KR20200041861A - IHC antigen imaging scale extrapolation method - Google Patents
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Abstract
본 발명은 IHC 항원 영상 척도 외삽 방법에 관한 것이다. 본 발명 특히 이차 포유 동물 IgG 혈청과 선택적으로 항원 농도의 구배 밀도 타깃 시리즈로부터 항원 농도 척도가 전개되는 방법에 관한 것이다. 상술한 방법의 일차적인 적용은 타깃 단백질 농도 척도로 슬라이드 상의 이미지 분석을 지원하는 것이다. 이 방법은 이차 단백질 농도 척도로부터 일차 항원 농도 척도를 형성하는 데에 사용된다. 다음으로, 암과 같은 검출된 세포 결손의 조직 절편으로 접근하기 위해 일차 항원 농도 척도가 공존의 조직 절편에 적용된다.The present invention relates to an IHC antigen imaging scale extrapolation method. The present invention particularly relates to a method in which an antigen concentration scale is developed from a series of gradient density targets of secondary mammalian IgG serum and optionally antigen concentration. The primary application of the method described above is to support image analysis on slides as a target protein concentration scale. This method is used to form a primary antigen concentration scale from a secondary protein concentration scale. Next, a primary antigen concentration scale is applied to coexisting tissue sections to access tissue sections of detected cell defects such as cancer.
Description
본 발명은 IHC 항원 영상 척도 외삽 방법에 관한 것이다. 본 발명 특히 이차 포유 동물 IgG 혈청과 선택적으로 항원 농도의 구배 밀도 타깃 시리즈로부터 항원 농도 척도가 전개되는 방법에 관한 것이다. 상술한 방법의 일차적인 적용은 타깃 단백질 농도 척도로 슬라이드 상의 이미지 분석을 지원하는 것이다. 이 방법은 이차 단백질 농도 척도로부터 일차 항원 농도 척도를 형성하는 데에 사용된다. 다음으로, 암과 같은 검출된 세포 결손의 조직 절편으로 접근하기 위해 일차 항원 농도 척도는 공존의 조직 절편에 적용된다.The present invention relates to an IHC antigen imaging scale extrapolation method. The present invention particularly relates to a method in which an antigen concentration scale is developed from a series of gradient density targets of secondary mammalian IgG serum and optionally antigen concentration. The primary application of the method described above is to support image analysis on slides as a target protein concentration scale. This method is used to form a primary antigen concentration scale from a secondary protein concentration scale. Next, the primary antigen concentration scale is applied to coexisting tissue sections to access tissue sections of detected cell defects such as cancer.
시료 내의 분석물의 알려지지 않은 농도가 정량화될 필요가 있는 경우 면역 측정법이 사용된다. 알려지지 않은 농도의 가장 정확한 판단을 얻기 위해, 일반적인 분석 개발 기준(표준 편차 또는 최적 신호 윈도우)을 기초로 할 뿐만 아니라 면역 측정법이 알려지지 않은 시료의 값을 얼마나 잘 예측할 수 있는지를 기초로 면역 측정법이 개발되어야 한다. 첫째, 중요한 성공 요인을 분석할 필요가 있다. 그런 다음, 개념의 증명을 확립하는 면역 측정법이 개발되어야 한다. 최적화 단계에서, 실험 시료이 측정될 매트릭스 내의 정밀도 프로파일을 산출하는 것에 의해 면역 측정법의 정량화 가능한 범위가 결정된다. 그런 다음, 분석물을 매트릭스 내로 주입하고 매트릭스 내의 분석물의 회수율을 결정함으로써 주입된 회수를 수행한다. 정밀도 프로파일이 요구되는 작동 범위 내에 있다면, 수일에 걸쳐 주입된 회수 시료를 분석하여 면역 측정법의 검증을 완료한다. 정밀도 프로파일 한계가 요구되는 작동 범위 내에 있지 않다면, 검증 전에 면역 측정법의 추가적인 최적화가 요구된다.Immunoassays are used when an unknown concentration of analyte in a sample needs to be quantified. To obtain the most accurate judgment of unknown concentrations, immunoassays are developed based on general analytical development criteria (standard deviation or optimal signal window), as well as how well immunoassays can predict the values of unknown samples. Should be. First, it is necessary to analyze important success factors. Then, an immunoassay should be developed to establish proof of concept. In the optimization step, a quantifiable range of immunoassay is determined by calculating the precision profile in the matrix to which the experimental sample is to be measured. The injected recovery is then performed by injecting the analyte into the matrix and determining the recovery rate of the analyte in the matrix. If the precision profile is within the required operating range, recovery samples injected over several days are analyzed to complete validation of the immunoassay. If the precision profile limits are not within the required operating range, further optimization of immunoassays is required before validation.
본원에 개시된 방법의 일차적인 적용은 타깃 단백질 농도 척도로 슬라이드 상의 이미지 분석을 지원하는 것이다. 본 발명은 이차 단백질 농도 척도로부터 일차 항원 농도 척도를 형성하는 데에 사용되는 방법을 개시한다. 다음으로, 암과 같은 검출된 세포 결손의 조직 절편으로 접근하기 위해 일차 항원 농도 척도는 공존의 조직 절편에 적용된다.The primary application of the methods disclosed herein is to support image analysis on slides as a target protein concentration scale. The present invention discloses a method used to form a primary antigen concentration scale from a secondary protein concentration scale. Next, the primary antigen concentration scale is applied to coexisting tissue sections to access tissue sections of detected cell defects such as cancer.
일반적으로, 본 발명의 일 양태는 IHC 항원 영상 척도 외삽 방법을 제공한다.Generally, one aspect of the present invention provides an IHC antigen imaging scale extrapolation method.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 항원 농도 및 이차 포유 동물 IgG 혈청의 알려진 구배 밀도 타깃 시리즈로부터 항원 농도 척도가 전개되는 방법을 개시한다.In another aspect of the invention, the present invention discloses a method in which the antigen concentration scale is developed from a series of known concentration density targets of antigen concentration and secondary mammalian IgG serum.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상술한 방법의 일차적인 적용은 타깃 단백질 농도 척도로 슬라이드 상의 이미지 분석을 지원하는 것이다.In another aspect of the invention, the primary application of the method described above is to support image analysis on slides as a target protein concentration measure.
본 발명의 또 다른 양태에서, 이 방법은 이차 단백질 농도 척도로부터 일차 항원 농도 척도를 형성하는 데에 사용된다.In another aspect of the invention, the method is used to form a primary antigen concentration scale from a secondary protein concentration scale.
본 발명의 또 다른 양태에서, 일차 항원 농도 척도는 그런 다음 암과 같은 검출된 세포 결손의 조직 절편으로 접근하기 위해 공존의 조직 절편에 적용된다.In another aspect of the invention, the primary antigen concentration scale is then applied to coexisting tissue sections to access tissue sections of detected cell defects such as cancer.
본 발명의 다른 양태가 후술하는 설명에 개시된다.Other aspects of the invention are disclosed in the description below.
도 1은 상이한 타깃을 식별하여 IHC 착색한 이후 타깃을 포집하는 일차 및 이차 착색을 포함하는 슬라이드의 일부의 도면을 도시한다.
도 2는 IHC 착색 이후의 이차 단백질 어레이 중 하나에 대한 항원 회수 처리의 효과를 도시한다.
도 3은 공존의 조직 절편을 가지며 IHC 착색의 대상이 되는 이차 단백질 농도 척도를 갖는 슬라이드를 도시한다.1 shows a diagram of a portion of a slide that includes primary and secondary staining to capture targets after IHC staining by identifying different targets.
2 shows the effect of antigen recovery treatment on one of the secondary protein arrays after IHC staining.
3 shows slides with coexisting tissue sections and secondary protein concentration scales subject to IHC staining.
본 발명은 본 개시의 일부를 구성하는 후술하는 본 발명의 상세한 설명을 참조하면 보다 쉽게 이해될 수 있다. 본 발명은 본원에 설명된 및/또는 도시된 구체적인 장치, 방법, 조건 또는 파라미터에 한정되지 않으며 본원에 사용된 용어는 예시적인 것일 뿐 청구된 발명을 한정하고자 하는 것이 아니라는 점이 이해될 것이다. 또한, 첨부된 청구범위를 포함하는 명세서에서 사용되는 것과 같이, 'a', 'an', 및 'the'의 단수 형식인 복수형을 포함하며, 특정 수치에 대한 참조는 그 내용이 명확하게 달리 언급하지 않는 한 적어도 그 특정 값을 포함한다. 이러한 범위가 다른 실시예에서 표현될 때, 본원에서는 '약' 또는 '대략적인' 다른 특정 값으로 범위가 표현될 수 있다. 또한, 달리 표시되지 않는 한, 본원에 명시된 치수 및 재료 특징은 한정적이기 보다는 예시적인 것이고, 적합한 실용성의 시료 실시예를 보다 잘 이해하기 위한 것이며, 명시된 값을 벗어나는 변동도 특정의 적용에 따라 본 발명의 범위 내에 있을 수 있다는 것이 이해될 것이다.The present invention may be more readily understood by referring to the detailed description of the present invention that will be described below, which forms part of the present disclosure. It will be understood that the invention is not limited to the specific devices, methods, conditions or parameters described and / or illustrated herein, and that the terms used herein are exemplary only and are not intended to limit the claimed invention. In addition, as used in the specification including the appended claims, it includes plurals in the singular form of 'a', 'an', and 'the', and references to specific numerical values clearly mention otherwise Unless it contains at least that specific value. When such a range is expressed in other embodiments, the range may be expressed herein as other specific values of 'about' or 'approximately'. In addition, unless otherwise indicated, the dimensions and material features specified herein are exemplary rather than limiting, and are intended to better understand sample embodiments of suitable practicality, and variations outside the stated values are subject to specific application. It will be understood that it may be within the scope of.
본 발명은 그 적용에 있어서 제시된 구성의 세부 사항 및 부품의 배치에 한정되지 않는다. 이하의 설명에서, 또는 이하의 설명에서 도시되거나, 또는 도면에 나타낸 바와 같이 본 발명은 다른 실시예들이 가능하고, 다양한 방식으로 실시되거나 실시될 수 있다. 또한, 설명을 목적으로 본원에 사용되는 어구와 용어는 한정적인 것으로 간주되면 안된다. "포함하는", "구성하는", "갖는", "함유하는", "관련하는" 및 이들의 변형 및 추가 항목의 사용.The present invention is not limited to the details of the arrangements and arrangements of components in its application. In the following description, or as shown in the following description, or as shown in the drawings, other embodiments are possible and the invention can be practiced or carried out in various ways. Also, the phraseology and terminology used herein for illustrative purposes should not be regarded as limiting. Use of "comprising", "consisting of", "having", "containing", "related" and variations and additional items thereof.
일반적으로, 면역 조직 화학적(IHC) 착색은 환자 조직 절편 내의 특정 항원 부위의 존재를 평가하는 데에 사용된다. 비정상 또는 암 상태의 진단 레벨을 할당하기 위해 조직 절편 상의 착색 밀도에 대하여 주관적인 해석이 적용된다. 일반적으로, IHC 처리는 항상 정확하게 기능하며 비정상 또는 암 상태이 존재할 때 비정상 또는 암 질환을 식별하는 가시적인 크로모겐 마커로 조직 절편이 마킹될 것으로 가정한다. 그러나, 항원 회수 또는 착색 시약의 실패는 인공물을 식별하는 특징(signature)을 남기지 않는다. 그러므로, 실험실 기술이나 병리학자의 입장에서 유효한 진단 판단을 내릴 수 없는 상당한 가능성이 있다. 다시 말하면, 물리적 형태가 비정상 상태를 표시하기에 충분하지 않을 수 있지만, 항원 부위가 마킹되지 않으면, 슬라이드는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 슬라이드에서 발견되는 것 이상의 것을 제공하지 않는다.In general, immunohistochemical (IHC) staining is used to assess the presence of specific antigenic sites in patient tissue sections. Subjective interpretation is applied to the color density on tissue sections to assign a diagnostic level of abnormal or cancerous conditions. In general, it is assumed that IHC treatment always functions correctly and tissue sections are marked with visible chromogen markers that identify abnormal or cancerous diseases when abnormal or cancerous conditions are present. However, the failure of antigen recovery or staining reagents does not leave a signature that identifies the artifact. Therefore, there is a considerable possibility that it is not possible to make a valid diagnostic judgment from the viewpoint of laboratory technology or pathologists. In other words, the physical morphology may not be sufficient to indicate an abnormal condition, but if the antigenic site is not marked, the slide provides nothing more than that found in the hematoxylin and eosin (H & E) slides.
산출을 완료하기 위해 필요한 요건 면에서 일부가 통과되었다. 알아야 할 파라미터는 아래와 같다.Some have been passed in terms of the requirements necessary to complete the calculation. The parameters to know are as follows.
1. 항체 A: 희석 비율, ID, 및 숙주종(예로서, 25, ER, 마우스)1. Antibody A: dilution ratio, ID, and host species (eg, 25, ER, mouse)
2. 항체 B: 희석 비율 및 ID(예로서, 20, Ki-67) 숙주종이 필요하지 않은 이유는 항체 A가 항체 B를 사용하는 것이 정반대의 마우스/토끼일 것이기 때문이다.2. Antibody B: The dilution ratio and ID (eg, 20, Ki-67) host species are not required because antibody A would be the opposite mouse / rabbit using antibody B.
일차 항체는 요구되는 항원 분율로 접종된 숙주 동물(마우스 또는 토끼)로부터 얻은 처리된 숙주 혈청으로 구성되는 것으로 알려져 있다. 그런 다음, 숙주는 항원 부위가 이제 항원 길항제에 대한 항체 반응물을 포함하는 혈청 단백질을 생성한다. 후속하여, 타깃 항원을 포함하는 단백질과 항체가 접촉하면, 항원 및 항체가 함께 결합한다. 그 결과, 항체의 숙주종(마우스 또는 토끼)이 이차 착색 키트와 자유롭게 반응한다.It is known that primary antibodies consist of treated host serum obtained from a host animal (mouse or rabbit) inoculated with the required antigen fraction. The host then generates a serum protein whose antigenic site now contains an antibody reactant to the antigen antagonist. Subsequently, when the protein containing the target antigen and the antibody contact, the antigen and the antibody bind together. As a result, the host species (mouse or rabbit) of the antibody freely reacts with the secondary coloring kit.
공존의 조직 절편에 대하여 항원 밀도 눈금자(ruler)를 전개하는 데에 IHC 타깃이 사용될 수 있는 기반은 후술하는 절차를 따른다.The basis on which IHC targets can be used to develop antigen density rulers for coexisting tissue sections follows the procedure described below.
슬라이드의 접착제 결합 부위 밀도는 단일 단백질의 면적 변위를 적어도 두 자릿수만큼 초과한다.The density of the adhesive binding site of the slide exceeds the area displacement of a single protein by at least two orders of magnitude.
일차 항체 및 이차 단백질은 나노그램의 중량으로 변환될 수 있는 알려진 원자 질량 kDa을 갖는다.Primary antibodies and secondary proteins have a known atomic mass kDa that can be converted to nanogram weights.
일차 및 이차 타깃은 알려진 분배 체적의 타깃 재료가 적용되는 잘 정의되고 둥근 침착(deposition) 영역을 갖는다. 단백질 침착물은 교차 링크 커플러를 포함하므로, 단백질 깊이 이상의 슬라이드 코팅의 공극률로 내려갈 수 없다. 그러므로, 단백질의 원자 질량, 침착물 내의 각 단백질 유형의 단백질의 수, 타깃의 면적을 알면, 타깃의 활성 표면 단백질 밀도가 산출될 수 있다.Primary and secondary targets have a well-defined and rounded deposition area to which a target material of known distribution volume is applied. The protein deposits contain cross link couplers, so they cannot go down to the porosity of the slide coating above the protein depth. Therefore, knowing the atomic mass of the protein, the number of proteins of each protein type in the deposit, and the area of the target, the active surface protein density of the target can be calculated.
적용된 농도, 분배된 체적, 일차 항체의 시약에 노출되는 슬라이드 상의 표면적이 알려져 있다. 시약의 노출 시간 동안 대부분의 부유 항체가 낙하하여 수용 항원 부위에 의해 포집될 것으로 합리적으로 가정할 수 있다. 항원 부위의 바로 위에 낙하한 것만이 포집될 것이고 버퍼 세척 단계에서 잔액이 세척된다. 그러므로, 농도가 컷오프의 25% 이상, 포화로부터 25% 미만이라면, 침착된 항체 농도가 설정될 수 있다.The concentration applied, the volume dispensed, and the surface area on the slide exposed to the reagent of the primary antibody are known. It can be reasonably assumed that during the exposure time of the reagent, most of the floating antibody will fall and be captured by the receiving antigenic site. Only those that fall directly above the antigenic site will be captured and the balance washed in the buffer wash step. Therefore, if the concentration is greater than 25% of the cutoff and less than 25% from saturation, the deposited antibody concentration can be established.
a. 컷오프는 적용된 단백질 농도를 포집하기에 불충분한 타깃 부위 밀도로서 정의된다.a. The cutoff is defined as the target site density insufficient to capture the applied protein concentration.
b. 포화는 적용된 모든 단백질 농도를 포집할 수 없는 것으로 정의된다.b. Saturation is defined as the inability to capture all applied protein concentrations.
일차 희석 배율을 알면, 정확한 일차 타깃 밀도 타깃이 선택될 수 있고 일차 농도가 검증될 수 있다.Knowing the primary dilution factor, the correct primary target density target can be selected and the primary concentration can be verified.
이차 및 일차 타깃은 각각 [(마우스 또는 토끼) +(당나귀 + 가교제 + 균류 억제제)] 또는 [(항원 A가 있는 KLH 또는 항원 B가 있는 KLH) +(비결합성(unconjugated) KLH + 가교제 + 균류 억제제)]의 혼합물이다. 각 도트는 총 단백질의 체적은 동일하지만, 특정 타깃을 구성하는 단백질 간에 원자 질량이 상이할 수 있으므로, 혼합비가 약간 조절되어야 한다. 예를 들면,Secondary and primary targets are [(mouse or rabbit) + (donkey + crosslinker + fungal inhibitor)] or [(KLH with antigen A or KLH with antigen B) + (unconjugated KLH + crosslinker + fungal inhibitor) )]. Each dot has the same total protein volume, but since the atomic mass may be different between proteins constituting a specific target, the mixing ratio should be slightly adjusted. For example,
A. 마우스 IgG = 155kDaA. Mouse IgG = 155 kDa
B. 토끼 IgG = 150kDaB. Rabbit IgG = 150 kDa
C. 당나귀 IgG = 160kDaC. Donkey IgG = 160 kDa
D. 항원 펩타이드 가닥과 결합된 KLH 서브 유닛(여기에서, 서브 유닛은 KLH1 및 KLH2) = 350 & 390kDaD. KLH subunit bound to the antigenic peptide strand (here, the subunits are KLH1 and KLH2) = 350 & 390kDa
2D 이차 타깃 시리즈는 20log(희석) 프로파일을 따르는 10 내지 100% 사이의 범위이며, 여기에서, 희석은 1:1 및 1,000:1 사이의 범위이다. 단일 2D/3D 타깃이 2D 베이스 및 3D 입자 사이의 착색 밀도 증분(delta)을 측정하는 데에 사용된다. 증분은 2D 어레이의 밸런스에 적용되어 조직 절편 내에서 또는 조직 절편 상에서 보이는 3D 거동과 양호하게 일치하는 색 밀도 척도를 생성할 수 있다.The 2D secondary target series ranges between 10 and 100% following a 20 log (dilution) profile, where the dilution ranges between 1: 1 and 1,000: 1. A single 2D / 3D target is used to measure the color density increment (delta) between the 2D base and 3D particles. The increment can be applied to the balance of the 2D array to produce a color density measure that is in good agreement with the 3D behavior seen within or on tissue sections.
이차 100% 2D/3D 및 2D 타깃은 2개의 침착물이 2D 착색 밀도와 관련하여 일치하는지를 검증한다. 이는 2D 성분의 이동을 초래하도록 입자 성분이 100% 단백질 물질을 충분히 소비하지 않았음을 검증하는 것이다.Secondary 100% 2D / 3D and 2D targets verify that the two deposits are consistent with respect to 2D pigmentation density. This is to verify that the particle component has not consumed enough 100% protein material to cause migration of the 2D component.
이차 착색은 착색 시약의 구성인1 내지 20배의 효소 이득 기능을 포함한다. 따라서, 이득이 증가함에 따라, 저농도 이차 타깃이 포화 상태로 전환되는 한편, 이득이 1로 떨어지면, 고농도 이차 타깃만이 가시적으로 착색된다.Secondary coloring includes the enzyme benefit function of 1 to 20 times that of the coloring reagent. Therefore, as the gain increases, the low-concentration secondary target is converted to the saturation state, while when the gain falls to 1, only the high-concentration secondary target is visually colored.
이차 타깃 어레이가 공칭적으로 고정되지 않으면, IHC 슬라이드가 경험하는 항원 회수 과정에서 침착물이 손상될 것이다. 이는 영향의 척도를 제공하지만, 조직에 대한 AR 영향이 무엇이 될지는 항상 알 수 없기 때문에, 조직에 적용될 수 있는 항원 밀도 척도를 생성하는 데에는 유용하지 않다. 따라서, 항원 밀도 척도는 조직 절편 상에 또는 조직 절편 내에 남아 있는 것 만을 반영할 수 있다. 따라서, AR 과정을 평가하는 QC 사용에 대해 2개의 항원 회수 타깃이 제공된다.If the secondary target array is not nominally fixed, the deposits will be damaged during the antigen recovery process experienced by the IHC slide. This provides a measure of the impact, but since it is not always known what the AR effect on the tissue will be, it is not useful to generate an antigen density measure that can be applied to the tissue. Thus, the antigen density measure can only reflect what remains on or within the tissue section. Thus, two antigen recovery targets are provided for the use of QC to assess the AR process.
이차 및 일차 타깃 단백질 간의 상당한 크기 차이로 인해, 단백질 농도 밀도가 일차 단백질에 의해 설정될 것이다. KLH 서브 유닛 KLH1 & KLH2이 50:50 분포를 갖는다는 전제를 인정한다면, 일차 타깃 희석을 설정하는 데에 이들의 평균 값인 370kDa가 사용될 수 있다.Due to the significant size difference between the secondary and primary target proteins, the protein concentration density will be set by the primary protein. Given the premise that the KLH subunits KLH1 & KLH2 have a 50:50 distribution, their average value of 370 kDa can be used to establish the primary target dilution.
평균 일차 항체 원자 질량이 150kDa이면, 단일 항체의 중량은 249×10-12ηg의 중량과 동일한 150kDa (1.6605×10-12). 노출된 부분만으로서 슬라이드의 단일 면적을 선택한다면, 적용된 일차 시약의 양을 전개할 수 있다. 따라서, 내부 치수가 20.3mm2×0.14mm 높이인 폐쇄된 모세관 간극에서, 체적은 57.2μl이다. 적용된 일차 항체 시약의 0.1μl를 생성하는 타깃 도트 중 하나의 면적을 나타내는 1mm 직경 직경의 타깃 구역에 대한 비율.If the average primary antibody atomic mass is 150 kDa, then the weight of a single antibody is 150 kDa (1.6605 x 10 -12 ) equal to the weight of 249 x 10 -12 ηg. If a single area of the slide is selected as only the exposed portion, the amount of primary reagent applied can be developed. Thus, in a closed capillary gap with an internal dimension of 20.3 mm 2 x 0.14 mm high, the volume is 57.2 μl. Ratio to target area of 1 mm diameter diameter representing the area of one of the target dots that produces 0.1 μl of the applied primary antibody reagent.
일차 항체 시약은 그 농축물로부터 1 to 100μg/ml 사이의 범위로 희석된다. 따라서, 1 내지 100μg/ml의 적용된 일차 희석에 대하여, 타깃이 0.1 to 1μg의 항체에 노출된다. 항체의 중량이 공칭적으로 249×10-12ηg이면, 1mm 타깃 최대 단백질 노출 범위는 41.06 내지 4106 항체가 될 것이다.Primary antibody reagents are diluted from 1 to 100 μg / ml from the concentrate. Thus, for the applied primary dilution of 1 to 100 μg / ml, the target is exposed to 0.1 to 1 μg of antibody. If the weight of the antibody is nominally 249 × 10 −12 ηg, the 1 mm target maximum protein exposure range will be 41.06 to 4106 antibodies.
100% 포집 능력을 확보하기 위해, 일차 타깃은 안전 계수 of 100 내지 1000배의 안전 계수를 가져야 한다. 1000배(1000x) 옵션을 선택하면, 일차 타깃은 4×106 항원 부위를 포함하여야 한다. KHL 서브 유닛은 적용된 항체보다 크지만, 이러한 증가는 포집된 항체의 수를 1:1을 초과하여 바꾸는 데에는 충분하지 않다. 각 KLH 서브 유닛은 614.4×10-12ηg의 중량과 동일한 370kDa의 평균 원자 질량을 갖는다.To ensure 100% capture capability, the primary target should have a safety factor of 100 to 1000 times the safety factor. If the 1000x (1000x) option is selected, the primary target should contain a 4x10 6 antigenic site. The KHL subunit is larger than the applied antibody, but this increase is not sufficient to change the number of captured antibodies beyond 1: 1. Each KLH subunit has an average atomic mass of 370 kDa equal to a weight of 614.4 x 10 -12 ηg.
단백질 분자의 체적은 매우 단순하고 신뢰할 수 있게 단백질의 분자량 및 평균 단백질 부분 비체적과 근사할 수 있다. (부분 비체적 = 체적/분자량) 가용성 구상성(globular) 단백질의 실험으로 결정된 부분 비체적의 평균은 0.73cm3/g이다. 이러한 값은 단백질마다 다르지만, 그 범위는 오히려 좁다. 이 방정식은 ~(1.212×103×MW)ηm3의 단백질 체적까지 감소한다. 그러므로, KLH 서브 유닛에 대해, 개별 체적는 448.44ηm3이다. 단백질이 구형으로 모델링되면, 구의 직경은 0.132×MW1/3inηm가 된다. KLH 서브 유닛에 대해, 이는 9.436ηm이다. The volume of the protein molecule can be very simple and reliably approximated to the molecular weight of the protein and the specific protein portion specific volume. (Partial specific volume = volume / molecular weight) The average of the specific specific volume determined by the experiment of soluble globular protein is 0.73 cm 3 / g. These values vary from protein to protein, but the range is rather narrow. This equation decreases to a protein volume of ~ (1.212 × 10 3 × MW) ηm 3 . Therefore, for the KLH sub-unit, the individual volume is 448.44ηm 3 . When the protein is modeled as spherical, the diameter of the sphere is 0.132 × MW 1/3 inηm. For the KLH sub-unit, it is 9.436ηm.
1mm의 타깃 직경에 대해, KLH 서브 유닛의 단일층은 11.237×1027단백질을 필요로 한다. 4×106 단백질의 활성 타깃 밀도에 대해, 최소 희석 비율은 1:2.8×1021이 된다. 실용적인 측면에서, 일차 항체의 평가가 그 활성 단백질 농도에 의해 좌우되기 때문에, 1:1000에 근접하는 임의의 희석이 작용 가능하다. 그러므로, 타깃 밀도는 그의 저농도 바닥 값에 의해서만 제한된다.For a target diameter of 1 mm, a single layer of KLH subunit requires 11.237 × 10 27 protein. For the active target density of the 4 × 10 6 protein, the minimum dilution ratio is 1: 2.8 × 10 21 . In practical terms, any dilution close to 1: 1000 is possible, since the evaluation of the primary antibody depends on its active protein concentration. Therefore, target density is limited only by its low concentration bottom value.
이차 타깃 어레이는 1:1 및 1,000:1 사이의 단계적 희석 증분이다. 희석용 선형 기울기는 -20log(희석)(이후 dBd라고 함)으로서 발생한다. 1:1 및 1,000:1 사이에 열거된 희석 범위에서, 편대수(semi-log) 범위는 0 내지 -60dBd이다. -3dBd 희석 단계를 선택하면, 이차 타깃 희석은 0, -3, -6, -9, -12, -15, -18, -21dBd가 된다.The secondary target array is a stepwise dilution increment between 1: 1 and 1,000: 1. The linear gradient for dilution occurs as -20 log (dilution) (hereinafter referred to as dBd). In the dilution ranges listed between 1: 1 and 1,000: 1, the semi-log range is 0 to -60 dBd. When the -3dBd dilution step is selected, the secondary target dilution is 0, -3, -6, -9, -12, -15, -18, -21dBd.
착색은 일차 항체의 농도 및 이차 착색 키트의 효소 이득의 함수로서 포화 또는 컷오프를 경험할 수 있다. 포화는 효소 부위의 밀도가 크로모겐로부터 착색제를 침전시키기 위한 용량을 초과할 때이다. 다시 말하면, 착색 색채가 실현될 수 있을 만큼 어둡다. 일차 항체의 농도 및 이차 착색 키트의 효소 이득이 너무 낮아 착색제 침전이 불충분할 때 컷오프가 발생한다. 이러한 두가지 요인은 이차 라인의 암흑이 포화(100%) 또는 컷오프(0%)로 전환되도록 한다. 도 2를 기준으로, 이러한 이동은 가시적인 타깃의 수로서 보여진다. 이차 효소 이득이 증가함에 따라, 100% 도트 밀도가 0% 위치를 향하여 이동한다. 일반적인 효소 이득은 1, 2, 4, 5, 8, 10, 15, 20이다. 이는 이차 어레이를 0% 위치를 향하여 이동하는 것으로 해석된다.Pigmentation can experience saturation or cutoff as a function of the concentration of the primary antibody and the enzyme benefit of the secondary coloring kit. Saturation is when the density of the enzyme site exceeds the capacity to precipitate the colorant from chromogen. In other words, the coloring color is dark enough to be realized. The cutoff occurs when the concentration of the primary antibody and the enzyme benefit of the secondary coloring kit is too low to cause insufficient colorant precipitation. These two factors cause the secondary line's darkness to switch to saturation (100%) or cutoff (0%). 2, this movement is shown as the number of visible targets. As the secondary enzyme gain increases, the 100% dot density moves towards the 0% position. Common enzyme benefits are 1, 2, 4, 5, 8, 10, 15 and 20. This translates to moving the secondary array towards the 0% position.
● 20x 모든 타깃 이동 -26dBd● 20x All target movement -26dBd
● 15x 모든 타깃 이동 -23.52● 15x Move all targets -23.52
● 10x 모든 타깃 이동 -20● 10x Move all targets -20
● 5x 모든 타깃 이동 -13.98● 5x Move all targets -13.98
● 4x 모든 타깃 이동 -12.04● 4x Move all targets -12.04
● 2x 모든 타깃 이동 -6.02● 2x All target movement -6.02
● 1x 흑색과 인접한 2D 100)% 도트만● 1x Only 2D 100)% dots adjacent to black
일차 타깃 어레이가 존재하면, 이차 효소 이득의 증가는 착색 밀도를 낮은 일차 농도 도트를 향하여 이동시킨다. 일차 항체 농도가 증가되는 경우에도 동일하다. 항원 회수 과정은 일차 및 이차 타깃 모두를 어느 정도로 저하시켜 컷오프을 향하는 이동을 역전시킨다. IHC 착색의 종료 시, 슬라이드에서 셋 이상의 도트가 사라지면, 과도한 항원 회수 지속 기간, 온도, 또는 이 둘 모두를 가졌다고 여겨질 것이며, 지나치게 많은 항원의 존재는 조직 상에서 손실되므로, 진단 해석을 미미하게 한다. 이차 착색이 이미 손상된 것으로 보이므로, 이러한 결정은 일차 항체의 효능과 무관하다. 항체 단계에서는 어떤 것도 이러한 손상 수준을 극복할 수 없다.If a primary target array is present, an increase in secondary enzyme gain shifts the color density towards the lower primary concentration dot. The same is true when the primary antibody concentration is increased. The antigen recovery process lowers both the primary and secondary targets to some extent, reversing the movement towards the cutoff. At the end of IHC staining, if three or more dots disappear from the slide, it will be considered to have excessive antigen recovery duration, temperature, or both, and the presence of too much antigen is lost in the tissue, thus making diagnostic interpretation insignificant. . Since secondary pigmentation appears to be already impaired, this determination is independent of the efficacy of the primary antibody. Nothing at the antibody stage can overcome this level of damage.
통상적으로, 셋 이상의 도트에 의해 이차 어레이를 100% 위치로 이동시키는 AR 손상은 과도한 것으로 여겨지며, 더 높은 효소 이득 이차 착색 키트 또는 더 높은 농도의 항체를 사용하여 슬라이드가 다시 만들어져야 한다.Typically, the AR damage that moves the secondary array to the 100% position by three or more dots is considered excessive, and slides must be re-created using a higher enzyme gain secondary staining kit or higher concentration of antibody.
따라서, 일차 항원 타깃 색 밀도는 항체 농도에 이차 착색 키트이 효소 이득을 곱한 것의 총 합이다. 이차 타깃 밀도는 효소 이득에 이차 타깃 단백질 농도를 곱한 것일 뿐이다.Therefore, the primary antigen target color density is the sum of the antibody concentration multiplied by the enzyme benefits of the secondary coloring kit. The secondary target density is simply the enzyme gain multiplied by the secondary target protein concentration.
디지털 영상 시스템에 따라, 조명 강도의 변화는 이미지의 동적 범위를 압축(더 어두워짐) 또는 포화(더 밝아짐)로 이동시킬 것이다. 이러한 변화는 항원 색채 척도를 이동시키는 한편, 항원 밀도 수치 척도는 이동시키지 않을 것이다. 그러므로, 수치 척도는 독립적이며, 색채 척도는 조명 강도에 따라 결정된다.Depending on the digital imaging system, changes in illumination intensity will shift the dynamic range of the image to compression (darker) or saturation (lighter). This change will shift the antigen colorimetric scale, while not the antigen density numeric scale. Therefore, the numerical scale is independent, and the color scale is determined according to the illumination intensity.
QC 모드에서, 도 3에 도시된 바와 같이, 공존의 타깃은 IHC 과정 피드백을 제공한다. 5, 10, 30, 40%의 공칭 이내인, 초과하는, 매우 초과하는, 그리고 과도하게 초과하는 것으로부터 수행되는 항원 회수의 정도에서 차이가 표시된 4개의 라인의 이차 어레이가 존재한다. 항원 회수 과정은 포름알데히드 및 단백질 사이의 시프(Schiff) 염기 결합을 역전시켜 항원 부위의 마스킹 해제를 도모한다. 항원이 노출되는 속도는 반응의 온도에 크게 의존한다. 온도가 증가함에 따라, 유핵 비등(nucleated boiling)의 기회가 발생한다. 유핵 비등은 조직 및 단백질 침착물 모두에 물리적인 손상을 일으킨다. 이상적으로, 항원 회수 활동은 슬라이드를 통해 균일하지만, 현실적으로는 발생하지 않아, 사용된 방법 및 환경에 따라 항원 회수 활동이 크거나 적게 이루어지는 면적이 생긴다. 균일한 항원 회수 활동을 가정하면, 슬라이드가 진단 판단에 사용 가능한 것임을 나타내는 데에 후술하는 것이 사용될 수 있다.In QC mode, as shown in Figure 3, the coexistence target provides IHC process feedback. There are four lines of secondary arrays with differences in the degree of antigen recovery performed from exceeding, exceeding, exceeding, and exceeding within 5, 10, 30, 40% nominal. The antigen recovery process reverses the binding of the Schiff base between formaldehyde and protein to promote masking of the antigen site. The rate at which the antigen is exposed is highly dependent on the temperature of the reaction. As the temperature increases, the opportunity for nucleated boiling occurs. Nucleated boiling causes physical damage to both tissue and protein deposits. Ideally, the antigen recovery activity is uniform through the slide, but in reality it does not occur, resulting in an area with large or low antigen recovery activity depending on the method and environment used. Assuming uniform antigen recovery activity, those described below can be used to indicate that the slide is usable for diagnostic judgment.
AR이 최소이거나 과도하면, 이차 어레이는 그 실패를 반영하지 못할 수 있다. 그러나, 2개의 AR 타깃은 과도한 실패 조건을 나타낼 것이다.If AR is minimal or excessive, the secondary array may not reflect the failure. However, the two AR targets will indicate excessive failure conditions.
ㅇ 낮은 AR은 고정 타깃 하의 2D/3D 및 고정 타깃 상의 2D는 모두 흑색인 것으로 보인다. AR이 타깃의 왼쪽으로 이동하지 않고 이차 어레이가 완벽하게 보일 것이다.ㅇ The low AR seems to be black in both 2D / 3D under the fixed target and 2D on the fixed target. The AR will not move to the left side of the target and the secondary array will look perfect.
ㅇ IHC 착색제 내에서의 후술하는 상황에서 낮은 AR 활동이 발생할 수 있다.ㅇ Low AR activity may occur in the following situations in the IHC colorant.
AR 히터가 작동하지 않거나 80℃ 미만으로 설정됨 AR heater does not work or is set below 80 ℃
AR 버퍼가 6 또는 9이 아닌 중립 pH 7을 가짐 AR buffer has neutral pH 7, not 6 or 9.
노출 시간이 지나치게 짧음 Exposure time too short
ㅇ 높은 AR은 고정 타깃 하의 2D/3D가 크게 표백되고 고정 타깃 상의 2D가 50% 흑색 미만인 것으로 보인다. 이차 어레이도 크게 표백될 것이다.ㅇ In high AR, 2D / 3D under a fixed target is largely bleached, and 2D on a fixed target appears to be less than 50% black. Secondary arrays will also be bleached significantly.
ㅇ IHC 착색제 내의 후술하는 상황에서 높은 AR 활동이 발생할 수 있다.ㅇ High AR activity may occur in the following situations in the IHC colorant.
온도 > 95℃에서 작동하는 히터 Heaters operating at temperature> 95 ℃
노출 시간이 지나치게 김 Exposure time is too long
ㅇ 두 가지 상황에서 크로모겐 침전 오류가 발생할 수 있다.ㅇ Chromogen sedimentation errors can occur in two situations.
고농도 이차 타깃인 경우, 착색 강도가 최대 암흑 보다 낮아진다. 이차 어레이는 부위 밀도와 비교하여 항상 증가하여야 한다. 그렇지 않다면, 크로모겐 침전이 이차 시약 키트 용량을 소진시킨 것이다. 해결 수단은 (항체 농도의 감소와 동일하게) 일차 항체 희석을 증가시키는 것이다. In the case of a high concentration secondary target, the coloring strength is lower than the maximum darkness. The secondary array should always increase compared to the site density. If not, chromogen precipitation has exhausted the secondary reagent kit capacity. The solution is to increase the primary antibody dilution (same as reducing antibody concentration).
크로모겐 시약은 활성화됨에 따라(DAB에서 종종 발생함) 변질되었다. 해결 수단은 새로운 DAB 혼합물을 사용하는 것이다.The chromogen reagent has been altered as it is activated (often occurring in DAB). The solution is to use a new DAB mixture.
종래의 현미경을 통하여 현미경 슬라이드를 보는 것은 조명 수준과 관련하여 주관적이다. 전체 슬라이드 영상(WSI)에서, 스캐너는 완벽한 백색 및 흑색 홀을 사용하여 백색 밸런스 및 콘트라스트를 설정한다. 수동적 현미경인 경우 그렇지 않다. 도 3은 조명 수준이 지나치게 어둡고(최적으로부터 -5%), 최적(+0), 지나치게 밝을 때(+10 또는 +15%)의 이미지에 대한 영향을 도시한다. 조도가 최적 미만이면, 착색 밀도가 압축된다. 암 단계에 있어서, 이는 진단을 필요한 것보다 한 단계 더 높게 이동시킬 수 있다. 조도가 최적을 초과하면, 이미지가 표백된다. 암 단계에 있어서, 이는 진단을 필요한 것보다 한 단계 더 낮게 이동시킬 수 있다. 항원 색 밀도 및 수치 눈금자가 일차 및 이차 타깃으로부터 전개되어 WSI 이미지에 중첩될 수 있다. 수치 척도는 독립적인 용어인 한편, 색 밀도는 종속적인 용어이다. 항원 밀도 색채 및 수치 눈금자가 WSI에 적용되면, 사용자가 조명 수준을 위 또는 아래로 이동시킴에 따라, 수치 척도는 고정된 상태로 유지된다. 다른 한편으로는, 조명 수준이 변화함에 따라 색 밀도 척도가 이동한다. 사용자가 수치 관계와 색 밀도를 잃지 않으면서 조직 이미지 상에 가장 좋은 '보기(see)' 특성으로 명백하게 조명을 올리고/낮추는 선택권을 갖는다는 점에 이점이 있다. 이는 또한 배율이 변경됨에 따라 기능할 것이다.Viewing a microscope slide through a conventional microscope is subjective with respect to the level of illumination. In the entire slide image (WSI), the scanner sets the white balance and contrast using perfect white and black holes. This is not the case with passive microscopes. FIG. 3 shows the effect on the image when the illumination level is too dark (−5% from optimal), optimal (+0), and too bright (+10 or + 15%). If the roughness is less than optimal, the color density is compressed. In the cancer stage, it can shift the diagnosis one step higher than necessary. If the illuminance exceeds optimal, the image is bleached. In the cancer stage, it can shift the diagnosis one step lower than necessary. Antigen color density and numerical rulers can be developed from primary and secondary targets to overlap the WSI image. Numerical scale is an independent term, while color density is a dependent term. When the antigen density color and numerical ruler are applied to the WSI, the numerical scale remains fixed as the user moves the illumination level up or down. On the other hand, the color density scale shifts as the illumination level changes. The advantage is that the user has the option of clearly raising / lowering the light with the best 'see' properties on the tissue image without losing the numerical relationship and color density. It will also function as the magnification changes.
항원 밀도 눈금자가 전개될 수 있는 데에 두 가지의 형태가 있다. 유형 A는 일차 항체가 항상 조직 항원 부위와 비교하여 10% 초과 항체 미만으로 적용된다는 가정을 기초로 한다. 유형 B는 일차 항원 구배 밀도 어레이를 사용한다.There are two forms in which the antigen density ruler can develop. Type A is based on the assumption that the primary antibody is always applied with less than 10% of the antibody compared to the tissue antigen site. Type B uses a primary antigen gradient density array.
유형 A: 2 차 단독 기반 항원 눈금자Type A: Secondary sole based antigen ruler
이 형태는 이차 타깃 어레이만을 사용한다. 2-D 바 코드에 포함된 전달된 정보는 (a) 일차 항체 데이터: 항체용 숙주종 및 -dBd에서의 희석 및 (b) 이차 효소 이득을 포함한다.This form uses only a secondary target array. The delivered information included in the 2-D bar code includes (a) primary antibody data: host species for the antibody and dilution at -dBd and (b) secondary enzyme gain.
이차 구배 밀도 타깃 어레이는 타깃 간의 -3dBd 감분(decrement)을 따르는 단백질의 알려진 농도로 구성된다. 최대 농도는 일차 항체에 사용되는 최소 희석에 의해 선택된다. 대부분의 사용자는 항체 시약 제조자가 제공한 농도 사양을 취하여 1ug/ml의 일정한 중간 농도로 희석한다. 이로부터 다른 모든 희석이 필요한 만큼 만들어져 상이한 조직 유형을 수용한다. 일반적으로, 제2 세트의 일차 항체 희석의 범위는 1:1 및 1,000:1 사이이다.The secondary gradient density target array consists of known concentrations of proteins following a -3dBd decrement between targets. The maximum concentration is selected by the minimum dilution used for the primary antibody. Most users take the concentration specifications provided by the antibody reagent manufacturer and dilute to a constant medium concentration of 1 ug / ml. From this, all other dilutions are made as needed to accommodate different tissue types. Generally, the range of primary antibody dilution of the second set is between 1: 1 and 1,000: 1.
이차 효소 이득의 범위를 수용하기 위해, 이차 어레이는 더 넓은 희석 범위로 구성되어야 한다. 그러므로, -3dBd 단계에서, 1,000:1 또는 SdBd로 대표되는 -60dBd로 이차 어레이의 최하 희석이 시작된다. 그러면, 8-도트 시리즈의 최대는 -0dBd 또는 1:1로 된다. 항원 회수의 작용은 ARdBd로 대표되는 이차 단백질을 감소시킨다. 이차 어레이에서, 8개 중 하나인 각 도트는 -3dBd 증분을 나타낸다. 2개의 타깃(더 이상 가시적이지 않음)의 손실에 대한 항원 회수 손실은 +6dBd가 될 것이다. 이는 이차 어레이가 2D 타깃에 대해 (-S + AR) dBd이거나 [+6 to -54dBd]인 것을 의미한다. 항체 농도 및 이차 효소 이득이 이제 고려되어야 한다. 항체 농도는 AdBd일 것인 한편, 효소 이득은 EdBd이다. 그러므로, 이차 어레이는 (-S + AR -E) dBd일 것인 한편, 조직은 (+AR -E + A) dBd일 것이다. 적용되어야 하는 새로운 요인은 100% 2D 내지 3D 차이이다. 100% 2D/3D 타깃의 3D 객체와 100% 2D 사이의 착색 차이는 2 차 착색 크로모겐 침전 상수를 나타내며, 이는 색 밀도를 수치 척도에 할당하고 DdBd에도 할당한다. 색 밀도의 차이는 어레이 내의 2D 타깃의 각각에 적용된다. 그러므로, 2D 어레이는 착색 색 밀도에서 (+AR -E +A +D) dBd로서 제공된다.To accommodate a range of secondary enzyme benefits, secondary arrays must be constructed with a wider dilution range. Therefore, in the -3dBd step, the lowest dilution of the secondary array begins with -60dBd, represented by 1,000: 1 or SdBd. Then, the maximum of the 8-dot series is -0dBd or 1: 1. The action of antigen recovery reduces the secondary protein represented by ARdBd. In the secondary array, each dot that is one of eight represents a -3 dBd increment. The loss of antigen recovery for the loss of two targets (which are no longer visible) will be + 6dBd. This means that the secondary array is (-S + AR) dBd or [+6 to -54 dBd] for the 2D target. Antibody concentration and secondary enzyme benefits should now be considered. The antibody concentration will be AdBd, while the enzyme benefit is EdBd. Therefore, the secondary array will be (-S + AR -E) dBd, while the tissue will be (+ AR -E + A) dBd. The new factor to be applied is a 100% 2D to 3D difference. The color difference between the 3D object of the 100% 2D / 3D target and the 100% 2D represents the secondary colored chromogen precipitation constant, which assigns the color density to a numerical scale and also to DdBd. The difference in color density applies to each of the 2D targets in the array. Therefore, the 2D array is provided as (+ AR -E + A + D) dBd at the color density of color.
예를 들면, 효소 이득은 10배(10x), E = -20dBd이었다. 그러면 2D 이차 어레이는: -14, -17, -20, -23, -26, -29, 블랭크(blank), 블랭크(blank) dBd가 될 것이다. 착색에 의해 복구될 수 없어 블랭크인 항원 회수 과정에 의해 충분히 손상된 0%를 향하는 2개의 도트 예를 들면, 2D/3D 색 밀도 차이는 10배(10x), D = +20dBd이며, 3D 이차 어레이를 -34, -37, -40, -43, -46, -49, 블랭크, 블랭크 dBd로 만든다. 일차 항체 시약이 100% 수율이 이루어지는 일차 타깃에서 적합한 항원 부위를 찾는 것으로 가정한다. 또한, KLH 단백질 당 2개보다 많은 항원 펩타이드 가닥이 있는 한편, KLH 단백질 당 하나의 항체만이 효과적으로 결합할 수 있고 착색될 수 있는 것으로 가정한다. 동일한 KLH 단백질에서 적합한 항원을 발견하는 임의의 추가적인 항체는 중첩 점유(overlapping occupancy)로 인해 이차 착색에 의해 완료되는 것이 방지될 것이다. 따라서, 검출될 수 있는 단백질을 수반하는 일차 항원 당 항원 부위의 수는 1이다. 일차 타깃은 이차 타깃과 마이크론 당 동일한 수의 단백질을 포함하므로, 500ug/ml 항체 마스터(master)로부터의 일차 희석이 이차 어레이 데이터에 적용되어 이차 색 밀도를 수치 항원 밀도로 조절한다. 이차 타깃을 모니터링하여 중간 색 밀도를 갖는 타깃을 선택한다. 중간 색 밀도는 최대 흑색 및 최대 백색 사이의 50% 지점으로서 정의된다. 그러면 그 지점은 3dBd 범위 외의 1.5dBd와 동일하다. 그러면, 그 지점은 항원 밀도 눈금자가 설정되는 앵커로서 기능한다. 상기 중간점 이상의 마지막 타깃 범위를 사용하면 -41.5dBd가 된다.For example, the enzyme gain was 10 times (10x), E = -20dBd. Then the 2D secondary array would be: -14, -17, -20, -23, -26, -29, blank, blank dBd. 2 dots toward 0%, which are not fully repaired by staining and are sufficiently damaged by the blank antigen recovery process, for example, 2D / 3D color density difference is 10 times (10x), D = + 20dBd, and 3D secondary array -34, -37, -40, -43, -46, -49, blank, blank dBd. It is assumed that the primary antibody reagent finds a suitable antigenic site in the primary target with 100% yield. It is also assumed that there are more than two antigenic peptide strands per KLH protein, while only one antibody per KLH protein can effectively bind and be colored. Any additional antibodies that find suitable antigens in the same KLH protein will be prevented from completing by secondary staining due to overlapping occupancy. Therefore, the number of antigenic sites per primary antigen carrying a protein that can be detected is 1. Since the primary target contains the same number of proteins per micron as the secondary target, primary dilution from a 500 ug / ml antibody master is applied to the secondary array data to adjust the secondary color density to the numerical antigen density. The secondary target is monitored to select a target with medium color density. Medium color density is defined as the 50% point between the maximum black and the maximum white. The point is then equal to 1.5 dBd outside the 3 dBd range. The point then serves as an anchor where the antigen density ruler is set. Using the last target range above the midpoint results in -41.5 dBd.
이차 단백질은 10ug/ml 마스터 희석으로 희석된다. 각 어레이는 당나귀 IgG 단백질과 혼합된 마우스 또는 토끼의 혼합물이다. 모두 150kDa이고 타깃 도트 당 총 단백질 수는 일정하고 혼합 비율은 일정하지 않은 가정하에서 단백질은 모두 상이한 원자 질량을 갖는다. 지금은 반응성 단백질 농도만이 고려된다. 150kDa에서, 개별 단백질 분자량은 MW = 249.07×1012ng이다. 표준 타깃 도트는 직경이 1mm이다. 인쇄된 침착물이 1um 두께이면, 침착물 농도는 10 ug/ml이고, 31.5×106 단백질이 침착된다. 그러면, 1um 직경 면적이 31.5 단백질을 가질 것이다. 하나의 단백질이 하나의 항원 부위와 동일하다고 하면, 항원 밀도가 설정될 수 있다. 이차 어레이는 침착물 당 동일한 수의 단백질을 사용하지만, 마우스 또는 토끼의 농도가 감소됨에 따라, 마우스 또는 토끼 및 당나귀 간의 비율이 변화한다. 100% 타깃은 전체적으로 마우스 또는 토끼이며, 눈금자 상의 0dBd 지점에 일치한다.Secondary protein is diluted to 10 ug / ml master dilution. Each array is a mixture of mouse or rabbit mixed with donkey IgG protein. All proteins have different atomic masses on the assumption that all are 150 kDa and the total number of proteins per target dot is constant and the mixing ratio is not constant. Currently, only reactive protein concentrations are considered. At 150 kDa, the individual protein molecular weight is MW = 249.07 × 10 12 ng. The standard target dot is 1 mm in diameter. If the printed deposit is 1 μm thick, the deposit concentration is 10 ug / ml, and 31.5 × 10 6 protein is deposited. Then, a 1um diameter area would have 31.5 protein. Assuming that one protein is identical to one antigen site, the antigen density can be established. The secondary array uses the same number of proteins per deposit, but as the concentration of mouse or rabbit decreases, the ratio between mouse or rabbit and donkey changes. The 100% target is the mouse or rabbit as a whole, coinciding with the 0dBd point on the ruler.
일차 항체가 조직 상의 항원 부위에 결합되면, 이차는 조직 상의 착색일 것이다. 특히, 충분한 항체 농도가 이용 가능한 항원 부위에 결합되도록 제공되어야 하는 것을 제외하고는, 적용된 항체의 농도에 의존하지 않는다. 그러므로, 조직 상에서의 항원 밀도 측정은 상수로서 유지되지만, 항원 회수 손상 및 이차 효소 이득에 대해 수치가 수정되어야 한다. 그러면 수치 측정에 대한 색 밀도는 조화를 이루어야 한다.If the primary antibody is bound to the antigenic site on the tissue, the secondary will be staining on the tissue. In particular, it does not depend on the concentration of antibody applied, except that sufficient antibody concentration should be provided to bind the available antigenic sites. Therefore, antigen density measurements on tissues remain constant, but values should be corrected for antigen recovery damage and secondary enzyme gain. Then the color density for numerical measurements must be harmonized.
이전의 예에서, 효소 이득은 10배(10x)이고, 항원 회수는 이차 어레이로부터의 2개의 도트의 손실을 초래하였다. 효소 이득은 -20dBd인 한편, 항원 회수 손실은 +6dBd이다. 결과는 -14dBd이다. 그러면 희석은 아래와 같다.In the previous example, the enzyme gain was 10 times (10x), and antigen recovery resulted in the loss of 2 dots from the secondary array. The enzyme gain is -20dBd, while the antigen recovery loss is + 6dBd. The result is -14dBd. Then the dilution is as follows.
Color density dBd
당나귀% Target Mouse / Rabbit:
Donkey
유형 B: 일차 항원 기반 눈금자Type B: primary antigen-based ruler
이 형태는 일차 및 이차 타깃 어레이 모두를 사용한다. 2-D 바 코드에 포매되어 전달된 정보는 (a) 일차 항체 데이터: 항체용 숙주종 및 dBdilution에서의 희석 및 (b) 이차 효소 이득을 포함한다. 로트(lot) 코드 데이터는 어떤 일차 타깃 조합이 사용되는지에 관한 정보를 포함한다.This form uses both primary and secondary target arrays. Information delivered embedded in the 2-D bar code includes (a) primary antibody data: host species for antibody and dilution in dBdilution and (b) secondary enzyme benefits. Lot code data includes information about which primary target combination is used.
일차 타깃 계열이 존재하는 경우, 가장 농축된 도트는 이차 어레이와 동일한 100% 농도를 가진 세 개의 도트들일 것이고, 도트들은 -6dBd 단계에서 간격을 두고 있다. 사실상, 일차 어레이 및 이차 어레이는 동일한 희석 기울기를 갖는다. 일차 타깃은: -0, -6, -12dBd이 되며, Pdbd로서 표시된다. 항원 회수 손상이 이차 어레이와 거의 동일할 것으로 예상하는 것이 타당하다. 일차 어레이는 이차 착색에 의해 작용되므로 동일한 효소 이득 기능을 경험한다. 그러므로, 일차 어레이는 (-A + AR -E) dBd이 될 것이며, 일차 타깃 밀도는 일차 항체 희석에 의해 제어된다. P가 항상 A보다 크다는 것이 유일한 요건이다. 10배(10x) 효소 이득 = -20dBd 및 +6dBd 항원 회수 손실이며, 일차 어레이는 -20, -26, -32dBd이다. 이차 어레이에 대한 영향을 기초로, 항원 회수 손실은 이들을 제거하기에 충분한 일차 타깃에 작용하지 않는다. 이차 어레이가 항원 밀도 눈금자를 생성하는 데에 충분하지만, 일차 희석이 정확하게 적용된 것은 확인하는 것이 중요하다. 그러므로, 일차 타깃은 그 용량 내에서 기능한다.If a primary target family is present, the most concentrated dot will be three dots with the same 100% concentration as the secondary array, and the dots are spaced in -6dBd steps. In fact, the primary and secondary arrays have the same dilution slope. The primary target is: -0, -6, -12dBd, and is expressed as Pdbd. It is reasonable to expect that the antigen recovery damage will be almost identical to the secondary array. Since the primary array is acted by secondary coloring, it experiences the same enzyme benefit function. Therefore, the primary array will be (-A + AR -E) dBd, and the primary target density is controlled by primary antibody dilution. The only requirement is that P is always greater than A. 10x (10x) enzyme gain = -20dBd and + 6dBd antigen recovery loss, primary arrays are -20, -26, -32dBd. Based on the effect on the secondary array, the loss of antigen recovery does not act on the primary target sufficient to remove them. Although the secondary array is sufficient to generate an antigen density ruler, it is important to confirm that the primary dilution has been applied correctly. Therefore, the primary target functions within its capacity.
본 출원은 그 전체에 "Process Record Slide for Immunohistochemical Staining"을 명칭으로 하는 출원번호 62/520319에 개시된 타깃 단백질 농도 척도를 갖는 슬라이드의 정의의 기준을 포함한다. 출원번호 62/520319에도 정의된 바와 같은 타깃 단백질 농도 척도를 갖는 상술한 슬라이드는 최소한 2개의 이차 단백질 타깃 어레이로 구성되며, 선택적으로 하나 이상의 일차 항원 타깃 어레이로 구성된다.This application includes criteria for the definition of slides with a target protein concentration scale disclosed in application number 62/520319, entitled "Process Record Slide for Immunohistochemical Staining" in its entirety. The above-described slide with a target protein concentration scale as defined in application number 62/520319 also consists of at least two secondary protein target arrays, and optionally one or more primary antigen target arrays.
본 발명의 일 실시예에서, 상술한 이차 단백질 타깃 어레이는 2개의 라인으로 형성되며: 20log (희석) 곡선에서 최대 밀도부터 최소 밀도로 진행하는 5개 이상의 부재 구배 밀도 시리즈를 형성하기 위해 더미 IgG 혈청 단백질과 혼합되는 마우스 IgG 및 다른 토끼 IgG 중 하나이며, 희석은 1:1 및 1,000:1 사이의 범위일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the secondary protein target array described above is formed of two lines: dummy IgG serum to form a series of five or more member gradient densities that progress from maximum density to minimum density in a 20 log (dilution) curve. It is one of the mouse IgG and other rabbit IgG mixed with the protein, and the dilution can range between 1: 1 and 1,000: 1.
다른 실시예에서, 마지막 공정 단계에서, 식별된 항원 부위는 크로모겐 침전에 의해 착색된다. 그러므로, 마우스 & 토끼 타깃 어레이는 이차 착색 키트 크로모겐 침전의 20log (희석) 곡선을 반영한다.In other examples, in the final process step, the identified antigenic sites are colored by chromogen precipitation. Therefore, the mouse & rabbit target array reflects the 20log (dilution) curve of the secondary staining kit chromogen precipitation.
다른 실시예에서, 일차 항원 밀도 척도를 형성하는 방법의 바람직한 해결 수단은 성공적으로 타깃 혼합물을 구성하여 이를 타깃 단백질 농도 척도로 슬라이드 상으로 침착시키고 접착제 및 타깃 물질 사이에 공유 결합을 갖는 것에 기반한다.In another embodiment, a preferred solution of the method of forming a primary antigen density measure is based on successfully constructing a target mixture, depositing it onto a slide on a target protein concentration scale and having a covalent bond between the adhesive and the target material.
다른 실시예에서, 타깃 어레이가 성공적으로 적용되고 일차 및 이차 착색 시약이 모두 합리적으로 수행된다고 추론하면, 데이터 세트 사이의 곡선 피팅이 컴퓨터 알고리즘에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 다른 실시예에서, 형광 마커에 결합되지 않거나 효소 부위(HRP 또는 AP 등)와 일체화되지 않는 마우스 또는 토끼 숙주 단백질을 사용하는 임의의 IHC 승인 항체로부터 일차 착색이 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, 효소 이득이 1배(1x) 내지 25배(25x)이며, 각각 상이한 색채 크로모겐을 사용하는 마우스 및 토끼 사이에서 고유하게 독립적인 이차 착색으로부터 이차 착색이 선택될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.In other embodiments, curve fitting between data sets can be easily performed by computer algorithms, deducing that the target array has been successfully applied and both primary and secondary coloring reagents have been performed reasonably. In other embodiments, primary staining can be selected from any IHC approved antibody that uses mouse or rabbit host proteins that do not bind to a fluorescent marker or integrate with an enzyme site (such as HRP or AP). In other embodiments, the secondary gain can be selected from secondary staining that is uniquely independent between mice and rabbits with enzyme gains between 1x (1x) and 25x (25x), each using a different color chromogen. It is not limited.
본 발명의 다른 실시예에서, 하나의 슬라이드 상의 절대 기준에서의 성능 결과가 다른 시간에 수행된 다른 슬라이드와 동일하지 않을 수 있다는 점에 주목하는 것이 적절하다. 이는 성능 로트면에서 이차 착색 키트가 일차 결합 일차 항체와 같은 로트까지 달라지는 사실에 비롯된다. 그러나, 타깃 단백질 농도 척도를 갖는 임의의 하나의 슬라이드에 대한 성능에서, 항원 척도가 유효할 것이며, 상이한 착색 시약을 사용하여 수행된 다른 슬라이드와 거의 동등할 것이다.It is appropriate to note that in other embodiments of the present invention, the performance results at absolute criteria on one slide may not be the same as another slide performed at different times. This is due to the fact that in terms of performance lot the secondary coloring kit varies from lot to lot, such as the primary binding primary antibody. However, in performance for any one slide that has a target protein concentration scale, the antigen scale will be effective and will be nearly equivalent to other slides performed using different coloring reagents.
다른 실시예에서, 다음으로, 암과 같은 검출된 세포 결손의 조직 절편으로 접근하기 위해 일차 항원 농도 척도가 공존의 조직 절편에 적용된다.In another embodiment, a primary antigen concentration scale is then applied to the coexisting tissue sections to access tissue sections of the detected cell defect, such as cancer.
다른 실시예에서, 타깃 단백질 농도 척도를 갖는 슬라이드가 후술된다.In other examples, slides with a target protein concentration scale are described below.
검출 구역 및 제어 구역을 포함하는 슬라이드에 있어서,In the slide comprising a detection zone and a control zone,
검출 구역은 조직 절편 또는 느슨한 세포가 면역 조직 화학적 특성(IHC) 및 후속하는 검사를 통한 처리에 적용되는 공간이고,The detection zone is a space where tissue sections or loose cells are applied for processing through immunohistochemical properties (IHC) and subsequent examination,
제어 구역은 하나 이상의 세트의 일차 및/또는 이차 타깃 어레이를 포함하며,The control zone includes one or more sets of primary and / or secondary target arrays,
이차 타깃 어레이는 하나 이상(예를 들면, 1 내지 50, 5 내지 45, 10 내지 40, 15 내지 35 또는 20 내지 30, 특히, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 이차 타깃 로딩 도트(도트는 원형, 타원, 정사각형, 다이아몬드 등의 임의의 규칙적인 또는 불규칙적인 형상일 수 있음)를 포함하며, 각각의 이차 타깃 로딩 도트는 특정 비율로 슬라이드에 고정된 숙주 단백질(예를 들면, IgG) 및 더미 단백질(예를 들면, IgG)의 혼합물이다.One or more secondary target arrays (e.g., 1 to 50, 5 to 45, 10 to 40, 15 to 35 or 20 to 30, in particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) Or 10) secondary target loading dots (dots may be of any regular or irregular shape, such as circular, elliptical, square, diamond, etc.), each secondary target loading dot fixed to the slide at a specific rate It is a mixture of host protein (eg, IgG) and dummy protein (eg, IgG).
"더미 단백질"이라는 용어는 이차 항체에 대해 비반응성이며 구배 희석을 얻기 위해 숙주 단백질과 혼합하는 데에 사용되는 단백질을 의미한다. 바람직한 더미 단백질은 당나귀 단백질(IgG) 또는 말 단백질(IgG)이다.The term "dummy protein" refers to a protein that is non-reactive to secondary antibodies and is used to mix with the host protein to obtain a gradient dilution. Preferred dummy proteins are donkey protein (IgG) or horse protein (IgG).
"숙주 단백질"이라는 용어는 마우스, 쥐, 토끼, 당나귀, 말, 및 염소 단백질(IgG)과 같은 일차 항체와 동일한 기원을 갖는 단백질(특히, IgG)을 의미한다.The term "host protein" refers to a protein (especially IgG) having the same origin as a primary antibody, such as mouse, mouse, rabbit, donkey, horse, and goat protein (IgG).
슬라이드의 일 예가 도 2의 타깃이 상세하게 식별되는 도 1에 도시된다.An example of a slide is shown in FIG. 1 where the target of FIG. 2 is identified in detail.
다양한 실시예가 예로서 본원에 설명된다. 본원에 제시된 본 발명의 더 넓은 범위로부터 벗어나지 않고 다양한 수정이 만들어질 수 있고 다른 실시예가 사용될 수 있는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 예시적인 실시예에 따른 이러한 변형 및 다른 변형은 본 발명에 속하는 것으로 의도된다.Various embodiments are described herein as examples. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made and other embodiments can be used without departing from the broader scope of the invention presented herein. These and other modifications according to exemplary embodiments are intended to be within the present invention.
본 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 2017년 6월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 US 62/520187 및 2017년 6월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 62/520319의 우선권을 주장한다.This application claims the priority of US provisional application number US 62/520187 filed on June 15, 2017 and US provisional application number 62/520319 filed on June 15, 2017, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
Claims (10)
(a) 항체로 구성되는 일차 착색 시약에 현미경 슬라이드를 노출시키는 단계;
(b) 일치하는 항원 타깃 상에서 상기 항체를 포집하는 단계;
(c) (a) 단계에서의 상기 항체 및 이차 타깃 어레이 사이에서 항원 식별용 이차 착색 시약 키트와 결합하는 단계;
(d) 크로모겐 침전에 의해 (c) 단계의 상기 식별된 항원을 착색하는 단계;
(e) 색채 강도를 산출/비교하는 단계를 포함하고, 상기 현미경 슬라이드는 검출 구역 및 제어 구역을 포함하고,
상기 검출 구역은 조직 절편 또는 느슨한 세포가 면역 조직 화학적 특성(IHC) 및 후속하는 검사를 통한 처리에 적용되는 공간이고, 상기 제어 구역은 2개의 이차 포유 동물 IgG 어레이를 포함하며, 선택적으로 특정 비율로 상기 슬라이드에 고정되는 하나 이상의 세트의 항원 어레이를 포함하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법.In an IHC image extrapolation method in which an antigen concentration scale is developed from a series of known gradient density targets of antigen concentration and secondary mammalian IgG,
(a) exposing the microscope slide to a primary coloring reagent consisting of an antibody;
(b) capturing the antibody on a matching antigen target;
(c) binding to a secondary coloring reagent kit for antigen identification between the antibody and the secondary target array in step (a);
(d) coloring the identified antigen of step (c) by chromogen precipitation;
(e) calculating / comparing color intensity, the microscope slide comprising a detection zone and a control zone,
The detection zone is a space where tissue sections or loose cells are subjected to processing through immunohistochemical properties (IHC) and subsequent examinations, the control zone comprising two secondary mammalian IgG arrays, optionally at specific proportions An IHC image extrapolation method comprising one or more sets of antigen arrays immobilized on the slide.
상기 항체는 마우스 IgG 또는 토끼 IgG 유형 항체인 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법.According to claim 1,
The antibody is a mouse IgG or rabbit IgG type antibody, characterized in that the IHC image extrapolation (extrapolation) method.
항원 및 이차 포유 동물 IgG 로딩 도트는 모두 원형, 타원형, 정사각형, 다이아몬드 등의 임의의 규칙적인 또는 불규칙적인 형상인 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법.The method of claim 1 or 2,
IHC image extrapolation method, characterized in that the antigen and secondary mammalian IgG loading dots are of any regular or irregular shape, such as round, oval, square, diamond, and the like.
형광 마커에 결합되지 않거나 효소 부위(HRP 또는 AP 등)와 일체화되지 않은 마우스 또는 토끼 숙주 단백질을 사용하는 IHC 승인 항체로부터 상기 항체가 선택되는 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법.The method according to any one of claims 1 to 3,
IHC imaging extrapolation method, characterized in that the antibody is selected from IHC approved antibodies using mouse or rabbit host proteins that are not bound to a fluorescent marker or integrated with an enzyme site (such as HRP or AP).
효소 이득이 1배(1x) 내지 25배(25x)이며, 각각 상이한 색채 크로모겐을 사용하는 마우스 및 토끼 사이에서 고유하게 독립적인 이차 착색으로부터 상기 이차 착색 시약이 선택되는 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법.The method according to any one of claims 1 to 4,
IHC image extrapolation, characterized in that the secondary coloration reagent is selected from secondary staining that is uniquely independent between mice and rabbits with enzyme gains between 1x (1x) and 25x (25x), each using a different color chromogen. (extrapolation) method.
상기 방법은 타깃의 어레이를 갖는 접착제 코팅 현미경 슬라이드 상에 구현될 수 있으며, 그 최소는 조직 절편과 공존하는 마우스 및 토끼 IgG 단백질의 구배 밀도 어레이를 갖는 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법.The method according to any one of claims 1 to 5,
The method can be implemented on an adhesive coated microscope slide with an array of targets, the minimum of which is an IHC image extrapolation method characterized by having a gradient density array of mouse and rabbit IgG proteins coexisting with tissue sections.
상기 어레이 타깃 모두는 20log(희석) 곡선 상의 부재이며, 상기 희석은 1:1로부터 1,000:1까지의 범위인 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법.The method according to any one of claims 1 to 6,
All of the array targets are absent on a 20 log (dilution) curve, and the dilution ranges from 1: 1 to 1,000: 1.
상기 착색 시약에서의 반응성 변동을 보상하면서, 20log(희석) 프로파일을 갖는 이차 단백질 시리즈로부터 보다 많은 수의 지점을 사용하는 확장된 척도로 20log(희석) 프로파일 상에 확장된 항원 척도가 3개의 지점으로부터 투영되는 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법.The method according to any one of claims 1 to 7,
The antigen scale extended on the 20 log (dilution) profile from 3 points with an extended scale using a larger number of points from the secondary protein series with a 20 log (dilution) profile, while compensating for the reactive fluctuations in the coloring reagent. IHC image extrapolation (extrapolation) method characterized in that the projection.
각 항원 척도는 객관적 척도(objective measure)로 상기 공존의 조직 절편 내의 동일한 항원 밀도를 측정하는 데에 적용되는 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법.The method according to any one of claims 1 to 8,
Each antigenic measure is an objective measure (objective measure) IHC image extrapolation (extrapolation) method, characterized in that applied to measure the same antigen density in the tissue section of the coexistence.
상기 일차 항원 농도 척도는 그런 다음 암과 같은 검출된 세포 결손의 상기 조직 절편으로 접근하기 위해 상기 공존의 조직 절편에 적용되는 것을 특징으로 하는 IHC 영상 외삽(extrapolation) 방법.The method according to any one of claims 1 to 9,
The primary antigen concentration scale is then applied to the coexisting tissue section to access the tissue section of a detected cell defect such as cancer, an IHC image extrapolation method.
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