KR20200099218A - Simple method for differentiating human pluripotent stem cells into highly proliferative vascular endothelial cells for hemophilia A treatment - Google Patents

Simple method for differentiating human pluripotent stem cells into highly proliferative vascular endothelial cells for hemophilia A treatment Download PDF

Info

Publication number
KR20200099218A
KR20200099218A KR1020190016414A KR20190016414A KR20200099218A KR 20200099218 A KR20200099218 A KR 20200099218A KR 1020190016414 A KR1020190016414 A KR 1020190016414A KR 20190016414 A KR20190016414 A KR 20190016414A KR 20200099218 A KR20200099218 A KR 20200099218A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
vascular endothelial
endothelial cells
stem cells
differentiation
Prior art date
Application number
KR1020190016414A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR102161910B1 (en
Inventor
김종훈
손정상
Original Assignee
(주) 넥셀
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주) 넥셀 filed Critical (주) 넥셀
Priority to KR1020190016414A priority Critical patent/KR102161910B1/en
Publication of KR20200099218A publication Critical patent/KR20200099218A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102161910B1 publication Critical patent/KR102161910B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The present invention relates to a differentiation method for hyperproliferative vascular endothelial cells for cell therapy of type 1 hemophilia and a use thereof. The present invention can be utilized in the treatment of various vascular diseases, such as type 1 hemophilia, by obtaining actively proliferating vascular endothelial cells in high purity in a short period of time using only a minimum amount of factors during the formation of vascular endothelial cells using pluripotent stem cells.

Description

제１형 혈우병의 세포치료를 위한 고증식성 혈관내피세포 분화방법 및 용도{Simple method for differentiating human pluripotent stem cells into highly proliferative vascular endothelial cells for hemophilia A treatment}Simple method for differentiating human pluripotent stem cells into highly proliferative vascular endothelial cells for hemophilia A treatment}

본 발명은 제1형 혈우병의 세포치료를 위한 고증식성 혈관내피세포 분화방법 및 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a method and use of highly proliferative vascular endothelial cells for cell therapy of type 1 hemophilia.

전체 혈액응고 관련 질환 중 59.7%(2014년 한국혈우재단)를 차지하는 제1형 혈우병(hemophilia A, HA)은 혈액응고인자 8번(Factor VIII, FVIII)의 문제로 발생하는 성염색체 유전질환이다. HA 환자는 일생동안 재조합 혈액응고인자 8번 제제를 1주일에 2~3번 주사 투여한다. 이러한 방식으로 혈중 FVIII의 농도를 일정수준까지 유지하는 예방요법(prophylaxis)이 현재 가장 널리 이용되는 HA 치료법이자 예방법이다.Hemophilia type 1 (hemophilia A, HA), which accounts for 59.7% of all blood clotting-related diseases (Korea Hemophilia Foundation in 2014), is a sex chromosome inherited disease caused by a problem with factor VIII, FVIII. HA patients are administered recombinant coagulation factor 8 by injection 2-3 times a week throughout their lifetime. In this way, prophylaxis, which maintains the concentration of FVIII in the blood to a certain level, is currently the most widely used HA treatment and prevention method.

1992년에 재조합 혈액응고인자 제재가 개발되었으며 2000년대 이후로는 해당 제제의 반감기와 약효를 증가시키기 위한 노력이 진행되고 있다. 하지만, 이는 근본적인 치료가 되지 못하므로 최근 들어 문제가 되는 FVIII 유전자를 교정하는 방식의 접근이 유전자치료, 세포 치료적으로 대두되고 있다.Recombinant coagulation factor formulations were developed in 1992, and efforts have been made to increase the half-life and efficacy of the drug since the 2000s. However, since this is not a fundamental treatment, the approach of correcting the problem FVIII gene has recently emerged as gene therapy and cell therapy.

인간의 체내에서 FVIII을 생산, 분비한다고 생각되는 세포 종류는 오래 전부터 논란이 되어 왔다. 우선 정상인의 간(liver)을 혈우병 환자에게 이식하였을 경우 혈우병 환자의 증상이 완화되는 것을 통해 FVIII의 주요 생산세포가 간 대부분을 구성하는 간세포(hepatocyte)일 것이라 생각하였다. 또한, 기존에 알려진 혈액응고인자 10여 종 중 FVIII을 제외한 나머지 인자들이 모두 간세포에서 생산된다는 근거가 이러한 가설에 힘을 실어주었다. 하지만, 혈우병 마우스의 간을 정상 마우스에 이식하였을 경우 혈우병의 표현형이 유발되지 않는다는 연구결과와 급성, 만성 간질환 환자의 혈중 내 FVIII 수치가 정상인보다 같거나 높은 것은 앞선 주장을 뒷받침하지 못한다. 불과 최근 2년 전까지도 FVIII을 생산하는 체내 세포 종류에 대해 논란이 있었으며 이는 크게 간세포, 모세혈관세포, 간 동모양 혈관내피세포(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC), 혈관내피세포 그리고 중간엽 줄기세포로 견해가 나뉘었다.Cell types that are thought to produce and secrete FVIII in the human body have long been controversial. First of all, when the liver of a normal person was transplanted to a hemophilia patient, it was thought that the main production cells of FVIII would be hepatocytes that make up most of the liver through the alleviation of the symptoms of the hemophilia patient. In addition, the evidence that all of the other factors except FVIII are produced in hepatocytes among the 10 known blood coagulation factors, gave strength to this hypothesis. However, the results of a study that the hemophilia phenotype is not induced when livers of hemophilia mice are transplanted into normal mice and that the blood FVIII levels of patients with acute and chronic liver disease are the same or higher than those of normal do not support the previous claim. Until the last two years, there was controversy over the types of cells in the body that produce FVIII, and these are largely divided into hepatocytes, capillary cells, liver sinusoidal endothelial cells (LSEC), vascular endothelial cells and mesenchymal stem cells. The views were divided.

본 발명자들은 이전 연구에서 역분화줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 타 연구진의 분화 방법들을 이용하여 혈관내피세포로 분화시킨 후 혈우병 모델 마우스에 이식하여 표현형적 완화를 살펴보았다. 혈우병 표현형을 확인하는 방법으로는 세포이식을 받은 마우스의 꼬리 끝을 잘라 출혈을 유도한 후 사망률을 측정하는 것인데 이 경우 약 40% 만이 생존하였다. 나머지 60%가 사망한 이유는 크게 두 가지로 접근할 수 있다. 첫 번째로, 분화시킨 혈관내피세포의 순도(purity)가 현격히 낮았으며 별도의 정제과정 없이 HA 마우스에 이식하였음에 기인한다. 두 번째로, 이식 후 눈에 띄는 표현형적 완화를 관찰하기에는 분화시킨 혈관내피세포와 이식된 세포의 양이 현저히 적었음에 있다.In a previous study, the present inventors examined phenotypic relief by differentiating induced pluripotent stem cells (iPSCs) into vascular endothelial cells using differentiation methods of other researchers, and then transplanting them into hemophilia model mice. The method of confirming the hemophilia phenotype is to cut the tail end of the mouse that received the cell transplant to induce bleeding and measure the mortality rate. In this case, only about 40% survived. There are two main reasons why the remaining 60% died. First, the purity of the differentiated vascular endothelial cells was remarkably low, and it was due to transplantation into HA mice without a separate purification process. Second, the amount of differentiated vascular endothelial cells and transplanted cells was remarkably small to observe noticeable phenotypic relief after transplantation.

Cell Stem Cell. 6;17(2):213-20 92015.08.06) Cell Stem Cell. 6;17(2):213-20 92015.08.06)

본 발명의 목적은 전분화능 줄기세포를 이용하여 단기간에 최소한의 성장인자만을 이용하여 고증식성 혈관내피세포를 분화 유도 및 증식하는 방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a method of inducing differentiation and proliferation of highly proliferative vascular endothelial cells using only a minimum growth factor in a short period of time using pluripotent stem cells.

본 발명의 다른 목적은 상기 혈관내피세포의 분화 유도 및 증식 방법으로부터 수득한 혈관내피세포 및 이의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide vascular endothelial cells obtained from the method for inducing differentiation and proliferation of vascular endothelial cells, and a pharmaceutical use thereof.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포를 CHIR99021, Y-27632, 아스코르브산, 액티빈 A(Activin A) 및 ITS를 함유한 분화배지에서 배양하여 중배엽성 세포로 분화 유도하는 단계; In order to achieve the above object, the present invention is to induce differentiation into mesodermal cells by culturing stem cells in a differentiation medium containing CHIR99021, Y-27632, ascorbic acid, activin A and ITS;

상기 중배엽성 세포를 VEGF165(Vascular endothelial growth factor 165)를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 배양하여 혈관내피세포로 분화 유도하고, CD31 양성인 혈관내피세포를 분리 정제하는 단계; 및Culturing the mesodermal cells in an animal-derived material removal culture medium containing VEGF165 (Vascular endothelial growth factor 165) to induce differentiation into vascular endothelial cells, and separating and purifying CD31-positive vascular endothelial cells; And

상기 정제된 혈관내피세포를 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 배양하여 증식하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 혈관내피세포의 분화 및 증식 촉진 방법을 제공한다.It provides a method for promoting differentiation and proliferation of vascular endothelial cells from stem cells, comprising the step of culturing and proliferating the purified vascular endothelial cells in an animal-derived material removal culture medium containing VEGF165.

본 발명은 또한 상기의 방법으로 분화되고, 초대배양 간 동모양 혈관내피세포(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC) 대비 1/4 내지 1/8 수준으로 FVIII 단백질을 생산하는 혈관내피세포를 제공한다.The present invention also provides vascular endothelial cells that are differentiated by the above method and produce FVIII protein at a level of 1/4 to 1/8 compared to primary cultured liver sinusoidal endothelial cells (LSEC).

본 발명은 또한 상기의 혈관내피세포를 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 배양하여 혈관망을 형성하는 단계를 포함하는 혈액응고인자 8(FVIII) 단백질 생산 촉진 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for promoting blood coagulation factor 8 (FVIII) protein production comprising the step of forming a vascular network by culturing the vascular endothelial cells in an animal-derived substance removal culture medium containing VEGF165.

본 발명은 또한 상기의 혈관내피세포를 포함하는 혈우병 치료용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for treating hemophilia comprising the vascular endothelial cells.

본 발명은 또한 상기의 혈관내피세포의 치료적 유효량을 혈우병 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈우병의 치료방법을 제공한다.The present invention also provides a method for treating hemophilia comprising administering the therapeutically effective amount of the vascular endothelial cells to a subject with hemophilia.

본 발명은 전분화능 줄기세포를 이용하여 혈관내피세포를 형성하는 과정 중에 최소한의 인자만을 이용하여 단기간에 순도 높은 증식이 활발한 혈관내피세포를 얻음으로써 다양한 혈관 질환, 예컨대 제1형 혈우병 등의 치료에 활용될 수 있다.The present invention uses pluripotent stem cells to obtain vascular endothelial cells with high purity and active proliferation in a short period of time by using only minimal factors during the process of forming vascular endothelial cells, thereby providing treatment for various vascular diseases, such as hemophilia type 1 Can be utilized.

도 1은 영양세포가 없는 상태에서 유지되고 있는 미분화 상태의 인간 전분화능 줄기세포(인간 배아줄기세포, 인간 역분화줄기세포)를 최소한의 성장인자와 화합물을 처리하여 단기간에 증식이 활발한 혈관내피세포로 분화시키는 모식도를 나타낸다.
도 2a는 인간 역분화줄기세포를 본 발명의 혈관내피세포 분화 방법으로 분화시킨 후 단계별로 유전자의 발현을 확인한 qPCR 결과이다(Undiff: hiPSC 미분화; 2, 4, 5일차: hiPSC 분화 2, 4, 5일차; P0, P1, P2: hiPSC 유래 혈관내피세포의 계대번호; ESC_P0: hESC 유래 혈관내피세포; HUVEC: Human umbilical cord derived endothelial cell; hLSEC: human liver sinusoidal endothelial cell).
도 2b는 hESC와 hiPSC를 본 발명의 혈관내피세포 분화 방법으로 분화시켜 얻은 고순도의 혈관내피세포를 증식이 활발한 혈관내피세포 군집 형성세포의 특징으로 알려진 CD31과 NRP1 표면 마커를 사용하여 유세포분석(FACS)으로 확인한 결과이다(hESC-EC: MACS 분리 후 2번 계대, hiPSC-EC: MACS 분리 후 계대하지 않은 상태).
도 3a는 분화된 혈관내피세포의 특성 확인을 위해 인 비트로 맥관 형성(in vitro tube formation)과 형성된 맥관에 Calcein AM과 PI 염색을 시행하여 얻은 사진도이다.
도 3b는 혈관내피세포의 전염증성 사이토카인의 노출에 따른 세포 표면 분자의 변화를 hiPSC 유래 혈관내피세포에서 형광염색과 qPCR을 통해 확인한 결과이다.
도 4a는 CD31 양성인 세포를 MACS를 이용하여 분리한 직후(P0)부터 계대배양을 5번까지 진행하면서 얻은 세포 성장 곡선이다.
도 4b는 hiPSC로부터 분화된 혈관내피세포를 냉동보관한 후, 4주 후에 녹여 다시 인큐베이터에서 배양하였을 때 새로운 세포와 생장률이 비슷한지를 확인한 결과이다.
도 4c는 hiPSC로부터 분화된 혈관내피세포의 단백질 발현을 계대 1번, 5번한 샘플에서 형광염색을 통해 확인한 결과이다.
도 5a는 hiPSC로부터 분화시킨 혈관내피세포의 혈우병 마우스 모델에 이식 후 생착 및 분포를 살펴보기 위한 in vivo tracking의 목적으로 Neo-LIVE라는 나노입자를 세포 배양액에 처리하여 나노입자의 흡수가 용이하게 진행되었는지 확인한 유세포분석 결과이다.
도 5b는 hiPSC로부터 분화된 혈관내피세포에 NEO-LIVE라는 형광을 나타내는 입자를 처리한 후 면역 억제된 마우스에 이식한 후 Maestro라는 생체영상분석장치를 사용하여 마우스 내 분포를 확인한 결과이다.
도 5c는 도 5b에 언급된 방법으로 이식받은 마우스의 이식 20일차에 이식부위(graft)를 적출하여 혈관내피세포 마커인 vWF, VE-cadherin 및 FVIII의 발현을 형광염색을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 야생형(wild-type) 역분화 줄기세포와 FVIII 유전자 2종의 인간 역분화줄기세포를 혈관내피세포로 각각 분화시킨 후 FVIII의 발현을 qPCR을 통해 살펴본 결과이다.
도 7은 인간 역분화줄기세포, 이로부터 분화한 혈관내피세포 2종(계대 1번, 2번) 그리고 FVIII 생산 양성 세포로 알려진 초대배양 간 동모양 혈관내피세포(hLSEC)의 용해물(lysate)과 배양액을 수거하여 FVIII의 양을 ELISA를 통해 살펴본 결과이다.
도 8은 TVTB(tail vein transection bleeding) 실험을 시행한 결과이다. 1 is a vascular endothelial cell that is active in proliferation in a short period of time by treating human pluripotent stem cells (human embryonic stem cells, human dedifferentiated stem cells) in an undifferentiated state maintained in the absence of feeder cells with minimal growth factors and compounds. It shows a schematic diagram to differentiate into.
Figure 2a is a qPCR result confirming the expression of the gene step by step after differentiating human dedifferentiated stem cells by the vascular endothelial cell differentiation method of the present invention (Undiff: hiPSC undifferentiated; days 2, 4, 5: hiPSC differentiation 2, 4, Day 5; P0, P1, P2: passage number of hiPSC-derived vascular endothelial cells; ESC_P0: hESC-derived vascular endothelial cells; HUVEC: Human umbilical cord derived endothelial cell; hLSEC: human liver sinusoidal endothelial cell).
Figure 2b is a flow cytometric analysis (FACS) of high purity vascular endothelial cells obtained by differentiating hESCs and hiPSCs by the vascular endothelial cell differentiation method of the present invention using CD31 and NRP1 surface markers known as features of vascular endothelial cluster-forming cells with active proliferation. ) (HESC-EC: passage 2 after separation of MACS, hiPSC-EC: no passage after separation of MACS).
3A is a photographic view obtained by performing in vitro tube formation and performing Calcein AM and PI staining on the formed vessels to confirm the characteristics of differentiated vascular endothelial cells.
3B is a result of confirming changes in cell surface molecules according to exposure of proinflammatory cytokines in vascular endothelial cells through fluorescence staining and qPCR in hiPSC-derived vascular endothelial cells.
4A is a cell growth curve obtained from immediately after isolation of CD31-positive cells using MACS (P0) through passage 5 times.
4B is a result of confirming whether the growth rate of new cells is similar to that of new cells when vascular endothelial cells differentiated from hiPSC are stored frozen, dissolved after 4 weeks, and cultured again in an incubator.
4C is a result of confirming the expression of proteins in vascular endothelial cells differentiated from hiPSC through fluorescence staining in samples of passages 1 and 5. FIG.
Figure 5a is a nanoparticle called Neo-LIVE treated in a cell culture solution for the purpose of in vivo tracking after transplantation into a hemophilia mouse model of vascular endothelial cells differentiated from hiPSC to examine engraftment and distribution to facilitate absorption of nanoparticles This is the result of flow cytometry to confirm that it has been performed.
Figure 5b is a result of confirming the distribution in the mouse using a biometric image analysis device called Maestro after treatment with a fluorescent particle called NEO-LIVE on vascular endothelial cells differentiated from hiPSC and implantation in an immunosuppressed mouse.
5C is a result of confirming the expression of vWF, VE-cadherin, and FVIII, which are vascular endothelial cell markers, through fluorescence staining by extracting the graft on the 20th day of transplantation of the mouse transplanted by the method mentioned in FIG. 5B.
6 is a result of examining the expression of FVIII through qPCR after differentiating wild-type dedifferentiated stem cells and human dedifferentiated stem cells of two types of FVIII genes into vascular endothelial cells, respectively.
7 is a lysate of human dedifferentiated stem cells, two types of vascular endothelial cells differentiated therefrom (passage 1 and 2), and primary cultured liver homologous vascular endothelial cells (hLSEC) known as FVIII-producing positive cells. This is the result of collecting fruit culture and examining the amount of FVIII through ELISA.
8 is a result of a TVTB (tail vein transection bleeding) experiment.

본 발명자들은 종래기술의 문제점을 해결하고자 98% 이상의 CD31과 다른 표지자를 발현하는 고증식성 혈관내피세포를 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화하는 프로토콜을 확립하였다. 또한, 분화된 혈관내피세포는 혈액응고인자인 FVIII 단백질을 생산하는 것이 확인되어 HA 마우스 모델과 혈우병 환자의 세포치료적 접근을 위한 실험실 연구에 사용할 수 있다.The present inventors have established a protocol for differentiating highly proliferative vascular endothelial cells expressing more than 98% of CD31 and other markers from human pluripotent stem cells in order to solve the problems of the prior art. In addition, differentiated vascular endothelial cells have been confirmed to produce FVIII protein, which is a blood coagulation factor, and thus can be used in a laboratory study for an HA mouse model and a cellular therapeutic approach in hemophilia patients.

따라서, 본 발명은 줄기세포를 CHIR99021, Y-27632, 아스코르브산, 액티빈 A(Activin A) 및 ITS를 함유한 분화배지에서 배양하여 중배엽성 세포로 분화 유도하는 단계;Accordingly, the present invention comprises the steps of inducing differentiation into mesodermal cells by culturing stem cells in a differentiation medium containing CHIR99021, Y-27632, ascorbic acid, activin A and ITS;

상기 중배엽성 세포를 VEGF165(Vascular endothelial growth factor 165)를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 배양하여 혈관내피세포로 분화 유도하고, CD31 양성인 혈관내피세포를 분리 정제하는 단계; 및Culturing the mesodermal cells in an animal-derived material removal culture medium containing VEGF165 (Vascular endothelial growth factor 165) to induce differentiation into vascular endothelial cells, and separating and purifying CD31-positive vascular endothelial cells; And

상기 정제된 혈관내피세포를 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 배양하여 증식하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 혈관내피세포의 분화 및 증식 촉진 방법에 관한 것이다.It relates to a method for promoting differentiation and proliferation of vascular endothelial cells from stem cells comprising the step of culturing and proliferating the purified vascular endothelial cells in an animal-derived material removal culture medium containing VEGF165.

본 발명의 줄기세포로부터 혈관내피세포의 분화 및 증식 촉진 방법은 전분화능 줄기세포를 중배엽 유도 인자들을 처리하여 중배엽성 세포로 분화 유도한 후 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 혈관내피세포로 분화 유도하고, CD31을 이용한 고순도의 CD31 양성 혈관내피세포를 분리 정제하여 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 증식함으로써 고증식 혈관내피세포를 얻는 것을 특징으로 한다.In the method for promoting differentiation and proliferation of vascular endothelial cells from stem cells of the present invention, pluripotent stem cells are treated with mesoderm inducing factors to induce differentiation into mesodermal cells, and then differentiate into vascular endothelial cells in an animal-derived material removal culture medium containing VEGF165. It is characterized in that high-proliferation vascular endothelial cells are obtained by induction and by separating and purifying high-purity CD31-positive vascular endothelial cells using CD31 and proliferating in an animal-derived material removal culture medium containing VEGF165.

본 발명에서, 용어 "줄기세포"는 분화능(potency) 및 자기재생(self-renewal)능을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화 능력에 따라 전분화능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 또는 단일분화능(unipotency)로 나누어진다. 상기 줄기세포는 분화능과 자기재생능을 갖는 것이라면, 그 종류 및 유래가 제한되지 아니한다. 상기 줄기세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수로부터 유래한 것일 수 있다. 용어 "분리된"은 자연적으로 발생하는 세포 또는 조직의 환경과는 다른 환경에 존재하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 상기 줄기세포는 미분화 또는 역분화 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem cell, iPSC), 체세포복제줄기세포(somatic cell nuclear transfer, SCNT), 또는 전분화능줄기세포(pluripotent stem cells, PSC) 등에서 선택된다.In the present invention, the term "stem cell" refers to a cell having potency and self-renewal capability. Stem cells are divided into pluripotency, multipotency, or unipotency according to their differentiation ability. As long as the stem cells have differentiation ability and self-renewal ability, the type and origin are not limited. The stem cells may be derived from, for example, mammals, humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice or rabbits. The stem cells may be derived from an isolated umbilical cord, placenta, fat, bone marrow, umbilical cord blood, or amniotic fluid. The term "isolated" means to exist in an environment different from that of a naturally occurring cell or tissue. Preferably, the stem cells are undifferentiated or dedifferentiated embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSCs), somatic cell nuclear transfer (SCNT), or It is selected from pluripotent stem cells (PSC) and the like.

줄기세포 배양 시 사용되는 배지는 줄기세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있는데, 예를 들면, DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium), Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium), RPMI-1640 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 DMEM 배지를 사용할 수 있다. 이들 배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함하며, 줄기세포의 배양 시 동물 유래 혈청을 약 10% 내지 30% 정도 포함하여 배양하고자 하는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공하게 된다. 줄기세포 배양에 사용되는 혈청은 태아, 송아지, 말 또는 사람의 혈청일 수 있고, 바람직하게는, 우태아혈청(FBS)일 수 있다. 또한, 동물 유래 혈청과 유사한 성분을 가지는 화합물, 예를 들어, BPE(bovine pituitary extract) 등을 사용할 수도 있다. The medium used for stem cell cultivation may be a conventional medium that can be used for culturing stem cells. For example, DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium), Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium), RPMI- 1640 or the like may be used, and DMEM medium may be preferably used. These mediums contain salts, vitamins, buffers, energy sources, amino acids and other substances, and contain about 10% to 30% of animal-derived serum when culturing stem cells to provide universal nutrients for the growth of cells to be cultured. Will be provided. The serum used for stem cell culture may be fetal, calf, horse, or human serum, and preferably, fetal calf serum (FBS). In addition, a compound having a component similar to that of animal-derived serum, for example, bovine pituitary extract (BPE) or the like may be used.

또한, 줄기세포 배양 시, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 좋다. 항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 펀지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신 등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다. In addition, when culturing stem cells, it is recommended to add antibiotics, antifungal agents, and reagents that prevent the growth of mycoplasma causing contamination. As the antibiotic, antibiotics commonly used in cell culture, such as penicillin, streptomycin, or fungizone, may be used. It is preferable to use amphotericin B as an antifungal agent, and tylosin as a mycoplasma inhibitor, and gentamicin, ciprofloxacin, azithromycin, etc. can prevent mycoplasma contamination.

필요에 따라 L-글루타민 등의 산화영양소와 소듐 피루베이트 등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.If necessary, oxidizing nutrients such as L-glutamine and energy metabolites such as sodium pyruvate may be further added.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90 내지 95％, 온도 25 내지 40℃, 5 내지 10％ CO2 배양기에서 배양하고, 5 내지 10％ CO2 배양 시에는 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량％가 되게 소듐 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다. General culture conditions of initial culture are cultured in a humidity 90-95%, temperature 25-40℃, 5-10% CO 2 incubator by applying the most suitable conditions for cell culture, and final concentration in 5-10% CO 2 culture. A carbon control source such as sodium bicarbonate may be added to 0.17 to 0.22% by weight.

상기 줄기세포를 중배엽성 세포로 분화 유도하기 위해 중배엽 유도 인자, 즉, CHIR99021, Y-27632, 아스코르브산, 액티빈 A 및 ITS를 사용한다.In order to induce differentiation of the stem cells into mesodermal cells, mesoderm inducing factors, that is, CHIR99021, Y-27632, ascorbic acid, activin A, and ITS are used.

상기 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)는 GSK(glycogen synthase kinase) 억제제로 GSK 신호전달과정에 관여하는 GSK1/2의 업스트림 분자인 GSK1/2를 표적으로 하는 물질로, 아미노피리미딘(aminopyrimidine)으로 표시될 수 있다. 상기 CHIR99021은 5 내지 10 μM의 농도, 바람직하게는 5 내지 7μM의 농도로 사용될 수 있다.The CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3- Pyridinecarbonitrile) is a GSK (glycogen synthase kinase) inhibitor, a substance that targets GSK1/2, an upstream molecule of GSK1/2 involved in the GSK signaling process, and can be expressed as aminopyrimidine. The CHIR99021 may be used at a concentration of 5 to 10 μM, preferably 5 to 7 μM.

상기 Y-27632는 Rho associated kinase(Rho 관련 코일드코일 함유 단백질 키나아제)의 저해제로 사용되는 물질로, 저분자 GTP-결합단백질인 Rho의 하류에서 작용하는 세린/트레오닌 키나아제인 ROCK를 억제할 수 있다. 상기 Y-27632는 2 내지 10 μM의 농도, 바람직하게는 5 내지 10 μM의 농도로 포함될 수 있다.Y-27632 is a substance used as an inhibitor of Rho associated kinase (Rho-related coiled coil-containing protein kinase), and can inhibit ROCK, a serine/threonine kinase acting downstream of Rho, a low-molecular GTP-binding protein. The Y-27632 may be included in a concentration of 2 to 10 μM, preferably 5 to 10 μM.

상기 액티빈 A(Activin A)는 TGF-

Figure pat00001
수퍼패밀리의 구성원으로서, 중배엽 유도, 신경세포 분화, 골 리모델링, 조혈작용 등의 광범위한 생물학적 활성을 갖는 물질로, 상기 액티빈 A는 0.5 내지 5 ng/mL의 농도, 바람직하게는 0.5 내지 2 ng/mL의 농도로 포함될 수 있다.The activin A (Activin A) is TGF-
Figure pat00001
As a member of the superfamily, it is a substance having a wide range of biological activities such as mesoderm induction, neuronal differentiation, bone remodeling, and hematopoietic activity, and the activin A is at a concentration of 0.5 to 5 ng/mL, preferably 0.5 to 2 ng/ It can be contained in a concentration of mL.

상기 아스코르브산(ascorbic acid)은 생물학적 분자들의 합성에 필요한 조효소로 작용하며, 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 강력한 효능이 있는데, 50 내지 300 μM의 농도, 바람직하게는 100 내지 200 μM의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.The ascorbic acid acts as a coenzyme necessary for the synthesis of biological molecules and has a strong effect of protecting cells from oxidative stress, and is used in a concentration of 50 to 300 μM, preferably 100 to 200 μM. It is desirable to do.

상기 ITS는 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 적절히 혼합해서 조제한 시판의 ITS supplement를 사용할 수 있다. 상기 ITS는 희석 없이 시판의 ITS supplement를 사용할 수 있다.As the ITS, a commercially available ITS supplement prepared by appropriately mixing insulin, transferrin, and selenate can be used. As for the ITS, a commercially available ITS supplement can be used without dilution.

중배엽성 세포로의 분화 유도시 사용되는 배지는 줄기세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있고, 바람직하게는 DMEM/F12 배지를 사용할 수 있다.The medium used for inducing differentiation into mesodermal cells may be a conventional medium that can be used for culturing stem cells, and preferably, DMEM/F12 medium may be used.

중배엽성 세포로의 분화 유도 조건은 습도 90 내지 95％, 온도 37℃, 5 내지 10％ CO2 배양기에서 1.5일 내지 2.5일 배양할 수 있다. Conditions for inducing differentiation into mesodermal cells may be cultured for 1.5 to 2.5 days in a humidity 90 to 95%, temperature 37°C, 5 to 10% CO 2 incubator.

상기 중배엽성 세포로부터 혈관내피세포를 분화 유도하기 위해 VEGF165를 분화 유도 인자로 사용할 수 있다.In order to induce differentiation of vascular endothelial cells from the mesodermal cells, VEGF165 may be used as a differentiation inducing factor.

상기 VEGF165는 50 내지 100 ng/mL의 농도로, 바람직하게는 40 내지 60 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다.The VEGF165 may be used at a concentration of 50 to 100 ng/mL, preferably at a concentration of 40 to 60 ng/mL.

상기 중배엽성 세포로부터 혈관내피세포로의 분화 유도 시 사용하는 동물유래물질제거 배양액은 Stemline II(Sigma-aldrich) 또는 Stempro34 (Invitrogen) 또는 mTeSR®1(STEMCELL Technologies)일 수 있다.From the mesodermal cells The animal-derived material removal culture medium used to induce differentiation into vascular endothelial cells may be Stemline II (Sigma-aldrich) or Stempro34 (Invitrogen) or mTeSR®1 (STEMCELL Technologies).

상기 중배엽성 세포로부터 혈관내피세포로의 분화 유도 조건은 습도 90 내지 95％, 온도 37℃, 5 내지 10％ CO2 배양기에서 3일 내지 5일 배양할 수 있다. Conditions for inducing differentiation from mesodermal cells to vascular endothelial cells may be cultured for 3 to 5 days in a humidity 90 to 95%, temperature 37°C, 5 to 10% CO 2 incubator.

상기 중배엽성 세포로부터 분화 유도된 혈관내피세포는 MACS(CD31 양성 세포)를 진행하여 99%의 고 순도의 혈관내피세포를 수득할 수 있다.The vascular endothelial cells induced differentiation from the mesodermal cells can be subjected to MACS (CD31 positive cells) to obtain vascular endothelial cells with high purity of 99%.

본 발명의 줄기세포로부터 혈관내피세포의 분화 및 증식 촉진 방법에서, 상기 MACS를 통해 정제된 혈관내피세포는 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 1회 내지 8회 계대배양함으로써 증식시킬 수 있다. In the method for promoting differentiation and proliferation of vascular endothelial cells from stem cells of the present invention, the vascular endothelial cells purified through MACS can be proliferated by subculturing once to eight times in an animal-derived substance removal culture medium containing VEGF165.

본 발명의 줄기세포로부터 혈관내피세포의 분화 및 증식 촉진 방법에서, 줄기세포의 중배엽성 세포 및 혈관내피세포로의 분화 유도 및 증식 시 세포배양은 피브로넥틴이 코팅된 세포배양용기에서 수행될 수 있다.In the method for promoting differentiation and proliferation of vascular endothelial cells from stem cells of the present invention, cell culture during induction and proliferation of differentiation of stem cells into mesodermal cells and vascular endothelial cells may be carried out in a fibronectin-coated cell culture vessel.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 미분화 상태의 역분화줄기세포는 분화 2일차부터 미분화 마커인 OCT4가 급격히 감소하며 T와 같은 중배엽 마커가 급격히 증가한다. 이후 분화 5일차에 CD31 양성인 혈관내피세포를 분리하였을 경우 hiPSC와 hESC 모두 CD31, VE-cadherin의 발현이 초대배양 혈관세포와 유사한 수준으로 발현하였다. vWF의 발현은 초대배양 세포주들에 비해 다소 낮은데 이는 완벽하게 분화한 초대세포에 비해 성숙이 완벽히 일어나지 않았음을 대변한다. 이에 반해 CD34의 발현은 초대배양 세포주들에 비해 월등히 높은데 이는 분화된 세포가 증식이 활발한 태아의 혈관내피세포의 특성을 나타냄을 설명한다. According to an embodiment of the present invention, in the dedifferentiated stem cells in an undifferentiated state, from day 2 of differentiation, OCT4, an undifferentiated marker, sharply decreases, and a mesodermal marker such as T increases rapidly. Subsequently, when CD31-positive vascular endothelial cells were isolated on day 5 of differentiation, both hiPSC and hESC expressed CD31 and VE-cadherin at levels similar to those of primary cultured vascular cells. The expression of vWF is somewhat lower than that of primary cultured cell lines, indicating that maturation did not occur completely compared to fully differentiated primary cells. On the other hand, the expression of CD34 is significantly higher than that of primary cultured cell lines, which explains that differentiated cells exhibit the characteristics of fetal vascular endothelial cells with active proliferation.

또한, 혈관내피세포 군집 형성세포의 주요 마커인 NRP1은 MACS 분리 후 계대를 2번 진행 한 hESC-EC에서는 약 50%의 발현을 나타내고 MACS 직후의 세포에서는 99%의 발현하였다.In addition, NRP1, a major marker of vascular endothelial cell colony-forming cells, was expressed about 50% in hESC-EC, which was passaged twice after MACS isolation, and 99% in cells immediately after MACS.

아울러, 분화된 혈관내피세포는 혈관망을 형성하며 Calcein AM 양성인 살아있는 혈관구조를 이루고 있으며, LDL 흡수 염색을 통해 대사적 활성을 나타냄을 확인할 수 있다.In addition, the differentiated vascular endothelial cells form a vascular network and constitute a living vascular structure that is positive for Calcein AM, and it can be confirmed that they exhibit metabolic activity through LDL absorption staining.

분화된 혈관내피세포를 전염증성 사이토카인으로 활성화시킨 경우, ICAM1, E-selectin, VCAM1과 같은 활성화된 혈관내피의 표면 분자의 발현이 확연히 증가하였다. 하지만 vWF와 CD31과 같은 일반적인 혈관내피세포의 발현은 큰 차이가 없다. 또한, 급성기 단백질 중 하나인 FVIII의 발현 또한 염증반응과 유사한 조건에서 발현이 증가하였다. 또한, CD31 양성인 세포를 MACS를 이용하여 분리한 직후부터 계대배양을 5번까지 진행하면, 계대배양을 2번 진행할 동안에는 세포 성장률이 일정하게 유지되나 그 이후부터는 성장률이 약 절반씩 감소하였다. 분화 시작시점에 미분화 세포를 1개로 시작한다고 가정하면, 최종 P5 혈관내피세포는 105개의 세포를 획득할 수 있다. 이때, CD31, vWF, VE-cadherin과 같은 혈관내피세포의 단백질 발현은 계대가 반복되어도 동일하게 유지되며 FVIII의 발현 또한 유지된다.When differentiated vascular endothelial cells were activated with pro-inflammatory cytokines, the expression of activated vascular endothelial surface molecules such as ICAM1, E-selectin, and VCAM1 was significantly increased. However, there is no significant difference in the expression of general vascular endothelial cells such as vWF and CD31. In addition, the expression of FVIII, one of the acute phase proteins, was also increased under conditions similar to the inflammatory response. In addition, if the CD31-positive cells were separated using MACS until passage 5 times, the cell growth rate remained constant during passage 2 times, but the growth rate decreased by about half thereafter. Assuming that one undifferentiated cell is started at the start of differentiation, the final P5 vascular endothelial cell can acquire 10 5 cells. At this time, protein expression of vascular endothelial cells such as CD31, vWF, and VE-cadherin remains the same even when the passage is repeated, and the expression of FVIII is also maintained.

그리고 hiPSC로부터 분화된 혈관내피세포를 냉동보관 후, 4주 후에 녹여 다시 배양할 경우, 해동 1일 동안은 증식하지 않다가 1일 이후부터는 새로운 세포와 비슷한 기울기의 성장률을 보여준다.In addition, when vascular endothelial cells differentiated from hiPSCs are frozen and stored after 4 weeks and re-cultivated, they do not proliferate for 1 day of thawing, but show a growth rate similar to that of new cells after 1 day.

본 발명은 또한 상기의 방법으로 분화되고, 초대배양 간 동모양 혈관내피세포(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC) 대비 1/4 내지 1/8 수준으로 FVIII 단백질을 생산하는 혈관내피세포를 제공한다.The present invention also provides vascular endothelial cells that are differentiated by the above method and produce FVIII protein at a level of 1/4 to 1/8 compared to primary cultured liver sinusoidal endothelial cells (LSEC).

본 발명의 일 구체예에 따르면, 인간 역분화줄기세포, 이로부터 분화한 혈관내피세포 2종(계대 1번, 2번) 및 FVIII 생산 양성 세포로 알려진 초대배양 간 동모양 혈관 내피세포(hLSEC)의 용해물과 배양액에서 FVIII의 양을 확인한 결과, hLSEC 용해물은 106개의 세포 당 약 15ng의 FVIII이 확인되었으며 인간 역분화줄기세포 유래 혈관내피세포에서는 1~3ng의 FVIII이 감지되었다. 하지만, 미분화 상태의 역분화줄기세포는 미미한 양이 감지되었다. 또한, hLSEC 배양액에서는 약 3~4ng이 확인되며, 분화된 혈관내피세포에서는 0.5ng이 확인된다. 역시 미분화세포 배양액에서는 감지가 되지 않았다. 이는 분화된 혈관내피세포가 초대배양세포의 FVIII 생산량의 약 1/4~1/8 수준에 근접하고 있음을 의미한다. 또한, 역분화줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포는 100만개의 세포당 7% FVIII 활성을 보여준다. 혈우병 환자의 치료법으로 널리 사용되고 있는 예방요법(prophylaxis)은 혈액응고인자 제제를 일정 시간 간격으로 투여하여 혈중 FVIII의 농도를 10% 내외로 지속시키는 유지요법이다.According to an embodiment of the present invention, human dedifferentiated stem cells, 2 types of vascular endothelial cells differentiated therefrom (passage 1 and 2), and primary cultured liver isoform vascular endothelial cells (hLSEC) known as FVIII-producing positive cells As a result of confirming the amount of FVIII in the lysate and culture medium, about 15 ng of FVIII per 10 6 cells of the hLSEC lysate was identified, and 1 to 3 ng of FVIII was detected in vascular endothelial cells derived from human dedifferentiated stem cells. However, an insignificant amount of dedifferentiated stem cells in an undifferentiated state was detected. In addition, about 3 to 4 ng was found in hLSEC culture medium, and 0.5 ng was found in differentiated vascular endothelial cells. Again, it was not detected in the undifferentiated cell culture. This means that the differentiated vascular endothelial cells are close to about 1/4 to 1/8 of the FVIII production of primary cultured cells. In addition, vascular endothelial cells differentiated from dedifferentiated stem cells show 7% FVIII activity per million cells. Prophylaxis, which is widely used as a treatment for hemophilia patients, is a maintenance therapy in which blood coagulation factor agents are administered at regular intervals to maintain the concentration of FVIII in the blood to around 10%.

따라서, 본 발명의 FVIII를 발현하는 혈관내피세포는 혈우병 치료를 위한 세포치료제로 사용할 수 있다.Therefore, the vascular endothelial cells expressing FVIII of the present invention can be used as a cell therapy for the treatment of hemophilia.

본 발명은 또한 상기의 혈관내피세포를 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 배양하여 혈관망을 형성하는 단계를 포함하는 혈액응고인자 8(FVIII) 단백질 생산 촉진 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for promoting blood coagulation factor 8 (FVIII) protein production comprising the step of forming a vascular network by culturing the vascular endothelial cells in an animal-derived substance removal culture medium containing VEGF165.

본 발명은 줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포는 FVIII를 발현하고 생체외 맥관 형성 시 혈관망을 형성하며 Calcein AM 양성인 살아있는 혈관 구조를 이룰 수 있고 대사적 활성을 나타내므로 생체외에서 FVIII의 생산을 촉진할 수 있다.In the present invention, the vascular endothelial cells differentiated from stem cells express FVIII, form a vascular network when vasculature in vitro, and form a living vascular structure that is positive for Calcein AM, and exhibit metabolic activity, thereby promoting the production of FVIII in vitro. I can.

본 발명은 또한 상기의 혈관내피세포를 포함하는 혈우병 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition for treating hemophilia comprising the above vascular endothelial cells.

또한, 본 발명은 상기의 혈관내피세포의 치료적 유효량을 혈우병 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈우병의 치료방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for treating hemophilia comprising administering the therapeutically effective amount of the vascular endothelial cells to a hemophilia subject.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 꼬리 끝에 상처를 입힌 후 15분 간격으로 상처 딱지부위에 출혈을 다시 발생시켜 총 출혈 시간을 계산하는 TVTB 실험 결과, 정상마우스의 경우 총 출혈시간이 3분으로 지혈이 활발하게 일어나는 반면 HA(hemophilia A) 마우스에서는 1차 지혈 후 2차 지혈이 일어나지 않고 계속적으로 출혈이 발생하였음. 역분화줄기세포로부터 분화한 혈관내피세포를 이식받은 경우에는 세포 수가 2백만 개에서 4백만 개로 늘어남에 따라 치료효과가 눈에 띄게 변화함을 확인할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, as a result of a TVTB experiment in which bleeding is re-occurred in the wound scab at 15 minute intervals after inflicting a wound on the tail end, the total bleeding time is calculated as 3 minutes in the case of a normal mouse. On the other hand, in HA (hemophilia A) mice, secondary hemostasis did not occur after primary hemostasis, and bleeding continued. In the case of transplantation of vascular endothelial cells differentiated from dedifferentiated stem cells, it can be seen that the therapeutic effect changes markedly as the number of cells increases from 2 million to 4 million.

따라서, 본 발명의 혈관내피세포는 혈우병 치료를 위한 세포치료제로 사용할 수 있다.Therefore, the vascular endothelial cells of the present invention can be used as a cell therapy for the treatment of hemophilia.

본 발명의 혈우병 치료용 조성물은 살아있는 동물 개체에 투입 또는 이식하여 생착될 수 있도록, 본 발명의 방법에 의해 제조된 혈관내피세포를 포함하는 조성물을 지칭한다.The composition for treating hemophilia of the present invention refers to a composition comprising vascular endothelial cells prepared by the method of the present invention so that they can be engrafted by injection or transplantation into a living animal individual.

상기 혈우병은 제1형 혈우병일 수 있다.The hemophilia may be type 1 hemophilia.

본 발명의 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있고, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이 있으며, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.In addition to the active ingredient, the composition of the present invention may include a conventional pharmaceutically acceptable carrier. In the case of injection, there are preservatives, painless agents, solubilizers or stabilizers, and in the case of topical formulations, a base, excipient, Lubricating agents or preservatives may be included.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the composition of the present invention are commonly used in formulation, and are lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate. , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc., but are limited thereto. no. The composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The composition of the present invention is prepared in a unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the art, or It can be manufactured by enclosing it in a multi-volume container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.

본 발명에 따른 조성물의 투여경로로는 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함하고, 바람직하게는 근육 주사(intramuscular injection) 형태로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 비경구 투여용 조성물(예, 주사제)은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 멸균 정제수, 약 pH 7의 완충액, 또는 생리식염수 중에 분산 및/또는 용해시켜 생체 내에 주입될 수 있으며, 필요할 경우, 보존제, 안정화제 등과 같은 통상의 첨가제를 포함할 수 있다.The route of administration of the composition according to the present invention may be administered to humans and animals orally or parenterally such as intravenously, subcutaneously, intranasally or intraperitoneally. Oral administration also includes sublingual application. Parenteral administration includes an injection method such as subcutaneous injection, intramuscular injection, and intravenous injection, and instillation, and may preferably be administered in the form of intramuscular injection. The composition for parenteral administration (e.g., injection) of the composition according to the present invention is dispersed and/or dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier, for example, sterile purified water, a buffer solution of about pH 7, or physiological saline, and injected into the body. It may be, if necessary, may contain conventional additives such as preservatives, stabilizers and the like.

또한, 본 발명에서 주입되는 혈관내피세포의 양은 이에 크게 제한되지 않으나, 1Х105 내지 6Х106 cell/회로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 1Х106 내지 6Х106 cell/회로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 4Х106cell/회로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.In addition, the amount of vascular endothelial cells injected in the present invention is not limited thereto, but may be administered 1Х10 5 to 6Х10 6 cells/cycle, preferably 1Х10 6 to 6Х10 6 cells/cycle, and most preferably May be administered 4Х10 6 cells/cycle, but is not limited thereto. The dosage may be variously prescribed depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity of the patient.

본 발명에서 사용된 용어 '치료'는 1) 혈우병의 억제, 즉 발전의 억제, 및 2) 혈우병의 경감을 의미한다. 구체적으로, 상기 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 혈우병의 치료가 필요한 대상체(subject)의 상처부위에 주입 또는 이식할 경우, 혈액응고인자 FVIII를 발현하는 고증식 혈관내피세포는 혈관망을 형성하여 상처부위의 출혈을 지혈시킴으로써 혈우병을 치료할 수 있다. 한편, 상기 투여 대상은 인간을 포함하는 포유동물일 수 있다.The term'treatment' as used herein refers to 1) inhibition of hemophilia, that is, inhibition of development, and 2) reduction of hemophilia. Specifically, when the composition is injected or transplanted in a therapeutically effective amount to a wound site of a subject in need of treatment for hemophilia, high-proliferative vascular endothelial cells expressing the blood coagulation factor FVIII form a vascular network to form a wound. Hemophilia can be treated by stopping bleeding in the area. Meanwhile, the administration target may be a mammal including a human.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는다.Terms that are not otherwise defined herein have meanings commonly used in the art to which the present invention belongs.

본 발명의 조성물이 혈우병의 치료에 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 물리적 수술 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 혈우병을 치료할 수 있다.When the composition of the present invention is used for the treatment of hemophilia, the composition of the present invention may be used as a single therapy, but may be used in combination with other conventional chemotherapy or physical surgery therapy, and when performing such a combination therapy Hemophilia can be treated more effectively.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples according to the present invention, but the scope of the present invention is not limited by the examples presented below.

<실시예 1> 인간 전분화능 줄기세포의 혈관내피세포의 분화 유도 및 증식<Example 1> Induction and proliferation of differentiation of vascular endothelial cells of human pluripotent stem cells

(세포배양)(Cell culture)

미분화 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell, hESC)와 인간 역분화배아줄기세포(human induced pluripotent stem cell, hiPSC)를 상온에서 30분~1시간 matrigel(Corning, USA)로 코팅한 배양접시에 mTeSR™1(Stemcell Technologies, Canada) 배지를 사용하여 지지세포 없이(feeder-free) 배양하였다. 상기 세포를 표준조건(37℃, 5% CO2 및 포화습도)에서 배양하고, 매일 배지를 교체하였다. 계대배양을 위해서는 ReLeSR(Stemcell Technologies, Canada)를 상온에서 1~2분가량 처리하여 콜로니 형태로 떼어낸 후 1:40의 비율로 계대 배양하였다. 이는 약 5~6일마다 진행되었다.MTeSR in a culture dish coated with matrigel (Corning, USA) of undifferentiated human embryonic stem cells (hESC) and human induced pluripotent stem cells (hiPSC) at room temperature for 30 minutes to 1 hour It was cultured without feeder cells using ™1 (Stemcell Technologies, Canada) medium. The cells were cultured under standard conditions (37° C., 5% CO 2 and saturated humidity), and the medium was changed every day. For subculture, ReLeSR (Stemcell Technologies, Canada) was treated at room temperature for 1 to 2 minutes, separated into colonies, and then subcultured at a ratio of 1:40. This took place about every 5-6 days.

HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)은 Lonza에서 분양받았으며 동일 회사에서 판매하는 EGM2 배지에서 배양하였다.HUVEC (Human umbilical vein endothelial cell) was sold in Lonza and cultured in EGM2 medium sold by the same company.

hLSEC(human liver sinusoidal endothelial cell)은 Angio-proteomie에서 분양 받았으며 동일 회사에서 판매하는 EGM 배지에서 배양하였다.Human liver sinusoidal endothelial cells (hLSEC) were pre-sale from Angio-proteomie and cultured in EGM medium sold by the same company.

(혈관내피세포 분화 배양)(Vascular endothelial cell differentiation culture)

분화 시작 24시간 전에 37℃ 인큐베이터에서 2ng/mL의 농도로 배양접시에 피브로넥틴(Roche, Switzerland)을 코팅하였다.Fibronectin (Roche, Switzerland) was coated on a culture dish at a concentration of 2ng/mL in a 37°C incubator 24 hours before the start of differentiation.

(1) 1단계: 중배엽세포로의 분화(1) Step 1: Differentiation into mesoderm cells

혈관내피세포는 중배엽으로부터 기원하며 전분화능 줄기세포의 생체외(in vitro) 분화에서도 이러한 발생학적 과정을 거쳐야 한다. 본 발명에서는 미분화상태의 hESC 및 hiPSC를 2일 동안 중배엽세포로 1차 분화시켰다. Vascular endothelial cells originate from the mesoderm and must undergo this developmental process in the in vitro differentiation of pluripotent stem cells. In the present invention, hESCs and hiPSCs in undifferentiated state were first differentiated into mesoderm cells for 2 days.

이를 위해, 지지세포 없는 상태의(feeder-free) 미분화세포에 TrypLE select(Invitrogen, USA)를 사용하여 3분 동안 단일 세포로 분산시킨 후 원심분리기로 1000rpm에서 5분간 세포만 분리하여 수확하였다. 이후 배양접시 cm2당 5500개의 세포를 뿌려 2일간 배양하였다. 이때 분화배지는 1ХITS, 10μM Y-27632, 3μM CHIR99021, 2ng/mL Activin A 및 200μM 아스코르브산을 포함하는 DMEM/F12 배양액이며 분화 0일 차에서 2일 차 사이에 배지를 한 번도 바꾸지 않았다. 중배엽 유도는 중배엽 마커인 T(brachyury)의 qPCR을 통하여 확인하였다.To this end, feeder-free undifferentiated cells were dispersed as single cells for 3 minutes using TrypLE select (Invitrogen, USA), and then only cells were separated and harvested for 5 minutes at 1000 rpm with a centrifuge. Thereafter, 5500 cells per cm 2 of the culture dish were sprayed and cultured for 2 days. At this time, the differentiation medium is a DMEM/F12 culture medium containing 1ХITS, 10 μM Y-27632, 3 μM CHIR99021, 2 ng/mL Activin A and 200 μM ascorbic acid, and the medium was not changed from day 0 to day 2 of differentiation. Mesoderm induction was confirmed through qPCR of the mesoderm marker T (brachyury).

(2) 2단계: 혈관내피세포로의 분화(2) Step 2: Differentiation into vascular endothelial cells

상기 1단계에서 수득한 중배엽세포를 3일 동안 추가 배양하여 혈관내피세포로 분화시켰다. 분화 2일 차의 상기 세포를 50ng/mL VEGF165가 포함된 Stemline II(sigma, USA) 배지에 3일 동안 배양하여 혈관내피세포로 분화시켰다. 이때 분화 2일차, 3일 차에 배지를 각각 한 번씩 바꿔주고 분화 4일 차는 생략하였다. 혈관내피세포로의 분화는 CD31, CD34, vWF의 발현을 qPCR로 분석하였다.The mesoderm cells obtained in step 1 were further cultured for 3 days to differentiate into vascular endothelial cells. The cells at the second day of differentiation were cultured in Stemline II (sigma, USA) medium containing 50 ng/mL VEGF165 for 3 days to differentiate into vascular endothelial cells. At this time, the medium was changed once on the 2nd and 3rd day of differentiation, and the 4th day of differentiation was omitted. Differentiation into vascular endothelial cells was analyzed by qPCR for expression of CD31, CD34, and vWF.

(3) 3단계: 분화된 혈관내피세포의 정제(3) Step 3: Purification of differentiated vascular endothelial cells

분화 5일 차에 비-혈관내피세포를 제외한 고순도의 혈관내피세포만을 분리하기 위하여 MACS(magnetic activated cell sorting) 방법을 시행하여 정제하였다. 이때 혈관내피세포/전구세포의 마커인 CD31을 사용하였다. 5일 차 세포에 TrypLE를 사용하여 단일 세포로 분산시킨 후 70㎛ strainer에 걸러 완벽하게 단일 세포만을 얻었다. 이후 5㎕의 mouse anti human CD31 항체(BD, USA)가 포함된 0.01g/mL 농도의 BSA/PBS 100㎕(MACS buffer)에 세포를 현탁시켜 냉장고에서 30분 반응시켰다. 이후 MACS buffer 3mL을 이용하여 1번 세척 과정을 거친 후, MACS 버퍼 80㎕에 anti-mouse IgG microbead(Miltenyi biotech, Germany) 40㎕를 섞은 용액에 세포를 현탁한 후 냉장고에서 20분간 반응시켰다. 이후 MACS manual separator를 이용하여 CD31을 발현하는 혈관내피세포를 분리 정제하였다. MACS 하루 전에 5ng/mL의 피브로넥티으로 코팅해 둔 배양접시에 50ng/mL VEGF165를 포함하는 stemline II 배지를 이용해 배양하였다. On the 5th day of differentiation, in order to isolate only high-purity vascular endothelial cells excluding non-vascular endothelial cells, magnetic activated cell sorting (MACS) was performed and purified. At this time, CD31, a marker of vascular endothelial cells/progenitor cells, was used. After dispersing into single cells using TrypLE on the 5th day, cells were completely filtered through a 70 μm strainer to obtain only single cells. Thereafter, cells were suspended in 100 µl (MACS buffer) of BSA/PBS containing 5µl of mouse anti human CD31 antibody (BD, USA) at a concentration of 0.01g/mL and reacted for 30 minutes in a refrigerator. After the washing process was performed once using 3 mL of MACS buffer, the cells were suspended in a solution of 40 µl of anti-mouse IgG microbead (Miltenyi biotech, Germany) in 80 µl of MACS buffer, and then reacted in a refrigerator for 20 minutes. Subsequently, vascular endothelial cells expressing CD31 were separated and purified using a MACS manual separator. One day before MACS, a culture dish coated with 5 ng/mL fibronecti was cultured using stemline II medium containing 50 ng/mL VEGF165.

(4) 4단계: 정제된 혈관내피세포의 배양(4) Step 4: Culture of purified vascular endothelial cells

정제된 혈관내피세포는 그 특성을 유지하면서 계대배양이 5~8회 가량 가능하다. 따라서 5ng/mL의 피브로넥틴이 코팅된 배양접시에 VEGF165가 포함된 Stemline II 배지를 이용하여 5~6일 동안 배양하며 TrypLE를 사용하여 계속적으로 계대배양이 가능하다. 계대 시점의 배양밀도는 cm2당 5000개의 세포이다.Purified vascular endothelial cells can be subcultured 5 to 8 times while maintaining their characteristics. Therefore, in a culture dish coated with 5ng/mL fibronectin, it is cultured for 5-6 days using Stemline II medium containing VEGF165, and subculture is possible continuously using TrypLE. The culture density at the time of passage is 5000 cells per cm 2 .

(면역세포화학(immunocytochemistry))(Immunocytochemistry)

분화된 혈관내피세포는 4% PFA(paraformaldehyde)를 포함하는 PBS를 처리하여 고정시켰다. 0.1%(세포 표면 단백질) 또는 0.3%(세포 내부 단백질) Triton X-100/PBS 및 10% 혈청을 포함하는 PBS로 처리하여 블로킹 및 천공시킨 다음, 1차 항체를 처리하고, 4℃에서 12시간~16시간 동안 반응시켰다. 동형 마우스 IgG 또는 정상 당나귀 혈청을 음성 대조군으로 사용하였는데, 상기 음성대조군에서는 형광이 검출되지 않았다. 1차 항체로는 vWF, CD31, VE-cadherin 및 FVIII 등을 사용하였다. 1차 항체 반응 후 PBS로 3회 세척하고 PBS에 1:400으로 희석한 Alexa Fluor 488 또는 594를 1시간 15분 동안 상온에서 반응시켰다. 이후 1㎍/mL DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하여 세포의 핵을 염색하였다. 위 과정을 끝마친 샘플은 형광현미경을 통해 해당 단백질의 발현을 확인하였다.The differentiated vascular endothelial cells were fixed by treatment with PBS containing 4% PFA (paraformaldehyde). Treatment with PBS containing 0.1% (cell surface protein) or 0.3% (inner cell protein) Triton X-100/PBS and 10% serum, followed by blocking and puncture, treatment with the primary antibody, and treatment at 4° C. for 12 hours It was reacted for ~16 hours. Homologous mouse IgG or normal donkey serum was used as a negative control, but fluorescence was not detected in the negative control. As the primary antibody, vWF, CD31, VE-cadherin and FVIII were used. After the primary antibody reaction, Alexa Fluor 488 or 594, washed three times with PBS and diluted 1:400 in PBS, was reacted at room temperature for 1 hour and 15 minutes. Thereafter, the nuclei of the cells were stained using 1 μg/mL DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). After completing the above process, the expression of the corresponding protein was confirmed through a fluorescence microscope.

(역전사 PCR(RT-PCR) 및 정량적 PCR(qRT-PCR))(Reverse transcription PCR (RT-PCR) and quantitative PCR (qRT-PCR))

총 RNA를 세포에서 추출하기 위하여 Trizol 시약을 사용하여 수득하고, 역전사 시스템(Promega Corp., USA)을 사용한 역전사 과정을 수행하였다. PCR 증폭 조건은 94℃ 5분, 35 사이클(94℃ 30초, 50-57℃ 30초 및 72℃ 30초) 및 72℃ 10분으로 설정하였다. Total RNA was obtained using Trizol reagent in order to extract from cells, and reverse transcription was performed using a reverse transcription system (Promega Corp., USA). PCR amplification conditions were set at 94°C for 5 minutes, 35 cycles (94°C for 30 seconds, 50-57°C for 30 seconds and 72°C for 30 seconds) and 72°C for 10 minutes.

qRT-PCR 분석은 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응물은 12.5㎕의 SYBR Green PCR Master Mix, 각각 0.8㎕의 10mM의 프라이머, 10.4㎕의 증류수 및 0.5㎕의 주형 cDNA를 포함하는 25㎕로 구성하여 각 프라이머에 맞는 조건에서 증폭하여 확인하였다. 각 유전자의 상대적인 발현수준은 GAPDH를 사용하여 정규화하여 측정하였다. 사용된 프라이머의 서열은 표 1과 같다. qRT-PCR analysis was performed using SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA). The PCR reaction product consisted of 12.5 µl of SYBR Green PCR Master Mix, 0.8 µl of 10 mM primers, 10.4 µl of distilled water, and 25 µl containing 0.5 µl of template cDNA, and amplified under conditions suitable for each primer. The relative expression level of each gene was measured by normalization using GAPDH. The sequences of the primers used are shown in Table 1.

Figure pat00002
Figure pat00002

(유세포 분석)(Flow cytometry)

배양접시 위 세포에 TrypLE를 가하여 단일세포로 분리 후 70㎛ strainer에 걸러 단일세포만을 얻었다. 이후 2% PBS, 0.1% BSA를 포함하는 PBS에 FITC mouse anti human CD31(BD, USA), APC mouse anti human NRP 항체를 1/5 희석하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 3번의 세척 과정 후 BD accuri C6(BD, USA) 장비를 사용하여 분석하였다. 마커별로 3회의 독립적인 실험을 수행하였다.TrypLE was added to the cells above the culture dish to separate them into single cells, and then filtered through a 70 μm strainer to obtain single cells. Then, FITC mouse anti human CD31 (BD, USA) and APC mouse anti human NRP antibodies were diluted 1/5 in PBS containing 2% PBS and 0.1% BSA, and reacted at 4° C. for 30 minutes. After three washing procedures, analysis was performed using BD accuri C6 (BD, USA) equipment. Three independent experiments were performed for each marker.

(Trypan Blue 염색) (Trypan Blue dyeing)

단일세포로 분리된 각 단계의 세포가 부유된 배양액 중 10㎕와 trypan blue 시약 10㎕를 섞어 세포 측정기를 통해 생존율을 분석하였다.The viability was analyzed through a cytometer by mixing 10 µl of the culture medium in which the cells of each stage separated into single cells were suspended and 10 µl of trypan blue reagent.

(EdU 염색)(EdU staining)

혈관내피세포의 증식능을 평가하기 위하여 10μM EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)를 배지에 4시간 동안 첨가하여 배양하였다. DNA 복제 중에 세포내 DNA에 EdU가 투입한 다음, 상기 세포에 PBS로 3회 세척하고, 4% PFA(paraformaldehyde)를 포함하는 PBS에 고정하였다. EdU 염색된 세포를 상술한 방법으로 면역 염색하였다(면역세포화학법 참조). EdU의 형광사진을 형광현미경(Carl Zeiss Jena, Germany)으로 촬영하였다.In order to evaluate the proliferative ability of vascular endothelial cells, 10 μM EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) was added to the medium for 4 hours and cultured. EdU was added to the intracellular DNA during DNA replication, and then the cells were washed three times with PBS, and fixed in PBS containing 4% PFA (paraformaldehyde). EdU-stained cells were immunostained by the method described above (see immunocytochemistry). The fluorescence picture of EdU was taken with a fluorescence microscope (Carl Zeiss Jena, Germany).

(세포성장률 분석)(Cell growth rate analysis)

혈관내피세포의 계대별 생장률을 비교하기 위하여 MACS 완료 시점에서 각 계대를 진행한 시점 그리고 동결-해동한 혈관내피세포를 포함하는 범위에서 모두 동일한 세포 수로 플레이팅한 후 6일 동안 매일 전체 세포 수를 측정하였다. 이때 상술한 Trypan blue 염색법을 시행하였다. 또한, 모든 실험은 최소 3 반복 이상, 각 반복 당 3번 연속 진행하였다.In order to compare the growth rate of vascular endothelial cells by passage, the total number of cells was calculated every day for 6 days after plating with the same number of cells in the range of each passage and freeze-thaw vascular endothelial cells at the time of MACS completion. Measured. At this time, the Trypan blue staining method described above was performed. In addition, all experiments were performed at least 3 repetitions, 3 times per repetition.

(분화된 혈관내피세포의 냉동과 해동(freezing & thawing))(Freezing & thawing of differentiated vascular endothelial cells)

분화된 혈관세포의 냉동과 해동 후 성장률 유지와 표현형 유지를 확인하기 위하여 배양접시 상에 세포에 TrypLE를 사용하여 단일 세포로 분리하였다. 해당 세포의 세척 과정을 거친 후 Cellbanker라는 세포동결제를 넣어 액화질소에 보관하였다. 냉동 보관 4주 후 해당 세포를 해동과정을 거쳤으며, 이때 해동 용액은 10% FBS가 포함된 DMEM이었다. After freezing and thawing of differentiated vascular cells, cells were separated into single cells using TrypLE on a culture dish to confirm the maintenance of growth rate and phenotype. After the cell was washed, a cell freeze called Cellbanker was added and stored in liquid nitrogen. After 4 weeks of freezing storage, the cells were thawed, and the thawing solution was DMEM containing 10% FBS.

(LDL 흡수 분석)(LDL absorption analysis)

분화시킨 혈관내피세포에 흡수된 LDL의 위치를 분석하기 위하여, Dil-Ac-LDL 염색 키트(Biomedical Technologies, USA)를 사용하여 사용자 메뉴얼에 따라 분석을 수행하였다. 흡수된 LDL에서 발현하는 형광을 형광현미경(Carl Zeiss Jena, Germany)으로 촬영하였다.In order to analyze the location of LDL absorbed by the differentiated vascular endothelial cells, analysis was performed according to the user's manual using a Dil-Ac-LDL staining kit (Biomedical Technologies, USA). Fluorescence expressed in the absorbed LDL was photographed with a fluorescence microscope (Carl Zeiss Jena, Germany).

(ELISA)(ELISA)

세포배양 상등액과 세포용해물(lysate)에 포함된 FVIII을 ELISA 키트(LSBio, USA)를 사용자 메뉴얼에 따라 분석을 수행하였다. 표준곡선은 해당 키트에 제공된 정상인의 혈장을 희석하여 그렸으며 각 시료는 3개의 독립적인 시료를 사용하여 3번 반복실험 하였다. 상등액과 세포 용해물 샘플의 ELISA 결과는 정량표준화를 위하여 샘플 수거 시에 세포 수를 측정하였으며 최종적으로 세포 수, 희석비율, 사용량에 근거하여 보정하였다.FVIII contained in the cell culture supernatant and cell lysate was analyzed using an ELISA kit (LSBio, USA) according to the user's manual. The standard curve was drawn by diluting the plasma of a normal person provided in the kit, and each sample was repeated 3 times using 3 independent samples. The ELISA results of the supernatant and cell lysate samples were measured at the time of sample collection for quantification and standardization, and finally corrected based on the number of cells, dilution ratio, and amount used.

(혈관내피세포 활성화(endothelial cell activation))(Endothelial cell activation)

분화시킨 혈관내피세포의 기능적 특성을 확인하기 위하여 전염증성 사이토카인을 처리하여 세포표면 단백질의 변화를 관찰하였다. 즉, 분화된 혈관내피세포를 배양함에 있어서 배양액에 TNF-α와 IL-1β를 첨가하여 6시간 후 혈관내피세포 활성화 마커인 ICAM1, VCAM1, P-selectin 그리고 E-selectin 등을 앞서 설명한 면역세포화학법, qPCR을 통해 확인하였다.In order to confirm the functional characteristics of differentiated vascular endothelial cells, pro-inflammatory cytokines were treated to observe changes in cell surface proteins. That is, in culturing differentiated vascular endothelial cells, the immunocytochemistry described above, such as ICAM1, VCAM1, P-selectin, and E-selectin, which are vascular endothelial cell activation markers 6 hours after addition of TNF-α and IL-1β to the culture medium. It was confirmed through method, qPCR.

(생체외 맥관 형성(in vitro tube formation))(In vitro tube formation)

분화시킨 혈관내피세포의 혈관망을 형성할 수 있는 능력을 확인하기 위하여, 생체 외 혈관망 형성 실험을 진행하였다. 24웰 플레이트 기준으로 8~10ng/mL 농도의 matrigel을 289㎕ 첨가한 후 37℃ 인큐베이터에서 30~60분간 중합반응(polymerization)을 유도하였다. 이후 분화시킨 혈관내피세포 1.2Х105개를 VEGF165가 포함된 stemline II 배양액 300㎕에 섞어 중합반응이 완료된 배양 웰에 뿌려주었다. 이후 37℃ 인큐베이터에서 16~18시간 후 형성된 혈관망을 도립 현미경으로 관찰하였다.In order to confirm the ability of differentiated vascular endothelial cells to form a vascular network, in vitro vascular network formation experiments were conducted. After adding 289 µl of matrigel at a concentration of 8 to 10 ng/mL based on a 24-well plate, polymerization was induced in an incubator at 37°C for 30 to 60 minutes. Afterwards, 5 differentiated vascular endothelial cells of 1.2Х10 were mixed with 300 µl of stemline II culture solution containing VEGF165 and sprayed onto the culture wells where polymerization was completed. Then, the vascular network formed after 16 to 18 hours in a 37°C incubator was observed with an inverted microscope.

(Neo-LIVE magnoxide 675 염색 & 생체 맥관 형성(in vivo tube formation))(Neo-LIVE magnoxide 675 staining & in vivo tube formation)

분화시킨 혈관내피세포를 마우스에 이식하였을 때 세포 생착능과 유지능을 확인하기 위하여 Neo_LIVE magnoxide 675 염색을 진행하였다. Neo-LIVE 사용자 매뉴얼에 따라 세포염색을 진행하였다. Neo-LIVE 처리 24시간 뒤에 EC를 단일 세포로 만든 1Х106개의 세포를 이식용 matrigel 50㎕ 그리고 VEGF165가 포함된 stemline II 배양액 50㎕에 섞어, 그 즉시 마우스 허벅지 부근 피하에 이식하여 생체 맥관 형성을 유도하였다.When the differentiated vascular endothelial cells were transplanted into mice, Neo_LIVE magnoxide 675 staining was performed to confirm cell engraftment and maintenance ability. Cell staining was performed according to the Neo-LIVE user manual. 24 hours after Neo-LIVE treatment, 1Х10 6 cells made of single EC cells were mixed with 50 µl of matrigel for transplantation and 50 µl of stemline II culture medium containing VEGF165, and immediately implanted subcutaneously near the thigh of the mouse to induce biovascularization. I did.

(생체영상분석(In vivo imaging))(In vivo imaging)

Neo-LIVE 처리된 혈관내피세포의 마우스 이식 후 분포를 확인하기 위하여 생체영상분석을 시행하였다. 이식 후 6시간, 1일 차, 3일 차, 5일 차, 9일 차, 14일 차 그리고 20일 차에 각각 Maestro2TM 으로 형광분포를 확인하였다. 이때 이식받은 마우스는 생체영상분석 직전부터 이미징 과정 도중까지 지속적으로 isofluorene을 사용해 호흡마취시켰다.Bio-imaging analysis was performed to confirm the distribution of Neo-LIVE-treated vascular endothelial cells after mouse transplantation. Maestro2 TM at 6 hours, 1 day, 3 days, 5 days, 9 days, 14 days and 20 days after transplantation The fluorescence distribution was confirmed. At this time, the transplanted mice were under respiratory anesthesia using isofluorene continuously from immediately before biometric analysis to the middle of the imaging process.

<실험예 1> 인간 전분화능 줄기세포의 혈관내피세포의 분화 유도 및 증식<Experimental Example 1> Induction and proliferation of differentiation of vascular endothelial cells of human pluripotent stem cells

도 1은 영양세포가 없는 상태에서 유지되고 있는 미분화 상태의 인간 전분화능 줄기세포를 최소한의 성장인자와 화합물을 처리하여 단기간에 증식이 활발한 혈관내피세포로 분화시키는 모식도를 나타낸 것으로, 분화 단계별 특이적 마커(미분화: OCT4, 중배엽: Bry, 혈관내피세포: CD31, vWF, VE-cadherin)로 각 단계별 세포를 구분하였다. 분화 유도를 위한 인자(중배엽 유도 인자: CHIR99021, Y-27632, 아스코르브산, 액티빈 A, ITS, 피브로넥틴, 혈관내피세포: Stemline II 배양액, VEGF165, 피브로넥틴)를 처리하여 혈관내피세포로 분화시킨 후, 분화 5일 차에 MACS(CD31 양성 세포)를 진행하여 99%의 고순도의 혈관내피세포를 단기간에 획득할 수 있었다.1 is a schematic diagram showing a schematic diagram of differentiating human pluripotent stem cells in an undifferentiated state maintained in the absence of feeder cells into vascular endothelial cells with active proliferation in a short period of time by treatment with a minimum of growth factors and compounds. Cells at each stage were classified by markers (undifferentiated: OCT4, mesoderm: Bry, vascular endothelial cells: CD31, vWF, VE-cadherin). After differentiation into vascular endothelial cells by treatment with factors for inducing differentiation (mesoderm induction factors: CHIR99021, Y-27632, ascorbic acid, activin A, ITS, fibronectin, vascular endothelial cells: Stemline II culture medium, VEGF165, fibronectin), On the 5th day of differentiation, MACS (CD31 positive cells) was performed to obtain 99% high purity vascular endothelial cells in a short period of time.

<실험예 2> 분화 유도된 혈관내피세포의 특성 규명<Experimental Example 2> Characterization of differentiation-induced vascular endothelial cells

도 2a는 인간 역분화줄기세포를 혈관내피세포로 분화시킨 후 단계별로 유전자의 발현을 qPCR을 통해 확인한 것으로, 미분화 상태의 역분화줄기세포는 분화 2일차부터 미분화 마커인 OCT4가 급격히 감소하며 T와 같은 중배엽 마커가 급격히 증가하였다. 이후 분화 5일 차에 CD31 양성인 혈관내피세포를 분리하였을 경우 hiPSC와 hESC 모두 CD31, VE-cadherin의 발현이 초대배양혈관세포와 유사한 수준으로 발현함을 확인할 수 있다. vWF의 발현은 초대배양 세포주들에 비해 다소 낮은데 이는 완벽하게 분화한 초대세포에 비해 성숙이 완벽히 일어나지 않았음을 대변한다. 이에 반해 CD34의 발현은 초대배양 세포주들에 비해 월등히 높은데 이는 분화된 세포가 증식이 활발한 태아의 혈관내피세포의 특성을 나타냄을 설명한다. Figure 2a is a step by step after the differentiation of human dedifferentiated stem cells into vascular endothelial cells, the expression of the gene was confirmed through qPCR, in the undifferentiated state dedifferentiated stem cells, from day 2 of differentiation, the undifferentiated marker OCT4 rapidly decreases and T and The same mesoderm markers increased rapidly. After that, when CD31-positive vascular endothelial cells were isolated on day 5 of differentiation, both hiPSC and hESC expressed CD31 and VE-cadherin at levels similar to those of primary cultured vascular cells. The expression of vWF is somewhat lower than that of primary cultured cell lines, indicating that maturation did not occur completely compared to fully differentiated primary cells. On the other hand, the expression of CD34 is significantly higher than that of primary cultured cell lines, which explains that differentiated cells exhibit the characteristics of fetal vascular endothelial cells with active proliferation.

도 2b는 분화 유도된 혈관내피세포를 증식이 활발한 혈관내피세포 군집 형성세포의 특징으로 알려진 CD31과 NRP1 표면 마커를 사용하여 유세포분석기로 확인한 결과로, CD31은 두 종류의 전분화능 줄기세포 유래 혈관내피세포에서 97% 이상 발현하였다. 혈관내피세포 군집 형성세포의 주요 마커로 알려져 있는 NRP1은 MACS 분리 후 계대를 2번 진행한 hESC-EC에서는 약 50%의 발현을 나타내었고 MACS 직후의 세포에서는 99%의 발현을 확인할 수 있었다.Figure 2b is a result of confirming the differentiation-induced vascular endothelial cells by flow cytometry using CD31 and NRP1 surface markers known as features of vascular endothelial cell cluster-forming cells with active proliferation. CD31 is a vascular endothelium derived from two types of pluripotent stem cells. It was expressed more than 97% in cells. NRP1, which is known as a major marker of vascular endothelial cell colony-forming cells, showed approximately 50% expression in hESC-EC, which was passaged twice after MACS isolation, and 99% in cells immediately after MACS.

도 3a는 분화된 혈관내피세포의 특성 확인을 위해 생체 외 맥관 형성과 형성된 맥관에 Calcein AM과 PI 염색을 시행한 결과로, 분화된 혈관내피세포가 혈관망을 형성하며 Calcein AM 양성인 살아있는 혈관구조를 이루고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 LDL 흡수 염색을 통해 대사적 활성을 나타냄을 확인하였다.3A is a result of in vitro vasculature and PI staining on the formed vasculature to confirm the characteristics of differentiated vascular endothelial cells. As a result, differentiated vascular endothelial cells form a vascular network, and a living vascular structure that is Calcein AM positive. It was confirmed that it is being accomplished. In addition, it was confirmed that it showed metabolic activity through LDL absorption staining.

도 3b는 혈관내피세포의 또 다른 특성인 전염증성 사이토카인의 노출에 따른 세포 표면 분자의 변화를 hiPSC 유래 혈관내피세포에서 형광염색과 qPCR을 통해 확인한 결과로, TNF-α, IL-1β의 조합 처리에 따라 ICAM1, E-selectin, VCAM1과 같은 활성화된 혈관내피의 표면 분자의 발현이 확연히 증가함을 확인할 수 있다. 하지만, vWF와 CD31과 같은 일반적인 혈관내피세포의 발현은 큰 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 급성기 단백질(acute phase protein) 중 하나인 FVIII의 발현 또한 염증반응과 유사한 조건에서 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.3B is a result of confirming changes in cell surface molecules according to exposure of proinflammatory cytokines, another characteristic of vascular endothelial cells, through fluorescence staining and qPCR in hiPSC-derived vascular endothelial cells. Combination of TNF-α and IL-1β It can be seen that the expression of activated vascular endothelial surface molecules such as ICAM1, E-selectin, and VCAM1 significantly increased with treatment. However, it was confirmed that there was no significant difference in the expression of general vascular endothelial cells such as vWF and CD31. In addition, it was confirmed that the expression of FVIII, one of the acute phase proteins, was also increased under conditions similar to the inflammatory response.

도 4a는 CD31 양성인 세포를 MACS를 이용하여 분리한 직후(P0)부터 계대배양을 5번까지 진행하면서 얻은 세포 성장 곡선으로, 계대배양을 2번 진행할 동안에는 세포 성장률이 일정하게 유지되었으나 그 이후부터는 성장률이 약 절반씩 감소하였다. 분화 시작시점에 미분화 세포를 1개로 시작한다고 가정하면, 최종 P5 혈관내피세포는 105개의 세포를 획득할 수 있다. 이를 토대로 그린 누적생장곡선은 도 4a의 하단에 있다.4A is a cell growth curve obtained from immediately after isolation of CD31-positive cells using MACS (P0) through passage 5 times, while the cell growth rate was maintained constant during passage 2 times, but the growth rate thereafter This decreased by about half. Assuming that one undifferentiated cell is started at the start of differentiation, the final P5 vascular endothelial cell can acquire 10 5 cells. The cumulative growth curve drawn based on this is at the bottom of FIG. 4A.

도 4b는 hiPSC로부터 분화된 혈관내피세포를 냉동보관한 후, 4주 후에 녹여 다시 인큐베이터에서 배양하였을 때 새로운 세포와 생장률이 비슷한지를 확인한 결과로, 얼렸다 녹인 혈관내피세포의 경우 해동 1일 동안은 증식을 하지 않다가 1일 이후부터는 새로운 세포와 비슷한 기울기의 성장률을 보여주는 것을 확인할 수 있다.Figure 4b is a result of confirming whether the growth rate of the vascular endothelial cells differentiated from hiPSC is similar to that of the new cells when they are frozen and stored 4 weeks later and then cultured again in an incubator. It can be seen that the growth rate of the new cells is similar to that of the new cells after 1 day.

도 4c는 hiPSC로부터 분화된 혈관내피세포의 단백질 발현을 계대 1번, 5번한 샘플에서 형광염색을 통해 확인한 결과로, CD31, vWF, VE-cadherin과 같은 혈관내피세포의 발현은 계대가 반복되었음에도 동일하게 유지되었으며 FVIII의 발현 또한 유지됨을 확인할 수 있다.Figure 4c is a result of confirming the protein expression of vascular endothelial cells differentiated from hiPSC through fluorescence staining in samples 1 and 5 passages.The expression of vascular endothelial cells such as CD31, vWF, and VE-cadherin is the same even though the passages are repeated. And it can be seen that the expression of FVIII is also maintained.

도 5a는 hiPSC로부터 분화된 혈관내피세포의 혈우병 모델 마우스에 이식 후 생착 및 분포를 살펴보기 위한 in vivo tracking의 목적으로 Neo-LIVE라는 나노입자를 세포 배양액에 처리하여 나노입자의 흡수가 용이하게 진행되었는지 유세포분석을 통해 살펴본 결과로, Neo-live를 1일 동안 처리한 결과 약 98%의 세포가 독성 없이 해당 입자를 흡수하는 것을 확인할 수 있었다.Figure 5a is a nanoparticle called Neo-LIVE treated in a cell culture solution for the purpose of in vivo tracking to examine engraftment and distribution after transplantation into a hemophilia model mouse of vascular endothelial cells differentiated from hiPSC to facilitate absorption of nanoparticles As a result of examining through flow cytometry, it was confirmed that about 98% of cells absorbed the particles without toxicity as a result of treatment with Neo-live for 1 day.

도 5b는 hiPSC로부터 분화된 혈관내피세포에 NEO-LIVE라는 형광을 나타내는 입자를 처리한 후 면역 억제된 마우스에 이식한 후 Maestro라는 생체영상분석장치를 사용하여 마우스 내 분포를 확인한 결과로, Neo-LIVE가 처리된 혈관내피세포를 이식받은 마우스는 피하조직 내에서 약 20일 동안 세포 수가 줄지 않고 그 자리에서 유지되는 것을 확인할 수 있다.Figure 5b is a result of confirming the distribution in the mouse using a bio-imaging device called Maestro after treatment with particles showing fluorescence called NEO-LIVE on vascular endothelial cells differentiated from hiPSC and implantation in immunosuppressed mice. It can be seen that the mice transplanted with LIVE-treated vascular endothelial cells do not decrease the number of cells for about 20 days in the subcutaneous tissue and remain there.

도 5c는 도 5b에 언급된 방법으로 이식받은 마우스의 이식 20일 차에 이식부위(graft)를 적출하여 혈관내피세포 마커인 vWF, VE-cadherin 그리고 FVIII의 발현을 형광염색을 통해 확인한 결과로, 이식 부위에 근접한 마우스 조직에서 발현하지 않는 해당 마커들이 이식부위에서는 혈관망을 이루며 발현하고 있는 것을 확인할 수 있다. 또한, 생체 외에서 PKH로 염색한 혈관내피세포를 이식한 후 이식부위를 채취하여 PKH의 발현을 확인하였다. 마우스 조직과 다르게 세포를 이식한 마우스 그룹에서는 염색됨을 확인하였다. Figure 5c is a result of confirming the expression of vascular endothelial cell markers vWF, VE-cadherin and FVIII through fluorescence staining by extracting the graft on the 20th day of transplantation of the mouse transplanted by the method mentioned in Figure 5b, It can be seen that the markers that are not expressed in the mouse tissue close to the transplant site form a vascular network at the transplant site. In addition, after transplanting vascular endothelial cells stained with PKH in vitro, the transplantation site was collected to confirm the expression of PKH. Unlike mouse tissue, it was confirmed that the cells were stained in the transplanted mouse group.

<실험예 3> 분화 유도된 혈관내피세포의 혈우병 치료 실험<Experimental Example 3> Hemophilia treatment experiment of differentiation-induced vascular endothelial cells

도 6은 야생형(wild-type) 역분화줄기세포를 혈관내피세포로 분화시킨 후 FVIII의 발현을 qPCR을 통해 살펴본 결과로, 혈관내피세포로 분화가 진행됨에 따라 혈관내피세포 마커인 CE31과 VE-cad의 발현이 증가하였다. 역분화줄기세포 유래 혈관내피세포가 맥관을 형성하였을 경우에 LYVE-1의 발현이 증가함도 확인하였다. 이때 FVIII의 발현이 눈에 띄게 증가한 것을 확인할 수 있었다.6 is a result of examining the expression of FVIII through qPCR after differentiating wild-type dedifferentiated stem cells into vascular endothelial cells. As the differentiation proceeds to vascular endothelial cells, vascular endothelial cell markers CE31 and VE- The expression of cad was increased. It was also confirmed that the expression of LYVE-1 increased when vascular endothelial cells derived from dedifferentiated stem cells formed vasculature. At this time, it was confirmed that the expression of FVIII was remarkably increased.

도 7은 인간 역분화줄기세포, 이로부터 분화된 혈관내피세포 2종(계대 1번, 2번) 그리고 FVIII 생산 양성 세포로 알려진 초대배양 간 동모양 혈관내피세포(hLSEC)의 용해물(lysate)과 배양액을 수거하여 FVIII의 양을 ELISA를 통해 살펴본 결과로, hLSEC 용해물은 106개의 세포 당 약 15ng의 FVIII이 확인되었으며 인간 역분화줄기세포 유래 혈관내피세포에서는 1~3ng의 FVIII이 감지되었다. 하지만, 미분화 상태의 역분화줄기세포는 미미한 양이 감지되었다. 또한, hLSEC 배양액에서는 약 3~4ng이 확인되었으며, 분화시킨 혈관내피세포에서는 0.5ng이 확인되었다. 역시 미분화세포 배양액에서는 감지되지 않았다. 이는 분화된 혈관내피세포가 초대배양세포의 FVIII 생산량의 약 1/4~1/8 수준에 근접하고 있음을 확인할 수 있다. 또한, 역분화줄기세포로부터 분화한 혈관내피세포는 100만개의 세포당 7% FVIII 활성을 보여주었다.7 is a lysate of human dedifferentiated stem cells, two types of vascular endothelial cells differentiated therefrom (passage Nos. 1 and 2), and primary cultured liver homologous vascular endothelial cells (hLSEC) known as FVIII-producing positive cells. As a result of examining the amount of FVIII by collecting the supernatant culture medium through ELISA, about 15 ng of FVIII per 10 6 cells in hLSEC lysate was identified, and 1 to 3 ng of FVIII was detected in vascular endothelial cells derived from human dedifferentiated stem cells. . However, an insignificant amount of dedifferentiated stem cells in an undifferentiated state was detected. In addition, about 3-4 ng was confirmed in hLSEC culture medium, and 0.5 ng was confirmed in differentiated vascular endothelial cells. Again, it was not detected in undifferentiated cell culture. This can be confirmed that the differentiated vascular endothelial cells are close to about 1/4 to 1/8 of the FVIII production of primary cultured cells. In addition, vascular endothelial cells differentiated from dedifferentiated stem cells showed 7% FVIII activity per million cells.

도 8은 TVTB(tail vein transection bleeding) 실험을 시행한 것으로, 꼬리 끝에 scalpel을 이용한 상처를 입힌 후 15분 간격으로 상처 딱지부위에 출혈을 다시 발생시켜 총 출혈 시간을 계산하는 방식이다. C57/BL6 정상 마우스의 경우 총 출혈시간이 3분으로 지혈이 활발하게 일어나는 반면에 HA(hemophilia A) 마우스에서는 1차 지혈 후 2차 지혈이 일어나지 않고 계속적으로 출혈이 발생하여 평균 총 출혈 시간이 39분에 달하였다. 역분화줄기세포 유래 혈관내피세포를 이식받은 경우에는 세포 수가 2백만 개에서 4백만 개로 늘어남에 따라 치료효과가 눈에 띄게 변화하였다. 8 is a TVTB (tail vein transection bleeding) experiment, a method of calculating the total bleeding time by regenerating bleeding in the wound scab at 15 minute intervals after wounding with a scalpel at the end of the tail. In the case of C57/BL6 normal mice, the total bleeding time is 3 minutes, and hemostasis occurs actively, whereas in the HA (hemophilia A) mice, secondary hemostasis does not occur after the first hemostasis, and bleeding continuously occurs, resulting in an average total bleeding time of 39 It reached minutes. When vascular endothelial cells derived from dedifferentiated stem cells were transplanted, the treatment effect changed markedly as the number of cells increased from 2 million to 4 million.

Claims (10)

줄기세포를 CHIR99021, Y-27632, 아스코르브산, 액티빈 A(Activin A) 및 ITS를 함유한 분화배지에서 배양하여 중배엽성 세포로 분화 유도하는 단계;
상기 중배엽성 세포를 VEGF165(Vascular endothelial growth factor 165)를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 배양하여 혈관내피세포로 분화 유도하고, CD31 양성인 혈관내피세포를 분리 정제하는 단계; 및
상기 정제된 혈관내피세포를 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 배양하여 증식하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 혈관내피세포의 분화 및 증식 촉진 방법.
Culturing stem cells in a differentiation medium containing CHIR99021, Y-27632, ascorbic acid, activin A, and ITS to induce differentiation into mesodermal cells;
Culturing the mesodermal cells in an animal-derived material removal culture medium containing VEGF165 (Vascular endothelial growth factor 165) to induce differentiation into vascular endothelial cells, and separating and purifying CD31-positive vascular endothelial cells; And
A method for promoting differentiation and proliferation of vascular endothelial cells from stem cells, comprising the step of culturing and proliferating the purified vascular endothelial cells in an animal-derived substance removal culture medium containing VEGF165.
제1항에 있어서,
줄기세포는 미분화 또는 역분화 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem cell, iPSC), 체세포복제줄기세포(somatic cell nuclear transfer, SCNT) 및 전분화능줄기세포(pluripotent stem cells, PSC)로 이루어진 군에서 선택되는, 줄기세포로부터 혈관내피세포의 분화 및 증식 촉진 방법.
The method of claim 1,
Stem cells include undifferentiated or dedifferentiated embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSCs), somatic cell nuclear transfer (SCNT) and pluripotent stem cells. stem cells, PSC), a method for promoting differentiation and proliferation of vascular endothelial cells from stem cells.
제1항에 있어서,
줄기세포를 중배엽성 세포로 분화 유도하는 것은 5 내지 7μM의 CHIR99021, 5 내지 10 μM의 Y-27632, 100 내지 200 μM의 아스코르브산, 0.5 내지 2 ng/ml의 액티빈 A 및 1ХITS를 함유한 분화배지에서 줄기세포를 37℃에서 1.5일 내지 2.5일 동안 배양하는 것인, 줄기세포로부터 혈관내피세포의 분화 및 증식 촉진 방법.
The method of claim 1,
Inducing differentiation of stem cells into mesodermal cells is differentiation containing 5 to 7 μM of CHIR99021, 5 to 10 μM of Y-27632, 100 to 200 μM of ascorbic acid, 0.5 to 2 ng/ml of activin A and 1ХITS. A method for promoting differentiation and proliferation of vascular endothelial cells from stem cells by culturing the stem cells in a medium for 1.5 to 2.5 days at 37°C.
제1항에 있어서,
중배엽성 세포를 혈관내피세포로 분화 유도하는 것은 중배엽성 세포를 50 내지 100 ng/mL의 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 37 ℃에서 3일 내지 5일 동안 배양하는 것인, 줄기세포로부터 혈관내피세포의 분화 및 증식 촉진 방법.
The method of claim 1,
Inducing the differentiation of mesodermal cells into vascular endothelial cells is to culture the mesodermal cells in an animal-derived material removal medium containing 50 to 100 ng/mL of VEGF165 at 37° C. for 3 to 5 days, from stem cells. A method of promoting differentiation and proliferation of vascular endothelial cells.
제1항에 있어서,
정제된 혈관내피세포를 증식시키는 것은 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 1회 내지 8회 계대배양하는 것인, 줄기세포로부터 혈관내피세포의 분화 및 증식 촉진 방법.
The method of claim 1,
Proliferating purified vascular endothelial cells is a method for promoting differentiation and proliferation of vascular endothelial cells from stem cells by subculturing once to 8 times in an animal-derived substance-removing culture medium containing VEGF165.
제1항에 있어서,
각 단계에서 세포의 배양은 피브로넥틴이 코팅된 세포배양용기에서 수행되는, 줄기세포로부터 혈관내피세포의 분화 및 증식 촉진 방법.
The method of claim 1,
Cell culture in each step is carried out in a cell culture vessel coated with fibronectin, a method of promoting differentiation and proliferation of vascular endothelial cells from stem cells.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 분화되고, 초대배양 간 동모양 혈관내피세포(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC) 대비 1/4 내지 1/8 수준으로 FVIII 단백질을 생산하는 혈관내피세포.
Vascular endothelial cells differentiated by the method of any one of claims 1 to 6 and produce FVIII protein at a level of 1/4 to 1/8 compared to primary cultured liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) .
제7항의 혈관내피세포를 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양액에서 배양하여 혈관망을 형성하는 단계를 포함하는 혈액응고인자 8(FVIII) 단백질 생산 촉진 방법.
A method for promoting blood coagulation factor 8 (FVIII) protein production comprising the step of culturing the vascular endothelial cells of claim 7 in an animal-derived substance removal culture medium containing VEGF165 to form a vascular network.
제7항의 혈관내피세포를 포함하는 혈우병 치료용 조성물.
A composition for treating hemophilia comprising the vascular endothelial cells of claim 7.
제9항에 있어서,
혈우병은 제1형 혈우병인, 혈우병 치료용 조성물.The method of claim 9,
Hemophilia is hemophilia type 1, a composition for treating hemophilia.
KR1020190016414A 2019-02-13 2019-02-13 Simple method for differentiating human pluripotent stem cells into highly proliferative vascular endothelial cells for hemophilia A treatment KR102161910B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190016414A KR102161910B1 (en) 2019-02-13 2019-02-13 Simple method for differentiating human pluripotent stem cells into highly proliferative vascular endothelial cells for hemophilia A treatment

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190016414A KR102161910B1 (en) 2019-02-13 2019-02-13 Simple method for differentiating human pluripotent stem cells into highly proliferative vascular endothelial cells for hemophilia A treatment

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200099218A true KR20200099218A (en) 2020-08-24
KR102161910B1 KR102161910B1 (en) 2020-10-06

Family

ID=72235400

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190016414A KR102161910B1 (en) 2019-02-13 2019-02-13 Simple method for differentiating human pluripotent stem cells into highly proliferative vascular endothelial cells for hemophilia A treatment

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102161910B1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116769710A (en) * 2023-01-28 2023-09-19 深圳市寰宇生物科技有限公司 Macrophage differentiated from human induced pluripotent stem cells, and preparation method and application thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cell Stem Cell. 6;17(2):213-20 92015.08.06)
Int J Clin Exp Med, vol.9(7), pp.12737~12744( 2016)* *
SCIENTIFIC REPORTS, vol.5:9718, pp.1~9(2015)* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116769710A (en) * 2023-01-28 2023-09-19 深圳市寰宇生物科技有限公司 Macrophage differentiated from human induced pluripotent stem cells, and preparation method and application thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR102161910B1 (en) 2020-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tatebayashi et al. Identification of multipotent stem cells in human brain tissue following stroke
JP2020189872A (en) Angiogenic cells from human placental perfusate
JP5450072B2 (en) Kidney-derived cells and their use in tissue repair and regeneration
US8895299B2 (en) Method for expansion of stem cells
JP7236114B2 (en) Methods, somatic cells, and compositions for producing somatic cells
US20100330047A1 (en) Mesenchymal Stem Cells Grown Under Hypoxic Conditions: Compositions, Methods and Uses Therefor
US10576106B2 (en) Musculoskeletal stem cell and medium for inducing differentiation of musculoskeletal stem cell
WO2011101834A1 (en) A method for obtaining mesenchymal stem cells, media, methods and composition thereof
EP3256569B1 (en) Alveolar-like macrophages and method of generating same
US20110305673A1 (en) Compositions and methods for tissue repair
WO2008077094A2 (en) Methods for promoting neovascularization
WO2014046417A1 (en) Method for preparing mesenchymal stem cell aggregates
JP2017511125A (en) Method for generating endothelial colony-forming cell-like cells
Ikhapoh et al. Sry-type HMG box 18 contributes to the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to endothelial cells
KR101520536B1 (en) Differentiation method from tonsil-derived mesenchymal stem cells to hepatocytes and cell therapy composition comprising tonsil-derived mesenchymal stem cells for treatment of hepatopathy
KR102161910B1 (en) Simple method for differentiating human pluripotent stem cells into highly proliferative vascular endothelial cells for hemophilia A treatment
US20170112879A1 (en) Methods of protection against ischemia reperfusion injury
KR102281535B1 (en) Generation of liver organoid from stem cells for hemophilia A treatment
JP2018516089A (en) Method for culturing hematopoietic stem cells and / or for differentiating hematopoietic stem cells into precursors and use thereof
EP3680324A1 (en) Stem cells derived from young pig and preparation method therefor
US11834679B2 (en) Method for producing cardiomyocytes
WO2020190672A1 (en) Cardiomyocyte-derived exosomes inducing regeneration of damaged heart tissue
Tanigawa et al. Modeling renal progenitors–defining the niche
CN113249320B (en) Application of abscisic acid in promoting in-vitro differentiation of human induced pluripotent stem cells into megakaryocytes and platelets
KR20230127938A (en) Method of stem cell culture using serum-free medium

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant