KR20200025210A

KR20200025210A - 모유두 세포의 배양용 조성물 및 이를 이용한 모유두 세포의 배양 방법

Info

Publication number: KR20200025210A
Application number: KR1020180102202A
Authority: KR
Inventors: 성종혁; 정매; 장예지
Original assignee: 주식회사 스템모어
Priority date: 2018-08-29
Filing date: 2018-08-29
Publication date: 2020-03-10
Also published as: WO2020045836A1

Abstract

본 발명은 세포 중에서도 특히 모유두 세포의 배양용 조성물 및 이를 이용한 모유두 세포의 배양 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM); 및 MCDB104, MCDB105, MCDB153, MCDB201 및 MCDB202로부터 선택되는 배지;를 포함하는 모유두 세포의 배양용 조성물 및 이를 이용한 모유두 세포의 배양 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배양용 조성물은 무혈청 배지임에도 이를 사용하여 모유두 세포를 배양하는 경우 종전의 일반적인 모유두 세포용 혈청 배지를 사용한 경우와 비교하여 모유두 세포의 배양 증식률이 2배 이상 뛰어난 장점이 있다.

Description

모유두 세포의 배양용 조성물 및 이를 이용한 모유두 세포의 배양 방법{Composition for culturing dermal papilla cells and the method for culturing dermal papilla cells using the same}

본 발명은 세포 중에서도 특히 모유두 세포의 배양용 조성물 및 이를 이용한 모유두 세포의 배양 방법에 관한 것이다.

모유두 세포(dermal papilla cell, DPC)는 모낭의 기저부에 존재하는 세포로, 모낭을 구성하는 세포들에게 산소와 영양을 공급하여 모발의 성장과 모낭 주기 조절을 담당한다. 따라서 모유두 세포의 증식이 촉진되면 모발이 건강해지고 모발 성장이 촉진되며 탈모를 막을 수 있다. 모발의 성장은 모유두(dermal papilla)를 둘러싸고 있는 상피세포(epithelial cell)가 분열하여 모간(hair shaft)을 만들면서 진행되기 때문에 모유두 세포는 상피세포의 분열을 조절하는 중요한 역할을 한다. 또한 남성형 탈모증에서 남성호르몬이 모낭에 작용하는 부위 역시 모유두로서 모유두 세포는 발모에 있어 매우 중요한 역할을 하고 있다.

Jahoda(Jahoda CA, et al., Induction of hair growth by implantation of cultured dermal papilla cells., Nature, 311, pp.560-562, 1984) 등이 행한 연구에 따르면 쥐의 콧수염 모낭에서 모유두세포(dermal papilla cell)를 제거하자 모발의 성장이 일시적으로 중지하였다가 진피 근초로부터 세포가 이동하여 다시 모유두 세포를 형성하면서 모발의 성장이 다시 계속되었으며, 모낭의 아랫부분을 1/3 이하로 제거하면 진피 근초로부터 모유두 세포가 형성되고 외피 근초로부터 모기질 세포가 형성되어 모발의 성장이 계속되나 모낭의 아랫부분의 1/3 이상을 제거하면 모발의 성장이 중지된다고 보고하고 있다. 또한 모낭의 아랫부분 1/3 이상을 제거한 후, 분리된 모유두 세포를 다시 이식하자 모발의 성장이 계속되었다고 보고하면서, 모근을 형성하고 있는 모유두 세포는 모발의 생성 및 성장에 매우 중요한 역할을 하고 있다고 밝혔다.

한편, 이러한 연구 결과와 함께 모낭 및 모낭을 구성하는 다양한 세포들의 배양법 개발은 탈모기전 연구를 위한 중요한 단서를 제공하는 동시에 유용한 평가모델로 활용되고 있다.

본 발명의 일 목적은 모유두 세포를 대량으로 배양하기 위한 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 모유두 세포를 대량으로 배양하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM); 및 MCDB104, MCDB105, MCDB153, MCDB201 및 MCDB202로부터 선택되는 배지;를 포함하는 모유두 세포의 배양용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 '모유두 세포'란, 간엽계 세포로서 모낭 최저부에 위치하고 모낭의 자기 재생을 위해 모낭 상피 줄기세포에 활성화 시그널을 보낸다, 말하자면 사령탑의 역할을 담당하고 있다고 생각되고 있는 세포를 말한다.

본 발명에서 상기 'DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)'은 통상 배지에 사용하는 DMEM이며, 상기 B27 용액 (Gibco® B-27® Supplements, Life Technologies)은 비오틴, DL 알파 토코페놀 아세테이트, DL 알파 토코페놀, 비타민 A, BSA, 카탈라아제, 인슐린, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 코티코스테론, D-갈락토오스, 에탄올아민 HCl, 글루타티온, L-카르니틴 HCl, 리놀레산, 리노레닉산, 프로게스테론, 푸트레신 2HCl, 나트륨 투석고(sodium selenite) 및 트리오도-1-티로닌을 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM); 및 MCDB104, MCDB105, MCDB153, MCDB201 및 MCDB202로부터 선택되는 배지;를 0.5~1.5:1의 부피 비로 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.75~1.25:1의 부피비로 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 1:1의 부피비로 포함할 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 배양용 조성물은 상기 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 및 MCDB202를 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 및 상기 MCDB202를 1:1의 부피비로 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 염기성 섬유아세포성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 덱사메타손(dexamethasone), 인간 인슐린 재조합체, 트랜스페린(transferrin), 셀렌산(selenous acid) 및 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 염기성 섬유아세포성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 0.1~100ng/ml; 덱사메타손(dexamethasone) 10^-10~10^-6M; 인슐린(insulin) 0.5~50㎍/ml; 트랜스페린(transferrin) 0.5~50㎍/ml; 셀렌산(selenous acid) 0.1~50ng/ml; 및 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 0.1~50mg/ml으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 지질 농축물(Chemically defined lipid concentrate)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 지질 농축물(Chemically defined lipid concentrate)을 0.001 내지 0.1x의 농도로 더 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 대두 레시틴, 콜레스테롤 지질 농축물(cholesterol lipid concentrate, chol) 및 (+α)-토코페롤 아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 대두 레시틴 0.5~50㎍/ml; 콜레스테롤 지질 농축물(cholesterol lipid concentrate, chol) 0.1~30㎍/ml; 및 (+α)-토코페롤 아세테이트 0.1~50㎍/ml로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 간 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 변환 성장 인자-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3) 및 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor, PDGF-BB)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 간 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF) 0.1~50ng/ml; 변환 성장 인자-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3) 0.5~100ng/ml; 및 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor, PDGF-BB) 0.5~100ng/ml으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 아스코르브산 2-인산세스퀴마그네슘염(ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딘산소디움염(phosphatidic acid sodium salt), 염화 리튬(lithium chloride) 및 L-글루타티온(L-glutathione)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물은 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor, EGF) 0.5~200ng/ml; 아스코르브산 2-인산세스퀴마그네슘염(ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt) 0.5~200㎍/ml; 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 0.1~30㎍/ml; 포스파티딘산소디움염(phosphatidic acid sodium salt) 0.1~30㎍/ml; 염화 리튬(lithium chloride) 0.1~5mM 및 L-글루타티온(L-glutathione) 0.1~10㎍/ml으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 배양용 조성물을 사용하여 모유두 세포를 배양하는 경우 종전의 일반적인 모유두 세포용 배지를 사용한 경우와 비교하여 모유두 세포의 배양 증식률이 2배 이상 뛰어난 장점이 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM); 및 MCDB104, MCDB105, MCDB153, MCDB201 및 MCDB202로부터 선택되는 배지;를 포함하는 모유두 세포의 배양용 조성물에 모유두 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 모유두 세포의 배양 방법에 관한 것이다.

본 발명의 모유두 세포의 기원이 되는 모유두 세포괴는 생체 시료, 바람직하게는 두피에서 그 자체 기존의 조작에 의해 조제할 수 있다. 예를 들면 Messenger, A. G., Br. J. Dermatol. 110,685-689(1984)에 기재된 방법에 따를 수 있다. 예를 들면 두피 등을 5 mm 정도의 스트립형에 잘라, 인산 완충 생리 식염수(PBS) 등으로 세척한 후, 필요에 따라 단백질 분해 효소 등을 이용해 또는 외과적으로 처리하고 표피층 및 진피층을 제외해, 피하 지방층에만 하고 이어서 모낭을 물리적 수단, 예를 들면 핀 세트 등으로 단리한다. 모낭에서 모구부를 잘라내, 이 모구 부하부에서 모유두를 노출시켜 모유두 세포괴를 단리한다.

본 발명에서 상기 모유두 세포괴로부터의 모유두 세포 1개의 단리 방법은 특별히 제한되는 것이 아니다. 바람직한 방법으로서는 상기 모유두 세포괴를 세포를 단일 부유 세포로 하는데 적당한 효소 용액, 예를 들면 Accumax(Chemicon사)로 처리하고 이어서 유리 캐필러리 등에 의해 단일 모유두 세포를 취출할 수 있다.

본 발명에서 상기와 같이 단리한 모유두 세포 1개는 피더 세포상에 파종해 배양할 수 있다. 피더 세포의 종류는 특히 제한되지 않지만 바람직하게는 WT4 세포(배양 마우스뺨히게 모유두 세포), Swiss 3 T3세포, MEF 세포(마우스태자성 섬유아세포) 등을 들 수 있다. 모유두 세포 1개에 대한 피더 세포의 양은 100~10,000개로 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 본 발명의 배양용 조성물에서의 단리 모유두 세포의 배양은 일반적으로 배양접시를 이용해 5% CO₂ 분위기, 37℃의 온도 하에서 배양기 내에 정치 배양할 수 있다. 성장 한계에 도달하면 배지를 교환해 또한 배양을 계속하며 계대 배양을 실시할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 배양 세포는 더욱 필요한 계대수에 걸쳐 계대 배양을 할 수 있다. 계대는 유두 세포가 원하는 양이 달성될 때까지 수행할 수 있고 예를 들어 10회 이상의 계대, 원하는 양이 많은 경우는 바람직하게는 15회 이상, 또한 바람직하게는 20회 이상까지 계대를 할 수 있다.

바람직하게는, 모유두 세포는 인간 모유두 세포이며 두피 모낭에서 채취할 수 있지만, 인간 유래로 한정될 것은 없고 인간 이외의 모든 포유 동물, 예를 들면 사람, 침팬지, 기타 영장류, 가축 동물, 예를 들면 개, 고양이, 토끼, 말, 양, 염소, 소, 그 밖에 실험용 동물, 예를 들면 래트, 마우스, 몰모트, 보다 바람직하게는 누드 마우스, 스키드 마우스, 누드 래트의 피부나 수염에서 유래해도 좋다. 사람 두피는 외과수술의 부산물로서 발생한 것을 사용할 수 있다. 두피는 본 발명의 목적에 비추어, 성인 남성 유래의 것을 사용하는 것이 망주위가 그에 한정될 것은 없고 아이 유래에서도 여성 유래라도 좋다. 사용하는 피부는 모유두가 정상적인 생리 기능을 지지하고 있는 한, 두발에 한정하지 않고 체모 등에 속하는 것을 선택해도 좋다. 일반적으로 바람직하게는, 두피 중 측두부나 후두부에서 유래하는 것이 좋다.

본 발명의 배양용 조성물은 무혈청 배지임에도 이를 사용하여 모유두 세포를 배양하는 경우 종전의 일반적인 모유두 세포용 혈청 배지를 사용한 경우와 비교하여 모유두 세포의 배양 증식률이 2배 이상 뛰어난 장점이 있다.

도 1은 실시예 1에서 본 발명에 따른 배지 또는 Promocell 배지에 모유두 세포를 배양한 후 배양된 세포의 수를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 본 발명에 따른 배지 또는 Promocell 배지에 모유두 세포를 배양한 후 배양된 세포를 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1에서 본 발명에 따른 배지 또는 Promocell 배지에 모유두 세포를 배양한 후 qPCR을 이용하여 배양된 세포에서 모유두 세포와 관련된 유전자 마커인 VCAN(versican), CD133 및 NES(nestin)의 발현 수준을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 비교예 1에서 Promocell 배지; DMEM 배지에 10% NBCS(newborn calf serum)를 첨가한 배지; 또는 DMEM 배지에 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 배지에 모유두 세포를 배양한 후 배양된 세포를 촬영한 사진을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[실시예 1]

본 발명에 따라 하기 표 1의 조성을 갖는 배지(STK2 배지)가 포함된 100mm 배양 접시에 모유두 세포 2X10⁵ 세포를 접종한 뒤 37℃의 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 단, 비교를 위하여 종래에 모유두 세포 배지로 사용되는 Promocell 배지를 대조군으로 사용하였다. 참고를 위하여, 상기 Promocell 배지에서 첨가 성분으로는 4% 소 태아 혈청(fetal calf serum, FCS) 0.04 ml/ml, 염기성 섬유아세포 성장 인자 1 ng/ml, 소 뇌하수체 추출물(Bovine pituitary extract) 0.004 ml/ml, 및 인간 재조합 인슐린 5 μg/ml에 해당한다. 배양 후 각 배지 별 모유두 세포의 수를 측정하여 그 결과를 도 1에 그래프로 나타내었고, 각 배지 별 배양된 모유두 세포를 촬영한 사진을 도 2에 나타내었다 (이미지 확대배율: 40X). 또한, 배양 후 모유두 세포의 마커인 VCAN(versican), CD133 및 NES(nestin)의 발현 수준을 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

성분		농도
기본 배지	DMEM/MCDB201	1:1 부피비
첨가물	인간 재조합 bFGF	3ng/ml
	덱사메타손	10^-8M
	인간 재조합 인슐린	6.25㎍/ml
	트렌스페린	6.25㎍/ml
	셀렌산	6.25ng/ml
	우혈청 알부민	1.25mg/ml
	지질 농축물	0.01x
	대두 레시틴	10㎍/ml
	콜레스테롤 지질 농축물	3㎍/ml
	(+α)-토코페롤 아세테이트	2㎍/ml
	인간 재조합 간 성장 인자	5ng/ml
	인간 재조합 변환 성장 인자- 3	10ng/ml
	인간 재조합 혈소판 유래 성장 인자	10ng/ml
	인간 재조합 상피세포 성장 인자	20ng/ml
	아스코르브산 2-인산세스퀴마그네슘염	50㎍/ml
	포스파티딜콜린	5㎍/ml
	포스파티딘산소디움염	5㎍/ml
	염화 리튬	1mM
	L-글루타티온	2㎍/ml

도 1 및 2에서 보는 바와 같이, Promocell 배지에 비하여 본 발명에 따른 배지에 모유두 세포를 배양한 경우 1 계대(passage) 및 2 계대(passage) 배양된 세포의 수가 2배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다.

도 3에서 보는 바와 같이, Promocell 배지와 비교할 때, 본 발명의 배지에서 모유두 세포를 배양한 경우, 모유두 세포의 마커인 VCAN(versican), CD133 및 NES(nestin)의 발현 수준 또한 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.

[비교예 1]

상기 실시예 1에서 본 발명에 따른 배지에서 모유두 세포의 증식률 효과를 비교하기 위하여, 상기 실시예 1에서 비교 대조군으로 사용한 Promocell 배지와, DMEM 배지에 10% NBCS(newborn calf serum)를 첨가한 배지; 또는 DMEM 배지에 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 배지에 모유두 세포를 접종하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 배양한 뒤 각 배지 별 배양된 모유두 세포를 촬영한 사진을 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, Promocell 배지와 비교할 때, DMEM 배지에 10% NBCS(newborn calf serum)를 첨가한 배지와 DMEM 배지에 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 배지에서의 모유두 세포의 증식률은 동등 이하의 정도를 보였다. 상기 실시예 1에서 본 발명에 따른 배지에서 모유두 세포의 증식률이 상기 Promocell 배지에서의 모유두 세포의 증식률 보다 2배 이상 높은 것을 보았을 때, 본 발명에 따른 배지를 사용하는 경우 DMEM 배지에 10% NBCS(newborn calf serum)를 첨가한 배지; 또는 DMEM 배지에 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 배지 보다 모유두 세포의 배양 증식률이 현저히 뛰어날 것임을 용이하게 알 수 있었다.

Claims

둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM); 및 MCDB104, MCDB105, MCDB153, MCDB201 및 MCDB202로부터 선택되는 배지;를 포함하는 모유두 세포의 배양용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양용 조성물은 둘베코 변형 이글 배지; 및 상기 MCDB104, MCDB105, MCDB153, MCDB201 및 MCDB202로부터 선택되는 배지;를 0.5~1.5:1의 부피 비로 포함하는, 모유두 세포의 배양용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양용 조성물은 둘베코 변형 이글 배지 및 MCDB201를 포함하는, 모유두 세포의 배양용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양용 조성물은 둘베코 변형 이글 배지 및 MCDB201를 1:1의 부피 비로 포함하는, 모유두 세포의 배양용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양용 조성물은 염기성 섬유아세포성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 0.1~100ng/ml; 덱사메타손(dexamethasone) 10^-10~10^-6M; 인슐린(insulin) 0.5~50㎍/ml; 트랜스페린(transferrin) 0.5~50㎍/ml; 셀렌산(selenous acid) 0.1~50ng/ml; 및 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 0.1~50mg/ml으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는, 모유두 세포의 배양용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양용 조성물은 지질 농축물(Chemically defined lipid concentrate)을 0.001 내지 0.1x의 농도로 더 포함하는, 모유두 세포의 배양용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양용 조성물은 대두 레시틴 0.5~50㎍/ml; 콜레스테롤 지질 농축물(cholesterol lipid concentrate, chol) 0.1~30㎍/ml; 및 (+α)-토코페롤 아세테이트 0.1~50㎍/ml로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는, 모유두 세포의 배양용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양용 조성물은 간 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF) 0.1~50ng/ml; 변환 성장 인자-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3) 0.5~100ng/ml; 및 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor, PDGF-BB) 0.5~100ng/ml으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는, 모유두 세포의 배양용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양용 조성물은 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor, EGF) 0.5~200ng/ml; 아스코르브산 2-인산세스퀴마그네슘염(ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt) 0.5~200㎍/ml; 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 0.1~30㎍/ml; 포스파티딘산소디움염(phosphatidic acid sodium salt) 0.1~30㎍/ml; 염화 리튬(lithium chloride) 0.1~5mM 및 L-글루타티온(L-glutathione) 0.1~10㎍/ml으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는, 모유두 세포의 배양용 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 배양용 조성물에 모유두 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 모유두 세포의 배양 방법.