KR20200013630A - 폐에서 인플라마솜 활성 및 염증의 조절 방법 - Google Patents
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- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Abstract
본 발명은 폐에서 염증을 야기하는 상태를 앓고 있는 포유동물의 폐에서 염증을 감소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은, 단독으로 또는 세포외 소포 흡수 억제제(들)과 병용하여 사용되는, 인플라마솜 성분에 대해 지시된 항체와 같은 포유동물에서 인플라마솜 신호전달을 억제하는 제제를 포함한다.
Description
본 출원은 2016년 12월 29일에 출원된 미국 가출원 연속 번호 62/440,180에 대한 우선권을 주장하고, 모든 목적을 위해 이의 전문이 참조로서 본원에 포함된다.
연방 후원 연구에 관한 진술
본 발명은 국립 신경학적 장애 및 뇌졸중 연구소 (National Institute of Neurological Disorders and Stroke; NINDS)에서 부여한 승인 번호 4R42BS086274-02하에 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정한 권리를 갖는다.
전자 제출한 텍스트 파일에 대한 기술
이와 함께 전자 제출한 텍스트 파일의 내용은 이의 전문이 본원에 참조로서 포함된다: 컴퓨터 판독가능한 포맷 카피의 서열 목록 (파일명칭: UNMI_010_01WO_SeqList_ST25.txt, 기록 날짜: 2017년 12월 28일, 파일 크기 2 킬로바이트).
분야
본 발명은 일반적으로 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 폐에서 염증을 발생시키는 상태에 반응하여 염증을 감소시키기 위한 치료제로서 포유동물의 폐에서 ASC (카스파제 활성화 동원 도메인 (CARD)을 포함하는 아폽토시스-관련된 Speck-유사 단백질) 활성 및 앱센트 인 멜라노마 2 (AIM2) 인플라마솜(inflammasome) 활성을 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
중증 외상성 뇌 손상 (TBI; Traumatic Brain Injury)은 공중 보건에서 주요한 관심사이고, 전세계적으로 사망률 및 이환율의 주요 원인이다. 뇌에 직접적인 손상 이외에, TBI는 폐와 같은 다른 기관에 합병증을 초래할 수 있다. 급성 폐 손상 (Acute Lung Injury; ALI; 2)은 외상 후 일반적인 심폐 문제이고, 40%에 이르는 병원 사망률에 관련된다 (4). TBI 환자는, 특히 ALI가 발병하기 쉽고, 일부 연구에서 30%만큼 높은 발생 정도를 보고하였다 (5). 최근 연구는 전신 염증성 인자가 TBI 후 폐 기능장애 및 폐 손상을 초래할 수 있지만 (6), 그러나 TBI-유도된 폐 손상의 기저를 이루는 정확한 분자 기전은 여전히 정의되지 않고 있다고 나타내었다.
손상된 세포에 의해 방출되는 사이토킨, 케모킨, 및 손상-관련된 분자 패턴 (damage-associated molecular patterns; DAMPs)을 포함하는 폭주하는(A flood of) 분비된 염증 매개체는 뇌 염증을 야기하고, 폐와 같은 원위 장기에 영향을 미친다 (5). 가장 널리 연구된 DAMPs 중 하나는 고이동성 그룹 박스-1 (high mobility group box-1; HMGB1)이고, 이는 TBI를 포함하는 다양한 병원성 상태에서 염증의 조기 매개체로서 역할을 할 수 있다 (7). 보다 최근 연구는 HMGB1이 TBI-유도된 폐 기능장애의 기전에 관여될 수 있음을 나타내었다 (8). HMGB1 방출은 인플라마솜에 의해 조절될 수 있고 (9), 상기 인플라마솜은 카스파제-1의 활성화 및 TBI 후 IL-1β 및 IL-18의 프로세싱에 관여되는 다중-단백질 복합체이다 (10).
모세혈관 누출 및 단백질 데브리스의 침윤을 초래하는 증가된 혈관 투과성을 포함하는 TBI 후 폐 합병증의 병태생리(pathomechanisms)를 설명하는 다양한 설명이 제시되었다 (11). 세포외 소포 (EV)는 세포-대-세포 전달(communication)에서 역할을 하는 막-함유 소포이고 (12), LPS-유도된 뮤린 모델에서 ALI 발병에 역할을 하는 것으로 관여된다. 추가로, EV는 IL-1β 및 인플라마솜 단백질과 같은 생체활성 사이토킨을 운반할 수 있고 (13) (14), 면역 반응을 촉발하고 이웃 및 주변 세포에 이의 적하(cargo)를 통해 염증을 증폭시킬 수 있음이 나타났다. 그러나, EV-매개된 인플라마솜 신호전달이 TBI-유도된 ALI의 병태생리에 기여할 수 있는지는 공지되지 않았다. 추가로, TBI-유도된 ALI의 병태생리가 폐 염증을 발생시키는 다른 상태에 의해 공유되는지도 또한 공지되지 않았다. 추가로, 미국의약품국 (FDA)이 폐 염증 치료용 약물을 승인한 것은 드물다.
따라서, TBI에 의해 야기된 폐 염증 뿐만 아니라 다른 상태의 병태생리를 밝히는 것 뿐만 아니라 폐 염증의 치료 및/또는 예방용 치료학적 조성물의 개발 및 이의 사용이 긴급하게 필요하다.
요지
하나의 측면에서, 이를 필요로 하는 환자에서 폐에서 염증을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 환자에게 인플라마솜 신호전달을 억제하여 환자의 폐에서 염증을 치료하는 제제를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 경우, 폐에서의 염증은 중추신경계 (CNS) 손상, 신경변성질환, 자가면역질환, 천식, 만성폐쇄폐질환, 낭성섬유증, 사이질성폐질환 및 급성호흡곤란증후군으로부터 선택되는 상태에 의해 야기된다. 일부 경우, CNS 손상은 외상성 뇌 손상 (TBI), 뇌졸중 및 척수 손상 (SCI)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우, 신경변성질환은 근위축측삭경화증 (ALS), 다발성 경화증 (MS) 및 파킨슨병 (PD)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우, 조성물의 투여는 상기 환자의 폐 세포에서 인플라마솜 활성화의 억제를 초래한다. 일부 경우, 조성물의 투여는 대조군과 비교하여 환자의 폐 세포에서 카스파제-1, 뉴클레오티드-결합 류신-풍부 반복 피린 도메인 함유 단백질 1 (NLRP1), 뉴클레오티드-결합 류신-풍부 반복 피린 도메인 함유 단백질 2 (NLRP2), 뉴클레오티드-결합 류신-풍부 반복 피린 도메인 함유 단백질 3 (NLRP3), NLR 부류 CARD 도메인-함유 단백질 4 (NLRC4), 카스파제-11, 아폽토시스 단백질의 X-연결(linked) 억제제 (XIAP), 파넥신-1, 카스파제 활성화 동원 도메인을 포함하는 아폽토시스-관련된 Spec-유사 단백질 (ASC), 인터류킨-18 (IL-18), 고이동성 그룹 박스 1 (HMGB1) 또는 앱센트 인 멜라노마 2 (AIM2) 수준의 감소를 초래하고, 여기서, 대조군은 처리되지 않은 환자이다. 일부 경우, 폐 세포는 II형 폐포 세포이다. 일부 경우, 조성물의 투여는 대조군과 비교하여 급성 폐 손상 (ALI)의 감소를 초래하고, 여기서, 대조군은 처리되지 않은 환자이다. 일부 경우, ALI의 감소는 폐포 및/또는 사이질 공간 내로 호중구 침윤의 감소, 감소된 또는 부재의 폐포 중격 비대 또는 이의 조합에 의해 입증된다. 일부 경우, 제제는 세포외 소포 (EV) 흡수 억제제, 인플라마솜 성분에 결합하는 항체 또는 이의 조합이다. 일부 경우, EV 흡수 억제제는 화합물 또는 항체이고, 여기서, 항체는 표 1로부터 선택된다. 일부 경우, 제제는 인플라마솜 성분에 결합하는 항체와 병용된 EV 흡수 억제제이다. 일부 경우, EV 흡수 억제제는 헤파린이다. 일부 경우, 헤파린은 에녹사파린이다. 일부 경우, 인플라마솜 성분에 결합하는 항체는 포유동물 AIM2, NLRP1, NLRP2, NLRP3 또는 NLRC4 인플라마솜의 성분에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 경우, 인플라마솜 성분은 카스파제-1, ASC 또는 AIM2이다. 일부 경우, 인플라마솜 성분은 ASC이다. 일부 경우, 항체는 N-말단 PYRIN-PAAD-DAPIN 도메인 (PYD), C-말단 카스파제-동원 도메인 (CARD) 도메인 또는 상기 ASC 단백질의 PYD 또는 CARD 도메인으로부터 유래된 에피토프에 결합한다. 일부 경우, 항체는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질에 결합한다. 일부 경우, 항체는 상기 환자의 폐에서 ASC 활성을 억제한다. 일부 경우, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 제형화된다. 일부 경우, 조성물은 뇌실내, 복강내, 정맥내 또는 흡입에 의해 투여된다.
또다른 측면에서, 중추신경계 (CNS) 손상을 겪었던 환자의 폐에서 염증을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은 인플라마솜 신호전달을 억제하는 제제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하여 환자의 폐에서 염증을 치료함을 포함한다. 일부 경우, CNS 손상은 외상성 뇌 손상 (TBI), 뇌졸중 및 척수 손상 (SCI)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우, 조성물의 투여는 상기 환자의 폐 세포에서 인플라마솜 활성화의 억제를 초래한다. 일부 경우, 조성물의 투여는 대조군과 비교하여 환자의 폐 세포에서 카스파제-1, NLRP1, NLRP2, NLRP3, NLRC4, 카스파제-11, XIAP, 파넥신-1, 카스파제 활성화 동원 도메인을 포함하는 아폽토시스-관련된 Spec-유사 단백질 (ASC), 인터류킨-18 (IL-18), 고이동성 그룹 박스 1 (HMGB1) 또는 앱센트 인 멜라노마 2 (AIM2) 수준의 감소를 초래하고, 여기서, 대조군은 처리되지 않은 환자이다. 일부 경우, 폐 세포는 II형 폐포 세포이다. 일부 경우, 조성물의 투여는 대조군과 비교하여 급성 폐 손상 (ALI)의 감소를 초래하고, 여기서, 대조군은 처리되지 않은 환자이다. 일부 경우, ALI의 감소는 폐포 및/또는 사이질 공간 내로 호중구 침윤의 감소, 감소된 또는 부재의 폐포 중격 비대 또는 이의 조합에 의해 입증된다. 일부 경우, 제제는 세포외 소포 (EV) 흡수 억제제, 인플라마솜 성분에 결합하는 항체 또는 이의 조합이다. 일부 경우, EV 흡수 억제제는 화합물 또는 항체이고, 여기서, 항체는 표 1로부터 선택된다. 일부 경우, 제제는 인플라마솜 성분에 결합하는 항체와 병용된 EV 흡수 억제제이다. 일부 경우, EV 흡수 억제제는 헤파린이다. 일부 경우, 헤파린은 에녹사파린이다. 일부 경우, 인플라마솜 성분에 결합하는 항체는 포유동물 AIM2, NLRP1, NLRP2, NLRP3 또는 NLRC4 인플라마솜의 성분에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 경우, 인플라마솜 성분은 카스파제-1, ASC 또는 AIM2이다. 일부 경우, 인플라마솜 성분은 ASC이다. 일부 경우, 항체는 PYD, CARD 도메인 또는 상기 ASC 단백질의 PYD 또는 CARD 도메인으로부터 유래된 에피토프에 결합한다. 일부 경우, 항체는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질에 결합한다. 일부 경우, 항체는 상기 환자의 폐에서 ASC 활성을 억제한다. 일부 경우, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 제형화된다. 일부 경우, 조성물은 뇌실내, 복강내, 정맥내 또는 흡입에 의해 투여된다.
도 1a 내지 1n은 TBI-후 C57/BL6 마우스 피질 및 폐 조직에서 인플라마솜 활성화를 예시한다. 도 1a는 TBI 후 활성 카스파제-1, ASC, IL-18, IL-β, HMGB1, 및 AIM2의 대표적인 면역블롯을 도시한다. 활성 카스파제-1 (도 1b), ASC (도 1c), IL-18 (도 1d), HMGB1 (도 1e), AIM 2 (도 1f), 및 IL-β (도 1g)는, TBI-후 4 및 24h에 피질 조직에서 유의하게 상승된다. 데이터는 평균+/-SEM으로 나타낸다; 샴(sham)과 비교하여 ****p<0.001, ***p<0.01, p<0.05. 그룹당 N=4 내지 5. 도 1h는 폐 조직에서 활성 카스파제-1, ASC, IL-18, IL-β, HMGB1, 및 AIM2의 대표적인 면역블롯을 도시한다. i, j, k, l, m, n) 활성 카스파제-1 (도 1i), ASC (도 1j), IL-18 (도 1k), HMGB1 (도 1l), AIM 2 (도 1m), 및 IL-β (도 1n)는 TBI 후 4 및 24h에 폐 조직에서 유의하게 상승된다. 데이터는 평균+/-SEM로서 제시되었다. 그룹당 N= 4 내지 5, 샴과 비교하여 **p<0.01., *p<0.05.
도 2a 내지 2c는 II형 폐포 상피 세포에서 인플라마솜 단백질의 발현을 예시한다. 도 2a는 AIM2를 도시한다. 도 2b는 활성 카스파제-1을 도시하고, 도 2c는 마우스와 비교한 경우 폐 조직에서 CCI 후 (4, 24 h) ASC 면역반응성 증가를 도시한다. AIM2, 카스파제-1, 및 ASC (녹색) 및 II형 상피 세포 (계면활성제 단백질 C, 적색)의 공초점 이미지.
도 3a 내지 3e는 TBI가 마우스 폐에서 핵 및 세포질 HMGB1 발현을 증가시킴을 예시한다. 도 3a는 TBI 후 핵 HMGB1의 대표적인 면역블롯을 도시한다. 도 3b는 샴과 비교하여 핵 HMGB1이 4 시간 손상된 동물에서 유의하게 상승됨을 도시한다. 도 3c는 TBI 후 세포질 HMGB1의 대표적인 면역블롯을 도시한다. 도 3d는 세포질 HMGB1이 샴과 비교하여 4 시간 손상된 동물에서 유의하게 상승됨을 나타낸다. 데이터는 평균+/-SEM으로 제시된다; 샴과 비교하여 ****p<0.001, ***p<0.01, *p<0.05. 그룹당 N=4 내지 5. 도 3e는 샴 마우스와 비교하는 경우 HMGB1 면역반응성이 CCI 후 폐 조직에서 증가되었음을 도시한다. HMGB1 및 II형 상피 세포의 공초점 이미지 (계면활성제 단백질 C, 적색)
도 4a 내지 4c는 TBI-후 4 시간에 마우스 폐에서 파이롭토솜(pyroptosome) 형성을 예시한다. 도 4a는 TBI이 폐 조직에서 ASC의 래더링(laddering)을 유도함을 도시하고, 이는 파이롭토솜의 형성, 카스파제-1의 활성화 및 파이롭토시스(pyroptosis)를 초래하는 ASC 이량체의 올리고머화를 지시한다. 도 4b는 대표적인 면역블롯을 도시하고, 도 4c는 가스데르민의 정량화를 도시한다. 가스데르민-D는 TBI-후 폐 조직에서 유의하게 상승된다. 데이터는 평균+/-SEM로서 제시된다. 그룹당 N=4 내지 5, 샴과 비교하여 **p<0.01., *p<0.05.
도 5a 내지 5b는 TBI가 마우스에서 폐포 형태학적 변화 및 급성 폐 손상을 유도함을 도시한다. 도 5a는 4h 및 24 h에 샴 및 손상된 동물으로부터의 폐 섹션의 H&E 염색을 도시한다. 섹션은 호중구 침윤 (화살표 머리), 폐포 모세혈관 막의 형태의 변화 (별표, *), 사이질 부종 (짧은 화살표)의 증거, 및 사이질 및 폐포 중격의 비대 (파운드, #)의 증거를 도시한다. 도 5b는 4h 및 24 h에 샴과 비교하는 경우 급성 폐 손상 스코어링이 손상된 동물에서 유의하게 증가함을 도시한다. 데이터는 평균+/-SEM로서 제시된다. 그룹당 N= 4 내지 5, 샴과 비교하여 **p<0.01., *p<0.05.
도 6는 대조군 및 TBI-손상된 마우스로부터의 혈청-유래 EV에서 CD81의 발현을 예시한다. 샴 대조군 및 TBI-손상된 마우스로부터의 혈청-유래 EV에서 CD81의 대표적인 면역블롯.
도 7a 내지 7h는 TBI 동물로부터 EV의 입양전달(adoptive transfer)이 비손상된 마우스의 폐에서 카스파제-1 및 ASC를 유도함을 예시한다. 도 7a는, 샴 동물로부터의 EV와 비교하는 경우, 카스파제-1 (도 7b), ASC (도 7c), IL-18 (도 7d), AIM2 (도 7e), HMGB1 (도 7f)이 TBI 마우스로부터 단리된 EV를 받은 동물의 폐에서 상승됨을 나타내는 대표적인 면역블롯을 예시한다. 데이터는 평균+/-SEM으로 제시된다; 샴과 비교하여 *p<.0.05. 그룹당 N=3. TBI 마우스로부터 EV는 H&E 염색에 의해 결정된 바와 같이 폐포 형태학적 변화 (감소된 폐포 크기) 및 염증성 세포의 침윤을 유도하였다 (도 7g). ALI 스코어는 비손상된 마우스와 비교하여 손상된 마우스로부터 전달된 EV에서 유의하게 증가한다 (도 7h). 데이터는 평균+/-SEM으로 제시된다; 비손상된 그룹과 비교하여 *p<.0.05.
도 8a 내지 8f는 에녹사파린 (3 mg/kg) 및 IC 100 (5 mg/kg)으로 치료는 손상된 마우스로부터 EV가 전달된 동물의 폐에서 인플라마솜 발현을 감소시킴을 예시한다. 도 8a는 치료되지 않은 양성 대조군 동물과 비교하여 카스파제-1 (도 8b), ASC (도 8c), IL-1β (도 8d), AIM2 (도 8e), HMGB1 (도 8f)가 에녹사파린 및 IC 100로 처리된 동물의 폐에서 감소됨을 나타내는 대표적인 면역블롯을 예시한다. 데이터는 평균+/-SEM으로 제시된다; 샴과 비교하여 *p<.0.05. 그룹당 N=4.
도 9a 내지 9e는 에녹사파린 (3 mg/kg) 및 IC 100 (5 mg/kg)으로의 처리가 손상된 마우스로부터의 EV가 전달된 동물의 폐에서 ALI 스코어를 감소시킴을 예시한다. 도 9a 내지 9d는 염수 (도 9a), 처리되지 않은 (도 9b), 에녹사파린 (도 9c) 및 IC 100 (항-ASC; 도 9d) 처리된, 손상된 동물로부터의 EV가 전달된 마우스 폐로부터의 폐 섹션의 H&E 염색을 예시한다. 섹션은 호중구 침윤의 증거, 폐포 모세혈관 막의 형태 변화, 사이질 부종의 증거, 및 사이질 및 폐포 중격 비대의 증거를 도시한다. 도 9e는 처리되지 않은 동물과 비교하는 경우 급성 폐 손상 스코어링이 에녹사파린, IC 100으로 처리된 동물에서 유의하게 감소됨을 예시한다. 데이터는 평균+/-SEM로서 제시된다. 그룹당 N= 4, **p<0.01., *p<0.05.
도 10a 내지 10f는 TBI 환자로부터 혈청-유래 EV의 전달이 폐 내피 세포에서 인플라마솜 단백질 발현을 증가시킴을 예시한다. 도 10a는 4 시간 동안 TBI-EV 및 대조군-EV로 인큐베이션한 후 PMVEC에서 카스파제-1, ASC, AIM2, HMGB1의 대표적인 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 10b 내지 10e)는 웨스턴 블롯의 정량화, 그룹당 n=3 필터, n=6 환자, t-테스트, p<0.05를 도시한다. 도 10f는 Ella 간단 플렉스 검정 그룹당 n=3 필터, n=6 환자, t-테스트, p<0.05를 사용하는 IL-1β 발현의 유의한 증가의 면역검정 결과를 도시한다.
도 11a 내지 11c는 폐 내피 세포로 TBI-EV의 전달이 활성 카스파제-1의 면역반응성 및 세포 사멸을 증가시킴을 예시한다. 도 11a는 4 시간 동안 TBI-EV로 인큐베이션된 카스파제-1 FLICA 및 PI 염색 및 PMVEC의 공동-국소화를 도시한다. 도 11b는 4 시간 동안 대조군-EV으로 인큐베이션된 PMVEC에서 카스파제-1 FLICA 및 PI 염색을 도시한다. 도 11c는 4 시간 동안 TBI 및 대조군-EV로 인큐베이션된 PMVEC의 형광성 플레이트 판독기 분석을 도시한다. n=6, p<0.05.
도 2a 내지 2c는 II형 폐포 상피 세포에서 인플라마솜 단백질의 발현을 예시한다. 도 2a는 AIM2를 도시한다. 도 2b는 활성 카스파제-1을 도시하고, 도 2c는 마우스와 비교한 경우 폐 조직에서 CCI 후 (4, 24 h) ASC 면역반응성 증가를 도시한다. AIM2, 카스파제-1, 및 ASC (녹색) 및 II형 상피 세포 (계면활성제 단백질 C, 적색)의 공초점 이미지.
도 3a 내지 3e는 TBI가 마우스 폐에서 핵 및 세포질 HMGB1 발현을 증가시킴을 예시한다. 도 3a는 TBI 후 핵 HMGB1의 대표적인 면역블롯을 도시한다. 도 3b는 샴과 비교하여 핵 HMGB1이 4 시간 손상된 동물에서 유의하게 상승됨을 도시한다. 도 3c는 TBI 후 세포질 HMGB1의 대표적인 면역블롯을 도시한다. 도 3d는 세포질 HMGB1이 샴과 비교하여 4 시간 손상된 동물에서 유의하게 상승됨을 나타낸다. 데이터는 평균+/-SEM으로 제시된다; 샴과 비교하여 ****p<0.001, ***p<0.01, *p<0.05. 그룹당 N=4 내지 5. 도 3e는 샴 마우스와 비교하는 경우 HMGB1 면역반응성이 CCI 후 폐 조직에서 증가되었음을 도시한다. HMGB1 및 II형 상피 세포의 공초점 이미지 (계면활성제 단백질 C, 적색)
도 4a 내지 4c는 TBI-후 4 시간에 마우스 폐에서 파이롭토솜(pyroptosome) 형성을 예시한다. 도 4a는 TBI이 폐 조직에서 ASC의 래더링(laddering)을 유도함을 도시하고, 이는 파이롭토솜의 형성, 카스파제-1의 활성화 및 파이롭토시스(pyroptosis)를 초래하는 ASC 이량체의 올리고머화를 지시한다. 도 4b는 대표적인 면역블롯을 도시하고, 도 4c는 가스데르민의 정량화를 도시한다. 가스데르민-D는 TBI-후 폐 조직에서 유의하게 상승된다. 데이터는 평균+/-SEM로서 제시된다. 그룹당 N=4 내지 5, 샴과 비교하여 **p<0.01., *p<0.05.
도 5a 내지 5b는 TBI가 마우스에서 폐포 형태학적 변화 및 급성 폐 손상을 유도함을 도시한다. 도 5a는 4h 및 24 h에 샴 및 손상된 동물으로부터의 폐 섹션의 H&E 염색을 도시한다. 섹션은 호중구 침윤 (화살표 머리), 폐포 모세혈관 막의 형태의 변화 (별표, *), 사이질 부종 (짧은 화살표)의 증거, 및 사이질 및 폐포 중격의 비대 (파운드, #)의 증거를 도시한다. 도 5b는 4h 및 24 h에 샴과 비교하는 경우 급성 폐 손상 스코어링이 손상된 동물에서 유의하게 증가함을 도시한다. 데이터는 평균+/-SEM로서 제시된다. 그룹당 N= 4 내지 5, 샴과 비교하여 **p<0.01., *p<0.05.
도 6는 대조군 및 TBI-손상된 마우스로부터의 혈청-유래 EV에서 CD81의 발현을 예시한다. 샴 대조군 및 TBI-손상된 마우스로부터의 혈청-유래 EV에서 CD81의 대표적인 면역블롯.
도 7a 내지 7h는 TBI 동물로부터 EV의 입양전달(adoptive transfer)이 비손상된 마우스의 폐에서 카스파제-1 및 ASC를 유도함을 예시한다. 도 7a는, 샴 동물로부터의 EV와 비교하는 경우, 카스파제-1 (도 7b), ASC (도 7c), IL-18 (도 7d), AIM2 (도 7e), HMGB1 (도 7f)이 TBI 마우스로부터 단리된 EV를 받은 동물의 폐에서 상승됨을 나타내는 대표적인 면역블롯을 예시한다. 데이터는 평균+/-SEM으로 제시된다; 샴과 비교하여 *p<.0.05. 그룹당 N=3. TBI 마우스로부터 EV는 H&E 염색에 의해 결정된 바와 같이 폐포 형태학적 변화 (감소된 폐포 크기) 및 염증성 세포의 침윤을 유도하였다 (도 7g). ALI 스코어는 비손상된 마우스와 비교하여 손상된 마우스로부터 전달된 EV에서 유의하게 증가한다 (도 7h). 데이터는 평균+/-SEM으로 제시된다; 비손상된 그룹과 비교하여 *p<.0.05.
도 8a 내지 8f는 에녹사파린 (3 mg/kg) 및 IC 100 (5 mg/kg)으로 치료는 손상된 마우스로부터 EV가 전달된 동물의 폐에서 인플라마솜 발현을 감소시킴을 예시한다. 도 8a는 치료되지 않은 양성 대조군 동물과 비교하여 카스파제-1 (도 8b), ASC (도 8c), IL-1β (도 8d), AIM2 (도 8e), HMGB1 (도 8f)가 에녹사파린 및 IC 100로 처리된 동물의 폐에서 감소됨을 나타내는 대표적인 면역블롯을 예시한다. 데이터는 평균+/-SEM으로 제시된다; 샴과 비교하여 *p<.0.05. 그룹당 N=4.
도 9a 내지 9e는 에녹사파린 (3 mg/kg) 및 IC 100 (5 mg/kg)으로의 처리가 손상된 마우스로부터의 EV가 전달된 동물의 폐에서 ALI 스코어를 감소시킴을 예시한다. 도 9a 내지 9d는 염수 (도 9a), 처리되지 않은 (도 9b), 에녹사파린 (도 9c) 및 IC 100 (항-ASC; 도 9d) 처리된, 손상된 동물로부터의 EV가 전달된 마우스 폐로부터의 폐 섹션의 H&E 염색을 예시한다. 섹션은 호중구 침윤의 증거, 폐포 모세혈관 막의 형태 변화, 사이질 부종의 증거, 및 사이질 및 폐포 중격 비대의 증거를 도시한다. 도 9e는 처리되지 않은 동물과 비교하는 경우 급성 폐 손상 스코어링이 에녹사파린, IC 100으로 처리된 동물에서 유의하게 감소됨을 예시한다. 데이터는 평균+/-SEM로서 제시된다. 그룹당 N= 4, **p<0.01., *p<0.05.
도 10a 내지 10f는 TBI 환자로부터 혈청-유래 EV의 전달이 폐 내피 세포에서 인플라마솜 단백질 발현을 증가시킴을 예시한다. 도 10a는 4 시간 동안 TBI-EV 및 대조군-EV로 인큐베이션한 후 PMVEC에서 카스파제-1, ASC, AIM2, HMGB1의 대표적인 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 10b 내지 10e)는 웨스턴 블롯의 정량화, 그룹당 n=3 필터, n=6 환자, t-테스트, p<0.05를 도시한다. 도 10f는 Ella 간단 플렉스 검정 그룹당 n=3 필터, n=6 환자, t-테스트, p<0.05를 사용하는 IL-1β 발현의 유의한 증가의 면역검정 결과를 도시한다.
도 11a 내지 11c는 폐 내피 세포로 TBI-EV의 전달이 활성 카스파제-1의 면역반응성 및 세포 사멸을 증가시킴을 예시한다. 도 11a는 4 시간 동안 TBI-EV로 인큐베이션된 카스파제-1 FLICA 및 PI 염색 및 PMVEC의 공동-국소화를 도시한다. 도 11b는 4 시간 동안 대조군-EV으로 인큐베이션된 PMVEC에서 카스파제-1 FLICA 및 PI 염색을 도시한다. 도 11c는 4 시간 동안 TBI 및 대조군-EV로 인큐베이션된 PMVEC의 형광성 플레이트 판독기 분석을 도시한다. n=6, p<0.05.
상세한 설명
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 숙련가가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 길이 또는 번역후 변형, 예를 들면, 글리코실화 또는 인산화에 상관없이 아미노산의 임의의 펩티드-연결 쇄를 의미하기 위해 동의어로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 일반적으로 그리고 광범위하게 면역글로불린, 모노클로날 항체, 및 폴리클로날 항체, 뿐만 아니라 이의 활성 단편을 언급한다. 단편은 동족 항원 (예를 들면, ASC, NLRP1, AIM2 등)에 결합되는 경우 활성일 수 있거나, 생물학적으로 기능적인 경우 활성일 수 있다. 본원에 사용하기 위한 항체는 당해 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 키메라, 사람화, 또는 사람일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "사람화 항체"는 비-사람 항체의 최소 부분이 그외의 사람 항체 내에 도입된 항체를 언급한다.
본원에 사용된 용어 "사람 항체"는 단지 최소의 서열 변화 또는 변형을 갖는 단백질의 실질적으로 모든 부분이 사람에서 실질적으로 비-면역원성인 항체를 언급한다.
항원 결합 부위는 일반적으로 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL) 면역글로불린 도메인에 의해 형성될 수 있고, 상보성 결정 영역 (CDRs)으로 불리는 6개 표면 폴리펩티드 루프에 의해 형성된 항원-결합 계면을 갖는다. 3개의 CDRs가 각각 VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3)에 프레임워크 영역 (FRs)과 함께 존재한다.
용어 "CDR 영역" 또는 "CDR"은 문헌[참조: Kabat et al., 1991 (Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington), 및 이후의 에디션]에 정의된 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 초가변 영역을 의미할 수 있다. 항체는 전형적으로 3 중쇄 CDRs 및 3 경쇄 CDRs을 포함한다.
전체 항체의 단편은 또한 항원을 결합할 수 있는 것으로 나타났다. 결합 단편의 예는 다음을 포함한다: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편 (참조: Ward, E. S. et al., (1989) Nature 341, 544-546); (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편 (참조: McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554); (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편 (참조: Holt et al., (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490); (iv) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (참조: Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554, Holt et al., (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) F(ab')2 단편, 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 이가 단편; (vii) 단일 쇄 Fv 분자 (scFv), 여기서, VH 도메인 및 VL 도메인은 펩티드 링커에 의해 연결되어 2개의 도메인이 회합하여 항원 결합 부위를 형성하도록 한다 (참조: Bird et al., (1988) Science, 242, 423-426, Huston et al., (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883); (viii) 이특이적 단일 쇄 Fv 이량체 (PCT/US92109965) 및 (ix) "디아바디", 유전자 융합에 의해 작제된 다가 또는 다중특이적 단편 (참조: WO94/13804; Holliger, P. (1993) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448).
Fv, scFv 또는 디아바디 분자를 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디설파이드 브릿지를 도입하여 안정화시킬 수 있다 (참조: Reiter, Y. et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디가 또한 만들어질 수 있다 (참조: Hu, S. et al., (1996) Cancer Res., 56, 3055-3061). 결합 단편의 다른 예는 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 수개의 잔기를 부가하여 Fab 단편과 상이한 Fab', 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 갖는 Fab' 단편인 Fab'-SH일 수 있다.
본원에 사용되는 경우 "Fv"는 항원-인식 및 항원-결합 부위 둘 다를 함유하는 항체의 최소 단편을 언급할 수 있다. 본원에 사용되는 경우 "Fab"는 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 항체의 단편을 언급할 수 있다. 용어 "mAb"는 모노클로날 항체를 언급한다.
용어 카스파제 활성화 동원 도메인 (CARD) 함유 아폽토시스-관련된 Speck-유사 단백질" 및 "ASC"은 ASC 유전자의 발현 생산물 또는 이의 이소형, 또는 ASC와 적어도 65% (그러나 바람직하게는 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)의 아미노산 서열 동일성을 공유하고 (예를 들면, 사람에서 NP_037390 (Q9ULZ3-1), NP_660183 (Q9ULZ3-2) 또는 Q9ULZ3-3, 마우스에서 NP_075747 또는 래트에서 NP_758825 (BAC43754)) ASC의 기능적 활성을 나타내는 단백질을 의미한다. 단백질의 "기능적 활성"은 단백질의 생리학적 기능과 관련된 임의의 활성이다. ASC의 기능적 활성은, 예를 들면, 카스파제-1의 활성화를 위한 단백질의 동원 및 세포 사멸의 개시를 포함한다.
용어 "ASC 유전자," 또는 "ASC 핵산"은 본래(native) ASC-암호화 핵산 서열, ASC cDNA가 전사될 수 있는 게놈 서열 및/또는 상기한 것의 대립유전자 변종 및 동족체를 의미한다. 상기 용어는 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 및 RNA를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "인플라마솜"은 카스파제-1을 활성화시키는 다중-단백질 (예를 들면, 적어도 2개의 단백질) 복합체를 의미한다. 추가로, 용어 "인플라마솜"은, 카스파제-1 활성을 활성화시켜 차례로 IL-1β, IL-18 및 IL-33 프로세싱 및 활성화를 조절하는 다중-단백질 복합체를 언급한다. 문헌[참조: Arend et al. 2008; Li et al. 2008; and Martinon et al. 2002]을 참조하고, 이들 각각의 전문이 참조로서 본원에 포함된다. 용어 "NLRP1 인플라마솜","NALP1 인플라마솜", "NLRP2 인플라마솜", "NALP2 인플라마솜", "NLRP3 인플라마솜", "NALP3 인플라마솜", "NLRC4 인플라마솜", "IPAF 인플라마솜" 또는 "AIM2 인플라마솜"은 적어도 카스파제-1 및 하나의 어댑터 단백질, 예를 들면, ASC의 단백질 복합체를 의미한다. 예를 들면, 용어 "NLRP1 인플라마솜" 및 "NALP1 인플라마솜"은 카스파제-1의 활성화 및 인터류킨-1β, 인터류킨-18 및 인터류킨-33의 프로세싱을 위한 NLRP1, ASC, 카스파제-1, 카스파제-11, XIAP, 및 파넥신-1을 포함하는 다중단백질 복합체를 의미할 수 있다. 용어 "NLRP2 인플라마솜" 및 "NALP2 인플라마솜"은 NLRP2 (aka NALP2), ASC 및 카스파제-1을 포함하는 다중단백질 복합체를 의미할 수 있는 반면, 용어 "NLRP3 인플라마솜" 및 "NALP3 인플라마솜"은 NLRP3 (aka NALP3), ASC를 포함하는 다중단백질 복합체를 의미할 수 있고, 용어 "NLRC4 인플라마솜" 및 "IPAF 인플라마솜"은 NLRC4 (aka IPAF), ASC 및 카스파제-1을 포함하는 다중단백질 복합체를 의미할 수 있다. 추가로, 용어 "AIM2 인플라마솜"은 AIM2, ASC 및 카스파제-1을 포함하는 다중단백질 복합체를 의미할 수 있다.
본원에 사용된 구절 "서열 동일성"은, 간격과 삽입을 고려하여 2개의 서열이 하위단위 매칭이 최대화되도록 정렬되는 경우, 2개의 서열 (예를 들면, 핵산 서열, 아미노산 서열)에서 상응하는 위치에서 동일한 하위단위의 퍼센트를 의미한다. 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어 (예를 들면, Sequence Analysis Software Package, 제조원: Accelrys CGC, San Diego, CA)를 사용하여 측정할 수 있다.
구절 "치료학적 유효량" 및 "유효 용량(effective dosage)"은 치료학적으로 (예를 들면, 임상적으로) 바람직한 결과를 발생하기에 충분한 양을 의미하고; 결과의 정확한 특성은 치료되는 장애의 특성에 좌우되어 가변적일 수 있다. 예를 들면, 치료될 장애가 SCI인 경우, 결과는 운동 기술 및 이동 기능의 개선, 감소된 척수 병변 등일 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 매일 1회 이상 내지 매주 1회 이상 투여될 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상자의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 다른 존재하는 질환을 포함하는, 특정 인자가 대상자를 효과적으로 치료하기 위해 요구되는 용량 및 시기에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인지할 것이다. 또한, 대상자를 본 발명의 조성물의 치료학적 유효량으로 치료하는 것은 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료(treatment)"는, 질환, 질환의 증상, 또는 질환에 대한 소인을 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 구제, 개선, 향상시키거나 영향을 주기 위한 목적으로, 본원에 기재되거나, 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 치료학적 제제를 환자에게 적용 또는 투여, 또는 질환, 질환의 징후 또는 질환에 대한 소인을 갖는 환자로부터 단리된 조직 또는 세포주에 치료학적 제제의 적용 또는 투여로 정의된다.
용어 "환자" "대상자" 및 "개인"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 치료받을 포유동물을 의미하고, 사람 환자가 바람직하다. 일부 경우, 본 발명의 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 마우스, 래트, 및 햄스터를 포함하는 설치류, 뿐만 아니라 영장류를 포함하는 질환 동물 모델의 실험 동물에서, 수의학적 적용에서, 및 질환을 위한 개발에서 사용을 발견한다.
본원에서 상호교환될 수 있게 사용된 "앱센트 인 멜라노마 2" 및 "AIM2"는 AIM2 유전자의 발현 생산물 또는 이소형; 또는 AIM2와 적어도 65% (그러나 바람직하게는 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)의 아미노산 서열 동일성을 공유하고 (예를 들면, 등록 번호(들) NX_014862, NP004824, XP016858337, XP005245673, AAB81613, BAF84731, AAH10940) AIM2의 기능적 활성을 나타내는 단백질을 의미할 수 있다.
본원에서 상호교환될 수 있게 사용된 "NALP1" 및 "NLRP1"은 NALP1 또는 NLRP1 유전자의 발현 생산물 또는 이소형; 또는 NALP1과 적어도 65% (그러나 바람직하게는 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)의 아미노산 서열 동일성을 공유하고 (예를 들면, 등록 번호(들) AAH51787, NP_001028225, NP_127500, NP_127499, NP_127497, NP055737) NALP1의 기능적 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.
본원에서 상호교환될 수 있게 사용된 "NALP2" 및 "NLRP2"는 NALP2 또는 NLRP2 유전자의 발현 생산물 또는 이소형; 또는 NALP2와 적어도 65% (그러나 바람직하게는 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)의 아미노산 서열 동일성을 공유하고 (예를 들면, 등록 번호(들) NP_001167552, NP_001167553, NP_001167554 또는 NP_060322) NALP2의 기능적 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.
본원에서 상호교환될 수 있게 사용된 "NALP3" 및 "NLRP3"은 NALP3 또는 NLRP3의 발현 생산물 유전자 또는 이소형; 또는 NALP3과 적어도 65% (그러나 바람직하게는 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)의 아미노산 서열 동일성을 공유하고 (예를 들면, 등록 번호(들) NP_001073289, NP_001120933, NP_001120934, NP_001230062, NP_004886, NP_899632, XP_011542350, XP_016855670, XP_016855671, XP_016855672 또는 XP_016855673) NALP3의 기능적 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.
본원에서 상호교환될 수 있게 사용된 "NLRC4" 및 "IPAF"는 NLRC4 또는 IPAF 유전자의 발현 생산물 또는 이소형; 또는 NLRC4와 적어도 65% (그러나 바람직하게는 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)의 아미노산 서열 동일성을 공유하고 (예를 들면, 등록 번호(들) NP_001186067, NP001186068, NP_001289433 또는 NP_067032) NLRC4의 기능적 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.
용어 "뇌졸중" 및 "허혈성 뇌졸중"은 혈류가 뇌 또는 척수의 부분으로 차단되는 경우를 의미한다.
"CNS에 대한 외상성 손상"은 CNS 기능의 영구적 또는 일시적 장애를 야기할 수 있는 외부 기계적 힘으로부터 CNS의 임의의 손상(insult)을 의미한다.
용어 "항체"는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 효소적 절단, 펩티드 합성 또는 재조합 기술과 같은 임의의 공지된 기술로 제공되는, 가용성 또는 결합된 형태로 표지화될 수 있는 항체에 대한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAbs), 키메라 항체, 사람화 항체, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 뿐만 아니라 이의 단편, 영역 또는 유도체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 이러한 항-ASC 및 항-NLRP1 항체는 카스파제-1 활성화를 방해하는, 각각 ASC 및 NLRP1의 결합 부분일 수 있다.
종래의 분자 생물학 기술에 연루되는 방법은 본원에 기재되어 있다. 이러한 기술은 일반적으로 당해 기술분야에 공지되어 있고, 다음과 같은 방법론 논문에 상세하게 기재되어 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; 및 Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (정기적으로 업데이트됨). 면역학 기술은 일반적으로 당해 기술분야에 공지되어 있고, 다음과 같은 방법론 논문에서 상세하게 기재되어 있다: Advances in Immunology, volume 93, ed. Frederick W. Alt, Academic Press, Burlington, MA, 2007; Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, eds. Gary C. Howard and Matthew R. Kaser, CRC Press, Boca Raton, FL, 2006; Medical Immunology, 6th ed., edited by Gabriel Virella, Informa Healthcare Press, London, England, 2007; 및 Harlow and Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 조성물 및 방법이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 조성물 및 방법이 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 및 특허는 이의 전문이 참조로서 본원에 포함된다. 모순이 있는 경우, 정의를 포함하는 본 발명의 명세서가 우선할 것이다. 하기 논의된 특정 실시형태는 단시 예시적이고 제한하려는 의도는 아니다.
개요
폐 염증을 초래하거나 야기하는 상태를 겪었거나 앓고 있는 포유동물의 폐에서 염증을 감소시키기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 세포외 소포 (EV) 흡수를 조절 (예를 들면, 억제 또는 감소)하고 포유동물에서 폐 염증용 치료제로서 용도를 갖는 포유동물 인플라마솜 및/또는 화합물 중 적어도 하나의 성분 (예를 들면, ASC)에 특이적으로 결합하는 본원에 제공된 항체 또는 이의 활성 단편을 포함할 수 있다.
폐에서 염증성 반응을 초래하고/하거나 야기하는 상태를 갖는 포유동물의 폐에서 염증을 감소시키기 위한 방법이 본원에 기재된다. 하나의 실시형태에서, 포유동물의 폐에서 염증을 치료하는 방법은 인플라마솜 신호전달을 억제하는 제제를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함한다. 포유동물은 본원에 제공된 환자 또는 대상자일 수 있다. 폐에서 염증을 초래할 수 있는 상태의 예는 중추신경계 (CNS) 손상 (예를 들면, 척수 손상 (SCI), 외상성 뇌 손상 (TBI) 또는 뇌졸중), 신경변성질환, 자가면역질환, 천식, 만성폐쇄폐질환 (COPD), 낭성섬유증, 사이질성폐질환 또는 급성호흡곤란증후군을 포함한다. 조성물은 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 치료학적 유효량은 본원에 제공된 용량(dose)일 수 있다. 제제는 세포외 소포 (EV) 흡수 억제제, 인플라마솜의 성분 또는 이의 조합에 결합하는 본원에 제공된 항체 또는 이의 활성 단편일 수 있다. 조성물은 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들면, 흡입에 의해, 정맥내, 복강내, 또는 뇌실내로 투여될 수 있다. 조성물은 추가로 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 제제의 투여는 대상자의 폐에서 포유동물 인플라마솜의 성분의 활성 및/또는 발현 수준의 감소를 초래할 수 있다. 감소는 폐의 세포, 예를 들면, II형 폐포 세포에 있을 수 있다. 감소는 대조군과 비교할 수 있다. 대조군은 제제의 투여 이전의 대상자일 수 있다. 대조군은 제제를 투여받지 않은 대상자에서 인플라마솜 성분(들)의 활성 및/또는 발현 수준일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 제제의 투여는 적어도 대상자의 폐 또는 폐 세포에서 카스파제-1 활성화의 감소를 초래한다. 하나의 실시형태에서, 제제의 투여는 적어도 대상자의 폐 또는 폐 세포에서 하나 이상의 인플라마솜 성분 (예를 들면, ASC, AIM2, NALP1, NALP2, NALP2, NALP3 또는 NLRC4)의 발현 수준의 감소를 초래한다.
또다른 실시형태에서, 제제의 투여는 급성 폐 손상 (ALI)의 감소 또는 제거를 초래할 수 있다. 하나의 실시형태에서, ALI의 감소는 폐포 및/또는 사이질 공간 내로 호중구 침윤의 감소, 감소된 또는 부재의 폐포 중격 비대 또는 이의 조합에 의해 입증된다. 상기 감소는 대조군과 비교할 수 있다. 대조군은 제제의 투여 이전의 대상자에서 ALI일 수 있다. 대조군은 제제를 투여받지 않은 ALI을 앓고 있는 대상자에서 ALI일 수 있다.
또한 또다른 실시형태에서, 제제의 투여는 대상자의 폐에서 파이롭토시스의 감소 또는 제거를 초래할 수 있다. 파이롭토시스는 카스파제-1의 활성화에 연루되는 세포 사멸의 염증유발성 형태이다. 파이롭토시스는 가스데르민 D (GSDMD)의 카스파제-1 매개된 절단에 의해 촉발될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 파이롭토시스의 감소는 대상자의 폐 또는 폐 세포 (예를 들면, II형 폐포 세포)에서 GSDMD의 절단의 감소 또는 결핍에 의해 입증된다. 파이롭토시스의 감소 또는 제거는 대조군과 비교할 수 있다. GSDMD의 절단의 감소 또는 결핍은 대조군과 비교할 수 있다. 대조군은 제제의 투여 이전의 대상자에서 파이롭토시스의 수준일 수 있다. 대조군은 제제를 투여받지 않은 파이롭토시스를 앓고 있는 대상자에서 파이롭토시스의 수준일 수 있다.
하나의 실시형태에서, 투여되는 제제는 EV 흡수 억제제이다. EV 흡수 억제제는 본원에 제공된 화합물, 안티센스 RNA, siRNA, 펩티드, 항체 또는 이의 활성 단편 또는 이의 조합일 수 있다. 화합물 또는 펩티드는 헤파린, α-디플루오로메틸오르니틴 (DFMO), 에녹사파린, 아시알로페투인, 사람 수용체-관련된 단백질 (receptor-associated protein; RAP), RGD (Arg-Gly-Asp) 펩티드, 사이토칼라신 D, 사이토칼라신 B, 에틸렌디아민테트라 아세트산 (EDTA), 라트룬쿨린 A, 라트룬쿨린 B, NSC23766, 다이나소어, 크로르프로마진, 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드 (EIPA), 아밀로라이드, 바필로마이신 A 모넨신 및 크로로퀸, 아넥신-V, 워트만닌, LY294002, 메틸-β-사이클로덱스트린 (MβCD), 필리핀, 심바스타틴, 푸모니신 B1 및 N-부틸데옥시노지리마이신 하이드로클로라이드, U0126 또는 양성자 펌프 억제제로부터 선택된 하나 이상의 화합물일 수 있다. 본원에 제공된 EV 흡수 억제제 항체 또는 이의 활성 단편은 표 1에 열거된 단백질 표적에 대해 지시된 하나 이상의 항체 또는 이의 활성 단편일 수 있다. EV 흡수 억제제를 사용하여 포유동물의 폐에서 염증을 치료 및/또는 감소시키기 위한 조성물은 추가로 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
표 1. EV 흡수를 차단하는데 사용하기 위한 예시적인 표적 및 상응하는 항체.
하나의 실시형태에서, 투여되는 제제는 포유동물 인플라마솜 또는 이로부터 유래되는 항원 또는 에피토프의 성분에 대하여 지시된 본원에 제공된 항체 또는 이의 활성 단편이다. 또다른 실시형태에서, 투여되는 제제는 포유동물 인플라마솜의 성분에 대해 지시된 안티센스 RNA 또는 siRNA이다. 인플라마솜 성분은 당해 기술분야에 공지된 임의의 인플라마솜의 성분, 예를 들면, NAPL1, NALP2, NALP3, NLRC4 또는 AIM2 인플라마솜일 수 있다. 전형적인 실시형태에서, 항체는 ASC 또는 이로부터 유래되는 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 그러나, 포유동물 인플라마솜 (예를 들면, NALP1, NALP2, NALP3, NLRC4 또는 AIM2 인플라마솜)의 임의의 다른 성분에 대한 항체가 사용될 수 있다.
본원에 기재된 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이의 활성 단편일 수 있다. 상기 항체 또는 활성 단편은 본원에 기재된 바와 같이 키메라, 사람 또는 사람화될 수 있다.
ASC를 특이적으로 결합하는 본원에 제공된 임의의 적합한 항체 또는 이의 활성 단편이 사용될 수 있고, 예를 들면, 대상자의 폐 세포 (예를 들면, II형 폐포 세포)에서 ASC 활성을 억제하는 항체가 사용될 수 있다. 전형적인 실시형태에서, 항체는 아미노산 서열 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다. 유사하게는, 또다른 실시형태에서, 인플라마솜은 NALP1 인플라마솜이고, 적어도 하나의 성분은 NALP1 (즉, NLRP1)이다. 이러한 실시형태에서, 본원에 제공된 항체 또는 이의 활성 단편은 아미노산 서열 서열번호 3 또는 서열번호 4와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다.
또한 또다른 실시형태에서, 제제는 인플라마솜의 성분을 결합하는 본원에 제공된 하나 이상의 항체 또는 이의 활성 단편과 병용된 하나 이상의 EV 흡수 억제제이다. EV 흡수 억제제는 본원에 제공된 임의의 EV 흡수 억제제일 수 있다. 인플라마솜의 성분을 결합하는 항체는 본원에 제공된 임의의 인플라마솜 성분을 결합하는 임의의 항체일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 폐 염증을 앓고 있는 대상자에게 투여되는 제제는 AIM2 인플라마솜의 성분 (예를 들면, ASC)을 결합하는 항체와 병용한 헤파린 (예를 들면, 에녹사파린)을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 상기 방법은: 포유동물 인플라마솜 (예를 들면, AIM2 인플라마솜)의 적어도 하나의 성분 (예를 들면, ASC)에 특이적으로 결합하는 본원에 제공된 항체 또는 이의 활성 단편을 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 제공하고; 폐 염증을 앓고 있는 포유동물에게 조성물을 투여함을 포함하고, 여기서, 포유동물에게 조성물을 투여하는 것은 포유동물의 폐에서 카스파제-1 활성화의 감소를 초래한다. 또다른 실시형태에서, 상기 방법은: 포유동물 인플라마솜 (예를 들면, AIM2 인플라마솜)의 적어도 하나의 성분 (예를 들면, ASC)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 제공하고; 폐 염증을 앓고 있는 포유동물에게 조성물을 투여함을 포함하고, 여기서, 포유동물에게 조성물을 투여하는 것은 하나 이상의 인플라마솜 성분 (예를 들면, ASC)의 수준의 감소를 초래한다. 또한 또다른 실시형태에서, 상기 방법은: 포유동물 인플라마솜 (예를 들면, AIM2 인플라마솜)의 적어도 하나의 성분 (예를 들면, ASC)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 제공하고; 폐 염증을 앓고 있는 포유동물에게 조성물을 투여함을 포함하고, 여기서, 포유동물에게 조성물을 투여하는 것은 ALI의 감소를 초래한다. 폐 염증은 CNS 손상 (예를 들면, SCI 또는 TBI), 천식, 만성폐쇄폐장애 (COPD), 신경변성질환, 또는 염증성 성분을 갖는 자가면역질환의 결과일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 폐 염증은 CNS 손상, 예를 들면, TBI 또는 SCI에 의해 야기된다.
하나의 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 추가로 폐 염증을 앓고 있는 것으로 의심되는 대상자로부터의 샘플에서 포유동물 인플라마솜의 하나 이상의 성분의 수준 또는 활성을 검출함을 수반한다. 수준 또는 활성을 검출하는 방법은 대상자로부터 수득한 샘플에서 적어도 하나의 인플라마솜 단백질 (예를 들면, ASC 또는 AIM2)의 수준을 측정하고; 상기 적어도 하나의 인플라마솜 단백질 (예를 들면, ASC 또는 AIM2)의 상승된 수준 또는 활성을 존재 또는 부재를 결정함을 수반한다. 상기 적어도 하나의 인플라마솜 단백질의 수준 또는 활성은 대조군 샘플에서 상기 적어도 하나의 인플라마솜 단백질의 수준에 상대적으로 향상될 수 있다. 단백질 시그니처(signature)에서 상기 적어도 하나의 인플라마솜 단백질의 수준 또는 활성은 이전에-결정된 참조 값 또는 참조 값의 범위에 상대적으로 향상될 수 있다. 적어도 하나의 인플라마솜 단백질은 뉴클레오티드-결합 류신-풍부 반복 피린 도메인 함유 단백질 1 (NLRP1), NLRP2, NLRP3, NLRC4, AIM2, 카스파제 동원 도메인 (ASC) 함유 아폽토시스-관련된 Speck-유사 단백질, 카스파제-1, 또는 이의 조합일 수 있다. 샘플은 뇌척수액 (CSF), 타액, 혈액, 혈청, 혈장, 소변 또는 폐 흡인물일 수 있다.
포유동물 인플라마솜의 적어도 하나의 성분에 특이적으로 결합하는 항체
포유동물의 폐에서 염증을 감소시키기 위한 본원에 기재된 방법은 포유동물 인플라마솜 (예를 들면, AIM2 인플라마솜)의 적어도 하나의 성분 (예를 들면, ASC, AIM2)에 특이적으로 결합하는 본원에 제공된 항체 또는 이의 활성 단편을 포함하는 조성물을 포함한다. 포유동물의 폐에서 염증을 치료 및/또는 감소시키기 위한 조성물은 추가로 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본원의 방법에서 사용하기 위한 포유동물 인플라마솜의 성분에 대하여 지시된 예시적인 항체는 US8685400에서 발견된 것들일 수 있고, 이의 내용 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
하나의 실시형태에서, 포유동물의 폐에서 염증을 치료 및/또는 감소시키기 위한 조성물은 포유동물 ASC 단백질, 예를 들면, 사람, 마우스 또는 래트 ASC 단백질의 도메인 또는 이의 부분에 특이적으로 결합하는 본원에 제공된 항체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 임의의 적합한 항-ASC 항체를 사용할 수 있고, 수개가 시판된다. 본원의 방법에서 사용하기 위한 항-ASC 항체의 예는 US8685400에서 발견된 것들일 수 있고, 이의 내용 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 시판되는 항-ASC 항체의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 04-147 항-ASC, 클론 2EI-7 마우스 모노클로날 항체 (제조원: MilliporeSigma), AB3607 - 항-ASC 항체 (제조원: Millipore Sigma), orb194021 항-ASC (제조원: Biorbyt), LS-C331318-50 항-ASC (제조원: LifeSpan Biosciences), AF3805 항-ASC (제조원: R & D Systems), NBP1-78977 항-ASC (제조원: Novus Biologicals), 600-401-Y67 항-ASC (제조원: Rockland Immunochemicals), D086-3 항-ASC (제조원: MBL International), AL177 항-ASC (제조원: Adipogen), 모노클로날 항-ASC (클론 o93E9) 항체, 항-ASC 항체 (F-9) (제조원: Santa Cruz Biotechnology), 항-ASC 항체 (B-3) (제조원: Santa Cruz Biotechnology), ASC 폴리클로날 항체 - ADI-905-173 (제조원: Enzo Life Sciences,) 또는 A161 항-사람 ASC - (제조원: Leinco Technologies)을 포함한다. 사람 ASC 단백질은 등록 번호 NP_037390.2 (Q9ULZ3-1), NP_660183 (Q9ULZ3-2) 또는 Q9ULZ3-3일 수 있다. 래트 ASC 단백질은 등록 번호 NP_758825 (BAC43754)일 수 있다. 마우스 ASC 단백질은 등록 번호 NP_075747.3일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항체는 포유동물 ASC 단백질 (예를 들면, 사람, 마우스 또는 래트 ASC)의 PYRIN-PAAD-DAPIN 도메인 (PYD) 또는 이의 부분 또는 단편에 결합한다. 이러한 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 사람, 마우스 또는 래트 ASC의 PYD 도메인 또는 이의 단편과 적어도 65% (예를 들면, 65, 70, 75, 80, 85%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 항체는 포유동물 ASC 단백질 (예를 들면, 사람, 마우스 또는 래트 ASC)의 C-말단 카스파제-동원 도메인 (CARD) 또는 이의 부분 또는 단편에 결합한다. 이러한 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 사람, 마우스 또는 래트 ASC의 CARD 도메인 또는 이의 단편과 적어도 65% (예를 들면, 65, 70, 75, 80, 85%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다. 또한 또다른 실시형태에서, 항체는 PYD 및 CARD 도메인 사이에 위치한 포유동물 ASC 단백질 서열 (예를 들면, 사람, 마우스 또는 래트 ASC)의 부분 또는 이의 단편에 결합한다. 또다른 실시형태에서, 포유동물의 폐에서 염증을 치료 및/또는 감소시키기 위한 조성물은 래트 ASC의 영역, 예를 들면, 아미노산 서열 ALRQTQPYLVTDLEQS (서열번호 1) (즉, 래트 ASC의 잔기 178-193, 등록 번호 BAC43754)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 래트 ASC의 아미노산 서열 ALRQTQPYLVTDLEQS (서열번호 1)과 적어도 65% (예를 들면, 65, 70, 75, 80, 85%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다. 또다른 실시형태에서, 포유동물의 CNS에서 염증을 치료 및/또는 감소시키기 위한 조성물은 사람 ASC의 영역, 예를 들면, 아미노산 서열 RESQSYLVEDLERS (서열번호 2)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 본원에 기재된 ASC 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 단편는 폐 세포, 예를 들면, 포유동물의 II형 폐포 세포에서 ASC 활성을 억제한다.
또다른 실시형태에서, 포유동물의 폐에서 염증을 감소시키기 위한 조성물은 NLRP1 (예를 들면, 항-NLRP1 닭 항체) 또는 이의 도메인에 특이적으로 결합하는 본원에 제공된 항체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 임의의 적합한 항-NLRP1 항체를 사용할 수 있고, 수개가 시판된다. 본원의 방법에서 사용하기 위한 항-NLRP1 항체의 예는 US8685400에서 발견된 것들일 수 있고, 이의 내용 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 시판되는 항-NLRP1 항체의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 사람 NLRP1 폴리클로날 항체 AF6788 (제조원: R&D Systems), EMD Millipore 토끼 폴리클로날 항-NLRP1 ABF22, Novus Biologicals 토끼 폴리클로날 항-NLRP1 NB100-56148, Sigma-Aldrich 마우스 폴리클로날 항-NLRP1 SAB1407151, Abcam 토끼 폴리클로날 항-NLRP1 ab3683, Biorbyt 토끼 폴리클로날 항-NLRP1 orb325922 mybiosource 토끼 폴리클로날 항-NLRP1 MBS7001225, R&D systems 양 폴리클로날 AF6788, Aviva Systems 마우스 모노클로날 항-NLRP1 oaed00344, Aviva Systems 토끼 폴리클로날 항-NLRP1 ARO54478_P050, Origene 토끼 폴리클로날 항-NLRP1 APO7775PU-N, Antibodies online 토끼 폴리클로날 항-NLRP1 ABIN768983, Prosci 토끼 폴리클로날 항-NLRP1 3037, Proteintech 토끼 폴리클로날 항-NLRP1 12256-1-AP, Enzo 마우스 모노클로날 항-NLRP1 ALX-804-803-C100, Invitrogen 마우스 모노클로날 항-NLRP1 MA1-25842, GeneTex 마우스 모노클로날 항-NLRP1 GTX16091, Rockland 토끼 폴리클로날 항-NLRP1 200-401-CX5, 또는 Cell Signaling Technology 토끼 폴리클로날 항-NLRP1 4990을 포함한다. 사람 NLRP1 단백질은 등록 번호 AAH51787, NP_001028225, NP_055737, NP_127497, NP_127499, 또는 NP_127500일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항체는 포유동물 NLRP1 단백질 (예를 들면, 사람 NLRP1)의 피린, NACHT, LRR1-6, FIIND 또는 CARD 도메인 또는 이의 부분 또는 단편에 결합한다. 이러한 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 사람 NLRP1의 특정 도메인 (예를 들면, 피린, NACHT, LRR1-6, FIIND 또는 CARD) 또는 이의 단편과 적어도 65% (예를 들면, 65, 70, 75, 80, 85%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 맞춤-설계되고 Ayes Laboratories에 의해 생산된 닭 항-NLRP1 폴리클로날은 폐 염증을 감소시키기 위해 사용된다. 이러한 항체는 사람 NLRP1에서 다음 아미노산 서열에 대하여 지시될 수 있다: CEYYTEIREREREKSEKGR (서열번호 3). 하나의 실시형태에서, 본원에 기재된 NLRP1 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 폐 세포, 예를 들면, 포유동물의 II형 폐포 세포에서 NLRP1 활성을 억제한다.
또한 또다른 실시형태에서, 포유동물의 폐에서 염증을 감소시키기 위한 조성물은 AIM2 또는 이의 도메인에 특이적으로 결합하는 본원에 제공된 항체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 임의의 적합한 항-AIM2 항체를 사용할 수 있고, 수개가 시판된다. 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 시판되는 항-AIM2 항체의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 토끼 폴리클로날 항-AIM2 카탈로그 번호 20590-1-AP (제조원: Proteintech), Abcam 항-AIMS 항체 (ab119791), 토끼 폴리클로날 항-AIM2 (N-말단 영역) 카탈로그 번호 AP3851 (제조원: ECM biosciences), 토끼 폴리클로날 항-ASC 카탈로그 번호 E-AB-30449 (제조원: Elabsciences), 카탈로그 번호 sc-293174를 갖는 AIM2 항체 (3C4G11)로 불리는 항-AIM2 마우스 모노클로날 항체 (제조원: Santa Cruz Biotechnology), 카탈로그 번호 TA324972를 갖는 마우스 모노클로날 AIM2 항체 (제조원: Origene), AIM2 모노클로날 항체 (10M2B3) (제조원: Thermofisher Scientific), AIM2 토끼 폴리클로날 항체 ABIN928372 또는 ABIN760766 (제조원: Antibodies-online), 카탈로그 번호 CAE02153을 갖는 Biomatix 코팅 항-AIM2 폴리클로날 항체, 항-AIM2 폴리클로날 항체 (OABF01632) (제조원: Aviva Systems Biology), 토끼 폴리클로날 항-AIM2 항체 LS-C354127 (제조원: LSBio-C354127), 카탈로그 번호 MA5-16259를 갖는 토끼 모노클로날 항-AIM2 항체 (제조원: Cell Signaling Technology), 토끼 폴리클로날 항-AIM2 모노클로날 항체 (제조원: Fab Gennix International Incorporated), 카탈로그 번호 AIM2 201AP, MyBiosource 토끼 폴리클로날 항-AIM2 카탈로그 번호 MBS855320, Signalway 토끼 폴리클로날 항 AIM2 카탈로그 번호 36253, Novus Biological 토끼 폴리클로날 항-AIM2 카탈로그 번호 43900002, GeneTex 토끼 폴리클로날 항-AIM2 GTX54910, Prosci, 토끼 폴리클로날 항-AIM2 26-540, Biorbyt 마우스 모노클로날 항-AIM2 orb333902, Abcam 토끼 폴리클로날 항-AIM2 ab93015), Abcam 토끼 폴리클로날 항-AIM2 ab76423, Signma Aldrich 마우스 폴리클로날 항-AIM2 SAB1406827, 또는 Biolegend 항-AIM2 3B10을 포함한다. 사람 AIM2 단백질은 등록 번호 NX_014862, NP004824, XP016858337, XP005245673, AAB81613, BAF84731 또는 AAH10940일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항체는 포유동물 AIM2 단백질 (예를 들면, 사람 AIM2)의 피린 또는 HIN-200 도메인 또는 이의 부분 또는 단편에 결합한다. 이러한 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 사람 AIM2의 특정 도메인 (예를 들면, 피린 또는 HIN-200) 또는 이의 단편과 적어도 65% (예를 들면, 65, 70, 75, 80, 85%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 본원에 기재된 AIM2 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 폐 세포, 예를 들면, 포유동물의 II형 폐포 세포에서 AIM2 활성을 억제한다.
본원에 기재된 항-인플라마솜 (예를 들면, 항-ASC, 항-NLRP1 또는 항-AIM2) 항체는 면역글로불린 가변 영역의 적어도 하나의 항원 결합 영역을 갖는 폴리클로날 및 모노클로날 설치류 항체, 폴리클로날 및 모노클로날 사람 항체, 또는 이의 임의의 부분을 포함하고, 상기 항체는 포유동물 인플라마솜 (예를 들면, AIM2 인플라마솜), 예를 들면, ASC 또는 AIM2의 성분에 특이적으로 결합한다. 일부 경우, 항체는 ASC에 대해 특이적이어서 항체는 폴리펩티드의 에피토프에 대해 생산되는 경우 ASC에 대해 특이적이고, 천연 또는 재조합 단백질의 적어도 일부에 결합한다.
경쟁적 억제에 의해 모노클로날 항체 특이성 및 친화력을 결정하는 방법은 문헌에서 발견될 수 있고[참조: Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), and Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601, 1983], 이의 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명의 항-인플라마솜 (예를 들면, 항-ASC 및 항-AIM2) 항체는 일상적으로 이에 제한되는 것을 아니지만 적합한 동물의 폴리펩티드 또는 항원 단편을 사용한 접종, 림프구 집단의 시험관내 자극, 합성 방법, 하이브리도마, 및/또는 이러한 항-ASC 또는 항-NLR1 항체를 암호화하는 재조합 세포 발현 핵산과 같은 방법에 따라 만들어질 수 있다. 정제된 재조합 ASC 또는 이의 펩티드 단편, 예를 들면, 래트 ASC (예를 들면, 등록 번호 BAC43754)의 잔기 178-193 (서열번호 1) 또는 사람 ASC의 서열번호 2를 사용한 동물의 면역화는, 항-ASC 항체의 제조 방법의 예이다. 유사하게는, 정제된 재조합 NLRP1 또는 이의 펩티드 단편, 예를 들면, 래트 NALP1의 잔기 MEE SQS KEE SNT EG-cys (서열번호 4) 또는 사람 NALP1의 서열번호 3를 사용한 동물의 면역화는, 항-NLRP1 항체의 제조 방법의 예이다.
ASC 또는 NLRP1을 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 수득할 수 있다. 예를 들면 문헌을 참조하고[참조: Kohler and Milstein, Nature 256:495-497, 1975; U.S. Pat. No. 4,376,110; Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); Harlow and Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)], 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, GILD 및 임의의 이의 하위분류를 포함하는 임의의 면역글로불린 분류일 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 시험관내, 동일계내(in situ) 또는 생체내 배양될 수 있다.
조성물의 투여
본 발명의 조성물은 포유동물 (예를 들면, 설치류, 사람)에게 임의의 적합한 제형으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 항-ASC 항체는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제, 예를 들면, 생리식염수 또는 완충된 염 용액 중에서 제형화될 수 있다. 적합한 담체 및 희석제는 투여의 방식 및 경로 및 표준 약제 실행을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체 및 희석제, 뿐만 아니라 약제학적 제형의 기술은, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences] 및 당해 기술 분야의 표준 텍스트, 및 USP/NF에서 발견할 수 있다. 조성물을 안정화시키고/시키거나 보존하기 위한 다른 물질이 조성물에 첨가될 수 있다.
본 발명의 조성물은 포유동물에게 임의의 통상적 기술로 투여될 수 있다. 전형적으로, 이러한 투여는 흡입에 의해 또는 비경구 (예를 들면, 정맥내, 피하, 종양내, 근육내, 복강내, 또는 척수강내 도입)일 수 있다. 조성물은 또한 표적 부위로, 예를 들면, 수술 전달에 의해 내부 또는 외부 표적 부위에, 또는 카테터에 의해 혈관에 의해 접근가능한 부위로 직접적으로 투여될 수 있다. 조성물은 단일 볼루스(bolus), 다중 주사로, 또는 연속 주입 (예를 들면, 정맥내, 복막 투석, 펌프 주입)에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 조성물은 바람직하게는 멸균-발열원-비함유 형태로 제형화된다.
효과적인 용량
상기한 조성물은 바람직하게는 포유동물 (예를 들면, 래트, 사람)에게 유효량, 즉, 처리된 포유동물에서 목적하는 결과를 생산할 수 있는 (예를 들면, CNS 또는 뇌졸중에 대한 외상성 손상을 겪었거나 자가면역 또는 CNS 질환을 갖는 포유동물의 CNS에서 염증을 감소시킬 수 있는) 양으로 투여한다. 이러한 치료학적 유효량은 하기에 기재된 바와 같이 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 조성물의 독성 및 치료학적 효능은 LD50 (집단의 50%에 치명적인 용량)을 결정하기 위해 배양 또는 실험 동물의 세포 중 어느 것을 사용하는 표준 약제학 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 용량 비는 치료학적 지수이고, 비 LD50/ED50로서 표현될 수 있다. 큰 치료학적 지수를 나타내는 이들 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 것들이 사용될 수 있지만, 이러한 부작용의 잠재적 손상을 최소화하는 전달 시스템을 설계하는데 주의를 기울여야 한다. 바람직한 조성물의 용량(dosage)은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 없는 ED50을 포함하는 범위 내에 있다. 이들 용량은 사용되는 용량 형태(dosage form) 및 사용되는 투여 경로에 좌우되어 이러한 범위 내에서 가변적일 수 있다.
의학 및 수의학 기술에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 대상자에 대한 용량은 대상자의 사이즈, 체표면적, 연령, 투여될 특정 조성물, 투여 시간 및 경로, 일반적 건강, 및 동시 투여되는 다른 약물을 포함하는 다수의 인자에 좌우된다.
실시예
본 발명은 추가로 하기 구체적인 실시예에 의해 예시된다. 실시예는 예시를 위해 제공되고, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: TBI 후 ALI에서 EV 매개된 인플라마솜 신호전달의 역할 및 이의 중화의 효과
폐 기능장애는 종종 중증 외상성 뇌 손상의 합병증으로서 나타난다 (1). TBI 대상자의 대략적으로 20 내지 25 퍼센트는 급성 폐 손상 (ALI)을 발병하지만 (2), TBI-유도된 ALI의 병리를 매개하는 기전은 여전히 잘 정의되지 있지 않다. 선행 문헌은 TBI 후 폐 기능장애가 심폐 기능장애를 야기하는 증가된 두개내압에 대한 교감신경 반응 때문이라는 생각이 뒷받침하였다 (42). 보다 최근 연구는, 그러나, 전신 염증성 반응이 또한 TBI-유도된 폐 손상에 주요한 역할을 한다고 나타내었다 (43). 특히, HMGB1-RAGE 리간드 수용체 경로는 TBI 후 폐 기능장애에 대한 중심 전달 기전(central transduction mechanism)으로 작용한다 (8). 추가로, HMGB1은 AIM2 인플라마솜 활성화를 유도한다 (37). 또한 선행 문헌은 병원체가 DAMPs, 예를 들면, HMGB1을 운반하는 EV를 분비하고, 염증을 촉발한다고 나타내었다 (참조: Buzas et al., 2014). 다양한 연구는 혈액 뇌 장벽 (BBB)이 TBI 후 빠르면 3 내지 6 시간에 뇌와 혈관내 구획 간의 보호 장벽에 손상을 초래하는 손상 후 투과할 수 있고, 단백질 및 유체의 누출을 야기함을 나타내었다 (44). 손상 후 BBB의 붕괴는 염증 매개체, 예를 들면, DAMPs의 분비를 초래하고, 이는 추가로 뇌 염증 및 원위 기관 손상을 일으킬 수 있다 (5). 수개의 염증 매개체는 뇌 손상에 대한 명확한 마커로서 작용할 수 있고, 그러나 이들의 타당성은 널리 받아 들여지지 않는다 (45). 또한, 현재 TBI-유도된 ALI에 대한 임상적으로 승인된 치료제 또는 바이오마커가 없다. 최근에, EV는 폐 손상 (46) 및 TBI (47)를 포함하는 수개 상이한 유형의 질환에 대한 바이오마커 조사에서 관심 대상의 영역이 되었다. 이전에 TBI를 갖는 환자의 뇌척수액으로부터 단리된 EV에서, 대조군 샘플과 비교하여 인플라마솜 단백질의 증가가 존재함을 나타내었다 (14). 이러한 실시예에서, TBI-유도된 ALI의 병인에서 EV 매개된 인플라마솜 신호전달의 기여가 조사되었다.
물질 및 방법
동물 및 외상성 뇌 손상
모든 동물 절차는 마이애미 밀러 대학 의학부의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Miami Miller School of Medicine) (Animal Welfare Assurance A3224-01)에 의해 승인되었고, 실험실 동물의 관리 및 사용(Care and Use of Laboratory Animals)에 대한 NIH 가이드에 따라서 수행되었다. 이 연구의 수행시 ARRIVE 가이드라인을 따랐다. 모든 C57/BL6 마우스는 8 내지 12 주령 및 24 내지 32 그램이었다. 마우스는 TBI에 대한 실험 그룹 (샴(sham), 4h, 24), 입양전달 및 처리에 대한 실험 그룹 (나이브(naive), 샴-염수, 비처리, 에녹사파린, 항-ASC)으로 예측 무작위배정하였다. TBI 실험-그룹에 대해, 샴 동물은 수술 절차를 겪지만, 손상되지 않았다. 입양전달 처리 연구를 위해, 샴-염수 그룹은 수술 절차를 겪고, 비히클 처리로서 염수를 받았다. 나이브 동물은 수술 절차를 겪지 않았다. 5 내지 6의 샘플 크기를 각 그룹에 대해 배율(power) 분석 (G* 배율 분석을 사용함, 효과 크기 F=0.85, α 설정 0.05) 및 이력 데이터를 기초로 하여 사용하였다 49, 50. 모든 마우스를 마이애미 대학(University of Miami)의 로이스 포프 라이프 센터(Lois Pope Life Center)에 바이러스 항원 부재 (viral antigen free; VAF) 동물 시설에 12-시간 빛/암흑 주기로 수용하고, 식품 및 물을 자유롭게(ad libitum) 공급하였다. 시설을 주2회 축산(husbandry) 절차를 수행하고, 동물의 상태를 매일 체크한다. 동물을 수술-후 관찰하고, 여기서, 이들을 가열 패드에 유지시키고, 체온을 직장 프로브로 제어하고, 수술실에서 37℃로 유지하고, 이어서, 동물 숙소로 옮겼다.
수술 전 동물을 케타민 및 자일라진 (복강내, i.p.)으로 마취하였다. 이어서, 마취된 동물을 37℃의 체온을 보장하기 위해 가열 패드 위에 위치시켰다. TBI를 제어된 피질 충격 (Controlled Cortical Impact; CCI) 모델을 사용하여 수행하였다. 5 mm 개두술를 오른쪽 피질에 수행하였다 (정수리점으로부터 -2.5 mm 후방, 2.0 mm 옆쪽). 손상을 3 mm 임파운더(impounder)를 갖는 ECCI-6.3 장치 (Custom Design & Fabrication, Richmond, VA, USA)를 6 m/s 속도, 0.8 mm 깊이, 및 150 ms 충격 지속기간으로 사용하여 유도하였다 (15). 이들 절차 후 동물을 이들의 우리로 돌려보내고, 식품과 물을 제공하였다. 동물을 TBI 후 4 시간 및 24 시간에 기재된 바와 같이 희생시켰다. 샴 동물을 마취하고, 손상된 동물과 동일한 수술-전 절개를 수행하였지만, 개두술 또는 타박상을 겪지 않았다.
조직 수집
모든 동물을 관류 전에 케타민 및 자일라진으로 마취하였다. 동물은 기관 관류를 겪었다. 폐를 기관 카테터를 사용하여 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 20 cm H2O에서 인퓨징하고, 이어서, 4% PFA에 밤새 4℃에서 고정하였다. 고정된 폐 조직을 파라핀 포매하고, 5 ㎛ 섹션을 프로세싱하였다 (16). 오른쪽 폐 조직을 단백질 단리 및 분자 분석을 위해 수집하였다. 이어서, 동물을 참수하고, 오른쪽 피질 조직을 단백질 단리 및 분자 분석을 위해 수집하였다.
파이롭토솜 단리 검정
마우스 폐 조직 용해물을 5 μm 저-결합 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막 (Millipore)을 통해 여과하였다. 여과 후, 상청액을 2,700 xg에서 8 분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 40 μl의 3[(3-콜아미도프로필) 디메틸암모니오]-프로판설폰산 (CHAPS) 완충액 (20mmol/L HEPES-KOH, pH 7.5, 5mmol/L MgCl2, 0.5mmol/L EGTA, 0.1mmol/L 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 프로테아제 억제제 칼테일, 및 0.1% CHAPS)에서 재현탁시켰다. 파이롭토솜을 2,700 xg에서 8 분 동안 원심분리하여 펠릿화하였다. 이어서, 펠릿을 재현탁시키고, 2.2 μl의 디석신이미딜 기질을 갖는 27.8 μl의 CHAPS 완충액에서 (9) 30 분 동안 실온에서 인큐베이팅하여 ASC 이량체를 가교결합하였다. 마지막으로, 동량의 2x 라엠리(Laemmli) 완충액을 첨가하고, 단백질을 ASC 및 가스데르민 D (GSD)에 대한 시판되는 항체를 사용하여 면역블롯팅으로 분석하였다.
핵 및 세포질 추출
핵 및 세포질 분획을 제조자의 지시에 따라서 NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약(NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents) (Thermo Scientific)을 사용하여 추출하였다. 간단하게, 마우스 폐 조직 샘플을 20 내지 100 mg 조각으로 절단하고, 500 x g에서 5 분 동안 원심분리하였다. 조직 조각을 세포질 추출 시약(Cytoplasmic Extraction Reagent)으로 균질화하고, 16,000 x g에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상청액 (세포 추출물)을 제거하고, 펠릿을 핵 추출 시약(Nuclear Extraction Reagent) (Thermo Scientific)으로 16,000 x g에서 10 분 동안 원심분리하였다. 이 상청액은 핵 분획과 상응하였고, 이를 제거하고, -800℃에서 보관하였다.
면역블롯팅
폐 및 뇌 조직 샘플을 액체 질소로 급속 냉동하고, -80℃에서 보관하였다. 오른쪽 하부 폐 및 오른쪽 피질 조직의 2-mm 섹션을 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 포함하는 추출 완충액 (Sigma, St Louis, MO, USA)으로 균질화하고, 4 내지 20% Tris-TGX 크리테리온 프리캐스트 겔(Criterion precasted gels) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 문헌[참조: de Rivero Vaccari et al. 2015 (13)]에 기재된 바와 같이 카스파제-1 (Novus Biologicals), ASC (Santa Cruz), IL-1 β (Cell Signaling), IL-18 (Abcam) AIM2 (Santa Cruz) 및 HMGB1 (Millipore)에 대한 항체를 사용하여 용해시켰다. 밴드 밀도의 정량화를 이미지 랩(Image Lab)을 사용하여 수행하고, 모든 데이터를 β-액틴으로 정규화하였다.
면역조직화학
조직 섹션을 자일렌에서 탈파라핀화하고, 이어서, 에탄올 및 트리스 완충 염수를 사용하여 재수화하였다. 이어서, 면역조직화학 절차를 이전에 기술된 이중 염색을 위해 수행하였다 (16). 섹션을 밤새 4℃에서 카스파제-1 및 ASC (Millipore), AIM2 (Santa Cruz), HMGB1 (Millipore) 및 SPC (Millipore)에 대한 항체로 인큐베이팅하였다. 샴 4 시간, 및 24 시간 마우스의 면역염색된 폐 섹션을 Zeiss 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (Zeiss, Inc., Thornwood, NY, USA)으로 조사하였다. 폐 섹션을 그룹으로 맹검된 개체로 분석하였다.
EV 단리
EV를 제조자(Invitrogen)의 지시에 따라서 전체 엑소좀 단리 용액을 사용하여 TBI-손상된 마우스 및 손상 마우스로부터의 혈청으로부터 단리하였다. 간단히, 각 샘플의 100 ㎕을 2000 x g에서 30 분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 20 ㎕의 전체 엑소좀 단리 (TEI) 시약으로 30 분 동안 4℃에서 인큐베이팅하고, 이어서, 10,000 x g에서 10 분 동안 실온에서 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 100 ㎕의 PBS에 재현탁시켰다. EV를 CD81의 발현 및 나노사이트 트랙킹(Nanosight Tracking) 분석으로 특성화하였다 (도 6).
EV의 입양전달
C57BL-6 TBI 및 샴 마우스로부터 혈청-유래 EV를 나이브 C57BL-6 마우스에 경정맥을 통해 1.0 x 1010 입자 그램 당/체중의 용량으로 주사하였다 48. 입자 계수를 나노사이트 트랙킹 분석에 의해 측정하고, 샘플을 이에 따라 희석하였다. 수술 전 동물을 케타민 및 자일렌으로 마취시켰다. 1-2 cm 절개를 턱과 쇄골 사이에 실시하였다. 경정맥을 올리고 묶고, 이어서, 카테터를 배치하였다. 혈청-유래 EV를 옮기고, 폐 및 뇌 조직을 분석을 위해 주사 후 24 시간에 수집하였다 (n=5).
에녹사파린 및 항-ASC 처리
TBI 마우스로부터 혈청-유래 EV를 나이브 C57-BL6 마우스에 경정맥 주사를 통해 주사하였다. 1시간 후, 에녹사파린 (3 mg/kg) (n=4) 및 항-ASC (5mg/kg) (n=4)를 수령자 동물에게 투여하였다. 하기 그룹을 사용하였다: 1) 나이브 그룹은 처리를 받지 않았고, 2) 샴 염수 그룹은 음성 대조군으로서 사용하고, 단지 염수의 경정맥 주사를 겪었고, 3) 치료되지 않은 그룹은 어떠한 처리 없이 TBI 마우스로부터 EV를 받았고, 양성 대조군으로 사용되었고, 4) ENOX 그룹은 TBI 마우스로부터 EV 및 에녹사파린을 받았고, 5) 항-ASC 그룹은 TBI 마우스로부터 EV 및 항-ASC를 받았다. 처리 순서를 무작위화하였다. 폐 및 뇌 조직을 분석을 위해 주사 후 24 시간에 수집하였다. 처리 실험에서 사용되는 항-ASC 항체가 ASC에 대한 사람화 모노클로날 항체였고, 뮤린, 사람 및 돼지 ASC를 인식함을 주의하여야 한다.
조직학 및 폐 손상 스코어링
폐 조직 섹션을 조직학, 형태학 및 ALI 스코어링을 위해 표준 헤마톡실린 및 에오신 방법으로 염색하였다. 폐 섹션을 미국 흉부 학회 워크샵 보고서(American Thoracic Society Workshop Report)로부터의 폐 손상 스코어링 시스템(Lung Injury Scoring System)을 사용하여 맹검 병리학자에 의해 스코어링하였다 (17). 20 무작위 높은 고배율 시야(high power fields)를 스코어링을 위해 선택하였다. ALI 스코어링을 위한 기준은 폐포 공간, 사이질 공간 중 호중구의 수, 유리질 막, 공기 공간을 충전하는 단백질 데브리스 및 폐포 중격 비대를 기초로 한다. 이들 기준을 기초로 하여 0 (손상 없음)과 1 (중증 손상) 사이의 스코어가 제공되었다.
통계적 분석
데이터를 2개 그룹에 대해 스튜던트 t-테스트 및 일원 ANOVA, 이어서 2개 이상의 그룹에 대해 터키 다중 비교 테스트, (GraphPad Prism version 7.0)를 사용하여 분석하였다. 다고스티노-피어슨(D'Agostino-Pearson) 테스트를 사용하여 정규화에 대해 테스트하였다. 데이터를 평균+/-SEM으로 표현한다. 사용되 유의한 P 값은 * p<0.05였다.
결과
중증 TBI는 마우스의 뇌에서 AIM2 인플라마솜 단백질 및 HMGB1 발현을 증가시킨다
과도한 수준의 염증유발성 사이토킨 IL-1β 및 IL-18, 및 인플라마솜 단백질은 유체-타진(fluid-percussion) 뇌 손상 후 이차적인 손상에 관련된다 (18). 염증유발성 사이토킨의 중증 CCI 유도된 프로세싱 및 인플라마솜 단백질, 피질 용해물 수준의 변경이 분석되는지 결정하기 위해, 그러나 중증 TBI에서 인플라마솜 활성화에 대한 제한된 연구가 있다. 이러한 실시예에서, 하기의 중증 CCI, 피질 용해물을 카스파제-1 (도 1a, b) (p<.001), ASC (도 1a, c) (p= .003), IL-18 (도 1a, d) (p=.0042), AIM2 (도 1a, f) (p=0.0197) 및 IL-1β (도 1a, g) (p=0.0141)의 수준에 대해 손상 후 4 및 24 hrs에 조사하였다. 카스파제-1, ASC, AIM2, 및 IL-1β의 수준은 CCI 후 4 시간에 피크였고, 24 hrs까지 감소하였다. 염증성 사이토킨 성숙에 대한 시간 과정은 약간 다르지만, TBI 후 24 시간에 피크였다. 다른 발명자들이 AIM2 인플라마솜을 활성화시키는 인플라마솜 DAMP HMGB1의 역할을 나타내었기 때문에, 이들 단백질의 수준을 또한 피질 용해물 중에서 측정하였다. 도 1a, 1e에 도시된 바와 같이, CCI는 손상 후 4 및 24 hrs에서 HMGB1의 수준 (도 1a, 1e) (p=0.0121)의 유의한 증가를 유도하였다. 이들 데이터는 중증 CCI 후 마우스에서, AIM2 인플라마솜 단백질의 수준이 손상 후 피질에서 유의하게 상승되었음을 나타내었다.
중증 TBI는 마우스의 폐에서 AIM2 인플라마솜 단백질 및 HMGB1 발현을 증가시킨다
CCI가 폐에서 인플라마솜 활성화를 유도하는지를 결정하기 위해, 폐 용해물의 면역블롯 분석을 카스파제-1 (도 1h, i) (p=.0026), ASC (도 1h, j) (p=.0427), IL-18 (도 1h, k) (p=.0025), IL-1β (도 1h, n) (p=.0012) 및 AIM2 (도 1h, m) (p<.001), 및 NLRP3 (p=.0047) (보충 도 1)에 대해 수행하였다. 증가된 수준의 카스파제-1, ASC, IL-18 및 AIM2는 샴 대조군과 비교하여 손상 후 4 hrs 및 24 hrs에 유의하게 증가되었다. 그러나 단백질 발현의 증가의 시간 과정은 뇌에서 관찰된 것과 약간 달랐고, 이는 CCI 후 24 hr에 피크였다. HMGB1-RAGE 축이 TBI이 폐 기능장애를 유도하는 기전에서 중요한 역할을 하기 때문에 (8), 폐 용해물을 HMGB1 단백질 발현의 수준에 대해 분석하였다. 도 1h, 1l (p=.0158)은 HMGB1 발현이 TBI 후 4 및 24 시간에 증가하였음을 도시하고, 이는 AIM2 인플라마솜 및 HMGB1이 TBI-후 폐에서 염증성 반응에서 역할을 한다는 것을 나타낸다.
TBI는 마우스의 폐에서 파이롭토시스를 유도한다
이전에 나타낸 바와 같이, 피질 뉴런에서 AIM2 인플라마솜의 활성화는 파이로프토틱(pyroptotic) 세포 사멸을 야기한다 (19). TBI가 마우스 폐 조직에서 파이롭토시스를 초래하는지 조사하기 위해, 폐 조직에서 파이롭토솜을 TBI 후 단리하였다. 4 시간 손상-후 희생된 TBI 동물을, 샴 동물과 비교하여 ASC 올리고머화의 증거를 나타내었다 (도 4a). ASC 이량체, 및 삼량체는 TBI 동물에서 나타났다 (각각 50, 75 kDA). 이들 결과는 파이롭토솜 형성을 나타내고, 이는 ASC 올리고머의 초분자 어셈블리를 특징으로 할 수 있다. 추가로, 카스파제-1의 활성화시 절단되고, 파이롭토시스 및 IL-1β의 방출을 촉발하는 (20) 가스데르민 D (GSDMD)은, 샴과 비교하여, TBI 동물의 폐에서 유의하게 증가시켰다 (도 4b 및 4c) (p=0.0001). 이들 발견은 파이롭토시스가 TBI 후 폐 조직에서 세포 사멸에 기여함을 지시하였다.
TBI는 II형 폐포 상피 세포에서 인플라마솜 단백질의 면역반응성을 증가시킨다
TBI는 모세혈관 누출을 야기할 수 있어서, II형 폐포세포로 칭명되는 특정 폐포 상피 세포에 증가된 혈관 투과성 및 손상을 초래한다 (5). 손상 후 폐에서 인플라마솜 발현에 미치는 TBI의 세포 효과를 조사하기 위해, 면역조직화학 분석을 샴의 폐 섹션에서 4 시간, 및 24 시간 손상된 동물에서 수행할 수 있다. II형 폐포 상피 세포는 ALI에서 손상된 폐 세포의 주요 유형인 것으로 공지되어 있다 (17). 폐 섹션을 AIM2, 카스파제-1, 및 ASC (녹색)에 대한 항체로 염색하고, 프로-계면활성제 단백질 C (Pro-SPC, 적색), II형 상피 세포의 마커, 및 DAPI 핵 염색 (청색)으로 공동-염색하였다. 도 2a 내지 2c에 도시된 바와 같이, 활성 카스파제-1 (도 2a), ASC (도 2b), 뿐만 아니라 AIM2 (도 2c)는 SPC-양성 세포에서 나타난다(화살표). 이들 인플라마솜 단백질의 면역반응성은 TBI 후 증가하였다. 이들 발견은 인플라마솜 단백질이 II형 폐포 상피 세포에서 발현되고, TBI가 이들 세포에서 증가된 면역반응성을 초래한다는 것을 지시한다.
TBI는 핵 및 세포질 HMGB1 발현을 증가시킨다
TBI 후 폐 세포에서 HMGB1의 세포 분포를 측정하기 위해, 폐 균질액으로부터 핵 및 세포질 단편을 단리하였다 (도 3a, 3c) (p=.0337). 면역블롯팅은 둘 다의 단편이 TBI-후 4 hrs에 HMGB1 발현의 유의한 증가를 갖는다는 것을 나타내었다 (도 3b, 3d) (p=.0345). HMGB1의 면역조직화학 분석을 또한 TBI 후 폐 섹션에서 면역반응성의 변화를 결정하기 위해 수행하였다. 섹션을 HMGB1 (녹색) 및 SPC (적색) 및 DAPI 핵 염색 (청색)에 대해 공동-염색하였다. HMGB1의 면역반응성은 샴과 비교하는 경우 4 hrs 및 24 hrs에 증가하였다. HMGB1의 약한 면역반응성은 SPC-양성 세포 (화살표)에서 관찰되었고 (도 3e); 따라서, 이는 손상된 폐 조직의 HMGB1 변화가 세포질에 존재할 수 있음을 뒷받침한다.
TBI는 폐 형태의 변화를 유도하고 ALI를 유도한다
ALI는 염증성 프로세스를 특징으로 할 수 있고, 이는 폐포 및 사이질 부종 뿐만 아니라 염증성 세포의 폐포 공간 내로 침윤을 야기한다 (23). 폐 조직의 조직병리학적 분석 (도 5a)은 중증 TBI가 손상 후 4 및 24 시간에 폐 구조 및 형태의 실질적 변화를 야기한다는 것을 나타낸다. 샴 동물은 정상 폐포 형태학을 나타내는 반면, 손상된 동물은 폐포 부종의 급성 변화를 나타내었지만, 손상 후 24 시간까지 약간 감소하였다 (긴 화살표). 추가로, 둘 다의 시점에서 호중구 침윤 (화살표 머리) 및 폐포 모세혈관 막의 형태 변화 (*)의 증거가 있었다. 손상된 동물은 사이질 부종의 징후를 나타내었고, 이는 손상-후 4 시간에 더 명백하였지만, 손상 후 24 시간에도 여전히 분명하였다 (짧은 화살표). 마지막으로, 손상된 동물은 또한 사이질 영역 및 폐포 중격의 비대의 증거를 나타내었다 (파운드, #).
중증 손상이 ALI를 유도함을 확인하기 위해, 조직학적 섹션을 미국 흉부 학회(American Thoracic Society)에 의해 한정되는 ALI 스코어링 시스템을 사용하여 분석하였다 (17). 이러한 시스템은 폐포 및 사이질 공간으로 호중구 침윤, 유리질 막 형성, 공기 공간을 채우는 단백질 데브리스, 및 폐포 중격 비대의 증거를 기반으로 한다 (17). 이들 특성은 손상된 동물에서 유의하게 상승하고, ALI 스코어는 샴과 비교하여 TBI 동물에서 전반적으로 더 높았다 (도 5b) (p=0.0017).
에녹사파린 및 항-ASC 항체 처리는 TBI 마우스로부터 EV의 입양전달 후 인플라마솜 발현 및 ALI를 유의하게 감소시킨다
EV 및 TBI 후 순환으로 방출될 수 있는 이의 적하는 폐에서에서 인플라마솜 활성화를 유도할 수 있다는 증거를 제공하기 위해, 전형적인 입양전달 실험을 중증 CCI 마우스로부터의 혈청-유래 EV를 사용하여 수행하였다. EV 제조를 EV 마커 CD81을 위해 웨스턴 블롯을 사용하여 검증하였다 (도 6). 대조군은 샴 또는 나이브 동물로부터 단리된 EV를 받았다. 도 7a 내지 7f에 도시된 바와 같이, 활성 카스파제-1 (도 7a, 7b), ASC (도 7a, 7c), IL-18 (도 7a, 7d), AIM2 (도 7a, 7e) 및 HMGB1 (도 7a, 7f)은, 비손상 또는 나이브 마우스 또는 나이브 마우스로부터 EV를 받은 동물의 폐와 비교하는 경우, TBI 손상된 동물로부터 EV를 받은 동물의 폐에서 유의하게 상승하였다. 또한, 염증성 세포의 침윤 (화살표)은 TBI 마우스로부터 EV로 처리된 폐에서 명백하였다 (도 7g). 마지막으로, ALI 스코어는 또한 손상된 마우스로부터의 EV를 받은 동물에서 유의하게 더 높았다 (도 7h). 이들 연구는 TBI 후 순환으로 방출되는 EV가 폐 표적 세포에서 인플라마솜을 활성화하고 ALI의 발병기전에 기여한다는 신경-호흡-인플라마솜 축(neural-respiratory-inflammasome axis)에 대한 증거를 제공하였다.
다음에, 엑소좀 흡수 차단을, 손상된 마우스에서 나이브 마우스까지 EV의 입양전달 후, ASC에 대한 에녹사파린 또는 모노클로날 항체 중 어느 하나로 처리하여 시도하였다. 음성 대조군 동물은 염수를 받았고, 양성 대조군 동물은 처리를 받지 않았다. 도 8a 내지 8f에 도시된 바와 같이, 카스파제-1 (도 8a, 8b), ASC (도 8a, 8c), IL-1β (도 8a, 8d), AIM2 (도 8a, 8e), 및 HMGB1 (도 8a, 8f)은 에녹사파린 또는 사람화 모노클로날 항-ASC 항체 (예를 들면, IC 100 항체)로 처리된 후 처리되지 않은 (양성 대조군) 그룹과 비교하여 유의하게 감소하였다 (p=<.0001). 추가로, H&E 염색된 폐 섹션은 폐포 및 사이질 공간 내로 유의하게 더 적은 호중구 침윤을 나타내었고, 뿐만 아니라 중격 비대 징후가 없었다 (도 9a 내지 d). 에녹사파린 및 항-ASC 항체 (IC 100)로 처리된 동물에 대한 ALI 스코어는 처리되지 않은 그룹과 비교하여 유의하게 더 낮았다 (도 9e) (p=<.0001). 따라서, TBI 후 순환으로 방출된 EV는 폐 세포에서 인플라마솜 활성화에서 역할을 하고 ALI을 야기한다.
결론
TBI는 특정 의학적 합병증, 특히 폐 및 중추신경계 기능장애의 더 높은 비율과 관련될 수 있다. 이러한 실시예에서, 중증 TBI는 피질 및 폐 조직에서 HMGB1 및 인플라마솜 발현 (예를 들면, AIM2, 카스파제-1 및 ASC 발현)을 증가시키고, ALI (예를 들면, 폐포 및 사이질 공간 내로 호중구의 침윤, 폐포 중격 비대, 및 폐포 부종 및 출혈)와 일치하는 폐 형태학의 변화를 유도함을 나타내었고, 이는 신경 호흡 염증 축(Neural Respiratory Inflammatory Axis)의 발상을 도입한다. 중요하게는, TBI는 폐 조직에서 파이롭토시스를 초래하고(예를 들면, GSDMD 절단의 존재), II형 폐포 상피 세포에서 인플라마솜 단백질의 발현을 증가시켰다. 추가로, TBI 마우스로부터 EV의 입양전달이 인플라마솜을 활성화시키고, ALI을 유도하였는데, 이는 뇌 손상이 인플라마솜 단백질의 적하를 포함하는 EV의 방출을 유도하고, 이어서, 운반되어 ALI을 초래함을 나타낸다. 추가로, EV 흡수 (에녹사파린) 및 인플라마솜 활성화 (항-ASC 항체 (IC 100) 처리) 둘 다를 억제하여, 인플라마솜 단백질 발현 및 ALI의 발병을 감소됨을 나타내었다.
요약하면, 이러한 실시예는 AIM2 인플라마솜 신호전달이 TBI 후 폐 손상의 병태생리에서 중요한 역할을 하고, EV-매개된 인플라마솜 신호전달에 연루된 TBI-유도된 ALI의 기전을 입증함을 나타내었다. 이들 데이터는 EV-매개된 인플라마솜 신호전달이 신경원성-호흡-염증성 축에 연루되어 중요한 역할을 할 수 있다는 증거를 제공하였다. 따라서, 인플라마솜 단백질 또는 EV 흡수를 차단하는 약물에 대하여 이러한 축을 항체를 사용하여 표적화하는 것은 중요한 치료 의약의 모든 영역에서 신경외상-유도된 ALI에서 치료학적 접근을 제공할 수 있다. 이들 결과를 고려하여, 개시된 치료학적 전략은 일반적으로 폐의 염증성 질환의 치료에 유용할 수 있다.
참조문헌에 의한 포함
다음 참조문헌은 모든 목적을 위해 이의 전문이 참조로서 포함된다.
실시예 2: 사람 환자에서 TBI 후 ALI에서 EV 매개된 인플라마솜 신호전달의 역할
실시예 1에서 마우스에 대한 실험에 후속 조치로서, 사람 폐 내피 세포에서 인플라마솜 신호전달에 대한 사람 TBI 환자로부터 단리된 EV의 역할을 조사하였다.
첫번째 실험에서, 혈청-유래 EV를 TBI 및 대조군 환자로부터 전체 엑소좀 단리 키트(Total Exosome Isolation kit) (Thermofisher)를 사용하여 단리하였다. 폐 사람 미세혈관 내피 세포(Pulmonary Human Microvascular Endothelial Cells) (HMVEC-Lonza)를 배양하고 12-웰 플레이트에서 플레이팅하였다. 컨플루언시(confluency)에 도달한 후, TBI 및 대조군 환자로부터 단리된 EV를 세포에 4 시간의 인큐베이션 기간 동안 전달하였다 (1.94 x 108 입자/ml). 인큐베이션 후 세포를 200 ul의 용해 완충액으로 수확하고, 세포 용해물을 웨스턴 블롯 분석을 위해 사용하였다.
두번째 실험에서, 혈청-유래 EV를 TBI 및 대조군 환자로부터 전체 엑소좀 단리 키트 (Thermofisher)를 사용하여 단리하였다. 폐 사람 미세혈관 내피 세포 (HMVEC- Lonza)를 배양하고, 96-웰 플레이트에서 플레이팅하였다. 컨플루언시에 도달한 후, TBI 및 대조군 환자로부터 단리된 EV를 세포에 3 시간의 인큐베이션 기간 동안 (1.94 x 108 입자/ml) 전달하고, 이어서, 추가로 1 시간 동안 1:30 용적 대 용적비를 갖는 카스파제-1 FAM FLICA (Immunohistochemistry Technologies)로 전달하였다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 아폽토시스 세척 완충액 (Immunohistochemistry Technologies)으로 3회 세척하였다. 이어서, 세포를 핵 염색을 위해 훽스트(Hoechst) 및 세포 사멸을 위해 프로피듐 요오다이드로 공동-염색하였다. EVOS 현미경을 사용하여 영상을 촬영하고, 이어서, 세포를 492 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장에서 형광성 플레이트 판독기하에 판독하였다.
결과
도 10a 내지 10f에 도시된 바와 같이, TBI 환자로부터 혈청-유래 EV의 전달은 폐 내피 세포에서 인플라마솜 단백질 발현을 증가시켰다. 도 10a 내지 10e는 카스파제-1, ASC, AIM2, 및 HMGB1이 대조군-EV로 4 시간 동안 배양된 PMVEC와 비교하여 TBI-EV로 4 시간 동안 배양된 PMVEC에서 상승되었음을 나타내었다. 면역검정 결과는 Ella 간단 플렉스 검정을 사용하여 IL-1베타 발현의 유의한 증가를 나타내었다 (도 10f).
도 11a 내지 11c에 도시된 바와 같이, TBI-EV의 폐 내피 세포로의 전달은 카스파제-1의 면역반응성 및 세포 사멸을 증가시켰다.
결론
이들 연구는 ALI의 발병기전에 기여하는 폐 표적 세포에서 TBI이 인플라마솜을 활성화시킨 후에 EV는 순환에 방출되는 신경-호흡-인플라마솜 축에 대한 추가 증거를 제공하였다.
상기 기재된 다양한 실시형태는 추가 실시형태를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본 명세서에 언급된 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 간행물 전부는 이의 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 실시형태의 측면은, 또다른 추가 실시형태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공보의 개념을 사용할 필요가 있는 경우, 변형될 수 있다.
이러한 또는 다른 변화가 상기 상세한 설명을 고려하여 실시형태에서 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용되는 용어는 청구범위를 명세서에 개시된 구체적인 실시형태로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되고, 이러한 청구범위에 주어진 등가의 전체 범위에 따라 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
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<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
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<212> PRT
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<213> HOMO SAPIENS
<400> 3
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Lys Gly Arg
<210> 4
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<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
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Met Glu Glu Ser Gln Ser Lys Glu Glu Ser Asn Thr Glu Gly Cys
1 5 10 15
Claims (42)
- 인플라마솜(inflammasome) 신호전달을 억제하는 제제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하여 환자의 폐에서 염증을 치료함을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자의 폐에서 염증을 치료하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폐에서의 염증이 중추신경계 (central nervous system; CNS) 손상, 신경변성질환, 자가면역질환, 천식, 만성폐쇄폐질환, 낭성섬유증, 사이질성폐질환 및 급성호흡곤란증후군으로부터 선택된 상태에 의해 야기되는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 CNS 손상이 외상성 뇌 손상 (traumatic brain injury; TBI), 뇌졸중 및 척수 손상 (spinal cord injury; SCI)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 신경변성질환이 근위축측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 다발성 경화증 (multiple sclerosis; MS) 및 파킨슨병 (Parkinson's disease; PD)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 상기 환자의 폐 세포에서 인플라마솜 활성화의 억제를 초래하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여가, 처리되지 않은 환자인 대조군과 비교하여 상기 환자의 폐 세포에서, 카스파제-1, 뉴클레오티드-결합 류신-풍부 반복 피린 도메인 함유 단백질 1 (nucleotide-binding leucine-rich repeat pyrin domain containing protein 1; NLRP1), 뉴클레오티드-결합 류신-풍부 반복 피린 도메인 함유 단백질 2 (NLRP2), 뉴클레오티드-결합 류신-풍부 반복 피린 도메인 함유 단백질 3 (NLRP3), NLR 부류 CARD 도메인-함유 단백질 4 (NLR family CARD domain-containing protein 4; NLRC4), 카스파제-11, 아폽토시스 단백질의 X-연결 억제제 (X-linked inhibitor of apoptosis protein; XIAP), 파넥신-1, 카스파제 활성화 동원 도메인을 포함하는 아폽토시스-관련된 Spec-유사 단백질 (Apoptosis-associated Spec-like protein containing a Caspase Activating Recruitment Domain; ASC), 인터류킨-18 (interleukin-18; IL-18), 고이동성 그룹 박스 1 (high mobility group box 1; HMGB1) 또는 앱센트 인 멜라노마 2 (absent in melanoma 2; AIM2) 수준의 감소를 초래하는, 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 폐 세포가 II형 폐포 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여가, 처리되지 않은 환자인 대조군과 비교하여 급성 폐 손상 (acute lung injury; ALI)의 감소를 초래하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 ALI의 감소가 폐포 및/또는 사이질 공간 내로 호중구 침윤의 감소, 감소된 또는 부재의 폐포 중격 비대 또는 이의 조합에 의해 입증되는, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 한 항에 있어서, 상기 제제가 세포외 소포 (EV) 흡수 억제제, 인플라마솜 성분에 결합하는 항체 또는 이의 조합인, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 EV 흡수 억제제가 화합물 또는 항체이고, 상기 항체가 표 1로부터 선택되는, 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제제가 인플라마솜 성분에 결합하는 항체와 병용된 EV 흡수 억제제인, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 EV 흡수 억제제가 헤파린인, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 헤파린이 에녹사파린(Enoxaparin)인, 방법.
- 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인플라마솜 성분에 결합하는 항체가 포유동물 AIM2, NLRP1, NLRP2, NLRP3 또는 NLRC4 인플라마솜의 성분에특이적으로 결합하는 항체인, 방법.
- 제10항 또는 제15항에 있어서, 상기 인플라마솜 성분이 카스파제-1, ASC 또는 AIM2인, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 인플라마솜 성분이 ASC인, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 항체가 N-말단 PYRIN-PAAD-DAPIN 도메인 (PYD), C-말단 카스파제-동원 도메인 (C-terminal caspase-recruitment domain; CARD) 도메인 또는 상기 ASC 단백질의 PYD 또는 CARD 도메인으로부터 유래된 에피토프에 결합하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산에 결합하는, 방법.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 상기 환자의 폐에서 ASC 활성을 억제하는, 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 제형화되는, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 한 항에 있어서, 상기 조성물이 뇌실내, 복강내, 정맥내 또는 흡입에 의해 투여되는, 방법.
- 인플라마솜 신호전달을 억제하는 제제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하여 환자의 폐에서 염증을 치료함을 포함하는, 중추신경계 (CNS) 손상을 겪었던 환자의 폐에서 염증을 치료하는 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 CNS 손상이 외상성 뇌 손상 (TBI), 뇌졸중 및 척수 손상 (SCI)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 상기 환자의 폐 세포에서 인플라마솜 활성화의 억제를 초래하는, 방법.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 조성물의 투여가, 처리되지 않은 환자인 대조군과 비교하여 상기 환자의 폐 세포에서, 카스파제-1, NLRP1, NLRP2, NLRP3, NLRC4, 카스파제-11, XIAP, 파넥신-1, 카스파제 활성화 동원 도메인을 포함하는 아폽토시스-관련된 Spec-유사 단백질 (ASC), 인터류킨-18 (IL-18), 고이동성 그룹 박스 1 (HMGB1) 또는 앱센트 인 멜라노마 2 (AIM2) 수준의 감소를 초래하는, 방법.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 폐 세포가 II형 폐포 세포인, 방법.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 처리되지 않은 환자인 대조군과 비교하여 급성 폐 손상 (ALI)의 감소를 초래하는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 ALI의 감소가 폐포 및/또는 사이질 공간 내로 호중구 침윤의 감소, 감소된 또는 부재의 폐포 중격 비대 또는 이의 조합에 의해 입증되는, 방법.
- 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 세포외 소포 (EV) 흡수 억제제, 인플라마솜 성분에 결합하는 항체 또는 이의 조합인, 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 EV 흡수 억제제가 화합물 또는 항체이고, 상기 항체가 표 1로부터 선택되는, 방법.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 제제가 인플라마솜 성분에 결합하는 항체와 병용된 EV 흡수 억제제인, 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 EV 흡수 억제제가 헤파린인, 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 헤파린이 에녹사파린인, 방법.
- 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 인플라마솜 성분에 결합하는 상기 항체가 포유동물 AIM2, NLRP1, NLRP2, NLRP3 또는 NLRC4 인플라마솜의 성분에 특이적으로 결합하는 항체인, 방법.
- 제30항 또는 제35항에 있어서, 상기 인플라마솜 성분이 카스파제-1, ASC 또는 AIM2인, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 인플라마솜 성분이 ASC인, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 항체가 PYD, CARD 도메인 또는 상기 ASC 단백질의 PYD 또는 CARD 도메인으로부터 유래된 에피토프에 결합하는, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산에 결합하는, 방법.
- 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 상기 환자의 폐에서 ASC 활성을 억제하는, 방법.
- 제23항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 제형화되는, 방법.
- 제23항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 뇌실내, 복강내, 정맥내 또는 흡입에 의해 투여되는, 방법.
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