KR20200064085A - 접합 부위를 갖는 t-세포 조절 다량체 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법 - Google Patents

접합 부위를 갖는 t-세포 조절 다량체 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법 Download PDF

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큐 바이오파마, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 동족 공동-면역조절 폴리펩타이드("Co-MOD")에 대해 감소된 결합 친화도를 나타내도록 선택될 수 있는 면역조절 폴리펩타이드("MOD") 및 에피토프로서 작용할 수 있는 분자, 예컨대 에피토프 펩타이드를 공유적으로 부착시키기 위한 위치를 포함하는 T-세포 조절 다량체 폴리펩타이드("T-세포-MMP")를 제공한다. 일단 에피토프 분자가 부착되면, 얻어진 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 IL-2R에 대한 감소된 결합 친화도를 나타내는 면역조절 펩타이드, 예컨대 IL-2 또는 IL-2 변이체를 에피토프 선택적/특이적 방식으로 T-세포에 전달함으로써 T-세포의 활성을 조절하는 데, 그리고 그에 따라, 개체에서의 면역 반응을 조절하는 데 유용하다.

Description

컨쥬게이션 부위를 가진 T-세포 조절 멀티머 폴리펩타이드 및 그것의 사용 방법
본 출원은 2017년 9월 7일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/555,559호, 2017년 12월 21일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/609,082호 및 2018년 1월 9일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/615,402호의 유익을 주장한다.
본 출원은 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되고, 종이 복사본과 2018년 9월 3일자로 생성되고 용량이 196,180 바이트인 파일명 "123640-8001WO00_seqlist.txt"로 이루어진 컴퓨터 판독 가능한 형태(computer readable form: CRF)로서 제공되고, 본 명세서에 전체가 참조에 의해 포함되는, 서열목록을 포함한다.
적응 면역 반응은 주조직 적합 복합체(major histocompatibility complex: MHC; 또한 인간에서 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen: HLA) 복합체로서 지칭됨)에 의해 항원 제시 세포(antigen presenting cell: APC) 표면 상에 비공유적으로 제시되는 작은 펩타이드 항원과, T-세포 표면 상에 존재하는 T-세포 수용체(T-cell receptor: TCR)의 맞물림을 수반한다. 이 맞물림은 면역계의 표적화 메커니즘을 나타내고, T-세포 조절(활성화 또는 저해)을 위한 필수 분자 상호작용 및 효과기 기능이다. 에피토프-특이적 세포 표적화 후에, 표적화된 T-세포는 APC 상에서 발견되는 공자극 단백질과 T-세포 상의 상대 공자극 단백질의 맞물림을 통해 활성화된다. 신호는 둘 다 - T-세포 공자극 단백질과 APC 공자극 단백질의 에피토프/TCR 결합 및 맞물림 - T-세포 특이성 및 활성화 또는 저해를 유도하는 데 필요하다. TCR은 주어진 에피토프에 대해 특이적이지만; 그러나, 공자극 단백질은 에피토프 특이적이지 않으며, 대신에 모든 T-세포 상에서 또는 거대 T-세포 서브세트 상에서 일반적으로 발현된다.
본 개시내용은 일 실시형태에서 MHC 수용체의 일부 및 적어도 하나의 면역조절 폴리펩타이드(또한 본 명세서에서 "MOD 폴리펩타이드" 또는 단순히, "MOD")를 포함하는 T-세포 조절 다량체 폴리펩타이드("T-세포-MMP" 또는 다중 "T-세포-MMP")를 제공한다. T-세포-MMP에 존재하는 MOD 중 임의의 하나 이상은 야생형이거나, 세포(예를 들어, T-세포 표면) 결합 상대/수용체(일반적으로 "Co-MOD"로서 지칭됨)에 대해 감소된 결합 친화도를 나타내는 변이체일 수 있다. T-세포-MMP는 표적 에피토프를 포함하는 분자(예를 들어, 펩타이드 또는 비펩타이드, 예컨대 탄수화물)가 T-세포 수용체를 보유하는 세포에 대한 제시를 위해 공유결합될 수 있는 적어도 하나의 화학적 접합 부위를 포함한다. 에피토프를 연결하기 위한 화학적 접합 부위를 포함하는 T-세포-MMP는 제시된 에피토프에 특이적인 T-세포의 활성을 조절할 수 있는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 빠르게 제조하는 데 유용하고, 따라서, 해당 T-세포를 수반하는 개체에서의 면역 반응을 조절하는 데 유용하다. T-세포-MMP 및 이들의 에피토프 접합체는 추가적으로 특정 표적 에피토프와의 공동 전달을 위해 생활성 물질(페이로드(payload)), 예컨대 화학치료제의 접합을 위한 부위를 포함할 수 있다. 이렇게 해서, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 면역조절 펩타이드(예를 들어, IL-2, 4-1BBL, FasL, TGFβ, CD70, CD80, CD86, OX40L, ICOS-L, ICAM, JAG1 또는 이들의 단편, 또는 이의 변경된(돌연변이된) 변이체) 및/또는 페이로드(예를 들어, 화학치료제)를 세포에 에피토프 특이적 방식으로 전달하는수단으로 고려될 수 있다.
본 명세서에 기재된 실시형태에서, T-세포-MMP는 세포내 수송 동안 T-세포-MMP의 안정화 및/또는 결합된 에피토프 펩타이드의 부재 하에서조차 다량체 폴리펩타이드를 발현시키는 세포에 의한 다음의 분비를 돕는 변형을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 실시형태에서, T-세포-MMP는 MHC-I α1 나선의 카복실 말단 및 MHC-I α2-1 나선의 아미노 말단을 연결하는 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 해당 나선의 표시 영역을 연결하는 이황화결합의 형성을 초래하는 시스테인 잔기의 삽입을 포함한다. 예를 들어, MHC-I의 아미노산 84(Y84C 치환) 및 139(A139C 치환), 또는 나선을 형성하는 서열에 대한 동등한 위치에서의 시스테인 잔기 삽입은 T-세포-MMP를 안정화시키는 이황화결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Z. Hein et al. (2014), Journal of Cell Science 127:2885-2897] 참조.
도 1은 β-2 마이크로글로불린(β2M) 폴리펩타이드 서열에 대해 화학적 결합("CC"로 나타냄)에 의해 부착되는 에피토프를 함유하는 본 개시내용의 T-세포-MMP의 실시형태에 의한 에피토프 비특이적 T-세포에 대한 에피토프-특이적 T-세포의 우선적인 활성화를 도시한 도면.
도 2a 내지 도 2g는 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드의 아미노산 서열(서열번호 1 내지 12)을 제공하는 도면.
도 3A, 도 3B 및 도 3C는 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 제공하는 도면. 신호 서열, 아미노산 1 내지 24는 볼드체이며, 밑줄표시되어 있다. 도 3A 항목: 3A.1은 HLA-A 알파쇄(HLA-A*01:01:01:01)(NCBI 수탁번호 NP_001229687.1), 서열번호 134이고; 항목 3A.2는 HLA-A*1101 서열번호 135이며; 항목 3A.3은 HLA-A*2402 서열번호 136이고, 항목 3A.4는 HLA-A*3303 서열번호 137이다.
도 3D는 리더 서열이 없고 막관통 도메인 영역이 없는 11개의 성숙 MHC 클래스 I 중쇄 펩타이드 서열의 정렬을 도시한 도면. 정렬된 서열은 인간 HLA-A, 서열번호 140(또한 서열번호 134 참조); HLA-B, 서열번호 141(서열번호 138 참조); HLA-C, 서열번호 142(서열번호 139 참조); HLA-A*0201, 서열번호 143; 마우스 H2K 단백질 서열, 서열번호 144; HLA-A의 3개의 변이체(변이체 2, 변이체 2C, 및 변이체 2CP, 서열번호 145 내지 147); 3개의 인간 HLA-A 변이체(HLA-A*1101(HLA-A11), 서열번호 148;HLA-A*2402(HLA-A24), 서열번호 149; 및 HLA-A*3303(HLA-A33), 서열번호 150))을 포함한다. HLA-A*0201은 HLA-A의 변이체이다. HLA-A(변이체 2)는 HLA-A의 Y84A 및 A236C 변이체로서 표시된다. HLA-A(변이체 2C)로서 표시되는 7번째 HLA-A 서열은 84, 139 및 236번 위치에서 C 잔기로 치환되는 HLA-A를 나타내고, 8번째 서열은 앞서 언급한 서열의 C-말단에 하나의 추가적인 프롤린을 첨가한다. 9번째 내지 11번째 서열은 각각 HLA-A11(HLA-A*1101), HLA-A24(HLA-A*2402); 및 HLA-A33(HLA-A*3303)로부터 유래되며, 이들은 특정 아시아인 집단에서 우세하다. 정렬에서 위치(성숙 단백질의 84 및 139)가 표시되며, 결합된 에피토프 펩타이드의 부재 하에 MHC - β2M 복합체를 안정화시키는 이황화결합의 형성을 위한 해당 위치에서 아미노산 대신에 시스테인 잔기가 삽입될 수 있다. 또한 β2M과의 쇄내 이황화 결합을(예를 들어, 성숙 폴리펩타이드의 aa 12에서) 형성할 수 있는 시스테인 잔기로 대체될 수 있는 (성숙 폴리펩타이드의) 236번 위치를 정렬에 나타낸다. 화살표는 해당 위치 각각의 위에 나타내며, 잔기는 볼드체이다. 잔기 84, 139 및 236에 측접하는 박스는 (i) 임의의 천연 유래 아미노산 또는 (ii) 프롤린 또는 글리신을 제외한 임의의 천연 유래 아미노산으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 아미노산으로 대체될 수 있는 aa 클러스터 1, aa 클러스터 2, aa 클러스터 3, aa 클러스터 4, aa 클러스터 5, 및 aa 클러스터 6(도면에서 각각 aac 1 내지 aac 6로서 나타냄)로 나타내는 5개 잔기의 6개 세트의 측면 상의 5개 아미노산 그룹을 나타낸다.
도 4는 호모 사피엔스(Homo sapiens)(NP_004039.1; 서열번호 151), 판 트로글로다이테스(Pan troglodytes)(NP_001009066.1; 서열번호 152), 마카카 물라타(Macaca mulatta)(NP_001040602.1; 서열번호 153), 보스 타우루스(Bos taurus)(NP_776318.1; 서열번호 154) 및 무스 무수스쿨루스(Mus musculus)(NP_033865.2; 서열번호 155)로부터의 β2M 전구체(즉, 리더 서열을 포함)의 다중 아미노산 서열 정렬을 제공하는 도면. 밑줄 표시한 아미노산 1 내지 20은 신호 펩타이드이다(때때로 리더 서열로서 지칭됨).
도 5는 A 내지 D로 표시되는 4개의 T-세포-MMP 실시형태를 제공한다. 각각의 경우에, T-세포-MMP는 N-말단 및 C-말단을 갖고 제1 주조직 적합 복합체(MHC) 폴리펩타이드(MHC-1)를 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및 N-말단 및 C-말단 및 제2 MHC 폴리펩타이드(MHC-2)을 갖고, 선택적으로 면역글로불린(Fc) 폴리펩타이드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드를 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 실시형태에서, 이황화결합에 의해 연결되는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드가 나타나지만; 그러나, T-세포-MMP는 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 사이에 이황화결합 또는 임의의 다른 공유결합을 필요로 하지 않는다는 것이 나타난다. T-세포-MMP는 또한 파선(- - -)으로 나타내는 독립적으로 선택되는 링커 서열을 포함할 수 있다. T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드, 또는 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 둘 다는 적어도 하나의 화학적 접합 부위를 포함한다. 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위(CC-1) 및 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위(CC-2)에 대한 일부 잠재적 위치는 화살표로 나타낸다. 독립적으로 선택되는 하나 이상의 MOD(예를 들어, MOD 사이에 선택적 아미노산 링커를 갖는 서열에서 연결되는 1, 2, 3개 이상의 MOD를 포함하는 서열)에 대한 위치는 점무늬 박스에서 "MOD"로 나타낸다. MOD는 본 개시내용의 다른 곳에서 MOD*로 나타내는 변이체 MOD를 함유할 수 있다. A에서 MOD(들)는 제1 폴리펩타이드의 C-말단에 위치되고, B에서 MOD(들)는 제2 폴리펩타이드의 N-말단에 위치되며, C에서 MOD(들)는 제2 폴리펩타이드의 C-말단에 위치되고, D에서 동일하거나 상이할 수 있는 MOD는 제1 폴리펩타이드의 C-말단 및 제2 폴리펩타이드의 N-말단에 위치된다.
도 6은 도 5의 실시형태에 병행하여 A 내지 H로서 표시되는 T-세포-MMP 에피토프 접합체의 8개의 실시형태를 제공한다. 도 5에서와 같이, 제1 폴리펩타이드는 MHC 클래스 I 중쇄(MHC-H)와 상호작용하고 T-세포 수용체에 대한 에피토프를 제시할 수 있는 β-2-마이크로글로불린 폴리펩타이드(β2M)를 포함하는 것으로 제공되는 제1 MHC 폴리펩타이드와 함께 N-말단 및 C-말단을 가진다. 제2 폴리펩타이드는 N-말단 및 C-말단, MHC-H 폴리펩타이드를 가지고, 선택적으로 면역글로불린(Fc) 폴리펩타이드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드를 포함한다. A 내지 D에서 β2M 펩타이드 서열과 MHC-H 펩타이드 서열을 연결하는 T-세포-MMP 에피토프 접합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 결합시키는 선택적 이황화결합을 나타내며, 파선(- - -)으로 표시되는 독립적으로 선택된 선택적 링커는 필요하지 않다. E 내지 H에서, A 내지 D의 복합체가 반복되지만, 에피토프와 β2M 펩타이드 서열 사이에 개재된 링커 서열에 MHC-H 펩타이드 서열을 결합시키는 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 결합시키는 이황화결합이 나타난다(예를 들어, 개재된 링커에 대한 MHC-H 쇄 서열의 84번 위치에서 Cys 잔기로부터의 결합(도 3 참조)). T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드, 또는 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 둘 다는 또한 에피토프의 접합에 대해 사용되는 부위에 추가로 하나 이상의 화학적 접합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 CC-1 및 CC-2에 대한 잠재적 위치는 화살표로 나타낸다. 하나 이상의 면역조절 폴리펩타이드(MOD 또는 변이체 MOD 중 하나)는 도 5에 기재하는 바와 같다.
도 7은 T-세포-MMP로부터 형성된 2개의 이량체의 예를 제공한다. 이량체 표지된 "A"는 도 6에서 "A"로 표지된 T-세포-MMP 중 둘을 이량체화한 것의 결과이다. 이량체 표지된 "B"는 도 6에서 "B"로 표지된 T-세포-MMP 중 둘을 이량체화한 것의 결과이다. 나타낸 실시형태는 폴리펩타이드 사이에 하나 이상의 이황화결합을 포함하며, 이들 각각은 선택적이다. 추가로, Fc 영역 또는 부착된 선택적 링커에서 CC-2 부위의 소집단만을 나타낸다.
도 8은 미국 특허 제9,310,374호로부터 적합하게 된 폴리펩타이드를 함유하는 알데하이드와 반응하는 하이드라진일 인돌의 개략도를 도시한 도면.
도 9는 A 부분에서, FGE 효소의 작용을 통해 화학적 접합 부위(fGly 잔기)를 발생시키기 위한 위치로서 설파타제 모티프를 갖는 제1 폴리펩타이드를 갖는 T-세포-MMP의 맵을 도시한 도면. B에서, 도 9는 인간 MHC 클래스 I HLA-A 중쇄 폴리펩타이드 다음에 인간 IgG1 Fc 폴리펩타이드의 아미노 말단에 부착된 직렬 IL-2 MOD를 갖는 T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드를 도시한 도면.
도 10A 내지 도 10D는 N-말단으로부터 C-말단까지, 밑줄 및 볼드체로 나타낸 인간 IL-2 신호 서열을 갖는 일련의 HLA A*1101 중쇄 작제물을 도시한 도면. 신호(리더) 서열 다음에 인간 IL-2 또는 "선택적 펩타이드 링커-면역조절 폴리펩타이드-선택적 펩타이드 링커"로서 표시하는 MOD가 이어진다. MOD가 구체화되지 않는 경우에, 이는 임의의 목적하는 MOD일 수 있다. 서열의 나머지는 3개의 시스테인 치환(Y84C; A139C; A236C); 링커; 및 2개의 아미노산 치환(L234A; L235A)을 갖는 hIgG1 Fc를 갖는 HLA A*1101 H 서열이다. 별표는 서열에 대한 정지를 나타낸다.
도 11A 내지 도 11E는 인간 β2M 폴리펩타이드 서열을 포함하는 일련의 작제물을 나타낸다. 작제물은 N-말단으로부터 C-말단까지: 리더 서열 MSRSVALAVLALLSLSGLEA(볼드체 및 밑줄 표시), 선택적 링커 및 설파타제 부위 및 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 다른 독립적으로 선택된 링커, (링커)0-4X1Z1X2Z2X3Z3(링커)0-4, 및 R12C 아미노산 변형을 갖는 인간 β2M 서열(IQRTPKIQVYS C HPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHS DLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM)을 포함한다. 포유류 세포에서 T-세포-MMP를 수득하기 위해 폴리펩타이드, 예컨대 도 10의 펩타이드를 함유하는 MHC 클래스 I 중쇄와 공동 발현 후에, 설파타제 서열은 폼일 글리신 잔기를 함유하도록 효소에 의해 변형된다. 이어서, T-세포-MMP 접합체는, 예를 들어, 카복실 말단에서 하이드라진일기(예를 들어, 하이드라진일 인돌기)를 보유하도록 변형된 HBV 펩타이드와 T-세포-MMP의 폼일 글리신을 반응시킴으로써(예를 들어, 도 11A 내지 도 11E에 나타낸 바와 같음) 제조될 수 있다.
정의
본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 하나인 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되며, 암호 및 비암호 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩타이드 골격을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭한다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 대해 "서열 동일성"의 특정 백분율을 갖는데, 이는 정렬될 때, 염기 또는 아미노산의 백분율이 동일하고, 두 서열을 비교할 때 동일한 상대적 위치에 있다는 것을 의미한다. 서열 동일성은 다수의 상이한 방법으로 결정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위해, 서열은 월드 와이드 웹 상에서 ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/, ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, 및 mafft.cbrc.jp/alignment/software/를 포함하는 사이트에서 이용 가능한 다양한 편리한 방법 및 컴퓨터 프로그램(예를 들어, BLAST, T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT 등)을 이용하여 정렬할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10] 참조. 달리 언급되지 않는 한, 서열 정렬은 BLAST를 이용하여 준비된다.
용어 "아미노산" 및 "아미노산들"은 각각 "aa" 및 "aas"로서 약칭된다. 달리 언급되지 않는 한 천연 유래 아미노산 또는 천연 유래 아미노산은 하기를 의미한다: L(Leu, 류신), A(Ala, 알라닌), G(Gly, 글리신), S(Ser, 세린), V(Val, 발린), F(Phe, 페닐알라닌), Y(Tyr, 타이로신), H(His, 히스티딘), R(Arg, 알기닌), N(Asn, 아스파라긴), E(Glu, 글루탐산), D(Asp, 아스파라긴), C(Cys, 시스테인), Q(Gln, 글루타민), I(Ile, 아이소류신), M(Met, 메티오닌), P(Pro, 프롤린), T(Thr, 트레오닌), K(Lys, 라이신), 및 W(Trp, 트립토판); 이들 모두는 L-입체배치임. 셀레노시스테인과 하이드록시프롤린은 둘 다 이들이 포함되는 것으로 의도되는 임의의 예에서 구체적으로 지칭되는 천연 유래 아미노산이다.
비천연 아미노산은 상기 열거된 천연 유래 아미노산, 셀레노시스테인 및 하이드록시프롤린 이외의 임의의 아미노산이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "화학적 접합"은 공유 결합의 형성을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "화학적 접합 부위"는 폴리펩타이드에 대한 공유 결합의 형성이 필요하거나 또는 이를 보조하는 임의의 맥락적 요소(예를 들어, 주위의 아미노산 서열)를 비롯한, 공유 결합이 형성될 수 있는 폴리펩타이드 내 위치를 의미한다. 따라서, 효소 변형을 지시하는 아미노산 기를 포함하는 부위, 및 궁극적으로는 기 내의 아미노산에서의 공유 결합 형성은 또한 화학적 접합 부위로 지칭될 수 있다. 일부 예에서, 문맥으로부터 분명하게 될 바와 같이, 용어 화학적 접합 부위는 공유 결합 형성 또는 화학적 변형이 이미 일어난 위치를 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 단백질에서의 상호 호환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신으로 이루어지고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌으로 이루어지며; 아마이드 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민으로 이루어지고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판으로 이루어지며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 라이신, 알기닌 및 히스티딘으로 이루어지고; 산성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글루타메이트 및 아스파르테이트로 이루어지며; 그리고 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌으로 이루어진다. 예시적인 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-알기닌, 알라닌-발린-글리신 및 아스파라긴-글루타민이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역학적 시냅스" 또는 "면역 시냅스"는 일반적으로 적응 면역 반응의 두 상호작용 면역 세포 사이의 천연 계면(예를 들어, APC, 또는 표적 T-세포와 효과기 세포, 예를 들어, 림프구, 효과기 T-세포, 자연 살해 세포 등 사이의 계면을 포함)을 지칭한다. APC와 T-세포 사이의 면역학적 시냅스는 일반적으로, 예를 들어, 문헌[Bromley et al., Ann Rev Immunol. 2001; 19:375-96]에 기재하는 T-세포 항원 수용체와 하나 이상의 MHC 분자의 상호작용에 의해 개시되며; 이의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참고로 포함된다.
"T-세포"는 T-헬퍼 세포(CD4+ 세포), 세포독성 T-세포(CD8+ 세포), T-조절 세포(Treg) 및 NK-T-세포를 포함하는 CD3을 발현시키는 모든 유형의 면역 세포를 포함한다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "제1 주조직 적합 복합체(MHC) 폴리펩타이드" 또는 "제1 MHC 폴리펩타이드", 및 용어 "제2 MHC 폴리펩타이드", "MHC 중쇄" 및 "MHC-H"는 MHC 클래스 I 수용체 요소를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "MOD"(또한 공동면역조절 또는 공자극 폴리펩타이드로 칭함)는 T-세포 상에서 "Co-MOD"(또한 동족 공동-면역조절 폴리펩타이드 또는 동족 공자극 폴리펩타이드)에 특이적으로 결합함으로써, 예를 들어, 펩타이드가 부하된 MHC 폴리펩타이드와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공되는 1차 신호에 추가로, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 T-세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는, APC(예를 들어, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 폴리펩타이드, 또는 APC 상의 폴리펩타이드 부분을 포함한다. MOD는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, Fas 리간드(FasL), 유도성 공자극 리간드(ICOS-L), 세포내 부착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, Toll 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. MOD는 또한, 특히, T-세포 상에 존재하는 Co MOD(예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드)에 특이적으로 결합하는 항체(또는 이의 항원 결합 부분, 예컨대 Fab)를 포함한다.
T-세포-MMP의 "면역조절 도메인"("MOD")은 MOD로서 작용하는 T-세포-MMP의 폴리펩타이드이다.
본 명세서에서 사용되는 "이종성"은 각각 천연 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "재조합체"는 특정 핵산(DNA 또는 RNA)이 천연 시스템에서 발견되는 내인성 핵산과 구별되는 구조적 암호 또는 비암호 서열을 갖는 작제물을 야기하는 클로닝, 제한, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR) 및/또는 결찰 단계의 다양한 조합물의 산물이라는 것을 의미한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 cDNA 단편으로부터 또는 일련의 합성 올리고뉴클레오타이드로부터 조립되어, 세포에서 또는 무 세포 전사 및 번역 시스템에서 함유된 재조합 전사 단위로부터 발현될 수 있는 합성 핵산을 제공할 수 있다.
용어 "재조합 발현 벡터" 및 "DNA 작제물"은 벡터 및 적어도 하나의 삽입물을 포함하는 DNA 분자를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다. 재조합 발현 벡터는 보통 삽입물(들)을 발현 및/또는 증식시킬 목적을 위해, 또는 다른 재조합 뉴클레오타이드 서열의 구성을 위해 생성된다. 삽입물(들)은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수도 있거나 연결되지 않을 수도 있고, DNA 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수도 있고 연결되지 않을 수도 있다.
본 명세서에서 용어 "친화도"는 2가지 제제(예를 들어, 항체 및 항원)의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 지칭하며 해리 상수(KD)로서 표현된다. 친화도는 관련없는 아미노산 서열에 대한 항체의 친화도보다 적어도 1배 초과, 적어도 2배 초과, 적어도 3배 초과, 적어도 4배 초과, 적어도 5배 초과, 적어도 6배 초과, 적어도 7배 초과, 적어도 8배 초과, 적어도 9배 초과, 적어도 10배 초과, 적어도 20배 초과, 적어도 30배 초과, 적어도 40배 초과, 적어도 50배 초과, 적어도 60배 초과, 적어도 70배 초과, 적어도 80배 초과, 적어도 90배 초과, 적어도 100배 초과 또는 적어도 1,000배 초과, 또는 더 큰 수 초과일 수 있다. 표적 단백질에 대한 항체의 친화도는, 예를 들어, 약 100 나노몰(nM) 내지 약 0.1nM, 약 100nM 내지 약 1 피코몰(pM), 또는 약 100nM 내지 약 1 펨토몰(fM) 이상일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "결합활성(avidity)"은 희석 후 분리에 대한 2 이상의 제제 복합체의 저항성을 지칭한다. 용어 "면역반응성" 및 "우선적으로 결합하는"은 항체 및/또는 항원-결합 단편에 대해 본 명세서에서 상호 호환 가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "결합"은 (예를 들어, 하나 이상의 폴리펩타이드(예를 들어, T-세포 수용체 및 T-세포 상의 동족 공동-면역조절 폴리펩타이드(Co-MOD))에 대해 하나 이상의 MOD 또는 이의 에피토프 접합체를 포함하는 T-세포-MMP와 같은 분자의 결합에 대해) 분자 사이의 비공유 상호작용(들)을 지칭한다. 비공유 결합은, 예를 들어, 염 브리지와 물 브리지와 같은 상호작용을 비롯한, 정전기적, 소수성, 이온성 및/또는 수소-결합 상호작용에 기인하는 두 분자 사이의 직접적 회합을 지칭한다. 비공유 결합 상호작용은 일반적으로 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-10 M 미만, 10-11 M 미만 또는 10-12 M 미만의 해리 상수(KD)를 특징으로 한다. "친화도"는 비공유 결합 강도를 지칭하며, 증가된 결합 친화도는 더 낮은 KD와 상호 관련된다. "특이적 결합"은 일반적으로, 예를 들어, 리간드 분자와 그의 결합 부위, 또는 "수용체" 사이의 결합을 지칭하며, 친화도는 적어도 약 10-7　M 이상(예를 들어, 5×10-7　M 미만, 10-8　M 미만, 5×10-8　M 미만, 10-9 M 미만, 10-10 M 미만, 10-11 M 미만, 또는 10-12 M 미만 및 더 큰 친화도, 또는 10-7 내지 10-9 또는 10-9 내지 10-12의 범위)이다. "비특이적 결합"은 일반적으로 전형적으로 약 10-7　M 미만의 친화도로 표기된 결합 부위 이외의 어느 것 또는 "수용체"에 대한 리간드의 결합(예를 들어, 약 10-6　M 미만, 약 10-5　M 미만, 약 10-4　M 미만의 친화도로 결합)을 지칭한다. 그러나, 일부 문맥에서, 예를 들어, TCR과 펩타이드/MHC 복합체 사이의 결합, "특이적 결합"은 1μM 내지 100μM, 또는 100μM 내지 1 mM의 범위일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "공유 결합"은 두 상이한 분자 사이의 하나 이상의 공유 화학 결합의 형성을 의미한다.
용어 "치료", 치료하는" 등은 본 명세서에서 목적하는 약학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 사용된다. 상기 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 데 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인하는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유에 관해 치료적일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "치료"는 포유류에서 질환 또는 증상의 임의의 치료를 아우르며, (a) 질환 또는 증상을 획득하는 성향이 있을 수 있지만 그것을 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에서 질환 또는 증상이 생기는 것을 방지하는 것; (b) 질환 또는 증상을 저해하는 것, 즉, 그의 발생을 저지하는 것; 및/또는 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다. 치료제는 질환 또는 손상의 개시 전에, 개시 동안에 그리고/또는 개시 후에 투여될 수 있다. 진행 중인 질환의 치료에 특히 관심이 있으며, 치료는 환자의 원치 않는 임상 증상을 안정화시키거나 또는 감소시킨다. 이러한 치료는 영향 받은 조직에서 기능의 완전한 상실 전에 바람직하게 수행된다. 대상 요법은 질환의 증상 단계 동안, 일부 경우에 질환의 증상 단계 후에 바람직하게 투여될 것이다.
용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되고, 진단, 치료 또는 요법이 요망되는 임의의 포유류 대상체를 지칭한다. 포유류는, 예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 설치류(예를 들어, 래트, 마우스), 토끼목(예를 들어, 토끼), 유제류(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말, 염소 등) 등을 포함한다.
본 발명을 추가로 설명하기 전에, 본 발명은 물론 변할 수 있는 기재된 특정 실시형태로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 제한되는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 하는데, 본 발명의 범주는 첨부하는 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.
수치 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명확하게 표시되지 않는 한, 범위는 하한의 1/10까지 각각의 개재 값, 해당 범위의 상한과 하한 사이 및 언급된 범위 내 임의의 다른 언급된 또는 개재된 값은 본 발명 내에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 한계까지 대상으로 본 발명 내에 포함된다. 범위가 상한 및 하한을 포함하는 경우, 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이해 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용하는 것과 관련한 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 그리고 첨부하는 청구범위에서 사용되는 단수의 형태는 명확하게 달리 표시되지 않는 한 복수의 대상을 포함하는 것으로 언급되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "다량체 T-세포 조절 폴리펩타이드"에 대한 언급은 복수의 이러한 폴리펩타이드를 포함하고, "면역조절 폴리펩타이드" 또는 "MOD"에 대한 언급은 하나 이상의 면역조절 폴리펩타이드 및 당업자에게 공지된 이의 동등물 등에 대한 언급을 포함한다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 초안이 작성될 수 있다는 것을 추가로 주목한다. 이렇게 해서, 이 언급은 청구범위 요소의 인용과 관련하여 "유일하게", "단지"등으로서 이러한 제외하는 용어의 사용 또는 "부정적" 제한의 사용을 위한 선행 사건 기반으로서 작용하는 것으로 의도된다.
명확을 기하기 위하여, 별개의 실시형태와 관련하여 기재된 본 발명의 소정의 특징은 또한 단일 실시형태와 조합하여 제공될 수도 있음이 인지된다. 대조적으로, 간략화를 기하기 위하여, 단일 실시형태와 관련하여 기재된 본 발명의 다양한 특징은 또한 별개로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수도 있다. 본 발명이 속하는 실시형태의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포괄되며, 각각의 그리고 모든 조합이 개별적으로 그리고 명확하게 개시되는 것과 같이 본 명세서에 개시된다. 추가로, 다양한 실시형태 및 이의 요소의 모든 하위 조합은 또한 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며, 각각의 그리고 모든 이러한 하위 조합이 본 명세서에서 개별적으로 그리고 명확하게 개시되는 것과 같이 본 명세서에 개시된다.
본 명세서에 논의되는 간행물은 본 출원의 출원일 전의 그들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명 때문에 이러한 간행물보다 선행한다는 자격이 부여되지 않는다는 용인으로서 해석되어서는 안 된다. 추가로, 제공되는 간행물의 날짜는 독립적으로 확인할 필요가 있을 수 있는 실제 공개일과 상이할 수 있다.
발명의 상세한 설명
I. 에피토프 결합을 위한 화학적 접합 부위를 갖는 T-세포 조절 다량체 폴리펩타이드(T-세포-MMP)
본 개시내용은 T-세포의 활성을 조절하는 데 유용한 T-세포-MMP 및 이들의 에피토프 접합체, 및 개체에서 면역 반응을 조절함에 있어서 이들의 제조 및 사용 방법을 제공한다. T-세포-MMP는 에피토프 및 페이로드에 대한 결합을 위해 Co-MOD 및 화학적 접합 부위에 대해 감소된 결합 친화도를 나타내는 하나 이상의 독립적으로 선택되는 야생형 및/또는 변이체 MOD 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 두 유형의 폴리펩타이드(제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드)를 포함하는 이형이량체인 T-세포-MMP가 포함되되, 해당 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 TCR에 결합할 수 있는 페이로드, 예컨대 화학치료제 및/또는 물질(예를 들어, 에피토프 펩타이드 및 무효(null) 펩타이드)의 부착(예를 들어, 공유 부착)을 위한 화학적 접합 부위를 포함한다. 또한 본 개시내용에 에피토프 및/또는 페이로드(예를 들어, 화학치료제)에 화학적으로 접합된 T-세포-MMP가 포함된다. T-세포-MMP에 존재하는 MOD(들) 유형에 따라서, TCR에 특이적인 에피토프가 T-세포-MMP 상에 존재할 때, T-세포는, 예를 들어, 클론 확장을 포함하는 활성화를 겪음으로써(예를 들어, 활성화 MOD, 예컨대 IL-2, 4-1BBL 및/또는 CD80이 T-세포-MMP에 혼입될 때) 반응할 수 있다. 대안적으로, T-세포는 MOD, 예컨대 CD86 및/또는 PD-L1이 T-세포-MMP 내로 혼입될 때 T-세포 활성(예를 들어, 자가면역 반응 차단)을 하향 조절하는 저해를 겪을 수 있다. MOD는 임의의 에피토프에 특이적이지 않기 때문에, T-세포에 대한 T-세포-MMP의 결합이 MHC-에피토프-TCR 상호작용에 의해 강하게 영향받거나, 심지어 이에 의해 지배되도록, Co-MOD 가 T-세포-MMP에 감소된 친화도를 갖는 변이체 MOD를 혼입함으로써 T-세포의 활성화 또는 저해는 에피토프-특이적 상호작용에 대해 편향될 수 있다.
본 명세서에 기재된 실시형태에서, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 대용 APC로서 작용하며, 적응 면역 반응을 모방한다. T-세포-MMP-에피토프 접합체는 이를 T-세포 표면 상에 존재하는 TCR 표면 상에 존재하는 TCR을 T-세포-MMP-에피토프 접합체 복합체에 존재하는 공유결합된 에피토프와 맞물리게 함으로써 행한다. 이런 맞물림은 에피토프-특이적 세포 표적화를 달성하는 능력을 갖는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 제공한다. 본 명세서에 기재된 실시형태에서, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 또한 T-세포 상에서 상대 공자극 단백질(Co-MOD)과 맞물리는 적어도 하나의 MOD를 가진다. TCR에 대한 신호 - 에피토프/MHC 결합과 Co-MOD에 대한 MOD 결합 -는, 이어서, 목적하는 T-세포 특이성 및 저해 또는 활성화/증식을 유도한다.
화학적 접합 부위를 갖는 T-세포-MMP는 상이한 에피토프 및/또는 페이로드는 치료적, 진단적 및 연구 적용을 위한 물질을 제조하기 위해 삽입될 수 있는 플랫폼으로서의 용도를 발견한다. 화학적 접합 부위를 포함하는 이러한 T-세포-MMP는 T-세포-MMP에 빠르게 삽입되고 에피토프에 특이적인 TCR을 보유하는 T-세포의 활성화 또는 저해를 위해 시험될 물질(예를 들어, 펩타이드)을 함유하는 에피토프를 허용하기 때문에 진단 및 치료의 빠른 준비를 가능하게 한다.
실시형태에서, 이러한 T-세포-MMP의 화학적 접합 부위는 화학치료제 또는 효소와 같은 페이로드를 T-세포-MMP에 부착하기 위해 이용될 수 있다. 첨가된 에피토프의 부재 하에서, 얻어진 복합체는 항체를 페이로드에 전달하는 것과 유사한 방식으로, 특히 Fc 스캐폴드의 혼입때문에 T-세포-MMP가 다량체(예를 들어, 이량체 또는 더 고차의 구조)를 형성할 때, 사용될 수 있다. 에피토프의 결여때문에, T-세포-MMP-페이로드 접합체의 MOD는 이들의 결합 특이성 및 상이한 세포에 대한 결합활성에 의해 페이로드를 받는 세포에 영향을 줄 것이다.
실시형태에서, T-세포 증식 및 에피토프를 자극하는 변이체 MOD가 T-세포-MMP에 혼입되는 경우에, T-세포를 T-세포-MMP의 적어도 하나의 농도와 접촉시키는 것은 에피토프에 특이적인 TCR를 갖지 않는 동일한 농도의 T-세포-MMP와 접촉된 T-세포에 비해, 에피토프에 특이적인 TCR을 갖는 T-세포의 활성화(T-세포 증식 또는 ZAP-70 활성에 의해 측정, 예를 들어, 문헌[Wang, et al., Cold Spring Harbor perspectives in biology 2.5 (2010): a002279])의 적어도 2배(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 75 또는 100배) 차이를 유도한다.
실시형태에서 T-세포 활성화를 저해하는 변이체 MOD 및 에피토프가 T-세포-MMP 내로 혼입되는 경우에, T-세포를 T-세포-MMP의 적어도 하나의 농도와 접촉시키는 것은 T-세포 증식에 의해 측정되는 바와 같이 에피토프 특이적 방식으로 T-세포의 활성화를 방지한다.
에피토프가 혼입된 T-세포-MMP의 특이성은 결합에 대한 에피토프 및 MOD의 상대적 기여에 의존할 것이다. 에피토프가 MOD보다 전반적인 결합 에너지에 더 많이 기여함으로써 결합 상호작용을 지배하는 T-세포-MMP 복합체에 비해, MOD가 결합 상호작용을 지배하는 경우에 에피토프에 특이적인 T-세포의 T-세포-MMP의 특이성은 감소될 것이다. 에피토프에 특이적인 TCR에 대한 에피토프의 기여가 클수록, T-세포 유형에 대한 T-세포-MMP의 특이성은 더 크다. 에피토프가 TCR에 대해 강한 친화도를 갖는 경우에, Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 갖는 변이체 MOD의 사용은 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 에피토프 선택적 상호작용을 선호할 것이며, 또한 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 접합될 수 있는 임의의 페이로드의 선택적 전달을 용이하게 한다.
에피토프에 혼입되고 에피토프 특이적인 T-세포-MMP를 준비하기 위한 구조로서 유용한 것에 추가로, 에피토프를 결여하거나 무효 펩타이드를 함유하는 것으로 기재된 T-세포-MMP는 T-세포-MMP에 존재하는 MOD 및/또는 변이체 MOD에 대한 수용체를 보유하는 표적 세포에 페이로드를 전달하는 데 사용될 수 있다.
실시형태에서, 에피토프를 결여하는(또는 무효 펩타이드를 함유하는) T-세포 활성화 및/또는 증식에 대해 MOD 저해를 보유하는 T-세포-MMP는 T-세포-MMP에 존재하는 MOD 또는 변이체 MOD에 대한 하나 이상의 수용체를 함유하는 T-세포의 자극제로서 사용될 수 있다. 이러한 자극 T-세포-MMP는 결합하는 T-세포에 페이로드(예를 들어, 화학적으로 접합된 화학치료제)를 동시에 전달하기 위해 사용될 수 있다.
실시형태에서, 에피토프를 결여하는(또는 무효 펩타이드를 함유하는) T-세포 활성화 및/또는 증식에 대한 MOD를 보유하는 T-세포-MMP는 단독으로 또는 다른 면역억제제, 예컨대 면역반응을 억제하기 위한(예를 들어, 이식편대숙주 또는 숙주대이식편 거부반응을 방지하기 위한) 사이클로스포린과 함께 면역억제제로서 사용될 수 있다. 이러한 저해 T-세포-MMP는 결합하는 T-세포에 페이로드(예를 들어, 화학적으로 접합된 화학치료제)를 동시에 전달하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 T-세포의 활성을 조절하는 데, 그리고 그에 따라, 개체에서의 면역 반응을 조절하는 데 유용한 T-세포-MMP를 제공한다. T-세포-MMP는 Co-MOD에 대해 감소된 결합 친화도를 나타내는 MOD를 포함한다.
I.A. T-세포-MMP
본 명세서에 기재된 T-세포-MMP 프레임워크는 제1 폴리펩타이드 쇄 또는 제2 폴리펩타이드 쇄 중 하나에 적어도 하나의 화학적 접합 부위를 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용은: a) 제1 MHC 폴리펩타이드를 포함하는 제1 폴리펩타이드; b) 제2 MHC 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드; c) 화학적 접합 부위를 포함하는 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 중 적어도 하나, 및 d) 적어도 하나의 MOD를 포함하는, 이형이량체를 포함하는 T-세포-MMP를 제공하며, 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드는 적어도 하나의 MOD(예를 들어, 1, 2, 3개 이상)를 포함한다. 선택적으로, 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드는 Ig Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 스캐폴드를 포함한다. 독립적으로 선택되는 MOD 중 하나 이상은 Co-MOD에 대한 대응하는 야생형 MOD의 친화도에 비해 Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 나타내는 변이체 MOD일 수 있다. 본 개시내용은 또한 에피토프(예를 들어, 에피토프를 보유하는 펩타이드)가 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 형성하는 화학적 접합 부위에 (직접적으로 또는 간접적으로) 공유결합되는 T-세포-MMP를 제공한다. 이러한 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 에피토프 접합체에 존재하는 에피토프(예를 들어, 에피토프 펩타이드)는 T-세포 상의 T-세포 수용체(TCR)에 적어도 100μM (예를 들어, 적어도 10μM, 적어도 1μM, 적어도 100nM, 적어도 10nM, 또는 적어도 1nM)의 친화도로 결합할 수 있다. T-세포-MMP 에피토프 접합체는 T-세포-MMP 에피토프 접합체가 제2 T-세포에 결합하는 친화도보다 적어도 25% 더 큰 친화도로 제1 T-세포에 결합할 수 있고, 여기서 제1 T-세포는 표면 상에서 적어도 100μM의 친화도로 에피토프에 결합하는 TCR 및 Co-MOD을 발현시키며, 제2 T-세포는 표면 상에서 Co-MOD을 발현시키지만 적어도 100μM(예를 들어, 적어도 10μM, 적어도 1μM, 적어도 100nM, 적어도 10nM, 또는 적어도 1nM)의 친화도로 에피토프에 결합하는 TCR을 발현시키지 않는다.
실시형태에서, 본 개시내용은 이형이량체 T-세포-MMP(이형이량체의 더 고수준의 다량체, 이량체, 삼량체 등을 형성할 수 있음)를 제공하며, 이는:
a) i) 제1 MHC 폴리펩타이드를 포함하는, 제1 폴리펩타이드;
b) N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로: i) 제2 MHC 폴리펩타이드 및 ii) 선택적 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 스캐폴드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드를 포함하는, 제2 폴리펩타이드;
c) 제1 폴리펩타이드에 또는 제1 폴리펩타이드 내에 부착된 하나 이상의 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위, 및/또는 제2 폴리펩타이드에 또는 제2 폴리펩타이드 내에 부착된 하나 이상의 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위; 및
d) 하나 이상의 면역조절 폴리펩타이드(immunomodulatory polypeptide: MOD)로서, 하나 이상의 MOD 중 적어도 하나는
A) 제1 폴리펩타이드의 C-말단에(예를 들어, 도 5 또는 도 6의 A 참조),
B) 제2 폴리펩타이드의 N-말단에(예를 들어, 도 5 또는 도 6의 B 참조),
C) 제2 폴리펩타이드의 C-말단에(예를 들어, 도 5 또는 도 6의 C 참조), 또는
D) 제1 폴리펩타이드의 C-말단에 그리고 제2 폴리펩타이드의 N-말단에(예를 들어, 도 5 또는 도 6의 D 참조)
있는, 상기 하나 이상의 면역조절 펩타이드를 포함하되;
하나 이상의 MOD의 각각은 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 MOD이다.
이러한 T-세포-MMP 프레임워크는, T-세포-MMP-에피토프 접합체를 형성하는 제1 및 제2 MHC 폴리펩타이드 중 적어도 하나에 결합된 제1 화학적 접합 부위 또는 제2 화학적 접합 부위 중 하나에 대한 결합을 통해 에피토프(예를 들어, 폴리펩타이드 에피토프)에 공유적으로 부착될 수 있는 플랫폼으로서 작용한다. 이는 T-세포 상에서 T-세포 수용체(TCR)에 대한 T-세포-MMP와 관련한 제시를 위해 프레임워크에 상이한 에피토프의 용이한 도입을 가능하게 한다. 페이로드(예를 들어, 화학치료제)는 제1 화학적 접합 부위 또는 제2 화학적 접합 부위(예를 들어, 에피토프의 부착을 위해 사용되지 않는 부위) 중 하나에 대한 공유 부착에 의해 T-세포-MMP에 유사하게 부착될 수 있다.
다량체화될 수 있는 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드가 사용되는 경우에, T-세포-MMP는 다량체화될 수 있다. 복합체는 이량체(예를 들어, 도 7 참조), 삼량체, 사량체, 또는 오량체의 형태일 수 있다. T-세포-MMP의 다량체를 포함하는 조성물은 또한 단량체를 포함할 수 있고, 따라서 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 또는 임의의 이들의 조합물(예를 들어, 단량체와 이량체의 혼합물)을 포함할 수 있다.
실시형태에서, MOD는 독립적으로 선택된 야생형 MOD, 또는 선택적으로 에피토프를 포함하는 T-세포-MMP에 제시된 변이체 MOD이다. 실시형태에서, MOD는 에피토프-특이적 T-세포 활성화/증식을 자극할 수 있는 하나 이상의 MOD 또는 변이체 MOD(예를 들어, IL-2, 4-1BBL 및/또는 CD80)이다. 다른 실시형태에서, MOD는 T-세포 활성화/증식을 저해할 수 있는 하나 이상의 MOD 또는 변이체 MOD(예를 들어, FAS-L 및/또는 PD-L1)이다. 적합한 에피토프를 보유하는 T-세포-MMP와 함께 사용될 ?, 이러한 활성화 또는 저해 MOD는 에피토프-특이적 T-세포 작용을 할 수 있으며, 특히, 여기서 MOD는 변이체 MOD이고, MHC-에피토프-TCR 상호작용은 T-세포-MMP와 T-세포의 상호작용을 지배하기에 충분히 강하다.
I.A.1 T-세포-MMP에서의 제1 화학적 접합 부위 및 제2 화학적 접합 부위의 위치
에피토프(예를 들어, 펩타이드를 함유하는 에피토프) 및/또는 페이로드를 혼입시키는 화학적 접합 반응을 실시하기 전에, 본 명세서에 기재된 T-세포-MMP는 적어도 하나의 화학적 접합 부위를 포함한다. T-세포-MMP가 하나 초과의 화학적 접합 부위를 포함하는 경우에, 제1 폴리펩타이드 상에 2개 이상의 접합 부위(제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위), 제2 폴리펩타이드 상에 2개 이상의 접합 부위(제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위), 또는 적어도 하나의 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 및 적어도 하나의 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위가 있을 수 있다. 하나 초과의 화학적 접합 부위가 T-세포-MMP 분자에 존재하는 각각의 예에서, 부위는 독립적으로 선택되고, 접합을 위해 동일 또는 상이한 화학, 아미노산 서열 또는 화학적 기를 사용할 수 있다. 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위(CC-1로 표시함) 및 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위(CC-1로 표시함)에 대한 위치의 일부 예를 도 5 내지 도 7에 나타낸다.
실시형태에서, T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드는: N-말단 및 C-말단 상에 링커가 없는 제1 MHC 폴리펩타이드; N-말단 상에 링커를 보유하는 제1 MHC 폴리펩타이드; C-말단 상에 링커를 보유하는 제1 MHC 폴리펩타이드, 또는 N-말단 및 C-말단 상에 링커를 보유하는 제1 MHC 폴리펩타이드를 포함한다. 하나 이상의 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는: a) 제1 MHC 폴리펩타이드가 N-말단 및 C-말단 상에 링커가 없을 때 제1 MHC 폴리펩타이드의 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되고; b) 제1 MHC 폴리펩타이드의 서열에 또는 서열 내에 부착되며(여기서, 제1 MHC 폴리펩타이드는 N-말단 및 C-말단 상에 링커를 포함함); c) 제1 MHC 폴리펩타이드의 N-말단 상의 링커 서열에 또는 서열 내에 부착되고; 그리고/또는 d) 제1 MHC 폴리펩타이드의 C-말단 상의 링서 서열에 또는 서열 내에 부착된다. T-세포-MMP의 추가적인 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위는 제1 MHC 폴리펩타이드를 포함하는 제1 폴리펩타이드(예를 들어, 화학적 접합을 위한 부위로서 작용하는 하나 초과의 효소 변형 서열) 상의 또는 이에 부착된 임의의 링커 내의 임의의 위치에 존재할 수 있다(위치에 또는 위치 내에 부착됨). 이러한 실시형태에서, 제1 MHC 폴리펩타이드는 이하에 기재하는 바와 같이 β2M 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
실시형태에서, T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드는: N-말단 및 C-말단 상에 링커가 없는 제2 MHC 폴리펩타이드; N-말단 상에 링커를 보유하는 제2 MHC 폴리펩타이드; C-말단 상에 링커를 보유하는 제2 MHC 폴리펩타이드, 또는 N-말단 및 C-말단 상에 링커를 보유하는 제2 MHC 폴리펩타이드를 포함한다. 하나 이상의 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는: a) 제2 MHC 폴리펩타이드가 N-말단 및 C-말단 상에 링커가 없을 때 제2 MHC 폴리펩타이드의 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되고; b) 제2 MHC 폴리펩타이드의 서열에 또는 서열 내에 부착되며(여기서, 제2 MHC 폴리펩타이드는 N-말단 및 C-말단 상에 링커를 포함함); c) 제2 MHC 폴리펩타이드의 N-말단 상의 링커 서열에 또는 서열 내에 부착되고; 그리고/또는 d) 제2 MHC 폴리펩타이드의 C-말단 상의 링서 서열에 또는 서열 내에 부착된다. 추가로, 제2 폴리펩타이드가 부착된 추가적인 링커와 함께 면역글로불린(Fc) 폴리펩타이드 aa 서열 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드를 함유하는 경우에, 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위는 제2 MHC 폴리펩타이드, 면역글로불린 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 스캐폴드 또는 부착된 링커에 또는 이들 내에 부착될 수 있다. T-세포-MMP의 추가적인 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위는 제2 MHC 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드(예를 들어, 화학적 접합을 위한 부위로서 작용하는 하나 초과의 효소 변형 서열) 상의 또는 이에 부착된 임의의 링커 내의 임의의 위치에 존재할 수 있다(위치에 또는 위치 내에 부착됨). 이러한 실시형태에서, 제2 MHC 폴리펩타이드는 이하에 기재하는 바와 같이 MHC 중쇄(MHC-H) 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
실시형태에서, 제1 및 제2 MHC 폴리펩타이드는 클래스 I MHC 폴리펩타이드가 되도록 선택될 수 있고, 제1 MHC 폴리펩타이드는 β2M 폴리펩타이드 서열을 포함하고 제2 폴리펩타이드는 MHC 중쇄 서열을 포함하되, 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 상에 적어도 하나의 화학적 접합 부위가 있다. 실시형태에서, T-세포-MMP에서 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 N-말단 또는 C-말단에 부착된 β2M 폴리펩타이드 또는 링커 중 하나에 또는 그 안에 부착될 수 있다(N-말단 또는 C-말단에서를 포함). 실시형태에서, T-세포-MMP에서 하나 이상의 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 MHC-H 폴리펩타이드; MHC-H 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 부착된 링커에(N-말단 또는 C-말단에서를 포함) 또는 링커 내에; 또는, 존재한다면, 면역글로불린(Fc) 폴리펩타이드(또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드) 또는 이에 부착된 링커에 또는 링커 내에 부착될 수 있다. 이러한 클래스 I MHC 폴리펩타이드 작제물의 다른 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드는 둘 다 적어도 하나의 화학적 접합 부위를 포함한다.
T-세포-MMP가 β2M 폴리펩타이드 서열을 포함하는 경우, 서열은 도 4에 제시된 아미노산 서열 중 하나에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성 또는 심지어 100% 동일성)을 가질 수 있다. β2M 폴리펩타이드는 도 4에 제시된 아미노산 서열의 일부에 대해 동일성을 갖는 적어도 20, 30, 40, 50, 80, 100 또는 110개의 인접한 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 화학적 접합 서열은 β2M 폴리펩타이드에(예를 들어, N- 및/또는 C- 말단 또는 이에 부착된 링커에서) 또는 β2M 폴리펩타이드 내에 부착될 수 있다.
T-세포-MMP가 MHC-H 폴리펩타이드를 포함하는 경우에, HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C 중쇄일 수 있다. 실시형태에서, MHC-H 폴리펩타이드는 도 3A 내지 도 3D 중 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성, 또는 심지어 100% 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 도 3A 내지 도 3D에 제시된 아미노산 서열의 일부에 대해 동일성을 갖는 적어도 20, 30, 40, 50, 80, 100, 150, 200, 250, 300 또는 330 개의 인접한 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 화학적 접합 서열은 MHC-H 폴리펩타이드에(예를 들어, N- 및/또는 C- 말단 또는 이에 부착된 링커에서) 또는 MHC-H 폴리펩타이드 내에 부착될 수 있다.
T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드는 T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)를 다량체화하는 구조 및 능력 및, 추가로, 화학적 접합을 위한 잠재적 위치를 제공하는 분자 스캐폴드의 부분으로서 작용할 수 있는 Ig Fc 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, Ig Fc 폴리펩타이드는 IgG1 Fc 폴리펩타이드, IgG2 Fc 폴리펩타이드, IgG3 Fc 폴리펩타이드, IgG4 Fc 폴리펩타이드, IgA Fc 폴리펩타이드, 또는 IgM Fc 폴리펩타이드이다. 이러한 실시형태에서, Ig Fc 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2D 중 하나에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 98 또는 99%, 또는 심지어 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. Ig Fc 폴리펩타이드는 도 2의 아미노산 서열의 일부에 대해 동일성을 갖는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 또는 220개의 인접한 아미노산을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드가 IgG1 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 경우에, 폴리펩타이드는 또한 N297A, L234A, L235A, L234F, L235E 및 P331S로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 하나의 이러한 실시형태에서, IgG1 Fc 폴리펩타이드는 단독으로 또는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위와 조합하여 L234A 및 L235A 치환을 포함한다. 화학적 접합 부위는 N- 및/또는 C-말단에서 또는 이에 부착된 링커에, 또는 Ig Fc 폴리펩타이드 내에 위치/부착될 수 있다.
I.A.2 T-세포-MMP의 화학적 접합 부위
T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위는 T-세포-MMP 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다에 대한 공유 결합의 형성을 가능하게 하는 시약 및/또는 촉매, 예컨대 효소에 의한 처리 시 변형될 수 있는 임의의 적합한 부위일 수 있다. 실시형태에서, T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 중 하나에 도입된 단지 하나의 화학적 접합 부위가 있다. 다른 실시형태에서, 상이한 분자가 폴리펩타이드의 각각에 선택적으로 접합되도록 각각의 폴리펩타이드 상에 접합 부위(상이한 접합 부위) 중 하나의 유형만이 있도록 각각의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위가 선택된다. 다른 실시형태에서, 예컨대 에피토프 분자와 하나 이상의 페이로드 분자가 T-세포-MMP에 혼입되는 경우에, 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합의 하나 초과의 복제물이 T-세포-MMP에 도입될 수 있다. 예를 들어, T-세포-MMP는 하나의 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위(예를 들어, 에피토프 접합을 위함) 및 페이로드의 분자를 전달하기 위한 다중 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위를 가질 수 있다.
실시형태에서, 제1 화학적 접합 부위 및 제2 화학적 접합 부위는 하기로부터 독립적으로 선택될 수 있다:
a) 효소 변형 서열로서 작용하는 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에 또는 폴리펩타이드 내에 부착된 펩타이드 서열(예를 들어, 설파타제, 솔타제(sortase) 및/또는 트랜스글루타미나제 서열);
b) 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에 또는 폴리펩타이드 내에 부착된 비천연 아미노산 및/또는 셀레노시스테인;
c) 조작된 아미노산 화학적 접합 부위;
d) 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에 부착된 탄수화물 또는 올리고당 모이어티; 및
e) 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에 또는 폴리펩타이드 내에 부착된 IgG 뉴클레오타이드 결합 부위.
I.A.2.1 설파타제 모티프
해당 실시형태에서, 효소 변형이 화학적 접합 부위를 제공하는 수단으로서 선택되는 경우에, 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 및 제2 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 설파타제 모티프를 포함할 수 있다. 설파타제 모티프는 보통 길이가 5 또는 6개의 아미노산이고, 예를 들어, 참조에 의해 포함된 미국 특허 제9,540,438호 및 미국 특허 공개 제2017/0166639 Al호에 기재되어 있다. 모티프의 삽입은 때때로 태그된 알데하이드로서 지칭되거나 또는 알데하이드 태그를 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드의 형성을 초래한다. 모티프는 모티프 내 시스테인 또는 세린을 선택적(예를 들어, 부위 선택적) 화학적 접합 반응을 위해 이용될 수 있는 알데하이드 함유 아미노산인 폼일글리신 잔기(때때로 "FGly"으로 나타내지만, "fGly")로 전환시키기 위해 폼일글리신 생성 효소(들)("FGE" 또는 "FGE")에 의해 작용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는, "알데하이드 태그" 또는 "알데하이드 태그된" 폴리펩타이드는 비전환 설파타제 모티프를 포함하는 아미노산 서열뿐만 아니라 모티프의 시스테인 또는 세린이 FGE의 작용에 의해 fGly으로 전환된 설파타제 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 지칭한다. 추가로, 설파타제 모티프가 아미노산 서열과 관련하여 제공되는 경우에, 비전환 모티프뿐만 아니라 상대를 함유하는 그의 fGly를 함유하는 아미노산 서열(예를 들어, 폴리펩타이드) 둘 다의 개시내용을 제공하는 것으로 이해된다. 일단 (예를 들어, T-세포-MMP의) 폴리펩타이드 내로 혼입되면, fGly 잔기는 티오세미카바자이드, 아미노옥시, 하이드라자이드 및 하이드라지노기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 반응기를 포함하는 분자(예를 들어, 에피토프 펩타이드)와 반응하여 fGly 잔기를 통해 펩타이드와 분자 사이에 공유 결합을 갖는 접합체(예를 들어, T-세포-MMP 에피토프 접합체)를 형성한다.
실시형태에서, 설파타제 모티프는 길이가 적어도 5 또는 6 aa 잔기이지만, 예를 들어, 5 내지 16(예를 들어, 6 내지 16, 5 내지 14, 6 내지 14, 5 내지 12, 6 내지 12, 5 내지 10, 6 내지 10, 5 내지 8 또는 6 내지 8) aa일 수 있다. 설파타제 모티프는 길이가 16, 14, 12, 10 또는 8개 미만의 아미노산 잔기로 제한될 수 있다.
실시형태에서, 설파타제 모티프는 식 (I)에 나타낸 서열을 함유한다:
X1Z1X2Z2X3Z3 (I)(서열번호 45), 여기서,
Z1은 시스테인 또는 세린이고;
Z2는 프롤린 또는 알라닌 잔기(또한 "P/A"로 나타낼 수 있음) 중 하나이고;
Z3은 염기성 아미노산(알기닌, 라이신, 또는 히스티딘, 보통 라이신), 또는 지방족 아미노산(알라닌, 글리신, 류신, 발린, 아이소류신, 또는 프롤린, 보통 A, G, L, V 또는 I)이며;
X1은 존재하거나 없고, 존재한다면, 임의의 아미노산일 수 있지만, 보통 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성 비하전 아미노산(예를 들어, 방향족 아미노산 또는 하전된 아미노산 이외), 보통 L, M, V, S 또는 T, 더 보통으로는 L, M, S 또는 V이고, 단, 설파타제 모티프가 표적 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재한다
X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있지만, 보통은 지방족 아미노산, 극성, 비하전 아미노산 또는 황 함유 아미노산(예를 들어, 방향조고 또는 하전된 아미노산 이외), 보통 S, T, A, V, G 또는 C, 더 보통으로는 S, T, A, V 또는 G이다.
따라서, 일 실시형태에서, FGly 함유 폴리펩타이드는 식 I을 갖는 설파타제 모티프를 이용하여 제조될 수 있으며, 여기서:
Z1은 시스테인 또는 세린이고;
Z2는 프롤린 또는 알라닌 잔기이며;
Z3은 지방족 아미노산 또는 염기성 아미노산이고;
X1은 존재하거나 또는 없으며, 존재한다면, 임의의 아미노산이고, 단, 설파타제 모티프가 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고; 그리고
X2 및 X3은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이되, 서열은 Ig 불변 영역의 용매 접근 가능 루프 내이거나 이에 인접해있고, 서열은 Ig 중쇄의 C-말단에 있지 않다.
알데하이드 태그가 표적 폴리펩타이드의 N-말단 이외의 위치에 존재하는 경우에, 설파타제 모티프의 X1은 표적 폴리펩타이드가 혼입되는 서열의 아미노산에 의해 제공될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 모티프가 표적 폴리펩타이드의 N-말단 이외의 위치에 존재하는 경우에, 설파타제 모티프는 하기 식을 가질 수 있다:
(C/S)X2(P/A)X3Z3, 식 (II)(서열번호 46), 여기서:X1은 부재이고; X2, X3 및 Z3은 상기 정의한 바와 같다.
진핵 FGE에 의해, 예를 들어 진핵 FGE를 이용하는 진핵 세포 또는 무세포 시스템에서 펩타이드의 발현 및 전환에 의해 fGly-함유 펩타이드로 전환을 위해 설파타제 모티프를 함유하는 펩타이드가 제조되는 경우에, 진핵 FGE에 의한 전환을 받아들일 수 있는 설파타제 모티프가 유리하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 진핵 FGE에 의한 전환을 잘 받아들이는 설파타제 모티프는 상기 식(I)(예를 들어, X1CX2PX3Z3, 서열번호 47)에서; 그리고 CX2PX3Z3, 서열번호 48(상기 식 (II)에 의해 포함됨)에서 각각 Z1 및 Z2에서 시스테인 및 프롤린을 함유한다. 해당 모티프를 보유하는 펩타이드는 "SUMFl-형" FGE에 의해 변형될 수 있다.
실시형태에서, FGE가 진핵 FGE인 경우, 설파타제 모티프는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
X1CX2PX3R 또는 CX2PX3R(서열번호 47 및 48, 여기서 Z3은 R이고, X1은 존재하거나 부재임);
X1CX2PX3K 또는 CX2PX3K(서열번호 47 및 48, 여기서 Z3은 K이고, X1은 존재하거나 부재임);
X1CX2PX3H 또는 CX2PX3H(서열번호 47 및 48, 여기서 Z3은 H이고, X1은 존재하거나 부재임);
X1CX2PX3L 또는 CX2PX3L(서열번호 47 및 48, 여기서 Z3은 L이고, X1은 존재하거나 부재임); X1, X2 및 X3은 상기 정의한 바와 같다.
실시형태에서, 설파타제 모티프는 서열을 포함한다: X1C(X2)P(X3)Z3(서열번호 47 참조), 여기서:
X1은 존재하거나 또는 없으며, 존재한다면, 임의의 아미노산이고, 단, 설파타제 모티프가 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고; 그리고
X2 및 X3은 독립적으로 선택된 세린, 트레오닌, 알라닌 또는 글리신 잔기이다.
원핵 FGE에 의한 전환이 되기 쉬운 식 (I) 및 식 (II)의 설파타제 모티프는 종종 "SUMP I형" FGE 또는 "AtsB-형" FGE에 의해 각각 변형될 수 있는 Z1에서 시스테인 또는 세린 및 Z2에서 프롤린을 함유한다. 원핵 FGE에 의한 전환이 되기 쉬운 식 (I) 또는 (II)의 다른 설파타제 모티프는 식 (I) 및 (II)에 대해 기재된 서열의 남아있는 아미노산과 함께 Z1에서 시스테인 또는 세린, 및 Z2에서 프롤린 또는 알라닌(각각 독립적으로 선택됨)을 함유하며; 예를 들어, 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens)(시스테인형 효소), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)(세린형 효소)의 FGE 또는 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 FGE에 의한 변형이 쉽다.
설파타제 모티프는 T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 상의 임의의 목적하는 위치에 혼입될 수 있다. 설파타제 모티프는 에피토프(예를 들어, 펩타이드를 제공하는 에피토프)를 혼입시키 데 뿐만 아니라 (예를 들어, 약물 및 진단 분자와의 접합체의 형성에서) 페이로드를 혼입시키는 데 사용될 수 있다. 실시형태에서, 설파타제 모티프는 제1 및 제2 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC-H 및 β2M 폴리펩타이드)를 비롯한 T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에서 임의의 요소의 말단에 또는 말단 근처에, 스캐폴드 또는 Ig Fc, 및 해당 요소 부근의 링커가 첨가될 수 있다. 실시형태에서, 설파타제 모티프는 β2M, 클래스 I MHC 중쇄 및/또는 Fc Ig 폴리펩타이드에 혼입될 수 있다. 실시형태에서, 설파타제 모티프는 제1 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, β2M 폴리펩타이드) 또는 이에 부착된 링커의 아미노 말단 단부 근처에 또는 말단 단부에서 제1 폴리펩타이드에 혼입될 수 있다. 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드가 β2M 폴리펩타이드 서열을 포함하는 경우에, 설파타제 모티프 X1(C/S)X2PX3Z3(서열번호 45, 여기서 Z1은 C 또는 S이고, Z2는 P임)은 β2M 서열의 N-말단에 또는 근처에 혼입되어, 예를 들어, 직접적으로 또는 링커를 통해 에피토프의 화학적 접합을 가능하게 할 수 있다. 예로서, 도 4에 나타낸 바와 같은 β2 마이크로글로불린의 성숙 서열은 20개의 아미노산 서열 리더 서열로 시작하며, 성숙 폴리펩타이드는 초기 서열 IQ(R/K)TP(K/Q)IQVYS... (서열번호 151 내지 155의 aa 잔기 21 내지 31)로 시작하고 β2M 폴리펩타이드의 나머지를 지나서 계속된다. 따라서, β2M(링커가 있거나 또는 없음)의 N-말단 영역에서 아미노산에 연결된 설파타제 모티프는, 예를 들어, 하기와 같이 나타낼 수 있거나:
Figure pct00001
또는 인간 β2M 리더 서열 MSRSVALAVLALLSLSGLEA(서열번호 151의 aas 1 내지 20) 및 선택적 링커(예를 들어, 링커 펩타이드)로 나타낸 바와 같을 수 있으며,
Figure pct00002
링커는, 존재한다면, 독립적으로 선택된 아미노산 서열(예를 들어, 1 내지 50 aa, 예컨대 폴리글리신, 폴리알라닌, 폴리세린 및 폴리-Gly, 예컨대 AAAGG(서열번호 75) 또는 (GGGGS)n(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임)(서열번호 76))을 포함할 수 있다. 나타낸 링커는 존재하거나 부재일 수 있고, 2개가 나타날 때, 이들은 동일 또는 상이할 수 있다.
실시형태에서, 설파타제 모티프는 도 4에 나타낸 서열(예를 들어, 도 4에 나타낸 임의의 전장 서열, 또는 아미노산 21에서 시작하고 이들의 C-말단에서 끝나는 임의의 성숙 β2M 폴리펩타이드의 서열)에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%, 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열이 있는 β2M 폴리펩타이드를 갖는 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에서 T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)에 혼입되거나 또는 (예를 들어, 펩타이드 링커를 통해) 부착된다. 본 실시형태의 목적을 위해, β2M 폴리펩타이드의 서열 동일성은 첨가된 설파타제 모티프 및 존재하는 임의의 링커 서열과 상관없이 도 4의 β2M 폴리펩타이드의 대응하는 부분에 대해 결정된다.
실시형태에서, 설파타제 모티프는 첨가된 A2-5 또는 G2-5 모티프 및 존재하는 임의의 링커 서열을 고려하지 않고 평가된 아미노산 결실, 삽입 및/또는 변화를 갖는 도 4에 나타낸 서열(예를 들어, 도 4에 나타낸 임의의 전장 서열, 또는 아미노산 21에서 시작하고 이들의 C-말단에서 끝나는 임의의 성숙 β2M 폴리펩타이드의 서열)에 비해 1 내지 15개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개)의 아미노산 결실, 삽입 및/또는 변화가 있는 β2M 폴리펩타이드 서열을 갖는 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드를 갖는 T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)에 혼입되거나 또는 (예를 들어, N-말단, C-말단 또는 N-말단과 C-말단 둘 다에서 하나 이상의 독립적으로 선택된 펩타이드 링커를 통해) 부착된다. 본 실시형태의 목적을 위해, β2M 폴리펩타이드의 아미노산 결실, 삽입 및/또는 변화는 설파타제 모티프 및 존재하는 임의의 링커 서열의 아미노산과 상관없이 도 4의 β2M 폴리펩타이드의 대응하는 부분에 대해 결정된다. 하나의 이러한 실시형태에서, (예를 들어, 상기 기재한 식 X1Z1X2Z2X3Z3, (C/S)X2(P/A)X3Z3, X1CX2PX3R 또는 X1CX2PX3L의) 설파타제 모티프는 성숙 β2M 서열, 예컨대 도 4에 나타낸 것의 임의의 아미노 말단의 15개의 아미노산을 대체하고/하거나 사이에 삽입될 수 있다.
다른 실시형태에서, 식 (I) 서열번호 45 또는 (II) 서열번호 46의 설파타제 모티프는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위로서 Ig Fc 영역에 혼입되거나 (예를 들어, 펩타이드 링커를 통해) 부착될 수 있다. 실시형태에서, 설파타제 모티프는 설파타제 모티프 서열의 첨가 전에 도 2에 나타낸 서열의 대응하는 부분에 비해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열에 혼입된다. 하나의 이러한 실시형태에서, 설파타제 모티프는, 예를 들어, 직접적으로 또는 펩타이드 또는 화학적 링커를 통해 간접적으로 에피토프 및/또는 페이로드의 접합을 위한 부위로서 이용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 서열번호 45(식 (I)) 또는 서열번호 46(식 II)의 설파타제 모티프는 화학적 접합 부위로서 MHC-H 폴리펩타이드 서열에 혼입될 수 있다. 실시형태에서, 설파타제 모티프는 설파타제 모티프 서열의 첨가 전에 도 3에 나타낸 서열의 대응하는 부분에 비해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 MHC-H 서열에 혼입된다. 하나의 이러한 실시형태에서, 설파타제 모티프는, 예를 들어, 직접적으로 또는 펩타이드 또는 화학적 링커를 통해 간접적으로 에피토프 및/또는 페이로드의 접합을 위한 부위로서 이용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 서열번호 45(식 (I)) 또는 서열번호 46(식 II)의 설파타제 모티프의 하나 이상의 복제물은 하나 이상의 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위로서 IgFc 영역에 혼입될 수 있다. 하나의 이러한 실시형태에서, 이들은, 예를 들어, 직접적으로 또는 펩타이드 또는 화학적 링커를 통해 간접적으로 에피토프 및/또는 페이로드의 접합을 위한 부위로서 이용될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 알데하이드 태그의 설파타제 모티프는 길이가 적어도 5 또는 6개의 아미노산 잔기이지만, 예를 들어, 5 내지 16개의 아미노산일 수 있다. 알데하이드 태그가 설파타제 모티프와 "보조 모티프"를 둘 다 포함하도록, 모티프는 N-말단과 C-말단 중 하나 또는 둘 다에서 추가적인 잔기를 함유할 수 있다. 실시형태에서, 설파타제 모티프는 C-말단의 보조 모티프(즉, 모티프의 Z3 위치 다음)를 포함하고, AALLTGR (서열번호 49), SQLLTGR (서열번호 50), AAFMTGR (서열번호 51), AAFLTGR(서열번호 52) 및 GSLFTGR (서열번호 53)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 인접한 잔기의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 모두 7개를 포함할 수 있으며; 수많은 다른 보조 모티프가 기재되었다. 보조 모티프 아미노산 잔기는 알데하이드 태그의 설파타제 모티프의 FGE 매개 전환에 필요하지 않으며, 따라서 단지 선택적이고, 본 명세서에 기재된 알데하이드 태그로부터 특이적으로 제외될 수 있다.
미국 특허 제9,540,438호는 Fc 영역 폴리펩타이드를 포함하는 다양한 면역글로불린 서열 내로의 설파타제 모티프의 혼입을 논의하며, 설파타제 모티프 및 Fc 폴리펩타이드 및 다른 폴리펩타이드의 변형에 대한 교시에 대해 본 명세서에 참고에 의해 포함된다. 해당 특허는 또한 FGE 효소, 및 fGly 잔기뿐만 아니라 분자 결합과 관련된 화학, 예컨대 fGly 잔기에 대한 에피토프 및 페이로드를 형성함에 있어서 이들의 용도에 대한 이의 가이드에 대해 참고로 포함된다.
설파타제 모티프의 혼입은 T-세포-MMP의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 내 목적하는 위치에서 모티프를 암호화하는 핵산 서열을 혼입함으로써 달성될 수 있다. 이하에 논의하는 바와 같이, 핵산 서열은 전사 조절 서열(들)(프로모터)의 제어 하에 놓일 수 있으며, 발현을 지시하는 조절 요소가 제공된다. 발현된 단백질은 발현 및 부분적 또는 완전한 정제 후에 하나 이상의 FGE로 처리될 수 있다. 대안적으로, 설파타제 모티프를 인식하는 FGE를 발현시키는 세포 내 핵산의 발현은 모티프의 시스테인 또는 세린이 때때로 옥소알라닌으로 불리는 fGly로 전환되게 한다. 2개 이상의 상이한 설파타제 모티프(예를 들어, 제1 및 제2 설파타제 모티프)가 존재하는 경우에, 또한 세포의 발현 동안 각각의 모티프, 또는 세포 발현 및 부분적 또는 완전한 정제 후에 각각의 모티프의 전환을 수행할 수 있다. FGE의 각각에 의해 우선적으로 전환되는 상이한 모티프 선택성 및 모티프를 갖는 2 이상의 FGE 효과를 이용하여, 세포의 발현 동안 적어도 하나의 설파타제 모티프 및 부분적 또는 완전한 정제 후에 적어도 하나의 설파타제 모티프를 순차적으로 전환시키거나, 또는 발현 후에 설파타제 모티프를 fGly 잔기로 별개로 전환시킬 수 있다. 이하에 논의하는 바와 같이, 상이한 설파타제 모티프를 별개로 전환시키고 순차적 방식으로 에피토프 및/또는 페이로드에 화학적으로 결합시키는 능력은 상이한 모티프의 위치에서 상이한 에피토프 또는 페이로드를 혼입시키기 위해 설파타제를 결합의 사용을 가능하게 한다.
비전환 설파타제 모티프를 갖는 폴리펩타이드의 생성을 위한 숙주 세포, 또는 세포가 fGly-함유 폴리펩타이드 서열을 전환시키기에 적합한 FGE를 발현시키는 경우, 원핵 및 진핵 유기체의 FGE를 포함한다. 비제한적 예는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주, 바실러스 종(Bacillus spp.)(예를 들어, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 등), 효모 또는 진균(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae), 피키아 종(Pichia spp.) 등)을 포함한다. 더 고등 유기체, 예컨대 곤충 및 척추동물, 특정 포유류로부터 유래된 것을 포함하는 다른 숙주 세포의 예는 CHO 세포, HEK 세포 등(예를 들어, 미국 미생물 보존 센터(ATCC) 번호 CCL-2), CHO 세포(예를 들어, ATCC Nos. CRL9618 및 CRL9096), CHO DG44 세포, CHO-Kl 세포(ATCC CCL-61), 293 세포(예를 들어, ATCC 번호 CRL-1573), Vero 세포, NIH 3T3 세포(예를 들어, ATCC 번호 CRL-1658), Hnh-7 세포, BHK 세포(예를 들어, ATCC 번호 CCLlO), PC12 세포(ATCC 번호 CRL1721), COS 세포, COS-7 세포(ATCC 번호 CRL1651), RAT1 세포, 마우스 L 세포(ATCC 번호 CCLI.3), 인간 배아 신장(HEK) 세포(ATCC 번호 CRL1573), HLHepG2 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다양한 FGE는 설파타제 모티프 내 시스테인 또는 세린의 fGly로의 전환(산화)을 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 폼일글리신 생성 효소, 또는 FGE는 설파타제 모티프의 시스테인 또는 세린의 fGly로의 전환을 촉매하는 fGly-생성 효소를 지칭한다. 미국 특허 제9,540,438호에 논의되는 바와 같이, 문헌은 종종 모티프의 시스테인을 fGly로 전환시키는 해당 효소에 대해 폼일글리신-생성 효소라는 용어를 사용하는 반면, 설파타제 모티프 내 세린을 fGly으로 전환시키는 효소는 Ats-B-유사로 지칭된다.
FGE는 2개의 범주, 즉, 호기성 및 혐기성으로 나누어질 수 있다. 진핵 효소(예를 들어, 인간 효소)를 포함하는 호기성 효소는 시스테인 잔기를 fGly로 전환시키며, 여기서 시스테인은 일반적으로 식 X1CX2PX3Z3(서열번호 47)의 설파타제 모티프와 관련한다. 진핵 FGE는 "SUMF1-형"을 가지며, SUMF1 유전자에 의해 인간에서 암호화된다. 혐기성 효소는 가장 흔하게는 원핵생물 공급원(예를 들어, 클로스트리듐 페르프린겐스, 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) 또는 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis))로부터 유래되는 AtsB 형을 가지며, 호기성 형태와 상이한 메커니즘을 이용하여 설파타제 모티프 내 시스테인 또는 세린을 fGly로 전환시킬 수 있는 것으로 나타난다.
fGly로의 세린 또는 시스테인 전환을 촉매하는 능력은 효소 및 설파타제 모티프에 의존한다. 세린 및 시스테인을 전환시키는 FGE의 능력 차이 때문에, 상이한 설파타제 모티프가 상이한 화학적 접합 부위로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 진핵 호기성 SUMF1-형 FGE에 의한 전환이 쉬운 시스테인 함유 부위와 AtsB-형 FGE에 의한 전환이 쉬운 세린 함유 부위를 둘 다 암호화하는 서열을 T-세포-MMP에 혼입시킬 수 있다. SumF1-형 FGE를 발현시키는 진핵 세포에서 발현 후에, 시스테인 모티프는 에피토프 또는 페이로드와의 제1 화학적 접합 처리될 수 있는 fGly 잔기를 보유할 것이다. 제1 화학적 접합 후에, T-세포-MMP 접합체는 무 세포 시스템에서 AtsB-형 세린-형 효소로 처리되고, 이어서, 세린 함유 모티프로부터 생성된 fGly는 제1 화학적 접합에서 사용되는 것과 동일하거나 상이한 분자와의 화학적 접합 처리될 수 있다.
앞서 언급한 것에 비추어, 본 개시내용은 상기 논의한 바와 같은 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 쇄의 서열에 혼입되는 하나 이상의 fGly 잔기를 포함하는 T-세포-MMP를 제공한다. fGly 잔기는, 예를 들어, X1(fGly)X2Z2X3Z3과 관련될 수 있으며, 여기서, fGly는 폼일글리신 잔기이고; Z2, Z3, X1, X2 및 X3은 상기 식 (I)에 정의된 바와 같다.
화학적 접합 후에, T-세포-MMP는 서열 X1(fGly')X2Z2X3Z3에 관해 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드쇄의 서열에 혼입된 하나 이상의 fGly의 잔기를 포함하며, fGly의 잔기는 화학 반응을 겪고, 모이어티(예를 들어, 에피토프 또는 페이로드)에 공유적으로 부착된 폼일글리신이다.
다수의 화학 및 상업적으로 입수 가능한 시약은 티오세미카바자이드, 아미노옥시, 하이드라자이드, 또는 하이드라지노, fGly-함유 화학적 접합 부위에 결합될 분자의 유도체의 사용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 fGly 잔기에 대한 분자(예를 들어, 에피토프 또는 페이로드)를 접합하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, (예를 들어, 펩타이드의 아미노산에 직접 부착되거나 또는 PEG와 같은 링커를 통해) 티오세미카바자이드, 아미노옥시, 하이드라자이드, 하이드라지노 또는 하이드라진일 작용기를 보유하는 에피토프(예를 들어, 에피토프 펩타이드) 및/또는 페이로드는 T-세포-MMP의 fGly-함유 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드와 반응되어 공유적으로 연결된 에피토프를 형성할 수 있다. 유사하게, 페이로드, 예컨대 약물 및 치료제는, 예를 들어, 연결제로서 바이오틴 하이드라자이드를 이용하여 혼입될 수 있다.
실시형태에서, 펩타이드(예를 들어, 에피토프 함유 펩타이드)는 T-세포-MMP의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드에 혼입된 fGly 잔기와 반응하는 친핵체-함유 모이어티(예를 들어, 아미노옥시 또는 하이드라자이드 모이어티)를 혼입하도록 변형된다. 반응은 T-세포-MMP 및 펩타이드(예를 들어, 에피토프 또는 페이로드)가 (예를 들어, 하이드라존 또는 옥심에 의해) 공유적으로 연결되는 접합체의 형성을 야기한다. (예를 들어, 미국 특허 제9,238,878호 및 제7,351,797호; 문헌[Interchem, Aminooxy & Aldehyde PEO/PEG reagents for Biorthogonal Conjugation and Labeling Featuring Oxime Formation (업데이트)], http://www.interchim.fr/ft/J/JV2290.pdf (2017년 9월 2일자로 액서스됨)에서 입수 가능.
실시형태에서, 티오세미카바자이드, 아미노옥시, 하이드라자이드 또는 하이드라지노기를 보유하는 에피토프(예를 들어, 펩타이드 에피토프) 및/또는 페이로드는 T-세포-MMP의 fGly-함유 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드와 반응된다. 반응은 T-세포-MMP와 에피토프 및/또는 페이로드 사이의 공유 결합 형성을 초래한다. 미국 특허 제9,540,438호 및 미국 특허 공개 제2017/0166639 Al호에 논의되는 바와 같이, 얻어진 접합체는 하기 형태의 구조(변형된 아미노산 잔기)를 함유할 수 있다:
Figure pct00003
식 중:
J1은 공유 결합된 모이어티이고;
각각의 L1이 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 사이클로알킬렌, 치환된 사이클로알킬렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 헤테로사이클렌, 치환된 헤테로사이클렌, 아실, 아미도, 아실옥시, 우레탄일렌, 티오에스터, 설폰일, 설폰아마이드, 설폰일 에스터, -O-, -S-, -NH- 및 치환된 아민으로부터 독립적으로 선택된 2가 모이어티이고; 그리고
n은 0 내지 40으로부터 선택되는 수(예를 들어, 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30 또는 30 내지 40)이다.
실시형태에서, 에피토프 및/또는 페이로드는 fGly 아미노산 잔기를 보유하는 T-세포-MMP에 대한 공유 부착을 가능하게 하는 환식 치환(예를 들어, 인돌)을 보유하는 것을 포함하는, 공유적으로 결합된 하이드라진일기를 포함하도록 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 하이드라진일 화합물은 하기 식 (III)의 화합물이다:
Figure pct00004
식 (III)의 목적을 위해:
R"'은 fGly 함유 폴리펩타이드에 접합될 관심 대상의 페이로드 또는 에피토프일 수 있으며;
R' 및 R"은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 설폰일, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 목적하는 치환체일 수 있고;
Q10, Q20, Q30 및 Q40은 CR11, NR12, N, O 또는 S일 수 있으며;
Q10, Q20, Q30 및 Q40 중 하나는 선택적이고, R11 및 R12는 임의의 목적하는 치환체(예를 들어, 알킬)일 수 있다. 미국 특허 공개 제2015/0352225호 참조.
다른 실시형태에서, 변형된 에피토프 및 페이로드(예를 들어, 약물 및/또는 진단제)의 하이드라진일기는 식 (IV), (V), (Va), (VI), 또는 (VIa)에 의해 제공되는 구조를 가진다. 펩타이드 및 폴리펩타이드를 수반하는 접합체를 포함하는 생물학적 접합체의 형성에서 하이드라진일 화합물의 제조 및 용도에 대한 교시에 대해 참조에 의해 포함되는 미국 특허 제9,310,374호 참조.
Figure pct00005
Figure pct00006
본 부문에 열거된 식 (IV), (V), (Va), (VI) 또는 (VIa)의 목적을 위해:
Q2 및 Q3 중 하나는 -(CH2) n NR3NHR2이고, 다른 하나는 Y4이며;
n은 0 또는 1이고;
R2 및 R3은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 설폰일, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택되며;
X1, X2, X3 및 X4는 C, N, O 및 S로부터 각각 독립적으로 선택되고;
Y1, Y2, Y3 및 Y4는 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 설폰일, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택되며;
L은 선택적 링커이고; 그리고
W1은 에피토프(예를 들어, 에피토프 폴리펩타이드), 약물, 진단제 또는 다른 페이로드로부터 선택된다.
알데하이드 작용기가 있는 펩타이드를 갖는 구조에 속하는 하이드라진일 인돌의 예시적인 반응을 도 8에 개략적으로 나타낸다.
실시형태에서, Q2는 -(CH2)nNR3NHR2이고, Q3은 Y4이다. 실시형태에서, Q3은 -(CH2)nNR3NHR2이고, Q2는 Y4이다. 실시형태에서, n은 1이다. 실시형태에서, R2 및 R3은 알킬 및 치환된 알킬로부터 각각 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, R2 및 R3은 각각 메틸이다. 실시형태에서, X1, X2, X3 및 X4는 각각 C이다. 실시형태에서, Y1, Y2, Y3 및 Y4는 각각 H이다.
실시형태에서, L이 존재하며, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카복실, 카복실 에스터, 아실 아미노, 알킬아마이드, 치환된 알킬아마이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되는 기를 포함한다. 일부 실시형태에서, L이 존재하며, 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다.
식 (IV), (V), (Va), (VI) 또는 (VIa)의 목적을 위해:
1. "알킬"은 1 내지 10개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 1가 포화 지방족 탄화수소기를 지칭한다. 이 용어는, 예로서, 선형 및 분지형 탄화수소기, 예컨대 메틸(CH3-), 에틸(CH3CH2-), n-프로필(CH3CH2CH2-), 아이소프로필((CH3)2CH-), n-뷰틸(CH3CH2CH2CH2-), 아이소뷰틸((CH3)2CHCH2-), sec-뷰틸((CH3)(CH3CH2)CH-), t-뷰틸((CH3)3C-), n-펜틸(CH3CH2CH2CH2CH2-) 및 네오펜틸((CH3)3CCH2-)을 포함한다.
2. 용어 "치환된 알킬"은 본 명세서에 정의된 바와 같은 알킬기를 지칭하되, 알킬쇄 내 하나 이상의 탄소 원자는 헤테로원자, 예컨대 -O-, -N-, -S-, -S(O)n-(여기서, n은 0 내지 2임), 또는 -NR-(여기서 R은 수소 또는 알킬임)로 선택적으로 대체되고 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 사이아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카복실, 카복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴 및 -NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 5개의 치환체를 갖되, Ra 및 Rb는 동일하거나 상이하고, 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 사이클로알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴 및 복소환식으로부터 선택된다.
3. "알킬렌"은 직쇄 또는 분지쇄인 1 내지 6개, 더 바람직하게는 1 내지 3개의 탄소 원자를 바람직하게 갖고, 선택적으로 -O-, -NR10-, -NR10C(O)-, -C(O)NR10- 등으로부터 선택되는 하나 이상의 기로 가로막히는 2가 지방족 탄화수소기를 지칭한다. 이 용어는 예로서, 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(-CH2CH2-), n-프로필렌(-CH2CH2CH2-), 아이소-프로필렌(-CH2CH(CH3)-), (-C(CH3)2CH2CH2-), (-C(CH3)2CH2C(O)-), (-C(CH3)2CH2C(O)NH-), (-CH(CH3)CH2-) 등을 포함한다.
4. R10은 H 또는 알킬(예를 들어, H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2CH2CH3)이다.
5. "치환된 알킬렌"은 이하의 "치환된"의 정의에서 탄소에 대해 기재되는 치환체로 대체되는 1 내지 3개의 수소를 갖는 알킬렌기를 지칭한다.
6. 용어 "알칸"은 본 명세서에 정의된 바와 같은 알킬기 및 알킬렌기를 지칭한다.
7. 용어 "알킬아미노알킬", "알킬아미노알켄일" 및 "알킬아미노알킨일"은 R'NHR"-기를 지칭하며, 여기서 R'는 본 명세서에 정의된 바와 같은 알킬기이고, R"는 본 명세서에 정의된 바와 같은 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키닐렌기이다.
8. 용어 "알카릴" 또는 "아르알킬"은 -알킬렌-아릴 및 -치환된 알킬렌-아릴기를 지칭하며, 알킬렌, 치환된 알킬렌 및 아릴은 본 명세서에 정의되어 있다.
9. "알콕시"는 -O-알킬기를 지칭하되, 알킬은 본 명세서에 정의된 바와 같다. 알콕시는, 예로서, 메톡시시, 에톡시, n-프로폭시, 아이소프로폭시, n-뷰톡시, t-뷰톡시, sec-뷰톡시, n-펜톡시 등을 포함한다. 용어 "알콕시"는 또한 알켄일-O-, 사이클로알킬-O-, 사이클로알켄일-O- 및 알킨일-O-기를 지칭하며, 알켄일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 및 알킨일은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
10. 용어 "치환된 알콕시"는 치환된 알킬-O-, 치환된 알켄일-O-, 치환된 사이클로알킬-O-, 치환된 사이클로알켄일-O- 및 치환된 알킨일-O-기를 지칭하며, 치환된 알킬, 치환된 알켄일, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알켄일 및 치환된 알킨일은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
11. 용어 "알콕시아미노"는 -NH-알콕시기를 지칭하되, 알콕시는 본 명세서에 정의되어 있다.
12. 용어 "할로알콕시"는 알킬-O-기를 지칭하되, 알킬기 상의 하나 이상의 수소 원자는 할로기로 치환되었고, 예로서, 트라이플루오로메톡시 등과 같은 기를 포함한다.
13. 용어 "할로알킬"은 상기 기재한 바와 같은 치환된 알킬기를 지칭하되, 알킬기 상의 수소 원자는 할로기로 치환되었다. 이러한 기의 예는 플루오로알킬기, 예컨대 트라이플루오로메틸, 다이플루오로메틸, 트라이플루오로에틸 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
14. 용어 "알킬알콕시"는 -알킬렌-O-알킬, 알킬렌-O-치환된 알킬, 치환된 알킬렌-O-알킬 및 치환된 알킬렌-O-치환된 알킬기를 지칭하되, 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌 및 치환된 알킬렌은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
15. 용어 "알킬티오알콕시"는 -알킬렌-S-알킬, 알킬렌-S-치환된 알킬, 치환된 알킬렌-S-알킬 및 치환된 알킬렌-S-치환된 알킬기를 지칭하되, 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌 및 치환된 알킬렌은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
16. "알켄일"은 2 내지 6개의 탄소 원자 및 바람직하게는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖고, 이중 결합 불포화의 적어도 1개, 바람직하게는 1 내지 2개 부위를 갖는 직쇄 또는 분지형의 탄화수소기를 지칭한다. 이 용어는, 예로서, 바이-비닐, 알릴 및 부트-3-엔-1-일을 포함한다. 본 용어 내에 시스 및 트랜스 이성질체 또는 이들 이성질체의 혼합물이 포함된다.
17. 용어 "치환된 알켄일"은 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 사이아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카복실, 카복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택되는 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체를 갖는 본 명세서에 정의된 바와 같은 알켄일기를 지칭한다.
18. "알킨일"은 2 내지 6개의 탄소 원자 및 바람직하게는 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖고, 삼중 결합 불포화의 적어도 1개, 바람직하게는 1 내지 2개 부위를 갖는 직쇄 또는 분지형의 1가 탄화수소기를 지칭한다. 이러한 알킨일기의 예는 아세틸렌일(-C≡CH) 및 프로파길(-CH2C≡CH)을 포함한다.
19. 용어 "치환된 알킨일"은 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 사이아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카복실, 카복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택되는 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체를 갖는 본 명세서에 정의된 바와 같은 알킨일기를 지칭한다.
20. "알킨일옥시"는 -O-알킨일기를 지칭하되, 알킨일은 본 명세서에 정의된 바와 같다. 알킨일옥시는, 예로서, 에틴일옥시, 프로핀일옥시 등을 포함한다.
21. "아실"은 H-C(O)-, 알킬-C(O)-, 치환된 알킬-C(O)-, 알켄일-C(O)-, 치환된 알켄일-C(O)-, 알킨일-C(O)-, 치환된 알킨일-C(O)-, 사이클로알킬-C(O)-, 치환된 사이클로알킬-C(O)-, 사이클로알켄일-C(O)-, 치환된 사이클로알켄일-C(O)-, 아릴-C(O)-, 치환된 아릴-C(O)-, 헤테로아릴-C(O)-, 치환된 헤테로아릴-C(O)-, 헤테로사이클릴-C(O)- 및 치환된 헤테로사이클릴-C(O)-기를 지칭하되, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 복소환식, 및 치환된 복소환식은 본 명세서에 정의된 바와 같다. 예를 들어, 아실은 "아세틸"기 CH3C(O)-를 포함한다.
22. "아실아미노"는 -NR20C(O)알킬, -NR20C(O)치환된 알킬, NR20C(O)사이클로알킬, -NR20C(O)치환된 사이클로알킬, -NR20C(O)사이클로알켄일, -NR20C(O)치환된 사이클로알켄일, -NR20C(O)알켄일, -NR20C(O)치환된 알켄일, -NR20C(O)알킨일, -NR20C(O)치환된 알킨일, -NR20C(O)아릴, -NR20C(O)치환된 아릴, -NR20C(O)헤테로아릴, -NR20C(O)치환된 헤테로아릴, -NR20C(O)복소환식, 및 -NR20C(O)치환된 복소환식기를 지칭하되, R20은 수소 또는 알킬이고, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 복소환식 및 치환된 복소환식은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
23. "아미노카보닐" 또는 용어 "아미노아실"은 -C(O)NR21R22기를 지칭하되, R21 및 R22는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 복소환식, 및 치환된 복소환식으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, R21 및 R22는 선택적으로 이에 결합된 질소와 함께 결합되어 복소환식 또는 치환된 복소환식기를 형성하고, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 복소환식 및 치환된 복소환식은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
24. "아미노카본일아미노"는 -NR21C(O)NR22R23기를 지칭하며, R21, R22 및 R23은 수소, 알킬, 아릴 또는 사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 2개의 R기는 결합되어 헤테로사이클릴기를 형성한다.
25. 용어 "알콕시카본일아미노"는 -NRC(O)OR기를 지칭하며, 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릴이되, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로사이클릴은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
26. 용어 "아실옥시"는 알킬-C(O)O-, 치환된 알킬-C(O)O-, 사이클로알킬-C(O)O-, 치환된 사이클로알킬-C(O)O-, 아릴-C(O)O-, 헤테로아릴-C(O)O- 및 헤테로사이클릴-C(O)O-기를 지칭하되, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로사이클릴은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
27. "아미노설폰일"은 -SO2NR21R22기를 지칭하되, R21 및 R22는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 복소환식, 및 치환된 복소환식으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, R21 및 R22는 선택적으로 이에 결합된 질소와 함께 결합되어 복소환식 또는 치환된 복소환식기를 형성하고, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 복소환식 및 치환된 복소환식은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
28. "설폰일아미노"는 -NR21SO2R22기를 지칭하되, R21 및 R22는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 치환된 아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 복소환식, 및 치환된 복소환식으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, R21 및 R22는 선택적으로 이에 결합된 원자와 함께 결합되어 복소환식 또는 치환된 복소환식기를 형성하고, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 복소환식 및 치환된 복소환식은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
29. "아릴" 또는 "Ar"은 단일 고리를 갖는 6 내지 18개의 탄소 원자의 1가 방향족 탄소환식기(예컨대 페닐기에 존재) 또는 다중 축합 고리를 갖는 고리계(이러한 방향족 고리계의 예는 나프틸, 안트릴 및 인단일을 포함함)를 지칭하며, 이 축합 고리는 방향족일 수도 있고 아닐 수도 있으며, 단, 부착 지점은 방향족 고리의 원자를 통한다. 이 용어는, 예로서, 페닐 및 나프틸을 포함한다. 아릴 치환체에 대한 정의에 의해 달리 제한되지 않는 한, 이러한 아릴기는 선택적으로 치환되어 아실옥시, 하이드록시, 티올, 아실, 알킬, 알콕시, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 알켄일, 치환된 알킨일, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알켄일, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아실아미노, 알카릴, 아릴, 아릴옥시, 아지도, 카복실, 카복실알킬, 사이아노, 할로겐, 나이트로, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 아미노아실옥시, 옥시아실아미노, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴 및 트라이할로메틸로부터 선택되는 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체를 갖는 "치환된 아릴"을 형성할 수 있다.
30. "아릴옥시"는 -O-아릴기를 지칭하되, 예로서, 선택적으로 본 명세서에 또한 정의되는 치환된 아릴기를 비롯한, 페녹시, 나프톡시 등을 포함하는 아릴은 본 명세서에 정의되는 바와 같다.
31. "아미노"는 -NH2 기를 지칭한다.
32. 용어 "치환된 아미노"는 -NRR기를 지칭하되, 각각의 R은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 단, 적어도 하나의 R은 수소가 아니다.
33. 용어 "아지도"는 -N3 기를 지칭한다.
34. "카복실", "카복시" 또는 "카복실레이트"는 -CO2H 또는 이의 염을 지칭한다.
35. "카복실 에스터" 또는 "카복시 에스터" 또는 용어 "카복시알킬" 또는 "카복실알킬"은 -C(O)O-알킬, -C(O)O-치환된 알킬, -C(O)O-알켄일, -C(O)O-치환된 알켄일, -C(O)O-알킨일, -C(O)O-치환된 알킨일, -C(O)O-아릴, -C(O)O-치환된 아릴, -C(O)O-사이클로알킬, -C(O)O-치환된 사이클로알킬, -C(O)O-사이클로알켄일, -C(O)O-치환된 사이클로알켄일, -C(O)O-헤테로아릴, -C(O)O-치환된 헤테로아릴, -C(O)O-복소환식 및 -C(O)O-치환된 복소환식기를 지칭하되, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 복소환식 및 치환된 복소환식은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
36. "(카복실 에스터)옥시" 또는 "카보네이트"는 -O-C(O)O-알킬, -O-C(O)O-치환된 알킬, -O-C(O)O-알켄일, -O-C(O)O-치환된 알켄일, -O-C(O)O-알킨일, -O-C(O)O-치환된 알킨일, -O-C(O)O-아릴, -O-C(O)O-치환된 아릴, -O-C(O)O-사이클로알킬, -O-C(O)O-치환된 사이클로알킬, -O-C(O)O-사이클로알켄일, -O-C(O)O-치환된 사이클로알켄일, -O-C(O)O-헤테로아릴, -O-C(O)O-치환된 헤테로아릴, -O-C(O)O-복소환식 및 -O-C(O)O-치환된 복소환식기를 지칭하되, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 복소환식 및 치환된 복소환식은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
37. "사이아노" 또는 "나이트릴"은 -CN기를 지칭한다.
38. "사이클로알킬"은 축합, 브리지 및 나선형 시스템을 비롯한 단일 또는 다중 환식 고리를 갖는 3 내지 10개의 탄소 원자의 환식 알킬기를 지칭한다. 적합한 사이클로알킬기의 예는, 예를 들어, 아다만틸, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로옥틸 등을 포함한다. 이러한 사이클로알킬기는, 예로서, 단일 고리 구조, 예컨대 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로옥틸 등, 또는 다중 고리 구조, 예컨대 아다만틸 등을 포함한다.
39. 용어 "치환된 사이클로알킬"은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 사이아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카복실, 카복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택되는 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체를 갖는 본 명세서에 정의된 바와 같은 사이클로알킬기를 지칭한다.
40. "사이클로알켄일"은 단일 또는 다중 고리를 갖고, 적어도 하나의 이중 결합, 바람직하게는 1 내지 2개의 이중 결합을 갖는 3 내지 10개의 탄소 원자의 비방향족 환식 알킬기를 지칭한다.
41. 용어 "치환된 사이클로알켄일"은 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 사이아노, 할로겐, 하이드록실, 케토, 티오케토, 카복실, 카복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택되는 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체를 갖는 본 명세서에 정의된 바와 같은 사이클로알켄일기를 지칭한다.
42. "사이클로알킨일"은 단일 또는 다중 고리를 갖고 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는 5 내지 10개의 탄소 원자의 비방향족 사이클로알킬기를 지칭한다.
43. "사이클로알콕시"는 -O-사이클로알킬을 지칭한다.
44. "사이클로알켄일옥시"는 -O-사이클로알켄일을 지칭한다.
45. "할로" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 지칭한다.
46. "하이드록시" 또는 "하이드록실"은 -OH기를 지칭한다.
47. "헤테로아릴"은 1 내지 15개의 탄소 원자, 예컨대 1 내지 10개의 탄소 원자 및 고리 내의 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 10개의 헤테로원자의 방향족기를 지칭한다. 이러한 헤테로아릴기는 고리계에서(예를 들어, 인돌리진일, 퀴놀린일, 벤조퓨란, 벤즈이미다졸릴 또는 벤조티엔일과 같은 기에서와 같이) 단일 고리(예컨대, 피리딘일, 이미다졸릴 또는 퓨릴) 또는 다중 축합 고리를 가질 수 있되, 고리계 내의 적어도 하나의 고리는 방향족이며, 단, 부착 지점은 방향족 고리의 원자를 통한다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴기의 질소 및/또는 황 고리 원자(들)는 선택적으로 산화되어 N-옥사이드(N->O), 설핀일 또는 설폰일 모이어티를 제공한다. 이 용어는, 예로서, 피리딘일, 피롤릴, 인돌릴, 티오페닐 및 퓨란일을 포함한다. 헤테로아릴 치환체에 대한 정의에 의해 달리 제한되지 않는 한, 이러한 헤테로아릴기는 선택적으로 치환되어 아실옥시, 하이드록시, 티올, 아실, 알킬, 알콕시, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 알켄일, 치환된 알킨일, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알켄일, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아실아미노, 알카릴, 아릴, 아릴옥시, 아지도, 카복실, 카복실알킬, 사이아노, 할로겐, 나이트로, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 아미노아실옥시, 옥시아실아미노, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2 -아릴 및 -SO2-헤테로아릴, 및 트라이할로메틸로부터 선택되는 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체를 갖는 "치환된 헤테로아릴기"를 형성할 수 있다.
48. 용어 "헤테로아르알킬"은 -알킬렌-헤테로아릴기를 지칭하며, 알킬렌 및 헤테로아릴은 본 명세서에 정의된다. 이 용어는 예로서 피리딜메틸, 피리딜에틸, 인돌릴메틸 등을 포함한다.
49. "헤테로아릴옥시"는 -O-헤테로아릴을 지칭한다.
50. "헤테로사이클", "복소환식", "헤테로사이클로알킬" 및 "헤테로사이클릴"은 축합, 브리지 및 스피로 고리계를 비롯한 단일 고리 또는 다중 축합 고리를 갖고, 1 내지 10개의 헤테로원자를 포함하는 3 내지 20개의 고리 원자를 갖는, 포화 또는 불포화기를 지칭한다. 이들 고리 원자는 질소, 황 또는 산소로 이루어진 군으로부터 선택되되, 축합된 고리계에서, 고리 중 하나 이상은 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있고, 단, 부착 지점은 비방향족 고리를 통한다. 특정 실시형태에서, 복소환식기의 질소 및/또는 황 원자(들)는 선택적으로 산화되어 N-옥사이드, -S(O)- 또는 -SO2- 모이어티를 제공한다.
51. 헤테로사이클 및 헤테로아릴의 예는 아제티딘, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 아이소인돌, 인돌, 다이하이드로인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 아이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프틸피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 카바졸, 카볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 페난트롤린, 아이소티아졸, 페나진, 아이속사졸, 페녹사진, 페노티아진, 이미다졸리딘, 이미다졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌린, 프탈이미드, 1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린, 4,5,6,7-테트라하이드로벤조[b]티오펜, 티아졸, 티아졸리딘, 티오펜, 벤조[b]티오펜, 몰폴린일, 티오몰폴린일(또한 티아몰폴린일로서 지칭됨), 1,1-다이옥소티오몰폴린일, 피페리딘일, 피롤리딘, 테트라하이드로퓨란일 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
52. 복소환식 치환체의 정의에 의해 달리 제한되지 않는 한, 이러한 복소환식기는 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 사이아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카복실, 카복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴 및 축합된 헤테로사이클로부터 선택되는 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있다.
53. "헤테로사이클릴옥시"는 -O-헤테로사이클릴기를 지칭한다.
54. 용어 "헤테로사이클릴티오"는 복소환식-S-기를 지칭한다.
55. 용어 "헤테로사이클렌"은 본 명세서에 정의된 바와 같은 헤테로사이클로부터 형성된 2라디칼기를 지칭한다.
56. 용어 "하이드록시아미노"는 -NHOH기를 지칭한다.
57. "나이트로"는 -NO2기를 지칭한다.
58. "옥소"는 원자(=O)를 지칭한다.
59. "설폰일"은 SO2-알킬, SO2-치환된 알킬, SO2-알켄일, SO2-치환된 알켄일, SO2-사이클로알킬, SO2-치환된 사이클로알킬, SO2-사이클로알켄일, SO2-치환된 사이클로알켄일, SO2-아릴, SO2-치환된 아릴, SO2-헤테로아릴, SO2-치환된 헤테로아릴, SO2-복소환식 및 SO2-치환된 복소환식기를 지칭하되, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 복소환식 및 치환된 복소환식은 본 명세서에 정의된 바와 같다. 설폰일은 예로서 메틸-SO2-, 페닐-SO2- 및 4-메틸페닐-SO2-를 포함한다.
60. "설폰일옥시"는 -OSO2-알킬, OSO2-치환된 알킬, OSO2-알켄일, OSO2-치환된 알켄일, OSO2-사이클로알킬, OSO2-치환된 사이클로알킬, OSO2-사이클로알켄일, OSO2-치환된 사이클로알켄일, OSO2-아릴, OSO2-치환된 아릴, OSO2-헤테로아릴, OSO2-치환된 헤테로아릴, OSO2-복소환식 및 OSO2 치환된 복소환식기를 지칭하되, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 치환된 사이클로알켄일, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 복소환식 및 치환된 복소환식은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
61. 용어 "아미노카본일옥시"는 -OC(O)NRR기를 지칭하며, 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 복소환식이되, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 복소환식은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
62. "티올"은 -SH 기를 지칭한다.
63. "티옥소" 또는 용어 "티오케토"는 원자(=S)를 지칭한다.
64. "알킬티오" 또는 용어 "티오알콕시"는 -S-알킬기를 지칭하되, 알킬은 본 명세서에 정의된 바와 같다. 특정 실시형태에서, 황은 -S(O)-로 산화될 수 있다. 설폭사이드는 하나 이상의 입체이성질체로서 존재할 수 있다.
65. 용어 "치환된 티오알콕시"는 -S-치환된 알킬기를 지칭한다.
66. 용어 "티오아릴옥시"는 아릴-S-기를 지칭하되, 또한 본 명세서에 정의된 선택적으로 치환된 아릴기를 포함하는 아릴기는 본 명세서에 정의되는 바와 같다.
67. 용어 "티오헤테로아릴옥시"는 헤테로아릴-S-기를 지칭하되, 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 치환된 아릴기를 포함하는 헤테로아릴기가 본 명세서에 정의된다.
68. 용어 "티오헤테로사이클로옥시"는 헤테로사이클릴-S-기를 지칭하되, 본 명세서에 정의된 바와 같은 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴기를 포함하는 헤테로사이클릴기는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
69. 본 명세서의 개시내용에 추가로, 용어 "치환된"은 구체화된 기 또는 라디칼을 변형시키기 위해 사용될 때, 또한 구체화된 기 또는 라디칼의 하나 이상의 수소 원자가 각가가 서로 독립적으로 이하에 정의되는 것과 동일 또는 상이한 치환체기로 대체된다는 것을 의미할 수 있다.
70. 본 명세서의 개개 용어에 대해 개시되는 기에 추가로, 구체화된 기 또는 라디칼에서 포화된 탄소 원자에 대한 하나 이상의 수소(단일 탄소 상의 임의의 2개의 수소는 =O, =NR70, =N-OR70, =N2 또는 =S로 대체될 수 있음)를 치환하는 치환체기는 달리 구체화되지 않는 한, -R60, 할로, =O, -OR70, -SR70, -NR80R80, 트라이할로메틸, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -SO2R70, -SO2O-M+, -SO2R70, -OSO2R70, -OSO2O-M+, -OSO2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)O-M+, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)O-M+, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2 -M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이며, R60은 선택적으로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 및 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 R70은 독립적으로 수소 또는 R60이고; 각각의 R80은 독립적으로 R70이거나 또는 대안적으로, 2개의 R80은 이들이 결합된 질소 원자와 함께, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클로알킬을 형성하며, 이는 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 동일 또는 상이한 추가적인 헤테로원자 중 1 내지 4개를 선택적으로 포함할 수 있고, 이 중 N은 -H 또는 C1-C3 알킬 치환을 가질 수 있고; 각각의 M+은 순 단일 양전하를 갖는 반대 이온이다. 각각의 M+는 독립적으로, 예를 들어, 알칼리 이온, 예컨대 K+, Na+, Li+; 암모늄 이온, 예컨대 +N(R60)4; 또는 알칼리토금속 이온, 예컨대 [Ca2+]0.5, [Mg2+]0.5 또는 [Ba2+]0.5일 수 있다("0.5"는 이러한 2가 알칼리 이온에 대한 반대 이온 중 하나가 본 발명의 화합물의 이온화된 형태 및 다른 전형적 반대 이온, 예컨대 염화물일 수 있거나, 또는 본 명세서에 개시된 2가지의 이온화된 화합물은 이러한 2가 알칼리토금속 이온에 대한 반대 이온으로서 작용할 수 있거나, 또는 본 발명의 두 가지로 이온화된 화합물은 이러한 2가 알칼리 토금속 이온에 대한 반대 이온으로서 작용할 수 있다는 것을 의미함). 구체적 예로서, -NR80R80은 -NH2, -NH-알킬, N-피롤리딘일, N-피페라진일, 4N-메틸-피페라진-1-일 및 N-몰폴린일을 포함하는 것을 의미한다.
71. 본 개시내용에 추가로, "치환된" 알켄, 알카인, 아릴 및 헤테로아릴기에서 불포화 탄소에 대한 수소에 대한 치환체기는, 달리 구체화되지 않는 한, -R60, 할로, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80, 트라이할로메틸, -CF3, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -SO2R70, -SO3 -M+, -SO3R70, -OSO2R70, -OSO3 -M+, -OSO3R70, -PO3 -2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -CO2 -M+, -CO2R70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OCO2 -M+, -OCO2R70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2 -M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이며, 여기서 R60, R70, R80 및 M+는 앞서 정의되어 있고, 단, 치환된 알켄 또는 알킨의 경우에, 치환체는 -O-M+, -OR70, -SR70 또는 -S-M+가 아니다.
72. 본 명세서의 개개 용어에 대해 개시된 기에 추가로, "치환된" 헤테로알킬 및 사이클로헤테로알킬기에서 질소 원자 상의 수소에 대한 치환체 기는 달리 구체화되지 않는 한, -R60, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80, 트라이할로메틸, -CF3, -CN, -NO, -NO2, -S(O)2R70, -S(O)2O-M+, -S(O)2R70, -OS(O)2R70, -OS(O)2O-M+, -OS(O)2R70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)(OR70), -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70C(O)OR70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이며, 여기서 R60, R70, R80 및 M+는 앞서 정의된 바와 같다.
실시형태에서, fGly 함유 폴리펩타이드와 접합될 에피토프(예를 들어, 펩타이드 에피토프) 및/또는 페이로드는 식 (III), (IV), (V), (Va), (VI) 또는 (VIa)의 형태를 가진다. 일부 실시형태에서 에피토프는 식 (III), (IV), (V), (Va), (VI) 또는 (VIa)의 화합물에 공유 결합된다. 하나의 이러한 실시형태에서, 에피토프는 에피토프(예를 들어, 바이러스 또는 암 에피토프)의 aa 서열을 포함하는 펩타이드이다. 실시형태에서, 펩타이드 에피토프는 길이가 약 4 aa 내지 약 20 aa (e.g., 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa 또는 20 aa)의 길이를 가진다.
본 개시내용은 T-세포-MMP-에피토프 접합체 및/또는 T-세포-MMP-페이로드 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 이는:
a) 세린 또는 시스테인을 포함하는 설파타제 모티프(예를 들어, 식 (I) 또는 (II), 예컨대 X1CX2PX3Z3(서열번호 47)의 설파타제 모티프; 상기 논의한 CX1PX2Z3 (서열번호 48)의 설파타제 모티프)를 암호화하는 서열을 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 혼입시키는 단계;
b) 하기 i) 또는 ii)의 세포에서 설파타제 모티프-함유 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드를 발현시키는 단계,
i) FGE를 발현시키고, 설파타제 모티프의 세린 또는 시스테인을 fGly로 전환시키고, fGly-함유 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드를 별개로 또는 T-세포-MMP로서 부분적으로 또는 완전히 정제하거나, 또는
ii) 설파타제 모티프의 세린 또는 시스테인을 fGly로 전환시키는 FGE를 발현시키지 않고, fGly 잔기를 함유하는 T-세포-MMP를 정제하거나 또는 부분적으로 정제하고 나서, 정제된 또는 부분적으로 정제된 T-세포-MMP를 설파타제 모티프의 세린 또는 시스테인를 fGly 잔기로 전환시키는 FGE와 접촉시킴; 및
c) fGly-함유 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드를 별개로, 또는 T-세포-MMP의 부분으로서, fGly의 알데하이드와 에피토프 및/또는 페이로드 사이에 공유 결합을 형성하는 기로 작용기화된 에피토프 및/또는 페이로드와 접촉시키는 단계;
를 포함함으로써, T-세포-MMP-에피토프 접합체 및/또는 T-세포-MMP 페이로드 접합체를 형성한다.
이러한 방법에서, 에피토프(에피토프 함유 분자) 및/또는 페이로드는 알데하이드기와 선택적으로 반응하는 임의의 적합한 작용기에 의해 작용기화될 수 있다. 이러한 기는, 예를 들어, 티오세미카바자이드, 아미노옥시, 하이드라자이드 및 하이드라지노로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 실시형태에서, 에피토프 및 또는 페이로드는 식 (III), (IV), (V), (Va), (VI) 또는 (VIa)의 하이드라진일 화합물의 부분이다. 하나의 이러한 실시형태에서, 설파타제 모티프는 β2M 서열 또는 이에 부착된 링커 내에(예를 들어, N-말단의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 aa 내에) β2M aa 서열을 포함하는 T-세포-MMP 제1 폴리펩타이드에 혼입된다. 실시형태에서, 설파타제 모티프는 도 4에 나타낸 β2M 서열에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%, 또는 심지어 100%) 서열 동일성을 갖는(예를 들어, 설파타제 모티프 서열의 첨가를 포함하지 않고 또는 첨가 전에 계산된 동일성을 갖는) β2M aa 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에 혼입된다. 예를 들어, 설파타제 모티프는 신호 서열과 성숙 펩타이드 서열 사이에, 또는 성숙 펩타이드의 N-말단에 위치될 수 있고, 모티프는 펩타이드 링커에 의해 β2M 서열(들)로부터 분리될 수 있다.
T-세포-MMP-에피토프 접합체 및/또는 T-세포-MMP 페이로드 접합체를 제조하기 위한 방법에 대한 다른 실시형태에서, 서열번호 45(식 (I)) 또는 서열번호 46의 설파타제 모티프는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위로서 제2 폴리펩타이드의 IgFc 영역에 혼입될 수 있다. 실시형태에서, 설파타제 모티프는 설파타제 모티프 서열의 첨가 전에 도 2에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%, 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 서열에 혼입된다.
T-세포-MMP-에피토프 접합체 및/또는 T-세포-MMP 페이로드 접합체의 제조 방법의 다른 실시형태에서, 서열번호 45(식 (I)) 또는 서열번호 46의 설파타제 모티프는 화학적 접합 부위로서 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드에 혼입될 수 있다.
T-세포-MMP-에피토프 접합체 및/또는 T-세포-MMP 페이로드 접합체의 제조 방법의 실시형태에서, 설파타제 모티프는 도 3에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%, 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 설파타제 모티프 서열의 첨가를 포함하지 않고 또는 첨가 전에 계산된 서열 동일성)을 갖는 서열에 혼입된다. 하나의 이러한 실시형태에서, 설파타제 모티프는, 예를 들어, 직접적으로 또는 펩타이드 또는 화학적 링커를 통해 간접적으로 에피토프 및/또는 페이로드의 접합을 위한 부위로서 이용될 수 있다.
I.A.2.2 솔타제 A 효소 부위
에피토프(예를 들어, 에피토프의 서열을 포함하는 펩타이드) 및 페이로드는 해당 부위에서 솔타제 A 접합을 위한 부위를 혼입함으로써 T-세포-MMP의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드의 N- 및/또는 C-말단에 부착될 수 있다.
솔타제 A는 C-말단의 펜타펩타이드 서열 LP(X5)TG/A(서열번호 54, X5는 임의의 단일 아미노산이며, G/A는 글리신 또는 알라닌임)를 인식하고, 서열 내의 트레오닌과 접합 상대의 N-말단에서 글리신 또는 알라닌 사이의 아마이드 결합을 생성한다. 유리하게는, 인식 서열은 접합 상대에 혼입되어 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드의 아미노 또는 카복실 중 하나가 화학적 접합 부위로서 작용하는 것을 가능하게 할 수 있다. 추가로, LP(X5)TG/A 서열은 T-세포-MMP에 대한 발현이 다양한 세포 유형에서 매우 다양한 조건 하에 수행되도록 허용하는 임의의 비천연 아미노산을 필요로 하지 않는다. 솔타제 A 효소 결찰의 잠재적 단점은 또한 알킬 1차 아민, 예컨대 라이신에 대한 글루타민 측쇄의 결합을 촉매할 수 있는 박테리아 트랜스글루타미나제(mTG)를 사용한다는 것이다. 박테리아 mTG는 천연 IgG1에서 글루타민 잔기를 변형시킬 수 없는 것으로 나타나지만, 사용될 때 폴리펩타이드 서열의 2차 변형을 초래할 수 있다.
T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드의 카복시 말단에 대한 에피토프 또는 페이로드의 부착을 위해, LP(X5)TG/A는 목적하는 펩타이드(들)의 카복시 말단에 조작된다. 글리신 또는 알라닌(예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스로부터의 솔타제 A를 이용할 때 (G)3-5(서열번호 55 및 56), 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 솔타제 A를 이용할 때 (A)3-5 (서열번호 57 및 58))의 노출된 신장은 에피토프(또는 이에 부착된 링커), 펩타이드 페이로드(또는 이에 부착된 링커), 또는 비-펩타이드 에피토프 또는 페이로드에 공유적으로 부착된 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 N-말단에 조작된다.
T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드의 아미노 말단에 대한 에피토프 또는 페이로드의 부착을 위해, 글리신(예를 들어, (G)2, 3, 4, 또는 5) 또는 알라닌(예를 들어, (A)2, 3, 4 또는 5)의 노출된 신장이 목적하는 폴리펩타이드(들)의 N-말단에서 나타나도록 조작되고, LP(X5)TG/A는 에피토프(또는 이에 부착된 링커), 펩타이드 페이로드(또는 이에 부착된 링커), 또는 비-펩타이드 에피토프 또는 페이로드에 공유 부착된 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 카복시 말단 부분에 조작된다.
솔타제 A를 아미노 및 카복시 조작된 펩타이드와 조합하는 것은 LP(X5)TG/A 서열에서 Thr과 Gly/Ala 잔기 사이의 절단을 초래하여, 카복시 표지된 펩타이드를 갖는 티오에스터 중간체를 형성한다. N-말단이 변형된 폴리펩타이드에 의한 친핵성 공격은: 카복시-변형된 폴리펩타이드-LP(X5)T*G/A-아미노-변형된 폴리펩타이드 형태의 공유 결합된 복합체의 형성을 초래하며, 여기서 "*"는 LP(X5)TG/A 모티프의 트레오닌과 N-말단의 변형된 펩타이드 글리신의 글리신 또는 알라닌 사이에 형성된 결합을 나타낸다. 앞서 언급한 것을 고려하여, 본 개시내용은 하기를 갖는 T-세포-MMP를 함유하는 조성물 및 이의 용도를 상정한다:
(예를 들어, N-말단에서 올리고글리신 또는 올리고 알라닌으로 변형된 에피토프 펩타이드와의 결합을 위한) 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드의 카복시 말단에서 적어도 하나의 LP(X5)TG/A 아미노산 서열;
(예를 들어, N-말단에서 LP(X5)TG/A 아미노산 서열로 변형된 에피토프 폴리펩타이드와의 결합을 위한) 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드의 아미노 말단에서 적어도 하나의 올리고글리신(예를 들어, (G)2, 3, 4 또는 5);
(예를 들어, N-말단에서 LP(X5)TG/A 아미노산 서열로 변형된 에피토프 폴리펩타이드와의 결합을 위한) 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드의 아미노 말단에서 적어도 하나의 올리고 알라닌(예를 들어, (A)2, 3, 4 또는 5);
(예를 들어, N-말단에서 올리고글리신 또는 올리고 알라닌으로 변형된 에피토프 펩타이드와의 결합을 위한) 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드의 카복시 말단에서 적어도 하나의 LP(X5)TA(예를 들어, LPETA, 서열번호 54, 여기서 X5는 E이고, 말단 위치는 A임) 아미노산 서열; 및/또는
(예를 들어, N-말단에서 올리고글리신 또는 올리고 알라닌으로 변형된 에피토프 펩타이드와의 결합을 위한) 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드의 카복시 말단에서 적어도 하나의 LP(X5)TG(예를 들어, LPETG, 서열번호 54, 여기서 X5는 E이고, 말단 위치는 G임) 아미노산 서열.
LP(X5)TG/A 대신에, LPETGG(서열번호 59) 펩타이드는 사카로마이세스 아우레우스(S. aureus) 솔타제 A 결합을 위해 사용될 수 있거나, 또는 LPETAA(서열번호 60) 펩타이드는 사카로마이세스 피오게네스(S. pyogenes) 솔타제 A 결합을 위해 사용될 수 있다. 접합 반응은 카복시-변형된 폴리펩타이드-LP(X5)T*G/A-아미노-변형된 폴리펩타이드를 수득하도록 여전히 트레오닌과 아미노 말단 올리고글리신 또는 올리고알라닌 펩타이드 사이에 있고, 여기서 "*"는 N-말단의 변형된 펩타이드의 트레오닌과 글리신 또는 알라닌 사이에 형성된 결합을 나타낸다.
일 실시형태에서, T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드가 β2M 폴리펩타이드를 포함하는 경우에, 제1 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 N-말단에서, 또는 제1 폴리펩타이드에 부착된 폴리펩타이드 링커에 부착된 폴리펩타이드 링커의 N-말단에서 올리고글리신(예를 들어, (G)2, 3, 4 또는 5) 또는 올리고알라닌(예를 들어, (A)2, 3, 4, 또는 5)을 함유한다(예를 들어, 링커는 제1 폴리펩타이드의 N-말단과 함께 그리고 N-말단에서 공동번역된다). 올리고글리신 또는 올리고알라닌은 에피토프 분자를 카복시 말단 영역에 LP(X5)TG/A를 보유하는 폴리펩타이드를 포함하는 에피토프와 접합함으로써 T-세포-MMP 내로 에피토프 분자를 도입하는 솔타제 A 화학적 접합 부위로서 사용될 수 있다. 예로서, 도 4에 나타낸 바와 같은 β2M의 서열은 20개의 아미노산 리더 서열로 시작하며, 성숙 폴리펩타이드는 개시 서열 IQRTP(K/Q)IQVYS로 시작하며, 폴리펩타이드의 나머지를 통해 계속된다. 서열번호 54, 59, 및 69의 솔타제 모티프는, 예를 들어 하기와 같이 혼입될 수 있다:
A2-5 또는 G2-5-링커-IQ(R/K)TP(K/Q)IQVYS...,
A2-5 또는 G2-5-링커-Q(R/K)TP(K/Q)IQVYS..., 또는
A2-5 또는 G2-5-링커-(R/K)TP(K/Q)IQVYS...,
(A2-5 또는 G2-5에 대해 서열번호 55 내지 58, 및 β2M 서열에 대해 서열번호 151 내지 155 및 도 4);
또는 인간 리더 서열 MSRSVALAVLALLSLSGLEA(서열번호 151 및 도 4)로 나타낸 바와 같음
MSRSVALAVLALLSLSGLEA (A2-5 또는 G2-5)-링커-IQ(R/K)TP(K/Q)IQVYS...,
MSRSVALAVLALLSLSGLEA (A2-5 또는 G2-5)-링커-Q(R/K)TP(K/Q)IQVYS...,
또는
MSRSVALAVLALLSLSGLEA (A2-5 또는 G2-5)-링커-(R/K)TP(K/Q)IQVYS...,
링커는, 존재한다면, 독립적으로 선택된 아미노산 서열(예를 들어, 1 내지 50개의 아미노산, 예컨대 폴리글리신, 폴리알라닌, 폴리세린 및 폴리-Gly, 예컨대 AAAGG (서열번호 75) 또는 (GGGGS)n(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임)(서열번호 76)) 또는 화학기(예를 들어, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜 등)를 포함할 수 있다. 링커는 존재하거나 부재일 수 있고, 2개가 나타날 때, 이들은 동일 또는 상이할 수 있다.
N-말단에서 올리고글리신을 보유하는 폴리펩타이드가 세포기반 시스템에서 발현에 의해 제조된 경우에, 리더 서열 및/또는 링커의 임의의 부분은 발현 세포에 의해 제거되지 않거나 또는 완전히 제거되지 않고, 트롬빈 절단 부위(Leu-Val-Pro-Arg-Gly, 서열번호 61)는 글리신 앞에 삽입될 수 있다. 트롬빈이 Arg과 Gly 잔기 사이를 절단하기 때문에, 폴리펩타이드에 다른 트롬빈 부위가 없다는 조건 하에, 절단 시, 글리신이 올리고 글리신으로 표지되고 접합될 단백질 분자 상에 노출된다는 것을 보장한다.
실시형태에서, A2-5 또는 G2-5 모티프는 도 4에 나타낸 서열(예를 들어, 도 4에 나타낸 전체 서열, 또는 아미노산 21에서 시작하고 C-말단에서 끝나는 성숙 폴리펩타이드의 서열)에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%, 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 혼입되며, 서열 동일성은 첨가된 A2-5 또는 G2-5 모티프 및 존재하는 임의의 링커 서열을 고려하지 않고 평가된다.
실시형태에서, A2-5 또는 G2-5 모티프 가 도 4에 나타낸 서열(예를 들어, 도 4에 나타낸 임의의 전장 서열, 또는 아미노산 21에서 시작해서 C-말단에서 끝나는 임의의 성숙 폴리펩타이드 서열)에 비해 1 내지 15개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개)의 아미노산 결실, 삽입 및/또는 변화를 갖는 β2M 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 혼입되며, 아미노산 결실, 삽입 및/또는 변화는 첨가된 A2-5 또는 G2-5 모티프 및 존재하는 임의의 링커 서열을 고려하지 않고 평가된다. 하나의 이러한 실시형태에서 A2-5 또는 G2-5 모티프는 성숙 β2M 서열, 예컨대 도 4에 나타낸 것의 임의의 아미노 말단 15(예를 들어, 1 내지 5, 5 내지 10 또는 10 내지 15) 아미노산을 대체하고/하거나 이들 사이에 삽입될 수 있다.
I.A.2.3 트랜스글루타미나제 효소 부위
트랜스글루타미나제(mTG)는 글루타민 잔기의 측쇄 상의 아마이드기와 1차 아민 공여자(예를 들어, 1차 알킬 아민, 예컨대 폴리펩타이드의 라이신 잔기의 측쇄 상에서 발견되는 것) 사이의 공유 결합 형성을 촉매한다. 트랜스글루타미나제는 직접적으로 또는 유리 1차 아민을 포함하는 링커를 통해 간접적으로 T-세포-MMP에 에피토프 및 페이로드를 접합시키는 데 사용될 수 있다. 이렇게 해서, T-세포-MMP의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드에 존재하는 글루타민 잔기는 이들이 스트렙토베트리실륨 모바라엔스(Streptoverticillium mobaraense) 트랜스글루타미나제와 같은 효소에 의해 평가될 때 화학적 접합 부위로서 고려될 수 있다. 해당 효소(EC 2.3.2.13)는 라이신의 ε-아미노기에 대한 글루타민의 γ-아실 전달을 촉매하는 안정한, 칼슘-독립적 효소이다. 그러나, 서열에 나타나는 글루타민 잔기는 효소 변형에 대해 항상 접근 가능하지 않다. 제한된 접근성은 변형이 일어날 수 있는 위치의 수를 제한하기 때문에 유리할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 mTG는 일반적으로 천연 IgG1에서 글루타민 잔기를 변형시킬 수 없지만; Schibli 및 공동 연구자(Jeger, S., et al. Angew Chem (Int Engl). 2010;49:99957 및 Dennler P, et al. Bioconjug Chem. 2014;25(3):569-78)는 N297에서의 IgG1의 탈글리코실화가 접근 가능한 글루타민 잔기 Q295를 제공하고 항체 약물 접합체를 생성하는 효소 결찰을 허용한다는 것을 발견하였다. 추가로, Q297 IgG1 돌연변이체에 대한 N297을 생성함으로써, 이들은 트랜스글루타미나제에 의한 효소 표지를 위해 2개의 부위를 도입한다.
T-세포-MMP의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드가 화학적 접합 부위로서 사용될 수 있는 글루타민을 함유하지 않는 경우에(예를 들어, 트랜스글루타미나제에 접근 가능하지 않거나 목적하는 위치에 놓이지 않음), 글루타민 잔기, 또는 트랜스글루타미나제의 기질(때때로 "글루타민 태그" 또는 "Q-태그"로서 지칭됨)로서 작용할 수 있는 접근 가능한 글루타민을 포함하는 서열은 폴리펩타이드 내로 혼입될 수 있다. 첨가된 글루타민 또는 Q-태그는 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 또는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위로서 작용할 수 있다. 미국 특허 공개 2017/0043033 A1은 글루타민 잔기 및 Q-태그의 혼입 및 펩타이드를 변형시키기 위한 트랜스글루타미나제의 사용을 기재하며, 이는 본 명세서에 교시를 위해 포함된다.
글루타민 잔기 및 Q-태그의 혼입은 펩타이드는 합성되는 경우에 화학적으로 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 변형시킴으로써 그리고 세포 또는 무 세포 시스템에서 변형된 핵산을 발현시킴으로써 달성될 수 있다.
실시형태에서 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위가 글루타민 또는 Q-태그인 경우에, 글루타민 또는 Q-태그는 상기 기재한 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 또는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위에 대해 나타낸 임의의 위치에 있을 수 있다.
실시형태에서, 첨가된 글루타민 잔기 또는 Q-태그는 제1 MHC 폴리펩타이드의 서열, 또는 존재한다면, 제1 MHC 폴리펩타이드에 부착된 링커에, 또는 이들 내에 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 부착된다. 추가적인 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위는 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 상의 임의의 위치에 존재할 수 있다(위치에 또는 위치 내에 부착됨). 하나의 이러한 실시형태에서, T-세포-MMP의 제1 MHC 폴리펩타이드는 β2M 폴리펩타이드이고, 첨가된 글루타민 또는 Q-태그는 도 4에서 제공되는 20개의 염기쌍 신호 서열(또는 도 4에서 β2M 폴리펩타이드에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 99 또는 심지어 100% 서열 동일성을 갖는 펩타이드)을 제외하는 성숙 β2M 폴리펩타이드 서열의 N-말단의 20, 15 또는 10 아미노산 내에 혼입된다. 다른 실시형태에서, 글루타민 또는 Q-태그는 도 4에 제공된 성숙 β2M 폴리펩타이드 중 하나의 N-말단에 부착된 폴리펩타이드 링커에 존재한다.
실시형태에서 첨가된 글루타민 잔기 또는 Q-태그는 T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드 서열에(예를 들어, N-또는 C-말단에) 또는 서열 내에, 예를 들어 제2 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC-H 펩타이드), 또는 존재한다면, 직접적으로 또는 제2 MHC 폴리펩타이드에 간접적으로 부착된 Fc, 스캐폴드 펩타이드 또는 링커의 말단에 또는 내에 부착된다. 추가적인 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위는 T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드 상의 임의의 위치에 존재할 수 있다(위치에 또는 위치 내에 부착됨). 일 실시형태에서, 제2 MHC 폴리펩타이드는 MHC-H 폴리펩타이드이고, 제2 폴리펩타이드는 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, 첨가된 글루타민 또는 Q-태그는 MHC-H 또는 Fc 폴리펩타이드 서열 내에 혼입된다. 다른 실시형태에서, 글루타민 또는 Q-태그는 MHC-H와 Fc 폴리펩타이드 사이의 폴리펩타이드 링커 내에, 또는 Fc 폴리펩타이드의 카복실 말단에 부착된 링커 내에 존재한다.
실시형태에서, 글루타민-함유 태그는 LQG, LLQGG (서열번호 62), LLQG (서열번호 63), LSLSQG (서열번호 64), 및 LLQLQG (서열번호 65)(수많은 다른 것들을 이용 가능함)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
1차 아민기를 함유하거나 또는 함유하도록 변형된 페이로드 및 에피토프는 글루타민 잔기(예를 들어, Q-태그 내 글루타민 잔기)와 에피토프 또는 페이로드 사이에 공유결합을 형성하는 트랜스글루타미나제 촉매 반응에서 아민 공여자로서 사용될 수 있다.
에피토프 또는 페이로드가 아민 공여자로서 작용하게 하는 적합한 1차 아민을 포함하지 않는 경우에, 에피토프 또는 페이로드는 아민기를 혼입하도록 화학적으로 변형될 수 있다(예를 들어, 라이신, 아미노카프르산, 카다베린 등에 대한 결합에 의해 1차 아민을 혼입하도록 변형됨). 에피토프 또는 페이로드가 펩타이드를 포함하고, 아민 공여자로서 작용하는 1차 아민을 필요로 하는 경우에, 라이신, 또는 트랜스글루타미나제와 함께 1차 아민이 작용할 수 있는 화합물을 함유하는 다른 아민이 펩타이드에 혼입될 수 있다. 1차 아민기를 제공할 수 있고, 알파 아미노산 쇄 내에 또는 말단에 혼입될 수 있는 화합물을 함유하는 다른 아민은 호모라이신, 2,7-다이아미노헵탄산 및 아미노헵탄산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 대안적으로, 에피토프 또는 페이로드는 적합한 아민기를 포함하는 펩타이드 또는 비펩타이드 링커에 부착될 수 있다. 적합한 비펩타이드 링커의 예는 알킬 링커 및 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 링커를 포함한다.
트랜스글루타미나제는 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있고, 포유류 간(예를 들어, 기니픽 간); 진균(예를 들어, 난균류(Oomycetes), 악티노마이세스(Actinomycetes), 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 크립토코커스(Cryptococcus), 모나스쿠스(Monascus) 또는 리조푸스 트랜스글루타미나제(Rhizopus transglutaminases)); 점균류(myxomycetes)(예를 들어, 피사룸 폴리세팔룸(Physarum polycephalum) 트랜스글루타미나제); 및/또는 박테리아(예를 들어, 스트렙토버티실륨 모바렌시스(Streptoverticillium mobarensis), 스트렙토버티실륨 그리세오카르네움(Streptoverticillium griseocarneum), 스트렙토버티실륨 라다카눔(Streptoverticillium ladakanum), 스트렙토마이세스 모바렌시스(Streptomyces mobarensis), 스트렙토마이세스 비리디스(Streptomyces viridis), 스트렙토마이세스 라다카눔(Streptomyces ladakanum), 스트렙토마이세스 카니페루스(Streptomyces caniferus), 스트렙토마이세스 플란텐시스(Streptomyces platensis), 스트렙토마이세스 하이그로스코피우스(Streptomyces hygroscopius), 스트렙토마이세스 네트롭시스(Streptomyces netropsis), 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae), 스트렙토마이세스 로세오버티빌라투스(Streptomyces roseovertivillatus), 스트렙토마이세스 신나마오네우스(Streptomyces cinnamaoneous), 스트렙토마이세스 그리세오카르네움(Streptomyces griseocarneum), 스트렙토마이세스 라벤둘라에(Streptomyces lavendulae), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 리디쿠스(Streptomyces lydicus), 스트렙토마이세스 모바렌시스(S. mobarensis), 스트렙토마이세스 시오얀시스(Streptomyces sioyansis), 악티노마두라 종(Actinomadura sp.), 바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테륨 암모니아게네스(Coryneba cterium ammoniagenes), 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium gluta micum), 클로스트리듐(Clostridium), 엔테로박터 종(Enterobacter sp.) 마이크로코커스(Micrococcus))로부터의 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제는 효소 입체형태 변화를 유도하고 효소 활성을 가능하게 하는 칼슘을 필요로 하지 않는 칼슘 독립적 트랜스글루타미나제이다.
다른 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 및 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위에 대해 상기 논의한 바와 같이, 글루타민 또는 Q-태그는 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 상의 임의의 목적하는 위치에 혼입될 수 있다. 실시형태에서, 글루타민 또는 Q-태그는 제1 및 제2 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC-H 및 β2M 폴리펩타이드)를 비롯한 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에서 임의의 요소의 말단에 또는 말단 근처에, 스캐폴드 또는 Ig Fc, 및 해당 요소 부근의 링커가 첨가될 수 있다.
일 실시형태에서, T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드가 β2M 폴리펩타이드 서열을 포함하는 경우에, 제1 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 N-말단에, 또는 제1 폴리펩타이드에 부착된 폴리펩타이드 링커의 N-말단에 글루타민 또는 Q-태그를 함유한다(예를 들어, 링커는 제1 폴리펩타이드의 N-말단에 부착됨). 글루타민 또는 Q-태그는 1차 아민 보유 에피토프 또는 트랜스글루타미나제에 의해 아마이드 공여자로서 사용될 수 있는 1차 아민을 포함하는 링커에 결합된 에피토프에 접합함으로써 T-세포-MMP에 에피토프 분자를 도입하는 화학적 접합 부위로서 사용될 수 있다. 예로서, 도 4에 나타낸 바와 같은 β2M의 서열은 20개의 아미노산 리더 서열로 시작하며, 성숙 폴리펩타이드는 개시 서열 IQRTP(K/Q)IQVYS로 시작하며, 폴리펩타이드의 나머지를 통해 계속된다. 상기 나타낸 다른 Q-태그를 나타내고 이에 의해 치환 가능한 아미노산 서열 LLQG(서열번호 63)를 갖는 Q-태그는 하기로 나타내는 바와 같이 β2M의 N-말단에 혼입될 수 있거나:
Figure pct00007
(β2M 서열에 대해 서열번호 151 내지 155 참조)
또는 인간 리더 서열 MSRSVALAVLALLSLSGLEA(서열번호 151 및 도 4)로 나타내는 바와 같을 수 있다,
Figure pct00008
링커는, 존재한다면, 독립적으로 선택된 아미노산 서열(예를 들어, 1 내지 50개의 아미노산, 예컨대 폴리글리신, 폴리알라닌, 폴리세린 및 폴리-Gly, 예컨대 AAAGG(서열번호 75) 또는 (GGGGS)n(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임)(서열번호 76)) 또는 화학기(예를 들어, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜 등)를 포함할 수 있다. 링커는 존재하거나 부재일 수 있고, 2개가 나타날 때, 이들은 동일 또는 상이할 수 있다.
실시형태에서 Q-태그 모티프는 도 4에 나타낸 서열(예를 들어, 도 4에 나타낸 임의의 전장 서열, 또는 아미노산 21에서 시작해서 이들의 C-말단에서 끝나는 임의의 성숙 β2M 폴리펩타이드의 서열)에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%, 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 β2M 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 혼입되며, 동일성은 첨가된 Q-태그 모티프 및 존재하는 임의의 링커 서열을 고려하지 않고 평가된다.
실시형태에서, Q-태그 모티프는 도 4에 나타낸 서열(도 4에 나타낸 전체 서열, 또는 아미노산 21에서 시작해서 이들의 C-말단에서 끝나는 성숙 폴리펩타이드의 서열)에 비해 1 내지 15개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개)의 아미노산 결실, 삽입 및/또는 변화를 갖는 서열에 혼입된다. 변화는 Q-태그 모티프 및 존재하는 임의의 링커 서열의 아미노산을 고려하지 않고 평가된다. 하나의 이러한 실시형태에서 Q-태그 모티프는 성숙 β2M 서열, 예컨대 도 4에 나타낸 것의 임의의 아미노 말단 15(예를 들어, 1 내지 5, 5 내지 10 또는 10 내지 15) 아미노산을 대체하고/하거나 이들 사이에 삽입될 수 있다.
대안적으로, T-세포-MMP에서 나타나는 MHC-H 쇄 서열에서 나타나는 글루타민 잔기 중 임의의 1, 2 또는 3개 주변의 서열은 Q-태그의 매치를 위해 변형될 수 있고, 에피토프 또는 페이로드의 첨가를 위한 화학적 접합 부위로서 사용된다.
다른 실시형태에서, 글루타민 또는 Q-태그는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위로서 IgFc 영역 내로 혼입될 수 있다. 하나의 이러한 실시형태에서, 그들은 직접적으로 또는 1차 아민을 보유하는 펩타이드 또는 화학적 링커를 통해 간접적으로, 예를 들어, 에피토프 및/또는 페이로드의 접합을 위한 부위로서 이용될 수 있다.
I.A.2.4 화학적 접합 부위로서 셀레노시스테인 및 비천연 아미노산
T-세포-MMP의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드에서 부위-특이적 화학적 접합 부위를 제공하기 위한 하나의 전략은 폴리펩타이드에 존재하는 다른 아미노산과 별개인 반응성을 갖는 아미노산의 삽입을 사용한다. 이러한 아미노산은 비천연 아미노산, 아세틸페닐알라닌(p-아세틸-L-페닐알라닌, pAcPhe), 파라지도 페닐알라닌 및 프로핀일-타이로신, 및 천연 유래 아미노산, 셀레노시스테인(Sec)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
Thanos 등의 미국 특허 공개 제20140051836 A1호는 O-메틸-L-타이로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-타이로신, 4-프로필-L-타이로신, 트라이-O-아세틸-GlcNAcβ세린, L-Dopa, 플루오린화된 페닐알라닌, 아이소프로필-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노타이로신, p-아이오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 아이소프로필-L-페닐알라닌 및 p-프로파길옥시-페닐알라닌을 비롯한 일부 다른 비천연 아미노산을 논의한다. 다른 비천연 아미노산은 아미노, 카복시, 아세틸, 하이드라지노, 하이드라지도, 세미카바지도, 설판일, 아지도 및 알킨일을 포함하는 반응기를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제20140046030 A1호 참조.
실험실에서 폴리펩타이드를 직접 합성하는 것에 추가로, 정지 코돈을 이용하는 2가지 방법은 전사-번역 시스템을 이용하여 단백질 및 폴리펩타이드에 비천연 아미노산을 혼입시키도록 진행되었다. 처음에 Sec 삽입 서열을 이용하여 오팔(opal) 정지 코돈인 UGA을 짝지음으로써 셀레노시스테인(Sec)을 혼입한다. 두번째로 일반적으로 앰버(amber), 오커(ochre) 또는 오팔 정지 코돈의 사용을 통해 폴리펩타이드에 비천연 아미노산을 혼입한다. 다른 유형의 코돈, 예컨대 고유한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5-염기 코돈 및 4-염기 코돈의 사용, 및 넌센스 및 틀이동 억제의 사용이 또한 보고되었다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제20140046030 A1호 및 문헌[Rodriguez et al., PNAS 103(23)8650-8655(2006)] 참조. 예로서, 비천연 아미노산 아세틸페닐알라닌은 생체내 또는 무세포 전사-번역 시스템에서 tRNA/아미노아실 tRNA 합성효소 쌍을 이용하여 앰버 코돈에서 혼입될 수 있다.
셀레노시스테인과 비천연 아미노산 둘 다의 혼입은 목적하는 위치(들)에서 T-세포-MMP의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드의 핵산 암호화 서열 내로 필수 정지 코돈(들)을 조작하는 것을 필요로 하며, 이 후에 암호화 서열은 생체내 또는 무세포 전사-번역 시스템에서 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 사용된다.
생체내 시스템은 일반적으로 생물 직교성(bio-orthogonal) 화학적 접합 부위로서 작용하는 비천연 아미노산을 폴리펩타이드 및 단백질에 혼입시키는 조작된 세포주에 의존한다. 예를 들어, 발명의 명칭이 "In vivo incorporation of unnatural amino acids"인 국제 특허 출원 공개 제2002/085923호 참조. 생체내 비천연 아미노산 혼입은 숙주 세포에서 모든 내인성 tRNA 및 합성효소에 대해 직교인 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소(aaRS) 쌍에 의존한다. 선택의 비천연 아미노산은 세포 배양 또는 발효 동안 배지에 보충되어, 세포 침투성 및 안정성을 중요한 고려 사항으로 만든다.
비천연 아미노산을 혼입시키기 위해 하전된 tRNA가 제공된 다양한 무세포 합성 시스템이 또한 이용될 수 있다. 이러한 시스템은 미국 특허 출원 공개 제20160115487A1호; 문헌[Gubens et al., RNA. 2010 Aug; 16(8): 1660-1672; Kim, D. M. and Swartz, J. R. Biotechnol. Bioeng. 66:180-8 (1999); Kim, D. M. and Swartz, J. R. Biotechnol. Prog. 16:385-90(2000); Kim, D. M. and Swartz, J. R. Biotechnol. Bioeng. 74:309-16 (2001); Swartz et al, Methods Mol. Biol. 267:169-82(2004); Kim, D. M. and Swartz, J. R. Biotechnol. Bioeng. 85:122-29 (2004); Jewett, M. C. and Swartz, J. R., Biotechnol. Bioeng. 86:19-26 (2004); Yin, G. and Swartz, J. R., Biotechnol. Bioeng. 86:188-95 (2004); Jewett, M. C. and Swartz, J. R., Biotechnol. Bioeng. 87:465-72(2004); Voloshin, A. M. and Swartz, J. R., Biotechnol. Bioeng. 91:516-21(2005)]에 기재된 것을 포함한다.
일단 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 내로 혼입되면, 혼입된 셀레노시스테인 또는 비천연 아미노산과 반응성인 에피토프 및/또는 페이로드 보유기는 공유결합을 형성하기에 적합한 조건 하에 T-세포-MMP와 접촉된다. 예로서, pAcPhe의 케토기는 옥심 결합을 통해 알콕시-아민에 대해 반응성이고, 에피토프 및/또는 페이로드를 함유하는 알콕시아민에 직접적으로 또는 알콕시 함유 링커를 통해 에피토프 및 페이로드에 간접적으로 접합될 수 있다. 셀레노시스테인은, 예를 들어, 1차 알킬 아이오다이드(예를 들어, 링커로서 사용될 수 있는 아이오도아세트아마이드), 말레이미드 및 메틸설폰 페닐옥사다이아졸기와 반응한다. 따라서, 해당 기를 보유하거나 또는 해당 기를 보유하는 링커에 결합된 에피토프 및/또는 페이로드는 셀레노시스테인을 보유하는 폴리펩타이드 쇄에 공유 결합될 수 있다.
다른 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 및 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위에 대해 상기 논의한 바와 같이, 셀레노시스테인 및/또는 비천연 아미노산은 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에서 임의의 목적하는 위치에 혼입될 수 있다. 실시형태에서, 셀레노시스테인 및/또는 비천연 아미노산은 제1 및 제2 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC-H 및 β2M 폴리펩타이드)를 비롯한 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에서 임의의 요소의 말단에 또는 말단 근처에, 스캐폴드 또는 Ig Fc, 및 해당 요소 부근의 링커가 첨가될 수 있다. 실시형태에서, 셀레노시스테인 및/또는 비천연 아미노산은 β2M, 클래스 I MHC 중쇄 및/또는 Fc Ig 폴리펩타이드에 혼입될 수 있다. 실시형태에서, 셀레노시스테인 및/또는 비천연 아미노산은 제1 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, β2M 폴리펩타이드) 또는 이에 부착된 링커의 아미노 말단 단부 근처에 또는 말단 단부에서 제1 폴리펩타이드에 혼입될 수 있다. 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드가 β2M 서열을 포함하는 경우에, 셀레노시스테인 및/또는 비천연 아미노산은 β2M 서열의 N-말단에 또는 근처에 혼입되어, 예를 들어, 직접적으로 또는 링커를 통해 에피토프의 화학적 접합을 가능하게 할 수 있다. 예로서, 도 4에 나타낸 바와 같은 β2M의 서열은 20개의 아미노산 리더 서열로 시작하며, 성숙 폴리펩타이드는 개시 서열 IQRTP(K/Q)IQVYS로 시작하며, 폴리펩타이드의 나머지를 통해 계속된다. 셀레노시스테인 및/또는 비천연 아미노산("ψ"로 나타냄)은, 예를 들어 하기와 같이 혼입될 수 있거나:
Figure pct00009
또는 인간 리더 서열 MSRSVALAVLALLSLSGLEA(β2M 서열에 대해 서열번호 151 내지 155 및 도 4 참조)로 나타낸 바와 같고
Figure pct00010
링커는, 존재한다면, 독립적으로 선택된 아미노산 서열(예를 들어, 1 내지 50개의 아미노산, 예컨대 폴리글리신, 폴리알라닌, 폴리세린 및 폴리-Gly, 예컨대 AAAGG(서열번호 75) 또는 (GGGGS)n(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임)(서열번호 76)) 또는 화학기(예를 들어, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜 등)를 포함할 수 있다. 링커는 존재하거나 부재일 수 있고, 2개가 나타날 때, 이들은 동일 또는 상이할 수 있다.
실시형태에서 셀레노시스테인 및/또는 비천연 아미노산은 도 4에 나타낸 β2M 서열(예를 들어, 도 4에 나타낸 임의의 전장 서열, 또는 아미노산 21에서 시작해서 이들의 C-말단에서 끝나는 임의의 성숙 β2M 폴리펩타이드의 서열)에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%, 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 β2M 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 혼입되며, 서열 동일성은 첨가된 셀레노시스테인 및/또는 비천연 아미노산 및 존재하는 임의의 링커 서열을 고려하지 않고 평가된다.
실시형태에서, 셀레노시스테인 및/또는 비천연 아미노산은 도 4에 나타낸 β2M 서열(도 4에 나타낸 임의의 전장 서열, 또는 아미노산 21에서 시작해서 이들의 C-말단에서 끝나는 성숙 β2M 폴리펩타이드의 서열)에 비해 1 내지 15개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개)의 아미노산 결실, 삽입 및/또는 변화를 갖는 β2M 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 혼입된다. 변화는 셀레노시스테인 및/또는 비천연 아미노산 및 존재하는 임의의 링커 서열의 아미노산을 고려하지 않고 평가된다. 하나의 이러한 실시형태에서 셀레노시스테인 및/또는 비천연 아미노산은 성숙 β2M 서열, 예컨대 도 4에 나타낸 것의 임의의 아미노 말단의 15개의 아미노산을 대체하고/하거나 이들 사이에 삽입될 수 있다.
다른 실시형태에서, 셀레노시스테인 및/또는 비천연 아미노산은 화학적 접합 부위로서 MHC-H 쇄 또는 IgFc 폴리펩타이드 서열(이에 부착된 링커를 포함)을 포함하는 폴리펩타이드에 혼입될 수 있다. 하나의 이러한 실시형태에서, 이들은, 예를 들어, 직접적으로 또는 펩타이드 또는 화학적 링커를 통해 간접적으로 T-세포-MMP에 접합된 에피토프 및/또는 페이로드의 접합을 위한 부위로서 이용될 수 있다.
I.A.2.5 조작된 아미노산 화학적 접합 부위
천연 유래 아미노산의 측쇄에, 또는 폴리펩타이드의 말단에 존재하는 임의의 다양한 작용기(예를 들어, -SH, -NH3, -OH, -COOH 등)는 화학적 접합 부위로서 사용될 수 있다. 이는 각각 N-하이드록시석신이미드 및 말레이미드 작용기를 포함하는 시약에 의해 용이하게 변형 가능한 라이신 및 시스테인의 측쇄를 포함한다. 이러한 아미노산 잔기를 이용하는 것의 주된 단점은 생성물의 잠재적 가변성 및 불균일성이다. 예를 들어, IgG는 80개 초과의 라이신을 가지며, 용매-접근 가능 부위에서는 20개 초과이다. 예를 들어, 문헌[McComb and Owen, AAPS J. 117(2): 339-351] 참조. 시스테인은 덜 광범위하게 분포되는 경향이 있으며; 이들은 이황화결합에서 맞물리는 경향이 있고, 화학적 접합 부위를 위치시키는 것이 바람직한 경우에 접근 가능하지 않으며 위치되지 않을 수 있다. 따라서, T-세포-MMP 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드의 선택적 변형을 위한 목적하는 위치에서 비천연 유래 아미노산을 혼입시키기 위해 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드를 조작하는 것이 가능하다. 조작은 폴리펩타이드의 직접 합성(예를 들어, 적절하게 차단된 아미노산을 결합시킴으로써) 그리고/또는 세포 또는 무세포 시스템에서 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 변형시키고 이를 발현시킴으로써 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 명세서는 전사/번역에 의한 T-세포-MMP의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드의 모두 또는 일부의 제조, 및 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드의 번역 부분의 C- 또는 N-말단에 (예를 들어, 에피토프 또는 펩타이드에 대한) 화학적 접합 부위로서 사용될 비천연 또는 천연(셀레노시스테인) 아미노산을 보유하는 조작된 폴리펩타이드를 결합시키는 것을 포함하고 제공한다. 조작된 펩타이드는 상기 에피토프 펩타이드에 대해 기재된 바와 같은 솔타제의 사용을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 결합될 수 있고, 링커 펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 실시형태에서 조작된 펩타이드는 솔타제 접합을 위해 그리고/또는 링커 서열의 부분으로서 작용할 수 있는 2, 3, 4 또는 5개의 알라닌 또는 글리신의 서열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드는 도 4에 나타낸 바와 같은 β2M 서열에 조작된 화학적 접합 부위로서 사용될 적어도 하나의 천연 유래 아미노산, 도 2에 나타낸 바와 같은 IgFc 서열 또는 도 3에 나타낸 바와 같은 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드를 함유한다. 실시형태에서, 화학적 접합 부위로서 사용될 적어도 하나의 천연 유래 아미노산은 도 4에 나타내는 β2M 서열, 도 2에 나타내는 바와 같은 IgFc 서열, 또는 도 3에 나타내는 바와 같은 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%, 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 내로 조작된다. 실시형태에서, 화학적 접합 부위로서 사용될 적어도 하나의 천연 유래 아미노산은 성숙 도 4에 나타내는 β2M 서열; 도 2에 나타내는 바와 같은 IgFc 서열; 또는 도 3에 나타내는 바와 같은 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드의 적어도 아미노 말단의 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 70개의 아미노산을 갖는 적어도 90%(예를 들어, 적어도 93%, 95%, 98% 또는 99% 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 β2M 아미노산 서열을 포함하는 T-세포-MMP 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 내로 조작된다. 다른 실시형태에서, 화학적 접합 부위로서 사용될 적어도 하나의 천연 유래 아미노산은 도 4에 나타내는 β2M 서열, 도 2에 나타내는 바와 같은 IgFc 서열, 또는 도 3에 나타내는 바와 같은 MHC 클래스 I 중쇄 서열에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 아미노산의 인접한 서열을 포함하는 폴리펩타이드 내로 조작된다. 상기 언급한 임의의 실시형태에서, 천연 유래 아미노산이 펩타이드 내로 조작되는 경우에, 아미노산은 알기닌, 라이신, 시스테인, 세린, 트레오닌, 글루탐산, 글루타민, 아스파르트산 및 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 이러한 실시형태에서, 아미노산은 라이신, 시스테인, 세린, 트레오닌 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 이러한 실시형태에서, 아미노산은 라이신, 글루타민 및 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 아미노산은 시스테인이다. 실시형태에서, 아미노산은 라이신이고; 다른 실시형태에서, 아미노산은 글루타민이다.
당업계에 공지된 임의의 방법은 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 내로 조작된 아미노산에 페이로드 또는 에피토프를 결합하는 데 사용될 수 있다. 예로서, 말레이미드는 설프하이드릴에 결합시키기 위해 이용될 수 있고, N-하이드록시석신이미드는 아민기에 결합시키기 이용될 수 있으며, 산 무수물 또는 염화물은 알코올 또는 아민에 결합시키기 위해 이용될 수 있고, 탈수제는 카복실산기에 알코올 또는 아민을 결합시키기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 이러한 화학을 이용하여, 에피토프 또는 페이로드는 직접적으로, 또는 링커(예를 들어, 호모- 또는 헤테로-2작용성 가교제)를 통해 간접적으로 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드 상의 위치에 결합될 수 있다. 예로서, 말레이미드 아미노산을 포함하는 에피토프 펩타이드(또는 펩타이드-함유 페이로드)는 천연 유래이거나 T-세포-MMP 내로 조작된 화학적 접합 부위(예를 들어, 시스테인 잔기)의 설프하이드릴에 접합될 수 있다. 딜스-알더(Diels-Alder)/역-딜스-알더 보호 반응식에 의해, 고체상 펩타이드 합성 기법을 이용하여 펩타이드(예를 들어, 에피토프 펩타이드)에 말레이미드 아미노산을 직접적으로 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Koehler, Kenneth Christopher (2012), "Development and Implementation of Clickable Amino Acids," Chemical & Biological Engineering Graduate Theses & Dissertations, 31, https://scholar.colorado.edu/ chbe_gradetds/31] 참조. 따라서, 일 실시형태에서 에피토프 펩타이드는 T-세포-MMP의 결합 포켓에 존재하는 시스테인에 결합되는 말레이미드 아미노산을 포함한다. 말레이미드는 또한 펩타이드에 말레이미드를 부착시키는 가교제(예를 들어, 펩타이드 라이신 상의 아민기에 말레이미드를 부착할 수 있는, 예를 들어, 헤테로2작용성 N-하이드록시석신이미드 - 말레이미드 가교제)를 이용하여 에피토프 펩타이드에 현수될 수 있다. 실시형태에서, 적어도 하나의(예를 들어, 1 또는 2) 말레이미드 아미노산을 갖는 에피토프 펩타이드는 도 3D에서와 같이 넘버링하여 5, 7, 59, 84, 116, 139, 167, 168, 170 및/또는 171번 위치(예를 들어, Y7C, Y59C, Y84C, Y116C, A139C, W167C, L168C, R170C 및 Y171C 치환)로부터 선택된 임의의 하나 이상의(예를 들어, 1 또는 2개의) 아미노산 위치에서 시스테인 잔기를 갖는 MHC 중쇄에 접합된다. 실시형태에서, 적어도 하나의(예를 들어, 1 또는 2개의) 말레이미드 아미노산을 갖는 에피토프 펩타이드는 도 3D에서와 같이 넘버링하여 7, 84 및/또는 116번 위치(예를 들어, Y7C, Y84C 및 Y116C 치환)로부터 선택된 임의의 하나 이상의(예를 들어, 1 또는 2개의) 아미노산 위치에서 시스테인 잔기를 갖는 MHC 중쇄에 접합된다. 실시형태에서, 적어도 하나의(예를 들어, 1 또는 2개의) 말레이미드 아미노산을 갖는 에피토프 펩타이드는 도 3D에서와 같이 넘버링하여 84 및/또는 116번 위치(예를 들어, Y84C 및/또는 Y116C 치환)로부터 선택된 임의의 하나 이상의(예를 들어, 1 또는 2개의) 아미노산 위치에서 시스테인 잔기를 갖는 MHC 중쇄에 접합된다.
설프하이드릴기의 쌍은 T-세포-MMP에 대한 화학적 접합을 생성하기 위해 동시에 사용될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 이황화결합을 갖거나, 또는 서로에 대해 근위인 위치 내로 조작된 2개의 시스테인(또는 셀레노시스테인)을 갖는 T-세포-MMP는 비스-티올 링커의 사용을 통해 화학적 접합 부위로서 이용될 수 있다. Godwin과 공동 작업자에 의해 기재된 비스-티올 링커는 이의 위치에 브리징 기를 형성함으로써 이황화결합을 환원시키는 것과 연관된 불안정성을 피하는 동시에 에피토프 또는 페이로드일 수 있는 다른 분자의 혼입을 허용한다. 예를 들어, 친수성 링커(예를 들어, PEG (폴리에틸렌글리콜) 링커)를 혼입하는 비스-설펀 시약의 사용을 기재하는 문헌[Badescu G, et al., (2014), Bioconjug Chem., 25(6):1124-36, 명칭: Bridging disulfides for stable and defined antibody drug conjugates] 참조.
T-세포-MMP가 이황화결합을 포함하는 경우에, 화학량론적 또는 거의 화학량론적 양의 다이티올 환원제(예를 들어, 다이티오트레이톨)를 이용하여 결합을 환원시키고 링커를 시스테인 잔기 둘 다와 반응시킴으로써 에피토프 또는 페이로드를 혼입시키기 위해 비스-티올 링커가 사용될 수 있다. 다중 이황화결합이 존재하는 경우에, 화학량론적 또는 거의 화학량론적 양의 다이티올 환원제의 사용은 하나의 부위에서 선택적 변형을 허용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Brocchini, et al., Adv. Drug. Delivery Rev. (2008)60:3-12] 참조. T-세포-MMP의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드가 시스테인 및/또는 셀레노시스테인(예를 들어, 셀레노시스테인 및 시스테인)의 쌍을 포함하지 않는 경우에, 이들은 (시스테인 또는 셀레노시스테인 중 하나 또는 둘 다를 도입함으로써) 폴리펩타이드 내로 조작되어 비스-티올 링커와 상호작용할 수 있는 잔기의 쌍을 제공할 수 있다. 시스테인 및/또는 셀레노시스테인은 비스-티올 링커가 (2개의 시스테인이 이황화결합을 형성할 수 있는 위치에서) 이들을 브리지할 수 있도록 위치되어야 한다. 시스테인과 셀레노시스테인의 임의의 조합(즉, 2개의 시스테인, 2개의 셀레노시스테인, 또는 셀레노시스테인과 시스테인)이 사용될 수 있다. 시스테인 및/또는 셀레노시스테인은 T-세포-MMP의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드 상에 존재할 수 있다. 대안적으로, 시스테인 및/또는 셀레노시스테인은 제1 폴리펩타이드 상에 그리고 T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드 상에 존재하는 비스-티올 링커 반응에 대한 이들의 상대 상에 존재할 수 있다.
실시형태에서, 시스테인 및/또는 셀레노시스테인의 쌍은 시스테인 및/또는 셀레노시스테인 쌍의 첨가 전에 도 4에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 또는 심지어 100%) 아미노산 서열을 갖는 β2M 서열을 포함하는 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 내로, 또는 해당 서열 중 하나에 부착된 펩타이드 링커 내로 혼입된다. 하나의 이러한 실시형태에서, 시스테인 및/또는 셀레노시스테인의 쌍은, 예를 들어, 직접적으로 또는 펩타이드 또는 화학적 링커를 통해 간접적으로 에피토프 및/또는 페이로드의 접합을 위한 비스-티올 링커 결합 부위로서 이용될 수 있다. 일 실시형태에서, 시스테인 및/또는 셀레노시스테인의 쌍은 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드의 아미노말단의 10, 20, 30, 40 또는 50개의 아미노산 내에 위치된다.
다른 실시형태에서, 시스테인 및/또는 셀레노시스테인의 쌍은 제2 폴리펩타이드 내에 혼입된 IgFc 서열 내로 혼입되어 화학적 접합 부위를 제공한다. 실시형태에서, 시스테인 및/또는 셀레노시스테인의 쌍은 시스테인 또는 셀레노시스테인 쌍의 첨가 전에 도 2에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 IgFc 서열을 포함하는 폴리펩타이드 내로, 또는 해당 서열 중 하나에 부착된 펩타이드 링커 내로 혼입된다. 하나의 이러한 실시형태에서, 시스테인 및/또는 셀레노시스테인의 쌍은, 예를 들어, 직접적으로 또는 펩타이드 또는 화학적 링커를 통해 간접적으로 에피토프 및/또는 페이로드의 접합을 위한 비스-티올 링커 결합 부위로서 이용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 시스테인 및/또는 셀레노시스테인의 쌍은 화학적 접합 부위로서 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드 내에 혼입된다. 실시형태에서, 시스테인 및/또는 셀레노시스테인의 쌍은 시스테인 또는 셀레노시스테인 쌍의 첨가 전에 도 3에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드 내로, 또는 해당 서열 중 하나에 부착된 펩타이드 링커 내로 혼입된다. 하나의 이러한 실시형태에서, 시스테인 및/또는 셀레노시스테인의 쌍은, 예를 들어, 직접적으로 또는 펩타이드 또는 화학적 링커를 통해 간접적으로 에피토프 및/또는 페이로드의 접합을 위한 비스-티올 링커 결합 부위로서 이용될 수 있다.
설프하이드릴기의 쌍은 T-세포-MMP에 대한 화학적 접합을 생성하기 위해 동시에 사용될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 이황화결합을 갖거나, 또는 서로에 대해 근위인 위치 내로 조작된 2개의 시스테인(또는 셀레노시스테인)을 갖는 T-세포-MMP는 비스-티올 링커의 사용을 통해 화학적 접합 부위로서 이용될 수 있다.
I.A.2.6 기타 화학적 접합 부위
탄수화물 화학적 접합 부위
세포의 발현에 의해 제조되는 다수의 단백질은 첨가된 탄수화물(예를 들어, 포유류 세포에서 발현된 항체에 첨가된 유형의 올리고당)을 함유한다. 따라서, T-세포-MMP의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드가 세포의 발현에 의해 제조되는 경우에, 탄수화물이 존재하며 글리콜-접합 반응에서 부위 선택적인 화학적 접합 부위로서 이용 가능할 수 있다. 문헌[McCombs and Owen, AAPS Journal, (2015) 17(2): 339-351] 및 이에 인용된 참고문헌은 항체에 대한 분자의 글리콜-접합을 위한 탄수화물 잔기의 사용을 기재한다.
탄수화물 잔기의 첨가 및 변형은 또한 화학적 접합 부위로서 사용을 위해 화학적으로 반응성인 탄수화물 또는 탄수화물 유사체를 혼입시킬 수 있는 탄수화물(예를 들어, 알데하이드 기를 도입하는 과요오드산염)을 변경시키는 화학물질의 사용을 통해, 또는 효소(예를 들어, 푸코실트랜스퍼라제)의 작용에 의해 생체외에서 수행될 수 있다.
실시형태에서, 공지된 글리코실화 부위를 갖는 IgFc 스캐폴드의 혼입은 부위 특이적 화학적 접합 부위를 도입하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 화학적 접합(글리콜-접합) 부위로서 탄수화물을 갖는 T-세포-MMP 및 이들의 에피토프 접합체를 포함하고, 이를 제공한다. 본 개시내용은 또한 에피토프와의 그리고 다른 분자, 예컨대 약물 및 진단제와의 접합체를 형성함에 있어서 이러한 분자의 용도, 및 의학적 치료 및 진단 방법에서 해당 분자의 용도를 포함하고 이를 제공한다.
뉴클레오타이드 결합 부위
뉴클레오타이드 결합 부위는 결합 부위에 공유적으로 연결될 수 있는 UV-반응 모이어티의 사용을 통해 부위-특이적 작용기화를 제공한다. 문헌[Bilgicer et al., Bioconjug Chem. 2014;25(7):1198-202]은 뉴클레오타이드 결합 부위에서 IgG에 공유적으로 연결될 수 있는 인돌-3-뷰티르산(IBA) 모이어티의 사용을 보고하였다. 뉴클레오타이드 결합 부위를 형성하는 데 필요한 서열의 혼입에 의해, 적합하게 변형된 에피토프 및/또는 반응성 뉴클레오타이드를 보유하는 다른 분자(예를 들어, 약물 또는 진단제)를 갖는 T-세포-MMP의 화학적 접합체는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 화학적 접합 부위로서 뉴클레오타이드 결합 부위를 갖는 T-세포-MMP를 포함하고 이를 제공한다. 본 개시내용은 또한 에피토프와의 그리고 다른 분자, 예컨대 약물 및 진단제와의 접합체를 형성함에 있어서 이러한 분자의 용도, 및 치료 및 진단 방법에서 해당 분자의 용도를 포함하고 이를 제공한다.
I.A.2.7 T-세포-MMP, 에피토프 및 MOD의 결합 및 특성
본 개시내용은 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 개시내용은 a) 제1 폴리펩타이드; 및 b) 제2 폴리펩타이드를 포함하는 T-세포-MMP 에피토프 접합체를 제공하되, 다량체 폴리펩타이드의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 에피토프; 제1 MHC 폴리펩타이드; 제2 MHC 폴리펩타이드; 및 선택적으로 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 스캐폴드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 또한: a) N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로: i) 에피토프; ii) 제1 MHC 폴리펩타이드를 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및 b) N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로: i) 제2 MHC 폴리펩타이드; 및 ii) 선택적으로 Ig Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 스캐폴드를 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함하는, T-세포-MMP-에피토프 접합체를 제공한다. 상기 열거한 해당 성분에 추가로, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 (예를 들어, 적어도 하나의) MOD를 포함한다. 하나 이상의 MOD가 A) 제1 폴리펩타이드의 C-말단에; B) 제2 폴리펩타이드의 N-말단에; C) 제2 폴리펩타이드의 C-말단에; 및/또는 D) 제1 폴리펩타이드의 C-말단에 그리고 제2 폴리펩타이드의 N-말단에 위치된다. 실시형태에서, 하나 이상의 MOD의 적어도 하나(예를 들어, 적어도 2 또는 적어도 3)는 Co-MOD에 대한 대응하는 야생형 MOD의 친화도에 비해 Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 나타내는 변이체 MOD이다.
실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프는 적어도 100μM(예를 들어, 적어도 10μM, 적어도 1μM, 적어도 100nM, 적어도 10nM 또는 적어도 1nM)의 친화도로 T-세포 상에서 T-세포 수용체(TCR)에 결합한다. 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 제2 T-세포에 결합하는 친화도보다 적어도 25% 더 큰 친화도로 제1 T-세포에 결합할 수 있고, 여기서 제1 T-세포는 표면 상에서 적어도 100μM의 친화도로 에피토프에 결합하는 TCR 및 Co-MOD을 발현시키며, 제2 T-세포는 표면 상에서 Co-MOD을 발현시키지만 적어도 100μM(예를 들어, 적어도 10μM, 적어도 1μM, 적어도 100nM, 적어도 10nM, 또는 적어도 1nM)의 친화도로 에피토프에 결합하는 TCR을 발현시키지 않는다.
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프는 약 10-4 M 내지 약 5×10-4 M, 약 5×10-4 M 내지 약 10-5 M, 약 10-5 M 내지 약 5×10-5 M, 약 5×10-5 M 내지 약 10-6 M, 약 10-6 M 내지 약 5×10-6 M, 약 5×10-6 M 내지 약 10-7 M, 약 10-7 M 내지 약 10-8 M 또는 약 10-8 M 내지 약 10-9 M의 친화도로 T-세포 상에서 TCR에 결합한다. 다른 방법으로 표현하면, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프는 약 0.1μM 내지 약 0.5μM, 약 0.5μM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 25μM, 약 25μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM의 친화도로 T-세포 상의 TCR에 결합한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 변이체 MOD는 Co-MOD에 대한 대응하는 야생형 MOD의 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 15% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 25% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 35% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 45% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 55% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 65% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 75% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 85% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 초과의 수 미만인 친화도로 Co-MOD에 결합한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 변이체 MOD는 Co-MOD에 대한 결합 친화도가 1nM 내지 100nM, 또는 100nM 내지 100μM이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 변이체 MOD는 Co-MOD에 대한 결합 친화도가 약 1nM 내지 약 5nM, 약 5nM 내지 약 10nM, 약 10nM 내지 약 50nM, 약 50nM 내지 약 100nM, 약 100nM 내지 약 150nM, 약 150nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 250nM, 약 250nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 350nM, 약 350nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 15μM, 약 15μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 25μM, 약 25μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP에 존재하는 변이체 MOD는 Co-MOD에 대한 결합 친화도가 약 1nM 내지 약 5nM, 약 5nM 내지 약 10nM, 약 10nM 내지 약 50nM, 약 50nM 내지 약 100nM이다.
Co-MOD에 대한 MOD의 감소된 친화도와 TCR에 대한 에피토프의 친화도 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 향상된 선택성을 제공하는 한편, 여전히 MOD의 활성을 허용한다. 예를 들어, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 i) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프 이외의 에피토프에 특이적인 TCR; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 MOD에 결합하는 Co-MOD를 나타내는 제2 T-세포에 대한 결합에 비해, i) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프에 특이적인 TCR; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 MOD에 결합하는 Co-MOD 둘 다를 나타내는 제1 T-세포에 대해 선택적으로 결합한다. 예를 들어, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 제2 T-세포에 결합하는 친화도보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 200%(2배), 적어도 250%(2.5배), 적어도 500%(5배), 적어도 1,000%(10배), 적어도 1,500%(15배), 적어도 2,000%(20배), 적어도 2,500%(25배), 적어도 5,000%(50배), 적어도 10,000%(100배) 또는 100배 초과인 친화도로 제1 T-세포에 결합한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP 에피토프 접합체는 이러한 접합체가 필요한 개체에게 투여될 때, 에피토프-특이적 T-세포 반응과 에피토프 비-특이적 T-세포 반응을 둘 다 유도한다. 본 개시내용의 T-세포-MMP 에피토프 접합체는 이러한 접합체가 필요한 개체에게 투여될 때, i) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프에 특이적인 TCR; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 MOD에 결합하는 Co-MOD 둘 다를 나타내는 제1 T-세포의 활성을 조절함으로써 에피토프-특이적 T-세포 반응을 유도한다. T-세포-MMP 에피토프 접합체는 또한 i) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프 이외의 에피토프에 특이적인 TCR; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 MOD에 결합하는 Co-MOD를 나타내는 제2 T-세포의 활성을 조절함으로써 에피토프 비-특이적 T-세포 반응을 유도한다. 에피토프-특이적 T-세포 반응 대 에피토프-비-특이적 T-세포 반응의 비는 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1 또는 적어도 100:1이다. 에피토프-특이적 T-세포 반응 대 에피토프-비-특이적 T-세포 반응의 비는 약 2:1 내지 약 5:1, 약 5:1 내지 약 10:1, 약 10:1 내지 약 15:1, 약 15:1 내지 약 20:1, 약 20:1 내지 약 25:1, 약 25:1 내지 약 50:1, 약 50:1 내지 약 100:1, 또는 100 초과의 수:1이다. T-세포의 "활성을 조절하는 것"은 i) 세포독성(예를 들어, CD8+) T-세포의 활성화; ii) 세포독성(예를 들어, CD8+) T-세포의 세포독성 활성 유도; iii) 세포독성(예를 들어, CD8+) T-세포에 의한 사이토톡신(예를 들어, 퍼포린; 그랜자임; 그라눌라이신(granulysin)의 생성 및 방출 유도; 및 iv)　자가반응성 T-세포의 활성 저해 등의 활성 저해 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
Co-MOD에 대한 MOD의 감소된 친화도와 TCR에 대한 에피토프의 친화도 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 향상된 선택성을 제공한다. 따라서, 예를 들어, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 i) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프 이외의 에피토프에 특이적인 TCR; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 MOD에 결합하는 Co-MOD를 나타내는 제2 T-세포에 결합하는 결합활성에 비해, i) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프에 특이적인 TCR; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 MOD에 결합하는 Co-MOD 둘 다를 나타내는 제1 T-세포에 대해 더 높은 결합활성으로 결합한다.
I.A.2.8 결합 친화도 결정
MOD와 이의 Co-MOD 사이의 결합 친화도는 정제된 MOD 및 정제된 Co-MOD를 이용하여 생물층 간섭계(BLI)에 의해 결정될 수 있다. T-세포-MMP-에피토프 접합체와 이의 Co-MOD 사이의 결합 친화도는 정제된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 및 Co-MOD를 이용하여 BLI에 의해 결정될 수 있다. BLI 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Lad et al. (2015) J. Biomol. Screen., 20(4):498-507; 및 Shah and Duncan (2014) J. Vis. Exp. 18:e51383] 참조. Co-MOD와 MOD 사이, 또는 Co-MOD와 T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체) 사이의 본 개시내용에 기재된 특이적 및 상대적 결합 친화도는 다음의 절차를 이용하여 결정될 수 있다.
BLI 분석은 다음과 같이, 옥텟 레드 96(Pal ForteBio) 기기 또는 유사한 기기를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)(예를 들어, 변이체 MOD를 갖는 본 개시내용의 T-세포-MMP 에피토프 접합체; 또는 야생형 MOD를 포함하는 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체)에 대한 Co-MOD의 결합 친화도를 결정하기 위해, T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)는 불용성 지지체("바이오센서") 상에 고정된다. 고정된 T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)는 "표적"이다. 고정화는 불용성 지지체 상에 포획 항체를 고정시킴으로써 달성될 수 있으며, 여기서 포획 항체는 T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)를 고정시킨다. 예를 들어, T-세포-MMP가 IgFc 폴리펩타이드를 포함하는 경우에, 고정은 항-Fc(예를 들어, 항-인간 IgG Fc) 항체를 불용성 지지체에 고정시킴으로써, 그리고 T-세포-MMP 에피토프 접합체를 이에 결합되고 고정시키는 고정된 항-Fc 항체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. Co-MOD는 몇몇 상이한 농도로 고정된 T-세포-MMP(또는 이의 고정된 에피토프 접합체)에 적용되고, 기기의 반응이 기록된다. 분석은 25mM HEPES pH 6.8, 5% 폴리(에틸렌 글리콜) 6000, 50mM KCl, 0.1% 소 혈청 알부민 및 0.02% 트윈(Tween) 20 비이온성 세정제를 포함하는 액체 배지에서 수행된다. 고정된 T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)에 대한 Co-MOD의 결합은 30°C에서 수행된다. 결합 친화도에 대한 양성 대조군으로서, 항-MHC 클래스 I 단클론성 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, KD가 7nM인 항-HLA 클래스 I 단클론성 항체(mAb) W6/32(American Type Culture Collection 번호 HB-95; Parham et al. (1979) J. Immunol. 123:342)가 사용될 수 있다. 표준 곡선은 항-MHC 클래스 I 단클론성 항체의 연속 희석을 이용하여 생성될 수 있다. Co-MOD 또는 항-MHC 클래스 I mAb는 "분석물"이다. BLI는 두 표면으로부터: i) 고정된 폴리펩타이드("표적"); 및 ii) 내부 기준층으로부터 반사된 백색광의 간섭 패턴을 분석한다. 바이오센서 팁에 결합된 분자("분석물"; 예를 들어, Co-MOD; 항-HLA 항체) 수의 변화는 간섭 패턴의 이동을 야기하며; 간섭 패턴의 이런 이동은 실시간으로 측정될 수 있다. 표적/분석물 상호작용의 친화도를 기재하는 두 역학 용어는 결합 상수(k a) 및 해리 상수(k d)이다. 이들 두 용어의 비(k d/k a)는 친화도 상수 KD를 생기게 한다. 분석은 또한 바이오센서 상에 고정된 정제된 야생형 또는 이의 변이체 MOD로 수행될 수 있는 한편, Co-MOD는 MOD와 이의 Co-MOD 사이의 결합 파라미터를 결정하기 위해 몇몇 상이한 농도로 적용된다.
야생형 MOD(예를 들어, IL-2)와 변이체 MOD(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 IL-2 변이체) 둘 다를 갖거나, 또는 야생형 또는 변이체 MOD를 함유하는 T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)를 갖는 Co-MOD(예를 들어, IL-2R)의 결합 친화도를 결정하는 것은, 그에 따라 야생형 및 변이체 분자의 상대적 결합 친화도를 결정하는 것을 가능하게 한다. 즉, 변이체 MOD의 그의 수용체(그의 Co-MOD)에 대한 결합 친화도가 동일한 Co-MOD에 대한 야생형 MOD의 결합 친화도에 비해 감소되는지의 여부, 그리고 만약에 그렇다면, 야생형 Co-MOD의 결합 친화도로부터의 감소 백분율이 무엇인지를 결정할 수 있다.
BLI 분석은 다중-웰 플레이트에서 수행된다. 분석을 실행하기 위해, 플레이트 레이아웃을 정하고, 분석 단계를 정하고 나서, 옥텟 데이터 획득 소프트웨어에서 바이오센서를 부여한다. 바이오센서 조립체는 수화된다. 수화된 바이오센서 조립체 및 분석 플레이트는 옥텟 기기 상에서 10분 동안 평형상태가 된다. 일단 데이터가 획득되면, 획득된 데이터는 옥텟 데이터 분석 소프트웨어에 부하된다. 데이터는 기준 차감, y-축 정렬, 단계간 보정 및 사비츠기-골레이 필터링(Savitzky-Golay filtering)에 대한 방법을 구체화함으로써 가공 창에서 가공된다. 데이터는 분석을 위해 단계들(결합 및 해리)을 구체화함으로서, 곡선 적합 모델(1:1), 적합화 방법(글로벌(global)) 및 관심 대상의 창(초)을 선택함으로써 분석 창에서 분석된다. 적합도 품질이 평가된다. 각각의 데이터 추적에 대한 KD 값(분석물 농도)은 3배 범위 내라면 평균화될 수 있다. KD 오차값은 친화도 상수 값의 10배 내이어야 하고; R2 값은 0.95 초과이어야 한다. 예를 들어, 문헌[Abdiche et al. (2008) J. Anal. Biochem., 377:209] 참조.
본 명세서에 달리 언급되지 않는 한, Co-MOD에 대한 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 친화도, 또는 Co-MOD에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체(대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 야생형 MOD를 포함하는 경우)의 친화도는 상기 기재한 바와 같은 BLI를 이용하여 결정된다. 마찬가지로, MOD 및 이의 Co-MOD 폴리펩타이드의 친화도는 상기 기재한 바와 같은 BLI를 이용하여 결정될 수 있다.
일부 경우에, i) Co-MOD에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체(대조군이 야생형 MOD를 포함하는 경우)의 결합 친화도 대 ii) Co-MOD에 대한 야생형 MOD의 변이체를 포함하는 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도의 비는, (상기 기재한 바와 같이) BLI에 의해 측정하여, 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 500:1, 적어도 102:1, 적어도 5×102:1, 적어도 103:1, 적어도 5×103:1, 적어도 104:1, 적어도 105:1, 또는 적어도 106:1이다. 일부 경우에, i) Co-MOD에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체(대조군이 야생형 MOD를 포함하는 경우)의 결합 친화도 대 ii) Co-MOD에 대한 야생형 MOD의 변이체를 포함하는 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도의 비는, BLI에 의해 측정될 때, 1.5:1 내지 106:1, 예를 들어, 1.5:1 내지 10:1, 10:1 내지 50:1, 50:1 내지 102:1, 102:1 내지 103:1, 103:1 내지 104:1, 104:1 내지 105:1, 또는 105:1 내지 106:1의 범위에 있다.
예로서, 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 야생형 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 및 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 MOD로서 변이체 IL-2 폴리펩타이드(야생형 IL-2 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 비해 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함)를 포함하는 경우, i) IL-2 수용체(즉, Co-MOD)에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도 대 ii) IL-2 수용체(즉, Co-MOD)에 대한 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도의 비는, BLI에 의해 측정될 때, 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 500:1, 적어도 102:1, 적어도 5×102:1, 적어도 103:1, 적어도 5×103:1, 적어도 104:1, 적어도 105:1 또는 적어도 106:1이다. 일부 경우에, 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 야생형 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 및 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 MOD로서 변이체 IL-2 폴리펩타이드(야생형 IL-2 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 비해 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함함)를 포함하는 경우, i) IL-2 수용체(즉, Co-MOD)에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도 대 ii) IL-2 수용체에 대한 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도의 비는, BLI에 의해 측정될 때, 1.5:1 내지 106:1, 예를 들어, 1.5:1 내지 10:1, 10:1 내지 50:1, 50:1 내지 102:1, 102:1 내지 103:1, 103:1 내지 104:1, 104:1 내지 105:1, 또는 105:1 내지 106:1의 범위에 있다.
다른 예로서, 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 야생형 PD-L1 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 및 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 MOD로서 변이체 PD-L1 폴리펩타이드(야생형 PD-L1 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 비해 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함)를 포함하는 경우, i) PD-1 폴리펩타이드(즉, Co-MOD)에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도 대 ii) PD-1 폴리펩타이드에 대한 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도의 비는, BLI에 의해 측정될 때, 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 500:1, 적어도 102:1, 적어도 5×102:1, 적어도 103:1, 적어도 5×103:1, 적어도 104:1, 적어도 105:1 또는 적어도 106:1이다.
다른 예로서, 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 야생형 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 및 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 MOD로서 변이체 CD80 폴리펩타이드(야생형 CD80 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 비해 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함)를 포함하는 경우, i) CTLA4 폴리펩타이드(즉, Co-MOD)에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도 대 ii) CTLA4 폴리펩타이드에 대한 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도의 비는, BLI에 의해 측정될 때, 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 500:1, 적어도 102:1, 적어도 5×102:1, 적어도 103:1, 적어도 5×103:1, 적어도 104:1, 적어도 105:1 또는 적어도 106:1이다.
다른 예로서, 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 야생형 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 MOD로서 변이체 CD80 폴리펩타이드(야생형 CD80 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 비해 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함)를 포함하는 경우, i) CD28 폴리펩타이드(즉, Co-MOD)에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도 대 ii) CD28 폴리펩타이드(즉, Co-MOD)에 대한 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도의 비는, BLI에 의해 측정될 때, 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 500:1, 적어도 102:1, 적어도 5×102:1, 적어도 103:1, 적어도 5×103:1, 적어도 104:1, 적어도 105:1 또는 적어도 106:1이다.
다른 예로서, 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 야생형 4-1BBL 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 및 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 MOD로서 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드(야생형 4-1BBL 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 비해 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함)를 포함하는 경우, i) 4-1BB 폴리펩타이드(즉, Co-MOD)에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도 대 ii) 4-1BB 폴리펩타이드(즉, Co-MOD)에 대한 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도의 비는, BLI에 의해 측정될 때, 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 500:1, 적어도 102:1, 적어도 5×102:1, 적어도 103:1, 적어도 5×103:1, 적어도 104:1, 적어도 105:1 또는 적어도 106:1이다.
다른 예로서, 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 야생형 CD86 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 및 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 MOD로서 변이체 CD86 폴리펩타이드(야생형 CD86 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 비해 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함)를 포함하는 경우, i) CD28 폴리펩타이드(즉, Co-MOD)에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도 대 ii)CD28 폴리펩타이드(즉, Co-MOD)에 대한 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도의 비는, BLI에 의해 측정될 때, 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 500:1, 적어도 102:1, 적어도 5×102:1, 적어도 103:1, 적어도 5×103:1, 적어도 104:1, 적어도 105:1 또는 적어도 106:1이다.
표적 T-세포에 대한 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도는 다음의 방식으로 측정될 수 있다: A) 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 이의 표면 상에서: i) 모 야생형 MOD에 결합하는 Co-MOD; 및 ii) 에피토프에 결합하는 TCR(여기서, T-세포-MMP-에피토프 접합체가 표적 T-세포에 결합하도록 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 에피토프 태그 또는 형광 표지를 포함함)을 발현시키는 표적 T-세포와 접촉시키는 것; B) T-세포-MMP 에피토프 접합체가 표지되지 않는다면, 표적 T-세포-결합된 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 에피토프 태그에 결합하는 형광 표지된 결합제(예를 들어, 형광 표지된 항체)와 접촉시켜, T-세포-MMP-에피토프 접합체/표적 T-세포/결합제 복합체를 생성하는 것; C) 유세포분석을 이용하여 T-세포-MMP-에피토프 접합체/표적 T-세포/결합제 복합체의 평균 형광 강도(MFI)를 측정하는 것. 에피토프 태그는, 예를 들어, FLAG 태그, 혈구응집소 태그, c-myc 태그, 폴리(히스티딘) 태그 등일 수 있다. 다양한 농도의 T-세포-MMP-에피토프 접합체(라이브러리 구성원)에 대해 측정된 MFI는 친화도의 측정을 제공한다. 다양한 농도의 T-세포-MMP-에피토프 접합체(라이브러리 구성원)에 대해 측정된 MFI는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 절반의 최대 유효 농도(EC50)를 제공한다. 일부 경우에, 표적 T-세포에 대한 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 EC50은nM 범위이고; 대조군 T-세포(대조군 T-세포가 그의 표면 상에서 i) 모 야생형 MOD에 결합하는 Co-MOD; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프에 결합하지 않는 T-세포 수용체를 발현시키는 경우)에 대한 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 EC50은μM 범위에 있다. 일부 경우에, 대조군 T-세포에 대한 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 EC50 대 표적 T-세포에 대한 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 EC50의 비는 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 500:1, 적어도 102:1, 적어도 5×102:1, 적어도 103:1, 적어도 5×103:1, 적어도 104:1, 적어도 105:1, 또는 적어도 106:1이다. 대조군 T-세포에 대한 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 EC50 대 표적 T-세포에 대한 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 EC50의 비는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 선택성의 표현이다.
일부 경우에, 앞서 언급한 단락에 기재한 바와 같이 측정할 때, i) 모 야생형 MOD에 결합하는 Co-MOD; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원에 존재하는 에피토프 이외의 에피토프에 결합하는 TCR을 포함하는 대조군 T-세포에 대한 T-세포-MMP-에피토프 접합체(라이브러리 구성원)의 결합에 비해 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 표적 T-세포에 대한 선택적 결합을 나타낸다.
이량체화된 다량체 T-세포 조절 폴리펩타이드
화학적으로 접합된 에피토프를 갖는 것을 포함하는 본 개시내용의 T-세포-MMP는 이량체화될 수 있으며, 즉, 본 개시내용은 본 개시내용의 다량체 T-세포-MMP의 이량체를 포함하는 다량체 폴리펩타이드를 제공한다. 따라서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 다량체 T-세포-MMP를 제공한다: A) a) i) 펩타이드 에피토프; 및 ii) 제1 MHC 폴리펩타이드를 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및 b) 제2 MHC 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하되, 제1 헤테로이량체는 하나 이상의 MOD를 포함하는, 제1 헤테로이량체; 및 B) a) i) 펩타이드 에피토프; 및 ii) 제1 MHC 폴리펩타이드를 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및 b) 제2 MHC 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하되, 제2 헤테로이량체는 하나 이상의 MOD를 포함하고, 제1 헤테로이량체 및 제2 헤테로이량체는 서로 공유적으로 연결되는, 제2 헤테로이량체. 일부 경우에, 2개의 다량체 T-세포-MMP는 아미노산 서열에서 서로 동일하다. 일부 경우에, 제1 헤테로이량체 및 제2 헤테로이량체는 제1 헤테로이량체의 제2 폴리펩타이드의 C-말단 영역 및 제2 헤테로이량체의 제2 폴리펩타이드의 C-말단 영역을 통해 서로 공유결합된다. 일부 경우에, 제1 헤테로이량체 및 제2 헤테로이량체는 제1 헤테로이량체의 제2 폴리펩타이드의 C-말단의 아미노산 및 제2 헤테로이량체의 제2 폴리펩타이드의 C-말단의 아미노산을 통해 서로 공유 결합되고; 예를 들어, 일부 경우에, 제1 헤테로이량체의 제2 폴리펩타이드의 C-말단의 아미노산 및 제2 헤테로이량체의 제2 폴리펩타이드의 C-말단의 아미노산은 직접적으로 또는 링커를 통해 서로 연결된다. 링커는 펩타이드 링커일 수 있다. 펩타이드 링커는 1 aa 내지 200 aa(예를 들어, 1 aa 내지 5 aa, 5 aa 내지 10 aa, 10 aa 내지 25 aa, 25 aa 내지 50 aa, 50 aa 내지 100 aa, 100 aa 내지 150 aa 또는 150 aa 내지 200 aa)의 길이를 가질 수 있다. 일부 경우에, 제1 헤테로이량체의 펩타이드 에피토프 및 제2 헤테로이량체의 펩타이드 에피토프는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제1 및 제2 헤테로이량체의 제1 MHC 폴리펩타이드는 MHC 클래스 I β2M이고, 제1 및 제2 헤테로이량체의 제2 MHC 폴리펩타이드는 MHC 클래스 I 중쇄이다. 일부 경우에, 제1 헤테로이량체의 MOD 및 제2 헤테로이량체의 MOD는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제1 헤테로이량체의 MOD 및 제2 헤테로이량체의 MOD는 대응하는 모 야생형 MOD에 비해 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 MOD이되, 1 내지 10개의 아미노산 치환은 Co-MOD에 대한 변이체 MOD의 감소된 친화도 결합을 초래한다. 일부 경우에, 제1 헤테로이량체의 MOD 및 제2 헤테로이량체의 MOD는 IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD70, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1(CD339), TGFβ, ICAM 및 이의 변이체 MOD(예를 들어, 대응하는 모 야생형 MOD에 비해 1 내지 10개의 아미노산 치환을 갖는 변이체 MOD)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합한 MHC 폴리펩타이드드, MOD 및 펩타이드 에피토프의 예는 이하에 기재된다.
이량체에 추가로, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및 T-세포-MMP 에피토프 접합체는 삼량체, 사량체 또는 오량체를 포함하는 더 고차의 복합체를 형성할 수 있다. T-세포-MMP의 다량체를 포함하는 조성물은 또한 단량체와 같은 더 저급의 복합체를 포함할 수 있고, 따라서 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 또는 임의의 이들의 조합물(예를 들어, 단량체와 이량체의 혼합물)을 포함할 수 있다.
I.B. T-세포-MMP의 MHC 폴리펩타이드
상기 언급한 바와 같이, T-세포-MMP 및 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 MHC 폴리펩타이드를 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "주조직 적합 복합체(MHC) 폴리펩타이드"는 인간 MHC(또한 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지칭됨) 폴리펩타이드, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트 등) MHC 폴리펩타이드 및 다른 포유류 종(예를 들어, 토끼목, 비인간 영장류, 갯과, 고양잇과, 유제류(예를 들어, 말, 소, 양, 염소 등) MHC 폴리펩타이드 등을 포함하는, 다양한 종의 MHC 클래스 I 폴리펩타이드를 포함하는 것을 의미한다. 용어 "MHC 폴리펩타이드"는 클래스 I MHC 폴리펩타이드(예를 들어, β-2 마이크로글로불린 및 MHC 클래스 I 중쇄 및/또는 이의 일부)를 포함하는 것을 의미한다.
상기 주목한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 T-세포-MMP 및 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 제1 및 제2 MHC 폴리펩타이드는 클래스 I MHC 폴리펩타이드이다(예를 들어, 일부 경우에, 제1 MHC 폴리펩타이드는 MHC 클래스 I β2M(β2M) 폴리펩타이드이고, 제2 MHC 폴리펩타이드는 MHC 클래스 I 중쇄(H 쇄)("MHC-H")이다). 실시형태에서, T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)에서 β2M과 MHC-H 쇄 서열은 둘 다 인간 유래이다. 달리 분명하게 언급되지 않는 항, 본 명세서에 기재된 T-세포-MMP는 이것이 발현되는 세포(예를 들어, 진핵 세포, 예컨대 포유류 세포)에 얻어진 T-세포-MMP를 고정시키는 데 충분한 MHC 클래스 I 분자 또는 해당 분자의 부분의 도메인(막관통 영역)을 고정시키는 막을 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
일부 경우에, T-세포-MMP, 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 MHC 폴리펩타이드는 클래스 I HLA 폴리펩타이드, 예를 들어, β2M 폴리펩타이드 또는 클래스 I HLA 중쇄 폴리펩타이드이다. T-세포-MMP 또는 이들의 에피토프 접합체에 포함될 수 있는 클래스 I HLA 중쇄 폴리펩타이드는 HLA-A 중쇄 폴리펩타이드, HLA-B 중쇄 폴리펩타이드, HLA-C 중쇄 폴리펩타이드, HLA-E 중쇄 폴리펩타이드, HLA-F 중쇄 폴리펩타이드 및 HLA-G 중쇄 폴리펩타이드, 또는 도 3A, 도 3B, 도 3C 및/또는 도 3D에 도시된 임의의 인간 HLA 중쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 아미노산 25 내지 365에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 이들은 1 내지 30, 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25 또는 25 내지 30개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있음)를 포함한다.
예로서, 다량체 폴리펩타이드의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 도 3A에 도시된 임의의 인간 HLA-A 중쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 아미노산 25 내지 365에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
I.B.1 MHC 클래스 I 중쇄
HLA-A (HLA-A*01:01:01:01)
실시형태에서, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 HLA-A*01:01:01:01의 아미노산 서열(도 3D의 HLA-A(서열번호 140)), 또는 해당 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(예를 들어, 이는 1 내지 25, 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25 또는 25 내지 30개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있음). 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A 중쇄 폴리펩타이드가 도 3D에 HLA-A로 표지된 서열에 대해 100% 미만의 동일성을 갖는 경우에, 84번 위치에서 타이로신의 알라닌으로의 치환(Y84A); 84번 위치에서의 타이로신의 시스테인으로의 치환(Y84C); 139번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A139C); 및 236번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A236C)으로부터 선택된 84, 139 및/또는 236번 위치 중 하나 이상에서 치환을 포함할 수 있다. Y84A 치환은 MHC 결합 포켓의 하나의 단부를 개방시키고, 링커가 (존재한다면) 포켓의 단부를 통해 "스레딩(thread)"되는 것을 가능하게 하며, 에피토프 크기(예를 들어, 에피토프 서열을 보유하는 더 긴 펩타이드)의 더 큰 변화는 포켓에 맞춰지게 하고, T-세포-MMP에 의해 제공된다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A 중쇄 폴리펩타이드는 Y84A 및 A236C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C 및 A139C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C, A139C 및 A236C 돌연변이를 포함한다.
HLA-A*0201
실시형태에서, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 도 3D에 제공된 HLA-A*0201의 아미노산 서열(서열번호 143), 또는 해당 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(예를 들어, 이는 1 내지 25, 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25 또는 25 내지 30개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있음). 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*0201 중쇄 폴리펩타이드가 도 3D에 HLA-A*0201로 표지된 서열에 대해 100% 미만의 동일성을 갖는 경우에, 84번 위치에서 타이로신의 알라닌으로의 치환(Y84A); 84번 위치에서의 타이로신의 시스테인으로의 치환(Y84C); 139번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A139C); 및 236번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A236C)으로부터 선택된 84, 139 및/또는 236번 위치 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*0201 중쇄 폴리펩타이드는 Y84A 및 A236C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*0201 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C 및 A139C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*0201 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C, A139C 및 A236C 돌연변이를 포함한다.
HLA-A*1101
실시형태에서, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 도 3D에 제공된 HLA-A*1101의 아미노산 서열(서열번호 148), 또는 해당 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(예를 들어, 이는 1 내지 25, 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25 또는 25 내지 30개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있음). 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*1101 중쇄 폴리펩타이드가 도 3D에 HLA-A*1101로 표지된 서열에 대해 100% 미만의 동일성을 갖는 경우에, 84번 위치에서 타이로신의 알라닌으로의 치환(Y84A); 84번 위치에서의 타이로신의 시스테인으로의 치환(Y84C); 139번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A139C); 및 236번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A236C)으로부터 선택된 84, 139 및/또는 236번 위치 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*1101 중쇄 폴리펩타이드는 Y84A 및 A236C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*1101 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C 및 A139C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*1101 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C, A139C 및 A236C 돌연변이를 포함한다.
HLA-A*2402
실시형태에서, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 도 3D에 제공된 HLA-A*2402의 아미노산 서열(서열번호 149), 또는 해당 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(예를 들어, 이는 1 내지 25, 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25 또는 25 내지 30개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있음). 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*2402 중쇄 폴리펩타이드가 도 3D에 HLA-A*2402로 표지된 서열에 대해 100% 미만의 동일성을 갖는 경우에, 84번 위치에서 타이로신의 알라닌으로의 치환(Y84A); 84번 위치에서의 타이로신의 시스테인으로의 치환(Y84C); 139번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A139C); 및 236번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A236C)으로부터 선택된 84, 139 및/또는 236번 위치 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*2402 중쇄 폴리펩타이드는 Y84A 및 A236C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*2402 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C 및 A139C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*2402 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C, A139C 및 A236C 돌연변이를 포함한다.
HLA-A*3303
실시형태에서, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 도 3D에 제공된 HLA-A*3303의 아미노산 서열(서열번호 150), 또는 해당 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(예를 들어, 이는 1 내지 25, 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25 또는 25 내지 30개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있음). 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*3303 중쇄 폴리펩타이드가 도 3D에 HLA-A*3303로 표지된 서열에 대해 100% 미만의 동일성을 갖는 경우에, 84번 위치에서 타이로신의 알라닌으로의 치환(Y84A); 84번 위치에서의 타이로신의 시스테인으로의 치환(Y84C); 139번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A139C); 및 236번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A236C)으로부터 선택된 84, 139 및/또는 236번 위치 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*3303 중쇄 폴리펩타이드는 Y84A 및 A236C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*3303 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C 및 A139C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-A*3303 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C, A139C 및 A236C 돌연변이를 포함한다.
HLA-B
실시형태에서, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 HLA-B의 아미노산 서열(서열번호 141)(도 3D의 HLA-B), 또는 해당 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(예를 들어, 이는 1 내지 25, 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25 또는 25 내지 30개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있음). 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-B 중쇄 폴리펩타이드가 도 3D에 HLA-B로 표지된 서열에 대해 100% 미만의 동일성을 갖는 경우에, 84번 위치에서 타이로신의 알라닌으로의 치환(Y84A); 84번 위치에서의 타이로신의 시스테인으로의 치환(Y84C); 139번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A139C); 및 236번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A236C)으로부터 선택된 84, 139 및/또는 236번 위치 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-B 중쇄 폴리펩타이드는 Y84A 및 A236C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-B 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C 및 A139C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-B 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C, A139C 및 A236C 돌연변이를 포함한다.
HLA-C
실시형태에서, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 HLA-C의 아미노산 서열(서열번호 142)(도 3D의 HLA-C), 또는 해당 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(예를 들어, 이는 1 내지 25, 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25 또는 25 내지 30개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있음). 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-C 중쇄 폴리펩타이드가 도 3D에 HLA-C로 표지된 서열에 대해 100% 미만의 동일성을 갖는 경우에, 84번 위치에서 타이로신의 알라닌으로의 치환(Y84A); 84번 위치에서의 타이로신의 시스테인으로의 치환(Y84C); 139번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A139C); 및 236번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A236C)으로부터 선택된 84, 139 및/또는 236번 위치 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-C 중쇄 폴리펩타이드는 Y84A 및 A236C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-C 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C 및 A139C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-C 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C, A139C 및 A236C 돌연변이를 포함한다.
마우스 H2K
실시형태에서, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 마우스 H2K의 아미노산 서열(서열번호 144)(도 3D의 마우스 H2K), 또는 해당 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다(예를 들어, 이는 1 내지 25, 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 20 내지 25 또는 25 내지 30개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있음). 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 마우스 H2K 중쇄 폴리펩타이드가 도 3D에 마우스 H2K로 표지된 서열에 대해 100% 미만의 동일성을 갖는 경우에, 84번 위치에서 타이로신의 알라닌으로의 치환(Y84A); 84번 위치에서의 타이로신의 시스테인으로의 치환(Y84C); 139번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A139C); 및 236번 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 치환(A236C)으로부터 선택된 84, 139 및/또는 236번 위치 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 마우스 H2K 중쇄 폴리펩타이드는 Y84A 및 A236C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 마우스 H2K 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C 및 A139C 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 마우스 H2K 중쇄 폴리펩타이드는 Y84C, A139C 및 A236C 돌연변이를 포함한다.
116 및 167번 위치에서의 치환
임의의 MHC 클래스 I 중쇄 서열(상기 논의한 것: HLA-A (HLA-A*01:01:01:01); HLA-A*0201; HLA-A*1101; HLA-A*2402; HLA-A*3303; HLA-B; HLA-C; 및 마우스 H2K를 포함함)은 116번 위치에서의 시스테인 치환(Y116C, 예컨대, 말레이미드 펩타이드와의 반응에 의해 에피토프 펩타이드를 고정시키는 티올을 제공) 및/또는 167번 위치에서의 알라닌(W167A) 또는 시스테인(W167C) 중 하나를 추가로 포함할 수 있다. MHC-H 결합 포켓 중 하나의 단부를 개방하는 치환(예를 들어, 84번 위치 또는 이의 동의어, 예컨대 Y84A)과 같이, 167번 위치 또는 이의 동의어에서의 알라닌 또는 글리신의 치환(예를 들어, W167A 치환)은 MHC 결합 포켓의 다른 단부를 개방하여, T-세포-MMP 에피토프 접합체에 의해 제공될 수 있는 에피토프 펩타이드의 더 큰 변형(예를 들어, 더 긴 길이)을 가능하게 하는 그루브를 생성한다. 84 및 167번 위치에서의 치환 또는 이들의 동의어(예를 들어, W167A 또는 W167G와 조합한 Y84A)는 MHC-H 쇄의 결합 포켓을 변형시키기 위해 조합하여 사용될 수 있다. 167번 위치에서의 시스테인 배치(예를 들어, W167C 돌연변이) 또는 이의 동의어는 에피토프 펩타이드를 고정시키기 위해 티올 잔기를 제공한다. 116 및 167번 위치에서의 시스테인 치환은 에피토프(예를 들어, 에피토프 펩타이드)를 고정시키기 위해 별개로, 또는 2개 위치(예를 들어, 펩타이드를 함유하는 에피토프의 말단)에서 에피토프를 고정시키는 것과 조합하여 사용될 수 있다. 116번 및/또는 167번 위치에서의 돌연변이는 상기 기재한 84, 139 및/또는 236번 위치에서 임의의 하나 이상의 돌연변이와 조합될 수 있다.
치환의 조합
아미노산 84 및 139가 둘 다 시스테인일 때, 이들은 MHC 클래스 1 단백질을 안정화시키고 에피토프 펩타이드가 부하되지 않을 때조차 진핵 세포의 번역 및 배출을 가능하게 할 수 있는 쇄내 이황화결합을 형성할 수 있다. 84번 위치가 C 잔기일 때, 이는 또한 β2M 폴리펩타이드의 N-말단에 부착된 링커(예를 들어, 에피토프-GCGGS(G4S)n (서열번호 133) 성숙 β2M 폴리펩타이드, 서열번호 151 내지 155 참조)를 갖는 쇄간 이황화결합을 형성할 수 있다. 아미노산 236이 시스테인일 때, 해당 위치에서 R12 C 치환을 포함하는 변이체 β2M 폴리펩타이드의 아미노산 12에서 시스테인과의 쇄간 이황화결합을 형성할 수 있다. T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체 내로 혼입될 수 있는 MHC 클래스 1 중쇄 서열 변형의 일부 가능한 조합을 다음의 표에 나타낸다. 잔기 84, 139 및 236에서 표에 제공되는 치환의 임의의 조합은 표에 제공되는 116 및 167번 위치에서의 치환의 임의의 조합과 조합될 수 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
I.B.2 MHC 클래스 I β2-마이크로글로빈 및 MHC-H 폴리펩타이드와의 조합
다량체 폴리펩타이드의 β2M 폴리펩타이드는 인간 β2M 폴리펩타이드, 비인간 영장류 β2M 폴리펩타이드, 뮤린 β2M 폴리펩타이드 등일 수 있다. 일부 예에서, β2M 폴리펩타이드는 도 4에 도시된 β2M 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 예에서, β2M 폴리펩타이드는 도 4에 도시된 β2M 아미노산 서열의 아미노산 21 내지 119에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, MHC 폴리펩타이드는 기준 MHC 폴리펩타이드에 비해 단일 아미노산 치환을 포함하며(여기서, 기준 MHC 폴리펩타이드는 야생형 MHC 폴리펩타이드일 수 있음), 단일 아미노산 치환은 아미노산을 시스테인(Cys) 잔기로 치환한다. 이러한 시스테인 잔기는, T-세포-MMP, 또는 이의 에피토프 접합체의 제1 폴리펩타이드의 MHC 폴리펩타이드에 존재할 때, 제2 폴리펩타이드 쇄에 존재하는 시스테인 잔기와의 이황화결합을 형성할 수 있다.
일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드의 제1 폴리펩타이드 내 제1 MHC 폴리펩타이드 및/또는 다량체 폴리펩타이드의 제2 폴리펩타이드 내 제2 MHC 폴리펩타이드는 아미노산을 시스테인으로 치환하는 아미노산 치환을 포함하며, 제1 MHC 폴리펩타이드 내 치환된 시스테인은 제2 MHC 폴리펩타이드에서 시스테인과의 이황화 결합을 형성하며, 제1 MHC 폴리펩타이드 내 시스테인은 제2 MHC 폴리펩타이드 내 치환된 시스테인과의 이황화 결합을 형성하거나, 또는 제1 MHC 폴리펩타이드 내 치환된 시스테인은 제2 MHC 폴리펩타이드 내 치환된 시스테인과의 이황화 결합을 형성한다.
예를 들어, 일부 경우에, HLA β2M 및 HLA 클래스 I 중쇄에서 다음의 잔기 쌍 중 하나는 시스테인으로 치환된다(여기서 잔기 수는 성숙 폴리펩타이드의 수임): 1) β2M 잔기 12, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 236; 2) β2M 잔기 12, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 237; 3) β2M 잔기 8, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 234; 4) β2M 잔기 10, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 235; 5) β2M 잔기 24, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 236; 6) β2M 잔기 28, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 232; 7) β2M 잔기 98, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 192; 8) β2M 잔기 99, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 234; 9) β2M 잔기 3, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 120; 10) β2M 잔기 31, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 96; 11) β2M 잔기 53, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 35; 12) β2M 잔기 60, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 96; 13) β2M 잔기 60, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 122; 14) β2M 잔기 63, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 27; 15) β2M 잔기 Arg3, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Gly120; 16) β2M 잔기 His31, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Gln96; 17) β2M 잔기 Asp53, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Arg35; 18) β2M 잔기 Trp60, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Gln96; 19) β2M 잔기 Trp60, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Asp122; 20) β2M 잔기 Tyr63, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Tyr27; 21) β2M 잔기 Lys6, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Glu232; 22) β2M 잔기 Gln8, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Arg234; 23) β2M 잔기 Tyr10, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Pro235; 24) β2M 잔기 Ser11, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Gln242; 25) β2M 잔기 Asn24, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Ala236; 26) β2M 잔기 Ser28, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Glu232; 27) β2M 잔기 Asp98, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 His192; 및 28) β2M 잔기 Met99, HLA 클래스 I 중쇄 잔기 Arg234. MHC/HLA 클래스 I 중쇄의 아미노산 넘버링은 신호 펩타이드가 없는 성숙 MHC/HLA 클래스 I 중쇄에 관한 것이다. 예를 들어, 신호 펩타이드를 포함하는 도 3A에 도시된 아미노산 서열에서, Gly120은 Gly144이고; Gln96은 Gln120 등이다. 일부 경우에서, β2M 폴리펩타이드는 R12C 치환을 포함하고, HLA 클래스 I 중쇄는 A236C 치환을 포함하며; 이러한 경우에, 이황화 결합은 β2M 폴리펩타이드의 Cys-12와 HLA 클래스 I 중쇄의 Cys-236을 형성한다. 예를 들어, 일부 경우에, 성숙 HLA-A 아미노산 서열의 잔기 236(즉, 도 3A에 도시된 아미노산 서열의 잔기 260)은 Cys으로 치환된다. 일부 경우에, 성숙 HLA-B 아미노산 서열의 잔기 236(즉, 도 3B에 도시된 아미노산 서열의 잔기 260)은 Cys으로 치환된다. 일부 경우에서, 성숙 HLA-C 아미노산 서열의 잔기 236(즉, 도 3C에 도시된 아미노산 서열의 잔기 260)은 Cys으로 치환된다. 일부 경우에, 도 4에 도시된 아미노산 서열의 잔기 32(성숙 β2M의 Arg-12에 대응)는 Cys으로 치환된다.
T-세포-MMP(상기 논의)의 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 사이에 쇄간 이황화결합을 형성하기 위해 사용될 수 있는 β2M 및 HLA 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드 내 시스테인 잔기의 쌍과 별개로 또는 추가로, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA-중쇄는 시스테인으로 치환되어 α1 나선의 카복실 말단 부분 내로 치환된 시스테인과 α2-1 나선의 아미노 말단 부분의 시스테인 사이에 쇄간 이황화결합을 형성할 수 있다. 이러한 이황화결합은 T-세포-MMP를 안정화시키며, 결합된 에피토프 펩타이드(또는 무효 펩타이드)의 부재 하에 진핵 세포로부터의 세포 가공 및 배출을 가능하게 한다. 일 실시형태에서, α1 나선의 카복실 말단 부분은 약 아미노산 79번 위치 내지 약 아미노산 89번 위치이고, α2-1 나선의 아미노 말단 부분은 약 아미노산 134번 위치 내지 MHC 클래스 I 중쇄의 아미노산 144번 위치이다(아미노산 위치는 이들의 리더 서열 없이 중쇄 서열에 기반하여 결정된다(예를 들어, 도 3D 참조). 하나의 이러한 실시형태에서, 이황화결합은 83, 84 또는 85번 위치에 위치된 시스테인과 MHC 클래스 I 중쇄의 138, 139 또는 140번 위치 중 어느 것에 위치된 시스테인 사이이다. 예를 들어, 이황화결합은 아미노산 83에서 MHC 클래스 I 중쇄 내로 혼입된 시스테인으로부터 138, 139 또는 140번 위치 중 어느 것에 위치된 아미노산에서 시스테인 사이에 형성될 수 있다. 대안적으로, 이황화결합은 84번 위치에 삽입된 시스테인과 138, 139 또는 140번 위치 중 어느 것에 삽입된 시스테인 사이에, 또는 85번 위치에 삽입된 시스테인과 138, 139 또는 140번 위치 중 어느 하나에서의 시스테인 사이에 형성될 수 있다. 실시형태에서, MHC 클래스 1 중쇄 쇄내 이황화결합은 84번 및 139번 위치에서 중쇄 서열 내로 치환되는 시스테인이다(예를 들어, 중쇄 서열은 도 3D에 제시된 중쇄 서열 중 하나일 수 있다). 상기 언급한 바와 같이, 84 및 139번에서 시스테인 사이의 이황화결합을 포함하는 MHC 클래스 I 쇄내 이황화결합 중 어느 것은, 예를 들어, 도 4에 나타낸 바와 같은 성숙 β2M 폴리펩타이드 서열(이의 리더를 결여)의 MHC 클래스 1 중쇄 236번 위치와 12번 위치 사이의 결합을 포함하는 쇄내 이황화결합과 조합될 수 있다.
다른 실시형태에서, 쇄내 이황화결합은 79번과 89번의 아미노산 위치 사이의 영역 내로 치환된 시스테인과 도 3D에 주어진 134번과 144번 아미노산 위치 사이의 영역 내로 치환된 시스테인 사이의 T-세포-MMP, 또는 이의 에피토프 접합체의 MHC-H 서열에 형성될 수 있다. 이러한 실시형태에서, MHC 클래스 I 중쇄 서열은 α1 나선의 카복실 말단 부분과 α2-1 나선의 아미노 말단 부분 사이에 이황화결합을 형성하는 시스테인 앞의 또는 뒤의 1 내지 5개의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 가질 수 있다. 임의의 삽입된 아미노산은 천연 유래 아미노산 또는 프롤린 및 알라닌을 제외한 천연 유래 아미노산으로부터 선택될 수 있다.
실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 β2M 폴리펩타이드는 NP_004039.1, NP_001009066.1, NP_001040602.1, NP_776318.1 또는 NP_ 033865.2 중 어느 하나(서열번호 151 내지 155) 중 어느 하나의 성숙 β2M 폴리펩타이드 서열(aas 21 내지 119)을 포함한다.
일부 경우에, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 도 3D에 제시된 HLA-A, B 또는 C 서열 중 어느 하나를 포함한다. 임의의 중쇄 서열은 쇄내 이황화결합을 형성할 수 있는 84번 및 139번 위치에서의 시스테인 치환을 추가로 포함할 수 있다.
실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 β2M 폴리펩타이드는 R12C 치환을 추가로 포함하는 도 4의 서열 중 어느 하나의 성숙 β2M 폴리펩타이드 서열(aas 21 내지 119)을 포함한다.
실시형태에서, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체는 R12C 치환을 갖는 성숙 β2M 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 도 4의 서열 중 어느 하나의 aas 21 내지 119)을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 236번 위치에서 시스테인을 함유하는 도 3D의 HLA-A, B 또는 C 중쇄 서열 중 어느 하나를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 실시형태에서 쇄내 이황화결합은 12번 및 236번 위치에서 시스테인 사이에 형성될 수 있다. 추가로, 임의의 중쇄 서열은 쇄내 이황화결합을 형성할 수 있는 84번 및 139번 위치에서의 시스테인 치환을 추가로 포함할 수 있다.
일부 경우에, T-세포-MMP, 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 HLA-A*0201의 아미노산 서열을 포함한다(도 3D). 일부 경우에, T-세포-MMP, 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 A236C 치환을 갖는 HLA-A*0201의 아미노산 서열을 포함한다(도 3D). 일부 경우에, T-세포-MMP, 또는 이의 에피토프 접합체의 HLA 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 Y84A 및 A236C 치환을 갖는 HLA-A*0201의 아미노산 서열을 포함한다(도 3D).
실시형태에서, T-세포-MMP, 또는 이의 에피토프 접합체는 R12C 치환을 갖는 NP_004039.1의 아미노산 잔기 21 내지 119를 포함하는 제1 폴리펩타이드(도 4 참조), 및 도 3D에서 HLA-A0201(HLA-A2) 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 하나의 이러한 실시형태에서, HLA-A0201 서열은 A236C 치환을 가진다. 다른 이러한 실시형태에서, HLA-A0201 서열은 Y84C 및 A139C 치환을 가진다. 다른 이러한 실시형태에서, HLA-A0201 서열은 Y84C, A139C 및 A236C 치환을 가진다. 표시한 바와 같이, Y84C 및 A139C 치환을 갖는 MHC-H 서열은 안정화 쇄내 이황화결합을 형성할 수 있고, 236번 위치에서 시스테인은 성숙 β2M 폴리펩타이드의 12번 위치에서 시스테인에 결합할 수 있다.
실시형태에서, T-세포-MMP, 또는 이의 에피토프 접합체는 R12C 치환을 갖는 NP_004039.1의 아미노산 잔기 21 내지 119를 포함하는 제1 폴리펩타이드(도 4 참조), 및 제2 폴리펩타이드를 포함하고, HLA 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 아미노산 서열
Figure pct00013
을 포함하거나; 또는 제1 폴리펩타이드는 서열
Figure pct00014
을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 아미노산 서열,
Figure pct00015
을 포함하며;
여기서, {C}로서 나타내는 시스테인 잔기는 α1과 α2-1 나선 사이에 이황화결합을 형성하고, (C) 잔기는 12번 위치에서 β2M 폴리펩타이드 시스테인과 이황화결합을 형성한다.
aa　클러스터　1, aa　클러스터　2, aa　클러스터　3, aa　클러스터　4, aa　클러스터　5 및 aa　클러스터　6의 각각의 경우는 1 내지 5개의 아미노산 잔기가 되도록 독립적으로 선택되되, 아미노산 잔기는 i) 임의의 천연 유래(유전단백체) 아미노산 또는 ii) 프롤린 또는 글리신을 제외한 임의의 천연 유래 아미노산으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
실시형태에서:
aa　클러스터　1은 아미노산 서열 GTLRG 또는 결실되거나 다른 천연 유래 아미노산(예를 들어, I, V, A 또는 F로 대체되는 L)으로 치환된 1 또는 2개의 아미노산을 갖는 해당 서열일 수 있고;
aa　클러스터　2는 아미노산 서열 YNQSE 또는 결실되거나 다른 천연 유래 아미노산(예를 들어, Q로 대체되는 N, N으로 대체되는 Q 및/또는 D로 대체되는 E)으로 치환된 1 또는 2개의 아미노산을 갖는 해당 서열일 수 있으며;
aa　클러스터　3은 아미노산 서열 TAADM 또는 결실되거나 다른 천연 유래 아미노산(예를 들어, S로 대체되는 T, G으로 대체되는 A, E로 대체되는 D 및/또는 L, V 또는 I로 대체되는 M)으로 치환된 1 또는 2개의 아미노산을 갖는 해당 서열일 수 있고;
aa　클러스터　4는 아미노산 서열 AQTTK 또는 결실되거나 다른 천연 유래 아미노산(예를 들어, G으로 대체되는 A, N으로 대체되는 Q 또는 S로 대체되는 T 및 또는 R 또는 Q로 대체되는 K)으로 치환된 1또는 2개의 아미노산을 갖는 해당 서열일 수 있으며;
aa　클러스터　5는 아미노산 서열 VETRP 또는 결실되거나 다른 천연 유래 아미노산(예를 들어, I 또는 L로 대체되는 V, D로 대체되는 E, S로 대체되는 T 및/또는 K로 대체되는 R)으로 치환된 1 또는 2개의 아미노산을 갖는 해당 서열일 수 있으며; 그리고/또는
aa　클러스터　6은 아미노산 서열 GDGTF 또는 결실되거나 다른 천연 유래 아미노산(예를 들어, E로 대체되는 D, S로 대체되는 T 또는 L, W 또는 Y로 대체되는 F)으로 치환된 1 또는 2개의 아미노산을 갖는 해당 서열일 수 있다.
일부 경우에, β2M 폴리펩타이드는 아미노산 서열: IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (서열번호 157)을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는: i) (예를 들어, 링커 및 β2M 서열에 대해 N-말단에 위치된 에피토프를 갖는)제1 폴리펩타이드 쇄에서 펩타이드 에피토프를 연결하는 링커 및 β2M 폴리펩타이드에 존재하는 Cys 잔기; 및 ii) 제2 폴리펩타이드 쇄 내의 MHC 클래스 I 중쇄에 존재하는 Cys 잔기를 통해 서려 연결되는 이황화결합이다. 일부 경우에, MHC 클래스 I 중쇄에 존재하는 Cys 잔기는 Y84C 치환으로서 도입되는 Cys이다. 일부 경우에, 제1 폴리펩타이드 쇄에서 펩타이드 에피토프를 연결하는 링커 및 β2M 폴리펩타이드는 GCGGS(G4S)n이며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9(서열번호 133)(예를 들어, 에피토프-GCGGS(G4S)n-성숙 β2M 폴리펩타이드)이다. 예를 들어, 일부 경우에, 링커는 아미노산 서열 GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 78)을 포함한다. 다른 예로서, 링커는 아미노산 서열 GCGGSGGGGSGGGGS (서열번호 79)을 포함한다. 이러한 이황화결합된 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 예는 도 6E 내지 도 6H에 개략적으로 도시된다.
I.C. 스캐폴드 폴리펩타이드
T-세포-MMP 및 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 Fc 폴리펩타이드를 포함할 수 있거나, 또는 다른 적합한 스캐폴드 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
적합한 스캐폴드 폴리펩타이드는 항체-기반 스캐폴드 폴리펩타이드및 비-항체-기반 스캐폴드를 포함한다. 비-항체-기반 스캐폴드는, 예를 들어, 알부민, XTEN(연장된 재조합체) 폴리펩타이드, 트랜스페린, Fc 수용체 폴리펩타이드, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드(예를 들어, 문헌[Hassouneh et al. (2012) Methods Enzymol. 502:215]; 예를 들어, (Val-Pro-Gly-X-Gly; 서열번호 159)의 펜타펩타이드 반복 단위를 포함하는 폴리펩타이드, 여기서, X는 프롤린이 아닌 임의의 아미노산임), 알부민-결합 폴리펩타이드, 실크-유사 폴리펩타이드(예를 들어, 문헌[Valluzzi et al. (2002) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 357:165] 참조), 실크-엘라스틴-유사 폴리펩타이드(SELP; 예를 들어, 문헌[Megeed et al. (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54:1075]) 등을 포함한다. 적합한 XTEN 폴리펩타이드는, 예를 들어, WO 2009/023270, WO 2010/091122, WO 2007/103515, 미국 특허 제2010/0189682호 및 미국 특허 제2009/0092582호에 개시된 것을 포함하고; 또한 문헌[Schellenberger et al. (2009) Nat Biotechnol. 27:1186)] 참조. 적합한 알부민 폴리펩타이드는, 예를 들어, 인간 혈청 알부민을 포함한다.
적합한 스캐폴드 폴리펩타이드는 일부 경우에 반감기 연장 폴리펩타이드일 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 적합한 스캐폴드 폴리펩타이드는 스캐폴드 폴리펩타이드가 없는 대조군 다량체 폴리펩타이드에 비해 다량체 폴리펩타이드의 생체내 반감기(예를 들어, 혈청 반감기)를 증가시킨다. 예를 들어, 일부 경우에, 스캐폴드 폴리펩타이드는 스캐폴드 폴리펩타이드가 없는 대조군 다량체 폴리펩타이드에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 25-배, 적어도 약 50-배, 적어도 약 100-배, 또는 100-배 초과만큼 다량체 폴리펩타이드의 생체내 반감기를 증가시킨다. 예로서, 일부 경우에, Fc 폴리펩타이드는 Fc 폴리펩타이드가 없는 대조군 다량체 폴리펩타이드에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 25-배, 적어도 약 50-배, 적어도 약 100-배, 또는 100-배 초과만큼 다량체 폴리펩타이드의 생체내 반감기(혈청 반감기)를 증가시킨다.
I.D. Fc 폴리펩타이드
일부 경우에, T-세포-MMP(또는 이의 대응하는 T-세포-MMP-에피토프 접합체)의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드 쇄는 폴리펩타이드 내에 또는 폴리펩타이드에 부착되는 (예를 들어, 말단에 또는 링커에 의해 부착되는) 하나 이상의 화학적 접합 부위를 포함하도록 변형될 수 있는 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 Fc 폴리펩타이드는, 예를 들어, 인간 폴리펩타이드 서열, 인간화된 폴리펩타이드 서열, 합성 중쇄 불변 영역의 Fc 영역 폴리펩타이드, 또는 공통 중쇄 불변 영역을 함유할 수 있는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM로부터 유래될 수 있다. 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 인간 IgG1 Fc, 인간 IgG2 Fc, 인간 IgG3 Fc, 인간 IgG4 Fc, 인간 IgA Fc, 인간 IgD Fc, 인간 IgE Fc, 인간 IgM Fc 등으로부터 유래될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, T-세포-MMPs 및 이들의 에피토프 접합체에서 사용되는 Fc 폴리펩타이드는 T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체를 세포막에 고정시키는 데 충분한 막관통 고정 도메인 또는 이의 일부를 포함하지 않는다. 일부 경우에, Fc 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2G에 도시된 Fc 영역의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Fc 영역은 도 2a에 도시된 인간 IgG1 Fc 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Fc 영역은 도 2a에 도시된 인간 IgG1 Fc 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 N77의 치환을 포함하며; 예를 들어, Fc 폴리펩타이드는 N77A 치환을 포함한다. 일부 경우에, Fc 폴리펩타이드는 도 2a에 도시된 인간 IgG2 Fc 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 예를 들어, Fc 폴리펩타이드는 도 2a에 도시된 인간 IgG2 Fc 폴리펩타이드의 아미노산 99 내지 325에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, Fc 폴리펩타이드는 도 2a에 도시된 인간 IgG3 Fc 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%, 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 예를 들어, Fc 폴리펩타이드는 도 2a에 도시된 인간 IgG3 Fc 폴리펩타이드의 아미노산 19 내지 246에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%, 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Fc 폴리펩타이드는 도 2b에 도시된 인간 IgM Fc 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 예를 들어, Fc 폴리펩타이드는 도 2b에 도시된 인간 IgM Fc 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 276에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Fc 폴리펩타이드는 도 2c에 도시된 인간 IgA Fc 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 예를 들어, Fc 폴리펩타이드는 도 2c에 도시된 인간 IgA Fc 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 234에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 도 2a에 도시된 아미노산 서열(인간 IgG1 Fc)을 포함한다. 일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 N297의 아스파라긴 이외의 아미노산으로의 치환을 제외하고 도 2a에 도시된 아미노산 서열(인간 IgG1 Fc)을 포함한다. 일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 도 2c에 도시된 아미노산 서열(N297A 치환을 포함하는 인간 IgG1 Fc)을 포함한다. 일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 L234의 류신 이외의 아미노산으로의 치환을 제외하고 도 2a에 도시된 아미노산 서열(인간 IgG1 Fc)을 포함한다. 일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 L235의 류신 이외의 아미노산으로의 치환을 제외하고 도 2a에 도시된 아미노산 서열(인간 IgG1 Fc)을 포함한다.
일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 도 2E에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 도 2F에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 도 2G에 도시된 아미노산 서열(L234A 치환 및 L235A 치환을 포함하는 인간 IgG1 Fc)을 포함한다. 일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 P331의 프롤린 이외의 아미노산으로의 치환을 제외하고, 도 2a에 도시된 아미노산 서열(인간 IgG1 Fc)을 포함하고; 일부 경우에, 치환은 P331S 치환이다. 일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 L234 및 L235의 류신 이외의 아미노산으로의 치환을 제외하고 도 2a에 도시된 아미노산 서열(인간 IgG1 Fc)을 포함한다. 일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 L234 및 L235의 류신 이외의 아미노산으로의 치환, 및 P331의 프롤린 이외의 아미노산으로의 치환을 제외하고 도 2a에 도시된 아미노산 서열(인간 IgG1 Fc)을 포함한다. 일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 도 2b에 도시된 아미노산 서열(L234F, L235E 및 P331S 치환을 포함하는 인간 IgG1 Fc)을 포함한다. 일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드는 L234A 및 L235A 치환을 포함하는 IgG1 Fc 폴리펩타이드이다.
I.E. 링커
T-세포-MMP(및 이들의 T-세포-MMP-에피토프 접합체)는, 예를 들어, i) MHC 폴리펩타이드 및 Ig Fc 폴리펩타이드, 여기서 이러한 링커는 본 명세서에서 "L1 링커"로서 지칭됨; ii) MHC 폴리펩타이드 및 MOD, 여기서 이러한 링커는 본 명세서에서 "L2 링커"로서 지칭됨; iii) 제1 MOD 및 제2 MOD, 여기서 이러한 링커는 본 명세서에서 "L3 링커"로서 지칭됨(예를 들어, 제1 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드와 제2 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드 사이; 또는 제2 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드와 제3 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드 사이); iv) 접합 부위 또는 펩타이드 항원(접합된 "에피토프" 펩타이드)과 MHC 클래스 I 폴리펩타이드(예를 들어, β2M); v) MHC 클래스 I 폴리펩타이드 및 이량체화 폴리펩타이드(예를 들어, 이량체화 쌍의 제1 또는 제2 구성원); 및 vi) 이량체화 폴리펩타이드(예를 들어, 이량체화 쌍의 제1 또는 제2 구성원) 및 IgFc 폴리펩타이드 중 어느 하나 이상 사이에 개재된 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 펩타이드를 포함할 수 있다.
적합한 링커(또한 "스페이서"로 지칭됨)는 용이하게 선택될 수 있고, 다수의 적합한 길이, 예컨대 1 aa 내지 25 aa, 3 aa 내지 20 aa, 2 aa 내지 15 aa, 3 aa 내지 12 aa, 4 aa 내지 10 aa, 5 aa 내지 9 aa, 6 aa 내지 8 aa, 또는 7 aa 내지 8 aa을 가질 수 있다. 실시형태에서, 적합한 링커는 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 aa일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 25 aa 내지 50 aa의 길이, 예를 들어, 25 내지 30, 30 내지 35, 35 내지 40, 40 내지 45, 또는 45 내지 50 aa의 길이를 가진다.
예시적인 링커는 글리신 중합체(G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n,(GSGGS)n(서열번호 66) 및 (GGGS)n(서열번호 67)을 포함하며, n은 적어도 1(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 당업계에 공지된 다른 유연한 링커를 포함한다. 글리신과 글리신-세린 중합체가 둘 다 사용될 수 있으며; Gly과 Ser은 둘 다 상대적으로 불포화이고, 따라서 성분 사이의 중성 테더(tether)로서 작용할 수 있다. 글리신 중합체는 심지어 알라닌보다 상당히 더 많은 파이-프사이 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한되어 있다(문헌[Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142(1992)] 참조). 예시적인 링커는 또한 GGSG (서열번호 68), GGSGG (서열번호 69), GSGSG (서열번호 70), GSGGG (서열번호 71), GGGSG (서열번호 72), GSSSG (서열번호 73) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 링커는, 예를 들어, Gly(Ser4)n(서열번호 74)일 수 있으며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 일 실시형태에서, 링커는 아미노산 서열 AAAGG (서열번호 75)를 포함한다.
일부 경우에, 링커는 아미노산 서열(GGGGS)n(서열번호 76)을 포함하며, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 일부 경우에, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 제1 폴리펩타이드에 존재하는 링커 폴리펩타이드는 에피토프 또는 T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 제2 폴리펩타이드에 존재하는 시스테인 잔기와 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 예를 들어, 링커는 아미노산 서열 GCGGS(G4S)n(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9임)(서열번호 133), G C GASGGGGSGGGGS (서열번호 77), 서열 G C GGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 78) 또는 서열 G C GGSGGGGSGGGGS (서열번호 79)를 포함한다.
상기 기재한 폴리펩타이드 링커를 포함하는 링커는 T-세포-MMP(또는 이의 에피토프 접합체)의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에 결합된 페이로드 사이에 존재할 수 있다. 상기 열거된 폴리펩타이드 링커에 추가로, 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드에 페이로드 또는 에피토프(예를 들어, 펩타이드)를 부착시키기 위해 사용되는 링커는 비펩타이드일 수 있다. 이러한 비-펩타이드 링커는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 중합체를 포함한다. 2작용성 가교제, 예컨대 이하에 열거된 것과의 결합으로부터 초래되는 것을 포함하는 다른 링커가 또한 이용될 수 있다.
I.F. 에피토프
본 명세서에 기재되는 화학적 접합 부위 및 화학물질은 펩타이드(에피토프-제시 펩타이드)와 비-펩타이드 에피토프 둘 다의 T-세포-MMP 내로의 혼입을 가능하게 한다. 폴리펩타이드 에피토프에 추가로, 에피토프는, 예를 들어 글리코펩타이드를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 에피토프는 약 4 aa 내지 약 25 aa의 길이를 가질 수 있고, 예를 들어, 에피토프는 4 aa 내지 10 aa, 10 aa 내지 15 aa, 15 aa 내지 20 aa, 또는 20 aa 내지 25 aa의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프는 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7, aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa, 20 aa, 21 aa, 22 aa, 23 aa, 24 aa 또는 25 aa의 길이를 가질 수 있다. 일부 경우에, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 에피토프는 5 aa 내지 10 aa, 예를 들어, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa 또는 10 aa의 길이를 가진다.
실시형태에서, 다량체 폴리펩타이드에 존재하는 에피토프는 T-세포에 의해 특이적으로 결합되고, 즉, 에피토프는 에피토프-특이적 T-세포에 의해 특이적으로 결합된다. 에피토프-특이적 T-세포는 기준 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 결합하지만, 기준 아미노산 서열과 상이한 에피토프에 실질적으로 결합하지 않는다. 예를 들어, 10-6 M 미만, 10-5 M 미만, 또는 10-4 M 미만인 친화도라고 하더라도, 에피토프-특이적 T-세포는 기준 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 결합하고, 기준 아미노산 서열과 상이한 에피토프에 결합한다. 에피토프-특이적 T-세포는 적어도 10-7 M, 적어도 10-8 M, 적어도 10-9 M 또는 적어도 10-10 M의 친화도로 특이적인 에피토프에 결합할 수 있다.
적합한 펩타이드/폴리펩타이드 에피토프는 암-관련 항원에 존재하는 에피토프를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 암-연관 항원은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Cheever et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15:5323] 참조. 암-관련 항원은 α-엽산 수용체; 탄산무수화 효소 IX(CAIX); CD19; CD20; CD22; CD30; CD33; CD44v7/8; 암배 항원(CEA); 상피 당단백-2(EGP-2); 상피 당단백-40(EGP-40); 엽산 결합 단백질(FBP); 태아 아세틸콜린 수용체; 강글리오사이드 항원 GD2; Her2/neu; IL-13R-a2; 카파 경쇄; LeY; L1 세포 부착 분자; 흑색종-관련 항원(MAGE); MAGE-A1; 메소텔린; MUC1; NKG2D 리간드; 종양 태아 항원(h5T4); 전립선 줄기 세포 항원(PSCA); 전립선-특이적 막 항원(PSMA); 종양-관련 당단백질-72(TAG-72); 혈관 내피세포 성장인자 수용체-2(VEGF-R2)(예를 들어, 문헌[Vigneron et al. (2013) Cancer Immunity 13:15; 및 Vigneron (2015) BioMed Res. Int'l Article ID 948501] 참조); 및 표피성장 인자 수용체(EGFR) vIII 폴리펩타이드(예를 들어, 문헌[Wong et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2965; 및 Miao et al. (2014) PLoSOne9:e94281] 참조)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 경우에, 에피토프는 인유두종 바이러스 E7 항원 에피토프이다;(예를 들어, 문헌[Ramos et al. (2013) J. Immunother. 36:66] 참조).
일부 경우에, 적합한 펩타이드 에피토프는 MUC1 폴리펩타이드, 인유두종바이러스(HPV) E6 폴리펩타이드, LMP2 폴리펩타이드, HPV E7 폴리펩타이드, 표피성장인자 수용체(EGFR) vIII 폴리펩타이드, HER-2/neu 폴리펩타이드, 흑색종 항원 패밀리 A, 3 (MAGE A3) 폴리펩타이드, p53 폴리펩타이드, 돌연변이체 p53 폴리펩타이드, NY-ESO-1 폴리펩타이드, 엽산 가수분해효소(전립선-특이적 막 항원; PSMA) 폴리펩타이드, 암배항원 (CEA) 폴리펩타이드, T-세포에 의해 인식되는 흑색종 항원(melanA/MART1) 폴리펩타이드, Ras 폴리펩타이드, gp100 폴리펩타이드, 프로테이나제3 (PR1) 폴리펩타이드, bcr-abl 폴리펩타이드, 타이로시나제 폴리펩타이드, 서비빈 폴리펩타이드, 전립선 특이적 항원(PSA) 폴리펩타이드, hTERT 폴리펩타이드, 육종 전위 파손점 폴리펩타이드, 활막육종 X(SSX) 파손점 폴리펩타이드, EphA2 폴리펩타이드, 산 포스파타제, 전립선(PAP) 폴리펩타이드, 세포자멸사의 흑색종 저해제(ML-IAP) 폴리펩타이드, 알파-태아단백질(AFP) 폴리펩타이드, 상피세포 접착 분자(EpCAM) 폴리펩타이드, ERG(TMPRSS2 ETS 융합) 폴리펩타이드, NA17 폴리펩타이드, 짝지어진-박스-3(PAX3) 폴리펩타이드, 역형성 림프종 키나제(ALK) 폴리펩타이드, 안드로겐 수용체 폴리펩타이드, 사이클린 B1 폴리펩타이드, N-myc 원발암유전자(MYCN) 폴리펩타이드, Ras 상동체 유전자 패밀리 구성원 C(RhoC) 폴리펩타이드, 타이로시나제-관련 단백질-2(TRP-2) 폴리펩타이드, 메소텔린 폴리펩타이드, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA) 폴리펩타이드, 흑색종 연관 항원-1(MAGE A1) 폴리펩타이드, 사이토크롬 P450 1B1(CYP1B1) 폴리펩타이드, 태반-특이적 단백질 1(PLAC1) 폴리펩타이드, BORIS 폴리펩타이드(또한 CCCTC-결합 인자 또는 CTCF로서 알려짐), ETV6-AML 폴리펩타이드, 유방암 항원 NY-BR-1 폴리펩타이드(또한 안키린 반복부 도메인-함유 단백질 30A로서 지칭됨), G-단백질 신호전달의 조절제(RGS5) 폴리펩타이드, T-세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원(SART3) 폴리펩타이드, 탄산무수화효소 IX 폴리펩타이드, 짝지어진 박스-5 (PAX5) 폴리펩타이드, OY-TES1(고환 항원; 또한 아크로신 결합 단백질로서 알려짐) 폴리펩타이드, 정자 단백질 17 폴리펩타이드, 림프구 세포-특이적 단백질-타이로신 키나제(LCK) 폴리펩타이드, 고분자량 흑색종 연관 항원(HMW-MAA), A-키나제 고정 단백질-4(AKAP-4), 활막육종 X 파손점 2(SSX2) 폴리펩타이드, X 항원 패밀리 구성원 1(XAGE1) 폴리펩타이드, B7 상동체 3(B7H3; 또한 CD276으로서 알려짐) 폴리펩타이드, 레구메인 폴리펩타이드(LGMN1; 또한 아스파라긴일 엔도펩티다제로서 알려짐), Ig를 갖는 타이로신 키나제 및 EGF 상동체 도메인-2(Tie-2; 또한 앤지오포이에틴-1 수용체로서 알려짐) 폴리펩타이드, P 항원 패밀리 구성원 4(PAGE4) 폴리펩타이드, 혈관내피성장인자 수용체 2(VEGF2) 폴리펩타이드, MAD-CT-1 폴리펩타이드, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 폴리펩타이드, 혈소판 유래 성장인자 수용체 베타(PDGFβ) 폴리펩타이드, MAD-CT-2 폴리펩타이드, Fos-관련 항원-1(FOSL) 폴리펩타이드 또는 윌름 종양-1(WT-1) 폴리펩타이드의 약 4 aa 내지 약 20 aa(예를 들어, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa 또는 20 aa) 길이의 펩타이드 단편이다.
암 연관 항원의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다; 예를 들어, MUC1(젠뱅크 CAA56734); LMP2(젠뱅크 CAA47024); HPV E6(젠뱅크 AAD33252); HPV E7(젠뱅크 AHG99480); EGFRvIII(젠뱅크 NP_001333870); HER-2/neu(젠뱅크 AAI67147); MAGE-A3(젠뱅크 AAH11744); p53(젠뱅크 BAC16799); NY-ESO-1(젠뱅크 CAA05908); PSMA(젠뱅크 AAH25672); CEA(젠뱅크 AAA51967); melan/MART1(젠뱅크 NP_005502); Ras(젠뱅크 NP_001123914); gp100(젠뱅크 AAC60634); bcr-abl(젠뱅크 AAB60388); 타이로시나제(젠뱅크 AAB60319); 서비빈(젠뱅크 AAC51660); PSA(젠뱅크 CAD54617); hTERT(젠뱅크 BAC11010); SSX(젠뱅크 NP_001265620); Eph2A(젠뱅크 NP_004422); PAP(젠뱅크 AAH16344); ML-IAP(젠뱅크 AAH14475); AFP(젠뱅크 NP_001125); EpCAM(젠뱅크 NP_002345); ERG(TMPRSS2 ETS 융합)(젠뱅크 ACA81385); PAX3(젠뱅크 AAI01301); ALK(젠뱅크 NP_004295); 안드로겐 수용체(젠뱅크 NP_000035); 사이클린 B1(젠뱅크 CAO99273); MYCN(젠뱅크 NP_001280157); RhoC(젠뱅크 AAH52808); TRP-2(젠뱅크 AAC60627); 메소텔린(젠뱅크 AAH09272); PSCA(젠뱅크 AAH65183); MAGE A1(젠뱅크 NP_004979); CYP1B1(젠뱅크 AAM50512); PLAC1(젠뱅크 AAG22596); BORIS(젠뱅크 NP_001255969); ETV6(젠뱅크 NP_001978); NY-BR1(젠뱅크 NP_443723); SART3(젠뱅크 NP_055521); 탄산무수화효소 IX(젠뱅크 EAW58359); PAX5(젠뱅크 NP_057953); OY-TES1(젠뱅크 NP_115878); 정자 단백질 17(젠뱅크 AAK20878); LCK(젠뱅크 NP_001036236); HMW-MAA(젠뱅크 NP_001888); AKAP-4(젠뱅크 NP_003877); SSX2(젠뱅크 CAA60111); XAGE1(젠뱅크 NP_001091073; XP_001125834; XP_001125856; 및 XP_001125872); B7H3(젠뱅크 NP_001019907; XP_947368; XP_950958; XP_950960; XP_950962; XP_950963; XP_950965; 및 XP_950967); LGMN1(젠뱅크 NP_001008530); TIE-2(젠뱅크 NP_000450); PAGE4(젠뱅크 NP_001305806); VEGFR2(젠뱅크 NP_002244); MAD-CT-1(젠뱅크 NP_005893 NP_056215); FAP(젠뱅크 NP_004451); PDGFβ(젠뱅크 NP_002600); MAD-CT-2 젠뱅크 NP_001138574); FOSL(젠뱅크 NP_005429); 및 WT-1(젠뱅크 NP_000369)). 이들 폴리펩타이드는 또한, 예를 들어, 문헌[Cheever et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15:5323, 및 이에 열거된 참고문헌; Wagner et al. (2003) J. Cell. Sci. 116:1653; Matsui et al. (1990) Oncogene 5:249; Zhang et al. (1996) Nature383:168]에 논의되어 있다.
일부 경우에, 에피토프는 감염성 질환 제제, 예컨대 바이러스, 마이코플라스마(예를 들어, 마이코플라즈마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae)) 또는 박테리아제의 에피토프이다. 일부 경우에, 에피토프가 바이러스 에피토프인 경우, 에피토프는 코어 단백질, 조기 단백질, 후기 단백질, DNA 또는 RNA 중합효소 또는 외피 단백질로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 경우에, 바이러스 에피토프는 유두종 바이러스(예를 들어, 인유두종 바이러스(HPV)) 또는 간염 바이러스(예를 들어, A형 간염 바이러스 또는 B형 간염 바이러스(HBV))로부터의 펩타이드 에피토프이다. 다른 실시형태에서, 에피토프는 거대세포바이러스("CMV")로부터 유래된다.
실시형태에서, 에피토프가 HPV 바이러스인 경우, 이는 인유두종 조기 단백질로부터 유래된다. 하나의 이러한 실시형태에서, 에피토프는 HPV E6 폴리펩타이드, HPV E7 폴리펩타이드, HPV 16 조기 단백질 7(HPV16E7) 아미노산 82 내지 90(HPV16E7/82-90, LLMGTLGIV; 서열번호 80)으로부터 유래된다. 실시형태에서, 에피토프는 HPV16E7 아미노산 86 내지 93(TLGIVCPI; 서열번호 81)이다. 실시형태에서, 에피토프는 HPV16E7 아미노산 11 내지 20(YMLDLQPETT; 서열번호 82)이다. 실시형태에서, 에피토프는 HPV16E7 아미노산 11 내지 19(YMLDLQPET; 서열번호 83)이다. 예를 들어, 추가적인 적합한 HPV 에피토프에 대해 문헌[Ressing et al. ((1995) J. Immunol. 154:5934)] 참조.
일부 경우에, 에피토프는 B형 간염 바이러스(HBV) 에피토프이다. 다수의 HBV 에피토프는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Desmond et al. (2008) Antiviral Therapy 13:161; Lumley et al. (2016) Wellcome Open Res. 1:9; 및 Kefalakes et al. (2015) Hepatology 62:47] 참조. 본 개시내용의 T-세포-MMP 에피토프 접합체에 포함시키기에 적합한 HBV 펩타이드는 HBV 유전자형 A, HBV 유전자형 B, HBV 유전자형 C 또는 HBV 유전자형 D를 포함하는 임의의 다양한 HBV 유전자형으로부터의 HBV 펩타이드일 수 있다. 본 개시내용의 T-세포-MMP에 포함시키기에 적합한 HBV 펩타이드는 임의의 다양한 HBV 하위 유전자형으로부터의 HBV 펩타이드일 수 있다. 본 개시내용의 T-세포-MMP에 포함시키기에 적합한 HBV 펩타이드는 적어도 10-7 M, 적어도 10-8 M, 5×10-9 M, 적어도 10-9 M, 5×10-10 M 또는 적어도 10-10 M의 친화도로 MHC 복합체에 결합할 수 있고; MHC 복합체와 복합체화될 때 TCR에 의해 결합된다.
본 개시내용의 T-세포-MMP에 포함시키기에 적합한 HBV 펩타이드는 약 4 aa 내지 약 25 aa의 길이를 가질 수 있고, 예를 들어, 에피토프는 4 aa 내지 10 aa, 9 aa 내지 15 aa, 10 aa 내지 15 aa, 15 aa 내지 20 aa, 또는 20 aa 내지 25 aa의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 T-세포-MMP에 포함시키기에 적합한 HBV 펩타이드는 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa, 20 aa, 21 aa, 22 aa, 23 aa, 24 aa 또는 25 aa의 길이를 가질 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP에 포함시키기에 적합한 HBV 펩타이드는 MHC 클래스 I-제한된 HBV 펩타이드이다(예를 들어, 이는 특정 HLA 클래스 I 대립유전자로 제한된다). 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP에 포함시키기에 적합한 HBV 펩타이드는 HLA-A, 예를 들어, HLA-A2, HLA-A11(HLA-A*1101), HLA-A*2402 또는 HLA-A3303으로 제한된다(예를 들어, 도 3 참조). 다른 예로서, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP 에피토프 접합체에 포함시키기에 적합한 HBV 펩타이드는 HLA-B로 제한된다. 다른 예로서, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP 에피토프 접합체에 포함시키기에 적합한 HBV 펩타이드는 HLA-C로 제한된다.
본 명세서에 기재된 T-세포-MMP 에피토프 접합체에 포함시키기에 적합한 HBV 펩타이드 중에: HBV 외피 펩타이드; HBV 프레코어/코어 펩타이드; 중합효소 펩타이드 및 HBV X-단백질 펩타이드이다. 일부 HBV 에피토프는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Desmond et al. (2008) Antiviral Therapy 13:161; Lumley et al. (2016) Wellcome Open Res. 1:9; 및 Kefalakes et al. (2015) Hepatology 62:47] 참조. 본 개시내용의 T-세포-MMP 에피토프 접합체에 포함시키기에 적합한 HBV 펩타이드는 적어도 10-7 M, 적어도 10-8 M, 5×10-9 M, 적어도 10-9 M, 5×10-10 M 또는 적어도 10-10 M의 친화도로 MHC 클래스 I 복합체에 결합할 수 있고; MHC 복합체와 복합체화될 때 TCR에 의해 결합된다. 본 명세서에 제공된 HBV 에피토프의 표는 T-세포-MMP-에피토프 접합체 내로 혼입된 에피토프 펩타이드의 모두 또는 일부를 형성할 수 있는 펩타이드 서열을 함유하는 HBV 에피토프의 비제한적 실시형태를 제시한다.
Figure pct00016
Figure pct00017
I.G. 면역조절 폴리펩타이드(MOD)
적합한 MOD 폴리펩타이드는 Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 나타내는 도메인으로서 T-세포-MMP 내로 혼입될 수 있다. MOD 폴리펩타이드는 야생형 면역조절 도메인과 1 aa 내지 10 aa의 차이를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드는, 예를 들어, 대응하는 야생형 MOD와 1 aa, 2 aa, 3 aa, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa, 또는 20 aa(예를 들어, 1aa 내지 5 aa, 5 aa 내지 10 aa, 또는 10 aa 내지 20 aa)만큼 아미노산 서열이 다를 수 있다. 예로서, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개(예를 들어, 1 내지 5, 2 내지 5, 3 내지 5, 5 내지 10, 또는 10 내지 20개)의 아미노산 치환을 갖고/갖거나 포함한다. 일부 경우에, T-세포-MMP에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD에 비해 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에, T-세포-MMP에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 야생형 기준(예를 들어, 야생형 MOD)에 비해: 1 내지 2 aa 치환; 1 내지 3 aa 치환; 1 내지 4 aa 치환; 1 내지 5 aa 치환; 1 내지 6 aa 치환; 1 내지 7 aa 치환; 1 내지 8 aa 치환; 1 내지 9 aa 치환; 1 내지 10 aa 치환; 1 내지 11 aa 치환; 1 내지 12 aa 치환; 1 내지 13 aa 치환; 1 내지 14 aa 치환; 1 내지 15 aa 치환; 1 내지 16 aa 치환; 1 내지 17 aa 치환; 1 내지 18 aa 치환; 1 내지 19 aa 치환 또는 1 내지 20 aa 치환을 포함한다.
상기 논의한 바와 같이, 본 개시내용의 T-세포-MMP(및/또는 이들의 에피토프 접합체)에서 도메인(MOD 폴리펩타이드)으로서 포함시키는 데 적합한 변이체 MOD는 Co-MOD에 대한 대응하는 야생형 MOD의 친화도에 비해, Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 나타내는 것을 포함한다. 적합한 변이체 MOD는, 예를 들어, 돌연변이유발, 예컨대 스캐닝 돌연변이유발(예를 들어, 알라닌, 세린 또는 글리신 스캐닝 돌연변이유발)에 의해 확인될 수 있다.
MOD 및 Co-MOD의 예시적인 쌍은 다음의 표에 열거된 항목 (a) 내지 (r)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:
Figure pct00018
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP에 존재하는 변이체 MOD는 Co-MOD에 대한 결합 친화도가 100nM 내지 100μM이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용(또는 이의 에피토프 접합체)의 T-세포-MMP에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드는 Co-MOD에 대한 결합 친화도가(예를 들어, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체는 Co-MOD에 대한 결합 친화도를 갖는 변이체 MOD를 포함함) 약 100nM 내지 약 150nM, 약 100nM 내지 약 500nM, 약 150nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 250nM, 약 250nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 350nM, 약 350nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 500nM 내지 약 1μM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 1μM 내지 약 25μM 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 15μM, 약 15μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 25μM, 약 25μM 내지 약 50μM, 약 25μM 내지 약 100μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다.
I.G.1 야생형 및 변이체 PD-L1 MOD
하나의 비제한적 예로서, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드는 변이체 PD-L1 폴리펩타이드이다. 야생형 PD-L1은 PD1에 결합한다.
야생형 인간 PD-L1 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00019
야생형 인간 PD-L1 엑토도메인은 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00020
야생형 PD-1 폴리펩타이드(NCBI 수탁번호 NP_005009.2, aas 21-288)는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00021
일부 경우에, MOD 폴리펩타이드로서 사용될 수 있는 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 13 또는 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 PD-L1 폴리펩타이드의 결합 친화도에 비해 Co-MOD PD-1(예를 들어, 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 PD-1 폴리펩타이드)에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 실시형태에서, 본 개시내용의 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 13 또는 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 PD-L1 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 15% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 25% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 35% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 45% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 55% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 65% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 75% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 85% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 초과의 수 미만인 결합 친화도로 PD-1(예를 들어, 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 PD-1 폴리펩타이드)에 결합한다.
실시형태에서, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 1nM 내지 1μM인 PD-1에 대해 결합 친화도를 가진다. 일부 경우에, 본 개시내용의 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 PD-1에 대한 결합 친화도가 100nM 내지 100μM이다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 약 100nM 내지 약 150nM, 약 150nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 250nM, 약 250nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 350nM, 약 350nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 15μM, 약 15μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 25μM, 약 25μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM인 PD1(예를 들어, 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 폴리펩타이드)을 가진다.
일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 PD-L1 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 가진다. 일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 13 또는 서열번호 14에 제시된 PD-L1 아미노산 서열에 비해 2 내지 10개의 아미노산 치환을 가진다. 일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 13 또는 서열번호 14에 제시된 PD-L1 아미노산 서열에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 가진다.
적합한 PD-L1 변이체는 다음의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다:
Figure pct00022
여기서, X는 Asp 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이다. 일부 경우에, X는 Arg이다.
적합한 PD-L1 변이체는 다음의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다:
Figure pct00023
여기서, X는 Ile 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Asp이다.
적합한 PD-L1 변이체는 다음의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다:
Figure pct00024
여기서, X는 Glu 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Arg이다.
I.G.2 야생형 및 변이체 CD80 MOD
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드는 변이체 CD80 폴리펩타이드이다. 야생형 CD80은 CD28에 결합한다.
인간 CD80의 엑토도메인의 야생형 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00025
야생형 CD28 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00026
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP가 변이체 CD80 폴리펩타이드를 포함하는 경우에, Co-MOD는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CD28 폴리펩타이드이다.
야생형 CD28 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00027
야생형 CD28 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00028
일부 경우에, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28에 대해 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD80 폴리펩타이드의 결합 친화도에 비해 CD28에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28(예를 들어, 서열번호 17, 18 또는 19 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD28 폴리펩타이드)에 대해 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열 세트를 포함하는 CD80 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 15% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 25% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 35% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 45% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 55% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 65% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 75% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 85% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 초과의 수 미만인 결합 친화도로 CD28에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 100nM 내지 100μM인 CD28에 대해 결합 친화도를 가진다. 다른 예로서, 일부 경우에, 본 개시내용의 변이체 CD80 폴리펩타이드는 CD28(예를 들어, 서열번호 17, 서열번호 18 또는 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD28 폴리펩타이드)에 대한 결합 친화도가 약 100nM 내지 150nM, 약 150nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 250nM, 약 250nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 350nM, 약 350nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 15μM, 약 15μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 25μM, 약 25μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다.
일부 경우에, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 서열번호 16에 제시된 CD80 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 가진다. 일부 경우에, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 서열번호 16에 제시된 CD80 아미노산 서열에 비해 2 내지 10개의 아미노산 치환을 가진다. 일부 경우에, 변이체 CD80 폴리펩타이드는 서열번호 16에 제시된 CD80 아미노산 서열에 비해 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 가진다.
일부 적합한 CD80 변이체는 다음의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 90%(20개 미만의 치환), 적어도 95%(10개 미만의 치환), 적어도 97%(6개 미만의 치환), 적어도 98%(4개 미만의 치환), 적어도 99%(2개 미만의 치환) 또는 적어도 99.5%(하나의 치환) 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다:
Figure pct00029
, 여기서, X는 Asn 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00030
, 여기서, X는 Asn 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00031
, 여기서, X는 Ile 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00032
, 여기서, X는 Lys 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00033
, 여기서, X는 Gln 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00034
, 여기서, X는 Asp 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00035
, 여기서, X는 Leu 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00036
, 여기서, X는 Tyr 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00037
, 여기서, X는 Gln 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00038
, 여기서, X는 Met 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00039
, 여기서, X는 Val 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00040
, 여기서, X는 Ile 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00041
, 여기서, X는 Tyr 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00042
, 여기서, X는 Asp 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00043
, 여기서, X는 Phe 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00044
, 여기서, X는 Ser 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고; 그리고
Figure pct00045
, 여기서, X는 Pro 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이다.
I.G.3 야생형 및 변이체 CD86 MOD
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드는 변이체 CD86 폴리펩타이드이다. 야생형 CD86은 CD28에 결합한다.
야생형 인간 CD86의 전체 엑토도메인의 아민노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00046
야생형 인간 CD86의 IgV 도메인의 아민노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00047
일부 경우에, 변이체 CD86 폴리펩타이드는 CD28에 대해 서열번호 20 또는 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD86 폴리펩타이드의 결합 친화도에 비해 CD28에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 CD86 폴리펩타이드는 CD28(예를 들어, 서열번호 17, 18 또는 19 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD28 폴리펩타이드)에 대해 서열번호 20 또는 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열 세트를 포함하는 CD86 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 15% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 25% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 35% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 45% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 55% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 65% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 75% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 85% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 초과의 수 미만인 결합 친화도로 CD28에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 CD86 폴리펩타이드는 100nM 내지 100μM인 CD28에 대해 결합 친화도를 가진다. 다른 예로서, 일부 경우에, 본 개시내용의 변이체 CD86 폴리펩타이드는 CD28(예를 들어, 서열번호 17, 18 또는 19에 제시된 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 CD28 폴리펩타이드)에 대한 결합 친화도가 약 100nM 내지 150nM, 약 150nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 250nM, 약 250nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 350nM, 약 350nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 15μM, 약 15μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 25μM, 약 25μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다.
일부 경우에, 변이체 CD86 폴리펩타이드는 서열번호 20에 제시된 CD86 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 가진다. 일부 경우에, 변이체 CD86 폴리펩타이드는 서열번호 20에 제시된 CD86 아미노산 서열에 비해 2 내지 10개의 아미노산 치환을 가진다. 일부 경우에, 변이체 CD86 폴리펩타이드는 서열번호 20에 제시된 CD86 아미노산 서열에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 가진다.
일부 경우에, 변이체 CD86 폴리펩타이드는 서열번호 21에 제시된 CD86 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 가진다. 일부 경우에, 변이체 CD86 폴리펩타이드는 서열번호 21에 제시된 CD86 아미노산 서열에 비해 2 내지 10개의 아미노산 치환을 가진다. 일부 경우에, 변이체 CD86 폴리펩타이드는 서열번호 21에 제시된 CD86 아미노산 서열에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 가진다.
적합한 CD86 변이체는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다:
Figure pct00048
, 여기서 X는 Asn 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00049
, 여기서 X는 Asp 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00050
, 여기서 X는 Trp 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00051
, 여기서 X는 His 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00052
, 여기서 X는 Asn 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00053
, 여기서 X는 Asp 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00054
, 여기서 X는 Trp 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00055
, 여기서 X는 His 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00056
, 여기서 X는 Val 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00057
, 여기서 X는 Val 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00058
, 여기서 X는 Gln 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00059
, 여기서 X는 Gln 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00060
, 여기서 X는 Phe 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00061
, 여기서 X는 Phe 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00062
, 여기서 X는 Leu 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00063
, 여기서 X는 Leu 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00064
, 여기서 X는 Tyr 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00065
, 여기서 X는 Tyr 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
Figure pct00066
, 여기서, X1은 Asn 이외의 임의의 아미노산이고, 두 번째 X2는 His 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1과 X2는 둘 다 Ala이고;
Figure pct00067
, 여기서, X1은 Asn 이외의 임의의 아미노산이고, X2는 His 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1과 X2는 둘 다 Ala이고;
Figure pct00068
, 여기서, X1은 Asp 이외의 임의의 아미노산이고, X2는 His 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고, X2는 Ala이며;
Figure pct00069
, 여기서, X1은 Asn 이외의 임의의 아미노산이고, X2는 His 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1과 X2는 둘 다 Ala이고;
Figure pct00070
, 여기서, X1은 Asn 이외의 임의의 아미노산이고, X2는 Asp 이외의 임의의 아미노산이며, X3은 His 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고, X2는 Ala이며, X3은 Ala이고; 그리고
Figure pct00071
, 여기서 X1은 Asn 이외의 임의의 아미노산이고, X2는 Asp 이외의 임의의 아미노산이며, X3은 His 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고, X2는 Ala이며, X3은 Ala이다
I.G.4 야생형 및 변이체 4-1BBL MOD
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드는 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드이다. 야생형 4-1BBL은 4-1BB(CD137)에 결합한다.
야생형 4-1BBL 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00072
일부 경우에, 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드는 인간 4-1BBL의 종양 괴사 인자(TNF) 상동체 도메인(THD)의 변이체이다.
인간 4-1BBL의 THD의 야생형 아미노산 서열은, 예를 들어, 다음과 같은 서열번호 23 내지 25 중 하나일 수 있다:
Figure pct00073
야생형 4-1BB 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00074
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP가 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드를 포함하는 경우에, Co-MOD는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 폴리펩타이드이다.
일부 경우에, 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드는 서열번호 22 내지 25 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 폴리펩타이드의 결합 친화도에 비해 4-1BB에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드는 동일한 조건 하에 분석될 때 4-1BB 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 폴리펩타이드)에 대해 서열번호 22 내지 25 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 15% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 25% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 35% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 45% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 55% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 65% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 75% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 85% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 초과의 수 미만인 결합 친화도로 4-1BB에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드는 100nM 내지 100μM인 4-1BB에 대해 결합 친화도를 가진다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드는 약 100nM 내지 약 150nM, 약 150nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 250nM, 약 250nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 350nM, 약 350nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 15μM, 약 15μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 25μM, 약 25μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM인 4-1BB(예를 들어, 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 폴리펩타이드)를 가진다.
일부 경우에, 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드는 서열번호 22 내지 25 중 하나에 제시된 4-1BBL 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 가진다. 일부 경우에, 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드는 서열번호 22 내지 25 중 하나에 제시된 4-1BBL 아미노산 서열에 비해 2 내지 10개의 아미노산 치환을 가진다. 일부 경우에, 변이체 4-1BBL 폴리펩타이드는 서열번호 22 내지 25 중 하나에 제시된 4-1BBL 아미노산 서열에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 가진다.
적합한 4-1BBL 변이체는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다:
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
I.G.5 IL-2 변이체
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드는 변이체 IL-2 폴리펩타이드이다. 야생형 IL-2는 IL-2 수용체(IL-2R), 즉, IL-2Rα, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ를 포함하는 이형삼량체 폴리펩타이드에 결합한다.
야생형 IL-2 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00088
야생형 IL2는 세포 표면 상의 IL2 수용체(IL2R)에 결합한다. IL2 수용체는 일부 경우에 알파쇄(IL-2Rα; 또한 CD25로 지칭됨), 베타 쇄(IL-2Rβ; 또한 CD122로서 지칭됨) 및 감마쇄(IL-2Rγ; 또한 CD132로서 지칭됨)를 포함하는 이형삼량체 폴리펩타이드이다. 인간 IL-2Rα, IL2Rβ 및 IL-2Rγ의 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다.
Figure pct00089
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP가 변이체 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 경우, Co-MOD는 서열번호 28, 29 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 IL-2R이다.
일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 폴리펩타이드의 결합 친화도에 비해 IL-2R에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 동일한 조건 하에 분석될 때 IL-2R(예를 들어, 서열번호 28 내지 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 IL-2R)에 대해 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 15% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 25% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 35% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 45% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 55% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 65% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 75% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 85% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 초과의 수 미만인 결합 친화도로 IL-2R에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 100nM 내지 100μM인 IL-2R에 대해 결합 친화도를 가진다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 IL-2R(예를 들어, 서열번호 28 내지 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 IL-2R)에 대한 결합 친화도가 약 100nM 내지 150nM, 약 150nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 250nM, 약 250nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 350nM, 약 350nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 내지 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 15μM, 약 15μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 25μM, 약 25μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다.
일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 27에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 단일 아미노산 치환을 가진다. 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 27에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 2 내지 10개의 아미노산 치환을 가진다. 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 27에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 가진다.
적합한 IL-2 변이체 MOD 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열 중 임의의 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다:
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
본 명세서에 제공된 임의의 야생형 또는 변이체 IL-2 서열에서, 125번 위치에서 시스테인은 알라닌으로 치환될 수 있다(C125A 치환). 치환에 의해 제공되는 임의의 안정성에 추가로, 예를 들어, 펩타이드 또는 페이로드를 함유하는 에피토프가 T-세포-MMP 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드의 어디에서나 시스테인 잔기에 접합되어, IL-2 MOD 서열의 C125로부터의 경쟁을 피하는 경우에 사용될 수 있다.
I.H. 추가적인 폴리펩타이드
T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 폴리펩타이드쇄는 상기 기재한 것에 추가로 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 적합한 추가적인 폴리펩타이드는 에피토프 태그 및 친화도 도메인을 포함한다. 하나 이상의 추가적인 폴리펩타이드(들)는 다량체 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 쇄의 C-말단에서, 또는 다량체 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 쇄 내에서 내부로 다량체 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 쇄의 N-말단에서 세포 또는 무세포 시스템에 의해 번역되는 폴리펩타이드의 부분으로서 포함될 수 있다.
I.I. 에피토프 태그
적합한 에피토프 태그는 혈구응집소(HA; 예를 들어, YPYDVPDYA(서열번호 31); FLAG(예를 들어, DYKDDDDK(서열번호 32); c-myc(예를 들어, EQKLISEEDL; 서열번호 33) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
I.J. 친화도 도메인
친화도 도메인은 동정 또는 정제에 유용한 결합 상대, 예를 들어, 고체 지지체 상에 고정된 것과 상호작용할 수 있는 펩타이드 서열을 포함한다. 다중 연속적 단일 아미노산, 예컨대 히스티딘을 암호화하는 DNA 서열은 발현된 단백질에 융합될 때, 수지 칼럼, 예컨대 니켈 세파로스(SEPHAROSE)(등록상표)에 대해 고친화도 결합에 의해 재조합 단백질의 1단계 정제를 위해 사용될 수 있다. 예시적인 친화도 도메인은 His5(HHHHH)(서열번호 34), HisX6(HHHHHH)(서열번호 35), C-myc (EQKLISEEDL) (서열번호 33), Flag (DYKDDDDK) (서열번호 32), Strep 태그(WSHPQFEK) (서열번호 36), 혈구응집소, 예를 들어, HA 태그(YPYDVPDYA)(서열번호 31), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 티오레독신, 셀룰로스 결합 도메인, RYIRS (서열번호 37), Phe-His-His-Thr (서열번호 38), 키틴 결합 도메인, S-펩타이드, T7 펩타이드, SH2 도메인, C-말단 RNA 태그, WEAAAREACCRECCARA (서열번호 39), 금속 결합 도메인, 예를 들어, 아연 결합 도메인 또는 칼슘 결합 도메인, 예컨대 칼슘-결합 단백질로부터의 도메인, 예를 들어, 칼모듈린, 트로포닌 C, 칼시네우린 B, 마이오신 경쇄, 리커버린, S-모듈린, 비시닌, VILIP, 뉴로칼신, 히포칼신, 프레쿼닌, 칼트락틴, 칼파인 거대 서브유닛, S100 단백질, 파브알부민, 칼빈딘 D9K, 칼빈딘 D28K, 및 칼레티닌, 인테인, 바이오틴, 스트렙타비딘, MyoD, Id, 류신 지퍼 서열 및 말토스 결합 단백질을 포함한다.
I.K. 페이로드
매우 다양한 페이로드는 제1 화학적 접합 부위 또는 제2 화학적 접합 부위에서 T-세포-MMP에 (공유적으로) 접합된 에피토프에 추가로 하나 초과의 유형의 페이로드를 혼입시킬 수 있는 T-세포-MMP 및 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 결합될 수 있다. 추가로, T-세포-MMP 분자 또는 이들의 에피토프 접합체가 다량체화하는 경우에, 상이한 페이로드로 표지된 단량체를 다량체에 혼입시킬 수 있다. 따라서, 치료제, 화학치료제, 진단제, 표지 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 페이로드를 도입할 수 있다. 일부 페이로드가 하나 초과의 범주에 속할 수 있다는 것은 분명할 것이다(예를 들어, 방사성 표지는 특정 조직 또는 세포 유형을 선택적으로 조사하기 위한 진단제 및 치료제로서 유용할 수 있다).
상기 언급한 바와 같이, T-세포-MMP 폴리펩타이드(예를 들어, 스캐폴드 또는 Fc 폴리펩타이드)는 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에 또는 에서 부착된 화학적 접합 부위에 (예를 들어, 화학적 접합 부위, 예컨대 조작된 시스테인 또는 라이신에서) 페이로드 및/또는 에피토프를 접합시키기 위한 가교 시약에 의해 변형될 수 있다. 이러한 가교제는 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 설포-SMCC, 말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS), 설포-MBS 또는 석신이미딜-아이오도아세테이트를 포함한다. 과량의 이러한 가교제를 이용하여 페이로드를 도입하는 것은 페이로드의 다중 분자가 T-세포-MMP에 혼입되도록 야기할 수 있다. T-세포-MMP 및 이들의 에피토프 접합체에 페이로드를 도입하기 위한 일부 2작용성 링커는 절단 가능한 링커 및 비절단성 링커를 포함한다. 일부 경우에, 페이로드 링커는 프로테아제-절단성 링커이다. 적합한 페이로드 링커는, 예를 들어, 펩타이드(예를 들어, 2 내지 10개의 아미노산 길이; 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 길이), 알킬쇄, 폴리(에틸렌 글리콜), 이황화기, 티오에터기, 산 불안정 기, 광 불안정 기, 펩티다제 불안정 기 및 에스터라제 불안정 기를 포함한다. 적합한 링커의 비제한적 예는 하기와 같다: N-석신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라에틸렌글리콜]에스터(NHS-PEG4-말레이미드); N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)부타노에이트(SPDB); 다이석신이미딜 수베레이트(DSS); 다이석신이미딜 글루타레이트(DGS); 다이메틸 아디피미데이트(DMA); N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)2-설포부타노에이트(설포-SPDB); N-석신이미딜 4-(2-피리딜다이티오) 펜타노에이트(SPP); N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트) (LC-SMCC); κ-말레이미도운데칸산 N-석신이미딜 에스터(KMUA); γ-말레이미드 부티르산 N-석신이미딜 에스터(GMBS); ε-말레이미도카프르산 N-하이드록시석신이미드 에스터(EMCS); m-말레이미드 벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터(MBS); N-(α-말레이미도아세톡시)-석신이미드 에스터(AMAS); 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아마이드)헥사노에이트(SMPH); N-석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)뷰티레이트(SMPB); N-(p-말레이미도페닐)아이소사이아네이트(PMPI); N-석신이미딜 4(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP); N-석신이미딜(4-아이오도-아세틸)아미노벤조에이트(SIAB); 6-말레이미도카프로일(MC); 말레이미도프로파노일(MP); p-아미노벤질옥시카본일(PAB); N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸)사이클로헥산카복실레이트(SMCC); 석신이미딜 3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP); PEG4-SPDP(페길화된(PEGylated), 장쇄 SPDP 가교제); BS(PEG)5(페길화된 비스(설포석신이미딜)수베레이트); BS(PEG)9 (페길화된 비스(설포석신이미딜)수베레이트); 말레이미드-PEG6-석신이미딜 에스터; 말레이미드-PEG8-석신이미딜 에스터; 말레이미드-PEG12-석신이미딜 에스터; PEG4-SPDP (페길화된 장쇄 SPDP 가교제); PEG12-SPDP (페길화된 장쇄 SPDP 가교제); N-석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트), SMCC의 "장쇄" 유사체(LC-SMCC); 3-말레이미도프로판산 N-석신이미딜 에스터(BMPS); N-석신이미딜 아이오도아세테이트(SIA); N-석신이미딜 브로모아세테이트(SBA); 및 N-석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP).
반응의 화학량론의 조절은 분자에서 모든 다른 기에 화학 직교성인 조작된 부위가 이용되지 않는 일부 선택적 변형을 초래할 수 있다. 훨씬 더 큰 선택성을 나타내는 시약, 예컨대 상기 논의한 비스-티오 링커는 단일 라이신 또는 시스테인 잔기와 반응하는 시약보다 위치 및 화학량론의 더 정확한 제어를 가능하게 하는 경향이 있다.
본 개시내용의 T-세포-MMP가 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 경우에, Fc 폴리펩타이드는 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 페이로드의 하나 이상의 공유 부착된 분자를 포함할 수 있다. 예로서, 본 개시내용의 T-세포-MMP가 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 경우에, Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 쇄는 식 (A)-(L)-(C)을 가질 수 있고, 여기서 (A)는 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 쇄이며; (L)은, 존재한다면, 링커이고; (C)는 페이로드(예를 들어, 세포독성제)이다. (L)은, 존재한다면, (A)를 (C)에 연결한다. 일부 경우에, Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 쇄는 페이로드의 하나 초과의 분자(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 5개 초과의 세포독성제 분자)를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 페이로드는 생물학적으로 활성제 또는 약물, 진단제 또는 표지, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 핵산 또는 합성 핵산(예를 들어, 안티센스 핵산, 소간섭 RNA, 이중 가닥(ds)DNA, 단일 가닥(ss)DNA, ssRNA, dsRNA), 독소, 리포좀(예를 들어, 화학치료제, 예컨대 5-플루오로데옥시유리딘을 혼입), 나노입자(예를 들어, 금 또는 핵산 또는 다른 분자를 보유하는 금속, 지질, 핵산 또는 다른 분자를 보유하는 입자) 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태에서, 페이로드는 치료제(예를 들어, 약물 또는 프로드러그), 화학치료제, 세포독성제, 항생제, 항바이러스제, 세포 주기 동기화제, 세포 표면 수용체(들)에 대한 리간드, 면역조절제(예를 들어, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린), 프로-세포자멸사제, 항-신생혈관제, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 단백질 또는 폴리펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 효소, 프로효소(proenzyme), 호르몬 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 생물학적 활성제 또는 약물로부터 선택된다.
실시형태에서, 페이로드는 광검출 가능한 표지(예를 들어, 염료, 형광 표지, 인광 표지, 발광 표지), 조영제(예를 들어, 아이오딘 또는 바륨 함유 물질), 방사성표지, 영상화제, 상자성 표지/영상화제(가돌리늄 함유 자기 공명 영상화 표지), 초음파 표지 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 치료적 진단제 또는 표지로부터 독립적으로 선택되는 생물학적 활성제 또는 약물로부터 선택된다.
I.L. 치료제 및 화학치료제
T-세포-MMP의 폴리펩타이드 쇄는 화학적 접합 부위에서 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 쇄에 연결된(예를 들어, 공유적으로 부착된) 소분자 약물을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 페이로드를 포함할 수 있다. 페이로드와 T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체의 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 쇄 사이의 결합은 직접 또는 간접 결합일 수 있다. 직접 결합은 아미노산 측쇄에 직접적으로 연결을 수반할 수 있다. 간접 결합은 링커를 통한 결합일 수 있다. 약물(예를 들어, 페이로드, 예컨대 암 화학치료제)는 티오에터 결합, 아마이드 결합, 카바메이트 결합, 이황화결합 또는 에터 결합을 통해 본 개시내용의 T-세포-MMP의 폴리펩타이드 쇄(예를 들어, Fc 폴리펩타이드)에 연결될 수 있다.
적합한 치료제는, 예를 들어, 라파마이신, 레티노이드, 예컨대 올-트랜스 레티노산(all-trans retinoic acid: ATRA); 비타민 D3; 비타민 D3 유사체 등을 포함한다. 상기 언급한 바와 같이, 일부 경우에, 약물은 세포독성제이다. 세포독성제는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 세포독성제는 세포사를 초래하거나, 세포사를 유도하거나, 또는 일부 방식에서 세포 생존도를 감소시키는 임의의 화합물일 수 있고, 예를 들어, 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체, 벤조다이아제핀, 탁소이드, CC-1065 및 CC-1065 유사체, 듀오카마이신 및 듀오카마이신 유사체, 엔다이인(enediyne), 예컨대 칼리케아마이신, 돌라스타틴 및 아우리스타틴을 포함하는 돌라스타틴 유사체, 토마마이신 유도체, 렙토마이신 유도체, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 카보플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실 및 몰폴린 독소루비신을 포함한다.
예를 들어, 일부 경우에, 세포독성제는 진핵세포에서 미세소관 형성을 저해하는 화합물이다. 이러한 제제는, 예를 들어, 메이탄시노이드, 벤조다이아제핀, 탁소이드, CC-1065, 듀오카마이신, 듀오카마이신 유사체, 칼리케아마이신, 돌라스타틴, 돌라스타틴 유사체, 아우리스타틴, 토메이마이신 및 렙토마이신 또는 앞서 언급한 것 중 임의의 하나의 프로드러그를 포함한다. 메이탄시노이드 화합물은, 예를 들어, N(2')-데아세틸-N(2')-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신(DM1); N(2')-데아세틸-N(2')-(4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM3); 및 N(2')-데아세틸-N2-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM4)을 포함한다. 벤조다이아제핀은, 예를 들어, 인돌리노벤조다이아제핀 및 옥사졸리디노벤조다이아제핀을 포함한다.
세포독성제는 탁솔; 사이토칼라신 B; 그라미시딘 D; 브로민화 에티듐; 에메틴; 미토마이신; 에토포사이드; 테노포사이드; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 콜히친; 독소루비신; 아우노루비신; 다이하이드록시 안트라신 다이온; 메이탄신 또는 이의 유사체 또는 유도체; 아우리스타틴 또는 이의 작용성 펩타이드 유사체 또는 유도체; 돌라스타틴 10 또는 15 또는 이의 유사체; 이리노테칸 또는 이의 유사체; 미톡산트론; 미트라마이신; 악티노마이신 D; 1-데하이드로테스토스테론; 글루코코티코이드; 프로카인; 테트라카인; 리도카인; 프로프라놀롤; 퓨로마이신; 칼리케아마이신 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항대사물질; 6 머캅토퓨린; 6 티오구아닌; 사이타라빈; 플루다라빈; 5 플루오로유라실; 데카바진; 하이드록시유레아; 아스파라기나제; 겜시타빈; 클라드리빈; 알킬화제; 백금 유도체; 듀오카마이신 A; 듀오카마이신 SA; 라켈마이신(CC-1065) 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항생체; 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조다이아제핀(PDB); 디프테리아 독소; 리신 독소; 콜레라 독소; 쉬가(Shiga)-유사 독소; LT 독소; C3 독소; 쉬가 독소; 백일해 독소; 파상풍 독소; 대두 보먼-버크(Bowman-Birk) 프로테아제 저해제; 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소; 알로린; 사포린; 모데신; 겔라닌; 아브린 A 쇄; 모데신 A 쇄; 알파-사르신; 알레우리테스 포디(Aleurites fordii) 단백질; 디안틴 단백질; 피톨라카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질; 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 저해제; 쿠르신; 크로틴; 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제; 겔로닌; 미토겔린; 레스트릭토신; 페노마이신; 에노마이신 독소; 리보뉴클레아제(RNase); DNase I; 스타필로코커스 엔테로톡신 A; 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질; 디프테린 독소; 및 슈도모나스 내독소를 포함한다.
I.M. 진단제 및 표지
T-세포-MMP의 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드 쇄는 광검출 가능한 표지(예를 들어, 염료, 형광 표지, 인광 표지, 발광 표지), 조영제(예를 들어, 아이오딘 또는 바륨 함유 물질), 방사성표지, 영상화제, 스핀 표지, 포스터 공명 에너지 전달(Forster Resonance Energy Transfer: FRET)-형 표지, 상자성 표지/영상화제(가돌리늄 함유 자기 공명 영상화 표지), 초음파 표지 및 이들의 조합물의 페이로드 중 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 접합 모이어티는 방사성 동위원소이거나 방사성 동위원소를 포함하는 표지를 포함한다. 방사성 동위원소 또는 다른 표지의 예는 3H, 11C, 14C, 15N, 35S, 18F, 32P, 33P, 64Cu, 68Ga, 89Zr, 90Y, 99Tc, 123I, 124I, 125I, 131I, 111ln, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi 및 153Pb를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
II. T-세포-MMP 폴리펩타이드를 생성하는 방법
본 개시내용은 Co-MOD에 대한 대응하는 모 야생형 MOD의 친화도에 비해 Co-MOD에 대해 더 낮은 친화도를 나타내는 하나 이상의 변이체 MOD를 포함하는 것을 포함하는 T-세포-MMP 및 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 얻는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
A) 세포 또는 무 세포 시스템에서 T-세포-MMP의 제1 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 도입함으로써 T-세포-MMP를 생성하는 단계로서, 각각의 구성원은:
a) i) 제1 MHC 클래스 I 폴리펩타이드(예를 들어, β2M 폴리펩타이드)를 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및
b) i) 제2 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드); 및 ii) 선택적으로 Ig Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 스캐폴드를 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함하되,
제1 폴리펩타이드는 제1 화학적 접합 부위를 포함하고/하거나 제2 폴리펩타이드는 제2 화학적 접합 부위를 포함하며, 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD(예를 들어, 1, 2, 3개 이상의 야생형 및/또는 변이체 MOD)를 포함하는, 상기 생성하는 단계; 및
B) 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 접촉시켜 (동일한 세포 또는 무세포 시스템에서 공동발현된다면, 이들이 번역됨에 따라 폴리펩타이드가 접촉되게 될 수 있음) T-세포-MMP를 형성하는 단계로서,
T-세포-MMP가 하나 이상의 발생기(예를 들어, 비활성화된) 화학적 접합 부위를 포함할 때, 발생기 화학적 접합 부위는 선택적으로 활성화되어 제1 및/또는 제2 화학적 접합 부위를 갖는 T-세포-MMP를 생성할 수 있는, 상기 형성하는 단계(예를 들어, T-세포-MMP를 발현시키는 세포가 폼일글리신 생성 효소를 발현시키지 않는다면 설파타제 모티프를 폼일글리신 생성 효소와 반응시킴).
상기 방법은 이 시점에 중단될 수 있고, T-세포-MMP는 정제에 의해 얻어지며; 대안적으로, T-세포-MMP 에피토프 접합체가 요망되는 경우, 상기 방법은 다음의 단계로 이어질 수 있다:
C) 제1 및/또는 제2 화학적 접합 부위와의 접합에 적합한 에피토프(예를 들어, 에피토프 펩타이드)(예를 들어, 설파타제 모티프의 폼일 글리신과의 반응을 위해 하이드라진일 또는 하이드라진일 인돌 변형된 펩타이드)를 제공하고, 에피토프를 T-세포-MMP와 (예를 들어, 적합한 반응 조건 하에) 접촉시켜 T-세포-MMP 에피토프 접합체를 생성하는 단계.
T-세포-MMP가 페이로드(예를 들어, 소분자 약물, 방사성 표지 등)를 함유하는 것이 바람직한 경우, 페이로드는 상기 기재한 바와 같은 에피토프 접합체 대신에 T-세포-MMP와 반응될 수 있다. T-세포-MMP 에피토프 접합체가 페이로드를 함유하는 것이 바람직한 경우에, 에피토프가 이의 화학적 반응 부위(들)와 접촉되고 반응되기 전에 또는 후에 페이로드는 화학적 접합 부위(들)와 반응될 수 있다. 상이한 접합 부위(예를 들어, 제1 화학적 접합 부위 및 제2 화학적 접합 부위)에 대한 에피토프 및 페이로드의 선택성은 직교 화학의 사용 및/또는 접합 반응에서 화학량론의 제어를 통해 제어될 수 있다. 실시형태에서, 링커(예를 들어, 폴리펩타이드 또는 다른 2작용성 화학적 링커)는 에피토프 및/또는 페이로드를 이들의 접합 부위에 부착시키기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 Co-MOD에 대한 대응하는 모 야생형 MOD의 친화도에 비해 Co-MOD에 대해 더 낮은 친화도를 나타내는 하나 이상의 변이체 MOD를 포함하는 T-세포-MMP 에피토프 접합체를 얻는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
A) 복수의 구성원을 포함하는 T-세포-MMP 에피토프 접합체의 라이브러리를 생성하는 단계로서, 각각의 구성원은: a) i) 에피토프; 및 ii) 제1 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, β2M 폴리펩타이드)를 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및 b) i) 제2 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드); 및 ii) 선택적으로 Ig Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 스캐폴드를 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함하되, 각각의 구성원은 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드, 또는 제1 및 제2 폴리펩타이드 둘 다에 대해 상이한 변이체 MOD를 포함하는, 상기 생성하는 단계;
B) Co-MOD에 대한 라이브러리의 각각의 구성원의 친화도를 결정하는 단계; 및
C) Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 나타내는 라이브러리 구성원을 선택하는 단계.
일부 경우에, 친화도는 정제된 T-세포-MMP 라이브러리 구성원 및 Co-MOD를 이용하여 BLI에 의해 결정된다. BLI 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. BLI 분석은 상기 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Lad et al. (2015) J. Biomol. Screen. 20(4): 498-507; 및 Shah and Duncan (2014) J. Vis. Exp. 18:e51383] 참조.
본 개시내용은 T-세포에 대해 선택적 결합을 나타내는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 얻는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
A) 복수의 구성원을 포함하는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 라이브러리를 생성하는 단계로서, 각각의 구성원은:
a) i) 제1 MHC 폴리펩타이드를 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및
b) i) 제2 MHC 폴리펩타이드; 및 ii) 선택적으로 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 스캐폴드를 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함하되,
각각의 구성원이 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드, 또는 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 둘 다에서 상이한 변이체 MOD를 포함하며, 변이체 MOD는 아미노산 서열이 모 야생형 MOD와 1 aa 내지 10 aa만큼 상이하고,
T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원은 에피토프 태그 또는 형광 표지를 추가로 포함하며,
제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 중 하나는 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 화학적 접합 부위를 통해 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드에 공유 결합되는 에피토프를 포함하는, 상기 생성하는 단계;
B) T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원을 표면 상에서: i) 모 야생형 MOD에 결합하는 Co-MOD; 및 ii) 에피토프에 결합하는 TCR을 발현시키는 표적 T-세포와 접촉시키는 단계;
C) T-세포-MMP 에피토프 접합체가 에피토프 태그를 포함할 때, 표적 T-세포에 결합된 T-세포-MMP 에피토프 접합체 라이브러리 구성원을 에피토프 태그(형광 표지된 T-세포-MMP 에피토프 접합체는 불필요)에 결합하는 형광 표지된 결합제와 접촉시켜, 라이브러리 구성원/표적 T-세포/결합제 복합체를 생성하는 단계;
D) 유세포분석을 이용하여 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원/표적 T-세포/결합제 복합체의 평균 형광 강도(MFI)를 측정하는 단계로서, 다양한 농도의 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원에 대해 측정된 MFI는 친화도 및 겉보기 결합활성의 측정을 제공하는, 상기 측정하는 단계; 및
E) i) 모 야생형 MOD에 결합하는 Co-MOD; 및 ii) T-세포-MMP 라이브러리 구성원에 존재하는 에피토프 이외의 에피토프에 결합하는 TCR을 포함하는 대조군 T-세포에 대한 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원의 결합에 비해, 표적 T-세포에 선택적으로 결합하는 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원을 선택하는 단계.
일부 경우에, 표적 T-세포에 선택적으로 결합하는 것으로 확인된 T-세포-MMP 라이브러리 구성원은 라이브러리로부터 단리된다. 일부 경우에, 모 야생형 MOD 및 Co-MOD 쌍은 IL-2와 IL-2 수용체; 4-1BBL과 4-1BB; PD-L1과 PD-1; FasL과 Fas; TGFβ와 TGFβ 수용체; CD80과 CD28; CD86과 CD28; OX40L과 OX40; ICOS-L과 ICOS; ICAM과 LFA-1; JAG1과 Notch; JAG1과 CD46; CD70과 CD27; CD80과 CTLA4; 및 CD86과 CTLA4로부터 선택된다.
본 개시내용은 Co-MOD에 대한 대응하는 모 야생형 MOD의 친화도에 비해 Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 나타내는 하나 이상의 변이체 MOD를 포함하는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 얻는 방법을 제공하며, 상기 방법은 복수의 구성원을 포함하는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 라이브러리로부터 Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 나타내는 구성원을 선택하는 단계를 포함하되, 복수의 구성원 각각은: a)　i) 화학적 접합 부위에 공유적으로 결합된 에피토프; 및 ii)　제1 MHC 폴리펩타이드를 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및 b) i) 제2 MHC 폴리펩타이드; 및 ii) 선택적으로 Ig Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 스캐폴드를 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함하고, 라이브러리의 구성원은 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드, 또는 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 둘 다에 존재하는 복수의 변이체 MOD를 포함한다. 일부 경우에, 선택하는 단계는 BLI를 이용하여 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원과 Co-MOD 사이의 결합 친화도를 결정하는 것을 포함한다. 일부 경우에, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 상기 기재한 바와 같다.
일부 경우에, Co-MOD에 대한 대응하는 모 야생형 MOD의 친화도에 비해 Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 나타내는 하나 이상의 변이체 MOD를 포함하는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 얻는 방법은: a) 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원을 표면 상에서: i) 모 야생형 MOD에 결합하는 Co-MOD; 및 ii) 에피토프에 결합하는 TCR을 발현시키는 표적 T-세포와 접촉시키는 단계로서, T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원이 표적 T-세포에 결합하도록 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원이 에피토프 태그를 포함하는, 상기 접촉시키는 단계; b) 표적 T-세포에 결합된 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원을 에피토프 태그에 결합하는 형광 표지된 결합제와 접촉시켜, 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원/표적 T-세포/결합제 복합체를 생성하는 단계; 및 c) 유세포분석을 이용하여 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원/표적 T-세포/결합제 복합체의 MFI를 측정하는 단계를 더 포함하되, 다양한 농도의 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원에 대해 측정된 MFI는 친화도 및 겉보기 결합활성의 측정을 제공한다. i) 모 야생형 MOD에 결합하는 Co-MOD; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원에 존재하는 에피토프 이외의 에피토프에 결합하는 TCR을 포함하는, 대조군 T-세포에 대한 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원의 결합에 비해 표적 T-세포에 선택적으로 결합하는 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원은 표적 T-세포에 대해 선택적으로 결합하는 것으로 확인된다. 일부 경우에, 결합제는 에피토프 태그에 특이적인 항체이다. 일부 경우에, 변이체 MOD는 대응하는 모 야생형 MOD에 비해 1 내지 20개의 아미노산 치환(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 치환)을 포함한다. 일부 경우에, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 2개의 변이체 MOD를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 변이체 MOD는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리펩타이드는 2개의 변이체 MOD 중 하나를 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 2개의 변이체 MOD 중 두 번째를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 변이체 MOD는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 동일한 폴리펩타이드 쇄 상에 있다. 일부 경우에, 2개의 변이체 MOD는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 제1 폴리펩타이드 상에 있다. 일부 경우에, 2개의 변이체 MOD는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 제2 폴리펩타이드 상에 있다.
일부 경우에, Co-MOD에 대한 대응하는 모 야생형 MOD의 친화도에 비해 Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 나타내는 하나 이상의 변이체 MOD를 포함하는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 얻는 방법은 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원을 라이브러리로부터 단리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 사용되는 적어도 하나의 화학적 접합 부위를 갖는 T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공하여 선택된 라이브러리 구성원을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 핵산은 재조합 발현 벡터에 존재한다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드 서열은 진핵 세포에서 기능성인 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일부 경우에, 상기 방법은 핵산을 진핵 숙주 세포에 도입하는 단계, 및 액체 배지에서 세포를 배양시켜 세포에서 적어도 하나의 화학적 접합 부위를 갖는 암호화된 T-세포-MMP를 합성하는 단계, 적어도 하나의 화학적 접합 부위를 갖는 합성된 T-세포-MMP를 세포로부터 또는 액체 배양 배지로부터 단리시키는 단계, 및 이를 적어도 하나의 에피토프에 접합시켜 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 화학적 접합 부위를 갖는 선택된 T-세포-MMP는 Ig Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 Ig Fc 폴리펩타이드에 약물을 접합시키는 단계를 ㅊ두가로 포함한다. 일부 경우에, 약물은 메이탄시노이드, 벤조다이아제핀, 탁소이드, CC-1065, 듀오카마이신, 듀오카마이신 유사체, 칼리케아마이신, 돌라스타틴, 돌라스타틴 유사체, 아우리스타틴, 토메이마이신 및 렙토마이신 또는 앞서 언급한 것 중 임의의 하나의 프로드러그로부터 선택된 세포독성제이다. 일부 경우에, 약물은 레티노이드이다. 일부 경우에, 모 야생형 MOD 및 Co-MOD는 하기로부터 선택된다: IL-2와 IL-2 수용체; 4-1BBL과 4-1BB; PD-L1과 PD-1; FasL과 Fas; TGFβ와 TGFβ수용체; CD70과 CD27; CD80과 CD28; CD86과 CD28; OX40L과 OX40; FasL과 Fas; ICOS-L과 ICOS; ICAM과 LFA-1; 및 JAG1과 Notch; JAG1과 CD46; CD80과 CTLA4; 및 CD86과 CTLA4.
본 개시내용은 Co-MOD에 대한 대응하는 모 야생형 MOD의 친화도에 비해 Co-MOD에 대해 더 감소된 친화도를 나타내는 하나 이상의 변이체 MOD를 포함하는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 얻는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: A)　복수의 구성원을 포함하는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 라이브러리를 제공하는 단계로서, 복수의 구성원은 a) i) 화학적 접합 부위에 공유적으로 결합된 에피토프; 및 ii) 제1 MHC 폴리펩타이드를 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및 b) i) 제2 MHC 폴리펩타이드; 및 ii) 선택적으로 Ig Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 스캐폴드를 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함하되, 라이브러리의 구성원은 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드, 또는 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 둘 다에 존재하는 복수의 변이체 MOD를 포함하는 단계; 및 B) 라이브러리로부터 Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 나타내는 구성원을 선택하는 단계. 일부 경우에, 선택하는 단계는 BLI를 이용하여 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원과 Co-MOD 사이의 결합 친화도를 결정하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 선택하는 단계는 BLI를 이용하여 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원과 Co-MOD 사이의 결합 친화도를 결정하는 것을 포함한다. 일부 경우에, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 상기 기재한 바와 같다.
일부 경우에, 상기 방법은: a) 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원을 표면 상에서: i) 모 야생형 MOD에 결합하는 Co-MOD; 및 ii) 에피토프에 결합하는 T-세포 수용체를 발현시키는 표적 T-세포와 접촉시키는 단계로서, T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원이 표적 T-세포에 결합하도록 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원이 에피토프 태그를 포함하는, 상기 접촉시키는 단계; b) 표적 T-세포에 결합된 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원을 에피토프 태그에 결합하는 형광 표지된 결합제와 접촉시켜, 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원/표적 T-세포/결합제 복합체를 생성하는 단계; 및 c) 유세포분석을 이용하여 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원/표적 T-세포/결합제 복합체의 MFI를 측정하는 단계를 더 포함하되, 다양한 농도의 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원에 대해 측정된 MFI는 친화도 및 겉보기 결합활성의 측정을 제공한다. i) 모 야생형 MOD에 결합하는 Co-MOD; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원에 존재하는 에피토프 이외의 에피토프에 결합하는 T-세포 수용체를 포함하는, 대조군 T-세포에 대한 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원의 결합에 비해 표적 T-세포에 선택적으로 결합하는 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원은 표적 T-세포에 대해 선택적으로 결합하는 것으로 확인된다. 일부 경우에, 결합제는 에피토프 태그에 특이적인 항체이다. 일부 경우에, 변이체 MOD는 대응하는 모 야생형 MOD에 비해 1 내지 20개의 아미노산 치환(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 아미노산 치환)을 포함한다. 일부 경우에, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 2개의 변이체 MOD를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 변이체 MOD는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리펩타이드는 2개의 변이체 MOD 중 하나를 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 2개의 변이체 MOD 중 두 번째를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 변이체 MOD는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 동일한 폴리펩타이드 쇄 상에 있다. 일부 경우에, 2개의 변이체 MOD는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 제1 폴리펩타이드 상에 있다. 일부 경우에, 2개의 변이체 MOD는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 제2 폴리펩타이드 상에 있다.
일부 경우에, 상기 방법은 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체 라이브러리 구성원을 라이브러리로부터 단리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 사용되는 적어도 하나의 화학적 접합 부위를 갖는 T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공하여 선택된 라이브러리 구성원을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 핵산은 재조합 발현 벡터에 존재한다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드 서열은 진핵 세포에서 기능성인 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일부 경우에, 상기 방법은 핵산을 진핵 숙주 세포에 도입하는 단계, 및 액체 배지에서 세포를 배양시켜 세포에서 적어도 하나의 화학적 접합 부위를 갖는 암호화된 T-세포-MMP를 합성하는 단계, 적어도 하나의 화학적 접합 부위를 갖는 합성된 선택된 T-세포-MMP를 세포로부터 또는 액체 배양 배지로부터 단리시키는 단계, 및 이를 적어도 하나의 에피토프에 접합시켜 선택된 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 선택된 T-세포-MMP 라이브러리 구성원은 Ig Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 Ig Fc 폴리펩타이드에 약물을 접합시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 약물은 메이탄시노이드, 벤조다이아제핀, 탁소이드, CC-1065, 듀오카마이신, 듀오카마이신 유사체, 칼리케아마이신, 돌라스타틴, 돌라스타틴 유사체, 아우리스타틴, 토메이마이신 및 렙토마이신 또는 앞서 언급한 것 중 임의의 하나의 프로드러그로부터 선택되는 세포독성제이다. 일부 경우에, 약물은 레티노이드이다. 일부 경우에, 모 야생형 MOD 및 동족 MOD는 하기로부터 선택된다: IL-2와 IL-2 수용체; 4-1BBL과 4-1BB; PD-L1과 PD-1; FasL과 Fas; TGFβ와 TGFβ수용체; CD70과 CD27; CD80과 CD28; CD86과 CD28; OX40L과 OX40; FasL과 Fas; ICOS-L과 ICOS; ICAM과 LFA-1; 및 JAG1과 Notch; JAG1과 CD46; CD80과 CTLA4; 및 CD86과 CTLA4.
III. 핵산
본 개시내용은 본 개시내용의 T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 T-세포-MMP의 폴리펩타이드 내로 조작된 화학적 접합 부위를 포함하는 본 개시내용의 T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 본 명세서에 기재된 T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP의 개개 폴리펩타이드 쇄는 별개의 핵산에서 암호화된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP의 모든 폴리펩타이드 쇄는 단일 핵산에서 암호화된다. 일부 경우에, 제1 핵산은 본 개시내용의 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 제2 핵산은 본 개시내용의 T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 단일 핵산은 본 개시내용의 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 및 본 개시내용의 T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
III.A. 다량체 폴리펩타이드의 개개 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 별개의 핵산
본 개시내용은 T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 상기 언급한 바와 같이, 일부 경우에, T-세포-MMP의 개개 폴리펩타이드 쇄는 별개의 핵산에서 암호화된다. 일부 경우에, T-세포-MMP의 별개의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 전사 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 예컨대 진핵 세포에서 기능성인 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다.
본 개시내용은 제1 핵산 및 제2 핵산을 제공하며, 제1 핵산은 본 개시내용의 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제1 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로: a) 제1 MHC 폴리펩타이드; 및 b) MOD(예를 들어, 상기 기재한 바와 같이 감소된-친화도 변이체 MOD 폴리펩타이드)를 포함하고; 제2 핵산은 T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제2 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로: a) 제2 MHC 폴리펩타이드; 및 b) Ig Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 적합한 에피토프, MHC 폴리펩타이드, MOD 및 Ig Fc 폴리펩타이드는 상기 기재되어 있다. 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 화학적 접합 부위(또는 화학적 접합 부위로 전환될 수 있는 발생기 부위)를 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일부 경우에, 전사 제어 요소는 진핵 세포에서 기능성인 프로모터이다. 일부 경우에, 핵산은 별개의 발현 벡터에 존재한다.
본 개시내용은 제1 핵산 및 제2 핵산을 제공하며, 제1 핵산은 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제1 폴리펩타이드는 제1 MHC 폴리펩타이드를 포함하고; 제2 핵산은 T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제2 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로, a) 상기 기재한 바와 같은 MOD(예를 들어, 감소된-친화도 변이체 MOD 폴리펩타이드); b) 제2 MHC 폴리펩타이드; 및 c) Ig Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 적합한 MHC 폴리펩타이드, MOD 및 Ig Fc 폴리펩타이드는 상기 기재되어 있다. 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 화학적 접합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일부 경우에, 전사 제어 요소는 진핵 세포에서 기능성인 프로모터이다. 일부 경우에, 핵산은 별개의 발현 벡터에 존재한다.
III.B. T-세포-MMP에 존재하는 2 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산
본 개시내용은 T-세포-MMP의 적어도 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP가 제1, 제2 및 제3 폴리펩타이드인 경우, 핵산은 제1, 제2 및 제3 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 사이에 개재된 단백질 분해에 의해 절단 가능한 링커를 포함한다. 일부 경우에, T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 사이에 개재된 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함한다. 일부 경우에, T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 사이에 개재된 리보솜 스키핑 신호(또는 시스-작용성 가수분해요소, CHYSEL)를 포함한다. 핵산의 예를 이하에 기재하며, 단백질 분해에 의해 절단 가능한 링커가 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 사이에 제공하는 경우; 임의의 실시형태에서, IRES 또는 리보솜 스키핑 신호는 단백질 분해에 의해 절단 가능한 링커를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 대신에 사용될 수 있다.
본 명세서에 제공된 일부 경우에, 제1 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터, mRNA, 바이러스 RNA 등)은 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 제2 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터, mRNA, 바이러스 RNA 등)은 T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열은 각각 전사 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 예컨대 진핵 세포에서 기능성인 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다.
본 개시내용은 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 재조합 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로, 요소: a) 제1 MHC 폴리펩타이드; b) MOD(예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 감소된-친화도 변이체); c) 단백질 분해에 의해 절단 가능한 링커; d) 제2 MHC 폴리펩타이드; 및 e) 면역글로불린 (Ig) Fc 폴리펩타이드를 포함하되, 요소 중 적어도 하나는 세포 가공 동안 제거되지 않은 화학적 접합 부위를 포함한다. 본 개시내용은 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 재조합 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로, 요소: a) 제1 리더 펩타이드; b) 제1 MHC 폴리펩타이드; c) MOD(예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 감소된-친화도 변이체); d) 단백질 분해에 의해 절단 가능한 링커; e) 제2 리더 펩타이드; f) 제2 MHC 폴리펩타이드; 및 g) 면역글로불린 (Ig) Fc 폴리펩타이드를 포함하되, 요소 중 적어도 하나는 세포 가공 동안 제거되지 않은 화학적 접합 부위를 포함한다. 본 개시내용은 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기서 재조합 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로, 요소: a) 제1 MHC 폴리펩타이드; b) 단백질 분해에 의해 절단 가능한 링커; c) MOD(예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 감소된-친화도 변이체); d) 제2 MHC 폴리펩타이드; 및 e) Ig Fc 폴리펩타이드를 포함하되, 요소 중 적어도 하나는 세포 가공 동안 제거되지 않은 화학적 접합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 제1 리더 펩타이드 및 제2 리더 펩타이드는 β2M 리더 펩타이드이다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드 서열은 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일부 경우에, 전사 제어 요소는 진핵 세포에서 기능성인 프로모터이다.
적합한 MHC 폴리펩타이드는 상기 기재되어 있다. 일부 경우에, 제1 MHC 폴리펩타이드는 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드이고; 제2 MHC 폴리펩타이드는 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드이다. 일부 경우에, β2-마이크로글로불린 폴리펩타이드는 도 4에 도시된 β2M 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85%(예를 들어, 적어도 약 90%, 95%, 98%, 99% 또는 심지어 100%) 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K 또는 HLA-L 중쇄이다. 일부 경우에, MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 도 3A 내지 도 3D 중 어느 하나에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 막관통 고정 도메인을 포함하지 않을 수도 있다(예를 들어, 중쇄 폴리펩타이드는 도 3D의 서열을 포함한다).
적합한 Fc 폴리펩타이드는 상기 기재되어 있다. 일부 경우에, Ig Fc 폴리펩타이드는 IgG1 Fc 폴리펩타이드, IgG2 Fc 폴리펩타이드, IgG3 Fc 폴리펩타이드, IgG4 Fc 폴리펩타이드, IgA Fc 폴리펩타이드, 또는 IgM Fc 폴리펩타이드이다. 일부 경우에, Ig Fc 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2G에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
적합한 면역조절 폴리펩타이드(MOD)는 상기 기재되어 있다.
임의의 다른 단백질 분해에 의해 절단 가능한 링커에 추가로, 일부 경우에, 단백질 분해에 의해 절단 가능한 링커는 a) LEVLFQGP (서열번호 40); b) ENLYTQS (서열번호 41); c) DDDDK (서열번호 42); d) LVPR (서열번호 43); 및 e)　GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열번호 44)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 제1 및 제2 Cys 잔기가 링커와 제2 MHC 폴리펩타이드 사이의 이황화결합을 제공하도록, 제1 MHC 폴리펩타이드에 부착된 제1 Cys 잔기를 포함하는 링커가 제공되며, 제2 MHC 폴리펩타이드는 제2(조작된) Cys 잔기를 제공하기 위한 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에, 제1 Cys 잔기 및 제2 Cys 잔기가 제1 MHC 폴리펩타이드와 제2 MHC 폴리펩타이드 사이에 이황화결합을 제공하도록 제1 MHC 폴리펩타이드는 제1 조작된 Cys 잔기를 제공하기 위한 아미노산 치환을 포함하고, 제2 MHC 폴리펩타이드는 제2 조작된 Cys 잔기를 제공하기 위한 아미노산 치환을 포함한다. 상기 논의한 바와 같이, 이황화 브리지가 제공되는 경우에, 페이로드 또는 에피토프를 혼입시키기 위해 티올 반응제 또는 비스-티올 링커 중 하나를 사용할 수 있다.
III.C. 재조합 발현 벡터
본 개시내용은 본 개시내용의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 일부 경우에, 재조합 발현 벡터는 비바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 재조합 발현 벡터는 바이러스 작제물, 예를 들어, 재조합 아데노-연관 바이러스 작제물(예를 들어, 미국 특허 제7,078,387호 참조), 재조합 아데노바이러스 작제물, 재조합 렌티바이러스 작제물, 재조합 레트로바이러스 작제물, 비통합 바이러스 벡터 등이다.
적합한 발현 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, 백시니아 바이러스에 기반한 바이러스 벡터; 폴리오바이러스; 아데노바이러스(예를 들어, 문헌[Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999]; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655); 아데노-연관 바이러스(예를 들어, 문헌[Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava의 WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; 및 Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617] 참조); SV40; 단순포진 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스(예를 들어, 문헌[Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999] 참조); 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스 및 레트로바이러스, 예컨대 라우스 육종 바이러스, 하비(Harvey) 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 유선 종양 바이러스로부터 유래된 벡터); 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
수많은 적합한 발현 벡터는 당업자에게 공지되어 있으며, 다수는 상업적으로 입수 가능하다. 다음의 벡터는 진핵 숙주 세포에 대한 예로서 제공된다: pXT1, pSG5(스트라타겐(Stratagene)), pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVLSV40(파마시아(Pharmacia)). 그러나, 숙주 세포에 적합하다면 임의의 다른 벡터가 사용될 수 있다.
이용되는 숙주/벡터 시스템에 따라서, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 비롯한 임의의 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소가 발현 벡터에서 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bitter et al. (1987), Methods in Enzymology, 153:516-544] 참조).
일부 실시형태에서, DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 제어 요소, 예를 들어, 전사 제어 요소, 예컨대 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 전사 제어 요소는 진핵 세포, 예를 들어, 포유류 세포; 또는 원핵 세포(예를 들어, 박테리아 또는 고세균 세포)에서 기능성일 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 원핵 세포와 진핵 세포 둘 다에서 DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 하는 다중 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다.
적합한 진핵 프로모터(진핵 세포에서 기능성인 프로모터)의 비제한적 예는 거대세포 바이러스(CMV) 급초기로부터의 프로모터, 단순포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나제, 조기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부(long terminal repeat: LTR) 및 마우스 메탈로티오네인-I을 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 수준 내에서 용이하다. 발현 벡터는 번역 개시 및 전사 종결자에 대한 리보솜 결합 부위를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위한 적절하나 서열을 포함할 수 있다.
Iv. 숙주 세포
본 개시내용은 유전자 변형된 숙주 세포를 제공하며, 숙주 세포는 본 개시내용의 핵산에 의해 유전자 변형된다.
적합한 숙주 세포 진핵 세포, 예컨대 효모 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 포함한다. 일부 경우에, 숙주 세포는 포유류 세포주의 세포이다. 적합한 포유류 세포주는 인간 세포주, 비인간 영장류 세포주, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트) 세포주 등을 포함한다. 적합한 포유류 세포주는 HeLa 세포(예를 들어, 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection: ATCC) 번호 CCL-2(상표명)), CHO 세포(예를 들어, ATCC Nos. CRL-9618(상표명), CCL-61(상표명), CRL9096), 293 세포(예를 들어, ATCC 번호 CRL-1573(상표명)), Vero 세포, NIH 3T3 세포(예를 들어, ATCC 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포(예를 들어, ATCC 번호 CCL-10(상표명)), PC12 세포(ATCC 번호 CRL-1721(상표명)), COS 세포, COS-7 세포(ATCC 번호 CRL1651), RAT1 세포, 마우스 L 세포(ATCC 번호 CCLI.3), 인간 배아 신장(HEK) 세포(ATCC 번호 CRL1573), HLHepG2 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 숙주 세포는 내인성 MHC β2M을 합성하지 않고/않거나 내인성 MHC 클래스 I 중쇄(MHC-H)을 합성하지 않도록 유전자 변형된 포유류 세포이다. 앞서 언급한 것에 추가로, 설파타제 모티프를 포함하는 T-세포-MMP와 함께 사용하기 위한 폼일글리신 생성 효소(FGE) 활성을 발현시키는 숙주 세포가 논의되며, 이러한 세포는 내인성 MHC β2M 및 MHC-H 단백질 중 둘 다가 아니라면, 적어도 하나를 발현시키지 않도록, 유리하게 변형될 수 있다.
V. 조성물
본 개시내용은 하나 이상의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 본 개시내용의 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다.
V.A. T-세포-MMP를 포함하는 조성물
본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 T-세포-MMP에 추가로, 염, 예를 들어, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4 등; 완충제, 예를 들어, 트리스(Tris) 완충제, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산)(HEPES), 2-(N-몰폴리노)에탄설폰산(MES), 2-(N-몰폴리노)에탄설폰산 나트륨 염(MES), 3-(N-몰폴리노)프로판설폰산(MOPS), N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노프로판설폰산(TAPS) 등; 가용화제; 세정제, 예를 들어, 비이온성 세정제, 예컨대 트윈(Tween)-20 등; 프로테아제 저해제; 글리세롤 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있으며, 이 중 다수는 당업계에 공지되어 있고 본 명세서에서 상세하게 논의할 필요가 없다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는, 예를 들어, 문헌["Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 19th Ed. (1995), 또는 최종판, Mack Publishing Co; A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc]을 포함하는 다양한 간행물에 충분히 기재되어 있다.
약제학적 조성물은 본 개시내용의 T-세포-MMP, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상 약제학적 조성물은 대상체에 대한 투여에 적합할 것이며, 예를 들어, 멸균일 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상 약제학적 조성물은 인간 대상체에 대한 투여에 적합할 것이며, 예를 들어, 조성물은 멸균이며 검출 가능한 발열원 및/또는 다른 독소가 없다.
단백질 조성물은 다른 성분, 예컨대 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 탤컴, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 마그네슘, 탄산염 등을 포함할 수 있다. 조성물은 생리적 조건에 근접하게 하는데 필요한 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨, 염산, 황산염, 용매화물(예를 들어, 혼합된 이온성염, 물, 유기물), 수화물(예를 들어, 물) 등을 함유할 수 있다.
예를 들어, 조성물은 수용액, 분말, 과립, 정제, 알약, 좌약, 캡슐, 현탁액, 스프레이 등을 포함할 수 있다(예를 들어, 이의 형태일 수 있다). 조성물은 이하에 기재되는 다양한 투여 경로에 따라 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 T-세포-MMP가 직접적으로 조직에 주사 가능하게(예를 들어, 피하로, 복강내로, 근육내로 및/또는 정맥내로) 투여되는 경우, 제형은 바로 사용 가능한 투약 형태로서, 비수성 형태(예를 들어, 재구성 가능한 저장-안정성 분말) 또는 수성 형태, 예컨대 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제로 구성된 액체로서 제공될 수 있다. 단백질-함유 제형은 또한 투여 후 대상 단백질의 혈청 반감기를 향상시키기 위해 제공될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 리포좀 제형에서 제공될 수 있고, 콜로이드 또는 혈청 반감기를 연장시키기 위한 다른 통상적인 기법으로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka et al. 1980 Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467], 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호 및 제4,837,028호에 기재된 리포좀을 제조하기 위한 다양한 방법이 이용 가능하다. 제제는 또한 제어 방출 또는 서방출 형태로 제공될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형의 다른 예는 등장성 멸균 주사 용액, 항산화제, 제균제, 및 의도된 수용자의 혈액과 등장성인 제형을 제공하는 용질, 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정제 및 보존제를 포함한다. 예를 들어, 대상 약제학적 조성물은 용기, 예를 들어, 멸균 용기, 예컨대 주사기에 제공될 수 있다. 제형은 단일 용량 또는 다회 용량 밀봉 용기, 예컨대 앰플 및 바이알에 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 부형제, 예를 들어, 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조(동결건조) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
제형 내 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 농도는 크게 다를 수 있고(예를 들어, 약 0.1중량% 미만으로부터, 보통 또는 적어도 약 2중량%에서 20% 내지 50% 이상만큼 많이) 보통 유체 용적, 점성도 및 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요에 따르는 환자 기반 인자일 것이다.
본 개시내용은 본 개시내용의 조성물, 예를 들어, 액체 조성물을 포함하는 용기를 제공한다. 용기는, 예를 들어, 주사기, 앰플 등일 수 있다. 일부 경우에, 용기는 멸균이다. 일부 경우에, 용기와 조성물 둘 다 멸균이다.
본 개시내용은 T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 T-세포-MMP 및 이들의 에피토프 접합체에 대해 상기 기재한 바와 같은 a) T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체; 및 b) 부형제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 부형제는 약제학적으로 허용 가능한 부형제이다.
일부 경우에, T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 액체 조성물에 존재한다. 따라서, 본 개시내용은 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물을 포함하는 액체 조성물)을 제공한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 조성물은 a) 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체; 및 b) 식염수(예를 들어, 0.9% 또는 약 0.9% NaCl)를 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 멸균이다. 일부 경우에, 조성물은 인간 대상체에 대한 투여에 적합하며, 예를 들어, 조성물은 멸균이며 검출 가능한 발열원 및/또는 다른 독소가 없다. 따라서, 본 개시내용은 a) T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체; 및 b) 식염수(예를 들어, 0.9% 또는 약 0.9% NaCl)를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 멸균이며, 검출 가능한 발열원 및/또는 다른 독소가 없다.
VI. 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 조성물
본 개시내용은 약제학적 조성물, 예를 들어, 본 개시내용의 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 매우 다양한 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에서 상세하게 논의할 필요는 없다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는, 예를 들어, 문헌[A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc]을 포함하는 다양한 간행물에 다양하게 기재되었다.
본 개시내용의 조성물은 a) T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 또는 하나 이상의 재조합 발현 벡터; 및 b)　완충제, 계면활성제, 항산화제, 친수성 중합체, 덱스트린, 킬레이트제, 현탁제, 가용화제, 농조화제, 안정제, 정균제, 습윤제 및 보존제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 적합한 완충제는 (예를 들어) N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(BES), 비스(2-하이드록시에틸)아미노-트리스(하이드록시메틸)메탄 (BIS-트리스), N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'3-프로판설폰산(EPPS 또는 HEPPS), 글리실글리신, N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES), 3-(N-몰폴리노)프로판 설폰산(MOPS), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄-설폰산) (PIPES), 중탄산나트륨, 3-(N-트리스(하이드록시메틸)-메틸-아미노)-2-하이드록시-프로판설폰산) TAPSO, (N-트리스(하이드록시메틸)메틸-2-아미노에탄설폰산(TES), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-글리신(트리신), 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄(트리스) 등)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 염은 예를 들어, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4 등을 포함한다.
본 개시내용의 약제학적 제형은 약 0.001% 내지 약 90%(w/w)의 양으로 본 개시내용의 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함할 수 있다. 제형의 설명에서, 이하의 "대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터"는 본 개시내용의 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상 제형은 본 개시내용의 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함한다.
대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 다른 화합물 또는 화합물의 혼합물과 혼합, 캡슐화, 접합 또는 달리 결합될 수 있고; 이러한 화합물은, 예를 들어 리포좀 또는 수용체 표적화 분자를 포함할 수 있다. 대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 섭취, 분포 및/또는 흡수를 돕는 1종 이상의 성분과 제형에서 조합될 수 있다.
대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터 조성물은 임의의 다수의 가능한 투약 형태, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 정제, 캡슐, 젤 캡슐, 액체 시럽, 연질젤, 좌약 및 관장제로 제형화될 수 있다. 대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터 조성물은 또한 수성, 비수성 또는 혼합 배지에서 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 수성 현탁액은, 예를 들어, 카복시메틸셀룰로스나트륨, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점성도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정제를 함유할 수 있다.
대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 제형은 리포좀 제형일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "리포좀"은 하나 이상의 구형 이중층들에 배열된 양친매성 지질로 구성된 소수포를 의미한다. 리포좀은 전달될 조성물을 함유하는 친유성 물질 및 수성 내부로부터 형성된 막을 갖는 단일층 또는 다층 소수포이다. 양이온성 리포좀은 음으로 하전된 DNA 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성할 수 있는 양으로 하전된 리포좀이다. pH 민감성 또는 음으로 하전된 리포좀은 그것과의 복합체보다는 DNA를 붙잡는 것으로 여겨진다. 양이온성 리포좀과 비양이온성 리포좀은 둘 다 대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
리포좀은 또한 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 리포좀 내로 혼입될 때 전문화된 지질이 없는 리포좀에 비해 향상된 순환 수명을 초래하는 1종 이상의 전문화된 지질을 포함하는 리포좀을 지칭하는 용어인 "입체적으로 안정화된" 리포좀을 포함한다. 입체적으로 안정화된 리포좀의 예는 리포좀의 소수포-형성 지질 부분이 1종 이상의 당지질을 포함하거나 또는 1종 이상의 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티에 의해 유도체화된다. 리포좀 및 그들의 용도는 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
본 개시내용의 제형 및 조성물은 또한 계면활성제를 포함할 수 있다. 약물 제품, 제형 중의 그리고 에멀션 중의 계면활성제의 용도는 당업계에 잘 공지되어 있다. 계면활성제 및 그들의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 핵산의 효율적인 전달을 달성하기 위한 다양한 침투 향상제가 포함된다. 세포막을 가로지르는 비친수성 약물의 확산을 돕는 것에 추가로, 침투 향상제는 또한 친유성 약물의 투과성을 향상시킨다. 침투 인핸서는 5가지 넓은 범주, 즉, 계면활성제, 지방산, 담즙염, 킬레이트제, 및 비킬레이트 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 침투 향상제 및 그들의 용도는 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 마이크로미립자, 나노미립자, 현탁액 또는 수 중 또는 비수성 배지 중의 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사쉐, 정제 또는 미니정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 적합한 경구 제형은 대상 안티센스 핵산이 1종 이상의 향상제 계면활성제 및 킬레이터와 함께 투여되는 것을 포함한다. 적합한 계면활성제는, 지방산 및/또는 에스터 또는 이들의 염, 담즙산 및/또는 이들의 염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 담즙산/염 및 지방산 및 그들의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다. 또한 침투 향상제, 예를 들어, 지방산/담즙산/염과 조합한 염의 조합물이 적합하다. 예시적인 적합한 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨염이다. 추가 침투 향상제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에터 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 침투 향상제는 또한 프로필렌 글리콜, 다이메틸설폭사이드, 트라이에타노이아민, N,N-다이메틸아세트아마이드, N,N-다이메틸폼아마이드, 2-피롤리돈 및 이들의 유도체, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올 및 아존(AZONE)(상표명)을 포함한다.
VII. T-세포 활성을 조절하는 방법
T-세포-MMP 상의 'MOD, 및 일부 예에서, T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체 상의 페이로드는 운반 중일 수 있다. 에피토프를 결여하는 T-세포-MMP는 MOD에 의해 정해지는 T-세포의 부류에 그리고/또는 T-세포의 해당 부류를 자극하거나 저해하기 위한 수단으로서 페이로드를 전달하는 데 사용될 수 있다. 다른 경우에, T-세포-MMP가 에피토프에 접합된 경우(즉, T-세포-MMP-에피토프 접합체인 경우), T-세포에 대한 접합체를 접합시키는 것은 에피토프-특이적 T-세포 조절을 초래한다. 일부 경우에, 접촉시키는 것은 생체내(예를 들어, 포유류, 예컨대 인간, 래트, 마우스, 개, 고양이, 돼지, 말 또는 영장류에서) 일어난다. 일부 경우에, 접촉시키는 것은 시험관내에서 일어난다. 일부 경우에, 접촉시키는 것은 생체외에서 일어난다.
본 개시내용은 에피토프-특이적 T-세포의 활성을 선택적으로 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 T-세포를 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 T-세포를 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 단계는 에피토프-특이적 T-세포의 활성을 선택적으로 조절한다. 일부 경우에, 접촉시키는 단계는 시험관내에서 일어난다. 일부 경우에, 접촉시키는 단계는 생체내에서 일어난다. 일부 경우에, 접촉시키는 단계는 생체외에서 일어난다.
일부 경우에, 예를 들어, 표적 T-세포가 CD8+ T-세포인 경우, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 클래스 I MHC 폴리펩타이드(예를 들어, β2-마이크로글로불린 및 클래스 I MHC 중쇄)를 포함한다.
본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 활성화 폴리펩타이드인 MOD를 포함하는 경우에, T-세포를 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 것은 에피토프-특이적 T-세포를 활성화시킨다. 일부 예에서, 에피토프-특이적 T-세포는 암 세포 상에 존재하는 에피토프에 특이적인 T-세포이며, 에피토프-특이적 T-세포를 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 단계는 암 세포에 대한 T-세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 일부 예에서, 에피토프-특이적 T-세포는 암 세포 상에 존재하는 에피토프에 특이적인 T-세포이며, 에피토프-특이적 T-세포를 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 단계는 에피토프-특이적 T-세포의 수를 증가시킨다.
일부 예에서, 에피토프-특이적 T-세포는 바이러스-감염 세포 상에 존재하는 에피토프에 특이적인 T-세포이며, 에피토프-특이적 T-세포를 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 단계는 바이러스-감염 세포에 대한 T-세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 일부 예에서, 에피토프-특이적 T-세포는 바이러스-감염 세포 상에 존재하는 에피토프에 특이적인 T-세포이며, 에피토프-특이적 T-세포를 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 단계는 에피토프-특이적 T-세포의 수를 증가시킨다.
본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 저해성 폴리펩타이드인 MOD를 포함하는 경우에, T-세포를 다량체와 접촉시키는 것은 에피토프-특이적 T-세포를 저해한다. 일부 예에서, 에피토프-특이적 T-세포는 자기-항원에 존재하는 에피토프에 특이적인 자기-반응성 T-세포이고, 접촉시키는 단계는 자기-반응성 T-세포의 수를 감소시킨다.
VIII. 공자극 폴리펩타이드(MOD)를 선택적으로 전달하는 방법
본 개시내용은, 예를 들어, 주어진 에피토프에 특이적인 TCR이 표적화되는 방식으로 선택된 T-세포 또는 선택된 T-세포 집단에 MOD 또는 천연 유래 MOD의 감소된-친화도 변이체(예컨대 본 명세서에 개시된 변이체)를 전달하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 MOD 또는 본 명세서에 개시된 천연 유래 MOD의 감소된-친화도 변이체를 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프에 특이적인 TCR을 보유하는 표적 T-세포에 선택적으로 전달하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 T-세포 집단을 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. T-세포 집단은: i) 표적 T-세포; 및 ii) 에피토프에 특이적이지 않은 비표적 T-세포(예를 들어, 에피토프-특이적 T-세포에 결합하는 에피토프 이외의 에피토프(들)에 특이적인 T-세포)를 포함하는 혼합된 집단일 수 있다. 에피토프-특이적 T-세포는 T-세포-MMP 에피토프 접합체에 존재하는 에피토프-제시 펩타이드에 특이적이고, T-세포-MMP 에피토프 접합체에 의해 제공된 펩타이드 HLA 복합체 또는 펩타이드 MHC 복합체에 결합한다. 따라서, T-세포 집단을 T-세포-MMP 에피토프 접합체와 접촉시키는 것은 T-세포-MMP 에피토프 접합체에 존재하는 에피토프에 특이적인 T-세포(들)에 선택적으로 공자극 폴리펩타이드(예를 들어, 야생형 MOD 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 야생형 MOD의 감소된-친화도 변이체)를 전달한다.
따라서, 본 개시내용은 MOD(예컨대 IL-2), 또는 본 명세서에 개시된 천연 유래 MOD의 감소된-친화도 변이체(예컨대 IL-2 변이체), 또는 둘 다의 조합을 표적 T-세포에 선택적으로 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 T-세포의 혼합된 집단을 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 혼합된 T-세포 집단은 표적 T-세포 및 비-표적 T-세포를 포함한다. 표적 T-세포는 T-세포-MMP-에피토프 접합체 내에 존재하는 에피토프에 특이적이다. T-세포의 혼합된 집단을 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 것은 T-세포-MMP-에피토프 접합체 내에 존재하는 MOD(들)를 표적 T-세포에 전달한다.
예를 들어, 본 개시내용의 T-세포-MMP 에피토프 접합체는: i) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프에 특이적인 표적 T-세포(들); 및 ii) 비-표적 T-세포(들), 예를 들어, T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프가 아닌 제2 에피토프(들)에 특이적인 T-세포(들)를 포함하는, T-세포의 집단과 접촉된다. 집단을 접촉시키는 것은 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 MOD(들)(예를 들어, 천연 유래 MOD(예를 들어, 천연 유래 IL-2) 또는 천연 유래 MOD의 감소된-친화도 변이체(예를 들어, 본 명세서에 개시된 IL-2 변이체))의 표적 T 세포에 대한 선택적 전달을 초래한다. 따라서, 예를 들어, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 비-표적 T 세포는 T-세포-MMP 에피토프 접합체에 결합하고, 그 결과, 공자극 폴리펩타이드(예를 들어, IL-2 또는 IL-2 변이체)는 비-표적 T 세포에 전달되지 않는다. 다른 예로서, 집단을 접촉시키는 것은 T-세포-MMP 에피토프 접합체에 존재하는 공자극 폴리펩타이드(들)(예를 들어, 천연 유래 공자극 폴리펩타이드(예를 들어, 천연 유래 공자극 폴리펩타이드의 천연 유래 4-1BBL) 또는 감소된-친화도 변이체(예를 들어, 본 명세서에 개시된 4-1BBL 변이체))의 표적 T-세포에 대한 선택적 전달을 초래한다. 따라서, 예를 들어, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 비-표적 T 세포는 T-세포-MMP 에피토프 접합체에 결합하고, 그 결과, 공자극 폴리펩타이드(예를 들어, 4-1BBL 또는 4-1BBL 변이체)는 비-표적 T 세포에 전달되지 않는다.
일부 경우에, T-세포 집단은 시험관내이다. 일부 경우에, T-세포 집단은 시험관내이고, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 대한 표적 T-세포 집단의 생물학적 반응(예를 들어, T-세포 활성화 및/또는 확성 및/또는 표현형 분화)은 시험관내 배양물과 관련하여 일어난다. 예를 들어, T-세포의 혼합된 집단은 개체로부터 얻을 수 있으며, 시험관내 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉될 수 있다. 이러한 접촉은 정해진 용량(들) 및/또는 노출 스케줄(들)에 대한 T-세포 집단의 단일 또는 다회 노출을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 접촉은 T-세포 집단 내에서 표적 T-세포를 선택적으로 결합/활성화 및/또는 확장시키는 것을 초래하고, 활성화된 그리고/또는 확장된 표적 T-세포의 집단 생성을 초래한다. 예로서, 혼합된 T-세포 집단은 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)일 수 있다. 예를 들어, 환자로부터의 PBMC는 표준 림프구 배양 조건 하에 0.1 내지 1000nM의 본 개시내용의 다량체 폴리펩타이드에 노출되기 전 표준 혈액 회수 및 PBMC 농축에 의해 얻을 수 있다. 정해진 용량 및 스케줄에서 혼합된 T-세포 집단의 노출 전, 노출 동안 그리고 노출 후 시점에서, 시험관내 배양물에서 표적 T-세포의 존재비는 특정 펩타이드-MHC 다량체 및/또는 표현형 마커 및/또는 기능성 활성(예를 들어, 사이토카인 ELISpot 분석)에 의해 모니터링될 수 있다. 일부 경우에, 시험관내에서 항원 특이적 세포의 최적의 존재비 및/또는 표현형을 달성할 때, 활성화된 그리고/또는 확장된 표적 T 세포 집단의 모두 또는 일부는 개체(T-세포의 혼합된 집단이 얻어진 개체)에게 투여된다.
일부 경우에, T-세포 집단은 시험관내이다. 예를 들어, 혼합된 T-세포 집단은 개체로부터 얻으며, 시험관내에서 본 개시내용의 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉된다. 시험관내 세포 배양물과 관련하여 정해진 용량(들) 및/또는 노출 계획(들)에 대한 T-세포의 단일 또는 다회 노출을 포함할 수 있는 이러한 접촉은 혼합된 T-세포 집단이 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 의해 제시된 에피토프에 특이적인 T-세포를 포함하는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. T-세포-MMP-에피토프 접합체의 에피토프에 특이적인 T-세포의 존재는 혼합된 T-세포 집단을 포함하는 샘플을 분석함으로써 결정될 수 있는데, 이 T-세포 집단은 에피토프에 특이적이지 않은 T-세포(비-표적 T 세포)를 포함하고 에피토프에 특이적인 T-세포(표적 T-세포)를 포함할 수 있다. 공지된 분석은 표적 T-세포의 활성화 및/또는 증식을 검출하기 위해 사용될 수 있고, 이에 의해 특정 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 개체에서 존재하는 T-세포에 결합하는 에피토프를 갖는지 여부 및 그에 따라 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 해당 개체에 대한 치료적 조성물로서 잠재적 용도를 갖는지의 여부를 결정할 수 있는 생체외 분석을 제공한다. 표적 T-세포의 활성화 및/또는 증식 검출을 위한 적합한 공지된 분석은, 예를 들어, T-세포 표현형 및/또는 항원 특이성 및/또는 증식의 유세포 특성규명을 포함한다. 에피토프-특이적 T-세포의 존재를 검출하기 위한 이러한 분석, 예를 들어, 동반 진단 기기는 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 표적 T-세포에 선택적으로 결합/활성화 및/또는 확장시키는지의 여부를 결정하기 위해 추가적인 분석(예를 들어, 효과기 사이토카인 ELISpot 분석) 및/또는 적절한 대조군(예를 들어, 항원-특이적 및 항원 비특이적 다량체 펩타이드-HLA 염색 시약)을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 개시내용은 개체로부터 얻은 혼합된 T-세포 집단에서 관심 대상의 에피토프에 결합하는 표적 T-세포의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 시험관내 혼합된 T-세포 집단을 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 단계로서, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 관심 대상의 에피토프를 포함하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 접촉시키는 단계에 반응한 T-세포의 활성화 그리고/또는 증식을 검출하는 단계로서, 활성화된 그리고/또는 증식된 T-세포는 표적 T-세포의 존재를 나타내는, 상기 검출하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 그리고/또는 추가로, T-세포-MMP-에피토프 접합체를 이용하여 목적하는 T-세포 집단의 활성화 및/또는 확장(증식)이 얻어지면, 활성화된/확장된 T-세포를 포함하는 T-세포 집단의 모두 또는 일부는 요법으로서 개체에게 다시 투여될 수 있다.
일부 예에서, T-세포 집단은 개체에서 생체내이다. 이러한 예에서, MOD(예를 들어, IL-2 또는 감소된-친화도 IL-2; 4-1BBL 또는 감소된 친화도 4-1BBL; PD-L1 또는 감소된 친화도 PD-L1; CD80 또는 감소된 친화도 CD80; 또는 CD86 또는 감소된 친화도CD86)를 에피토프-특이적 T-세포에 선택적으로 전달하기 위한 본 개시내용의 방법은 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
MOD(예를 들어, IL-2 또는 감소된-친화도 IL-2;4-1BBL 또는 감소된 친화도 4-1BBL; PD-L1 또는 감소된 친화도 PD-L1; CD80 또는 감소된 친화도 CD80; 또는 CD86 또는 감소된 친화도 CD86)이 선택적으로 전달되는 에피토프-특이적 T-세포는 또한 본 명세서에서 "표적 T-세포"로서 지칭된다. 일부 경우에, 표적 T-세포는 조절 T-세포(Treg)이다. 일부 경우에, Treg는 자가반응성 T-세포의 활성을 저해하거나 또는 억제한다.
일부 경우에, 표적 T-세포는 세포독성 T-세포이다. 예를 들어, 표적 T-세포는 암 에피토프(예를 들어, 암 세포에 의해 제시된 에피토프)에 특이적인 세포독성 T-세포일 수 있다.
XI. 치료 방법
본 개시내용은 개체(예를 들어 치료 개체)에서 에피토프-특이적 T-세포의 활성을 선택적으로 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 본 개시내용의 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 또는 T-세포-MMP를 암호화하는 하나 이상의 핵산의 양을 투여하는 단계를 포함하며, 이 후에, 에피토프에 대한 접합은 개체에서 에피토프-특이적 T-세포의 활성을 선택적으로 조절하는 데 효과적이다. 또한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에서 사용하기 위한 본 개시내용의 T-세포-MMP 에피토프 접합체가 제공된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 치료 방법은 본 개시내용의 T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터를 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 치료 방법은 본 개시내용의 T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 mRNA 분자를 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 치료 방법은 치료가 필요한 개체에게 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 치료될 수 있는 병태는 감염, 암 및 자가면역 장애를 포함하며, 이의 일부의 예를 이하에 기재한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 이러한 접합체가 필요한 개체에게 투여될 때, 에피토프-특이적 T-세포 반응과 에피토프 비-특이적 T-세포 반응을 둘 다 유도한다. 다시 말해서, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체는, 이것이 필요한 개체에게 투여될 때, i) T-세포-MMP에 존재하는 에피토프에 특이적인 TCR; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 MOD에 결합하는 Co-MOD를 둘 다 나타내는 제1 T-세포의 활성을 조절함으로써 에피토프-특이적 T-세포 반응을 유도하고; i) T-세포-MMP에 존재하는 에피토프 이외의 에피토프에 특이적인 TCR; 및 ii) T-세포-MMP에 존재하는 MOD에 결합하는 Co-MOD를 나타내는 제2 T-세포의 활성을 조절함으로써 에피토프 비-특이적 T-세포 반응을 유도한다. 에피토프-특이적 T-세포 반응 대 에피토프-비-특이적 T-세포 반응의 비는 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1 또는 적어도 100:1이다. 에피토프-특이적 T-세포 반응 대 에피토프-비-특이적 T-세포 반응의 비는 약 2:1 내지 약 5:1, 약 5:1 내지 약 10:1, 약 10:1 내지 약 15:1, 약 15:1 내지 약 20:1, 약 20:1 내지 약 25:1, 약 25:1 내지 약 50:1, 약 50:1 내지 약 100:1, 또는 100 초과의 수:1이다. T-세포의 "활성을 조절하는 것"은 i) 세포독성(예를 들어, CD8+) T-세포의 활성화; ii) 세포독성(예를 들어, CD8+) T-세포의 세포독성 활성 유도; iii) 세포독성(예를 들어, CD8+) T-세포에 의한 사이토톡신(예를 들어, 퍼포린; 그랜자임; 그라눌라이신(granulysin)의 생성 및 방출 유도; iv)　자가반응성 T-세포의 활성 저해 등의 활성 저해 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
실시형태에서, 환자가 일반적으로 면역억제된 경우와 같이, 독립적으로 선택된 MOD(예를 들어, 야생형) 또는 Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 갖는 변이체 MOD를 보유하는 하나 이상의 T-세포-MMP는 이들의 전반적 면역 상태/반응성을 자극하기 위해 (예를 들어, 백신 항원 또는 감염에 반응하는 이들의 능력에 의해 측정됨) 환자에게 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 환자가 일반적으로 면역억제된 경우와 같이, 독립적으로 선택된 MOD(예를 들어, 야생형) 또는 Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 갖는 변이체 MOD를 보유하는 하나 이상의 T-세포-MMP는 환자의 면역 반응을 자극하기 위해 환자에 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 조합하여 투여될 수 있다.
실시형태에서, Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 갖는 독립적으로 선택된 MOD(예를 들어, 야생형), 또는 변이체 MOD를 보유하는 하나 이상의 T-세포-MMP는 병원균에 대한 면역의 발생을 자극/향상시키기 위해 병원균에 대한 백신(예를 들어, 단백질 또는 핵산 백신)과 함께 환자에게 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 병원균에 대한 에피토프를 보유하는 하나 이상의 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 병원균에 대한 면역의 발생을 자극하기 위해 병원균에 대한 백신(예를 들어, 단백질 또는 핵산 백신)과 함께 환자에게 투여된다. 이러한 경우에, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 독립적으로 선택된 MOD(예를 들어, 야생형), 또는 Co-MOD에 대해 감소된 친화도를 갖는 변이체 MOD를 포함할 수 있다. T-세포-MMP가 백신(예를 들어, 단백질 또는 핵산)과 함께 투여되는 경우에, 백신과 조합하여 또는 백신 투여와 동시에 또는 상이한 시점에 투여되는 별개의 제형으로 공동 투여될 수 있다.
Co-MOD에 대한 MOD의 감소된 친화도와 TCR에 대한 에피토프의 친화도 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 향상된 선택성을 제공한다. 따라서, 예를 들어, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 i) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프 이외의 에피토프에 특이적인 TCR; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 MOD에 결합하는 Co-MOD를 나타내는 제2 T-세포에 결합하는 결합활성에 비해, i) T-세포-MMP 에피토프 접합체에 존재하는 에피토프에 특이적인 TCR; 및 ii) T-세포-MMP 에피토프 접합체에 존재하는 MOD에 결합하는 Co-MOD 둘 다를 나타내는 제1 T-세포에 대해 더 높은 결합활성으로 결합한다.
본 개시내용은 개체에서 에피토프-특이적 T-세포의 활성을 선택적으로 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 T-세포-MMP 또는 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체는 개체에서 에피토프-특이적 T-세포의 활성을 선택적으로 조절한다. 에피토프-특이적 T-세포의 활성을 선택적으로 조절하는 것은 개체에서 질환 또는 장애를 치료할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 치료가 필요한 개체에게 유효량의 T-세포-MMP 또는 이의 에피토프 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
일부 경우에, MOD는 활성화 폴리펩타이드이고, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 에피토프-특이적 T-세포를 활성화시킨다. 일부 경우에, 에피토프는 암-관련 에피토프이며, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 암 관련 에피토프에 특이적인 T-세포의 활성을 증가시킨다.
본 개시내용은 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 유효량의 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 투여하는 단계를 포함하며, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 암 에피토프인 T-세포 에피토프를 포함하고, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 자극 MOD를 포함한다. 일부 경우에, "유효량"의 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 치료가 필요한 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, 개체에서 암 세포의 수를 감소시키는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 "유효량"의 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 치료가 필요한 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 투여 전에, 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 함께 투여의 부재 하의 개체에서의 암 세포 수에 비해 개체에서 암 세포의 수를 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%만큼, 또는 검출 가능하지 않은 수준으로 개체에서의 암 세포 수를 감소시킨다. 다른 경우에, "유효량"의 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 치료가 필요한 개체에 대해 1회 이상의 용량으로 투여될 때, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 초회 용량의 투여 시 해당 종양의 용적에 비해 개체에서 적어도 하나의 고형 종양의 용적을 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%만큼, 또는 검출 가능하지 않은 수준으로 감소시킨다.
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 이러한 치료가 필요한 개체(종양을 갖는 개체)에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, 개체에서 암 세포의 수, 또는 적어도 하나의 종양의 용적을 검출가능하지 않은 수준으로 감소시키는 양이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은, 치료가 필요한 개체에 대해 1회 이상의 용량으로 투여될 때, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 투여 전에, 또는 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 투여의 부재 하에 개체에서의 총 종양 질량에 비해 개체에서의 종양 질량을 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%만큼, 또는 검출 가능하지 않은 수준으로 감소시키는 양이다. 다른 실시형태에서, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 이러한 치료가 필요한 개체(종양을 갖는 개체)에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, 개체에서 적어도 하나의 종양의 용적을 감소시키는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 다량체 폴리펩타이드의 "유효량"은 치료가 필요한 개체(종양을 갖는 개체)에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 투여 전에, 또는 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 투여의 부재 하에 개체에서의 종양 용적에 비해 종양 용적을 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 검출 가능한 수준(용적)으로 감소시키는 양이다. 이러한 실시형태에서, 질량은 종양 밀도 및 용적에 기반하여 계산된다.
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 치료가 필요한 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, 개체의 생존 시간을 증가시키는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 생존 시간의 증가가 필요한 개체에 대해 1회 이상의 용량이 투여될 때, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 투여의 부재 하에서 개체의 예상되는 생존 시간에 비해 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 3개월 내지 6개월, 6개월 내지 1년, 1년 내지 2년, 2년 내지 5년, 5년 내지 10년 또는 10년 초과만큼 개체의 생존 시간을 증가시키는 양이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 치료가 필요한 개체의 집단 내 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, 집단의 평균 생존 시간을 증가시키는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 치료가 필요한 개체 집단의 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 받지 않은 개체의 생존 시간에 비해 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 3개월 내지 6개월, 6개월 내지 1년, 1년 내지 2년, 2년 내지 5년, 5년 내지 10년, 또는 10년 초과만큼 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 받는 개체 집단의 생존 시간을 증가시키는 양이되; 집단은 연령, 성별, 체중 및 질환 상태(질환 및 진행 정도)가 매칭된 집단이다.
일부 예에서, 에피토프-특이적 T-세포는 바이러스-감염 세포 상에 존재하는 에피토프에 특이적인 T-세포이며, 에피토프-특이적 T-세포를 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 것은 바이러스-감염 세포에 대한 T-세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 일부 예에서, 에피토프-특이적 T-세포는 바이러스-감염 세포 상에 존재하는 에피토프에 특이적인 T-세포이며, 에피토프-특이적 T-세포를 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시키는 것은 에피토프-특이적 T-세포의 수를 증가시킨다. 따라서, 본 개시내용은 개체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 유효량의 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 투여하는 단계를 포함하며, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 바이러스 에피토프인 T-세포 에피토프를 포함하고, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 자극 MOD를 포함한다. 일부 경우에, T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 치료가 필요한 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, 개체에서 바이러스 감염된 세포의 수를 감소시키는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 치료가 필요한 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, T-세포-MMP-에피토프 접합체의 투여 전에, 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 함께 투여의 부재 하의 개체에서의 바이러스-감염 세포 수에 비해 개체에서 바이러스-감염 세포의 수를 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%만큼 개체에서의 바이러스 감염 세포 수를 감소시킨다. 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 치료가 필요한 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, 개체에서 바이러스 감염된 세포의 수를 검출 가능하지 않은 수준으로 감소시키는 양이다.
본 개시내용은 또한 개체에서 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 유효량의 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 투여하는 단계를 포함하며, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 병원균-연관 에피토프인 T-세포 에피토프를 포함하고, T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 자극 MOD를 포함한다. 일부 경우에, T-세포-MMP의 "유효량"은 치료가 필요한 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, 개체에서 병원균의 수를 감소시키는 양이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 치료가 필요한 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 투여 전에, 또는 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 함께 투여의 부재 하의 개체에서의 바이러스-감염 세포 수에 비해 개체에서 병원균의 수를 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%만큼 개체에서의 병원균 수를 감소시킨다. 일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 치료가 필요한 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, 개체에서 병원균의 수를 검출 가능하지 않은 수준으로 감소시키는 양이다. 병원균은 바이러스, 박테리아, 원생동물 등을 포함한다.
일부 경우에, MOD는 저해 폴리펩타이드이고, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 에피토프-특이적 T-세포의 활성을 저해한다. 일부 경우에, 에피토프는 자기-에피토프이며, T-세포-MMP-에피토프 접합체는 자기-에피토프에 특이적인 T-세포의 활성을 저해한다.
본 개시내용은 개체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 유효량의 T-세포-MMP(또는 T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산) 및/또는 자기-에피토프를 포함하는 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 저해 MOD를 포함한다. 이러한 경우에, T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 치료가 필요한 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 투여 전에, 또는 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 함께 투여의 부재 하의 개체에서의 바이러스-감염 세포 수에 비해 자기-반응성 T-세포의 수를 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%만큼 개체에서의 자기-반응성 T-세포 수를 감소시킨다. 일부 경우에, 이러한 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 치료가 필요한 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여될 때, 개체에서의 Th2 사이토카인의 생성을 (예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%만큼) 감소시킨다. 일부 경우에, 이러한 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 "유효량"은 치료가 필요한 개체에개 1회 이상의 용량으로 투여될 때 개체에서 자가면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 개선시키는 양이다.
상기 언급한 바와 같이, 일부 경우에, 대상 치료를 수행함에 있어서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 폴리펩타이드 그 자체로서 치료가 필요한 개체에게 투여된다. 다른 예에서, 대상 치료 방법을 수행함에 있어서, 본 개시내용의 T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 한 가지 이상의 핵산은 치료가 필요한 개체에게 투여된다. 따라서, 다른 예에서, 본 개시내용의 하나 이상의 핵산, 예를 들어, 본 개시내용의 하나 이상의 재조합 발현 벡터는 치료가 필요한 개체에게 투여된다.
X. 제형
적합한 제형은 상기 기재되어 있고, 적합한 제형은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 일부 경우에, 적합한 제형은 a) 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체; 및 b) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 일부 경우에, 적합한 제형은 a) 본 개시내용의 T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 및 b) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하고; 일부 예에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 경우에, 적합한 제형은 a) 본 개시내용의 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산; b) 본 개시내용의 T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산; 및 c) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 일부 경우에, 적합한 제형은 a) 본 개시내용의 T-세포-MMP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; 및 b) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 일부 경우에, 적합한 제형은 a) 본 개시내용의 T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터; b) 본 개시내용의 T-세포-MMP의 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; 및 c) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
적합한 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 상기 기재되어 있다.
X.A. 투약량
적합한 투약량은 다양한 임상 인자에 기반하여 담당 의사 또는 다른 자격있는 의료인에 의해 결정될 수 있다. 의학 분야에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 임의의 한 명의 환자에 대한 투약량은 환자의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 폴리펩타이드 또는 핵산, 환자의 성별, 시간, 투여 경로, 일반적 건강상태 및 동시에 투여 중인 다른 약물을 포함하는 다수의 인자에 의존한다. 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 1ng/kg 체중 내지 20㎎/㎏ 체중/용량, 예를 들어, 0.1㎎/㎏ 체중 내지 10㎎/㎏ 체중, 예를 들어, 0.5㎎/㎏ 체중 내지 5㎎/㎏ 체중의 양으로 투여될 수 있지만; 그러나, 특히 앞서 언급한 인자를 고려하여 이 범위 미만의 또는 초과의 용량이 생각된다. 요법이 연속 주입이라면, 이는 또한 1㎍ 내지 10㎎/체중 킬로그램/분의 범위일 수 있다. 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 약 1㎎/㎏ 체중 내지 50㎎/㎏ 체중, 예를 들어, 약 1㎎/㎏ 체중 내지 약 5㎎/㎏ 체중, 약 5㎎/㎏ 체중 내지 약 10㎎/㎏ 체중, 약 10㎎/㎏ 체중 내지 약 15㎎/㎏ 체중, 약 15㎎/㎏ 체중 내지 약 20㎎/㎏ 체중, 약 20㎎/㎏ 체중 내지 약 25㎎/㎏ 체중, 약 25㎎/㎏ 체중 내지 약 30㎎/㎏ 체중, 약 30㎎/㎏ 체중 내지 약 35㎎/㎏ 체중, 약 35㎎/㎏ 체중 내지 약 40㎎/㎏ 체중, 또는 약 40㎎/㎏ 체중 내지 약 50㎎/㎏ 체중의 양으로 투여된다.
일부 경우에, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 적합한 용량은 0.01㎍ 내지 100 g/체중 ㎏, 0.1㎍ 내지 10 g/체중 ㎏, 1㎍ 내지 1 g/체중 ㎏, 10㎍ 내지 100㎎/체중 ㎏, 100㎍ 내지 10㎎/체중 ㎏, 또는 100㎍ 내지 1㎎/체중 ㎏이다. 당업자는 체액 또는 조직 내 투여된 제제의 측정된 체류 시간 및 농도에 기반하여 투약에 대한 반복 속도를 용이하게 추정할 수 있다. 성공적인 치료 후에, 환자는 질환 상태의 재발을 방지하기 위한 유지 요법을 받는 것이 바람직할 수 있되, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 0.01㎍ 내지 100 g/체중 ㎏, 0.1㎍ 내지 10 g/체중 ㎏, 1㎍ 내지 1 g/체중 ㎏, 10㎍ 내지 100㎎/체중 ㎏, 100㎍ 내지 10㎎/체중 ㎏, 또는 100㎍ 내지 1㎎/체중 ㎏ 범위의 유지 용량으로 투여된다.
당업자는 용량 수준이 특정 T-세포-MMP, 증상의 중증도 및 대상체의 부작용에 대한 감수성의 함수로서 다를 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 주어진 화합물의 바람직한 투약량은 다양한 수단에 의해 당업자에 의해 용이하게 결정 가능하다.
일부 실시형태에서, 다회 용량의 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터가 투여된다. 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터의 투여 빈도는 임의의 다양한 인자, 예를 들어, 증상의 중증도 등에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 1개월당 1회, 1개월당 2회, 1개월당 3회, 격주(qow), 주당 1회(qw), 주당 2회(biw), 주당 3회(tiw), 주당 4회, 주당 5회, 주당 6회, 격일(qod), 매일(qd), 1일 2회(qid), 또는 1일 3회(tid)로 투여된다.
본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터의 투여 지속기간, 예를 들어, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터가 투여되는 시간 기간은 임의의 다양한 인자, 예를 들어, 환자 반응 등에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 약 1일 내지 약 1주, 약 2주 내지 약 4주, 약 1개월 내지 약 2개월, 약 2개월 내지 약 4개월, 약 4개월 내지 약 6개월, 약 6개월 내지 약 8개월, 약 8개월 내지 약 1년, 약 1년 내지 약 2년, 또는 약 2년 내지 약 4년 또는 그 이상의 범위의 시간 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.
X.B. 투여 경로
활성제(본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터)는 생체내 및 생체외 방법을 포함하는 약물 전달에 적합한 임의의 이용 가능한 방법 및 투여 경로뿐만 아니라 전신 및 국소화된 투여 경로를 이용하여 개체에게 투여된다.
통상적인 및 약제학적으로 허용 가능한 투여 경로는 종양내, 종양 주위, 근육내, 림프내, 기관내, 두개내, 피하, 진피내, 국소, 정맥내, 동맥내, 직장, 비강, 경구 및 다른 장 및 비경구 투여 경로를 포함한다. 투여 경로는 원한다면 조합될 수 있고, 또는 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체 및/또는 원하는 효과에 따라 조절될 수 있다. 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 또는 본 개시내용의 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 단일 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 근육내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 림프내로 투여된다. 일부 실시형태에서, T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 국소로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 종양내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 종양주위로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 두개내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 피하로 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 근육내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 국소로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 종양내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 종양주위로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 두개내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 피하로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 림프내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체는 림프내로 투여된다.
본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 임의의 이용 가능한 통상적인 방법 및 전신 또는 국소 경로를 비롯한, 통상적인 약물의 전달에 적합한 경로를 이용하여 숙주에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용의 방법에서 사용하기 위해 상정된 투여 경로는 장, 비경구 및 흡입 경로를 포함하지만, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
흡입 투여 이외의 비경구 투여 경로는 국소, 경피, 피하, 근육내, 안와내, 낭내, 척수내, 흉골내, 종양내, 림프내, 종양 주위, 및 정맥내 경로, 즉, 소화관을 통하는 것 이외의 임의의 투여 경로를 포함하지만, 반드시 이들로 제한되지는 않는다. 비경구 투여는 본 개시내용의 T-세포-MMP 및/또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터의 전신 또는 국소 전달을 달성하기 위해 수행될 수 있다. 전신 전달이 요망되는 경우에, 투여는 전형적으로 약제학적 제제의 침습성 또는 전신으로 흡수되는 국소 또는 점막 투여를 수반한다.
X.C. 치료에 적합한 대상체
본 개시내용의 방법에 의한 치료에 적합한 대상체는 암이 있는 것으로 진단된 개체, 암에 대해 치료되었지만, 치료에 대한 반응이 없는 개체, 및 암에 대해 치료되고 초기에 반응하였지만, 후속적으로 치료에 대해 난치성이 된 개체를 포함하는, 암이 있는 개체를 포함한다. 본 개시내용의 방법에 의한 치료에 적합한 대상체는 감염으로 진단된 개체, 및 감염에 대해 치료되었지만 치료에 반응하지 않은 개체를 포함하는 감염(예를 들어, 병원균, 예컨대 박테리아, 바이러스, 원생동물 등에 의한 감염)을 갖는 개체를 포함한다. 본 개시내용의 방법에 의한 치료에 적합한 대상체는 박테리아 감염을 갖는 것으로 진단된 개체, 및 박테리아 감염에 대해 치료되었지만, 치료에 반응하지 않은 개체를 포함하는, 박테리아 감염을 갖는 개체를 포함한다. 본 개시내용의 방법에 의한 치료에 적합한 대상체는 바이러스 감염을 갖는 것으로 진단된 개체, 및 바이러스 감염에 대해 치료되었지만, 치료에 반응하지 않은 개체를 포함하는, 바이러스 감염을 갖는 개체를 포함한다. 본 개시내용의 방법에 의한 치료에 적합한 대상체는 자가면역 질환을 갖는 것으로 진단된 개체, 및 자가면역 질환에 대해 치료되었지만, 치료에 반응하지 않은 개체를 포함하는, 자가면역 질환을 갖는 개체를 포함한다.
특정 예에서, 예를 들어, 본 개시내용의 T-세포 조절 다량체 폴리펩타이드가 HBV 에피토프를 포함하는 경우에, 치료에 적합한 개체는 HBV로 감염된 개체이다. 일부 경우에, 개체는 급성 HBV 감염을 가진다. 일부 경우에, 개체는 급성 HBV 감염을 가지며, 간암을 갖지 않는다. 일부 경우에, 개체는 HBV의 비활성 운반체이다. 일부 경우에, 개체는 HBV의 비활성 운반체이고, 간암을 갖지 않는다. 일부 경우에, 개체는 만성 활성 HBV를 가진다. 일부 경우에, 개체는 만성 활성 HBV를 가지며, 간암을 갖지 않는다. 일부 경우에, 개체는 HBV 감염에 기인하는 간암을 가진다.
특정 예에서, 예를 들어, 본 개시내용의 T-세포 조절 다량체 폴리펩타이드가 HBV 에피토프를 포함하는 경우에, 치료에 적합한 개체는 HBV로 감염된 개체이며, 개체는 아시아인이고, 예를 들어, 개체는 HLA-A11, HLA-A24 또는 HLA-A33 대립유전자이다. 일부 경우에, 개체는 급성 HBV 감염을 가진다. 일부 경우에, 개체는 급성 HBV 감염을 가지고, 간암을 갖지 않으며, 개체는 아시아인이고, 예를 들어, 개체는 HLA-A11, HLA-A24 또는 HLA-A33 대립유전자를 가진다. 일부 경우에, 개체는 HBV의 비활성 담체이고, 개체는 아시아인이며, 예를 들어, 개체는 HLA-A11, HLA-A24 또는 HLA-A33 대립유전자를 가진다. 일부 경우에, 개체는 HBV의 비활성 담체이고, 간암을 갖지 않으며, 개체는 아시아인이며, 예를 들어, 개체는 HLA-A11, HLA-A24 또는 HLA-A33 대립유전자를 가진다. 일부 경우에, 개체는 만성 활성 HBV를 가지고, 개체는 아시아인이며, 예를 들어, 개체는 HLA-A11, HLA-A24 또는 HLA-A33 대립유전자를 가진다. 일부 경우에, 개체는 만성 활성 HBV를 가지고, 간암을 갖지 않으며, 개체는 아시아인이며, 예를 들어, 개체는 HLA-A11, HLA-A24 또는 HLA-A33 대립유전자를 가진다. 일부 경우에, 개체는 HBV 감염에 기인하는 간암을 가지고, 개체는 아시아인이며, 예를 들어, 개체는 HLA-A11, HLA-A24 또는 HLA-A33 대립유전자를 가진다.
XI. 특정 실시형태
본 발명은 이의 특정 실시형태를 참고로 하여 기재하였지만, 본 발명의 진정한 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 다양한 변화가 만들어질 수 있고, 동등물이 치환될 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해되어야 한다. 추가로, 본 발명의 목적, 정신 및 범주에 대해 특정 상황, 물질, 물질의 조성, 공정 및/또는 공정 단계 또는 단계들을 적합화시키기 위한 다수의 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본 명세서에 첨부하는 청구범위의 범주 내인 것으로 의도된다.
1. T-세포-MMP(T-세포-MMP)로서:
a) i) N-말단 및 C-말단을 갖는 제1 주조직 적합 복합체(MHC) 폴리펩타이드를 포함하는, 제1 폴리펩타이드;
b) N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로,
i) 제2 MHC 폴리펩타이드; 및
ii) 선택적으로 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드
를 포함하는 제2 폴리펩타이드;
c) 제1 폴리펩타이드에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 제1 폴리펩타이드 내에 부착된 하나 이상의 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위, 및/또는 제2 폴리펩타이드에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 제2 폴리펩타이드 내에 부착된 하나 이상의 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위; 및
d) 하나 이상의 면역조절 폴리펩타이드(MOD)로서, 하나 이상의 MOD 중 적어도 하나는
A) 제1 폴리펩타이드의 C-말단에;
B) 제2 폴리펩타이드의 N-말단에;
C) 제2 폴리펩타이드의 C-말단에; 또는
D) 제1 폴리펩타이드의 C-말단에 그리고 제2 폴리펩타이드의 N-말단에
있는, 하나 이상의 면역조절 펩타이드를 포함하되,
하나 이상의 MOD의 각각은 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 MOD인, T-세포-MMP.
2. 실시형태 1에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드는
N-말단 및 C-말단 상에 링커가 없는 제1 MHC 폴리펩타이드,
N-말단 상에 링커를 보유하는 제1 MHC 폴리펩타이드,
C-말단 상에 링커를 보유하는 제1 MHC 폴리펩타이드, 또는
N-말단 및 C-말단 상에 링커를 보유하는 제1 MHC 폴리펩타이드
를 포함하는, T-세포-MMP.
3. 실시형태 1 또는 2 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는:
a) 상기 제1 MHC 폴리펩타이드의 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되며, 상기 제1 MHC 폴리펩타이드는 이의 N-말단 및 C-말단 상에 링커가 없고;
b) 상기 제1 MHC 폴리펩타이드의 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되며, 상기 제1 MHC 폴리펩타이드는 이의 N-말단 및 C-말단 상에 링커를 포함하고;
c) 상기 제1 MHC 폴리펩타이드의 N-말단 상의 링커 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되고; 그리고/또는
d) 상기 제1 MHC 폴리펩타이드의 C-말단 상의 링커 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되는, T-세포-MMP.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 MHC 폴리펩타이드는 클래스 I MHC 폴리펩타이드이고, 상기 제1 MHC 폴리펩타이드는:
N-말단 및 C-말단 상에 링커가 없는 N-말단 및 C-말단을 갖는 베타-2-마이크로글로불린("β2M") 폴리펩타이드,
N-말단 상에 링커를 보유하는 β2M 폴리펩타이드,
C-말단 상에 링커를 보유하는 β2M 폴리펩타이드, 또는
N-말단 및 C-말단 상에 링커를 보유하는 β2M 폴리펩타이드
를 포함하는, T-세포-MMP.
5. 실시형태 4에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는:
a) N-말단 또는 C-말단 상에 링커가 없는 β2M 폴리펩타이드의 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되고;
b) 상기 β2M 폴리펩타이드의 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되며, 상기 β2M 폴리펩타이드는 이의 N-말단 및 C-말단 상에 링커를 포함하고;
c) 상기 β2M 폴리펩타이드의 N-말단 상의 링커 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되고; 그리고/또는
d) 상기 β2M 폴리펩타이드의 C-말단 상의 링커 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되는, T-세포-MMP.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드는:
N-말단 및 C-말단 상에 링커가 없는 제2 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC 클래스 I 중쇄("MHC-H") 폴리펩타이드를 포함),
N-말단 상에 링커를 보유하는 제2 MHC 폴리펩타이드,
C-말단 상에 링커를 보유하는 제2 MHC 폴리펩타이드, 또는
N-말단 및 C-말단 상에 링커를 보유하는 제2 MHC 폴리펩타이드
를 포함하는, T-세포-MMP.
7. 실시형태 6에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드는 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드를 더 포함하는, T-세포-MMP.
8. 실시형태 7에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로:
C-말단 상에 링커를 보유하고, 이어서, 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드를 보유하는 제2 MHC 폴리펩타이드; 또는
N-말단 및/또는 C-말단 상에 링커를 보유하고, 이어서, 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드를 보유하는 제2 MHC 폴리펩타이드
를 포함하는, T-세포-MMP.
9. 실시형태 1 또는 8 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는:
a) 상기 제2 MHC 폴리펩타이드의 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되며, 상기 제2 MHC 폴리펩타이드는 이의 N-말단 및 C-말단 상에 링커가 없고;
b) 상기 제2 MHC 폴리펩타이드의 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되며, 상기 제2 MHC 폴리펩타이드는 이의 N- 및/또는 C-말단 상에 링커를 포함하고;
c) 상기 제2 MHC 폴리펩타이드의 N-말단 상의 링커 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되고;
d) 상기 제2 MHC 폴리펩타이드의 C-말단 상의 링커 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되고/되거나
e) 제2 MHC 폴리펩타이드에 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드가 이어질 때 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드의 서열에(예를 들어, N-또는 C-말단) 또는 서열 내에 부착되는, T-세포-MMP.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 MHC 폴리펩타이드는 N-말단 및 C-말단 상에 링커가 없는 N-말단 및 C-말단을 갖는 MHC 클래스 I 중쇄("MHC-H") 폴리펩타이드, N-말단 상에 링커를 보유하는 MHC-H 폴리펩타이드, C-말단 상에 링커를 보유하는 MHC-H 폴리펩타이드, 또는 N-말단 및 C-말단 상에 링커를 보유하는 MHC-H 폴리펩타이드를 포함하는, T-세포-MMP.
11. 실시형태 4 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는:
a) N-말단 또는 C-말단 상에 링커가 없는 β2M 폴리펩타이드의 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되고;
b) 상기 β2M 폴리펩타이드의 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되며, 상기 β2M 폴리펩타이드는 이의 N-말단 및 C-말단 상에 링커를 포함하고;
c) 상기 β2M 폴리펩타이드의 N-말단 상의 링커 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되고; 그리고/또는
d) 상기 β2M 폴리펩타이드의 C-말단 상의 링커 서열에(예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서) 또는 서열 내에 부착되는, T-세포-MMP.
12. 실시형태 4 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 중 적어도 하나에서 신호 서열을 결여하는 성숙 β2M 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 도 4에 나타내는 β2M 폴리펩타이드 서열)의 아미노 말단 15개의 아미노산 중 어느 것을 대체하고/하거나 아미노산 사이에 삽입되는, T-세포-MMP.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드는 Ig Fc 폴리펩타이드를 포함하는, T-세포-MMP.
14. 실시형태 13에 있어서, Ig Fc 폴리펩타이드는 IgG1 Fc 폴리펩타이드, IgG2 Fc 폴리펩타이드, IgG3 Fc 폴리펩타이드, IgG4 Fc 폴리펩타이드, IgA Fc 폴리펩타이드, 또는 IgM Fc 폴리펩타이드인, T-세포-MMP.
15. 실시형태 14에 있어서, 상기 Ig Fc 폴리펩타이드는 도 2a 내지 도 2D에 도시된 아미노산 서열, 또는 IgFc 폴리펩타이드에 대응하는 도 2a 내지 도 2D 중 하나의 서열의 일부(적어도 약 50, 75, 100, 125 또는 150개의 아미노산 길이)에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성, 또는 심지어 100% 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, T-세포-MMP.
16. 실시형태 15에 있어서, 상기 IgFc 폴리펩타이드는 IgG1 Fc 폴리펩타이드인, T-세포-MMP.
17. 실시형태 16에 있어서, IgG1 Fc 폴리펩타이드는 N297A, L234A, L235A, L234F, L235E 및 P331S로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, T-세포-MMP.
18. 실시형태 17에 있어서, 상기 IgG1 Fc 폴리펩타이드는 L234A 및 L235A 치환을 포함하는, T-세포-MMP.
19. 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, T-세포-MMP는 하나 이상의 독립적으로 선택된 야생형 및/또는 변이체 MOD 폴리펩타이드를 포함하되; 상기 하나 이상의 변이체 MOD 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 Co-MOD에 대한 대응하는 야생형 MOD의 친화도에 비해 Co-MOD(이의 Co-MOD)에 대해 감소된 친화도를 나타내는(예를 들어, Co-MOD에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체(대조군이 야생형 MOD를 포함하는 경우)의 결합 친화도 대 ii) Co-MOD에 대한 야생형 MOD의 변이체를 포함하는 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도의 비는, (상기 기재한 바와 같이) BLI에 의해 측정하여, 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 500:1, 적어도 102:1, 적어도 5×102:1, 적어도 103:1, 적어도 5×103:1, 적어도 104:1, 적어도 105:1 또는 적어도 106:1임), T-세포-MMP.
20. 실시형태 19에 있어서, 상기 변이체 MOD 폴리펩타이드는 대응하는 야생형 면역조절 폴리펩타이드에 비해 1 내지 10개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하거나: 대응하는 야생형 MOD의 아미노산 서열, 또는 야생형 MOD 서열의 일부(예를 들어, 야생형 MOD의 적어도 약 50, 75, 100, 125 또는 150개의 인접한 아미노산 길이) 아미노산 서열에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성, 또는 심지어 100% 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, T-세포-MMP.
21. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 야생형 면역조절 폴리펩타이드는 IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD70, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, ICAM 및 PD-L2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, T-세포-MMP.
22. 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 MHC 폴리펩타이드는 β2 마이크로글로불린 β2M 폴리펩타이드이고; 상기 제2 MHC 폴리펩타이드는 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드인, T-세포-MMP.
23. 실시형태 4 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 β2M 폴리펩타이드는 도 4에 제시된 아미노산 서열 중 하나, 또는 도 4의 성숙 서열 β2M 폴리펩타이드(예를 들어, 적어도 약 60, 70, 80 또는 90개의 아미노산 길이)에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성, 또는 심지어 100% 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, T-세포-MMP.
24. 실시형태 4 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 β2M 폴리펩타이드는 도 4에 제시된 아미노산 서열 중 하나의 적어도 일부를 갖는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 99개의 인접한 아미노산의 서열(예를 들어, 도 4에 제시된 신호 서열을 결여하는 성숙 β2M 폴리펩타이드의 서열에 대해 동일성을 갖는 20 내지 99, 20 내지 40, 30 내지 50, 40 내지 60, 40 내지 90, 50 내지 70, 60 내지 80, 60 내지 99, 70 내지 90, 또는 79 내지 99개의 인접한 아미노산을 갖는 서열)을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진, T-세포-MMP.
25. 실시형태 10 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C 중쇄(예를 들어, HLA-A11, HLA-A24 및 HLA-A33을 포함하는 도 3으로부터의 HLA-A HLA-B 또는 HLA-C)인, T-세포-MMP.
26. 실시형태 25에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드 서열은 도 3A 내지 도 3D 중 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성, 또는 심지어 100% 동일성)을 갖는 아미노산 서열, 또는 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드에 대응하는 도 3A 내지 도 3D 중 하나의 서열의 일부(예를 들어, 도 3A 내지 도 3D 중 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 동일성을 갖는 20 내지 100, 20 내지 40, 30 내지 50, 40 내지 60, 40 내지 90, 50 내지 70, 60 내지 80, 60 내지 90, 70 내지 90, 80 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 250, 또는 250개 초과의 인접한 아미노산을 갖는 서열)을 포함하고, 선택적으로 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드가 기능성 막관통 고정 도메인을 포함하지 않는다는 조건으로 처리되는, T-세포-MMP.
27. 실시형태 26에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 도 3A 내지 도 3D에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 일부와 동일성을 갖는 적어도 20, 30, 40, 50, 80, 100, 150, 200, 또는 250개의 인접한 아미노산 서열을 포함하며, 단, MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 기능성 막관통 도메인을 포함하지 않는, T-세포-MMP.
28. 실시형태 10 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드 서열은 α1 나선의 카복실 말단 부분의 시스테인과 α2-1 나선의 아미노 말단 부분의 시스테인 사이의 이황화 결합, 및/또는 아미노산 잔기 2, 7, 84, 5, 59, 116, 139, 167, 168, 170 또는 171의 임의의 하나 이상(2, 3, 4개 등)에서의 시스테인 또는 시스테인 치환을 포함하는, T-세포-MMP.
29. 실시형태 28에 있어서, α1 나선의 카복실 말단 부분은 약 아미노산 79번 위치 내지 약 아미노산 89번 위치이고, α2-1 나선의 아미노 말단 부분은 약 아미노산 134번 위치 내지 MHC 클래스 I 중쇄의 아미노산 144번 위치이고, 아미노산 위치는 이들의 리더 서열 없이 중쇄 서열에 기반하여 결정되는(예를 들어, 도 3D 참조), T-세포-MMP.
30. 실시형태 28 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 이황화결합은 83, 84 또는 85번 위치에 위치된 시스테인 138, 139 또는 140번 위치에 위치된 시스테인(예를 들어, 83번 위치 내지 138, 139 또는 140번 위치, 84번 위치 내지 138, 139 또는 140번 위치, 또는 85번 위치 내지 138, 139 또는 140번 위치)인, T-세포-MMP.
31. 실시형태 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 이황화결합은 84번 위치에 위치된 시스테인과 139번 위치에 위치된 시스테인 사이에 있는, T-세포-MMP.
32. 실시형태 28에 있어서, MHC 클래스 I 중쇄 서열은 α1 나선의 카복실 말단 부분과 α2-1 나선의 아미노 말단 부분 사이에 이황화결합을 형성하는 시스테인 앞의 또는 뒤의 1 내지 5개의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 가질 수 있는, T-세포-MMP.
33. 실시형태 32에 있어서, 치환 및/또는 삽입이 존재할 때, 상기 아미노산은 임의의 천연 유래 아미노산, 또는 글리신 및 프롤린을 제외한 임의의 천연 유래 아미노산으로부터 선택될 수 있는, T-세포-MMP.
34. 실시형태 25 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 1 내지 79번 위치의 상기 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드 아미노산 서열은 도 3D에 제시된 적어도 하나의 서열의 대응하는 부분에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성, 또는 심지어 100% 동일성)을 갖는(예를 들어, 서열이 도 3D에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 갖는), T-세포-MMP.
35. 실시형태 25 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 89 내지 134번 위치(89번과 134번 위치를 포함)의 상기 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드 아미노산 서열이 도 3D에 제시된 적어도 하나의 서열의 대응하는 부분에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성, 또는 심지어 100% 동일성)을 갖는(예를 들어, 서열은 도 3D의 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 가짐), T-세포-MMP.
36. 실시형태 25 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 144 내지 230번 위치(144번과 230번 위치를 포함)의 상기 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드 아미노산 서열이 도 3D에 제시된 적어도 하나의 서열의 대응하는 부분에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성, 또는 심지어 100% 동일성)을 갖는(예를 들어, 서열은 도 3D의 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 가짐), T-세포-MMP.
37. 실시형태 25 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 242 내지 274번 위치(242번과 274번 위치를 포함)의 상기 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드 아미노산 서열이 도 3D에 제시된 적어도 하나의 서열의 대응하는 부분에 대해 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성, 또는 심지어 100% 동일성)을 갖는(예를 들어, 서열은 도 3D의 서열에 비해 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 가짐), T-세포-MMP.
38. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 및 상기 제2 폴리펩타이드는 비공유적으로 결합되는, T-세포-MMP.
39. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 및 상기 제2 폴리펩타이드는 서로 공유적으로 결합되는, T-세포-MMP.
40. 실시형태 39에 있어서, 상기 공유 결합은 이황화 결합을 통하는, T-세포-MMP.
41. 실시형태 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 독립적으로 선택된 MOD를 포함하는, T-세포-MMP.
42. 실시형태 41에 있어서, 2 이상의(예를 들어, 2, 3 또는 4) 야생형 또는 변이체 MOD 중 임의의 2 이상, 3 이상 또는 4 이상 사이에 펩타이드 링커를 포함하는, T-세포-MMP.
43. 실시형태 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드는 제1 MHC 폴리펩타이드와 적어도 하나의 야생형 또는 변이체 MOD 사이에 펩타이드 링커를 포함하는, T-세포-MMP.
44. 실시형태 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드는 제2 MHC 폴리펩타이드와 적어도 하나의 야생형 또는 변이체 MOD 사이에 펩타이드 링커를 포함하는, T-세포-MMP.
45. 실시형태 2 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커는 5개의 아미노산 내지 30개의 아미노산(예를 들어, 5 내지 10, 10 내지 20, 또는 20 내지 30개의 아미노산) 길이를 갖는, T-세포-MMP.
46. 실시형태 45에 있어서, 상기 링커는 식 (AAAGG)n 또는 (GGGGS)n의 펩타이드이며, n은 1 내지 8(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 또는 1 내지 4, 3 내지 6, 또는 4 내지 8로부터 선택되는 범위)인, T-세포-MMP.
47. 실시형태 1 내지 46 중 임의의 하나에 있어서, 상기 제1 화학적 접합 부위 및 제2 화학적 접합 부위는:
a) 효소 변형 서열로서 작용하는 펩타이드 서열(예를 들어, 설파타제 모티프);
b) 비천연 아미노산 및/또는 셀레노시스테인;
c) 조작된 아미노산 화학적 접합 부위;
d) 탄수화물 또는 올리고당 모이어티; 및/또는
e) IgG 뉴클레오타이드 결합 부위
로부터 독립적으로 선택되는, T-세포-MMP.
48. 실시형태 1 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 및 제2 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 효소 변형 서열을 포함하는, T-세포-MMP.
49. 실시형태 48에 있어서, 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 또는 제2 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 설파타제 모티프인, T-세포-MMP.
50. 실시형태 49에 있어서, 상기 설파타제 모티프는 서열 X1Z1X2Z2X3Z3, X1(C/S) X2(P/A)X3Z3, X1CX2PX3Z3 또는 CX2PX3R을 포함하는, T-세포-MMP; 여기서
Z1은 시스테인 또는 세린이고;
Z2는 프롤린 또는 알라닌 잔기 중 하나이며;
Z3은 염기성 아미노산(알기닌, 라이신, 또는 히스티딘, 보통 라이신), 또는 지방족 아미노산(알라닌, 글리신, 류신, 발린, 아이소류신, 또는 프롤린, 보통 A, G, L, V 또는 I)이며;
X1은 존재하거나 없고, 존재한다면, 임의의 아미노산일 수 있지만, 보통 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성 비하전 아미노산(즉, 방향족 아미노산 또는 하전된 아미노산 이외), 보통 L, M, V, S 또는 T, 더 보통으로는 L, M, S 또는 V이고, 단, 설파타제 모티프가 표적 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고; 그리고
X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있지만, 보통은 지방족 아미노산, 극성, 비하전 아미노산 또는 황 함유 아미노산(즉, 방향조고 또는 하전된 아미노산 이외), 보통 S, T, A, V, G 또는 C, 더 보통으로는 S, T, A, V 또는 G이다.
51. 실시형태 50에 있어서, 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 fGly 아미노산 잔기를 포함하는, T-세포-MMP.
52. 실시형태 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 또는 제2 화학적 접합 부위는 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드의 C-말단에 위치된 아미노산 서열 LP(X5)TG, LP(X5)TG, LP(X5)TA, LP(X5)TGG, LP(X5)TAA, LPETGG 또는 LPETAA를 포함하는 솔타제 A 효소 부위이고, X5는 임의의 아미노산인, T-세포-MMP.
53. 실시형태 1 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 또는 제2 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드의 아미노 말단에서 적어도 하나의 올리고글리신(예를 들어, (G)2, 3, 4 또는 5), 및/또는 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드의 아미노 말단에서 적어도 하나의 올리고 알라닌(예를 들어, (A)2, 3, 4 또는 5)을 포함하는 솔타제 A 효소인, T-세포-MMP.
54. 실시형태 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 또는 제2 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 트랜스글루타미나제 부위인, T-세포-MMP.
55. 실시형태 54에 있어서, 하나 이상의 트랜스글루타미나제 부위 중 적어도 하나는: LQG, LLQGG, LLQG, LSLSQG, GGGLLQGG, GLLQG, LLQ, GSPLAQSHGG, GLLQGGG, GLLQGG, GLLQ, LLQLLQGA, LLQGA, LLQYQGA, LLQGSG, LLQYQG, LLQLLQG, SLLQG, LLQLQ, LLQLLQ, LLQGR, LLQGPP, LLQGPA, GGLLQGPP, GGLLQGA, LLQGPGK, LLQGPG, LLQGP, LLQP, LLQPGK, LLQAPGK, LLQGAPG, LLQGAP 및 LLQLQG로 이루어진 군으로부터 선택되는, T-세포-MMP.
56. 실시형태 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 또는 제2 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 하나 이상의 독립적으로 선택된 비천연 아미노산을 함유하는 셀레노시스테인 또는 아미노산 서열을 포함하는, T-세포-MMP.
57. 실시형태 56에 있어서, 상기 하나 이상의 비천연 아미노산 중 적어도 하나는 파라-아세틸페닐알라닌, 파라-아지도 페닐알라닌 및 프로핀일-타이로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는, T-세포-MMP.
58. 실시형태 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 및 제2 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 조작된 아미노산 부위를 포함하는, T-세포-MMP.
59. 실시형태 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 및 제2 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 하나 이상의 설프하이드릴 또는 아민기(예를 들어, 아미노산 잔기 2, 7, 84, 5, 59, 116, 139, 167, 168, 170 또는 171 중 임의의 하나 이상(2, 3, 4 등)에서의 시스테인 치환)을 포함하는, T-세포-MMP.
60. 실시형태 59에 있어서, 하나 이상의 설프하이드릴 또는 아민기 중 적어도 하나는 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에서 라이신 또는 시스테인의 존재로부터 초래되는, T-세포-MMP.
61. 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 또는 제2 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 독립적으로 선택된 탄수화물, 단당류, 이당류 및/또는 올리고당을 포함하는, T-세포-MMP.
62. 실시형태 1 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 또는 제2 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 하나 이상의 IgG 뉴클레오타이드 항체 결합 부위를 포함하는, T-세포-MMP.
63. 실시형태 1 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 에피토프(예를 들어, 에피토프 폴리펩타이드)를 더 포함하되; 상기 에피토프는 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위에서, 또는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위에서 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에 직접적으로, 또는 스페이서 또는 링커를 통해 간접적으로 접합되어(공유적으로 부착되어), T-세포-MMP-에피토프 접합체를 형성하는, T-세포-MMP.
64. 실시형태 63에 있어서, 하나 이상의 MOD 중 적어도 하나는 변이체 MOD인, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
65. 실시형태 63 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 에피토프는 링커 또는 스페이서에 의해 제1 또는 제2 펩타이드 화학적 접합 부위에 간접적으로 공유적으로 결합되는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
66. 실시형태 63 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 에피토프는 펩타이드 또는 비펩타이드 중합체로부터 선택되는 링커를 통해 접합되는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
67. 실시형태 66에 있어서, 상기 링커는 글리신 중합체(G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, GGSG), (GGSGG), (GSGSG), (GSGGG)n, (GGGSG)n, (GSSSG)n, 및 (GGGGS)n을 포함함), 글리신-알라닌 중합체, 예컨대 (AAAGG)n, 알라닌-세린 중합체, 및 시스테인 함유 링커, 예컨대 GCGGS(G4S)n GCGASGGGGSGGGGS, GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS 또는 GCGGSGGGGSGGGGS(여기서, n은 적어도 1의 정수임(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임))를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 10개의 아미노산 내지 30개의 아미노산(예를 들어, 10 내지 20 또는 20 내지 30개의 아미노산)의 길이를 갖는 펩타이드인, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
68. 실시형태 67에 있어서, 상기 링커는 식 (AAAGG)n 또는 (GGGGS)n의 펩타이드이며, n은 1 내지 8(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 또는 1 내지 4, 3 내지 6, 또는 4 내지 8로부터 선택되는 범위)인, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
69. 실시형태 63 내지 68 중 어느 하나에 있어서,
(a) T-세포-MMP가 제2 T-세포에 결합하는 친화도보다 적어도 25% 더 높은(1.25배 더 높은) 친화도로 T-세포-MMP-에피토프 접합체가 제1 T-세포에 결합하되,
제1 T-세포가 이의 표면 상에서 적어도 10-7 M(예를 들어, 10-8 또는 10-9 M)의 친화도로 에피토프에 결합하는 Co-MOD 및 TCR을 발현시키고,
제2 T-세포가 이의 표면 상에서 Co-MOD를 발현시키지만, 이의 표면 상에서 적어도 10-7 M의 친화도(예를 들어, 10-7 M 미만의 친화도, 예컨대 10-6 또는 10-5 M)로 에피토프에 결합하는 TCR을 발현시키지 않거나; 또는
(b) T-세포-MMP-에피토프 접합체는 제2 T-세포에 결합하는 친화도보다 적어도 10%(예를 들어, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%), 또는 적어도 2배 (e.g., 적어도 2.5배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 또는 100배 초과) 더 높은 친화도로 제1 T-세포에 결합하되,
제1 T-세포는 i) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프에 특이적인 TCR, 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 MOD에 결합하는 Co-MOD 둘 다를 나타내고,
제2 T-세포는 i) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프 이외의 에피토프 특이적인 TCR; 및 ii) T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 MOD에 결합하는 Co-MOD 둘 다를 나타내는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
70. 실시형태 63 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 변이체 MOD를 포함하되, 하나 이상의 MOD는 생물층 간섭계에 의해 측정할 때 Co-MOD에 대한 대응하는 야생형 MOD의 친화도에 비해 Co-MOD에 대해 감소된 친화도(예를 들어, Co-MOD에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체(대조군이 야생형 MOD를 포함하는 경우)의 결합 친화도 대 ii) BLI에 의해 측정할 때(상기 기재한 바와 같이), 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 500:1, 적어도 102:1, 적어도 5×102:1, 적어도 103:1, 적어도 5×103:1, 적어도 104:1, 적어도 105:1, 또는 적어도 106:1인 Co-MOD에 대한 야생형 MOD의 변이체를 포함하는 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도의 비)를 나타내는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
71. 실시형태 63 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 에피토프는 암 에피토프, 바이러스 에피토프 또는 자가에피토프(autoepitope)인, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
72. 실시형태 63 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 에피토프는 HPV CMV 또는 HBV 에피토프로부터 선택되는 바이러스 에피토프인, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
73. 실시형태 63 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 상기 에피토프는 4개의 아미노산(aa), 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa 또는 20 aa의 펩타이드 길이인, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
74. 실시형태 63 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 에피토프는 솔타제, 설파타제 또는 트랜스글루타미나제 부위에서 접합되는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
75. 실시형태 63 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 상기 에피토프는 비천연 아미노산 또는 셀레노시스테인을 통해 접합되는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
76. 실시형태 63 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 상기 에피토프는 조작된 아미노산을 통해 접합되는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
77. 실시형태 63 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제1 및/또는 제2 화학적 접합 부위에 직접적으로 또는 스페이서 또는 링커를 통해 간접적으로 공유 결합된 하나 이상의 독립적으로 선택되는 페이로드를 더 포함하되, 스페이서 또는 링커는 (예를 들어, 포유류 세포의 엔도솜에서) 선택적으로 절단 가능한, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
78. 실시형태 77에 있어서, 상기 페이로드는 하나 이상의 독립적으로 선택된 생물학적으로 활성제 또는 약물, 진단제 또는 표지, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 유사체, 핵산 또는 합성 핵산, 또는 독소, 리포좀(예를 들어, 5-플루오로데옥시유리딘과 같은 약물을 혼입), 나노입자 또는 이들의 조합을 포함하는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
79. 실시형태 77에 있어서, 페이로드는 치료제(예를 들어, 약물 또는 프로드러그), 화학치료제, 세포독성제, 항생제, 항바이러스제, 세포 주기 동기화제, 세포 표면 수용체(들)에 대한 리간드, 면역조절제(예를 들어, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린), 프로-세포자멸사제, 항-신생혈관제, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 단백질 또는 폴리펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 효소, 프로효소(proenzyme), 호르몬 또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1종 이상의 활성제 생물학적 활성제 또는 약물로부터 선택되는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
80. 실시형태 77에 있어서, 광검출 가능한 표지(예를 들어, 염료, 형광 표지, 인광 표지, 발광 표지) 및 방사성 표지, 영상화제, 조영제, 상자성 표지, 초음파 표지 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 1종 이상의 진단제 또는 표제로부터 선택되는 페이로드를 포함하는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
81. 실시형태 77에 있어서, 단일 또는 이중 가닥 DNA, 단일 또는 이중 가닥 RNA, DNA/RNA 혼성체, 리보자임, siRNA, 안티센스 RNA, cDNA, 구체 핵산 및 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 핵산 또는 합성 핵산으로부터 선택되는 페이로드를 포함하는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
82. 실시형태 77에 있어서, 마이셀, 금속 나노입자(예를 들어, 금 나노입자) 및 비금속 나노입자로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 리포좀 및/또는 나노입자로부터 선택되는 페이로드를 포함하며, 이들 중 어느 것 또는 모두는 핵산 및 또는 단백질에 접합될 수 있는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
83. 실시형태 77에 있어서, 상기 페이로드는 링커를 통해 접합되며, 1 내지 20(예를 들어, 1 내지 2, 2 내지 4, 5 내지 10 또는 10 내지 20)개의 독립적으로 선택된 알파, 베타, 델타, 감마 아미노산 또는 이들의 조합을 갖거나; 또는 링커는 식 폴리-글리신 폴리-알라닌, 무작위 폴리 글리신/알라닌 공중합체 또는 폴리(GGGGS)n의 펩타이드이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8인, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
84. 실시형태 77에 있어서, 페이로드는 스페이서에 의해 화학적 접합 부위에 부착되되, 스페이서는 단일 또는 이중 결합, 이황화결합, 탄소-산소 결합, 탈소 질소 결합 또는 이들의 조합, T-세포-MMP-에피토프 접합체에 의해 결합되는 2개 이상의 탄소 원자를 포함하는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
85. 실시형태 77에 있어서, 페이로드는 스페이서에 의해 화학적 접합 부위에 부착되되, 스페이서는 동종작용성(예를 들어, 동종2작용성) 가교제 또는 헤테로작용성(예를 들어, 헤테로2작용성) 가교제의 작용으로부터 초래되는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
86. 실시형태 77 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 페이로드는 링커에 의해 결합되고, 인간 T-세포 엔도솜 내에서 링커 또는 스페이서의 절단에 의해, 또는 과량의 티올 환원제(예를 들어, 다이티오트레이톨, DTT)를 이용하는 환원에 의해 T-세포-MMP로부터 제거될 수 있는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
87. 실시형태 63 내지 85 중 어느 하나의 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 포함하는 조성물.
88. 조성물로서,
a) 실시형태 63 내지 87 중 어느 하나의 T-세포-MMP-에피토프 접합체; 및
b) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 조성물.
89. 개체에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 개체에게 유효량의 실시형태 63 내지 87 중 어느 하나의 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
90. 시험관내에서 또는 생체내에서 개체에게 에피토프-선택적 또는 에피토프-선택적/특이적 방식으로 표적 T-세포(예를 들어, 조절 T-세포 또는 세포독성 T-세포)에 대한 면역조절 폴리펩타이드(MOD)를 전달하는 방법으로서,
실시형태 63 내지 86 중 어느 하나의 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 시험관내에서 T-세포와 접촉시키는 단계, 또는
실시형태 63 내지 86 중 어느 하나의 T-세포-MMP-에피토프 접합체 또는 실시형태 87 내지 88 중 어느 하나의 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되,
표적 T-세포는 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 에피토프에 특이적인, 방법.
91. 실시형태 90에 있어서, 상기 MOD는 야생형이거나 IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD70, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, ICAM 또는 PD-L2 폴리펩타이드로부터 선택되는 변이체 MOD인, 방법.
92. 실시형태 89 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 상기 개체는 인간인, 방법.
93. 실시형태 89 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 상기 조절하는 단계는 암 세포에 대한 세포독성 T-세포 반응을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
94. 실시형태 89 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 조절하는 단계는 자가항원에 대한 T-세포 반응을 감소시키는 것을 포함하는, 방법.
95. 실시형태 89 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여하는 단계는 직장, 비강, 경구 및 다른 장용 및/또는 비경구 투여 경로인, 방법.
96. 실시형태 89 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여하는 단계는 종양내, 종양주위, 근육내, 기관내, 두개내, 피하, 림프내, 진피내, 국소, 정맥내 및/또는 동맥내인, 방법.
97. 실시형태 1 내지 62 중 어느 하나의 T-세포-MMP의 제1 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산.
98. 실시형태 97에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 제1 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되고, 제2 폴리펩타이드는 제2 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되며, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 단일 핵산(예를 들어, 플라스미드)에 존재하는, 하나 이상의 핵산.
99. 실시형태 97 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결되는, 하나 이상의 핵산.
100. 실시형태 97에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드는 제1 핵산(예를 들어, 제1 플라스미드)에 존재하는 제1 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되고, 상기 제2 폴리펩타이드는 제2 핵산(예를 들어, 제2 플라스미드)에 존재하는 제2 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는, 하나 이상의 핵산.
101. 실시형태 98 또는 100 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 제1 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결되고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 제2 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결된, 하나 이상의 핵산.
102. 실시형태 97 내지 101 중 어느 하나의 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물.
103. 실시형태 1 내지 62 중 어느 하나의 T-세포-MMP의 제조 방법으로서, 상기 방법은 하기를 포함하는, 방법:
a) 제1 MHC 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 제2 MHC 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 및 하나 이상의 독립적으로 선택된 MODS를 암호화하는 핵산(들), 및 선택적으로 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드, 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드, 및/또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 중 임의의 하나 이상을 암호화하는 핵산을 제공하는 단계;
b) 하기 단계 i 및 ii를 임의의 순서로 수행하는 단계로서, 해당 단계들은:
i) 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD를 암호화하는 핵산(들) 이외의 제공된 핵산 중 하나에 하나 이상의 화학적 접합 부위를 포함하도록(암호 서열 내로 조작된) 제공된 핵산 중 적어도 하나를 변형시키는 단계; 및
ii) 제공된 핵산을 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산에 혼입시키는 단계
를 포함하는, 상기 수행하는 단계;
c) 제1 핵산 및 제2 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 발현시켜 T-세포-MMP를 얻어서 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 얻는 단계.
104. 실시형태 103에 있어서, 상기 하나 이상의 화학적 접합 부위는 효소 변형 서열, 비천연 아미노산 및/또는 셀레노시스테인, 조작된 아미노산 화학적 접합 부위; IgG 뉴클레오타이드 결합 부위로서 작용하는 펩타이드 서열로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
105. 실시형태 104에 있어서, 제공된 핵산 중 적어도 하나를 변형시키는 것은 MOD(들)를 암호화하는 핵산(들) 이외의 제공된 핵산 중 하나 이상을 변형시켜, 야생형 제1 MHC 폴리펩타이드, 제2 MHC 폴리펩타이드, MOD의 펩타이드 서열이 존재하지 않는 위치에서, 또는 임의의 선택적 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드, 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드, 또는 링커에서 천연 유래 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 서열로서 암호화하는 것을 포함하는, 방법.
106. 실시형태 103 내지 105 중 어느 하나에 있어서,
a) 반응기를 보유하는 에피토프 펩타이드, 또는 반응기를 보유하는 선택적 링커에 접합된 에피토프 펩타이드를 제공하는 단계;
b) 공유 결합이 반응기와 화학적 접합 부위 사이에 형성되는 조건 하에 에피토프 펩타이드, 또는 선택적 링커에 접합된 에피토프 펩타이드를 실시형태 103 내지 105 중 어느 하나의 T-세포-MMP와 접촉시킴으로써;
T-세포-MMP-에피토프 접합체를 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
107. 실시형태 106에 있어서, 공유 결합은 반응기와 제1 MHC 폴리펩타이드 내 화학적 접합 부위 또는 제1 MHC 폴리펩타이드에 부착된 링커 사이에 선택적으로 형성된, 방법.
108. 실시형태 107에 있어서, 상기 제1 MHC 폴리펩타이드는 N-말단에 부착된 선택적 펩타이드 링커를 갖는 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
109. 실시형태 108에 있어서, 상기 β2M 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드의 N-말단에 있는, 방법.
110. 실시형태 103 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 반응기를 보유하는 페이로드를 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체와 접촉시켜 T-세포-MMP 또는 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 페이로드 접합체를 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
111. 실시형태 63 내지 86 중 어느 하나에 있어서, T-세포-MMP-에피토프를 생성하도록 에피토프가 공유 결합된 화학적 접합 부위는:
도 2a 내지 도 2G의 Fc 폴리펩타이드 서열;
도 3A 내지 도 3D의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드 서열; 또는
도 4의 β-2 마이크로글로불린 폴리펩타이드 서열
에 대해 100% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열에 위치되지 않는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
112. 실시형태 63 내지 86 중 어느 하나에 있어서, T-세포-MMP-에피토프를 생성하도록 에피토프가 공유 결합된 화학적 접합 부위는:
도 2a 내지 도 2G의 Fc 폴리펩타이드 서열;
도 3A 내지 도 3D의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드 서열; 또는
도 4의 β-2 마이크로글로불린 폴리펩타이드 서열
중 임의의 부분에 대해 100% 아미노산 동일성을 갖는 10, 20, 30, 40 또는 50개의 아미노산 길이 서열에 위치되지 않는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
113. 실시형태 63 내지 86 중 어느 하나에 있어서, T-세포-MMP-에피토프를 생성하도록 에피토프가 공유 결합된 화학적 접합 부위는:
도 2a 내지 도 2G의 Fc 폴리펩타이드;
도 3A 내지 도 3D의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드; 또는
도 4의 β-2 마이크로글로불린 폴리펩타이드 서열
중 임의의 부분에 대해 100% 아미노산 동일성을 갖는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 70개의 아미노산 길이 서열에 나타나는 아미노산이 아닌, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
114. 실시형태 63 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 에피토프가 공유 결합되어 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 생성하는 화학적 접합 부위는:
도 2a 내지 도 2G의 Fc 폴리펩타이드 서열;
도 3A 내지 도 3D의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드 서열; 또는
도 4의 β-2 마이크로글로불린 폴리펩타이드 서열
중 임의의 하나의 임의의 부분에 대해 100% 아미노산 동일성을 갖는 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 70개의 아미노산 길이 서열에 위치된 라이신, 시스테인, 세린, 트레오닌, 알기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴 또는 글루타민이 아닌, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
115. 폴리펩타이드로서,
N-말단 및 C-말단을 갖는 성숙 β2M 폴리펩타이드 서열(신호 서열을 결여함);
선택적 링커; 및
성숙 β2M 폴리펩타이드의 서열 내의 또는 선택적 링커를 통해 성숙 β2M 폴리펩타이드에 부착된 하나 이상의 화학적 접합 부위를 포함하는, 폴리펩타이드.
116. 실시형태 115에 있어서, 상기 성숙 β2M 폴리펩타이드는 도 4에 제공된 성숙 β2M의 서열에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성, 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며; 도 4에서 β2M 폴리펩타이드와 대응하는 서열 사이의 동일성은 첨가된 설파타제 모티프 및 존재하는 임의의 선택적 링커 서열을 고려하지 않고 결정되는, 폴리펩타이드.
117. 실시형태 115 또는 116에 있어서, 상기 β2M 폴리펩타이드 서열은 도 4에 제시된 아미노산 서열 중 하나의 적어도 일부를 갖는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 99개의 인접한 아미노산의 서열(예를 들어, 도 4에 제시된 신호 서열을 결여하는 성숙 β2M의 서열에 대해 동일성을 갖는 20 내지 99, 20 내지 40, 30 내지 50, 40 내지 60, 40 내지 90, 50 내지 70, 60 내지 80, 60 내지 99, 70 내지 90, 또는 79 내지 99개의 인접한 아미노산을 갖는 서열)을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진, 폴리펩타이드.
118. 실시형태 115 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 β2M 폴리펩타이드 서열은 성숙 β2M 폴리펩타이드 서열의 10, 11, 12, 13 또는 14번 아미노산 위치 중 1, 2개 이상에서 시스테인을 포함하는, 폴리펩타이드.
119. 실시형태 118에 있어서, β2M 폴리펩타이드 서열의 처음 12개의 아미노산은 IQRTPKIQVYSC인, 폴리펩타이드.
120. 실시형태 115 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 상기 설파타제 모티프는 서열 X1Z1X2Z2X3Z3, X1(C/S) X2(P/A)X3Z3, X1CX2PX3Z3 또는 CX2PX3R을 포함하는, 폴리펩타이드; 여기서
Z1은 시스테인 또는 세린이고;
Z2는 프롤린 또는 알라닌 잔기 중 하나이며;
Z3은 염기성 아미노산(알기닌, 라이신, 또는 히스티딘, 보통 라이신), 또는 지방족 아미노산(알라닌, 글리신, 류신, 발린, 아이소류신, 또는 프롤린, 보통 A, G, L, V 또는 I)이며;
X1은 존재하거나 없고, 존재한다면, 임의의 아미노산일 수 있지만, 보통 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성 비하전 아미노산(즉, 방향족 아미노산 또는 하전된 아미노산 이외), 보통 L, M, V, S 또는 T, 더 보통으로는 L, M, S 또는 V이고, 단, 설파타제 모티프가 표적 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고; 그리고
X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있지만, 보통은 지방족 아미노산, 극성, 비하전 아미노산 또는 황 함유 아미노산(즉, 방향조고 또는 하전된 아미노산 이외), 보통 S, T, A, V, G 또는 C, 더 보통으로는 S, T, A, V 또는 G이다.
121. 실시형태 115 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 상기 설파타제 모티프는 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 β2M 폴리펩타이드 서열의 N-말단에 연결되는, 폴리펩타이드.
122. 실시형태 115 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 신호 서열, 또는 신호 서열 및 링커를 더 포함하되, 상기 신호 서열은 폴리펩타이드의 아미노 말단의 대부분의 요소인, 폴리펩타이드.
123. 실시형태 115 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 상기 임의의 하나 이상의 링커는 독립적으로 선택된 폴리펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진, 폴리펩타이드.
124. 실시형태 123에 있어서, 링커 중 임의의 하나 이상은 식 (AAAGG)n 또는 (GGGGS)n으로부터 독립적으로 선택되며, n은 1 내지 8(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 또는 1 내지 4, 3 내지 6, 또는 4 내지 8로부터 선택된 범위)인, 폴리펩타이드.
125. 실시형태 123에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기 서열을 갖는, 폴리펩타이드:
Figure pct00093
또는 서열
Figure pct00094
126. 실시형태 115 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 설파타제 모티프의 세린 또는 시스테인은 fGly(폼일글리신) 잔기로 전환된, 폴리펩타이드.
127. 실시형태 126에 있어서, fGly 잔기와의 화학적 반응(예를 들어, 티오세미카바자이드, 아미노옥시, 하이드라자이드 또는 하이드라지노 변형된 에피토프 폴리펩타이드와 fGly의 알데하이드의 반응)을 통해 폴리펩타이드에 공유결합된 에피토프를 더 포함하는, 폴리펩타이드.
128. 실시형태 127에 있어서, 상기 에피토프는 fGly 잔기의 알데하이드와의 반응을 위한 하이드라진일 인돌기를 포함하는, 폴리펩타이드.
129. 실시형태 127 또는 128에 있어서, 상기 에피토프는 폴리펩타이드 에피토프인, 폴리펩타이드.
130. 실시형태 115 내지 129 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물.
131. 실시형태 127 내지 129 중 어느 하나의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
132. N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로:
성숙 MHC 클래스 1 중쇄 폴리펩타이드 서열(신호 서열을 결여);
선택적 링커; 및
면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드
를 포함하는, 폴리펩타이드.
133. 실시형태 132에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 도 3D에 제공된 서열에 대해 적어도 85%(예를 들어, 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성, 또는 심지어 100%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 갖고; 도 3D의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드와 대응하는 서열 사이의 동일성은 (Ig) Fc 폴리펩타이드 및 존재하는 임의의 선택적 링커와 상관없이 결정되는, 폴리펩타이드.
134. 실시형태 132 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는 도 3D에 제시된 아미노산 서열 중 하나의 적어도 일부와의 동일성을 갖는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 인접한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진(예를 들어, 도 3D에 제시된 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드의 서열에 대해 동일성을 갖는 20 내지 100, 20 내지 40, 30 내지 50, 40 내지 60, 40 내지 90, 50 내지 70, 60 내지 80, 60 내지 90, 70 내지 90 또는 80 내지 100개의 인접한 아미노산을 갖는 서열), 폴리펩타이드.
135. 실시형태 134에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는:
i) 약 아미노산 79번 위치 내지 약 아미노산 89번 위치의 서열;
ii) 약 아미노산 134번 위치 내지 약 아미노산 144번 위치의 서열; 및
iii) 도 3D에 제시된 MHC 클래스 I 중쇄 서열의 약 아미노산 231번 위치 내지 약 아미노산 241번 위치의 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
136. 실시형태 135에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드는:
i) 약 아미노산 79번 위치 내지 약 아미노산 89번 위치의 서열; 및
ii) 약 아미노산 134번 위치 내지 약 아미노산 144번 위치의 서열
을 포함하되,
83, 84, 또는 85번 중 하나의 위치가 138, 139 또는 140번 위치 중 하나에서 치환된 시스테인을 갖는 쇄내 이황화결합을 형성하는 시스테인으로 치환되는, 폴리펩타이드.
137. 실시형태 135 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 도 3D에 제시된 MHC 클래스 I 중쇄 서열의 약 아미노산 231번 위치 내지 약 아미노산 241번 위치의 MHC 클래스 I 중쇄 폴리펩타이드 서열을 포함하되, 235, 236 또는 237번 위치 중 하나는 시스테인으로 치환된, 폴리펩타이드.
138. 실시형태 132 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 링커 중 임의의 하나 이상은 식 (AAAGG)n 또는 (GGGGS)n으로부터 독립적으로 선택되며, n은 1 내지 8(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 또는 1 내지 4, 3 내지 6, 또는 4 내지 8로부터 선택된 범위)인, 폴리펩타이드.
139. 실시형태 137에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기 서열을 갖는, 폴리펩타이드:
Figure pct00095
.
140. 실시형태 132 내지 139 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물.
141. 실시형태 132 내지 139 중 어느 하나의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
142. T-세포-MMP-에피토프 접합체의 제조 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는, 방법:
a) T-세포-MMP의 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 내로 화학적 접합 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 혼입시켜, 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 및/또는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위를 도입하는 단계;
b) 핵산을 세포 내로 도입하여 T-세포-MMP를 발현시키고 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위를 갖는 T-세포-MMP를 얻으며, 선택적으로 T-세포-MMP를 (부분적으로 또는 완전히) 정제하는 단계;
c) 화학적 접합 부위(들)가 효소적 활성화 또는 화학적 전환을 필요로 하는 경우, 화학적 접합 부위(들)를 (예를 들어, 효소를 이용하여) 활성화 또는 전환시키는 단계; 및
d) 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위와 에피토프(또는 에피토프에 부착된 링커) 사이의 공유 결합을 야기하는 데 적합한 반응 조건 하에(예를 들어, 효소 또는 촉매의 존재 하에) 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 및/또는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위를 갖는 T-세포-MMP를 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위 및/또는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위와의 반응을 겪을 수 있는 에피토프(또는 부착된 링커를 갖는 에피토프)와 접촉시켜 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 생성하는 단계.
143. 실시형태 142에 있어서, 화학적 접합 부위는 설파타제 모티프(예를 들어, 식 (I) 또는 (II), 예컨대 X1CX2PX3Z3; CX1PX2Z3의 설파타제 모티프)인, 방법.
144. 실시형태 143에 있어서, 상기 세포는:
i) FGE를 발현시키고, 설파타제 모티프의 세린 또는 시스테인을 FGly로 전환시키거나, 또는
ii) 설파타제 모티프의 세린 또는 시스테인을 FGly으로 전환시키는 FGE를 발현시키지 않고, 상기 방법은 설파타제 모티프의 세린 또는 시스테인을 FGly으로 전환시키는 FGE와 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위를 갖는 T-세포-MMP를 접촉시키는 단계를 더 포함하고; 그리고
iii) FGly의 알데하이드와 에피토프 사이에 공유 결합을 형성하는 기에 의해 작용기화된 에피토프와 FGly-함유 폴리펩타이드를 접촉시킴으로써,
T-세포-MMP-에피토프 접합체를 형성하는, 방법
XII. 실시예
실시예 1. 폼일 글리신(fGly) 화학적 접합 부위를 갖는 T-세포-MMP의 제조.
본 예언적 실시예는 fGly 화학적 접합 부위를 함유하는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 갖는 T-세포-MMP의 제조를 제공하며, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 함께 취해져서 에피토프 내로 접합될 수 있는 T-세포-MMP를 형성한다.
폴리아데닐화 및 정지 코돈과 함께 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA 분자의 발현을 유도하기 위한 구성적 또는 유도성 프로모터 요소를 포함하는 발현 카세트에서 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 암호 서열을 조립함으로써 폴리펩타이드를 제조한다. 발현 카세트는 적합한 세포주(예를 들어, CHO, HEK, Vero, COS, 효모 등)로부터의 일시적 발현을 위해 별개의 벡터(플라스미드, 바이러스 등) 또는 단일 벡터에 조립된다. 대안적으로, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 구성적 또는 유도된 발현을 위해 조립된 카세트를 이러한 세포 내로 안정하게 통합시킨다.
이하에 기재하는 T-세포-MMP 폴리펩타이드의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드에 나타낸 링커는 선택적이다. 존재한다면, 링커는 아미노산 서열(예를 들어, 1 내지 50개의 아미노산, 예컨대 AAAGG(서열번호 75) 또는 (GGGGS)n(여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10(서열번호 76))이다. 하나 초과의 링커 서열이 나타난 경우, 각각의 위치에 대해 선택된 링커 서열은 링커가 나타나는 임의의 다른 부위 이외에 선택된 링커 서열과 동일하거나 상이할 수 있다.
1A. 제1 폴리펩타이드
본 실시예의 제1 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단까지 a) 리더 서열, b) fGly 화학적 결합 부위를 도입하는 설파타제 모티프, c) 선택적 링커, 및 d) β2M 폴리펩타이드를 포함한다. FGE의 작용 후에 제1 펩타이드는 폼일글리신(fGly) 잔기로 전환되는 모티프에서 시스테인을 가진다. 따라서, mRNA는 전체 서열(fGly 잔기를 생성하기 위해 리더 서열 제거 및 FGE 작용 전을 나타냄)을 갖는 제1 폴리펩타이드를 암호화한다:
Figure pct00096
상기 언급한 제1 폴리펩타이드 내에서, 서열 MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167)은 신호 서열로서 작용하고 폴리펩타이드의 성숙 동안 세포 가공 동안에 제거된다. 설파타제 모티프(X1, Z1, X2, Z2, X3 및 Z3)의 잔기를 상기 부문 I.A에 기재되어 있다. 이러한 제1 폴리펩타이드의 맵을 도 9의 A부분에 나타내며, 설파타제 모티프(LCTPSR)는 링커가 모티프 전에 그리고/또는 후에 놓일 수 있다는 것을 강조하기 위해 G4S (GGGGS) 서열번호 76 내에 나타낸다. 맵은 또한 알기닌을 시스테인으로 바꾸는 β2M 폴리펩타이드 내 12번 위치에서의 잠재적 아미노산 치환(R12C) 위치를 나타낸다. 이하의 맵은 리더 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드에 대한 예시적인 펩타이드 서열을 나타낸다. β2M 폴리펩타이드는 이탤릭체이면서 볼드체로 나타내고, 설파타제 서열(LCTPSR)은 볼드체로 나타낸다.
1B. 제2 폴리펩타이드
본 실시예의 제2 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 C-말단까지 a) 리더 서열, b) MOD 폴리펩타이드(들), c) 선택적 링커, d) MHC 클래스 1 중쇄 폴리펩타이드, e) 선택적 링커, 및 f) 면역글로불린 Fc 영역을 포함한다.
mRNA는 전체 구조: 신호 서열-링커-IL2 폴리펩타이드-링커-IL2 폴리펩타이드-MHC 클래스 1 중쇄 폴리펩타이드-링커-면역글로불린 중쇄 Fc 폴리펩타이드를 갖는, 제2 폴리펩타이드를 암호화하며, 여기서 신호 서열은 인간 IL2 신호 서열이다. 이러한 제2 폴리펩타이드의 맵을 도 9, B 부분에 나타내며, 여기서 폴리펩타이드는 신호 서열 MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168), 4개의 G4S (GGGGS) 반복부를 갖는 링커(서열번호 76)에 의해 분리되는 인간 IL2 MOD의 반복부(볼드체로 나타냄)를 함유한다. 폴리펩타이드는 또한 인간 HLA-A 폴리펩타이드(볼드체 및 이탤릭체로 나타냄) 및 인간 IgG1 Fc 폴리펩타이드를 함유한다. Y84C, A139C 및 A236C 시스테인 치환 위치를 포함하는 잠재적 아미노산 치환 위치를 맵 아래에 나타낸다. Y84C 및 A139C 치환은 HLA α1 나선의 카복실 말단 근처의 영역과 HLA α2-1 나선의 아미노 말단 근처의 영역 사이에 형성되는 이황화결합 안정화를 가능하게 한다. A236C 치환으로부터 초래되는 시스테인은 제1 폴리펩타이드에서 β2M 폴리펩타이드의, 예를 들어, 12번 위치에서의 시스테인과 쇄간 이황화결합을 형성할 수 있다. 이하의 맵은 리더 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드에 대한 예시적인 펩타이드 서열을 나타낸다.
1C. 제1 제2 폴리펩타이드의 발현 및 성숙
상기 나타낸 바와 같이, 적합한 세포주(예를 들어, 진핵 또는 포유류 세포주)에서 일시적 또는 안정한 발현에 의해 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 제조한다. 세포 내 가공은 신호 서열을 제거하며, 폴리펩타이드 발현을 위해 사용되는 세포가 또한 설파타제 모티프의 시스테인 또는 세린을 폼일글리신(fGly) 잔기로 전환시킬 수 있는 FGE를 발현시킬 때 fGly 잔기를 형성한다.
T-세포-MMP는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 및 결합된(비공유 결합된) 에피토프 또는 무효 폴리펩타이드를 포함하는 복합체로서 세포에 의해 가공될 수 있다. α1 나선의 카복실 말단 영역과 α2-1 나선의 아미노 말단 영역 사이의 HLA 중쇄 폴리펩타이드에서 이황화결합의 도입은 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드와 결합된 에피토프 폴리펩타이드의 부재 하에서의 발현을 가능하게 한다. 추가로, T-세포-MMP 복합체가 막 고정 영역을 함유하지 않기 때문에, 복합체는 가용성 형태로 발현 세포로부터 방출된다.
발현된 T-세포-MMP의 적합한 수준이 달성된 후에 발현된 T-세포-MMP를 함유하는 세포 배양 배지를 수집한다. 발현을 위해 사용한 세포가 FGE 활성을 갖지 않은 경우에, 설파타제 모티프에서 fGly 잔기를 형성할 수 있는 FGE로 T-세포-MMP를 처리한다. T-세포-MMP 형태의 단리 및 농축은, 예를 들어, 복합체의 제1 폴리펩타이드의 아미노 말단에서 또는 아미노 말단 부근에서 fGly 화학적 접합 부위를 갖는 정제된 T-세포-MMP를 생성하는 크로마토그래피 방법을 이용하여 수행한다. 얻어진 T-세포-MMP는 도 5, B 부분에 나타낸 일반적 구조를 가지며, 제1 폴리펩타이드에서 MHC-1은 β2M 폴리펩타이드이고, 제2 폴리펩타이드 "MOD"는 IL2 폴리펩타이드의 쌍이며, MHC-2는 HLA-A 폴리펩타이드이고, Fc는 IGg1 중쇄 불변 영역이다. 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 사이의 이황화결합은 β2M 폴리펩타이드 R12C 및 HLA-A A236C 치환으로부터 생긴 시스테인으로부터 초래된다.
실시예 2. T-세포-MMP-에피토프 접합체의 제조
에피토프 폴리펩타이드는 에피토프 펩타이드 상에 T-세포-MMP에서 fGly 알데하이드와 반응할 수 있는 기를 형성함으로써 실시예 1에 제조된 fGly 폴리펩타이드에 접합된다. 티오세미카바자이드, 아미노옥시, 하이드라자이드 또는 하이드라지노 알데하이드 반응기가 이용될 수 있지만, 본 실시예는 인돌에 부착된 하이드라진일기의 사용에 의해 예시하며, 여기서 에피토프 펩타이드(도 8의 R)는 인돌 고리의 질소에 직접적으로 또는 간접적으로 공유결합된다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 하이드라진일 인돌의 특정 구조에 따라서, 에피토프 펩타이드(R)를 T-세포-MMP의 fGly 함유 폴리펩타이드(원형 표시한 폴리펩타이드)와 접촉시키는 것은 T-세포-MMP를 초래하며, 에피토프는 삼환식기의 형성을 통해 공유결합되어, T-세포-MMP-에피토프 접합체를 형성한다. 접합체는 도 6의 실시형태 B의 일반화된 구조를 가지며, 에피토프와 β2M 폴리펩타이드를 공유적으로 연결하는 삼환식기는 나타내지 않는다.
실시예 3. HBV 에피토프에 접합된 T-세포-MMP
T-세포-MMP 복합체를 생성하게 할 수 있는 T-세포-MMP 작제물의 비제한적 예는 도 10A 내지 도 10D 및 도 11A 내지 도 11E에 도시하는 것을 포함하였다. 특정 복합체에 의해 예시하지만, 도 10으로부터의 펩타이드 및 도 11로부터의 펩타이드의 임의의 조합을 사용하여 T-세포-MMP 복합체를 형성하기 위해 에피토프 펩타이드에 접합될 수 있는 T-세포-MMP를 사용할 수 있다. 도 10에 나타낸 펩타이드 각각은 인간 IL-2 서열; HLA-A 중쇄 서열 및 IgG 스캐폴드를 구성하는 아미노산을 함유한다. HLA-A 서열은 상기 기재한 바와 같이 쇄내 안정화 이황화결합을 형성하는 아미노산 89 및 139번의 시스테인, 및 다음에 기재하는 폴리펩타이드를 함유하는 β2M과의 쇄간 이황화결합을 형성할 수 있는 아미노산 236번에서의 시스테인의 혼입에 의해 안정화된다. 각각의 예에서, 도 11에 나타낸 폴리펩타이드는 쇄간 이황화결합 형성을 위한 12번 위치에서의 시스테인 치환 및 선택적 링커에 의해 측접되는 설파타제 모티프(서열번호 45): (링커)0-4-X1Z1X2Z2X3Z3-(링커)0-4를 갖는 β2M 서열을 함유한다. LCTPSR과 같은 설파타제 아미노산 서열을 포함하도록 상기 기재한 바와 같이(예를 들어, 실시예 1 및 2에서와 같이) 설파타제 모티프 아미노산을 선택할 수 있다. 설파타제 모티프의 아미노 및 카복실측 상의 링커는 독립적으로 선택되고, 존재할 때, 임의의 목적하는 아미노산 서열, 예컨대 GGGGS의 1 내지 4개의 반복부(서열번호 76)일 수 있다. 예를 들어, 포유류 세포에서의 발현은 HLA-A 중쇄 및 설파타제 및 β2M 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 T-세포-MMP 복합체의 형성을 초래한다. 에피토프 펩타이드, 예컨대 HBV 에피토프 펩타이드는: LIMPARFYPK(서열번호 91); AIMPARFYPK (서열번호 92); YVNVNMGLK(서열번호 93); FLPSDFFPSV(서열번호 84); STLPETTVV (서열번호 90)로부터 선택되거나; 또는 HBV 에피토프의 표에 열거된 다른 HBV 에피토프는 설파타제 모티프 내 폼일 글리신의 형성 다음에 적절하게 변형된 펩타이드(예를 들어, 카복실 말단에서 또는 근처에서 하이드라진일 인돌과 같은 티오세미카바자이드, 아미노옥시, 하이드라자이드, 또는 하이드라지노기를 보유하는 펩타이드)에 폼일기를 접합시킴으로써 제1 및 제2 펩타이드 복합체에 접합될 수 있다.
T-세포-MMP의 하나의 비제한적 예에서, 복합체는 도 10A에서 1775'로 표기된 아미노산 서열을 함유하는 MHC 중쇄를 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 도 11A에서 1783'로 표기된 폴리펩타이드이다. 해당 폴리펩타이드는 일부 경우에 신호 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168))를 포함하지 않을 것이며, β2M 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 일부 경우에 리더 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167))를 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에, 에피토프 펩타이드는 도 11A에 도시된 LIMPARFYPK (서열번호 91) 펩타이드 이외이다.
T-세포-MMP의 두번째 비제한적 예에서, 복합체는 도 10B에서 1777'로 표기된 아미노산 서열을 함유하는 MHC 중쇄를 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 도 11A에서 1783'로 표기된 폴리펩타이드이다. 해당 폴리펩타이드는 일부 경우에 신호 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168))를 포함하지 않을 것이며, β2M 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 일부 경우에 리더 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167))를 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에, 에피토프 펩타이드는 도 11A에 도시된 LIMPARFYPK (서열번호 91) 펩타이드 이외이다.
T-세포-MMP의 세 번째 비제한적 예에서, 복합체는 도 10C에서 1779'로 표기된 아미노산 서열을 함유하는 MHC 중쇄를 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 도 11A에서 1783'로 표기된 폴리펩타이드이다. 해당 폴리펩타이드는 일부 경우에 신호 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168))를 포함하지 않을 것이며, β2M 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 일부 경우에 리더 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167))를 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에, 에피토프 펩타이드는 도 11A에 도시된 LIMPARFYPK (서열번호 91) 펩타이드 이외이다.
T-세포-MMP의 네 번째 비제한적 예에서, 복합체는 도 10D에서 1781'로 표기된 아미노산 서열을 함유하는 MHC 중쇄를 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 도 11A에서 1783'로 표기된 폴리펩타이드이다. 해당 폴리펩타이드는 일부 경우에 신호 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168))를 포함하지 않을 것이며, β2M 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 일부 경우에 리더 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167))를 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에, 에피토프 펩타이드는 도 11A에 도시된 LIMPARFYPK (서열번호 91) 펩타이드 이외이다.
T-세포-MMP의 다섯 번째 비제한적 예에서, 복합체는 도 10A에서 1775'로 표기된 아미노산 서열을 함유하는 MHC 중쇄를 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 도 11B에서 1784'로 표기된 폴리펩타이드이다. 해당 폴리펩타이드는 일부 경우에 신호 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168))를 포함하지 않을 것이며, β2M 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 일부 경우에 리더 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167))를 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에, 에피토프 펩타이드는 도 11B에 도시된 AIMPARFYPK(서열번호 92) 펩타이드 이외이다.
T-세포-MMP의 여섯 번째 비제한적 예에서, 복합체는 도 10B에서 1777'로 표기된 아미노산 서열을 함유하는 MHC 중쇄를 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 도 11B에서 1784'로 표기된 폴리펩타이드이다. 해당 폴리펩타이드는 일부 경우에 신호 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168))를 포함하지 않을 것이며, β2M 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 일부 경우에 리더 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167))를 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에, 에피토프 펩타이드는 도 11B에 도시된 AIMPARFYPK(서열번호 92) 펩타이드 이외이다.
T-세포-MMP의 일곱 번째 비제한적 예에서, 복합체는 도 10C에서 1779'로 표기된 아미노산 서열을 함유하는 MHC 중쇄를 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 도 11B에서 1784'로 표기된 폴리펩타이드이다. 해당 폴리펩타이드는 일부 경우에 신호 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168))를 포함하지 않을 것이며, β2M 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 일부 경우에 리더 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167))를 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에, 에피토프 펩타이드는 도 11B에 도시된 AIMPARFYPK(서열번호 92) 펩타이드 이외이다.
T-세포-MMP의 여덟 번째의 비제한적 예에서, 복합체는 도 10D에서 1781'로 표기된 아미노산 서열을 함유하는 MHC 중쇄를 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 도 11B에서 1784'로 표기된 폴리펩타이드이다. 해당 폴리펩타이드는 일부 경우에 신호 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168))를 포함하지 않을 것이며, β2M 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 일부 경우에 리더 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167))를 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에, 에피토프 펩타이드는 도 11A에 도시된 AIMPARFYPK(서열번호 92) 펩타이드 이외이다.
T-세포-MMP의 아홉 번째 비제한적 예에서, 복합체는 도 10A에서 1775'로 표기된 아미노산 서열을 함유하는 MHC 중쇄를 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 도 11C에서 1785'로 표기된 폴리펩타이드이다. 해당 폴리펩타이드는 일부 경우에 신호 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168))를 포함하지 않을 것이며, β2M 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 일부 경우에 리더 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167))를 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에, 에피토프 펩타이드는 도 11C에 도시된 YVNVNMGLK(서열번호 93) 펩타이드 이외이다.
T-세포-MMP의 열 번째 비제한적 예에서, 복합체는 도 10B에서 1777'로 표기된 아미노산 서열을 함유하는 MHC 중쇄를 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 도 11C에서 1785'로 표기된 폴리펩타이드이다. 해당 폴리펩타이드는 일부 경우에 신호 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168))를 포함하지 않을 것이며, β2M 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 일부 경우에 리더 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167))를 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에, 에피토프 펩타이드는 도 11A에 도시된 YVNVNMGLK(서열번호 93) 펩타이드 이외이다.
T-세포-MMP의 열한 번째의 비제한적 예에서, 복합체는 도 10C에서 1779'로 표기된 아미노산 서열을 함유하는 MHC 중쇄를 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 도 11C에서 1785'로 표기된 폴리펩타이드이다. 해당 폴리펩타이드는 일부 경우에 신호 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168))를 포함하지 않을 것이며, β2M 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 일부 경우에 리더 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167))를 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에, 에피토프 펩타이드는 도 11C에 도시된 YVNVNMGLK(서열번호 93) 펩타이드 이외이다.
T-세포-MMP의 열 두번째 비제한적 예에서, 복합체는 도 10D에서 1781'로 표기된 아미노산 서열을 함유하는 MHC 중쇄를 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 도 11C에서 1785'로 표기된 폴리펩타이드이다. 해당 폴리펩타이드는 일부 경우에 신호 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168))를 포함하지 않을 것이며, β2M 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 일부 경우에 리더 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167))를 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에, 에피토프 펩타이드는 도 11C에 도시된 YVNVNMGLK(서열번호 93) 펩타이드 이외이다.
실시예 4. CMV 에피토프에 접합된 T-세포-MMP
신호 펩타이드(MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 167)), 선택적 링커에 측접되는 설파타제 모티프 (서열번호 45) 및 β2M 서열(서열번호 151 및 도 4 참조)의 순서로 포함하는 제1 폴리펩타이드:
Figure pct00097
신호 서열(MYRMQLLSCIALSLALVTNS (서열번호 168)) 다음에 Y84C, A139C 및 A236C 아미노산 치환을 갖는 인간 IL-2 MOD, HLA-A11(HLA A*1101) 서열을 함유하는 제2 폴리펩타이드에 의해 발현될 수 있다:
Figure pct00098
도 10에서와 같은 다른 MHC 클래스 1 중쇄 작제물은 상기 나타낸 HLA-A 함유 작제물에 대한 대안으로서 공동 발현될 수 있다. 링커 및 설파타제 모티프는, 예를 들어, 실시예 1 및 2에서 상기 기재한 바와 같다.
공동발현은 폴리펩타이드에 접합될 수 있는 설파타제 모티프와의 T-세포-MMP 복합체의 생성을 초래한다. 설파타제 모티프가, 예를 들어 LCTPSR(알데하이드로의 전환 후에 L(fGly)TPSR)이고 접합을 위한 에피토프가 CMV(예를 들어, NLVPMVATV (서열번호 170))로부터 유래되는 경우, FGly 잔기 및 에피토프 펩타이드의 c-말단에 대한 접합을 함유하는 전환 후에 제1 폴리펩타이드는 다음과 같이 나타날 수 있다:
Figure pct00099
신호 펩타이드는 세포 가공에 의해 제거되었고, 시스테인 12와 HLA-A*1101 함유 작제물 사이의 결합은 나타내지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Cue Biopharma, Inc. <120> T-Cell Modulatory Multimeric Polypeptide with Conjugation Sites and Methods of Use Thereof <130> WO/2019/051127 <140> PCT/US2018/049803 <141> 2018-09-06 <150> US 62/555,559 <151> 2017-09-07 <150> US62/609,082 <151> 2017-12-21 <150> US 62/615,402 <151> 2018-01-09 <160> 170 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 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Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp 275 280 285 Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser 290 295 300 Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu 305 310 315 320 Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp 325 330 335 Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr 340 345 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope tag <400> 31 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope tag <400> 32 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope tag <400> 33 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5x His Tag <400> 34 His His His His His 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6x His Tag <400> 35 His His His His His His 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STREP TAG <400> 36 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cellulose binding domain <400> 37 Arg Tyr Ile Arg Ser 1 5 <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phe-His-His-Thr <400> 38 Phe His His Thr 1 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WEAAAREACCRECCAR PEPTIDE <400> 39 Trp Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Cys Cys Arg Glu Cys Cys Ala Arg 1 5 10 15 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LEVLFQGP CLEVAGE SITE <400> 40 Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ENLYTQS CLEAVAGE SITE <400> 41 Glu Asn Leu Tyr Thr Gln Ser 1 5 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDDDK CLEVAGE SITE <400> 42 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 43 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LVPR CLEVAGE SITE <400> 43 Leu Val Pro Arg 1 <210> 44 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP CLEVAGE SITE <400> 44 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SULFATASE MOTIF <220> <221> UNSURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is present or absent, and when present, can be any amino acid, though usually an aliphatic, a sulfur-containing , or a polar, uncharged amino acid (e.g.., other than an aromatic amino acid or a charged amino acid), usually L, M, V, S or T <220> <221> UNSURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is cysteine or serine <220> <221> UNSURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid, though usually an aliphatic amino acid, a polar uncharged amino acid, or a sulfur containing amino acid (e.g., other than an aromatic amino acid or charged amino acid), usually S, T, A, V, G or C. <220> <221> UNSURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is proline or alanine <220> <221> UNSURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid, though usually an aliphatic amino acid, a polar uncharged amino acid, or a sulfur containing amino acid (e.g., other than an aromatic amino acid or charged amino acid), usually S, T, A, V, G or C. <220> <221> UNSURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is a basic amino acid (arginine, lysine, or histidine, usually lysine), or an aliphatic amino acid (alanine, glycine, leucine, valine, isoleucine, or proline, usually A, G, L, V, or I. <400> 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SULFATASE MOTIF <220> <221> UNSURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is cysteine or serine. <220> <221> UNSURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid, though usually an aliphatic amino acid, a polar uncharged amino acid, or a sulfur containing amino acid (i.e., other than an aromatic amino acid or charged amino acid), usually S, T, A, V, G or C. <220> <221> UNSURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is proline or alanine. <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> UNSURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid, though usually an aliphatic amino acid, a polar uncharged amino acid, or a sulfur containing amino acid (i.e., other than an aromatic amino acid or charged amino acid), usually S, T, A, V, G or C <220> <221> UNSURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is a basic amino acid (arginine, lysine, or histidine, usually lysine), or an aliphatic amino acid (alanine, glycine, leucine, valine, isoleucine, or proline, usually A, G, L, V, or I). <400> 46 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SULFATASE MOTIF <220> <221> UNSURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is present or absent, and when present, can be any amino acid, though usually an aliphatic, a sulfur-containing , or a polar, uncharged amino acid (e.g.., other than an aromatic amino acid or a charged amino acid), usually L, M, V, S or T <220> <221> UNSURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid, though usually an aliphatic amino acid, a polar uncharged amino acid, or a sulfur containing amino acid (e.g., other than an aromatic amino acid or charged amino acid), usually S, T, A, V, G or C. <220> <221> UNSURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid, though usually an aliphatic amino acid, a polar uncharged amino acid, or a sulfur containing amino acid (e.g., other than an aromatic amino acid or charged amino acid), usually S, T, A, V, G or C. <220> <221> UNSURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is a basic amino acid (arginine, lysine, or histidine, usually lysine), or an aliphatic amino acid (alanine, glycine, leucine, valine, isoleucine, or proline, usually A, G, L, V, or I. <400> 47 Xaa Cys Xaa Pro Xaa Xaa 1 5 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SULFATASE MOTIF <220> <221> UNSURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid, though usually an aliphatic amino acid, a polar uncharged amino acid, or a sulfur containing amino acid (e.g., other than an aromatic amino acid or charged amino acid), usually S, T, A, V, G or C. <220> <221> UNSURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid, though usually an aliphatic amino acid, a polar uncharged amino acid, or a sulfur containing amino acid (e.g., other than an aromatic amino acid or charged amino acid), usually S, T, A, V, G or C. <220> <221> UNSURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is a basic amino acid (arginine, lysine, or histidine, usually lysine), or an aliphatic amino acid (alanine, glycine, leucine, valine, isoleucine, or proline, usually A, G, L, V, or I. <400> 48 Cys Xaa Pro Xaa Xaa 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AUXILIARY SULFATASE MOTIF <400> 49 Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AUXILIARY SULFATASE MOTIF <400> 50 Ser Gln Leu Leu Thr Gly Arg 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AUXILIARY SULFATASE MOTIF <400> 51 Ala Ala Phe Met Thr Gly Arg 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AUXILIARY SULFATASE MOTIF <400> 52 Ala Ala Phe Leu Thr Gly Arg 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AUXILIARY SULFATASE MOTIF <400> 53 Gly Ser Leu Phe Thr Gly Arg 1 5 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SORTASE SITE <220> <221> UNSURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acide. <220> <221> UNSURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is glycine or alanine. <400> 54 Leu Pro Xaa Thr Xaa 1 5 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5X Glycine <400> 55 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 56 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4X Glycine <400> 56 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5X Alanine <400> 57 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 58 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4X Alanine <400> 58 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LPETGG SORTASE SITE <400> 59 Leu Pro Glu Thr Gly Gly 1 5 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LPETAA SORTASE SITE <400> 60 Leu Pro Glu Thr Ala Ala 1 5 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> THROMBIN CLEAVAGE SITE <400> 61 Leu Val Pro Arg Gly 1 5 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRANSGLUTAMINASE SITE <400> 62 Leu Leu Gln Gly Gly 1 5 <210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRANSGLUTAMINASE SITE <400> 63 Leu Leu Gln Gly 1 <210> 64 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRANSGLUTAMINASE SITE <400> 64 Leu Ser Leu Ser Gln Gly 1 5 <210> 65 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRANSGLUTAMINASE SITE <400> 65 Leu Leu Gln Leu Gln Gly 1 5 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GSGGS PEPTIDE <400> 66 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 67 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GGGS PEPTIDE <400> 67 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 68 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GGSG PEPTIDE <400> 68 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GGSGG PEPTIDE <400> 69 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GSGSG PEPTIDE <400> 70 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GSGGG PEPTIDE <400> 71 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GGGSG PEPTIDE <400> 72 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GSSSG PEPTIDE <400> 73 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 74 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GSSSS PEPTIDE <400> 74 Gly Ser Ser Ser Ser 1 5 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAAGG PEPTIDE <400> 75 Ala Ala Ala Gly Gly 1 5 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GGGGS PEPTIDE <400> 76 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GCGASGGGGSGGGGS PEPTIDE <400> 77 Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 78 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS PEPTIDE <400> 78 Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GCGGSGGGGSGGGGS PEPTIDE <400> 79 Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 80 Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val 1 5 <210> 81 <211> 8 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 81 Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile 1 5 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 82 Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr 1 5 10 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 83 Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr 1 5 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 84 Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 85 Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Gly 1 5 10 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 86 Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 87 Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 88 Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 89 Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 90 Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val 1 5 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 91 Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Lys 1 5 10 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 92 Ala Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Lys 1 5 10 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 93 Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys 1 5 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 94 Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 <210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 95 Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro 1 5 10 15 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 96 Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu 1 5 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 97 Ser Ile Leu Ser Lys Thr Gly Asp Pro Val 1 5 10 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 98 Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 99 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 100 Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 101 Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 1 5 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 102 Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu 1 5 10 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 103 Leu 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Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr 50 55 60 Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr 65 70 75 80 Leu Arg Gly Ala Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln 85 90 95 Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu 115 120 125 Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys 130 135 140 His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His 180 185 190 Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe 195 200 205 Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro 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Gly Ala Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln 85 90 95 Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp 115 120 125 Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His 130 135 140 Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu 145 150 155 160 Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu 165 170 175 Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala 180 185 190 Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr 195 200 205 Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr 210 215 220 Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Cys Gly Asp Gly Thr Phe 225 230 235 240 Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr 245 250 255 Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg 260 265 270 Trp Glu Pro 275 <210> 148 <211> 275 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gln Glu Thr 50 55 60 Arg Asn Val Lys Ala Gln Ser Gln Thr Asp Arg Val Asp Leu Gly Thr 65 70 75 80 Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Asp Gly Ser His Thr Ile Gln 85 90 95 Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu 115 120 125 Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Lys 130 135 140 Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Ala Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His His 180 185 190 Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe 195 200 205 Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp 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Lys 130 135 140 Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His His 180 185 190 Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe 195 200 205 Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 225 230 235 240 Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 260 265 270 Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Val Pro Ile Val Gly Ile Ile 275 280 285 Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala 290 295 300 Ala Val Met Trp Arg Arg Asn Ser Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr 305 310 315 320 Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu 325 330 335 Thr Ala Cys Lys Val 340 <210> 150 <211> 341 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Thr Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr 50 55 60 Arg Asn Val Lys Ala His Ser Gln Ile Asp Arg Val Asp Leu Gly Thr 65 70 75 80 Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Ile Gln 85 90 95 Met Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr Gln Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu 115 120 125 Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Gln 130 135 140 Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His His 180 185 190 Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe 195 200 205 Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 225 230 235 240 Phe Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 260 265 270 Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile 275 280 285 Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Val Phe Ala Gly Ala Val Val Ala 290 295 300 Ala Val Arg Trp Arg Arg Lys Ser Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr 305 310 315 320 Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Met Ser Leu 325 330 335 Thr Ala Cys Lys Val 340 <210> 151 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115 <210> 152 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115 <210> 153 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Lys Met Gly Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Asn Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gly Pro Arg Thr 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115 <210> 154 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Met Ala Arg Phe Val Ala Leu Val Leu Leu Gly Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Asp Ala Ile Gln Arg Pro Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Pro Glu Asp Gly Lys Pro Asn Tyr Leu Asn Cys Tyr Val Tyr 35 40 45 Gly Phe His Pro Pro Gln Ile Glu Ile Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Lys Ile Lys Ser Glu Gln Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser 65 70 75 80 Phe Tyr Leu Leu Ser His Ala Glu Phe Thr Pro Asn Ser Lys Asp Gln 85 90 95 Tyr Ser Cys Arg Val Lys His Val Thr Leu Glu Gln Pro Arg Ile Val 100 105 110 Lys Trp Asp Arg Asp Leu 115 <210> 155 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Met Ala Arg Ser Val Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Val Ser Leu Thr 1 5 10 15 Gly Leu Tyr Ala Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys Tyr Val Thr 35 40 45 Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Lys Asn Gly Lys 50 55 60 Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp 85 90 95 Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Ala Ser Met Ala Glu Pro Lys Thr 100 105 110 Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met 115 <210> 156 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC Class I heavy chain sequence with variable regions <220> <221> Unsure <222> (79)..(79) <223> Xaa is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (80)..(80) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (81)..(81) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (82)..(82) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (83)..(83) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (85)..(85) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (86)..(86) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (87)..(87) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (88)..(88) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (89)..(89) <223> Xaa is (i) any amino acid or (ii) or ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (134)..(134) <223> Xaa is (i) any amino acid or (ii) or ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (135)..(135) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (136)..(136) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (137)..(137) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (138)..(138) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (138)..(138) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (140)..(140) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (141)..(141) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (142)..(142) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (143)..(143) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (144)..(144) <223> Xaa is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <400> 156 Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr 50 55 60 Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Gly Ser His Thr Val Gln 85 90 95 Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu 115 120 125 Asp Leu Arg Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His 180 185 190 Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe 195 200 205 Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 225 230 235 240 Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 260 265 270 Arg Trp Glu Pro 275 <210> 157 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Cys His Pro Ala Glu 1 5 10 15 Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 20 25 30 Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 35 40 45 Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 50 55 60 Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp 85 90 95 Arg Asp Met <210> 158 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC Class 1 heavy chain sequence with variable regions <220> <221> Unsure <222> (79)..(79) <223> Xaa is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (79)..(79) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (80)..(80) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (81)..(81) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (82)..(82) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (83)..(83) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (85)..(85) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (86)..(86) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (87)..(87) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (88)..(88) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (89)..(89) <223> Xaa is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (134)..(134) <223> Xaa is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (135)..(135) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (136)..(136) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (137)..(137) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (138)..(138) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (140)..(140) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (141)..(141) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (142)..(142) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (143)..(143) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (144)..(144) <223> Xaa is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (231)..(231) <223> Xaa is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (232)..(232) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (233)..(233) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (234)..(234) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (235)..(235) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (237)..(237) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (238)..(238) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (239)..(239) <223> Xaa is present or absent, and when present is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> Unsure <222> (240)..(240) <223> Xaa is (i) any amino acid or (ii) any amino acid except proline or glycine <220> <221> misc_feature <222> (241)..(241) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 158 Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr 50 55 60 Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Gly Ser His Thr Val Gln 85 90 95 Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser 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proline <400> 159 Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 160 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE COSTRUCT <400> 160 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Leu Cys Thr Pro Ser Arg Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Cys 35 40 45 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 50 55 60 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 65 70 75 80 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 85 90 95 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 100 105 110 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 115 120 125 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 130 135 <210> 161 <211> 833 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE CONSTRUCT <400> 161 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 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CONSTRUCT <400> 165 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ser Val 20 25 30 Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val 35 40 45 Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg 50 55 60 Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp 65 70 75 80 Asp Gln Glu Thr Arg Asn Val Lys Ala Gln Ser Gln Thr Asp Arg Val 85 90 95 Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Asp Gly Ser 100 105 110 His Thr Ile Gln Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg 115 120 125 Phe Leu Arg Gly Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile 130 135 140 Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala 145 150 155 160 Gln Ile Thr Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Ala Ala Glu Gln Gln 165 170 175 Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu 180 185 190 Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His 195 200 205 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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 420 425 430 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 435 440 445 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 450 455 460 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 465 470 475 480 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 485 490 495 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 500 505 510 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 515 520 525 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 530 535 540 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 545 550 <210> 166 <211> 858 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE CONSTRUCT <400> 166 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu Ala Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr 165 170 175 Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Ala Leu Leu Leu 180 185 190 Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys 195 200 205 Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr 210 215 220 Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu 225 230 235 240 Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg 245 250 255 Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser 260 265 270 Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val 275 280 285 Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr 290 295 300 Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr 325 330 335 Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly 340 345 350 Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser 355 360 365 Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu 370 375 380 Tyr Trp Asp Gln Glu Thr Arg Asn Val Lys Ala Gln Ser Gln Thr Asp 385 390 395 400 Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Asp 405 410 415 Gly Ser His Thr Ile Gln Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp 420 425 430 Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp 435 440 445 Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met 450 455 460 Cys Ala Gln Ile Thr Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Ala Ala Glu 465 470 475 480 Gln Gln Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg 485 490 495 Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys 500 505 510 Thr His Met Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg 515 520 525 Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln 530 535 540 Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg 545 550 555 560 Pro Cys Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro 565 570 575 Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu 580 585 590 Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 595 600 605 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 610 615 620 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 625 630 635 640 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 645 650 655 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 660 665 670 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 675 680 685 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 690 695 700 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 705 710 715 720 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 725 730 735 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 740 745 750 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 755 760 765 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 770 775 780 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 785 790 795 800 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 805 810 815 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 820 825 830 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 835 840 845 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 850 855 <210> 167 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala 20 <210> 168 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser 20 <210> 169 <211> 833 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PROTEIN CONSTRUCT <400> 169 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu Ala Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr 165 170 175 Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Ala Leu Leu Leu 180 185 190 Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys 195 200 205 Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr 210 215 220 Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu 225 230 235 240 Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg 245 250 255 Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser 260 265 270 Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val 275 280 285 Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr 290 295 300 Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr 325 330 335 Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly 340 345 350 Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser 355 360 365 Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu 370 375 380 Tyr Trp Asp Gln Glu Thr Arg Asn Val Lys Ala Gln Ser Gln Thr Asp 385 390 395 400 Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Asp 405 410 415 Gly Ser His Thr Ile Gln Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp 420 425 430 Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp 435 440 445 Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Cys Ala Asp Met 450 455 460 Cys Ala Gln Ile Thr Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Ala Ala Glu 465 470 475 480 Gln Gln Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg 485 490 495 Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys 500 505 510 Thr His Met Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg 515 520 525 Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln 530 535 540 Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg 545 550 555 560 Pro Cys Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro 565 570 575 Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu 580 585 590 Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Ala Ala Ala Gly Gly Asp Lys 595 600 605 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 610 615 620 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 625 630 635 640 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 645 650 655 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 660 665 670 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 675 680 685 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 690 695 700 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 705 710 715 720 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 725 730 735 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 740 745 750 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 755 760 765 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 770 775 780 Asp Ser Asp 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Claims (19)

  1. T-세포 조절 다량체 폴리펩타이드(T-세포-MMP)로서,
    a) i) N-말단 및 C-말단을 갖는 제1 주조직 적합 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 폴리펩타이드
    를 포함하는, 제1 폴리펩타이드;
    b) N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로:
    i) 제2 MHC 폴리펩타이드; 및
    ii) 선택적으로 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드
    를 포함하는, 제2 폴리펩타이드;
    c) 상기 제1 폴리펩타이드에 또는 상기 제1 폴리펩타이드 내에 부착된 하나 이상의 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위, 및/또는 상기 제2 폴리펩타이드에 또는 상기 제2 폴리펩타이드 내에 부착된 하나 이상의 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위; 및
    d) 하나 이상의 면역조절 폴리펩타이드(immunomodulatory polypeptide: MOD)로서, 상기 하나 이상의 MOD 중 적어도 하나는,
    A) 상기 제1 폴리펩타이드의 상기 C-말단에;
    B) 상기 제2 폴리펩타이드의 상기 N-말단에;
    C) 상기 제2 폴리펩타이드의 상기 C-말단에; 또는
    D) 상기 제1 폴리펩타이드의 상기 C-말단에 그리고 상기 제2 폴리펩타이드의 상기 N-말단에
    있는, 하나 이상의 면역조절 펩타이드를 포함하되,
    상기 하나 이상의 MOD의 각각은 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 MOD인, T-세포 조절 다량체 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 MHC 폴리펩타이드는 클래스 I MHC 폴리펩타이드이고, 상기 제1 MHC 폴리펩타이드는,
    N-말단 및 C-말단 상에 링커가 없는 N-말단 및 C-말단을 갖는 베타-2-마이크로글로불린("β2M") 폴리펩타이드,
    N-말단 상에 링커를 보유하는 β2M 폴리펩타이드,
    C-말단 상에 링커를 보유하는 β2M 폴리펩타이드, 또는
    N-말단 및 C-말단 상에 링커를 보유하는 β2M 폴리펩타이드
    를 포함하는, T-세포-MMP.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드는,
    N-말단 및 C-말단 상에 링커가 없는 제2 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC 클래스 I 중쇄("MHC-H") 폴리펩타이드를 포함);
    N-말단 상에 링커를 보유하는 제2 MHC 폴리펩타이드;
    C-말단 상에 링커를 보유하는 제2 MHC 폴리펩타이드; 또는
    N-말단 및 C-말단 상에 링커를 보유하는 제2 MHC 폴리펩타이드
    를 포함하는, T-세포-MMP.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드는 면역글로불린(Ig) Fc 폴리펩타이드 또는 비-Ig 폴리펩타이드 스캐폴드를 더 포함하는, T-세포-MMP.
  5. 제3항에 있어서, 상기 T-세포-MMP는 하나 이상의 독립적으로 선택된 야생형 및/또는 변이체 MOD 폴리펩타이드를 포함하는, T-세포-MMP.
  6. 제3항에 있어서, 상기 T-세포-MMP는 하나 이상의 독립적으로 선택된 야생형 및/또는 변이체 MOD 폴리펩타이드를 포함하되; 상기 하나 이상의 변이체 MOD 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 Co-MOD에 대한 대응하는 야생형 MOD의 친화도에 비해 Co-MOD(이의 Co-MOD)에 대해 감소된 친화도를 나타내고; i) Co-MOD에 대한 대조군 T-세포-MMP-에피토프 접합체(상기 대조군이 야생형 MOD를 포함하는 경우)의 결합 친화도 대 ii) 상기 Co-MOD에 대한 상기 야생형 MOD의 변이체를 포함하는 본 개시내용의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 결합 친화도의 비는, 생물층 간섭계(bio-layer interferometry: "BLI")에 의해 측정할 때, 적어도 1.5:1 또는 1.5:1 내지 106:1의 범위인, T-세포-MMP.
  7. 제6항에 있어서, 상기 야생형 MOD 폴리펩타이드는 IL-2, 4-1BBL, PD-L1, CD70, CD80, CD86, ICOS-L, OX-40L, FasL, JAG1, TGFβ, ICAM 및 PD-L2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 상기 변이체 MOD 폴리펩타이드는 이들의 변이체인, T-세포-MMP.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 화학적 접합 부위 및 제2 화학적 접합 부위는,
    a) 효소 변형 서열로서 작용하는 펩타이드 서열(예를 들어, 설파타제 모티프);
    b) 비천연 아미노산 및/또는 셀레노시스테인;
    c) 조작된 아미노산 화학적 접합 부위;
    d) 탄수화물 또는 올리고당 모이어티; 및/또는
    e) IgG 뉴클레오타이드 결합 부위
    로부터 독립적으로 선택되는, T-세포-MMP.
  9. 제8항에 있어서, 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 및 제2 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 효소 변형 서열을 포함하는, T-세포-MMP.
  10. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 화학적 접합 부위 또는 제2 화학적 접합 부위 중 적어도 하나는 설파타제 모티프인, T-세포-MMP.
  11. 제10항에 있어서, 상기 설파타제 모티프는 서열 X1Z1X2Z2X3Z3, X1(C/S) X2(P/A)X3Z3, X1CX2PX3Z3 또는 CX2PX3R을 포함하되;
    Z1은 시스테인 또는 세린이고;
    Z2는 프롤린 또는 알라닌 잔기 중 하나이며;
    Z3은 염기성 아미노산이고;
    X1은 존재하거나 없고, 존재한다면, 임의의 아미노산일 수 있지만, 보통 지방족 아미노산, 황-함유 아미노산, 또는 극성 비하전 아미노산일 수 있고, 단, 상기 설파타제 모티프가 상기 폴리펩타이드의 상기 N-말단에 있을 때, X1이 존재하고; 그리고
    X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있지만, 보통은 지방족 아미노산, 극성, 비하전 아미노산 또는 황 함유 아미노산일 수 있는, T-세포-MMP.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 화학적 접합 부위 또는 상기 제2 화학적 접합 부위로서 fGly 아미노산 잔기를 포함하는, T-세포-MMP.
  13. T-세포-MMP-에피토프 접합체로서, 제8항의 T-세포-MMP를 포함하고, 에피토프를 더 포함하되; 상기 에피토프는 제1 폴리펩타이드 화학적 접합 부위에서, 또는 제2 폴리펩타이드 화학적 접합 부위에서 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에 직접적으로, 또는 스페이서 또는 링커를 통해 간접적으로 접합되는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 에피토프는 스페이서 또는 링커를 통해 상기 제1 폴리펩타이드 또는 상기 제2 폴리펩타이드에 접합되는, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
  15. 제13항에 있어서, 상기 에피토프는 암 에피토프, 바이러스 에피토프 또는 자가에피토프(autoepitope)인, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 에피토프는 HPV CMV 또는 HBV 에피토프로부터 선택되는 바이러스 에피토프인, T-세포-MMP-에피토프 접합체.
  17. 조성물로서,
    a) 제15항의 T-세포-MMP-에피토프 접합체; 및
    b) 약제학적으로 허용 가능한 부형제
    를 포함하는 조성물.
  18. 유효량의 상기 T-세포-MMP-에피토프 접합체를 이것이 필요한 개체에게 투여하기 위한 의약을 제조를 위한 제15항의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 용도.
  19. 시험관내에서, 또는 생체내에서 개체에게 에피토프-선택적 또는 에피토프-선택적/특이적 방식으로 표적 T-세포에 면역조절 폴리펩타이드(MOD)를 전달하는 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조를 위한, 제15항의 T-세포-MMP-에피토프 접합체의 용도로서, 상기 방법은,
    의약을 시험관내에서 T-세포와 접촉시키는 단계, 또는
    상기 개체에게 상기 의약을 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 표적 T-세포는 상기 T-세포-MMP-에피토프 접합체에 존재하는 상기 에피토프에 특이적인, T-세포-MMP-에피토프 접합체의 용도.
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