KR20200104839A - Natural killer cells for treating biliary tract cancer - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 담도암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 자연살해세포, 이를 유도하는 방법과, 상기 자연살해세포를 포함하는 담도암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a natural killer cell capable of effectively preventing or treating biliary tract cancer, a method for inducing it, and a pharmaceutical composition for preventing or treating biliary tract cancer comprising the natural killer cell.
담도암은 간의 담관에 생기는 암으로 간암과 같은 줄기세포에서 발생하는 것으로 생각된다 (Sell and Dunsford Am J. Pathol. 134:1347-1363, 1989). 세계적으로 담도암의 발생빈도는 간암에 비해 훨씬 낮으나, 동남아시아에서의 발생빈도는 유럽이나 북아메리카 보다 훨씬 높게 나타난다. 담도암은 높은 재발률 때문에 외과적 절제술이 효과적이지 않고 보통의 화학 요법이나 방사선 요법이 잘 듣지 않는다는 특징을 가진다 (Pederson et al Cancer Res. 4325-4332, 1997). 게다가, 담도암의 진단이 쉽지 않고, 담즙관의 박테리아나 기생충 감염으로 인한 만성염증으로부터 오는 만성 담즙관의 염증이 담도암을 형성하는 경향이 있다는 소견이 있다 (Roberts et al., Gastroenterology 112:269-279, 1997). Biliary duct cancer is a cancer of the bile ducts of the liver and is thought to occur in stem cells such as liver cancer (Sell and Dunsford Am J. Pathol. 134:1347-1363, 1989). Globally, the incidence of biliary cancer is much lower than that of liver cancer, but the incidence in Southeast Asia is much higher than in Europe or North America. Biliary duct cancer is characterized by a high recurrence rate that surgical resection is not effective and that normal chemotherapy or radiation therapy does not work well (Pederson et al Cancer Res. 4325-4332, 1997). In addition, it is not easy to diagnose biliary tract cancer, and there are findings that chronic inflammation of the biliary tract from chronic inflammation due to bacterial or parasitic infection of the bile duct tends to form biliary tract cancer (Roberts et al., Gastroenterology 112:269 -279, 1997).
그럼에도 불구하고, 담도암의 발생 원인에 대한 기전은 아직 잘 알려져 있지 않으며, 담도암의 치료를 위한 타겟 분자도 알려져 있지 않다. 또한, 몇몇 담도암의 세포유전적 연구들이 발표되고 극소수의 세포주만이 확립되어 있으며(Yamaguchi et al., J. Natl Cancer Inst 75: 29-35, 1985; Ding et al., Br J Cancer 67: 1007-1010, 1993), 이 세포주를 이용하여 담도암에 결합하는 항체를 제조하는 방법도 알려지지 않았다.Nevertheless, the mechanism of the cause of biliary tract cancer is not yet well known, and the target molecule for the treatment of biliary tract cancer is not known. In addition, several cytogenetic studies of biliary tract cancer have been published and very few cell lines have been established (Yamaguchi et al., J. Natl Cancer Inst 75: 29-35, 1985; Ding et al., Br J Cancer 67: 1007-1010, 1993), and a method of producing an antibody that binds to biliary tract cancer using this cell line is not known.
자연살해세포(natural killer cell, NK cell)는 병원균 및 암세포를 제거하는 선천성 면역(innate immunity)에 관여하며, 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양괴사인자-알파(TNF-α), 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β) 및 그 외 적응성 면역(adaptive immunity)을 매개하는 물질들을 분비하는 것으로 알려져 있다. NK 세포가 다른 세포를 만나면, NK 세포의 MHC가 분자 작용을 통해 암 세포처럼 MHC Class 1이 없거나 바이러스에 감염된 세포와 같이 MHC Class 1의 형태가 비정상적인 경우 NK 세포 내부로 신호를 보내 이러한 비정상세포를 공격하는 시스템을 갖고 있다. 그러나, 여러 종류의 암에서는 이러한 NK 세포의 기능 및 분화 능력에 결함이 있는 것으로 보고되어 암 세포의 생존과 NK 세포의 활성이 밀접한 관련이 되어 있음이 알려져 있다. 따라서, 암 면역 치료를 위해 NK 세포의 수나 활성을 증가시키고자 하는 연구가 다양한 형태로 수행되어 왔지만, 아직까지는 만족할 만한 성과를 얻은 바는 없다.Natural killer cells (NK cells) are involved in innate immunity that removes pathogens and cancer cells, interferon-gamma (IFN-γ), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), macrophages It is known to secrete inflammatory protein-1β (MIP-1β) and other substances that mediate adaptive immunity. When an NK cell meets another cell, the MHC of the NK cell sends a signal to the inside of the NK cell by sending a signal to the inside of the NK cell when the NK cell's MHC does not have
본 발명의 일 목적은 담도암의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 자연살해세포를 유도하는 방법과, 상기 방법으로 유도된 자연살해세포를 제공하고자 한다. An object of the present invention is to provide a method for inducing natural killer cells that can be used for the prevention or treatment of biliary tract cancer, and a natural killer cell induced by the method.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에서 유도된 자연살해세포를 포함하는 담도암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating biliary tract cancer comprising natural killer cells induced in the present invention.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent by the following detailed description, claims and drawings.
본 발명에서 달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험을 위해 실행 시 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본 명세서에 기재된다. 본 발명의 기재 및 청구 시, 하기 정의가 이용될 것이다. 본 명세서에서 사용된 전문용어는 제한인 것으로 의도되지 않고, 오히려 특정한 실시형태를 기술할 목적을 위해 본 명세서에서 사용되는 것으로 또한 이해될 것이다. 관사 "하나" 및 "일"은 관사의 문법상 목적어의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나 또는 하나 이상)를 의미하도록 본 명세서에서 사용된다.Unless otherwise defined in the present invention, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. While any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in practice for the testing of the present invention, preferred materials and methods are described herein. In the description and claims of the present invention, the following definitions will be used. It will also be understood that the terminology used herein is not intended to be limiting, but rather is used herein for the purpose of describing particular embodiments. The articles "one" and "one" are used herein to mean one or more than one (ie, at least one or more than one) of the grammatical objects of the article.
종전부터 자연살해세포를 이용하여 면역 관련 질환을 치료하려는 시도가 이루어지고 있었으나, 아직까지는 만족할 만한 성과를 보이지 못하고 있다. 특히 암 중에서 담도암은 치료가 어려운 것으로 알려져 있으며, 아직까지는 자연살해세포를 이용하여 담도암 치료를 성공하였다는 연구는 보고된 바가 없다. Previously, attempts have been made to treat immune-related diseases using natural killer cells, but so far, satisfactory results have not been shown. In particular, among cancers, biliary tract cancer is known to be difficult to treat, and there are no reports of successful treatment of biliary tract cancer using natural killer cells.
본 발명의 발명자들은 담도암 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 이하의 방법으로 유도된 자연살해세포를 이용하는 경우, 담도암 치료 효과가 매우 뛰어남을 발견하여 본 발명을 완성하였다. As a result of intensive research efforts to develop a therapeutic agent for biliary tract cancer, the inventors of the present invention found that the biliary tract cancer treatment effect was very excellent when using the natural killer cells induced by the following method according to the present invention, and completed the present invention.
본 발명은 자연살해세포의 유도 방법에 관한 것으로, 우선 건강한 사람으로부터 혈액, 예를 들면, 전혈, 제대혈, 골수, 또는 말초혈액, 바람직하게는 말초혈액을 수득하는 단계를 수행할 수 있다. The present invention relates to a method of inducing natural killer cells, and first, a step of obtaining blood, for example whole blood, cord blood, bone marrow, or peripheral blood, preferably peripheral blood, from a healthy person can be performed.
본 발명에서 상기와 같이 수득된 말초혈액으로부터 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리 수득하는 단계를 수행할 수 있다. In the present invention, a step of separating and obtaining peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from the peripheral blood obtained as described above may be performed.
본 발명에서 상기 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 포유동물, 바람직하게는 사람의 말초혈액으로부터 분리된 단핵의 세포로서, 주로 B 세포, T 세포, 자연살해세포와 같은 면역세포, 및 호염구(basophil), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil)와 같은 과립구 등을 포함한다. 상기 PBMC는 생체에서 채취한 말초혈액으로부터 통상의 제조방법에 의해 준비될 수 있다. 바람직하게 상기 PBMC는 피콜(Ficoll)을 이용한 비중 원심분리법을 이용하여 말초혈액으로부터 분리할 수 있다. In the present invention, the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are mononuclear cells isolated from peripheral blood of mammals, preferably humans, mainly B cells, T cells, immune cells such as natural killer cells, And granulocytes such as basophil, eosinophil, and neutrophil. The PBMC may be prepared from peripheral blood collected from a living body by a conventional manufacturing method. Preferably, the PBMC can be separated from peripheral blood using a specific gravity centrifugation method using Ficoll.
본 발명에서는 상기 분리된 말초혈액 단핵세포로부터 CD3+ T 세포를 제거하는 단계를 수행할 수 있다. 본 발명에서 상기 CD3+ T 세포를 제거하는 방법은 특별히 제한하지 않으나, 상업적으로 시중에 판매되고 있는 면역자기 분리 제품으로, 예를 들면, MACSxpress (Milteyi Biotec, Germany) 등을 이용하여 수행될 수 있다. In the present invention, the step of removing CD3 + T cells from the isolated peripheral blood mononuclear cells may be performed. In the present invention, the method of removing the CD3 + T cells is not particularly limited, but commercially available immunomagnetic separation products, for example, may be performed using MACSxpress (Milteyi Biotec, Germany). .
본 발명에서는 상기와 같이 CD3+ T 세포가 제거된 말초혈액 단핵세포를 사이토카인(cytokine)이 500 내지 1500 IU/ml의 양으로 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계를 수행할 수 있다. In the present invention, the peripheral blood mononuclear cells from which CD3 + T cells are removed as described above may be cultured in a culture medium containing a cytokine in an amount of 500 to 1500 IU/ml.
본 발명에서 상기 배양 배지는 염화나트륨(NaCl) 0.5 내지 0.6 중량%, D-글루코스(D-glucose) 0.4 내지 0.5 중량%, 아미노산 0.2 내지 0.3 중량%, NaHCO3 0.15 내지 0.25 중량% 및 HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 0.15 내지 0.25 중량%를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 Cell Science & Technology Institute inc. (CSTI)의 AlyS505NK-EX를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the culture medium is sodium chloride (NaCl) 0.5 to 0.6% by weight, D-glucose (D-glucose) 0.4 to 0.5% by weight, amino acids 0.2 to 0.3% by weight, NaHCO3 0.15 to 0.25% by weight and HEPES (4-( 2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) may contain 0.15 to 0.25% by weight, but is not limited thereto. Preferably Cell Science & Technology Institute inc. (CSTI) AlyS505NK-EX may be used, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 사이토카인(cytokine)은 말초혈액 단핵구를 자연살해세포로 유도하는데 사용 가능한 면역 활성화 사이토카인을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 이러한 사이토카인으로는 예를 들어 IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-12, IL18 또는 이들을 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 특히 IL-2, IL-15 또는 IL-21이 자연살해세포로의 분화 및 증식에 탁월한 효과가 있는 사이토카인으로 알려져 있으므로, 이들 사이토카인을 이용하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 IL-2일 수 있다.In the present invention, the cytokine refers to an immune-activating cytokine that can be used to induce peripheral blood mononuclear cells into natural killer cells. In one embodiment of the present invention, such cytokines include, for example, IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-12, IL18, or a mixture of two or more thereof. Can be used. In particular, since IL-2, IL-15, or IL-21 is known as a cytokine that has an excellent effect on differentiation and proliferation into natural killer cells, it is preferable to use these cytokines, most preferably IL-2. have.
본 발명의 목적상 상기 사이토카인은 500 내지 1500 IU/ml의 양으로 포함되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 800 내지 1200 IU/ml의 양으로 포함될 수 있다. For the purposes of the present invention, the cytokine is preferably contained in an amount of 500 to 1500 IU/ml, more preferably 800 to 1200 IU/ml.
또한, 본 발명에서 상기 배양은 10 내지 25일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 CD3+ T 세포가 제거된 말초혈액 단핵세포를, 배양 배지가 10 내지 30 ml로 포함된 T75 플라스크에서 5 내지 7일 동안 배양한 뒤 T175 플라스크로 이동시켜 7 내지 14일 동안 추가로 배양하며 수행할 수 있다. In addition, in the present invention, the cultivation may be performed for 10 to 25 days, and preferably, peripheral blood mononuclear cells from which CD3 + T cells are removed are 5 to 7 in a T75 flask containing 10 to 30 ml of the culture medium. After incubation for 1 day, it can be transferred to a T175 flask and further cultured for 7 to 14 days.
본 발명에서 상기 배양은 정치배양(stationary culture) 또는 부유배양(suspension culture) 방법을 사용할 수 있고, 정치배양은 배양기에 교반(agitating) 또는 진탕(shaking) 없이 방치한 상태에서 배양하는 것을 의미하며, 부유배양은 통기(aeration)나 교반 등을 통해 세포들이 반응기의 하부 또는 측면부에 부착되지 않고 현탁된 상태에서 배양하는 것을 의미한다. 또한, 정치배양을 위한 반응기와 부유배양을 위한 반응기는 동일한 것일 수도 있고, 상이한 것일 수도 있다. 예를 들어, 정치배양을 위한 반응기와 부유배양을 위한 반응기가 동일한 것인 경우에는 동일한 반응기에서 정치배양이 완료된 후, 사이토카인 등의 필요한 영양성분을 포함하는 배지를 추가적으로 공급하여 부유배양 방식으로 배양하는 것이 가능하며, 상이한 종류의 배양기를 사용하는 경우에는 정치배양이 완료된 후에 배양물을 부유배양을 위한 반응기로 옮겨 부유배양 할 수 있다.In the present invention, the cultivation may be a stationary culture or a suspension culture method, and the stationary cultivation means cultivation in a state left to stand without agitating or shaking in an incubator, Suspension culture refers to culturing in a state in which cells are suspended without being attached to the bottom or side of the reactor through aeration or stirring. In addition, the reactor for stationary culture and the reactor for suspension culture may be the same or different. For example, if the reactor for stationary culture and the reactor for suspension culture are the same, after the stationary culture is completed in the same reactor, a medium containing necessary nutrients such as cytokines is additionally supplied and cultured in a suspension culture method. In the case of using a different type of incubator, the culture can be transferred to a reactor for suspension culture after the stationary culture is completed and cultured in suspension.
본 발명에서 상기와 같은 방법으로 유도된 자연살해세포는 CD3- 표현형을 가지며, CD56bright 또는 CD56dim의 표현형을 가질 수 있다. In the present invention, the natural killer cells induced by the above method have a CD3 - phenotype, and may have a CD56 bright or CD56 dim phenotype.
또한, 본 발명에서 상기와 같이 유도된 자연살해세포는 담도암 세포 중에서도 특히 간 내(intrahepatic) 담도암 세포에 대하여 선택적으로 세포 독성이 매우 뛰어나, 간 내 담도암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. In addition, the natural killer cells induced as described above in the present invention are particularly excellent in selective cytotoxicity to intrahepatic biliary cancer cells among biliary tract cancer cells, and thus can effectively prevent or treat intrahepatic biliary tract cancer.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법으로 얻어진 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 담도암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.According to another embodiment of the present invention, it relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of biliary tract cancer comprising as an active ingredient the natural killer cells obtained by the method of the present invention.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"를 의미한다. 본 발명의 용어 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.In the present invention, the pharmaceutical composition means "cellular therapeutic agent". The term "cellular therapeutic agent" of the present invention refers to a drug (US FDA regulation) used for treatment, diagnosis, and prevention of cells and tissues manufactured through isolation, culture and special manipulation from an individual. Or medicines used for treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as proliferating and selecting live autologous, allogeneic, or xenogeneic cells in vitro to restore tissue function, or by changing the biological characteristics of cells in other ways. Means.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 자연살해세포는 담도암 세포 중에서도 특히 간 내 담도암 세포에 대한 선택적 세포 독성이 매우 뛰어나, 간 내 담도암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.The natural killer cells included in the pharmaceutical composition of the present invention are particularly excellent in selective cytotoxicity to biliary tract cancer cells in the liver, and can effectively prevent or treat biliary tract cancer in the liver.
본 발명의 약학적 조성물은 자연살해세포를 1Х104 개 이상, 1Х105 개 이상, 3Х105 개 이상, 1Х106 개 이상, 3Х106 개 이상, 6Х106 개 이상, 또는 1Х107 개 이상, 그리고 1Х1010 개 이하로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention contains 1Х10 4 or more, 1 Х10 5 or more, 3 Х10 5 or more, 1 Х10 6 or more, 3 Х10 6 or more, 6 Х10 6 or more, or 1 Х10 7 or more, and 1 Х10 10 It may contain up to dogs.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 약학적 조성물의 투여로 담도암 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. The term "prevention" as used in the present invention means any action of suppressing or delaying biliary tract cancer disease by administration of the pharmaceutical composition.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 약학적 조성물의 투여로 담도암 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.In addition, the term "treatment" as used in the present invention means all actions in which symptoms of biliary tract cancer disease are improved or cured by administration of the pharmaceutical composition.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the pharmaceutical composition may be characterized in that it is in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders or beverages, and the pharmaceutical composition may be characterized in that for humans.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is not limited to these, but is formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, etc., external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to conventional methods. I can. The pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers can be used as binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, coloring agents, flavoring agents, etc. for oral administration, and buffers, preservatives, painlessness, etc. Agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, and the like can be mixed and used, and in the case of topical administration, a base agent, excipient, lubricant, preservative, etc. can be used. The formulation of the pharmaceutical composition of the present invention may be variously prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. For example, for oral administration, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixir, suspension, syrup, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. have. Others, solutions, suspensions, tablets, capsules, can be formulated as sustained-release preparations.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.On the other hand, examples of suitable carriers, excipients and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil may be used. In addition, fillers, anti-aggregating agents, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifying agents, preservatives, and the like may additionally be included.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. The route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited thereto, but oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, local , Sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.In the present invention, "parenteral" includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques. The pharmaceutical composition of the present invention can also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention depends on a number of factors including the activity of the specific compound used, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, excretion rate, drug formulation and the severity of the specific disease to be prevented or treated. It may vary in various ways, and the dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's condition, weight, degree of disease, drug form, route of administration and duration, but may be appropriately selected by those skilled in the art, and 0.0001 to 50 mg/day. It can be administered in kg or 0.001 to 50 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be divided several times. The above dosage does not in any way limit the scope of the present invention. The pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as a pill, dragee, capsule, liquid, gel, syrup, slurry, or suspension.
본 발명에서 유도되는 자연살해세포는 암 중에서도 특히 담도암 세포, 그 중에서도 간 내 담도암 세포에 대한 살상능이 매우 뛰어나, 간 내 담도암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.The natural killer cells induced in the present invention are excellent in killing ability against biliary tract cancer cells, especially biliary tract cancer cells, among cancers, and can effectively prevent or treat biliary tract cancer in the liver.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 누드 마우스를 이용한 생체 내(in-vivo) 실험을 설계한 디자인 모식도를 나타낸 것으로, 도 1(a)는 본 발명에서 얻어진 SMT01 자연살해세포의 농도 의존적 안정성 및 독성 평가를 위한 실험 설계도에 해당한다. 또한, 도 1(b)는 본 발명에서 얻어진 SMT01 자연살해세포의 농도 의존적 효능 평가를 위한 실험 설계도에 해당한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 생체 외(ex-vivo) 증폭된 SMT01의 유세포 분석 결과와, 담도암 세포주에 대한 세포 독성을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 2(a)는 SMT01의 세포 군의 표현형을 분석한 결과로, NK 세포의 표현형을 분석하기 위해 항-CD56/CD16 항체를 사용하였고, T 세포군 분석을 위하여 항-CD3 항체를 사용하였으며, DC 및 B 세포 분석을 위하여 항-CD40 항체를 사용하였다. 도 2(b)는 간 내 담도암 세포주 및 간 외 담도암 세포주에 해당하는 HuCCT-1 (간 내 담도암 세포주), SNU1196 (간 외 담도암 세포주), 및 SNU478 (바터 팽대부 선암 세포주)에 대한 SMT01의 세포 용해능을 분석한 결과이다. 여기서, K562 세포주는 양성 대조군에 해당한다.
도 3은 SMT01의 종양 성장 억제 효과를 나타낸 것이다. 도 3(a), 도 3(b) 및 도 3(c)는 G1 내지 G5 처리를 수행한 누드 마우스 및 이로부터 분리한 종양의 사진, 종양 부피 및 종양 무게의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 SMT01의 생체 내(in-vivo) 누드 마우스 실험을 나타낸 것이다. 도 4(a)는 체중의 변화를 나타낸 것이고, 도 4(b)는 종양 부피의 변화를 나타낸 것이다. 여기서, 종양 부피는 칼리퍼((CD-15CX, Mitutoyo, Japan)를 이용하여 다음의 식에 따라 측정하였다. 종양 부피(mm3) = L (mm) × W2 (mm2) × 1/2. 도 4(c)는 종양 무게의 변화를 측정한 것이다. 각 군에서 측정된 평균 종양의 무게는 다음과 같다: G1, 2.904 g (IR:0.0%); G2, 1.892 g (IR: 34.8%); G3, 2.292 g (IR: 21.1%); G4, 2.252 g (IR: 22.4%); G5, 1.385 g (IR: 52.3%). 여기서, 상기 IR은 다음의 식을 이용하여 측정하였다: IR (%) = (1 － T/C) ×× 100 (T: 실험군과 양성 대조군에서 평균 종양 무게이고, C: 음성 대조군에서 평균 종양 무게에 해당한다).
도 5는 누드 마우스 종양의 H&E 염색 및 IHC 실험 결과를 나타낸 것이다. 각 그룹에서 대표되는 종양의 전체 형상과 CD56 IHC 결과는 저배율(12.5 X)에서 관찰하였고, 확대된 사진은 오른쪽 열에 나타내었다(100X). G2 내지 G4 그룹에서 CD56-양성 NK 세포는 종양 결절 사이 간극(cleavage)을 따라 분포된 것을 알 수 있었다(적색 화살표).
도 6은 세포 자멸하는 종양 세포와 침윤하는 자연살해세포의 조직학적 관찰 결과를 나타낸 것이다. 도 6(a)는 모든 그룹의 종양 절편의 TUNEL 염색 결과를 나타낸 것으로, G1 그룹에 비하여 G2 내지 G5 그룹에서 TUNEL 양성 세포가 더 흔히 관찰되었다. 도 6(b)는 IHC 실험 결과를 나타낸 것으로, a 및 b는 종양 결절 사이 느슨한 조직을 따라 NCR1-양성 자연살해세포 침윤(적색 화살표)을 보이는 G2 그룹의 연속 절편을 나타낸 것이고, c 및 d는 CD56 및 NCR1-양성 자연살해세포를 보이는 G3 그룹의 연속 절편 사진을 나타낸 것이다. e 내지 h는 G3 그룹의 연속 절편 사진을 나타낸 것으로, 항-인간 카스파제 3a(caspase 3a) 항체를 이용한 IHC로 탐지된 종양 세포의 세포 자멸 신호는 자연살해세포의 침윤 부위에서 주로 관찰되었다. i 및 j는 G4 그룹의 연속 절편 사진을 나타낸 것으로, 종양에서 카스파제 3a 양성 세포(흑색 화살표)는 침윤된 자연살해세포가 관찰되는 부위(적색 화살표)에서 관찰되었다. k 및 l은 G4 그룹의 연속 절편 사진을 나타낸 것으로, 카스파제 3a 양성 세포(흑색 화살표)는 종양 결절 사이 느슨한 조직을 따라 자연살해세포가 침윤한 부위(적색 화살표)에 존재하는 것으로 관찰되었다. m 내지 p는 G1 및 G5 그룹에서 자연살해세포의 침윤과 관계 없는 종양에서 분포된 다수의 카스파제 3a 양성 세포(흑색 화살표)를 보이는 연속 절편 사진을 나타낸 것이다. 1 is a schematic design diagram of an in-vivo experiment using a nude mouse in an embodiment of the present invention, and FIG. 1 (a) is a concentration-dependent stability and stability of SMT01 natural killer cells obtained in the present invention. Corresponds to the experimental design for toxicity assessment. In addition, FIG. 1(b) corresponds to an experimental design for evaluating the concentration-dependent efficacy of SMT01 natural killer cells obtained in the present invention.
FIG. 2 shows the results of flow cytometric analysis of SMT01 amplified ex-vivo and cytotoxicity analysis of biliary tract cancer cell lines in an embodiment of the present invention. Figure 2(a) is a result of analyzing the phenotype of the cell group of SMT01, an anti-CD56/CD16 antibody was used to analyze the phenotype of NK cells, and an anti-CD3 antibody was used to analyze the T cell group, DC And anti-CD40 antibody was used for B cell analysis. Figure 2(b) is for HuCCT-1 (intrahepatic biliary cancer cell line), SNU1196 (extrahepatic biliary cancer cell line), and SNU478 (Batter bulge adenocarcinoma cell line) corresponding to intrahepatic biliary cancer cell lines and extrahepatic biliary cancer cell lines. This is the result of analyzing the cell lysis ability of SMT01. Here, the K562 cell line corresponds to a positive control.
3 shows the tumor growth inhibitory effect of SMT01. 3(a), 3(b), and 3(c) are photographs of nude mice subjected to G1 to G5 treatment and tumors isolated therefrom, showing changes in tumor volume and tumor weight.
4 shows an experiment of SMT01 in a nude mouse in vivo. Fig. 4(a) shows the change in body weight, and Fig. 4(b) shows the change in tumor volume. Here, the tumor volume was measured according to the following equation using a caliper ((CD-15CX, Mitutoyo, Japan): Tumor volume (mm 3 ) = L (mm) × W2 (mm 2 ) × 1/2. Figure 4 (c) is a measurement of the change in tumor weight The average tumor weight measured in each group is as follows: G1, 2.904 g (IR:0.0%); G2, 1.892 g (IR: 34.8%) ; G3, 2.292 g (IR: 21.1%); G4, 2.252 g (IR: 22.4%); G5, 1.385 g (IR: 52.3%), wherein the IR was measured using the following formula: IR ( %) = (1-T/C) ×× 100 (T: average tumor weight in the experimental group and positive control group, C: corresponds to the average tumor weight in negative control group).
5 shows the results of H&E staining and IHC experiments of nude mouse tumors. The overall shape and CD56 IHC results of the tumors represented in each group were observed at low magnification (12.5 X), and an enlarged picture was shown in the right column (100X). It was found that CD56-positive NK cells in the G2 to G4 groups were distributed along the cleavage between tumor nodules (red arrow).
6 shows the histological observation results of apoptosis tumor cells and infiltrating natural killer cells. 6(a) shows the results of TUNEL staining of tumor sections of all groups, and TUNEL-positive cells were more commonly observed in the G2 to G5 groups than in the G1 group. Figure 6 (b) shows the results of the IHC experiment, a and b show the continuous section of the G2 group showing NCR1-positive natural killer cell infiltration (red arrow) along the loose tissue between the tumor nodules, c and d It shows a picture of the serial section of the G3 group showing CD56 and NCR1-positive natural killer cells. e to h show pictures of consecutive sections of the G3 group. Apoptosis signals of tumor cells detected by IHC using anti-human caspase 3a antibody were mainly observed at the invasion site of natural killer cells. i and j show pictures of consecutive sections of the G4 group. In the tumor, caspase 3a positive cells (black arrows) were observed in the area where infiltrated natural killer cells were observed (red arrows). k and l show the pictures of the continuous section of the G4 group, and caspase 3a positive cells (black arrows) were observed to be present in the site of infiltrating natural killer cells along the loose tissues between tumor nodules (red arrows). m to p show pictures of consecutive sections showing a number of caspase 3a positive cells (black arrows) distributed in tumors irrelevant to the invasion of natural killer cells in the G1 and G5 groups.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples. However, the following examples are only illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
실시예Example
1. 자연살해세포의 준비1. Preparation of natural killer cells
2명의 건강한 기증자로부터 혈액을 얻은 뒤 PBMC를 분리하였다. MACSxpress (Milteyi Biotec, Germany)를 이용하여 CD3+ T 세포를 제거하였다. DPBS 버퍼를 이용하여 T 세포가 제거된 PBMC를 2차례 세척한 뒤 NK 증폭 배지(ALyS505NK-IL2 1000 IU/ml, Cell Science & Technology Inst) 20ml를 포함하는 T75 플라스크에서 배양하였다. 3일마다 IL-2 활성화된 자연살해세포에 신선한 배지를 추가하였고, 배양 5~7일 후에 T175 플라스크로 이동시켰다. 자연살해세포 증폭은 목표로 하는 세포 수에 도달할 때까지 신선한 배지를 계속하여 추가해 주면서 7 내지 14일 동안 추가로 수행하였다. 자동 세포 계수기(automatic cell counter)를 이용하여 트리판 블루 카운팅 방법으로 증폭된 자연살해세포(SMT01 세포)의 생존율 및 수를 측정하였다. PBMCs were isolated after blood was obtained from 2 healthy donors. CD3 + T cells were removed using MACSxpress (Milteyi Biotec, Germany). After washing the PBMC from which the T cells were removed twice using DPBS buffer, it was cultured in a T75 flask containing 20 ml of NK amplification medium (ALyS505NK-IL2 1000 IU/ml, Cell Science & Technology Inst). Fresh medium was added to the IL-2 activated natural killer cells every 3 days, and after 5-7 days of culture, they were transferred to a T175 flask. Natural killer cell amplification was further performed for 7 to 14 days while continuously adding fresh medium until the target number of cells was reached. The survival rate and number of natural killer cells (SMT01 cells) amplified by trypan blue counting method were measured using an automatic cell counter.
2. 누드 마우스에서 인-비보 실험 설계2. Design of in-vivo experiments in nude mice
NCr 무흉선 누드 마우스(BALB/cSlc-nu/nu)(Charles River Laboratories, Japan SLC, Inc)를 OECD 우수 실험실 관리 기준(OECD Good Laboratory Practice regulations (ENV/MC/CHEM(98)17 as revised in 1997))과 비임상 실험실 연구를 위한 우수 실험실 관리 기준(Good Laboratory Practice)(21CFR Part 58, Food and Drug Administration, United States of America (Apr. 1, 2015)에 따라 마이크로아이솔레이터 케이지(microisolator cage) 내에서 조작 및 사육 하였다. NCr athymic nude mice (BALB/cSlc-nu/nu) (Charles River Laboratories, Japan SLC, Inc) were established as OECD Good Laboratory Practice regulations (ENV/MC/CHEM(98)17 as revised in 1997). )) and in a microisolator cage according to Good Laboratory Practice (21 CFR Part 58, Food and Drug Administration, United States of America (Apr. 1, 2015)). Manipulated and bred.
용량 의존적 안전성 및 독성을 평가하기 위하여, 상기와 같이 얻어진 자연살해세포를 3종류의 다른 용량으로 준비하였다(도 1(a)). 저용량 주입으로는, 인간에게서 2X106 세포/kg의 용량에 해당하는 4X104 세포/동물로 하였고, 중간 및 고용량 주입으로는 각각 2X105 세포/동물 및 1X106 세포/동물로 지정하였다. 이후, 생체 외(ex-vivo)에서 증폭된 자연살해세포를 회복 군을 포함하여 수컷 및 암컷 마우스 50 마리(6주 경에 수컷 및 암컷 각각의 몸무게는 18.7~22.5g 및 16.1~18.8g에 해당하였다)에 27주 동안 3주 간격으로 매주 2번씩 정맥 주사하였다. 총 18번 SMT01 세포를 정맥 주사하였다.In order to evaluate dose-dependent safety and toxicity, natural killer cells obtained as described above were prepared in three different doses (Fig. 1(a)). For low-dose injection, 4 ×10 4 cells/animal corresponding to a dose of 2 × 10 6 cells/kg in humans, and 2 × 10 5 cells/animal and 1× 10 6 cells/animal, respectively, for medium and high-dose injections. Thereafter, 50 male and female mice, including the recovery group, from the ex-vivo amplified natural killer cells (the weight of each male and female at around 6 weeks was 18.7-22.5g and 16.1-18.8g) Was injected twice a week at 3 weeks intervals for 27 weeks. A total of 18 SMT01 cells were injected intravenously.
동일한 누드 마우스에 대하여 SMT01의 용량 별 효능 평가를 위한 실험을 수행하였다(도 1(b)). 구체적으로, 누드 마우스 10마리로 이루어진 각 그룹(G1~G5)에 HuCCT1 세포(5ｘ106 cells/0.2 mL)를 피하에 주사하여 이식 및 생착을 수행하였다: G1, 생리식염수 (음성 대조군); G2-G4, SMT01 주입; G5, 젬시타빈+시스플라틴(Gem+CDDP) (양성 대조군). 각 그룹에서 종양이 84 ~ 119 mm3의 부피 (19.3~20.5 g 체중 범위)로 잘 생착된 마우스 중 8마리를 선별한 뒤, 치료를 수행하였다. An experiment for evaluating the efficacy of SMT01 for each dose was performed on the same nude mouse (Fig. 1(b)). Specifically, transplantation and engraftment were performed by subcutaneous injection of HuCCT1 cells (5ｘ10 6 cells/0.2 mL) into each group (G1-G5) consisting of 10 nude mice: G1, physiological saline (negative control); G2-G4, SMT01 injection; G5, gemcitabine + cisplatin (Gem + CDDP) (positive control). In each group, 8 mice engrafted well with a volume of 84 to 119 mm 3 (19.3 to 20.5 g body weight) were selected, and then treatment was performed.
보다 상세하게는 HuCCT-1 종양을 포함하는 누드 마우스에 SMT01을 10일 간격으로 5번 정맥 주사하였다. 양성 대조군으로는 젬시타빈(Gem), 시스-디아민플라티넘 (II) 디클로라이드 (CDDP)를 각각 120mg/kg 및 3mg/kg의 용량으로 투여하였다. SMT01의 주입 시 3개의 마우스 그룹에 하기와 같이 다른 용량으로 투여하였다. G2-G4: G2, 저용량 (4X104 cell/animal); G3, 중간 용량 (2X105 cells/animal); G4, 고용량 (1X106 cells/animal). G1 및 G5는 각각 음성 대조군(생리식염수) 및 양성 대조군(CDDP+Gem)에 해당한다. 세포 주사 시 1회용 주사기(26G, 1 ml)를 사용하였다. 주입 부피는 0.2ml/head가 되도록 하였으며, 마지막 주사 후 14일 경과하였을 때 종양을 포함하는 마우스를 안락사시킨 뒤 평가를 수행하였다(도 1(b)). More specifically, SMT01 was injected intravenously 5 times at 10-day intervals to nude mice containing HuCCT-1 tumors. As a positive control, gemcitabine (Gem) and cis-diamine platinum (II) dichloride (CDDP) were administered at a dose of 120 mg/kg and 3 mg/kg, respectively. Upon injection of SMT01, three groups of mice were administered at different doses as follows. G2-G4: G2, low volume (4X10 4 cell/animal); G3, medium dose (2X10 5 cells/animal); G4, high dose (1X10 6 cells/animal). G1 and G5 correspond to the negative control (physiological saline) and the positive control (CDDP+Gem), respectively. A disposable syringe (26G, 1 ml) was used for cell injection. The injection volume was set to 0.2 ml/head, and when 14 days elapsed after the last injection, the mouse containing the tumor was euthanized and evaluated (FIG. 1(b)).
3. 인간 세포주3. Human cell line
본 실험에서 사용한 인간 담도암 세포주로, HuCCT-1 (간 내 담도암 세포주)는 Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan)로부터 구입하였고, SNU1196 (간 외 담도암 세포주) 및 SNU478 (바터 팽대부 선암 세포주)는 한국 세포주 은행 (Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 세포주는 5% CO2를 포함하는 가습 환경 하에서, 10% 소 태아 혈청 (GIBCO), 100 U/ml 페니실린, 및 100 mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지 (GIBCO)에서 배양하였다. As the human biliary tract cancer cell line used in this experiment, HuCCT-1 (intrahepatic biliary cancer cell line) was purchased from Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan), SNU1196 (extrahepatic biliary tract cancer cell line) and SNU478 (Batter bulge adenocarcinoma cell line) ) Was purchased from a Korean cell line bank (Seoul, Korea). Cell lines were cultured in RPMI-1640 medium (GIBCO) supplemented with 10% fetal bovine serum (GIBCO), 100 U/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin under a humidified environment containing 5% CO 2 .
4. 표현형 유세포 분석(Phenotypic flow cytometric analysis)4. Phenotypic flow cytometric analysis
SMT01 세포 군을 분석하기 위하여, 세포들을 PE 컨쥬게이트된 항-인간 CD56 및 항-인간 CD40 항체와, FITC 컨쥬게이트된 항-인간 CD3 및 항-인간 CD16 단일클론항체(BD Biosciences)로 염색하였다. 염색을 위하여, 인산염 완충 식염수(phosphate buffer saline, PBS)에서 SMT01을 2번 세척한 뒤 FACS 염색 버퍼(0.5 % 소 혈청 알부민을 포함하는 PBS)에 재부유시켰다. 그 후, 세포를 적절한 항체를 이용하여 4℃에서 30분 동안 염색하였다. PBS 버퍼를 이용하여 3번 세척한 뒤, FACS 유세포 분석기 (Beckton Dickinson AriaIII)에서 세포를 분석하였다. NK 세포군을 분석하기 위하여 자연살해세포를 CD56+/CD3- 및 CD56+/CD16+로 정의하였다. To analyze the SMT01 cell population, cells were stained with PE conjugated anti-human CD56 and anti-human CD40 antibodies, and FITC conjugated anti-human CD3 and anti-human CD16 monoclonal antibodies (BD Biosciences). For staining, SMT01 was washed twice in phosphate buffer saline (PBS) and then resuspended in FACS staining buffer (PBS containing 0.5% bovine serum albumin). Thereafter, the cells were stained for 30 minutes at 4°C using an appropriate antibody. After washing three times using PBS buffer, cells were analyzed in a FACS flow cytometer (Beckton Dickinson AriaIII). In order to analyze the NK cell population, natural killer cells were defined as CD56 + /CD3 - and CD56 + /CD16 + .
5. 세포 독성 분석5. Cytotoxicity analysis
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Mol. Tech., USA)를 이용하여 자연살해세포의 세포 독성 활성을 측정하였다. 인간 담도암 세포주에 대한 자연살해세포의 세포 독성 활성을 평가하기 위하여 양성 대조군으로 K562 세포를 사용하였다. 96-웰 플레이트에 각 웰당 1 x 104 세포로 SMT01 이펙터 세포(effector cells)를 접종한 뒤 24시간 동안 배양하였다. CCK8 키트를 이용하여 3 종류의 상이한 이펙터:타겟(E:T) 세포 비율 (1:5, 1:1, 및 5:1)에서 타겟 세포주의 세포 생존율을 측정하였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 결과는 하기 식을 이용하여 측정하였다. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Mol. Tech., USA) was used to measure the cytotoxic activity of natural killer cells. In order to evaluate the cytotoxic activity of natural killer cells against human biliary tract cancer cell lines, K562 cells were used as a positive control. SMT01 effector cells were inoculated at 1 x 10 4 cells per well in a 96-well plate and then cultured for 24 hours. The cell viability of the target cell lines was measured at three different effector: target (E:T) cell ratios (1:5, 1:1, and 5:1) using the CCK8 kit. Absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader. The cytotoxicity result was measured using the following formula.
세포 독성 (%) = 100% - ((ODe+t -ODb) - (ODe - ODb)) / (ODt - ODb) X 100% (OD, absorbance; e, effector; t, target; b, blank). Cytotoxicity (%) = 100%-((ODe+t -ODb)-(ODe-ODb)) / (ODt-ODb)
6. 조직학, 면역조직화학 (IHC) 및 TUNEL 분석 6. Histology, immunohistochemistry (IHC) and TUNEL analysis
조직학적 분석을 위하여, 누드 마우스로부터 HuCCT-1 종양을 분리한 뒤 파라핀에 고정시켰다. 조직 절편을 4 ㎛의 크기로 준비한 뒤, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 IHC 실험에 사용하였다. IHC 실험에 사용되는 항체는 항-인간 CD56 (BD Sciences), 자연 세포독성 수용체 1(natural cytotoxicity triggering receptor 1, NCR1)(BD Sciences), 및 항-인간 Caspase 3a 항체(Abcam)이다. 종양 절편 슬라이드를 사용하여 TUNEL 염색을 이용한 세포 자멸 세포의 제자리(in situ) 분석을 수행하였다. TUNEL 분석은 TumorTACS 제자리 세포 자멸 키트 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 수행하였다. 현미경 관찰을 위하여 Olympus MVX10을 사용하였고, Olympus BX51를 이용하여 슬라이드 절편을 촬영하였다. For histological analysis, HuCCT-1 tumors were isolated from nude mice and then fixed in paraffin. Tissue sections were prepared in a size of 4 μm, stained with hematoxylin and eosin (H&E), and used in IHC experiments. Antibodies used in IHC experiments are anti-human CD56 (BD Sciences), natural cytotoxicity triggering receptor 1 (NCR1) (BD Sciences), and anti-human Caspase 3a antibody (Abcam). Tumor section slides were used to perform an in situ analysis of apoptotic cells using TUNEL staining. TUNEL analysis was performed using the TumorTACS in situ apoptosis kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). For microscopic observation, Olympus MVX10 was used, and slide sections were photographed using Olympus BX51.
7. 통계적 분석 7. Statistical Analysis
체중, 종양 부피 및 종양 무게는 SAS (Version 9.3, SAS Institute Inc., USA)를 사용하여 평가하였다. 각 값은 평균±SD로 나타내었다. 등분산성을 위하여 Bartlett 테스트를 사용하였고, 통계적 유의성을 위하여 Dunnett t-테스트를 사용하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05에서 결정하였다. Body weight, tumor volume and tumor weight were evaluated using SAS (Version 9.3, SAS Institute Inc., USA). Each value is expressed as mean±SD. The Bartlett test was used for equal variance, and the Dunnett t-test was used for statistical significance. Statistical significance was determined at P <0.05.
8. PBMC로부터 SMT01, 세포 독성 자연살해세포의 증폭8. Amplification of SMT01, cytotoxic natural killer cells from PBMC
SMT01를 생산하기 위하여, MACSexpress를 이용하여 인간 말초혈액으로부터 자연살해세포를 분리한 뒤, CD3 양성 T 세포를 제거하였다. 그후, 분리된 자연살해세포를 IL-2 존재 하에서 14일 동안 배양하였다. SMT01 세포군을 결정하기 위하여, 자연살해세포 (CD56/CD3), T 세포 (CD3), 및 수지상 세포 및 B 세포 등의 림프구 세포 (CD40)를 인지하는 항체를 이용하여 생체 외에서 증폭된 자연살해세포를 염색하였다. 자연살해세포 아형을 결정하기 위하여 CD56/CD16 항체를 사용하였다. CD56 및 CD3 표현형에 근거하여 증폭된 세포 내 다수를 자연살해세포로 나타내었다. CD3+ T 세포군은 0.2%의 매우 낮은 수준으로 분포하는 것을 확인할 수 있었다(도 2(a)). SMT01 세포군 99.2%는 CD56+/CD3- 자연살해세포로 확인되었다. 자연살해세포 중 CD56dim 및 CD56bright 표현형 또한 관찰되었으며, SMT01에서는 특히 CD56dim 자연살해세포를 많이 포함하는 것으로 확인되었다.To produce SMT01, natural killer cells were isolated from human peripheral blood using MACSexpress, and then CD3-positive T cells were removed. Then, the isolated natural killer cells were cultured for 14 days in the presence of IL-2. In order to determine the SMT01 cell population, natural killer cells amplified in vitro using an antibody that recognizes natural killer cells (CD56/CD3), T cells (CD3), and lymphocyte cells (CD40) such as dendritic cells and B cells. Dyed. CD56/CD16 antibodies were used to determine the natural killer cell subtype. Based on the CD56 and CD3 phenotypes, many of the amplified cells were represented as natural killer cells. It was confirmed that the CD3 + T cell population was distributed at a very low level of 0.2% (FIG. 2(a)). 99.2% of the SMT01 cell group was identified as CD56 + /CD3 - natural killer cells. Among the natural killer cells, CD56 dim and CD56 bright phenotypes were also observed, and SMT01 was found to contain a large number of CD56 dim natural killer cells.
SMT01의 세포 용해 활성을 평가하였다(도 2(b)). 자연살해세포의 세포 독성을 평가하기 위하여 세포 계수 키트-8 (CCK-8)를 이용해 생균 타겟 세포의 수를 측정하였다. 인간 간 내(intrahepatic) 및 간 외(extrahepatic) 담도암(cholangiocarcinoma, CC) 세포주의 생존율을 비교하기 위하여 K562 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. SMT01는 K562 세포에 대하여 증가된 세포 용해 활성을 보였다. 담도암 세포주에 있어서는, SMT01는 간 외 담도암 세포주인 SNU1196 및 SNU478 세포주보다 간 내 담도암 세포주인 HuCCT1를 효과적으로 사멸시키는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 본 발명에 따라 유도된 자연살해세포는 간 내 담도암 세포주에 대한 세포 용해 효과가 현저히 뛰어난 것을 알 수 있었다. The cytolytic activity of SMT01 was evaluated (Fig. 2(b)). In order to evaluate the cytotoxicity of natural killer cells, the number of viable target cells was measured using a cell counting kit-8 (CCK-8). In order to compare the survival rates of human intrahepatic (intrahepatic) and extrahepatic (extrahepatic) cholangiocarcinoma (CC) cell lines, K562 cells were used as positive controls. SMT01 showed increased cytolytic activity against K562 cells. In the biliary tract cancer cell line, it was confirmed that SMT01 effectively killed the intrahepatic biliary tract cancer cell line, HuCCT1, than the SNU1196 and SNU478 cell lines, which are non-hepatic biliary cancer cell lines. Through this, it was found that the natural killer cells induced according to the present invention have remarkably excellent cytolytic effects on the biliary tract cancer cell line in the liver.
9. 누드 마우스에서 SMT01의 생체 외 연구 9. In vitro study of SMT01 in nude mice
SMT01의 용량 의존적 안전성 및 독성과 효능을 평가하기 위하여, 자연살해세포의 3가지 용량에 대하여 생체 내(in-vivo) 실험을 수행하였다(표 1 및 2). 누드 마우스의 꼬리 정맥에 SMT01를 주사하였다. 이때, SMT01의 저용량은 인간에게서 2X106 세포/kg에 해당하는 4X104 세포(cells)/동물(animal)로 설정하였고, 중간 용량 및 고용량은 각각 2X105 세포/동물 및 1x106 세포/동물로 설정하였다. 용량 의존적 안전성 및 독성 평가를 위하여, SMT01를 3주 간격으로 매주 2회 주입하여 총 18회 주입하되, 3개의 다른 용량으로 주입하였다(표 1, 도 1). 그 결과, SMT01을 최대 용량으로 주입하여도 별도의 치사 반응 없이 안전한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도면에는 포함하지 않았지만, 모든 SMT01 처리 그룹에 있어서 내부 장기를 관찰한 결과 자연살해세포 투여와 관련하여 그 어떤 독성도 관찰할 수 없었다. 또한, T 및 B 림프구의 특별한 변화도 관찰되지 않았는 바, 본 발명에 따른 SMT01는 면역 관련 부작용을 일으키지 않는 것을 알 수 있었다(표 1). In order to evaluate the dose-dependent safety, toxicity, and efficacy of SMT01, three doses of natural killer cells were tested in vivo (Tables 1 and 2). SMT01 was injected into the tail vein of nude mice. At this time, the low dose of SMT01 was set to 4X10 4 cells/animal corresponding to 2X10 6 cells/kg in humans, and the medium dose and high dose were set to 2X10 5 cells/animal and 1x10 6 cells/animal, respectively. I did. For the dose-dependent safety and toxicity evaluation, SMT01 was injected twice a week at three-week intervals for a total of 18 injections, but at three different doses (Table 1, Fig. 1). As a result, it was confirmed that even when SMT01 was injected at the maximum dose, it was safe without a separate lethal reaction. In addition, although not included in the figure, as a result of observing internal organs in all SMT01 treatment groups, no toxicity was observed in relation to the administration of natural killer cells. In addition, no specific changes in T and B lymphocytes were observed, and it was found that SMT01 according to the present invention did not cause immune-related side effects (Table 1).
담도암 세포주에 SMT01의 생체 내 세포 용해 활성을 평가하였다. 이를 위하여, 누드 마우스에 담도암 세포를 이종 이식하였다. 보다 상세하게는 HuCCT-1 세포를 5X106 세포/ml의 양으로 각 그룹의 누드 마우스 10 마리의 등에 피하 이식하였다. 담도암 세포 이식 후 8일이 경과하였을 때, 비슷한 종양 부피로 잘 생착된 누드 마우스를 선별한 뒤 생체 내 실험에 사용하였다. 처리를 위하여 음성 대조군(G1, 생리식염수 주입)을 포함하는 각 처리 그룹에서 선별된 8마리 마우스에 하기 표 2 및 도 1에 나타낸 방법으로 각 투여를 실시하였다. 화학-투여는 양성 대조군(G5, CDDP+Gem)으로 동일 수의 마우스에 대하여 수행하였다. SMT01의 다섯 번 투여를 3가지 다른 농도의 용량으로 나누었다(G2~G4). 누드 마우스로부터 종양을 채취한 뒤 종양 부피 및 무게를 측정하였다(도 3).In vivo cytolytic activity of SMT01 in biliary tract cancer cell lines was evaluated. To this end, biliary tract cancer cells were xenografted into nude mice. More specifically, HuCCT-1 cells were implanted subcutaneously on the backs of 10 nude mice in each group in an amount of 5 ×10 6 cells/ml. When 8 days had elapsed after biliary tract cancer cell transplantation, nude mice well engrafted with similar tumor volumes were selected and used for in vivo experiments. For treatment, 8 mice selected from each treatment group including the negative control group (G1, physiological saline injection) were administered by the method shown in Table 2 and FIG. 1 below. Chemical-administration was performed on the same number of mice as a positive control (G5, CDDP+Gem). Five doses of SMT01 were divided into three different concentration doses (G2-G4). After the tumor was collected from nude mice, the tumor volume and weight were measured (FIG. 3 ).
G1, G2, G3, G4, 및 G5 그룹 각각에서 투여 후 55일 경과하였을 때 관찰된 평균 종양 부피는 5324, 2769, 3491, 3193, 및 2167 mm3에 해당하였다(도 3(b)). 음성 대조군(G1)을 제외하고 모든 처리 그룹에서 종양의 성장 억제가 관찰되었다. 처리 그룹과 음성 대조군 그룹 각각에서 분리된 종양의 평균 무게 차이가 매우 큰 것을 볼 수 있었다(도 3(a)). 이러한 결과를 통하여 본 발명에 따른 SMT01 자연살해세포는 담도암 성장 억제 효과가 현저히 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 비록 최대 성장 억제는 화학 투여 그룹에서 관찰되었지만, 통계적 유의성은 없었다. 더욱이 모든 처리 그룹에서 체중 변화를 측정한 결과, 화학 투여 그룹에서는 마우스의 체중이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었는데(도 4(a)), 이는 식이와는 관련이 없는 것으로 확인되었다(도 4(b)). 그런데 본 발명에 따라 SMT01 자연살해세포를 처리 그룹에서는 마우스의 체중이 일정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 자연살해세포 치료는 삶의 질과 관련되며, 암 치료에서 중요한 파라미터로 작용하는 체중 유지에 유효한 효과를 가지는 것을 알 수 있다. The average tumor volumes observed 55 days after administration in each of the G1, G2, G3, G4, and G5 groups corresponded to 5324, 2769, 3491, 3193, and 2167 mm 3 (Fig. 3(b)). Inhibition of tumor growth was observed in all treatment groups except for the negative control group (G1). It could be seen that the average weight difference of the tumors isolated from the treatment group and the negative control group was very large (FIG. 3(a)). Through these results, it was confirmed that the SMT01 natural killer cells according to the present invention have a remarkably excellent effect of inhibiting the growth of biliary tract cancer. Although maximal growth inhibition was observed in the chemotherapy group, there was no statistical significance. Moreover, as a result of measuring the body weight change in all treatment groups, it was confirmed that the weight of the mice significantly decreased in the chemical administration group (Fig. 4(a)), which was confirmed to be not related to diet (Fig. )). However, in the group treated with SMT01 natural killer cells according to the present invention, it was confirmed that the weight of the mice was kept constant. Through this, it can be seen that natural killer cell therapy is related to quality of life and has an effective effect on weight maintenance, which is an important parameter in cancer treatment.
상기의 생체 내 연구를 통하여 본 발명에 따른 SMT01 자연살해세포가 간 내 담도암 세포에 대한 세포 용해 활성이 뛰어나고, 생체 내에서 특별한 부작용을 일으키지 않는 것을 알 수 있었다. Through the above in vivo studies, it was found that the SMT01 natural killer cells according to the present invention have excellent cytolytic activity against biliary tract cancer cells in the liver and do not cause any special side effects in vivo.
(동물 수)group
(Number of animals)
(세포 수/동물)Number of cells injected
(Number of cells/animal)
(mL/동물)Injection volume
(mL/animal)
(수컷/암컷)T cells
(Male/female)
(수컷/암컷)B cells
(Male/female)
(20)Negative control
(20)
용량group/
Volume
0 세포/두G1/
0 cells/two
G2: SMT01, 저용량(4X104 세포/두)
G3: SMT01, 중간 용량(2X105 세포/두)
G4: SMT01, 고용량(1X106 세포/두)
G5: 시스-디아민플라티넘(Ⅱ) 디클로라이드(CDDP)+젬시타빈(Gem)
N: 동물 수
정도: ±: 아주 적은, +: 적은, ++: 보통, +++: 높은, ++++: 심각한 G1: negative control (physiological saline)
G2: SMT01, low dose (4X10 4 cells/two)
G3: SMT01, medium dose (2X10 5 cells/two)
G4: SMT01, high dose (1X10 6 cells/two)
G5: cis-diamine platinum (II) dichloride (CDDP) + gemcitabine (Gem)
N: number of animals
Degree: ±: very little, +: little, ++: moderate, +++: high, ++++: serious
10. 누드 마우스 종양에서 SMT01 활성의 조직학적 영향 평가10. Evaluation of histological effects of SMT01 activity in nude mouse tumors
종양 조직 절편을 이용하여 SMT01의 세포 용해 활성을 평가하였다(도 5 및 6). 도 3에서 보는 바와 같이, 누드 마우스로부터 분리된 종양을 조직 절편을 제조하기 위하여 파라핀에 고정하였다. SMT01이 주입된 누드 마우스의 HuCCT-1 종양에 자연살해세포가 침투하였는지 확인하기 위하여 IHC 실험을 위해 항-인간 CD56 항체를 사용하였다. TUNEL 분석을 위하여 동일한 종양 조직 절편을 사용하였다. The cytolytic activity of SMT01 was evaluated using tumor tissue sections (FIGS. 5 and 6 ). As shown in FIG. 3, tumors isolated from nude mice were fixed in paraffin to prepare tissue sections. Anti-human CD56 antibody was used for the IHC experiment to confirm whether natural killer cells infiltrated the HuCCT-1 tumor of nude mice injected with SMT01. The same tumor tissue sections were used for TUNEL analysis.
G1(생리식염수 투입 그룹) 및 G5(화학-투여 마우스 그룹)으로부터 얻어진 조직 절편에 대한 IHC 실험 결과는 배경 수준에서 CD56 양성 신호를 보인 반면, SMT01 주입 그룹(G2-G4)의 경우 종양 결절(tumor nodules) 사이 간극(cleavage)에 주로 분포하는 CD45 세포의 IHC 시그널을 보였다. 즉, SMT01 자연살해세포는 누드 마우스에서 형성된 HuCCT-1 종양으로 침투한 것을 알 수 있었다(도 5). 또한 IHC 신호는 관 침투를 위하여 종양 내부에 조직 덩어리와 밀도가 느슨하게 분포된 부위에서 주로 관찰되는 것을 알 수 있었다(도 5, G2-G4, 화살표)IHC test results for tissue sections obtained from G1 (physiological saline input group) and G5 (chemical-administered mouse group) showed CD56 positive signal at the background level, whereas tumor nodules in the SMT01 injection group (G2-G4). nodules) showed IHC signals of CD45 cells mainly distributed in the cleavage. That is, it was found that SMT01 natural killer cells penetrated into HuCCT-1 tumors formed in nude mice (FIG. 5). In addition, it was found that the IHC signal is mainly observed in the area where the tissue mass and density are loosely distributed inside the tumor for vascular penetration (Fig. 5, G2-G4, arrows).
종양 조직을 침투하는 CD56 양성 자연살해세포의 침윤은 고해상도의 현미경에서 더 선명하게 관찰할 수 있었다(도 6(b)). 도 6(b)에서 보는 바와 같이, CD56 양성 자연살해세포는, SMT01을 주입한 G2 내지 G4 마우스 그룹에서 혈관을 통해 세포가 이종 이식된 종양 조직을 침투한 부위에서 밀집되어 분포하는 것을 관찰할 수 있었다. 자연살해세포의 활성화 수용체인, NCR1에 대한 IHC 실험에서 유사한 결과를 얻을 수 있었는 바, 침투하는 세포가 자연살해세포인 것을 알 수 있었다(도 6(b), NCR1 패널). TUNEL 염색 및 세포 자멸 마커인, 카스파제 3a에 대한 IHC 실험을 통하여 세포 자멸 신호를 검출하였다(도 6(a), (b)). 그 결과, 본 발명에 따른 SMT01 자연살해세포가 주입된 종양에서 종양 세포의 자멸을 다수 관찰할 수 있었다(도 6(a)). 또한, 세포 자멸한 세포는 자연살해세포 군집 부위에서 현저히 많이 관찰되었는 바, 이를 통하여, 유출되어 나온 자연살해세포가 종양 혈관 부근의 종양 세포에 대하여 세포 용해 활성을 나타내는 것을 알 수 있었고, 본 발명에 따른 SMT01 자연살해세포는 특히 간 내 담도암 세포주에 대하여 세포 독성이 뛰어난 것을 알 수 있었다. The invasion of CD56-positive natural killer cells penetrating the tumor tissue could be observed more clearly under a high-resolution microscope (FIG. 6(b)). As shown in Fig. 6(b), it can be observed that in the group of G2 to G4 mice injected with SMT01, the CD56-positive natural killer cells are densely distributed at the site where the cells penetrated the xenografted tumor tissue through blood vessels. there was. Similar results were obtained in the IHC experiment for NCR1, an activation receptor for natural killer cells, and it was found that the infiltrating cells were natural killer cells (Fig. 6(b), NCR1 panel). Apoptosis signals were detected through IHC experiments for TUNEL staining and apoptosis marker, caspase 3a (FIGS. 6(a), (b)). As a result, it was possible to observe a number of apoptosis of tumor cells in the tumor injected with SMT01 natural killer cells according to the present invention (FIG. 6(a)). In addition, apoptotic cells were observed significantly in the area of the natural killer cell cluster, and through this, it was found that the outflowed natural killer cells exhibit cytolytic activity against tumor cells near the tumor vessels. Thus, it was found that SMT01 natural killer cells were particularly toxic to liver biliary tract cancer cell lines.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.Although the embodiments of the present invention have been described in detail above, the scope of the present invention is not limited thereto, and various modifications and variations are possible without departing from the technical spirit of the present invention described in the claims. It will be obvious to those of ordinary skill in the field.
Claims (5)
상기 CD3+ T 세포가 제거된 말초혈액 단핵세포를, 인터루킨-2(interleukin-2, IL-2)가 500 내지 1500 IU/ml의 양으로 포함된 배양 배지가 10 내지 30 ml로 포함된 T75 플라스크에서 5 내지 7일 동안 배양한 뒤 T175 플라스크로 이동시켜 7 내지 14일 동안 추가로 배양하는 단계를 포함하고,
상기 배양 배지는 염화나트륨(NaCl) 0.5 내지 0.6 중량%, D-글루코스(D-glucose) 0.4 내지 0.5 중량%, 아미노산 0.2 내지 0.3 중량%, NaHCO3 0.15 내지 0.25 중량% 및 HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 0.15 내지 0.25 중량%를 포함하는, 담도암의 예방 또는 치료용 자연살해세포의 분화 방법. Removing CD3 + T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC); And
The peripheral blood mononuclear cells from which the CD3 + T cells are removed are a T75 flask containing 10 to 30 ml of a culture medium containing interleukin-2 (IL-2) in an amount of 500 to 1500 IU/ml Incubating for 5 to 7 days at, and then moving to a T175 flask and further culturing for 7 to 14 days,
The culture medium is sodium chloride (NaCl) 0.5 to 0.6% by weight, D-glucose (D-glucose) 0.4 to 0.5% by weight, amino acids 0.2 to 0.3% by weight, NaHCO3 0.15 to 0.25% by weight and HEPES (4-(2-hydroxyethyl) )-1-piperazineethanesulfonic acid) Method of differentiation of natural killer cells for the prevention or treatment of biliary tract cancer, comprising 0.15 to 0.25% by weight.
상기 CD3+ T 세포가 제거된 말초혈액 단핵세포는 인터루킨-2가 800 내지 1200 IU/ml의 양으로 포함된 배양 배지에서 배양되는, 담도암의 예방 또는 치료용 자연살해세포의 분화 방법.The method of claim 1,
The peripheral blood mononuclear cells from which the CD3 + T cells are removed are cultured in a culture medium containing interleukin-2 in an amount of 800 to 1200 IU/ml, a method for differentiation of natural killer cells for the prevention or treatment of biliary tract cancer.
분화된 자연살해세포는 CD56bright 또는 CD56dim의 표현형을 갖는 자연살해세포를 포함하는, 담도암의 예방 또는 치료용 자연살해세포의 분화 방법.The method of claim 1,
Differentiated natural killer cells include natural killer cells having a CD56 bright or CD56 dim phenotype, a method for differentiation of natural killer cells for the prevention or treatment of biliary tract cancer.
상기 분화된 자연살해세포는 CD56dim의 표현형을 갖는 자연살해세포를 CD56bright의 표현형을 갖는 자연살해세포 보다 더 많이 포함하는, 담도암의 예방 또는 치료용 자연살해세포의 분화 방법.The method of claim 3,
The differentiated natural killer cells contain more natural killer cells having a phenotype of CD56 dim than that of natural killer cells having a phenotype of CD56 bright , the differentiation method of natural killer cells for the prevention or treatment of biliary tract cancer.
상기 담도암은 간 내(intrahepatic) 담도암인, 담도암의 예방 또는 치료용 자연살해세포의 분화 방법.The method of claim 1,
The biliary tract cancer is intrahepatic (intrahepatic) biliary tract cancer, a method of differentiation of natural killer cells for the prevention or treatment of biliary tract cancer.
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