KR20200091131A - Composition for anticancer immune vaccine using rna oligonucleotide - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 이용한 항암 면역 백신 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to an anti-cancer immune vaccine composition using RNA oligonucleotides.
인체에는 바이러스의 감염에 대응하기 위해 RIG-I(Retinoic acid inducible gene I)와 같은 핵산 감지 단백질 (nucleic acid sensor)이 존재한다. RIG-I는 침입한 병원체의 RNA를 인식하여 감염된 세포를 사멸시키기 위해 사멸 신호전달체계와 면역체계를 동시에 활성화시킨다. 면역체계는 사멸된 세포에서 나온 사이토카인에 의해 활성화된다. RIG-I의 이러한 성질을 이용하면 RIG-I 활성물질을 암세포에 투여하여 암세포를 사멸시키고, 사멸된 암세포에서 분비된 사이토카인들이 면역체계를 활성화시켜 암을 공격할 수 있다(Peter Duewell et al., Cell Death Differ., 2014, Vol.21, No. 12, 1825-1837).In the human body, a nucleic acid sensor, such as Retinoic Acid Inducible Gene I (RIG-I), is present to cope with viral infection. RIG-I recognizes the RNA of the invading pathogen and simultaneously activates the death signaling system and the immune system to kill the infected cells. The immune system is activated by cytokines from dead cells. Using these properties of RIG-I, RIG-I active substances are administered to cancer cells to kill cancer cells, and cytokines secreted from the killed cancer cells can activate the immune system to attack cancer (Peter Duewell et al. , Cell Death Differ. , 2014, Vol. 21, No. 12, 1825-1837).
구체적으로, RIG-I는 바이러스 RNA의 특징적인 구조 즉, 이중나선 구조와 5'-말단의 삼인산(triphosphate)을 선택적으로 결합하여 인식한다. 인플루엔자 바이러스의 RNA 프로모터도 이와 같은 구조를 가지기 때문에 RIG-I에 의해 인식되고, 인체의 면역반응을 활성화한다. 바이러스의 RNA는 RIG-I의 C-말단에 강하게 결합하고, RIG-I의 형태를 변화시켜 면역활성 신호를 전달하게 한다. Specifically, RIG-I is recognized by selectively combining a characteristic structure of viral RNA, that is, a double-helix structure and a 5'-terminal triphosphate. The RNA promoter of the influenza virus also has this structure, so it is recognized by RIG-I and activates the human immune response. The RNA of the virus binds strongly to the C-terminus of RIG-I, and changes the form of RIG-I to transmit an immunoactive signal.
또한, 종양 세포에서 제 1형 인터페론 유전자 클러스터(cluster)의 인터페론-α 및 인터페론-β 유전자가 결실되어 있음이 보고된 이후, 인터페론은 종양의 성장에 중요한 인자로 알려져 1980년대부터 항암제로 사용되어 왔다(Jun Yoshida et al., Cancer Sci., 2004, Vol.95, No.11, 858-865). RIG-I는 바이러스의 이중나선 RNA에서 5'-말단에 존재하는 삼인산을 특이적으로 인식하여 인터페론 합성을 유도하여 면역반응을 활성화하므로, RIG-I를 표적으로 하는 항바이러스제, 항암제, 바이러스 백신, 암 백신 개발에 이용되고 있다. In addition, since it has been reported that the interferon-α and interferon-β genes of the
최근 인체의 면역 시스템과 암세포의 상호작용에 대한 이해가 높아짐에 따라 인체의 면역 시스템을 보조하여 항암 효과를 갖는 면역 항암제가 출시되고 있다. 대표적으로 국내 시판이 허가된 여보이(Yerboy), 키트루다(Keytruda), 옵디보 (Opdivo) 등이 있다. Recently, as the understanding of the interaction between the human immune system and cancer cells increases, an immune anti-cancer agent having an anti-cancer effect has been released by assisting the human immune system. Examples include Yerboy, Keytruda, and Opdivo, which have been approved for domestic market.
현재의 면역 항암제는 단백질기반 치료제나 세포기반 치료제로서, 단백질기반 치료제들은 대부분 항체들이고, 세포기반 치료제들은 T 세포를 과다발현시키는 방법, 또는 T 세포가 암을 공격하도록 변형하는 방법 등이 있다. 현재의 면역 항암제들은 높은 생산 단가 및 치료 비용 때문에 대다수의 환자들에게 접근성이 낮다. 특히 면역 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor)들 중 하나인 키트루다의 치료률은 33%로 낮다. Current immune anti-cancer agents are protein-based therapeutics or cell-based therapeutics, and most of the protein-based therapeutics are antibodies, and cell-based therapeutics include a method for overexpressing T cells, or a method for modifying T cells to attack cancer. Current immuno-cancer drugs are less accessible to the majority of patients due to the high cost of production and the cost of treatment. In particular, one of the immune checkpoint inhibitors, Kitruda, has a low treatment rate of 33%.
이에 본 발명자들은 부작용이 적고 효과적인 항암 면역 백신을 개발하기 위해 노력한 결과, RIG-I를 활성화시키는 RNA 올리고뉴클레오티드를 암세포에 처리하여 수득한 전세포 조성물이 암세포의 성장을 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors tried to develop an effective anti-cancer immune vaccine with fewer side effects, and confirmed that the whole cell composition obtained by treating RNA oligonucleotides that activate RIG-I to cancer cells inhibits the growth of cancer cells. Completed.
본 발명은 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 암세포에 처리하여 수득된 전세포 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암 면역 백신 조성물을 제공한다. The present invention provides an anti-cancer immune vaccine composition comprising a whole cell composition obtained by treating an RNA oligonucleotide having a double helix bending structure on cancer cells as an active ingredient.
본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드를 이용한 항암 면역 백신 조성물은 상기 RNA 올리고뉴클레오티드로 사멸시킨 암세포, 암세포의 세포용해산물 또는 파생물을 포함한다. 본 발명의 항암 면역 백신 조성물은 사멸된 암세포로부터 나온 사이토카인에 의해 면역체계가 활성화함으로써, 부작용이 적고 안정성이 높다. 또한, 면역 체계를 활성화시킬 수 있으므로, 다른 항암제들과 같이 사용할 수 있다. 그뿐만 아니라, 상기 항암 면역 백신 조성물은 면역 체계가 암세포를 기억하게 하여, 암의 재발 또는 전이를 효과적으로 차단할 수 있는 항암 면역 백신으로서 유용하게 사용될 수 있다.The anti-cancer immune vaccine composition using the RNA oligonucleotide of the present invention includes cancer cells killed by the RNA oligonucleotides, cell lysates or derivatives of cancer cells. The anti-cancer immune vaccine composition of the present invention is activated by the immune system by cytokines from killed cancer cells, so that side effects are small and stability is high. In addition, since it can activate the immune system, it can be used with other anticancer drugs. In addition, the anti-cancer immune vaccine composition can be useful as an anti-cancer immune vaccine that can effectively block cancer recurrence or metastasis by allowing the immune system to remember cancer cells.
도 1a는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드들의 서열 및 구조를 나타낸 도면이다.
도 1b는 인터페론-β 발현을 증가시키는 이중나선 굽힘 구조(RNA bend motif)를 갖는 RNA를 나타낸 도면이다. 빨간색 표시상자는 굽힘이 있는 부분이며, 주황색 핵산은 RNA 골격을 포스포로티오에이트로 변형한 부분을 나타낸다.
도 1c는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC에 의한 인터페론-β의 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 1d는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp에 의한 인터페론-β의 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 1e는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-8bp-Bend-GC Minimum에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 1f는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double Bend에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 1g는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 CBS-1, CBS-1-PS, CBS-4 및 CBS-7의 서열 및 구조를 나타낸 도면이다. 빨간색 표시상자는 굽힘이 있는 부분이며, 주황색 핵산은 RNA 골격을 포스포로티오에이트로 변형한 부분을 나타낸다.
도 2b는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오인 CBS-1, CBS-1-PS, CBS-4 및 CBS-7에 의한 ISG56 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 췌장암세포(Panc02), 간암세포(SNU886) 및 정상세포(HEK293)의 사멸효과를 확인한 도면이다.
도 4는 본 발명의 항암 면역 백신 조성물에 의한 항암효과를 마우스 모델에서 확인하기 위한 실험을 도식화한 도면이다.
도 5는 본 발명의 항암 면역 백신 조성물에 의한 항암효과를 마우스 모델을 통해 확인한 도면이다.1A is a diagram showing the sequence and structure of RNA oligonucleotides prepared according to an embodiment of the present invention.
1B is a diagram showing RNA having a double helix bending structure (RNA bend motif) that increases interferon-β expression. The red box is the bent part, and the orange nucleic acid indicates the part of the RNA skeleton modified with phosphorothioate.
Figure 1c is a graph confirming the increase in the expression of interferon-β by 5'-OH-Bend-GC, an RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
Figure 1d is a graph confirming the increase in the expression of interferon-β by 5'-OH-Bend-GC-8bp, an RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
Figure 1e is a graph confirming the increase in the expression of ISG56 by 5'-OH-8bp-Bend-GC Minimum RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
Figure 1f is a graph confirming the increased expression of ISG56 by 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS and 5'-OH-16mer-Double Bend, RNA oligonucleotides prepared according to an embodiment of the present invention.
Figure 1g is a graph confirming the increase in the expression of ISG56 by 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
Figure 2a is a diagram showing the sequence and structure of the RNA oligonucleotides CBS-1, CBS-1-PS, CBS-4 and CBS-7 prepared according to an embodiment of the present invention. The red box is the bent part, and the orange nucleic acid indicates the part of the RNA skeleton modified with phosphorothioate.
Figure 2b is a graph confirming the increase in ISG56 expression by RNA oligonucleotides CBS-1, CBS-1-PS, CBS-4 and CBS-7 prepared according to an embodiment of the present invention.
3 is a view confirming the killing effect of pancreatic cancer cells (Panc02), liver cancer cells (SNU886) and normal cells (HEK293) by RNA oligonucleotide having a double helix bending structure according to the present invention.
4 is a diagram showing an experiment for confirming the anti-cancer effect of the anti-cancer immune vaccine composition of the present invention in a mouse model.
5 is a diagram confirming the anti-cancer effect of the anti-cancer immune vaccine composition of the present invention through a mouse model.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 암세포에 처리하여 수득된 전세포 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암 면역 백신 조성물로서, 상기 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 하기 i) 내지 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드 중에서 선택되는 어느 하나인 것인 항암 면역 백신 조성물을 제공한다. The present invention is an anti-cancer immune vaccine composition comprising a whole cell composition obtained by treating an RNA oligonucleotide having a double helix bending structure on cancer cells as an active ingredient, wherein the RNA oligonucleotide having the double helix bending structure is i) to iv It provides an anti-cancer immune vaccine composition that is any one selected from RNA oligonucleotides.
상기 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 i) 서열번호 1(5'-N1GUAGAN2N3-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N4N5UUUGCN6-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다.The RNA oligonucleotide having the double-helix bending structure is i) an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3') and SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6- RNA oligonucleotides having a hydroxyl group (OH) at the 5'-end of the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 to form a double strand by oligonucleotide represented by 3') complementary to each other Nucleotides.
상기 i)의 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 독립적으로 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 N1 내지 N6은 독립적으로 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, 그리고 N3는 G일 수 있고(서열번호 3에 해당), 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, 그리고 N6은 C일 수 있다(서열번호 4에 해당).In the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 constituting the RNA oligonucleotide of i), N 1 to N 6 may be independently selected from the group consisting of A, G, C and U. Preferably N 1 to N 6 may be independently G or C. In one embodiment according to the present invention, N 1 is G, N 2 is C, and N 3 is G in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (corresponding to SEQ ID NO: 3), and represented by SEQ ID NO: 2 In the base sequence, N 4 may be C, N 5 may be G, and N 6 may be C (corresponding to SEQ ID NO: 4).
또한, 상기 i)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.In addition, the RNA oligonucleotide of i) is characterized by having a double-stranded helical bend structure. Specifically, a spiral bending structure is formed between the fourth base (A) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
본 발명에 따른 일실시예에서, 나선형 굽힘 구조는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 각각 워블 염기쌍일 때 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U)에서 형성된다.In one embodiment according to the present invention, the helical bending structure, each of the third base (U) and the fifth base (G) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, the sixth base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (G) and the fourth base (U) and wobble base pairs, respectively, are formed from the fourth base (A) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 .
상기 나선형 굽힘 구조는 이중가닥 RNA가 이루는 평면을 기준으로 10 내지 90도, 구체적으로는, 30 내지 70도, 더욱 구체적으로는 40 내지 50도로 구부러진 형태를 갖는다.The helical bending structure has a bent shape of 10 to 90 degrees, specifically, 30 to 70 degrees, more specifically 40 to 50 degrees, based on the plane formed by the double-stranded RNA.
상기 i)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 하기 [구조식 1]을 가질 수 있다. The RNA oligonucleotide of i) may have the following [Structural Formula 1].
[구조식 1][Structural Formula 1]
상기 구조식 1에서,In the above
N1 내지 N6은 독립적으로 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 구체적으로는 G 또는 C일 수 있다. UㆍG 또는 GㆍU는 워블 염기쌍이다. N 1 to N 6 may be independently any one selected from the group consisting of A, G, C and U, specifically, it may be G or C. U·G or G·U is a wobble base pair.
또한, 상기 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 ii) 서열번호 1(5'-N1GUAGAN2N3-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N4N5UUUGCN6-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 1로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다. In addition, the RNA oligonucleotide having the double-helical bending structure is ii) an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3') and SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN The oligonucleotides represented by 6 -3') complementarily bind to each other to form a double strand, and the 3'-end of the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 and the 5'- of the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 The terminal may be an RNA oligonucleotide having a hairpin structure connected to a loop and having a hydroxyl group at the 5'-end of the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1.
상기 ii)의 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 독립적으로 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 N1 내지 N6은 독립적으로 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, 그리고 N3는 G일 수 있고(서열번호 3에 해당), 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, 그리고 N6은 C일 수 있다(서열번호 4에 해당).In the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 constituting the RNA oligonucleotide of ii), N 1 to N 6 may be independently selected from the group consisting of A, G, C and U. Preferably N 1 to N 6 may be independently G or C. In one embodiment according to the present invention, N 1 is G, N 2 is C, and N 3 is G in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (corresponding to SEQ ID NO: 3), and represented by SEQ ID NO: 2 In the base sequence, N 4 may be C, N 5 may be G, and N 6 may be C (corresponding to SEQ ID NO: 4).
또한, 상기 ii)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.In addition, the RNA oligonucleotide of ii) is characterized by having a double-stranded spiral bending structure. Specifically, a spiral bending structure is formed between the fourth base (A) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
본 발명에 따른 일실시예에서, 나선형 굽힘 구조는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 각각 워블 염기쌍일 때 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U)에서 형성된다.In one embodiment according to the present invention, the helical bending structure, each of the third base (U) and the fifth base (G) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, the sixth base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (G) and the fourth base (U) and wobble base pairs, respectively, are formed from the fourth base (A) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 .
상기 나선형 굽힘 구조는 이중가닥 RNA가 이루는 평면을 기준으로 10 내지 90도, 구체적으로는, 30 내지 70도, 더욱 구체적으로는 40 내지 50도로 구부러진 형태를 갖는다.The helical bending structure has a bent shape of 10 to 90 degrees, specifically, 30 to 70 degrees, more specifically 40 to 50 degrees, based on the plane formed by the double-stranded RNA.
상기 헤어핀 RNA 구조에서 루프는 적어도 4개의 염기로 이루어질 수 있고, 예를 들어, 4 내지 80개, 4 내지 75개, 4 내지 70개, 4 내지 65개, 4 내지 60개, 4 내지 55개, 4 내지 50개, 4 내지 45개, 4 내지 40개, 4 내지 35개, 4 내지 30개, 4 내지 25개, 4 내지 20개, 4 내지 15개 또는 4 내지 10개의 염기로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서 상기 루프는 4개 또는 73개의 염기로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 루프를 구성하는 4개의 염기 서열은 UUCG이다.The loop in the hairpin RNA structure may consist of at least 4 bases, for example, 4 to 80, 4 to 75, 4 to 70, 4 to 65, 4 to 60, 4 to 55, 4 to 50, 4 to 45, 4 to 40, 4 to 35, 4 to 30, 4 to 25, 4 to 20, 4 to 15 or 4 to 10 bases. In one embodiment according to the present invention, the loop may consist of 4 or 73 bases. In one embodiment according to the present invention, the four base sequences constituting the loop are UUCG.
또한, 상기 루프에서 이를 구성하는 일부의 염기서열이 서로 상보적인 경우 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 스템(stem) 구조를 가질 수 있다. 상기 스템 구조는 A 및 U 사이에 왓슨-크릭 염기쌍이 형성된 AU 모티프(motif)를 포함할 수 있다.In addition, when some of the base sequences constituting them in the loop are complementary to each other, Watson-Crick base pairs may be formed to have a stem structure. The stem structure may include an AU motif in which a Watson-Crick base pair is formed between A and U.
상기 AU 모티프는 10 내지 50개, 15 내지 40개, 20 내지 35개, 25 내지 30개의 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 AU 모티프는 26개의 연속된 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있다.The AU motif may consist of 10 to 50, 15 to 40, 20 to 35, 25 to 30 AU base pairs. In one embodiment according to the present invention, the AU motif may consist of 26 consecutive AU base pairs.
상기 ii)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 하기 [구조식 2]를 가질 수 있다. The RNA oligonucleotide of ii) may have the following [Structural Formula 2].
[구조식 2][Structural Formula 2]
상기 구조식 2에서,In the
N1 내지 N6은 상기 구조식 1에서 정의한 바와 같으며, L은 루프를 포함한 헤어핀일 수 있다. 구체적으로 L은 UUCG로 표시되는 4개의 염기서열일 수 있다. N 1 to N 6 are the same as defined in the
나아가, 상기 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 iii) 서열번호 1(5'-N1GUAGAN2N3-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N4N5UUUGCN6-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 연결된 서열번호 17(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 17로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다. Furthermore, the RNA oligonucleotide having the double-helical bending structure is iii) an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3') and SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') the two oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 17 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') to which the oligonucleotides are linked are complementary to each other and double stranded To form, it may be an RNA oligonucleotide having a hydroxyl group at the 5'-end of the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 17.
상기 iii)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 17로 표시되는 염기서열 2개가 회귀성 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 용어 "회귀성(palindromic) 구조"는 이중가닥을 형성하는 2개의 염기서열이 5'-말단에서 3'-말단의 방향으로 동일한 순서의 염기서열로 구성되는 구조를 나타낸다. 본 발명에서 상기 회귀성 구조는 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 3'-말단이 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 5'-말단과 결합하여 단일가닥을 형성하고, 상기 형성된 단일가닥 2개가 서로 상보적으로 결합하여 형성된 이중가닥일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 단일가닥은 서열번호 18로 표시되는 염기서열일 수 있다.The RNA oligonucleotide of iii) is characterized in that the two nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 17 have a recursive structure. The term "palindromic structure" refers to a structure in which two nucleotide sequences forming a double strand are composed of nucleotide sequences of the same order in the direction of 5'-end to 3'-end. In the present invention, the recursive structure forms a single strand by combining the 3'-end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 with the 5'-end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the two formed single strands are mutually It may be a double strand formed by complementary bonding. In one embodiment of the present invention, the single strand may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.
상기 회귀성 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드의 이중가닥에서 나선형 굽힘 구조는 2개일 수 있다.In the double strand of the RNA oligonucleotide having the regressive structure, there may be two spiral bending structures.
상기 iii)의 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 독립적으로 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 N1 내지 N6은 독립적으로 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, 그리고 N3는 G, N4는 C, N5는 G, 그리고 N6은 C일 수 있다(서열번호 18에 해당).In the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 constituting the RNA oligonucleotide of iii), N 1 to N 6 may be independently selected from the group consisting of A, G, C and U. Preferably N 1 to N 6 may be independently G or C. In one embodiment according to the present invention, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 17, N 1 is G, N 2 is C, and N 3 is G, N 4 is C, N 5 is G, and N 6 is C It may be (corresponding to SEQ ID NO: 18).
또한, 상기 iii)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.In addition, the RNA oligonucleotide of iii) is characterized in that the double strand has a spiral bending structure. Specifically, a spiral bending structure is formed between the fourth base (A) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
본 발명에 따른 일실시예에서, 나선형 굽힘 구조는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 각각 워블 염기쌍일 때 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U)에서 형성된다.In one embodiment according to the present invention, the helical bending structure, each of the third base (U) and the fifth base (G) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, the sixth base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (G) and the fourth base (U) and wobble base pairs, respectively, are formed from the fourth base (A) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 .
상기 나선형 굽힘 구조는 이중가닥 RNA가 이루는 평면을 기준으로 10 내지 90도, 구체적으로는, 30 내지 70도, 더욱 구체적으로는 40 내지 50도로 구부러진 형태를 갖는다.The helical bending structure has a bent shape of 10 to 90 degrees, specifically, 30 to 70 degrees, more specifically 40 to 50 degrees, based on the plane formed by the double-stranded RNA.
상기 iii)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 하기 [구조식 3]을 가질 수 있다. The RNA oligonucleotide of iii) may have the following [Structural Formula 3].
[구조식 3][Structural Formula 3]
상기 구조식 3에 있어서,
In the
N1 내지 N6은 상기 구조식 1에서 정의한 바와 같다.N 1 to N 6 are as defined in
또한, 상기 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 iv) 서열번호 1(5'-N1GUAGAN2N3-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N4N5UUUGCN6-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 연결된 서열번호 17(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다. In addition, the RNA oligonucleotide having the double helix bending structure is iv) an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3') and SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') the two oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 17 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') to which the oligonucleotides are linked are complementary to each other and double stranded To form, the 3'-end of one oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 17 and the 5'-end of the other oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 17 are connected in a loop to have a hairpin structure, and the sequence It may be an RNA oligonucleotide having a hydroxyl group at the 5'-end of one oligonucleotide represented by the
상기 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 독립적으로 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 N1 내지 N6은 독립적으로 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, 그리고 N3는 G, N4는 C, N5는 G, 그리고 N6은 C일 수 있다(서열번호 18에 해당).In the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 constituting the RNA oligonucleotide of iv), N 1 to N 6 may be independently selected from the group consisting of A, G, C and U. Preferably N 1 to N 6 may be independently G or C. In one embodiment according to the present invention, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 17, N 1 is G, N 2 is C, and N 3 is G, N 4 is C, N 5 is G, and N 6 is C It may be (corresponding to SEQ ID NO: 18).
또한, 상기 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.In addition, the RNA oligonucleotide of iv) is characterized by having a double-stranded helical bending structure. Specifically, a spiral bending structure is formed between the fourth base (A) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
본 발명에 따른 일실시예에서, 나선형 굽힘 구조는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 각각 워블 염기쌍일 때 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U)에서 형성된다.In one embodiment according to the present invention, the helical bending structure, each of the third base (U) and the fifth base (G) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, the sixth base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (G) and the fourth base (U) and wobble base pairs, respectively, are formed from the fourth base (A) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 .
상기 나선형 굽힘 구조는 이중가닥 RNA가 이루는 평면을 기준으로 10 내지 90도, 구체적으로는, 30 내지 70도, 더욱 구체적으로는 40 내지 50도로 구부러진 형태를 갖는다.The helical bending structure has a bent shape of 10 to 90 degrees, specifically, 30 to 70 degrees, more specifically 40 to 50 degrees, based on the plane formed by the double-stranded RNA.
상기 헤어핀 RNA 구조에서 루프는 적어도 4개의 염기로 이루어질 수 있고, 예를 들어, 4 내지 80개, 4 내지 75개, 4 내지 70개, 4 내지 65개, 4 내지 60개, 4 내지 55개, 4 내지 50개, 4 내지 45개, 4 내지 40개, 4 내지 35개, 4 내지 30개, 4 내지 25개, 4 내지 20개, 4 내지 15개 또는 4 내지 10개의 염기로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서 상기 루프는 4개 또는 73개의 염기로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 루프를 구성하는 4개의 염기 서열은 UUCG이다.The loop in the hairpin RNA structure may consist of at least 4 bases, for example, 4 to 80, 4 to 75, 4 to 70, 4 to 65, 4 to 60, 4 to 55, 4 to 50, 4 to 45, 4 to 40, 4 to 35, 4 to 30, 4 to 25, 4 to 20, 4 to 15 or 4 to 10 bases. In one embodiment according to the present invention, the loop may consist of 4 or 73 bases. In one embodiment according to the present invention, the four base sequences constituting the loop are UUCG.
또한, 상기 루프에서 이를 구성하는 일부의 염기서열이 서로 상보적인 경우 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 스템(stem) 구조를 가질 수 있다. 상기 스템 구조는 A 및 U 사이에 왓슨-크릭 염기쌍이 형성된 AU 모티프(motif)를 포함할 수 있다.In addition, when some of the base sequences constituting them in the loop are complementary to each other, Watson-Crick base pairs may be formed to have a stem structure. The stem structure may include an AU motif in which a Watson-Crick base pair is formed between A and U.
상기 AU 모티프는 10 내지 50개, 15 내지 40개, 20 내지 35개, 25 내지 30개의 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 AU 모티프는 26개의 연속된 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있다.The AU motif may consist of 10 to 50, 15 to 40, 20 to 35, 25 to 30 AU base pairs. In one embodiment according to the present invention, the AU motif may consist of 26 consecutive AU base pairs.
상기 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 하기 [구조식 4]를 가질 수 있다. The RNA oligonucleotide of iv) may have the following [Structural Formula 4].
[구조식 4][Structural Formula 4]
상기 구조식 4에서,In the
N1 내지 N6은 상기 구조식 1에서 정의한 바와 같으며, L은 루프를 포함한 헤어핀일 수 있다. 구체적으로 L은 UUCG로 표시되는 4개의 염기서열일 수 있다. N 1 to N 6 are the same as defined in the
본 발명에 따른 i) 내지 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 엔도뉴클레아제에 의한 분해를 억제하고 생체 내 안정성 향상을 위해, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형될 수 있다. 본 발명에 따른 구체적인 일실시예에서 상기 변형은 적어도 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합이다.RNA oligonucleotides of i) to iv) according to the present invention inhibits degradation by endonuclease and improves in vivo stability, at least one or more of the phosphodiester bonds forming the RNA oligonucleotides are phosphoro It may be modified with one or more bonds selected from the group consisting of thioroate bonds, boranophosphate bonds, and methylphosphonate bonds. In a specific embodiment according to the present invention, the modification is at least one phosphorothioate bond.
또한, 본 발명에 따른 i) 내지 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 8 내지 100개, 8 내지 50개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 10 내지 100개, 10 내지 50개, 10 내지 30개, 20 내지 500개, 20 내지 300개, 10 내지 200개, 10 내지 100개, 20 내지 100개, 20 내지 90개 또는 20 내지 50개의 염기를 가질 수 있다.In addition, RNA oligonucleotides of i) to iv) according to the present invention are 8 to 100, 8 to 50, 8 to 30, 8 to 20, 10 to 100, 10 to 50, 10 to 30 , 20 to 500, 20 to 300, 10 to 200, 10 to 100, 20 to 100, 20 to 90 or 20 to 50 bases.
본 발명자들은 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS의 RNA 올리고뉴클레오티드가 IFN-β 및 ISG56(Interferon-stimulated gene 56)의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 1d 내지 1f).We found that RNA oligonucleotides of 5'-OH-Bend-GC-8bp and 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS increase the expression of IFN-β and ISG56 (Interferon-stimulated gene 56) (Fig. 1d to 1f).
또한, 상기 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS에 의한 췌장암세포(Panc02), 간암세포(SNU886) 및 정상세포(HEK293)의 세포 사멸 유도효과를 확인하였다(도 3).In addition, the effect of inducing apoptosis of pancreatic cancer cells (Panc02), liver cancer cells (SNU886) and normal cells (HEK293) by the RNA oligonucleotide 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS having the spiral bending structure was confirmed. (Fig. 3).
나아가, 상기 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 췌장암세포에 처리하여 수득한 전세포 조성물을 마우스에게 투여한 후, 췌장암세포를 상기 마우스에게 주입하였을 경우 췌장암세포의 증식이 억제됨을 확인하였다(도 5). Furthermore, after administering the whole cell composition obtained by treating the RNA oligonucleotide having the helical bending structure to pancreatic cancer cells to a mouse, it was confirmed that when pancreatic cancer cells are injected into the mouse, the proliferation of pancreatic cancer cells is inhibited (FIG. 5 ). ).
따라서, 본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드를 이용한 항암 면역 백신 조성물은 항암 면역 활성을 나타냄으로, 이를 유효성분으로 포함하는 항암 면역 백신의 개발 및 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다. Therefore, since the anti-cancer immune vaccine composition using the RNA oligonucleotide of the present invention exhibits anti-cancer immune activity, it can be usefully used for the development of an anti-cancer immune vaccine and cancer treatment comprising it as an active ingredient.
상기 전세포 조성물은 RNA 올리고뉴클레오티드를 암세포에 처리한 후, 수득한 사멸된 암세포, 상기 암세포의 세포용해산물 또는 이의 파생물을 포함할 수 있다. The whole cell composition may include the obtained dead cancer cell, the cell lysate of the cancer cell, or a derivative thereof after treating the RNA oligonucleotide to the cancer cell.
상기 암세포의 세포용해산물 또는 파생물은 RNA 올리고뉴클레오티드에 의해 암세포가 분비한 사이토카인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 사이토카인은 IFN-β, IL-12, CXCL-10, IL-6 또는 IFN-γ일 수 있다.The cell lysate or derivative of the cancer cells may include cytokines secreted by cancer cells by RNA oligonucleotides. Specifically, the cytokine may be IFN-β, IL-12, CXCL-10, IL-6 or IFN-γ.
또한, 상기 암세포의 세포용해산물 또는 파생물은 암세포가 발현하는 종양항원을 포함할 수 있다. 종양항원은 종양세포에만 발현하는 종양 특이적 항원이다. 상기 종양항원은 돌연변이에 의한 단백질, 종양 특이적 암유전자 또는 바이러스성 암유전자일 수 있다. In addition, the cell lysate or derivative of the cancer cell may include a tumor antigen expressed by the cancer cell. A tumor antigen is a tumor-specific antigen expressed only on tumor cells. The tumor antigen may be a mutagenic protein, a tumor specific oncogene or a viral oncogene.
상기 암세포는 췌장암, 간암, 위암, 폐암, 대장암, 직장암, 갑상선암, 식도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 자궁경부암, 유방암, 피부암, 상피암, 뇌암, 중추신경암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있다. The cancer cells are selected from the group consisting of pancreatic cancer, liver cancer, stomach cancer, lung cancer, colon cancer, rectal cancer, thyroid cancer, esophageal cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, cervical cancer, breast cancer, skin cancer, epithelial cancer, brain cancer, central nerve cancer, and ovarian cancer. It can be one.
본 발명의 항암 면역 백신 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 예를 들어, 부형제, 담체, 희석제, 기타 보조제 등을 1종 이상 포함할 수 있다. The anti-cancer immune vaccine composition of the present invention may include one or more pharmaceutically acceptable additives, for example, excipients, carriers, diluents, and other adjuvants, in addition to the active ingredients described above for administration.
약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-parabens and chlorobutanol. Other pharmaceutically acceptable carriers can be referred to those described in the following documents (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 항암 면역 백신 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 항암 면역 백신 조성물에 포함되는 암세포수를 기준으로 개체의 체중 kg당 1x104 내지 1x108 세포수가 될 수 있다. 이때 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.The dosage of the anti-cancer immune vaccine composition of the present invention is the type of disease, the severity of the disease, the type and content of active ingredients and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the patient's age, weight, general health status, sex and diet. , The time of administration, route of administration, duration of treatment, and drugs used simultaneously. However, for a desired effect, the number of cancer cells included in the anti-cancer immune vaccine composition of the present invention may be 1 x 10 4 to 1 x 10 8 cells per kg body weight of the individual. At this time, the administration may be administered once a day, or may be divided into multiple administrations.
또한, 본 발명의 항암 면역 백신 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다. 상기 항암 면역 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.In addition, the anti-cancer immune vaccine composition of the present invention can be administered to an individual by various methods known in the art. The administration route may be appropriately selected by a person skilled in the art in consideration of the administration method, the volume of body fluids, viscosity, and the like. The route of administration of the anti-cancer immune vaccine composition can be administered through any general route as long as it can reach the target tissue. Parenteral administration may be, for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, but is not limited thereto.
본 발명에서 사용하는 용어 '항암 면역 백신'이란, 생체내의 전반적인 면역 반응을 향상시켜 암을 치료하는 비특이적 항암 치료 백신과 종양세포의 특정 항원에 대해 특이적인 면역반응을 유도하는 특이적 항암 치료 백신을 의미한다. 상기 비특이적 항암 치료 백신은 생체 내 면역 반응, 특히 T세포의 활성과 분화에 중요한 면역 보조 자극제를 이용하여 암환자의 전반적인 면역력을 향상시킨다. 상기 특이적 항암 치료 백신은 종양 항원을 기반으로 사용하거나 종양세포 자체를 항원으로 사용하여 종양 세포에 대한 특이적인 면역 반응을 유도한다.The term'anti-cancer immune vaccine' used in the present invention refers to a non-specific anti-cancer therapeutic vaccine that improves the overall immune response in vivo to treat cancer and a specific anti-cancer therapeutic vaccine that induces a specific immune response against specific antigens of tumor cells. it means. The non-specific anti-cancer treatment vaccine improves the overall immunity of cancer patients by using an immune response stimulator, which is important for the immune response in vivo, especially T cell activity and differentiation. The specific anti-cancer treatment vaccine is based on a tumor antigen or uses the tumor cell itself as an antigen to induce a specific immune response against tumor cells.
본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1. RNA 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 제조Example 1. Preparation of RNA oligonucleotide
인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시킬 수 있는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다.RNA oligonucleotides capable of increasing the expression of interferon-β or ISG56 were constructed.
먼저, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 제작하였다. 반면, 서열번호 5 내지 10 및 서열번호 18로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖거나, 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 RNA 올리고뉴클레오티드는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technologies) 또는 다르마콘(Dharmacon)에 주문제작하였다.First, RNA oligonucleotides consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and having a triphosphate at the 5'-end were prepared using techniques known in the art. On the other hand, RNA oligonucleotides consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 5 to 10 and SEQ ID NO: 18 and having a hydroxy group at the 5'-end, or wherein phosphodiester bonds are substituted with phosphorothioate bonds are integrated. It was custom-made to Integrated DNA Technologies or Dharmacon.
이에 따라, 도 1a에 나타난 바와 같이, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-control 및 5'-PPP-control RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Bend-GC-8bp RNA 올리고뉴클레오티드 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS를 각각 제작하였다. 또한, 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Bend-GC RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 또한, 서열번호 9로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 제작하였다. 또한, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Long-Bend RNA 올리고뉴클레오티드 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드의 말단 8개의 염기가 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Long-Bend-BPS를 제조하였다. 또한, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 구성되고, 이들 염기가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하며, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 아울러, 서열번호 18로 표시되는 염기서열 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.Accordingly, as shown in Fig. 1A, 5'-OH-control and 5'-PPP-control RNA oligo consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and having a hydroxyl group or triphosphate at the 5'-terminus. Nucleotides were prepared. In addition, 5'-OH-iav and 5'-PPP-iav RNA oligonucleotides consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 and having a hydroxyl group or triphosphate at the 5'-terminus were prepared. In addition, a 5'-OH-Bend-GC-8bp RNA oligonucleotide composed of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 and having a hydroxyl group at the 5'-end, and a phosphodiester bond forming the RNA oligonucleotide 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS substituted with phosphorothioate bonds was prepared, respectively. In addition, a 5'-OH-Bend-GC RNA oligonucleotide was constructed comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 and having a hydroxyl group at the 5'-end. In addition, a 5'-OH-Cont-GC-8bp was constructed consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 and having a hydroxyl group at the 5'-terminus. In addition, a 5'-OH-Long-Bend RNA oligonucleotide composed of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 and having a hydroxyl group at the 5'-end and a phosphodiester formed by the 8 bases of the RNA oligonucleotide 5'-OH-Long-Bend-BPS was prepared in which the bond was substituted with a phosphorothioate bond. In addition, it consists of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, these bases are complementary to each other to form a double strand, 5'-OH-8bp-Bend having a hydroxyl group at the 5'-end -GC-Minimum RNA oligonucleotide was prepared. In addition, two base sequences represented by SEQ ID NO: 18 complementarily bind to each other to form a double strand, and a 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA oligonucleotide having a hydroxyl group at its 5'-end was prepared. .
실시예 2. RNA 올리고뉴클레오티드의 구조 확인Example 2. Confirmation of the structure of RNA oligonucleotide
상기 실시예 1에서 제조된 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드의 구조를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.The following experiments were performed to confirm the structures of the 5'-OH-iav and 5'-PPP-iav RNA oligonucleotides prepared in Example 1.
먼저, 상기 실시예 1에서 제작된 RNA 올리고뉴클레오티드를 10 mM 인산나트륨(pH 6.5), 0.01 mM EDTA, 10 (v/v)% D2O를 포함하는 완충액에 용해시킨 샘플을 제조하여 당업계에 공지된 방법으로 다양한 분광실험을 하였다. 이때, 2차원 NOE 분광실험(NOESY)은 400, 600 및 800 ㎒의 핵자기공명(NMR) 분광기(Bruker, USA)로 100 및 200 ㎳의 믹싱시간에서 하였다. 또한, 278 K의 온도에서 1H-15H HSQC(heteronuclear single quantum coherence) 분광실험, 125 ㎳ 믹싱시간에서 DQF-COSY(double quantum filtered correlated) 및 TOCSY(homonuclear total correlation) 분광실험, 30 ㎳ 믹싱시간에서 1H-31P HETCOR(heteronuclear correlation) 및 1H-31P Hetero-TOCSY 분광실험, 및 80, 150 및 250 ㎳ 믹싱시간에서 NOESY 분광실험을 하였다. 그 외에도, 1H-13C CT-HSQC, HCCH-COSY, 2D HCCH-relayed COSY, 2D HCCH-TOCSY 및 3D HCCH-TOCSY 분광실험들을 하였다.First, a sample in which the RNA oligonucleotide prepared in Example 1 was dissolved in a buffer containing 10 mM sodium phosphate (pH 6.5), 0.01 mM EDTA, and 10 (v/v)% D2O was prepared, and is known in the art. Various spectral experiments were conducted by the method. At this time, the 2D NOE spectroscopy experiment (NOESY) was performed at a mixing time of 100 and 200 로 with a nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy (Bruker, USA) of 400, 600 and 800 MHz. In addition, 1H-15H heteronuclear single quantum coherence (HSQC) spectroscopy at a temperature of 278 K, DQF-COSY (double quantum filtered correlated) and TOCSY (homonuclear total correlation) spectroscopy at 125 믹 mixing time, 1H at 30 ㎳ mixing time -31P HETCOR (heteronuclear correlation) and 1H-31P Hetero-TOCSY spectroscopy, and NOESY spectroscopy at 80, 150 and 250 ㎳ mixing time. In addition, 1H-13C CT-HSQC, HCCH-COSY, 2D HCCH-relayed COSY, 2D HCCH-TOCSY and 3D HCCH-TOCSY spectroscopy were performed.
NMR 분광실험 결과, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드의 염기 수소들과, H1', H2', H3', H4', H5'/H5''들의 NMR 피크들을 정하였다. NOESY 분광실험으로부터 약 563개의 NOE 거리 규정값(distance constraints)들을 구하였고, 거리 규정값들은 거리에 따라 3 내지 4개의 그룹들(예컨대, 1.8 내지 3.4 Å, 1.8 내지 5.0 Å 및 3.8 내지 7.0 Å, 또는 1.8 내지 3.4 Å, 2.5 내지 4.5 Å, 3.5 내지 6.0 Å 및 4.0 내지 7.0 Å)로 분류하였다. 비 왓슨-크릭 결합들에 대해서는 수소결합 제한을 두지 않았다. DQF-COSY에서 얻은 3JH1', H2' 값으로 δ 이면각(dihedral angle)을 구하였고, 모든 χ 이면각은 -158±15도로 고정하였다. 다른 이면각(예컨대, α, β, γ, ε, ζ)은 RNA의 A형 나선 구조로 제한하였다. 벌지(bulge) 부분은 몇몇 β 및 ε 이면각을 제외하고, 다른 이면각들은 제한하지 않았다. 잔류 쌍극 결합(residual dipolar coupling) 값들을 ±1 ㎐의 정확도로 민감성이 증가된 HSQC 실험으로 측정하였다. 또한, 특이값 분해(singular value decomposition)를 통해 얼라인먼트 텐서(alignment tensor)를 분석한 결과, -8.0 ㎐의 비등방성(anisotropy) 값과 0.32의 롬빅시티(rhombicity) 값을 얻었다. 모든 구조의 계산은 X-PLOR 3.1 및 CNS로 하였다. 100개의 구조를 거리 규정값에 따라 생성하여 3,000 K에서 10 ㎰ 동안 시뮬레이션 후, 50 ㎰ 동안 300 K에서 식히는 담금질 기법(simulated annealing)을 수행하였다. 거리 힘 상수(distance force constant)는 50 ㎉/mol/Å로 유지하였고, 이면각 상수는 20 ㎉/mol/Å에서 400 ㎉/mol/Å로 변화시켰다. 제일 낮은 에너지 상태의 구조들은 300 K에서 20 ㎰로 정제하였고, 마지막 5 ㎰는 제한된 에너지 최적화(restrained energy minimization)를 하였다. 이로부터 얻어진 총 220개의 구조들은 22개의 잔류 쌍극 결합 규정 값들을 추가하여 정제하였고, 이때 잔류 쌍극 결합의 힘 상수 값은 3.0 ㎉/mol을 유지하였다. 최종적으로 32개의 구조를 얻었으며, 이를 Insight II(Biosym Technologies, USA) 및 CURVES 5.2 소프트웨어로 분석하였다.As a result of NMR spectroscopy, the base hydrogens of the RNA oligonucleotide and NMR peaks of H1', H2', H3', H4', H5'/H5'' were determined. About 563 NOE distance constraints were obtained from the NOESY spectroscopy, and the distance regulation values were 3 to 4 groups according to the distance (eg, 1.8 to 3.4 km, 1.8 to 5.0 km and 3.8 to 7.0 km, Or 1.8 to 3.4 Å, 2.5 to 4.5 Å, 3.5 to 6.0 Å and 4.0 to 7.0 Å). There are no hydrogen bond restrictions for non-Watson-Crick bonds. The δ dihedral angle was obtained with 3JH1' and H2' values obtained from DQF-COSY, and all χ dihedral angles were fixed at -158±15 degrees. Other back angles (e.g., α, β, γ, ε, and ζ) were limited to RNA type A helical structures. The bulge portion did not limit other back angles except for some β and ε back angles. Residual dipolar coupling values were measured by HSQC experiments with increased sensitivity with an accuracy of ±1 ㎐. In addition, as a result of analyzing the alignment tensor through singular value decomposition, an anisotropy value of -8.0 과 and a rhombicity value of 0.32 were obtained. All structures were calculated using X-PLOR 3.1 and CNS. 100 structures were generated according to the distance regulation value, and then simulated for 10 K at 3,000 K, followed by a simulated annealing at 300 K for 50 ㎰. The distance force constant was maintained at 50 ㎉/mol/Å, and the back angle constant was changed from 20 ㎉/mol/Å to 400 ㎉/mol/Å. The structures of the lowest energy state were purified from 300 K to 20 kW, and the last 5 kW was subjected to limited energy minimization. A total of 220 structures obtained therefrom were refined by adding 22 residual dipole bond prescribed values, and the force constant value of the residual dipole bond was maintained at 3.0 MPa/mol. Finally, 32 structures were obtained and analyzed with Insight II (Biosym Technologies, USA) and CURVES 5.2 software.
그 결과 도 1b에 나타난 바와 같이, 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav RNA 올리고뉴클레오티드는 나선형 굽힘 구조를 형성하고 있었다. 이와 같은 나선형 굽힘 구조는 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav를 구성하는 서열 중, 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'로 표시되는 서열로 구성된 두 개의 단일 가닥이 비 왓슨-크릭 결합을 통해 이중가닥을 형성하며 생성되는 구조로 확인되었다. 따라서, 상기 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'로 표시되는 서열을 포함하는 본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC, 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS, 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum, 5'-OH-16mer-Double-Bend, 5'-OH-Long-Bend 및 5'-OH-Long-Bend-BPS 올리고뉴클레오티드도 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 알 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 1B, 5'-PPP-iav and 5'-OH-iav RNA oligonucleotides formed a helical bending structure. This helical bending structure consists of two single strands consisting of 5'-GUAGA-3' and 5'-UUUGC-3', among the sequences constituting 5'-PPP-iav and 5'-OH-iav. Through this non-Watson-Crick bond, it was confirmed that the structure was formed by forming a double strand. Thus, 5'-OH-Bend-GC, 5'-OH-Bend-GC-, which are the RNA oligonucleotides of the present invention comprising the sequences represented by the 5'-GUAGA-3' and 5'-UUUGC-3' 8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS, 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum, 5'-OH-16mer-Double-Bend, 5'-OH-Long-Bend and 5' It was found that the -OH-Long-Bend-BPS oligonucleotide also formed a helical bending structure.
실험예 1. RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 인터페론-β의 발현 확인Experimental Example 1. Confirmation of expression of interferon-β by RNA oligonucleotide
상기 실시예 1에서 제조된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드들이 인터페론-β의 발현을 증가시키는지 확인하였다.It was confirmed that the RNA oligonucleotides having the helical bending structure prepared in Example 1 increase the expression of interferon-β.
실험예 1.1. 세포주의 준비Experimental Example 1.1. Preparation of cell lines
먼저, 100 ㎜ 조직배양 플레이트에 3x106개의 HEK293T 세포(ATCC, USA)를 10%(v/v) 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, 미국)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 7 ㎖에 분주하고, 이를 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하여 세포주를 준비하였다.First, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing 3x10 6 HEK293T cells (ATCC, USA) in 10 mm (v/v) fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA) in 100 mm tissue culture plate Dispense into 7 ml of medium, and cultured for 24 hours at 37° C. and 5% CO 2 to prepare a cell line.
실험예 1.2. RNA 올리고뉴클레오티드의 처리Experimental Example 1.2. Treatment of RNA oligonucleotides
상기 실험예 1.1.에서 준비한 세포주에 상기 실시예 1에서 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.The cell line prepared in Experimental Example 1.1. was treated with the RNA oligonucleotide prepared in Example 1.
먼저, 상기 배양된 세포에 트립신-EDTA(Gibco, 미국)를 처리하여 세포들을 떼어내고, 이를 계수하여 6-웰(well) 플레이트에 1x103개가 되도록 분주하였다. 그 후, 이를 37℃, 5% CO2의 조건에서 42시간 동안 배양하고, 배지를 제거한 뒤, FBS가 포함되지 않은 400 ㎕ OPTI-MEM 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.First, the cultured cells were treated with trypsin-EDTA (Gibco, USA) to separate the cells, counted, and dispensed to 1x10 3 cells in a 6-well plate. Then, it was incubated at 37° C., 5% CO 2 for 42 hours, the medium was removed, and 400 μl OPTI-MEM and RNA oligonucleotides without FBS were treated.
RNA 올리고뉴클레오티드의 처리는, 1 μM의 5'-PPP-control, 5'-PPP-iav, 5'-OH-control, 5'-OH-iav, 5'-OH-Bend-GC 각각에 4 ㎕의 리포펙타민 LTX, 및 1.6 ㎕의 플러스-시약을 혼합하여, 이를 200 ㎕씩 세포에 처리하였다. 그 후, 상기 세포를 다시 37℃, 5% CO2의 조건에서 4시간 동안 배양하였고, 이때, 양성대조군으로는 RIG-I 리간드로 알려진 폴리(I:C)[poly(I:C)]를, 음성대조군으로는 배지만 처리하였다. 4시간 후, 배지를 제거하고, 10%(v/v) FBS를 포함하는 2 ㎖의 DMEM 배지를 넣어 37℃, 5% CO2의 조건에서 2시간을 더 배양하였다.Treatment of RNA oligonucleotides was 4 µl each in 1 μM of 5'-PPP-control, 5'-PPP-iav, 5'-OH-control, 5'-OH-iav, and 5'-OH-Bend-GC. Lipofectamine LTX, and 1.6 μl of the plus-reagent were mixed, and 200 μl of the cells were treated. Subsequently, the cells were cultured for 4 hours at 37° C. and 5% CO 2 again. At this time, poly(I:C) [poly(I:C)] known as RIG-I ligand was used as a positive control. , As a negative control, only the medium was treated. After 4 hours, the medium was removed, and 2 ml of DMEM medium containing 10% (v/v) FBS was added, followed by further incubation at 37°C and 5% CO 2 for 2 hours.
실험예 1.3. 인터페론-β의 발현 확인Experimental Example 1.3. Confirmation of the expression of interferon-β
상기 서술한 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리한 세포에서 인터페론-β의 발현을 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 RNA를 분리하였다.As described above, RNA was isolated by the following method to confirm the expression of interferon-β in cells treated with RNA oligonucleotides.
먼저, 배지를 제거하고 500 ㎕의 TRI-시약(Ambion, 미국)으로 세포를 회수한 뒤, 모아진 세포에 클로로포름을 넣어 RNA 층을 분리하였다. 여기에 이소프로판올을 첨가하여 펠렛(pellet)을 만들고, 상기 펠렛을 75% 에탄올로 세척 및 건조시킨 뒤, 멸균된 증류수에 녹였다. 이렇게 분리된 RNA에 DNase(Promega, 미국)를 첨가하여 30분 동안 상온에서 처리하여 오염된 DNA를 제거하였고, 정지용액(stop solution)으로 이를 불활성화하였다. 그 후, 슈퍼스크립트 III 역전사효소(Invitrogen, 미국)를 이용하여 50℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.First, the medium was removed, and the cells were recovered with 500 μl of TRI-reagent (Ambion, USA), and then the chloroform was added to the collected cells to separate the RNA layer. Here, an isopropanol was added to make a pellet, and the pellet was washed and dried with 75% ethanol, and then dissolved in sterile distilled water. DNase (Promega, USA) was added to the RNA thus isolated, treated at room temperature for 30 minutes to remove contaminated DNA, and inactivated with a stop solution. Thereafter, cDNA was synthesized from RNA by reacting at 50°C for 1 hour using Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen, USA).
이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 구체적으로, 실시간 PCR은 h-tag DNA 중합효소(solgent, 대한민국), dNTP, 염화테트라에틸암모늄(tetraethylammonium chloride), 에바그린 염료(evagreen dye, Biotium, USA), 및 표적 유전자인 인터페론-β 및 대조 유전자인 GAPDH를 위한 프라이머를 혼합하여 수행하였다. 실시간 PCR은 95℃에서 15분 동안 고정한 후, 95℃ 20초, 60℃ 40초, 및 72℃ 20초를 1회로 총 40회를 반복하였다. 이때, 인터페론-β 및 GAPDH를 표적으로 하는 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.Real-time PCR (real-time PCR) was performed using the synthesized cDNA as a template. Specifically, real-time PCR includes h-tag DNA polymerase (solgent, Korea), dNTP, tetraethylammonium chloride, evagreen dye (Biotium, USA), and the target gene, interferon-β and control It was performed by mixing primers for the gene GAPDH. After real-time PCR was fixed at 95°C for 15 minutes, 95°
도 1c에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라, 5'-말단에 하이드록시기를 갖더라도 나선형 굽힘 구조가 있는 5'-OH-Bend-GC RNA 올리고뉴클레오티드도 인터페론-β의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.As shown in Fig. 1C, 5'-OH-Bend-GC RNA oligonucleotide having a helical bending structure even with a 5'-terminal hydroxy group as well as RNA oligonucleotide having a triphosphate at the 5'-terminus is interferon. It was confirmed that the expression of -β was increased to a significant level.
실험예 2. 짧은 길이의 헤어핀 RNA에 의한 인터페론-β의 발현 확인Experimental Example 2. Confirmation of expression of interferon-β by short-length hairpin RNA
상기 실험예 1에서 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β의 발현을 증가시키는지 확인하였다. 이때 인터페론-β의 발현에 영향을 미치는 RNA 올리고뉴클레오티드 부분의 확인을 위하여 굽힘 구조를 포함하는 더 짧은 길이의 헤어핀 RNA인 5'-OH-Bend-GC-8bp를 이용하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다.In Experimental Example 1, it was confirmed that RNA oligonucleotide having a bending structure increases the expression of interferon-β. At this time, in order to identify the RNA oligonucleotide portion that affects the expression of interferon-β, the same method as in Experimental Example 1 was performed using 5'-OH-Bend-GC-8bp, a shorter hairpin RNA containing a bending structure. Real-time PCR was performed.
단, 이때 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 5'-OH-control을 처리하였고, 양성 대조군은 폴리(I:C)[poly(I:C)]를 처리하였다. 실험군으로 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC의 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였고, 5'-OH-Bend-GC-8bp는 3번 실험을 수행하였다.However, at this time, only the negative control was treated with medium or 5'-OH-control, and the positive control was treated with poly(I:C) [poly(I:C)]. RNA oligonucleotides of 5'-OH-Bend-GC-8bp and 5'-OH-Bend-GC were treated as an experimental group, and 5'-OH-Bend-GC-8bp was tested 3 times.
그 결과, 인터페론-β의 발현 변화를 도 1d에 그래프로 나타내었다.As a result, the expression change of interferon-β is shown graphically in FIG. 1D.
도 1d에 나타난 바와 같이, 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC를 처리한 경우 유의미한 수준으로 인터페론-β의 발현을 증가시켰음을 확인하였다.As shown in FIG. 1D, it was confirmed that the expression of interferon-β was increased to a significant level when 5'-OH-Bend-GC-8bp and 5'-OH-Bend-GC were treated.
실험예 3. 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 ISG56의 발현 확인Experimental Example 3. Confirmation of expression of ISG56 by RNA oligonucleotide of minimum length
상기 실험예 2에서 확인된 5'-OH-Bend-GC-8bp 헤어핀 RNA에서 루프 부분을 제외한 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드로 이루어진 이중나선 RNA인 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum을 이용하여 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.In the 5'-OH-Bend-GC-8bp hairpin RNA identified in Experimental Example 2, 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum, a double-stranded RNA composed of RNA oligonucleotides of the minimum length excluding the loop portion, is used. In order to confirm whether there is an activity to increase the expression of interferon-β, the expression change of ISG56 induced by the expression of interferon-β was confirmed.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-Control을 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.All experiments were performed in the same manner as in Experimental Example 1, and the primers used for PCR were as described in Table 1 above. However, the negative control was treated with only the medium, or 5'-OH-Cont-GC-8bp, which does not have a bending structure, and the 5'-PPP-Control was treated as a positive control. As the experimental group, 5'-OH-Bend-GC-8bp and 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA oligonucleotides were treated.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 1e에 그래프로 나타내었다.As a result, the expression change of ISG56 is shown graphically in FIG. 1E.
도 1e에 나타낸 바와 같이 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열이 상보적으로 결합된 최소 길이의 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum이 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.As shown in Fig. 1e, 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum, a double-stranded RNA oligonucleotide having the minimum length to which the base sequences represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 are complementarily linked, expresses ISG56. It was confirmed that it was increased to a significant level.
실험예 4. 포스포로티오에이트 결합 또는 회귀성 구조로 연결된 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 ISG56의 발현 확인Experimental Example 4. Confirmation of ISG56 expression by RNA oligonucleotides linked by phosphorothioate bonds or regressive structures
본 발명에서 제작된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되거나(5'-OH-Bend-GC-8bp-PS), 나선형 굽힘 구조를 갖는 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드가 회귀성 구조로 연결되어 2개의 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드(5'-OH-16mer-Double-Bend)가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.Among the RNA oligonucleotides having a spiral bending structure produced in the present invention, the phosphodiester bond forming the RNA oligonucleotide is substituted with a phosphorothioate bond (5'-OH-Bend-GC-8bp-PS), Whether the RNA oligonucleotide (5'-OH-16mer-Double-Bend) having two helical bending structures has the activity to increase the expression of interferon-β by ligating the minimum length RNA oligonucleotide having a helical bending structure into a recurrent structure) To confirm, the expression change of ISG56 induced by the expression of interferon-β was confirmed.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 굽힘 구조를 갖지 않은 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.All experiments were performed in the same manner as in Experimental Example 1, and the primers used for PCR were as described in Table 1 above. However, the negative control was treated only with medium, or 5'-OH-Cont-GC-8bp without bending structure was treated, and 5'-OH-Bend-GC-8bp was treated as a positive control. As the experimental group, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS and 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA oligonucleotide were treated.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 1f에 그래프로 나타내었다.As a result, the expression change of ISG56 is shown graphically in FIG. 1F.
도 1f에 나타낸 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 치환하여 세포 내로 주입된 RNA 올리고뉴클레오티드 중 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 대해 저항성을 갖고, 나선형 굽힘 구조를 갖는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.As shown in Fig. 1f, the RNA oligonucleotide-forming bond is substituted with a phosphorothioate bond, and the RNA oligonucleotide injected into the cell is resistant to endonuclease and has a helical bending structure 5' It was confirmed that -OH-Bend-GC-8bp-PS and 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA oligonucleotide increased the expression of ISG56 to a significant level.
실험예 5. 긴 길이의 헤어핀 RNA에 의한 ISG56의 발현 확인Experimental Example 5. Confirmation of ISG56 expression by long-length hairpin RNA
본 발명에서 제작된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, 긴 길이의 헤어핀 RNA 올리고뉴클레오티드(5'-OH-Long_Bend)가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.Among RNA oligonucleotides having a helical bending structure prepared in the present invention, in order to confirm whether a long-length hairpin RNA oligonucleotide (5'-OH-Long_Bend) has an activity to increase interferon-β expression, expression of interferon-β The expression change of ISG56 induced by was confirmed.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-iav를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.All experiments were performed in the same manner as in Experimental Example 1, and the primers used for PCR were as described in Table 1 above. However, only the negative control group was treated with 5'-PPP-iav as the positive control group. As the experimental group, 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide was treated.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 1g에 그래프로 나타내었다.As a result, the expression change of ISG56 is shown graphically in FIG. 1G.
도 1g에 나타난 바와 같이, 나선형 굽힘 구조를 갖는 긴 길이의 헤어핀 RNA인 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 증가시켰음을 확인하였다.As shown in Fig. 1g, it was confirmed that 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide, a long hairpin RNA having a helical bending structure, increased the expression of ISG56.
실험예 6. RNA 올리고뉴클레오티드의 암세포 사멸 유도 효과 확인Experimental Example 6. Confirmation of the effect of RNA oligonucleotide on cancer cell death
실험예 6.1. 세포주의 준비 및 RNA 올리고뉴클레오티드 처리Experimental Example 6.1. Cell line preparation and RNA oligonucleotide treatment
먼저, 24-웰 플레이트의 각 웰에, 0.5x105 개의 Panc02 세포(Prof. Dr. med. Christiane Bruns, Universittsklinikum Magdeburg), SNU886 세포 (Korean Cell Line Bank, Republic of Korea) 또는 정상세포 (HEK293; ATCC, USA) 및 50배 희석시킨 2x 비타민 (Gibco, USA)과 2x NEAA (Non-essential Amino Acid solution; Sigma, USA)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; WELGENE, USA) 배지 300 ㎕를 분주하였다. First, in each well of a 24-well plate, 0.5x10 5 Panc02 cells (Prof. Dr. med. Christiane Bruns, Universittsklinikum Magdeburg), SNU886 cells (Korean Cell Line Bank, Republic of Korea) or normal cells (HEK293; ATCC , USA) and 300 µl of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) medium containing 2x vitamin (Gibco, USA) diluted with 50-fold and 2x Non-essential Amino Acid solution (Sigma, USA) NEAA (WELGENE, USA) was dispensed. .
한편, 1 ㎍/㎖의 RNA 올리고뉴클레오티드(CBS-1, CBS-7 또는 CBS-13-BPS)와 폴리(I:C)[poly(I:C)] (Invivogen, USA)를 각각 40 ㎕의 OPTI-MEM(Gibco, USA)과 섞어주었다. 그리고, 1 ㎕의 리포펙타민 LTX (Invitrogen, USA) 및 0.6 ㎕의 플러스-시약 (Invitrogen, USA)을 혼합하여, 이를 40 ㎕의 OPTI-MEM (Gibco, USA)에 넣고 상온에서 5분간 반응시켰다. 그 후, 준비된 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 폴리(I:C)[poly(I:C)]의 혼합물 40 ㎕와 리포펙타민-플러스시약의 혼합물 40 ㎕을 각각 혼합하고, 20분간 상온에 두어 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 Poly I:C와 리포펙타민이 서로 결합체를 이룰 수 있도록 하였다. Meanwhile, 1 µg/ml of RNA oligonucleotides (CBS-1, CBS-7 or CBS-13-BPS) and poly(I:C)[poly(I:C)] (Invivogen, USA) of 40 µl each It was mixed with OPTI-MEM (Gibco, USA). Then, 1 μl of Lipofectamine LTX (Invitrogen, USA) and 0.6 μl of plus-reagent (Invitrogen, USA) were mixed, and placed in 40 μl of OPTI-MEM (Gibco, USA) and reacted at room temperature for 5 minutes. . Then, 40 µl of the mixture of the prepared RNA oligonucleotide or poly(I:C) [poly(I:C)] and 40 µl of the lipofectamine-plus reagent are mixed, and the RNA oligonucleotide is placed at room temperature for 20 minutes. Alternatively, Poly I:C and lipofectamine were able to form a conjugate with each other.
그 후, 80 ㎕의 RNA 올리고뉴클레오티드-리포펙타민 결합체를 Panc02 세포, SNU886 세포, 또는 HEK293 세포가 들어있는 웰에 투여하였고, 상기 세포를 다시 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이때, 양성대조군으로는 RIG-I 리간드로 알려진 폴리(I:C)[poly(I:C)]를, 음성대조군으로는 배지와 CBS-1만 처리하였다. Thereafter, 80 μl of the RNA oligonucleotide-lipofectamine conjugate was administered to a well containing Panc02 cells, SNU886 cells, or HEK293 cells, and the cells were cultured for 24 hours at 37° C. and 5% CO 2 . Did. At this time, poly(I:C) [poly(I:C)], known as a RIG-I ligand, was treated as a positive control, and only medium and CBS-1 were treated as a negative control.
실험예 6.2. 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 올리고뉴클레오티드의 암세포 사멸 유도 효과 확인 Experimental Example 6.2. Confirmation of the effect of 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS oligonucleotide inducing cancer cell death
실험예 6.1과 같이 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 폴리(I:C)[poly(I:C)]를 처리한 세포주를 0.25%(v/v) 트립신-EDTA (Gibco, USA)를 사용해 5 ㎖ 둥근바닥(round-bottom) 튜브에 회수한 뒤, 1500 rpm의 속도로 40℃에서 5분간 스핀-다운(spin-down)하여 상등액을 제거하였다. 그 후, 세포들을 FITC가 결합된 아넥신(Annexin) V (Biolegend, USA)와 7-아미노액티노마이신 D (7-AAD; BD Bioscience, USA)를 포함한 100 ㎕의 1x 결합 버퍼 (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)에서 암실에서 15분간 염색하였다. 그 후, 염색된 세포들을 LSRFortessa flow cytometry (BD Bioscience, USA)로 측정하였고, FlowJo software (Treestar, USA)를 통해 측정결과를 분석하였다. As in Experimental Example 6.1, a cell line treated with RNA oligonucleotide or poly(I:C) [poly(I:C)] was treated with 0.25% (v/v) trypsin-EDTA (Gibco, USA) and 5 ml round bottom ( After collecting in a round-bottom tube, the supernatant was removed by spin-down at 40°C for 5 minutes at a speed of 1500 rpm. Then, the cells were 100 μl of 1x binding buffer (10 mM HEPES) containing FITC-coupled Annexin V (Biolegend, USA) and 7-aminoactinomycin D (7-AAD; BD Bioscience, USA). , 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2) in the dark for 15 minutes. Thereafter, the stained cells were measured by LSRFortessa flow cytometry (BD Bioscience, USA), and the measurement results were analyzed through FlowJo software (Treestar, USA).
그 결과, 세포사멸에 의해 사멸한 세포의 비율을 도 3에 나타내었다.As a result, the proportion of cells killed by apoptosis is shown in FIG. 3.
도 3에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 하이드록시기를 갖고 굽힘 구조가 있는 CBS-7 올리고뉴클레오티드와 CBS-13-BPS 올리고뉴클레오티드가 유의미한 수준으로 췌장암 세포주와 간암세포주의 사멸을 유도한 반면, 정상세포주의 사멸을 유도하지 않았다.As shown in FIG. 3, CBS-7 oligonucleotides and CBS-13-BPS oligonucleotides having a hydroxy group at the 5′-end and a bending structure induced death of pancreatic cancer cell line and liver cancer cell line at a significant level, whereas they were normal. It did not induce cell line death.
실시예 3. 전세포 조성물에 의한 항암 효과 확인Example 3. Confirmation of anticancer effect by whole cell composition
실시예 3.1. 암세포주 및 마우스 준비Example 3.1. Cancer cell line and mouse preparation
마우스 췌장암 세포인 Panc02 세포(Professor. Christiane Bruns; University Hospital Magdeburg 무상제공)는 10%(v/v) 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, 미국), 2x MEM NEAA (Non-essential Amino Acids, Sigma, 미국) 및 2x MEM Vitamin (Sigma, 미국)가 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle' medium)에 배양하였다. 마우스는 C57BL/6J 마우스를 사용하였다. Mouse pancreatic cancer cells, Panc02 cells (Professor. Christiane Bruns; provided by University Hospital Magdeburg free) are 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA), 2x MEM NEAA (Non-essential Amino Acids) , Sigma, USA) and 2x MEM Vitamin (Sigma, USA) in DMEM (Dulbecco's modified Eagle' medium). C57BL/6J mice were used as the mice.
실시예 3.2. RNA 올리고뉴클레오티드를 이용한 전세포 조성물 제조Example 3.2. Preparation of whole cell composition using RNA oligonucleotide
먼저, RNA 올리고뉴클레오티드 처리에 앞서, Panc02 세포는 5 개의 100 mm 조직배양 플레이트에 각 2x106 개(총 107개)가 되도록 2 ㎖씩 분주하였다. 그 후, 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드는 Panc02 세포에 형질주입 (transfection)에 앞서 95℃에서 5분간 처리하여 변성(denaturation) 시킨 후, 천천히 온도를 낮추어 어닐링(annealing)시켜 준비하였다. RNA 올리고뉴클레오티드의 처리는, 1 ㎍/㎖의 CBS-13-BPS 또는 Poly I:C와 400 ㎕ 리포펙타민 LTX 및 132 ㎕ 플러스-시약을 OPTI-MEM (Gibco, 미국)에 각각 혼합하여 상온에서 5분간 배양하였다 (총 5.5 ㎖). 두 혼합물을 함께 혼합 후, 상온에서 20분간 배양하였다. 그 후, CBS-13-BPS 또는 Poly I:C와 리포펙타민 LTX 및 플러스-시약 혼합물을 플레이트당 1 ㎖씩 떨어뜨려 처리 후, 상기 세포를 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. First, prior to RNA oligonucleotide treatment, Panc02 cells were aliquoted to 5 x 100 mm tissue culture plates, each 2x10 6 (10 7 total). Thereafter, the prepared RNA oligonucleotide was prepared by denaturation by treating the Panc02 cells at 95°C for 5 minutes prior to transfection, and then slowly lowering the temperature to anneal. For RNA oligonucleotide treatment, 1 μg/ml CBS-13-BPS or Poly I:C and 400 μl Lipofectamine LTX and 132 μl plus-reagent were mixed in OPTI-MEM (Gibco, USA), respectively, at room temperature. Incubated for 5 minutes (total 5.5 ml). After mixing the two mixtures together, they were incubated at room temperature for 20 minutes. Thereafter, CBS-13-BPS or Poly I:C and lipofectamine LTX and a plus-reagent mixture were treated by dropping 1 ml per plate, and the cells were kept at 37° C. and 5% CO 2 for 24 hours. Cultured.
24시간 배양 후, CBS-13-BPS 또는 Poly I:C 처리에 의해 세포 사멸 (apoptosis)가 유도된 세포만을 얻어내기 위해, 배지만 얻어내어 그 안의 사멸된 세포의 수를 트리판 블루(trypan blue) 염색을 통해 계산하였다. 얻어진 사멸된 세포는 0.1 ㎖ PBS에 5x105개가 되도록 분주하여 준비하였다.After incubation for 24 hours, in order to obtain only cells in which apoptosis was induced by CBS-13-BPS or Poly I:C treatment, only medium was obtained and the number of killed cells therein was trypan blue. It was calculated through staining. The resulting dead cells were prepared by dispensing 5 x 10 5 cells in 0.1 ml PBS.
실시예 3.3. 전세포 조성물 투여에 따른 암세포 증식 억제 확인Example 3.3. Confirmation of inhibition of cancer cell proliferation according to administration of whole cell composition
실시예 3.2에서 준비된 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 Poly I:C 처리에 의해 유도된 사멸세포를 29 gauge/ 1 ㎖ 주사기를 이용하여 피하주사법 (subcutaneous injection)으로 비 이식부위 (오른쪽 등)에 주입하였다. The RNA oligonucleotide prepared in Example 3.2 or apoptotic cells induced by Poly I:C treatment was injected into a non-implantation site (right, etc.) by subcutaneous injection using a 29 gauge/1 ml syringe.
일주일 후, C57BL/6J 마우스에 새로운 Panc02 세포를 이식하였다. Panc02 세포를 0.1 ㎖ PBS에 5x105개 세포를 분주하여 준비하였다. C57BL/6J 마우스는 암세포 이식 전, 아이소플루레인(isoflurane, 제품명; 테렐액, 경보제약, 한국)을 이용하여 흡입 마취 후, 이식 부위 (왼쪽 등)의 털을 면도하였다. 준비된 암세포는 29 gauge/ 1 ㎖ 주사기를 이용하여 피하주사법 (subcutaneous injection)으로 주입하였다.A week later, C57BL/6J mice were implanted with new Panc02 cells. Panc02 cells were prepared by dispensing 5x10 5 cells in 0.1 ml PBS. C57BL/6J mice were shaved the hair at the site of transplantation (left, etc.) after inhalation anesthesia using isoflurane (trade name, Terrell solution, Kyung-A Pharm, Korea) before cancer cell transplantation. The prepared cancer cells were injected by subcutaneous injection using a 29 gauge/ 1 ml syringe.
전세포 조성물 투여에 따른 암세포 증식을 확인하기 위해 음성대조군은 PBS 주입하였다. 실험군 1에는 CBS-13-BPS를 처리하여 수득한 전세포 조성물을 투여하였고, 실험군 2에는 Poly I:C를 처리하여 수득한 전세포 조성물을 투여하였다. In order to confirm cancer cell proliferation according to administration of the whole cell composition, a negative control group was injected with PBS. In
모든 대조군 및 실험군은 새로운 암세포 이식한 날로부터 7일 후, 종양 관찰 시기를 기점으로 하여 캘리퍼 (caliper)를 이용하여 종양을 크기를 재었다. 종양의 크기는 종양의 장축 (L)과 단축 (W)을 측정하였다. 종양의 부피 (Volume; V)를 계산함으로써 각 군의 암세포의 증식을 비교하였다. 종양의 부피는 다음의 공식으로 계산하였다. V = (L X W2)/2 All control and experimental groups were tumor sized using a caliper starting from the time of
그 결과, 전세포 조성물 투여에 따른 암세포 크기 변화를 도 5에 나타내었다.As a result, cancer cell size changes according to administration of the whole cell composition are shown in FIG. 5.
도 5에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 하이드록시기를 갖고 굽힘 구조가 있는 CBS-13-BPS 올리고뉴클레오티드에 의해 사멸된 암세포를 투여받은 실험군은 새로운 종양의 생성이 억제되었다.As shown in FIG. 5, the experimental group receiving cancer cells killed by CBS-13-BPS oligonucleotide having a bending structure having a hydroxyl group at the 5′-end was inhibited from generating new tumors.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> COMPOSITION FOR ANTICANCER IMMUNE VACCINE USING RNA OLIGONUCLEOTIDE <130> FPD/201901-0026 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 1 nguagann 8 <210> 2 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 2 nnuuugcn 8 <210> 3 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 3 gguagacg 8 <210> 4 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 4 cguuugcc 8 <210> 5 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control RNA oligonucleotide <400> 5 gagcagaaac aaggcuucgg ccuuguuucu gcuc 34 <210> 6 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iav RNA oligonucleotide <400> 6 gaguagaaac aaggcuucgg ccugcuuuug cuc 33 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bend-GC-8bp RNA oligonucleotide <400> 7 gguagacguu cgcguuugcc 20 <210> 8 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bend-GC RNA oligonucleotide <400> 8 gguagacgcg cgcguucgcg cgcgcguuug cc 32 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cont-GC-8bp RNA oligonucleotide <400> 9 ggcagacguu cgcgucugcc 20 <210> 10 <211> 89 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Long_Bend RNA oligonucleotide <400> 10 gguagacgaa accagauaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaauaauuuu uuuuuuuuuu 60 uuuuuuuuuu uuaucugguu ucguuugcc 89 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interferon-beta forward primer <400> 11 ggaggacgcc gcattgac 18 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interferon-beta reverse primer <400> 12 caatagtctc attccagcca gtgc 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 13 gcattgccct caacgaccac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 14 gaggccatgt gggccatgag 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISG56 forward primer <400> 15 gcctccttgg gttcgtctac aa 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISG56 reverse primer <400> 16 tcaaagtcag cagccagtct ca 22 <210> 17 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 17 nguagannnn uuugcn 16 <210> 18 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 18 gguagacgcg uuugcc 16 <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> COMPOSITION FOR ANTICANCER IMMUNE VACCINE USING RNA OLIGONUCLEOTIDE <130> FPD/201901-0026 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 1 nguagann 8 <210> 2 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 2 nnuuugcn 8 <210> 3 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 3 gguagacg 8 <210> 4 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 4 cguuugcc 8 <210> 5 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control RNA oligonucleotide <400> 5 gagcagaaac aaggcuucgg ccuuguuucu gcuc 34 <210> 6 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iav RNA oligonucleotide <400> 6 gaguagaaac aaggcuucgg ccugcuuuug cuc 33 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bend-GC-8bp RNA oligonucleotide <400> 7 gguagacguu cgcguuugcc 20 <210> 8 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bend-GC RNA oligonucleotide <400> 8 gguagacgcg cgcguucgcg cgcgcguuug cc 32 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cont-GC-8bp RNA oligonucleotide <400> 9 ggcagacguu cgcgucugcc 20 <210> 10 <211> 89 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Long_Bend RNA oligonucleotide <400> 10 gguagacgaa accagauaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaauaauuuu uuuuuuuuuu 60 uuuuuuuuuu uuaucugguu ucguuugcc 89 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interferon-beta forward primer <400> 11 ggaggacgcc gcattgac 18 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interferon-beta reverse primer <400> 12 caatagtctc attccagcca gtgc 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 13 gcattgccct caacgaccac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 14 gaggccatgt gggccatgag 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISG56 forward primer <400> 15 gcctccttgg gttcgtctac aa 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISG56 reverse primer <400> 16 tcaaagtcag cagccagtct ca 22 <210> 17 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 17 nguagannnn uuugcn 16 <210> 18 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 18 gguagacgcg uuugcc 16
Claims (10)
i) 서열번호 1(5'-N1GUAGAN2N3-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N4N5UUUGCN6-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드;
ii) 서열번호 1(5'-N1GUAGAN2N3-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N4N5UUUGCN6-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 1로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드;
iii) 서열번호 1(5'-N1GUAGAN2N3-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N4N5UUUGCN6-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 연결된 서열번호 17(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 17로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드;
iv) 서열번호 1(5'-N1GUAGAN2N3-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N4N5UUUGCN6-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 연결된 서열번호 17(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드.An anti-cancer immune vaccine composition comprising a whole cell composition obtained by treating an RNA oligonucleotide having a double helix bending structure on cancer cells as an active ingredient, wherein the RNA oligonucleotide having the double helix bending structure is RNA of i) to iv) below. Anti-cancer immune vaccine composition is any one selected from oligonucleotides:
i) The oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3') and the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') complement each other RNA oligonucleotide having a hydroxyl group (OH) at the 5'-end of the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 by forming a double-strand by binding;
ii) The oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3') and the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') complement each other To form a double strand by binding, the 3'-end of the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 and the 5'-end of the oligonucleotide shown by SEQ ID NO: 2 are connected in a loop to form a hairpin. RNA oligonucleotide having a structure and having a hydroxyl group at the 5'-end of the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1;
iii) Sequence in which the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3') and the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') are linked Two oligonucleotides represented by No. 17 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') complementarily bind to each other to form a double strand, and the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 17 RNA oligonucleotide having a hydroxyl group at the 5'-end of the;
iv) Sequence of the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3') and the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') Two oligonucleotides represented by the number 17 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') complementarily bind to each other to form a double strand, and one of SEQ ID NO: 17 The 3'-end of the oligonucleotide and the 5'-end of the other oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 17 are connected in a loop to have a hairpin structure, and the 5'- of one oligonucleotide shown by SEQ ID NO: 17 RNA oligonucleotide having a hydroxyl group at the terminal.
상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 독립적으로 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, 항암 면역 백신 조성물.According to claim 1,
N 1 to N 6 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is independently G or C, anti-cancer immune vaccine composition.
상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G이고, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, N6는 C인 것을 특징으로 하는, 항암 면역 백신 조성물.According to claim 2,
In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, N 1 is G, N 2 is C, N 3 is G, and in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, N 4 is C, N 5 is G, N 6 is C It characterized in that, anti-cancer immune vaccine composition.
상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지는 것을 특징으로 하는, 항암 면역 백신 조성물.According to claim 1,
Anti-cancer immune vaccine composition, characterized in that the double-strand has a spiral bending structure.
상기 RNA 올리고뉴클레오티드에 존재하는 포스포다이에스테르 결합 중 적어도 하나가 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합 및 메틸포스포네이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 결합으로 변형된 것을 특징으로 하는, 항암 면역 백신 조성물.According to claim 1,
Anticancer immunity, characterized in that at least one of the phosphodiester bonds present in the RNA oligonucleotide is modified with one bond selected from the group consisting of phosphorothioate bonds, boranophosphate bonds and methylphosphonate bonds. Vaccine composition.
상기 나선형 굽힘 구조는, 상기 이중가닥에서 서열번호 1의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)와 서열번호 2의 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)가 각각 워블 염기쌍(wobble base pair)일 때 서열번호 1의 네 번째 염기(A) 및 서열번호 2의 다섯 번째 염기(U)에서 형성되는 것을 특징으로 하는, 항암 면역 백신 조성물.According to claim 1,
In the helical bending structure, in the double strand, the third base (U) and fifth base (G) of SEQ ID NO: 1 and the sixth base (G) and fourth base (U) of SEQ ID NO: 2 are each wobble base pairs ( wobble base pair), anti-cancer immune vaccine composition, characterized in that formed in the fourth base (A) of SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of SEQ ID NO: 2.
상기 루프가 4개 내지 80개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항암 면역 백신 조성물.According to claim 1,
Anti-cancer immune vaccine composition, characterized in that the loop is composed of 4 to 80 bases.
상기 루프가 UUCG로 표시되는 염기서열을 갖는 것인, 항암 면역 백신 조성물.The method of claim 7,
The loop is to have a nucleotide sequence represented by UUCG, anti-cancer immune vaccine composition.
상기 전세포 조성물은 RNA 올리고뉴클레오티드를 암세포에 처리한 후, 수득한 사멸된 암세포, 상기 암세포의 세포용해산물 또는 이의 파생물을 포함하는 것인, 항암 면역 백신 조성물.According to claim 1,
The whole cell composition, after treating the RNA oligonucleotide to cancer cells, comprising the obtained killed cancer cells, cell lysates of the cancer cells or derivatives thereof, anti-cancer immune vaccine composition.
상기 암세포는 췌장암, 간암, 위암, 폐암, 대장암, 직장암, 갑상선암, 식도암, 신장암, 방광암, 전립선압, 자궁경부암, 유방암, 피부암, 상피암, 뇌암, 중추신경암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택되는 암세포인, 항암 면역 백신 조성물.According to claim 1,
The cancer cells are selected from the group consisting of pancreatic cancer, liver cancer, stomach cancer, lung cancer, colon cancer, rectal cancer, thyroid cancer, esophageal cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate pressure, cervical cancer, breast cancer, skin cancer, epithelial cancer, brain cancer, central nerve cancer and ovarian cancer. Cancer cell, anti-cancer immune vaccine composition.
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Non-Patent Citations (2)
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| Jun Yoshida et al., Cancer Sci., 2004, Vol.95, No.11, 858-865. |
| Peter Duewell et al., Cell Death Differ., 2014, Vol.21, No. 12, 1825-1837. |
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