KR20200106051A - 향상된 키메라 항원 수용체 및 그의 용도 - Google Patents

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마이클 새들레인
유디트 포이히트
모하메드 하미에
지에 순
조지 에이. 만실라-소토
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Abstract

본 개시된 주제는 암 및 병원체에 대한 면역 반응을 향상시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이것은 신규한 디자인의 키메라 항원 수용체(CAR) 및 이를 포함하는 조작된 면역반응성 세포에 관한 것이다. 상기 신규한 CAR을 포함하는 조작된 면역반응성 세포는 항원-지향성이며, 기능의 손상 없이 연장된 지속성을 갖는다.

Description

향상된 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 그 전체 내용이 인용에 의해 포함되고 우선권이 주장되는 2017년 12월 29일자로 출원된 미국 가출원 제62/612,031에 대한 우선권을 주장한다.
본 개시된 주제는 암 및 병원체에 대한 면역 반응을 향상시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이것은 키메라 항원 수용체(CAR) 및 이를 포함하는 조작된(engineered) 면역반응성 세포의 신규한 디자인에 관한 것이다. 상기 신규한 CAR을 포함하는 조작된 면역반응성 세포는 항원-지향성이고, 기능의 손상 없이 연장된 지속성을 갖는다.
키메라 항원 수용체(CAR) 치료법은 혈액학적 악성물(malignancy)에 대해 큰 임상적 성공을 달성하였다(PMID: 23515080). 이것은 항원 인식 및 신호 전달 기능 모두를 갖는 합성 수용체에 기반한다(PMID: 20467460). CAR 내의 단일-사슬 가변 단편(scFv)은 본래의 모노클론 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로부터 그 항원 인식 특이성을 유지한다. 한편, 상기 CAR 구조체(construct)의 신호 전달은 주로 본래의 면역 수용체의 신호전달 도메인(domain)에 의존한다. 현재, 임상 시험 중인 모든 버전의 2세대 CAR은 2개의 면역 수용체 유래의 도메인을 함유하고 있기 때문에 2개의 신호전달 능력/양식을 갖고 있으며, 한 수용체는 CD3ζ이고, 다른 수용체는 공-자극성 수용체, 예컨대 CD28 또는 41BB이다(PMID: 26129802). 본질적으로, 이것은 별도의 수용체에 의해 전달된 2개의 신호를 하나의 합성 수용체로 조합한다. 아마도, CAR에서의 신호 전달은 CD3ζ 및 CD28/41BB에서의 신호 전달과 유사할 수 있다.
CD3ζ는 항원에 결합하고 상기 결합을 세포막을 가로질러 세포내 신호로 전달하는 멀티머성(multimeric) T 세포 항원 수용체(TCR) 복합체의 일부이다. TCRαβ (또는 TCRγδ) 서브유닛(subunit)은 그 특이적 세포외 영역을 통해 항원을 인식하지만, CD3ζ는 상기 복합체에서 주로 그 잘-보존된 3개의 면역-수용체-티로신-기반-활성화-모티프(immune-receptor-tyrosine-based-activation-motif, ITAM)를 통해 신호 전달 기능을 수행한다(PMID: 20516133). 그 서열 상동성(homology)에 기반하여 처음으로 확인된 ITAM은 정의된 수의 아미노산(YxxL/I-X6-8-YxxL/I)에 의해 분리된 2개의 연이은 YxxL/I 모티프로 이루어진다(PMID: 2927501). ITAM은 대개 조혈 세포에서 발현되는 수용체에서 발견되고, TCR 신호전달의 맥락에서 잘 연구되어 있다. 펩티드-MHC에 대한 TCR의 결합은 Src 패밀리 키나아제(kinase) Lck의 활성화를 유도하고, 이는 CD3ζ 내의 3개의 ITAM 각각에서 2개의 티로신 잔기를 인산화한다(PMID: 25861978). 이후, 각각의 양쪽 인산화된 ITAM은 Syk 패밀리 키나아제인 ZAP-70의 2개의 탠덤(tandem) SH2 도메인에 결합하는 능력을 얻는다. 이러한 상호작용은 ZAP-70을 Lck에 매우 근접하게 하여서, Lck에 의한 ZAP-70의 인산화 및 활성화를 야기한다. 활성화된 ZAP-70은 추가로 그 하류의 표적, 예컨대 어댑터(adaptor) 단백질인 LAT 및 SLP-76을 인산화한다. 인산화된 LAT 및 SLP-76은 많은 다른 단백질, 예컨대 PLC-γ, Grb2/Sos, Gads 및 Itk, Vav 및 Nck에 대한 스캐폴드(scaffold)를 제공하고, 최종적으로 칼슘의 이동, Ras/Erk 활성화 및 액틴 세포골격(cytoskeletal)의 재배열 및 궁극적으로 유전자 발현의 활성화를 유도한다(PMID: 20516133). 따라서, CD3ζ 내의 3개의 ITAM은 TCR 신호전달에 있어서 유일하지는 않더라도 주된 신호전달 모이어티(moiety)이다.
반면에, CD28은 어떠한 ITAM도 함유하고 있지 않다. 대신, 그 세포내 도메인은 CD28이 그 리간드인 CD80/CD86에 결합하여 인산화되면 PI3K 및 Grb2/Gads의 p85 서브유닛에 결합할 수 있는 YMNM 모티프를 함유한다(PMID: 20534709). 부가적으로, CD28의 프롤린-풍부 영역은 Itk, Tec, Lck, Grb2/Vav 및 필라민 A와 상호작용할 수 있다(PMID: 20534709). 따라서, CD3ζ 및 CD80/86-결합 개시성 CD28 신호전달을 통한 항원-결합 개시성 TCR 신호전달은 많은 공통의 참가자, 예컨대 Grb2, Vav, Gads, Lck, Itk를 공유하며, 이것은 상기 2가지 경로 사이의 크로스토크(crosstalk)를 가능하게 한다. 게다가, 면역학적 시냅스에서 세포막 근처에 조립된 신호전달 복합체에서는 양쪽 경로의 활성화가 일어나서, 상기 2가지 경로 유래의 신호전달 분자를 서로 공간상에 함께 가져온다. 마지막으로 중요한 것은, 먼저가 아니라면 TCR-개시성 세포내 칼슘 증가 후에 CD28 유도성 칼슘 신호전달이 2번째로 일어나서, 2가지 경로의 일시적 인접/근접을 반영한다(PMID: 18848472).
본 발명은 관심있는 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 상기 CAR은 종양 항원 또는 병원체 항원에 결합할 수 있다. 소정 비제한적 구현예에서, 상기 CAR은 세포외 항원-결합 도메인, 막통과(transmembrane) 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)의 전부 또는 일부가 없으며, 여기서 상기 ITAM은 ITAM1, ITAM2, 및 ITAM3이다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 ITAM3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 ITAM1 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 ITAM3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2 또는 그의 일부의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 ITAM1 또는 그의 일부의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1 또는 그의 일부의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 염기성-풍부 스트레치(stretch)(BRS) 영역의 전부 또는 일부가 없으며, 여기서 상기 BRS 영역은 BRS1, BRS2, 및 BRS3이다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS2 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 BRS3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 BRS1 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 BRS3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부, BRS2 또는 그의 일부, 및 BRS3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS2 또는 그의 일부의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 BRS3 또는 그의 일부의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 BRS1 또는 그의 일부의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 BRS3 또는 그의 일부의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부, BRS2 또는 그의 일부, 및 BRS3 또는 그의 일부의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2, ITAM3, BRS2, 및 BRS3의 결실을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2, ITAM3, BRS2, 및 BRS3이 없다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 서열번호 45 또는 서열번호 47에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 염기성-풍부 스트레치(BRS) 영역의 전부 또는 일부가 없으며, 여기서 상기 BRS 영역은 BRS1, BRS2, 및 BRS3이다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS2 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 BRS3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 BRS1 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 BRS3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부, BRS2 또는 그의 일부, 및 BRS3 또는 그의 일부가 없다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 변이체, BRS2 변이체, 및 BRS3 변이체로부터 선택되는 BRS 변이체를 포함하며, 여기서 상기 BRS 변이체는 하나 이상의 기능-소실(loss-of-function) 돌연변이를 포함한다.
소정 구현예에서, 전술한 임의의 다양한 CAR은 힌지(hinge)/스페이서(spacer) 영역을 추가로 포함하며, 여기서 상기 힌지/스페이서 영역은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD40 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD84 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드 또는 이들의 조합을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 CD166 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 서열번호 3의 아미노산 489 내지 527을 갖는 CD166 폴리펩티드를 포함한다.
소정 구현예에서, 전술한 임의의 다양한 CAR의 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD40 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD84 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드 또는 이들의 조합을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 CD166 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 서열번호 3의 아미노산 528 내지 527을 갖는 CD166 폴리펩티드를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역은 동일한 분자로부터 유래된다. 소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 CD28 폴리펩티드를 포함하고, 상기 막통과 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 CD84 폴리펩티드를 포함하고, 상기 막통과 도메인은 CD84 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 CD166 폴리펩티드를 포함하고, 상기 막통과 도메인은 CD166 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 서열번호 3의 아미노산 489 내지 553을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 CD8a 폴리펩티드를 포함하고, 상기 막통과 도메인은 CD8a 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 CD8b 폴리펩티드를 포함하고, 상기 막통과 도메인은 CD8b 폴리펩티드를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역은 상이한 분자로부터 유래된다. 소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 CD28 폴리펩티드를 포함하고, 상기 막통과 도메인은 ICOS 폴리펩티드를 포함한다.
소정 구현예에서, 전술한 임의의 다양한 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 공-자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함한다.
본 개시된 주제는 또한 세포외 항원-결합 도메인, 힌지/스페이서 영역, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공하며, 여기서 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM 변이체를 포함하고, 여기서 상기 ITAM 변이체는 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD40 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD84 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드 또는 이들의 조합을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 ITAM2 변이체는 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 ITAM3 변이체는 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 CD166 폴리펩티드의 힌지/스페이서 영역 및 CD166 폴리펩티드의 막통과 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 서열번호 3의 아미노산 489 내지 553을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 43의 아미노산 374 내지 485를 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 서열번호 43에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시된 주제는 또한 본 명세서에 개시된 CAR을 포함하는 면역반응성 세포를 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 재조합적으로 발현된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 벡터로부터 발현된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 상기 면역반응성 세포의 내재적(endogenous) 유전자 좌위(locus)에 위치한다. 소정 구현예에서, 상기 내재적 유전자 좌위는 TRAC 좌위, TRBC 좌위 또는 TRGC 좌위이다. 소정 구현예에서, 상기 내재적 유전자 좌위는 TRAC 좌위이다. 소정 구현예에서, 상기 CAR이 위치하면 TCR의 내재적 발현을 방해하거나 없앤다.
본 개시된 주제는 또한 2 이상의 CAR을 포함하는 면역반응성 세포를 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 a) 제1 항원에 결합하는 제1 세포외 항원-결합 도메인, 제1 막통과 도메인, 및 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR; 및 b) 제2 항원에 결합하는 제2 세포외 항원-결합 도메인, 제2 막통과 도메인, 및 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR;을 포함하며, 여기서 상기 제1 CAR은 전술한 CAR이거나, 또는 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 ITAM 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 각각의 상기 하나 이상의 ITAM 변이체는 독립적으로 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 제1 CAR은 제1 힌지/스페이서 영역을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 제2 CAR은 제2 힌지/스페이서 영역을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 각각의 상기 제1 및 제2 힌지/스페이서 영역은 독립적으로 본 명세서에 개시된 임의의 힌지/스페이서 영역으로부터 선택될 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 제2 CAR은 전술한 CAR이다. 소정 구현예에서, 상기 제2 CAR의 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 ITAM 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 ITAM 변이체는 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 제2 CAR의 제2 세포내 신호전달 도메인은 상기 제1 CAR의 제1 세포내 신호전달 도메인에 포함되는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드와 동일한 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 제2 CAR의 제2 세포내 신호전달 도메인은 상기 제1 CAR의 제1 세포내 신호전달 도메인에 포함되는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드와 상이한 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 제2 CAR의 제2 세포내 신호전달 도메인은 자연형의 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 제1 CAR의 제1 세포내 신호전달 도메인은 상기 제2 CAR의 제2 세포내 신호전달 도메인과 동일하다. 소정 구현예에서, 상기 제1 CAR의 제1 세포내 신호전달 도메인은 상기 제2 CAR의 제2 세포내 신호전달 도메인과 상이하다.
소정 구현예에서, 상기 제1 항원은 상기 제2 항원과 상이하다.
소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖는다.
소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는다.
소정 구현예에서, 상기 세포는 제3 항원에 결합하는 제3 세포외 항원-결합 도메인, 제3 막통과 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제3 CAR을 추가로 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖고, 상기 제3 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는다.
소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖고, 상기 제3 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는다.
소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제3 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는다.
소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제3 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는다.
소정 구현예에서, 상기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 인간 배아 줄기 세포, 및 림프성 세포로 분화될 수 있는 다능성(pluripotent) 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 세포는 T 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 T 세포는 세포독성 T 림프구(CTL), 조절성 T 세포, 및 자연 살해 T(NKT) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 골수성 세포, 예컨대 대식세포이다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 자가성(autologous)이다. 소정 구현예에서, 상기 항원은 종양 항원이다. 소정 구현예에서, 상기 종양 항원은 CD19, MUC16, MUC1, CAlX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CLL1, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, erb-B2,3,4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, 폴레이트 수용체-a, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-a2, K-경쇄, KDR, LeY, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린(Mesothelin), ERBB2, MAGEA3, p53, MART1,GP100, 프로티나아제3(Proteinase3)(PR1), 티로시나아제(Tyrosinase), 수르비빈(Survivin), hTERT, EphA2, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, 종양태아성 항원(h5T4), PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, BCMA, CD123, CD44V6, NKCS1, EGF1R, EGFR-VIII, 및 CD99, CD70, ADGRE2, CCR1, LILRB2, PRAME, CCR4, CD5, CD3, TRBC1, TRBC2, TIM-3, 인테그린(Integrin) B7, ICAM-1, CD70, Tim3, CLEC12A 및 ERBB로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 항원은 CD19이다.
본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 유효량의 면역반응성 세포 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 신생물(neoplasm)을 치료하기 위한 것이다.
본 개시된 주제는 대상체에서 종양 부하(burden)를 감소시키는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 본 명세서에 개시된 유효량의 상기 면역반응성 세포 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시된 주제는 또한 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 면역반응성 세포는 세포외 항원-결합 도메인, 힌지/스페이서 영역, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하고, 여기서 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 ITAM 변이체를 포함하고, 여기서 각각의 상기 하나 이상의 ITAM 변이체는 독립적으로 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체 중 하나 또는 모두는 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 ITAM2 변이체는 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 ITAM3 변이체는 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 하나 이상의 기능-소실 돌연변이는 티로신 아미노산 잔기(residue)에 있다. 소정 구현예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공-자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 방법은 종양 세포의 수를 감소시킨다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 종양의 크기를 감소시킨다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 상기 대상체에서 종양을 근절한다.
본 개시된 주제는 신생물을 치료 또는 예방하는 방법을 추가로 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 본 명세서에 개시된 유효량의 상기 면역반응성 세포 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 면역반응성 세포는 세포외 항원-결합 도메인, 힌지/스페이서 영역, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하고, 여기서 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 ITAM 변이체를 포함하고, 여기서 각각의 상기 하나 이상의 ITAM 변이체는 독립적으로 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시된 주제는 재발된 신생물을 갖는 대상체의 치료 방법을 추가로 제공하며, 여기서 상기 대상체는 항원 인식 수용체를 포함하는 면역반응성 세포를 수용하고, 여기서 상기 항원 인식 수용체는 4-1BB 공자극성 신호를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 본 명세서에 개시된 유효량의 상기 면역반응성 세포 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 면역반응성 세포는 세포외 항원-결합 도메인, 힌지/스페이서 영역, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하고, 여기서 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 ITAM 변이체를 포함하고, 여기서 각각의 상기 하나 이상의 ITAM 변이체는 독립적으로 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공-자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 신생물 또는 종양은 혈액암, B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 신생물은 B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병, 또는 비-호지킨 림프종이고, 상기 CAR은 CD19에 결합한다. 소정 구현예에서, 상기 신생물은 CD19+ ALL이다. 소정 구현예에서, 상기 신생물은 낮은 발현 레벨의 종양 특이적 항원을 갖는 종양 세포를 포함한다.
본 개시된 주제는 항원-특이적 면역반응성 세포를 생산하기 위한 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 면역반응성 세포 내로 본 명세서에 개시된 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 도입하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 핵산 서열은 벡터 내에 포함된다. 소정 구현예에서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 CAR을 암호화하는 단리된 뉴클레오티드 산을 추가로 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 단리된 뉴클레오티드 산은 서열번호 45 및 서열번호 47에 기재된 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 CAR을 포함하는 핵산 조성물을 추가로 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 핵산 서열은 벡터 내에 포함된다. 소정 구현예에서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 핵산 조성물을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다.
본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 CAR, 면역반응성 세포, 약학적 조성물, 핵산 조성물 또는 벡터를 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 키트는 신생물, 병원체 감염, 자가면역 질병, 또는 동종이계(allogeneic) 이식을 치료 및/또는 예방하기 위한 기록된 설명서를 추가로 포함한다.
하기 상세한 설명은 예로서 제공되고, 특정 구현예로 본 개시된 주제를 한정하기 위한 의도가 아니며, 부속하는 도면과 접목되어 이해될 수 있다.
도 1은 야생형, 돌연변이형 및 절단형 1928ζ(1928z) CAR의 세포질 영역을 도시한다. A) 상이한 1928ζ(1928z) CAR의 세포질 영역. 본래의 1928ζ CAR의 ζ 사슬이 돌연변이되어 독특한 ζ 신호전달 도메인을 갖는 1928ζ CAR T 세포를 구성한다. 상기 ζ 도메인 내의 3개의 ITAM 모티프는 막 근위부(proximal)에서 원위부(distal) 방향으로 ITAM1, ITAM2 및 ITAM3으로 명명된다. 1XX, X2X, XX3 및 X23 CAR에서, 표시된 ITAM에 대하여 해당 ITAM 내의 2개의 티로신 잔기(Y)가 2개의 페닐알라닌 잔기(F)로 돌연변이된다. D12 및 D23에서, 결실 돌연변이를 만들어 ITAM1 및 ITAM2(D12) 또는 ITAM2 및 ITAM3(D23)을 제거한다. B) 본래의 1928z 구조와 비교하여 개선된 항종양 효험을 갖는 1928z CAR의 세포질 영역. 1XX에서, 본래의 1928ζ CAR의 ζ 사슬은 ITAM2 및 ITAM3에서 점-돌연변이(티로신(T)에서 페닐알라닌(F)으로 전환)되지만, 염기성 풍부 스트레치(BRS-1, -2, -3)의 아미노산은 유지된다. D12 및 D23에서, ITAM1 및 ITAM2(D12) 또는 ITAM2 및 ITAM3(D23)이 결실된다; D23은 하나의 BRS 영역(BRS-1)을 포함하지만, D12에는 BRS가 없다. C) 1928ζ 및 표시된 1928ζ 돌연변이체에 대하여 CAR 및 LNGFR의 발현 레벨을 보여주는 대표적인 유세포 분석. UT: 형질도입되지 않은 T 세포가 대조군으로 사용되었다.
도 2a 및 도 2b는 신규한 CAR 디자인 또는 대조군 1928ζ(1928z) CAR을 포함하는 T 세포의 치료 효능을 도시한다. 1928ζ(1928z) CAR T 세포의 치료 효능은 상기 CAR 구조체에서 CD3ζ 사슬의 돌연변이에 의해 개선된다. 0.05×106 CAR T 세포로 처리된 NALM-6-보유(bearing) 마우스의 종양 부하(평균 광휘(radiance))(n = 9-10, 2 회의 독립적 실험으로부터 모은 데이터). A) 그 본래의 CAR 위치에 미변형 CD3ζ, ITAM3(XX3), ITAM2(X2X) 또는 ITAM2 및 ITAM3(X23)의 조합 및 나머지 ITAM 모티프의 돌연변이를 갖는 1928ζ 돌연변이체의 생체내 반응. B) 제1 위치(D12의 경우 ITAM3 및 D23의 경우 ITAM1)에서 하나의 단일 비돌연변이 CD3ζ 서열 및 나머지 ζ-사슬 도메인의 결실로 이루어지는 1928ζ 돌연변이체로 처리된 NALM-6 마우스의 종양 부하.
도 3a 및 도 3b는 1928ζ(1928z) 대조군 또는 신규한 CAR 구조체를 발현하는 동일한 용량의 CAR T 세포로 처리된 후의 생존을 도시한다. Nalm-6 보유 마우스는 5×104 CAR+ T 세포로 처리되었다. A) 및 B) 단일 용량의 1928z WT 및 1928z 돌연변이체 XX3, X23 및 X2X(A) 또는 1928z 돌연변이체 D12, D23 및 1XX(B)의 생체내 효험을 비교하는 마우스 생존의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석. 2 회의 독립적 실험으로부터 모은 데이터이며, n = 10 마우스를 나타낸다. 대조군은 미처리 마우스를 나타낸다(n = 3). *p< 0.05(로그-순위(log-rank) 만텔-콕스(Mantel-Cox) 테스트)
도 4는 종양 보유 마우스에서 CAR T 세포를 계수한 것을 도시한다. NALM-6-보유 마우스는 5×104 CAR T 세포로 처리되었고(군 당 n = 10; 2 회의 독립적 실험으로부터 모은 데이터), 주입 후 17일에 안락사시켰다; 골수 CAR T 세포 및 NALM-6 세포를 분석하였고, FACS에 의해 카운트하였다. 모든 데이터는 평균±SD이다. *P <0.05, ***P <0.001, ****P < 0.0001 (언페어드(unpaired) 스튜던트 t 테스트).
도 5a 내지 도 5c는 T 세포 분화의 분석을 도시한다. CAR 주입 10일 후 마우스 골수에서 CD4+ 및 CD8+ CAR T 세포의 표현형(데이터는 평균±SEM이고, 각각의 막대(bar)는 n = 5 마우스를 나타냄). A) 1928ζ WT와 비교하여 표시된 1928ζ 돌연변이체에 대한 CAR T 세포 상의 CD62L/CD45RA 발현의 백분율. CD4+ 및 CD8+ CAR T 세포에서 B) 중심 메모리(memory) 세포(CD62L+CD45RA-) 및 C) 이펙터(effector) 세포(CD62L-CD45RA+)의 백분율. 데이터는 1928ζ WT와 비교된다. **P <0.01, ***P <0.001 (언페어드 스튜던트 t 테스트).
도 6은 T-세포 투여 10일 및 17일 후 마우스 골수에서 중심 메모리 CD4+ CAR 세포(CAR+CD4+CD62L+CD45RA-) 및 IL7R-발현 CD4+CAR T 세포의 세포 수의 분석을 도시한다(데이터는 평균±SEM이고, 각각의 막대는 n = 5 마우스를 나타냄). **P <0.01, ***P <0.001 (언페어드 스튜던트 t 테스트).
도 7은 T 세포 고갈(exhaustion)의 분석을 도시한다. NALM-6-보유 마우스는 5×104 CAR T 세포로 처리되었고(군 당 n = 9-10; 2 회의 독립적 실험으로부터 모은 데이터), CAR 주입 10일 후에 안락사시켰다; 골수 CAR T 세포를 FACS에 의해 분석하였다. CAR 주입 10일 후 FACS에 의해 정량화된 고갈 마커를 발현하는 CD4+ 및 CD8+ CAR T 세포의 백분율. 데이터는 평균±SEM이고, 각각의 점은 한 마우스를 나타낸다. *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001, (언페어드 스튜던트 t 테스트).
도 8은 CAR T 세포 효능의 시험관내 기능 테스트를 도시한다. A) 표적으로 EL4-CD19를 이용한 4시간 51Cr 방출 분석법에 의해 측정된 세포독성 활성(n = 2, 3중으로 수행된 독립적 실험, 데이터는 평균±SEM임). B) 및 C) 표적으로 반딧불이 루시퍼라아제(luciferase)(FFL)-발현 NALM-6을 이용한 18시간 생물발광(bioluminescence) 분석법을 이용한 세포독성 활성. 데이터는 평균±SEM이다(n = 5, 3중으로 수행된 독립적 실험). 실험은 조사된(irradiated) 3T3-CD19에 대한 이펙터 세포의 확장 1주일 후에 수행되었다.
도 9는 CAR T 세포의 시험관내 사이토카인(cytokine) 프로필을 도시한다. 3T3-CD19를 이용한 2차 자극 18시간 후 세포내 사이토카인 염색에 의해 결정될 때의 같은 단일 (A) 및 이중 (B) 양성 Th1 사이토카인의 양성 발현을 갖는 CD4+ 및 CD8+ CAR T 세포의 백분율(데이터는 평균±SEM이고, 1928ζ WT와 비교하였음. 페어드(paired) 스튜던트 t 테스트, n = 3-5 회의 독립적 실험). *P <0.05, **P <0.01.
도 10은 상이한 힌지(H) 및 막통과 도메인(TM)을 보유한 1XX CAR의 개략적인 묘사를 도시한다. 유세포 분석 프로필은 각각 염소 IgG 항-마우스 IgG (F (ab')2) 단편 및 항-LNGFR을 이용한 CAR 및 LNGFR 발현을 보여준다. CD28/CD28 H/TM 영역을 함유하는 1928z-LNGFR CAR은 대조군으로 사용된다.
도 11은 106 세포/㎖ CAR T 세포로부터 시작하여 매주 자극시에 누적된 CAR T 세포 카운트를 도시한다. 화살표는 자극 시점을 나타낸다. 데이터는 평균±SEM이다. n = 3.
도 12는 CAR T 세포의 시험관내 세포독성을 도시한다. CAR T 세포의 세포독성 활성은 제3 자극(D21)의 종료시에 4시간 51Cr 방출 분석법을 이용하여 측정된다. T 세포 및 EL-4-CD19+ 표적 세포를 상이한 이펙터:표적 비(E:T)에서 사용하였다. 데이터는 평균±SEM이다. 데이터는 4 회의 독립적 실험을 나타낸다.
도 13은 NOD.Cg PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스를 이용한 상이한 H/TM CAR T 세포의 생체내 항-종양 효능을 도시한다. 위쪽 패널에서, 종양 부하 후에 매주 생물발광 신호의 정량화를 행한다. CAR 구조체는 각각의 처리에 대해 표시된다. 아래쪽 패널은 동일한 실험의 마우스의 종양 부재 생존의 카플란-마이어 분석이다. 로그-순위 (만텔-콕스) 테스트가 생존 비교를 위해 사용된다. n = 7 마우스/군.
도 14는 신규한 CAR 구조체에 대한 예시적인 탈-면역화 전략을 도시한다. J1 및 J2: WT 접합부(junction)로부터 변형 없음. J3: CD28의 마지막 아미노산인 Ser(S)을 Lys(K)으로 치환. J: 접합부; X: 점 돌연변이.
도 15는 CAR T 세포로 처리된 마우스의 다양한 생존 곡선을 도시한다. NSG 마우스는 5×105 FFLuc-GFP NALM6 세포(프리-B ALL 세포주)로 꼬리 정맥 주사되었고, 4일 후 2×105 19BBz CAR T 세포로 주사되었다. 첫번째 T 세포 주사 10일 후(종양의 진행을 지연시키기만 하는 비효과적인 용량), 마우스는 다시 19BBz CAR T 세포 또는 대안적으로 1928z 또는 (5×105/마우스)로 주사되었다. 화살표는 CAR T 세포의 주입 시간을 나타낸다. 위쪽 패널에서, 종양 부하 후에 매주 생물발광 신호의 정량화를 행한다. 아래쪽 패널은 동일한 실험의 마우스의 종양 부재 생존의 카플란-마이어 분석이다. 로그-순위 (만텔-콕스) 테스트가 생존 비교를 위해 사용된다. n = 7 마우스/군.
도 16a 내지 도 16e는 1928ζ iTAM이 차등적으로 CAR T 세포 효능을 조절함을 도시한다. A) 야생형 및 돌연변이된 1928ζ CAR의 셀포질 영역. 상기 1928ζ CAR의 ζ 사슬은 막-근위부로부터 막-원위부 방향으로 ITAM1, ITAM2, 및 ITAM3으로 명명되는 3개의 ζ 신호전달 도메인 중 1개 또는 2개가 돌연변이되었다. 1XX, X2X, XX3, 및 X23 CAR에서, 해당 ITAM 내의 2개의 티로신(Y)은 표시된 ITAM에 대하여 2개의 페닐알라닌(F)으로 점 돌연변이된다. B) A)에 도시된 구조체에 대한 CAR 및 LNGFR의 발현 레벨을 보여주는 유세포 분석. 데이터는 유사한 결과를 갖는 적어도 5 회의 독립적 실험을 나타낸다. 형질도입되지 않은 T(UT) 세포가 대조군으로 사용되었다. C)-E) Nalm6-보유 마우스를 5×104 CAR+ T 세포로 처리하였다. C) 마우스의 종양 부하(평균 광휘)가 나타나 있으며, 야생형 1928ζ, 1XX, X2X, XX3, 및 X23의 생체내 효험을 비교한다(군 당 n = 10 마우스, 결과는 2 회의 독립적 실험으로부터 모음). 대조군은 미처리 마우스를 나타낸다(n = 6). D) 주입 17일 후 마우스 골수 내의 CAR T 세포의 수(결과는 2 회의 독립적 실험으로부터 모았고, 군 당 n = 10 마우스). E) CAR 주입 10일 후 마우스 골수에서 CAR T 세포의 표현형으로서, TCM 및 TEFF 세포의 백분율에 의해 나타냄. 2 회의 독립적 실험의 대표적인 결과가 나타나 있다(군 당 n = 5 마우스). 모든 데이터는 평균±s.e.m이다. D) 및 E)에서, P 값은 양측-꼬리 만-휘트니(Mann-Whitney) U-테스트에 의해 결정되었다.
도 17a 내지 도 17e는 1928ζ CAR 내의 iTAM 위치가 항종양 효험을 결정하는 것을 도시한다. A) CD3ζ 사슬에 결실을 갖는 1928ζ CAR의 세포질 도메인. D12에서 결실 돌연변이는 ITAM1 및 ITAM2를 제거하지만, D23에서는 ITAM2 및 ITAM3이 제거된다. B) 표시된 구조체에 대하여 CAR 및 LNGFR의 발현 레벨을 보여주는 유세포 분석. 데이터는 유사한 결과를 갖는 적어도 5 회의 독립적 실험을 나타낸다. UT, 형질도입되지 않은 T 세포가 대조군으로 사용되었다. C)-E) Nalm6-보유 마우스는 5×104 CAR+ T 세포로 처리되었다. C) 야생형 1928ζ, D12, 또는 D23으로 처리된 마우스의 종양 부하(평균 광휘)(야생형 1928ζ 및 D23: n = 10; D12: n = 9; 2 회의 독립적 실험으로부터 모은 데이터). D) 주입 17일 후 마우스 골수에서 CAR T 세포의 수(결과는 2 회의 독립적 실험으로부터 모았고, 군 당 n = 10 마우스). E) CAR 주입 10일 후 마우스 골수에서 CAR T 세포의 표현형으로서, TCM 및 TEFF 세포의 백분율에 의해 결정됨(2 회의 독립적 실험으로부터 모은 데이터, 군 당 n = 10 마우스). 모든 데이터는 평균±s.e.m이다. D) 및 E)에서, P 값은 양측-꼬리 만-휘트니 U-테스트에 의해 결정되었다.
도 18a 내지 도 18h는 TRAC-1XX가 T 세포 고갈을 감소시키고 및 효과적인 리콜(recall) 반응을 갖는 장기-생존 메모리 T 세포로 분화됨으로써 T 세포 효능을 강화함을 도시한다. A)-D), Nalm6-보유 마우스는 1×105 또는 5×105 TRAC-CAR T 세포로 처리되었다. A) 1×105 TRAC-1XX 또는 TRAC-XX3로 처리된 마우스의 생존을 TRAC-1928ζ와 비교한 카플란-마이어 분석(TRAC-1928ζ 및 TRAC-XX3: 군 당 n = 5 마우스; TRAC-1XX: n = 7). 대조군은 미처리 마우스를 나타낸다(n = 3). P 값은 단측(one-sided) 로그-순위 만텔-콕스 테스트에 의해 결정되었다. B) 5×105(군 당 n = 5 마우스) 또는 1×105(TRAC-1928ζ: n = 10 마우스, TRAC-1XX: n = 5 마우스) TRAC-CAR T 세포로 처리된 마우스의 생존의 카플란-마이어 분석. P 값은 단측 로그-순위 만텔-콕스 테스트에 의해 결정되었다. C) 및 D) TRAC-1XX 및 TRAC-XX3에 대하여 세포의 수(C) 및 골수 CAR T 세포 상의 고갈 마커 PD1+TIM3+LAG3+의 발현(D)을 결정하였고, TRAC-1928ζ와 비교하였다. 데이터는 평균±s.e.m을 나타내고, 각각의 부호는 개별 마우스를 나타낸다(군 당 n = 5 마우스). P 값은 양측-꼬리 만-휘트니 U-테스트에 의해 결정하였다. E)-H) Nalm6-보유 마우스는 5×105 TRAC-편집된 나이브(naive) T 세포로 처리되었고, 화살표에 의해 나타낸 것과 같이, Nalm6 세포로 재시도(rechallenge)되었다(군 당 n = 5 마우스). 대조군에 대해서는 종양을 이용한 추가적인 재시도는 수행되지 않았다(TRAC-1928ζ: n = 6 마우스; TRAC-1XX: n = 7 마우스). E) 마우스의 종양 부하(평균 광휘)로서, TRAC-1928ζ 및 TRAC-1XX 후 종양 재시도한 경우 대 추가적인 재시도 없는 경우의 생체내 효험을 비교함. 모든 데이터는 평균±s.e.m이다. 양측-꼬리 언페어드 스튜던트 t-테스트를 CAR 투여 59일 후 종양 부하의 통계학적 분석을 위해 사용하였다(TRAC-1928ζ: n = 4; TRAC-1XX: n = 5). F) 및 G) CAR 투여 63일 후 처리된 마우스 골수에서 전체 CAR T 세포(F), TCM, TEFF, 및 IL7R+ CAR T 세포(G)의 수(재시도: TRAC-1928ζ: n = 4 마우스, TRAC-1XX: n = 5 마우스; 재시도 없음: 군 당 n = 5 마우스). 모든 데이터는 평균±s.e.m이다; 양측-꼬리 언페어드 스튜던트 t-테스트를 통계학적 분석을 위해 사용하였다. H) 골수 CAR T 세포 상의 고갈 마커 PD1+TIM3+LAG3+의 발현. 모든 데이터는 평균±s.e.m이다. P 값은 양측-꼬리 언페어드 스튜던트 t-테스트에 의해 결정되었다.
도 19a 내지 도 19h는 1928ζ CAR 내의 CD3ζ ITAM 돌연변이가 별개의 전사 시그니처(signature)를 확립함을 도시한다. CD19+ 표적 세포로 자극한 24시간 후 CD8+ TRAC-1928ζ, TRAC-1XX, 및 TRAC-XX3 CAR T 세포(처음으로 분류된 나이브 T 세포)의 유전자 발현 프로필. A) 1928ζ 대 1XX 및 1928ζ 대 XX3(군 당 n = 3 복제물)에서 현저하게 상향- 또는 하향조절된 유전자 세트의 표준화된 농축(enrichment) 점수로서, MSigDB C7 유전자 온콜로지(ontology) 세트를 이용한 GSEA에 의해 결정됨. 모든 경로에 대하여, 오발견율(FDR) q ≤ 0.02. GSE 데이터세트는 괄호로 나타낸다. stim, 자극됨. B) 분류된 이펙터 및 나이브/메모리 T 세포(왼쪽)(군 당 n = 6 복제물) 사이에 차등적으로 발현된 유전자(FDR q < 0.05) 및 CAR T 세포에 대하여 동일한 유전자의 발현 프로필을 나타내는 히트 맵(heat map)(군 당 n = 3 복제물). TF, 전사 인자. C) 표현형적 및 기능적 T 세포 특성과 연관되어 현저하게 농축된 유전자 세트의 표준화된 농축 점수(FDR q ≤ 0.03)로서, GSEA 분석으로 확인시의 TRAC-1928ζ 대 TRAC-XX3, TRAC-1928ζ 대 TRAC-1XX, 및 TRAC-1XX 대 TRAC-XX3을 비교함(군 당 n = 3 복제물). JAK-STAT, 전사의 야누스 키나아제-신호 형질도입자 및 활성자(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription). D) 이펙터- 및 메모리-연관 T 세포 기여에 대한 1928ζ CAR T 세포에서의 소정의 CD3z ITAM 돌연변이의 영향. 1XX CAR T 세포는 균형잡힌 이펙터 및 메모리 특성을 나타낸다.
도 20a 내지 도 20e는 시험관내 T 세포 기능, 생체내 T 세포 분화 및 항종양 활성에 대한 ITAM-돌연변이된 1928ζ CAR의 영향을 도시한다. A) 조사된 3T3-CD19에 대한 이펙터 세포의 확장(expansion) 1주일 후 4시간 51Cr 방출 분석법에 의해 결정될 때의 세포독성 활성(데이터는 3중으로 수행된 n = 2 독립적 실험의 평균으로 나타냄). B) CD19+ 표적 세포를 이용한 매주 자극시 표시된 CAR T 세포의 누적된 세포 카운트(n = 3 독립적 실험). 모든 데이터는 평균±s.e.m이다. P 값은 양측-꼬리 페어드 스튜던트 t-테스트를 이용해 계산되었다. C) NALM6-보유 마우스는 5×104 CAR+ T 세포로 처리되었다. 야생형 1928ζ 또는 표시된 1928ζ 돌연변이체의 생체내 효험을 비교하는 생존의 카플란-마이어 분석(n = 10 마우스, 2 회의 독립적 실험으로부터 모은 데이터). 대조군(Ctl)은 미처리 마우스를 나타낸다(n = 6). P 값은 단측 로그-순위 만텔-콕스 테스트에 의해 결정되었다. D) CD19+ 표적 세포로 2차 자극된 48시간 후 중심 메모리(CD62L+CD45RA-) 및 이펙터 메모리(CD62L-CD45RA-) CD4+CAR T 세포의 백분율에 의해 나타낼 때의 CAR T 세포의 표현형. 양측-꼬리 페어드 스튜던트 t-테스트가 수행되었고, 데이터는 n = 4 독립적 실험의 평균±s.e.m.을 나타낸다. E) NALM6-보유 마우스는 5×104 CAR T 세포로 처리되었고, 주입 후 10일에 안락사시켰다; 골수 CAR T 세포는 FACS에 의해 분석하였다. 표시된 CAR T 세포에 대한 표현형의 대표적인 유세포 분석으로서, CD62L/CD45RA 발현에 의해 결정되고, CAR+CD4+ T 세포에 대해 게이트됨. 유사한 결과를 갖는 적어도 n = 2의 독립적 실험에서 군 당 5마리 마우스의 대표도.
도 21a 내지 도 21c는 야생형 1928ζ와 비교하여 1928ζ 돌연변이체에서 이펙터 기능의 분석을 도시한다. A) 표적으로서 FFL-발현 NALM6 세포를 이용한 18-h 생물발광 분석법을 이용한 야생형 1928ζ와 비교한 1928ζ 돌연변이체의 세포독성 활성. 실험은 CD19+ 표적 세포에 대한 이펙터 세포의 확장 1주일 후에 수행되었다. 데이터는 평균±s.e.m.이다(3중으로 수행된 n = 4의 독립적 실험). 3중 실험의 평균의 양측-꼬리 페어드 스튜던트 t-테스트에 의해 계산되었을 때 *P < 0.05 (21: P = 0.0273, 2-1: P = 0.0387, 2-2: P = 0.0125), **P = 0.0018. B) 및 C) CD19-발현 표적 세포를 이용한 2차 자극시 CD8+ CAR T 세포에 대한 그랜자임(Granzyme) B (GrB) 발현(n = 4의 독립적 실험) (B) 및 CD4+ 및 CD8+ CAR T 세포의 사이토카인 분비 (C). 모든 데이터는 평균±s.e.m.이다(IFNγ 및 IL2, n = 4; TNFα, n = 5의 독립적 실험). 비자극(Unstim.) 야생형 1928ζ 세포는 대조군으로 사용되었다. 1928ζ와 비교하여 현자한 차이는 양측-꼬리 페어드 스튜던트 t-테스트에 의해 결정되었다.
도 22a 내지 도 22d는 T 세포 기능 및 치료 효능에 대한 1928ζ CAR 내부의 ITAM 위치의 영향을 도시한다. A) 조사된 3T3-CD19에 대한 이펙터 세포의 확장 1주일 후 4시간 51Cr 방출 분석법에 의해 결정될 때의 세포독성 활성(데이터는 3중으로 수행된 n = 2의 독립적 실험의 평균임). B) CD19+ 표적 세포를 이용한 매주 자극시의 표시된 CAR T 세포의 누적된 세포 카운트(n = 3의 독립적 실험). 모든 데이터는 평균±s.e.m.이다; P 값은 양측-꼬리 페어드 스튜던트 t-테스트로 계산되었다. C) 표적으로 FFL-발현 NALM6 세포를 이용한 18시간 생물발광 분석법에 의해 결정될 때의 야생형 1928ζ와 비교한 D12 및 D23의 세포독성 활성. 실험은 CD19+ 표적 세포에 대한 이펙터 세포의 확장 1주일 후에 수행되었다. 데이터는 평균±s.e.m.이다(3중으로 수행된 n = 4의 독립적 실험). P 값은 3중 실험의 평균의 양측-꼬리 페어드 스튜던트 t-테스트에 의해 계산되었고, 모든 E/T 비에 대해 D12/D23 및 야생형 1928ζ 사이에 현저한 차이가 없음을 보여주었다(P > 0.05). D) NALM6-보유 마우스는 5×104 CAR T 세포로 처리되었다. 야생형 1928ζ 또는 표시된 1928ζ 돌연변이체로 처리된 마우스의 생존의 카플란-마이어 분석(군 당 n = 10 마우스). 대조군은 미처리 마우스를 나타낸다(n = 6). P 값은 단측 로그-순위 만텔-콕스 테스트에 의해 계산되었다.
도 23a 및 도 23b는 시험관내에서 이펙터 기능에 대한 1928ζ CAR 내부의 iTAM 위치의 영향을 도시한다. A) CD8+ CAR T 세포에 대한 그랜자임 B(GrB) 발현(n = 5의 독립적 실험). B) CD19-발현 표적 세포를 이용한 2차 자극시 CD4+ 및 CD8+ CAR T 세포의 사이토카인 분비. 비자극 야생형 1928ζ 세포는 대조군으로 사용되었다. 모든 데이터는 평균±s.e.m.이다(IFNγ 및 IL2, n = 4; TNFα, n = 5의 독립적 실험). 각각의 개별 부호는 하나의 샘플을 나타낸다. 1928ζ와 비교한 현저한 차이는 양측-꼬리 페어드 스튜던트 t-테스트에 의해 결정되었다.
도 24a 내지 도 24f는 TRAC-암호화된 1928ζ 돌연변이체의 T 세포 분화 및 이펙터 기능을 도시한다. NALM6-보유 마우스는 1×105 CAR T 세포로 처리되었고, 주입 17일 후에 안락사시켰다. 골수 및 비장 CAR T 세포는 FACS에 의해 분석 및 카운트되었다. A) TRAC 좌위 내로의 CAR 유전자 통합(integration) 4일 후 CAR 발현의 히스토그램(Histogram) 및 유세포 분석. 유사한 결과를 갖는 4 회의 독립적 실험의 대표도. B) CD4+ 및 CD8+ CAR T 세포의 세포 수, C) 골수 CD8+CAR T 세포에 대한 CD62L/CD45RA 발현의 CD8+ TCM(CD62L+CD45RA-)의 백분율 및 유세포 분석(1 회의 독립적 실험에서 군 당 n = 5 마우스의 대표도). D) CAR+IL7R+ 대 종양 세포의 비 및 마우스의 골수에서 IL7R+ CAR T 세포의 예시적인 유세포 분석. E) 마우스의 비장에서 CAR T 세포의 계수. B), C), D) 및 E)에서, 모든 데이터는 평균± s.e.m.이고, 양측-꼬리 만-휘트니 분석이 수행되었으며, 군 당 n = 5 마우스이다. F) TRAC-1XX, TRAC-XX3 및 야생형 TRAC-1928ζ의 세포독성 활성(표적으로 FFL-발현 NALM6을 이용한 18시간 생물발광 분석법). 실험은 형질도입 후 4일, 매주 CD19 항원 자극을 이용한 확장 후 1주 및 3주에 수행되었다. 부호는 3중 실험의 평균을 나타낸다(하나의 대표적인 공여자).
도 25a 내지 도 25g는 야생형 TRAC-1928ζ와 비교하여 TRAC-1928ζ 돌연변이체의 생체내 T 세포 고갈을 도시한다. A) NALM6-보유 마우스는 1×105 CAR T 세포로 처리되었고, 주입 17일 후에 안락시시켰다. CAR+ T 세포 상의 고갈 마커의 발현의 FACS 분석으로서, 1 회의 독립적 실험에서 군 당 n = 5 마우스의 대표도. B)-G) NALM6-보유 마우스는 1×105 TRAC-편집된 나이브 T 세포로 처리되었다. CAR 투여 16일(B 및 C) 및 36일(E 및 G) 후, 골수 및 비장 유래의 TRAC-1928ζ 및 TRAC-1XX 세포는 NALM6 또는 PMA/이오노마이신(Iono)을 이용한 생체외 자극에 노출되었다. 발현의 백분율 및 유세포 분석에 의해 나타낼 때의 CAR T 세포에 대한 사이토카인 및 그랜자임 B (GrB)/CD107a 발현으로서, 2 회의 독립적 실험에서 n = 3 마우스(B) 및 n = 3 복제물(G)에 대한 대표도. NALM6을 이용한 공-배양 10시간 후 CAR T 세포 상의 고갈 마커 PD1+LAG3+의 발현(D) 및 TRAC-1XX의 세포독성 활성(F)(36일). 모든 데이터는 평균±s.e.m.이고, 군 당 n = 3 마우스이다.
도 26a 내지 도 26g는 야생형 TRAC-1928ζ와 비교하여 TRAC-1XX에서 T 세포 메모리 형성을 도시한다. NALM6-보유 마우스는 1×105 또는 5×105 TRAC-편집된 나이브 T 세포로 처리된다. A)-C) 1×105 TRAC-1928ζ 및 TRAC-1XX의 투여 16일 및 36일 후, CAR는 골수 및 비장으로부터 단리되었다. A)-B) CAR T 세포(A), 중심 메모리(TCM: CD62L+CD45RA-), 이펙터(TEFF: CD62L-CD45RA+) 및 IL7R-발현 골수 CAR T 세포(B)의 세포 수. 모든 데이터는 평균±s.e.m.이고, 군 당 n = 3 마우스이다. C) 1 회의 독립적 실험에서 36일에 TRAC-1928ζ 및 TRAC-1XX 골수 CAR T 세포에 대한 CD62L/CD45RA 발현의 대표적인 유세포 분석(군 당 n = 3 마우스). D)-G) NALM6-보유 마우스는 5×105 TRAC-편집된 나이브 T 세포로 처리되었고, NALM6 세포(군 당 n = 5 마우스)로 재시도되거나, 종양을 이용한 재시도가 수행되지 않았다(TRAC-1928ζ, n = 6 마우스; TRAC-1XX, n = 7 마우스). D)-E) CAR 투여 63일 후에 처리된 마우스의 비장 내의 전체 CAR T 세포(D), TCM, TEFF 및 IL7R+ CAR T 세포(E)의 세포 수(재시도: TRAC-1928ζ, n = 4 마우스; TRAC-1XX, n = 5 마우스. 재시도 없음, 군 당 n = 5 마우스). 모든 데이터는 평균±s.e.m.이다; 통계적 분석을 위해 양측-꼬리 언페어드 스튜던트 t-테스트를 사용하였다. F) CAR 주입 63일 후 TRAC-1928ζ 및 TRAC-1XX CAR T 세포 상의 IL7R-, CD62L- 및 CD45RA-발현의 FACS 분석(1 회의 독립적 실험에서 군 당 적어도 n = 3 마우스에 대한 대표도). G) 비장 유래의 CAR T 세포 상의 고갈 마커 PD1+TIM3+LAG3+의 발현(재시도: TRAC-1928ζ, n = 4 마우스; TRAC-1XX: n = 5 마우스. 재시도 없음, 군 당 n = 5 마우스). 모든 데이터는 평균±s.e.m.이다; P 값은 양측-꼬리 언페어드 스튜던트 t-테스트에 의해 결정되었다.
도 27a 내지 도 27c는 TRAC-암호화된 1928ζ 돌연변이체 및 분류된 대조군 T 세포의 전사 프로필을 도시한다. A) CD19 표적 세포(왼쪽) 및 분류된 대조군 T 세포 서브세트(오른쪽): TN, TSCM 및 TEFF을 이용한 자극 후 CD8+ TRAC-1XX, TRAC-XX3 및 TRAC-1928ζ의 글로벌 전사 프로필의 주요 성분 분석(PCA). 실험은 각각의 CAR 구조체의 경우 기술적 3 회 반복으로, 각각의 대조군 서브세트의 경우 6 회 반복으로 수행되었다. B) 대표적인 GSEA 농축 플롯(GSE10239)으로서, 1928ζ 대 1XX 및 1928ζ 대 XX3에서 메모리-연관 유전자에 대한 이펙터-연관 유전자 및 나이브-연관 유전자에 대한 이펙터-연관 유전자의 하향조절을 나타낸다(군 당 n = 3 마우스). C) 분류된 대조군 T 세포 서브세트의 차등적 유전자 발현(TEFF, TSCM 및 TN)과 비교하여 가티노니(Gattinoni) 등에 의해 개시된 것과 같은 CD8+ T 세포 서브세트(왼쪽)의 900개의 차등적으로 발현된 유전자의 히트 맵.
도 28a 내지 도 28d는 T 세포 분화 상태에 대한 TRAC-1928ζ에서의 CD3ζ ITAM 돌연변이의 영향 및 이펙터 프로필을 도시한다. A) GSE41867로부터 유래될 때 나이브 또는 메모리 CD8 T 세포와 비교하여 고갈된 CD8 T 세포에서 상향조절된 최상위 200개 유전자의 시그니처의 GSEA로서, TRAC-1928ζ 대 TRAC-1XX 또는 TRAC-XX3에서, 및 분류된 대조군 TEFF 대 TN 및 TSCM에서 고갈 시그니처의 농축을 나타낸다. 실험은 각각의 CAR 구조체의 경우 기술적 3 회 반복으로, 각각의 대조군 서브세트의 경우 6 회 반복으로 수행되었다. B) 1928ζ 대 XX3, 1XX 대 XX3 및 1928ζ 대 1XX에서 염증, 사이토카인 및 케모카인(chemokine) 신호전달과 연관되어 현저하게 농축된 유전자 세트를 보여주는 유전자 온콜로지 분석(n = 3). 전사 분석은 나이브 T 세포의 TRAC 좌위 내로의 CAR 유전자 통합 및 CD19+ 표적 세포를 이용한 자극 이후에 수행되었다. 결과는 현저한 순서로 -log10으로 나타나 있다(수정된 P 값). P 값은 단측-꼬리(one-tailed) 피셔(Fisher)의 정확 테스트에 의해 결정되었고, 벤자미니(Benjamini)-호크베르그(Hochberg) 방법을 사용하여 다중 가설 테스트에 대해 수정하였다. C) 염증, 사이토카인 및 케모카인 활성과 연관되어 CAR 구조체들 사이에 선택된 차등적으로 발현된 유전자의 히트맵. D) CD19 항원으로 자극된 후 CD8+CAR T 세포에 대한 T 세포 분화 상태의 유세포 분석(유사한 결과를 갖는 n = 2의 독립적 실험에 대한 대표도).
도 29a 및 도 29b는 처리된 마우스의 골수로부터 수득된 CAR T 세포를 분석하기 위한 게이팅(gating) 전략을 도시한다. A)-B) CAR 주입 17일 후에 TRAC-1XX(B)와 비교하여 TRAC-1928ζ(A)의 대표적인 유세포 분석. 게이팅의 배치(placement)는 FMO 대조군에 기초하였다.
본 개시된 주제는 변형된 CD3ζ 사슬을 포함하는 새로운 CAR 디자인, 및 상기 CAR을 포함하는 유전적으로 변형된 면역반응성 세포(예컨대, T 세포, NK 세포, 또는 CTL 세포)를 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시된 주제는 또한 표적 항원에 대한 면역 반응을 유도 및/또는 향상시키거나, 및/또는 항원-특이적 면역 반응의 증가가 요구되는 신생물 또는 다른 질환/질병의 치료 및/또는 예방하기 위한 이러한 세포의 사용 방법을 제공한다. 본 개시된 주제는 적어도 부분적으로 본 발명의 개시된 CAR을 포함하는 면역반응성 세포가 종래의 CAR을 포함하는 대조군 세포와 비교하여 개선된 치료 효능(예컨대, 감소된 세포 고갈)을 나타낸다는 발견에 기초한다.
1. 정의
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 기술분야의 기술자에 의해 보통 이해되는 의미를 갖는다. 다음의 참고문헌들은 기술자에게 본 개시된 주제에서 사용된 많은 용어들의 일반적인 정의를 제공한다: [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본 명세서에서 사용될 때, 다음의 용어들은, 달리 특정하지 않는 한, 이들에 대해 아래에 개시한 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "약" 또는 "대략"은 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 때의 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내임을 의미하며, 이는 부분적으로 그 값이 어떻게 측정되는지 또는 결정되는지, 즉, 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들면, "약"은 본 기술분야에서의 실시에 따라 표준 편차 3 이내 또는 그 초과를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 20%까지, 예컨대, 10%까지, 5%까지, 또는 1%까지의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 대하여, 상기 용어는 값의 10배 크기 이내, 예컨대 5배 이내, 또는 2배 이내를 의미할 수 있다.
"면역반응성 세포를 활성화시킨다"는 세포에서 단백질 발현에서의 신호 전달을 도입 또는 변화시켜서 면역 반응의 개시를 야기하는 것을 의미한다. 예를 들면, 리간드 결합 및 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITAM)에 대한 반응으로 CD3 사슬이 클러스터될 때, 신호 전달 캐스케이드(cascade)가 생성된다. 소정 구현예에서, 내재적 TCR 또는 외인성(exogenous) CAR 항원에 결합할 때, 결합된 수용체(예컨대, CD4 또는 CD8, CD3γ/δ/ε/ζ, 등) 근처의 많은 분자의 클러스터화를 포함하는 면역학적 시냅스의 형성이 일어난다. 상기 막 결합 신호전달 분자의 클러스터화는 상기 CD3 사슬 내에 함유되는 ITAM 모티프가 이산화되게 한다. 상기 인산화는 다시 T 세포 활성화 경로를 개시하고, 궁극적으로 전사 인자, 예컨대 NF-κB 및 AP-1을 활성화시킨다. 상기 전사 인자는 T 세포 매개성 면역 반응을 개시하기 위하여 T 세포의 글로벌 유전자 발현을 유도하여 마스터 조절성 T 세포 단백질의 증식 및 발현을 위한 IL-2 생산을 증가시킨다.
"면역반응성 세포를 자극시킨다"는 강력하고 지속되는 면역 반응을 야기하는 신호를 의미한다. 다양한 구현예에서, 이것은 면역 세포(예컨대, T-세포) 활성화 후에 일어나거나, CD28, CD137 (4-lBB), OX40, CD40, CD27, CD40/My88, NKGD2 및 ICOS를 비제한적으로 포함하는 수용체를 통해 동시 매개된다. 다중 자극 신호를 수용하는 것은 강력하고 장기간의 T 세포 매개성 면역 반응을 늘이는데 중요할 수 있다. T 세포는 즉시 억제되고 항원에 반응하지 않을 수 있다. 상기 공-자극성 신호의 효과는 다양할 수 있지만, 일반적으로 완전하고 지속적인 근절을 위해 항원에 강력하게 반응하는 수명이 길고 증식성인 항-아폽토시스 T 세포를 생성하기 위하여 증가된 유전자 발현을 야기한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "항원-인식 수용체"는 항원에 대한 결합에 대한 반응으로 면역 또는 면역반응성 세포(예컨대, T-세포)를 활성화시킬 수 있는 수용체를 나타낸다. 항원-인식 수용체의 비제한적 예는 자연형 또는 내재적 T 세포 수용체("TCR"), 및 키메라 항원 수용체("CAR")를 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "항체"는 온전한 항체 분자뿐만 아니라 면역원-결합 능력을 보유하는 항체 분자의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 또한 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 시험관내 및 생체내에서 모두 정규 도입된다. 따라서, 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자뿐만 아니라 잘-알려진 활성 단편 F(ab')2 및 Fab를 의미한다. F(ab')2 및 온전한 항체의 Fc 단편이 없는 Fab 단편은 순환으로부터 보다 신속하게 제거되며, 온전한 항체의 비-특이적인 조직 결합을 더 적게 가질 수 있다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). 본 명세서에서 사용될 때, 항체는 전체 자연형의 항체, 이중특이적 항체; 키메라 항체; Fab, Fab', 단일 사슬 V 영역 단편(scFv), 융합 폴리펩티드, 및 비통상적 항체를 포함한다. 소정 구현예에서, 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변(CH) 영역을 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 CL 영역을 포함한다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. 상기 VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 명명된, 보다 보존된 영역과 함께 배치되는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명되는 고가변성 영역으로 추가 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 아미노-말단부터 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 상기 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포(예컨대, 이펙터 세포) 및 전통적 보체 시스템의 제1 성분(C1 q)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
"CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로 정의된다. 예컨대 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987))을 참고한다. 일반적으로, 항체는 가변 영역에 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 또는 CDR 영역을 포함한다. CDR은 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합을 위한 대부분의 접촉 잔기를 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 CDR 영역은 카밧(Kabat) 시스템[Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and 인간 Services, NIH Publication No. 91-3242]을 이용해 기술된다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "단일-사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 VH::VL 헤테로다이머를 형성하기 위해 공유결합된 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 상기 VH 및 VL은 직접 연결되거나, VH의 N-말단과 VL의 C-말단, 또는 VH의 C-말단과 VL의 N-말단을 결합시키는 펩티드-암호화 링커(예컨대, 10개, 15개, 20개, 25개 아미노산)에 의해 연결된다. 상기 링커는 보통 유연성(flexibility)을 위해 글리신이, 그리고 용해도를 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하다. 불변 영역의 제거와 링커의 도입에도 불구하고, scFv 단백질은 본래의 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 단일 사슬 Fv 폴리펩티드 항체는 허스톤 등의 문헌(Huston, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)에 개시된 것과 같이 VH- 및 VL-암호화 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,091,513호, 제5,132,405호 및 제4,956,778호; 및 미국 특허 공개 제20050196754호 및 제20050196754호를 참조한다. 억제 활성을 갖는 길항성(antagonistic) scFv가 개시되어 있다(예컨대, (Zhao et al., Hyrbidoma (Larchmt) 2008 27(6):455-51); (Peter et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12); (Shieh et al., J Imunol2009 183(4):2277-85); (Giomarelli et al., Thromb Haemost 2007 97(6):955-63); (Fife eta., J Clin Invst 2006 116(8):2252-61); (Brocks et al., Immunotechnology 1997 3(3):173-84); (Moosmayer et al., Ther Immunol 1995 2(10:31-40)) 참조). 자극 활성을 갖는 작용성(agonistic) scFv가 개시되어 있다(예컨대, (Peter et al., J Bioi Chern 2003 25278(38):36740-7); (Xie et al., Nat Biotech 1997 15(8):768-71); (Ledbetter et al., Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55); (Ho et al., BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66) 참조).
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "친화도(affinity)"는 결합 세기의 측정을 의미한다. 친화도는 항체 조합 부위와 항원 결정기(determinant) 사이의 입체화학적 맞춤(fit)의 근접함, 이들 사이의 접촉 면적의 크기, 및/또는 대전된 기 및 소수성 기의 분포에 의존할 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "친화도"는 또한 가역적 복합체의 형성 후의 항원-항체 결합의 세기를 나타내는 "결합도(avidity)"를 포함한다. 항원에 대한 항체의 친화도를 계산하는 방법은 본 기술분야에 알려져 있으며, 다양한 항원-결합 실험, 예컨대 기능적 분석법(예컨대, 유세포 분석법)을 비제한적으로 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역반응성 세포를 활성화 또는 자극시킬 수 있는 세포내 신호전달 도메인에 융합된 세포외 항원-결합 도메인, 및 막통과 도메인을 포함하는 분자를 나타낸다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 scFv를 포함한다. 상기 scFv는 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 융합으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 상기 scFv는 Fab로부터 유래될 수 있다(항체 대신에, 예컨대 Fab 라이브러리로부터 수득됨). 소정 구현예에서, 상기 scFv는 상기 막통과 도메인에 융합된 후 상기 세포내 신호전달 도메인에 융합된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 항원에 대한 높은 결합 친화도 또는 결합도를 갖도록 선택된다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "핵산 분자"는 관심있는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 암호화하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내재적 핵산 서열과 100% 상동성이거나 동일할 필요는 없지만, 실질적인 동일성(identity)을 나타낼 수 있다. 내재적 서열과 "실질적인 동일성" 또는 "실질적인 상동성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 한 가닥과 혼성화될 수 있다. "혼성화시킨다"는 다양한 가혹함 조건 하에 상보적 폴리뉴클레오티드 서열들(예컨대, 본 명세서에 개시된 유전자) 또는 그의 일부 사이에 이중-가닥 분자를 형성하기 위해 쌍을 이루는 것을 의미한다(예컨대, Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507 참조).
예를 들면, 가혹한 염 농도는 대개는 약 750 mM NaCl 및 75 mM 트리나트륨 시트레이트 이하, 예컨대 약 500 mM NaCl 및 50 mM 트리나트륨 시트레이트 이하, 또는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 트리나트륨 시트레이트 이하일 것이다. 낮은 가혹함 혼성화는 유기 용매, 예컨대, 포름아미드의 부재시에 얻어질 수 있고, 높은 가혹함 혼성화는 적어도 약 35% 포름아미드, 예컨대 적어도 약 50% 포름아미드의 존재시에 얻어질 수 있다. 가혹한 온도 조건은 대개는 적어도 약 30℃, 적어도 약 37℃, 또는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 혼성화 시간, 세제(detergent), 예컨대, 나트륨 도데실 설페이트(SDS)의 농도, 및 캐리어 DNA의 포함 또는 배제와 같은 추가적인 파라미터들을 변경하는 것은 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 다양한 레벨의 가혹함은 필요시에 이러한 다양한 조건들을 조합함으로써 달성된다. 소정 구현예에서, 혼성화는 750 mM NaCl, 75 mM 트리나트륨 시트레이트, 및 1% SDS 내에서 30℃에서 일어날 것이다. 소정 구현예에서, 혼성화는 500 mM NaCl, 50 mM 트리나트륨 시트레이트, 1% SDS, 35% 포름아미드, 및 100 ㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA(ssDNA) 내에서 37℃에서 일어날 것이다. 소정 구현예에서, 혼성화는 250 mM NaCl, 25 mM 트리나트륨 시트레이트, 1% SDS, 50% 포름아미드, 및 200 ㎍/㎖ ssDNA 내에서 42℃에서 일어날 것이다. 상기 조건들에 대한 다양한 변경들은 본 기술분야의 기술자에게 즉시 자명할 것이다.
대부분의 적용분야의 경우, 혼성화 이후의 세척 단계는 또한 가혹함에 있어서 다양할 것이다. 세척 가혹함 조건은 염 논도 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 전술한 것과 같이, 세척 가혹함은 염 농도를 감소시키거나 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들면, 세척 단계를 위한 가혹한 염 농도는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 트리나트륨 시트레이트 이하, 예컨대 약 15 mM NaCl 및 1.5 mM 트리나트륨 시트레이트 이하일 수 있다. 세척 단계를 위한 가혹한 온도 조건은 대개는 적어도 약 25℃, 적어도 약 42℃, 또는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 것이다. 소정 구현예에서, 세척 단계는 30 mM NaCl, 3 mM 트리나트륨 시트레이트, 및 0.1% SDS 내에서 25℃에서 일어날 것이다. 소정 구현예에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 트리나트륨 시트레이트, 및 0.1% SDS 내에서 42℃에서 일어날 것이다. 소정 구현예에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 트리나트륨 시트레이트, 및 0.1% SDS 내에서 68℃에서 일어날 것이다. 상기 조건들에 대한 추가적인 변경은 본 기술분야의 기술자에게 즉시 자명할 것이다. 혼성화 기술은 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌들(Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Rogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 개시되어 있다.
"실질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 상동성인"은 기준(reference) 아미노산 서열(예를 들면, 본 명세서에 개시된 아미노산 서열 중 임의의 하나) 또는 핵산 서열(예를 들면, 본 명세서에 개시된 핵산 서열 중 임의의 하나)과 적어도 50% 상동성 또는 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 소정 구현예에서, 이러한 서열은 비교를 위해 사용된 아미노산 또는 핵산의 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 상동성이거나 동일하다.
서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어(예를 들면, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 이용해 측정될 수 있다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 및/또는 다른 변형에 대한 상동성의 정도를 배치함으로써 동일하거나 유사한 서열을 맞춘다. 보존적 치환은 전형적으로 다음의 군 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성의 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근법에서, BLAST 프로그램이 매우 연관된 서열을 나타내는 e-3 및 e-100 사이의 가능성 점수로 사용될 수 있다.
"유사체"는 기준 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 기능을 갖는 구조적으로 연관된 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "리간드"는 수용체에 결합하는 분자를 나타낸다. 소정 구현예에서, 상기 리간드는 다른 세포 상의 수용체에 결합하여서 세포-대-세포 인식 및/또는 상호작용을 허용한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "구성적 발현" 또는 "구성적으로 발현되는"은 모든 생리학적 조선 하에서의 발현 또는 발현되는 것을 나타낸다.
"질환"은 세포, 조직, 또는 기관의 정상 기능에 손상을 주거나 간섭하는 임의의 증상, 질환 또는 질병, 예컨대 신생물, 및 세포의 병원체 감염을 의미한다.
"유효량"은 치료 효과를 갖기에 충분한 양을 의미한다. 소정 구현예에서, "유효량"은 신생물의 지속적인 증식, 성장, 또는 전이(예컨대, 침입, 또는 이동)를 억제, 개선, 또는 억제하기에 충분한 양이다.
"내성을 강화하는"은 이식된 기관 또는 조직을 표적화하는 자가-반응성 세포 또는 면역반응성 세포의 활성을 방지하는 것을 의미한다.
"내재적"은 세포 또는 조직 내에서 정상적으로 발현되는 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다.
"외인성"은 세포에 내재적으로 존재하지 않는 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 용어 "외인성"은 세포에서 발현되는 임의의 재조합 핵산 분자 또는 폴리펩티드, 예컨대 외래의, 이종성의, 및 과발현된 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포괄할 것이다. "외인성" 핵산은 자연형의 야생형 세포에 존재하지 않는 핵산을 의미한다; 예를 들면, 외인성 핵산은 서열에 의해, 부위/위치에 의해, 또는 이들 모두에 의해 내재적 대응물과 달라질 수 있다. 명확성을 위하여, 외인성 핵산은 그 자연형의 내재적 대응물과 비교하여 동일하거나 상이한 서열을 가질 수 있다; 이것은 그 자체 또는 그의 일부가 유전공학에 의해 세포 내로 도입될 수 있고, 선택적으로 대안적 조절 서열, 예컨대 비-자연형의 프로모터 또는 분비 서열과 결합될 수 있다.
"이종성 핵산 분자 또는 폴리펩티드"는 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플 내에 정상적으로 존재하지 않는 핵산 분자(예컨대, cDNA, DNA 또는 RNA 분자) 또는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 핵산은 다른 유기체 유래일 수 있거나, 또는 예를 들면 세포 또는 샘플 내에 정상적으로 발현되지 않는 mRNA 분자일 수 있다.
"면역반응성 세포"는 면역 반응에서 기능을 하는 세포 또는 그의 전구체(progenitor), 또는 후손(progeny)을 의미한다.
"조절하다"는 양성적 또는 음성적으로 변경하는 것을 의미한다. 예시적인 조절은 약 1%, 약 2%, 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 또는 약 100% 변화를 포함한다.
"증가하다"는 적어도 약 5% 양성적으로 변경하는 것을 의미한다. 변경은 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 30%, 약 50%, 약 75%, 약 100%, 또는 그 이상까지일 수 있다.
"감소시키다"는 적어도 약 5% 음성적으로 변경하는 것을 의미한다. 변경은 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 30%, 약 50%, 약 75%, 또는 심지어 약 100%까지일 수 있다.
"단리된 세포"는 세포와 자연적으로 동반되는 분자 및/또는 세포 성분들로부터 분리된 세포를 의미한다.
용어 "단리된", "정제된", 또는 "생물학적으로 정제된"은 그 자연 상태에서 발견되는 것과 같은 정상적으로 동반되는 성분들이 다양한 정도로 없는 물질을 나타낸다. "단리된"은 본래의 공급원(source) 또는 주변으로부터 분리된 정도를 나타낸다. "정제된"은 단리보다 더 높은 분리 정도를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 정제된" 단백질은 다른 물질들이 충분히 제거되어서, 임의의 불순물이 상기 단백질의 생물학적 특성에 물질적으로 영향을 미치거나 다른 부정적 결과를 초래하지 않는다. 즉, 핵산 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때에는 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지가, 화학적으로 합성될 때에는 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다면 정제된 것이다. 순도 및 동질성(homogeneity)은 전형적으로 분석적 화학 기술, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용해 결정된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔 내에서 본질적으로 하나의 밴드만을 생성하는 것을 나타낼 수 있다. 변형, 예를 들면, 인산화 또는 글리코실화를 거칠 수 있는 단백질의 경우, 상이한 변형은 별도로 정제될 수 있는 상이한 단리된 단백질을 생성할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "항원-결합 도메인"은 세포 상에 존재하는 특정 항원성 결정기 또는 항원성 결정기의 세트에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 나타낸다.
본 명세서에서 사용될 때, "링커"는 2 이상의 폴리펩티드 또는 핵산을 공유적으로 부착시켜서 이들이 서로 연결되게 하는 작용기(예컨대, 화학물질 또는 폴리펩티드)를 의미할 것이다. 본 명세서에서 사용될 때, "펩티드 링커"는 2개의 단백질을 서로 커플링시키기 위해(예컨대, VH 및 VL 도메인을 커플링시키기 위해) 사용되는 하나 이상의 아미노산을 나타낸다. 소정 구현예에서, 상기 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS [서열번호 66]에 기재된 서열을 포함한다.
"신생물"은 세포 또는 조직의 병리학적 증식과 그 이후의 다른 조직 또는 기관으로의 이동 또는 침입에 의해 특정되는 질환을 의미한다. 신생물 성장은 전형적으로 조절되지 않고 진행성이며, 정상 세포의 증식을 일으키지 않거나, 이의 중단을 초래하는 조건 하에 일어난다. 신생물은 방광, 뼈, 뇌, 유방, 연골, 교세포, 식도, 나팔관, 쓸개, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 신경 조직, 난소, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기도, 비뇨생식로, 요관, 요도, 자궁, 및 질로 이루어진 군으로부터 선택되는 기관, 또는 그의 조직 또는 세포 타입을 비제한적으로 포함하는 다양한 세포 타입, 조직, 또는 기관에 영향을 미칠 수 있다. 신생물은 암, 예컨대 육종, 암종, 또는 형질세포종(혈질 세포의 악성 종양)을 포함한다.
"수용체"는 하나 이상의 리간드에 선택적으로 결합하는 세포막 상에 존재하는 폴리펩티드, 또는 그의 일부를 의미한다.
"인식하다"는 표적에 대한 선택적인 결합을 의미한다. 종양을 인식하는 T 세포는 종양 항원에 결합하는 수용체(예컨대, TCR 또는 CAR)를 발현할 수 있다.
"참조물" 또는 "대조군"은 비교의 표준물을 의미한다. 예를 들면, CAR 및 scFv를 발현하는 세포에 의한 scFv-항원 결합의 레벨은 CAR만을 발현하는 대응하는 세포에서의 scFv-항원 결합의 레벨과 비교할 수 있다.
"분비된"은 소포체, 골지체, 및 세포막에서 일시적으로 융합되어 세포 밖으로 단백질을 방출하는 소포(vesicle)를 통한 분비 경로를 통해 세포로부터 방출되는 폴리펩티드를 의미한다.
"신호 서열" 또는 "리더(leader) 서열"은 분비 경로로의 진입을 인도하는 새롭게 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 펩티드 서열(예컨대, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개 아미노산)을 의미한다. 예시적인 리더 서열은 IL-2 신호 서열: MYRMQLLSCIALSLALVTNS [서열번호 67] (인간), MYSMQLASCVTLTLVLLVNS [서열번호 68] (마우스); 카파 리더 서열: METPAQLLFLLLLWLPDTTG [서열번호 69] (인간), METDTLLLWVLLLWVPGSTG [서열번호 70] (마우스); CD8 리더 서열: MALPVTALLLPLALLLHAARP [서열번호 71] (인간); 절단된 인간 CD8 신호 펩티드: MALPVTALLLPLALLLHA [서열번호 72] (인간); 알부민 신호 서열: MKWVTFISLLFSSAYS [서열번호 73] (인간); 및 프로락틴 신호 서열: MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLCQGVVS [서열번호 74] (인간)을 비제한적으로 포함한다. 소정 구현예에서, 리더 서열은 IgG 신호 펩티드 또는 GM-CSF 신호 펩티드일 수 있다. "가용성"은 (예컨대, 막에 결합되지 않은) 수성 환경에서 자유롭게 확산할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다.
"특이적으로 결합한다"는 샘플, 예를 들면, 본 발명에 개시된 폴리펩티드를 자연적으로 포함하는 생물학적 샘플 내의 관심있는 생물학적 분자(예컨대, 폴리펩티드)를 인식하거나 결합하지만 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 의미한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "종양 항원"은 정상 또는 비-IS 신생물 세포와 비교하여 종양 세포 상에 특유적 또는 차등적으로 발현되는 항원(예컨대, 폴리펩티드)을 나타낸다. 소정 구현예에서, 종양 항원은 CAR(예컨대, CD19, MUC-16)을 통해 면역 반응을 활성화 또는 유도할 수 있거나 수용체-리간드 결합(예컨대, CD47, PD-L1/L2, B7.1/2)을 통해 면역 반응을 저해할 수 있는 종양에 의해 발현되는 임의의 폴리펩티드를 포함한다.
용어"포함하다", 및 "포함하는"은 미국 특허법에서 이들에 대해 주어진 넓은 의미를 갖게 하기 위한 의도이며, "함유하다", "함유하는" 등을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 질환 경과를 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 나타내며, 예방을 위해 또는 임상 병리 경과 동안 수행될 수 있다. 치료의 치료적 효과는 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리적 결과의 약화, 전환 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 완화 또는 억제, 및 면제 또는 개선된 예후를 비제한적으로 포함한다. 질환 또는 질병의 진행을 방지함으로써, 치료는 영향받거나 진단받은 대상체 또는 질병을 갖는 것으로 추정되는 대상체에서 질병으로 인한 악화를 방지할 수 있지만, 또한 치료는 질병에 대한 위험에 처하거나 질병을 갖는 것으로 추정되는 대상체에서 질병의 개시 또는 질병의 증상을 방지할 수 있다.
본 명세서에서 "개체" 또는 "대상체"는 척추동물, 예컨대 인간 또는 비-인간 동물, 예를 들면, 포유동물이다. 포유동물은 인간, 영장류, 가축, 스포츠 종물, 설치류 및 애완동물을 비제한적으로 포함한다. 비-인간 동물 대상체의 비제한적 예는 마우스, 래트, 햄스터, 및 기니 피그와 같은 설치류; 토끼; 개; 고양이; 양; 돼지; 염소; 소; 말; 및 유인원 및 원숭이와 같은 비-인간 영장류를 포함한다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "면역손상된"은 면엽결핍을 갖는 대상체를 나타낸다. 상기 대상체는 대개 건강한 면역 시스템을 갖는 인간에서는 질환을 초래하지 않지만 면역 시스템이 불량하게 기능하거나 저해된 인간에게는 영향을 미칠 수 있는 유기체에 의해 초래되는 감염인 기회 감염에 대해 매우 취약하다.
본 개시된 주제의 다른 측면들이 아래에 개시되며, 본 개시된 주제의 영역 이내이다.
2. 키메라 항원 수용체
본 발명은 관심있는 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 상기 CAR은 종양 항원 또는 병원체 항원에 결합할 수 있다.
2.1. 항원
소정 구현예에서, 상기 CAR은 종양 항원에 결합한다. 임의의 종양 항원(항원성 펩티드)이 본 명세서에 개시된 종양-연관 구현예에서 사용될 수 있다. 항원의 공급원은암 단백질을 비제한적으로 포함한다. 상기 항원은 펩티드 또는 온전한 단백질 또는 그의 일부로서 발현될 수 있다. 상기 온전한 단백질 또는 그의 일부는 자연형이거나 돌연변이형일 수 있다. 종양 항원의 비제한적 예는 include 탄산 탈수효소 IX(CAlX), 암태아 항원(CEA), CD8, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CLL1, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, CD123, CD44V6, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원(예컨대, 세포 표면 항원), 상피 당단백질-2(EGP-2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 수용체 티로신-단백질 키나아제 erb-B2,3,4(erb-B2,3,4), 폴레이트-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 폴레이트 수용체-α, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1CAM), 흑색종 항원 패밀리 A, 1(MAGE-A1), 뮤신 16(MUC16), 뮤신 1(MUC1), 메소텔린(MSLN), ERBB2, MAGEA3, p53, MART1,GP100, 프로티나아제3(PR1), 티로시나아제, 수르비빈, hTERT, EphA2, NKG2D 리간드, 암-고환 항원 NY-ES0-1, 종양태아성 항원(h5T4), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선-특이적 막 항원(PSMA), ROR1, 종양-연관 당단백질 72(TAG-72), 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF-R2), 및 윌름스 종양 단백질(WT-1), BCMA, NKCS1, EGF1R, EGFR-VIII, CD99, CD70, ADGRE2, CCR1, LILRB2, PRAME CCR4, CD5, CD3, TRBC1, TRBC2, TIM-3, 인테그린 B7, ICAM-1, CD70, Tim3, CLEC12A 및 ERBB를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR은 CD19 폴리펩티드에 결합한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR 인간 CD19 폴리펩티드에 결합한다. 소정 구현예에서, 상기 인간 CD19 폴리펩티드는 서열번호 75에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK [서열번호75]
소정 구현예에서, 상기 CAR은 CD19 단백질의 세포외 도메인에 결합한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR은, 예를 들면, 면역손상된 대상체에서 병원체 감염 또는 다른 감염성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위하여 병원체 항원에 결합한다. 병원체의 비제한적 예는 질환을 초래할 수 있는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 및 프로토조아를 포함한다.
바이러스의 비제한적 예는 레트로비리대(Retroviridae)(예컨대 인간 면역결핍 바이러스, 예컨대 HIV-1(HDTV-III, LAVE 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III로도 나타냄; 및 다른 단리물, 예컨대 HIV-LP); 피코르나비리대(Picornaviridae)(예컨대 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스; 엔테로바이러스, 인간 콕사키 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스); 칼시비리대(Calciviridae)(예컨대 위장염을 초래하는 균주); 토가비리대(Togaviridae)(예컨대 말 뇌염 바이러스, 루벨라 바이러스); 플라비리대(Flaviridae)(예컨대 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로노비리대(Coronoviridae)(예컨대 코로나바이러스); 라브도비리대(Rhabdoviridae)(예컨대 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로비리대(Filoviridae)(예컨대 에볼라 바이러스); 파라믹소비리대(Paramyxoviridae)(예컨대 파라인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스); 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae)(예컨대 인플루엔자 바이러스); 분가비리대(Bungaviridae)(예컨대 한탄 바이러스, 분가 바이러스, 플레보바이러스 및 나이라 바이러스); 아레나 비리대(Arena viridae)(출혈열 바이러스); 레오비리대(Reoviridae)(예컨대 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나비리대(Birnaviridae); 헤파드나비리대(Hepadnaviridae)(B형 간염 바이러스); 파르보비리대(Parvovirida)(파르보바이러스); 파포바비리대(Papovaviridae)(파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리대(Adenoviridae)(대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리대(Herpesviridae)(헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 1 및 2, 바리셀라 조스터 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 헤르페스 바이러스; 폭스비리대(Poxviridae)(바리올라 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스); 및 이리도비리대(Iridoviridae)(예컨대 아프리카 돼지 열 바이러스); 및 분류되지 않은 바이러스(예컨대 델타 간염의 매개체(B형 간염 바이러스의 결점형 위성체로 여겨짐), 비-A형, 비-B형 간염의 매개체(클래스 1 = 내부에서 전파됨; 클래스 2 = 비경구로 전파됨(즉, C형 간염); 노르워크(Norwalk) 및 연관 바이러스, 및 아스트로바이러스);를 포함한다.
박테리아의 비제한적 예는 파스네우렐라(Pasteurella), 스타필로코커스(Staphylococci), 스트렙토코커스(Streptococcus), 에스세리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 및 살모넬라(Salmonella)종을 포함한다. 감염성 박테리아의 구체적 예는 헬리코박터 파일로리스(Helicobacter pyloris), 보렐리아 버그도르페리(Borelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 마이코박테리아 속(Mycobacteria spp)(예컨대 M. 투베르쿨로시스(tuberculosis), M. 아비움(avium), M. 인트라셀룰라레(intracellulare), M. 칸사이이(kansaii), M. 고르도니(gordonae)), 스타필로코커스 아루에우스(Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌지티데스(meningitides), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 피오게네스(스트렙토코커스 pyogenes)(그룹 A 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 아갈락티이(agalactiae)(그룹 B 스트렙토코커스), 스트렙토코커스(비리단스 그룹), 스트렙토코커스 패칼리스(faecalis), 스트렙토코커스 보비스(bovis), 스트렙토코커스(아나에로빅 종), 스트렙토코커스 뉴모니애(pneumonia), 병원성 캄필로박터 속(Campylobacter sp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 해모필러스 인플루엔재(Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus antracis), 코리네박테리움 디프테리애(corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 속, 에리시펠로트릭스 루시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리디움 페르프린저스(Clostridium perfringers), 클로스트리디움 테타니(tetani), 엔테로박터 애로게네스(Enterobacter aerogenes), 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 파스투렐라 멀토시다(Pasturella multocida), 박테리오이데스 속(Bacteroides sp.), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리디움(Treponema pallidium), 트레포네마 페르테누에(pertenue), 렙토스피라(Leptospira), 리케치아(Rickettsia), 및 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelli)를 비제한적으로 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 병원체 항원은 사이토메갈로바이러스(CMV)에 존재하는 바이러스 항원, 엡스테인 바 바이러스(EBV)에 존재하는 바이러스 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 존재하는 바이러스 항원, 또는 인플루엔자 바이러스에 존재하는 바이러스 항원이다.
2.2. 키메라 항원 수용체(CAR)
CAR은 면역 이펙터 세포 상에 관심있는 특이성을 이식 또는 부여하는 조작된 수용체이다. CAR은 T 세포에 레트로바이러스 벡터에 의해 촉진되는 그 코딩 서열을 전달하여 모노클론 항체의 특이성을 이식하기 위해 사용될 수 있다.
3세대의 CAR이 있다. "1세대" CAR은 전형적으로 막통과 도메인에 융합되고 세포질/세포내 신호전달 도메인에 융합된 세포외 항원-결합 도메인(예컨대, scFv)으로 이루어진다. "1세대" CAR은 데노보(de novo) 항원 인식을 제공하고, HLA-매개성 항원 제공과 무관하게 단일 융합 분자 내의 CD3ζ 사슬 신호전달 도메인을 통해 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두의 활성화를 유발할 수 있다. "2세대" CAR은 CAR의 세포질 꼬리에 다양한 공-자극성 분자(예컨대, CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, CD27, CD40/My88 및 NKGD2) 유래의 세포내 도메인을 추가하여 T 세포에 추가적인 신호를 제공한다. "2세대" CAR은 공-자극(예컨대, CD28 또는 4-1BB) 및 활성화(CD3ζ) 모두를 제공하는 것들을 포함한다. "3세대" CAR은 복수의 공-자극(예컨대, CD28 및 4-1BB) 및 활성화(CD3ζ)를 제공하는 것들을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 2세대 CAR이다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 항원에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하며, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공-자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 힌지/스페이서 영역을 추가로 포함한다.
소정 비제한적 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인(구현예는, 예를 들면, scFv 또는 그의 유사체)는 약 2×10-7 M 이하의 해리 상수(Kd)로 항원에 결합한다. 소정 구현예에서, 상기Kd 는 약 2×10-7 M 이하, 약 1×10-7 M 이하, 약 9×10-8 M 이하, 약 1×10-8 M 이하, 약 9×10-9 M 이하, 약 5×10-9 M 이하, 약 4×10-9 M 이하, 약 3×10-9 이하, 약 2×10-9 M 이하, 또는 약 1×10-9 M 이하이다. 소정 비제한적 구현예에서, 상기 Kd는 약 3×10-9 M 이하이다. 소정 비제한적 구현예에서, 상기 Kd는 약 1×10-9 M 내지 약 3×10-7 M이다. 소정 비제한적 구현예에서, 상기 Kd는 약 1.5×10-9 M 내지 약 3×10-7 M이다. 소정 비제한적 구현예에서, 상기 Kd는 약 1.5×10-9 M 내지 약 2.7×10-7 M이다. 소정 비제한적 구현예에서, 상기 Kd는 약 1×10-4 M 내지 약 1×10-6 M이다. 소정 비제한적 구현예에서, 상기 Kd는 약 1×10-13 M 내지 약 1×10-15 M이다.
(예를 들면, scFv 또는 그의 유사체 내의) 세포외 항원-결합 도메인의 결합은, 예를 들면, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역분석법(RIA), FACS 분석, 바이오분석법(예컨대, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 확인될 수 있다. 각각의 이들 분석법은 일반적으로 관심있는 복합체에 특이적인 표지된 시약(예컨대, 항체 또는 scFv)을 도입함으로써 특정 관심있는 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들면, 상기 scFv는 방사성 표지되고 방사면역분석법(RIA)에서 사용될 수 있다(예를 들면, 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radio Ligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참조). 상기 방사성 동위원소는 γ 카운터 또는 섬광(scintillation) 카운터를 이용하는 수단 또는 오토라디오그라피(autoradiography)에 의해 검출될 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인은 형광 마커로 표지된다. 형광 마커의 비제한적 예는 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(예컨대, EBFP, EBFP2, Azurite 및 mKalama1), 시안색 형광 단백질(예컨대, ECFP, Cerulean 및 CyPet), 및 황색 형광 단백질(예컨대, YFP, Citrine, Venus 및 YPet)을 포함한다.
2.2.1. CAR의 세포외 항원-결합 도메인
소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 항원에 특이적으로 결합한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 scFv이다. 소정 구현예에서, 상기 scFv는 인간 scFv이다. 소정 구현예에서, 상기 scFv는 인간화 scFv이다. 소정 구현예에서, 인간화 scFv 쥐과(murine) scFv이다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 선택적으로 가교결합되는 Fab이다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 F(ab)2이다. 소정 구현예에서, 임의의 외래 분자가 이종성 서열을 갖는 융합 단백질 내에 포함되어 세포외 항원-결합 도메인을 형성할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 scFv는 항원-Fc 융합 단백질로 scFv 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인된다. 상기 scFv는 인간 VL 및/또는 VH 유전자를 보유하는 마우스로부터 유래될 수 있다. 상기 scFv는 또한 낙타과(camelid) 중쇄(예컨대, 낙타, 라마 등으로부터의 VHH) 또는 세포 표면 수용체에 대한 부분적인 자연형 리간드로 치환될 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 항원은 종양 항원, 예컨대, 본 명세서에 개시된 종양 항원이다. 소정 구현예에서, 상기 항원은 병원체 항원, 예컨대, 본 명세서에 개시된 병원체 항원이다.
소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인 쥐과 scFv이다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 인간 CD19 폴리펩티드에 결합하는 쥐과 scFv이다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하고 인간 CD19 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 75에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD19 폴리펩티드)에 특이적으로 결합하는 쥐과 scFv이다. 소정 구현예에서, 서열번호 84의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 85에 기재된다. 소정 구현예에서, 상기 쥐과 scFv는 서열번호 82에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 쥐과 scFV는 서열번호 83에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 쥐과 scFv는 서열번호 82에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 83에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 선택적으로 (ⅲ) 링커 서열, 예를 들면 상기 VH 및 VL 사이의 링커 펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 링커는 서열번호 66에 기재된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 82와 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%) 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 예를 들면, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 82와 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 82에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 83과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%) 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 예를 들면, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 83과 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 83에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 82와 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%) 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 83과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%) 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 82에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 83에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 76에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 77에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하는 VH CDR2, 및 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하는 VH CDR3을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 76에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 77에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 79에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 80에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 본형을 포함하는 VL CDR2, 및 서열번호 81에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 79에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 80에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열번호 81에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 76에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 77에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 79에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 80에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하는 VL CDR2, 및 서열번호 81에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 서열번호 76에 기재된 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 77에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 78에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 79에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 80에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열번호 81 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
항-인간 CD19 scFv(SJ25C1)
CDR 1 2 3
VH a.a. GYAFSS [서열번호 76] YPGDGD [서열번호 77] KTISSVVDF [서열번호 78]
VL a.a. KASQNVGTNVA [서열번호 79] SATYRN [서열번호 80] QQYNRYPYT [서열번호 81]
전체 VH EVKLQQSGAE LVRPGSSVKI SCKASGYAFS SYWMNWVKQR PGQGLEWIGQ IYPGDGDTNY NGKFKGQATL TADKSSSTAY MQLSGLTSED SAVYFCARKT ISSVVDFYFD YWGQGTTVTV SS [서열번호 82]
전체 VL DIELTQSPKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVG TNVAWYQQKP GQSPKPLIYS ATYRNSGVPD RFTGSGSGTD FTLTITNVQS KDLADYFCQQ YNRYPYTSGG GTKLEIKR [서열번호 83]
scFv MALPVTALLL PLALLLHAEV KLQQSGAELV RPGSSVKISC KASGYAFSSY WMNWVKQRPG QGLEWIGQIY PGDGDTNYNG KFKGQATLTA DKSSSTAYMQ LSGLTSEDSA VYFCARKTIS SVVDFYFDYW GQGTTVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSDIELT QSPKFMSTSV GDRVSVTCKA SQNVGTNVAW YQQKPGQSPK PLIYSATYRN SGVPDRFTGS GSGTDFTLTI TNVQSKDLAD YFCQQYNRYP YTSGGGTKLE IKR [서열번호 85]
DNA ATGGCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTCAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCGGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAAAGACCATTAGTTCGGTAGTAGATTTCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACCACTGATTTACTCGGCAACCTACCGGAACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACTAACGTGCAGTCTAAAGACTTGGCAGACTATTTCTGTCAACAATATAACAGGTATCCGTACACGTCCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGG [서열번호 85]
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 포함하는 본 개시된 CAR(예컨대, 상기 CAR의 세포외 항원-결합 도메인)의 결합 특징에 현저하게 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 나타낸다. 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함할 수 있다. 변형은 위치-지정 돌연변이화 및 PCR-매개성 돌연변이화와 같은 본 기술분야에 알려진 표준 기술에 의해 본 개시된 CAR의 인간 scFv 내로 도입될 수 있다. 아미노산은 전하 및 극성과 같은 그 생리화학적 특성에 따라 그룹으로 분류될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 동일한 그룹 내의 아미노산으로 교체되는 치환이다. 예를 들면, 아미노산은 전하에 의해 분류될 수 있다: 양전하 아미노산은 리신, 아르기닌, 히스티딘을 포함하고, 음전하 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함하며, 중성 전하 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 게다가, 아미노산은 극성에 의해 분류될 수 있다: 극성 아미노산은 아르기닌(염기성 극성), 아스파라긴, 아스파르트산(산성 극성), 글루탐산(산성 극성), 글루타민, 히스티딘(염기성 극성), 리신(염기성 극성), 세린, 트레오닌, 및 티로신을 포함한다; 비-극성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 및 발린을 포함한다. 따라서, CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 그룹 유래의 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있고, 상기 변경된 항체는 본 명세서에 개시된 기능 분석법을 이용하여 유지된 기능(즉, 상기 (c) 내지 (l)에 개시된 기능)에 대해 테스트될 수 있다. 소정 구현예에서, 특정된 서열 또는 CDR 영역 내의 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하의 잔기가 변경된다.
특정 서열(예컨대, 서열번호 82 및 83)과 적어도 약 80%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%(예컨대, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%) 상동성 또는 동일성을 갖는 VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 상기 특정 서열(들)과 비교하여 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유할 수 있지만, 표적 항원(예컨대, CD19)에 결합하는 능력을 유지한다. 소정 구현예에서, 특정 서열(예컨대, 서열번호 82, 및 83)에서 총 1 내지 10개 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 소정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 상기 세포외 항원-결합 도메인의 CDR 바깥의 영역에서(예컨대, FR에서) 일어난다. 소정 구현예에서, 상기 세포외 항원-결합 도메인은 그 서열(서열번호 82 및 서열번호 83)의 번역-후 변형을 포함하여 서열번호 82, 및 서열번호 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 및/또는 VL 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, 2개의 아미노산 서열 사이의 상동성 백분율은 상기 2개 서열 사이의 동일성 백분율과 동등하다. 상기 2개 서열 사이의 동일성 백분율은 갭(gap)의 수를 고려한 상기 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 수 / 위치의 총 수×100), 및 상기 2개의 서열을 최적으로 정렬하기 위해 도입될 필요가 있는각각의 갭의 길이의 함수이다. 서열들의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 이용해 달성될 수 있다.
2개의 아미노산 서열 사이의 상동성 백분율은 ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 통합된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))을 이용하여 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 벌점 및 4의 갭 벌점을 이용해 결정될 수 있다. 게다가, 2개의 아미노산 서열 사이의 상동성 백분율은 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용가능함) 내의 GAP 프로그램 내로 통합된 Needleman 및 Wunsch 알고리즘(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))을 이용하여 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 이용해 결정될 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 본 개시된 주제의 아미노산 서열은, 예를 들면, 관련 서열을 확인하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "쿼리(query) 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌(Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)의 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 이용해 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어길이 = 3을 이용해 수행하여 본 명세서에 개시된 특정 서열(예컨대, scFv m903, m904, m905, m906, 및 m900의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)과 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다.
비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위하여, 문헌(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)에 개시된 것과 같은 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 해당 프로그램(예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 이용될 수 있다.
2.2.2. CAR의 막통과 도메인
CAR의 막통과 도메인
소정 비제한적 구현예에서, 상기 CAR의 막통과 도메인은 막의 적어도 일부를 가로지르는 소수성의 알파 나선을 포함한다. 상이한 막통과 도메인은 상이한 수용체 안정성을 야기한다. 항원 인식 후, 수용체 클러스터(cluster) 및 신호가 세포에 전달된다. 본 개시된 주제에 따르면, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD40 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD84 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, (면역 반응과 연관된 단백질에 기반하지 않는) 합성 폴리펩티드, 또는 이들의 조합의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인을 포함할 수 있다.
CD8
소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 아래에 제공된 것과 같은 NCBI 참조 번호 NP_001139345.1(서열번호 86)(여기서 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 이용해 결정될 수 있음)을 갖는 서열 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 갖고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 적어도 20개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 50개, 및 235개까지의 아미노산 길이인 서열번호 86의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 서열번호 86의 아미노산 1 내지 235, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 또는 200 내지 235의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 서열번호 86의 아미노산 137 내지 209의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는 CD8 폴리펩티드를 포함하는 막통과 도메인을 포함한다.
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV [서열번호 86]
소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 아래에 제공된 것과 같은 NCBI 참조 번호 AAA92533.1(서열번호 87)(여기서 상동성은 BLAST 또는 FASTA와 같은 표준 소프트웨어를 이용해 결정될 수 있음)을 갖는 서열 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 갖고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 또는 적어도 약 60개, 또는 적어도 약 70개, 또는 적어도 약 100개, 또는 적어도 약 200개, 및 247개까지의 아미노산 길이인 서열번호 87의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 서열번호 87의 아미노산 1 내지 247, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 151 내지 219, 또는 200 내지 247의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 서열번호 87의 아미노산 151 내지 219의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는 CD8 폴리펩티드를 포함하는 막통과 도메인을 포함한다.
1 MASPLTRFLS LNLLLMGESI ILGSGEAKPQ APELRIFPKK MDAELGQKVD LVCEVLGSVS
61 QGCSWLFQNS SSKLPQPTFV VYMASSHNKI TWDEKLNSSK LFSAVRDTNN KYVLTLNKFS
121 KENEGYYFCS VISNSVMYFS SVVPVLQKVN STTTKPVLRT PSPVHPTGTS QPQRPEDCRP
181 RGSVKGTGLD FACDIYIWAP LAGICVAPLL SLIITLICYH RSRKRVCKCP RPLVRQEGKP
241 RPSEKIV [서열번호 87]
소정 구현예에서, 상기 CD8 폴리펩티드는 아래에 제공된 서열번호 88에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다:
STTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICY [서열번호 88]
본 개시된 주제에 따르면, "CD8 핵산 분자"는 CD8 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
소정 구현예에서, 서열번호 88에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CD8 폴리펩티드를 암호화하는 CD8 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 89에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
TCTACTACTACCAAGCCAGTGCTGCGAACTCCCTCACCTGTGCACCCTACCGGGACATCTCAGCCCCAGAGACCAGAAGATTGTCGGCCCCGTGGCTCAGTGAAGGGGACCGGATTGGACTTCGCCTGTGATATTTACATCTGGGCACCCTTGGCCGGAATCTGCGTGGCCCTTCTGCTGTCCTTGATCATCACTCTCATCTGCTAC [서열번호 89]
CD28
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함한다. 상기 CD28 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 P10747 또는 NP_006130(서열번호 90)을 갖는 서열 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 가질 수 있거나, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 비제한적 소정 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 적어도 20개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 50개, 및 220개까지의 아미노산 길이인 서열번호 90의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 서열번호 90의 아미노산 1 내지 220, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 114 내지 220, 150 내지 200, 또는 200 내지 220의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인 내에 포함되는 CD28 폴리펩티드는 서열번호 90의 아미노산 153 내지 179의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
서열번호 90은 아래에 제공된다:
1 MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLD
61 SAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP
121 PYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLV TVAFIIFWVR
181 SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS [서열번호 90]
본 개시된 주제에 따르면, "CD28 핵산 분자"는 CD28 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 소정 구현예에서, 서열번호 90의 아미노산 153 내지 179를 갖는 CD28 폴리펩티드를 암호화하는 CD28 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 91에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg [서열번호 91]
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD28 막통과 도메인을 포함한다. 상기 인간 CD28 막통과 도메인은 서열번호 92 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 서열번호 92는 아래에 제공된다:
FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV [서열번호 792].
서열번호 92의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 93에 기재된다.
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG [서열번호 93]
CD84
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인은 CD84 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인을 포함한다. 상기 CD84 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_001171808.1(서열번호 1)을 갖는 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 비제한적 소정 구현예에서, 상기 CD84 폴리펩티드는 적어도 20개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 50개, 및 220개까지의 아미노산 길이인 서열번호 1의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 CD84 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 1 내지 220, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 114 내지 220, 150 내지 200, 또는 200 내지 220의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인 내에 포함되는 CD84 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 226 내지 250의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
서열번호 1은 아래에 제공된다:
1 maqhhlwill lclqtwpeaa gkdseiftvn gilgesvtfp vniqeprqvk iiawtsktsv
61 ayvtpgdset apvvtvthrn yyerihalgp nynlvisdlr medagdykad intqadpytt
121 tkrynlqiyr rlgkpkitqs lmasvnstcn vtltcsveke eknvtynwsp lgeegnvlqi
181 fqtpedqelt ytctaqnpvs nnsdsisarq lcadiamgfr thhtgllsvl amffllvlil
241 ssvflfrlfk rrqgrifpeg sclntftknp yaaskktiyt yimasrntqp aesriydeil
301 qskvlpskee pvntvysevq fadkmgkast qdskppgtss yeivi [서열번호 1]
본 개시된 주제에 따르면, "CD84 핵산 분자"는 CD84 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 소정 구현예에서, 서열번호 1의 아미노산 226 내지 250을 갖는 CD84 폴리펩티드를 암호화하는 CD84 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
TTGCTGAGCGTGCTGGCTATGTTCTTTCTGCTTGTTCTCATTCTGTCTTCAGTGTTTTTGTTCCGTTTGTTCAAG [서열번호 2]
CD166
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인은 CD166 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인을 포함한다. 상기 CD166 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_001618.2(서열번호 3)를 갖는 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 비제한적 소정 구현예에서, 상기 CD166 폴리펩티드는 적어도 20개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 50개, 및 220개까지의 아미노산 길이인 서열번호 3의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 CD166 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 1 내지 220, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 114 내지 220, 150 내지 200, 또는 200 내지 220의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인 내에 포함되는 CD166 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 528 내지 553의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인 내에 포함되는 CD166 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 528 내지 549의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
서열번호 3은 아래에 제공된다:
1 meskgasscr llfcllisat vfrpglgwyt vnsaygdtii ipcrldvpqn lmfgkwkyek
61 pdgspvfiaf rsstkksvqy ddvpeykdrl nlsenytlsi snarisdekr fvcmlvtedn
121 vfeaptivkv fkqpskpeiv skalfleteq lkklgdcise dsypdgnitw yrngkvlhpl
181 egavviifkk emdpvtqlyt mtstleyktt kadiqmpftc svtyygpsgq ktihseqavf
241 diyypteqvt iqvlppknai kegdnitlkc lgngnpppee flfylpgqpe girssntytl
301 tdvrrnatgd ykcslidkks miastaitvh yldlslnpsg evtrqigdal pvsctisasr
361 natvvwmkdn irlrsspsfs slhyqdagny vcetalqeve glkkresltl ivegkpqikm
421 tkktdpsgls ktiichvegf pkpaiqwtit gsgsvinqte espyingryy skiiispeen
481 vtltctaenq lertvnslnv saisipehde adeisdenre kvndqakliv givvglllaa
541 lvagvvywly mkksktaskh vnkdlgnmee nkkleennhk tea [서열번호 3]
본 개시된 주제에 따르면, "CD166 핵산 분자"는 CD166 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 소정 구현예에서, 서열번호 3의 아미노산 528 내지 553을 갖는 CD166 폴리펩티드를 암호화하는 CD166 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 4에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
CTAATTGTGGGAATCGTTGTTGGTCTCCTCCTTGCTGCCCTTGTTGCTGGTGTCGTCTACTGGCTGTACATGAAGAAG [서열번호 4]
CD8a
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인은 CD8a 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인을 포함한다. 상기 CD8a 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_001139345.1(서열번호 5)을 갖는 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 비제한적 소정 구현예에서, 상기 CD8a 폴리펩티드 적어도 20개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 50개, 및 220개까지의 아미노산 길이인 서열번호 5의 연속적인 ㅂ부ㅜㄴ인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 CD8a 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 1 내지 220, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 114 내지 220, 150 내지 200, 또는 200 내지 220의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인 내에 포함되는 CD8a 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 183 내지 207의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
서열번호 5는 아래에 제공된다:
1 malpvtalll plalllhaar psqfrvspld rtwnlgetve lkcqvllsnp tsgcswlfqp
61 rgaaasptfl lylsqnkpka aegldtqrfs gkrlgdtfvl tlsdfrrene gyyfcsalsn
121 simyfshfvp vflpakpttt paprpptpap tiasqplslr peacrpaagg avhtrgldfa
181 cdiyiwapla gtcgvlllsl vitlycnhrn rrrvckcprp vvksgdkpsl saryv
[서열번호 5]
본 개시된 주제에 따르면, "CD8a 핵산 분자"는 CD8a 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 소정 구현예에서, 서열번호 5의 아미노산 183 내지 207을 갖는 CD8a 폴리펩티드를 암호화하는 CD8a 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 6에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaac [서열번호 6]
CD8b
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인은 CD8b 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인을 포함한다. 상기 CD8b 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_742099.1(서열번호 7)을 갖는 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 비제한적 소정 구현예에서, 상기 CD8b 폴리펩티드는 적어도 20개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 50개, 및 220개까지의 아미노산 길이인 서열번호 7의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 CD8b 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 1 내지 220, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 114 내지 220, 150 내지 200, 또는 200 내지 220의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인 내에 포함되는 CD8b 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 171 내지 195의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
서열번호 7은 아래에 제공된다:
1 mrprlwllla aqltvlhgns vlqqtpayik vqtnkmvmls ceakislsnm riywlrqrqa
61 pssdshhefl alwdsakgti hgeeveqeki avfrdasrfi lnltsvkped sgiyfcmivg
121 speltfgkgt qlsvvdflpt taqptkkstl kkrvcrlprp etqkgplcsp itlgllvagv
181 lvllvslgva ihlccrrrra rlrfmkqlrl hplekcsrmd y [서열번호 7]
본 개시된 주제에 따르면, "CD8b 핵산 분자"는 CD8b 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 소정 구현예에서, 서열번호 7의 아미노산 171 내지 195를 갖는 CD8b 폴리펩티드를 암호화하는 CD8b 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 8에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
ATCACCCTTGGCCTGCTGGTGGCTGGCGTCCTGGTTCTGCTGGTTTCCCTGGGAGTGGCCATCCACCTGTGCTGC [서열번호 8]
ICOS
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인은 ICOS 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인을 포함한다. 상기 ICOS 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_036224.1(서열번호 9)을 갖는 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 비제한적 소정 구현예에서, 상기 ICOS 폴리펩티드는 적어도 20개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 50개, 및 220개까지의 아미노산 길이인 서열번호 9의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 ICOS 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 1 내지 220, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 114 내지 220, 150 내지 200, 또는 200 내지 220의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인 내에 포함되는 ICOS 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 141 내지 165의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
서열번호 9는 아래에 제공된다:
1 mksglwyffl fclrikvltg eingsanyem fifhnggvqi lckypdivqq fkmqllkggq
61 ilcdltktkg sgntvsiksl kfchsqlsnn svsfflynld hshanyyfcn lsifdpppfk
121 vtltggylhi yesqlccqlk fwlpigcaaf vvvcilgcil icwltkkkys ssvhdpngey
181 mfmravntak ksrltdvtl [서열번호 9]
본 개시된 주제에 따르면, "ICOS 핵산 분자"는 ICOS 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 소정 구현예에서, 서열번호 9의 아미노산 141 내지 165를 갖는 ICOS 폴리펩티드를 암호화하는 ICOS 핵산 분자는 아레에 제공된 것과 같은 서열번호 10에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
TTCTGGTTACCCATAGGATGTGCAGCCTTTGTTGTAGTCTGCATTTTGGGATGCATACTTATTTGTTGGCTTACA [서열번호 10]
CTLA-4
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인은 CTLA-4 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인을 포함한다. 상기 CTLA-4 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_005205.2(서열번호 11)를 갖는 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 비제한적 소정 구현예에서, 상기 CTLA-4 폴리펩티드는 적어도 20개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 50개, 및 220개까지의 아미노산 길이인 서열번호 11의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 CTLA-4 폴리펩티드는 서열번호 11의 아미노산 1 내지 220, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 114 내지 220, 150 내지 200, 또는 200 내지 220의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인 내에 포함되는 CTLA-4 폴리펩티드는 서열번호 11의 아미노산 162 내지 186의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
서열번호 11은 아래에 제공된다:
1 maclgfqrhk aqlnlatrtw pctllffllf ipvfckamhv aqpavvlass rgiasfvcey
61 aspgkatevr vtvlrqadsq vtevcaatym mgneltfldd sictgtssgn qvnltiqglr
121 amdtglyick velmypppyy lgigngtqiy vidpepcpds dfllwilaav ssglffysfl
181 ltavslskml kkrsplttgv yvkmpptepe cekqfqpyfi pin [서열번호 11]
본 개시된 주제에 따르면, "CTLA-4 핵산 분자"는 CTLA-4 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 소정 구현예에서, 서열번호 11의 아미노산 162 내지 186을 갖는 CTLA-4 폴리펩티드를 암호화하는 CTLA-4 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 12에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
TTCCTCCTCTGGATCCTTGCAGCAGTTAGTTCGGGGTTGTTTTTTTATAGCTTTCTCCTCACAGCTGTTTCTTTG [서열번호 12]
ICAM-1
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인은 ICAM-1 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 막통과 도메인을 포함한다. 상기 ICAM-1 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_000192.2(서열번호 13)를 갖는 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동질성인 아미노산 서열을 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 비제한적 소정 구현예에서, 상기 ICAM-1 폴리펩티드는 적어도 20개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 50개, 및 220개까지의 아미노산 길이인 서열번호 13의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 ICAM-1 폴리펩티드는 서열번호 13의 아미노산 1 내지 220, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 114 내지 220, 150 내지 200, 또는 200 내지 220의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 막통과 도메인 내에 포함되는 ICAM-1 폴리펩티드는 서열번호 13의 아미노산 481 내지 507의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
서열번호 13은 아래에 제공된다:
1 mapssprpal pallvllgal fpgpgnaqts vspskvilpr ggsvlvtcst scdqpkllgi
61 etplpkkell lpgnnrkvye lsnvqedsqp mcysncpdgq staktfltvy wtpervelap
121 lpswqpvgkn ltlrcqvegg apranltvvl lrgekelkre pavgepaevt ttvlvrrdhh
181 ganfscrtel dlrpqglelf entsapyqlq tfvlpatppq lvsprvlevd tqgtvvcsld
241 glfpvseaqv hlalgdqrln ptvtygndsf sakasvsvta edegtqrltc avilgnqsqe
301 tlqtvtiysf papnviltkp evsegtevtv kceahprakv tlngvpaqpl gpraqlllka
361 tpedngrsfs csatlevagq lihknqtrel rvlygprlde rdcpgnwtwp ensqqtpmcq
421 awgnplpelk clkdgtfplp igesvtvtrd legtylcrar stqgevtrkv tvnvlsprye
481 iviitvvaaa vimgtaglst ylynrqrkik kyrlqqaqkg tpmkpntqat pp [서열번호 13]
본 개시된 주제에 따르면, "ICAM-1 핵산 분자"는 ICAM-1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 소정 구현예에서, 서열번호 13의 아미노산 481 내지 507을 갖는 ICAM-1 폴리펩티드를 암호화하는 ICAM-1 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 14에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
ATTGTCATCATCACTGTGGTAGCAGCCGCAGTCATAATGGGCACTGCAGGCCTCAGCACGTACCTCTATAACCGCCAGCGG [서열번호 14]
2.2.3. 힌지/스페이서 영역
소정 비제한적 구현예에서, CAR은 또한 상기 세포외 항원-결합 도메인을 상기 막통과 도메인에 결합시키는 힌지/스페이서 영역을 포함할 수 있다. 상기 힌지/스페이서 영역은 항원 결합 도메인을 상이한 방향으로 배향하게 하여 항원 인식을 촉진하기에 충분히 유연할 수 있다. 소정 비제한적 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD40 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD84 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, (면역 반응과 연관된 단백질에 기반하지 않는) 합성 폴리펩티드, 또는 이들의 조합의 자연형 또는 변형된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 상기 힌지/스페이서 영역은 IgG1, 또는 면역글로불린의 CH2CH3 영역 및 CD3의 일부, CD28 폴리펩티드의 일부(예컨대, 서열번호 90의 일부), CD8 폴리펩티드의 일부(예컨대, 서열번호 86의 일부, 또는 서열번호 87의 일부), 여기에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 임의의 변경 유래의 힌지 영역, 또는 합성 스페이서 서열일 수 있다.
CD28
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 CD28 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 CD28 폴리펩티드는 서열번호 90의 아미노산 114 내지 152의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 서열번호 90의 아미노산 114 내지 152를 갖는 CD28 폴리펩티드를 암호화하는 CD28 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 15에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP [서열번호 15]
CD84
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 CD84 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 CD84 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 187 내지 225의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 서열번호 1의 아미노산 187 내지 225를 갖는 CD84 폴리펩티드를 암호화하는 CD84 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 16에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
CAAGAGCTGACTTACACGTGTACAGCCCAGAACCCTGTCAGCAACAATTCTGACTCCATCTCTGCCCGGCAGCTCTGTGCAGACATCGCAATGGGCTTCCGTACTCACCACACCGGG [서열번호 16]
CD166
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 CD166 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 CD166 폴리펩티드는 서열번호3의 아미노산 489 내지 527을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 서열번호 3의 아미노산 489 내지 527을 갖는 CD166 폴리펩티드를 암호화하는 CD166 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 17에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
ACCAACTGGAGAGAACAGTAAACTCCTTGAATGTCTCTGCTATAAGTATTCCAGAACACGATGAGGCAGACGAGATAAGTGATGAAAACAGAGAAAAGGTGAATGACCAGGCAAAA [서열번호 17]
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 CD166 폴리펩티드는 서열번호3의 아미노산 484 내지 527을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 CD166 폴리펩티드는 서열번호3의 아미노산 506 내지 527을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 CD166 폴리펩티드는 서열번호3의 아미노산 517 내지 527을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 CD166 폴리펩티드는 서열번호 109 또는 서열번호 110에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
NQLERTVNSLNVPAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAK [서열번호 109]
AAANQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAK [서열번호 110]
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 및 막통과 도메인 내에 포함되는 CD166 폴리펩티드는 서열번호 111, 112, 113, 114, 115, 116 또는 117에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
PEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKK [서열번호 111]
ENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKK [서열번호 112]
NQLERTVNSLNVPAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKK [서열번호 113]
TCTAENQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWL [서열번호 114]
PEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWL [서열번호 115]
NQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWL [서열번호 116]
AAANQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKK [서열번호 117]
CD8a
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 CD8a 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 CD8a 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 137 내지 182를 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 서열번호 5의 아미노산 137 내지 182를 갖는 CD8a 폴리펩티드를 암호화하는 CD8a 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 18에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
cccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat [서열번호 18]
CD8b
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 CD8b 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 CD8b 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 132 내지 170을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 서열번호 7의 아미노산 132 내지 170을 갖는 CD8b 폴리펩티드를 암호화하는 CD8b 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 19에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
CTGAGTGTGGTTGATTTCCTTCCCACCACTGCCCAGCCCACCAAGAAGTCCACCCTCAAGAAGAGAGTGTGCCGGTTACCCAGGCCAGAGACCCAGAAGGGCCCACTTTGTAGCCCC [서열번호 19]
ICOS
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 ICOS 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 ICOS 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 102 내지 140을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 서열번호 9의 아미노산 102 내지 140을 갖는 ICOS 폴리펩티드를 암호화하는 ICOS 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 20에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
tctcatgccaactattacttctgcaacctatcaatttttgatcctcctccttttaaagtaactcttacaggaggatatttgcatatttatgaatcacaactttgttgccagctgaag [서열번호 20]
CTLA-4
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 CTLA-4 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 CTLA-4 폴리펩티드는 서열번호 11의 아미노산 123 내지 161을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 서열번호 11의 아미노산 123 내지 161을 갖는 CTLA-4 폴리펩티드를 암호화하는 CTLA-4 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 21에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
GACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGAC [서열번호 21]
ICAM-1
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역은 본 명세서에 개시된 것과 같은 ICAM-1 폴리펩티드의 자연형 또는 변형된 힌지 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 힌지/스페이서 영역 내에 포함되는 ICAM-1 폴리펩티드는 서열번호 13의 아미노산 442 내지 480을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 서열번호 13의 아미노산 442 내지 480을 갖는 ICAM-1 폴리펩티드를 암호화하는 ICAM-1 핵산 분자는 아래에 제공된 것과 같은 서열번호 22에 기재된 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 갖는다.
GGGGAATCAGTGACTGTCACTCGAGATCTTGAGGGCACCTACCTCTGTCGGGCCAGGAGCACTCAAGGGGAGGTCACCCGCAAGGTGACCGTGAATGTGCTCTCCCCCCGGTATGAG [서열번호 22]
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 힌지/스페이서 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 세포외 항원-결합 도메인 및 막통과 도메인 사이에 위치된다. 소정 구현예에서, 상기 힌지/스페이서 영역은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD4 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, (면역 반응과 연관된 단백질에 기반하지 않는) 합성 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD4 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, (면역 반응과 연관된 단백질에 기반하지 않는) 합성 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역은 동일한 분자로부터 유래된다. 소정 구현예에서, 상기 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역은 상이한 분자로부터 유래된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD28 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD28 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD84 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD84 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD166 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD166 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD8a 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD8a 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD8b 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 CD8b 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 힌지/스페이서 영역은 CD28 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CAR의 막통과 도메인은 ICOS 폴리펩티드를 포함한다.
2.2.4. CAR의 세포내 신호전달 도메인
소정 비제한적 구현예에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 세포(예컨대, 림프 계통의 세포, 예컨대 T 세포)를 활성화 또는 자극할 수 있는 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 야생형("자연형") CD3ζ는 3개의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프("ITAM")(예컨대, ITAM1, ITAM2 및 ITAM3), 3개의 염기성-풍부 스트레치(BRS) 영역(BRS1, BRS2 및 BRS3)을 포함하고, 항원이 결합된 후 활성화 신호를 세포(예컨대, 림프 계통의 세포, 예컨대 T 세포)에 전달한다. 본 명세서의 구현예에서 사용된 것과 같이, 상기 자연형 CD3ζ-사슬의 세포내 신호전달 도메인은 내재적 TCR 유래 신호의 1차적 전달자이고, 자연형의 CD3ζ이 아니라 변형된 CD3ζ이다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_932170(서열번호 94)을 갖는 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 비제한적 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 적어도 20개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 50개, 또는 적어도 100개, 또는 적어도 110개, 또는 적어도 113개, 및 163개까지의 아미노산 길이인 서열번호 94의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 94의 아미노산 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 50 내지 164, 55 내지 164, 또는 150 내지 164의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 94의 아미노산 52 내지 164의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다.
서열번호 94는 아래에 제공된다:
1 MKWKALFTAA ILQAQLPITE AQSFGLLDPK LCYLLDGILF IYGVILTALF LRVKFSRSAD
61 APAYQQGQNQ LYNELNLGRR EEYDVLDKRR GRDPEMGGKP QRRKNPQEGL YNELQKDKMA
121 EAYSEIGMKG ERRRGKGHDG LYQGLSTATK DTYDALHMQA LPPR [서열번호 94]
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 상기 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 95 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 서열번호 95는 아래에 제공된다:
RVKFSRSADA PAYQQGQNQL YNELNLGRRE EYDVLDKRRG RDPEMGGKPR RKNPQEGLYN
ELQKDKMAEA YSEIGMKGER RRGKGHDGLY QGLSTATKDT YDALHMQALP PR [서열번호 95].
서열번호 95의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공되는 서열번호 96에 기재된다.
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC [서열번호 96]
면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)
소정 비제한적 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 1개, 2개 또는 3개의 ITAMfmf 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 자연형의 ITAM1을 포함한다.
QNQLYNELNLGRREEYDVLDKR [서열번호 23]
서열번호 23의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 24에 기재된다.
cagaaccagctctataacgagctcaatctagga cgaagagaggagtacgatgttttggacaagaga [서열번호 24]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이를 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 기능 소실 돌연변이는 ITAM1 내의 티로신 잔기의 돌연변이를 포함한다. 소정 구현예에서, 2개의 기능-소실 돌연변이로 이루어지는 ITAM1 변이체는 아래에 제공된 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
QNQLFNELNLGRREEFDVLDKR [서열번호 25]
서열번호 25의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 26에 기재된다.
cagaaccagctctTtaacgagctcaatctagga cgaagagaggagtTcgatgttttggacaagaga [서열번호 26]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 아래에 제공된 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 자연형의 ITAM2를 포함한다.
QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK [서열번호 27]
서열번호 27의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 28에 기재된다.
caggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaa [서열번호 28]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM2 변이체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM2 변이체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 기능 소실 돌연변이는 ITAM2 내의 티로신 잔기의 돌연변이를 포함한다. 소정 구현예에서, 2개의 기능-소실 돌연변이로 이루어지는 ITAM2 변이체는 아래에 제공된 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
QEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMK [서열번호 29]
서열번호 29의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 30에 기재된다.
caggaaggcctgtTcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctTcagtgagattgggatgaaa [서열번호 30]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 아래에 제공된 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 자연형의 ITAM3을 포함한다.
HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ [서열번호 31]
서열번호 131의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 32에 기재된다.
cacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcag [서열번호 32]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM3 변이체를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM3 변이체를 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 기능 소실 돌연변이는 ITAM3 내의 티로신 잔기의 돌연변이를 포함한다. 소정 구현예에서, 2개의 기능-소실 돌연변이로 이루어지는 ITAM3 변이체는 아래에 제공된 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
HDGLFQGLSTATKDTFDALHMQ [서열번호 33]
서열번호 33의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 34에 기재된다.
cacgatggcctttTccaggggctcagtacagccaccaaggacacctTcgacgcccttcacatgcag [서열번호 34]
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이체, 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM2 변이체, 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM3 변이체, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이루어지는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 (예컨대, 2개의) 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM2 변이체 및 하나 이상의 (예컨대, 2개의) 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자연형의 ITAM1, 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM2 변이체 및 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 ITAM1, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 갖는 ITAM2 변이체 및 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, "1XX"로 표기된 구조체)를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 (예컨대, 2개의) 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이체 및 하나 이상의 (예컨대, 2개의) 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이체, 자연형의 ITAM2, 및 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 갖는 ITAM1 변이체, 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 ITAM2 및 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, "X2X"로 표기된 구조체)를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 (예컨대, 2개의) 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이체 및 하나 이상의 (예컨대, 2개의) 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM2 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이체, 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM2 변이체, 및 자연형의 ITAM3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 갖는 ITAM1 변이체, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 갖는 ITAM2 변이체 및 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 ITAM3를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, "XX3"으로 표기된 구조체)를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 (예컨대, 2개의) 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이체, 자연형의 ITAM2, 및 자연형의 ITAM3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 ITAM1 변이체, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 ITAM2 및 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 ITAM3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, "X23"으로 표기된 구조체)를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자연형의 ITAM1, 자연형의 ITAM2, 및 하나 이상의 (예컨대, 2개의) 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자연형의 ITAM1, 자연형의 ITAM2, 및 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM1 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 ITAM1, 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 ITAM2 및 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, "12X"로 표기된 구조체)를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자연형의 ITAM1, 하나 이상의 (예컨대, 2개의) 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM2 변이체, 및 자연형의 ITAM3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자연형의 ITAM1, 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 ITAM2 변이체, 및 자연형의 ITAM3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 ITAM1, 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 갖는 ITAM2 변이체 및 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, "1X3"으로 표기된 구조체)를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 1개 또는 2개 ITAM의 결실을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1 및 ITAM2의 결실을 포함하며, 예컨대, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형의 ITAM3 또는 ITAM3 변이체를 포함하고, ITAM1 또는 ITAM2를 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 ITAM3을 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM1, 또는 (자연형 또는 변형된) ITAM2를 포함하지 않는다(예컨대, D12).
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2 및 ITAM3의 결실을 포함하며, 예컨대, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형의 ITAM1 또는 ITAM1 변이체를 포함하고, 및 ITAM2 또는 ITAM3을 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 ITAM1을 포함하고, 및 (자연형 또는 변형된) ITAM2, 또는 (자연형 또는 변형된) ITAM3을 포함하지 않는다(예컨대, D23).
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1 및 ITAM3의 결실을 포함하며, 예컨대, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형의 ITAM2 또는 ITAM2 변이체를 포함하고, ITAM1 또는 ITAM3을 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 ITAM2를 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM1, 또는 (자연형 또는 변형된) ITAM3을 포함하지 않는다(예컨대, D13).
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1의 결실을 포함하며, 예컨대, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형의 ITAM2 또는 ITAM2 변이체, 및 자연형의 ITAM3 또는 ITAM3 변이체를 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM1을 포함하지 않는다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2의 결실을 포함하며, 예컨대, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형의 ITAM1 또는 ITAM1 변이체, 및 자연형의 ITAM3 또는 ITAM3 변이체를 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM2를 포함하지 않는다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM3의 결실을 포함하며, 예컨대, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형의 ITAM1 또는 ITAM1 변이체, 및 자연형의 ITAM2 또는 ITAM2 변이체를 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM3을 포함하지 않는다.
염기성-풍부 스트레치(BRS) 영역
소정 비제한적 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 1개, 2개 또는 3개의 BRS 영역(즉, BRS1, BRS2, 및 BRS3)을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 상기 BRS region은 자연형의 BRS 또는 변형된 BRS(예컨대, BRS 변이체)일 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 아래에 제공된 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 자연형의 BRS1 영역을 포함한다.
KRRGR [서열번호 35]
서열번호 35의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 36에 기재된다.
aagagacgtggccgg [서열번호 36]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 BRS1 변이체를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 37에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 자연형의 BRS2를 포함한다.
KPRRK [서열번호 37]
서열번호 37의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 38에 기재된다.
aagccgagaaggaag [서열번호 38]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 BRS2 변이체를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 39에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 자연형의 BRS3을 포함한다.
KGERRRGK [서열번호 39]
서열번호 39의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 40에 기재된다.
aaaggcgagcgccggaggggcaag [서열번호 40]
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 BRS3 변이체를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 3개의 모든 BRS 영역, 즉, BRS1 영역, BRS2 영역, 및 BRS3 영역을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자연형의 BRS1, 자연형의 BRS2, 및 자연형의 BRS3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 BRS1, 서열번호 37에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 BRS2, 및 서열번호 39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 BRS3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하며, 예컨대, 구조체 1XX 내에 포함되는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드이다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 1개 또는 2개를 포함하지만 3개의 모든 BRS 영역을 포함하지는 않는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 영역 및 BRS2 영역을 포함하고, BRS3 영역은 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 영역 및 BRS3 영역을 포함하고, BRS2 영역은 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS2 영역 및 BRS3 영역을 포함하고, BRS1 영역은 포함하지 않는다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 영역을 포함하고, BRS2 영역 또는 BRS3 영역은 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열을 갖는 자연형의 BRS1을 포함하고, BRS2 영역 또는 BRS3 영역은 포함하지 않으며, 예컨대, 구조체 D23 내에 포함되는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드이다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS2 영역을 포함하고, BRS1 영역 또는 BRS3 영역은 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 영역을 포함하고, BRS1 영역 또는 BRS2 영역은 포함하지 않는다.
소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS 영역(자연형 또는 변형된 BRS1, BRS2 또는 BRS3)을 포함하지 않고, 예컨대, 3개의 모든 BRS가 결실되며, 예컨대, 구조체 D12 내에 포함되는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드이다.
소정 비제한적 구현예에서, 상기 CAR은 세포외 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)의 전부 또는 일부가 없고, 여기서 상기 ITAM는 ITAM1, ITAM2, 및 ITAM3이다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 ITAM3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 ITAM3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 ITAM3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 염기성-풍부 스트레치(BRS) 영역의 전부 또는 일부가 없고, 여기서 상기 BRS 영역은 BRS1, BRS2, 및 BRS3이다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS2 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 BRS3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 BRS1 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 추가로 BRS3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부, BRS2 또는 그의 일부, 및 BRS3 또는 그의 일부가 없다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2, ITAM3, BRS2, 및 BRS3이 없다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 서열번호 45 또는 서열번호 47에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 세포외 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 염기성-풍부 스트레치(BRS) 영역의 전부 또는 일부가 없고, 여기서 상기 BRS 영역은 BRS1, BRS2, 및 BRS3이다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 세포외 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 변이체, BRS2 변이체, 및 BRS3 변이체로부터 선택되는 BRS 변이체를 포함하고, 여기서 상기 BRS 변이체는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함한다.
공-자극성 신호전달 영역
소정 비제한적 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 적어도 공-자극성 신호전달 영역을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 최적의 림프구 활성화를 제공할 수 있는 적어도 하나의 공-자극성 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, "공-자극성 분자"는 항원에 대한 림프구의 효과적인 반응을 위해 요구되는 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자를 나타낸다. 상기 적어도 하나의 공-자극성 신호전달 영역은 CD28 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, DAP-10 폴리펩티드, CD27 펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 공-자극성 분자는 그 수용체에 결합시에 공-자극성 반응, 즉 항원이 그 CAR 분자에 결합할 때 자극이 제공되게 하는 세포내 반응을 생성하는 세포 표면에 발현되는 단백질인 공-자극성 리간드에 결합할 수 있다. 공-자극성 리간드는 CD80, CD86, CD70, OX40L, 및 4-1BBL을 비제한적으로 포함한다. 한 예로서, 4-1BB 리간드(즉, 4-1BBL)는 4-1BB("CD137"로도 알려짐)에 결합하여 CAR 신호와 조합하여 CAR+ T 세포의 이펙터 세포 기능을 유도하는 세포내 신호를 제공할 수 있다. 4-1BB, ICOS 또는 DAP-10을 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR은 인용에 의해 그 전체가 본 명세서에 통합되는 미국 제7,446,190호에 개시되어 있다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다. 상기 CD28 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 P10747 또는 NP_006130(서열번호 90)을 갖는 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 가질 수 있고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 비제한적 소정 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 적어도 20개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 50개, 및 220개까지의 아미노산 길이인 서열번호 90의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 서열번호 90의 아미노산 1 내지 220, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 114 내지 220, 150 내지 200, 또는 200 내지 220의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 90의 아미노산 180 내지 220의 아미노산을 포함하거나 갖는 CD28 폴리펩티드를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_031668.3(서열번호 97)을 갖는 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 갖고, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 비제한적 소정 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 또는 적어도 약 30개, 또는 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 50개, 및 218개까지의 아미노산 길이인 서열번호 97의 연속적인 부분인 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비제한적인 다양한 구현예에서, 상기 CD28 폴리펩티드는 서열번호 97의 아미노산 1 내지 218, 1 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 150, 114 내지 220, 150 내지 200, 178 내지 218, 또는 200 내지 220의 아미노산 서열을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR의 공-자극성 신호전달 영역은 서열번호 97의 아미노산 178 내지 218을 포함하거나 갖는 CD28 폴리펩티드를 포함한다.
서열번호 97은 아래에 제공된다:
1 MTLRLLFLAL NFFSVQVTEN KILVKQSPLL VVDSNEVSLS CRYSYNLLAK EFRASLYKGV
61 NSDVEVCVGN GNFTYQPQFR SNAEFNCDGD FDNETVTFRL WNLHVNHTDI YFCKIEFMYP
121 PPYLDNERSN GTIIHIKEKH LCHTQSSPKL FWALVVVAGV LFCYGLLVTV ALCVIWTNSR
181 RNRLLQSDYM NMTPRRPGLT RKPYQPYAPA RDFAAYRP [서열번호 97]
본 개시된 주제에 따르면, "CD28 핵산 분자"는 CD28 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR(예컨대, 서열번호 97의 아미노산 178 내지 218) 의 공-자극성 신호전달 영역 내에 포함되는 CD28 폴리펩티드를 암호화하는 CD28 핵산 분자는 아래에 제공된 서열번호 98에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 갖는다.
aat agtagaagga acagactcct tcaaagtgac tacatgaaca tgactccccg gaggcctggg ctcactcgaa agccttacca gccctacgcc cctgccagag actttgcagc gtaccgcccc [서열번호 98]
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD28의 쥐과 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. CD28의 쥐과 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 99 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 가질 수 있으며, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 서열번호 99는 아래에 제공된다:
NSRRNRLLQS DYMNMTPRRP GLTRKPYQPY APARDFAAYR P [서열번호 99].
서열번호 99의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 100에 기재된다.
AATAGTAGAAGGAACAGACTCCTTCAAAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGGAGGCCTGGGCTCACTCGAAAGCCTTACCAGCCCTACGCCCCTGCCAGAGACTTTGCAGCGTACCGCCCC [서열번호 100]
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD28의 인간 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 상기 CD28의 인간 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 101 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 가질 수 있으며, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 서열번호 101은 아래에 제공된다:
RSKRSRLLHS DYMNMTPRRP GPTRKHYQPY APPRDFAAYR S [서열번호 101].
서열번호 70의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 102에 기재된다.
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC [서열번호 102]
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD28의 탈-면역화된 인간 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. CD28의 탈-면역화된 인간 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 108 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 가질 수 있으며, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 서열번호 108은 아래에 제공된다:
RSKRSRLLHS DYMNMTPRRP GPTRKHYQPY APPRDFAAYR K [서열번호 108]
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공-자극성 분자, 예컨대, CD28 및 4-1BB의 공-자극성 신호전달 영역 또는 CD28 및 OX40의 공-자극성 신호전달 영역을 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 도메인은 2개의 공-자극성 분자: CD28 및 4-1BB 또는 CD28 및 OX40를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다.
4-1BB은 종양 괴사 인자(TNF) 리간드로 작용할 수 있고, 자극성 활성을 가질 수 있다. 상기 4-1BB 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 P41273 또는 NP_001552(서열번호 103) 또는 그의 단편을 갖는 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 가질 수 있으며, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
서열번호 103은 아래에 제공된다:
1 MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP NSFSSAGGQR
61 TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC
121 CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE
181 PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG
241 CSCRFPEEEE GGCEL [서열번호 103]
본 개시된 주제에 따르면, "4-1BB 핵산 분자"는 4-1BB 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 상기 4-1BB의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 104 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 가질 수 있으며, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 서열번호 104는 아래에 제공된다:
KRGRKKLLYI FKQPFMRPVQ TTQEEDGCSC RFPEEEEGGC EL [서열번호 104].
서열번호 104의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 105에 기재된다.
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG [서열번호 105]
OX40 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 P43489 또는 NP_003318(서열번호 106)을 갖는 서열, 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 가질 수 있으며, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
서열번호 106은 아래에 제공된다:
1 MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ
61 NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK
121 PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ
181 GPPARPITVQ PTEAWPRTSQ GPSTRPVEVP GGRAVAAILG LGLVLGLLGP LAILLALYLL
241 RRDQRLPPDA HKPPGGGSFR TPIQEEQADA HSTLAKI [서열번호 106]
본 개시된 주제에 따르면, "OX40 핵산 분자"는 OX40 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
ICOS 폴리펩티드는 NCBI 참조 번호 NP_036224(서열번호 65)를 갖는 서열 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함하거나 가질 수 있으며, 및/또는 선택적으로 1개까지, 또는 2개까지, 또는 3개까지의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
서열번호 65는 아래에 제공된다:
1 MKSGLWYFFL FCLRIKVLTG EINGSANYEM FIFHNGGVQI LCKYPDIVQQ FKMQLLKGGQ
61 ILCDLTKTKG SGNTVSIKSL KFCHSQLSNN SVSFFLYNLD HSHANYYFCN LSIFDPPPFK
121 VTLTGGYLHI YESQLCCQLK FWLPIGCAAF VVVCILGCIL ICWLTKKKYS SSVHDPNGEY
181 MFMRAVNTAK KSRLTDVTL [서열번호 65]
본 개시된 주제에 따르면, "ICOS 핵산 분자"는 ICOS 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 인간 세포 내에서 핵산 서열을 발현하기 위한 유도가능한 프로모터를 추가로 포함한다. CAR 유전자의 발현에 사용하기 위한 프로모터는 구성적 프로모터, 예컨대 유비퀴틴 C(UbiC) 프로모터일 수 있다.
소정 구현예에서, 상이한 단백질로부터 유래되는 CAR의 도메인/모티프/영역들 사이의 돌연변이 부위 및/또는 접합부는 탈-면역화된다. 상이한 CAR 모이어티 사이의 접합부의 면역원성은 NetMHC 4.0 Server를 이용해 예측될 수 있다. 그 다음 모이어티로부터의 적어도 하나의 아미노산을 함유하는 각각의 펩티드의 경우, 모든 대립유전자(allele)에 대하여, HLA A, B 및 C에 대한 결합 친화도가 예측될 수 있다. 면역원성 점수는 면역원성 점수 = [(50 - 결합 친화도) × HLA 빈도]n의 식을 이용해 계산될 수 있다. n은 각각의 펩티드에 대한 예측의 수이다.
1928z WT 구조체
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 CD19 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD19 폴리펩티드)에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, CD28 폴리펩티드로부터 유래되는 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역, 자연형의 ITAM1, 자연형의 ITAM2, 자연형의 ITAM3, 자연형의 BRS1, 자연형의 BRS2, 및 자연형의 BRS3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 "1928z WT"로 표기된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR(예컨대, 1928z WT)은 아래에 제공된 서열번호 41에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 41은 아미노산 1 내지 18에서 CD8 리더 서열을 포함하고, CD19(예컨대, 인간 CD19)에 결합할 수 있다.
MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR [서열번호 41]
서열번호 41의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 42에 기재된다.
atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa [서열번호 42]
1XX 구조체
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 CD19 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD19 폴리펩티드)에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, CD28 폴리펩티드로부터 유래되는 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역, 자연형의 ITAM1, 자연형의 BRS1, 자연형의 BRS2, 자연형의 BRS3, 2개의 기능-소실 돌연변이를 갖는 ITAM2 변이체, 및 2개의 기능-소실 돌연변이를 갖는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 "1XX"로 표기된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR(예컨대, 1XX)은 아래에 제공된 서열번호 43에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 43은 아미노산 1 내지 18에서 CD8 리더 서열을 포함하고, CD19(예컨대, 인간 CD19)에 결합할 수 있다.
MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR [서열번호 43]
서열번호 43의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 44에 기재된다.
atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtTcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctTcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttTccaggggctcagtacagccaccaaggacacctTcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa [서열번호 44]
D12 구조체
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 CD19 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD19 폴리펩티드)에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, CD28 폴리펩티드로부터 유래되는 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역, 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함하며, 여기서 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형의 ITAM3을 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM1, (자연형 또는 변형된) ITAM2, (자연형 또는 변형된) BRS1, (자연형 또는 변형된) BRS2, 또는 (자연형 또는 변형된) BRS3은 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 "D12"로 표기된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR(예컨대, D12)은 아래에 제공된 서열번호 45에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 45는 아미노산 1 내지 18에서 CD8 리더 서열을 포함하고, CD19(예컨대, 인간 CD19)에 결합할 수 있다.
MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR [서열번호 45]
서열번호 45의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 46에 기재된다.
atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccacgatggcctttaccaggggctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa [서열번호 46]
D23 구조체
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 CD19 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD19 폴리펩티드)에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, CD28 폴리펩티드로부터 유래되는 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역, ITAM1, BRS1 및 ITAM2, ITAM3, BRS2 및 BRS3의 결실을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함하며, 여기서 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형의 ITAM1 및 자연형의 BRS1을 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM2, (자연형 또는 변형된) ITAM3, (자연형 또는 변형된) BRS2, 또는 (자연형 또는 변형된) BRS3은 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 "D23"으로 표기된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR(예컨대, D23)은 아래에 제공된 서열번호 47에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 47은 아미노산 1 내지 18에서 CD8 리더 서열을 포함하고, CD19(예컨대, 인간 CD19)에 결합할 수 있다.
MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP [서열번호 47]
서열번호 47의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 48에 기재된다.
atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggacccttaa [서열번호 48]
XX3 구조체
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 CD19 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD19 폴리펩티드)에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, CD28 폴리펩티드로부터 유래되는 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역, 자연형의 ITAM3, 자연형의 BRS1, 자연형의 BRS2, 자연형의 BRS3, 2개의 기능-소실 돌연변이를 갖는 ITAM1 변이체, 및 2개의 기능-소실 돌연변이를 갖는 ITAM2 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 "XX3"으로 표기된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR(예컨대, XX3)은 아래에 제공된 서열번호 49에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 49는 아미노산 1 내지 18에서 CD8 리더 서열을 포함하고, CD19(예컨대, 인간 CD19)에 결합할 수 있다.
MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLFNELNLGRREEFDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR [서열번호 49]
서열번호 49의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 50에 기재된다.
atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctTtaacgagctcaatctaggacgaagagaggagtTcgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtTcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctTcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa [서열번호 50]
X23 구조체
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 CD19 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD19 폴리펩티드)에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, CD28 폴리펩티드로부터 유래되는 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역, 자연형의 ITAM2, 자연형의 ITAM3, 자연형의 BRS1, 자연형의 BRS2, 자연형의 BRS3, 및 2개의 기능-소실 돌연변이를 갖는 ITAM1 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 "X23"으로 표기된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR(예컨대, X23)은 아래에 제공된 서열번호 51에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 51은 아미노산 1 내지 18에서 CD8 리더 서열을 포함하고, CD19(예컨대, 인간 CD19)에 결합할 수 있다.
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서열번호 51의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 52에 기재된다.
atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctTtaacgagctcaatctaggacgaagagaggagtTcgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa [서열번호 52]
X2X 구조체
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 CD19 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD19 폴리펩티드)에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, CD28 폴리펩티드로부터 유래되는 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역, 자연형의 ITAM2, 자연형의 BRS1, 자연형의 BRS2, 자연형의 BRS3, 2개의 기능-소실 돌연변이를 갖는 ITAM1 변이체, 및 2개의 기능-소실 돌연변이를 갖는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 "X2X"로 표기된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR(예컨대, X2X)은 아래에 제공된 서열번호 53에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 53은 아미노산 1 내지 18에서 CD8 리더 서열을 포함하고, CD19(예컨대, 인간 CD19)에 결합할 수 있다.
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서열번호 53의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 54에 기재된다.
atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctTtaacgagctcaatctaggacgaagagaggagtTcgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttTccaggggctcagtacagccaccaaggacacctTcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa [서열번호 54]
12X 구조체
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 CD19 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD19 폴리펩티드)에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, CD28 폴리펩티드로부터 유래되는 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역, 자연형의 ITAM1, 자연형의 ITAM2, 자연형의 BRS1, 자연형의 BRS2, 자연형의 BRS3, 및 2개의 기능-소실 돌연변이를 갖는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 "12X"로 표기된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR(예컨대, 12X)은 아래에 제공된 서열번호 55에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 55는 아미노산 1 내지 18에서 CD8 리더 서열을 포함하고, CD19(예컨대, 인간 CD19)에 결합할 수 있다.
MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR [서열번호 55]
서열번호 55의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 56에 기재된다.
atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttTccaggggctcagtacagccaccaaggacacctTcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa [서열번호 56]
D3 구조체
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 CD19 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD19 폴리펩티드)에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, CD28 폴리펩티드로부터 유래되는 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역, ITAM1, ITAM2, BRS1, BRS2, 및 ITAM3 및 BRS3의 일부의 결실을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함하며, 여기서 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형의 ITAM1, 자연형의 ITAM2, 자연형의 BRS1 및 자연형의 BRS2을 포함하고, 및 (자연형 또는 변형된) ITAM3 또는 자연형의 BRS3는 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 "D3"으로 표기된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR(예컨대, D3)은 아래에 제공된 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 57은 아미노산 1 내지 18에서 CD8 리더 서열을 포함하고, CD19(예컨대, 인간 CD19)에 결합할 수 있다.
MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR [서열번호 57]
서열번호 57의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열운 아래에 제공된 서열번호 58에 기재된다.
atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggtaa [서열번호 58]
19-166-28z 구조체
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 CD19 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD19 폴리펩티드)에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, CD166 폴리펩티드로부터 유래되는 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역, 자연형의 ITAM1, 자연형의 ITAM2, 자연형의 ITAM3, 자연형의 BRS1, 자연형의 BRS2, 및 자연형의 BRS3을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 "19-166-28z"로 표기된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR(예컨대, 19-166-28z)은 아래에 제공된 서열번호 59에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 59는 아미노산 1 내지 18에서 CD8 리더 서열을 포함하고, CD19(예컨대, 인간 CD19)에 결합할 수 있다.
MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRNQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKKRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRKRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR [서열번호 59]
서열번호 59의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 60에 기재된다.
atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacggAACCAACTGGAGAGAACAGTAAACTCCTTGAATGTCTCTGCTATAAGTATTCCAGAACACGATGAGGCAGACGAGATAAGTGATGAAAACAGAGAAAAGGTGAATGACCAGGCAAAACTAATTGTGGGAATCGTTGTTGGTCTCCTCCTTGCTGCCCTTGTTGCTGGTGTCGTCTACTGGCTGTACATGAAGAAGaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgcaaaagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa [서열번호 60]
19-166-28z 1XX 구조체
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 CD19 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD19 폴리펩티드)에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, CD166 폴리펩티드로부터 유래되는 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역, 자연형의 ITAM1, 자연형의 BRS1, 자연형의 BRS2, 자연형의 BRS3, 2개의 기능-소실 돌연변이를 갖는 ITAM2 변이체, 및 2개의 기능-소실 돌연변이를 갖는 ITAM3 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 "19-166-28z 1XX"로 표기된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR(예컨대, 19-166-28z 1XX)은 아래에 제공된 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 61은 아미노산 1 내지 18에서 CD8 리더 서열을 포함하고, CD19(예컨대, 인간 CD19)에 결합할 수 있다.
MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRNQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKKRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRKRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR [서열번호 61]
서열번호 61의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 62에 기개된다.
atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacggAACCAACTGGAGAGAACAGTAAACTCCTTGAATGTCTCTGCTATAAGTATTCCAGAACACGATGAGGCAGACGAGATAAGTGATGAAAACAGAGAAAAGGTGAATGACCAGGCAAAACTAATTGTGGGAATCGTTGTTGGTCTCCTCCTTGCTGCCCTTGTTGCTGGTGTCGTCTACTGGCTGTACATGAAGAAGaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgcaaaagagtgaagttcagcaggagcgcagaCGcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtTcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctTcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttTccagggtctcagtacagccaccaaggacacctTcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa [서열번호 62]
19-166-28z D23 구조체
소정 구현예에서, 본 개시된 CAR은 CD19 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD19 폴리펩티드)에 결합하는 세포외 항원-결합 도메인, CD166 폴리펩티드로부터 유래되는 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역, ITAM1, BRS1 및 ITAM2, ITAM3, BRS2 및 BRS3의 결실을 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 변형된 인간 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28 폴리펩티드(예컨대, 인간 CD28 폴리펩티드)를 포함하는 공-자극성 신호전달 영역을 포함하며, 여기서 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 자연형의 ITAM1 및 자연형의 BRS1을 포함하고, (자연형 또는 변형된) ITAM2, (자연형 또는 변형된) ITAM3, (자연형 또는 변형된) BRS2, 또는 (자연형 또는 변형된) BRS3은 포함하지 않는다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 "19-166-28z D23"으로 표기된다. 소정 구현예에서, 상기 CAR(예컨대, 19-166-28z D23)은 아래에 제공된 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 상동성 또는 동일성인 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 63은 아미노산 1 내지 18에서 CD8 리더 서열을 포함하고, CD19(예컨대, 인간 CD19)에 결합할 수 있다.
MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRNQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKKRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRKRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP [서열번호 63]
서열번호 63의 아미노산 서열을 암호화하는 예시적 핵산 서열은 아래에 제공된 서열번호 64에 기재된다.
atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacggAACCAACTGGAGAGAACAGTAAACTCCTTGAATGTCTCTGCTATAAGTATTCCAGAACACGATGAGGCAGACGAGATAAGTGATGAAAACAGAGAAAAGGTGAATGACCAGGCAAAACTAATTGTGGGAATCGTTGTTGGTCTCCTCCTTGCTGCCCTTGTTGCTGGTGTCGTCTACTGGCTGTACATGAAGAAGaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgcaaaagagtgaagttcagcaggagcgcagaCGcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggacccttaa [서열번호 64]
3. 면역반응성 세포
본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 CAR을 포함하는 면역반응성 세포를 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 상기 면역반응성 세포를 활성화시킬 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 CAR은 내재적 좌위(예컨대, TRAC)로부터 발현된다.
소정 구현예에서, 하나 이상의 본 개시된 CAR을 포함하는 면역반응성 세포는 대조군 세포와 비교하여 개선된 치료 효능을 나타낸다. 소정 구현예에서, 하나 이상의 본 개시된 CAR을 포함하는 면역반응성 세포는 대조군 세포와 비교하여 유사한 세포용해 효과를 나타낸다. 소정 구현예에서, 하나 이상의 본 개시된 CAR을 포함하는 면역반응성 세포는 대상체에 투여될 때 대조군 세포와 비교하여 증가된 세포 축적을 나타낸다. 소정 구현예에서, 하나 이상의 본 개시된 CAR을 포함하는 면역반응성 세포는 대상체에 투여될 때 대조군 세포와 비교하여 감소된 세포 고갈을 나타낸다. 면역반응성 세포 고갈 마커는TIM3, LAG3, 및 PD1을 비제한적으로 포함한다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR을 포함하는 면역반응성 세포는 대상체에 투여될 때 대조군 세포와 비교하여 메모리 면역 세포의 더 높은 컨틴전트(contingent)를 유지한다. 메모리 면역 세포 마커는 CD62L 및 CD45RA를 비제한적으로 포함한다. 소정 구현예에서, 하나 이상의 본 개시된 CAR을 포함하는 면역반응성 세포는 대조군 세포와 비교하여 유사한 레벨의 사이토카인을 분비한다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포에 의해 분비되는 사이토카인은 TNFα, IFNγ 및 IL2를 비제한적으로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 대조군 세포는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 포함하며, 여기서 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 모든 자연형의 ITAM1-3 및 모든 자연형의 BRS1-3을 포함한다.
3.1 2 이상의 CAR을 포함하는 면역반응성 세포
소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 2 이상의 CAR을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 2 이상의 CAR 중 적어도 하나는 본 명세서에 개시된 CAR이다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 2개의 CAR을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 3개의 CAR을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 a) 제1 항원에 결합하는 제1 세포외 항원-결합 도메인, 제1 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 본 명세서에 개시된 하나의 변형된 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함하는 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR; 및 b) 제2 항원에 결합하는 제2 세포외 항원-결합 도메인, 제2 막통과 도메인, 및 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR;을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 제1 CAR은 제1 힌지/스페이서 영역을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 제2 CAR은 제2 힌지/스페이서 영역을 추가로 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 변형된 CD3ζ 폴리펩티드(예컨대, 본 명세서에 개시된 하나의 변형된 CD3ζ 폴리펩티드)를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 자연형의 CD3ζ 폴리펩티드를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인 내에 포함되는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 상기 제1 세포내 신호전달 도메인 내에 포함되는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드와 동일하다. 소정 구현예에서, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인 내에 포함되는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 상기 제1 세포내 신호전달 도메인 내에 포함되는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드와 상이하다. 소정 구현예에서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 1개의 자연형의 ITAM을 포함하는 CD3ζ 폴리펩티드, 2개의 자연형의 ITAM을 포함하는 CD3ζ 폴리펩티드, 3개의 자연형의 ITAM을 포함하는 CD3ζ 폴리펩티드, 본 명세서에 개시된 1개의 ITAM 변이체를 포함하는 CD3ζ 폴리펩티드, 본 명세서에 개시된 2개의 ITAM 변이체를 포함하는 CD3ζ 폴리펩티드, 1개의 자연형의 BRS 영역을 포함하는 CD3ζ 폴리펩티드, 2개의 자연형의 BRS 영역을 포함하는 CD3ζ 폴리펩티드, 3개의 자연형의 BRS 영역을 포함하는 CD3ζ 폴리펩티드, ITAM1, ITAM2, ITAM3 및/또는 그의 임의의 일부분의 전부 또는 일부가 없는 CD3ζ 폴리펩티드, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포 내에 포함되는 2 이상의 CAR은 상이하다(예컨대, 상기 제1 CAR은 상기 제2 CAR과 상이함). 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포 내에 포함되는 2 이상의 CAR은 동일하다(예컨대, 상기 제1 CAR은 제2 CAR과 동일함).
소정 구현예에서, 상기 2 이상의 CAR은 상이한 항원에 결합한다(예컨대, 상기 제1 항원은 상기 제2 항원과 상이함).
소정 구현예에서, 상기 2 이상의 CAR은 상이한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다(예컨대, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 상기 제2 세포내 신호전달 도메인과 상이함). 소정 구현예에서, 상기 2 이상의 CAR은 동일한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다(예컨대, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 상기 제2 세포내 신호전달 도메인과 동일함).
소정 구현예에서, 상기 2 이상의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 상이한 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 공-자극성 신호전달 영역은 CD28 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, DAP-10 폴리펩티드, CD27 펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 2 이상의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 동일한 공-자극성 신호전달 영역을 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 2개, 3개 또는 그 이상의 본 개시된 CAR을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 각각의 세포내 신호전달 도메인은 독립적으로 1928ζ, 19ζ, 1XX, X2X, XX3, X23, 12X, D3, D12 및 D23의 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
세포 내에 포함되는 CAR의 선택은 CAR에 의해 표적화되는 항원의 밀도, 모든 ITAM의 합, 각각의 ITAM 사이의 거리, CAR의 막통과 도메인, 및/또는 CAR의 공-자극성 신호전달 도메인에 의존할 수 있는데, 그 이유는 이들은 각각의 CAR에 의해 생산되는 활성화 신호의 강도를 결정할 수 있기 때문이다.
소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 2개의 CAR을 포함하며, 여기서 상기 제1 CAR은 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 제2 CAR은 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, 각각의 상기 제1 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 1928ζ, 19ζ, 1XX, X2X, XX3, 12X, X23, D3, D12 및 D23의 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 상기 제2 세포내 신호전달 도메인과 동일하다. 소정 구현예에서, 각각의 상기 제1 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인 및 D23의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인 및 XX3의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 D23의 세포내 신호전달 도메인 및 XX3의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인 및 X2X의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인 및 D12의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인 및 12X의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인 및 D3의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 X2X의 세포내 신호전달 도메인 및 X2X의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 1928z의 세포내 신호전달 도메인 및 1XX의 세포내 신호전달 도메인이다.
소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는다.
소정 구현예에서, 상기 2개의 CAR 내에 포함되는 자연형의 ITAM의 합은 약 5 이하, 약 4 이하, 약 3 이하, 또는 약 2 이하이다.
소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 3개의 CAR을 포함하며, 여기서 상기 제1 CAR은 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 제2 CAR은 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 및 상기 제3 CAR은 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 각각의 제1, 제2 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 독립적으로 1928ζ, 19ζ, 1XX, X2X, XX3, X23, 12X, D3 D12 및 D23의 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인, D23의 세포내 신호전달 도메인, 및 XX3의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 D23의 세포내 신호전달 도메인, D23의 세포내 신호전달 도메인, 및 XX3의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 D23의세포내 신호전달 도메인, XX3의 세포내 신호전달 도메인, 및 XX3의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 XX3의 세포내 신호전달 도메인, XX3의 세포내 신호전달 도메인, 및 XX3의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인, 1XX의 세포내 신호전달 도메인, 및 1XX의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인, X2X의 세포내 신호전달 도메인, 및 X2X의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인, 1XX의 세포내 신호전달 도메인, 및 X2X의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인, 1XX의 세포내 신호전달 도메인, 및 D12의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인, 1XX의 세포내 신호전달 도메인, 및 D23의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인, 1XX의 세포내 신호전달 도메인, 및 12X의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 1XX의 세포내 신호전달 도메인, 1XX의 세포내 신호전달 도메인, 및 D3의 세포내 신호전달 도메인이다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 X2X의 세포내 신호전달 도메인, X2X의 세포내 신호전달 도메인, 및 X2X의 세포내 신호전달 도메인이다.
소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖고, 상기 제3 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖고, 상기 제3 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제3 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제3 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는다.
소정 구현예에서, 상기 3개의 CAR 내에 포함되는 자연형의 ITAM의 합은 약 5 이하, 약 4 이하, 약 3 이하이다.
소정 구현예에서, 상기 CAR의 표적은 서로 상이하다.
3.1 면역반응성 세포의 타입
본 개시된 주제의 면역반응성 세포는 림프 계통의 세포일 수 있다. B, T 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하는 상기 림프 계통은 항체의 생산, 세포 면역 시스템의 조절, 혈액 내 외래 제제의 검출, 숙주에 외래성인 세포의 검출 등을 위해 제공된다. 상기 림프 계통의 면역반응성 세포의 비제한적 예는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 배아 줄기 세포, 및 다능성 줄기 세포(예컨대, 림프성 세포로 분화될 수 있는 세포)를 포함한다. T 세포는 흉선에서 성숙되고 세포-매개성 면역력을 주로 담당하는 림프구일 수 있다. T 세포는 적응성(adaptive) 면역 시스템에 관여된다. 본 개시된 주제의 T 세포는 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 메모리 T 세포(중심 메모리 T 세포, 줄기-세포-유사 메모리 T 세포(또는 줄기-유사 메모리 T 세포), 및 2가지 타입의 이펙터 메모리 T 세포: 예컨대, TEM 세포 및 TEMRA 세포를 포함함), 조절성 T 세포(저해성 T 세포로도 알려짐), 자연 살해 T 세포, 점막 연관성 불변(invariant) T 세포, 및 γδ T 세포를 비제한적으로 포함하는 임의의 타입의 T 세포일 수 있다. 세포독성 T 세포(CTL 또는 킬러 T 세포)는 감염된 체세포 또는 종양 세포의 죽음을 유도할 수 있는 T 림프구의 서브세트(subset)이다. 환자 자신의 T 세포는 유전적으로 변형되어 CAR의 도입을 통해 특정 항원을 표적화할 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 면역반응성 세포는 T 세포이다. 상기 T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포일 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포이다. 소정 구현예에서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포이다.
자연 살해(NK)세포는 세포-매개성 면역력의 일부이고 선천성 면역 반응 동안에 작용하는 림프구일 수 있다. NK 세포는 표적 세포에 대한 세포독성 효과를 수행하기 위해 사전 활성화를 필요로 하지 않는다.
본 개시된 주제의 인간 림프구의 타입은 말초 공여자 림프구, 예컨대 [Sadelain, M., et al. 2003 Nat Rev Cancer 3:35-45](CAR을 발현하기 위해 유전적으로 변형된 말초 공여자 림프구를 개시함), [Morgan, R.A., et al. 2006 Science 314:126-129](α 및 β 헤테로다이머를 포함하는 전장 종양 항원-인식 T 세포 수용체 복합체를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 말초 공여자 림프구를 개시함), [Panelli, M.C., et al. 2000 J Immunol 164:495-504]; [Panelli, M.C., et al. 2000 J Immunol 164:4382-4392](종양 생검에서 종양 침입 림프구(TIL)로부터 유래되는 림프구 배양물을 개시함), 및 [Dupont, J., et al. 2005 Cancer Res 65:5417-5427]; [Papanicolaou, G.A., et al. 2003 Blood 102:2498-2505](인공 항원-제공 세포(AAPC) 또는 펄스화 수지상 세포를 도입하는 시험관내-확장 항원-특이적 말초 혈액 백혈구를 선택적으로 개시함)에 개시된 것들을 제한없이 포함한다. 상기 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)는 자가성, 비-자가성(예컨대, 동종이계)이거나, 조작된 전구체 또는 줄기 세포로부터 시험관내에서 유래될 수 있다.
본 개시된 면역반응성 세포는 종양 미세환경을 조정할 수 있다. 종양은 면역 인식 및 제거로부터 그 자신을 보호하기 위한 악성 세포에 의한 일련의 메커니즘을 수반하는 숙주 면역 반응에 적대적인 미세환경을 갖는다. 상기 "적대적인 종양 미세환경"은 침입하는 조절성 CD4+ T 세포(Treg), 골수 유래 저해(MDSC), 종양 연관성 대식세포(TAM), TGF-β를 포함하는 면역 저해성 사이토카인, 및 활성화 T 세포(CTLA-4 및 PD-1)에 의해 발현되는 면역 저해성 수용체를 표적으로 하는 리간드의 발현을 포함하는 다양한 면역 저해성 인자를 포함한다. 상기 면역 저해의 메커니즘은 내성의 유지 및 부적절한 면역 반응의 저해에 있어서 역할을 하지만, 상기 종양 미세환경 내에서 상기 메커니즘은 효과적인 항-종양 면역 반응을 방지한다. 집합적으로 상기 면역 저해성 인자는 표적화 종양 세포와 대항할 때에 입양적으로(adoptively) 전달된 CAR 변형된 T 세포의 현저한 아네르기(anergy) 또는 아폽토시스를 유도할 수 있다.
CTL의 비정제된 공급원은 본 기술분야에 알려진 임의의 것들, 예컨대 골수, 태아, 신생아 또는 성인 또는 다른 조혈성 세포 공급원, 예컨대 태아 간, 말초 혈액 또는 제대혈일 수 있다. 다양한 기술이 세포를 분리하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들면, 음성 선택 방법은 처음에 비-CTL을 제거할 수 있다. mAB는 양성 및 음성 선택 모두의 경우에 특정 세포 계통 및/또는 분화 상태와 연관된 마커를 확인하기 위해 특히 유용하다.
많은 비율의 최종적으로 분화된 세포는 처음에 상대적으로 대충 분리함으로써 제거될 수 있다. 예를 들면, 자성 비드 분리가 처음에 많은 수의 무관한 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 소정 구현예에서, 적어도 약 80%, 대개는 적어도 70%의 총 조혈성 세포가 세포 단리 이전에 제거될 것이다.
분리를 위한 절차는 밀도 구배 원심분리; 리셋팅; 세포 밀도를 변형하는 입자와의 커플링; 항체-코팅된 자성 입자를 이용한 자성 분리; 친화성 크로마토그래피; 보체 및 사이토톡신을 비제한적으로 포함하는 mAb와 결합되거나 접목되어 사용되는 세포독성 제제; 및 플레이트, 칩과 같은 고형 매트릭스에 부착된 항체와의 패닝(panning), 일루트리에이션(elutriation) 또는 임의의 다른 편리한 기술을 비제한적으로 포함한다.
분리 및 분석을 위한 기술은 복수의 컬러 채널, 낮은 각 및 둔한 광 산란 검출 채널, 임피던스(impedance) 채널과 같은 다양한 정도의 소피스티케이션(sophistication)을 갖는 유세포 분석을 비제한적으로 포함한다.
상기 세포는 프로피디움 아이오다이드(PI)와 같은 죽은 세포와 연관된 염료를 도입함으로써 죽은 세포에 대해 선택될 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 세포는 2% 송아지 태아 혈청(FCS) 또는 0.2% 소 혈청 알부민(BSA) 또는 임의의 다른 적합한, 예컨대 멸균의 등장 배지를 포함하는 배지 내에 수집된다.
4. 벡터
면역반응성 세포(예컨대, T 세포 또는 NK 세포)의 유전적 변형은 실질적으로 균일한 세포 조성물을 재조합 DNA 구조체로 형질도입함으로써 달성될 수 있다. 소정 구현예에서, 레트로바이러스 벡터(감마-레트로바이러스 또는 렌티바이러스)가 상기 DNA 구조체를 세포 내로 도입하기 위해 도입된다. 예를 들면, 상기 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 레트로바이러스 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 발현은 그 내재적 프로모터, 상기 레트로바이러스 긴 말단 반복물, 또는 관심있는 표적 세포 타입에 대해 특이적인 프로모터로부터 구동될 수 있다. 비-바이러스 벡터도 역시 사용될 수 있다.
CAR을 포함하기 위한 면역반응성 세포의 처음의 유전적 변형을 위하여, 레트로바이러스 벡터가 형질도입을 위해 일반적으로 도입되지만, 임의의 다른 적합한 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 운반 시스템이 사용될 수 있다. 상기 CAR은 단일, 다중시스트론성 발현 카세트, 단일 벡터의 다중 발현 카세트, 또는 다중 벡터 내에서 보조적 분자(예컨대, 사이토카인)를 이용해 구축될 수 있다. 폴리시스트론성 발현 카세트를 생성하는 요소들의 예는 다양한 바이러스 및 비-바이러스 내부 리보솜 진입 부위(IRES, 예컨대, FGF-1 IRES, FGF-2 IRES, VEGF IRES, IGF-II IRES, NF-κB IRES, RUNX1 IRES, p53 IRES, A형 간염 IRES, C형 간염 IRES, 페스티바이러스 IRES, 아프토바이러스 IRES, 피코르나바이러스 IRES, 폴리오바이러스 IRES 및 뇌심근염 바이러스 IRES) 및 절단가능한 링커(예컨대, 2A 펩티드, 예컨대, P2A, T2A, E2A 및 F2A 펩티드)를 비제한적으로 포함한다. 소정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 임의의 벡터 또는 CAR은 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 107)의 아미노산 서열을 포함하는 P2A 펩티드를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 벡터 및 적절한 패키징 라인의 조합이 또한 적합하며, 이때 캡시드 단백질은 인간 세포의 감염을 위해 기능을 할 것이다. PA12(Miller, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317(Miller, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902); 및 CRIP(Danos, et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464)를 비제한적으로 포함하는 다양한 암포트로픽(amphotropic) 바이러스-생성 세포주가 알려져 있다. 비-암포트로픽 입자, 예컨대, VSVG, RD114 또는 GALV 외피로 위형화된(pseudotyped) 입자 및 본 기술분야에 알려진 임의의 다른 입자도 역시 적합하다.
형질도입의 가능한 방법은 또한, 예컨대, [Bregni, et al. (1992) Blood 80:1418-1422]의 방법에 의해 세포를 프로듀서 세포와 직접 공-배양하거나, 예컨대, [Xu, et al. (1994) Exp. Hemat. 22:223-230; and Hughes, et al. (1992) J. Clin. Invest. 89:1817]의 방법에 의해 적절한 성장 인자 및 다가양이온의 존재 또는 부재시 바이러스 상등액과 단독으로 또는 농축된 벡터 스톡과 함께 배양하는 것을 포함한다.
다른 형질도입 바이러스 벡터가 면역반응성 세포를 변형하기 위해 사용될 수 있다. 소정 구현예에서, 선택된 벡터는 높은 감염 효율 및 안정한 통합 및 발현을 나타낸다(예컨대, [Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997]; [Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996]; [Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997]; [Naldini et al., Science 272:263 267, 1996]; and [Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997] 참조). 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터는, 예를 들면, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스, 소 파필로마 바이러스, 또는 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스와 같은 헤르페스 바이러스(또한, 예를 들면, [Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990]; [Friedman, Science 244:1275-1281, 1989]; [Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988]; [Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990]; [Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991]; [Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987]; [Anderson, Science 226:401-409, 1984]; [Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991]; [Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989]; [Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993]; and [Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995]의 벡터 참조)를 포함한다. 레트로바이러스 벡터가 특히 잘 개발되었고, 임상적 세팅에서 사용되고 있다(Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson et al., U.S. Pat. No. 5,399,346).
비-바이러스 접근법이 또한 면역반응성 세포의 유전적 변형을 위해 도입될 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자는 상기 핵산을 리포펙션(lipofection)(Feigner et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983), 아시알로오로소뮤코이드(asialoorosomucoid)-폴리리신 접합(Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989)의 존재 하에 투여하거나, 외과적 조건(Wolff et al., Science 247:1465, 1990) 하에 미세-주사함으로써 면역반응성 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자 전달을 위한 다른 비-바이러스 수단은 칼슘 포스페이트, DEAE 덱스트란, 전기천공(electroporation), 및 원형질체(protoplast) 융합을 이용한 시험관내 형질주입(transfection)을 포함한다. 리포좀은 또한 세포 내로의 DNA의 운반에 대해 잠재적인 이점을 가질 수 있다. 정상 핵산을 생체외에서 배양가능한 타입의 세포(예컨대, 자가성 또는 이종성 원발 세포 또는 그의 자손) 내로 전달하고, 이후 상기 세포(또는 그의 후손)를 표적화 조직 내로 주입하거나 전신 주입함으로써 대상체의 손상된 조직 내로의 정상 유전자의 이식이 또한 달성될 수 있다. 재조합 수용체는 또한 트랜스포자제(transposase) 또는 표적화 뉴클레아제(예컨대, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 또는 TALE 뉴클레아제, CRISPR)를 이용하여 유래 또는 얻어질 수 있다. 일시적 발현은 RNA 전기천공에 의해 얻어질 수 있다.
클러스터되고 규칙적으로-이격된 짧은 팔린드롬 반복물(CRISPR) 시스템은 원핵생물 세포에서 발견된 게놈 편집 도구이다. 게놈 편집을 위해 이용될 때, 상기 시스템은 Cas9(그 가이드로서 crRNA를 이용하여 DNA를 변형할 수 있는 단백질), CRISPR RNA(crRNA, 숙주 DNA의 올바른 섹션으로 이를 가이드하기 위해 Cas9에 의해 이용되는 RNA와 함께 tracrRNA(일반적으로 헤어핀 루프 형태)에 결합하는 영역을 포함하여 Cas9와 활성 복합체를 형성함), 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA, crRNA에 결합하고 Cas9와 활성 복합체를 형성함), 및 선택적인 섹션의 DNA 복구 주형(세포의 복구 프로세스를 가이드하여 특정 DNA 서열이 삽입되도록 하는 DNA)을 포함한다. CRISPR/Cas9은 종종 표적 세포를 형질주입하기 위한 플라스미드를 도입한다. 상기 crRNA는 Cas9가 세포 내에서 표적 DNA를 확인하고 직접 결합하기 위해 사용하는 서열이기 때문에, 각각의 적용을 위해 디자인될 필요가 있다. CAR 발현 카세트를 운반하는 복구 주형은 절단된 각각의 측 상의 서열과 중첩되고 삽입 서열을 코딩해야 하기 때문에, 또한 각각의 적용을 위해 디자인될 필요가 있다. 다중 crRNA 및 tracrRNA가 함께 패키지되어 단일-가이드 RNA(sgRNA)를 형성할 수 있다. 상기 sgRNA는 세포 내로 형질주입되기 위하여 상기 Cas9 유전자와 함께 결합되어 플라스미드로 제조될 수 있다.
징크-핑거 뉴클레아제(ZFN)는 인공 제한 효소이며, 징크 핑거 DNA-결합 도메인과 DNA-절단 도메인을 조합함으로써 생성된다. 징크 핑거 도메인은 특정 DNA 서열을 표적화하기 위해 조작되어서 징크-핑거 뉴클레아제가 게놈 내에서 원하는 서열을 표적화하도록 할 수 있다. 개별 ZFN의 DNA-결합 도메인은 전형적으로 복수의 개별 징크 핑거 반복물을 함유하고, 각각 복수의 염기쌍을 인식할 수 있다. 새로운 징크-핑거 도메인을 생성하기 위한 가장 평범한 방법은 특이성이 공지된 더 작은 징크-핑거 "모듈"을 조합하는 것이다. ZFN 내의 가장 평범한 절단 도메인은 타입 II 제한 엔도뉴클레아제 FokI 유래의 비-특이적 절단 도메인이다. 상기 내재적 상동성 재조합(HR) 구성요소(machinery) 및 CAR 발현 카세트를 운반하는 상동성 DNA 주형을 이용함으로써, ZFN은 게놈 내로 CAR 발현 카세트를 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 상기 표적화 서열이 ZFN에 의해 절단될 때, 상기 HR 구성요소는 손상된 염색체와 상동성 DNA 주형 사이의 상동성에 대해 검색한 후, 염색체의 2개의 깨어진 말단 사이의 주형의 서열을 복사하고, 이로 인해 상기 상동성 DNA 주형이 상기 게놈 내로 통합된다.
전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 DNA의 특정 서열을 절단하도록 조작될 수 있는 제한 효소이다. TALEN 시스템은 ZEN과 거의 동일한 원리로 작동한다. 이들은 전사 활성자-유사 이펙터 DNA-결합 도메인과 DNA 절단 도메인을 조합함으로써 생성된다. 전사 활성자-유사 이펙터(TALE)는 33-34개의 아미노산 반복 모티프와 특정 뉴클레오티드에 대한 강한 인식을 갖는 2개의 가변성 위치로 구성된다. 상기 TALE의 조립 배열에 의해, 상기 TALE DNA-결합 도메인은 원하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있고, 이로 인해 상기 뉴클레아제가 게놈 상의 특정 위치를 절단하도록 가이드한다. 폴리뉴클레오티드 치료 방법에서 사용하기 위한 cDNA 발현은 임의의 적합한 프로모터(예컨대, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV), 유인원 바이러스 40(SV40), 또는 메탈로티오네인 프로모터)로부터 지향되고, 임의의 적절한 포유동물 조절성 인자 또는 인트론(예컨대, 신장 인자 1a 인핸서/프로모터/인트론 구조)에 의해 조절될 수 있다. 예를 들면, 원한다면, 특정 세포 타입에서의 유전자 발현을 우세하게 지향하는 것으로 알려져 있는 인핸서가 핵산의 발현을 지향하기 위해 사용될 수 있다. 사용되는 인핸서는 조직- 또는 세포-특이적 인핸서로 특정되어 있는 것들을 비제한적으로 포함할 수 있다. 대안적으로, 게놈성 클론이 치료적 구조체로 사용된다면, 조절은 전술한 임의의 프로모터 또는 조절성 인자를 포함하는 동족의(cognate) 조절성 서열에 의해, 또는, 원한다면, 이종성 공급원으로부터 유래되는 조절성 서열에 의해 매개될 수 있다.
결과물인 세포는 미변형 세포의 경우와 유사한 조건 하에 자랄 수 있고, 이로 인해 상기 변형된 세포는 다양한 목적을 위해 확장 및 사용될 수 있다.
5. 게놈 편집 방법
임의의 표적화 게놈 편집 방법이 본 개시된 면역반응성 세포의 하나 이상의 내재적 유전자 좌위에 본 개시된 CAR을 위치시키기 위해 사용될 수 있다. 소정 구현예에서, CRISPR 시스템이 본 개시된 CAR을 본 개시된 면역반응성 세포의 하나 이상의 내재적 유전자 좌위로 운반하기 위해 사용된다. 소정 구현예에서, 징크-핑거 뉴클레아제가 본 개시된 CAR을 본 개시된 면역반응성 세포의 하나 이상의 내재적 유전자 좌위로 운반하기 위해 사용된다. 소정 구현예에서, TALEN 시스템이 본 개시된 CAR을 본 개시된 면역반응성 세포의 하나 이상의 내재적 유전자 좌위로 운반하기 위해 사용된다.
상기 게놈 편집 제제/시스템을 운반하기 위한 방법은 필요에 따라 변할 수 있다. 소정 구현예에서, 선택된 게놈 편집 방법의 성분들은 하나 이상의 플라스미드 내의 DNA 구조체로서 운반된다. 소정 구현예에서, 상기 성분들은 바이러스 벡터를 통해 운반된다. 보통의 운반 방법은 전기천공, 미세주입(microinjection), 유전자 총, 임페일펙션(impalefection), 정수압(hydrostatic pressure), 계속적 주입, 초음파, 자기주입(magnetofection), 아데노-연관 바이러스, 바이러스 벡터의 외피 단백질 슈도타이핑(pseudotyping), 복제-적격(competent) 벡터 시스 및 트랜스-작용성 요소, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 화학적 비히클(예컨대, 올리고뉴클레오티드, 리포플렉스, 폴리머솜, 폴리플렉스, 덴드리머, 무기 나노입자, 및 세포-침투성 펩티드)을 비제한적으로 포함한다.
본 개시된 CAR의 배치는 임의의 내재적 유전자 좌위에서 행해질 수 있다. 소정 구현예에서, 상기 내재적 유전자 좌위는 TRAC 좌위, TRBC 좌위 또는 TRGC 좌위이다. 소정 구현예에서, 상기 내재적 유전자 좌위는 TRAC 좌위이다. 소정 구현예에서, 상기 CAR의 배치는 TCR의 내재적 발현을 방해하거나 없앤다.
6. 폴리펩티드 및 유사체
본 개시된 주제에는 또한 면역반응성 세포에서 발현될 때 그 항-종양 활성을 향상시키는 방식으로 변형된 CD19, CD8, CD28, CD3ζ, CD40, 4-1BB, OX40, CD84, CD166, CD8a, CD8b, ICOS, ICAM-1, CD27, MY88, NKGD2 및 CTLA-4 폴리펩티드 또는 그의 단편이 포함된다. 본 개시된 주제는 서열 내에 변경을 도입함으로써 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 최적화하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 변경은 소정의 돌연변이, 결실, 삽입, 또는 번역후 변형을 포함할 수 있다. 본 개시된 주제는 본 명세서에 개시된 임의의 자연-발생형 폴리펩티드(CD19, CD8, CD28, CD3ζ, CD40, 4-1BB, OX40, CD27, CD40/My88, NKGD2, CD84, CD166, CD8a, CD8b, ICOS, ICAM-1, 및 CTLA-4를 비제한적으로 포함함)의 유사체를 추가로 포함한다. 유사체는 아미노산 서열의 차이, 번역후 변형, 또는 이들 모두에 의해 본 명세서에서 개시된 자연-발생형 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 유사체는 본 개시된 주제의 자연-발생형 아미노산 서열의 전체 또는 일부와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상의 상동성을 나타낼 수 있다. 서열 비교의 길이는 적어도 5, 10, 15 또는 20개 아미노산 잔기, 예컨대, 적어도 25, 50, 또는 75개 아미노산 잔기, 또는 100개 이상의 아미노산 잔기이다. 다시, 동일성의 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근법에서, BLAST 프로그램이 매우 연관된 서열을 나타내는 e-3 및 e-100 사이의 가능성 점수로 사용될 수 있다. 변형은 폴리펩티드의 생체내 및 시험관내 화학적 유도체화, 예컨대, 아세틸화, 카르복실화, 인산화, 또는 글리코실화를 포함한다; 이러한 변형은 폴리펩티드 합성 또는 단리된 변형 효소를 이용한 가공 또는 그 이후의 처리 동안에 일어날 수 있다. 유사체는 또한 1차 서열에서의 변경에 의해 자연-발생형 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 이들은 자연형 또는 유도형 모두의 유전적 변이체(예를 들면, 방사선조사 또는 에탄메틸설페이트에 대한 노출 또는 전술한 [Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), CSH Press, 1989, or Ausubel et al.]에 개시되어 있는 것과 같은 위치-특이적 돌연변이화에 의한 무작위 돌연변이화의 결과물)를 포함한다. 또한, 환형화된 펩티드, 분자, 및 L-아미노산 이외의 잔기를 함유하는 유사체, 예컨대, D-아미노산 또는 비-자연 발생형 또는 합성 아미노산, 예컨대, 베타 또는 감마 아미노산이 포함된다.
전장 폴리펩티드 이외에도, 본 개시된 주제는 또한 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 또는 펩티드 도메인 중 임의의 하나의 단편을 제공한다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "단편"은 적어도 5, 10, 13, 또는 15개 아미노산을 의미한다. 소정 구현예에서, 단편은 적어도 20개의 인접한(contiguous) 아미노산, 적어도 30개의 인접한 아미노산, 또는 적어도 50개의 인접한 아미노산을 포함한다. 소정 구현예에서, 단편은 적어도 60 내지 80, 100, 200, 300개 또는 그 이상의 인접한 아미노산을 포함한다. 단편은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법에 의해 생성될 수 있거나, 정상적인 단백질 처리(예컨대, 초기의 폴리펩티드로부터 생물학적 활성에 필요하지 않는 아미노산의 제거 또는 대안적 mRNA 스플라이싱 또는 대안적 단백질 처리 사건에 의한 아미노산의 제거)의 결과물일 수 있다.
비-단백질 유사체는 본 명세서에 개시된 단백질의 기능적 활성을 모방하도록 디자인된 화학적 구조를 갖는다. 이러한 유사체는 본래의 폴리펩티드의 생리학적 활성을 상회할 수 있다. 유사체의 디자인 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 유사체의 합성은 결과물인 유사체가 면역반응성 세포에서 발현될 때 본래의 폴리펩티드의 항-신생물 활성을 증가시키도록 화학적 구조를 변형함으로써 이러한 방법에 따라 수행될 수 있다. 이러한 화학적 변형은 기준 폴리펩티드의 특정 탄소 원자에서 대안적 R 기를 치환하고 포화 정도를 변경하는 것을 비제한적으로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 단백질 유사체는 생체내 분해에 대해 상대적으로 저항성이어서, 투여시 보다 연장된 치료 효과를 야기할 수 있다. 기능적 활성의 측정을 위한 분석법은 아래의 실시예에서 개시된 것들을 비제한적으로 포함한다.
7. 투여
본 개시된 면역반응성 세포를 포함하는 조성물은 항원에 대한 면역 반응을 유도 및/또는 향상시키거나, 및/또는 신생물, 병원체 감염, 또는 감염성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위하여 대상체에 전신적으로 또는 직접적으로 제공될 수 있다. 소정 구현예에서, 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물은 관심있는 기관(예컨대, 신생물에 의해 발병된 기관) 내로 직접 주사될 수 있다. 대안적으로, 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물은, 예를 들면, 순환 시스템(예컨대, 종양 맥관구조) 내로 투여함으로써 관심있는 기관에 직접 제공된다. 확장 및 분화 제제는 시험관내 또는 생체내에서 T 세포, NK 세포, 또는 CTL 세포의 생산을 증가시키기 위하여 상기 세포 또는 조성물을 투여하기 전, 투여하는 동안 또는 투여 후에 제공될 수 있다.
본 개시된 면역반응성 세포는 임의의 생리학적으로 허용가능한 비히클 내에서 보통은 혈관내로 투여될 수 있지만, 뼈 또는 세포의 재생산 및 분화를 위한 적절한 부위로 발견될 수 있는 다른 편리한 부위(예컨대, 흉선) 내로 도입될 수도 있다. 대개, 적어도 약 1×105 세포가 투여될 것이고, 최종적으로 1×1010 또는 그 이상에 도달한다. 본 개시된 면역반응성 세포는 정제된 세포 개체군(population)을 포함할 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 다양한 잘 알려진 방법, 예컨대 형광 활성화 세포 분류법(FACS)을 이용하여 개체군 내에서 본 개시된 면역반응성 세포의 백분율을 즉시 결정할 수 있다. 본 개시된 면역반응성 세포를 포함하는 개체군 내에서 순도의 적합한 범위는 약 50% 내지 약 55%, 약 5% 내지 약 60%, 및 약 65% 내지 약 70%이다. 소정 구현예에서, 상기 순도는 약 70% 내지 약 75%, 약 75% 내지 약 80%, 또는 약 80% 내지 약 85%이다. 소정 구현예에서, 상기 순도는 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 및 약 95% 내지 약 100%이다. 복용량(dosage)은 본 기술분야의 기술자에 의해 즉시 조정될 수 있다(예컨대, 순도가 떨어지면 복용량의 증가가 필요할 수 있음). 상기 세포는 주사, 카테터 등에 의해 도입될 수 있다.
본 개시된 조성물은 본 개시된 면역반응성 세포 또는 그의 전구체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물일 수 있다. 투여는 자가성 또는 이종성일 수 있다. 예를 들면, 면역반응성 세포, 또는 전구체는 한 대상체로부터 수득하고, 동일한 대상체 또는 상이한 호환가능한 대상체에 투여될 수 있다. 말초혈 유래의 면역반응성 세포 또는 그의 후손(예컨대, 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래)은 카테터 투여를 포함하는 국소 주사, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 주사, 또는 비경구 투여를 통해 투여될 수 있다. 본 개시된 주제의 치료적 조성물(예컨대, 본 개시된 면역반응성 세포를 포함하는 약학적 조성물)을 투여할 때, 주사가능한 단위 제형(용액, 현탁액, 에멀전)으로 제형화될 수 있다.
8. 제형
본 개시된 면역반응성 세포를 포함하는 조성물은 선택된 pH로 버퍼화될 수 있는 멸균 액체 제조물, 예컨대, 등장 수용액, 현탁액, 에멀전, 분산액, 또는 점성 조성물로서 편리하게 제공될 수 있다. 액체 제조물은 보통 겔, 다른 점성 조성물, 및 고형 조성물보다 제조하기에 더 용이하다. 부가적으로, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기에 다소 더 편리하다. 반면에, 점성 조성물은 적절한 점도 범위 내로 제형화되어 특정 조직과의 접촉 기간을 더 길게 제공할 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들면, 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 프로필렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매체일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사가능 용액은 필요시 다양한 양의 다른 성분들과 함께 필요한 양의 적절한 용매 내에 유전적으로 변형된 면역반응성 세포를 포 통합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 멸균슈, 생리 식염수, 글루코오스, 덱스트로오스 등과 같은 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 혼합될 수 있다. 상기 조성물은 또한 동결건조될 수 있다. 상기 조성물은 투여 경로 및 원하는 제조법에 따라 습윤제, 분산제, 또는 에멀전화제(예컨대, 메틸셀룰로오스), pH 버퍼화제, 겔화 또는 점도 증진 첨가제, 보존제, 착향제, 색소 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 ["REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985]과 같은 표준 교과서가 과도한 실험 없이 적합한 제조물을 제조하기 위해 검토될 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 버퍼를 포함하는 상기 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 보장될 수 있다. 주사가능한 약학적 형태의 장기간의 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴를 사용함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 본 개시된 주제에 따르면, 사용되는 임의의 비히클, 희석제, 또는 첨가제는 유전적으로 변형된 면역반응성 세포 또는 그의 전구체와 호환성이어야 한다.
상기 조성물은 등장일 수 있으며, 즉 혈액 및 눈물과 동일한 삼투압을 가질 수 있다. 상기 조성물의 원하는 등장성은 염화나트륨, 또는 덱스트로오스, 붕산, 나트륨 타르트레이트, 프로필렌 글리콜과 같은 다른 약학적으로 허용가능한 제제 또는 다른 무기 또는 유기 용질을 이용하여 달성될 수 있다. 염화나트륨이 나트륨 이온을 함유하는 버퍼용으로 특히 바람직할 수 있다.
상기 조성물의 점도는, 원한다면, 약학적으로 허용가능한 증점제를 이용하여 선택된 레벨로 유지될 수 있다. 예를 들면, 메틸셀룰로오스는 즉시 경제적으로 이용가능하고, 작업하기가 쉽다. 다른 적합한 증점제는, 예를 들면, 잔탄 검, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 카르보머 등을 포함한다. 상기 증점제의 농도는 선택되는 제제에 의존할 수 있다. 중요한 점은 선택된 점도를 달성하게 되는 양을 사용하는 것이다. 명백하게, 적합한 담체 및 다른 첨가제의 선택은 정확한 투여 경로 및 특정 제형, 예컨대, 액체 제형의 본성(예컨대, 상기 제형이 용액, 현탁액, 겔 또는 시간 방출 형태 또는 액체-충진 형태와 같은 다른 액체 형태로 제형화되어야 하는지 여부)에 의존할 것이다.
투여되는 세포의 함량은 치료되는 대상체에 따라 다양할 것이다. 한 구현예에서, 약 104 내지 약 1010, 약 105 내지 약 109, 또는 약 106 내지 약 108의 본 개시된 면역반응성 세포가 인간 대상체에 투여된다. 보다 효과적인 세포는 훨씬 적은 수로 투여될 수 있다. 소정 구현예에서, 적어도 약 1×108, 약 2×108, 약 3×108, 약 4×108, 또는 약 5×108의 본 개시된 면역반응성 세포가 인간 대상체에 투여된다. 소정 구현예에서, 약 1×107 및 5×108의 본 개시된 면역반응성 세포가 인간 대상체에 투여된다. 무엇이 효과적인 용량으로 간주되어야 하는가에 대한 정확한 결정은 그 크기, 연령, 성별, 체중, 및 특정 대상체의 상태를 포함하는 각각의 대상체에 대한 개별적인 인자들에 기반할 수 있다. 복용량은 즉시 본 발명의 설명 및 본 기술분야의 지식으로부터 본 기술분야의 기술자에 의해 파악될 수 있다.
숙련된 기술자는 상기 방법에서 투여되어야 하는 조성물 내의 세포 및 선택적인 첨가제, 비히클 및/또는 담체의 양을 즉시 결정할 수 있다. 전형적으로, (활성 세포(들) 및/또는 제제(들) 이외의) 임의의 첨가제는 포스페이트 완충 식염수 내에서 0.001 내지 50%(중량) 용액의 양으로 존재하고, 상기 활성 성분은 약 0.0001 내지 약 5 wt%, 약 0.0001 내지 약 1 wt%, 약 0.0001 내지 약 0.05 wt% 또는 약 0.001 내지 약 20 wt%, 약 0.01 내지 약 10 wt%, 또는 약 0.05 내지 약 5 wt%와 같이 대략 마이크로그램 내지 밀리그램으로 존재한다. 동물 또는 인간에게 투여되는 임의의 조성물의 경우, 적합한 동물 모델, 예컨대, 마우스와 같은 쥐과에서 치사 용량(LD) 및 LD50을 결정하는 것과 같은 독성; 및 적합한 반응을 일으키는 상기 조성물(들)의 복용량, 그 내부의 성분들의 농도 및 상기 조성물(들)의 투여 시간이 결정될 수 있다. 이러한 결정은 숙련된 기술자의 지식, 본 발명의 설명 및 본 명세서에 인용된 문헌들로부터 과도한 실험을 필요로 하지 않는다. 그리고, 연속적인 투여를 위한 시간은 과도한 실험없이 파악될 수 있다.
9. 치료 방법
본 개시된 주제는 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도 및/또는 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 본 개시된 면역반응성 세포 및 이를 포함하는 조성물은 대상체에서 신생물을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시된 면역반응성 세포 및 이를 포함하는 조성물은 신생물을 앓고 있는 대상체의 생존을 연장하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시된 면역반응성 세포 및 이를 포함하는 조성물은 또한 대상체, 예컨대 면역손상된 인간 대상체에서 병원체 감염 또는 다른 감염성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 소정 구현예에서, 본 개시된 CAR을 포함하는 면역반응성 세포는 재발된 질환을 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 상기 대상체는 잔류 종양 세포를 유발하는 치료를 받는다. 소정 구현예에서, 상기 잔류 종양 세포는 종양 세포 표면에 낮은 밀도의 표적 분자를 갖는다. 소정 구현예에서, 세포 표면에 낮은 밀도를 갖는 표적 분자는 세포 당 약 10,000 분자 이하, 세포 당 약 8,000 분자 이하, 세포 당 약 6,000 분자 이하, 세포 당 약 4,000 분자 이하, 세포 당 약 2,000 분자 이하, 세포 당 약 1,000 분자 이하, 세포 당 약 500 분자 이하, 세포 당 약 200 분자 이하, 또는 세포 당 약 100 분자 이하를 갖고, 소정 구현예에서, 세포 표면에 낮은 밀도를 갖는 표적 분자는 세포 당 약 4,000 내지 약 2,000 분자 또는 세포 당 약 2,000 내지 약 1,000 분자를 갖는다. 소정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 CAR을 포함하는 면역반응성 세포는 재발된 질환을 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 상기 대상체는 4-1BB 폴리펩티드(예컨대, 4-1BBz CAR)를 포함하는 공-자극성 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)를 받는다. 소정 구현예에서, 상기 종양 세포는 종양 세포의 표면에 낮은 밀도의 종양 특이적 항원을 갖는다. 소정 구현예에서, 상기 질환은 CD19+ ALL이다. 소정 구현예에서, 상기 종양 세포는 종양 세포 상에 낮은 밀도의 CD19를 갖는다. 이러한 방법은 원하는 효과, 존재하는 증상의 경감 또는 재발의 예방을 달성하기 위하여 유효량의 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물(예컨대, 약학적 조성물)을 투여하는 단계를 포함한다. 치료의 경우, 투여되는 양은 원하는 효과를 생성하기에 효과적인 양이다. 유효량은 1회 또는 일련의 투여로 제공될 수 있다. 유효량은 볼루스(boulus)로, 또는 연속적 관류에 의해 제공될 수 있다.
"유효량"(또는, "치료적 유효량")은 치료시 유익하거나 원하는 임상적 결과를 발생시키기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 치료의 측면에서, 유효량은 질환의 진행을 완화, 개선, 안정화, 되돌림 또는 늦추거나, 달리 질환의 병리학적 결과를 감소시키기에 충분한 양이다. 상기 유효량은 일반적으로 사례별 기준으로 내과의사에 의해 결정되며, 본 기술분야의 기술자의 범위 이내이다. 유효량을 달성하기 위한 적절한 복용량을 결정할 때 몇 가지 인자가 전형적으로 고려된다. 상기 인자는 대상체의 연령, 성별 및 체중, 치료되는 상태, 상기 상태의 증세 및 투여되는 면역반응성 세포의 형태 및 효과적인 농도를 포함한다.
항원-특이적 T 세포를 이용한 입양적 면역치료법의 경우, 약 106 - 1010(예컨대, 약 109) 범위의 세포 용량이 전형적으로 주입된다. 본 개시된 세포를 숙주 내로 투여한 이후에 분화시키면, T 세포는 상기 특이적 항원에 대해 특이적으로 지향하도록 유도된다. 상기 면역반응성 세포는 정맥내, 피하, 노드내(intranodal), 종양내, 척추강내(intrathecal), 늑막내, 복강내 투여 및 흉선에 직접 투여를 비제한적으로 포함하는 본 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다.
본 개시된 주제는 대상체에서 신생물을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효량의 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 신생물을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
신생물의 비제한적 예는 혈액암(예컨대, 백혈병, 림프종, 및 골수종), 난소암, 유방암, 방광암, 뇌암, 결장암, 장암, 간암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 위암, 교모세포종, 인후암, 흑색종, 신경아세포종, 선암종, 교종, 연부 조직 육종, 및 (전립선 및 소세포 폐암을 포함하는) 다양한 암종을 포함한다. 적합한 암종은 성상세포종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 핍지교종, 상의세포종, 수모세포종, 원시 신경 외배엽 종양(PNET), 연골육종, 골육종, 췌장 관 선암종, 소세포 및 대세포 폐 선암종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 편평 세포 암종, 기관지폐포암종, 상피 선암종, 및 그의 간 전이, 림프관육종, 림프관내피육종, 간세포암, 담관암종, 윤활막종, 중피종, 유윙 종양, 횡문근육종, 결장 암종, 기저 세포 암종, 한선 암종, 유두 암종, 피지선 암종, 유두 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신경 세포 암종, 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 고환 종양, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경아세포종, 망막모세포종, 백혈병, 다발성 골수종, 발덴스트롬 매크로글로불린혈증, 및 중쇄 질환, 관 및 로브 선암종과 같은 유방 종양, 자궁 경부의 편평 및 선암종, 자궁 및 난소 상피 암종, 전립선 선암종, 방광의 이행 편평 세포 암종, B 및 T 세포 림프종, (노듈성 및 확산성) 형질세포종, 급성 및 만성 백혈병, 악성 흑색종, 연부 조직 육종 및 평활근육종을 비제한적으로 포함하는 종양학 분야에서의 임의의 공지된 암종을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 신생물은 혈액암(예컨대 백혈병, 림프종, 및 골수종), 난소암, 전립선암, 유방암, 방광암, 뇌암, 결장암, 장암, 간암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 위암, 교모세포종, 및 인후암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 본 개시된 면역반응성 세포 및 이를 포함하는 조성물은 종래의 치료적 개입으로 다룰 수 없는 혈액암(예컨대, 백혈병, 림프종, 및 골수종) 또는 난소암을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
상기 대상체는 진행된 형태의 질환을 가질 수 있으며, 이 경우 치료의 목적은 질환 진행의 완화 또는 되돌림, 및/또는 부작용의 개선을 포함할 수 있다. 상기 대상체는 이미 치료되었던 증상의 이력을 가질 수 있으며, 이 경우 치료의 목적은 전형적으로 재발 위험성의 감소 또는 지연을 포함할 것이다.
치료법을 위한 적합한 인간 대상체는 전형적으로 임상적 기준에 의해 구별될 수 있는 2가지 치료 그룹을 포함한다. "진행된 질환" 또는 "높은 종양 부하"를 갖는 대상체는 임상적으로 측정가능한 종양을 갖는 대상체이다. 임상적으로 측정가능한 종양은 종양 질량을 기초로 검출할 수 있는 종양이다(예컨대, 촉진, CAT 스캔, 소노그램, 맘모그램 또는 X-선에 의함; 그 자신에 대한 양성 생화학적 또는 조직병리학적 마커는 본 개체군을 확인하는데 불충분함). 약학적 조성물은 그 증상을 완화시킬 목적으로 항-종양 반응을 일으키기 위해 상기 대상체에 투여된다. 이상적으로, 종양 질량의 감소는 결과로서 일어나지만, 임의의 임상적 개선은 이점을 구성한다. 임상적 개선은 진행의 위험성 또는 속도의 감소 또는 상기 종양의 병리학적 결과에서의 감소를 포함한다.
적합한 대상체의 두 번째 그룹은 "어주번트 그룹"으로 본 기술분야에 알려져 있다. 이들은 신생물의 이력을 갖고 있지만 다른 방식의 치료법에 반응성인 개체이다. 상기 이전의 치료법은 외과적 절제, 방사선치료법, 및 전통적인 화학치료법을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 그 결과, 상기 개체는 임상적으로 측정가능한 종양을 갖지 않는다. 그러나, 이들은 본래의 종양 부위 근처에 또는 전이에 의해 상기 질환이 진행할 위험성이 있는 것으로 의심된다. 상기 그룹은 추가로 고-위험성 및 저-위험성 개체로 세분될 수 있다. 상기 세분은 처음의 치료 전후에 관찰되는 특성에 기반하여 행해진다. 상기 특성은 임상 기술분야에 알려져 있으며, 각각의 상이한 신생물에 대해 적합하게 정의된다. 고-위험성 서브그룹의 전형적인 특성은 상기 종양이 이웃하는 조직을 침입하거나, 림프절이 관여됨을 보여주는 것들이다.
다른 그룹은 신생물에 대한 유전적 성향을 갖고 있지만, 신생물의 임상적 조짐에 대한 증거가 아직 없다. 예를 들면, 유방암과 연관된 유전자 돌연변이에 대해 양성으로 테스트되고 아직 가임기인 여성은 예방적 수술을 수행하기에 적합할 때까지 신생물의 발생을 방지하기 위한 예방적 치료로서 본 명세서에 개시된 하나 이상의 면역반응성 세포를 받기 원할 수 있다.
부가적으로, 본 개시된 주제는 대상체, 예컨대, 면역손상된 대상체에서 병원체 감염(예컨대, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염, 또는 원생동물 감염)을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효량의 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 병원체 감염을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 치료에 감수성인 예시적인 바이러스 감염은 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스테인 바 바이러스(EBV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 인플루엔자 바이러스 감염을 비제한적으로 포함한다.
추가적인 변형이 본 개시된 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)에 도입되어 면역학적 합병증("악성 T-세포 형질변환"으로 알려짐), 예컨대, 이식편대숙주질환(GvHD)의 위험성을 피하거나 최소화할 수 있거나, 건강한 조직이 종양 세포와 동일한 표적 항원을 발현할 때, GvHD와 유사한 결과를 유도할 수 있다. 이러한 문제에 대한 잠재적인 해결책은 자살 유전자를 본 개시된 면역반응성 세포 내로 조작하는 것이다. 적합한 자살 유전자는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(hsv-tk), 유도성 카스파아제 9 자살 유전자(iCasp-9), 및 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFRt) 폴리펩티드를 비제한적으로 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 자살 유전자는 EGFRt 폴리펩티드이다. 상기 EGFRt 폴리펩티드는 항-EGFR 모노클론 항체(예컨대, 세툭시맙)를 투여함으로써 T 세포를 제거할 수 있다. EGFRt는 본 개시된 CAR의 상류에 공유결합될 수 있다. 상기 자살 유전자는 본 개시된 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 내에 포함될 수 있다. 이러한 방식으로, 악성 T-세포 형질변환(예컨대, GVHD) 동안에 상기 자살 유전자를 활성화시키도록 디자인된 전구약물(예컨대, 전구약물(예컨대, iCasp-9를 활성화시킬 수 있는 AP1903))을 투여하면 상기 자살 유전자-활성화된 CAR-발현 T 세포에서 아폽토시스를 촉발한다. 본 개시된 CAR 내로 자살 유전자를 통합시키면 매우 짧은 기간 내에 대부분의 CAR T 세포를 제거할 수 있는 능력을 가져서 추가된 레벨의 안정성을 제공한다. 자살 유전자와 함께 통합되는 본 개시된 면역반응성 세포(예컨대, T 세포)는 CAR T 세포 주입 후 해당 시점에서 선제적으로 제거되거나, 가장 빠른 독성의 조짐시에 근절될 수 있다.
10. 키트
본 개시된 주제는 대상체에서 면역 반응을 유도 및/또는 향상시키거나, 및/또는 신생물 또는 병원체 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 키트를 제공한다. 소정 구현예에서, 상기 키트는 유효량의 본 개시된 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 키트는 멸균 용기를 포함한다; 이러한 용기는 박스, 앰풀, 병, 바이알, 튜브, 가방, 파우치, 블리스터-팩, 또는 본 기술분야에 알려진 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 적층 종이, 금속 포일, 또는 약물을 보유하기에 적합한 다른 재료로 만들어질 수 있다. 소정 비제한적 구현예에서, 상기 키트는 선택적으로 하나 이상의 벡터 내에 포함될 수 있고 발현가능한 형태로 관심있는 항원에 대해 지향하는 본 개시된 CAR을 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
원한다면, 상기 면역반응성 세포 및/또는 핵산 분자는 신생물을 갖고 있거나 발생할 위험성이 있는 대상체에 상기 세포 또는 핵산 분자를 투여하기 위한 설명서와 함께 제공된다. 상기 설명서는 일반적으로 신생물 또는 병원체 감염의 치료 및/또는 예방을 위해 상기 조성물을 이용하기 위한 정보를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 설명서는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 치료제의 처방; 신생물, 병원체 감염, 또는 면역 질병 또는 그의 징후를 치료 또는 예방하기 위한 투여 스케줄 및 투여; 예방법; 주의문; 지시문; 금기문; 과복용 정보; 부작용; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 참고문헌. 상기 설명서는 상기 용기(존재시) 상에 직접 인쇄되거나, 상기 용기에 적용된 라벨, 또는 상기 용기 내에 또는 이와 함께 공급된 별도의 시트, 팜플렛, 카드, 또는 폴더일 수 있다.
실시예
본 발명의 실행은, 달리 나타내지 않는 한, 숙련된 기술자의 범위 이내인 종래의 분자생물학(재조합 기술을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학 기술을 도입한다. 이러한 기술은 전체적으로 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989)]; ["Oligonucloetide Synthesis" (Gait, 1984)]; ["Animal Cell Culture" (Freshney, 1987)]; ["Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996)]; ["Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994)]; ["Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)]와 같은 문헌 내에 설명된다. 상기 기술은 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조에 적용가능하며, 이와 같이, 본 개시된 주제의 제조 및 실행에 고려될 수 있다. 특히, 특정 구현예에 대한 유용한 기술은 다음의 섹션에서 논의될 것이다.
다음의 실시예는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 본 개시된 세포 및 조성물을 제조 및 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위한 것이며, 본 발명자들이 본 발명으로서 간주하는 것들의 범위를 제한하기 위한 의도는 아니다.
실시예 1
도입
CD3ζ 및 TCR 복합체 내의 다수의 ITAM은 TCR 신호를 증폭하는 것으로 제안되어 있다(PMID: 20516133). 한편, CD28은 TCR 신호전달을 위한 정량적 지지를 제공한다(PMID: 14647476). 따라서, 신호전달 도메인의 수 및 타입은 TCR 신호전달에 있어서 중요하다. 인간 T 세포에서, CD28 및 TCR/CD3ζ은 세포 당 ∼6×104 및 ∼2×104 분자로 발현된다(PMID: 14647476). 따라서, 3개의 CD28 분자는 3개의 ITAM을 갖는 1개의 TCR/CD3ζ 분자에 대한 신호전달 지지를 제공할 수 있다. 그러나, 2세대 CAR 1928z는 융합된 CD28 및 CD3ζ 세포질 도메인의 디자인을 갖고, 이들의 화학양론 비를 1로 고정한다. 살해 및 증식의 뛰어난 능력과 함께, 1928z CAR은 마우스 모델과 환자에서 CD19 보유 세포의 신속한 시험관내 제거를 허용한다. 그러나, 임상 시험에서의 일부 문제를 극복하기 위해 현재의 1928z CAR의 개선이 필요하다. 한 문제는 대량의 동기화된 T 세포 활성화 및 많은 양의 사이토카인의 방출에 의해 특정되는 사이토카인 방출 증후군(CRS)이다. CRS의 메커니즘은 여전히 알 수 없지만, 이것은 1928z CAR T 세포의 과잉 신호전달과 연관될 수 있다. 다른 문제는 CAR T 세포의 고갈 및 지속성이다. 1928z CAR T 세포는 주입 수 주 또는 수 개월 후에 낮은 수 및/또는 PD-1과 같은 고갈 마커를 발현하는 기능장애 상태로 존재하는 것으로 나타났고, 이것은 일부 재발 사례를 설명할 수 있다. 고갈은 과잉 활성화와 연관된다고 추정되며(PMID: 26331345), 이것은 1928z CAR의 디자인으로 인한 내재적 특성의 결과일 수 있다.
1928z CAR 신호전달과 TCR 신호전달을 비교하면, 2개의 세포질 도메인의 융합으로 인한 일부 주된 차이점은 명확하다. 첫번째로, CAR에서, CD28 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인과 시스(cis) 형이지만, CD28은 시냅스 내로 모집되고 트랜스 형으로 동시-국소화된다. 두번째로, CD28 활성화는 CAR에서 CD3ζ 활성화와 동시에 일어나지만, CD28 동시자극은 TCR 라이게이션(ligation) 수 초 후에 일어난다. 세번째로, 3개의 CD28 분자는 1개의 TCR을 돕지만, 그 비는 CAR에서 1 대 1이다. 처음 2가지 차이점은 현재의 CAR 디자인 하에서 변형이 쉽지 않지만, 세번째 차이점은 동시자극 신호 및 활성화 신호의 균형을 맞춤으로써 해소될 수 있고, 이것은 현존하는 과다자극의 문제를 해결하는데 도움이 될 수 있다. CD28/CD3ζ 비는 융합 디자인으로 인해 직접 변화될 수 없지만, CD3ζ 내의 ITAM의 수는 TCR 신호전달 내의 비를 모방하도록 돌연변이될 수 있다. CD3ζ 내의 3개의 ITAM은 그 1차 아미노산 서열뿐만 아니라 세포막에서의 상대적인 위치(즉, 막 근위부로부터 원위부로 ITAM1, ITAM2, ITAM3)에 있어서 상이하며, 따라서 Lck에 의한 인산화 또는 인산화시 ZAP70에 대한 결합 능력이 상이하다(PMID:23555234). 2번째 위치에 1개의 ITAM만을 갖는 CD28-기반 ErbB2 CAR의 이전의 연구는 시험관내에서 감소된 아폽토시스를 보였지만(PMID:19843940), 추가적인 CAR 특징분석 및 생체내 연구는 여전히 수행되지 않았다. 따라서, 1928z CAR-디자인에 기반한 신규한 CARS가 디자인되었고, 이것은 특히 T 세포 지속성, 분화, 고갈 및 항-종양 활성에 대한 영향을 포함하는 전술한 문제점의 관점에서 그 기능성을 평가하기 위하여 정의된 ITAM 수 및 위치를 도입하였다. 1928z CAR 문맥에서 각각의 ITAM이 CD28 신호전달과 커플링되는 방식은 시험관내 및 생체내에서 분석되는 전체적인 CAR 기능에 영향을 미친다. CD28에 커플링된 ITAM1은 CD28에 커플링된 ITAM2 또는 ITAM3보다 더 나을 뿐만 아니라, 보다 중요하게는 생체내 항-종양 효험의 측면에서 본래의 1928z CAR보다 더 나아서, 이것을 임상 적용을 위한 뛰어난 후보자가 되게 한다. 모든 연구는 인간 말초 혈액 T 세포에서 수행되었다.
결과
1928ζ CAR 내의 CD3ζ ITAM 도메인은 정성적으로 구별되는 CAR T-세포 기능을 나타낸다
첫번째 단계는 2세대 1928z-CAR 구조체 내에서 각각의 CD3ζ ITAM이 정성적으로 독특한 기능에 기여하는지, 또는 개별 ITAM이 중첩하는 기능적 중복 특성을 보여주는지를 조사하였다. 1928z CAR의 기능에 대한 각각의 개별 ITAM의 기여도를 평가하기 위하여, 1개의 단일 기능적 ITAM 도메인만을 갖는 1928z CAR을 생성하였다(1XX, X2X 및 XX3, 도 1a 참조). 2개의 나머지 ITAM의 신호전달은 2개의 티로신(Y)을 페닐알라닌(F)으로 전환시키는 점 돌연변이의 삽입에 의해 방해되었고, 따라서 하류 신호전달 경로의 완전한 활성화를 위한 ZAP70의 인산화 및 연이은 모집을 할 수 없다. T 세포는 상이한 구조체들 사이에 상당한 형질도입 비율로 SFG 레트로바이러스 벡터를 이용해 효과적으로 형질도입되었다(도 1b).
생성된 1928z 돌연변이체의 치료적 잠재력을 비교하기 위하여, 5×104 CAR+ T 세포의 준최적(suboptimal) CAR T-세포 용량을 이전에 개시된 프리-B 급성 림프아구성 백혈병 NALM-6 마우스 모델에 투여하였고, 1928z 야생형(1928z WT) 마우스를 이용한 치료와 효험을 비교하였다(도 2).
해당 기능적 ITAM에 관하여 마우스의 종양 근절 및 생존에서 점진적인 차이가 발견되었다: 본래의 1928z CAR 위치 내의 미변형 ITAM1(1XX) 또는 ITAM2(X2X)는 본래의 1928z 야생형(WT) 내의 3개의 기능적 ITAM과 비교하여 개선된 항종양 활성을 보여주었다. 이와 대조적으로, 기능장애성 ITAM 1 및 2(XX3)와 조합된 유일한 기능적 ITAM인 ITAM3은 성능이 불량하였고, 마우스의 감소된 종양 근절 및 감소된 생존을 보여주었다(도 3).
따라서, 1928z CAR 내의 개별 ITAM은 2세대 1928z 구조 내에서 본래의 위치를 유지할 때 정성적으로 구별되는 기능을 나타내었다. 종양 근절의 효험은 기능적 ITAM의 각각이 더 원위부 위치에 있을수록 점진적으로 감소하였다: 1XX은 일관되게 신속한 종양 근절을 보여주었고, 장기간의 완전한 차도를 달성하였지만, X2X를 이용한 처리는 종양의 진행을 지연시켰고, 1928z WT보다는 뛰어났지만, 최종적으로 재발이 일어났다. 가장 원위부 위치에 비-돌연변이된(자연형의) ITAM을 갖는 XX3은 종양 조절을 달성하지 못했고, 신속한 종양 진행 및 감소된 생존율을 유발하였다(도 3). 결론적으로, 2번째 또는 3번째 ITAM 위치에 1개 또는 2개 ITAM을 갖는 1928z CAR(XX3, X2X, X23)은 1928z 야생형보다 덜 활성이거나 더 이상 치료적으로 활성(생체내)이 아니었다.
올바른 위치의 1개의 단일 기능적 CD3ζ ITAM은 강력한 항종양 활성을 위해 충분하다
제기되는 다음 질문은 ITAM1보다 ZAP70에 대해 더 낮은 친화도를 가질 것으로 생각되는 원위부 위치의 2개의 기능적 ITAM의 조합(ITAM2 및 ITAM3(X23, 도 1a))이 해당 단일 ITAM 1928ζ 돌연변이체(X2X/XX3)의 효능을 함께 개선할 수 있는지 여부였다. 생체내 분석은 XX3으로 처리된 마우스의 결과에 필적하는 X23으로 처리된 마우스의 빈약한 종양 제거 및 생존을 나타내었다(도 2 및 도 3). 이와 대조적으로, 첫번째(1XX) 또는 두번째(X2X) 위치에서 1개의 단일 기능성 ITAM만을 갖는 1928z 돌연변이체 CAR은 종양 부하 및 생존 동안에 반영된 것과 같이 2개(X23) 또는 3개(WT)의 기능적 ITAM을 갖는 1928z CAR보다 더 뛰어난 것으로 나타났다. 1XX는 일관되게 가장 강력한 1928z 돌연변이체인 것으로 판명되었고, 매우 낮은 처리 용량에서 조차도 신속하고 지속되는 종양 근절을 달성하였다. 따라서, 상기 결과는 1개의 단일 ITAM이 효과적으로 죽이는데 충분함을 나타내지만, CD3ζ 내의 어느 ITAM이 기능적인지에 따라 CAR T 세포의 치료 효능에 현저한 차이가 있음을 나타낸다.
다음의 분석은 XX3에서의 감소된 CAR 기능이 ITAM3의 개별 특이성으로 인한 것인지, 또는 그 자연 위치와 비교하여 2세대 CAR의 문맥에서 보다 원위부 위치의 ITAM3과 연관되는 것인지 여부였다. 따라서, 정확하게 동일한 근위부 CAR 위치(D12 및 D23)에서 ITAM1 또는 ITAM3을 갖고 나머지 CD3ζ 사슬이 결실되어서 1928-CAR 문맥에서 상기 2개의 ITAM을 직접 비교할 수 있는 1928z 돌연변이체 CAR을 생성하였다(도 1). 그 결과는 보다 근위부 위치에 있는 ITAM3(D12)가 D23에 필적하는 결과를 나타내어 신속하고 효과적인 장기간의 종양 제거를 위해 충분함을 보여주었다(도 2 및 도 3). 동일한 ITAM(ITAM3)을 공유하고 있음에도 불구하고, D12는 명확하게 XX3을 능가하였고, 효과적인 항종양 효능을 달성하였다. 따라서, D12 및 XX3 사이의 치료 효능에 있어서의 현저한 차이는 2세대 CAR 내의 ITAM 위치의 영향을 나타낸다. 결론적으로, 첫번째 ITAM 위치에서 단일 ITAM(1XX 및 D23에서 ITAM1 또는 D12에서 ITAM3)은 1928z 야생형보다 보다 치료적으로 활성이었다(생체내).
D23 및 1XX은 유일한 기능적 ITAM으로 ITAM1을 공통적으로 갖고 있지만, 1XX는 D23과 비교하여 개선된 기능적 특성을 보여주었고, 더 높은 T-세포 증식 및 유리한 T-세포 표현형을 야기하였다(도 4 및 도 5). 이것은 막의 연합을 매개하고 신호전달을 조정하는 것으로 이전에 밝혀진 상기 CD3ζ 사슬 내의 염기성 풍부 스트레치(BRS)가 1928z CAR의 기능적 특성에 기여할 수 있음을 뒷받침한다(도 1b).
따라서, 1XX CAR의 구조 내에 부가적인 돌연변이를 삽입하였고, 이로 인해 BRS-2 및 BRS-3(=1XX BRS음성)의 신호전달을 방해하였다. 1XX BRS음성은 시험관내 및 생체내에서 감소된 증식 및 살해 기능을 보였으므로, 상기 BRS 영역은 1XX의 기능에 필수적인 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명자들은 1XX 내에서 상기 BRS 영역의 기능적 중요성을 입증한다.
CD3ζ ITAM 돌연변이는 1928ζ CAR 내에서 향상된 T-세포 증식을 허용하고 T-세포 분화 및 고갈을 제한한다
생체내 연구는 1개의 기능적 ITAM 및 2개의 돌연변이 ITAM 영역을 갖는 모든 CAR 군에 대해 향상된 CAR T-세포 축적을 보였다: XX3, X2X 및 1XX의 세포 수는 17일 후에 1928z WT와 비교하여 종양 부위에서 현저하게 더 높은 T-세포 축적을 달성하였다(도 4). 단일 ITAM(XX3, X2X, 1XX)을 함유하는 돌연변이체 1928z CAR을 발현하는 T 세포는 생체내에서 야생형 28z CAR을 발현하는 T 세포보다 더 높은 레벨을 축적하였다. 2개 이상의 ITAM(1928z 및 X23)을 함유하는 CAR은 단일-ITAM CAR(XX3, X2X, 1XX, D23 및 D12)을 발현하는 T 세포보다 감소된 축적을 보여주었다.
더 높은 T-세포 축적은 CD4+ 및 CD8+ CAR T 세포에서의 중심 메모리(CD62L+CD45RA-)(TCM) 및 이펙터(CD62L-CD45RA+)(TEFF) 세포의 백분율에서 반영되는 것과 같이 더 낮은 T-세포 분화와 연관된다: 1XX는 1928z WT와 비교하여 현저하게 높은 백분율의 TCM (개선된 생체내 증식 잠재력과 연관되는 T-세포 표현형) 및 현저하게 낮은 백분율의 최종 분화된 TEFF를 보여주었다(도 5). 아울러, 1XX는 CAR 주입 17일 후에 처리된 마우스의 골수에서 현저하게 높은 수의 TCM 세포 및 메모리-연관 마커 IL7R을 발현하는 T 세포를 보였다. 또한, 양쪽 T-세포 개체군 모두 CAR 투여 10일 내지 17일에 현저한 증가를 보였다(도 6). 전체적으로, 1XX는 가장 큰 분획의 메모리 T 세포를 유발하였고, D23은 장기간 시험관내 분석법에서 2번째로 뛰어났다. 지연된 분화 및 IL7R-발현 CAR T 세포의 증가는 또한 항원에 반복적으로 노출시 시험관내에서 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
또한, 상기 1928z 돌연변이체는 줄어든 항-종양 활성과 연관된 억제성 분자인 PD1, TIM3 및 LAG3의 동시-발현에 의해 결정될 때 T-세포 고갈의 정도에서 차이가 있다. 1개의 단일 기능성 ITAM을 갖고 2개의 다른 ITAM이 결실된 1928z 돌연변이체 군(D12 및 D23)은 현저하게 낮은 고갈 마커의 발현을 보였다(도 7).
XX3은 종양 부위에서 CAR 수에서 1928z WT를 상회하였고(도 4), 높은 백분율의 TCM을 보였지만, 이들 세포는 종양의 진행을 예방할 수 없었다. XX3-처리된 마우스는 초기 처리시 반응을 보였지만, 단기간 후에 재발하였다. 기능적 시험관내 분석은 XX3에서 감소된 살해 활성뿐만 아니라 줄어든 Th1 사이토카인 및 그랜자임 B(GrB) 분비를 보여주었다(도 8 및 도 9). 도 8은 표준 시험관내 세포독성 분석법에서 줄어든 세포용해 활성을 나타내는 XX3을 제외하고는 모든 CAR이 종양 세포를 유사하게 용해시킴을 보여준다. 모든 구조체가 초기 T-세포 형질도입 후에 유사하고 강력한 세포독성 활성을 보였지만, 반복적 Ag 노출시 CAR 확장 후에 차이가 나타났다(도 8). 도 9는 표준 시험관내 사이토카인 분석법이 생체내 기능적 특징분석과 연관되지 않지만, 1XX 및 D23은 유리한 프로필을 보여줌을 나타낸다(IL2 및 항-종양 사이토카인, 예컨대 IFNg 및 TNFa).
이러한 발견은 XX3에서 이펙터 및 증식 기능의 언커플링을 나타내며, CAR T 세포의 확장 및 지속성은 효과적인 종양 근절을 위해 충분하지 않음을 보여준다. 이와 대조적으로, 1928z WT는 높은 세포독성 활성을 나타냈지만, 이펙터 세포로의 이른 분화 및 억제성 분자의 증가된 상향조절을 획득하여서, 1928z CAR의 고갈 및 감소된 지속성을 유발하였다.
결론
2세대 1928z CAR에서 조합된 CD3ζ 활성화 및 CD28 동시자극으로 인한 기능적 중복성 및 증가된 신호전달은 이른 T-세포 분화 및 고갈을 유발하여서, 항종양 활성을 감소시킬 수 있다. 따라서, CAR 기능에 대한 단일 ITAM의 기여가 분석되었다. CD3ζ 사슬 내에서 ITAM의 위치, 친화도 및 수는 1928z CAR T 세포의 기능적 특성에 차등적으로 영향을 미쳤다. 전체적으로, 단일 ITAM을 함유하는 1928z CAR은 더 뛰어난 T 세포 축적, 메모리 형성 및 감소된 고갈을 지향하지만(도 4 내지 도 7), 상기 단일 ITAM은 가장 높은 치료적 (항-종양) 활성을 제공하기 위하여 첫번째 위치에 위치해야만 한다(도 2 및 도 3). 1XX는 이펙터 및 메모리 세포 모두의 가장 유리한 특성을 포함하였고, 이로 인해 활성화 및 분화를 균형잡는다. 1XX는 조합된 CD3ζ 신호전달 및 CD28 동시자극의 강한 활성화를 조절하고, 적절한 세포내 신호로 강도를 미세-조율하며, 따라서 CAR-매개성 신호전달을 조정하고, 더 뛰어난 장기간의 종양 근절을 야기한다.
실시예 2 - CAR의 대안적 힌지/스페이서 영역 및 막통과 도메인
대안적 힌지/스페이서 영역 및 막통과 도메인을 CAR 구조체에서 테스트하였다. 상이한 힌지(H) 및 막-통과 도메인(TM)을 보유하는 1XX CAR의 개략도는 도 10에 나타나 있다. 테스트된 모든 힌지 및 막-통과 도메인은 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF)에 속하며, 세포-표면 호모다이머를 형성할 수 있다. 모든 구조체는 CAR 및 LNGFR을 암호화하는 레트로바이러스 벡터(SFG) 상에 P2A 비시스트론성으로 클로닝되었다. 유세포 분석 프로필은 각각 염소 IgG 항-마우스 IgG (F(ab')2) 단편 및 항-LNGFR을 이용하여 CAR 및 LNGFR 발현을 보여준다. T 세포는 건강한 공여자의 PBMC(말초 혈액 단핵 세포)로부터 수득하였고, 활성화 48시간 후에 안정하게 형질도입되었으며, 다수의 시점에서 CAR의 발현에 대해 분식되었다. CD28/CD28 H/TM 영역을 함유하는 1928z-LNGFR CAR을 대조군으로 사용하였다.
CD28/CD28(H/TM)을 ICOS/ICOS(H/TM), CTLA-4/CTLA-4(H/TM) 또는 ICAM-1/ICAM-1(H/TM) 힌지로 교체하면 CAR의 세포-표면 발현을 없앴다. 그러나, CAR 발현은 CD28 힌지가 ICOS 막-통과(CD28/ICOS; H/TM)에 융합될 때 회복되었다. 그러나, CAR 발현은 CD28/CTLA-4(H/TM) 외형(configureation)에서는 구조되지 않았다. 상기 발견은 효과적인 CAR 발현을 가능하게 하는 H/TM 조합의 발견이 자명한 것이 아님을 나타낸다. 결론적으로, CD84/CD84, CD166/CD166, CD8a/CD8a, CD8b/CD8b 또는 CD28/ICOS (H/TM) 영역을 갖는 1XX CAR은 T 세포 표면에서 유사하게 발현되었지만, 이들 중 3개는 CD28과 다이머를 형성할 수 없다: CD166-28z, CD8a-28z, CD8b-28z.
106 세포/㎖ CAR T 세포로부터 시작되는 매주 자극시의 누적된 CAR T 세포 카운트는 도 11에 나타나 있다. CD19에 대한 매주 노출에 의해 유도되는 CAR T 세포의 증식은 먼저 21일에 걸쳐서 시험관내에서 평가되었다. CAR T 세포는 임의의 외인성 사이토카인 없이 조사된 CD19+ NIH 3T3를 이용해 공동-배양되었다. 매주, 106 세포/㎖ CAR+ T 세포를 조사된 신선한 CD19+ NIH 3T3에 첨가하였다. CD28/CD28(H/TM)을 갖는 1928z-1XX-LNGFR CAR을 참조물로 사용하였다. 19-CD166-28z의 시험관내 증식은 1928z 야생형과 유사하였다.
데이터는 CAR T 세포 표면 검출에 기반하여 조직화하였다. ICOS/ICOS(H/TM), CTLA-4/CTLA-4(H/TM), ICAM-1/ICAM-1(또는 CD28/CTLA-4 (H: TM)를 보유하는 CAR로 형질도입된 T 세포는 CD19+ NIH 3T3 세포로 공동-배양한 후 축적할 수 없었다. CD84/CD84 및 CD8b/CD8b(H/TM)을 갖는 CAR T 세포는 2 라운드의 자극 후에 축적할 수 있었다. 그러나, 상기 세포는 3 라운드의 자극 후에 축적 능력을 잃었다. CD166(H/TM), CD8a(H/TM) 도메인 및 CD28/ICOS(H/TM)를 갖는 CAR T 세포는 대조군 1928Z-1XX CAR T 세포와 같이 효과적으로 축적하였다.
CAR T 세포의 세포독성 활성은 세번째 자극의 종결시(D21)에 4시간 51Cr 방출 분석법을 이용해 측정하였고, 그 결과는 도 12에 나타나 있다. T 세포 및 EL-4-CD19+ 표적 세포를 상이한 이펙터:표적 비(E:T)로 사용하였다. EL-4-PSMA 세포를 대조군으로 사용하였다. 기대한 것과 같이, 모든 잘-발현된 H/TM CD28/CD3z 변이체의 시험관내 세포독성 잠재력은 유사하였다. CD166(H/TM), CD8a(H/TM) 도메인 및 CD28/ICOS(H/TM)을 갖는 CAR T 세포의 세포독성 능력은 CD28/CD28(H/TM)을 갖는 CAR T 세포에 필적하였다.
NOD.Cg PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(Immuno-deficient NSG) 마우스를 이용한 상이한 H/TM CAR T 세포의 생체내 항-종양 효능은 도 13에 나타나 있다. 마우스는 5×105 FFLuc-GFP NALM6 세포(프리-B ALL 세포주), 및 4일 후 2×105 CAR T 세포로 꼬리 정맥 주사하였다. 종양 부하는 생체발광 신호의 매주 정량화에 의해 후속 조사하였다. 생체내 연구를 위해 선택된 모든 구조체인 CD166/CD166(H/TM), CD8a/CD8a(H/TM) 및 CD28/ICOS(H/TM)는 종양 세포를 완전히 근절할 수 있었다. 대조군인 1928z CAR T 세포와 비교하여 임의의 조건에 대해 종양 부하 또는 생존의 관점에서 현저한 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 3 - 탈-면역화 전략
인간 서열 또는 그의 돌연변이의 병치(juxtaposition)는 신규항원의 생성 위험성을 갖는다. 따라서, 1XX에서 신규한 CD166 접합부 및 그 돌연변이는 탈-면역화되었다. 상이한 CAR 모이어티 사이의 접합부의 면역원성을 NetMHC 4.0 서버를 이용해 예측하였다. 총 26개 아미노산(첫번째 모이어티 유래의 13개 아미노산 및 두번째 모이어티 유래의 13개 아미노산)을 선택하였다. 그 다음 모이어티로부터의 적어도 하나의 아미노산을 함유하는 각각의 생성된 펩티드(14, 13, 12, 11, 10, 9 및 8머)의 경우, 모든 대립유전자에 대하여, HLA A, B 및 C에 대한 결합 친화도가 예측되었다. 각각의 펩티드의 면역원성 점수를 각각의 펩티드에 대해 할당하였다. 면역원성 점수 = [(50 - 결합 친화도) × HLA 빈도]n의 식을 이용해 면역원성 점수를 계산하였다. 50 nm를 강한 결합 친화도에 대한 컷오프(cutoff)로 사용하였다. 코카시안 개체군에서의 HLA 빈도를 사용하였다. n = 각각의 펩티드에 대한 예측 수. 총 개체군에서 1% 이하의 HLA 빈도는 배제되었다. 접합부에 대하여, 탈-면역화, 접합부를 형성하는 양쪽 아미노산의 셔플링(shuffling) 또는 접합부의 양측 유래의 아미노산의 결실을 테스트하였다. 이전에 개시된 면역원성 예측 전략을 각각의 새롭게 생성된 펩티드에 대해 사용하였다. 최소 면역원성 점수를 갖는 접합부를 사용하여 탈-면역화된 CAR을 구축하였다. 예시적인 탈-면역화 전략은 도 14에 나타나 있다.
실시예 4 - 4-1BBz CAR T 세포를 이용한 처리 후 CD19가 낮은 ALL의 재발의 구조
도입
키메라 항원 수용체(CAR)를 이용한 입양적 면역치료법은 백혈병 및 림프종의 치료에서 현저한 임상 결과를 보였으며, 원칙적으로 넓은 범위의 암에 적용가능한 유망한 면역치료법이다. 2가지 유망한 CAR 디자인이 성공적으로 임상에 도입되었으며, 하나는 공자극성 성분으로 CD28의 세포질 도메인을 이용하고, 다른 하나는 4-1BB의 세포질 도메인을 이용한다. 양쪽 경우에 있어서, T 세포 활성화는 CD3 제타 사슬의 융합된 세포질 도메인을 통해 개시된다. 양쪽 디자인 모두 현저한 결과를 달성하였지만, 임상적 성과는 그 CAR 구조의 단점에 의해 제한된다. CD28-기반의 CAR을 발현하는 T 세포는 강력하지만 수명이 짧은 반면, 4-1BB-기반의 CAR을 발현하는 T 세포는 수명이 길지만 표적 항원을 낮은 레벨로 발현하는 종양 세포의 항원 탈출을 허용한다. 따라서, 기능의 손상 없이 T 세포의 지속성을 연장하는 신규한 CAR 디자인의 필요성이 있다.
결과
본 개시된 CD28z CAR T 세포는 4-1BBz CAR T 세포의 처리 후 CD19가 낮은 ALL의 재발을 구조할 수 있다. 안정적으로 CD19-음성인 경우를 제외하고, 이것은 4-1BBz CAR T 세포의 처리 후에 일어나는 많은 재발에 대한 주된 구조 경로일 수 있다.
NSG 마우스는 5×105 FFLuc-GFP NALM6 세포(프리-B ALL 세포주), 및 4일 후 2×105 19BBz CAR T 세포로 꼬리 정맥 주사하였다. 첫번째 T 세포 주사 10일 후(종양의 진행만을 지연시키는 효과적이지 않은 용량), 마우스는 다시 19BBz CAR T 세포 또는 대안적으로 1928z 또는 (5×105/마우스)로 주사하였다. 다양한 생존 곡선은 도 15에 나타나 있다. 1928z 기반의 CAR T 세포의 신선한 주사(2차 주사)만이 NALM-6으로 처리된 마우스를 재발로부터 구조할 수 있었다. 신선한 19BBz CAR T 세포로 주사한 후에는 생존율에서의 현저한 증가가 관찰되지 않았다.
결론적으로, CD28z CAR T 세포는 4-1BBz CAR T 세포의 실패를 구조할 수 있다. 상기 실시예에 비추어, 본 명세서에 개시된 변형된 CD28z CAR T 세포, 예컨대 (CD166 힌지/TM 도메인과 같은 다양한 힌지/TM 도메인을 갖는) 1XX, D23 및 D12 CAR T 세포는 4-1BBz CAR T 세포의 실패를 구조함에 있어서 심지어 1928z CAR T 세포보다 더 효과적일 수 있다.
실시예 5
본 실시예는 실시예 1의 소정 측면의 경신된 최신 연구이다.
키메라 항원 수용체(CAR)는 T 세포가 강화된 항종양 특성을 획득하도록 표적화 및 재프로그래밍하는 합성 수용체이다1. CD28 및 CD3ζ 신호전달 모티프2를 포함하는 CD19-특이적 CAR은 난치성 백혈병3-5 및 림프종6을 갖는 환자에서 현저한 반응을 유도하였고, 현재 미국 식품 의약품 안정처에 의해 승인되었다7. 상기 CAR은 T 세포에 대해 부여하는 제한된 지속성에도 불구하고3-6,8 강력한 종양 제거4,8를 매개하는 고성능 이펙터 기능을 프로그래밍한다. 그 효능의 손상 없이 기능적 지속성을 연장하는 것은 현재의 CAR 치료법을 개선해야 한다. 강한 T 세포 활성화는 고갈을 일으키고9,10, 이것은 CD28 및 CD3ζ 신호전달의 중복성11,12 뿐만 아니라 2세대 CAR의 구조에 의해 부여된 시공간적 제약의해 강화될 수 있다2. 따라서, CD28-기반의 CAR의 활성화 잠재력을 교정하면 T 세포 기능 및 분화를 차등적으로 재프로그래밍할 것이라는 가설을 세웠다. 여기서, 단일 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프를 암호화하는 CAR은 이펙터 및 메모리 프로그램의 균형을 맞춤으로써 T 세포가 상이한 운명이 되도록 인도하고, 이로 인해 향상된 치료적 프로필을 갖는 CAR 디자인을 생성한다.
3개의 모든 CD3 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM) 11,13를 통합하는 키메라 항원 수용체(CAR) 디자인에서 CD28 및 CD3 신호전달의 중복성은 비생산적 T 세포 분화 및 고갈을 조성할 수 있다는 가설을 세웠다9,10. 따라서, 티로신 잔기를 돌연변이시켜 그 인산화 및 하류의 신호전달을 지연시키도록 ITAM 활성을 교정하였다14-17. 1928z-조작된 T 세포의 기능, 분화, 및 치료 효능에 대한 각각의 3개의 CD3 ITAM의 기여도를 조사하기 위하여, 1XX, X2X, 및 XX3로 명명된 단일 ITAM-함유 1928z 돌연변이체를 생성하였다(도 16a). X23으로 명명된 한 부가적인 돌연변이체에서, 2개의 원위부 ITAM(ITAM2 및 ITAM3)은 유지되었으며, 이들 모두는 ITAM1에 비해 티로신-단백질 키나아제 ZAP-70에 대한 낮은 결합 친화도를 보이는 것으로 나타났다13,18. 모든 돌연변이체 CAR은 레트로바이러스로 형질도입된 인간 말초 혈액 T 세포에서 유사하게 발현하였다(도 16b); 이들은 4시간 크롬-51(51Cr) 방출 분석법에서의 구분 불가능한 세포독성 및 CD19 항원을 이용한 3주간 자극에 대한 반응시의 증식을 유도하는 것으로 나타났다(도 20a 및 도 20b).
주목하게는, 상기 돌연변이체 CAR을 발현하는 CAR T 세포의 치료적 효험은 잘-확립된 프리-B 급성 림프아구성 백혈병 Nalm6 마우스 모델에서 특이하게 상이하다8,19,20. CAR T 세포 용량은, CAR 스트레스 테스트에서 이전에 개시된 것과 같이, T 세포 효능을 보다 잘 비교하기 위하여 의도적으로 낮추었다8. 모체(parental) 1928에 비해, XX3은 현저하게 줄어든 항종양 효험을 보였고, 단지 종양 부하의 일시적 감소만 달성한 것과 대조적으로, 1XX는 1928z를 상회하였으며, 모든 마우스에서 장기간의 차도를 유도하였다(도 16c 및 도 20c). X2X 및 X23을 이용한 처리는 1928과 비교하여 생존율을 현저하게 변경하지는 않았다(1928 대 X2X: P = 0.6942; 1928 대 X23: P = 0.1085).
따라서, 1개(1XX, X2X, XX3), 2개(X23), 또는 3개(1928z)의 기능성 ITAM의 존재가 단기간의 시험관내 기능을 주목할만하게 변경하지는 않았지만, 1개 ITAM-함유 CAR은 생체내에서 3개- 및 2개-ITAM-함유 CAR을 능가하였다. 종양 근절의 효험은 기능성 ITAM의 원위부 위치가 증가함에 따라 점진적으로 감소하였다. 1XX CAR은 일관되게 신속한 종양 근절을 보였고, 가장 낮은 T 세포 용량에서 지속적이고 완전한 차도를 달성하는 유일한 CAR 디자인이었다. X2X를 이용한 처리는 야생형 1928z와 비교하여 종양의 진행을 약간 지연시켰지만, 최종적으로 재발이 발생하였다. XX3 CAR은 어떠한 종양 조절도 달성하지 않았으며, 신속한 종양의 진행을 유발하고 생존율을 현저하게 감소시켰다(도 16c 및 도 20c).
항종양 효험에서의 이렇나 주된 차이에 대한 기능적 기반을 조사하기 위하여, 상기 CAR에 의해 부여되는 반응을 보다 심층 조사하였다. 낮은 이펙터-대-표적 비에서의 연장된(18시간) 세포독성 분석법에서, XX3은 1928z 및 다른 돌연변이체보다 덜 활성인 것으로 판명되었다(도 21a). XX3의 줄어든 이펙터 기능은 CD19+ 표적을 이용한 자극 후에 감소된 그랜자임 B(GrB) 발현(도 21b) 및 감소된 단일 및 다기능성 타입 1 T 헬퍼 세포(TH1) 사이토카인 분비(도 21c)에 의해 추가로 입증되었다. 단일 ITAM(ITAM1, 2, 또는 3)을 포함하면 CD62L/CD45RA 발현에 의해 결정될 때 T 세포 분화를 제한하였고, CD19+ 표적을 이용한 반복된 시험관내 자극에 대한 반응으로 중심 메모리 CAR T 세포 분획의 증가 및 이펙터 세포 비율의 감소를 야기하였다(도 20d).
이러한 발견은 2개의 비활성 CD3 ITAM 도메인을 갖는 CAR T 세포가 증가된 지속성(도 16d) 및 지연된 T 세포 분화(도 16e)를 나타내었을 때 생체내로 확장되었다. 1XX, X2X, 및 XX3 CAR T 세포는 모두 더 높은 백분율의 CD62L+CD45RA- 중심 메모리 T 세포(TCM) 및 최종적으로 분화된 CD62L-CD45RA+ 이펙터 세포(TEFF)의 분획 감소를 나타내었다(도 16e 및 도 20e). CD4+ 및 CD8+ CAR T 세포에서의 이펙터 분화의 약화는 종양 부위에서 양쪽 T 세포 서브세트의 증가된 축적과 연관되며(도 16d), CD28-기반의 2세대 CAR 내에서 CD3 신호전달을 감소시키는 이점을 확립한다.
XX3의 더 낮은 효능이 ITAM3에 내재적인 것인지, 또는 그 원위부 위치로 인한 것인지 여부를 다음에 조사하였다. 따라서, 동일한 근위부 CAR 위치에 ITAM1 또는 ITAM3을 갖는 1928ζ 돌연변이체 CAR을 나머지 CD3ζ 사슬의 결실을 통해 생성하였다(D12 및 D23, 도 17a 및 도 17b). 시험관내 연구는 4시간 및 18시간 분석법에서 모든 구조체들 사이에 동등한 강도의 세포용해 활성, 줄어들지 않은 사이토카인 및 GrB 분비, 및 D12, D23, 및 1928ζ 사이에 필적하는 증식 잠재력을 보여주었다(도 21 및 도 22). 그러나, D12 및 D23은 모두 생체내에서 1928ζ을 능가하였고, 완전한 종양 근절을 달성하였다(도 17c 및 도 22d). 양쪽 CAR 구조체는 모두 T 세포 분화를 알맞게 줄였고, 1928ζ에 비해 종양 부위에서 더 높은 CAR T 세포 축적을 촉진하였다(도 17d 및 도 17e). 이러한 발견은 1928ζ CAR 내에서 ITAM 투여량 및 위치의 중요성을 보여준다. 강력한 항종양 효험을 위해서는 단일 기능성 ITAM이 충분하며, 3개의 ITAM-함유 야생형 CD3ζ 사슬에 의해 제공되는 것보다 더 뛰어나다. 또한, ITAM3에 의해 제공되는 치료 효능은 해당 자연형의 위치에서 ITAM1의 경우보다 낮지만(XX3 대 1XX), 동일한 근위부 위치에는 필적한다(D12 대 D23). 동일한 ITAM 서열을 공유함에도 불구하고, D12는 XX3에 비해 더 뛰어난 종양 근절을 달성하였으며, 이는 2세대 CAR 내에서 ITAM 위치의 중요성을 보여준다.
미묘하게 다른 CAR 발현 레벨로부터 발생하는 잠재적인 혼동 효과를 배제하기 위하여, CAR 상보성 DNA(cDNA)를 TRAC 좌위에 표적화하였고19, 이로 인해 내재적 T 세포 수용체(TCR; 도 24a)를 동시에 제거하면서 이식유전자(transgene) 조절 및 사본 수를 표준화하였다. 상기 조건 하에서, 1XX CAR T 세포는 다시 1928z 또는 XX3를 발현하는 것들을 능가하였다(도 3a). TRAC-1XX T 세포는 21일 내에 완전한 차도를 달성하였지만, TRAC-XX3 T 세포는 종양의 진행을 지연만 시켰고, 종양 조절을 달성할 수 없었다(도 18a). CAR 주입 17일 후에 회수된 CAR T 세포 및 종양 세포의 분석은 CD4+ 및 CD8+ 서브세트 모두에서 TRAC-1928z와 비교하여 더 높은 TRAC-1XX 및 TRAC-XX3 CAR T 세포의 축적을 보여주었다(도 18c 및 도 24b 및 도 24e). 증가된 CAR T 세포의 지속성은 더 높은 백분율의 TCM 및 인터루킨-7 수용체(IL7R)+ CAR T 세포 카운트와 연관되었으며(도 24c 및 도 24d), 1928z 돌연변이체에서 지연된 T 세포 분화의 발견을 강화한다. 레트로바이러스로 조작된 T 세포와 유사하게, TRAC-XX3 T 세포는 TRAC-1928z 및 TRAC-1XX 세포와 대조적으로 시간이 지남에 따라 그 세포용해 잠재력을 상실하였다(도 24f). 고갈 마커의 발현은 TRAC-1928z와 비교하여 1928z 돌연변이체에서 감소하였고, TRAC-1928z의 기능적 고갈은 처리된 마우스로부터의 CAR 단리 및 Nalm6 세포에 대한 생체외 재-노출 후 감소된 TH1 사이토카인 분비 및 GrB/CD107a 발현에 의해 확인되었다(도 18d 및 도 25). TRAC-1XX가 높은 세포용해 기능 및 다수의 사이토카인의 동시생산 능력을 유지하고 있지만, TRAC-1928z는 고갈 마커의 증가된 발현과 연관된 TH1 사이토카인을 분비하는 능력의 점진적인 소실을 나타내었다.
2가지 상이한 T 세포 용량(5×105 및 1×105 CAR+ T 세포)의 투여 후의 장기간의 후속 연구는 명백하게 TRAC-1XX의 치료적 우월성을 보여주었다. 종양-연관 사망이 60일 이내(5×105 CAR+ T 세포로 처리) 또는 40일 이내(1×105 CAR+ T 세포로 처리)에 일어났지만, TRAC-1XX로 처리된 마우스는 모두 관찰 기간 내내 완전한 종양 근절 및 향상된 생존을 보였다(도 18b 및 도 29).
매우 기능적인 장기-생존 메모리 세포로 분화시키는 1XX의 향상된 능력은 분류된 나이브 T 세포가 생체내 치료법을 위해 사용되었을 때 추가로 설명되었다. TRAC-1XX는 시간이 지남에 따라 TCM 및 IL7R-발현 세포의 개체군에서의 증가를 보였고(도 26a 내지 도 26c), 매우 강력한 CAR T 세포의 향상된 지속성과 연관되었다. 중요하게는, TRAC-1XX CAR은 효과적인 리콜 반응을 일으켜서 종양 재시도 후에 완전한 종양 조절을 달성할 수 있었다(도 18e). 지속적인 1XX CAR T 세포는 증가된 수의 TCM, TEFF, 및 IL7R+ CAR을 포함하였다(도 18f 및 도 18g 및 도 26d 내지 도 26f). 이와 대조적으로, TRAC-1928z는 보다 신속하게 고갈된 표현형을 획득하였고(도 3h 및 확장된 데이터 도 7g), 메모리 형성 없이 감소된 CAR T 세포 지속성 및 종양 재시도 조절의 불능을 수반하였다.
상기 상이한 표현형적 및 기능적 패턴을 추가로 특징분석하기 위하여, 1928z, 1XX, 및 XX3의 게놈-범위의 전사 프로필을 TRAC-편집된 나이브 T 세포의 CD19 항원 자극 후에 비교하였다. 주요 성분 분석은 그 CD3z 돌연변이에 의존하는 CAR T 세포의 별개의 클러스터를 나타내었다(도 27a). 기능적 연구와 일치하게, 주된 차이는 T 세포 기능, 분화, 및 고갈과 연관된 전사체 프로필에서 나왔다. 유전자 세트 농축 분석(GSEA)은 XX3 및 1XX 모두에 비해 1928z에서 나이브/메모리-연관 유전자의 하향조절 및 T 세포 활성화- 및 이펙터-연관 유전자의 농축을 보였다(도 19a 및 도 27b). 예상한 것과 같이, 1928z CAR T 세포는 T 세포 분화, 고갈, 및 아폽토시스 유전자 발현 프로필의 가장 큰 상향조절을 보였다(도 19b 및 도 19c 및 도 28a). 유전자 온콜로지 및 GSEA 분석은 XX3과 비교하여 1928z에서, 그리고 XX3과 비교하여 1XX에서 염증, 사이토카인, 및 케모카인 활성과 연관된 유전자 세트의 현저한 상향조절을 확인하였다(도 19c 및 도 28b 및 도 28c). 상기 유전자 세트는 또한 그 정도는 덜하지만 1928z 및 XX3에 대한 1XX의 중간체 상태와 일치하게 1XX에 비해 1928z에서 농축되었다(도 19b 및 도 19c 및 도 28b 및 도 28c). TRAC-편집된 CAR T 세포와 비유전자적으로 변형된 CD8+ T 세포 서브세트의 이펙터 및 메모리 특성을 비교하기 위하여, 그 특징적 전사 프로필은 이전에 결정되어 있기 때문에, 나이브 (TN), 줄기 세포 메모리(TSCM 2 이상), 및 TEFF를 휴지기 말초 혈액 단핵 세포로부터 분류하였다21(도 27c). 이펙터 대 나이브/메모리 T 세포 운명과 연관된 차등적으로 발현된 유전자(조정된 P < 0.05)는 이들 CAR 구조체를 구별하였다(도 19b). 흥미롭게는, TRAC-1XX 세포는 TRAC-1928z 및 TRAC-XX3 T 세포보다 TSCM과 더 유사성을 나타내었으며, 전자는 다시 각각 TEFF 및 TN 세포와 더 유사하였다(도 19b).
T-bet (및 T-bet:Eomes 비), PR 도메인 징크 핑거 단백질 1(PRDM1), 및 DNA-결합 단백질 억제제 ID-2(참고문헌 22-24)와 같은 이펙터 분화의 핵심 조절자의 상향조절과 나이브/메모리-연관 마커(예를 들면, CCR7, CD27, 및 IL7R21)의 동시 소실은 1928z에서 보여지는 이펙터의 신속한 획득을 제공한다(도 19b 및 도 28c 및 도 28d). 이와 대조적으로, 1XX에서의 조율된 신호전달 강도는 감속화된 T 세포 분화 및 전사 인자 7(TCF7), B-세포 림프종 6 단백질(BCL6), 림프구 향상자-결합 인자 1(LEF1), 및 크루펠-유사 인자 2(KLF2)23-26와 같은 중요한 메모리-연관 전사 인자의 보존된 발현을 야기하였고(도 19b), CCR7, CD62L, ITGB7, 및 S1PR1(참고문헌 27,28)와 같은 KLF2-조절성 유전자의 상향조절로 반영되었다(도 19b 및 도 28d). 1XX T 세포만이 덜-분화된 T 세포 상태 쪽으로 부분적으로 이동함을 보였지만, XX3은 높은 레벨의 나이브/메모리-연관 유전자와 함께 T 세포 분화 및 이펙터 기능을 위한 마스터 전사 인자들을 암호화하는 유전자의 전신적 저해를 나타내었다(도 19b 내지 도 19d). 이러한 발견은 상이한 T 세포 운명을 부여하는 ITAM 투여량 및 위치의 결정적인 역할을 강조한다. 이들은 세포의 운명을 신호전달의 강도의 조절 하에 두는 메모리 형성의 모델을 추가로 뒷받침한다24,29.
최근의 보고는 덜-분화된 T 세포 서브세트 및 메모리 특징이 입양적으로 전달된 T 세포의 증가된 항종양 효능 및 지속성과 연관되어 있다는 개념을 뒷받침한다30,31. 상기 결과는 T 세포 분화 상태가 CAR T 세포의 CD3z 사슬에서의 돌연변이에 의해 내재적으로 조절될 수 있음을 나타내는 이러한 발견을 확장한다. CD28 및 CD3z 신호전달 도메인은 CAR 내에서 1:1 화학양론으로 제약되어서2, 그 자연적 시공간적 상관관계와 상이하다11. CD3ζ 돌연변이에 대한 이전의 연구는 생체내에서 알아낸 중대한 결과와 대조적으로 주된 효과를 알아내지 않은 시험관내 비교에 국한되었다32-34(도 16). 상기 생체내 연구는 T 세포 분화 및 이펙터 기능 획득의 균형이 변함없는 게놈 좌위로부터 발현되는 상이한 신호전달 모티프의 비교에 기반하여 CAR T 세포의 치료 효능을 최적화하기 위해 필수적임을 보였다(도 18 및 도 19). 본 실험 세팅은 정량적 CAR 및 TCR 비교를 위해 최적인 것으로 여겨졌다19.
요약하면, 1XX는 메모리 프로그램의 차단 없이 강한 이펙터 기능을 유도하였고, 스트레스 테스트 조건에서 1928ζ를 능가하였다. XX3를 통해 추가적으로 T 세포 활성화 잠재력을 감소시키면 매우 지속되는 T 세포와 이펙터 기능의 불충분한 유발로 인한 보통 정도의 항종양 활성을 갖게 된다. 현저하게는, 1XX에서의 변형된 ITAM 외형은 매우 기능적인 CAR의 지속성을 지지하여서, 장기-생존 메모리 세포의 복제 능력 및 효과적인 항종양 기능의 획득의 균형을 맞춘다. 1XX CAR 디자인을 이용하는 임상 연구를 위한 제조는 진행중이다.
방법
세포주 및 배양 조건. 이전에 개시된 것과 같이 반딧불이 루시퍼라아제(FFLuc)-녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하도록 Nalm6 세포를 형질도입하였고, 인간 CD19를 발현하도록 쥐과 흉선종 EL4 세포 및 NIH/3T3 세포를 형질도입하였다8,20. MycoAlert 마이코플라즈마 검출 키트(Lonza)를 이용하여 세포를 마이코플라즈마에 대해 규칙적으로 테스트하였고, 음성으로 나타났다.
인간 T 세포의 단리 및 확장. 익명의 건강한 공여자 유래의 버피 코트(buffy coat)를 뉴욕 혈액 센터(기관 윤리 위원회 면제됨)로부터 구입하였고, 말초 혈액을 건강한 자원자로부터 수득하였다. 모든 혈액 샘플은 요구되는 윤리적 및 안전성 절차에 따라 취급하였다. 말초 혈액 단핵 세포는 밀도 구배 원심분리에 의해 단리되었고, 레트로바이러스 벡터로 수행된 실험을 위해 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)(2 ㎍ ㎖-1)으로 활성화되었으며, 또는 T 세포는 Pan T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec)를 이용해 정제되었고, 이전에 개시된 것과 같이 CD3/CD28 T 세포 활성자 다이나비드(Invitrogen)로 자극되었으며19, 유전자 표적화 실험을 위하여 5% 인간 혈청(Gemini Bio-Products), 5 ng ㎖-1 인터루킨-7(IL7) 및 5 ng ㎖-1 IL15(BioLegend)로 보충된 X-VIVO 15 혈청-부재 조혈 세포 배지(Lonza)에서 배양하였다. 상기 배지는 매 2일마다 교환하였고, 세포는 ㎖ 당 106 세포로 플레이팅하였다.
일부 실험의 경우, 나이브(TCR+CD62L+CCR7+CD45RA+CD95-), TSCM(TCR+CD62L+CCR7+CD45RA+CD95+), 및 TEFF 세포(TCR+CD62L-CCR7-CD45RA+CD95+)를 유세포 분석에 의해 분류하였다. 이후, 상기 CAR cDNA를 분류된 나이브 T 세포의 TRAC 좌위로 표적화한 후, 이후에 개시된 것과 같이 시험관내 배양 및 TCR-음성 정제를 수행하였다. 유전자 표적화가 수행된지 수일 후에, 추가적인 분석을 위해 T 세포를 3T3-CD19로 24시간 동안 자극하거나, 종양-보유 마우스 내로 주사하였다.
T 세포의 유전적 변형. 이전에 개시된 것과 같이 SFGγ 레트로바이러스 벡터를 암호화하는 플라스미드35를 표준 분자 생물학 기술을 이용해 제조하였다20. 형질도입된 gpg29 섬유아세포(H29)로부터 유래된 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G(VSV-G) 위형화된(pseudotyped) 레트로바이러스 상등액을 사용하여 안정한 레트로바이러스 생산 세포주를 구축하였다36.
SFG-1928ζ의 합성은 이전에 개시되어 있다2,20,37; 이것은 인간 CD19에 특이적인 단일-사슬 가변 단편을 포함하며, 이에 앞서 CD8a 리더 펩티드가 있고, 그 뒤에 CD28 힌지-막통과-세포내 영역, 및 절단된 낮은 친화도의 신경 성장 인자 수용체(LNGFR)를 유도하기 위하여 P2A 서열에 결합된 CD3ζ 또는 ITAM-돌연변이/결실 CD3ζ 세포내 도메인이 있다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 1928ζ 돌연변이체를 구축하였다. 상기 CD3ζ 사슬의 ITAM 내에서 티로신으로부터 페닐알라닌으로의 점 돌연변이를 도입하여 1개 또는 2개의 기능적 ITAM을 갖는 1928ζ CAR을 생성하였다. 결실 돌연변이의 경우, 막-근위부 ITAM 서열(ITAM1)이 유지되거나 막-원위부 ITAM(ITAM3) 서열로 치환되었고, 나머지 CD3ζ 도메인은 결실되었다. T 세포 활성화 개시 48시간 후, 이전에 개시된 것과 같이 T 세포를 RetroNectin-코팅된 플레이트(Takara) 상에서 원심분리에 의해 레트로바이러스 상등액으로 형질도입하였다. 형질도입 효율은 4일 후에 유세포 분석에 의해 결정하였고, CAR은 종양-보유 마우스 내로 주사되거나, 시험관내 실험을 위해 사용되었다.
이전에 개시된 것과 같이 유전자 표적화 실험을 수행하였다19. 간략하게, TRA 유전자의 불변 사슬의 첫번째 엑손을 표적화하는 변형된 가이드 RNA(gRNA)19 및 Cas9 메신저 RNA(mRNA)를 TriLink BioTechnologies에 의해 합성하였다. pAAV-TRAC-1928ζ를 pAAV-GFP 백본(Cell Biolabs)에 기반하여 클로닝하였다. 상기 pAAV-TRAC-1928ζ는 1.9 kb의 상기 gRNA 표적화 서열의 옆에 있는 게놈 TRAC, TRAC의 첫번째 엑손과 프레임-내(in-frame)인 자가-절단성 P2A 펩티드, 이어서 앞서 개시된 것과 같은 1928ζ 또는 1928ζ 돌연변이체 CAR을 함유한다. 상기 CAR cDNA 뒤에는 소 성장 호르몬 polyA 신호가 있다.
CD3/CD28 비드는 T 세포 활성화 개시 48시간 후에 자기력으로 제거되었다. T 세포는 AgilePulse MAX 시스템(BTX)을 이용한 Cas9 mRNA 및 gRNA의 전기전달(electrotransfer)에 의해 형질주입되었고, 재조합 AAV6 공여자 벡터(SignaGen Laboratories에 의해 제조됨)를 배지에 첨가한 후, 이전에 개시된 것과 같이 전기천공을 행하였다19. TCR-음성 T 세포를 수득하기 위하여, 자성의 바이오틴-항-TCRα β, 항-바이오틴 마이크로비드, 및 LS 컬럼(Miltenyi Biotec)을 이용하여 TCR-양성 T 세포를 배지로부터 제거하였다.
세포독성 분석법. 표준 51Cr 방출 분석법 및 루시퍼라아제-기반 분석법에 의해 CAR로 형질도입된 T 세포의 세포독성을 결정하였다. 51Cr 방출 분석법의 경우, 이전에 개시된 것과 같이 CD19를 발현하는 EL4를 표적 세포로 사용하였다38. 루시퍼라아제-기반 분석법의 경우, Nalm6-발현 FFLuc-GFP가 표적 세포로 기능하였다. 이펙터 및 종양 표적 세포를 Nalm6 배지에서 웰 당 100 ㎕의 총 부피에서 5×104 표적 세포로 검정-벽의 96-웰 플레이트를 이용해 표시된 이펙터/표적 비로 3중으로 공동배양하였다. 표적 세포를 단독으로 동일한 세포 밀도로 플레이팅하여 최대 루시퍼라아제 발현(상대 광 단위(RLU))을 결정하였다; 18시간 후, 100 ㎕ 루시퍼라아제 기질(Bright-Glo; Promega)을 각각의 웰에 직접 첨가하였다. 방출된 광을 발광 플레이트 판독기에서 검출하였다. 용해는 (1 - (RLUsample) / (RLUmax))×100으로 결정하였다.
항원 자극 및 증식 분석법. 형질도입 4일 후, CAR T 세포를 24-웰 조직 배양 플레이트에서 ㎖ 당 106 CAR+ 세포로 조사된 융합성(confluent) CD19+ NIH/3T3와 공동배양하였다. 신선한 배지에서 동일한 자극을 매주 수행하였다. 총 세포를 계수하였고, CAR 발현을 유세포 분석에 의해 매주 결정하였다. 이어서, CAR T 세포를 동일한 조건 하에 재자극하였다.
마우스 전신 종양 모델. 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터(MSKCC) 기관 동물 돌봄 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜 하에 6 내지 12 주령의 NOD/SCID/IL-2Rγ 빈(null) 수컷 마우스(The Jackson Laboratory)를 사용하였다. 모든 해당 동물 사용 지침 및 윤리 규정을 준수하였다. 꼬리 정맥 주사에 의해 0.5×106 FFLuc-GFP NALM6 세포로 마우스를 접종하였고, 이어서 4일 후에 5×104, 1×105, 또는 5×105 CAR T 세포를 주사하였다. 표시된 시점에서 7-10일의 간격으로 0.5×106, 1×106 또는 2×106 FFLuc-GFP Nalm6 세포의 정맥내 투여에 의해 종양 재시도 실험을 수행하였다. Nalm6은 매우 균일한 종양 부하를 생성하였고, 처리 전에 어떠한 마우스도 배제되지 않았다. 무작위 또는 맹검 방법은 사용하지 않았다. 이미징 데이터세트를 획득하기 위하여 리빙 이미지 소프트웨어(PerkinElmer)를 갖는 IVIS 이미징 시스템(PerkinElmer)을 이용하여 생물발광 이미징을 수행하였다. 이전에 개시된 것과 같이 종양 부하를 평가하였다39.
RNA 추출, 전사체 서열분석 및 RNA-seq 분석. 분류된 나이브 T 세포의 유전자 표적화 7일 후에 수행하였으며, 조사된 3T3-CD19로 24시간 동안 TRAC-1928ζ, TRAC-XX3, 및 TRAC-1XX을 자극한 후, CD8+ 세포를 자기력으로 선택하였다(Miltenyi Biotec). 세척된 T 세포를 250 ㎕ PBS 내에 재현탁하였고, 750 ㎕ TRIzol LS 시약(Thermo Fisher Scientific) 중에 두었다. 제조사에 의해 제공된 설명서에 따라 RNeasy 미니 키트(QIAGEN)를 이용하여 RNA를 추출하였다. RiboGreen RNA 정량화 및 Agilent Bioanalyzer를 이용한 품질 관리 후, 500 ng의 총 RNA를 제조사(TruSeq 표준 mRNA LT 키트; Illumina)에 의해 제공된 설명서에 따라 8 사이클의 PCR로 polyA 선택 및 TruSeq RNA 라이브러리 제조를 행하였다. 샘플에 바코드를 붙였고, HiSeq 3000/4000 SBS 키트(Illumina)를 이용하여 50 염기쌍(bp)/50 bp 페어드-엔드 구동에서 HiSeq4000 (Illumina)으로 구동하였다. 샘플 당 평균 30.6×106의 페어드 판독물(paired read)이 생성되었다. 기껏해야, 리보솜 판독물은 생성된 총 판독물의 4.69%를 나타내었다; mRNA 염기의 백분율은 평균 69.3%였다.
출력된 FASTQ 데이터를 STAR RNA-seq 얼라이너(aligner)(버전 2.5.0a; 투-패스(two-pass) 방법40을 이용해 표적 게놈에 맵핑(mapping)하여, 스플라이스 접합부에 걸쳐 판독물을 분석하였다. 첫번째 맵핑 패스는 Ensemble(https://www.ensembl.org/index.html)로부터의 공지된 주석화(annotated) 접합부의 목록을 이용하였다. 이후, 첫번째 패스 동안에 발견된 접합부를 공지된 접합부에 부가하고, RemoveNoncanonical 플래그(flag)를 이용하여 두번째 맵핑 패스를 행한다. 맵핑 후, 출력된 SAM 파일(SAMtools, 버전 0.1.19)을 PICARD 도구(버전 1.124; https://broadinstitute.github.io/picard/)를 이용해 처리하여 판독물 군 및 AddOrReplaceReadGroups에 추가하였고, 이를 통해 다시 상기 파일을 분류하고 압축된 BAM 포맷으로 전환하였다. 이후, HTSeq(버전 0.5.3; https://htseq.readthedocs.io/en/release_0.10.0/) 및 몇가지 가능한 유전자 모델 데이터베이스 중 하나를 이용하여 상기 맵팽된 판독물로부터 발현 카운트 매트릭스를 컴퓨터화하였다. R(버전 3.2.0) 패키지 DESeq(https://www.huber.embl.de/users/anders/DESeq/)을 사용하여 전체 데이터세트를 표준화하였고, 샘플 그룹 사이에 차등 발현을 분석하였다.
T 세포 서브세트(TN, TCM, TSCM, TEFF 세포) 사이에 차등적으로 발현된 유전자를 가티노니(Gattinoni) 등21으로부터 검색하였다. Broad Institute 분자 시그니처 데이터베이스(http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/)로부터의 큐레이트화(curated) 경로 유전자 세트에 대한 log2(배수 변화)를 이용하여 생성된 미리-등급화된 파일을 이용하여 GSEA를 수행하였다. 설명된 유전자 시그니처는 면역학적 시그니처 C7, Reactome, KEGG 및 유전자 온콜로지(Biological Process) 유전자 세트로부터 유래된다. 고갈 대 나이브/메모리 CD8 T 세포의 GSEA를 위해, 그리고 메모리 및 나이브 세포에 비해 고갈된 CD8 T 세포(림프구성 맥락수막염 바이러스 감염 30일 후)에서 상향조절된 200개 유전자의 시그니처를 큐레이트하기 위해 GSE41867을 사용하였다. 조정된 P 값 < 0.05 및 절대 log2(배수 변화) > 1로 실험 조건들 사이에 차등적으로 발현된 것으로 확인된 유전자들은 R 패키지 enrichR(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)을 이용한 유전자 온콜로지 분석을 위해 사용하였다.
항체 및 세포내 염색. 다음의 형광단(fluorophore)-접합 항체를 사용하였다. BD Biosciences 제조: APC-Cy7 마우스 항-인간 CD8; APC-Cy7 마우스 항-인간 CD45; BUV395 마우스 항-인간 CD4; PE 마우스 항-인간 CD4; BB515 마우스 항-인간 CD4; BV421 마우스 항-인간 CD62L; BV650 마우스 항-인간 CD45RA; BV421 마우스 항-인간 CD45RA; BV480 마우스 항-인간 CD279(PD-1); BV650 마우스 항-인간 CD279(PD-1); BUV737 마우스 항-인간 CD19; BV421 마우스 항-인간 TIM3(CD366); BB515 마우스 항-인간 CD95; APC-H7 마우스 항-인간 CD27; PE 마우스 항-인간 CD271(LNGFR). BioLegend 제조: APC 항-인간 CD8a; APC/Cy7 항-인간 CD62L; FITC 항-인간 CD45RA; 브릴리언트 바이올렛(Brilliant Violet) 785 항-인간 CD366(Tim-3); PE 항-인간 CD127(IL-7Rα); 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 항-인간 CD127(IL-7Rα); PerCP/Cyanine5.5 항-인간 CD197(CCR7); 브릴리언트 바이올렛 650 항-인간 CD28. Invitrogen 제조: CD8a 모노클론 항체(RPA-T8), PE-Cyanine7; CD223(LAG-3) 모노클론 항체(3DS223H) PerCP-eFluor 710; CD223 (LAG-3) 모노클론 항체(3DS223H), APC; InvitrogenTCR 알파/베타 모노클론 항체(IP26), PE-Cyanine7. Miltenyi Biotec 제조: 인간 모노클론 항-TCRα/β-PE.7-AAD(BD Biosciences) 및 LIVE/DEAD 고정가능 자색 죽은 세포 염색 키트(Invitrogen)를 생존력 염료로 사용하였다.
CAR 염색을 위하여, Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-마우스 IgG, F(ab')2 단편 특이적 항체를 사용하였다(Jackson ImmunoResearch). 세포 카운팅을 위하여, 제조사의 설명서에 따라 CountBright Absolute 카운팅 비드를 첨가하였다(Invitrogen). 생체내 실험을 위하여, FcR 차단 시약, 마우스(Miltenyi Biotec)를 이용하여 Fc 수용체를 차단하였다.
세포내 사이토카인 분비 분석법을 위하여, T 세포를 골지 플러그(Golgi Plug) 단백질 전달 억제제(BD Biosciences)의 존재 하에 3T3-CD19 또는 Nalm6과 마지막 4시간 동안 공동배양하였다. CD107a 염색을 위하여, 브릴리언트 바이올렛 650 항-인간 CD107a(LAMP-1) 항체(BioLegend)를 상기 공동배양물에 첨가하였다. 생체외 사이토카인 분석을 위하여, CAR T 세포를 처리된 마우스의 골수 및 비장으로부터 수득하였고, 마우스 세포 고갈 키트(Miltenyi Biotec)를 이용해 정제하였다. 샘플을 생물학적 삼중물(triplicate)(d16)에서 처리하거나 모았고(1928ζ-처리된 마우스에서의 낮은 세포 수로 인함), 기술적 삼중물(d36)을 수행하였다. 양성 대조군으로서 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)/이오노마이신(Invitrogen)을 이용한 자극을 수행하였다. 이어서, T 세포를 세척하였고, 세포 표면 마커에 대해 염색하였고, Cytofix/Cytoperm 고정/투과 솔루션 키트(BD Biosciences)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 고정 및 투과하였다. BV421 래트 항-인간 IL2, BV650 마우스 항-인간 TNF, BUV395 마우스 항-인간 TNF, BUV395 마우스 항-인간 IFN-γ, 또는 FITC 마우스 항-인간 IFN-γ(모두 BD Biosciences), 및 APC 또는 PE 그랜자임 B 단일클론 항체(GB12, 둘 모두 Invitrogen)를 이용하여 세포내 사이토카인 염색을 수행하였다.
LSR II 또는 LSRFortessa 기기(BD Biosciences)에서 유세포 분석을 수행하였고, 세포 분류를 위해 FACSAria 분류기(BD Biosciences)를 사용하였다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어 v.10.1(FlowJo LLC)을 이용해 분석하였다.
통계적 분석. 모든 통계적 분석은 Prism 7(GraphPad) 소프트웨어를 이용해 수행하였다. 샘플 크기를 미리 결정하기 위한 통계적 방법은 사용하지 않았다. 2개 군 사이의 통계적 비교는 언페어드 데이터의 경우 양측-꼬리 파라미터 또는 비-파라미터(만-휘트니 U-테스트) t-테스트에 의해 결정하였고, 매치된 샘플의 경우 양측-꼬리 페어드 스튜던트 t-테스트에 의해 결정하였다. 생체내 실험의 경우, 전체 생존율은 카플란-마이어 곡선에 의해 도시되었고, 로그-순위 테스트를 사용하여 군들 사이의 생존 차이를 비교하였다. P 값 <0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 각각의 도면에 대해 사용된 통계적 테스트는 대응하는 도면의 범례에 개시되어 있다.
보고서 요약. 연구 디자인에 대한 추가적인 정보는 본 문헌에 연결된 네이처 리서치 보고서 요약에서 이용가능하다.
데이터 이용가능성
RNA-seq 데이터는 유전자 발현 옴니버스에 기탁되었고, 접근 번호 GSE121226 하에 이용가능하다. 원고 내의 도면에 대한 미가공 데이터는 해당 저자에게 요청시에 이용가능하게 될 것이다.
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본 개시된 주제의 구현예
전술한 설명으로부터, 다양한 용법 및 조건에 채택되도록 변경 및 변형이 본 개시된 주제에 행해질 수 있음이 명확할 것이다. 이러한 구현예는 또한 다음의 청구항의 범위 이내이다.
본 명세서에서 변수의 임의의 정의에서 요소들의 목록을 인용하는 것은 나열된 요소들의 임의의 단일 요소 또는 조합(또는 서브-조합)으로서의 상기 변수의 정의를 포함한다. 본 명세서에서 구현예를 인용하는 것은 임의의 단일 구현예 또는 임의의 다른 구현예 또는 그의 일부와의 조합으로서의 상기 구현예를 포함한다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 공개문헌은 각각의 독립적 특허 및 공개문헌이 인용에 의해 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
<110> MEMORIAL SLOAN-KETTERING CANCER CENTER <120> ENHANCED CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND USES THEREOF <130> 2020-FPA-0135 <140> PCT/US2018/068134 <141> 2018-12-31 <150> 62/612,031 <151> 2017-12-29 <160> 119 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 345 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln His His Leu Trp Ile Leu Leu Leu Cys Leu Gln Thr Trp 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Lys Asp Ser Glu Ile Phe Thr Val Asn Gly Ile 20 25 30 Leu Gly Glu Ser Val Thr Phe Pro Val Asn Ile Gln Glu Pro Arg Gln 35 40 45 Val Lys Ile Ile Ala Trp Thr Ser Lys Thr Ser Val Ala Tyr Val Thr 50 55 60 Pro Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Val Thr Val Thr His Arg Asn 65 70 75 80 Tyr Tyr Glu Arg Ile His Ala Leu Gly Pro Asn Tyr Asn Leu Val Ile 85 90 95 Ser Asp Leu Arg Met Glu Asp Ala Gly Asp Tyr Lys Ala Asp Ile Asn 100 105 110 Thr Gln Ala Asp Pro Tyr Thr Thr Thr Lys Arg Tyr Asn Leu Gln Ile 115 120 125 Tyr Arg Arg Leu Gly Lys Pro Lys Ile Thr Gln Ser Leu Met Ala Ser 130 135 140 Val Asn Ser Thr Cys Asn Val Thr Leu Thr Cys Ser Val Glu Lys Glu 145 150 155 160 Glu Lys Asn Val Thr Tyr Asn Trp Ser Pro Leu Gly Glu Glu Gly Asn 165 170 175 Val Leu Gln Ile Phe Gln Thr Pro Glu Asp Gln Glu Leu Thr Tyr Thr 180 185 190 Cys Thr Ala Gln Asn Pro Val Ser Asn Asn Ser Asp Ser Ile Ser Ala 195 200 205 Arg Gln Leu Cys Ala Asp Ile Ala Met Gly Phe Arg Thr His His Thr 210 215 220 Gly Leu Leu Ser Val Leu Ala Met Phe Phe Leu Leu Val Leu Ile Leu 225 230 235 240 Ser Ser Val Phe Leu Phe Arg Leu Phe Lys Arg Arg Gln Gly Arg Ile 245 250 255 Phe Pro Glu Gly Ser Cys Leu Asn Thr Phe Thr Lys Asn Pro Tyr Ala 260 265 270 Ala Ser Lys Lys Thr Ile Tyr Thr Tyr Ile Met Ala Ser Arg Asn Thr 275 280 285 Gln Pro Ala Glu Ser Arg Ile Tyr Asp Glu Ile Leu Gln Ser Lys Val 290 295 300 Leu Pro Ser Lys Glu Glu Pro Val Asn Thr Val Tyr Ser Glu Val Gln 305 310 315 320 Phe Ala Asp Lys Met Gly Lys Ala Ser Thr Gln Asp Ser Lys Pro Pro 325 330 335 Gly Thr Ser Ser Tyr Glu Ile Val Ile 340 345 <210> 2 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ttgctgagcg tgctggctat gttctttctg cttgttctca ttctgtcttc agtgtttttg 60 ttccgtttgt tcaag 75 <210> 3 <211> 583 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Glu Ser Lys Gly Ala Ser Ser Cys Arg Leu Leu Phe Cys Leu Leu 1 5 10 15 Ile Ser Ala Thr Val Phe Arg Pro Gly Leu Gly Trp Tyr Thr Val Asn 20 25 30 Ser Ala Tyr Gly Asp Thr Ile Ile Ile Pro Cys Arg Leu Asp Val Pro 35 40 45 Gln Asn Leu Met Phe Gly Lys Trp Lys Tyr Glu Lys Pro Asp Gly Ser 50 55 60 Pro Val Phe Ile Ala Phe Arg Ser Ser Thr Lys Lys Ser Val Gln Tyr 65 70 75 80 Asp Asp Val Pro Glu Tyr Lys Asp Arg Leu Asn Leu Ser Glu Asn Tyr 85 90 95 Thr Leu Ser Ile Ser Asn Ala Arg Ile Ser Asp Glu Lys Arg Phe Val 100 105 110 Cys Met Leu Val Thr Glu Asp Asn Val Phe Glu Ala Pro Thr Ile Val 115 120 125 Lys Val Phe Lys Gln Pro Ser Lys Pro Glu Ile Val Ser Lys Ala Leu 130 135 140 Phe Leu Glu Thr Glu Gln Leu Lys Lys Leu Gly Asp Cys Ile Ser Glu 145 150 155 160 Asp Ser Tyr Pro Asp Gly Asn Ile Thr Trp Tyr Arg Asn Gly Lys Val 165 170 175 Leu His Pro Leu Glu Gly Ala Val Val Ile Ile Phe Lys Lys Glu Met 180 185 190 Asp Pro Val Thr Gln Leu Tyr Thr Met Thr Ser Thr Leu Glu Tyr Lys 195 200 205 Thr Thr Lys Ala Asp Ile Gln Met Pro Phe Thr Cys Ser Val Thr Tyr 210 215 220 Tyr Gly Pro Ser Gly Gln Lys Thr Ile His Ser Glu Gln Ala Val Phe 225 230 235 240 Asp Ile Tyr Tyr Pro Thr Glu Gln Val Thr Ile Gln Val Leu Pro Pro 245 250 255 Lys Asn Ala Ile Lys Glu Gly Asp Asn Ile Thr Leu Lys Cys Leu Gly 260 265 270 Asn Gly Asn Pro Pro Pro Glu Glu Phe Leu Phe Tyr Leu Pro Gly Gln 275 280 285 Pro Glu Gly Ile Arg Ser Ser Asn Thr Tyr Thr Leu Thr Asp Val Arg 290 295 300 Arg Asn Ala Thr Gly Asp Tyr Lys Cys Ser Leu Ile Asp Lys Lys Ser 305 310 315 320 Met Ile Ala Ser Thr Ala Ile Thr Val His Tyr Leu Asp Leu Ser Leu 325 330 335 Asn Pro Ser Gly Glu Val Thr Arg Gln Ile Gly Asp Ala Leu Pro Val 340 345 350 Ser Cys Thr Ile Ser Ala Ser Arg Asn Ala Thr Val Val Trp Met Lys 355 360 365 Asp Asn Ile Arg Leu Arg Ser Ser Pro Ser Phe Ser Ser Leu His Tyr 370 375 380 Gln Asp Ala Gly Asn Tyr Val Cys Glu Thr Ala Leu Gln Glu Val Glu 385 390 395 400 Gly Leu Lys Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Ile Val Glu Gly Lys Pro 405 410 415 Gln Ile Lys Met Thr Lys Lys Thr Asp Pro Ser Gly Leu Ser Lys Thr 420 425 430 Ile Ile Cys His Val Glu Gly Phe Pro Lys Pro Ala Ile Gln Trp Thr 435 440 445 Ile Thr Gly Ser Gly Ser Val Ile Asn Gln Thr Glu Glu Ser Pro Tyr 450 455 460 Ile Asn Gly Arg Tyr Tyr Ser Lys Ile Ile Ile Ser Pro Glu Glu Asn 465 470 475 480 Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Glu Asn Gln Leu Glu Arg Thr Val Asn 485 490 495 Ser Leu Asn Val Ser Ala Ile Ser Ile Pro Glu His Asp Glu Ala Asp 500 505 510 Glu Ile Ser Asp Glu Asn Arg Glu Lys Val Asn Asp Gln Ala Lys Leu 515 520 525 Ile Val Gly Ile Val Val Gly Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly 530 535 540 Val Val Tyr Trp Leu Tyr Met Lys Lys Ser Lys Thr Ala Ser Lys His 545 550 555 560 Val Asn Lys Asp Leu Gly Asn Met Glu Glu Asn Lys Lys Leu Glu Glu 565 570 575 Asn Asn His Lys Thr Glu Ala 580 <210> 4 <211> 78 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ctaattgtgg gaatcgttgt tggtctcctc cttgctgccc ttgttgctgg tgtcgtctac 60 tggctgtaca tgaagaag 78 <210> 5 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr 20 25 30 Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser 35 40 45 Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala 50 55 60 Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala 65 70 75 80 Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp 85 90 95 Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe 115 120 125 Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg 130 135 140 Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg 145 150 155 160 Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly 165 170 175 Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly 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<213> Homo sapiens <400> 21 gacacgggac tctacatctg caaggtggag ctcatgtacc caccgccata ctacctgggc 60 ataggcaacg gaacccagat ttatgtaatt gatccagaac cgtgcccaga ttctgac 117 <210> 22 <211> 117 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 ggggaatcag tgactgtcac tcgagatctt gagggcacct acctctgtcg ggccaggagc 60 actcaagggg aggtcacccg caaggtgacc gtgaatgtgc tctccccccg gtatgag 117 <210> 23 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 1 5 10 15 Asp Val Leu Asp Lys Arg 20 <210> 24 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 60 aagaga 66 <210> 25 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Gln Asn Gln Leu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Phe 1 5 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 caggaaggcc tgttcaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggcctt cagtgagatt 60 gggatgaaa 69 <210> 31 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 1 5 10 15 Asp Ala Leu His Met Gln 20 <210> 32 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 60 atgcag 66 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe 1 5 10 15 Asp Ala Leu His Met Gln 20 <210> 34 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 cacgatggcc ttttccaggg gctcagtaca gccaccaagg acaccttcga cgcccttcac 60 atgcag 66 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Lys Arg Arg Gly Arg 1 5 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 aagagacgtg gccgg 15 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Lys Pro Arg Arg Lys 1 5 <210> 38 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 aagccgagaa ggaag 15 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 1 5 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 aaaggcgagc gccggagggg caag 24 <210> 41 <211> 485 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 20 25 30 Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 35 40 45 Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly 65 70 75 80 Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 100 105 110 Phe Cys Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val 165 170 175 Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val 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gaccattagt 360 tcggtagtag atttctactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 ggtggaggtg gatcaggtgg aggtggatct ggtggaggtg gatctgacat tgagctcacc 480 cagtctccaa aattcatgtc cacatcagta ggagacaggg tcagcgtcac ctgcaaggcc 540 agtcagaatg tgggtactaa tgtagcctgg tatcaacaga aaccaggaca atctcctaaa 600 ccactgattt actcggcaac ctaccggaac agtggagtcc ctgatcgctt cacaggcagt 660 ggatctggga cagatttcac tctcaccatc actaacgtgc agtctaaaga cttggcagac 720 tatttctgtc aacaatataa caggtatccg tacacgtccg gaggggggac caagctggag 780 atcaaacggg cggccgcaat tgaagttatg tatcctcctc cttacctaga caatgagaag 840 agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc 900 ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 960 ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 1020 cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1080 ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1140 gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1200 cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1260 aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1320 gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1380 ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1440 gccctgcccc ctcgctaa 1458 <210> 43 <211> 485 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 20 25 30 Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 35 40 45 Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly 65 70 75 80 Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 100 105 110 Phe Cys Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val 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caatctagga 1200 cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctta a 1251 <210> 49 <211> 485 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 49 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 20 25 30 Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 35 40 45 Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly 65 70 75 80 Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 100 105 110 Phe Cys Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser 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atttctactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 ggtggaggtg gatcaggtgg aggtggatct ggtggaggtg gatctgacat tgagctcacc 480 cagtctccaa aattcatgtc cacatcagta ggagacaggg tcagcgtcac ctgcaaggcc 540 agtcagaatg tgggtactaa tgtagcctgg tatcaacaga aaccaggaca atctcctaaa 600 ccactgattt actcggcaac ctaccggaac agtggagtcc ctgatcgctt cacaggcagt 660 ggatctggga cagatttcac tctcaccatc actaacgtgc agtctaaaga cttggcagac 720 tatttctgtc aacaatataa caggtatccg tacacgtccg gaggggggac caagctggag 780 atcaaacggg cggccgcaat tgaagttatg tatcctcctc cttacctaga caatgagaag 840 agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc 900 ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 960 ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 1020 cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1080 ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1140 gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1200 cgaagagagg agtacgatgt 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240 aagttcaagg gtcaagccac actgactgca gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag 300 ctcagcggcc taacatctga ggactctgcg gtctatttct gtgcaagaaa gaccattagt 360 tcggtagtag atttctactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 ggtggaggtg gatcaggtgg aggtggatct ggtggaggtg gatctgacat tgagctcacc 480 cagtctccaa aattcatgtc cacatcagta ggagacaggg tcagcgtcac ctgcaaggcc 540 agtcagaatg tgggtactaa tgtagcctgg tatcaacaga aaccaggaca atctcctaaa 600 ccactgattt actcggcaac ctaccggaac agtggagtcc ctgatcgctt cacaggcagt 660 ggatctggga cagatttcac tctcaccatc actaacgtgc agtctaaaga cttggcagac 720 tatttctgtc aacaatataa caggtatccg tacacgtccg gaggggggac caagctggag 780 atcaaacggg cggccgcaat tgaagttatg tatcctcctc cttacctaga caatgagaag 840 agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc 900 ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 960 ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 1020 cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1080 ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1140 gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1200 cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1260 aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1320 gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggtaa 1368 <210> 59 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 59 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 20 25 30 Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 35 40 45 Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly 65 70 75 80 Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 100 105 110 Phe Cys Ala Arg 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aggcctgggt cctcagtgaa gatttcctgc 120 aaggcttctg gctatgcatt cagtagctac tggatgaact gggtgaagca gaggcctgga 180 cagggtcttg agtggattgg acagatttat cctggagatg gtgatactaa ctacaatgga 240 aagttcaagg gtcaagccac actgactgca gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag 300 ctcagcggcc taacatctga ggactctgcg gtctatttct gtgcaagaaa gaccattagt 360 tcggtagtag atttctactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 ggtggaggtg gatcaggtgg aggtggatct ggtggaggtg gatctgacat tgagctcacc 480 cagtctccaa aattcatgtc cacatcagta ggagacaggg tcagcgtcac ctgcaaggcc 540 agtcagaatg tgggtactaa tgtagcctgg tatcaacaga aaccaggaca atctcctaaa 600 ccactgattt actcggcaac ctaccggaac agtggagtcc ctgatcgctt cacaggcagt 660 ggatctggga cagatttcac tctcaccatc actaacgtgc agtctaaaga cttggcagac 720 tatttctgtc aacaatataa caggtatccg tacacgtccg gaggggggac caagctggag 780 atcaaacgga accaactgga gagaacagta aactccttga atgtctctgc tataagtatt 840 ccagaacacg atgaggcaga cgagataagt gatgaaaaca gagaaaaggt gaatgaccag 900 gcaaaactaa ttgtgggaat cgttgttggt ctcctccttg ctgcccttgt tgctggtgtc 960 gtctactggc tgtacatgaa gaagaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 1020 atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 1080 ccacgcgact tcgcagccta tcgcaaaaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 1140 gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1200 tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 1260 aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 1320 agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1380 ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 1440 cgctaa 1446 <210> 61 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 61 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 20 25 30 Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 35 40 45 Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg 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cttggcagac 720 tatttctgtc aacaatataa caggtatccg tacacgtccg gaggggggac caagctggag 780 atcaaacgga accaactgga gagaacagta aactccttga atgtctctgc tataagtatt 840 ccagaacacg atgaggcaga cgagataagt gatgaaaaca gagaaaaggt gaatgaccag 900 gcaaaactaa ttgtgggaat cgttgttggt ctcctccttg ctgcccttgt tgctggtgtc 960 gtctactggc tgtacatgaa gaagaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 1020 atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 1080 ccacgcgact tcgcagccta tcgcaaaaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 1140 gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1200 tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 1260 aagaaccctc aggaaggcct gttcaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggccttc 1320 agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg ccttttccag 1380 ggtctcagta cagccaccaa ggacaccttc gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 1440 cgctaa 1446 <210> 63 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 63 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 20 25 30 Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 35 40 45 Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly 65 70 75 80 Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 100 105 110 Phe Cys Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val 165 170 175 Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln 180 185 190 Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr 195 200 205 Arg Asn Ser 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Lys Arg 260 <210> 85 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 85 atggctctcc cagtgactgc cctactgctt cccctagcgc ttctcctgca tgcagaggtg 60 aagctgcagc agtctggggc tgagctggtg aggcctgggt cctcagtgaa gatttcctgc 120 aaggcttctg gctatgcatt cagtagctac tggatgaact gggtgaagca gaggcctgga 180 cagggtcttg agtggattgg acagatttat cctggagatg gtgatactaa ctacaatgga 240 aagttcaagg gtcaagccac actgactgca gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag 300 ctcagcggcc taacatctga ggactctgcg gtctatttct gtgcaagaaa gaccattagt 360 tcggtagtag atttctactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 ggtggaggtg gatcaggtgg aggtggatct ggtggaggtg gatctgacat tgagctcacc 480 cagtctccaa aattcatgtc cacatcagta ggagacaggg tcagcgtcac ctgcaaggcc 540 agtcagaatg tgggtactaa tgtagcctgg tatcaacaga aaccaggaca atctcctaaa 600 ccactgattt actcggcaac ctaccggaac agtggagtcc ctgatcgctt cacaggcagt 660 ggatctggga cagatttcac tctcaccatc actaacgtgc agtctaaaga cttggcagac 720 tatttctgtc aacaatataa caggtatccg tacacgtccg gaggggggac caagctggag 780 atcaaacgg 789 <210> 86 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr 20 25 30 Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser 35 40 45 Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala 50 55 60 Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala 65 70 75 80 Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp 85 90 95 Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe 115 120 125 Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg 130 135 140 Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg 145 150 155 160 Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly 165 170 175 Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr 180 185 190 Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His 195 200 205 Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser 210 215 220 Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val 225 230 235 <210> 87 <211> 247 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 87 Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Met 1 5 10 15 Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Pro 20 25 30 Glu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Lys Met Asp Ala Glu Leu Gly Gln Lys 35 40 45 Val Asp Leu Val Cys Glu Val Leu Gly Ser Val Ser Gln Gly Cys Ser 50 55 60 Trp Leu Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys Leu Pro Gln Pro Thr Phe Val 65 70 75 80 Val Tyr Met Ala Ser Ser His Asn Lys Ile Thr Trp Asp Glu Lys Leu 85 90 95 Asn Ser Ser Lys Leu Phe Ser Ala Val Arg Asp Thr Asn Asn Lys Tyr 100 105 110 Val Leu Thr Leu Asn Lys Phe Ser Lys Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe 115 120 125 Cys Ser Val Ile Ser Asn Ser Val Met Tyr Phe Ser Ser Val Val Pro 130 135 140 Val Leu Gln Lys Val Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu 165 170 175 Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala 180 185 190 Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Pro 195 200 205 Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Tyr His Arg Ser Arg Lys 210 215 220 Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Leu Val Arg Gln Glu Gly Lys Pro 225 230 235 240 Arg Pro Ser Glu Lys Ile Val 245 <210> 88 <211> 69 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 88 Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro 1 5 10 15 Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly 20 25 30 Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp 35 40 45 Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu Ile Ile 50 55 60 Thr Leu Ile Cys Tyr 65 <210> 89 <211> 207 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 89 tctactacta ccaagccagt gctgcgaact ccctcacctg tgcaccctac cgggacatct 60 cagccccaga gaccagaaga ttgtcggccc cgtggctcag tgaaggggac cggattggac 120 ttcgcctgtg atatttacat ctgggcaccc ttggccggaa tctgcgtggc ccttctgctg 180 tccttgatca tcactctcat ctgctac 207 <210> 90 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 145 150 155 160 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 165 170 175 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 180 185 190 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 195 200 205 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 210 215 220 <210> 91 <211> 81 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60 gcctttatta ttttctgggt g 81 <210> 92 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 93 <211> 81 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60 gcctttatta ttttctgggt g 81 <210> 94 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu 1 5 10 15 Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys 20 25 30 Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala 35 40 45 Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 50 55 60 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 65 70 75 80 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 85 90 95 Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 100 105 110 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 115 120 125 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 130 135 140 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 145 150 155 160 Leu Pro Pro Arg <210> 95 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 95 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 96 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 96 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 97 <211> 218 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 97 Met Thr Leu Arg Leu Leu Phe Leu Ala Leu Asn Phe Phe Ser Val Gln 1 5 10 15 Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Leu Leu Val Val 20 25 30 Asp Ser Asn Glu Val Ser Leu Ser Cys Arg Tyr Ser Tyr Asn Leu Leu 35 40 45 Ala Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asn Ser Asp Val 50 55 60 Glu Val Cys Val Gly Asn Gly Asn Phe Thr Tyr Gln Pro Gln Phe Arg 65 70 75 80 Ser Asn Ala Glu Phe Asn Cys Asp Gly Asp Phe Asp Asn Glu Thr Val 85 90 95 Thr Phe Arg Leu Trp Asn Leu His Val Asn His Thr Asp Ile Tyr Phe 100 105 110 Cys Lys Ile Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Arg 115 120 125 Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Ile Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr 130 135 140 Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val 145 150 155 160 Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp 165 170 175 Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met 180 185 190 Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala 195 200 205 Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro 210 215 <210> 98 <211> 123 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 98 aatagtagaa ggaacagact ccttcaaagt gactacatga acatgactcc ccggaggcct 60 gggctcactc gaaagcctta ccagccctac gcccctgcca gagactttgc agcgtaccgc 120 ccc 123 <210> 99 <211> 41 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 99 Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro 35 40 <210> 100 <211> 123 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 100 aatagtagaa ggaacagact ccttcaaagt gactacatga acatgactcc ccggaggcct 60 gggctcactc gaaagcctta ccagccctac gcccctgcca gagactttgc agcgtaccgc 120 ccc 123 <210> 101 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 102 <211> 123 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 102 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 103 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 104 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 105 <211> 126 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 106 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro 35 40 45 Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 50 55 60 Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 85 90 95 Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly 100 105 110 Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 115 120 125 Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp 130 135 140 Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn 145 150 155 160 Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro 165 170 175 Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr 180 185 190 Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu 195 200 205 Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val 210 215 220 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu 225 230 235 240 Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 260 265 270 Thr Leu Ala Lys Ile 275 <210> 107 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 107 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 108 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 108 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Lys 35 40 <210> 109 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Asn Gln Leu Glu Arg Thr Val Asn Ser Leu Asn Val Pro Ala Ile Ser 1 5 10 15 Ile Pro Glu His Asp Glu Ala Asp Glu Ile Ser Asp Glu Asn Arg Glu 20 25 30 Lys Val Asn Asp Gln Ala Lys 35 <210> 110 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Ala Ala Ala Asn Gln Leu Glu Arg Thr Val Asn Ser Leu Asn Val Ser 1 5 10 15 Ala Ile Ser Ile Pro Glu His Asp Glu Ala Asp Glu Ile Ser Asp Glu 20 25 30 Asn Arg Glu Lys Val Asn Asp Gln Ala Lys 35 40 <210> 111 <211> 48 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Pro Glu His Asp Glu Ala Asp Glu Ile Ser Asp Glu Asn Arg Glu Lys 1 5 10 15 Val Asn Asp Gln Ala Lys Leu Ile Val Gly Ile Val Val Gly Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Val Val Tyr Trp Leu Tyr Met Lys Lys 35 40 45 <210> 112 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Glu Asn Arg Glu Lys Val Asn Asp Gln Ala Lys Leu Ile Val Gly Ile 1 5 10 15 Val Val Gly Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Val Val Tyr Trp 20 25 30 Leu Tyr Met Lys Lys 35 <210> 113 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Asn Gln Leu Glu Arg Thr Val Asn Ser Leu Asn Val Pro Ala Ile Ser 1 5 10 15 Ile Pro Glu His Asp Glu Ala Asp Glu Ile Ser Asp Glu Asn Arg Glu 20 25 30 Lys Val Asn Asp Gln Ala Lys Leu Ile Val Gly Ile Val Val Gly Leu 35 40 45 Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Val Val Tyr Trp Leu Tyr Met Lys 50 55 60 Lys 65 <210> 114 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Thr Cys Thr Ala Glu Asn Gln Leu Glu Arg Thr Val Asn Ser Leu Asn 1 5 10 15 Val Ser Ala Ile Ser Ile Pro Glu His Asp Glu Ala Asp Glu Ile Ser 20 25 30 Asp Glu Asn Arg Glu Lys Val Asn Asp Gln Ala Lys Leu Ile Val Gly 35 40 45 Ile Val Val Gly Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Val Val Tyr 50 55 60 Trp Leu 65 <210> 115 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Pro Glu His Asp Glu Ala Asp Glu Ile Ser Asp Glu Asn Arg Glu Lys 1 5 10 15 Val Asn Asp Gln Ala Lys Leu Ile Val Gly Ile Val Val Gly Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Val Val Tyr Trp Leu 35 40 <210> 116 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Asn Gln Leu Glu Arg Thr Val Asn Ser Leu Asn Val Ser Ala Ile Ser 1 5 10 15 Ile Pro Glu His Asp Glu Ala Asp Glu Ile Ser Asp Glu Asn Arg Glu 20 25 30 Lys Val Asn Asp Gln Ala Lys Leu Ile Val Gly Ile Val Val Gly Leu 35 40 45 Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Val Val Tyr Trp Leu 50 55 60 <210> 117 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Ala Ala Ala Asn Gln Leu Glu Arg Thr Val Asn Ser Leu Asn Val Ser 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Claims (139)

  1. 세포외 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)의 전부 또는 일부가 없고, 상기 ITAM은 ITAM1, ITAM2, 및 ITAM3인 CAR.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2 또는 그의 일부가 없는 CAR.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM3 또는 그의 일부가 추가로 없는 CAR.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1 또는 그의 일부가 추가로 없는 CAR.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1 또는 그의 일부가 없는 CAR.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM3 또는 그의 일부가 추가로 없는 CAR.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM3 또는 그의 일부가 없는 CAR.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2 또는 그의 일부의 결실을 포함하는 CAR.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 추가로 포함하는 CAR.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1 또는 그의 일부의 결실을 추가로 포함하는 CAR.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM1 또는 그의 일부의 결실을 포함하는 CAR.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 추가로 포함하는 CAR.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하는 CAR.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 염기성-풍부 스트레치(BRS) 영역의 전부 또는 일부가 없고, 상기 BRS 영역은 BRS1, BRS2, 및 BRS3인 CAR.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS2 또는 그의 일부가 없는 CAR.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부가 추가로 없는 CAR.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부가 추가로 없는 CAR.
  18. 청구항 14에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드 BRS1 또는 그의 일부가 없는 CAR.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부가 추가로 없는 CAR.
  20. 청구항 14에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부가 없는 CAR.
  21. 청구항 14에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부, BRS2 또는 그의 일부, 및 BRS3 또는 그의 일부가 없는 CAR.
  22. 청구항 1에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2, ITAM3, BRS2, 및 BRS3가 없는 CAR.
  23. 청구항 14에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS2 또는 그의 일부의 결실을 포함하는 CAR.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부의 결실을 추가로 포함하는 CAR.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부의 결실을 추가로 포함하는 CAR.
  26. 청구항 14에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부의 결실을 포함하는 CAR.
  27. 청구항 26에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부의 결실을 추가로 포함하는 CAR.
  28. 청구항 14에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부의 결실을 포함하는 CAR.
  29. 청구항 14에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부, BRS2 또는 그의 일부, 및 BRS3 또는 그의 일부의 결실을 포함하는 CAR.
  30. 청구항 1에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2, ITAM3, BRS2, 및 BRS3의 결실을 포함하는 CAR.
  31. 청구항 1에 있어서,
    상기 CAR은 서열번호 45 또는 서열번호 47에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CAR.
  32. 세포외 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 염기성-풍부 스트레치(BRS) 영역의 전부 또는 일부가 없고, 상기 BRS 영역은 BRS1, BRS2, 및 BRS3인 CAR.
  33. 청구항 32에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS2 또는 그의 일부가 없는 CAR.
  34. 청구항 33에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부가 추가로 없는 CAR.
  35. 청구항 34에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부가 추가로 없는 CAR.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부가 없는 CAR.
  37. 청구항 36에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부가 추가로 없는 CAR.
  38. 청구항 37에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS3 또는 그의 일부가 없는 CAR.
  39. 청구항 32에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 또는 그의 일부, BRS2 또는 그의 일부, 및 BRS3 또는 그의 일부가 없는 CAR.
  40. 세포외 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 BRS1 변이체, BRS2 변이체, 및 BRS3 변이체로부터 선택되는 BRS 변이체를 포함하고, 상기 BRS 변이체는 하나 이상의 기능-소실(loss-of-function) 돌연변이를 포함하는 CAR.
  41. 청구항 1 내지 청구항 40 중 어느 한 항에 있어서,
    힌지/스페이서 영역을 추가로 포함하고, 상기 힌지/스페이서 영역은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD4 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하는 CAR.
  42. 청구항 41에 있어서,
    상기 힌지/스페이서 영역은 CD166 폴리펩티드를 포함하는 CAR.
  43. 청구항 42에 있어서,
    상기 CD166 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 489 내지 527을 갖는 CAR.
  44. 세포외 항원-결합 도메인, 힌지/스페이서 영역, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 ITAM 변이체를 포함하고, 각각의 상기 하나 이상의 ITAM 변이체는 독립적으로 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되며, 및
    상기 힌지/스페이서 영역은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD4 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하는 CAR.
  45. 청구항 44에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하는 방법.
  46. 청구항 45에 있어서,
    상기 ITAM2 변이체는 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열을 갖는 방법.
  47. 청구항 45 또는 청구항 46에 있어서,
    상기 ITAM3 변이체는 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 방법.
  48. 청구항 44 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 서열번호 43의 아미노산 374 내지 485를 포함하거나 이로 이루어지는 CAR.
  49. 청구항 44 내지 청구항 48 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR은 서열번호 43에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CAR.
  50. 청구항 45 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체 중 하나 또는 모두는 2개의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 방법.
  51. 청구항 44 내지 청구항 50 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 기능-소실 돌연변이는 티로신 아미노산 잔기에 있는 방법.
  52. 청구항 1 내지 청구항 51 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막통과 도메인은 CD8 폴리펩티드, CD28 폴리펩티드, CD3ζ 폴리펩티드, CD4 폴리펩티드, 4-1BB 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD166 폴리펩티드, CD8a 폴리펩티드, CD8b 폴리펩티드, ICOS 폴리펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, CTLA-4 폴리펩티드, CD27 폴리펩티드, CD40/My88 펩티드, NKGD2 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함하는 CAR.
  53. 청구항 52에 있어서,
    상기 막통과 도메인은 CD166 폴리펩티드를 포함하는 CAR.
  54. 청구항 53에 있어서,
    상기 CD166 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 528 내지 553을 포함하는 CAR.
  55. 청구항 44 내지 청구항 54 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역은 동일한 분자로부터 유래되는 CAR.
  56. 청구항 44 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 힌지/스페이서 영역은 CD28 폴리펩티드를 포함하고, 상기 막통과 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함하는 CAR.
  57. 청구항 44 내지 청구항 56 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 힌지/스페이서 영역은 CD84 폴리펩티드를 포함하고, 상기 막통과 도메인은 CD84 폴리펩티드를 포함하는 CAR.
  58. 청구항 44 내지 청구항 57 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 힌지/스페이서 영역은 CD166 폴리펩티드를 포함하고, 상기 막통과 도메인은 CD166 폴리펩티드를 포함하는 CAR.
  59. 청구항 58에 있어서,
    상기 CAR은 서열번호 3의 아미노산 489 내지 553을 포함하는 CAR.
  60. 청구항 44 내지 청구항 59 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 힌지/스페이서 영역은 CD8a 폴리펩티드를 포함하고, 상기 막통과 도메인은 CD8a 폴리펩티드를 포함하는 CAR.
  61. 청구항 44 내지 청구항 60 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 힌지/스페이서 영역은 CD8b 폴리펩티드를 포함하고, 상기 막통과 도메인은 CD8b 폴리펩티드를 포함하는 CAR.
  62. 청구항 44 내지 청구항 54 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막통과 도메인 및 힌지/스페이서 영역은 상이한 분자로부터 유래되는 CAR.
  63. 청구항 62에 있어서,
    상기 힌지/스페이서 영역은 CD28 폴리펩티드를 포함하고, 상기 막통과 도메인은 ICOS 폴리펩티드를 포함하는 CAR.
  64. 청구항 1 내지 청구항 63 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포내 신호전달 도메인은 공-자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 CAR.
  65. 청구항 65에 있어서,
    상기 공-자극성 신호전달 도메인은 CD28 폴리펩티드를 포함하는 CAR.
  66. 청구항 1 내지 청구항 65 중 어느 한 항의 CAR을 포함하는 면역반응성 세포.
  67. 청구항 66에 있어서,
    상기 CAR은 재조합적으로 발현되는 면역반응성 세포.
  68. 청구항 66 또는 청구항 67에 있어서,
    상기 CAR은 벡터로부터 발현되는 면역반응성 세포.
  69. 청구항 66 내지 청구항 68 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR은 상기 면역반응성 세포의 내재적 유전자 좌위(locus)에 위치하는 면역반응성 세포.
  70. 청구항 69에 있어서,
    상기 내재적 유전자 좌위는 TRAC 좌위, TRBC 좌위 또는 TRGC 좌위인 면역반응성 세포.
  71. 청구항 69 또는 청구항 70에 있어서,
    상기 내재적 유전자 좌위는 TRAC 좌위인 면역반응성 세포.
  72. 청구항 69 내지 청구항 71 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR의 배치는 TCR의 내재적 발현을 방해하거나 없애는 면역반응성 세포.
  73. 청구항 66 내지 청구항 72 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절성 T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 골수성 세포, 인간 배아 줄기 세포, 및 림프성 세포로 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역반응성 세포.
  74. 청구항 66 내지 청구항 73 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역반응성 세포는 자가성인 면역반응성 세포.
  75. 청구항 66 내지 청구항 74 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 종양 항원인 면역반응성 세포.
  76. 청구항 75에 있어서,
    상기 종양 항원은 CD19, MUC16, MUC1, CAlX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CLL1, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, erb-B2,3,4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, 폴레이트 수용체-a, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-a2, K-경쇄, KDR, LeY, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, ERBB2, MAGEA3, p53, MART1,GP100, 프로티나아제3(PR1), 티로시나아제, 수르비빈, hTERT, EphA2, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, 종양태아성 항원(h5T4), PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, BCMA, CD123, CD44V6, NKCS1, EGF1R, EGFR-VIII, 및 CD99, CD70, ADGRE2, CCR1, LILRB2, PRAME, CCR4, CD5, CD3, TRBC1, TRBC2, TIM-3, 인테그린 B7, ICAM-1, CD70, Tim3, CLEC12A 및 ERBB로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역반응성 세포.
  77. 청구항 77에 있어서,
    상기 항원은 CD19인 면역반응성 세포.
  78. 유효량의 청구항 66 내지 청구항 77 중 어느 한 항의 면역반응성 세포 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  79. 청구항 78에 있어서,
    신생물을 치료하기 위한 약학적 조성물.
  80. 유효량의 청구항 66 내지 청구항 77 중 어느 한 항의 면역반응성 세포 또는 청구항 78 또는 청구항 79의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 종양 부하를 감소시키는 방법.
  81. 유효량의 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 종양 부하를 감소시키는 방법으로서,
    상기 면역반응성 세포는 세포외 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하고, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 ITAM 변이체를 포함하고, 각각의 상기 하나 이상의 ITAM 변이체는 독립적으로 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  82. 청구항 81 또는 청구항 82에 있어서,
    상기 방법은 종양 세포의 수를 감소시키는 방법.
  83. 청구항 81 내지 청구항 83 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 종양의 크기를 감소시키는 방법.
  84. 청구항 81 내지 청구항 84 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 대상체에서 종양을 근절하는 방법.
  85. 유효량의 청구항 66 내지 청구항 77 중 어느 한 항의 면역반응성 세포 또는 청구항 78 또는 청구항 79의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 신생물을 치료 또는 예방하는 방법.
  86. 유효량의 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 신생물을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    상기 면역반응성 세포는 세포외 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하고, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 ITAM 변이체를 포함하고, 각각의 상기 하나 이상의 ITAM 변이체는 독립적으로 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  87. 청구항 80 내지 청구항 86 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신생물 또는 종양은 혈액암, B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  88. 청구항 80 내지 청구항 87 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신생물은 B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병, 또는 비-호지킨 림프종이고, 상기 CAR은 CD19에 결합하는 방법.
  89. 청구항 80 내지 청구항 87 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신생물은 B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병, 또는 비-호지킨 림프종이고, 상기 CAR은 BCMA, ADGRE2, MSLN, PSMA 또는 이들의 조합에 결합하는 방법.
  90. 재발된 신생물을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체는 재발된 질환을 갖고, 상기 대상체는 잔류 종양 세포를 유발하는 치료를 받거나, 상기 대상체는 항원 인식 수용체를 포함하는 면역반응성 세포를 받고, 상기 항원 인식 수용체는 4-1BB 공자극성 신호를 포함하고, 상기 방법은 유효량의 청구항 66 내지 청구항 77 중 어느 한 항의 면역반응성 세포 또는 청구항 78 또는 청구항 79의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  91. 재발된 신생물을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체는 재발된 질환을 갖고, 상기 대상체는 잔류 종양 세포를 유발하는 치료를 받거나, 상기 대상체는 항원 인식 수용체를 포함하는 면역반응성 세포를 받고, 상기 항원 인식 수용체는 4-1BB 공자극성 신호를 포함하고, 상기 방법은 유효량의 면역반응성 세포 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 면역반응성 세포는 세포외 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하고, 상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 ITAM 변이체를 포함하고, 각각의 상기 하나 이상의 ITAM 변이체는 독립적으로 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  92. 청구항 90 또는 청구항 91에 있어서,
    상기 신생물은 혈액암, B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병 및 비-호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  93. 청구항 90 내지 청구항 92 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신생물은 B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병, 또는 비-호지킨 림프종이고, 상기 CAR은 CD19에 결합하는 방법.
  94. 청구항 90 내지 청구항 93에 있어서,
    상기 신생물은 CD19+ ALL인 방법.
  95. 청구항 90 내지 청구항 94에 있어서,
    상기 신생물은 종양 세포의 표면에 낮은 밀도의 종양 특이적 항원을 갖는 종양 세포를 포함하는 방법.
  96. 종양 부하의 감소, 신생물의 치료 또는 예방, 및/또는 재발된 신생물을 갖는 대상체의 치료에 사용하기 위한 청구항 66 내지 청구항 77 중 어느 한 항의 면역반응성 세포 또는 청구항 78 또는 청구항 79의 약학적 조성물.
  97. 종양 부하의 감소, 신생물의 치료 또는 예방, 및/또는 재발된 신생물을 갖는 대상체의 치료에 사용하기 위한, 세포외 항원-결합 도메인, 막통과 도메인, 및 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    상기 변형된 CD3ζ 폴리펩티드는 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 ITAM 변이체를 포함하고, 각각의 상기 하나 이상의 ITAM 변이체는 독립적으로 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 CAR.
  98. 청구항 1 내지 청구항 65 중 어느 한 항에 따른 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 면역반응성 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 항원-특이적 면역반응성 세포를 생산하기 위한 방법.
  99. 청구항 98에 있어서,
    상기 핵산 서열은 벡터 내에 포함되는 방법.
  100. 청구항 99에 있어서,
    상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인 방법.
  101. 청구항 1 내지 청구항 65 중 어느 한 항의 CAR을 암호화하는 단리된 뉴클레오티드 산.
  102. 청구항 101에 있어서,
    서열번호 45 및 서열번호 47에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 산.
  103. 청구항 1 내지 청구항 65 중 어느 한 항의 CAR을 포함하는 핵산 조성물.
  104. 청구항 103에 있어서,
    상기 핵산 서열은 벡터 내에 포함되는 핵산 조성물.
  105. 청구항 104에 있어서,
    상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인 핵산 조성물.
  106. 청구항 103 내지 청구항 105 중 어느 한 항의 핵산 조성물을 포함하는 벡터.
  107. 청구항 1 내지 청구항 65 중 어느 한 항의 CAR, 청구항 66 내지 청구항 77 중 어느 한 항의 면역반응성 세포, 청구항 78 또는 청구항 79의 약학적 조성물, 청구항 103 내지 청구항 105 중 어느 한 항의 핵산 조성물, 또는 청구항 106의 벡터를 포함하는 키트.
  108. 청구항 107에 있어서,
    상기 키트는 신생물, 병원체 감염, 자가면역 질병, 또는 동종이계 이식을 치료 및/또는 예방하기 위한 기록된 설명서를 추가로 포함하는 키트.
  109. a) 제1 항원에 결합하는 제1 세포외 항원-결합 도메인, 제1 막통과 도메인, 및 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR; 및 b) 제2 항원에 결합하는 제2 세포외 항원-결합 도메인, 제2 막통과 도메인, 및 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR;을 포함하는 면역반응성 세포로서,
    상기 제1 CAR은 청구항 1 내지 청구항 65 중 어느 한 항의 CAR이거나, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 ITAM 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하고, 각각의 상기 하나 이상의 ITAM 변이체는 독립적으로 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역반응성 세포.
  110. 청구항 109에 있어서,
    상기 제2 CAR은 청구항 1 내지 청구항 65 중 어느 한 항의 CAR인 면역반응성 세포.
  111. 청구항 109에 있어서,
    상기 제2 CAR의 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 기능-소실 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 ITAM 변이체를 포함하는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하고, 각각의 상기 하나 이상의 ITAM 변이체는 독립적으로 ITAM1 변이체, ITAM2 변이체, 및 ITAM3 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역반응성 세포.
  112. 청구항 109에 있어서,
    상기 제2 CAR의 제2 세포내 신호전달 도메인은 상기 제1 CAR의 제1 세포내 신호전달 도메인 내에 포함되는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드와 동일한 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 면역반응성 세포.
  113. 청구항 109에 있어서,
    상기 제2 CAR의 제2 세포내 신호전달 도메인은 상기 제1 CAR의 제1 세포내 신호전달 도메인 내에 포함되는 변형된 CD3ζ 폴리펩티드와 상이한 변형된 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 면역반응성 세포.
  114. 청구항 109에 있어서,
    상기 제2 CAR의 제2 세포내 신호전달 도메인은 자연형의 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 면역반응성 세포.
  115. 청구항 109 내지 청구항 113 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 CAR의 제1 세포내 신호전달 도메인은 상기 제2 CAR의 제2 세포내 신호전달 도메인과 동일한 면역반응성 세포.
  116. 청구항 109 내지 청구항 114 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 CAR의 제1 세포내 신호전달 도메인은 상기 제2 CAR의 제2 세포내 신호전달 도메인과 상이한 면역반응성 세포.
  117. 청구항 109 내지 청구항 116 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항원은 상기 제2 항원과 상이한 면역반응성 세포.
  118. 청구항 109 내지 청구항 117 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 CAR은 제1 힌지/스페이서 영역을 추가로 포함하는 면역반응성 세포.
  119. 청구항 109 내지 청구항 118 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 CAR은 제2 힌지/스페이서 영역을 추가로 포함하는 면역반응성 세포.
  120. 청구항 109 내지 청구항 119 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖는 면역반응성 세포.
  121. 청구항 109 내지 청구항 119 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는 면역반응성 세포.
  122. 청구항 109 내지 청구항 121 중 어느 한 항에 있어서,
    제3 항원에 결합하는 제3 세포외 항원-결합 도메인, 제3 막통과 도메인, 및 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제3 CAR을 추가로 포함하는 면역반응성 세포.
  123. 청구항 122에 있어서,
    상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 변이체 및 ITAM3 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖고, 상기 제3 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는 면역반응성 세포.
  124. 청구항 122에 있어서,
    상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖고, 상기 제3 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는 면역반응성 세포.
  125. 청구항 122에 있어서,
    상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM2 또는 그의 일부의 결실 및 ITAM3 또는 그의 일부의 결실을 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제3 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는 면역반응성 세포.
  126. 청구항 122에 있어서,
    상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖고, 상기 제3 세포내 신호전달 도메인은 ITAM1 변이체 및 ITAM2 변이체를 포함하거나 갖는 면역반응성 세포.
  127. 유효량의 청구항 109 내지 청구항 126 중 어느 한 항의 면역반응성 세포 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  128. 종양 부하의 감소, 신생물의 치료 또는 예방, 및/또는 재발된 신생물을 갖는 대상체의 치료에 사용하기 위한 청구항 109 내지 청구항 126 중 어느 한 항의 면역반응성 세포 또는 청구항 127의 약학적 조성물.
  129. 유효량의 청구항 109 내지 청구항 126 중 어느 한 항의 면역반응성 세포 또는 청구항 127의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 종양 부하를 감소시키는 방법.
  130. 청구항 129에 있어서,
    상기 방법은 상기 대상체에서 종양 세포의 수를 감소시키고, 종양의 크기를 감소시키고, 및/또는 종양을 근절하는 방법.
  131. 유효량의 청구항 109 내지 청구항 126 중 어느 한 항의 면역반응성 세포 또는 청구항 127의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 신생물을 치료 또는 예방하는 방법.
  132. 청구항 131에 있어서,
    상기 신생물 또는 종양은 혈액암, B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  133. 청구항 131 또는 청구항 132에 있어서,
    상기 신생물은 B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병, 또는 비-호지킨 림프종이고, 상기 CAR은 CD19에 결합하는 방법.
  134. 청구항 131 내지 청구항 133 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신생물은 B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병, 또는 비-호지킨 림프종이고, 상기 CAR은 BCMA, ADGRE2, MSLN, PSMA 또는 이들의 조합에 결합하는 방법.
  135. 재발된 신생물을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체는 재발된 질환을 갖고, 상기 대상체는 잔류 종양 세포를 유발하는 치료를 받거나, 상기 대상체는 항원 인식 수용체를 포함하는 면역반응성 세포를 받고, 상기 항원 인식 수용체는 4-1BB 공자극성 신호를 포함하고, 상기 방법은 유효량의 청구항 109 내지 청구항 126 중 어느 한 항의 면역반응성 세포 또는 청구항 127의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  136. 청구항 135에 있어서,
    상기 신생물은 혈액암, B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병 및 비-호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  137. 청구항 135 또는 청구항 136에 있어서,
    상기 신생물은 B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병, 또는 비-호지킨 림프종이고, 상기 CAR은 CD19에 결합하는 방법.
  138. 청구항 135 내지 청구항 137 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신생물은 CD19+ ALL인 방법.
  139. 청구항 135 내지 청구항 138 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신생물은 상기 종양 세포의 표면에 낮은 밀도의 종양 특이적 항원을 갖는 종양 세포를 포함하는 방법.
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