 106개 세포/투약량)일 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 투여되는 본 발명의 CAR 구축 물질의 양 또는 투약량은 합리적인 기간에 걸쳐 대상 또는 동물에서 치료학적 또는 예방학적 반응에 영향을 주기에 충분해야 한다. 예를 들어, 본 발명의 CAR 구축 물질의 투약량은 항원에 결합하거나, 투여 시간으로부터 약 2시간 이상, 예를 들어, 약 12 내지 약 24시간 이상의 기간에 암을 검출하거나 치료하거나 예방하기에 충분해야 한다. 특정 양태에서, 시간은 더 길 수 있다. 투약량은 본 발명의 특정 CAR 구축 물질의 효능 및 동물(예를 들어, 인간)의 증상, 뿐만 아니라 치료되는 동물(예를 들어, 인간)의 체중에 의해 결정될 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 본 발명의 CAR을 발현하는 소정의 상이한 투약량의 T 세포가 각각 제공되는 포유동물 집합 중에서, 포유동물에게 이러한 T 세포의 소정의 투약량을 투여할 경우, 본 발명의 CAR 구축물의 방출된 CAR을 발현하는 T 세포에 의해 표적 세포가 용해되고/되거나 IFN-γ 또는 IL-2가 분비되는 정도를 비교함을 포함하는 검정은, 포유동물에게 투여되는 출발 투약량을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 용량의 투여시 표적 세포가 용해되고/되거나 IFN-γ 또는 IL-2가 분비되는 정도는 당업계에 공지된 방법에 의해 검정될 수 있다.
본 발명의 CAR 구축 물질이 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여되는 경우, 하나 이상의 추가적인 치료제는 포유동물에게 공-투여될 수 있다. "공-투여"는, 본 발명의 CAR 구축 물질이 하나 이상의 추가적인 치료제의 효과를 향상시키거나 그 반대이도록 하나 이상의 추가적인 치료제 및 본 발명의 CAR 구축 물질을 충분히 가까운 시간 이내에 투여함을 의미한다. 이와 관련하여, 본 발명의 CAR 구축 물질이 우선 투여되고, 하나 이상의 추가적인 치료제가 두 번째로 투여되거나, 그 반대이다. 다르게는, 본 발명의 CAR 구축 물질 및 하나 이상의 추가적인 치료제는 동시에 투여될 수 있다. CAR 구축 물질과 공-투여될 수 있는 예시적인 치료제는 IL-2이다.
본 발명의 CAR 구축 물질은 포유동물에서 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 특정 이론 또는 기작에 얽매이는 것은 아니지만, 본 발명의 CAR 구축물은 생물 활성을 갖고, 예를 들어, 항원, 예컨대 CD33을 인식하여, CAR이 세포에 의해 발현될 경우 항원, 예컨대 CD33을 발현하는 세포에 대하여 면역 반응을 중재할 수 있도록 하는 CAR이다. 이와 관련하여, 본 발명의 하나의 양태는 포유동물의 암을 치료하거나 예방하는 데 효과적인 양으로 본 발명의 임의의 CAR 구축물, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 및/또는 약학 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 양태는 본 발명의 CAR 구축 물질을 투여하기 이전에 포유동물을 림프구고갈(lymphodepletion)시킴을 추가로 포함한다. 림프구고갈은, 예를 들어 비제한적으로 비-골수절제성(nonmyeloablative) 림프구고갈 화학요법, 골수절제성 림프구고갈 화학요법, 전신 방사선 치료 등을 포함한다.
숙주 세포 또는 세포 집단이 투여되는 본 발명의 방법의 목적을 위해, 세포는 포유동물에 대해 동종이형성 또는 자가유래성 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 포유동물에 대해 자가유래성이다.
본원에 지칭된 포유동물은 임의의 포유동물일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물을 지칭하고, 비제한적으로, 설치목(Rodentia)의 포유동물, 예컨대 마우스 및 햄스터, 및 중치목(Logomorpha)의 포유동물, 예컨대 토끼가 포함된다. 포유동물은 식육목(Carnivora)으로부터일 수 있고, 예컨대 고양이과(고양이) 및 개과(개)가 포함된다. 포유동물은 소과(소) 및 돼지과(돼지)를 비롯한 우제목(Artiodactyla), 또는 말과(말)를 비롯한 기제목(Perissodactyla)일 수 있다. 포유동물은 영장목(Primate), 세보이드(Ceboid), 또는 시모이드(Simoid) 목(원숭이), 또는 유인원목(Anthropoid)(인간 및 유인원)일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
본 발명의 치료 방법과 관련하여, 암은 임의의 암, 예컨대 임의의 급성 림프구성 암, 급성 골수성 백혈병, 폐포 횡문근육종, 방광암(예컨대, 방광 암종), 골암, 뇌암(예컨대, 수모세포종), 유방암, 항문, 항문관 또는 항문 직장의 암, 눈의 암, 간내 담관의 암, 관절의 암, 목, 담낭 또는 흉막의 암, 코, 비강 또는 중이의 암, 구강의 암, 외음부의 암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수암, 결장암, 식도암, 자궁경부암, 섬유 육종, 위장 유암종, 두경부암(예컨대, 두경부 편평 세포 암종), 호지킨 림프종, 하인두암, 신장암, 후두암, 백혈병, 액체 종양, 간암, 폐암(예컨대, 비-소세포 폐암), 림프종, 악성 중피종, 비만세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비-호지킨 림프종, B-만성 림프구성 백혈병, B-전구성 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL), 프리-B 세포 전구체 급성 림프모구성 백혈병(BCP-ALL), B 세포 림프종, 모양 세포 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 버킷 림프종, 난소암, 췌장암, 복막, 장막 및 장간막 암, 인두암, 전립선암, 직장암, 콩팥암, 피부암, 소장암, 연조직암, 고형 종양, 위암, 고환암, 갑상선암 및 요관암일 수 있다. 바람직하게는, 암은 혈액학적 악성 종양[예를 들어, 비제한적으로 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, CLL, 급성 림프구성 암, 급성 골수성 백혈병, B-만성 림프구성 백혈병, 모양 세포 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL)("급성 림프모구성 백혈병"으로도 지칭됨), B-ALL, BCP-ALL, B 세포 림프종 및 버킷 림프종을 비롯한 백혈병 또는 림프종]이다. 바람직하게는, 암은 CD33의 발현을 특징으로 한다.
본원에 사용된 용어 "치료" 및 "예방", 및 이로부터 유래된 단어는 필수적으로 100% 또는 완전한 치료 또는 예방을 내포하는 것은 아니다. 오히려, 당업자가 잠재적 이점 또는 치료학적 효과를 갖는 것으로 인식하는 치료 또는 예방의 다양한 정도가 존재한다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 포유동물에서 암을 치료 또는 예방하는 임의의 수준의 임의의 양을 제공할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 방법에 의해 제공되는 치료 또는 예방은, 치료되거나 예방되는 하나 이상의 질병, 예를 들어, 암 또는 이러한 증상의 증후를 치료 또는 예방함을 포함할 수 있다. 또한, 본원에서 목적을 위해, "예방"은 질병의 개시, 또는 이의 증후 또는 증상을 지연시킴을 내포할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한, 본 발명의 CAR 구축물, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 (a) 포유동물로부터의 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플을 본 발명의 CAR 구축물, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 또는 약학 조성물과 접촉시켜 복합체를 형성하는 단계; 및 b) 상기 복합체를 검출하는 단계로서, 상기 복합체의 검출이 포유동물에서 암의 존재를 나타내는, 단계를 포함하는, 포유동물에서 암의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
샘플은 임의의 적합한 방법, 예컨대 생검 또는 부검에 의해 수득될 수 있다. 생검은 개인으로부터 조직 및/또는 세포를 제거하는 것이다. 이러한 제거는 제거된 조직 및/또는 세포에 대한 실험을 수행하기 위해 개인으로부터 조직 및/또는 세포를 수집하는 것일 수 있다. 이러한 실험은 개인이 특정 병태 또는 질병 상태를 갖고/거나 앓고 있는지 여부를 결정하기 위한 실험을 포함할 수 있다. 상기 병태 또는 질병은, 예컨대 암일 수 있다.
포유동물에서 암의 존재를 검출하는 본 발명의 방법의 양태와 관련하여, 포유동물의 세포를 포함하는 샘플은 전체 세포, 이의 용해물 또는 전체 세포 용해물의 분획, 예컨대, 핵 또는 세포질 분획, 전체 단백질 분획 또는 핵산 분획을 포함하는 샘플일 수 있다. 샘플이 전체 세포를 포함하는 경우, 세포는 포유동물의 임의의 세포, 예컨대 혈액 세포 또는 내피 세포를 비롯한 임의의 기관 또는 조직의 세포일 수 있다.
본 발명의 검출 방법의 목적을 위해, 접촉은 포유동물에 대해 시험관 내에서 또는 생체 내에서 일어날 수 있다. 바람직하게는, 접촉은 시험관내이다.
또한, 복합체의 검출은 당업계에 공지된 임의의 수의 방식을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 본 발명의 CAR 구축물, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포 또는 세포 집단은, 예를 들어 방사성 동위 원소, 형광단(예컨대, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE)), 효소(예컨대, 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 과산화효소) 및 원소 입자(예컨대, 금 입자)와 같은 검출가능한 표지에 의해 표지될 수 있다.
표적 세포를 인식하는 능력 및 항원 특이성에 대해 CAR을 시험하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Clay et al., J. Immunol., 163: 507-513 (1999)]은 사이토카인(예컨대, 인터페론-γ, 과립구/단핵구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 종양 괴사 인자 α(TNF-α) 또는 인터루킨 2(IL-2))의 방출을 측정하는 방법을 교시한다. 또한, CAR 기능은 문헌[Zhao et al., J. Immunol., 174: 4415-4423 (2005)]에 기술된 바와 같이, 세포 세포독성의 측정에 의해 평가될 수 있다.
하기는 본 발명의 특정 양상을 포함한다.
1. CD33에 대한 항원 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
(a) 상기 항원 결합 도메인이 Hu195의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
(b) 상기 항원 결합 도메인이 Hu195의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고,
CDR 영역이 서열번호 41 내지 46의 영역인,
키메라 항원 수용체.
2. 제1 양상에 있어서,
항원 결합 도메인이 서열번호 15의 중쇄 가변 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
3. 제1 양상 또는 제2 양상에 있어서,
항원 결합 도메인이 서열번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
4. 제1 양상 내지 제3 양상 중 어느 한 양상에 있어서,
항원 결합 도메인이 서열번호 4의 연결기 서열을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
5. 제1 양상 내지 제4 양상 중 어느 한 양상에 있어서,
항원 결합 도메인이 서열번호 15, 4 및 16의 항원 결합 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
6. 제1 양상 내지 제5 양상 중 어느 한 양상에 있어서,
(i) 서열번호 7의 CD8 막관통 도메인 및 서열번호 6의 CD8 힌지 도메인, 또는 (ii) 서열번호 11의 CD28 막관통 도메인 및 서열번호 10의 CD28 힌지 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체.
7. 제1 양상 내지 제6 양상 중 어느 한 양상에 있어서,
세포내 T 세포 신호전달 도메인이 서열번호 8의 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 서열번호 9의 CD3 제타 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 또는 둘 다를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
8. 제1 양상 내지 제7 양상 중 어느 한 양상에 있어서,
스페이서를 추가로 포함하는 키메라 항원 수용체.
9. CD33에 대한 항원 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
(a) 상기 항원 결합 도메인이 hP67.6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고/거나;
(b) 상기 항원 결합 도메인이 hP67.6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고,
CDR 영역이 서열번호 47 내지 52의 영역인,
키메라 항원 수용체.
10. 제9 양상에 있어서,
항원 결합 도메인이 서열번호 3의 중쇄 가변 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
11. 제9 양상 또는 제10 양상에 있어서,
항원 결합 도메인이 서열번호 5의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
12. 제9 양상 내지 제11 양상 중 어느 한 양상에 있어서,
항원 결합 도메인이 서열번호 4의 연결기 서열을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
13. 제9 양상 내지 제12 양상 중 어느 한 양상에 있어서,
항원 결합 도메인이 서열번호 3, 4 및 5의 항원 결합 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
14. 제9 양상 내지 제13 양상 중 어느 한 양상에 있어서,
(i) 서열번호 7의 CD8 막관통 도메인 및 서열번호 6의 CD8 힌지 도메인, 또는 (ii) 서열번호 11의 CD28 막관통 도메인 및 서열번호 10의 CD28 힌지 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체.
15. 제9 양상 내지 제14 양상 중 어느 한 양상에 있어서,
세포내 T 세포 신호전달 도메인이 서열번호 8의 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 서열번호 9의 CD3 제타 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 또는 둘 다를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
16. 제9 양상 내지 제15 양상 중 어느 한 양상에 있어서,
스페이서를 추가로 포함하는 키메라 항원 수용체.
17. 서열번호 16, 17, 20 또는 21을 포함하는 키메라 항원 수용체.
18. 제1 양상 내지 제17 양상 중 어느 한 양상에 따른 키메라 항원 수용체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
19. 제18 양상에 있어서,
뉴클레오티드 서열이 코돈-최적화된, 핵산.
20. 제18 양상 또는 제19 양상에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
21. 제20 양상에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
22. 하나 이상의 제21 양상에 따른 숙주 세포를 포함하는 세포 집단.
23. 제1 양상 내지 제17 양상 중 어느 한 양상에 따른 키메라 항원 수용체, 제18 양상 또는 제19 양상에 따른 핵산, 제20 양상에 따른 재조합 발현 벡터, 제21 양상에 따른 숙주 세포, 또는 제22 양상에 따른 세포 집단, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
24. (a) 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플을 제1 양상 내지 제17 양상 중 어느 한 양상에 따른 키메라 항원 수용체, 제18 양상 또는 제19 양상에 따른 핵산, 제20 양상에 따른 재조합 발현 벡터, 제21 양상에 따른 숙주 세포, 제22 양상에 따른 세포 집단, 또는 제23 양상에 따른 약학 조성물과 접촉시켜 복합체를 형성하는 단계; 및
(b) 상기 복합체를 검출하는 단계로서, 상기 복합체의 검출이 암의 존재를 나타내는, 단계
를 포함하는, 암의 존재를 검출하는 방법.
25. 제24 양상에 있어서,
암이 급성 골수성 백혈병인, 방법.
26. 포유동물에서 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1 양상 내지 제17 양상 중 어느 한 양상에 따른 키메라 항원 수용체, 제18 양상 또는 제19 양상에 따른 핵산, 제20 양상에 따른 재조합 발현 벡터, 제21 양상에 따른 숙주 세포, 제22 양상에 따른 세포 집단, 또는 제23 양상에 따른 약학 조성물.
27. 제26 양상에 있어서,
암이 급성 골수성 백혈병인, 키메라 항원 수용체, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 또는 약학 조성물.
28. 효과량의 제1 양상 내지 제17 양상 중 어느 한 양상에 따른 키메라 항원 수용체, 제18 양상 또는 제19 양상에 따른 핵산, 제20 양상에 따른 재조합 발현 벡터, 제21 양상에 따른 숙주 세포, 제22 양상에 따른 세포 집단, 또는 제23 양상에 따른 약학 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는 방법.
29. 제28 양상에 있어서, 암이 급성 골수성 백혈병인, 방법.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론 그의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명의 양태에 따른 CAR의 용도를 증명한다.
CAR 구축물
CAR 구축물은 막관통 도메인과 연결되고, 4-1BB 또는 CD28 공-자극 도메인, CD3 제타 신호전달 도메인과 짝지어지고, 제3 세대 렌티바이러스 플라스미드에서 클로닝된 표적 특이적 단일 쇄 단편 가변 서열(scFv)로 개발되었다. CD33 CAR 구축물의 scFv는 린투주맙(Lintuzumab)(Hu195, SGN-33)(문헌[Co et al., J. Immunol., 148: 1149-54 (1992)]), 및 CD33Mylo(겜투주맙 오조가미신, 상표명: 마일로타르그, 회사: 와이어스(Wyeth), 인간화된 mAb/칼리케아미신, CD33; 미국 특허공보 제5,739,116호; 문헌[Cowan et al., Front Biosci (Landmark Ed)., 18: 1311-34 (2013)])로부터 유도되었다. CD123 CAR은 32716-scFv(국제 특허출원공보 제WO 2014/144622호)로부터 유도되었다. 이러한 CAR은 pELNS 렌티 벡터 골격으로 서브클로닝되었다. 모든 제한 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)[입스위치(Ipswich), 미국 매사추세츠주 소재]로부터 구입되었다. 모든 CAR 구축물의 서열은 서열을 마크로겐(Macrogen)(미국 메릴랜드주 록빌 소재)에서 서열분석함으로써 확인되었다(도 1a 및 1b 참고).
세포주
AML 세포주 MV411, THP1 및 MOLM14를 발현하는 GFP 및 루시퍼라제는 다양한 수준의 CD33 발현을 함유하고, 엑손 2 스플라이스 변이에 대한 상이한 유전형(문헌[Laszlo et al., Oncotarget, 7: 43281-94 (2016)])을 CAR 효능을 시험하는 데 사용하였다. DNA 단리를 통해, MOLM14가 CC 유전형을 갖고 SNP를 함유하지 않는 반면, THP1 및 MV411이 둘 다 CT 유전형을 갖는 SNP에 대해 이형접합임이 밝혀졌다(문헌[Lamba et al., J. Clin. Oncol., 35: 2674-82 (2017)]). 이러한 세포주는 CD33도 CD123도 발현하지 않는다. MV411은 급성 단핵구성 백혈병(AML FAB M5)을 갖는 10세 소년으로부터 확립된 급성 단핵구성 백혈병 라인이다. MOLM14는 초기 골수이형성 증후군(MDS, 모세포 과다 불응성 빈혈, RAEB) 후 1995년에 재발된 급성 골수성 백혈병 AML FAB M5a를 갖는 20세 남성의 말초 혈액으로부터 확립된 급성 골수성 백혈병 라인이다. THP-1은 급성 단핵구성 백혈병 환자로부터 유도된 인간 단핵구성 세포주이다. K562는 53세 여성 만성 골수성 백혈병 환자로부터 확립되고 유도된 인간 적백혈병 백혈병 라인이다.
CAR T 세포 생성
CD33 또는 CD123 CAR-코딩 렌티바이러스 벡터를 렌티-X 293T 렌티 패키징 세포주의 일시적인 형질감염에 의해 생산하였다. 렌티-X 293T 세포를 폴리-D 리신 코팅된 15-cm 플레이트[비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 새너제이 소재)]에서 평판배양하였다. 다음날, 렌티-X 293T 세포를 리포펙타민 3000[써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 매사추세츠주 왈탐 소재)]을 사용하여 패키징 및 인벨롭 벡터(pMDLg/pRRE, pMD-2G 및 pRSV-Rev)와 함께 CAR을 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 렌티바이러스 상청액을 형질감염 후 24 및 48시간에 수확하고, 3,000 RPM으로 10분 동안 원심분리시켜 세포 파괴물을 제거하고, 드라이 아이스 상에서 냉동시키고, -80℃에서 저장하였다. 정상 공여자로부터의 인간 PBMC를 NIH-승인된 프로토콜로 수득하고, 40 IU/mL 재조합 IL-2 및 5% FBS를 함유하는 AIM-V 매질에서 24시간 동안 1:3 비의 CD3/CD28 마이크로비드[다이나비즈 휴먼 티-익스팬더(Dynabeads Human T-Expander) CD3/CD28, 써모 피셔 사이언티픽, Cat# 11141D]로 활성화시켰다. 활성화된 T 세포를, 2 mL의 렌티바이러스 상청액 + 6-웰 플레이트 중에서 10 mcg/mL 프로타민 설페이트 및 100 IU/mL IL-2을 갖는 1 mL의 신선한 AIM-V 매질 당 200만개 세포로 재현탁시켰다. 플레이트를 32℃에서 2시간 동안 1,000 x g로 원심분리하고, 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 전술된 동일한 형질도입 과정을 반복함으로써, 제2 형질도입을 다음날에 수행하였다. CD3/CD28 비드를 형질도입 후 3일에 제거하고, 세포를 8 또는 9일에 수확될 때까지, 2 또는 3일마다 첨가된 신선한 IL2-함유 매질과 함께 100 IU/mL IL2를 함유하는 AIM-V로 300,000개 세포/mL로 배양하였다.
유세포분석
CD33 CAR-형질도입된 T 세포의 표면 발현은 단백질-L(써모 피셔) 또는 비오티닐화된 인간 시글렉-3/CD33 단백질[아크로 바이오시스템즈(Acro Biosystems), 미국 델라웨어주 뉴워크 소재]을 사용하는 유세포분석 및 이어서 스트렙타비딘(Streptavidin)-PE[바이오레전드(BioLegend), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재]에 의한 항온처리에 의해 측정하였다. CD123 CAR 발현은 단백질-L로 검출하였다. CD33, CD123 및 다른 세포 표면 마커의 발현은 이바이오사이언스(eBioscience)(써모 피셔)로부터의 하기 항체를 사용하여 검출하였다: CD33, CD45, CD3, CD8a, CD4, CD10.
PDX
100만개의 PDX 백혈병 세포 JMM117을 CAR T 세포 전달의 1주 전에 NSG 마우스에 주사하였다. 마우스를 0일에 CAR T 세포로 처리하였다. 2주 후에, 마우스를 죽이고, 백혈병 세포 및 CAR T 세포에 대한 분석을 수행하였다.
세포독성 검정
100 μL의 RPMI 매질 중 5E4의 표적 종양 세포를 96-웰 플레이트[코닝(Corning, 등록상표)(미국 뉴욕주 크로닝 소재) 바이오코트(BioCoat, 상표) 폴리-L-리신 96-웰 투명한 TC-처리된 평저 검정 플레이트]에 로딩하였다. 동일한 양의 CAR T 세포를 다음날 지정된 웰에 첨가하였다. 초기 인큐사이트 세포자멸 마커[에센 바이오사이언스(Essen BioScience), 미국 미시건주 앤 아버 소재]를 100 μL PBS에 희석하고 1 μL의 희석제를 각각의 웰에 첨가하였다. GFP 및/또는 RFP 형광 발현에 대해 플레이트를 스캔하여 40시간 동안 30분마다 인큐사이트 줌(IncuCyte ZOOM, 등록상표) 시스템을 사용하여 세포의 세포자멸을 모니터링하였다. 각각의 시점에서 세포 살해의 백분율은 기준선-수정되었다.
사이토카인 생산의 분석
표적 종양 세포 및 형질도입된 CAR 양성 T 세포를 1XPBS로 3회 세척하고, RPMI에 1E6/mL로 재현탁하였다. 100 μL의 종양 세포 및 100 μL의 CAR 양성 T 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 로딩하였다. T 세포만 및 종양 세포만의 대조군을 준비하였다. 모든 시험을 2회 또는 3회 수행하였다. 세포를 37℃에서 18시간 동안 항온처리하고, 120 μL의 배양 상청액을 사이토카인 생산의 검출을 위해 수확하였다. ELISA 키트[알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미국 미네소타주 미니아폴리스 소재] 또는 멀티플렉스 검정[메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), 미국 메릴랜드주 록빌 소재]을 사용하여 상청액의 사이토카인 수준을 측정하였다.
생물에너지 분석
해당 스트레스 시험을 위해, CAR-T 세포를 L-글루타민(200 mM) 및 NaCl(143 mM)이 보충된 무혈청 비완충 DMEM 매질[시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미저리주 세인트 루이스 소재]에 현탁하였다. 0.6 mL의 0.5% 페놀 레드(Phenol Red) 용액(시그마P0290)을 3 mg/L의 최종 농도로 첨가하고, pH를 7.35 +/- 0.05로 조정하였다. CAR-T 세포는 T 세포 부착을 용이하게 하기 위해 셀-탁(Cell-Tak)(코닝)으로 코팅된 시호스 세포 플레이트(웰 당 3E5 세포) 상으로 평판배양하였다. 간단히 말해서, 카트리지를 검정 전날 수화하였다. 검정 당일, 플레이트를 셀-탁으로 코팅하고, 세포를 셀-탁 코팅된 플레이트에 시딩하고, 검정을 위해 XF24 분석기 상에 위치시켰다. 상세한 과정은 다음과 같다. 검정 카트리지를 처음에 200 μL/웰의 XF 보정 용액으로 수화시키고, 하이드로 부스터를 첨가하고, 파라필름에 싸서, 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트의 상부에 위치시키고, CO2 없이 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 이어서, 세포 배양 플레이트를 다음과 같이 셀-탁으로 코팅하였다: 1 플레이트의 경우, 46 μL의 셀-탁을 204 μL TC 물 및 1 mL의 NaHCO3에 희석시켰다. 믹서를 각각의 웰에 50 μL 분배하고, 플레이트를 실온에서 20분 이상 동안 항온처리하였다. 셀-탁 용액을 제거한 후, 250 μL의 TC 물을 사용하여 각각의 웰을 세척하였다. CAR-T 세포(3E5/웰)를 158 μL 검정 매질에서 평판배양하였다. 이어서, 세포 배양 플레이트를 느린 가속 및 감속 없이 1초 동안 450 rpm으로 회전시키고, 이어서 플레이트의 방향을 반전시키고, 느린 가속 및 감속 없이 1초 동안 650 rpm으로 회전시켰다. 이어서, 플레이트를 37℃ 0% CO2에서 25 내지 30분 동안 항온처리하였다. 25 내지 30분 항온처리 후, 158 μL의 따뜻한 검정 매질을 수동 P200 피펫터를 사용하여 벽의 측면을 따라 각각의 웰의 상부에 천천히 부드럽게 첨가하였다. 세포 플레이트를 15 내지 25분 동안 항온처리하였다. 15 내지 25분 후, 플레이트를 XF24 분석기 상에 위치시켰다(보정 완료 후). XF 검정이 실행되었다. 용액을 3개의 포트를 통해 순차적으로 주입하였다: 포트 A: 글루코스 80 mM(3 mL 검정 매질에서 96 μL의 저장 용액). 포트 B: 올리고마이신 18 μM(3 mL 검정 매질 중 10.8 μL의 저장 용액). 포트 C: 2DG 사용 저장 용액. 카트리지 포트에 75 μL의 약물 용액을 로딩한 후 정적 상태에서 ECAR(mpH/분)을 측정하여 해당 스트레스 시험을 수행하였다. 미토콘드리아 스트레스 시험을 위해, CAR T 세포를 D-글루코스(25 mM) 및 나트륨 피루베이트(1 mM)를 갖는 무혈청 비완충 DMEM 매질에 현탁하였다. 미토콘드리아 스트레스 시험은 정적 상태에서 OCR(pmol/분)을 측정함으로써, 올리고마이신(0.5 μM), FCCP(0.5 μM), 로테논(1 μM) 및 안티마이신 A(1 μM)(시그마-알드리치)를 순차적으로 주사한 후 상기한 바와 유사하게 수행하였다. 시호스 시스템을 사용한 실험은 하기 분석 조건을 사용하였다: 2분 혼합; 2분 대기; 및 3분 측정. 모든 샘플은 6회 반복 시험하였다.
형광 현미경 이미징 및 분석
MOLM14(4x105) 종양 세포를 이비디(ibidi) μ-디쉬 35 mm의 셀-탁 코팅된 내부 웰 상에서 1 mL의 따뜻한 RPMI에서 평판배양하고, 37C 인큐베이터에서 밤새 항온처리하였다. 이어서, 종양 세포를 획스트(Hoechst) 염료(2.5 μg/mL)로 염색하였다. T 세포를 형질도입하여 CAR-mCherry 융합 단백질을 발현시켰다. CAR-T 양성 세포를 분류하고, 이어서, 7.5 E5의 이러한 CAR-T 세포를 접시에서 고정된 MOLM14 세포와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 새로 준비한 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, 이미징 준비에서 비-경화 장착 매질에 장착하였다.
면역 시냅스에서 액틴 발현을 평가하기 위해, 상기 프로토콜을 수정하고, 파라포름알데하이드 고정 후 0.1% 트리톤 x를 샘플에 투과시켰다. 세포를 팔로이딘(Phalloidin) 640(165 nM)으로 염색하고, 이어서 장착하기 전에 세척하였다.
제이스(Zeiss) LSM 880을 사용하여 에어리스캔(Airyscan) 이미지를 획득하였다. 노출 설정은 전체 실험에서 동일하였다. 면역 시냅스의 전체 부피를 포괄하기 위해 이미지를 z 스택으로서 수집하였다.
63x 대물 렌즈를 가진 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) Ti2 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 일부 이미지를 획득하였다. 0.5 μM 두께의 z 스택은 3개 채널(405, 488, 640 nm)에 대해 초점면 위와 아래에서 10 μM 범위에 걸쳐 병렬로 획득되었다. 각각의 채널은 각각 405, 488 및 640에 대해 300 ms, 1 s 및 300 ms의 노출 시간으로 50% 레이저 강도로 여기되었다. 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 데이터 분석에 사용하였다.
면역 시냅스(IS)에서의 CAR 응집은 CD33-28 및 CD33-BBz CAR 구축물 둘 다에 대해 관찰되었다. F-액틴의 증가된 축적은 CAR 구축물 둘 다에 대해 결합되지 않은 세포에 비해 IS에서 상관적으로 관찰되었다. CAR 및 액틴 축적을 평가하기 위해 각각의 CAR에 대한 n > 10 면역 시냅스에 대한 정량 분석을 수행하였다. 구체적으로, 시냅스에서의 평균 형광 강도(MFI)의 비 대 나머지 T 세포 표면에서의 MFI의 비가 측정되었다. 추가 매개변수는 IS에서의 MFI * 부피 대 나머지 T 세포 표면에 대한 MFI * 부피의 비를 포함하고, IS의 MFI * 부피 대 T 세포의 MFI * 부피, 및 세포내 CAR 신호 대 세포외 CAR 신호가 또한 평가되었다. 액틴의 경우, IS에서의 형광 강도를 기준선 액틴 T 세포 발현에 대해 정규화하였다. IS에서의 액틴의 MFI * 부피를 결정하고, 기준선 액틴 발현을 설명하기 위해 미결합된 T 및 종양 세포의 MFI * 부피를 빼었다.
mCherry에 대한 서열은 다음과 같다:
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG(서열번호 40).
생체내 실험
동물 실험을 NCI 베데스다 동물 관리 및 사용 위원회(NCI Bethesda Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. AML 세포주 및 이종이식된 인간 AML 견본을 NSG 마우스에 IV 주사하였다. 루시퍼라제 발현 계통의 경우, 제노겐(Xenogen) IVIS 루미나(Lumina)[칼리퍼 라이프 사이언시즈(Caliper Life Sciences), 미국 매사추세츠주 홉킨턴 소재]를 사용하여 백혈병을 검출하였다. NSG를 3 mg D-루시페린(칼리퍼 라이프 사이언시즈)으로 복강내 주사하고, 4분 후 AML 세포주에 대해 1분의 노출 시간으로 이미징하였다. 리빙 이미지(Living Image) 버전 4.1 소프트웨어(칼리퍼 라이프 사이언시즈)를 사용하여 각각의 마우스에 대한 총 생물발광 신호 플럭스를 광자/초로 분석하였다. 적출시, 마우스의 골수, 비장 및 간을 채취하여 유세포분석으로 평가하였다.
통계 분석
통계 분석을 프리즘(Prism) 7.0 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 플롯은 평균 +/- SD로 표시된다. 모든 데이터의 통계적 유의성은 짝이 없는 스튜던트 t 검정을 사용하여 계산되었다. p < 0.05는 유의한 것으로 간주되었다.
CD33 및 CD123 CAR의 개발
2세대 CAR은 4-1BB 또는 CD28 공-자극 도메인과 조합된 2개의 scFv를 사용하여 개발되었다. 항-CD33 CAR의 경우, CD33.1 CAR은 마일로타르그로도 공지된 겜투주맙 항체를 포함하고; CD33.2 CAR은 린투주맙으로 공지된 항체, 또는 인간화된 M195(Hu195)를 포함한다. 항-CD123 CAR은 인간 CD123에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체인 32716에서 유도되었다. 형질도입 후, 단백질 L 검출은 동일한 scFv를 갖는 CAR이 공-자극 도메인에 관계 없이 유사한 양의 형질도입 효율을 갖는 것으로 나타났다. 형질도입 효율의 차이는 scFv와 관련이 있는 것으로 보인다. CD123 CAR에서, 형질도입 효율은 더 높지만, CAR 표면 발현 밀도는 일반적으로 CD33 CAR보다 낮게 보인다(도 2a 내지 2f 참고).
AML 상의 CD33 및 CD123 표면 발현 평가
4개의 세포주, K562, MV411, MOLM14 및 THP1을 CD33의 표면 발현에 대해 항 -CD33 유동 항체를 사용하여 평가하였다. MV411, MOLM14 및 THP1은 CD33의 증가된 표면 발현의 오름차순으로 CD33을 발현한다. CD123 표면 발현의 경우, K562, THP1, MOLM14 및 MV411의 순서로 표면 발현이 증가한다. 이러한 3개의 AML 세포주는 광범위한 표면 발현을 나타내고, 이에 따라 추가 실험을 위해 선택되었다(도 3a 및 3b 참고).
시험관내 사이토카인 생산 및 세포독성 검정은 종양 표적에 대한 CAR 활성 확인한다
시험관내 사이토카인 검정을 사용하여 AML CAR의 효능을 평가하였다. 일반적으로, 사이토카인 생산은 표적 항원 발현의 수준과 상관되고, CD28 장착된 CAR이 다수의 AML 세포주에 걸쳐 4-1BB 장착된 CAR보다 많은 인터페론-감마를 지속적으로 생산함을 나타냈다. CD33.2 및 CD123 CAR은 일반적으로 CD33.1 CAR보다 IFN-감마를 적게 만들었다. 특히, CD33.1 BBz 및 CD28z 및 CD33.2 BBz CAR은 종양 항원 자극 없이 IFN-감마 생성과 함께 약간의 활성을 가졌지만, CD33.28z CAR은 검출가능한 수준의 IFN-감마를 갖지 않았다.
IL-2는 CAR 효능에 대해 보다 신뢰할 수 있는 생산자로 간주되었다. CD33.1-28z 및 CD33.1-BBz는 CD33 고 항원 발현 THP1 세포주와 함께 항원처리될 때만 다량의 IL-2를 생산한다. 대조적으로, CD33.2-28z CAR은 표적 항원의 중간 수준의 발현을 갖는 MOLM14에 대해 유사한 수준의 IL-2 THP1 라인 및 적절한 양의 IL-2를 만들었다. CD123 CAR은 또한 MOLM14 및 THP1에 대해 적절한 양의 IL-2를 만들었지만, MV411에서는 IL-2 수준이 검출되지 않았다. CD33.1 및 CD33.2 CAR 둘 다 MV411에 대해 낮은 수준의 IL-2를 생산하여, 생체내 낮은 활성이 낮은 표면 항원 발현에 기인한 것일 수 있음을 나타내고, 또한 생체 내에서 낮은 활성을 가질 수 있음을 시사한다(도 4a 내지 4f 참고).
인큐사이트 살해 검정에서, CD33 CAR 형질도입된 T 세포를 표적 백혈병 세포와 함께 항원처리하였다. 원래 평판배양된 세포에 대한 살아있는 백혈병 세포의 백분율을 도표화하였다. 도표는 시험관 내에서 THP1, MV411 및 MOLM14 백혈병의 효율적인 살해를 증명하였다(도 5a 내지 5e 참고).
28z CAR은 AML 모델에서 4-1BB CAR보다 더 효과적이고 BBz CAR은 골수외 질환 재발 패턴을 보여준다
생체 내에서 이러한 발견을 번역하기 위해, 이종이식 모델에 THP1 AML 세포를 주사하고, CD33 CAR T 세포로 처리하였다. 생물발광 이미징에 의해, CD33.1 CAR은 체중 감소, 저체온증 및 무기력감에서 볼 수 있듯이 CD33.2 CAR보다 더 많은 독성을 나타냈다. CD33.2-CD28z 처리된 마우스는 검출가능한 질병이 없었고, CD33-4-1BB 처리된 마우스는 백혈병이 있었는 데, 이는 28z 장착된 CAR이 AML 박멸에 4-1BB CAR보다 효과적임을 나타낸다. 이것은 ALL 모델에서의 관찰과 상이하다. 이 현상은 THP1 모델의 CD123 CAR, MOLM14 모델의 CD33.1 CAR에서 추가로 확인되었다.
조합된, 시험관내 및 생체내 결과는 공-자극 도메인이 CAR T 세포 기능성에서 중요한 역할을 하고 다른 종양 모델에서 다른 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 생물발광에 의해 검출된 마우스에서 AML의 존재를 확인하기 위해, 마우스 조직에서 유세포분석을 수행하였다. CD33-4-1BB 처리된 동물은 골수에서 어떠한 백혈병도 없었고, 이는 골수외 질환(EMD)이 있음을 시사한다. 덜 강력한 CD33-4-1BB CAR 처리된 마우스에서 EMD의 발달은 CAR 면역 압력이 골수와 같은 백혈병의 원발성 부위를 제거할 만큼 충분히 강력할 수 있지만, AML이 시딩할 수 있는 2차 조직의 질병을 제거할 수 없음을 시사한다.
이러한 2개의 공-자극 인자의 효과를 추가로 조사하기 위해, CAR 압력이 없는 경우에도 EMD를 정기적으로 나타내는 다른 AML 모델인 MV411이 사용되었다. MV411에 대해 CD33.2-CD28을 사용하는 경우, 골수에서의 제거가 있었지만, CD33.2-CD28 CAR은 EMD의 발생을 예방할 수 없었다. 이러한 실험은 CD28 공-자극 도메인이 THP1에서 4-1BB보다 더 강력하지만, CD28의 효능이 여전히 모든 모델에서 EMD를 극복할 수 없음을 시사한다.
MOLM14 모델에서, 마우스에서 백혈병 및 CAR T 세포의 표현형을 보기 위해 조직을 수확했을 때, 이러한 세포 유형을 분석하기 위해 유세포분석을 사용하였다. GFP CAR 처리된 마우스에서, CD33+ 백혈병 및 형질도입된 T 세포가 골수 및 비장 구획에서 발견되었다. CD33.1 BBz CAR 치료된 병태에서, 골수와 비장에서 발견되는 CD33+ 백혈병의 양이 적었고, 다리 및 장 주변을 감싸는 많은 양의 고형 종양이 발견되었다. 종양 세포의 유세포분석은 AML이 CD33 발현의 감소된 양으로 이동하면서 여전히 CD33 표면 발현을 유지한다는 것을 보여준다.
CD33.2 CAR의 효능을 확인하기 위해, 공격적인 MOLM14 종양 모델에 대해 투약량 적정을 수행하였다. CD33.2-28z CAR은 500만개만큼 적은 CAR+ T 세포로 백혈병을 효율적으로 제거할 수 있다(도 6a 내지 6e 참고).
PDX 박멸에 대한 CD33.2-CD28z CAR의 강력한 활성
CD33 CAR의 활성을 확인하기 위해 임상 관련 1차 아동기 AML PDX 모델을 사용하였다. 100만개의 PDX 백혈병 세포 JMM117을 -7일에 NSG 마우스에 주사하고, 이어서 0일에 CAR T 세포의 1E6의 ADT를 주사하였다. CD28 CAR은 BBz CAR보다 우수했고, CD33.2-BBz는 생체 내에서 CD33.1-BBz CAR보다 우수하게 수행한다(도 7a). 이는 2주차 유동 분석으로 CD33.1 처리된 마우스 비장이 검출가능한 수준의 백혈병을 가졌지만, CD33.2 CAR 군에서는 거의 없는 것으로 확인되었다(도 7b). 또한, 이러한 PDX 모델은 41-BBz 공-자극 도메인을 가진 CAR이 더 오래 상승된 상태로 유지됨을 나타냈다(도 7c). CAR 지속성을 살펴보면, CD33.1 및 CD33.2 CAR 둘 다에서 4-1BBz 버전이 AML 모델에서 BBz CAR의 높은 독성과 관련될 수 있는 CD28z CAR보다 훨씬 더 많은 양으로 검출되는 것으로 관찰되었다.
CD28z 함유 CAR은 4-1BB CAR에 비해 증가된 효능을 나타내지만, 증가된 독성은 없다. 연장된 B 세포 무형성증은 CD19 CAR-T 세포 치료 후 허용되는 결과일 수 있지만, 골수 지향된 CAR-T 세포 접근법에 따른 연장된 골수억제 및 지속된 무형성에 대한 우려를 감안할 때, 덜 지속적인 CD28z 기반 CAR은 그렇지 않은 경우, 더 효율적으로 질병을 박멸할 뿐만 아니라 CAR의 자가-제한된 지속성을 갖는 정상적인 조혈 회복을 허용함으로써 더욱 유리할 수 있다. CD123 CAR을 고갈시키기 위한 전략 또는 AML 지시 CAR 후 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)을 고려하는 것은 지속적 CAR을 효과적으로 제거하고 효과적인 조혈을 복원하기 위한 다른 전략을 나타낸다.
전술된 바에 기초하여, CD33.2-CD28z CAR은 다른 모든 구축물에 비해 독성이 적은 가장 강력한 CAR이다. 항-CD33 CAR에 대한 공-자극 도메인의 영향은 항-CD19 또는 항-CD22 CAR에 대한 관찰과 반대이다.
실시예 2
본 실시예는 백혈병 세포 상에서 CD33 표적 항원 발현의 유세포분석을 증명한다.
도 8 참고: U937은 37세 남성 환자의 조직구 림프종으로부터 단리된 골수 계통의 조직구성 림프종 라인이다. THP1은 급성 단핵구성 백혈병을 갖는 1세 소년의 혈액으로부터 배양된 인간 급성 단핵구성 백혈병 라인이다. NALM6은 급성 림프모 구성 백혈병을 갖는 19세 남성의 말초 혈액으로부터 확립된 인간 B 세포 전구체 백혈병 라인이다. MV411은 급성 단핵구성 백혈병(AML FAB M5)을 갖는 10세 소년으로부터 확립된 급성 단핵구성 백혈병 라인이다. MOLM14는 초기 골수이형성 증후군(MDS, 모세포 과다 불응성 빈혈, RAEB) 후, 1995년 재발시 급성 골수성 백혈병(AML FAB M5a)을 갖는 20세 남성의 말초 혈액으로부터 확립된 급성 골수성 백혈병 라인이고; FLT3의 내부 직렬 복제를 갖고; 세포주는 CBL 델타엑손(deltaExon)8 돌연변이를 갖는다.
실시예 3
본 실시예는 본 발명의 양태에 따른 CAR의 사용을 증명한다.
구축물의 시험관내 시험은 항-CD33 CD28 CAR이 다수의 AML 세포주에 걸쳐 항-CD33 4-1BB CAR보다 많은 IL-2 및 인터페론-감마를 일관되게 생산하는 것으로 밝혀졌다. 도 9a 및 9b는 CD33Hu195-CD28Z CAR에 대한 결과를 제공한다.
이러한 발견을 생체 내에서 번역하기 위해, 이종이식 모델(마우스: NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ stock#005557)에 MOLM14 AML 세포를 주사하고, 항-CD33 CD28 CAR 또는 항-CD33 4-1BB CAR T 세포로 처리하였다. 생물발광 이미징에 의해, 항-CD33 CD28 CAR-처리된 마우스는 검출가능한 질병이 없는 반면, 항-CD33 4-1BB CAR-처리된 마우스는 백혈병을 나타냈다(도 10 참고).
조합된 시험관내 및 생체내 결과는 공-자극 도메인이 CAR T 세포 기능성에서 역할을 하고 CAR 효능을 개선할 수 있음을 시사한다.
생물발광에 의해 검출된 마우스에서 AML의 존재를 확인하기 위해, 모의군 및 항-CD33 4-1BB CAR-처리된 마우스의 조직에서 유세포분석을 수행하였다. 모의군 T 세포 처리된 마우스의 골수에서는 백혈병이 발견되지 않았다. 대조적으로, 항-CD33 4-1BB CAR-처리된 동물은 골수에서 백혈병이 없었고, 이는 골수외 질병(EMD)의 존재를 시사한다. 덜 강력한 항-CD33 4-1BB CAR-처리된 마우스에서 EMD의 발생은 CAR 면역 압력이 골수와 같은 백혈병의 원발성 부위를 제거할 만큼 충분히 강력할 수 있지만, AML이 시딩할 수 있는 2차 조직에서 질병을 제거할 수 없음을 시사한다. 화학요법에 의한 AML의 치료는 종종 녹색종 형태의 골수외 질병의 발생을 야기한다.
다른 AML 모델인 THP1은 CAR 압력이 없는 경우에도 정기적으로 EMD를 나타낸다. THP1에 대해 항-CD33 CD28 CAR을 사용하는 경우, 구획 골수에 제거가 있었지만, 항-CD33 CD28 CAR은 EMD의 발생을 예방할 수 없었다. 이러한 실험은, CD28 공-자극 도메인이 MOLM14에서 4-1BB보다 더 강력하지만, CD28의 효능은 여전히 모든 모델에서 EMD를 극복할 수 없음을 시사한다.
실시예 4
본 실시예는 본 발명의 양태에 따른 CAR의 사용을 증명한다.
도 11 및 12는 추가 데이터를 나타낸다.
도 11a: 비오틴화된 시글렉-3에 대한 결합은 시험관 내에서 CD33.2 CAR의 기능을 확인하였다.
도 11b: 상이한 렌티 바이러스 생산 설정에서 CD33.2-28Z의 강력한 활성의 확인.
도 12a 내지 12c: CD33-C28z는 더 많은 여분의 호흡 능력 및 양호한 ATP 생산-연관 산소 소비율을 갖는 더 강한 미토콘드리아 호흡을 증명하였다.
도 12d 내지 12f: 놀랍게도, CD33-28z는 또한 더 높은 세포외 산성화율을 갖는 강화된 해당 대사를 갖는다.
비오티닐화된 인간 시글렉-3/CD33 단백질을 사용한 CD33 CAR 검출의 경우: 2 μL의 비오티닐화된 인간 시글렉-3/CD33 단백질의 첨가[아비 태그(Avitag, 상표) 아크로 바이오시스템즈, 미국 델라웨어주 뉴워크 소재], 20분 동안의 항온처리, 1회 세척, 및 0.5 μL의 스트렙타비딘-PE와의 항온처리, 추가 10분 동안의 항온처리, 1회 세척, FACS 분석에 의한 CAR 검출.
RNAseq 데이터의 주요 성분 분석은 동일한 수의 MOLM14 표적 세포와의 공동-항온처리 후 6시간 또는 24시간에 CD33.2-28z 및 CD33.2-BBz CAR과 관련된 상이한 유전자 발현 프로파일을 나타냈다.
CD33.2-28z는 온 사이트 오프(on site off) 종양 독성이 없거나 미미함을 나타냈다. CAR+ T 세포의 1E5를 정상 조직을 나타내는 동일한 수의 다양한 iPS 세포주와 함께 공동-항온처리하였다. 배양 상청액의 IFNg 수준은 알앤디로부터의 IFNg 키트로 검출하였다.
실시예 5
본 실시예는 본 발명의 양태에 따른 CAR의 사용을 증명한다.
NALM6은 비-CD33 발현 종양 모델로 사용되었고, MOLM14 모델과 비교되었다. 치료는 CD33.2-28z CAR을 사용하여 수행되었다. NALM6 모델에서는 종양이 계속 진행되는 반면, MOLM14 모델에서는 CAR 처리 후 3일 후에 종양 부담이 감소되었다(도 13 참고).
본원에 인용된 출판물, 특허 출원 및 특허를 비롯한 모든 참고문헌은, 각각의 참고문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참고로 혼입되고 그의 전체가 본원에 제시되는 것과 동일한 정도로, 본원에 참고로 혼입된다.
본 발명을 기재함에 있어서(특별히 하기 청구범위와 관련하여) 단수형 용어 및 유사한 언급은, 본원에 달리 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "하나 이상의" 및 이어서 하나 이상의 항목의 목록(예를 들어, "하나 이상의 A 및 B")의 사용은, 본원에 달리 지시되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 열거된 항목으로부터 선택되는 하나의 항목(A 또는 B) 또는 열거된 항목 중 2개 이상의 임의의 조합(A 및 B)을 의미하는 것으로 간주된다. 용어 "포함하는", "갖는", "포함되는" 및 "함유하는"은, 달리 주지되지 않는 한, 확장가능한 용어(즉, "비제한적으로 포함함"을 의미함)인 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 값의 범위에 대한 언급은, 달리 본원에 지시되지 않는 한, 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 작용하고자 할 뿐이고, 각각의 별도의 값은 이것이 개별적으로 본원에 언급되는 것과 마찬가지로 본원에 혼입되는 것이다. 본원에 기재된 모든 방법은, 본원에 달리 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 표현(예를 들어, "예컨대")의 사용은, 단지 본 발명을 좀 더 잘 설명하려는 것이고, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범주에 제한을 두는 것이 아니다. 본 명세서에서 어떠한 표현도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실행에 필수적임을 지시하는 것으로 이해되어서는 안된다.
본 발명의 바람직한 양태, 예컨대 본 발명을 실행하기 위해 본 발명자들에게 공지된 최적의 방식이 본원에 기재되어 있다. 이들 바람직한 양태의 변경은 전술된 기재내용을 살펴볼 경우 당업자에게 분명할 수 있다. 본 발명자들은 당업자라면 이러한 변경을 적절히 이용할 것으로 기대하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실행될 수 있음을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률에 의해 허용될 경우 본원에 첨부된 청구범위에 인용된 대상 발명의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 게다가, 이의 모든 가능한 변경에서 상기 기재된 요소들의 임의의 조합은, 본원에 달리 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 본 발명에 의해 포괄된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES <120> ANTI-CD33 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND THEIR USES <130> 741580 <140> PCT/US2019/022309 <141> 2019-03-14 <150> US 62/643,015 <151> 2018-03-14 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Met 1 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro 20 <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser 20 25 30 Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr 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ggccttcatc atcttctggg tgaggagcaa gaggtccagg 1020 ctgctgcaca gcgactacat gaatatgacc cccagaaggc ccggccccac cagaaagcac 1080 tatcagccct acgccccccc cagggacttt gccgcctaca ggagcagggt gaagttcagc 1140 agatccgccg atgcccctgc ttaccagcag ggccagaacc agctgtataa cgagctgaac 1200 ctgggcagga gggaggaata cgacgtgctg gataagagga ggggaaggga ccccgagatg 1260 ggcggaaagc ccaggaggaa gaacccccag gagggcctgt acaatgagct gcagaaagac 1320 aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agaggaggag gggcaagggc 1380 catgacggcc tgtaccaagg cctgtccacc gccaccaagg atacctacga cgccctgcac 1440 atgcaggccc tgcctcccag gggatcctaa 1470 <210> 30 <211> 7691 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 30 gacaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt 60 gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc 120 cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag 180 ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc 240 actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc 300 cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg 360 ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg 420 ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc 480 ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt 540 cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctggaatt 600 cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt 660 taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt 720 ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac 780 tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg 840 cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga 900 aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga 960 aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 1020 gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 1080 tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc 1140 gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 1200 cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 1260 aggcttttgc gtcgagacgt acccaattcg ccctatagtg agtcgtatta cgcgcgctca 1320 ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc 1380 cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 1440 ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta 1500 agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 1560 cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 1620 gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 1680 aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 1740 cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 1800 acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 1860 tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta 1920 acgcttacaa tttaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 1980 ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 2040 aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 2100 tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 2160 atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 2220 agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 2280 tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 2340 tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 2400 atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 2460 ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 2520 tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 2580 acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 2640 ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 2700 aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 2760 ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 2820 cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 2880 gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 2940 actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 3000 agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 3060 cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 3120 tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 3180 agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 3240 ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 3300 acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 3360 ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 3420 gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 3480 gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 3540 gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 3600 tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 3660 caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 3720 tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 3780 gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg 3840 agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt 3900 ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc 3960 gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc 4020 ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct 4080 atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa aagctggagc 4140 tgcaagctta atgtagtctt atgcaatact cttgtagtct tgcaacatgg taacgatgag 4200 ttagcaacat gccttacaag gagagaaaaa gcaccgtgca tgccgattgg tggaagtaag 4260 gtggtacgat cgtgccttat taggaaggca acagacgggt ctgacatgga ttggacgaac 4320 cactgaattg ccgcattgca gagatattgt atttaagtgc ctagctcgat acataaacgg 4380 gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact 4440 gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg 4500 tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag 4560 tggcgcccga acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg 4620 actcggcttg ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca 4680 aaaattttga ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag 4740 cgggggagaa ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa 4800 tataaattaa aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatcct 4860 ggcctgttag aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt 4920 cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg 4980 catcaaagga tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa 5040 aacaaaagta agaccaccgc acagcaagcg gccgctgatc ttcagacctg gaggaggaga 5100 tatgagggac aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa ttgaaccatt 5160 aggagtagca cccaccaagg caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg 5220 aataggagct ttgttccttg ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcgtc 5280 aatgacgctg acggtacagg ccagacaatt attgtctggt atagtgcagc agcagaacaa 5340 tttgctgagg gctattgagg cgcaacagca tctgttgcaa ctcacagtct ggggcatcaa 5400 gcagctccag gcaagaatcc tggctgtgga aagataccta aaggatcaac agctcctggg 5460 gatttggggt tgctctggaa aactcatttg caccactgct gtgccttgga atgctagttg 5520 gagtaataaa tctctggaac agatttggaa tcacacgacc tggatggagt gggacagaga 5580 aattaacaat tacacaagct taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga 5640 aaagaatgaa caagaattat tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa 5700 cataacaaat tggctgtggt atataaaatt attcataatg atagtaggag gcttggtagg 5760 tttaagaata gtttttgctg tactttctat agtgaataga gttaggcagg gatattcacc 5820 attatcgttt cagacccacc tcccaacccc gaggggaccc gacaggcccg aaggaataga 5880 agaagaaggt ggagagagag acagagacag atccattcga ttagtgaacg gatctcgacg 5940 gtatcgatta gactgtagcc caggaatatg gcagctagat tgtacacatt tagaaggaaa 6000 agttatcttg gtagcagttc atgtagccag tggatatata gaagcagaag taattccagc 6060 agagacaggg caagaaacag catacttcct cttaaaatta gcaggaagat ggccagtaaa 6120 aacagtacat acagacaatg gcagcaattt caccagtact acagttaagg ccgcctgttg 6180 gtgggcgggg atcaagcagg aatttggcat tccctacaat ccccaaagtc aaggagtaat 6240 agaatctatg aataaagaat taaagaaaat tataggacag gtaagagatc aggctgaaca 6300 tcttaagaca gcagtacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat 6360 tgggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac atacaaacta 6420 aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttcg ggtttattac agggacagca 6480 gagatccagt ttggctgcat acgcgtcgtg aggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg 6540 cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta 6600 gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc 6660 cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa 6720 cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt 6780 tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct 6840 tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc 6900 cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat 6960 ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt 7020 ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga 7080 tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca 7140 gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta 7200 gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc 7260 ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc 7320 cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga 7380 gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac 7440 tgagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg tgcttttgga gtacgtcgtc 7500 tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac 7560 tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt 7620 tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca 7680 ggtgtcgtga g 7691 <210> 31 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 31 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 20 25 30 Cys Gln <210> 32 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 32 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Asn Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 20 25 30 Cys Gln <210> 33 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 33 Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Tyr Cys Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala 20 25 <210> 34 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 34 Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Asp Phe Tyr 1 5 10 15 Tyr Cys Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala 20 25 <210> 35 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 130 135 140 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val 145 150 155 160 Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys Thr Ser Ser Gly 245 <210> 36 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser 20 25 30 Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala 130 135 140 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu 145 150 155 160 Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Val Lys Arg <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 37 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 1 5 10 <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 38 Thr Ser Ser Gly 1 <210> 39 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 39 Ser Gly 1 <210> 40 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 40 atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60 gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120 cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180 ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240 cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300 gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360 ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420 atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480 gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540 gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600 aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660 cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 41 Asp Tyr Asn Met His 1 5 <210> 42 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 42 Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser Lys Ala <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 43 Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 1 5 10 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 44 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 45 Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 46 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 47 Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser Asn 1 5 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 48 Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 49 Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr 1 5 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 50 Glu Ser Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe 1 5 10 <210> 51 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 51 Ala Ala Ser 1 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 52 Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser 1 5

Claims (27)

  1. CD33에 대한 항원 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    (a) 상기 항원 결합 도메인이 Hu195의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
    (b) 상기 항원 결합 도메인이 Hu195의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고,
    CDR 영역이 서열번호 41 내지 46의 영역인,
    키메라 항원 수용체.
  2. 제1항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 서열번호 15의 중쇄 가변 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 서열번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 서열번호 4의 연결기 서열을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 서열번호 15, 4 및 16의 항원 결합 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 7의 CD8 막관통 도메인 및 서열번호 6의 CD8 힌지 도메인, 또는 (ii) 서열번호 11의 CD28 막관통 도메인 및 서열번호 10의 CD28 힌지 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포내 T 세포 신호전달 도메인이 서열번호 8의 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 서열번호 9의 CD3 제타 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 또는 둘 다를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    스페이서를 추가로 포함하는 키메라 항원 수용체.
  9. CD33에 대한 항원 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    (a) 상기 항원 결합 도메인이 hP67.6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고/거나;
    (b) 상기 항원 결합 도메인이 hP67.6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고,
    CDR 영역이 서열번호 47 내지 52의 영역인,
    키메라 항원 수용체.
  10. 제9항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 서열번호 3의 중쇄 가변 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 서열번호 5의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 서열번호 4의 연결기 서열을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 서열번호 3, 4 및 5의 항원 결합 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 7의 CD8 막관통 도메인 및 서열번호 6의 CD8 힌지 도메인, 또는 (ii) 서열번호 11의 CD28 막관통 도메인 및 서열번호 10의 CD28 힌지 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포내 T 세포 신호전달 도메인이 서열번호 8의 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 서열번호 9의 CD3 제타 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 또는 둘 다를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    스페이서를 추가로 포함하는 키메라 항원 수용체.
  17. 서열번호 16, 17, 20 또는 21을 포함하는 키메라 항원 수용체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  19. 제18항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열이 코돈-최적화된, 핵산.
  20. 제18항 또는 제19항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  21. 제20항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  22. 하나 이상의 제21항에 따른 숙주 세포를 포함하는 세포 집단.
  23. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체, 제18항 또는 제19항에 따른 핵산, 제20항에 따른 재조합 발현 벡터, 제21항에 따른 숙주 세포, 또는 제22항에 따른 세포 집단, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  24. (a) 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플을 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체, 제18항 또는 제19항에 따른 핵산, 제20항에 따른 재조합 발현 벡터, 제21항에 따른 숙주 세포, 제22항에 따른 세포 집단, 또는 제23항에 따른 약학 조성물과 접촉시켜 복합체를 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 복합체를 검출하는 단계로서, 상기 복합체의 검출이 암의 존재를 나타내는, 단계
    를 포함하는, 암의 존재를 검출하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    암이 급성 골수성 백혈병인, 방법.
  26. 포유동물에서 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체, 제18항 또는 제19항에 따른 핵산, 제20항에 따른 재조합 발현 벡터, 제21항에 따른 숙주 세포, 제22항에 따른 세포 집단, 또는 제23항에 따른 약학 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    암이 급성 골수성 백혈병인, 키메라 항원 수용체, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 또는 약학 조성물.
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