KR20200036017A - 상용적인 암 면역요법의 플랫폼으로서 cd1d-제한된 nkt 세포 - Google Patents

상용적인 암 면역요법의 플랫폼으로서 cd1d-제한된 nkt 세포 Download PDF

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Abstract

본원의 구현예는 숙주 개체에 보편적으로 허용될 수 있는 동종이계 세포를 포함하는 면역요법을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 내인성 β2-마이크로글로불린 (B2M) 및/또는 MHC 클래스 II-부속 불변 체인 (Ii)의 발현이 감소된 것이며, 특정 경우에 세포는 숙주 조직을 손상시키는 능력이 결핍되고, 숙주 면역 세포에 의한 인지가 현저하게 감소되고, 놀랍게도 숙주 NK 세포에 의한 파괴를 회피하는, NKT 세포이다. 일부 구현예에서, B2M- 및/또는 Ii-타겟팅 분자는, 예를 들어, 보편적으로 허용되는 상용 면역치료제를 원-히트 제조하기 위해, 재조합에 의해 조작된 수용체와 조합하여 (하나의 구조체 내에서) 발현되도록 조작된다.

Description

상용적인 암 면역요법의 플랫폼으로서 CD1D-제한된 NKT 세포
이 출원은 2017년 8월 11일자 EP 특허 출원 17185992.9에 대해 우선권을 주장하며, 이 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 적어도 세포 생물학, 분자 생물학, 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다.
자가 종양-특이적인 T 세포를 이용한 암 면역요법. 종양-특이적인 T 세포를 분리 및 증폭한 후 이를 다시 환자에게 주입 (입양 전달)하는 전략은 유망한 암 치료 방법이다. 이러한 치료는 일부 흑색종 환자들에서 성공적이었으며, 자가-흑색종-특이 T 세포를 주입한 후 완전하고 지속적인 종양 퇴행을 달성할 수 있었다 (1). 그러나, T 세포 요법은 다른 면역원성이 낮은 암에 대한 치료로서 견고한 T 세포 반응을 유발할 수 있는 분자적으로-정의되는 종양 항원이 부족하고 종양-보유 숙주로부터 이러한 T 세포를 분리하기 어려운 문제로 인해, 제한적이었다.
CAR-전향된 (CAR-redirected) 자가 T 세포를 이용한 암 면역요법. 전향된 항원 특이성을 위해 T 세포를 키메라 항원 수용체 (CAR) 유전자를 이용해 변형하는 방법은, 기-존재하는 항-종양 T 세포 면역에 기대지 않는 입양 요법을 위한 작동자 세포를 구축하는 한가지 전략이다. 최근 임상 실험에서, CD19 항원으로 전향된 T 세포는 B 세포 림프종 및 림프종 환자들에서 지속적인 완전한 반응을 유발할 수 있는 것으로, 나타났다 (2-7). 그러나, 림프종 환자에서 수득된 T 세포는 질환 및 화학요법의 작용으로 인해 증식력 저하를 나타낸다. 생산물 제조 중에 T 세포의 증식성 감소는, 신규 진단된 환자들 중 불과 25%, 그리고 치료받은 림프종 소아 환자들 중 12.5%만 자가 CD19 CAR T 세포를 주입받을 수 있다는 것을 의미한다 (8). 림프종 환자에서와 마찬가지로, T 세포의 수 및 기능상의 문제는 다수 타입의 암 환자들에서 일반적이다 (9-12). 이러한 한계를 극복하기 위한 한가지 방안은, 건강한 개체로부터 수득한 T 세포를 종양-특이적인 CAR로 변형하고 암 환자에게 주입하기 위해 생체외 증폭시켜, 이를 사용하는 것이다. 그러나, HLA-미스매치 T 세포는, 이식 편대 숙주 질환 (GvHD)을 유발할 수 있거나 및/또는 환자의 면역계에 의해 거부될 수 있어, 동종이계 줄기 세포 이식에 적합한 적은 비율의 환자들 외에는 사용할 수 없다.
GvHD를 회피하기 위한 T 세포의 TCR 유전자 결손. T 세포에 CAR 도입과 TCR 파괴를 동시에 수행하기 위해 유전자 편집을 이용해 매치되지 않은 건강한 공여자로부터 GvHD-불능성 CAR T 세포를 구축하는 한가지 방법은, Qasim 등의 문헌에 기술된 바 있다 (13). TCR 유전자는, 오프-타겟 유전자 변형을 도입하는 전사 활성인자-유사 작동자 뉴클레아제 (transcription activator-like effector nuclease: TALEN) 기법을 이용한 실험에서, T 세포의 게놈에서 제거되었다 (13).
자연 살상 T 세포 ( NKT )는 항-종양 작동자 기능을 가지며, 천연적으로 GvHD 를 회피한다. NKT는, 불변성 TCR α-체인 Va24-Ja18을 발현하고 단형성 HLA 클래스 I 유사 분자 CD1d에 의해 제시된 당지질에 반응하는 것을 특징으로 하는, 선천적인 림프구의 진화적으로 보존된 서브세트이다 (14-17). NKT는 수많은 항-종양 특성을 가지고 있으며, 이의 개수가 여러가지 타입의 암에서의 양호한 결과와 연관되어 있는 것으로 보고되어 있다 (18). Heczey A. 등의 문헌과 Gian T. 등의 문헌에는, NKT를 말초혈에서 분리한 다음 CAR로 형질전환하고, 이를 입양 세포 요법 용도로 임상적인 규모로 증식시킬 수 있는 것으로, 기술되어 있다 (19, 20). 몇몇 연구들에서, 공여체-유래 NKT가 GvHD를 매개하지 않으며, 심지어 이를 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (21, 22). 따라서, 동종이계의 건강한 공여체-유래 CAR NKT는, T 세포와는 대조적으로, 부가적인 유전자 조작 없이, GvHD 위험성 없이도 암 환자를 치료하기 위해 사용할 수 있다.
숙주 면역 시스템에 의한 동종이계 치료학적 세포의 제거. 모든 정상적인 유핵 세포는 HLA 클래스 I을 발현하므로, HLA 미스매치 공여체로부터 입양 전달된 치료학적 세포는 숙주 면역 시스템에 의해 제거될 것이다. T 및 NKT 세포 역시 활성화되었을 때 HLA 클래스 II를 일시적으로 발현할 수 있으며, HLA 클래스 II 미스매치는 숙주 CD4 T 세포에 의한 공여 세포의 제거를 촉발할 수 있다. 이러한 거부 반응을 지연하기 위한 일반적인 방법은, 숙주 면역 시스템이 회복되기 전에 작용자 세포의 치료학적 윈도우가 항-종양 활성을 매개할 수 있도록 컨디셔닝화된 면역억제 숙주를 이용하는 것이다. 그러나, 이 방법은 환자에게 좋지 않으며, 치료학적 작동자 세포의 충분하지 않은 지속성으로 인해 완전한 종양 통제가 불가능할 수 있다.
세포 표면 상의 HLA 클래스 I 분자의 발현은 β2 -마이크로글로불린 ( B2M )에 의존한다. 세포 표면 HLA 클래스 I 상에 발현되기 위해서는 B2M이 필요한 것으로 잘 확립되어 있다 (23). 그래서, 공여체-유래 작동자 세포에서 B2M을 타겟팅하면, HLA 클래스 I 발현을 파괴하고, 숙주 CD8 T 세포에 의한 이의 인지를 막을 수 있을 것이다. 그러나, HLA 클래스 I 분자는 또한 NK 세포에 대한 저해성 리간드로도 사용되므로, B2M의 발현 감소는 공여 세포가 숙주 NK 세포에 의한 살상에 취약하게 만들 것으로 예상된다 (24). 어떤 수준의 B2M/HLA 클래스 I 발현이, 숙주 NK 세포의 세포독성은 촉발하지 않으면서, 숙주 CD8 T 세포의 활성화를 방지할 만큼 충분히 공여 세포에서 달성될 수 있는지는 알려져 있지 않다. NKT 세포에서 이러한 B2M의 발현 수준 파악이, GvHD 발병 위험 없이 지속적인 항-종양 활성을 허용할 수 있는, HLA 매치되지 않는 건강한 공여체 유래 CAR NKT 또는 치료학적 NKT에 대해 암 환자가 지속적인 관용성을 발휘하게 만들 수 있을 것이다.
HLA 클래스 II 분자의 세포 표면 발현은 HLA-DR 항원-부속 불변 체인 (HLA-DR antigens-associated invariant chain) (Ii, CD74라고도 함)에 의존한다. 불변 체인은 ER로부터 MHC 클래스 II의 방출을 촉진하며, MHC 클래스 II/항원 복합체의 표면 발현 및 적절한 항원 탑재에 필수적이다. T 세포가 활성화되면, 예를 들어 항원을 인지하게 되면, 세포 표면에 MHC 클래스 II를 일시적으로 발현하는 것으로 알려져 있다. 본원은, NKT 세포가 또한 TCR 자극 후 세포 표면에서 MHC 클래스 II의 발현을 상향 조절할 수 있다는 발견 사실을 기술한다 (도 3A). 이에, 본 발명자들은 Ii 발현의 타겟팅을 통해 MHC 클래스 II를 하향 조절함으로써 숙주 CD4 T 세포에 의한 NKT 세포 거부를 약화시키고자 한다. 아울러, NKT에서 B2M 및 Ii에 대한 조합 타겟팅이 HLA 매치되지 않는 건강한 공여체 유래 CAR NKT 또는 치료학적 NKT에 대한 암 환자의 관용성을 추가적으로 연장시키고, GvHD 위험없이 이의 항-종양 활성을 극대화할 것으로, 규명되었다.
Atkins MB, et al. High-dose recombinant interleukin 2 therapy for patients with metastatic melanoma: analysis of 270 patients treated between 1985 and 1993. J Clin Oncol 1999;17(7):2105-2116. Porter DL, Levine BL, Kalos M, Bagg A, June CH. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N. Engl. J. Med. 2011;365(8):725-733. Grupp SA, et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N. Engl. J. Med. 2013;368(16):1509-1518. Brentjens RJ, et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Sci. Transl. Med. 2013;5(177):177ra138. Kochenderfer JN, et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood 2012;119(12):2709-2720. Ramos CA, Heslop HE, Brenner MK. CAR-T Cell Therapy for Lymphoma. Annu. Rev. Med. 2015. Turtle CJ, Maloney DG. Clinical trials of CD19-targeted CAR-modified T cell therapy; a complex and varied landscape. Expert Rev Hematol 2016;9(8):719-721. Singh N, Perazzelli J, Grupp SA, Barrett DM. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Sci Transl Med 2016;8(320):320ra323. Dudley ME, et al. Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science 2002;298(5594):850-854. Tahir SM, et al. Loss of IFN-gamma production by invariant NK T cells in advanced cancer. J.Immunol. 2001;167(7):4046-4050. Yanagisawa K, Exley MA, Jiang X, Ohkochi N, Taniguchi M, Seino K. Hyporesponsiveness to natural killer T-cell ligand alpha-galactosylceramide in cancer-bearing state mediated by CD11b+ Gr-1+ cells producing nitric oxide. Cancer Res. 2006;66(23):11441-11446. Dhodapkar MV, et al. A Reversible Defect in Natural Killer T Cell Function Characterizes the Progression of Premalignant to Malignant Multiple Myeloma. J. Exp. Med. 2003. Qasim W, et al. Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells. Sci Transl Med 2017;9(374). Porcelli S, Yockey CE, Brenner MB, Balk SP. Analysis of T cell antigen receptor (TCR) expression by human peripheral blood CD4-8- alpha/beta T cells demonstrates preferential use of several V beta genes and an invariant TCR alpha chain. J. Exp. Med. 1993;178(1):1-16. Lantz O, Bendelac A. An invariant T cell receptor alpha chain is used by a unique subset of major histocompatibility complex class I-specific CD4+ and CD4-8- T cells in mice and humans. J. Exp. Med. 1994;180(3):1097-1106. Bendelac A, Lantz O, Quimby ME, Yewdell JW, Bennink JR, Brutkiewicz RR. CD1 recognition by mouse NK1+ T lymphocytes. Science 1995;268(5212):863-865. Kim EY, Lynch L, Brennan PJ, Cohen NR, Brenner MB. The transcriptional programs of iNKT cells. Semin.Immunol. 2015;27(1):26-32. Metelitsa LS. Anti-tumor potential of type-I NKT cells against CD1d-positive and CD1d-negative tumors in humans. Clin. Immunol. 2011;140(2):119-129. Heczey A, et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood 2014;124(18):2824-2833. Tian G, et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. J Clin Invest 2016;126(6):2341-2355. Pillai AB, George TI, Dutt S, Teo P, Strober S. Host NKT cells can prevent graft-versus-host disease and permit graft antitumor activity after bone marrow transplantation. J. Immunol. 2007;178(10):6242-6251. Morris ES, et al. NKT cell-dependent leukemia eradication following stem cell mobilization with potent G-CSF analogs. J. Clin. Invest 2005;115(11):3093-3103. Krangel MS, Orr HT, Strominger JL. Assembly and maturation of HLA-A and HLA-B antigens in vivo. Cell 1979;18(4):979-991. Lanier LL. NK cell recognition. Annu Rev Immunol 2005;23:225-274. Gundry MC, et al. Highly Efficient Genome Editing of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9. Cell Rep 2016;17(5):1453-1461.
본원의 구현예들은, 예를 들어, 부적절한 숙주 면역 반응을 회피하기 위해, 숙주에 용인되도록 조작된, 공여체 유래 세포와 같은 세포를 포함하며; 면역요법 등의 세포의 이용 방법 역시 본원에 포함된다. 구체적인 구현예에서, 세포는 면역요법에 사용하기 위한 것이며, 상용 (off-the-shelf)으로 사용될 것으로 간주할 수 있다. 세포는, 특정 구현예에서, 입양 요법에 적합하다. 특정 구현예에서, 세포는 개체에서 GvHD를 회피한다. 세포는, 하나 이상의 숙주에 사용하도록 조작된 동일한 복수의 세포로부터 유래된 세포를 포함하여, 하나 이상의 숙주에 사용될 수 있다. 특정한 경우, 개체에 제공될 세포는 숙주 면역 세포를 피하는 능력을 달성하도록 조작된 것이며, 일부 경우, 세포 파괴에 있어 종양 특이성을 또한 제공하는 능력을 달성하도록 조작된 것이다. 일부 경우, 본원은, 암을 포함하여, 상용 면역요법을 위한, 종양-특이적인 및 보편적으로 용인되는 NKT 세포를 건강한 공여자로부터 원-히트 제조 (one-hit generation)하는 방법을 개시한다. 특정 경우에, 본원에 포함되는 세포는, 동종이계 NK 세포에 의한 살상을 촉발하지 않는 등의, 동종이계 CD8 T 세포 또는 CD4 T 세포의 활성화를 방지할 수 있다. 이러한 경우, 세포는 HLA 클래스 I 분자를 거의 또는 전혀 발현하지 않도록 조작된 NKT 세포이며, 이들 세포는, 놀랍게도, 숙주 NK 세포에 의한 살상에 대해 저항성을 유지한다. 본원에서, NKT 세포는 예를 들어 iNKT, UTNKT 또는 자연 살상 T 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 공여 세포는, 암을 가진 개체 등의 HLA 비-매치 개체의 면역요법에 이용할 수 있다. 특정 경우에, RNA 간섭을 B2M-특이적인 shRNA에 의해 적용하고, 동종이계 NK 세포에 의한 살상을 촉발하지 않으면서 동종이계 CD8 T 세포의 활성화를 방지하는 NKT 세포에서 B2M 및 HLA 클래스 I의 발현 수준을 확인할 수 있다. 특정 경우에, Ii-특이적인 shRNA를 이용한 RNA 간섭을 이용하고, 동종이계 CD4 T 세포의 활성화를 방지하는 NKT 세포에서 Ii 및 HLA 클래스 II 발현의 하향 조절을 확인할 수 있다. 일부 특정 경우에, B2M-특이적인 shRNA, Ii-특이적인 shRNA 또는 이 둘다 및 종양-특이적인 CAR은, HLA 비-매칭 암 환자의 면역요법 용도로, 종양-특이적인 및 보편적으로 용인되는 건강한 공여자-유래 NKT 세포를 원-히트 제조하기 위해, 단일한 레트로바이러스 구조체에서 발현되도록 조작할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 유도된 만능성 줄기 세포 (induced pluripotent stem cell)로부터 유래되지 않는다. 세포는 특정 측면에서 NK 세포에 의한 제거에 저항성을 가진다.
본 발명의 일 구현예에서, 내인성 β-2-마이크로글로불린 (B2M) 및/또는 MHC 클래스 II-부속 불변 체인 (Ii) 또는 이 둘다의 발현이 감소된, 단리된 NKT 세포 또는 이의 복수의 세포들을 제공한다. 사람에 의해 조작되어 세포는 B2M 및/또는 Ii의 발현이 감소되고, 사실상 위치되지 않거나 또는 사실상 세포들과 유사하지 않다. 발현 감소는 세포에서 넉아웃 또는 넉다운으로서 추가적으로 정의될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 또는 세포들은 B2M 유전자 및/또는 Ii 유전자를 타겟팅하는 하나 이상의 물질, 예를 들어 B2M 유전자 또는 Ii 유전자, 예를 들어 B2M 또는 Ii 유전자의 3' 말단을 타겟팅하는, 하나 이상의 합성 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 경우에, 합성 RNA는 shRNA 또는 CRISPR 가이드 RNA이다.
본원의 특정 구현예에서, 내인성 B2M 및/또는 Ii의 발현이 감소된 세포 또는 세포들은 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체와 같은 하나 이상의 조작된 수용체를 포함한다. 일부 경우에, NKT 세포 또는 세포들은 IL-15, IL-15Ra, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL-27, IL-33 또는 이들의 조합 등의 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 사이토카인 수용체를 재조합에 의해 발현한다. 일부 경우에, NKT 세포 또는 세포들은 제2의 내인성 유전자의 발현이 감소된다. 특정 경우에, 세포 또는 세포들은 개체에 자가 또는 동종이계 세포이다.
일 구현예에서, 세포 또는 세포들에서, 내인성 B2M 및/또는 MHC 클래스 II-부속 불변 체인 (Ii)의 발현을 감소시키는 하나 이상의 물질에 NKT 세포를 노출시킴으로써, 본 발명에 포함되는 NKT 세포 또는 세포들을 제조하는 방법을 제공한다. 이들 물질은, 비-제한적으로, DNA 벡터, 모르폴리노, 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, siRNA, S-DNA, TALEN, ZFN (Zinc finger nuclease) 또는 CRISPR 가이드 RNA 등의, 임의 타입의 것일 수 있다. DNA 벡터는 하나 이상의 타겟 유전자를 불활화하거나 또는 활성을 감소시키는 물질을 코딩한다. 일부 경우에, NKT 세포는, 하나 이상의 조작된 수용체 및/또는 하나 이상의 사이토카인을 가지도록 조작되는 등의, 내인성 B2M의 발현이 감소되도록 조작하는 것과는 다른 하나 이상의 엔터티 (entity)를 발현하도록 조작된다. 일부 경우에, NKT 세포 이외의 세포가 이용된다.
일부 구현예에서, 암과 같은 의학적인 병태를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 포함되는 세포 또는 세포들을 제공한다. 일부 경우에, 암은 뇌암, 폐암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 피부암, 신장암, 간암, 고환암, 난소암, 담낭암, 비장암, 자궁내막암, 자궁경부암, 식도암, 갑상선암, 뇌하수체암, 위암, 결장암, 항문암, 혈액암, 골암, 방광암, 담관암, 두경부암, 구강암, 침샘암, 소장암 및/또는 요도암 또는 전암성 병태, 예로, 골수이형성 증후군 (MDS)이다.
구체적인 구현예에서, 개체에서 의학적인 병태, 바람직하게는 암 또는 전암성 병태를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 포함되는 동종이계 세포 또는 동종이계 세포들을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 포함되는 하나 이상의 세포를 유효량으로 개체에 제공함으로써 개체에서 의학적인 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 의학적인 병태는 암이거나 또는 암이 아닐 수 있다. 일부 경우에, 세포는 개체에 대해 동종이계 세포이며, 다른 경우에 개체 자가 세포이다. 특정 구현예에서, 이는 NKT 세포이다.
전술한 내용은 후술한 본 발명의 상세한 내용이 더 잘 이해될 수 있도록 본 발명의 특징 및 기술적인 이점을 보다 광의적으로 설명한다. 본 발명의 부가적인 특징 및 이점은 아래에 기술될 것이며, 본 발명의 청구 내용을 구성한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 기술된 개념 및 구체적인 구현예가 본 발명을 동일한 목적으로 수행하기 위해 다른 구조를 수정 또는 설계하기 위한 토대로서 본원에 기술된 개념 및 특정 구현예를 쉽게 활용할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 당해 기술 분야의 당업자라면, 이러한 등가의 구성이 첨부된 청구항에 기술된 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않음을 인지하여야 한다. 구성 및 작동 방법 둘다에 대해 본 발명의 특징으로 간주되는 새로운 특징들은, 추가적인 과제 및 이점과 더불어, 첨부된 도면과 함께 고려하였을 때 후술한 설명으로부터 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 각각의 도면은 예시 및 단순 기술 목적으로 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범위를 정의하고자 하는 것은 아닌 것으로 명백히 이해하여야 한다.
본 발명을 보다 완전히 이해하기 위해, 첨부된 도면과 더불어 아래 설명을 참조한다.
도 1. NKT 세포는 동종이계 PBMC의 존재시 증식되지 않는다. 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)-표지된 NKT 세포는, 자극 세포로서 방사선 처리된 동종이계 PBMC와 5:1의 비율로 공동-배양하였다. 자가 PBMC 단독 또는 αGalCer 처리된 (pulsed with) 것을 각각 음성 대조군 또는 양성 대조군으로 사용하였다. NKT 세포 증식을 6일째 유세포 측정에 의한 측정한 CFSE 희석에 의해 평가하였다. 결과는 4번의 실험으로 나온 것이다.
도 2A, 2B 및 2C. CRISPR / Cas9 넉아웃 및 β2 -마이크로글로불린 ( B2M ) 발현의 shRNA 넉아웃. (2A) Cas9 단독 (녹색) 또는 Cas9/hB2M-sgRNA (적색)의 전기천공 후 96시간 후 NKT 세포에서 B2M 발현 (좌) 및 HLA ABC 발현 (우)의 대표적인 유세포 측정 분석 결과. (2B) Cas9 단독 (녹색) 또는 Cas9/hB2M-sgRNA (적색)의 전기천공 후 Anti-APC MicroBead (Miltenyi Biotec)를 이용해 B2M 양성 세포를 고갈시켜 추가로 정제한 후, NKT 세포에서 B2M 및 HLA ABC 발현에 대한 대표적인 유세포 측정 분석 결과. (2C) NKT 세포에서 B2M (상단) 및 HLA ABC (하단) 발현의 하향 조절을 유발하는 렌티바이러스-매개 B2M shRNA에 대한 대표적인 유세포 측정 분석 결과. 결과는 실험 공여체 5명으로부터 나온 것이다.
도 3A 및 3B. Ii (CD74)- 타겟팅 shRNA를 이용한 HLA 클래스 II 발현의 넉아웃 . (3A) 휴지기 NKT 세포 (자극 후 15일) 및 활성화된 NKT 세포 (자극 후 2일)에서 퍼시픽 블루-접합된 anti-HLA DP-DQ-DR mAb를 이용한 HLA DP-DQ-DR 발현에 대한 대표적인 유세포 측정 분석 결과. (3B) 형질전환된 NKT 세포에서 HLA DP-DQ-DR의 하향 조절을 유발하는 렌티바이러스-매개 Ii shRNA에 대한 대표적인 유세포 측정 분석 결과.
도 4A 및 4B. CRISPR 및 shRNA를 이용한 B2M 타겟팅은 동종이계 혼합 림프구 반응 ( MLR ) 분석에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 NKT -세포 자극을 낮추는데 동일하게 효과적이다. (4A) CFSE-표지된 T 세포를 WT, B2Mnull (CRISPR), B2Mlow (shRNA) 또는 Iilow (shRNA) NKT와 5:1의 비율로 공동-배양하였다. 자극 5일 후, CFSE 희석에 의해 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 증식을 평가하였다. (4B) 결과는 3명의 검사 공여체로부터 나온 것이다. *P<0.05, **p<0.01, WT NKT 대비.
도 5A 및 5B. B2M null /low NKT는 allo NK -세포 세포독성을 최소한으로 허용한다. (5A) 건강한 공여자-유래 WT, B2Mnull (CRISPR) 또는 B2Mlow (shRNA) NKT 세포를 칼세인-AM으로 표지하고, 무처리한 건강한 공여자 유래의 동종이계 NK 세포와 함께 작동자 : 타겟 10:1, 5:1 및 1:1의 비율로 인큐베이션하였다. 천연적으로 저해성 HLA 클래스 I 리간드가 결핍된 NK-민감성 K562 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. (5B) 특이적인 세포용해의 평균 %를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD이다. N=3; *P<0.05, **p<0.01, 대조군 WT 세포 대비.
도 6A 및 6B. CAR 및 shRNA를 발현하는 레트로바이러스 벡터 구축. (6A) CAR/shRNA 구조체의 개략도: U6 프로모터 및 shRNA는 반대 방향 (1) 또는 동일한 방향 (2)으로 CAR의 하류에 삽입된다. 또한, U6 프로모터 및 shRNA는 EF1 프로모터-구동형 CAR의 상류에 동일한 방향 (3) 또는 반대 방향 (4)으로 삽입된다. (6B) NKT 세포에서 CAR 및 B2M 발현에 대한 유세포 측정 분석 결과. 결과는 5명의 검사 공여체로부터 유래된 것이다.
도 7. CD28 또는 41BB 공동-자극 도메인을 IL-15와 함께 또는 IL-15 없이 발현하는 CD19 CAR 구조체 구축. 2개의 도메인 구조에 기반하여 구조체 8개를 구축하였다. 제1 그룹 (39 및 84 구조체)은 IgG4 힌지, IgG1 CH3 스페이서, CD28 TM, 및 CD28 또는 4-1BB 공동-자극성 도메인을 코딩하며, 이들 모두 IL-15 함유 또는 비-함유이다. 제2 그룹 (28 및 41 구조체)은 CD8α 힌지 및 CD28 또는 4-1BB 공동-자극성 도메인과 더불어 TM을 코딩하며, 이들 모두 IL15 함유 또는 비-함유이다. 28 및 41 구조체는 각각 CD28 또는 41BB 공동-자극성 도메인을 함유한 단편을 FMC63 scFv와 연결함으로써 구축하였다. 2A 및 IL15 서열은 깁슨 조립 방법 (New England Biosciences)을 사용해 모든 구조체에 삽입하였다. LTR = 긴 말단 반복체, scFv = 단쇄 가변성 단편, TM = 트랜스멤브레인, 2A = A형 말 비염 바이러스의 2A 서열.
도 8. CD19 CAR NKT 주입한 마우스에서 파이어플라이 루시퍼라제 ( Ffluc )-표지된 Daudi 림프종 세포의 연속적인 생발광 사진. NSG 마우스에 2x105 Ffluc+ Daudi 림프종 세포를 정맥내 주사한 다음 3일 후 지정된 구조체로 형질전환된 5x106 NKT 또는 구조체 비함유 세포 (비-형질전환, NT)를 정맥내 주사하였다. 사진 촬영 직전에, 마우스에 30 mg/mL 루시페린 100 ㎕를 복막내 주사하고, 5분간 생발광 채널에서 사진을 촬영하였다. 생발광 카운트 스케일 150 - 5000.
도 9. 도 8에서 CD19 CAR NKT 처리한 Daudi 림프종 마우스의 생존 곡선. 생존 가능성을 카플란-마이어 방법 (마우스 8마리/그룹)에 의해 분석하였으며, 로그-순위 (Mantel-Cox) 검정으로 비교하였다. 39 vs. 39.15 p = 0.0033, 28 vs. 28.15 p = 0.0003, 39.15 vs 28.15 p = 0.0011, 84 vs. 84.15 p = 0.0039, 41 vs. 41.15 p = 0.1410.
도 10. B2M 및 Ii shRNA와 함께 및 이들 없이 CD19 CAR을 발현하는 레트로바이러스 벡터 구축. 28.15 구조체는 도 7에 기술된 바와 같이 구축하였다. shRNA-함유 구조체의 경우, 개별 U6 프로모터 (Sigma-Aldrich)에 각각 연결된 B2M 및 Ii shRNA 서열을 깁슨 조립에 의해 CAR의 하류에 반대 전사 방향으로 각각 또는 함께 삽입하였다. LTR = 긴 말단 반복체, scFv = 단쇄 가변성 단편, TM = 트랜스멤브레인, 2A = A형 말 비염 바이러스의 2A 서열.
도 11A-11F. B2M 및 Ii 발현의 shRNA 넉아웃 . (11A) CD19 CAR 발현에 대한 대표적인 유세포 측정 분석 결과. 항원 자극 후 4일째에 지정된 구조체를 NKT 세포에 형질도입하고, Alexa 647-접합된 anti-FMC63 mAb로 염색하였다. 비-형질전환 (NT) NKT를 대조군으로 사용하였다. 지정된 구조체로 형질전환된 NKT 세포 또는 NT NKT 세포에서 (11B) B2M, (11C) HLA ABC, (11D) Ii 및 (11E) HLA DP-DQ-DR 발현에 대한 대표적인 유세포 측정 분석 결과. 세포를, anti-FMC63 mAb 및 1) PE-접합된 anti-B2M 항체 + FITC-접합된 anti-HLA ABC 항체 또는 2) PE-접합된 anti-Ii 항체 + FITC-접합된 anti-HLA DP-DQ-DR 항체로 염색하였다. 샘플을 CAR 양성 세포에서 게이팅하였다. 결과는 검사 공여체 3-5명에서 나온 것이다. (11F) CAR-shRNA NKT 대비 CAR NKT에서 지정된 유전자의 넉다운에 대한 정량 분석.
도 12. B2M /Ii shRNA는 CAR UT NKT 세포의 CAR-특이적인 시험관내 세포독성에 영향을 미치지 않는다. 지정된 CD19 CAR-shRNA 구조체로 형질전환된 NKT 또는 비-형질전환 세포 (NT)를, 루시퍼라제-양성 Daudi (CD19-양성) 타겟 세포와 지정된 작동자:타겟 비율로 공동-배양하였다. 공동-배양 후, 타겟 세포 생발광의 함수로서 NKT 세포독성을 구하였다.
도 13A, 13B 및 13C. 비-매칭 CD8 + 및 CD4 + T 세포는 동종이계 MLR 분석에서 CAR UT NKT 세포에 대한 동종이계 반응성 ( alloreactivity )을 감소시킨다. (13A) 동종이계 MLR 분석에서 T 세포에서 예상되는 결과 개략도. 동종이계 CD8 + 또는 CD4 + T 세포가 부모 NKT 상의 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II를 각각 인지하면, T 세포 증식이 유도될 것이다. UTNKT에서 B2M 넉다운에 의한 MHC 클래스 I의 하향 조절 또는 Ii 넉다운에 의한 MHC 클래스 II의 하향 조절은 동종이계 T 세포 증식의 상대적인 감소를 유발할 것이다. (13B) CFSE-표지된 CD8+ 또는 (13C) CD4+ T 세포를, 지정된 구조체를 발현하는 CAR UTNKT 세포 또는 비-형질전환 (NT) NKT 세포와 1:5 (T:NKT) 비율로 공동-배양하였다. 자극 5일 후 CFSE 희석 측정에 의해 T 세포 증식을 분석하였다. 결과는 3명의 검사 공여체로부터 나온 것이다.
도 14A 및 14B. UT NKT 세포는 부모 NKT와 비교해 동종이계 T-세포성 세포독성에 대해 감수성이 낮다. (14A) T 세포 세포독성 분석에서 NKT 및 UTNKT 세포에 대해 예상되는 결과 개략도. 동종이계 T 세포는 부모 NKT 상의 MHC 분자를 외래의 것으로 인지하여, 이들 NKT 세포의 사멸을 유도할 것이다. UTNKT에서 MHC 분자의 하향 조절은 이들 세포가 부모 NKT와 비교해 T-세포 세포독성을 더 잘 회피하게 만들 것이다. (14B) 동종이계 T 세포를 CAR UTNKT 또는 비-형질전환 (NT) NKT와 1:1의 비율로 4일간 배양하였다. NKT 세포 카운트를 카운팅 비드 (Invitrogen)를 이용한 유세포 측정에 의해 결정하였다. * p < 0.05, ** p <0.01, NT NKT 대비.
도 15A 및 15B. UT NKT 세포는 NK 세포성 세포독성에 대한 감수성이 최소화된다. (15A) NK 세포의 세포독성 분석에서 예상되는 결과 개략도. NK 세포는 MHC 클래스 I을 발현하는 부모 NKT를 사멸시키진 않지만, MHC 클래스 I이 결핍된 타겟 세포는 일반적으로 사멸시킨다. UTNKT는 NK 세포에 의한 사멸을 회피하기 위해 충분한 MHC I을 발현할 것이다. (15B) 건강한 공여자 유래 NK 세포를 칼세인 AM-표지된 UTNKT와 5:1의 비율로 4시간 동안 공동-배양하였다. 타겟 세포의 세포용해는 유세포 측정에 의해 남아있는 칼세인-AM 형광으로서 확인한다. 평균 ± SD, N=3; ** p < 0.01. NS: 유의하지 않음.
도 16A 및 16B. CAR.CD19 UT NKT 주입 마우스에서 Ffluc -표지된 Daudi 림프종 세포에 대한 연속 생발광 사진. (16A) NSG 마우스에 2x105 Ffluc+ Daudi 림프종 세포를 정맥내 주사하고, 3일 후 지정된 구조체로 형질전환된 5x106 CAR.CD19 UTNKT 또는 구조체-비함유 (비-형질전환, NT) 세포를 정맥내 주사하였다. 사진 촬영 직전에, 마우스에 30 mg/mL 루시페린 100 ㎕를 복막내 주사에 의해 투여하고, 5분간 생발광 채널에서 사진을 촬영하였다 (16B). 생발광 카운트 스케일 150 - 5000.
도 17. 도 16에서 CAR.CD19 UT NKT 처리한 Daudi 림프종 마우스의 생존 곡선. 생존 확률을 카플란-마이어 방법 (마우스 10마리/그룹)에 의해 분석하였으며, 로그-순위 (Mantel-Cox) 검정으로 비교하였다. **** p < 0.0001.
본 명세서에서, 부정관사 ("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원의 청구항에서, 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, 부정관사는 하나 또는 하나 보다 많을 것을 의미할 수 있다. 본원에서, "다른"은 적어도 제2 이상을 의미할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 측면은 예를 들어 본 발명의 하나 이상의 서열"로 필수적으로 구성"되거나 또는 "로 구성"될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예는 본 발명의 하나 이상의 요소, 방법 단계 및/또는 방법으로 구성되거나 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있다. 본원에 기술된 임의의 방법 또는 조성물이 본원에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있는 것으로 고려된다. 본 발명의 범위는 명세서에 기술된 공정, 기계, 제조, 대상 조성물, 수단, 방법 및 단계들에 대한 구체적인 구현예들로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
본원에서, 용어 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은, 질환을 치료하기 위해 개체 또는 환자에 투여하였을 때, 질환의 한가지 이상의 증상을 개선하는 등의 질환에 대한 치료를 달성하기에 충분한 양을 의미한다.
내인성 β-2-마이크로글로불린 (B2M) 및/또는 내인성 MHC 클래스 II-부속 불변 체인 (Ii)의 발현이 감소된 NKT 세포는, 내인성 β-2-마이크로글로불린 (B2M) 및/또는 내인성 MHC 클래스 II-부속 불변 체인 (Ii)의 발현 수준이 비-변형 NKT 세포와 비교해 감소된, 세포를 지칭한다. 일 구현예에서, 내인성 β-2-마이크로글로불린 (B2M) 및/또는 내인성 MHC 클래스 II-부속 불변 체인 (Ii)의 발현 수준은, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 더 바람직하게 100% 감소된다.
용어 "하향 조절되는", "하향 조절" 등은 하나 이상의 유전자의 발현 감소, 약화, 소거 및/또는 저해를 의미한다. 이와 같이, 이 용어는 "넉다운" 및 "넉아웃" 용어 둘다를 포괄한다.
본원에서, 용어 "넉다운"은 하나 이상의 유전자의 유전자 발현 감소 또는 제거 (elimination)를 의미한다.
본원에서, 용어 "넉아웃"은 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 무효화 (ablation)를 의미한다.
본원에서, 용어 "내인성"은 세포 안에서 형성 또는 생산되는 임의의 물질을 지칭하는데 반해, 용어 "외인성"은 세포 외부에서 생산되거나 또는 세포 외부로부터 도입되는 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서, 용어 "재조합에 의해 조작된 수용체"는 표준적인 유전자 재조합 기법을 이용해 사람에 의해 제작된 세포 표면 수용체를 의미한다.
I. 본 발명에 따라 변형된 NKT는 allo - NK 세포성 세포독성에 대해 저항성을 나타낸다
본 발명은, NKT 세포를, 고 기능성 세포 표현형은 보존하면서, 건강한 공여자로부터 분리하여 많은 수로 생체외 증폭시켜, 입양 암 면역요법과 같은 치료학적 용도로 NKT 세포-기반의 동종이계 치료학적 산물을 제조하기 위한 토대를 제공할 수 있다는 것을, 입증하였다.
본원에서는, 모든 인간들에서 동일한 단형성 CD1d에 의한 NKT TCR 제한으로 인해, NKT 세포가 비관련 도너로부터 유래된 PBMC에 반응하지 않는다는 것을, 실험적으로 입증하였다. 이러한 결과는, 일반적인 T 세포와는 다르게, 동종이계 NKT는 비관련 수여체에 전달되었을 때 GvHD를 매개하지 않을 것임을 시사한다.
임의의 다른 세포와 마찬가지로, NKT는 HLA 클래스 I 분자를 발현하며, HLA 미스매치 수용체의 면역계, 주로 HLA 클래스I-제한된 CD8 T 세포에 의해 제거된다. 본 분야에서의 기존 지식은, B2M의 발현을 타겟팅함으로써 HLA 클래스 I의 발현을 감소시키거나 또는 없앨 수 있는 것으로, 알려져 있다. 또한, HLA 클래스 I 분자는 NK 세포에 대한 저해성 리간드로서 작용하므로, B2M 발현의 타겟팅이 NK-세포 매개 사멸을 촉발한다는 것도 예상할 수 있다. 즉, 당해 분야의 기존 기술에서는, 암 면역요법에서 사용되는 NKT 또는 임의의 다른 타입의 작동자 림프구에서 B2M의 제거 또는 하향 조절이 세포를 allo-NK 세포성 세포독성에 노출되게 만든다는 것으로, 제시되어 있다. 본원에서는, CRISPR-매개 유전자 결손에 의해서와 같은 B2M 발현의 완전한 제거, 또는 shRNA-매개 RNA 간섭에 의해서와 같은 B2M 발현의 단계별 하향 조절 (graded downregulation)이, 동종이계 CD8 및 CD4 T 세포에 의한 NKT-세포 자극을 줄이는데 동일하게 효과적이라는 것을, 최초로 입증하였다.
예상치 못하게도, 본원에서 입증된 바와 같이, 대부분의 NKT는 CRISPR-매개 B2M 넉아웃 후, 심지어 shRNA-매개 B2M 넉다운 후, allo-NK 세포성 세포독성에 대해 저항성을 유지하였다. NKT에서 shRNA-매개 B2M 유전자 넉다운이 T-세포 동종이계 반응성을 줄이는데 동일하게 효과적이지만, CRISPR-매개 B2M 유전자 넉아웃과 비교해 NKT를 allo-NK 세포성 세포독성에 덜 감수성이게 만든다는 점을 고려해, 일부 구현예에서, shRNA가, 동종이계 상황에서 입양 세포 요법 용도를 위해, NKT, 그리고 가능하게는 기타 작동자 림프구 (예, T, NK, γ/δT, MAIT, ILC 등)에서 B2M의 발현을 타겟팅하는데 사용된다. 아울러, CRISPR 및 유사한 게놈-편집 방법 (예, TALEN, ZFN)과 대조적으로, shRNA는 타겟 세포에 영구적인 유전자 변화를 유발하지 않으며, 따라서 적어도 일부 경우들에서 임상적으로 보다 안전한 옵션을 제공해준다.
마지막으로, 본원에서는, B2M-특이적인 shRNA 및 종양-특이적인 CAR이, HLA 비매칭 암 환자의 면역요법을 위한 종양-특이적인 및 보편적으로 용인되는 건강한 공여자-유래 NKT 세포를 원-히트 제조하기 위해 단일한 레트로바이러스 구조체에서 발현되도록 조작할 수 있다는 것을, 최초로 입증하였다.
II. 본 발명의 세포
특정 구현예에서, 본원의 세포는, 이식편대숙주 질환을 회피할 수 있거나 및/또는 항-종양 작동자 기능을 가진, 세포이다. 특정 구현예에서, 세포가 NKT 세포이더라도, 다른 구현예에서 세포는 T, NK, γ/δT, MAIT 또는 ILC이다. 세포는 적어도 일부 경우에 유도된 만능성 줄기 세포로부터 유래되지 않는다. 특정 구현예에서, 세포는 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자 및/또는 하나 이상의 HLA 클래스 II 분자의 발현이 감소되거나 또는 전혀 발현하지 않는다. 특정 구현예에서, 세포는 숙주 CD8 T 세포 및/또는 숙주 CD4 T 세포와 같은 특정 숙주 T 세포에 의해 인지될 수 없다. 특정 구현예에서, 세포는, 예를 들어, HLA 클래스 I 분자의 발현이 세포에서 감소되거나 또는 없어지도록, B2M의 발현을 감소시키거나 또는 없어지게 조작된다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세포는, 예를 들어 HLA 클래스 II 분자의 발현이 세포에서 감소되거나 또는 없어지도록, Ii의 발현을 감소시키거나 또는 없어지게 조작된다. 특정 구현예에서, 본원의 세포는, 숙주 NK 세포가 본원에 포함되는 세포를 살상할 수 없도록 설계된다. 일부 구현예에서, 본원의 세포는 PBMC와 같은 숙주 자극 세포와 동종이계 반응성을 나타나지 않으며, 동종이계 숙주에 입양 전달되었을 때 GvHD 매개하는 능력이 결핍되어 있다. 특정 구현예에서, 세포는 NK 세포에 의한 제거에 저항성을 가진다.
특정 구현예에서, 본원은 B2M의 발현이 감소된 세포에 관한 것이다. B2M의 발현이 감소된 세포는 당해 기술 분야의 표준 수단에 의해 B2M 발현이 검출불가능한 수준일 수 있거나, 또는 검출가능하지만 인간에 의해 내인성 발현이 감소되도록 조작되지 않은 세포와 비교해 발현 수준이 감소될 수 있다. 세포는 B2M 넉아웃 또는 발현 넉다운된 것으로서 정의될 수 있다. 이로써, 세포는 특정 구현예에서 HLA 클래스 I-음성이다. 일부 구현예에서, 본원은 Ii 발현이 감소된 세포에 관한 것이다. Ii 발현이 감소된 세포는 당해 기술 분야의 표준적인 수단에 의해 Ii 발현이 검출불가능한 수준일 수 있거나, 또는 검출가능하지만 인간에 의해 내인성 발현이 감소되도록 조작되지 않은 세포와 비교해 발현 수준이 감소될 수 있다. 세포는 Ii 넉아웃 또는 발현의 넉다운된 것으로서 정의될 수 있다. 이로써, 세포는 특정 구현예에서 HLA 클래스 II-음성이다.
다른 경우에, 세포는, B2M 또는 Ii 발현 수준의 일부 또는 완전한 감소 대신, 각각의 비-기능성 버전을 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포는, 전장의 비-기능성 단편이거나 또는 이의 일반적인 기능성에 손상을 주는 하나 이상의 돌연변이 (점 돌연변이, 역위 (inversion), 결손 등)를 가진 전장인, B2M 및/또는 Ii가 발현되도록 조작될 수 있다. B2M 돌연변이의 일 예는 결함성 (defective) MHC1 alpha 1 alpha 2 도메인 상호작용을 가진 것이다 (Hill et al., 2003).
특정 구현예에서, (a), (b) 또는 (c)의 발현이 감소되거나 또는 발현이 검출불가한, 복수의 세포를 포함한, 하나 이상의 단리된 인간 NKT 세포를 제공하며, 이 세포는 입양 요법 (adoptive therapy)에 적합하다: (a) 내인성 β-2-마이크로글로불린 (B2M); (b) 내인성 MHC 클래스 II-부속 불변 체인 (Ii); 또는 (c) 이 둘다. 특정 구현예에서, 이러한 특징이 세포가 NK 세포에 의한 제거에 내성을 나타내는 직접 또는 간접적인 이유이다.
일부 경우에, 세포는 건강한 공여자를 비롯한 공여체로부터 단리되며, 세포는 하나 이상의 특정 형질에 대해 선택된다. 예를 들어, 세포는 표면 마커와 같은 하나 이상의 특정 마커의 발현에 대해 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 마커(들)는, 예를 들어, 마커(들)가 결여된 세포와 비교해, 세포의 증식력 증가, 입양 전달 후 생체내 유지 능력 증가 및/또는 종양 세포 사멸의 반복적인 수행시 약화되지 않는 능력과 같은 특별한 유익한 기능과 관련있을 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 CD62L, CD4 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커를 발현하거나, 및/또는 PD1, LAG3, TIM3, TIGIT 등의 발현이 결핍되거나 또는 발현 감소된 것으로 선택된다.
특정 구현예에서, 세포는, B2M 및/또는 Ii 발현이 감소된 세포 외에도, 하나 이상의 수용체와 같은, 하나 이상의 다른 비-천연적인 엔터티를 발현하도록 조작될 수 있다. 수용체(들)는 임의 타입일 수 있으며, 세포는 B2M 및/또는 Ii의 발현이 감소된 것 외에도, 2 이상의 수용체를 가질 수 있다. 구체적인 경우, 수용체(들)는 재조합에 의해 조작된 수용체이다. 예를 들어, 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR), 키메라 사이토카인 수용체, T 세포 수용체 등일 수 있다. 세포가 하나 이상의 CAR을 발현하도록 조작된 경우, 단일한 CAR(들)은 하나 이상의 종양 항원 등의 하나 이상의 항원을 타겟팅할 수 있다. 수용체에 의해 타겟화되는 종양 항원은 예를 들어 5T4, 8H9, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR 패밀리, 예로 ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, FBP, fetal AchR, FRa, GD2, GD3, 글리피칸-3 (Glypican-3)(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, KDR, MCSP, 메조텔린 (Mesothelin), Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSC1, PSCA, PSMA, ROR1, SP17, 서비빈 (Survivin), TAG72, TEM, 암태아성 항원, HMW-MAA 또는 VEGFR2를 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR은 (CD3 제타 체인을 포함하는) 1세대, (CD3 제타 체인과 하나의 세포내 신호전달 공동-자극성 엔도도메인을 포함하는) 2세대, (CD3 제타 체인과 2 이상의 세포내 신호전달 공동-자극성 엔도도메인을 포함하는) 3세대, (유도에 의해 재조합 면역 변형제를 방출하는) 4세대 등일 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은 CD28, OX40, 4-1BB, ICOS, CD40, CD30, CD27 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동-자극성 엔도도메인을 포함한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 세포는 하나 이상의 재조합 T 세포 수용체 (TCR)를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 TCR은, 예를 들어 WO2016170320A1에 언급된 바와 같이 높은 수준의 세포 표면 억제를 달성하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 TCR은 예를 들어 WO2006000830A2에 언급된 바와 같이 세포외 불변 도메인의 잔기들 간에 체인간 인간 재조합 이황화 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 TCR을 발현하는 세포는 재조합 면역 변형제를 유도성으로 방출하도록 추가로 조작될 수 있다. 예시적인 재조합 면역 변형제는, 예를 들어 TNFα 및/또는 PD-L1을 타겟팅할 수 있는, 항체, 이의 단편 (예, scFv) 또는 항체 유도체이다.
일부 구현예에서, 세포는 세포의 항-종양 활성, 증식 및/또는 생장에 유익한 하나 이상의 유전자 산물을 재조합에 의해 발현하도록 조작된다. 이러한 유전자 산물로는 하나 이상의 사이토카인 (적어도 IL-15, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL-27, IL-33, 항체 단편 또는 유도체, 예를 들어 scFv 또는 이중 특이성 (예, 암 항원 및/또는 체크포인트 저해제를 타겟팅함) 또는 이들의 조합), 및/또는 생존 촉진성 (pro-survival) 사이토카인 수용체, 예를 들어 IL-7Ra 또는 IL-15Ra 등이 있다. 하나 이상의 특정 유전자 산물을 발현하도록 선택된 NKT 세포는 유전자 산물(들)을 재조합에 의해 또한 발현하도록 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 세포에서 저해성 수용체 (예, PD1, LAG3, TIM3, TIGIT, TGFbR1, IL-10R 등)를 타겟팅하는 하나 이상의 유전자 산물의 발현을 하향 조절하도록 조작된다.
세포는, B2M 및/또는 Ii의 발현이 감소되도록 조작되는 것 외에도, 엔터티를 발현하도록 조작되는 경우, 이러한 엔터티는 벡터에 의해 세포에 도입되거나 또는 도입되지 않을 수 있다. 일부 경우에, B2M 및/또는 Ii의 발현을 감소시키기 위한 물질 및 이러한 물질 이외의 다른 엔터티 (예, 조작된 수용체)는 동일한 벡터 상에서 세포로 도입되지만, 다른 경우에는 서로 다른 벡터 상에 존재한다. 일부 경우, 세포는, 부가적인 엔터티를 발현하도록 세포를 조작하기 전에, B2M 및/또는 Ii의 발현이 저하되도록 조작될 수 있지만, 일부 경우에는 B2M 및/또는 Ii의 발현이 감소되도록 세포를 조작한 후 부가적인 엔터티를 발현하도록 조작한다. 동일한 벡터에 존재하는 경우, B2M 및/또는 Ii의 발현을 감소시키기 위한 물질 및 부가적인 엔터티는 동일한 발현 구조체에 존재하고 동일한 또는 서로 다른 유전자 조절 서열(들)에 의해 조절될 수 있거나, 또는 서로 다른 유전자 조절 서열(을)을 가진 서로 다른 발현 구조체에 존재할 수 있다. 하나의 벡터를 사용하는 경우, B2M의 발현을 감소시키기 위한 물질은 5'에서 3' 방향으로 부가적인 엔터티에 대해 5' 또는 3'일 수 있거나 또는 그 반대일 수 있다.
세포가 NKT 세포가 아닌 다른 림프구 아종일 경우, shRNA에 의한 B2M 하향 조절 수준이, 암 면역요법에 사용가능한, allo-NK 세포성 살상은 촉발하지 않으면서 알레르기 항원성 (allergenicity)을 줄이는데 충분한지를 평가할 수 있다: 예, (또한 TCR이 결손될 수 있는) T 세포, γ/δ T 세포, MAIT 세포, NK 세포 및 ILC. non-NKT 세포를 이용하는 경우, non-NKT 세포는 NKT 세포에는 필요없는 조작을 수행하여야 할 수도 있다.
일부 구현예에서, 세포에서 MHC 클래스 II-부속 불변 체인 (Ii)은 하향 조절을 위한 물질 (예, shRNA 또는 기타 표준 방법)에 의해 타겟팅되며, 따라서 세포에서 HLA 클래스 II 발현의 하향 조절이 부여되고, 추가적으로 CD4 T 세포에 의해 매개되는 동종이계 반응성이 감소된다. 이 경우, 세포는 조작된 수용체 및/또는 하나 이상의 사이토카인 등의 다른 엔터티를 재조합 방식으로 발현하도록 또한 조작될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 Ii shRNA와 더불어 CAR를 코딩하는 바이러스 (예, 레트로바이러스) 구조체를 포함하지만, 일부 경우에 CAR 및 Ii shRNA는 별개의 벡터에 존재한다. 일부 경우에, 세포는 Ii 발현이 하향 조절된 것이나, B2M의 발현이 하향 조절되도록 조작되진 않는다.
일부 구현예에서, B2M 및/또는 Ii를 감소된 수준으로 안정적으로 발현하거나 또는 B2M 및/또는 Ii의 발현이 안정적으로 비활성화된, 세포주를 제공한다.
특정 구현예에서, 세포는 B2M 및 Ii 둘다 하향 조절하는 구조체 (예, 레트로바이러스 구조체)를 발현한다. 이러한 세포에서, CAR 및/또는 기타 유전자 산물도 역시 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 CAR을 발현하고, B2M와 Ii 둘다 하향 조절된다 (예를 들어, B2M 및 Ii shRNA 둘다 포함함). 다른 구체적인 구현예에서, 세포는 재조합 TCR을 발현하며, B2M와 Ii 둘다 하향 조절된다 (예, B2M 및 Ii shRNA 둘다 포함).
일부 구현예에서, 세포는 컴플렉스 CAR, 예를 들어 CAR 구조체 및 부가적으로 하나 이상의 사이토카인 (예, IL-15, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL-27, IL-33, 이들의 조합 등) 및/또는 사이토카인 수용체 (IL-15, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL-27, IL-33에 대한 수용체, 이들의 조합)를 발현한다. 바람직한 구현예에서, 세포는 부가적으로 B2M 또는 Ii에 대한 shRNA 또는 이 둘다 (또는 shRNA 이외의, B2M 또는 Ii를 타겟팅하는 하나 이상의 다른 물질, 또는 이 둘다)를 부가적으로 발현한다.
일부 구현예에서, 세포는 재조합에 의해 조작된 하나 이상의 수용체, B2M 및/또는 Ii shRNA, 및 다른 유전자를 타겟팅하는 제2 shRNA를 발현한다. 특정 구현예에서, 세포는 CAR, B2M 및/또는 Ii shRNA를 발현하며, 다른 shRNA는 세포에서 저해성 수용체를 코딩하는 유전자 (예, PD1, LAG3, TIM3, TIGIT, TGFbR1, IL-10R 등)를 타겟팅한다.
특정 구현예에서, 세포는 유도성 자살 유전자 (inducible suicide gene)(예, 카스파제-9 또는 티미딘 키나제)를 포함한다.
다른 측면에서, 면역요법에 대한 종양-특이적인 및 allo-NK-세포 저항성 NKT를 원-히트 구축하기 위한 벡터를 제공한다. 본원의 세포를 조작하기 위해 사용되는 벡터는, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터 등의, 임의 타입의 벡터일 수 있다. 비-바이러스 벡터로는 플라스미드가 있으며, 바이러스 벡터로는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노부속 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터 등이 있다. 이러한 벡터는 전술한 하나 이상의 조작된 수용체(들)를, B2M 및/또는 Ii의 발현을 감소시키는 물질과 함께 코딩한다. 이러한 물질은 shRNA, CRISPR 시스템, 예를 들어 CRISPR 가이드 RNA, 모르폴리노, siRNA, 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, S-DNA, ZFN 및 TALEN으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
구체적인 구현예는 NKT 내에 CAR과 shRNA를 동시에 코딩하는 바이러스 구조체 (예, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 구조체)를 포함한다.
B2M 및/또는 Ii를 하향 조절하도록 변형된 동종이계 세포는 상업적으로 입수할 수 있다. 동종이계 세포는 공여체로부터 수득한 후 즉시 B2M 및/또는 Ii을 하향 조절하도록 처리될 수 있거나, 또는 동종이계 세포는 신선한 상태 또는 냉동된 상태 등의 저장물 (repository)로부터 수득할 수 있다.
III. 세포 생산 방법
특정 구현예에서, B2M 또는 Ii 또는 둘다 하향 조절된 세포를 포함하여, 본 발명에 포함되는 세포의 제조 방법을 제공한다. 이러한 세포는 또한 조작된 수용체 하나 이상의 타입을 발현할 수 있다.
일부 경우에, 세포의 제조 방법은 조작할 세포를 수득하는 단계를 포함하며, 다른 경우 본 방법은 수득하는 단계를 포함하지 않는다. 공여 세포는, 예를 들어 암에 걸리지 않은 개체를 포함하여, 건강한 개체로부터 수득할 수 있다. 세포는 B2M 및/또는 Ii를 하향 조절하도록 재조합 조작하기 전에 증폭하거나 또는 증폭하지 않을 수 있다. 일부 방법에서, 세포는 마커를 발현하거나 또는 발현이 결핍되도록 선별될 수 있으며, 예를 들어 그래서 이러한 선별로 세포의 증폭을 강화할 수 있다. 예를 들어, 세포 제조 방법의 일부는 CD62L 발현, CD4 발현 및/또는 PD1 발현의 감소 또는 발현의 부재에 대해 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
세포는 B2M, Ii 또는 둘다의 발현의 하향 조절을 달성하기 위해 임의의 하나 이상의 물질을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 물질은 임의 타입의 것일 수 있으며, 특정 구현예에서 이 물질은 shRNA, CRISPR 시스템, 예를 들어 CRISPR 가이드 RNA, 모르폴리노, siRNA, 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, S-DNA, TALEN, ZFN 등이다. B2M을 타겟팅하는 핵산을 설계하기 위한 B2M 폴리뉴클레오티드 서열의 일례는 GenBank® 등재 번호 NM_004048에 기술된다. Ii (CD74)를 타겟팅하는 핵산을 설계하기 위한 Ii 폴리뉴클레오티드 서열의 일례는 GenBank® 등재 번호 NC_000005에 기술된다. 본원의 세포를 구축하기 위해 사용되는 임의의 shRNA는, 5' 말단 또는 3' 말단, 또는 예를 들어 엑손 1 또는 엑손 2 등의 그 사이의 영역 등의, 타겟 핵산의 임의 영역을 타겟팅할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원의 세포는 B2M 및/또는 Ii를 하향 조절하는 물질 이외의 다른 엔터티를 발현하도록 조작되며, 이러한 엔터티는 조작된 수용체 (특히 전술한 수용체), 사이토카인 또는 다른 유전자 산물일 수 있다. 특정 구현예에서, 엔터티는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 일부 경우에, 세포에서 B2M 및/또는 Ii를 하향 조절하는 단계는, 다른 엔터티를 발현할 수 있는 세포를 만드는 단계와 동시적인 단계 (concomitant step)이며, 다른 예로 서로 다른 단계이다. 특정 구현예에서, 세포가 B2M 및/또는 Ii를 하향 조절하고 (예를 들어) CAR을 발현하도록 동시에 조작된다면, 이는 B2M 및/또는 Ii를 하향 조절하는 물질과 CAR이 동일한 벡터에서 발현되기 때문이다. 그러나, 다른 경우, B2M 및/또는 Ii를 하향 조절하는 물질과 CAR은 서로 다른 벡터로부터 발현된다.
본원의 방법은 공여 세포 (또는 이의 증식된 후대)에 도입할 벡터를 구축하는 단계를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 재조합 벡터의 제조 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터 등의 다양한 벡터들을 이용할 수 있다. 하나의 벡터가 B2M 및/또는 Ii를 하향 조절하는 물질 및 (예를 들어) CAR과 같은 조작된 수용체를 둘다 포함할 경우, 당해 기술 분야의 당업자라면 벡터의 설계시 (예를 들어) 세포에 대한 크기 제약을 고려함을 알 것이다.
조작할 세포가 T 세포일 경우, 세포의 내인성 T 세포 수용체는, 예를 들어, 당해 기술 분야의 통상적인 방법을 이용해, 하향 조절하거나 또는 넉아웃할 수 있다.
IV. 세포 이용 방법
본 발명의 구현예는 암 또는 전암성 병태 등의 의학적인 병태를 개체에서 치료하는데 사용하기 위한 본 발명에 포함되는 세포 또는 세포들을 포함한다. 세포는, 신경모세포종, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 흑색종, 방광암, 폐암, 췌장암, 결장암, 전립선암, 림프구 계열의 조혈 종양, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, B-세포 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병, 갑상선암, 갑상선 여포암, 간엽계 종양, 섬유육종, 횡문근육종, 흑색종, 포도막 흑색종, 기형암종, 신경모세포종, 신경교종, 교모세포종, 피부의 양성 종양, 신장암, 역형성 거대-세포 림프종, 식도 편평 세포 암종, 간세포암, 여포성 수지상 세포 암종, 장암, 근-침윤성 암, 정낭 종양, 상피 암종, 비장암, 방광암, 두경부암, 위암, 간암, 골암, 뇌암, 망막암, 담관계 암, 소장 암, 침샘 암, 자궁암, 고환암, 결합 조직 암, 전립선 비대증, 골수이형성증, 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증, 비인두암, 신경내분비암, 골수이형성 증후군, 중피종, 혈관육종, 카포시 육종, 유암종, 위식도암, 자궁관암, 복막암, 유두상 장액성 뮐러암 (papillary serous mullerian cancer), 악성 복수, 위장관 기질 종양 (GIST), 또는 리-프라우메니 증후군 및 폰 히펠-린도우 증후군 (VHL)으로부터 선택되는 유전성 암 증후군 등의, 임의 타입의 암에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 전암성 병태는 골수이형성 증후군 (MDS)이다.
본원의 특정 구현예에서, 본 발명에 포함되는 세포를 이용한 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 질환은 임의 타입일 수 있으며, 특정 구현예에서, 질환은 암이다. 신경모세포종, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 흑색종, 방광암, 폐암, 췌장암, 대장암, 전립선암, 림프구 계열의 조혈 종양, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, B-세포 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병, 갑상선암, 갑상선 여포암, 골수이형성 증후군 (MDS), 간엽계 종양, 섬유육종, 횡문근육종, 흑색종, 포도막 흑색종, 기형암종, 신경모세포종, 신경교종, 교모세포종, 피부의 양성 종양, 신장암, 역형성 거대-세포 림프종, 식도 편평 세포 암종, 간세포암, 여포성 수지상 세포 암종, 장암, 근-침윤성 암, 정낭 종양, 상피 암종, 비장암, 방광암, 두경부암, 위암, 간암, 골암, 뇌암, 망막암, 담관계 암, 소장암, 침샘 암, 자궁암, 고환암, 결합 조직 암, 전립선 비대증, 골수이형성증, 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증, 비인두암, 신경내분비암, 골수이형성 증후군, 중피종, 혈관육종, 카포시 육종, 유암종, 위식도암, 자궁관암, 복막암, 유두상 장액성 뮐러암, 악성 복수, 위장관 기질 종양 (GIST), 또는 리-프라우메니 증후군 및 폰 히펠-린도우 증후군 (VHL)으로부터 선택되는 유전성 암 증후군 등의, 임의 타입의 암을 치료할 수 있다. 특정 구현예에서, 질환은 골수이형성 증후군 (MDS)이다.
B2M, Ii 또는 둘다의 발현이 저하된 본 발명에 따른 세포의 유효량이, 세포를 이용한 치료가 필요한 개체에 제공된다. 그 양은 질환의 한가지 이상의 증상을 개선하는 한 임의 함량일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 적어도 약 1x106 내지 약 1x109 세포, 보다 더 적절하게는 약 1x107 내지 약 1x109 세포의 범위로 제공되며, 그 이상의 임의의 적절한 양으로, 예를 들어 세포 1x109주 보다 많거나 또는 적은 양으로, 예로, 세포 1x107주 미만으로 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 개체에 세포는 1회 이상 제공되며, 이후 투여는 분, 시간, 일, 주, 달 또는 년 간격일 수 있다. 일부 경우에, 세포의 각각의 전달시 세포는 서로 다른 양으로 포함된다. 예를 들어, 세포의 1차 투여량은 이후의 하나 이상의 투여량 보다 많거나 또는 적을 수 있다.
치료 중인 개체는 성인, 청소년, 어린이, 유아 또는 동물일 수 있다. 개체는 인간, 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지 등을 비롯한 포유류일 수 있다. 개체는 임의 성별, 인종, 유전자 백그라운드 등을 가질 수 있다. 개체는 암 개체 병력 (personal history) 및/또는 암 가족력을 가지거나 또는 가지지 않을 수 있다. B2M 및/또는 Ii의 발현을 하향 조절하기 위해 조작할 세포는 패밀리 구성원으로부터 수득되거나 또는 수득되지 않을 수 있다. 개체가 암을 앓고 있는 경우, 암은 임의 병기 또는 분화도의 암일 수 있으며, 암은 원발성, 전이성, 재발성, 민감성 (sensitive), 불응성 (refractory) 등일 수 있다.
일부 경우에, 본원의 면역요법 외에도, 수술, 방사선 치료, 호르몬 요법, 다른 비-상동 면역요법 (nonidentical immunotherapy), 화학요법 또는 이들의 조합 등의, 하나 이상의 요법이 개체에 제공될 수 있다.
일부 경우에, 세포는, 예를 들어, 암 개체 이력 및/또는 암 가족력을 가진 개체 등의 개체에서 암을 예방하기 위해 사용된다.
세포는 예를 들어, 주사 등의 임의의 적절한 방식으로 개체에 전달될 수 있다. 특히, 세포는 주입 또는 주사를 통해 개체에 투여되는 것으로 고려된다. 적절한 조성물의 투여는 여러가지 방식으로, 예를 들어, 정맥내, 피하, 복막내, 근육내, 국소, 비경구, 경피, 강내 (intraluminal), 동맥내, 척추강내 또는 진피내 투여에 의해 달성될 수 있다. 세포는 암에의 직접 주사에 의해 제공될 수 있다. 세포의 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다.
세포는 암과 관련된 저산소 환경 (hypoxic environment)으로 타겟팅되거나 또는 타겟팅되지 않을 수 있다. 이 경우, 세포에서 발현 구조체(들)로부터 발현을 구현하기 위한 임의의 조절 인자(들)는 저산소 환경에서 유효할 수 있다.
일부 구현예에서, 개체에서 암 또는 전암성 병태와 같은 의학적인 병태를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기술된 동종이계 NKT를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은, HLA가 매치되거나 또는 매치되지 않던 간에, 임의 개체에 투여될 수 있는 상용 제품 (off-the shelf product)이다. 이러한 조성물은 즉각적인 생체이용성, 안전성 및 치료학적 잠재성과 관련하여 환자에게 상당한 이점을 가진다. 조성물은, 본원에 기술된 세포 외에도, 현탁화제, 항산화제, 완충제, 정균제 및 용질을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
V. 키트
본원에 기술된 임의의 세포 조성물 및/또는 세포 조성물을 제조 및/또는 이용하기 위한 시약 (reagent)이 키트에 포함될 수 있다. 비-제한적인 예에서, 세포 또는 세포를 조작할 시약이 키트에 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, B2M 및/또는 Ii의 발현이 감소된 세포, 또는 B2M 및/또는 Ii의 발현이 감소된 NKT 세포를 포함하는 세포 집단이 키트에 포함될 수 있다. 이러한 키트는 세포를 조작하기 위한 하나 이상의 시약을 구비하거나 또는 구비하지 않을 수 있다. 이러한 시약으로는 예를 들어 소분자, 단백질, 핵산, 항체, 완충제, 프라이머, 뉴클레오티드, 염 및/또는 이들의 조합 등이 있다. shRNA 또는 CRISPR 가이드 RNA 등의, B2M 및/또는 Ii의 발현을 직접 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 핵산 (DNA 또는 RNA) 또는 기타 물질이, 키트에 포함될 수 있다. 하나 이상의 사이토카인을 코딩하는 핵산 또는 사이토카인 자체가 키트에 포함될 수도 있다. 작용제성 단일클론 항체를 비롯하여, 사이토카인 또는 항체와 같은 단백질이 키트에 포함될 수 있다. 항체를 포함하는 기질 또는 네이키드 기질 (naked substrate) 자체가 키트에 포함될 수 있다. 항원 제시 세포 활성을 포함하는 세포 또는 이를 구축하기 위한 시약이 키트에 포함될 수 있다. 키메라 항원 수용체 또는 키메라 사이토카인 수용체 또는 조작된 T-세포 수용체 등의 조작된 수용체를 코딩하는 핵산이, 이를 구축하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하여, 키트에 포함될 수 있다.
특정 측면에서, 키트는 본원의 세포 요법을 포함하며, 또한 암 요법과 같은 특정한 의학적인 병태에 대한 다른 요법을 포함한다. 일부 경우에, 키트는, 세포 요법 구현예 외에도, 예를 들어 화학요법, 호르몬 요법 및/또는 면역요법과 같은 제2 암 요법을 포함한다. 키트(들)는 개체에 대한 특정 암에 맞게 맞춤 제작될 수 있으며, 개체에 대한 각각의 제2 암 요법을 포함할 수 있다.
키트는 본원의 조성물을 적절하게 분액된 형태로 포함할 수 있다. 키트의 구성 성분은 수성 매질 중에 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로 구성 성분이 수용될 수 있는, 바람직하게는 적절하게 분액되어 수용될 수 있는, 하나 이상의 바이얼, 시험관, 플라스크, 바틀, 시린지 또는 기타 용기 수단을 포함할 것이다. 키트에 구성 성분이 2 이상 존재할 경우, 키트는 일반적으로 부가적인 구성 성분이 분리되어 수용될 수 있는, 제2, 제3 또는 기타 부가적인 용기를 또한 포함할 수 있다. 그러나, 바이얼에는 구성 성분들의 다양한 조합들이 수용될 수도 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 조성물을 수용하기 위한 수단 및 임의의 기타 시약 용기를, 상업적인 판매를 위한 밀봉된 형태 (in close confinement)로 포함할 것이다. 이러한 용기는, 바람직한 바이얼이 수용되는, 사출 또는 블로우-성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내기 위해 포함된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 후술한 실시예에 기술된 기법은 본 발명자에 의해 발견된 기술이 본 발명을 실시하는데 잘 작동됨을 나타내고 따라서 바람직한 실시 방식을 나타내는 것으로 간주될 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 그러나, 당해 기술 분야의 당업자는, 본 발명의 내용에 비추어, 본 발명의 사상 및 범위로부터 이탈하지 않으면서 개시된 구체적인 구현예에 다수의 변형을 가할 수 있으며 유사하거나 비슷한 결과를 여전히 달성할 수 있는 것으로 이해하여야 한다.
실시예 1
상용 암 면역요법을 위한 건강한 공여자로부터 종양-특이적이고 보편적으로 용인되는 NKT 세포의 구축
고 기능성 NKT를 가진 후보를 선별하기 위한 건강한 공여자에 대한 스크리닝 .
인간 PBMC에서 NKT 세포 빈도는 0.01% 미만에서부터 1% 초과까지 다양하여, 먼저 IRB 승인된 프로토콜에 따라 기대되는 건강한 공여자로부터 분리한 PBMC에서 NKT 세포 빈도를 분석하였다. 다음으로, 실험실에서 개발한 프로토콜을 이용해 NKT를 12일간 배양하여 증폭시켰으며, 이의 증폭 및 기능적인 잠재성과 연관된 주요 표면 마커의 발현 비율을 정량하였다: CD62L, CD4 및 PD1. 건강한 공여자 12명의 특징을 규명하였다. 적어도 3명 (# 6, 7, 8)이 매우 높은 NKT 세포 증폭 잠재성을 가지고 있었으며, 양호한 CD62L 체류성 및 PD1 저 발현성을 나타내었다 (표 1).
표 1. 건강한 공여자로부터 NKT 세포 증폭. NKT 세포를 기대되는 건강한 공여자로부터 분리하여 증폭시켰다. iNKT 세포 빈도와 증폭율을 0일 및 12일에 각각 계산하였다. CD62L, CD4 및 PD1의 발현을 유세포 측정을 이용해 정량하였다.
Figure pct00001
동종이계 -반응성 NKT 세포 검사.
NKT는 단형성 CD1d에 의해 제한되므로, 동종이계 세포에 반응할 것으로 예상되지 않았다. 이러한 추정을 검사하기 위해, 자극자 세포로서 방사선 처리된 PBMC와 반응자 세포로서 비관련 도너 유래 NKT를 사용해 원-웨이 allo-MLR 배양을 수행하였다. 자가 PBMC를 음성 대조군으로 사용하였으며, NKT-세포 리간드로 펄스 처리한 자가 PBMC를 양성 대조군으로 사용하였다. 반응자 세포의 증식을 CFSE 희석 검사로 분석하였다. NKT 세포를 연층 (buffy coat)으로부터 신선하게 분리하여, 2번 헹군 후 PBS에 1x 107　세포/ml로 현탁하고, 2.5 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE; CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit, ThermoFisher Scientific)와 함께 5분간 인큐베이션하였다. 표지된 세포를 스핀 다운한 다음 배양 배지에 106 세포/ml로 재현탁하여 방사선 처리된 PBMC의 존재 하에 인큐베이션하였다. 유세포 측정을 통해 CFSE 희석을 측정하여 세포 증식을 6일에 검사하였다. 도 1은, NKT가 이의 특이적인 리간드 αGalCer에만 반응하여 증식할 수 있으며, 비매칭 공여자 3명으로부터 유래된 자가 또는 동종이계 PBMC에 대해서는 그렇지 않다는 것을, 보여준다. 이러한 결과는 NKT 세포가 동종-반응성이 아님을 나타낸다.
NKT에서 B2M 발현 타겟팅 .
NKT에서 전장 B2M 유전자의 넉아웃을 달성하기 위해, CRISPR/Cas9 기법을 이용하였다 (25). B2M에 대한 싱글 가이드 (sg)RNA 서열을 CRISPRscan 알고리즘 (http://www.crisprscan.org)을 이용해 동정하였다. sgRNA (10 ㎍)를 Cas9 단백질 10 ㎍ (PNA Bio)과 실온에서 10-15분간 인큐베이션하였으며, 3x106 NKT 세포에 전기천공으로 주입하였다. NKT 세포에 대해 최적화된 전기천공 조건은 1600V, 10ms 및 펄스 3회이었으며, Neon 형질감염 시스템 (ThermoFisher Scientific)을 이용하였다. 본 실험에서 sgRNA 서열은 GGCCACGGAGCGAGACATCT (서열번호 1)이다. 도 2A는, B2M 발현이 NKT 세포의 88%에서 없어졌음을 보여준다. B2M-음성 세포를 추가로 농화하기 위해, APC-접합된 anti-B2M mAb 및 anti-APC MicroBeads를 이용한 MACS 분류를 통해 B2M-양성 세포를 고갈시킴으로써 세포로 네거티브 선별하였다. 수득된 네거티브 분획의 B2M- 및 HLA 클래스 I (ABC)-음성 NKT 세포 함유율은 >95%이었다 (도 2B).
다음으로, 여러가지 수준의 B2M 유전자 하향 조절 (넉다운)을 달성하기 위해 B2M을 타겟팅하는 짧은 헤어핀 (sh)RNA 구조체 5종을 조사하였다. B2M-특이적인 shRNA 발현을 Sigma Mission® shRNA service (Sigma) 사의 렌티바이러스 발현 시스템을 사용해 달성하였다.
다음과 같은 5종의 shRNA 서열을 조사하였다:
1. GTACCGGAGGTTTGAAGATGCCGCATTTCTCGAGAAATGCGGCATCTTCAAACCTTTTTTTG (서열번호 2);
2. CCGGCTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTCGAGTACAAGAGATAGAAAGACCAGTTTTTG (서열번호 3);
3. CCGGCAGCAGAGAATGGAAAGTCAACTCGAGTTGACTTTCCATTCTCTGCTGTTTTTG (서열번호 4);
4. CGGTCCGACATTGAAGTTGACTTACTCGAGTAAGTCAACTTCAATGTCGGATTTTTG (서열번호 5); 및
5. CCGGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCTCGAGATCCCACTTAACTATCTTGGGTTTTTG (서열번호 6).
HEK-293T 세포에 패키징 벡터를 공동-형질감염시켜 바이러스 상층액을 제조하였다. 이들 shRNA 바이러스 입자는 8 μg/ml 헥사다이메트린 브로마이드 (Polybrene, H9268, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용해 NKT 세포에 형질전환하였다. B2M 넉다운을 FACS에 의해 검증하였다. 도 2C에 나타낸 바와 같이 검사한 가장 효과적인 구조체를 이용해 60% 내지 90% 범위의 다양한 수준으로 B2M 넉다운을 달성할 수 있었다. 이 shRNA는 인간 B2M 코딩 서열의 엑손 2를 타겟팅한다.
NKT에서 Ii 발현 타겟팅 .
T 세포가 활성화되면 HLA 클래스 II의 발현이 상향 조절되는 것으로 공지되어 있지만, 인간 NKT에서 HLA 클래스 II 발현 상태는 아직까지 조사된 바 없다. 이를 해결하기 위해, 휴지기 NKT 세포, 및 α-갈락토실세라마이드로 활성화한 후 2일된 세포에서, HLA 클래스 II의 발현을 유세포 측정으로 분석하였다. 도 3A는, T 세포와 마찬가지로, NKT 세포는 자극 부재시 HLA 클래스 II를 발현하지 않으며, 항원 자극 후 이들 분자의 표면 발현이 쉽게 상향 조절된다는 것을, 보여준다. 다음으로, 활성화된 NKT에서 HLA 클래스 II 발현을 Ii-특이적인 shRNA를 사용해 효과적으로 하향 조절할 수 있다는 것을, 확인하였다 (도 3B).
다양한 수준의 Ii 유전자 하향 조절 (넉다운)을 달성하기 위해 Ii를 타겟팅하는 짧은 (sh)RNA 구조체 5종을 검사하였다. Ii-특이적인 shRNA 발현은 Sigma Mission® shRNA service (Sigma) 사의 렌티바이러스 발현 시스템을 사용해 달성하였다.
예를 들어, 다음과 같은 Ii shRNA 5종을 조사하였다:
1. CCGGGACCATAGACTGGAAGGTCTTCTCGAGAAGACCTTCCAGTCTATGGTCTTTTT (서열번호 7);
2. CCGGCCACCAAGTATGGCAACATGACTCGAGTCATGTTGCCATACTTGGTGGTTTTT (서열번호 8);
3. CCGGCGCGACCTTATCTCCAACAATCTCGAGATTGTTGGAGATAAGGTCGCGTTTTT (서열번호 9);
4. CCGGCCACACAGCTACAGCTTTCTTCTCGAGAAGAAAGCTGTAGCTGTGTGGTTTTT (서열번호 10); 및
5. CCGGGAGAACCTGAGACACCTTAAGCTCGAGCTTAAGGTGTCTCAGGTTCTCTTTTTTG (서열번호 11).
HEK-293T 세포에 패키징 벡터를 공동-형질감염시켜 바이러스 상층액을 제조하였다. 이들 shRNA 바이러스 입자는 8 μg/ml 헥사다이메트린 브로마이드 (Polybrene, H9268, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용해 NKT 세포에 형질전환하였다. Ii 넉다운을 FACS에 의해 검증하였다. 검사한 가장 효과적인 구조체 (서열번호 7)를 사용해 51.2% 내지 75.6% 범위의 다양한 수준으로 Ii 넉다운을 달성할 수 있었다. 이 shRNA는 인간 Ii 코딩 서열의 CDS를 타겟팅한다.
B2M null ,B2M low 및 Ii low NKT의 알로제니서티 ( allogenicity ) 검사 .
NKT에서 동종이계-반응성 반응을 자극하는 능력에 대한 CRISPR-매개 B2M 넉아웃 및 shRNA-매개 B2M 넉다운의 효과를 확인하기 위해, 자극자 세포로서 방사선 처리된 NKT를 사용해 원-웨이 allo-MLR 분석을 수행하고, 반응자 세포로서 비관련 공여체로부터 CD8 및 CD4 T 세포를 자기적으로 분류하였다. T 세포는 동종이계 NKT 부재 조건에서 음성 대조군으로 사용하였다. 야생형 (WT) B2M을 가진 동종이계 반응성 NKT를 양성 대조군으로 사용하였다. 실험 조건에서, WT NKT를 자극 세포로서 CRISPR-유도성 B2Mnull 또는 shRNA (서열번호 2)-유도성 B2Mlow NKT로 대체하였다. 또한, Ii-shRNA (서열번호 7)를 이용해 Iilow NKT를 구축하였다. 배양 5일에, 유세포 측정에 의한 CFSE 희석 평가를 통해 반응 세포의 증식을 분석하였다. 또한, 각각의 T 세포 아종의 증식을 정량하기 위해 CD8 및 CD4 마커에 대해 세포를 염색하였다.　도 4A 및 4B는, B2Mnull NKT가, WT B2M과 비교해, CD8 T 세포의 증식을 74.1% 내지 38.5% (P < 0.01)로 저해함을, 보여준다. 예상한 바와 같이, B2M 및 HLA 클래스 I 발현이, HLA 클래스 II 분자에 한정되는 CD4 T 세포의 증식에 현저하게 영향을 미치진 않았다. 즉, Iilow NKT는 CD4 T 세포 증식을 68.1% 내지 31.6% (P < 0.01)로 감소시켰지만, CD8 T 세포의 증식에는 영향을 미치지 않았다.
놀랍게도, NKT에서 shRNA-매개 B2M/HLA-ABC의 발현 감소는, CRISPR-매개 B2M/HLA-ABC 발현의 완전한 소실에 의해 달성되는 바와 같이, 동종이계-반응성 CD8 T 세포 반응을 동일하게 효과적으로 억제하였다. 이들 결과는, 동종이계 T 세포에 의해 허용될 수 있는 다양한 수준의 B2M/HLA-ABC 발현이 NKT에 존재한다는 것을, 최초로 입증한다. 이러한 사실은 CRISPR 대신 더 안전한 shRNA 기법 또는 NKT에서 B2M의 단계적인 하향 조절을 위한 다른 게놈-편집 방법의 이용을 정당화하므로, 즉각적인 실현가능한 효과를 가진다.
allo - NK 세포에 대한 B2M null 및 B2M low 의 감수성 검사 .
HLA 클래스 I 분자는 NK 세포에 대한 주요 저해성 리간드로서 사용되므로, B2M 발현 감소는 숙주 NK 세포에 의한 살상에 대해 공여 세포를 취약하게 만들 것으로 예상된다 (24). 그러나, 특정 수준의 B2M/HLA 클래스 I이 공여 세포, 특히 NKT 세포에서 숙주 NK-세포성 세포독성을 촉발하지 않으면서, 숙주 CD8 T 세포의 활성화를 방지하기에 충분하게 달성될 수 있는지는 알려진 바 없다. 따라서, 음성 대조군으로서 야생형 (WT) NKT 세포와, 저해성 HLA 클래스 I 리간드가 천연적으로 결핍된 NK-민감성 K562 세포를 양성 대조군으로 이용하여, 동종이계 NK 세포에 의한 살상에 대한 B2Mnull 및 B2Mlow NKT의 감수성을 검사하였다. 타겟 세포로서 NKT 또는 K562 세포를 생존성 염료 칼세인-AM으로 표지한 다음, 비관련 공여체로부터 네거티브 자기 분류에 의해 수득한 동종이계 NK 세포를 작동자 세포로 사용해 4시간 동안 공동-배양하였다. 자가 NK 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. NK 세포의 세포독성 활성을 유세포 측정에 의해 측정된 바와 같이 타겟 세포에서 칼세인-AM 형광 감소에 의해 정량하였다. 도 5는, NKT가, K562 세포와는 다르게, 심지어 B2M 발현의 완전한 소실 후에도 NK 세포성 세포독성에 상당한 내성을 유지한다는 것을, 보여준다. 실제, B2Mnull NKT의 21.3%만 10:1 작동자:타겟 비율에서 allo-NK 세포에 의해 사멸되는 반면, K562 세포는 거의 100%가 동일 조건에서 사멸하였다. B2Mlow NKT가 B2Mnull 세포에 비해 내성이 더 높아, 전자는 18.8% 만 10:1 작동자: 타겟 비율에서 allo-NK 세포에 의해 사멸하였다. 따라서, 예상된 바와는 달리, 이러한 결과는, B2M 발현을 완전히 유전자 소실한 후에도 NKT의 약 80%가 allo-NK 세포성 세포독성에 대해 내성을 유지한다는 것을, 입증해준다. 아울러, NKT에서 shRNA-매개 B2M 발현의 하향 조절은, CRISPR-매개 B2M 넉아웃과 비교해, allo-NK-세포성 세포독성에 더 저항성으로 만든다.
CAR 구조체 및 B2M shRNA 및/또는 Ii shRNA 둘다를 코딩하는 레트로바이러스 벡터 설계
CAR 및 shRNA가 동일한 레트로바이러스 벡터에서 효과적으로 발현될 수 있는 지를 조검사하기 위해, 도 6A에 나타낸 바와 같이, GD2-특이적인 CAR 및 B2M shRNA (서열번호 2) 및/또는 Ii shRNA (서열번호 7)를 코딩하는 레트로바이러스 벡터를 구축하였다. shRNA(들)를 레트로바이러스 벡터에 클로닝하기 위해, 전사 개시 부위로 사용하기 위해 센스 shRNA 서열 앞에 G 한개를 삽입하고. 전사 정지 부위로 사용하기 위해 안티센스 shRNA 서열 뒤에 T 5개를 삽입하였다. 제조된 shRNA 서열은 다음과 같다:
CTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTCGAGTACAAGAGATAGAAAGACCAG (서열번호 12)
GACCATAGACTGGAAGGTCTTCTCGAGAAGACCTTCCAGTCTATGGTC (서열번호 13)
B2M shRNA는 U6 프로모터의 제어 하에 배치하고, U6-shRNA를 정방향 또는 역방향으로 sphI 사이트에 삽입하여, 내인성 레트로바이러스 LTR 또는 EF1 프로모터에 의해 CAR 발현이 구동되게 하였다 (도 6A). CAR.GD2/B2M shRNA로 형질전환된 NKT 세포는 효과적인 CAR 발현성을 나타내었다. 구조체 4종 모두 NKT에서 동시적인 CAR 발현 및 B2M 하향 조절이 관찰되었으며, 구조체 #1이 가장 우수하였다 (도 6B).
본 발명의 특정 구현예들의 중요성
1) NKT 세포는, 고 기능성 세포의 표현형을 유지하면서, 건강한 공여체로부터 분리하여, 많은 수를 생체외 증폭시킬 수 있다. 이러한 공여체-유래 NKT는 입양 암 면역요법을 위한 치료 제품의 소스로 사용할 수 있다.
2) NKT 세포는 NKT TCR의 HLA 분자의 인지 불능과 일관되게, 비관련 공여자 유래 PBMC에 반응하여 증식하지 않는다.
3) CRISPR 및 shRNA를 이용한 B2M-타겟팅은 CD8 T 세포의 NKT-세포 자극을 감소시키는데 동일하게 효과적이다.
4) shRNA를 이용한 Ii-타겟팅이 CD4 T 세포의 NKT-세포 자극을 감소시키는데 효과적이다.
5) NKT 대부분은, CRISPR-매개 B2M 넉아웃 후, 심지어 shRNA-매개 B2M 넉다운 후, allo-NK 세포성 세포독성에 대해 저항성을 유지한다.
6) NKT에서 CAR 및 B2M shRNA 및/또는 Ii shRNA의 효과적인 발현은 싱글 레트로바이러스 벡터에서 달성되므로, 암 면역요법을 위한 CAR-제한된 보편적으로 용인되는 동종이계 NKT 세포 생산물의 구축 수단이 제공된다.
실시예 2
상용 암 면역요법을 위한 건강한 공여자로부터 종양-특이적이고 보편적으로 용인되는 NKT 세포 이외의 세포의 구축
특정 구현예에서, NKT 세포가 아닌 다른 세포를 내인성 B2M 및/또는 Ii의 발현이 감소되게 조작한다. 이러한 세포는 T 세포, γ/δ T 세포, 점막-부속 불변 T (MAIT) 세포, NK 세포, ILC (Innate lymphoid cell) 또는 이들의 혼합 등의, NKT 세포 이외의 다른 임의의 면역 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, NKT 세포와, NKT 세포가 아닌 하나 이상의 면역 세포의 혼합물은 본 발명에 포함되는 조성물 및 방법에 이용된다.
non-NKT 세포는, shRNA 또는 CRISPR 가이드 RNA와 같은 핵산을 포함하여, B2M 유전자의 발현을 타겟팅하기 위한 하나 이상의 물질을 사용하는 등과 같이, 당해 기술 분야의 표준적인 수단에 의해, 내인성 B2M 및/또는 Ii의 발현이 감소되도록 조작할 수 있다. 다른 수단은 적어도 모르폴리노, siRNA, S-DNA, TALEN, ZFN 등을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 non-NKT 세포는, 내인성 B2M 및/또는 Ii의 발현이 감소되도록 세포 조작 전 및/또는 조작 후, 증폭된다. 당해 기술 분야에서 통례적인 증폭 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 하나 이상의 사이토카인 등의 하나 이상의 특정 물질 및 특정 배지를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 한가지 타입 이상의 non-NKT 세포는 NKT 세포에 의해 효과적으로 사용될 수 있는 것 이외의 다른 조작이 필요할 수도 있다. 예를 들어, T 세포는 수여체 조직의 거부 반응으로 인한 손상을 방지하도록 변형될 수 있다. 특정 경우에, T 세포는 T 세포 수용체의 구성성분이 결손되도록 조작된다.
실시예 3
MHC 클래스 II-부속 불변 체인 (Ii)의 타겟팅에 의한, 상용 암 면역요법을 위한 건강한 공여자로부터 종양-특이적이고 용인되는 NKT 및 기타 세포의 구축
일부 구현예에서, B2M의 발현이 감소된 세포 및 이를 이용한 방법에 대한 대안으로서 (또는 아울러), 세포는 MHC 클래스 II-부속 불변 체인 (Ii)의 발현이 감소된 것이다. 이러한 세포는 내인성 B2M의 발현이 감소된 세포 대신 사용할 수 있다. 일부 경우에, 동일 세포는 B2M 및 IL 둘다의 발현이 저하된 것이며, 일부 경우에 내인성 B2M 발현이 감소된 세포 또는 내인성 II 발현이 감소된 세포의 혼합물이 사용된다. 동일 세포에서 내인성 B2M과 내인성 II의 발현이 감소된 경우, 각각의 발현 감소를 타겟팅하는데 동일한 타입의 물질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, B2M 및 Ii 둘다 발현을 낮추기 위해 shRNA에 의해 타겟팅하거나, 또는 다른 경우에 B2M 및 Ii 둘다 이들의 발현을 낮추기 위해 CRISPR 가이드 RNA에 의해 타겟팅한다. 일부 경우에, 예를 들어, B2M을 타겟팅하기 위한 shRNA 및 Ii를 타겟팅하기 위한 CRISPR 가이드 RNA 등의 여러가지 물질들이 B2M 및 Ii를 타겟팅한다.
특정 구현예에서, Ii의 발현 감소를 포함하는 세포는 또한 예를 들어 사이토카인 또는 CAR 등의 세포에 비-천연적인 다른 엔터티의 발현을 포함할 수 있다. 이러한 부가적인 엔터티는 Ii의 발현을 타겟팅하는 물질과 동일한 구조체에서 발현되거나 또는 발현되지 않을 수 있다. 동일 세포에서 Ii 발현이 타겟팅되고 세포에서 발현하기 위해 다른 엔터티가 제공되는 경우, 이는, 서로 5' 또는 3'이도록 임의 적절한 정렬로 동일 구조체에 구축될 수 있으며; 이는 동일한 조절 인자(들)에 의해 조절되거나 또는 조절되지 않을 수 있다.
세포는 NKT 세포이거나, 또는 T 세포, γ/δ T 세포, MAIT 세포, NK 세포, ILC 또는 이들의 혼합 등의 NKT 세포가 아닐 수 있으며, T 세포는 TCR이 결핍되도록 조작될 수 있다.
실시예 4
MHC 클래스 II-부속 불변 체인 (Ii) 또는 B2M의 타겟팅에 의한, 상용 암 면역요법을 위한 키메라 항원 수용체를 발현하는 종양-특이적이고 용인되는 NKT의 구축
IL-15와 더불어 또는 IL-15 없이 CD28 또는 41BB 공동-자극성 도메인을 발현하는 CD19 CAR 구조체를 구축하였다 (도 6). 구조체는 2가지 도메인 구조를 기반으로 구축하였다: (1) IgG4 힌지, IgG1 CH3 스페이서, CD28 TM, 및 CD28 또는 4-1BB 공동-자극성 도메인을, IL-15와 더불어 또는 IL-15 없이 코딩하는, 제1 그룹 (구조체 39 및 84); 및 (2) CD8α 힌지 및 TM을 CD28 또는 4-1BB 공동-자극성 도메인과 함께, 모두 IL-15와 더불어 또는 IL-15 없이 코딩하는, 제2 그룹 (구조체 28 및 41) (도 6A). 대안적인 또는 부가적인 공동-자극성 도메인이 이러한 구조체에 이용될 수 있다. 각각의 유세포 측정 분석을 도 6B에 나타낸다. CD19 CAR 구조체의 예들은 도 7에 예시된다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 2x105 Ffluc+ Daudi 림프종 세포를 정맥내 주사한 다음 지정된 구조체로 형질전환된 5x106 NKT 또는 구조체 비-함유 세포 (비-형질전환, NT)를 정맥내 주사한, NSG 마우스에서 연속적으로 사진을 촬영하였다. 사진 촬영 직전에, 마우스에 30 mg/mL 루시페린 100 ㎕를 복막내 주사에 의해 투여하였으며; 5분간 발광 채널에서 사진을 촬영하였다. 예로 3-25주 동안 사진을 촬영하였다. 도 9는 이들 마우스의 생존 곡선을 예시한다.
도 10은 CD19 CAR을 B2M 및 Ii shRNA와 함께 또는 이들 없이 발현하는 레트로바이러스 벡터의 예를 예시한다. shRNA를 포함하는 구조체의 경우, B2M 및 Ii shRNA 서열은 각각의 U6 프로모터에 연결되며, CAR의 28.15 하류에 전사 반대 방향으로 각각 또는 함께 라이게이션된다.
도 11은 각각의 구조체를 이용한 B2M 및 Ii 발현의 shRNA 넉다운을 도시한 것이다. 도 11A에서, NKT의 형질전환 및 Alexa 647-접합된 anti-FMC63 mAb 염색 후, CD19 CAR 발현에 대한 각각의 유세포 측정 분석 결과를 나타낸다. 지정된 구조체로 형질전환된 NKT 세포에서, (11B) B2M, (11C) HLA ABC, (11D) Ii 및 (11E) HLA DP-DQ-DR 발현에 대한 대표적인 유세포 측정 분석 결과를 제공한다. 세포를, anti-FMC63 mAb 및 1) PE-접합된 anti-B2M 항체 + FITC-접합된 anti-HLA ABC 항체, 또는 2) PE-접합된 anti-Ii 항체 + FITC-접합된 anti-HLA DP-DQ-DR 항체로 염색하였다. 도 11F는 CAR-shRNA NKT 대비 CAR NKT에서 CAR-shRNA NKT에서의 지정된 유전자 넉다운의 정량적인 결과를 도시한다.
도 12는, B2M/Ii shRNA가 CAR UTNKT 세포의 CAR-특이적인 시험관내 세포독성에 영향을 미치지 않는다는 것을, 보여준다. 지정된 CD19 CAR-shRNA 구조체로 형질전환된 NKT 또는 비-형질전환체 (NT)를 루시퍼라제-양성 타겟 Daudi (CD19-양성) 타겟 세포와 명시된 작동자:타겟 비율로 공동-배양하였다. 공동-배양 후 타겟 세포의 생발광성의 함수로서 NKT 세포독성을 결정하였다.
CAR UTNKT 세포에 대한 동종이계 반응성 수준이 도 13에서 결정되었으며, 비-매칭된 CD8+ 및 CD4+ T 세포는 동종이계 혼합 림프구 반응 (MLR) 분석에서 CAR UTNKT 세포에 대한 동종이계 반응성이 없어진 것으로 확인되었다. 도 13A에, 동종이계 MLR 분석에서 T 세포의 예상되는 개략적인 결과를 도시한다. 특정 구현예에서, 부모 NKT에서, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II가 동종이계 CD8+ 또는 CD4+ T 세포를 인자하게 되면 각각 T 세포 증식이 유도될 것이다. 또한, UTNKT에서 B2M 넉다운을 통한 MHC 클래스 I의 하향 조절 또는 Ii 넉다운을 통한 MHC 클래스 II의 하향 조절이 이루어지면, 동종이계 T 세포 증식은 상대적인 감소될 것이다. CFSE-표지된 CD8+ (도 13B) 또는 CD4+ T 세포 (도 13C)를 지정된 구조체를 발현하는 CAR UTNKT 세포와 공동-배양하였으며, CFSE 희석에 의한 측정으로 자극 후 5일째에 T 세포 증식을 분석하였다.
UTNKT 세포는 부모 NKT에 비해 동종이계 T 세포성 세포독성에 대한 감수성이 낮았다. 도 14A는 T 세포성 세포독성 분석에서 NKT 및 UTNKT 세포에서 예상적인 결과를 개략적으로 도시한다. 동종이계 T 세포는 부모 NKT 상의 MHC 분자를 외래의 것으로서 인지하여 이들 NKT 세포의 사멸을 유발할 것이다. UTNKT 상의 MHC 분자의 하향 조절은 이들 세포가 부모 NKT와 비교해 T 세포성 세포독성을 더 잘 피할 수 있게 해준다. 도 14B에서, CAR UTNKT를 가진 동종이계 T 세포 또는 비-형질전환 (NT) NKT와 1:1의 비율로 4일간 인큐베이션하였을 때, NKT 세포 카운트를 유세포 측정에 의해 측정하였다.
도 15에 나타낸 바와 같이, UTNKT 세포는 NK 세포성 세포독성에 대한 감수성이 최소화되는 것으로, 나타났다. 도 15A는 NK 세포성 세포독성 분석에서 예상되는 결과를 도시한다. 나타낸 바와 같이, NK 세포는 MHC 클래스 I을 발현하는 부모 NKT를 살상하진 않지만, MHC I이 결핍된 타겟 세포는 통상적으로 살상한다. 특정 구현예에서, UTNKT는 NK 세포에 의한 살상을 피할 정도로 충분하게 MHC I을 발현한다. 도 15B는, 건강한 공여자 유래 NK 세포를 칼세인 AM-표지된 UTNKT와 5:1의 비율로 공동-배양한 후 세포용해에 대한 타겟팅 결과를 보여준다.
CAR.CD19 UTNKT를 주사한 마우스에서 Ffluc-표지된 Daudi 림프종 세포의 생발광 연속 사진을 도 16에 예시한다. NSG 마우스에 2x105 Ffluc+ Daudi 림프종 세포를 정맥내 주사한 다음, 지정된 구조체로 형질전환된 5x106 CAR.CD19 UTNKT 또는 구조체 비-함유 세포 (비-형질전환, NT)를 정맥내 주사하였다. 마우스의 대응되는 생존 곡선을 도 17에 제시한다.
참조문헌
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 본원의 모든 특허 및 간행물은, 각각의 개별 간행물이 구체적이고 개별적으로 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 나타낸 바와 동일한 수준으로 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명 및 이의 이점이 상세히 기술되어 있지만, 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 사상 및 범위로부터 이탈하지 않으면서 다양한 변화, 치환 및 변형을 행할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 명세서에 기술된 공정, 장치, 제조, 물질의 조성, 수단, 방법 및 단계들에 대한 구체적인 구현예로 제한하고자 의도된 것은 않는다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 기술된 대응되는 구현예들은, 본 발명에 따라 이용될 수 있는 바와 실질적으로 동일한 결과 또는 실질적으로 동일한 기능을 수행하는, 현재 존재하거나 또는 향후 개발될 공정, 장치, 제조, 물질의 조성, 수단, 방법 또는 단계에 대한 기술 내용으로부터 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 첨부된 청구항은 이러한 공정, 장치, 제조, 물질의 조성, 수단, 방법 또는 단계를 범위에 포함하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE <120> CD1D-RESTRICTED NKT CELLS AS A PLATFORM FOR OFF-THE-SHELF CANCER IMMUNOTHERAPY <130> BAYM.P0236WO <140> <141> <150> EP 17185992.9 <151> 2017-08-11 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 ggccacggag cgagacatct 20 <210> 2 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gtaccggagg tttgaagatg ccgcatttct cgagaaatgc ggcatcttca aacctttttt 60 tg 62 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ccggctggtc tttctatctc ttgtactcga gtacaagaga tagaaagacc agtttttg 58 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 ccggcagcag agaatggaaa gtcaactcga gttgactttc cattctctgc tgtttttg 58 <210> 5 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 cggtccgaca ttgaagttga cttactcgag taagtcaact tcaatgtcgg atttttg 57 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 ccggcccaag atagttaagt gggatctcga gatcccactt aactatcttg ggtttttg 58 <210> 7 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 ccgggaccat agactggaag gtcttctcga gaagaccttc cagtctatgg tcttttt 57 <210> 8 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 ccggccacca agtatggcaa catgactcga gtcatgttgc catacttggt ggttttt 57 <210> 9 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 ccggcgcgac cttatctcca acaatctcga gattgttgga gataaggtcg cgttttt 57 <210> 10 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 ccggccacac agctacagct ttcttctcga gaagaaagct gtagctgtgt ggttttt 57 <210> 11 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 ccgggagaac ctgagacacc ttaagctcga gcttaaggtg tctcaggttc tcttttttg 59 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 ctggtctttc tatctcttgt actcgagtac aagagataga aagaccag 48 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 gaccatagac tggaaggtct tctcgagaag accttccagt ctatggtc 48

Claims (20)

  1. (a), (b) 또는 (c)의 발현이 감소되거나 또는 발현이 검출불가능한, 단리된 인간 NKT 세포 또는 이의 복수의 세포들:
    (a) 내인성 β-2-마이크로글로불린 (B2M);
    (b) 내인성 MHC 클래스 II-부속 불변 체인 (MHC class II-associated invariant chain) (Ii); 또는
    (c) (a) 및 (b).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 또는 세포들이 B2M 유전자 또는 Ii 유전자를 타겟팅하는 합성 DNA 또는 RNA를 포함하는, 세포 또는 세포들.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 합성 DNA 또는 RNA가 B2M 유전자 또는 Ii 유전자의 3' 말단을 타겟팅하는, 세포 또는 세포들.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 합성 RNA가 shRNA 또는 CRISPR 가이드 RNA인, 세포 또는 세포들.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포가 하나 이상의 재조합에 의해 조작된 수용체를 포함하는, 세포 또는 세포들.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 수용체가 키메라 항원 수용체, 키메라 사이토카인 수용체 또는 T 세포 수용체인, 세포 또는 세포들.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포가 하나 이상의 사이토카인을 재조합에 의해 발현하는, 세포 또는 세포들.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 사이토카인이 IL-15, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL-27, IL-33 또는 이들의 조합인, 세포 또는 세포들.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    B2M 및/또는 Ii 이외의 다른 내인성 유전자의 발현이 추가적으로 감소된, 세포 또는 세포들.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 또는 세포들이 CD62L-양성 및/또는 CD4-양성 및/또는 PD1-음성/저 발현성 (low)의 NKT 세포인, 세포 또는 세포들.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 또는 세포들이 개체에 대해 자가 (autologous) 세포인, 세포 또는 세포들.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 또는 세포들이 개체에 동종이계 (allogeneic) 세포인, 세포 또는 세포들.
  13. NKT 세포를 (a), (b) 또는 (c)에 노출시키는 것을 포함하는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포들의 제조 방법:
    (a) 세포 및 세포들에서 내인성 B2M의 발현을 감소시키는 하나 이상의 물질;
    (b) 세포 및 세포들에서 내인성 Ii의 발현을 감소시키는 하나 이상의 물질; 또는
    (c) (a) 및 (b).
  14. 제13항에 있어서,
    상기 물질이 DNA 벡터, 모르폴리노, siRNA, S-DNA, TALEN, ZFN, shRNA 또는 CRISPR 가이드 RNA인, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 NKT 세포가 재조합에 의해 조작된 수용체 및/또는 하나 이상의 사이토카인을 발현하도록 조작된, 방법.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 세포를 치료학적 함량으로 개체에 제공하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에서 하나 이상의 의학적인 병태를 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 의학적인 병태가 암 또는 전암성 병태 (premalignant condition)인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 암이 신경모세포종, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 흑색종, 방광암, 폐암, 췌장암, 대장암, 전립선암, 림프구 계열의 조혈 종양, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, B-세포 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병, 갑상선암, 갑상선 여포암, 간엽계 종양, 섬유육종, 횡문근육종, 흑색종, 포도막 흑색종, 기형암종, 신경모세포종, 신경교종, 교모세포종, 피부의 양성 종양, 신장암, 역형성 거대-세포 림프종, 식도 편평 세포 암종, 간세포암, 여포성 수지상 세포 암종, 장암, 근-침윤성 암, 정낭 종양, 상피 암종, 비장암, 방광암, 두경부암, 위암, 간암, 골암, 뇌암, 망막암, 담관계 암, 소장암, 침샘암, 자궁암, 고환암, 결합 조직암, 전립선 비대증, 골수이형성증, 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증, 비인두암, 신경내분비암, 골수이형성 증후군, 중피종, 혈관육종, 카포시 육종, 유암종, 위식도암, 자궁관암, 복막암, 유두상 장액성 뮐러암, 악성 복수, 위장관 기질 종양 (GIST), 또는 리-프라우메니 증후군 (Li-Fraumeni syndrome) 및 폰 히펠-린도우 증후군 (Von Hippel-Lindau syndrome, VHL)으로부터 선택되는 유전성 암 증후군이거나, 또는
    상기 전암성 병태가 골수이형성 증후군 (MDS)인, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 개체는 암을 앓고 있으며, 부가적인 암 요법 (cancer therapy)이 제공되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 부가적인 암 요법이 수술, 방사선 치료, 화학요법, 면역요법, 양성자 치료 (proton therapy), 호르몬 요법 또는 이들의 조합인, 방법.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
JP2022536693A (ja) * 2019-06-12 2022-08-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 操作されたオフザシェルフ免疫細胞およびそれらの使用方法
WO2021050601A1 (en) * 2019-09-09 2021-03-18 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for use in immunotherapy
EP4139458A1 (en) * 2020-04-23 2023-03-01 AZTherapies, Inc. Cellular ablation of hla-class i mhc
CA3201631A1 (en) * 2020-11-13 2022-05-19 Duke University Targeted gene regulation of human immune cells with crispr-cas systems
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
CN113122555B (zh) * 2021-04-14 2022-04-08 河北森朗生物科技有限公司 嵌合抗原受体(CAR)修饰的γδT细胞的制备方法、产品、抗肿瘤药物及其应用
US20220348930A1 (en) * 2021-04-23 2022-11-03 Baylor College Of Medicine CAR NKTs Expressing Artificial Micro RNA-Embedded shRNA for Downregulation of MHC Class I & II Expression
CN113462723B (zh) * 2021-07-05 2023-07-11 北京中医药大学 表达CAR和shRNA的逆转录病毒载体及其应用
WO2023078288A1 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 Hangzhou Qihan Biotechnology Co., Ltd. Systems and methods for enhanced immunotherapies
GB202206507D0 (en) * 2022-05-04 2022-06-15 Antion Biosciences Sa Expression construct

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE112004002914A5 (de) * 2004-05-06 2007-05-24 Medizinische Hochschule Hannover Verbindungen und Verfahren zur Immunsuppression
ATE475669T1 (de) 2004-06-29 2010-08-15 Immunocore Ltd Einen modifizierten t-zellen-rezeptor exprimierende zellen
WO2006044486A2 (en) * 2004-10-13 2006-04-27 Denzai Therapeutics Corporation Methods and compositions for the utilization and targeting of osteomimicry
WO2008094510A2 (en) * 2007-01-26 2008-08-07 The Regents Of The University Of Colorado Methods of modulating immune function
CA2678618C (en) * 2007-02-21 2019-03-12 Vaccinex, Inc. Modulation of nkt cell activity with antigen-loaded cd1d molecules
EP3789487A1 (en) * 2013-04-03 2021-03-10 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Effective generation of tumor-targeted t-cells derived from pluripotent stem cells
ES2844700T3 (es) 2014-09-26 2021-07-22 Baylor College Medicine Receptores quiméricos de antígeno específicos de glipicano-3 para inmunoterapia adoptiva
EP3215168B1 (en) * 2014-10-31 2023-08-02 The Trustees of the University of Pennsylvania Altering gene expression in modified t cells and uses thereof
WO2016094679A1 (en) * 2014-12-10 2016-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
GB201506642D0 (en) 2015-04-20 2015-06-03 Ucl Business Plc T cell receptor
US20160310532A1 (en) * 2015-04-23 2016-10-27 Baylor College Of Medicine Nkt-cell subset for in vivo persistence and therapeutic activity and propagation of same
CA2986314C (en) * 2015-06-30 2024-04-23 Cellectis Methods for improving functionality in nk cell by gene inactivation using specific endonuclease
ES2953925T3 (es) * 2015-11-04 2023-11-17 Fate Therapeutics Inc Ingeniería genómica de células pluripotentes

Non-Patent Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Atkins MB, et al. High-dose recombinant interleukin 2 therapy for patients with metastatic melanoma: analysis of 270 patients treated between 1985 and 1993. J Clin Oncol 1999;17(7):2105-2116.
Bendelac A, Lantz O, Quimby ME, Yewdell JW, Bennink JR, Brutkiewicz RR. CD1 recognition by mouse NK1+ T lymphocytes. Science 1995;268(5212):863-865.
Brentjens RJ, et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Sci. Transl. Med. 2013;5(177):177ra138.
Dhodapkar MV, et al. A Reversible Defect in Natural Killer T Cell Function Characterizes the Progression of Premalignant to Malignant Multiple Myeloma. J. Exp. Med. 2003.
Dudley ME, et al. Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science 2002;298(5594):850-854.
Grupp SA, et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N. Engl. J. Med. 2013;368(16):1509-1518.
Gundry MC, et al. Highly Efficient Genome Editing of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9. Cell Rep 2016;17(5):1453-1461.
Heczey A, et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood 2014;124(18):2824-2833.
Immunology. 2002 Jul, 106(3): 363-372. *
Kim EY, Lynch L, Brennan PJ, Cohen NR, Brenner MB. The transcriptional programs of iNKT cells. Semin.Immunol. 2015;27(1):26-32.
Kochenderfer JN, et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood 2012;119(12):2709-2720.
Krangel MS, Orr HT, Strominger JL. Assembly and maturation of HLA-A and HLA-B antigens in vivo. Cell 1979;18(4):979-991.
Lanier LL. NK cell recognition. Annu Rev Immunol 2005;23:225-274.
Lantz O, Bendelac A. An invariant T cell receptor alpha chain is used by a unique subset of major histocompatibility complex class I-specific CD4+ and CD4-8- T cells in mice and humans. J. Exp. Med. 1994;180(3):1097-1106.
Metelitsa LS. Anti-tumor potential of type-I NKT cells against CD1d-positive and CD1d-negative tumors in humans. Clin. Immunol. 2011;140(2):119-129.
Morris ES, et al. NKT cell-dependent leukemia eradication following stem cell mobilization with potent G-CSF analogs. J. Clin. Invest 2005;115(11):3093-3103.
Pillai AB, George TI, Dutt S, Teo P, Strober S. Host NKT cells can prevent graft-versus-host disease and permit graft antitumor activity after bone marrow transplantation. J. Immunol. 2007;178(10):6242-6251.
Porcelli S, Yockey CE, Brenner MB, Balk SP. Analysis of T cell antigen receptor (TCR) expression by human peripheral blood CD4-8- alpha/beta T cells demonstrates preferential use of several V beta genes and an invariant TCR alpha chain. J. Exp. Med. 1993;178(1):1-16.
Porter DL, Levine BL, Kalos M, Bagg A, June CH. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N. Engl. J. Med. 2011;365(8):725-733.
Qasim W, et al. Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells. Sci Transl Med 2017;9(374).
Ramos CA, Heslop HE, Brenner MK. CAR-T Cell Therapy for Lymphoma. Annu. Rev. Med. 2015.
Singh N, Perazzelli J, Grupp SA, Barrett DM. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Sci Transl Med 2016;8(320):320ra323.
Tahir SM, et al. Loss of IFN-gamma production by invariant NK T cells in advanced cancer. J.Immunol. 2001;167(7):4046-4050.
Tian G, et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. J Clin Invest 2016;126(6):2341-2355.
Turtle CJ, Maloney DG. Clinical trials of CD19-targeted CAR-modified T cell therapy; a complex and varied landscape. Expert Rev Hematol 2016;9(8):719-721.
Yanagisawa K, Exley MA, Jiang X, Ohkochi N, Taniguchi M, Seino K. Hyporesponsiveness to natural killer T-cell ligand alpha-galactosylceramide in cancer-bearing state mediated by CD11b+ Gr-1+ cells producing nitric oxide. Cancer Res. 2006;66(23):11441-11446.

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