KR20200116075A - 항-egf 유사 도메인 다중 6(egfl6) 항체 및 암 진단 및 치료에서 이의 적용 - Google Patents

Abstract

항-EGF 유사 도메인 다중 6 항체(항-EGFL6 항체), 및 항-EGFL6 항체를 사용한 암 검출(또는 진단) 및 치료가 제공된다. 또한, EGFL6에 결합시키고 혈관신생 및 암 세포 성장을 억제하는 능력을 갖는, 단쇄 항체 단편(scFv) 및 인간화된 항체가 제공된다.

Description

항-EGF 유사 도메인 다중 6(EGFL6) 항체 및 암 진단 및 치료에서 이의 적용

본 발명은 암 검출(또는 진단) 및 치료의 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항-EGF 유사 도메인 다중 6 항체(항-EGFL6 항체), 및 항-EGFL6 항체를 사용한 암 검출(또는 진단) 및 치료에 관한 것이다.

암은 신체의 임의의 곳에서 비정상 세포의 조절되지 않은 성장이다. 비정상 세포는 암 세포, 악성 세포, 또는 종양 세포로 불리워진다. 암의 조기 진단은 종종 이러한 질병의 성공적인 치료 또는 치유의 가능성을 증가시킨다.

바이오마커는 암의 검출에서 잠재적인 툴(potential tool)이다. EGFL6은 상피 성장 인자(EGF) 반복 수퍼패밀리 단백질의 구성원이고, EGF-유사 반복 영역 및 인테그린 연관 모티프(integrin association motif; RGD)로 이루어진다. EGFL6은 내피 세포 이동 및 혈관신생을 증진시킨다. 조지 영(George Yeung) 등은, EGFL6이 예측된 신호 펩타이드를 암호화하는 것으로서, 이러한 것이 분비되고 이의 전사체가 뇌 및 폐 종양 및 태아 조직에서 발현됨을 시사한다는 것을 보고하였다[George Yeung et al., Genomics 62, 1999, pp. 304-307]. 종양 혈관 마커가 난소암에 대한 잠재적인 바이오마커 및 분자 표적으로서 역할을 할 수 있음을 나타낸 난소 종양 맥관 구조의 분자 프로파일을 식별하기 위한 연구가 수행되었으며, 여기서, EGFL6은 마커 중 하나이다[Ronald J. Buckanovich et al., Journal of Clinical Oncology, 2007, Vol. 25, No. 7, pp. 852-861]. 그러나, EGFL6 mRNA가 난소암에서 높은 수준으로 발견되었고, 양성 수막종에서 유사하게 발견되었으며, 섬유모세포 수막종과 비교할 때, EGFL6 mRNA 수준이 신경교종, 폐암, 간세포 암종, 췌장 암종, 위암, 유방암, 전립선암, 대장암 및 방광암을 포함하는 모든 다른 조사된 종양에서 상당히 감소되었다는 것이 문헌에 보고되어 있다[Xuanchun Wang et al., PLOS ONE; 2012, Vol. 7, Issue 12, e52707].

또한, EGFL6이 W1TR 세포주에서 과발현되고, 상피 세포 이동 및 혈관신생을 증진시키는 분비된 단백질이라는 것이 보고되어 있다[Radoslaw Januchowski et al., Oncology Reports 32: 1981-1990, 2014]. EGFL6이 유방암에서 후보 종양 맥관구조 리간드라는 것이 다른 문헌에 보고되어 있다[Benjimin M Larimer, J. Mol Biomark Diagn. 2014, 5(3): doi:10.4172/2155-9929.1000178]. WO2009057849호에는 KLK6, CKS2, IFITMl, SPPl, DPEPl, CSTl, CDH3, ANLN, CXCLl, MELK, CDCAl, CTHRCl, CEACAM6, MMPl, LCN2, HS6ST2, EGFL6 및 CA9로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 작용제를 포함하는, 결장암을 위한 진단 조성물이 개시되어 있다.

그러나, EGFL6 단독은 실제로, 임상 암 진단에서 적용되지 않는다. 더욱이, 암 치료를 위한 항-EGFL6 항체를 개발하는 것이 또한 요구되고 있다.

본 개시는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 잔기 또는 서열번호 1 및 2 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체로 이루어진 경쇄 CDR1(L-CDR1); 서열번호 3 또는 4의 아미노산 잔기 또는 서열번호 3 및 4 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체로 이루어진 경쇄 CDR2(L-CDR2); 및 서열번호 5 또는 6의 아미노산 잔기 또는 서열번호 5 및 6 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체로 이루어진 경쇄 CDR3(L-CDR3) 중 적어도 하나; 및

서열번호 7 또는 8의 아미노산 잔기 또는 서열번호 7 및 8 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체로 이루어진 중쇄 상보성 결정 영역 1(H-CDR1); 서열번호 9 또는 10의 아미노산 잔기 또는 서열번호 9 및 10 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체로 이루어진 중쇄 CDR2(H-CDR2); 및 서열번호 11 또는 12의 아미노산 잔기 또는 서열번호 11 및 12 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체로 이루어진 중쇄 CDR3(H-CDR3) 중 적어도 하나를 포함하는 단리된 항-EGFL6 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 EGFL6에 결합한, 단리된 항-EGFL6 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.

본 개시의 항체의 특정 구현예는 모노클론 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 항-EGFL6 항체는 단쇄 Fv(scFv), IgG, Fab, (Fab)₂, 또는 (scFv ')₂이다.

본 개시의 일 구현예는 서열번호 13 또는 14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

본 개시의 일 구현예는 서열번호 15 또는 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.

추가 구현예에서, 본 발명은 서열번호 13에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 15에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는, 단리된 항체(EL6_S12)를 포함한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 서열번호 14에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 16에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는, 단리된 항체(EL6_E5)를 포함한다.

본 개시는 본 개시의 항-EGFL6 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.

본 개시는 또한, 대상체에 본 개시의 항-EGFL6 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 혈관신생 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

본 개시는 또한, 대상체에 본 개시의 항-EGFL6 항체를 투여한는 것을 포함하는, 대상체에서 암 세포 성장 또는 암 전이를 억제하는 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 상기 식별된 조성물 및 치료 방법 각각은 추가적으로, 추가적인 항-종양 약물, 및 추가적인 하나 이상의 항-종양 약물의 투여를 포함할 수 있다.

본 개시는 또한, 대상체로부터의 생물학적 샘플을 본 개시의 항-EGFL6 항체와 접촉시키는 단계, 항체에 대한 샘플에서의 EGFL6 항원의 결합을 정량화하는 단계, 및 암에 걸리지 않은 대조 대상체로부터의 샘플에서 결정된 EGFL6 항원과 EGFL6 항체 간의 결합을 나타내는 기준 값과 상기 결합을 비교하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 또는 암의 향후 발병의 상승된 위험을 검출하거나 진단하거나, 암의 전이 또는 예후를 예측하는 방법을 제공한다.

본 개시는 또한, 암으로 이미 진단된 대상체에서 암의 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다.

본 개시는 또한, 본 개시의 항-EGFL6 항체를 포함하는, 대상체에서 암 또는 암의 향후 발병의 상승된 위험을 검출하거나 진단하거나, 암의 전이 또는 예후를 예측하거나, 암 진행을 모니터링하기 위한 키트를 제공한다.

도 1은 ELISA를 이용한 항-EGFL6 항체의 결합 활성을 도시한 것이다.
도 2A 및 도 2B는 웨스턴 블로팅에서 E5 scFv (A) 및 S12 scFv (B)에 의해 식별된 전장 EGFL6 단백질 및 EGFL6-F396 절단된 단편을 도시한 것이다.
도 3은 웨스턴 블로트에 의해 측정된 다양한 암 세포주에서 EGFL6의 단백질 발현을 도시한 것이다.
도 4(A) 및 도 4(B)는 단쇄 항체 Ab4, Ab5 (E5) 및 Ab10이 암 세포 이동을 억제하는 데 효과적이며(A) 항-EGFL6 단쇄 항체가 파클리탁셀로 치료된 대조군과 비교하여 종양 캡슐의 형성을 효과적으로 억제할 수 있음(B)을 도시한 것이다.
도 5는 항-EGFL6 단쇄 항체 E5 및 S12로 치료된 누드 마우스의 기질 마이셀에서의 헤모글로빈 함량을 도시한 것이다.
도 6(A) 및 도 6(B)는 인간화된 IgG 항체 S12 및/또는 E5가 대장암 세포 HCT-116(A) 및 비-소세포 폐암 A549(B)에서 종양 성장을 억제하는 능력을 가짐을 도시한 것이다.
도 7(A) 및 도 7(B)는 인간화된 IgG 항체 E5가 삼중 음성 유방암 세포 MDA-MB-231(A) 및 교아종 암 세포 U87(B)에서 종양 성장을 억제하는 능력을 가짐을 도시한 것이다.
도 8은 인간 비-소세포 폐암 A549 이종이식 모델에서 파클리탁셀과 조합된 인간화된 IgG 항체 E5의 항암 활성을 도시한 것이다.

본원의 용어는 본 발명의 특정 구현예를 기술하기 위해 사용되지만, 이의 용법은 청구범위에서 개략되는 것을 제외하고 본 발명을 한정하지 않는다. 상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명 둘 모두가 단지 예이고 예시적이고 본 적용에서 청구된 주제를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

단수 용어("a", "an" 및 "the")는 단지 단수 독립체만을 지칭하기 위해 의도되는 것은 아니고, 특정 예가 예시를 위해 사용될 수 있는 일반적인 부류를 포함한다.

본 출원에서, 달리 기술하지 않는 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함하다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적인 것이 아니다.

정의

본원에서 사용되는 용어 "종양," "암" 및 "암종"은 상호 교환 가능하게 사용되고, 악성 또는 양성이든지 간에 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전아멍 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "마커" 또는 "바이오마커"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되고, 본 발명의 문맥에서, 대조 대상체(예를 들어, 음성 진단을 갖는 사람, 정상 또는 건강한 대상체)로부터 획득된 유사한 샘플과 비교하여 암을 갖는 대상체로부터 획득된 샘플에서 차별적으로 발현된 유전자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "생물학적 샘플"은 환자로부터 수득된 샘플을 지칭한다. 생물학적 샘플은, 예를 들어, 혈액, 조직(예를 들어, 종양), 혈청, 대변, 소변, 가래, 뇌척수액, 유두 흡인물 및 세포 용해물로부터의 상청액으로부터 수득될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "진단"은 병리학적 질환의 존재 또는 특성을 식별함을 의미하고, 암이 발병할 위험이 있는 대상체를 식별하는 것을 포함한다. 진단 방법은 이의 민감성 및 특이성에 있어서 상이하다. 진단 검정의 "민감성"은 양성 반응으로 시험되는 병에 걸린 개체의 백분율("진 양성"의 퍼센트)이다. 검정에 의해 검출되지 않은 병에 걸린 개체는 "거짓 음성"이다. 병에 걸리지 않고 검정에서 음성으로 시험된 대상체는 "진 음성"으로 불리워진다. 진단 검정의 "특이성"은 이와 같이 올바르게 식별된 음성의 비율(예를 들어, 병에 걸리지 않고 질환을 갖지 않은 것으로 정확하게 식별된 대상체의 백분율)을 측정하기 위한 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "검출," "검출하는" 등은 바이오마커를 검출하거나 암을 검출하는 문맥에서(예를 들어, 양성 검정 결과가 수득될 때) 사용될 수 있다. 후자의 문맥에서, "검출하는" 및 "진단하는"은 동의어로 여겨진다.

마커의 "시험량"은 시험되는 샘플에 존재하는 마커의 양을 지칭한다.

마커의 "대조양"은 마커의 시험양에 대해 비교되는 임의의 양 또는 양의 범위일 수 있다.

용어 "...에 위험이 있는"은 정상 대상체와 비교하여 또는 대조군과 비교하여 증가된 위험이 있는 것을 의미하도록 의도된다. 이에 따라, 암이 발병할 "위험이 있는" 대상체는 정상 집단과 비교하여 증가된 위험이 있으며, 암이 재발할 "위험이 있는" 대상체는 모든 치료된 암 환자들 중에서 재발의 위험과 비교하여 재발의 증가된 위험이 있는 것으로 여겨질 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "증가된 위험" 또는 "상승된 위험"은 예를 들어, 대상체에서 암이 발병하거나 재발될 임의의 통계학적으로 유의미한 확률의 증가를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "예후"는 난소암과 같은 신생물 질병의 재발, 전이성 확장, 및 약물 내성을 포함하는, 암으로 인한 사망 또는 진행의 가능성의 예측을 지칭한다. 용어 "불량한 예후"는 암(예를 들어, 전립선암), 즉, 수술, 방사선, 화학요법의 치료에 대한 주의의 표준에도 불구하고 질병의 생존 및 회복 전망이 거의 없음을 의미한다. 불량한 예후는 생존이 평균 생존보다 낮은 환자의 카테고리이다.

본원에서 사용되는 용어 "전이"는 신체의 한 부분에서 다른 부분으로 암의 확산으로서 규정된다. 확산되는 세포에 의해 형성된 종양은 "전이성 종양" 또는 "전이"로서 불리워진다.

본원에서 사용되는 용어 "전이의 위험"은 특정 환자, 특히 인간 환자에서의 암이 통계적 예측변수를 기초로 하여 전이성 상태로 진행되는 예후 징후를 지칭한다. 전이성 상태로의 실제적인 진행은 필요하지 않으며, 이러한 위험의 실현을 지연시키거나 예방하기 위한 치료 방식의 채택이 일어날 것으로 예상된다.

본원에서 사용되는 표현 "기준값"은 대상체로부터 수득된 샘플에 의해 수득된 값/데이터에 대한 기준으로서 사용되는 실험실 값을 지칭한다.

본원에서 사용되는 "수준의 결정", "수준을 결정하는" 또는 "수준을 측정하는"은 통상적으로, 특정 물질의 양 또는 농도의 계산, 또는 특정 물질의 양 또는 농도를 나타내는 프로브로부터의 신호 강도를 정량화하는 것을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 특이적으로 천연 폴리펩타이드를 결합하고/하거나 본 발명의 생물학적 활성 또는 면역학적 활성을 나타내는 한, 구체적으로, 예를 들어, 단일 모노클론 항체(효능제, 길항제 및 중화 항체를 포함함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 폴리클론 항체, 단쇄 항-항체, 및 항체의 단편을 포함한다(하기를 참조함). 일 구현예에 따르면, 항체는 표적 단백질의 올리고머 형태, 예를 들어, 트라이머 형태에 결합한다. 구 항체의 "기능성 단편 또는 유사체"는 지칭되는 항체와 공통으로 정성적 생물학적 활성을 갖는 화합물이다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 기능성 단편 또는 유사체는 EGFR에 특이적으로 결합할 수 있는 것일 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 EGFR이 세포 증식을 유도하는 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "단리된 항체"는 이의 자연 환경의 성분으로부터 식별되고 분리되고/되거나 복구된 것이다. 이의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는 (1) 로리 방법(Lowry method)에 의해 결정한 경우 95 중량% 초과의 항체 및 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체까지, (2) 스피닝 컵 배열 결정장치(spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 동질성(homogeneity)까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내에 인시튜로 항체를 포함한다. 그러나, 일반적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

본원에서 사용되는 "아미노산 서열 동일성의 퍼센트(%)" 및 "상동성"은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체 서열과 관련하여, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 필요한 경우에, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후에, 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다. 아미노산 서열 동일성의 퍼센트를 결정할 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 당해 분야에 공지된 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "Fab"는 가변 도메인 및 제1 불변 도메인을 포함하는 (어떻게 제조되는 지와는 무관함) Ig의 항원 결합 단편을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유한 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 단단한, 비-공유 결합에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 다이머로 이루어진다. 이러한 2개의 도메인의 폴딩으로부터, 항원 결합에 대한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(H 및 L 사슬로부터 각각 3개의 루프)가 나온다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 단지 3개의 HVR을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화력으로 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

본원에서 사용되는 용어 "단쇄 Fv"는 또한, "sFv" 또는 "scFv"로서 약칭되는 것으로서, 이는 단일 폴리펩타이드 사슬에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는 sFv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하며, 이는 sFv가 항원 결합을 위한 요망되는 구조를 형성하게 한다. sFv의 개요를 위해, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]이 참조된다.

본원에서 사용되는 용어 "상보성 결정 영역"(CDR)은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 가변 영역 내에서 확인된 비-인접 항원 결합 부위를 지칭한다. CDR은 문헌[Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health 및 Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]에 기술되어 있으며, 여기서, 정의는 서로에 비교할 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 하위세트를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "인간화된 항체"는 하나의 종으로부터의 항체, 예를 들어, 뮤린 또는 닭 항체로로부터의 CDR이 종으로부터의 항체의 가변 중쇄 및 경쇄로부터 인간 가변 중쇄 및 경쇄 도메인(프레임워크 영역)으로 이동되는 재조합 단백질을 지칭한다. 항체 분자의 불변 도메인은 인간 항체의 것으로부터 유도된다. 일부 경우에, 인간화된 항체의 프레임워크 영역의 특정 잔기, 특히, CDR 서열과 접촉하거나 가까운 것은 변형, 예를 들어, 본래 뮤린, 설치류, 인간이하의 영장류, 또는 다른 항체로부터의 상응하는 잔기로 대체될 수 있다. 인간화된 항체는 (a) 중요한 프레임워크 잔기를 보유하거나 보유하지 않고 단지 비-인간 CDR을 인간 프레임워크 및 불변 영역 상에 그라프팅하거나 (b) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만 이러한 것을 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 섹션으로 "클로킹(cloaking)"시키는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 본 발명을 실행하는 데 유용한 이러한 방법은 문헌[Padlan, Mol. Immunol., 31(3):169-217 (1994)]에 개시된 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "키메라 항체"는 항체 분자의 불변 도메인이 인간 항체로부터 유래되며, 하나의 종으로부터 유도된 항체, 바람직하게는 설치류 항체 또는 닭 항체, 더욱 바람직하게는 뮤린 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 중쇄 및 경쇄 항체 둘 모두의 가변 도메인을 함유하는 재조합 단백질을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 질병의 "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함하는 유익한 또는 요망되는 결과를 얻기 위한 방법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 요망되는 임상 결과는 하기 기술한 것 중 하나 이상을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 질병으로부터 형성된 하나 이상의 증상을 완화시킴, 질병의 정도를 감소시킴, 질병을 안정화시킴(예를 들어, 질병의 악화를 방지하거나 지연시킴), 질병의 확산(예를 들어, 전이)을 예방하거나 지연시킴, 질병의 재발을 예방하거나 지연시킴, 질병의 징행을 지연시키거나 늦춤, 질병 상태를 개선시킴, 질병의 차도(remission)(일부 또는 전체)를 제공함, 질병을 치료하기 위해 요망되는 하나 이상의 다른 약제의 용량을 감소시킴, 질병의 진행을 지연시킴, 삶의 질을 증진시커나 개선시킴, 체중 증가, 및/또는 생존 연장. 또한, "치료"는 암의 병리학적 결과(예를 들어, 예컨대, 종양 용적)의 감소를 포함한다. 본원에 제공된 방법은 이러한 치료 양태 중 임의의 하나 이상을 고려한다.

본원에서 사용되는 용어 "투여하다" 또는 "투여"는 예를 들어, 점막, 피부내, 정맥내, 근육내 전달 및/또는 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 다른 물리적 전달 방법에 의해 신체 외측에 존재하는 물질(예를 들어, 본 발명의 제형)을 환자 내로 주사하거나 달리 물리적으로 전달하는 행위를 지칭한다. 질병, 또는 이의 증상이 치료될 때, 질병 또는 이의 증상의 발병 후에 통상적으로 물질의 투여가 일어난다. 질병, 또는 이의 증상이 예방될 때, 질병 또는 이의 증상의 발병 전에 통상적으로 물질의 투여가 일어난다.

본원에서 상호 교환 가능하게 사용되는 용어 "개체," "대상체," "숙주," 및 "환자"는 뮤린(랫트, 마우스), 비-인간 영장류, 인간, 개, 고양이, 유제류(예를 들어, 말, 소, 양, 돼지, 염소), 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 포유동물을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 질병을 치료하기 위한 포유동물 또는 다른 대상체에 투여될 때, 질병에 대한 이러한 치료를 달성하기에 충분한, 대상 항-EGFL6 항체의 양을 지칭한다.

항- EGFL6 항체 및 암 치료에서의 이의 적용

본 발명은 EGFL6에 결합하고 혈관신생 및 암 세포 성장을 억제하는 능력을 갖는, 항-EGFL6 항체, 구체적으로, 단쇄 항체 단편(scFv) 및 인간화된 항체를 생성한다.

다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 잔기 또는 서열번호 1 및 2 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체로 이루어진 경쇄 CDR1(L-CDR1); 서열번호 3 또는 4의 아미노산 잔기 또는 서열번호 3 및 4 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체로 이루어진 경쇄 CDR2(L-CDR2); 및 서열번호 5 또는 6의 아미노산 잔기 또는 서열번호 5 및 6 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체로 이루어진 경쇄 CDR3(L-CDR3) 중 적어도 하나; 및

서열번호 7 또는 8의 아미노산 잔기 또는 서열번호 7 및 8 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체로 이루어진 중쇄 상보성 결정 영역 1(H-CDR1); 서열번호 9 또는 10의 아미노산 잔기 또는 서열번호 9 및 10 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체로 이루어진 중쇄 CDR2(H-CDR2); 및 서열번호 11 또는 12의 아미노산 잔기 또는 서열번호 11 및 12 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체로 이루어진 중쇄 CDR3(H-CDR3) 중 적어도 하나를 포함하는 단리된 항-EGFL6 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 EGFL6에 결합하게 하는 단리된 항-EGFL6 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다. 바람직하게는 상기에 언급된 바와 같은 서열 동일성은 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.

경쇄 및 중쇄에서 상보성 결정 영역의 아미노산 서열은 하기에 나열된다.

경쇄의 CDR

중쇄의 CDR

일부 구현예에서, 단리된 항-EGFL6 항체는 모노클론 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 단리된 항-EGFL6 항체는 단쇄 항체(예를 들어, Fv (scFv), IgG, Fab, (Fab)₂, 또는 (scFv')₂)이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 경쇄 및 중쇄의 및 항체의 아미노산의 구현예는 하기에 나열된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 서열번호 13 또는 14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 제공한다.

일부 구현예에서, 경쇄는 서열번호 13에 기술된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3은 각각 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 대체된다. 다른 구현예에서, 경쇄는 서열번호 14에 기술된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3은 각각 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5로 대체된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 서열번호 15 또는 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 제공한다.

일부 구현예에서, 중쇄는 서열번호 15에 기술된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3은 각각 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12로 대체된다. 다른 구현예에서, 중쇄는 서열번호 16에 기술된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3은 각각 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11로 대체된다.

추가 구현예에서, 본 발명은 서열번호 13 및 14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기술된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열번호 13 및 14 중 어느 하나에 대한 적어도 80% 동일성을 갖는 변이체를 갖는 경쇄, 및 (ii) 서열번호 15 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기술된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 서열번호 15 또는 16 중 어느 하나에 대한 적어도 80% 동일성을 갖는 변이체를 갖는 중쇄를 포함하는, 단리된 항체를 포함한다. 바람직하게는 상기에 언급된 바와 같은 서열 동일성은 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.

추가 구현예에서, 본 발명은 서열번호 13에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 15에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는, 단리된 항체(EL6_S12)를 포함한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 서열번호 14에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 16에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는, 단리된 항체(EL6_E5)를 포함한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 서열번호 13에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 16에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는, 단리된 항체를 포함한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 서열번호 14에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 15에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는, 단리된 항체를 포함한다.

사실상 임의의 표적 항원에 대한 모노클론 항체를 제조하기 위한 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다[예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975), 및 Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)] 참조]. 간단하게, 모노클론 항체는 마우스 또는 닭에 항원을 포함하는 조성물을 주사하고, 비장을 제거하여 B-림프구를 수득하고, B-림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성하고, 하이브리도마를 클로닝하고, 항원에 대한 항체를 생성시키는 양성 클론을 선택하고, 항원에 대한 항체를 생성시키는 클론을 배양시키고, 하이브리도마 배양물로부터 항체를 단리시킴으로써 수득될 수 있다.

다양한 기술, 예를 들어, 키메라 또는 인간화된 항체의 생성은 항체 클로닝 및 작제화의 절차를 포함할 수 있다. 고려되는 항체에 대한 항원-결합 가변 경쇄 및 가변 중쇄 서열은 다양한 분자 클로닝 절차, 예를 들어, RT-PCR, 5'-RACE, 및 cDNA 라이브러리 스크리닝에 의해 수득될 수 있다. 뮤린 항체를 발현시키는 세포로부터의 항체의 가변 중쇄 또는 경쇄 서열 유전자는 PCR 증폭에 의해 클로닝되고 시퀀싱될 수 있다. 이의 진위를 확인하기 위해, 클로닝된 V_L 및 V_H 유전자는 문헌[Orlandi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 3833 (1989))]에 기술된 바와 같이 키메라 항체로서 세포 배양물에서 발현될 수 있다. 가변 중쇄 또는 경쇄 유전자 서열을 기초로 하여, 인간화된 항체는 이후에, 문헌[Leung et al. (Mol. Immunol., 32: 1413 (1995))]에 기술된 바와 같이 설계되고 작제화될 수 있다.

키메라 항체는 인간 항체의 가변 영역이 마우스 항체의 상보상-결정 영역(CDR)을 포함하는, 예를 들어, 마우스 항체의 가변 영역에 의해 대체된 재조합 단백질이다. 키메라 항체는 대상체에 투여될 때 감소된 면역원성 및 증가된 안정성을 나타낸다. 키메라 항체를 작제화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다[예를 들어, Leung et al., 1994, Hybridoma 13:469].

키메라 모노클론 항체는 마우스 CDR을 마우스 면역글로불린의 가변 중쇄 및 경쇄로부터 인간 항체의 상응하는 가변 도메인으로 전달함으로써 인간화될 수 있다. 키메라 모노클론 항체에서 마우스 프레임워크 영역(FR)은 또한, 인간 FR 서열로 대체된다. 인간화된 모노클론의 안정성 및 항원 특이성을 보존하기 위해, 하나 이상의 인간 FR 잔기는 마우스 대응 잔기에 의해 대체될 수 있다. 인간화된 모노클론 항체는 대상체의 치료적 치료를 위해 사용될 수 있다. 인간화된 모노클론 항체의 생성을 위한 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다[예를 들어, 문헌[Jones et al., 1986, Nature, 321:522; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534; Carter et al., 1992, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89:4285; Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 1992, 12:437; Tempest et al., 1991, Biotechnology 9:266; Singer et al., J. Immun., 1993, 150:2844] 참조].

파지 디스플레이 기술은 비면역화된 공여자로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터, 시험관내 항-EGFL6 항체 및 항체 단편을 생성시키기 위해 이용될 수 있다. 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 필라멘트 박테리오파지의 주요 또는 소수 외피 단백질 유전자로 프레임내에서 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로서 디스프레이된다. 필라멘트 입자가 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 성질을 기초로 한 선택은 또한, 그러한 성질을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자의 선택을 초래한다. 이에 따라, 파지는 B-세포의 일부 성질을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷에서 수행될 수 있다[예를 들어, 문헌[Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol. 3:564-571 (1993)]에서 리뷰됨]. V-유전자 세그먼트의 여러 소스는 파지 디스플레이를 위해 사용될 수 있다. 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유도된 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체가 단리되었다. 다른 구현예에서, 리보솜 디스플레이 기술은 시험관내에서 항-EGFL6 항체 및 항체 단편을 생성하기 위해 이용될 수 있다.

다양한 기술은 항체 단편의 생성을 위해 개발되었다. 전통적으로, 이러한 단편은 손상되지 않은 항체의 단백질분해 소화를 통해 유도되었다. 그러나, 이러한 단편은 재조합 숙주-세포에 의해, 예를 들어, 본 개시의 항-EGFL6 항체를 암호화하는 핵산을 사용하여 직접적으로 생성될 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편 모두는 E. 콜라이에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있고, 이에 따라, 대량의 이러한 단편의 간단한 생성을 가능하게 한다. 항-EGFL6 항체 단편은 또한, 상기에 논의된 바와 같은 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 E. 콜라이로부터 직접적으로 회복되고 F(ab')2 단편을 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있다. 다른 방법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주-세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 항체 단편의 생성은 US 5,869,046호에 기술되어 있다. 다른 구현예에서, 선택된 항체는 단쇄 Fv 단편(scFv)이다.

변형은 이의 생물학적 활성을 감소시키지 않으면서 본원에 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 대해 이루어질 수 있다. 일부 변형은 융합 단백질 내에 표적화 분자의 클로닝, 발현, 또는 도입을 용이하게 하기 위해 이루어질 수 있다. 이러한 변형은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 말단 코돈, 초기화 부위를 제공하기 위해 아미노 말단에 부가된 메티오닌, 통상적으로 위치된 제한 부위를 생성시키기 위해 말단 상에 배치된 추가적인 아미노산, 또는 정제 단계에서 도움을 주기 위한 추가적인 아미노산(예를 들어, 폴리 His)을 포함한다. 재조합 방법 이외에, 본 개시의 항체는 또한, 당해 분야에 널리 공지된 표준 펩타이드 합성을 이용하여 전부 또는 부분적으로 작제화될 수 있다.

2개의 사슬 항체 정제 프로토콜에 대한 변형으로서, 중쇄 및 경쇄 영역은 별도로 용해되고 환원되고, 이후에, 리폴딩 용액에서 결합된다. 다른 단백질에 비해 5배 몰 과량의 하나의 단백질이 초과하지 않게 하는 몰 비율로 이러한 2개의 단백질이 혼합될 때 예시적인 수율이 얻어진다. 과량의 산화된 글루타티온 또는 다른 산화 저분자량 화합물은 레독스-셔플링(redox-shuffling)이 완료된 후에 리폴딩 용액에 첨가될 수 있다.

재조합 방법 이외에, 본원에 개시된 항체 및 이의 변이체는 또한, 표준 펩타이드 합성을 이용하여 전부 또는 부분적으로 작제화될 수 있다. 폴리펩타이드의 고체상 합성은 불용성 지지체에 서열의 C-말단 아미노산을 부착시키고 이후에 서열에서 잔류하는 아미노산을 순차적으로 부가함으로써 달성될 수 있다. 고체상 합성을 위한 기술은 문헌[Barany & Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. pp. 3-284; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963, 및 Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., 1984]에 기술되어 있다. 더 큰 길이의 단백질은 더 짧은 단편의 아미노 및 카르복실 말단의 축합에 의해 합성될 수 있다.

항-EDFL6 항체를 포함하는 약제 조성물, 및 항-EDFL6 항체의 치료 또는 예방 적용

특정 구현예는 본 발명의 항-EGFL6 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 공지된 임의의 타입의 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형을 포함하지만 이로 제한되지 않는 것으로 의도된다. 희석제, 예를 들어, 폴리올, 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란은 컨쥬게이트의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 약제 조성물은 통상적인 방법에 따라 제형화될 수 있고[예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.]], 또한, 약제학적으로 허용되는 담체 및 첨가제를 함유할 수 있다. 예는 계면활성제, 부형제, 착색제, 착향제, 보존제, 안정화제, 완충제, 현탁화제, 등장화제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 유동성 증진제, 및 교정제(corrigent), 및 적합하게 사용될 수 있는 다른 일반적으로 사용되는 담체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 담체의 특정 예는 경 무수 규산, 락토오스, 결정질 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로오스 칼슘, 카르멜로오스 나트륨, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈 디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화된 캐스터 오일 60, 사카로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 옥수수 전분, 무기 염, 등을 포함한다.

구현예는 대상체에 본 개시의 항-EGFL6 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 혈관신생 장애를 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 대안적으로, 구현예는 대상체에서 혈관신생 장애를 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의 본 개시의 항-EGFL6 항체의 용도에 관한 것이다. 병리학적 혈관신생에 의해 특징된 장애는 비정상 또는 이상 혈관신생이 단독으로 또는 다른 것과 조합하여, 장애의 원인, 기원, 또는 증상에 기여하는 장애를 지칭한다. 이러한 장애의 예는 다양한 암(예를 들어, 혈관화 종양), 안구 장애, 염증성 장애, 및 다른 장애를 포함한다.

추가 구현예는 대상체에 본 개시의 항-EGFL6 항체를 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 암 세포 성장 또는 암 전이를 억제하는 방법에 관한 것이다. 대안적으로, 추가 구현예는 대상체에서 암 세포 성장 또는 암 전이를 억제하기 위한 약제의 제조에서의 본 개시의 항-EGFL6 항체의 용도에 관한 것이다. 혈관신생이 원발성 암 성장 및 전이 둘 모두에 관여되어 있기 때문에, 본 개시에 의해 제공된 항혈관신생 치료는 1차 부위에서 암 세포 성장을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 2차 부위에서 종양의 전이를 예방할 수 있다. 예시적인 고형 종양은 피부, 신장, 전립선, 지방 조직, 폐, 유방, 뼈, 난소, 위, 췌장, 후두, 식도, 고환, 간, 귀밑샘, 담도, 결장, 직장, 자궁경부, 자궁, 자궁내막, 신장, 방광, 전립선, 갑상선의 암종, 편평 세포 암종, 선암, 소세포 암종, 흑색종, 신경교종, 교아종, 신경아세포종, 카포시 육종, 및 육종(예를 들어, 위장관 기질 종양)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 추가 구현예에서, 암은 대장암, 결장암, 또는 직장암이다.

본 방법은 또한, 다른 표준 치료법과 동시에 또는 후속하여 본 개시의 항-EGFL6 항체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 표준 치료법은 방사선요법, 수술 및 화학요법으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직한 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 예시적인 포유동물은 인간, 돼지, 양, 염소, 말, 마우스, 개, 고양이, 소, 등을 포함한다. 항-EGFL6 항체 또는 이의 약제 조성물로 치료될 수 있는 질병은 암, 예를 들어, 간, 피부, 두경부, 폐, 유방, 전립선, 난소, 자궁내막, 자궁경부, 결장, 직장, 결장 및 직장, 방광, 뇌, 위, 췌장 또는 림프계의 암을 포함한다. 바람직하게는 암은 대장암이다.

항-EGFL6 항체 또는 이의 약제 조성물은 정맥내로, 복강내로, 동맥내로, 척추강내로, 소포내로, 또는 종양내로 투여될 수 있다. 당업자는 항-EGFL6 항체의 유효량이 경험적으로 결정될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 인간 환자에 투여될 때, 항-EGFL6 항체 또는 조성물의 전체 일일 사용량이 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것인 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 치료학적 유효 용량 수준은 다양한 인자에 따라 달라질 것이다: 달성되는 세포 반응의 유형 및 정도; 사용되는 특정 항-EGFL6 항체 또는 조성물의 활성; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 규정식; 항-EGFL6 항체의 투여 시간, 투여 경로, 및 배설 속도; 치료 기간; 항-EGFL6 항체와 병용 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에서 널리 공지된 유사한 인자.

상기 식별된 조성물 및 치료 방법 각각은 추가적으로, 추가적인 항-종양 약물, 및 추가적인 하나 이상의 항-종양 약물의 투여를 포함할 수 있다. 본 개시와 함께 사용하기에 적합한 항-종양 약물은 아폽토시스를 유도하는 제제, 아데노신 데아미나아제 기능을 억제하거나, 피리미딘 생합성을 억제하거나, 퓨린 고리 생합성을 억제하거나, 뉴클레오타이드 상호전환을 억제하거나, 리보뉴클레오타이드 리덕타아제를 억제하거나, 티미딘 모노포스페이트(TMP) 합성을 억제하거나, 디하이드로폴레이트 환원을 억제하거나, DNA 합성을 억제하거나, DNA를 갖는 부가물을 형성하거나, DNA를 손상시키거나, DNA 복원을 억제하거나, DNA와 인터칼레이션하거나, 아스파라긴을 탈이만화하거나, RNA 합성을 억제하거나, 단백질 합성 또는 안정성을 억제하거나, 미소관 합성 또는 기능을 억제하는 제제, 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 추가적인 항-종양 약물의 예는 1) 미소관 억제제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 및 빈데신, 등), 미소관 안정화제(예를 들어, 파클리탁셀(TAXOL), 및 도세탁셀, 등)를 포함하는 알칼로이드, 및 토포이소머라아제 억제제, 예를 들어, 에피도필로톡신(예를 들어, 에토포시드(VP-16), 및 테니포시드(VM-26), 등)을 포함하는 염색질 기능 억제제, 및 토포이소머라아제 I을 표적으로 하는 작용제(예를 들어, 캄프토테신 및 이시리노테칸(CPT-11), 등); 2) 질소 머스타드(예를 들어, 메클로레타민, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 이포스파미드 및 부술판(MYLERAN), 등), 니트로소우레아(예를 들어, 카르무스틴, 로무스틴, 및 세무스틴, 등), 및 다른 알킬화제(예를 들어, 테모졸로미드, 다카르바진, 하이드록시메틸멜라민, 티오테파, 및 미토마이신, 등)을 포함하는 공유 DNA-결합제(알킬화제); 3) 핵산 억제제(예를 들어, 닥티노마이신(악티노마이신 D), 등), 안트라시클린(예를 들어, 다우노루비신(다우노마이신, 및 세루비딘), 독소루비신(아드리아마이신), 및 이다루비신(이다마이신), 등), 안트라센디온(예를 들어, 안트라시클린 유사체, 예를 들어, 미톡산트론, 등), 블레오마이신(BLENOXANE), 등 및 플리카마이신(미트라마이신)을 포함하는 비공유 DNA-결합제(항종양 항생제); 4) 항엽산제(예를 들어, 메토트렉세이트, FOLEX, 및 MEXATE, 등), 퓨린 대사길항물질(예를 들어, 6-머캅토퓨린(6-MP, PURINETHOL), 6-티오구아닌(6-TG), 아자티오프린, 아시클로버, 간시클로버, 클로로데옥시아데노신, 2-클로로데옥시아데노신(CdA), 및 2-데옥시코포르마이신(펜토스타틴), 등), 피리미딘 길항제(예를 들어, 플루오로피리미딘(예를 들어, 5-플루오로우라실(ADRUCIL), 5-플루오로데옥시우리딘(FdUrd)(플록수리딘)) 등), 및 시토신 아라비노시드(예를 들어, CYTOSAR(ara-C) 및 플루다라빈, 등)을 포함하는 대사길항물질; 5) L-아스파라기나아제, 및 하이드록시우레아 등을 포함하는 효소; 6) 글루코코르티코이드, 항에스트로겐(예를 들어, 타목시펜, 등), 비스테로이드성 항안드로겐(예를 들어, 플루타미드, 등), 및 아로마타아제 억제제(예를 들어, 아나스트로졸ARIMIDEX), 등)를 포함하는 호르몬; 7) 백금 화합물(예를 들어, 시스플라틴 및 카르보플라틴, 등); 8) 항암 약물, 톡신, 및/또는 방사성 핵종, 등과 컨쥬게이션된 모노클론 항체; 9) 생물학적 반응 조절제(예를 들어, 인터페론(예를 들어, IFN-알파, 등) 및 인터류킨(예를 들어, IL-2, 등), 등); 10) 입양 면역요법; 11) 조혈 성장 인자; 12) 종양 세포 분화를 유도하는 제제(예를 들어, 올-트랜스-레틴산, 등); 13) 유전자 요법 기술; 14) 안티센스 치료법 기술; 15) 종양 백신; 16) 종양 전이에 대해 유도된 치료법(예를 들어, 바티마스타트, 등); 17) 혈관신생 억제제; 18) 프로테오솜 억제제(예를 들어, VELCADE); 19) 아세틸화 및/또는 메틸화의 억제제(예를 들어, HDAC 억제제); 20) NF 카파 B의 조절제; 21) 세포 주기 조절의 억제제(예를 들어, CDK 억제제); 및 22) p53 단백질 기능의 조절제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

항- EGFL6 항체를 사용한 암의 검출 또는 진단

본 개시는 또한, EGFL6 수준과 암 중증도 간에 관련이 있음을 나타낸다. 이에 따라, 대조군 샘플에서 EGFL6 또는 이의 단편의 발현의 기준 수준과 비교하여 생물학적 샘플에서 높은 수준의 EGFL6 또는 이의 단편의 발현은 전이 또는 불량한 예후의 예측을 나타낸다. 본 발명은 예상치 못하게, 본 개시의 항-EGFL6 항체가 대상체에서 암의 전이 또는 향후 발병의 예후 또는 상승된 위험의 진단 또는 예측의 지시제로서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 이에 따라, 본 개시는 대상체에서 암 또는 암의 향후 발병의 상승된 위험을 검출하거나 진단하거나, 암의 전이 또는 예후를 예측하는 방법으로서, 대상체로부터의 생물학적 샘플을 본 개시의 항-EGFL6 항체와 접촉시키는 단계, 항체에 대한 샘플에서의 EGFL6 항원의 결합을 정량화하는 단계, 및 암에 걸리지 않은 대조 대상체로부터의 샘플에서 결정된 EGFL6 항원과 항-EGFL6 항체 사이에 결합을 나타내는 기준 값과 상기 결합을 비교하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

일 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포, 조직, 장기, 장기 샘플, 조직 생검, 혈액, 혈장, 혈청, 복막액(ascetic fluid), 림프구, 소변, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합일 수 있다.

항체 및 다른 결합 시약에 대한 컨쥬게이션을 위해 적합한 검출 가능한 표지는 방사성 동위원소, 형광 표지, 효소-기질 표지, 발색 표지(chromogenic label), 화학발광 표지 및 콜로이드성 금 입자를 포함한다.

측정 방법의 예는 형광 면역검정(FIA) 방법, 효소 면역검정(EIA) 방법, 방사선면역검정(RIA) 방법, 웨스턴 블로팅 방법, 도트 블롯, 면역조직화학적 검정, 형광 활성화 세포 분류기(FACS), 생체내 영상화 및 방사선-영상화 검정을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

본 개시는 또한, 암을 가진 것으로 이미 진단된 대상체에서 암의 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 모니터링은 특정 치료가 성공적인 지의 여부를 평가하기 위해 이용될 수 있다.

일부 구현예에서, 암 진행을 모니터링하는 것은 본 개시의 항-EGFL6 항체에 의해 암으로 진단된 대상체로부터 수득된 제1 생물학적 샘플에서 EGFL6 또는 이의 단편의 제1 수준을 결정하고; 사전결정된 기간 후에 본 개시의 항-EGFL6 항체에 의해 대상체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플에서 EGFL6 또는 이의 단편의 제2 수준을 결정하고; EGFL6 또는 이의 단편의 제1 수준과 제2 수준을 비교하는 것을 포함하며, 여기서, 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플에서 EGFL6 또는 이의 단편의 더 높은 수준은 질병 진행 및 악화를 나타낸다. 유사하게, 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플에서 EGFL6 또는 이의 단편의 더 낮은 수준은 개선을 나타낸다.

본 개시의 진단 방법은 암에 대한 공지된 진단 방법에 결합될 수 있다.

본 개시의 다른 양태는 대상체에서 암 또는 암의 향후 발병의 상승된 위험을 검출하거나 진단하거나, 암의 전이 또는 예후를 예측하거나, 암 진행을 모니터링하기 위한 키트를 포함한다. 이는 통상적으로, 선택적으로 설명서를 포함하는 모든 구성요소를 함유하는 패키지에 존재한다. 패키지는 성분이 요망될 때까지 혼합되지 않도록 나누어질 수 있다. 개개 성분은 키트 내에 별도로 패키징될 수 있다. 키트는 마커 유전자의 발현 수준을 검출하기 위해 필요한 시약을 함유할 수 있다. 키트는 샘플에서 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출하고/하거나 측정하기 위한 적어도 하나의 시약, 예를 들어, 항체 시약(들)을 포함하는 임의의 제조물(예를 들어, 패키지 또는 용기)이다.

상이한 성분을 갖는 다양한 키트는 본 개시에 의해 고려된다. 일반적으로 말하면, 키트는 대상체에서 EGFL6 또는 더 많은 바이오마커를 정량화하기 위한 수단을 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 키트는 생물학적 샘플을 수집하기 위한 수단, 생물학적 샘플에서 EGFL6 또는 더 많은 바이오마커를 정량화하기 위한 수단, 및 키트 내용물의 사용 설명서를 포함할 것이다. 특정 양태에서, 키트는 바이오마커의 양을 정량화하기 위한 수단을 포함한다. 추가 양태에서, 바이오마커의 양을 정량화하기 위한 수단은 바이오마커의 양을 검출하기 위해 필수적인 시약을 포함한다.

본 발명의 다수의 구현예가 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이에 따라, 하기 실시예는 청구범위에 기술된 본 발명의 범위를 예시하지만 이를 제한하지 않는 것으로 의도된다.

실시예

실시예 1 항 - EGFL6 단쇄 항체 라이브러리의 작제 및 바이오패닝 ( Biopanning )

암컷 백색 레그혼(Gallus domesticus) 닭을 근육내 주사에 의해 동일한 용적의 프라우드의 완전 애주번트 중 50 ㎍의 재조합 EGF6으로 면역화하였다. 불완전한 애주번트로의 3회의 추가적인 면역화를 7일 간격으로 수행하였다. 각 면역화 후에, 난황에서 닭 IgY 항체를 수집하고, 체액성 항-EGFL6 항체 면역 반응의 존재를 결정하기 위해 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 적정하였다. 난황은 공개된 프로토콜[Akita, E.M ., and Nakai , S. (1993). Production and purification of Fab' fragments from chicken egg yolk immunoglobulin Y ( IgY ). J Immunol Methods 162, 155- 164]에 따라 10% 덱스트란 설페이트를 사용한 IgY 정제를 위해 난백으로부터 분리될 것이다.

항체 라이브러리는 종래 보고서를 기초로 하여 규명될 것이다[Andris - Widhopf , J., Rader , C., Steinberger , P., Fuller, R., and Barbas , C.F ., 3rd (2000). Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. J Immunol Methods 242, 159-181. Barbas , C.F ., 3rd, Kang , A.S ., Lerner , R.A ., and Benkovic , S.J . (1991). Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 7978-7982]. 간단하게, 닭 비장은 수확되고, 트리졸에 바로 배치되었다. 10 ㎍의 전체 RNA는 제1-가닥 cDNA로 역전사될 것이다. 닭-특이적 프라이머를 사용한 증폭 후에, 짧은 또는 긴 링커를 갖는 중쇄 및 경쇄 가변(VH 및 VL) 영역의 PCR 생성물은 제2 라운드의 PCR로 처리되고, SfiI로 소화되고, pComb3X 벡터 내로 클로닝되었다. 재조합 DNA는 전기천공에 의해 E. 콜라이 ER2738 균주로 형질전환되었다. 재조합 파지는 VCS-M13 헬퍼 파지의 첨가에 의해 생성되고, 4% 폴리에틸글리콜 8000 및 3% NaCl(w/v)로 침전되고, 1% 소혈청알부민(BSA)을 함유한 포스페이트-완충 염수(PBS) 중에서 재현탁되었다. 이후에, 10¹¹ 플라크 형성 단위(pfu)의 재조합 파지는 EGFL6 단백질(0.5 ㎍/웰)로 사전-코팅된 웰에 첨가되고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 결합된 파지는 0.1 M HCl/글리신(pH 2.2)/0.1% BSA으로 용리되고, 2 M Tris 염기 완충제로 중화되고, ER2738 균주를 감염시키기 위해 사용되었다. 증폭된 파지는 다음 라운드의 선택을 위해 상술된 바와 같이 회수되었다. 패닝 절차는 6회 반복되었다. 전체 DNA는 정제되고 TOP 10F' E. 콜라이로 형질전환되었다. 20개의 클론이 무작위적으로 선택되고, 최종 패닝 공정으로부터 성장되었다. 박테리아 세포는 용해되고, scFv 항체 발현 및 EGFL6에 대한 결합 반응성에 대해 분석되었다. ScFv 항체는 제조업체(Amersham Biosciences, UK)에 의해 기술된 바와 같이 Ni²⁺-하전된 세파로오스를 사용하여 정제되었다. 도 1은 ELISA를 이용한 항-EGFL6 항체의 결합 활성을 도시한 것이다. 6차 라운드의 바이오-패닝 후에 각 ELISA-양성 파지 라이브러리로부터 무작위적으로 선택된 14개의 클론의 전체 세포 용리액은 이의 항-EGFL6 활성을 시험하기 위해 사용되었다. 대부분의 scFv 항체가 EGFL6 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다는 것이 확인되었다(도 1 참조).

실시예 2 항-EGFL6 단쇄 항체의 결합 분석

E. 콜라이-발현된 scFv 항체는 정제되고 니트로셀룰로오스 막 상에 고정된 EGFL6 단백질과 함께 인큐베이션되었다. 이의 결합은 후속하여, 염소 항-닭 IgY 경쇄, 이후 HRP-컨쥬게이션된 당나귀 항-염소 Ig 항체를 첨가함으로써 검출되었다. 3회 세척 후에, 막은 요망되는 세기에 도달할 때까지 디아미노벤지딘(DAB) 기질로 현상되었다. 도 2는 재조합 전장 EGFL6 단백질(레인 EGFL6)을 도시한 것으로서, N-말단 절단된 단편(레인 EGFL6-F37) 및 C-말단 절단된 단편(레인 EGFL6-F396)은 환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 위해 사용되었다. 도 2A 및 도 2B는 웨스턴 블로팅에서 E5 scFv(도 2A) 및 S12 scFv(도 2B)에 의해 식별된 전장 EGFL6 단백질 및 EGFL6-F396 절단된 단편을 도시한 것이다.

실시예 3 대장암 환자의 혈청에서 EGFL6의 발현

상피 성장 인자 유사 단백질 6(EGFL6)의 발현은 암 환자의 혈청에서 평가되었다.

도 3에 도시된 바와 같이, 폐, 결장, 난소, 전립선, 뇌, 자궁 및 유방암 세포주에서 EGFL6의 단백질 발현은 웨스턴 블로트에 의해 측정되었다. EGFL6은 정상 세포주에서 발현되지 않는다. 이러한 결과는, EGFL6이 암에 걸린 환자에서 발견될 수 있으며 EGFL6이 암 마커로서 역할을 할 수 있음을 시사한다.

실시예 4 동물 모델에서 대장암 세포주 HCT116의 세포 이동 억제 및 항-EGFL6 단쇄 항체 S12 및 E5에 의한 암 전이의 억제에 대한 단쇄 항체의 평가

세포 침투 이동 분석은 대장암 세포주 HCT116의 세포 이동을 억제하는 능력에 대해 단쇄 항체를 평가하기 위해 수행되었다. 도 4(A)에 도시된 바와 같이, 항-EGFL6 단쇄 항체는 대장암 세포주 HCT116에 첨가되었고, 세포 배양 조건 하에서 암 세포의 성장을 억제한다. 결과는, 항체 Ab4, Ab5 (E5) 및 Ab10이 암세포 이동을 억제하는 데 효과적임을 나타내었다.

CT26 동종이식 마우스 모델에서, 폐로의 대장암 세포 CT26의 전이를 억제하는 능력은, 마우스에 항-EGFL6 단쇄 항체(S12 및 E5) 및 소분자 약물 파클리탁셀이 투여된 후 관찰되었다. 항-EGFL6 단쇄 항체 S12 및 E5는 3일에 한번씩 15 mg/kg의 용량으로 투여되며, 파클리탁셀은 4일에 한번씩 20 mg/kg의 용량으로 투여되었다. 도 4(B)에 도시된 바와 같이, 3일에 한번씩 15 mg/kg의 용량으로 2개의 항-EGFL6 단쇄 항체로 치료된 그룹은 4일에 한번씩 20 mg/kg의 용량으로 파클리탁셀로 치료된 대조군과 비교하여 종양 캡슐의 형성을 효과적으로 억제할 수 있다.

실시예 5 단쇄 항체 E5 및 S12에 의한 생체내에서 혈관신생 억제

5주령 누드 마우스는 혈관신생을 유도하기 위해 500 ㎕의, EGF와 혼합된 마트리겔로 피하 주사되었다. 누드 마우스는 하기 4개의 그룹으로 나누어졌다: (1) 음성 대조군(기초)으로서의 마트리겔 단독; (2) 양성 대조군(대조군)으로서 EGF와 혼합된 마트리겔(150 ng/mL); (3) EGF-유도 조건 하에서 15 mg/kg의 용량으로 단쇄 항체 E5로 치료된 그룹; 및 (4) EGF-유도 조건 하에서 15 mg/kg의 용량으로 단쇄 항체 S12로 치료된 그룹. 각 그룹은 3마리의 누드 마우스를 가지며, 단쇄 항체 E5 및 S12는 1주일 동안 꼬리 정맥 주사에 의해 1주일에 3회 투여되었다. 누드 마우스는 8일째에 희생되었다. 마우스 복부에서의 기질 마이셀은 그라인딩 로드에 의해 제거되고 균질화되고, 이후에, 헤모글로빈 함량을 측정하였다.

도 5에 도시된 바와 같이, 혈관신생은 마트리겔이 단독으로 주사된 음성 대조군(기초)에서 나타나지 않았다. 음성 대조군(기초)과 비교하여, 혈관신생은 24시간 동안 EGF와 혼합된 마트리겔이 주사된 양성 대조군(대조군)에서 나타났다. 도 5에 도시된 바와 같이, 항-EGFL6 단쇄 항체 E5 및 S12 둘 모두로 치료된 그룹이 혈관신생을 억제하는 효과를 나타낸다는 것이 명백하였다. 또한, 누드 마우스는 희생되었으며, 마우스 복부에서의 기질 마이셀이 제거되었으며, 헤모글로빈 함량이 측정되었다. 도 5에는 항-EGFL6 단쇄 항체 E5 및 S12로 치료된 누드 마우스의 기질 마이셀에서의 헤모글로빈 함량이 누드 마우스 독립체의 관찰과 관련하여 더 낮은 값을 나타낸다는 것이 예시되었다. 또한, 도 5에 도시된 바와 같이, 항-EGFL6 단쇄 항체 E5 및 S12는 혈관신생을 억제하는 데 유의미한 효과를 나타내었다. 항-EGFL6 단쇄 항체 E5 및 S12로 치료된 그룹의 헤모글로빈 함량은 음성 대조군(기초(Basal))의 함량과 거의 동일하였다. 이러한 결과는 항-EGFL6 단쇄 항체 E5 및 S12가 EGFL6을 중화시키는 능력을 가지고 이에 따라 혈관신생을 억제하는 효과를 달성함을 나타낸다.

실시예 6 동물 모델에서 항-EGFL6 인간화된 IgG 항체에 의한 생체내에서 종양 성장의 억제

닭 scFv 항체의 가변 영역의 인간화는 종래 연구에서 적용된 알고리즘에 의해 생성된 분자 모델의 도움으로 수행될 것이다[Tsurushita et al., 2004; Zilber et al., 1990]. 간단하게, 항-EGFL6 scFv 항체의 CDR에 대한 수용체로서 사용되는 인간 V 영역 프레임워크는 서열 상동성을 기초로 하여 선택될 것이다. CDR 구조의 적절한 형성을 위해 중요한 3차원 모델로부터 예측된 인간화된 V 영역에서의 아미노산 잔기는 닭 항-EGFL6 scFv 항체의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 다른 방법은 인간화된 항-EGFL6 항체의 구조를 추가로 미세-조정하기 위해 결합되고 이용될 것이다[Ewert et al., 2003; Sidhu et al., 2004].

2개의 항-EGFL6 인간화된 IgG 항체(S12 및 E5)는 이종이식 마우스에서 대장암 세포 HCT116, 비-소세포 폐암 A549, 삼중 음성 유방암 세포 MDA-MB-231 및 교모세포종 암 세포 U87의 성장을 억제하는 능력을 평가하였다. 마우스는 1주일에 2회 명시된 용량 및 정맥 주사로 투여되었다. 초기 종양 크기는 약 200 ㎣이었다. 실험의 종료 후에, 종양 성장 억제의 비율(%TGI)은 대조군과 비교하여 계산되었다. 도 6(A)에 도시된 바와 같이, 인간화된 IgG 항체 S12 및 E5를 갖는 두 그룹 모두는 종양 성장(대장암 세포 HCT-116)을 억제하는 능력을 갖는다. S12를 갖는 그룹의 %TGI는 7.5%이며, E5 항체를 갖는 그룹은 36.2%이다. 도 6(B)에 도시된 바와 같이, 인간화된 IgG 항체 E5는 비-소세포 폐암 A549에서 종양 성장을 억제하는 능력을 갖는다. E5 항체(10 mg/kg)를 갖는 그룹의 %TGI는 14.3%이며, E5 항체(20 mg/kg)를 갖는 그룹은 80.8%이다.

도 7(A)에 도시된 바와 같이, 인간화된 IgG 항체 E5를 갖는 그룹은 종양 성장(삼중 음성 유방암 세포 MDA-MB-231)을 억제하는 능력을 갖는다. E5 항체(20 mg/kg)를 갖는 그룹의 %TGI는 65.1%이며, E5 항체(40 mg/kg)를 갖는 그룹은 65.4%이다. 도 7(B)에 도시된 바와 같이, 단쇄 항체 E5를 갖는 그룹은 종양 성장(교아종 암 세포)을 억제하는 능력을 갖는다. E5 항체(20 mg/kg)를 갖는 그룹의 %TGI는 36.5%이다.

인간 비-소세포 폐암 A549 이종이식 모델에서 파클리탁셀과 조합된 인간화된 IgG 항체 E5의 항암 활성이 추가로 수행되었다. 파클리탁셀(5 mg/kg), E5 IgG(10 mg/kg) 및 E5 IgG(10 mg/kg)와 조합한 파클리탁셀(5 mg/kg)은 마우스에 정맥 주사되었다. 도 8에 도시된 바와 같이, 항체 E5 IgG를 갖는 그룹은 종양 성장을 억제하는 능력을 가지며, E5 IgG와 조합한 파클리탁셀은 종양의 억제에서 예상치 못한 효능을 갖는다. E5 항체(10 mg/kg)를 갖는 그룹의 %TGI는 14.3%이며, E5 IgG와 조합한 파클리탁셀을 갖는 그룹은 61.8%이다.

SEQUENCE LISTING <110> TAIPEI MEDICAL UNIVERSITY LEE, YU-CHING PAN, SHIOW-LIN HUANGFU, WEI-CHUN HUANG, TSUI-CHIN WEI, PO-LI HUANG, HAN-LI TSAI, KENG-CHANG <120> ANTI-EGF LIKE DOMAIN MULTIPLE 6 (EGFL6) ANTIBODIES AND THEIR APPLICATIONS IN CANCER DIAGNOSIS AND TREATMENT <130> T54267/CN32599 <150> US 62/566,509 <151> 2017-10-01 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Gly Asn Asp Lys Tyr 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 Ser Gly Arg Tyr Gly 1 5 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Glu Thr Arg 1 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Asp Asn Asp 1 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Ala Gly Tyr Ala Gly Met 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Gly Ser Tyr Asp Arg Ser Gly Gly Val Gly Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 7 Gly Phe Asp Phe Ser Ser His Gly 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 8 Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 9 Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 10 Ile Arg Ser Asp Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 11 Val Arg Thr Arg Gly Ser Phe Asn Ile Val Thr Ile Asp Thr 1 5 10 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 12 Ala Lys Ser Ala Tyr Gly Thr Gly Tyr Ser Ser Gly Arg Ile Asp Thr 1 5 10 15 <210> 13 <211> 106 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 13 Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Glu Thr Val Lys 1 5 10 15 Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Gly Trp Phe Gln 20 25 30 Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Glu Thr Arg 35 40 45 Ser Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly 50 55 60 Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala 65 70 75 80 Val Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Ala Gly Tyr Ala Gly Met 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 14 <211> 103 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 14 Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys 1 5 10 15 Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Arg Tyr Gly Trp Phe Gln Gln Lys 20 25 30 Ser Pro Gly Thr Ala Pro Val Thr Met Ile Tyr Asp Asn Asp Lys Arg 35 40 45 Pro Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr 50 55 60 Gly Thr Leu Ile Ile Thr Gly Val Gln Val Glu Asp Glu Ala Val Tyr 65 70 75 80 Phe Cys Gly Ser Tyr Asp Arg Ser Gly Gly Val Gly Thr Phe Gly Ala 85 90 95 Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 <210> 15 <211> 131 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 15 Thr Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Val Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser His 20 25 30 Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Tyr Ala Pro Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Leu Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asp Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Val Arg Thr Arg Gly Ser Phe Asn Ile Val Thr Ile Asp 100 105 110 Thr Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser Gly Gln 115 120 125 Ala Gly Gln 130 <210> 16 <211> 130 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 16 Thr Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu His Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Arg Ser Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Gly Ala Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asp Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Ala Tyr Gly Thr Gly Tyr Ser Ser Gly Arg Ile Asp Thr 100 105 110 Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser Gly Gln Ala 115 120 125 Gly Gln 130

Claims (26)

1. 서열번호 1 또는 2의 아미노산 잔기로 이루어진 경쇄 CDR1(L-CDR1); 서열번호 3 또는 4의 아미노산 잔기로 이루어진 경쇄 CDR2(L-CDR2); 및 서열번호 5 또는 6의 아미노산 잔기로 이루어진 경쇄 CDR3(L-CDR3) 중 적어도 하나; 및
   서열번호 7 또는 8의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(H-CDR1); 서열번호 9 또는 10의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 CDR2(H-CDR2); 및 서열번호 11 또는 12의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 CDR3(H-CDR3) 중 적어도 하나를 포함하는 단리된 항-EGFL6 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서,
   상기 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 EGFL6에 결합하는, 단리된 항-EGFL6 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
2. 제1항에 있어서, 모노클론 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체인 항-EGFL6 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
3. 제1항에 있어서, 단쇄 Fv(scFv), IgG, Fab, (Fab)₂, 또는 (scFv ')₂인 항-EGFL6 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
4. 서열번호 13 또는 14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
5. 서열번호 13에 기술된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄로서, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3은 각각 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 대체된 경쇄.
6. 서열번호 14에 기술된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄로서, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3은 각각 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5로 대체된 경쇄.
7. 서열번호 15 또는 16에 기술된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
8. 서열번호 15에 기술된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄로서, H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3은 각각 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12로 대체된 중쇄.
9. 서열번호 16에 기술된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄로서, H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3은 각각 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11로 대체된 중쇄.
10. 서열번호 13 및 14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄, 및 (ii) 서열번호 15 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 단리된 항체.
11. 제10항에 있어서, 서열번호 13에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 15에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 단리된 항체.
12. 제10항에 있어서, 서열번호 14에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 16에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 단리된 항체.
13. 제10항에 있어서, 서열번호 13에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 16에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 단리된 항체.
14. 제10항에 있어서, 서열번호 14에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 15에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 단리된 항체.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-EGFL6 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제 조성물.
16. 제15항에 있어서, 추가적인 하나 이상의 항-종양 약물을 추가로 포함하는 약제 조성물.
17. 대상체에서 혈관신생 장애를 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-EGFL6 항체의 용도.
18. 제17항에 있어서, 혈관신생 장애가 암, 안구 장애 또는 염증성 장애인 용도.
19. 대상체에서 암 세포 성장 또는 암 전이를 억제하기 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-EGFL6 항체의 용도.
20. 제19항에 있어서, 약제가 추가적인 하나 이상의 항-종양 약물과 함께 추가로 투여되는 용도.
21. 제19항에 있어서, 암이 피부, 신장, 전립선, 지방 조직, 폐, 유방, 뼈, 난소, 위, 췌장, 후두, 식도, 고환, 간, 귀밑샘, 담도, 결장, 직장, 자궁경부, 자궁, 자궁 내막, 신장, 방광, 전립선, 갑상선의 암종, 편평 상피세포 암종, 선암, 소세포 암종, 흑색종, 신경교종, 교아종, 신경모세포종, 카포시 육종 또는 육종인 용도.
22. 제19항에 있어서, 암이 대장암인 용도.
23. 대상체에서 암 또는 암의 향후 발병의 상승된 위험을 검출하거나 진단하거나 암의 전이 또는 예후를 예측하는 방법으로서,
    대상체로부터의 생물학적 샘플을 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-EGFL6 항체와 접촉시키는 단계,
    항체에 대한 샘플에서의 EGFL6 항원의 결합을 정량화하는 단계, 및
    상기 결합을, 암에 걸리지 않은 대조 대상체로부터의 샘플에서 결정된 EGFL6 항원과 항-EGFL6 항체 간에 결합을 나타내는 기준 값과 비교하는 단계를 포함하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 생물학적 샘플이 세포, 조직, 장기, 장기 샘플, 조직 생검, 혈액, 혈장, 혈청, 복막액(ascetic fluid), 림프구, 소변, 골수액, 림프액, 타액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합인 방법.
25. 이미 암에 걸린 것으로 진단된 대상체에서 암의 진행을 모니터링하는 방법으로서,
    제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-EGFL6 항체에 의해 암으로 진단된 대상체로부터 수득된 제1 생물학적 샘플에서 EGFL6 또는 이의 단편의 제1 수준을 결정하는 단계; 및
    사전결정된 기간 후에 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-EGFL6 항체에 의해 대상체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플에서 EGFL6 또는 이의 단편의 제2 수준을 결정하는 단계;
    EGFL6 또는 이의 단편의 제1 수준 및 제2 수준을 비교하는 단계를 포함하며,
    제1 샘플에 비해 제2 샘플에서의 더 높은 수준의 EGFL6 또는 이의 단편은 질병 진행 및 악화를 나타내는 방법.
26. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-EGFL6 항체를 포함하는, 대상체에서 암 또는 암의 향후 발병의 상승된 위험을 검출하거나 진단하거나, 암의 전이 또는 예후를 예측하거나, 암 진행을 모니터링하기 위한 키트.

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