KR20200087505A - Drug Carrier using Black Phosphorus Nanosheet - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a drug delivery system containing a black phosphorus nanosheet, a conjugate of a linker and folic acid, and a target drug absorbed to the linker and a siRNA for a target gene, wherein the target drug can kill cancer cells, can inhibit the expression of oncogenes, irradiates near-infrared rays to increase the temperature of cancer cell tissues, and also can promote the release of the target drug, thereby being able to use all chemotherapy, immunotherapy, and photothermal therapy for cancer treatment.

Description

흑린 나노시트를 사용한 약물 전달체{Drug Carrier using Black Phosphorus Nanosheet}Drug Carrier using Black Phosphorus Nanosheet

본 발명은 흑린 나노시트, 링커와 엽산의 컨쥬게이트 및 상기 링커에 흡착된 목적 약물과 표적 유전자용 siRNA를 포함하는 약물 전달체에 관한 것이다.The present invention relates to a drug delivery system comprising a blacklin nanosheet, a conjugate of a linker and folic acid, a target drug adsorbed to the linker, and a siRNA for a target gene.

현대의학의 암 치료법은 크게 외과적 수술, 항암제 투여 및 방사선 치료로 나눌 수 있다. 종양 조직 주위를 광범위하게 절재해 내고, 혹시 모를 전이된 암세포를 죽이기 위해 항암제 투여 및 방사선 치료를 병행한다. 사용되는 항암제는 크게 세포독성 항암제, 표적치료 항암제 및 면역항암제로 나눌 수 있으며, 각각 1세대, 2세대 및 3세대 항암제로 불리운다.Modern medicine's cancer treatment methods can be largely divided into surgical surgery, chemotherapy, and radiation therapy. Anti-cancer drugs and radiotherapy are combined to excite the tumor tissue extensively and kill any cancer cells that have spread. Anti-cancer agents used can be largely divided into cytotoxic anti-cancer agents, targeted therapy anti-cancer agents, and immuno-cancer agents, and are called first-generation, second-generation, and third-generation anti-cancer agents, respectively.

세포 독성 항암제는 정상 세포, 암세포를 구분하지 않고 증식을 시도하는 세포를 골라 파괴하므로 모근 및 골수 손상 등의 부작용이 심각한 단점이 있다. 표적치료 항암제는 암세포에만 존재하는 표적을 포착해서 공격하는 항암제이나, 모든 암세포에 표적이 존재하는 것이 아니고, 암세포의 표적에 친화성을 나타내는 물질의 개발이 어려워 널리 사용되지 못하고 있다. 면역항암제는 암환자의 면역 체를 활성화시켜 면역세포가 암세포를 공격하도록 유도하는 항암제로 기존 항암제보다 부작용 빈도가 낮고, 치료 반응을 보이는 환자에서 반응 시간이 오래 간다는 장점이 있다. 그러나 최근 간염, 폐렴, 설사 등의 부작용이 있고, 치료 비용이 고가인 단점이 있다.Cytotoxic anticancer drugs have serious disadvantages such as damage to the hair follicles and bone marrow, as normal cells and cancer cells are selected and destroyed. Targeted therapeutic anticancer agents are anticancer agents that capture and attack targets present only in cancer cells, but not all cancer cells have targets, and it is difficult to develop a substance that exhibits affinity for the targets of cancer cells, and thus has not been widely used. Immune anti-cancer drugs are anti-cancer drugs that activate immune cells in cancer patients and induce immune cells to attack cancer cells. They have the advantage of lower reaction frequency than conventional anti-cancer drugs and longer response time in patients with treatment response. However, there are side effects such as hepatitis, pneumonia, and diarrhea in recent years, and there are disadvantages of high cost of treatment.

최근에는 빛을 이용해 암세포만 선택적으로 파괴하는 광역학 치료법과 같이 다양한 암 치료법이 개발되고 있다. 그러나 암세포의 전이 가능성 및 치료 과정 중의 부작용으로 인하여 암은 여전히 공포스러운 질병으로 인식되고 있으므로 효과적인 암 치료법은 지속적으로 개발되어야 한다.Recently, various cancer treatments have been developed, such as photodynamic therapy that selectively destroys cancer cells using light. However, due to the possibility of cancer cell metastasis and side effects during the treatment process, cancer is still recognized as a fearful disease, and therefore effective cancer treatment methods must be continuously developed.

1. Adv Mater. 2017 Jan;29(1) 1. Adv Mater. 2017 Jan;29(1)

본 발명의 목적은 흑린 나노시트에 목적 약물과 표적 유전자용 siRNA가 결합되어 있어 암치료 방법 중 화학 요법, 면역 요법 및 광열 요법에 동시에 이용될 수 있는 약물 전달체를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a drug delivery system that can be used simultaneously in chemotherapy, immunotherapy and photothermal therapy among cancer treatment methods because the target drug and siRNA for target gene are combined with the blacklin nanosheet.

본 발명의 다른 목적은 상기 약물 전달체를 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계; 및 상기 개체에 근적외선을 조사하는 단계를 포함하는 목적 약물의 전달 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to administer the drug delivery system to an individual in need of treatment; And it is to provide a method of delivering a target drug comprising the step of irradiating near-infrared to the subject.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 양상은One aspect of the present invention to achieve the above object

흑린 나노시트(black phosphorus nanosheet); Black phosphorus nanosheets;

링커와 엽산의 컨쥬게이트(conjugate); 및A linker and a folic acid conjugate; And

링커에 흡착된 목적 약물과 표적 유전자용 siRNA를 포함하는 약물 전달체로서,A drug delivery system comprising a target drug adsorbed on a linker and a siRNA for a target gene,

상기 링커는 흑린 나노시트의 표면에 결합하고, 정전기적 상호작용 (electrostatic interaction)에 의해 목적 약물과 표적 유전자용 siRNA를 흡착시키는 것인, 약물 전달체를 제공한다.The linker provides a drug delivery system that binds to the surface of a blacklin nanosheet and adsorbs a target drug and siRNA for a target gene by electrostatic interaction.

본 명세서에 사용된 용어, "흑린(black phosphorus)"은 인 원소로 구성된 2차원 물질로 인에 고온과 고압을 가하면 만들어지며, 겉보기에 검정색을 나타낸다. 그래핀처럼 2차원 층 구조를 이루고 있으며, 흑린을 원자 한 개 층 두께로 떼어내면 머리카락 굵기의 10만분의 1 수준인 포스포린(phosphorene)이 된다. 흑린은 육각벌집의 구조로 그래핀과 유사한 원자 배열을 갖지만, 규칙적인 주름이 잡혀 있어 외부 압력이나 전기장 등을 이용한 물성 제어가 쉬운 특성이 있다. 또한, 생체적합성 및 생분해성이 우수하고, 제조가 용이하며, 높은 광열 변환 효율을 가지고 있다.As used herein, the term “black phosphorus” is a two-dimensional material composed of phosphorus elements, which is made by applying high temperature and high pressure to phosphorus, and apparently shows black. It has a two-dimensional layer structure like graphene, and when black phosphorus is separated by a layer thickness of one atom, it becomes phosphorene, which is one-tenth of the thickness of hair. Heukrin has a hexagonal honeycomb structure that has an atomic arrangement similar to that of graphene, but has regular pleats, so it is easy to control physical properties using external pressure or electric fields. In addition, it is excellent in biocompatibility and biodegradability, easy to manufacture, and has high photothermal conversion efficiency.

본 명세서에 사용된 용어, "흑린 나노시트(black phosphorus nanosheet)"는 흑린이 나노미터 단위로 층을 형성한 것을 말하며, 흑린 나노시트는 이전에 비유기성 나노입자(inorganic nanoparticle, INP)나 그래핀(graphene)으로 시도한 연구와 같이 나노플랫폼의 광학 특성을 재확인하는 것에 불과한 화학-광치료법 분야에 주로 사용되어 왔다. 이러한 응용 방법은 종양을 효율적으로 제거하지 못하고, 종양의 재발 또는 전이 가능성을 남기게 되므로 흑린 나노시트의 응용 방법에 대한 추가 연구가 필요하다.As used herein, the term "black phosphorus nanosheet" refers to a black phosphor layer formed in nanometers, and the black phosphor nanosheet has previously been used as an organic nanoparticle (INP) or graphene. It has been used mainly in the field of chemo-phototherapy, which is merely reaffirming the optical properties of nanoplatforms, such as studies attempted with (graphene). Since such an application method does not efficiently remove the tumor and leaves a possibility of tumor recurrence or metastasis, further research on the application method of the blacklin nanosheet is required.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 약물 전달체는 크기가 10 내지 150 ㎚이고, 다분산지수는 0.05 내지 0.6일 수 있으며, 바람직하게는 크기는 20 내지 100 ㎚이고, 다분산지수는 0.1 내지 0.5일 수 있고, 가장 바람직하게는 크기는 30 내지 80 ㎚이고, 다분산지수는 0.1 내지 0.4일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the drug delivery system has a size of 10 to 150 nm, a polydispersity index may be 0.05 to 0.6, preferably a size of 20 to 100 nm, and a polydispersity index of 0.1 to 0.5 days. May be, most preferably, the size is 30 to 80 nm, the polydispersity index may be 0.1 to 0.4.

다분산지수(polydispersity index, PDI)는 입자의 크기 분포를 의미하며, 다분산지수가 1이면 입자의 크기가 단분산(monodisperse)하고, 1보다 크면 입자의 크기가 다분산(polydisperse)하다.The polydispersity index (PDI) refers to the particle size distribution. If the polydispersity index is 1, the particle size is monodisperse, and if it is greater than 1, the particle size is polydisperse.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 컨쥬게이트는 흑린 나노시트의 무게 대비 1 내지 20% (w/w)로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 10% (w/w)로 포함될 수 있다. 또한, 상기 컨쥬게이트는 링커로 인하여 전체적으로 양전하로 하전될 수 있으며, 이로 인해 다른 분자의 음전하로 하전된 분자단과 정전기적 상호작용이 발생하여 목적 약물과 표적 유전자용 siRNA를 흡착시킬 수 있다.In one embodiment of the present invention, the conjugate may be included in 1 to 20% (w/w) of the weight of the black phosphorus nanosheet, preferably 1 to 10% (w/w). In addition, the conjugate may be positively charged as a whole due to the linker, thereby electrostatically interacting with the negatively charged molecular group of other molecules to adsorb the target drug and siRNA for the target gene.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 링커(linker)는 정전기적 상호 작용을 나타낼 수 있는 물질이면 제한없이 사용될 수 있고, 예를 들어 키토산-폴리에틸렌 글리콜(chitosan-polyethylene glycol), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 피브리노겐 (fibrinogen), 실크 피브로인(silk fibroin), 카세인(casein), 엘라스틴(elastin), 라미닌(laminin) 및 피브로넥틴 (fibronectin)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 링커는 키토산-폴리에틸렌 글리콜이 사용될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the linker may be used without limitation as long as it is a substance capable of exhibiting electrostatic interaction, for example, chitosan-polyethylene glycol, gelatin, collagen (collagen), fibrinogen, silk fibroin, casein, elastin, laminin, and fibronectin. Preferably, the linker may be chitosan-polyethylene glycol.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 키토산-폴리에틸렌 글리콜은 정전기적 상호 작용에 의하여 흑린 표면에 부착하며, 구체적으로 음전하를 나타내는 흑린 표면에 양전하를 갖는 키토산이 정전기적 인력으로 부착한 후, 다시 음전하를 갖는 폴리에틸렌 글리콜이 키토산과 정전기적 인력으로 결합한다.In one embodiment of the present invention, the chitosan-polyethylene glycol is attached to the surface of the black line by electrostatic interaction, and specifically, after the chitosan having a positive charge is attached to the surface of the black line showing a negative charge by electrostatic attraction, again the negative charge is The polyethylene glycol possessed combines chitosan with electrostatic attraction.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 키토산-폴리에틸렌 글리콜은 키토산과 폴리에틸렌 글리콜이 각각 10%(키토산 10% 및 폴리에틸렌 글리콜 90%; 또는 키토산 90% 및 폴리에틸렌 글리콜 10%) 내지 90%의 비율로 결합된 것일 수 있으며, 바람직하게는 1:1의 비율로 결합된 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the chitosan-polyethylene glycol is a chitosan and polyethylene glycol are combined at a ratio of 10% (chitosan 10% and polyethylene glycol 90%; or chitosan 90% and polyethylene glycol 10%) to 90%, respectively. It may be, it may be preferably combined in a ratio of 1:1.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 링커와 엽산을 컨쥬게이션하는 방법은 정전기적 상호작용에 의해 컨쥬게이션하거나, 또는 당업계에 알려진 통상적인 방법을 사용할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method of conjugating the linker and folic acid may be performed by electrostatic interaction, or a conventional method known in the art.

본 발명에서, 컨쥬게이트에 포함된 엽산은 암세포 표적 용도로 사용되었으며, 상기 약물 전달체는 종양세포에 많이 발현되어 있는 엽산 수용체를 통해 종양 조직에 선택적으로 축적될 수 있다.In the present invention, folic acid contained in the conjugate was used for cancer cell targeting, and the drug delivery agent may selectively accumulate in tumor tissue through a folic acid receptor that is highly expressed in tumor cells.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 약물은 흑린 나노시트와 1:0.2 내지 1:10의 질량비(mass ratio)로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1:1 내지 1:5의 질량비로 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 목적 약물에는 항암제가 있으며, 항암제는 독소루비신(doxorubisin), 파클리탁셀(paclitaxel), 아지트로마이신 (azithromycin), 에리트로마이신(erythromycin), 빈블라스틴(vinblastin), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 아이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantron), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 항암제는 독소루비신이 사용될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the target drug may be included in a mass ratio of 1:0.2 to 1:10 with blacklin nanosheets, and preferably in a mass ratio of 1:1 to 1:5. . Targeted drugs that can be used include anti-cancer agents, and anti-cancer agents include doxorubisin, paclitaxel, azithromycin, erythromycin, vinblastin, bleomycin, and dactino. Can be selected from the group consisting of dactinomycin, daunorubicin, idarubicin, mitoxantron, plicamycin, mitomycin, and combinations thereof. . Preferably, the anticancer agent may be used doxorubicin.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 표적 유전자로는 종양 유전자(oncogene)가 사용될 수 있으며, 표적 유전자는 유전자는 p53, 감마-시스(γ-sis), 표피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR), 섬유아세포 성장 인자 (fibroblast growth factor, FGF), 각질세포 성장 인자 (keratinocyte growth factor, KGF), erbB2/neu, ros, met, abl, src, yes, fyn, fgr, lyn, lck, hck, blk, csk, fps, fes, mas, gsp, gip, H-ras, K-ras, N-ras, mos, raf, A-raf1, B-raf, myc, jun, bcl, tls/fus 및 tel로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 표적 유전자로 프로그램된 세포사멸 리간드 1(programmed death ligand 1, PDL1)이 사용될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the target gene may be a tumor gene (oncogene), the target gene is p53, gamma-cis (γ-sis), epidermal growth factor receptor (epidermal growth factor receptor, EGFR) ), fibroblast growth factor (FGF), keratinocyte growth factor (KGF), erbB2/neu, ros, met, abl, src, yes, fyn, fgr, lyn, lck, hck, blk, csk, fps, fes, mas, gsp, gip, H-ras, K-ras, N-ras, mos, raf, A-raf1, B-raf, myc, jun, bcl, tls/fus and tel It can be selected from the group consisting. Preferably, a programmed death ligand 1 (PDL1) may be used as a target gene.

본 발명자들은 흑린 나노시트를 효율적인 약물 전달체로 활용하기 위하여, 흑린 나노시트를 링커와 엽산의 컨쥬게이트와 결합시키고, 추가로 목적 약물과 표적 유전자용 siRNA를 흡착시킴으로써 암치료법 중 화학요법, 면역요법 및 광열요법 모두에 활용될 수 있는 약물 전달체를 완성하였다.In order to utilize the blacklin nanosheet as an efficient drug delivery system, the present inventors combined the blacklin nanosheet with a linker and a folic acid conjugate, and additionally adsorbed the target drug and siRNA for a target gene, thereby chemotherapy, immunotherapy and cancer therapy. A drug delivery system that can be used for both photothermal therapy has been completed.

본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 목적 약물의 전달 방법을 제공한다:Another object of the present invention is to provide a method for delivering a target drug comprising the following steps:

⒜ 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 약물 전달체를 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계; 및단계 administering the drug delivery system of any one of claims 1 to 11 to an individual in need of treatment; And

⒝ 상기 치료가 필요한 개체에 근적외선을 조사하는 단계.근 Irradiating near-infrared rays to the individual in need of the treatment.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 약물 전달체는 항암제로 사용되는 독소루비신을 포함하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the drug delivery system may include doxorubicin used as an anticancer agent.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 약물 전달체는 내부에 포함된 약물을 서서히 방출시키나, 근적외선을 조사하는 경우 약물 방출 속도가 증가하므로 근적외선 조사에 의하여 약물을 효과적으로 전달할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the drug delivery system slowly releases the drug contained therein, but the drug release rate increases when irradiated with near-infrared rays, so that the drug can be effectively delivered by near-infrared irradiation.

본 발명의 약물 전달체를 사용하면, 약물 전달체에 포함된 목적 약물로 암세포를 사멸시킬 수 있고, 종양 유전자의 발현을 억제할 수 있으며, 근적외선을 조사하여 암조직의 온도를 상승시키고, 표적 약물의 방출을 촉진시킬 수 있으므로 암치료에 화학요법, 면역요법 및 광열요법을 모두 이용할 수 있다.When the drug delivery system of the present invention is used, the target drug contained in the drug delivery system can kill cancer cells, suppress the expression of tumor genes, and irradiate near infrared rays to increase the temperature of cancer tissue and release the target drug. Because it can promote the cancer treatment, chemotherapy, immunotherapy and photothermal therapy can all be used.

도 1에서 A는 흑린 나노시트(BP)에 다른 농도의 cF를 로딩한 후 입자 크기(partie size) 및 제타 전위(zeta potential)를 측정한 결과이고, B는 다분산지수(polydispersity index, PDI)를 확인한 결과이다.
도 2는 흑린 나노시트(BP)에 다른 농도의 D를 로딩한 후 흑린 용액의 색상 변화(A), 자외선-적외선(UV-vis) 스펙트럼 변화(B) 및 로딩 용량(C)을 확인한 결과이다.
도 3에서 A와 B는 흑린 나노시트(BP)에 독소루비신(BP-D); 또는 독소루비신, 키토산-폴리에틸렌 글리콜 및 엽산(BP-DcF)을 로딩한 후 자외선-적외선 스펙트럼 변화(A) 및 로딩 용량(B)을 측정한 결과이고, C는 흑린 나노시트(BP)에 독소루비신(BP-D); 독소루비신, 키토산-폴리에틸렌 글리콜 및 엽산(BP-DcF); 또는 독소루비신, 키토산-폴리에틸렌 글리콜, 엽산 및 PL의 siRNA(BP-DcF@sPL)를 로딩한 후 입자 크기와 제타 전위를 측정한 결과이며, D는 BP-DcF와 sPL의 결합 비율을 확인한 결과이다.
도 4에서 A 및 B는 BP-DcF@sPL의 투과전자현미경 이미지(A), 유체역학적 크기 분포 그래프(B)이고, C는 흑린 나노시트(BP)의 원자간력 현미경 이미지(상단)과 주사 터널링 현미경 이미지(하단)이다.
도 5는 흑린 나노시트(BP)에 DcF@sPL이 로딩되는지 여부를 각각 푸리에 변환 적외선 분광기(A), X-선 회절 분석기(B) 및 에너지-분산형 X-선 분광(C)으로 확인한 결과이다.
도 6에서 A는 다른 농도의 BP-DcF@sPL에 근적외선을 조사한 후 온도를 측정한 결과이고, B는 흑린 나노시트(BP), BP-DcF 및 BP-DcF@sPL에 근적외선을 조사한 후 온도를 측정한 결과이며, C는 상이한 배지 조건에서 BP-DcF@sPL의 독소루비신(D) 방출 정도를 확인한 결과이다.
도 7은 BP-DcF@sPL를 마우스 혈청과 반응시킨 후 로딩된 독소루비신의 안정성을 확인한 결과이다.
도 8은 HCT116, HT29 및 MC-38 세포에 BP-cF, D 및 BP-DcF@sPL을 처리한 후 근적외선 조사 또는 비조사 조건에서 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 9는 엽산(F)을 전처리하거나 또는 전처리하지 않은 조건으로 HCT116, HT29 및 MC-38 세포에 BP-DcF@sPL를 처리한 후 세포내 흡수 정도를 형광 이미지(A) 및 유세포 분석기(B)로 확인한 결과이다.
도 10은 근적외선 조사 또는 비조사 조건, 및 엽산 전처리 조건으로 MC-38 세포에 BP-cF, D 및 BP-DcF@sPL을 처리한 후 세포사멸 수준을 유세포 분석기(A), 라이브(녹색 형광)/데드(적색 형광) 분석(B) 및 아넥신V/PI 이중 염색 분석(C)으로 확인한 결과이다.
도 11은 HCT116, HT29 및 MC-38 세포에 sPL, BP-DcF, BP-DcF+sPL 및 BP-DcF@sPL을 처리한 후 PL의 발현 억제 여부를 웨스턴 블롯(A)과 유세포 분석기(B)로 확인한 결과이다.
도 12에서 A는 종양-침윤성 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)와 MC-38 세포 사이에서 BP-DcF@sPL의 경쟁적 세포 흡수를 측정하기 위한 실험 모식도이고, B 내지 E는 각각 MC-38 세포, CD8+ T 세포, 수지상 세포 및 RAW264.7 세포에서 BP-DcF@s 및 BP-Dc@s의 흡수 정도를 측정한 결과이다.
도 13은 흑린 나노시트(BP)와 BP-DcF@sPL을 마우스 전혈과 반응시킨 후 적혈구의 용혈(hemolysis) 여부를 확인한 결과이다.
도 14에서 A 및 B는 MC-38 종양-보유 마우스에 BP-DcF@s 또는 BP-DcF@s를 주사한 후 근적외선 조사 또는 비조사 조건에서 형광 수준을 확인한 결과이고, C 및 D는 마우스의 각 장기에서 형광 수준을 확인한 결과이며, E는 MC-38 종양-보유 마우스에 D 단독 또는 BP-DcF@sPL을 주사한 후 조직에서 D의 축적 여부를 확인한 결과이다.
도 15에서 A는 MC-38 종양-보유 마우스에 BP-DcF@s 또는 BP-Dc@s를 주사한 후 근적외선을 조사하여 종양 조직의 온도 변화를 확인한 결과이고, B는 종양 조직의 온도 변화를 그래프로 표시한 결과이다.
도 16은 MC-38 종양 보유 마우스에 BP-DcF, BP-DcF@sPL 또는 BP-DcF+aPL을 주사한 후 근적외선 조사 또는 비조사 조건에서 CD11c+ CD86+ 성숙 수지상세포의 비율(A), CD8+ CD69+ T 세포 비율(B) 및 TNF-α의 종양내 농도(C)를 측정한 결과이다.
도 17은 MC-38 종양 보유 마우스에 BP-DcF, BP-DcF@sPL 또는 BP-DcF+aPL을 주사한 후 근적외선 조사 또는 비조사 조건에서 생체내 활성산소 생성 여부를 측정한 결과를 나타낸다.
도 18은 CD8+ T 세포에서 BP-DcF@sPL의 유전자 침묵 효과(A) 및 인터페론-감마의(IFN-γ) 발현 수준(B)을 를 확인한 결과이다.
도 19는 MC-38 세포에 BP-DcF, BP-DcF@sPL 또는 BP-DcF+aPL을 처리한 후 근적외선 조사 또는 비조사 조건에서 사멸세포의 비율을 확인한 결과이다.
도 20은 MC-38 종양이 이식(xenograft)된 C57BL/6 마우스에 BP-DcF, BP-DcF@sPL 또는 BP-DcF+aPL을 투여한 후 근적외선 조사 또는 비조사 조건에서 종양 크기(A 및 D), 몸무게(B) 및 생존 비율(C)을 확인한 결과이다.
도 21은 MC-38 종양이 이식된 C57BL/6 마우스에 BP-DcF, BP-DcF@sPL 또는 BP-DcF+aPL을 투여하고, 근적외선을 조사 또는 비조사한 후 종양 조직을 분리하여 염색한 결과이다.
도 22는 MC-38 종양이 이식된 C57BL/6 마우스에 BP-DcF, BP-DcF@sPL 또는 BP-DcF+aPL을 투여하고, 근적외선을 조사 또는 비조사한 후 각 장기를 분리하여 헤마토자일린&에오신으로 염색한 결과이다.
도 23은 HCT116 종양-보유 Balb/c 누드 마우스에 BP-DcF, BP-DcF@sPL 또는 BP-DcF+aPL을 투여한 후 근적외선 조사 또는 비조사 조건에서 종양 크기(A), 몸무게(B) 및 생존 비율(C)을 확인한 결과이다.In Figure 1, A is the result of measuring the particle size (partie size) and zeta potential (zeta potential) after loading cF of different concentrations on the black phosphorus nanosheet (BP), and B is the polydispersity index (PDI). It is the result of checking.
2 is a result of checking the color change (A), ultraviolet-infrared (UV-vis) spectral change (B) and loading capacity (C) of the blackline solution after loading D of different concentrations in the blackline nanosheet (BP). .
In Figure 3, A and B are doxorubicin (BP-D) on black phosphorus nanosheets (BP); Alternatively, after loading doxorubicin, chitosan-polyethylene glycol and folic acid (BP-DcF), ultraviolet-infrared spectral change (A) and loading capacity (B) were measured, and C is doxorubicin (BP) on blacklin nanosheet (BP). -D); Doxorubicin, chitosan-polyethylene glycol and folic acid (BP-DcF); Or after loading the siRNA (BP-DcF@sPL) of doxorubicin, chitosan-polyethylene glycol, folic acid, and PL, the particle size and zeta potential are measured, and D is the result of confirming the binding ratio of BP-DcF and sPL.
In FIG. 4, A and B are transmission electron microscope images (A) of BP-DcF@sPL, a graph of hydrodynamic size distribution (B), and C is an atomic force microscope image (top) and scanning of a black phosphorus nanosheet (BP). This is a tunneling microscope image (bottom).
5 is a result of confirming whether or not DcF@sPL is loaded on the blacklin nanosheet (BP) by Fourier transform infrared spectroscopy (A), X-ray diffraction analyzer (B) and energy-dispersive X-ray spectroscopy (C), respectively. to be.
In FIG. 6, A is a result of measuring the temperature after irradiating near infrared rays to BP-DcF@sPL at different concentrations, and B is the temperature after irradiating near infrared rays to black phosphorus nanosheets (BP), BP-DcF and BP-DcF@sPL. As a result of the measurement, C is a result confirming the degree of release of doxorubicin (D) of BP-DcF@sPL under different medium conditions.
7 is a result confirming the stability of the loaded doxorubicin after reacting BP-DcF@sPL with mouse serum.
8 is a result of measuring the cell viability under the conditions of near-infrared irradiation or non-irradiation after treating BP-cF, D and BP-DcF@sPL on HCT116, HT29 and MC-38 cells.
Figure 9 is treated with BP-DcF@sPL on HCT116, HT29, and MC-38 cells with or without pre-treatment of folic acid (F), resulting in fluorescence image (A) and flow cytometer (B). It is the result confirmed by.
FIG. 10 shows apoptosis levels after treatment with BP-cF, D and BP-DcF@sPL on MC-38 cells under near-infrared irradiation or non-irradiation conditions, and folic acid pretreatment conditions, flow cytometry (A), live (green fluorescence). /Dead (red fluorescence) analysis (B) and Annexin V/PI double staining analysis (C).
FIG. 11 shows the treatment of sPL, BP-DcF, BP-DcF+sPL, and BP-DcF@sPL on HCT116, HT29 and MC-38 cells, and whether the expression of PL is inhibited by Western blot (A) and flow cytometer (B) It is the result confirmed by.
12A is an experimental schematic for measuring competitive cell uptake of BP-DcF@sPL between tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) and MC-38 cells, and B to E are MC-38 cells, respectively. , CD8 + T cells, dendritic cells and RAW264.7 cells are the results of measuring the degree of absorption of BP-DcF@s and BP-Dc@s.
13 is a result of confirming whether hemolysis of red blood cells (hemolysis) after reacting black phosphorus nanosheets (BP) and BP-DcF@sPL with mouse whole blood.
In Figure 14, A and B are the results of confirming the fluorescence level in the near-infrared or non-irradiated conditions after injecting BP-DcF@s or BP-DcF@s into MC-38 tumor-bearing mice, and C and D are mouse It is the result of confirming the fluorescence level in each organ, and E is the result of confirming the accumulation of D in tissue after injection of D alone or BP-DcF@sPL into MC-38 tumor-bearing mice.
In FIG. 15, A is a result of confirming a temperature change of tumor tissue by irradiating near infrared rays after injecting BP-DcF@s or BP-Dc@s into MC-38 tumor-bearing mice, and B is a temperature change of tumor tissue. This is the result of the graph.
Fig. 16 shows the ratio of CD11c + CD86 + mature dendritic cells (A), CD8 in the near-infrared irradiation or non-irradiated conditions after injection of BP-DcF, BP-DcF@sPL or BP-DcF+aPL into MC-38 tumor bearing mice. + CD69 + T cell ratio (B) and TNF-α intratumoral concentration (C).
Figure 17 shows the results of measuring whether or not to generate free radicals in vivo under near-infrared irradiation or non-irradiated conditions after injection of BP-DcF, BP-DcF@sPL or BP-DcF+aPL into MC-38 tumor bearing mice.
18 is a result confirming the gene silencing effect (A) and the expression level (B) of interferon-gamma (IFN-γ) of BP-DcF@sPL in CD8 + T cells.
FIG. 19 shows the results of confirming the ratio of apoptotic cells under conditions of near-infrared irradiation or non-irradiation after treating BP-DcF, BP-DcF@sPL or BP-DcF+aPL on MC-38 cells.
FIG. 20 shows tumor size (A and D) in the near-infrared irradiation or non-irradiated conditions after administration of BP-DcF, BP-DcF@sPL or BP-DcF+aPL to C57BL/6 mice transplanted with MC-38 tumors (xenograft). ), weight (B) and survival rate (C).
21 is a result of administering BP-DcF, BP-DcF@sPL or BP-DcF+aPL to C57BL/6 mice transplanted with MC-38 tumor, and irradiating or non-irradiating near infrared rays to separate and stain the tumor tissue. .
Figure 22 is a C57BL/6 mouse transplanted with MC-38 tumor, BP-DcF, BP-DcF@sPL or BP-DcF+aPL is administered, and each organ is separated after irradiated or non-irradiated near-infrared radiation, and hematoxyllin This is the result of dyeing with &eosin.
FIG. 23 shows tumor size (A), weight (B), and tumors in the near-infrared or non-irradiated conditions after administration of BP-DcF, BP-DcF@sPL or BP-DcF+aPL to HCT116 tumor-bearing Balb/c nude mice. It is the result of confirming the survival rate (C).

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, one or more specific examples will be described in more detail through examples. However, these examples are intended to illustrate one or more embodiments by way of example, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실험 방법Experimental method

1. One. 흑린Black Lin 나노시트Nano sheet (black phosphorus (black phosphorus nanosheetnanosheet ) 제작) Production

흑린의 분해를 방지하기 위하여 코오스 흑린 플레이크(coarse black phosphorus flakes)는 분자 생물학 등급의 물(HyCloneTM, GE Healthcare Life Sciences, USA)에 분산시켰다. 상기 용액을 500 ㎖ 부피의 저장부 및 60 ㎖ 부피의 프로브 소니케이션 반응기(probe sonication reactor)에 채웠다. 이후 프로브 소니케이터(probe sonicator; 150W, Sonics&Materials, USA)를 사용하여 코오스 흑린 플레이크의 나노화(nanorization)를 연속적으로 수행하였다. 구체적으로, 아르곤 가스를 주입(60 ㎖/분)하면서 연막 펌프(323Du/MC4, Watson-Marlow Bredel Pump, USA)를 사용하여 저장부 내에 분산(0.5 ㎎/㎖)된 코오스 흑린 나노플레이크를 소니케이션 반응기 내부로 공급(1 ㎖/분)하였다. 분산된 흑린 플레이크를 소니케이션 반응기에서 초음파로 분쇄하고(분산된 흑린의 체류 시간: 1시간), 분쇄된 흑린을 함유하는 버스트 물방울은 분산액의 자유 표면에 부유시켰다. 초음파 버블 붕괴에 의한 중력과 부력 사이의 힘의 불균형으로 인해, 특정 크기의 물방울은 부유시키고, 물방울의 응집을 억제하기 위하여 양이온화된 아르곤 가스와 함께 흘려 보냈다. 이후 상기 물방울을 확산 건조기(실리카젤로 충진된 속이 빈 튜브)에 통과시켜 건조하였다. 건조된 흑린 나노시트(nanosheet)는 음성 전기장(-2 kV/㎝)을 갖는 두랄루민 로드(duralumin rod)를 사용하여 정전기적으로 수집하였다.Coarse black phosphorus flakes were dispersed in molecular biology grade water (HyClone ™ , GE Healthcare Life Sciences, USA) to prevent degradation of black phosphorus. The solution was charged into a 500 ml volume reservoir and a 60 ml volume probe sonication reactor. After that, the nanoparticles of the coarse blackline flakes were continuously performed using a probe sonicator (150 W, Sonics & Materials, USA). Specifically, while injecting argon gas (60 mL/min), using a smoke pump (323Du/MC4, Watson-Marlow Bredel Pump, USA), sonication of coarse blackline nanoflakes dispersed (0.5 mg/mL) in a storage section It was fed into the reactor (1 ml/min). The dispersed black phosphorus flakes were crushed ultrasonically in a sonication reactor (retention time of the dispersed black phosphorus: 1 hour), and burst droplets containing the pulverized phosphorus were suspended on the free surface of the dispersion. Due to the imbalance of force between gravity and buoyancy caused by ultrasonic bubble collapse, water droplets of a certain size floated and flowed together with cationized argon gas to suppress the aggregation of water droplets. Then, the droplets were dried by passing through a diffusion dryer (a hollow tube filled with silica gel). The dried blacklin nanosheet was electrostatically collected using a duralumin rod having a negative electric field (-2 kV/cm).

2. BP-DcF@sPL 나노플랫폼 제작2. BP-DcF@sPL nanoplatform production

상기 1에서 제작한 흑린 나노시트(이하, BP로 기재함) 10 ㎎을 탈산소화된 물 10 ㎖에 재분산시켰다. 키토산-폴리에틸렌 글리콜(chitosan-polyethylene glycol; 이하 c로 기재함) 및 엽산(folic acid; 이하, F로 기재함)의 혼합 용액(c와 F의 비율은 일대일;이하, cF로 기재함) 10%(BP의 w/w 기준)와 독소루비신(doxorubicin; 이하, D로 기재함, BP와 D의 질량비=1.0:5.0)을 혼합하여 DcF 용액을 제조하였다. 얼음 위에서 30분 동안 울트라소니케이션을 하면서, 상기 BP 분산 용액에 DcF 용액을 첨가하였다. BP-DcF 복합체 형성을 유도하기 위하여 3시간 동안 교반하고, 여기에 프로그램된 세포사멸 리간드 1(programmed death ligand 1, PDL1)에 대한 siRNA(Thermo Fisher Scientific; 이하, sPL로 기재함)를 50 nM 농도로 첨가하였다. 교반하면서 밤새 반응시킨 후, 투석백(분자량=3,500 kDa)을 사용하여 정제하였다. 약물의 로딩 효율 및 함량 분석을 위해, 다른 농도의 D를 사용하여 BP-D, BP-DcF 및 BP-DcF@sPL 전달체를 제조하였다. 전달체에 포함된 D의 함량은 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC; CM5000, Hitachi, Japan)로 측정하였다.10 mg of the blacklin nanosheet prepared in 1 (hereinafter referred to as BP) was redispersed in 10 mL of deoxygenated water. Mixed solution of chitosan-polyethylene glycol (chitosan-polyethylene glycol; hereinafter referred to as c) and folic acid (hereinafter, referred to as F) (the ratio of c and F is one to one; hereinafter referred to as cF) 10% (Based on w/w of BP) and doxorubicin (hereinafter referred to as D, mass ratio of BP and D=1.0:5.0) to prepare a DcF solution. DcF solution was added to the BP dispersion solution while ultrasonating for 30 minutes on ice. The mixture was stirred for 3 hours to induce BP-DcF complex formation, and siRNA (Thermo Fisher Scientific; hereinafter referred to as sPL) against a programmed death ligand 1 (PDL1) programmed therein was 50 nM concentration. Was added. After reacting with stirring overnight, it was purified using a dialysis bag (molecular weight=3,500 kDa). For analysis of drug loading efficiency and content, BP-D, BP-DcF and BP-DcF@sPL transporters were prepared using different concentrations of D. The content of D contained in the carrier was measured by high-performance liquid chromatography (HPLC; CM5000, Hitachi, Japan).

3. BP의 물리화학적 특성(Physicochemical characterization) 확인3. Confirmation of BP's Physicochemical Characterization

수득한 BP(흑린 나노시트)의 크기는 아르곤 가스 존재 하에 BP를 이동성 입자 주사 정립기(scanning mobility particle sizer, SMPS; 3936, TSI, USA)에 직접 샘플링하여 측정하였다. 건조시킨 BP의 표면 구조는 라만 분광기(XploRA Plus, HORIBA, Japan) 및 XPS (Axis-HIS, Kratos Analytical, Japan)를 사용하여 확인하였다. 또한, 자외선-가시광선 분광기(UV-vis spectroscopy; U-2800, PerkinElmer, USA)를 사용하여 BP-D 또는 BP-DcF의 광 흡수 스펙트럼(light absorption spectra)을 측정하였다. 다른 농도(0 내지 25%)의 cF를 포함하는 BP-cF의 유체역학 크기 분포(hydrodynamic size distribution) 및 제타 전위(Zeta potential)는 제타사이저(Zetasizer; Nano-S90, Malvern Instruments, UK)로 분석하였다.The size of the obtained BP (black phosphorus nanosheet) was measured by directly sampling the BP in the presence of argon gas to a scanning mobility particle sizer (SMPS; 3936, TSI, USA). The surface structure of the dried BP was confirmed using a Raman spectroscopy (XploRA Plus, HORIBA, Japan) and XPS (Axis-HIS, Kratos Analytical, Japan). In addition, the light absorption spectra of BP-D or BP-DcF was measured using an ultraviolet-visible spectroscopy (UV-vis spectroscopy; U-2800, PerkinElmer, USA). The hydrodynamic size distribution and zeta potential of BP-cF containing cF at different concentrations (0 to 25%) are the Zetasizer (Nano-S90, Malvern Instruments, UK). Analysis.

BP 및 이를 사용하여 제작한 전달체의 형태 및 미세구조는 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM; Tecnai G2 F20 S-TWIN, FEI, USA), 원자간력 현미경(atomic force microscope, AFM; Nanoscope®IIIa, Digital Instruments, USA) 및 주사 터널링 현미경(scanning tunneling microscope, STM; Nanoscope®IIIaECSTM, Digital Instruments, USA). 으로 확인하였다. BP-DcF 및 s 사이의 최적 N/P 비율은 GelRedTM 핵산 염색약(Biotium, USA)을 함유한 3% 아가로스 젤(Invitrogen, USA)을 사용한 젤 지연 분석법(gel retardation assay)으로 확인하였다. BP의 광열 활성은 10 내지 200 ㎍/㎖ 농도의 BP 분산액에 근적외선(near infradred ray; 이하, NIR로 기재함)을 5분 동안 조사(808 ㎚, 1.5 W/㎠)한 후 디지털 열 카메라(Therm-App TH, Israel)로 측정하였다.The shape and microstructure of the BP and the vehicle produced using the same are transmission electron microscopy (TEM; Tecnai G 2 F20 S-TWIN, FEI, USA), atomic force microscope (AFM; Nanoscope®) IIIa, Digital Instruments, USA) and scanning tunneling microscope (STM; Nanoscope® IIIaECSTM, Digital Instruments, USA). It was confirmed by. The optimal N/P ratio between BP-DcF and s was confirmed by gel retardation assay using a 3% agarose gel (Invitrogen, USA) containing GelRed ™ nucleic acid stain (Biotium, USA). The photothermal activity of BP was irradiated with near infrared rays (near infradred ray; hereinafter referred to as NIR) for 5 minutes (808 nm, 1.5 W/cm 2) in a BP dispersion at a concentration of 10 to 200 μg/ml, followed by a digital thermal camera (Therm -App TH, Israel).

흑린 나노시트에 DcF와 sPL이 결합하는 것은 푸리에 변환 적외선(Fourier transform infrared, FTIR; Nicolet Nexus 670, Thermo Fisher Scientific, USA) 분광기 및 X-선 회절 분석기 (X-ray diffractometry, XRD; D/MAX-2500, Rigaku, Japan)를 통해 정성분석하였다.The combination of DcF and sPL on a blacklin nanosheet is Fourier transform infrared (FTIR; Nicolet Nexus 670, Thermo Fisher Scientific, USA) spectrometer and X-ray diffractometry (XRD; D/MAX-) 2500, Rigaku, Japan).

4. BP-DcF@sPL의 시험관 내(4.In vitro of BP-DcF@sPL ( in vitroin vitro ) ) 독소루비신Doxorubicin 방출 실험 Release experiment

상기 2.에서 제작한 BP-DcF@sPL의 D 방출 실험은 투석백(분자량=3500 kDa)을 사용한 평형 투석 방법(equilibrium dialysis method)으로 평가하였다. 간략하게, BP-DcF@sPL 용액 1 ㎖을 투석백에 넣고, 상기 투석백은 인산염-완충 식염수(phosphate-buffered saline, pH 7.4; 이하, PBS로 기재함) 30 ㎖ 또는 아세트산염-완충 식염수(acetate-buffered saline, pH 5.0; 이하, ABS로 기재함) 30 ㎖에 담근 후 37℃에서 100 rpm으로 교반하였다. PBS 또는 ABS 1 ㎖을 0.0, 1.5, 3.0, 6.0, 12.0, 24.0 및 48.0 시간에 각각 꺼내고, 동일한 부피의 새로운 PBS 또는 ABS를 보충하였다.The D release experiment of BP-DcF@sPL prepared in 2. was evaluated by an equilibrium dialysis method using a dialysis bag (molecular weight=3500 kDa). Briefly, 1 ml of a BP-DcF@sPL solution is placed in a dialysis bag, and the dialysis bag is 30 ml of phosphate-buffered saline (pH 7.4; below, described in PBS) or acetate-buffered saline ( acetate-buffered saline, pH 5.0; below, described as ABS) After immersing in 30 ml, the mixture was stirred at 37°C at 100 rpm. 1 ml of PBS or ABS was taken out at 0.0, 1.5, 3.0, 6.0, 12.0, 24.0 and 48.0 hours, respectively, and supplemented with the same volume of fresh PBS or ABS.

D의 방출에 NIR 조사(808 ㎚, 1.5 W/cm2, 5분)가 미치는 영향은 ABS를 사용하여 1.5, 3.0 및 6.0 시간에 평가하였다. D의 누적적 방출 정도는 HPLC(CM5000, 히타치, 일본)로 D의 농도를 측정하여 추정하였다.The effect of NIR irradiation (808 nm, 1.5 W/cm 2 , 5 min) on the release of D was evaluated at 1.5, 3.0 and 6.0 hours using ABS. The cumulative release degree of D was estimated by measuring the concentration of D by HPLC (CM5000, Hitachi, Japan).

혈청 내 BP-DcF@sPL의 로딩 안정성은 0, 4, 8, 12 및 24 시간에 D의 함량을 측정하여 확인하였다.Loading stability of BP-DcF@sPL in serum was confirmed by measuring the content of D at 0, 4, 8, 12 and 24 hours.

5. 세포 배양5. Cell culture

MC-38 세포는 Kerafast(Boston, MA, USA)로부터 구매하고, HCT116 및 HT29 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였다. 구입한 세포들은 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. CD8+ T 세포는 6주령 C57BL/6 마우스의 지라(spleen) 및 림프절(lymph nodes)에서 분리한 세포를 CD8-conjugated magnetic beads (Miltenyi Biotec, Germany)를 사용하여 정제하였다. 정제한 CD8+ T 세포는 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지에서 배양하였다.MC-38 cells were purchased from Kerafast (Boston, MA, USA), and HCT116 and HT29 cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). The purchased cells were cultured at 37°C and 5% CO 2 using Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin. For CD8 + T cells, cells isolated from spleen and lymph nodes of 6-week-old C57BL/6 mice were purified using CD8-conjugated magnetic beads (Miltenyi Biotec, Germany). Purified CD8 + T cells were cultured in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin.

6. BP-DcF@sPL의 세포독성(6. Cytotoxicity of BP-DcF@sPL ( CytotoxicityCytotoxicity ) 확인) Confirm

MC-38, HCT116 및 HT29 세포를 96-웰 플레이트에 1x104 세포/웰 농도로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 상기 세포에 다른 농도(1.25 내지 20.0 ㎍/㎖)의 BP-cF, BP-DcF@sPL 또는 D를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. NIR을 조사하는 경우, 배양 6시간 후 조사(808 ㎚, 1.5 W/cm2, 5분)하였다. 배양이 끝난 후, MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 용액을 각 웰에 첨가하여 4시간 동안 반응시키고, 마이크로플레이트 판독기(Multiskan EX; Thermo Scientific, USA)를 사용하여 493 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.MC-38, HCT116, and HT29 cells were cultured in a 96-well plate at a concentration of 1x10 4 cells/well for 24 hours. Then, the cells were incubated for 24 hours by treating BP-cF, BP-DcF@sPL or D at different concentrations (1.25 to 20.0 μg/ml). In the case of NIR irradiation, irradiation was performed after 6 hours of culture (808 nm, 1.5 W/cm 2 , 5 minutes). After incubation, MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) solution was added to each well for 4 hours. During the reaction, absorbance was measured at a wavelength of 493 nm using a microplate reader (Multiskan EX; Thermo Scientific, USA).

7. BP-DcF@sPL의 세포 흡수(cellular uptake) 여부 확인7. Confirmation of cellular uptake of BP-DcF@sPL

MC-38, HCT116 또는 HT29 세포를 12-웰 플레이트에 1x105 세포/웰 농도로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포에 F(엽산)를 전처리하거나 또는 전처리하지 않은 상태로 BP-DcF@sPL(D는 5 ㎍/㎖, sPL은 50 nM)을 37℃에서 6시간 동안 처리하였다. 이후, 세포를 회수하여 PBS로 세척하고, 유세포 분석기(flow cytometer; FACSCaliburTM, BD Biosciences, USA)로 분석하였다.MC-38, HCT116 or HT29 cells were cultured in 12-well plates at a concentration of 1x10 5 cells/well for 24 hours. The cells were pre-treated with or without F (folic acid) and treated with BP-DcF@sPL (D for 5 μg/ml, sPL for 50 nM) at 37° C. for 6 hours. Thereafter, the cells were collected, washed with PBS, and analyzed with a flow cytometer (FACSCalibur ™ , BD Biosciences, USA).

엽산 전처리 유무에 따른 BP-DcF@sPL의 세포내 위치(localization)는 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM; Leica Microsystems, Germany)으로 확인하였다. 세포(2x105)를 원형 유리 커버슬립에 부착시키고, 무혈청 배지에서 BP-DcF@sPL을 6시간 동안 처리(엽산 전처리 또는 엽산 무처리 조건)하였다. 세포를 차가운 PBS로 세척한 후 라이소트랙커 그린(Lysotracker green)으로 20분 동안 염색하고, 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 고정시켰다. 이후 세포를 DAPI(4 ', 6-diamidino-2-phenylindole)로 10분 동안 염색한 후 CLSM으로 확인하였다. 엔도좀 탈출(endosomal escape) 연구를 위해서, 세포를 분주하여 배양한 후 상기와 동일한 조건으로 BP-DcF@sPL을 처리하되, NIR을 조사(808 ㎚, 1.5 W/cm2, 5분)하였다. 세포 지도의 병합에는 FAM(fluorescein amidite)이 표지된 sPL 및 라이소트랙커 그린을 사용하였다.The intracellular localization of BP-DcF@sPL with and without folic acid pretreatment was confirmed by confocal laser scanning microscopy (CLSM; Leica Microsystems, Germany). Cells (2x10 5 ) were attached to circular glass coverslips, and BP-DcF@sPL was treated for 6 hours in serum-free medium (folic acid pre-treatment or folic acid-free conditions). Cells were washed with cold PBS, stained with Lysotracker green for 20 minutes, and fixed with 4% paraformaldehyde. Thereafter, the cells were stained with DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) for 10 minutes, and then confirmed by CLSM. For the endosomal escape study, cells were divided and cultured, and then treated with BP-DcF@sPL under the same conditions as described above, but irradiated with NIR (808 nm, 1.5 W/cm 2 , 5 minutes). Cell maps were combined with fluorescein amidite (FAM) labeled sPL and lysotracker green.

8. 시험관 내(8. In vitro in vitroin vitro ) ) PLPL 발현 및 발현 억제(silencing) 확인 Expression and expression suppression (silencing) confirmation

PL 발현 여부를 확인하기 위해 MC-38, HCT116 또는 HT29 세포를 6-웰 플레이트에 1x105 세포/웰 농도로 분주하고, 인터페론 감마(IFN-γ; 20 ng/㎖)를 포함하는 배지 2 ㎖를 각 웰에 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 세포를 용해시키고 웨스턴 블롯팅을 위해 단백질을 추출하였다. 인터페론 감마 자극에 따른 PL의 발현 변화는 배양 후 0, 12, 24 및 48시간을 확인하였다.To check for PL expression, MC-38, HCT116 or HT29 cells were dispensed into a 6-well plate at a concentration of 1x10 5 cells/well, and 2 ml of a medium containing interferon gamma (IFN-γ; 20 ng/ml) It was added to each well. After incubation for 48 hours, cells were lysed and proteins were extracted for Western blotting. Changes in expression of PL according to interferon gamma stimulation were confirmed at 0, 12, 24 and 48 hours after culture.

PL에 대한 sPL의 발현 억제(silencing) 효과는 다음과 같이 확인하였다. 종양-침윤(tumor-infiltrating) 세포 독성 T 세포(cytotoxic T lympocyte; 이하, CTL로 기재함)에 의한 IFN-γ의 생산은 종양에서의 PL 발현을 자극할 수 있고, 배양 배지내 IFN-γ의 존재는 대장암 또는 흑색종에서 PL 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 세포를 인터페론 감마(20 ng/㎖)로 자극하고, 상이한 농도(10 내지 100 nM)의 sPL을 포함하는 BP-DcF@sPL(D는 5 ㎍/㎖)을 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후 세포를 용해시키고 웨스턴 블롯팅을 위해 단백질을 추출하였다. 음성 대조군에는 스크램블(scramble) siRNA를 처리하고, 비교를 위해 sPL(50 nM), BP-DcF(D는 5 ㎍/㎖), BP-DcF+sPL(sPL이 캡슐화되지 않음) 및 Dharmafect@sPL을 처리한 세포에서도 PL 발현 수준을 확인하였다. 유세포 분석은 세포를 피코에리트린(phycoerythrin, PE) 항-마우스 PL 항체로 세포를 염색하여 수행하였다.The silencing effect of sPL expression on PL was confirmed as follows. Production of IFN-γ by tumor-infiltrating cytotoxic T cells (hereinafter referred to as CTLs) can stimulate PL expression in tumors, and IFN-γ in culture medium The presence is known to promote PL expression in colorectal cancer or melanoma. Cells were stimulated with interferon gamma (20 ng/mL) and treated with BP-DcF@sPL (D = 5 μg/mL) containing sPL at different concentrations (10-100 nM). After incubation for 48 hours, cells were lysed and proteins were extracted for Western blotting. The negative control was treated with scramble siRNA, and sPL (50 nM), BP-DcF (D = 5 μg/mL), BP-DcF+sPL (sPL was not encapsulated) and Dharmafect@sPL for comparison. PL expression levels were also confirmed in the treated cells. Flow cytometry was performed by staining the cells with phycoerythrin (PE) anti-mouse PL antibody.

세포내 단백질은 세포 용해물을 4℃에서 20분 동안 원심분리 (12,000xg)하여 회수하고, BCA(bicinchoninic acid) 방법으로 정량하였다. 이후 상기 단백질을 10% 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 젤(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)을 사용하여 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 상기 막을 37℃에서 1시간 동안 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹하고, 막을 0.1% Tween 20을 포함하는 트리스-완충 식염수(Tris-buffered saline, TBS)로 3회 세척하였다. 이후 상기 막을 PL 또는 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 일차 항체와 하룻밤 동안 배양시켰다. 다음날 막을 TBST로 세척하고, 2차 항체인 G-HRP(horseradish peroxidase) 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 상기 막에 화학발광 시약을 처리하여 단백질 밴드를 확인하였다.Intracellular proteins were recovered by centrifugation (12,000xg) of cell lysates at 4°C for 20 minutes, and quantified by a bicinchoninic acid (BCA) method. Then, the protein was separated by electrophoresis using 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and then transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane was blocked with 5% skim milk for 1 hour at 37°C, and the membrane was washed 3 times with Tris-buffered saline (TBS) containing 0.1% Tween 20. The membrane was then incubated with PL or GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) primary antibody overnight. The next day, the membrane was washed with TBST and reacted with a secondary antibody, a horseradish peroxidase (G-HRP) antibody, for 1 hour at room temperature. Subsequently, a protein band was identified by treating the membrane with a chemiluminescent reagent.

9. BP-DcF@sPL의 시험관 내 활성산소 생성 억제 및 세포사멸 확인9. BP-DcF@sPL inhibits the production of free radicals in vitro and confirms apoptosis

MC-38 세포를 12-웰 플레이트에 1x105 세포/웰 농도로 분주하여 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날 상기 세포에 D 단독, BP-Dc(c는 5 ㎍/㎖) 및 BP-DcF@sPL(D는 5 ㎍/㎖ 및 sPL은 50 nM)를 처리하고, F를 전처리하였다. NIR 조사군의 경우, 처리 6시간 후 NIR을 조사(808 ㎚, 1.5 W/cm2, 5분)하고, 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이후 세포를 회수하고, 20 μM DCFDA (dichlorodihydrofluorescein diacetate)로 세포를 30분 동안 염색하였다. 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 생성 정도는 유세포 분석기로 확인하였다.MC-38 cells were cultured overnight in a 12-well plate at a concentration of 1×10 5 cells/well. The next day, the cells were treated with D alone, BP-Dc (5 μg/ml for c) and BP-DcF@sPL (5 μg/ml for D and 50 nM for sPL), and pretreated with F. In the case of the NIR irradiation group, NIR was irradiated (808 nm, 1.5 W/cm 2 , 5 minutes) after 6 hours of treatment, and further cultured for 24 hours. Cells were then recovered and cells stained for 30 min with 20 μM DCFDA (dichlorodihydrofluorescein diacetate). The degree of production of reactive oxygen species (ROS) was confirmed by flow cytometry.

ROS 생성에 의한 세포사멸(apoptosis)은 라이브/데드 실험(live/dead assay) 및 아넥신 V/프로피디움 아이오다이드(annexin V/propidium iodide) 염색으로 분석하였다. 간략하게, ROS 검출을 위해 동일하게 처리된 MC-38 세포를 RPMI 배지에서 아크리딘 오렌지(6.7 μM) 및 PI(750 μM)로 염색하였다. PBS로 3회 세척한 후, 상기 세포를 형광 현미경(Eclipse Ti; Nikon, USA)으로 관찰하였다. 세포사멸이 일어난 세포의 정량은 아넥신 V/PI 키트(BD Biosciences, USA)를 사용하여 세포를 염색하여 수거한 후, FACSCaliburTM 유세포 분석기로 수행하였다.Apoptosis by ROS production was analyzed by live/dead assay and annexin V/propidium iodide staining. Briefly, identically treated MC-38 cells for ROS detection were stained with acridine orange (6.7 μM) and PI (750 μM) in RPMI medium. After washing three times with PBS, the cells were observed with a fluorescence microscope (Eclipse Ti; Nikon, USA). Quantification of apoptotic cells was performed by staining and collecting cells using the Annexin V/PI kit (BD Biosciences, USA), followed by FACSCalibur TM flow cytometry.

10. 10. 공배양Coculture 시스템( system( coculturecoculture system)에서 BP-DcF@sPL의 경쟁적 흡수 확인 system) to confirm the competitive absorption of BP-DcF@sPL

C57BL/6 마우스에 10 ng/㎖ 농도의 인터루킨 4 및 20 nM/㎖ 농도의 GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)를 7일 동안 투여하여 자극시키고, 대퇴골(femurs)에서 수지상 세포를 회수하였다.C57BL/6 mice were stimulated with interleukin 4 at a concentration of 10 ng/ml and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) at a concentration of 20 nM/ml for 7 days, and dendritic cells were recovered from the femurs. Did.

6주령 C57BL/6 마우스의 비장과 림프절로부터 단일세포 현탁액을 제조하였다. 상기 단일세포 현탁액으로부터 CD4 마이크로비드(MicroBead)를 사용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. CD8+ T 세포는 CD8 마이크로비드 및 MidiMACS sorting device (Miltenyi Biotec, Germany)를 사용하여 분리하였다.Single cell suspensions were prepared from spleens and lymph nodes of 6 week old C57BL/6 mice. CD4 + T cells were isolated from the single cell suspension using CD4 MicroBeads. CD8 + T cells were isolated using a CD8 microbead and MidiMACS sorting device (Miltenyi Biotec, Germany).

MC-38 세포 (1x105 세포/웰) 및 CD8+ T 세포 (또는 수지상 세포, 또는 RAW264.7 세포; 1x105 세포/웰)를 트랜스웰(Transwell; 0.4 ㎛ 포어 사이즈)에 같이 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 트랜스웰에 BP-Dc@s 및 BP-DcF@s (D는 2.5 ㎍/㎖ 및 s는 50 nM)를 첨가하고, 6시간 동안 추가로 배양하였다. 트랜스웰의 세포를 회수하여 PBS로 세척하고, FACSCaliburTM 유세포 분석기로 BP-Dc@s 및 BP-DcF@s의 흡수 정도를 확인하였다.Dispense MC-38 cells (1×10 5 cells/well) and CD8 + T cells (or dendritic cells, or RAW264.7 cells; 1×10 5 cells/well) together in Transwell (0.4 μm pore size) for 24 hours Cultured for a while. Then, BP-Dc@s and BP-DcF@s (D for 2.5 µg/ml and s for 50 nM) were added to the transwell, and further cultured for 6 hours. The cells of the transwell were collected and washed with PBS, and the degree of absorption of BP-Dc@s and BP-DcF@s was confirmed by a FACSCalibur TM flow cytometer.

11. BP-DcF@sPL의 용혈(11. Hemolysis of BP-DcF@sPL ( hemolysishemolysis ) 효과 확인) Check effect

C57BL/6 마우스로부터 분리한 전혈을 원심분리(500xg)하고, 혈장을 제거하기 위하여 PBS로 3회 세척하였다. 총 0.5 ㎖의 4% 적혈구(v/v)를 각각 0.5 ㎖의 증류수, PBS 및 BP-DcF@sPL(또는 BP; 농도 25, 50, 100 및 200 ㎍/㎖)과 혼합하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 8시간 동안 반응시킨 후 적혈구를 침전시키고, UV-vis 분광 광도계(U-2800; PerkinElmer, USA)를 사용하여 540 ㎚ 파장에서 현탁액의 흡광도를 측정하였다. 적혈구의 용혈 비율은 하기 수학식 1에 따라 평가하였다.Whole blood isolated from C57BL/6 mice was centrifuged (500xg) and washed 3 times with PBS to remove plasma. A total of 0.5 ml 4% red blood cells (v/v) were mixed with 0.5 ml distilled water, PBS and BP-DcF@sPL (or BP; concentrations 25, 50, 100 and 200 μg/ml), respectively. After reacting the mixture at 37° C. for 8 hours, red blood cells were precipitated, and the absorbance of the suspension was measured at a wavelength of 540 nm using a UV-vis spectrophotometer (U-2800; PerkinElmer, USA). The rate of hemolysis of red blood cells was evaluated according to Equation 1 below.

Figure pat00001
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(A 및 A 0 는 각각 BP-DcF@sPL(또는 BP) 및 적혈구(증류수와 혼합한 것)의 흡광도를 나타냄)( A and A 0 represent absorbance of BP-DcF@sPL (or BP) and red blood cells (mixed with distilled water), respectively)

12. BP-DcF@sPL의 12. BP-DcF@sPL 생체내In vivo 생물학적 분포( Biological distribution ( in in vivovivo biodistributionbiodistribution ) 확인) Confirm

생체내 종양 모델을 제작하기 위해, MC-38 (1x106 세포/마우스) 세포를 C57BL/6 마우스의 옆구리(flank)에 주입하였다. 종양이 500 ㎣까지 자랐을 때 [email protected] 또는 [email protected](D는 5 ㎎/㎏, Cy5.5-s는 마우스당 30 ㎍)를 마우스(N=6)의 정맥에 주사하였다. 주사 후 0, 12 및 24시간에 마우스를 마취하고, 생체내 이미징 시스템(FOBI; NeoScience, Republic of Korea)으로 형광 이미지를 확인하였다. 주사 24시간 후에 마우스를 희생시키고, 심장, 간, 비장, 폐, 신장 및 종양의 엑스 비보 형광 분포(ex vivo fluorescence distribution)를 확인하였다.To construct an in vivo tumor model, MC-38 (1×10 6 cells/mouse) cells were injected into the flanks of C57BL/6 mice. [email protected] or [email protected] (D is 5 mg/kg, Cy5.5-s is 30 μg per mouse) when the tumor has grown to 500 mm 3 mice (N= 6). The mice were anesthetized at 0, 12 and 24 hours after injection, and fluorescence images were confirmed with an in vivo imaging system (FOBI; NeoScience, Republic of Korea). Mice were sacrificed 24 hours after injection, and ex vivo fluorescence distribution of heart, liver, spleen, lung, kidney and tumors was confirmed.

상기 MC-38 종양 보유 마우스에서 종양이 500 ㎣까지 자랐을 때 BP-DcF@sPL(D는 5 ㎎/㎏, sPL은 마우스당 30 ㎍) 및 D를 정맥에 주사하였다. 24시간 후 마우스를 희생시키고, 심장, 간, 비장, 폐, 신장 및 종양을 분리하여 무게를 측정하였다. 상기 조직들을 용해 버퍼[40 mM 트리스 아세테이트, 1% 트리톤-100, 10 mM DTT(dithiothreitol), 10 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 및 1% SDS(sodium dodecyl sulfate)]에 담근 후 균질화하고, HCl/이소프로판올을 사용하여 D를 추출하였다. 추출한 D는 HPLC (CM5000, Hitachi, Japan)로 정량하였다. 각 장기 및 종양에서 D의 분포는 분포는 단위 조직 질량(unit tissue mass; g) 당 주입량(injected dose, ID), 즉 %ID/g로 나타내었다.In the MC-38 tumor-bearing mouse, BP-DcF@sPL (D is 5 mg/kg, sPL is 30 μg per mouse) and D were injected intravenously when the tumor grew to 500 mm 3. After 24 hours, mice were sacrificed, and heart, liver, spleen, lung, kidney and tumor were separated and weighed. Soak the tissues in lysis buffer [40 mM Tris Acetate, 1% Triton-100, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 10 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) and 1% SDS (sodium dodecyl sulfate)], homogenize, HCl/isopropanol D was extracted using. The extracted D was quantified by HPLC (CM5000, Hitachi, Japan). The distribution of D in each organ and tumor is expressed as an injected dose (ID) per unit tissue mass (g), that is,% ID/g.

13. BP-DcF@sPL의 13. BP-DcF@sPL 생체내In vivo 광열Frenzy 활성( activation( in in vivovivo photothermalphotothermal activity) activity)

종양 부위 근처의 체온 상승을 확인하기 위하여, 500 ㎣ 이내의 MC-38 세포 유래 종양을 갖는 마우스에 F를 포함하거나 또는 포함하지 않는 [email protected](D는 5 ㎎/㎏, Cy5.5-s는 마우스당 30 ㎍)를 정맥에 주사하였다. 주사 8시간 후에, 마우스에 NIR을 5분 동안 조사(808 ㎚, 1.5 W/cm2)하였다. NIR을 조사하는 동안 디지털 열화상 카메라(Therm-App TH, Israel)를 사용하여 온도 변화를 기록하였다.[email protected] (D is 5 mg/kg, with or without F) in mice with MC-38 cell-derived tumors within 500 kPa to confirm an increase in body temperature near the tumor site Cy5.5-s was injected intravenously (30 μg per mouse). Eight hours after injection, mice were irradiated with NIR for 5 minutes (808 nm, 1.5 W/cm 2 ). During the NIR investigation, the temperature change was recorded using a digital thermal imaging camera (Therm-App TH, Israel).

14. BP-DcF@sPL의 항종양(14.Anti-tumor of BP-DcF@sPL ( antitumorantitumor ) 효과) effect

항종양 효과를 평가하기 위해, MC-38 세포 유래 종양을 갖는 마우스를 무작위로 8개 그룹(N=6)으로 나누고, NIR 조사 또는 비조사 그룹으로 분류하였다. 분류한 마우스에 BP-Dc@F(D는 5 ㎎/㎏) 및 BP-DcF@sPL(D는 5 ㎎/㎏, sPL은 마우스당 30 ㎍)를 정맥에 주사하였다. 이때 비교를 위하여 각각 PBS, NIR, 및 D+BP-DcF+aPL(NIR 조사; aPL은 PL 항체)을 같이 실험하였다. 주사 8시간 후, NIR 조사군에는 NIR 레이저를 5분 동안 조사(808 ㎚, 1.5 W/cm2)하였다. 상기 처치(정맥 주사+ NIR 조사)는 항종양 실험 종료시까지 2일마다 반복하였고, 이 기간 동안 종양의 부피 및 체중을 매일 모니터하고, 종양의 부피는 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.To evaluate the anti-tumor effect, mice with tumors derived from MC-38 cells were randomly divided into 8 groups (N=6) and classified into NIR or non-irradiated groups. Sorted mice were injected intravenously with BP-Dc@F (D is 5 mg/kg) and BP-DcF@sPL (D is 5 mg/kg, sPL is 30 μg per mouse). At this time, for comparison, PBS, NIR, and D+BP-DcF+aPL (NIR irradiation; aPL is a PL antibody) were tested together. Eight hours after the injection, the NIR irradiation group was irradiated with an NIR laser for 5 minutes (808 nm, 1.5 W/cm 2 ). The treatment (intravenous injection + NIR irradiation) was repeated every 2 days until the end of the anti-tumor experiment, during which time the volume and body weight of the tumor were monitored daily, and the volume of the tumor was calculated according to the following equation (2).

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BP-DcF@sPL의 광치료 효과를 구체적으로 조사하기 위하여, 실험 16일 차에 마우스를 희생시키고, 종양 조직을 분리하였다. 상기 종양 조직을 기계적으로 분쇄한 후 100 ㎛ 스트레이너(strainer; Falcon, BD Biosciences, USA)에 통과시켜 단일세포 현탁액을 제조하였다. 상기 단일세포 현탁액을 DCFDA (20 μM)로 30분 동안 염색하고, 종양 내 ROS 생성 수준은 FACSCaliburTM 유세포 분석기(BD Biosciences, USA)로 측정하였다.To specifically investigate the phototherapeutic effect of BP-DcF@sPL, mice were sacrificed on day 16 of the experiment and tumor tissues were isolated. After the tumor tissue was mechanically crushed, a single cell suspension was prepared by passing through a 100 μm strainer (Falcon, BD Biosciences, USA). The single cell suspension was stained with DCFDA (20 μM) for 30 minutes, and the level of ROS production in the tumor was measured by a FACSCalibur ™ flow cytometer (BD Biosciences, USA).

항종양 면역(antitumor immunity) 효과는 하기와 같이 확인하였다. 실험 16일 차에 마우스로부터 종양 조직을 분리하고, 상기 종양 조직을 기계적으로 분쇄하여 단일세포 현탁액을 제조하였다. 상기 단일세포 현탁액은 FITC(fluorescein isothiocyanate) 항-마우스 CD11c+, PE 항-마우스 CD86+, APC(adenomatous polyposis coli) 항-마우스 CD69+ 및 Percp-Cy5.5 항-마우스 CD8+ 항체로 염색하였다. 이후 성숙한 수지상세포(mature dendritic cel) 및 CD8+ 세포의 비율을 FACSVerseTM 유세포 분석기(BD Biosciences, USA)로 분석하였다. 또한 종양 조직으로부터 균질액(homogenate)을 제조하고, 효소 면역 측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 키트(Invitrogen, USA)를 사용하여 TNF-α의 분비 수준을 측정하였다.The antitumor immunity effect was confirmed as follows. On the 16th day of the experiment, the tumor tissue was separated from the mouse, and the tumor tissue was mechanically crushed to prepare a single cell suspension. The single cell suspension was stained with FITC (fluorescein isothiocyanate) anti-mouse CD11c + , PE anti-mouse CD86 + , APC (adenomatous polyposis coli) anti-mouse CD69 + and Percp-Cy5.5 anti-mouse CD8 + antibody. Then, the ratio of mature dendritic cells (mature dendritic cel) and CD8 + cells was analyzed by a FACSVerse ™ flow cytometer (BD Biosciences, USA). In addition, a homogenate was prepared from tumor tissue, and the secretion level of TNF-α was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Invitrogen, USA).

sPL의 생체 내 침묵 효과(silencing effect)를 확인하기 위해, 분리된 단일세포 현탁액을 PE 항-마우스 PL로 염색하고, 유세포 분석기로 신호를 분석하였다.To confirm the in vivo silencing effect of sPL, the isolated single cell suspension was stained with PE anti-mouse PL, and the signal was analyzed by flow cytometry.

CD8+ T 세포에 의해 분비되는 세포내 인터페론-감마(IFN-γ)의 수준을 확인하기 위하여, 분리된 세포를 50 ng/㎖ 농도의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate), 500 ng/㎖ 농도의 이오노마이신(ionomycin) (eBioscience, USA) 및 1 ㎕/㎖ 농도의 GolgiStopTM (BD Biosciences, USA)으로 4시간 동안 자극하였다. 이후 상기 세포를 FITC 항-마우스 CD3+, APC 항-마우스 IFN-γ 및 Percp-Cy5.5 항-마우스 CD8+ 항체로 염색하고, 신호는 유세포 분석기로 확인하였다.To confirm the level of intracellular interferon-gamma (IFN-γ) secreted by CD8 + T cells, the isolated cells were treated with 50 ng/ml concentration of fobol 12-myristate 13-acetate (phorbol 12-myristate 13- acetate), 500 ng/ml concentration of ionomycin (eBioscience, USA) and 1 μl/ml concentration of GolgiStop ™ (BD Biosciences, USA) for 4 hours. The cells were then stained with FITC anti-mouse CD3 + , APC anti-mouse IFN-γ and Percp-Cy5.5 anti-mouse CD8 + antibody, and the signal was confirmed by flow cytometry.

처리 후의 세포사멸성 종양 세포(apoptotic tumor cells) 비율은 아넥신 V/PI 키트로 염색한 후 유세포 분석기로 확인하였다. 또한, 복합 항종양 효과(combined antitumor effect)는 HCT116 종양 보유 마우스(N=6)에 BP-DcF (D는 5.0 ㎎/㎏) 및 BP-DcF@sPL(D는 5.0 ㎎/㎏ 및 sPL은 마우스당 30 ㎍)을 각각 투여한 후 NIR을 조사(808 ㎚, 1.5 W/㎠, 5분, 주사 6시간 후) 또는 조사하지 않은 조건에서 평가하였다. 이때 비교를 위하여 PBS, NIR 및 D 투여군도 같이 실험하였다(총 7개 실험군).The ratio of apoptotic tumor cells after treatment was confirmed by flow cytometry after staining with the Annexin V/PI kit. In addition, the combined antitumor effect is BP-DcF (D is 5.0 mg/kg) and BP-DcF@sPL (D is 5.0 mg/kg and sPL is mouse in HCT116 tumor bearing mouse (N=6)). After 30 μg of sugar was administered, NIR was evaluated under irradiation (808 nm, 1.5 W/cm 2, 5 minutes, 6 hours after injection) or without irradiation. At this time, for comparison, PBS, NIR, and D administration groups were also tested (a total of 7 experimental groups).

15. 통계 분석15. Statistical Analysis

모든 실험 결과는 평균±표준편차로 기재하였다. 실험 결과의 통계적 유의성은 스튜던트 t-검정(Student's t-test)(두 개 실험군) 및 일원 분산 분석(one-way analysis of variance)(두 개 이상의 실험군) 방법으로 분석하였다. 유의미한 결과는 *p<0.05로 표시하였다.All experimental results were reported as mean±standard deviation. Statistical significance of the results was Student's t - was analyzed by black (Student's t -test) (two experimental groups) and one-way ANOVA (one-way analysis of variance) ( more than one group) method. Significant results were expressed as * p <0.05.

실험 결과Experiment result

1. One. 나노화된Nanoized BP의 물리화학적 특성 확인 Checking the physicochemical properties of BP

1-1. 입자 크기 및 전위1-1. Particle size and dislocation

BP에 cF가 로딩(loading)되는지 여부를 확인하기 위해, 다른 농도의 cF를 로딩한 후 유체역학적 입자 크기(hydrodynamic particle size) 및 제타 전위(zeta potential)의 변화를 분석하였다. 그 결과, BP-cF의 입자 크기, 제타 전위 및 다분산지수(PDI)는 cF 로딩 함량(wt %)에 비례하고, 특히 BP의 음전위는 2.5% 농도의 cF에서 중화되었다(도 1의 A, B). 상기 결과는 cF 함량이 5%에서 25%까지 증가함에 따라 양전위가 증가하는 것을 의미하며, cF 함량이 BP의 크기와 표면 전하를 동시에 조절할 수 있음을 의미한다. BP 표면에 로딩되는 s의 음전위를 고려하여, 정전기적 인력에 대해 높은 양전위(~16 mV)를 확보하기 위해 10% cF 농도를 선택하였다.In order to check whether cF was loaded into BP, changes in hydrodynamic particle size and zeta potential were analyzed after loading different concentrations of cF. As a result, the particle size, zeta potential, and polydispersity index (PDI) of BP-cF are proportional to the cF loading content ( wt %), and in particular, the negative potential of BP was neutralized at 2.5% concentration of cF (A in FIG. 1, B). The above results indicate that the positive potential increases as the cF content increases from 5% to 25%, and that the cF content can simultaneously control the size and surface charge of the BP. Considering the negative potential of s loaded on the BP surface, a concentration of 10% cF was selected to ensure a high positive potential (~16 mV) against electrostatic attraction.

BP에 다른 농도의 D를 로딩한 결과, 입자 분산액의 색상이 회색에서 빨간색으로 변하여 D가 로딩되는 것을 알 수 있었다(도 2의 A). 또한, D의 용량이 증가할수록 UV-vis 스펙트럼이 변화하고, BP와 D의 비율이 1:1.5보다 큰 경우 D에 해당하는 밴드 강도는 유의하게 증가하지 않았다(도 2의 B). 이러한 결과는 BP의 D 로딩 능력을 확인한 그래프의 경향과 일치한다(도 2의 C).As a result of loading D of different concentrations in BP, it was found that the color of the particle dispersion was changed from gray to red to load D (FIG. 2A). In addition, as the dose of D increased, the UV-vis spectrum changed, and when the ratio of BP and D was greater than 1:1.5, the band intensity corresponding to D did not increase significantly (Fig. 2B). This result is consistent with the trend of the graph confirming the D loading ability of BP (C in FIG. 2).

BP-DcF의 UV-vis 스펙트럼을 BP-D의 UV-vis 스펙트럼과 비교하였으며(도 3의 A), 이 둘은 서로 유사한 로딩 능력을 보였다(도 3의 B). BP에 DcF를 로딩한 경우 입자 크기 및 표면 전하가 각각 약 48 ㎚ 및 23 ㎷였다(도 3의 C). 따라서, BP-DcF는 양이온적 특성으로 인해 음으로 하전된 sPL을 적재할 수 있다. 이 결과는 N/P 비율(nitrogen to phosphate ratio)을 실험한 젤 지연 분석(gel retardation assay)으로 확인하였으며, sPL은 20:1보다 큰 비율로 BP-DcF에 강력하게 부착하는 것을 알 수 있었다(도 3의 D). BP-DcF는 sPL 로딩 후(BP-DcF@sPL)에도 양성 표면 전하(6.2 ㎷, 세포 상호 작용 및 sPL의 형질감염시 최소 양이온-매개 세포 독성을 위한 적절한 양성 전위)를 나타냈다(도 3의 C). 또한, 상기 sPL 로딩은 입자 크기를 현저하게 증가시키거나(<50 ㎚; 도 3의 C), 적재 용량 감소(93%; 도 3의 B)를 유발하지 않았다.The UV-vis spectrum of BP-DcF was compared with the UV-vis spectrum of BP-D (A in FIG. 3), and the two showed similar loading ability (B in FIG. 3). When DcF was loaded into BP, the particle size and surface charge were about 48 nm and 23 kPa, respectively (C in FIG. 3). Thus, BP-DcF can load negatively charged sPL due to its cationic properties. This result was confirmed by a gel retardation assay in which an N/P ratio (nitrogen to phosphate ratio) was tested, and it was found that sPL strongly adheres to BP-DcF at a ratio greater than 20:1 ( 3) D). BP-DcF also showed positive surface charge (6.2 kPa, adequate positive potential for minimal cation-mediated cytotoxicity upon cell interaction and sPL transfection) even after sPL loading (BP-DcF@sPL) (FIG. 3C) ). In addition, the sPL loading did not significantly increase the particle size (<50 nm; FIG. 3C) or cause a decrease in loading capacity (93%; FIG. 3B).

BP-DcF@sPL의 TEM 이미지(200개 입자 분석)는 46.0±3.2 ㎚의 측면 크기를 갖는 이방성 구조(anisotropic structure)를 보여준다(도 4의 A 상단). 이 크기는 DLS 시스템으로 측정한 BP-DcF@sPL의 유체역학적 크기 분포(50.1±1.3 ㎚)와 일치한다 (도 4의 B). 입자 크기의 근소한 차이는 표본의 상태(건조 파우더 vs 분산) 차이에 기인하며, DLS 측정에서 나노플랫폼의 팽창(swelling)이 크기 차이를 유발했을 수 있다. 그러나 나노플랫폼의 크기는 팽창 상태에서도 전자 상자성 공명(electron paramagnetic resonance, EPR) 효과의 유효 범위 내에 있었다. DcF@sPL을 로딩하기 전의 BP 고배율 TEM 이미지는 이방성 구조 내의 주름진 형태(즉, 나노시트의 변형) 및 BP 고유의 결정 특성[0.34 ㎚ d-spacing, (021) 플레인(plane)]을 보였다(도 4의 A 하단). 이는 나노화를 통해 흑린 미세구조의 변형(deformation) 없이 흑린 나노시트를 제작할 수 있음을 의미한다. BP의 형태를 AFM으로 추가로 확인한 결과, 울트라소닉 버블 붕괴로부터 주름 구조(평평하지 않은)가 형성된 것을 알 수 있었다(도 4의 C 상단). 또한, STM으로 확인한 BP의 미세구조는 일그러진 벌집 격자 구조 (puckered honeycomb lattice structure)를 나타내었다(도 4의 C 하단).The TEM image of BP-DcF@sPL (analysis of 200 particles) shows an anisotropic structure with a lateral size of 46.0±3.2 nm (top A in FIG. 4 ). This size is consistent with the hydrodynamic size distribution (50.1±1.3 nm) of BP-DcF@sPL measured with the DLS system (Fig. 4B). The slight difference in particle size is due to the difference in the state of the sample (dry powder vs dispersion), and the swelling of the nanoplatform in DLS measurements may have caused the size difference. However, the size of the nanoplatform was within the effective range of electron paramagnetic resonance (EPR) effects even in the expanded state. The BP high magnification TEM image before loading DcF@sPL showed corrugated morphology (ie, deformation of nanosheets) in the anisotropic structure and BP-specific crystal properties [0.34 nm d -spacing, (021) plane] (FIG. 4, A bottom). This means that it is possible to produce a blacklin nanosheet without deformation of the blacklin microstructure through nanonization. As a result of further confirming the shape of the BP by AFM, it was found that a wrinkle structure (non-flat) was formed from the collapse of the ultrasonic bubble (top of C in FIG. 4). In addition, the microstructure of BP confirmed by STM showed a distorted honeycomb lattice structure (bottom C in FIG. 4).

BP와 DcF@sPL의 결합은 FTIR 및 XRD 분석에서 BP-DcF@sPL과 개별 구성 요소 사이의 스펙트럼을 비교하여 확인하였다(도 5의 A 및 B). 구성 요소들간의 병합된 스펙트럼 특성은 나노시트 텍스처(texture)가 BP 표면에 DcF@sPL을 단단히 고정하는 데 적절한 방법임을 시사한다. BP 표면에 DcF@sPL이 로딩되는지 여부는 에너지-분산형 X-선 분광(energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDS)으로 추가로 확인하였으며, BP(P로 표시됨)와 세 원소 (탄소(C), 질소(N) 및 산소(O))가 공존하는 것을 확인하였다(도 5의 C)The binding of BP and DcF@sPL was confirmed by comparing the spectra between BP-DcF@sPL and individual components in FTIR and XRD analysis (A and B in Fig. 5). The combined spectral properties between the components suggest that the nanosheet texture is a suitable method to securely fix DcF@sPL to the BP surface. Whether DcF@sPL is loaded on the BP surface was further confirmed by energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS), and BP (denoted as P) and three elements (carbon (C)) , It was confirmed that nitrogen (N) and oxygen (O)) coexist (C in FIG. 5).

나노화 후 BP의 고유 특성(intrinsic property) 유지 여부는 5분 동안 NIR을 조사(808 ㎚, 1.5 W/㎠)하면서 열화상 카메라로 BP의 시간- 및 투여량-의존적 온도 상승을 기록하여 확인하였다. BP의 온도는 200 ㎍/㎖ 농도에서 70℃까지 상승하였고(도 6의 A), 이러한 안정적인 온도 상승은 BP-DcF (22.6 내지 45.6℃) 및 BP-DcF@sPL(21.9 내지 45.3℃) 나노플랫폼에 NIR을 6회 조사한 후에도 유지되었다(도 6의 B).Whether or not to maintain the intrinsic properties of the BP after nanonization was confirmed by recording the time- and dose-dependent temperature rise of the BP with a thermal imaging camera while irradiating NIR for 5 minutes (808 nm, 1.5 W/cm 2 ). The temperature of the BP rose from a concentration of 200 μg/ml to 70° C. (A in FIG. 6), and this stable temperature rise was BP-DcF (22.6 to 45.6° C.) and BP-DcF@sPL (21.9 to 45.3° C.) nanoplatform. It was maintained even after NIR was irradiated 6 times (Fig. 6B).

상이한 배지(ABS-pH 5.0 및 PBS-pH 7.4)에서 96시간 동안 측정한 누적적 D 방출은 부위 선택적 방출 특성을 나타냈다. 종양 미세 환경을 모방한 ABS에서는 D 방출 비율이 88.4%에 도달해 PBS보다 2배 큰 수치를 보였다. 이러한 D 방출은 광열 효과-촉발 방출(photothermal effect-triggered release)로 인하여 NIR 조사(2, 4 및 6시간 시점에서 5분)에 의해 더욱 촉진되어 48시간 이내에 91.0%까지 방출되었다(도 6의 C).Cumulative D release measured over 96 hours in different media (ABS-pH 5.0 and PBS-pH 7.4) showed site selective release properties. In the ABS, which mimics the tumor microenvironment, the D release rate reached 88.4%, which was twice that of PBS. This D release was further facilitated by NIR irradiation (5 minutes at 2, 4 and 6 hour time points) due to photothermal effect-triggered release and released to 91.0% within 48 hours (FIG. 6C) ).

또한, BP-DcF@sPL를 마우스 혈청과 반응시켜 로딩된 독소루비신(D)의 안정성을 확인한 결과, 독소루비신(D)의 유의미한 감소(즉, 독소루비신의 비특이적 방출)는 확인할 수 없었으며(도 7), 흑린 나노시트(BP)와 독소루비신(D)의 정전기적 결합(electrostatic conjugation)이 가능함을 나타내므로 나노플랫폼이 생체 내를 순환하는 과정에서 D가 원하지 않은 부위에서 방출되는 것을 피할 수 있다.In addition, as a result of confirming the stability of the loaded doxorubicin (D) by reacting BP-DcF@sPL with mouse serum, a significant decrease in doxorubicin (D) (ie, non-specific release of doxorubicin) could not be confirmed (FIG. 7 ), Since it indicates that electrostatic conjugation of black phosphorus nanosheets (BP) and doxorubicin (D) is possible, it is possible to avoid D from being released from an undesired site while the nanoplatform is circulating in vivo.

2. 세포 독성(2. Cytotoxicity ( cytotoxiccytotoxic effects) effects)

HCT116, HT29, 및 MC-38 세포에 대한 BP-DcF@sPL 나노플랫폼(0 내지 20 ㎍/㎖)의 세포독성 효과는 NIR 조사 및 비조사 조건에서 MTT 분석으로 확인하였고, BP-cF(NIR 조사 및 비조사) 처리군 및 D 단독 처리군의 세포 독성과 비교하였다(도 8의 A 내지 C). BP-cF(NIR 비조사) 처리군 및 D 단독 처리군의 세포 독성 결과는 D를 로딩하기 전의 BP-cF가 생체적합성(biocompatible)임을 나타낸다. NIR 조사에 의한 BP-cF의 세포 독성 증가는 BP의 본질적인 광치료 효능(phototherapeutic efficacy)을 뒷받침한다.The cytotoxic effect of the BP-DcF@sPL nanoplatform (0-20 μg/ml) on HCT116, HT29, and MC-38 cells was confirmed by MTT analysis under NIR irradiation and non-irradiation conditions, and BP-cF (NIR irradiation) And non-irradiation) compared to the cytotoxicity of the treatment group and the D alone treatment group (A to C in FIG. 8). Cytotoxicity results of the BP-cF (NIR irradiated) treatment group and the D alone treatment group indicate that the BP-cF prior to loading D is biocompatible. The increased cytotoxicity of BP-cF by NIR irradiation supports the intrinsic phototherapeutic efficacy of BP.

또한, BP-cF가 생체적합성을 나타내더라도 BP-DcF@sPL 나노플랫폼(NIR 비조사) 처리군의 세포 독성은 모든 세포주에서 D 단독 처리군의 세포 독성보다 높은 수준이었다(도 8의 A 내지 C). 이 결과는 F-매개 세포내 흡수가 D 단독의 그것보다 크기 때문인 것으로 추측되며, D의 표적화된 세포내 전달은 더 큰 세포독성(10 ㎍/㎖ 농도에서 50% 이상의 세포 사멸)을 유도한다. BP-DcF@sPL을 처리한 세포에 NIR을 조사한 결과, 광열 효과에 의해 유발된 D의 방출 및 ROS 생성의 증가로 인해 5 ㎍/㎖ 처리 농도에서도 60% 이상의 세포가 사멸하였다.In addition, even if BP-cF showed biocompatibility, the cytotoxicity of the BP-DcF@sPL nanoplatform (NIR irradiated) treatment group was higher than that of the D alone treatment group in all cell lines (A to C in FIGS. 8A to 8C). ). This result is presumed to be because F-mediated intracellular uptake is greater than that of D alone, and targeted intracellular delivery of D leads to greater cytotoxicity (more than 50% cell death at 10 μg/mL concentration). As a result of NIR irradiation on the cells treated with BP-DcF@sPL, more than 60% of cells were killed even at a concentration of 5 μg/ml due to the release of D and ROS production caused by the photothermal effect.

BP-DcF@sPL이 세포 내로 흡수되는 것에 F-전처리가 미치는 영향은 세포내 D의 형광을 CLSM으로 확인였다. F-전처리 세포에서는 F-수용체 포화에 의해 BP-DcF@sPL 흡수가 저해되어 D 형광이 감소(attenuation)하였고, 이는 F-매개 D의 표적화를 뒷받침한다(도 9의 A). 또한, HCT116, HT29 및 MC-38 세포는 모두 F-수용체를 발현하고, 가장 많이 발현하는 MC-38 세포는 HCT116, HT29 세포와 비교하여 BP-DcF@sPL을 더 많이 흡수하였다(도 9의 A). 이 결과는 유세포 분석기로 정량적으로 확인하였다(도 9의 B). 상기 결과는 F가 BP-DcF@sPL 나노플랫폼에 세포내 흡수를 위한 표적성을 부여하는 것을 의미한다.The effect of F-pretreatment on the absorption of BP-DcF@sPL into cells was confirmed by fluorescence of intracellular D by CLSM. In F-pretreated cells, absorption of BP-DcF@sPL was inhibited by F-receptor saturation, resulting in decreased D fluorescence (attenuation), which supports the targeting of F-mediated D (FIG. 9A). In addition, HCT116, HT29 and MC-38 cells all express F-receptors, and the most expressed MC-38 cells absorbed more BP-DcF@sPL compared to HCT116, HT29 cells (A in FIG. 9). ). This result was quantitatively confirmed by a flow cytometer (Fig. 9B). The results indicate that F imparts a target for intracellular uptake to the BP-DcF@sPL nanoplatform.

3. BP-DcF@sPL의 세포사멸 효과3. Cell death effect of BP-DcF@sPL

ROS 생성에 대한 NIR 조사의 효과는 MC-38 세포에 대한 DCFDA 분석으로 확인하였다. NIR을 조사하지 않는 경우(without NIR) F-전처리 유무와 무관하게 BP-Dc 처리군과 BP-DcF@sPL 처리군에서 ROS 수준에는 유의한 차이가 없었다(도 7의 A 좌측). 상기 두 처리군의 ROS 수준은 D 처리군보다 낮았고, NIR 조사에 의해 ROS 수준은 유의하게 증가하였다. 특히, NIR 조사는 BP-DcF@sPL 나노플랫폼의 ROS 생성을 유의하게 촉진하였다(도 7의 A 우측). F-전처리 실험군의 경우 F 수용체가 포화되어 BP-DcF@sPL의 세포내 흡수가 차단되므로 F-미포함 나노플랫폼인 BP-Dc와 유사한 ROS 생성 수준을 나타냈다(도 7의 A 우측). NIR 조사에 의한 BP-DcF@sPL의 상승적인(synergistic) 세포사멸 효과는 라이브(녹색 형광)/데드(적색 형광) 분석에 의해 추가로 확인하였다. F-미포함 (BP-Dc) 및 F-전처리(엽산 수용체-포화) 실험군은 BP-Dc 및 BP-DcF@sPL의 낮은 세포내 흡수, D 방출 수용체(efflux receptor)의 활성화로 인해 세포사멸(apoptotic cell death)을 유의미하게 유도하지 않았다. 반면, BP-DcF@sPL 처리군에 NIR을 조사한 경우 세포사멸이 현저하게 일어나 적색 형광을 확인할 수 있었다(도 10의 B).The effect of NIR irradiation on ROS production was confirmed by DCFDA analysis on MC-38 cells. When NIR was not examined (without NIR), there was no significant difference in ROS level in the BP-Dc-treated group and the BP-DcF@sPL-treated group, with or without F-pretreatment (left side in FIG. 7 ). The ROS level of the two treatment groups was lower than that of the D treatment group, and the ROS level was significantly increased by NIR irradiation. In particular, NIR irradiation significantly promoted ROS generation of the BP-DcF@sPL nanoplatform (right side in FIG. 7A ). In the case of the F-pretreatment experiment group, since the F receptor was saturated and the intracellular uptake of BP-DcF@sPL was blocked, the level of ROS generation similar to that of the F-free nanoplatform BP-Dc was shown (right side in FIG. 7A ). The synergistic apoptosis effect of BP-DcF@sPL by NIR irradiation was further confirmed by live (green fluorescence)/dead (red fluorescence) analysis. F-free (BP-Dc) and F-pretreatment (folic acid receptor-saturated) experimental groups showed apoptosis due to low intracellular uptake of BP-Dc and BP-DcF@sPL, and activation of D efflux receptor. cell death). On the other hand, when NIR was irradiated to the BP-DcF@sPL treatment group, apoptosis occurred remarkably and red fluorescence could be confirmed (FIG. 10B ).

사멸되는 세포의 비율은 MC-38 세포에서 NIR 비조사 및 조사 조건으로 아넥신V/PI 이중 염색 키트를 사용하여 유세포 분석기로 정량하였다. NIR을 조사하지 않은 BP-Dc 처리군에서 초기(6.06%) 및 후기(9.50%)의 사멸 세포 비율은 F와 sPL을 부가함으로써 각각 11.60% 및 14.70%로 증가하였다. 또한, 상기 증가 효과는 NIR 조사에 의해서 각각 33.40% 및 51.50%까지 추가로 상승하였으며, NIR 조사가 세포사멸을 촉진함을 의미한다. F-전처리 실험군에서는 NIR 조사에도 불구하고 세포사멸이 각각 14.10% 및 28.30%로 감소하였다(도 10의 C). 이는 F 및 NIR을 부가함으로써 BP 나노플랫폼의 세포 독성 능력이 향상되는 것을 의미한다.The percentage of dead cells was quantified by flow cytometry using the Annexin V/PI double staining kit as NIR irradiated and irradiated conditions in MC-38 cells. In the BP-Dc treated group not irradiated with NIR, the proportion of early (6.06%) and late (9.50%) dead cells increased to 11.60% and 14.70%, respectively, by adding F and sPL. In addition, the increase effect was further increased to 33.40% and 51.50%, respectively, by NIR irradiation, which means that NIR irradiation promotes apoptosis. In the F-treatment group, cell death was reduced to 14.10% and 28.30%, respectively, despite NIR irradiation (Fig. 10C). This means that the cytotoxic ability of the BP nanoplatform is improved by adding F and NIR.

BP-DcF@sPL 나노플랫폼의 PL 유전자 침묵 효과를 확인한 결과, HCT116, HT29, and MC-38 세포 모두에서 sPL의 로딩량에 의존적으로 PL 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 BP-DcF@sPL 처리군은 BP-DcF 및 BP-DcF+sPL(sPL 혼합) 처리군과 비교하여 현저하게 감소된 PL 발현을 나타내었다(도 11의 A). BP-DcF@sPL에 의한 PL 발현 감소 수준은 상업용 트랜스펙션 용액 (Dharmafect®sPL) 처리군과 유사하였다(도 11의 B).As a result of confirming the PL gene silencing effect of the BP-DcF@sPL nanoplatform, it was confirmed that PL expression decreases depending on the loading amount of sPL in all HCT116, HT29, and MC-38 cells. In particular, the BP-DcF@sPL treatment group showed significantly reduced PL expression compared to the BP-DcF and BP-DcF+sPL (sPL mixed) treatment groups (FIG. 11A). The level of PL expression reduction by BP-DcF@sPL was similar to the commercial transfection solution (Dharmafect®sPL) treatment group (FIG. 11B ).

종양 미세환경에 존재하는 종양-침윤성 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)와 다른 세포 사이에서 BP-DcF@sPL의 경쟁적 세포 흡수를 측정하기 위해, 트랜스웰을 사용하여 MC-38 세포를 CD8+ T 세포, 수지상 세포 또는 RAW264.7 세포(대식세포)와 공동배양(coculture)하였다(도 12의 A). 그 결과, MC-38 세포에서만 BP-DcF@s가 BP-Dc@s(F 미포함)보다 유의하게 많이 흡수되는 것을 확인할 수 있었다(도 12의 B). 반면에 CD8+ T 세포에서는 BP-DcF@s 및 BP-Dc@s의 흡수에 서로 유의미한 차이가 없었으며, BP-DcF@s의 종양세포 특이적 내재화 특성을 확인할 수 있었다(도 12의 C). 수지상 세포 및 RAW264.7 세포에서는 BP-DcF@s와 BP-Dc@s 모두 거의 흡수되지 않았다(도 12의 D 및 E).To measure the competitive cellular uptake of BP-DcF@sPL between tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) and other cells present in the tumor microenvironment, MC-38 cells are transfected with CD8 + T using transwells. The cells were co-cultured with dendritic cells or RAW264.7 cells (macrophages) (FIG. 12A). As a result, it was confirmed that BP-DcF@s is absorbed significantly more than BP-DcF@s (without F) in MC-38 cells only (FIG. 12B ). On the other hand, in CD8 + T cells, there was no significant difference in absorption of BP-DcF@s and BP-Dc@s, and it was possible to confirm tumor cell specific internalization characteristics of BP-DcF@s (Fig. 12C). . In dendritic cells and RAW264.7 cells, both BP-DcF@s and BP-Dc@s were hardly absorbed (D and E in FIG. 12).

4. BP-DcF@sPL의 4. BP-DcF@sPL 생체내In vivo 효과 effect

용혈 효과 확인 결과, BP(흑린 나노시트) 및 BP-DcF@sPL 모두 200 ㎍/㎖ 농도에서도 현저한 용혈 효과(<5 %)가 없음을 알 수 있었다(도 13). BP의 음성 표면 전하는 흑린과 적혈구의 응집을 제한하여 헤모글로빈의 방출을 감소시키는 반면, BP-DcF@sPL의 c는 적혈구와의 상호 작용을 보호할 수 있다. 이러한 결과는 BP와 BP-DcF@sPL의 생체적합성 및 전신 순환 용도로의 사용가능성을 암시한다.As a result of confirming the hemolytic effect, it was found that there was no significant hemolytic effect (<5%) even at a concentration of 200 µg/ml for both BP (black phosphorus nanosheet) and BP-DcF@sPL (FIG. 13). The negative surface charge of BP reduces the release of hemoglobin by limiting the aggregation of black and red blood cells, while c of BP-DcF@sPL can protect the interaction with red blood cells. These results suggest the biocompatibility of BP and BP-DcF@sPL and their use for systemic circulation.

BP-Dc@s의 생체내 분포는 시아닌 5.5(Cy5.5)와 접합된 BP-DcF@s 또는 BP-DcF@s를 MC-38 종양-보유 마우스에 정맥 주사(intravenous injection)하여 확인하였다. BP-DcF@s를 투여한 경우 F-매개 종양세포 표적화로 인해 주사 12시간 및 24시간 후에 종양 부위에서 형광 신호가 2배 이상 증가하였다(도 14의 A 및 B). 종양과 주요 장기에서 형광 강도의 차이는 F의 부가로 인한 BP-DcF@s의 종양-선택적 축적을 뒷받침했다(도 14의 C). 또한, BP-DcF@sPL 투여에 의한 D의 생체내 분포를 확인한 결과, D 단독 투여와 비교하여 종양 조직에 선택적으로 D가 축적되는 것을 알 수 있었다(도 14의 D 및 E).In vivo distribution of BP-Dc@s was confirmed by intravenous injection of BP-DcF@s or BP-DcF@s conjugated with cyanine 5.5 (Cy5.5) into MC-38 tumor-bearing mice. When BP-DcF@s was administered, the fluorescence signal increased more than 2 fold at the tumor site 12 and 24 hours after injection due to F-mediated tumor cell targeting (A and B in Fig. 14). The difference in fluorescence intensity in tumors and major organs supported tumor-selective accumulation of BP-DcF@s due to the addition of F (FIG. 14C ). In addition, as a result of confirming the in vivo distribution of D by administration of BP-DcF@sPL, it was found that D was selectively accumulated in tumor tissues compared to D alone administration (D and E in FIG. 14).

종양-선택적 온도 상승은 주사 6시간 후에 NIR을 조사(808 ㎚, 1.5 W/㎠2, 5분)하는 동안 열 카메라로 측정하였다. NIR 조사에 의해 BP-DcF@s 투여군은 BP-Dc@s 투여군(41.3℃)에 비해 현저히 높은 최고 온도(53.9℃)를 나타내어 F의 표적 효과를 확인할 수 있었다(도 15의 A). 흥미롭게도, 단지 3분의 조사만으로도 BP-DcF@s 투여군은 온도가 50.2℃까지 상승하였으며(도 15의 B), BP가 생체내 모델에서도 고열(hyperthermia)을 생성하는 효과적인 광-변환 물질(photo-transducing base materials)임을 시사한다.Tumor-selective temperature rise was measured with a thermal camera during NIR irradiation (808 nm, 1.5 W/cm 2, 5 min) 6 hours after injection. By the NIR irradiation, the BP-DcF@s-administered group showed a significantly higher peak temperature (53.9°C) compared to the BP-Dc@s-administered group (41.3°C), thereby confirming the target effect of F (FIG. 15A). Interestingly, the BP-DcF@s dose group was elevated to 50.2° C. (B in FIG. 15 ), and an effective light-converting material that produced BP-hyperthermia even in an in vivo model (photo) -transducing base materials).

6. BP-DcF@sPL의 면역 반응 유도 효과6. Effect of BP-DcF@sPL inducing an immune response

NIR 조사 및 PL 발현 차단이 종양 조직에 미치는 영향을 확인하기 위해, MC-38 종양 보유 마우스에 NIR 조사(808 ㎚, 1.5 W/㎠, 5분, 주사 후 8시간) 및 비조사 조건으로 BP-DcF 및 BP-DcF@sPL을 주사하였다. 비교군으로는 각각 PBS, NIR, 및 BP-DcF+aPL(NIR 조사) 처리 조건을 사용하였다.To confirm the effect of NIR irradiation and PL expression blocking on tumor tissue, MC-38 tumor-bearing mice were irradiated with NIR (808 nm, 1.5 W/cm 2, 5 minutes, 8 hours after injection) and BP- under non-irradiated conditions. DcF and BP-DcF@sPL were injected. PBS, NIR, and BP-DcF+aPL (NIR irradiation) treatment conditions were used as a comparison group, respectively.

실험 결과, NIR을 조사한 BP-DcF@sPL 투여군은 다른 실험군(NIR 조사 또는 비조사한 BP-DcF 투여군 및 NIR 비조사 BP-DcF@sPL 투여군)과 비교하여 CD11c+ CD86+ 성숙 수지상세포의 비율(~20%)이 높았다. 상기 결과는 sPL(BP-DcF vs. BP-DcF@sPL)의 효과를 입증한다. 그러나 sPL의 효과는 sPL이 aPL(PL 항체)로 대체되고, NIR 조사에 의해 보상될 수있다(즉, BP-DcF+aPL 투여군은 BP-DcF@sPL 투여군과 성숙한 수지상세포의 비율이 유사함) (도 16의 A). CD8+ CD69+ T 세포 비율을 확인한 실험에서도 유사한 결과가 나타났다. 특히, NIR을 조사한 BP-DcF@sPL 투여군에서 약 37%의 활성화된 T 세포가 발견되었으며, 이 결과는 NIR을 조사한 BP-DcF+aPL 투여군의 결과와 유사하다(도 16의 B). 이러한 경향은 ELISA로 측정한 TNF-α의 종양내 농도(intratumoral concentration)(도 16의 C) 및 DCFDA 프로브를 사용한 생체내 ROS 생성 측정 결과(도 17의 A 및 B)에서도 확인할 수 있다.As a result of the experiment, the ratio of CD11c + CD86 + mature dendritic cells compared to other experimental groups (NIR irradiated or non-irradiated BP-DcF administered group and NIR irradiated BP-DcF@sPL administered group) irradiated with NIR (~ 20%). The results demonstrate the effect of sPL (BP-DcF vs. BP-DcF@sPL). However, the effect of sPL is that sPL is replaced by aPL (PL antibody) and can be compensated by NIR irradiation (i.e., the BP-DcF+aPL administration group has a similar proportion of BP-DcF@sPL administration group and mature dendritic cells). (Fig. 16A). Similar results were obtained in the experiments confirming the ratio of CD8 + CD69 + T cells. In particular, about 37% of activated T cells were found in the BP-DcF@sPL-administered group irradiated with NIR, and the results are similar to those of the BP-DcF+aPL-administered group irradiated with NIR (Fig. 16B). This trend can also be confirmed by the intratumoral concentration of TNF-α (FIG. 16C) measured by ELISA and the in vivo ROS production measurement result (A and B of FIG. 17) using the DCFDA probe.

BP-DcF@sPL 처리군의 유전자 침묵 효과(즉, PL 발현 감소에 의한 종양 미세환경으로의 CD8+ T 세포 침윤 촉진)는 다른 처리군보다 우수하였다. 반면 NIR 조사는 BP-DcF@sPL 처리군의 유전자 침묵 효과를 유의하게 증가시키지 않았으며, 다른 처리군들은 대조군과 유사한 수준의 침묵 효과를 나타냈다(도 18의 A). 이는 유전자 침묵 효과가 sPL의 캡슐화(sPL encapsulation)에 더 많이 의존적임을 의미한다. BP-DcF@sPL 또는 BP-DcF+aPL 처리군의 경우, CD8+ T 세포에서 IFN-γ(CTLs의 활성화 및 침윤에 필수적 요소)의 발현 수준은 NIR을 조사하지 않아도 다른 처리군보다 우수하였다(도 18의 B). 이 결과는 CD8+ T 세포가 종양 미세환경으로 보다 잘 침투하기 위해서는 PL 발현 억제가 중요한 매개 변수임을 시사한다.The gene silencing effect of the BP-DcF@sPL treatment group (ie, promoting CD8 + T cell infiltration into the tumor microenvironment by reducing PL expression) was superior to that of the other treatment groups. On the other hand, NIR irradiation did not significantly increase the gene silencing effect of the BP-DcF@sPL treatment group, and the other treatment groups showed a similar level of silencing effect to the control group (FIG. 18A). This means that the gene silencing effect is more dependent on sPL encapsulation. In the case of the BP-DcF@sPL or BP-DcF+aPL treatment group, the expression level of IFN-γ (essential for activation and infiltration of CTLs) in CD8 + T cells was superior to other treatment groups without NIR irradiation ( Fig. 18B). These results suggest that inhibition of PL expression is an important parameter for better CD8 + T cell penetration into the tumor microenvironment.

생체내 종양세포의 괴사(necrosis) 및 세포사멸(apoptosis) 비율은 아넥신 V/PI 키트로 확인하였다. NIR을 조사한 경우, BP-DcF 및 BP-DcF@sPL 처리군에서 세포괴사 수준(1사분면)은 고열에 의한 직접적 세포 괴사로 인해 44.1%에서 52.8%까지 상승하였고, 세포사멸 수준(2사분면)은 28.3%에서 36.3%로 증가하여 모두 유의미한 결과를 보였다. BP-DcF+aPL 처리군 또한 BP-DcF@sPL 처리군과 유사한 결과를 보였다. CD8+ T 세포에 의해 유도된 면역-항종양 효과의 상승 및 종양세포의 PL 발현 감소에 의하여 BP-DcF@sPL 처리군은 BP-DcF 처리군보다 높은 세포사멸 수준을 나타내었다(도 19). Necrosis and apoptosis ratios of tumor cells in vivo were confirmed with the Annexin V/PI kit. When NIR was examined, the level of cell necrosis (quadrant 1) in the BP-DcF and BP-DcF@sPL treated groups rose from 44.1% to 52.8% due to direct cell necrosis due to high fever, and the cell death level (quadrant 2) It increased from 28.3% to 36.3%, all showing significant results. The BP-DcF+aPL treatment group also showed similar results to the BP-DcF@sPL treatment group. The BP-DcF@sPL treatment group showed higher apoptosis level than the BP-DcF treatment group by increasing the immune-antitumor effect induced by CD8 + T cells and decreasing PL expression of tumor cells (FIG. 19 ).

7. BP-DcF@sPL의 전신 치료 효과(systemic therapeutic effects)7. Systemic therapeutic effects of BP-DcF@sPL

BP-DcF@sPL 투여에 의한 전신 치료 효과는 MC-38 종양이 이식(xenograft)된 C57BL/6 마우스 모델에서 확인하였다. NIR을 조사한 BP-DcF@sPL(NIR) 및 BP-DcF+aPL(NIR) 투여군은 대조군(PBS 투여군, D 단독 투여군 및 NIR 조사군)을 포함한 다른 실험군과 비교하여 현저한 체중 감소 없이 종양 성장을 각각 82% 및 80%까지 유의미하게 감소시켰다(도 20의 A, B 및 D). 따라서, NIR을 조사한 BP-DcF@sPL(90%) 및 BP-DcF+aPL(80%) 투여군은 실험 80일차 후에도 마우스의 생존율을 각각 90% 및 80%까지 유지시켰다(도 20의 C). 이 결과를 통해 본 발명의 BP-DcF@sPL 나노플랫폼이 지속적인 항종양 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.The effect of systemic treatment by administration of BP-DcF@sPL was confirmed in a C57BL/6 mouse model in which MC-38 tumors were transplanted (xenograft). The BIR-irradiated BP-DcF@sPL (NIR) and BP-DcF+aPL (NIR) administration groups showed tumor growth without significant weight loss compared to other experimental groups, including the control group (PBS administration group, D alone administration group, and NIR investigation group). Significantly reduced by 82% and 80% (A, B and D in Figure 20). Therefore, the BIR-irradiated BP-DcF@sPL (90%) and BP-DcF+aPL (80%) administration groups maintained the survival rate of mice up to 90% and 80%, respectively, after day 80 of the experiment (FIG. 20C). Through these results, it was confirmed that the BP-DcF@sPL nanoplatform of the present invention has a persistent anti-tumor activity.

종양 조직의 조직병리학적 및 면역조직 화학적 분석 결과, NIR을 조사한 BP-DcF@sPL(NIR) 및 BP-DcF+aPL(NIR) 투여군에서는 종양 조직 내에 CD4+ 또는 CD8+ T 세포가 현저하게 축적되는 것을 확인하였다(도 21의 첫번째, 두번째 패널). 반면, 종양 세포 증식을 나타내는 Ki-67 또는 혈관 신생을 나타내는 CD31의 발현 수준은 상기 투여군에서 감소하였다(도 21의 세번째, 네번째 패널). 이러한 결과는 병용 치료를 통해 종양 조직의 괴사를 더 많이 유도할 수 있음을 의미한다. 분석 결과는 표 1에 기재하였으며, 수치는 6개 종양 조직에서 측정한 값을 평균±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다.As a result of histopathological and immunohistochemical analysis of tumor tissue, CD4 + or CD8 + T cells were significantly accumulated in tumor tissue in the BP-DcF@sPL (NIR) and BP-DcF+aPL (NIR) groups examined by NIR. It was confirmed (first and second panels in Fig. 21). On the other hand, the expression level of Ki-67 indicating tumor cell proliferation or CD31 indicating angiogenesis was decreased in the administration group (third and fourth panels in FIG. 21). These results indicate that the combination treatment can induce more necrosis of tumor tissue. The results of the analysis are listed in Table 1, and the values are expressed as the mean±standard deviation (SD) of values measured in 6 tumor tissues.

Figure pat00003
Figure pat00003

대조군(G1): PBS 투여Control group (G1): PBS administration

처리군: G2=NIR 조사군; G3=D 단독 투여군; G4=BP-DcF 투여군(NIR 비조사); G5=BP-DcF 투여군(NIR 조사); G6=BP-DcF@sPL 투여군(NIR 비조사) 및; G7=BPDcF@sPL 투여군(NIR 조사); 및 G8=BP-DCF+aPL 투여군(NIR 조사)Treatment group: G2=NIR irradiation group; G3=D alone administration group; G4=BP-DcF administration group (NIR irradiated); G5=BP-DcF administration group (NIR investigation); G6=BP-DcF@sPL administration group (NIR irradiated) and; G7=BPDcF@sPL administration group (NIR investigation); And G8=BP-DCF+aPL administration group (NIR investigation)

a 및 b는 MW 검정(Mann-Whitney test)에서 G1과 비교하여 각각 p<0.01(a) 및 p<0.05(b); c 및 d는 MW 검정에서 G2와 비교하여 각각 p<0.01(c) 및 p<0.05(d); e는 MW 검정에서 G3과 비교하여 p<0.01; f는 MW 검정에서 G4와 비교하여 p<0.01; g 및 h는 MW 검정에서 G5와 비교하여 각각 p<0.01(g) 및 p<0.05(h); i는 MW 검정에서 G6과 비교하여 p<0.01; 및 j는 MW 검정에서 G7과 비교하여 p<0.01을 의미함 a and b are p <0.01( a ) and p <0.05( b ), respectively, compared to G1 in the MW test (Mann-Whitney test); c and d are p <0.01( c ) and p <0.05( d ), respectively, compared to G2 in the MW assay; e is p <0.01 compared to G3 in the MW test; f is p <0.01 compared to G4 in the MW test; g and h are p <0.01( g ) and p <0.05( h ), respectively, compared to G5 in the MW assay; i is p <0.01 compared to G6 in the MW assay; And j means p <0.01 compared to G7 in MW test

또한, 각 투여군에서 심장, 간, 비장, 폐 및 신장을 헤마토자일린 &에오신으로 염색한 결과, BPDcF@sPL 투여와 NIR을 조사하는 병용 요법이 상기 장기에 큰 피해를 주지 않는 것을 확인하였으며(도 22), 이는 상기 병용 요법이 생물학적으로 안전함(biosafety)을 의미한다.In addition, as a result of staining the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys with hematoxylin & eosin in each administration group, it was confirmed that the combination therapy of BPDcF@sPL administration and NIR irradiation did not significantly damage the organs ( 22), which means that the combination therapy is biosafety.

BP-DcF@sPL이 다른 종류의 직장암(colorectal cancer)에 적용될 수 있는지 여부는 HCT116 종양-보유 Balb/c 누드 마우스에서 확인하였다. NIR을 조사한 BP-DcF@sPL(NIR) 및 BP-DcF(NIR) 투여군에서는 NIR을 조사하지 않는 실험군보다 종양 성장이 약 1.5배 감소하였다(도 23의 A; 각 그룹별로 N=6, ** p<0.01, *** p<0.001). 누드 마우스에는 기능성 T 세포가 존재하지 않기 때문에 BP-DcF@sPL 및 BP-DcF 투여군 사이에서 항종양 효과는 유의한 차이가 없었다. 투여 과정에서 체중은 큰 변화가 없었고(도 23의 B), NIR을 조사한 BP-DcF@sPL (NIR) 및 BP-DcF(NIR) 투여군은 투여 70일 후에도 누드 마우스의 생존율을 증진시켰다(도 23의 C).Whether BP-DcF@sPL can be applied to other types of colorectal cancer was confirmed in HCT116 tumor-bearing Balb/c nude mice. In the BP-DcF@sPL(NIR) and BP-DcF(NIR)-administered groups irradiated with NIR, tumor growth decreased by about 1.5-fold compared to the experimental group not irradiated with NIR (A in FIG. 23; N=6, ** for each group) p <0.01, *** p <0.001). There was no significant difference in anti-tumor effect between the BP-DcF@sPL and BP-DcF-administered groups because functional T cells were not present in nude mice. There was no significant change in body weight during the administration (B in Fig. 23), and the BP-DcF@sPL (NIR) and BP-DcF (NIR) groups irradiated with NIR improved the survival rate of nude mice 70 days after administration (Fig. 23). C).

BP-DcF@sPL의 항암 효과는 HCT116 유래 종양을 갖는 Balb/c 누드 마우스(면역력이 무방비(immunocompromised) 상태)보다 MC-38 유래 종양을 갖는 C57BL/6 마우스(면역력이 활성(immunocompetent) 상태) 모델에서 더 현저하게 나타났다. 이 결과는 본 발명의 BP-DcF@sPL 나노플랫폼이 암 치료를 위한 치료법으로 다양하게 활용될 수 있음을 의미한다.The anti-cancer effect of BP-DcF@sPL is C57BL/6 mice (immunocompetent state) with MC-38 derived tumors than Balb/c nude mice with HCT116 derived tumor (immunocompromised state) model Appeared more prominently. This result means that the BP-DcF@sPL nanoplatform of the present invention can be used in various ways as a treatment for cancer.

본 발명은 흑린 나노시트 제조시 독성 화합물을 사용하지 않으므로 흑린 나노시트에 DcF 및 sPL을 직접 로딩하여 BP-DcF@sPL 나노플랫폼을 제조할 수 있다. BP-DcF@sPL 나노플랫폼에서 흑린 나노시트(BP)는 광열 활성으로 인하여 NIR 조사시 고열 효과 및 약물을 방출할 수 있다. 또한, cF는 나노플랫폼 제작시 정전 인력으로 인해 sPL의 결합을 용이하게 하고, 생체적용 (bioapplication)시 엽산 수용체 표적화을 통해 종양세포 특이적으로 나노플랫폼이 축적되게 한다. BP-DcF@sPL 나노플랫폼은 화학 (세포사멸/세포괴사)-광치료(국소적 열 및 ROS 생성) 효과를 유도할 뿐만 아니라 PL 신호대사경로-조절 면역 내성(PL pathway-regulated immune tolerance) 및 CD8+ T 세포의 억제를 방해한다(IFN-γ 및 TNF-α로 인한 암세포 사멸 효과를 유도함). NIR 조사에 의한 수지상세포의 성숙은 종양 미세환경으로 T 세포의 침투를 촉진시켜 암세포 사멸 효과를 더욱 강화시키며, 이는 본 발명의 나노플랫폼에 NIR을 조사하면 면역 시스템의 집단 활성화를 적절히 유도할 수 있음을 의미한다.Since the present invention does not use a toxic compound in the preparation of the blackline nanosheet, it is possible to manufacture the BP-DcF@sPL nanoplatform by directly loading DcF and sPL on the blackline nanosheet. In the BP-DcF@sPL nanoplatform, black phosphorus nanosheet (BP) can release a high fever effect and drug upon NIR irradiation due to photothermal activity. In addition, cF facilitates the binding of sPL due to electrostatic attraction when manufacturing the nanoplatform, and allows the accumulation of nanoplatform specifically for tumor cells through folic acid receptor targeting during bioapplication. BP-DcF@sPL nanoplatform not only induces chemo (apoptotic/cell necrosis)-phototherapy (local heat and ROS production) effects, but also PL pathway-regulated immune tolerance and CD8 + Interferes with the suppression of T cells (induces cancer cell killing effects due to IFN-γ and TNF-α). The maturation of dendritic cells by NIR irradiation further enhances the cancer cell killing effect by promoting the penetration of T cells into the tumor microenvironment, which can appropriately induce population activation of the immune system by irradiating NIR to the nanoplatform of the present invention. Means

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been focused on the preferred embodiments. Those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in terms of explanation, not limitation. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the equivalent range should be interpreted as being included in the present invention.

Claims (12)

흑린 나노시트(black phosphorus nanosheet);
링커와 엽산의 컨쥬게이트(conjugate); 및
링커에 흡착된 목적 약물과 표적 유전자용 siRNA를 포함하는 약물 전달체로서,
상기 링커는 흑린 나노시트의 표면에 결합하고, 정전기적 상호작용 (electrostatic interaction)에 의해 목적 약물과 표적 유전자용 siRNA를 흡착시키는 것인, 약물 전달체.
Black phosphorus nanosheets;
A linker and a folic acid conjugate; And
A drug delivery system comprising a target drug adsorbed on a linker and a siRNA for a target gene,
The linker binds to the surface of the blacklin nanosheet, and adsorbs the target drug and siRNA for the target gene by electrostatic interaction.
제1항에 있어서, 상기 약물 전달체는 크기가 10 내지 150 ㎚이고, 다분산지수는 0.05 내지 0.6인 것인, 약물 전달체.
The drug delivery system of claim 1, wherein the drug delivery system has a size of 10 to 150 nm and a polydispersity index of 0.05 to 0.6.
제1항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 흑린 나노시트의 무게 대비 1 내지 20% (w/w)로 포함되는 것인, 약물 전달체.
The method of claim 1, wherein the conjugate is contained in 1 to 20% (w/w) of the weight of the black phosphorus nanosheet, the drug delivery system.
제1항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 양전하를 갖는 것인, 약물 전달체.
The drug delivery system of claim 1, wherein the conjugate has a positive charge.
제1항에 있어서, 상기 링커는 키토산-폴리에틸렌 글리콜(chitosan-polyethylene glycol), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 피브리노겐 (fibrinogen), 실크 피브로인(silk fibroin), 카세인(casein), 엘라스틴 (elastin), 라미닌(laminin) 및 피브로넥틴(fibronectin)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약물 전달체.
The method of claim 1, wherein the linker is chitosan-polyethylene glycol (chitosan-polyethylene glycol), gelatin (gelatin), collagen (collagen), fibrinogen (fibrinogen), silk fibroin (silk fibroin), casein (casein), elastin (elastin) ), Laminin (laminin) and fibronectin (fibronectin) is selected from the group consisting of, drug delivery system.
제1항에 있어서, 상기 목적 약물은 흑린 나노시트와 1:0.2 내지 1:10의 질량비(mass ratio)로 포함되는 것인, 약물 전달체.
The drug delivery system of claim 1, wherein the target drug is contained in a mass ratio of 1:0.2 to 1:10 with black phosphorus nanosheets.
제1항에 있어서, 상기 표적 유전자는 종양 유전자(oncogene)인 것인, 약물 전달체.
The drug delivery system according to claim 1, wherein the target gene is an oncogene.
제7항에 있어서, 상기 표적 유전자는 프로그램된 세포사멸 리간드 1(programmed death ligand 1, PDL1), p53, 감마-시스(γ-sis), 표피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR), 섬유아세포 성장 인자 (fibroblast growth factor, FGF), 각질세포 성장 인자 (keratinocyte growth factor, KGF), erbB2/neu, ros, met, abl, src, yes, fyn, fgr, lyn, lck, hck, blk, csk, fps, fes, mas, gsp, gip, H-ras, K-ras, N-ras, mos, raf, A-raf1, B-raf, myc, jun, bcl, tls/fus 및 tel로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약물 전달체.
8. The method of claim 7, wherein the target gene is programmed apoptosis ligand 1 (programmed death ligand 1, PDL1), p53, gamma-cis (γ-sis), epidermal growth factor receptor (epidermal growth factor receptor, EGFR), fiber Fibroblast growth factor (FGF), keratinocyte growth factor (KGF), erbB2/neu, ros, met, abl, src, yes, fyn, fgr, lyn, lck, hck, blk, csk , fps, fes, mas, gsp, gip, H-ras, K-ras, N-ras, mos, raf, A-raf1, B-raf, myc, jun, bcl, tls/fus and tel The drug delivery system that is selected.
제1항에 있어서, 상기 목적 약물은 항암제인 것인, 약물전달체.
The drug delivery system of claim 1, wherein the target drug is an anti-cancer agent.
제9항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신(doxorubisin), 파클리탁셀(paclitaxel), 아지트로마이신(azithromycin), 에리트로마이신 (erythromycin), 빈블라스틴 (vinblastin), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아이다루비신 (idarubicin), 미톡산트론 (mitoxantron), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 약물 전달체.
The method according to claim 9, wherein the anticancer agent is doxorubisin, paclitaxel, azithromycin, erythromycin, vinblastin, bleomycin, dactinomycin. ), drug delivery vehicle selected from the group consisting of daunorubicin, idarubicin, mitoxantron, plicamycin, mitomycin and combinations thereof. .
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 약물 전달체를 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계; 및
상기 치료가 필요한 개체에 근적외선을 조사하는 단계를 포함하는, 목적 약물을 전달하는 방법.
Administering the drug delivery agent of any one of claims 1 to 10 to an individual in need of treatment; And
A method of delivering a target drug, comprising the step of irradiating near-infrared light to an individual in need of the treatment.
제11항에 있어서, 상기 약물 전달체는 독소루비신을 포함하는 것인, 목적 약물을 전달하는 방법.The method of claim 11, wherein the drug delivery system comprises doxorubicin.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115671314A (en) * 2022-11-16 2023-02-03 中南大学 Preparation method and application of anti-angiogenesis targeted black phosphorus nanosheet
KR20230046444A (en) * 2021-09-30 2023-04-06 숭실대학교산학협력단 Method for manufacturing electrorheological fluid using phosphorene
CN117122692A (en) * 2023-08-30 2023-11-28 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司 Targeting nano-carrier and preparation method and application thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. Adv Mater. 2017 Jan;29(1)
Adv.Mater, 29(1), 1-15, 2017.01. (2016.10.31.)* *
Advanced Materials, 29(5), 1-7, 2017 *
ChemCommun. 54(25), 3142-3145, 2018.03. (2018.03.12.)* *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230046444A (en) * 2021-09-30 2023-04-06 숭실대학교산학협력단 Method for manufacturing electrorheological fluid using phosphorene
CN115671314A (en) * 2022-11-16 2023-02-03 中南大学 Preparation method and application of anti-angiogenesis targeted black phosphorus nanosheet
CN117122692A (en) * 2023-08-30 2023-11-28 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司 Targeting nano-carrier and preparation method and application thereof
CN117122692B (en) * 2023-08-30 2024-04-05 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司 Targeting nano-carrier and preparation method and application thereof

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