KR20200008802A - A kit for detecting renal cell damage, method for detecting renal tubular cell damage and method for screening a therapeutic agent for renal tubular cell damage - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a kit for diagnosing cell damage in the glomerulus or renal tubules, and methods for providing information for diagnosing the same and screening a therapeutic substance for the same. As changes in the levels of Sirt1, HIF-1, CA9, and Bnip3 proteins are found in cell damage in the glomerulus or renal tubules, cell damage in the glomerulus or renal tubules caused by hypoxia or drugs can be diagnosed through changes in Sirt1, HIF-1, CA9, and Bnip3 proteins, which may be utilized in the development of cell-based specific diagnostic kits, diagnosis methods, methods for predicting and diagnosing cell damage induced by a drug on the glomerulus or renal tubules, and methods for screening candidate substances.

Description

신장 세포 손상 진단용 키트, 이를 진단하는 방법 및 이를 억제하는 후보물질 스크리닝 방법{A kit for detecting renal cell damage, method for detecting renal tubular cell damage and method for screening a therapeutic agent for renal tubular cell damage}A kit for detecting renal cell damage, method for detecting renal tubular cell damage and method for screening a therapeutic agent for renal tubular cell damage}

본 발명은 신장의 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 진단하기 위한 키트, 및 이를 진단하기 위한 정보를 제공하고, 이를 억제하는 후보물질을 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이다.The present invention relates to kits for diagnosing glomerular or tubular cell damage in the kidney, and methods for screening candidates for providing information for diagnosing and inhibiting them.

최근 많은 종류의 질환을 조기에 진단할 수 있는 다양한 진단방법 및 치료기술이 개발되어왔다. 개발된 다수의 진단방법 중에는 진단과정과 약물에 의해 신장이 손상되는 해로운 증례들이 발생하고 있다.Recently, various diagnostic methods and treatment techniques for early diagnosis of many kinds of diseases have been developed. Among the many diagnostic methods developed, harmful cases in which kidney damage is caused by diagnostic procedures and drugs are occurring.

특히, 신장의 사구체 또는 세뇨관들은 허혈/재관류 손상과 같은 신장 손상에 대한 서로 다른 민감성을 나타낼 수 있고, 신장은 쉬지 않고 그 역할을 수행하고 있어 잠시라도 방해가 있거나 질환이 발생한 경우에는 매우 치명적인 결과를 초래할 수 있다. In particular, the glomeruli or tubules of the kidneys may exhibit different sensitivity to kidney damage, such as ischemia / reperfusion injury, and the kidneys play a role without rest, resulting in very fatal consequences in the event of disturbance or disease for a while. Can cause.

세뇨관의 이상은 유전성 질환으로 또는 신세뇨관을 침범하는 다른 질환이나 독성 물질에 의하여 발병하며, 임상적으로 전신성 산증이 항상 분명한 것은 아니며, 신수질 석회화(medullary nephrocal-cinosis), 반복적인 요로 결석, 성장 지연, 왜소증 및 골연화증의 임상 양상으로 발견되기도 한다. Tubular abnormalities are caused by hereditary diseases or by other diseases or toxic substances that invade the renal tubules, and clinical systemic acidosis is not always evident, including medullary nephrocal-cinosis, recurrent urinary stones, and growth. It is also found as a clinical feature of delayed, dwarf and osteomalacia.

상술한 신장 세뇨관 질환 중에서도 신장 세뇨관 세포(소변이 생성될 때 소변 속 체액과 무기질을 재흡수하는 세포)에 손상이 생겨 유발되는 급성 세뇨관 괴사는 신장으로 가는 혈류의 부족이나 신장을 손상시키는 약물 그리고 심한 전신 감염에 의해 발생되는 것으로 알려져 있다. 상기 저혈압의 원인으로는 손상 또는 대수술로 인한 혈액 손실, 심한 화상, 심한 전신 감염(패혈증) 및 췌장염이 있고, 신장을 손상시키는 약물로는 아미노글리코시드계 항생제(예, 겐타마이신, 토브라마이신), 암포테리신 B(중증의 전신 진균 감염을 치료하는 데 사용되는 약물), 콜리스티메탄(다른 질환으로 입원한 환자들에서 발생하는 감염 치료에 사용되는 항생제), 반코마이신(다른 항생제들에 내성을 보이고 2주 이상 동안 고용량으로 투여할 때 신장 손상을 야기할 수 있는 감염 치료에 사용되는 항생제), 비스테로이드성 항염증제(NSAID) 등이 밝혀진 바 있다. 또한 아미노글리코사이드는 나이든 사람, 대수술을 받은 사람, 또는 심한 간, 담낭 또는 담관 질환이 있는 이에게서 원인이 될 가능성이 더 높고, 드물지만 영상 촬영 중에 쓰는 조영제 노출로 인해 신장 손상이 유발될 수 있다.Among the renal tubular diseases described above, acute tubular necrosis, caused by damage to renal tubule cells (cells that reabsorb fluid and minerals in the urine when urine is produced), is caused by a lack of blood flow to the kidney, drugs that damage the kidney, and severe It is known to be caused by systemic infection. The causes of hypotension include blood loss due to injury or major surgery, severe burns, severe systemic infections (septicemia), and pancreatitis, and drugs that damage the kidney are aminoglycoside antibiotics (eg, gentamycin, tobramycin). , Amphotericin B (a drug used to treat severe systemic fungal infections), colistimethane (an antibiotic used to treat infections in patients hospitalized with other diseases), and vancomycin (resistant to other antibiotics) And antibiotics used to treat infections that can cause kidney damage when administered at high doses for more than two weeks, and nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) have been identified. Aminoglycosides are also more likely to be caused by older people, those who underwent major surgery, or those with severe liver, gallbladder, or bile duct disease, and, in rare cases, kidney damage can be caused by exposure to contrast agents used during imaging.

사구체 또는 세뇨관 손상으로 인한 질환의 경우, 임상 증상으로는 신장 손상이 심하지 않는 한 아무 증상이 나타나지 않아, 장기간 지속적으로 노출되거나 유지되어, 대부분 신기능 거의 상실된 신부전 상태까지 진전된 중증의 병에서 진단되는 경우가 많다.In the case of a disease caused by glomeruli or tubule damage, the clinical symptom does not appear as long as the kidney damage is not severe, and is diagnosed in a serious disease that has been exposed or maintained for a long period of time and most often progressed to a state of renal failure with almost no renal function. There are many.

병의 중증도가 높은 환자는 신장 기능의 저하로 인하여 신대체요법이 필요한 경우가 많이 있다. 신부전의 경우 조기에 진단할 수 있는 방법의 부재로 인하여 적절한 치료 시점을 놓치는 것이 주된 원인이 될 수 있다. 전통적인 신장 기능의 평가 방법은 혈청 크레아티닌을 측정함으로써 이를 통하여 신장 기능의 정도를 간접적으로 반영하는 것이다. 하지만, 혈청 크레아티닌은 개개인의 체중, 나이, 성별, 근육량, 단백질의 섭취 정도, 약물 등에 의해서 영향을 받게 되기 때문에 신장 기능의 변화를 실시간으로 반영하지 못하는 단점이 있다. 다시 말해서, 신장 기능이 50% 이상 저하되어야만 혈청 크레아티닌이 상승하게 되므로 혈청 크레아티닌을 이용한 진단 방법은 신장손상을 조기에 진단하는 데는 한계가 있다.Patients with high severity of disease often need renal replacement due to decreased kidney function. In the case of renal failure, the lack of a method to diagnose early can be a major cause of missing appropriate time points of treatment. Traditional methods of assessing kidney function are indirectly reflecting the extent of kidney function by measuring serum creatinine. However, since serum creatinine is affected by an individual's weight, age, sex, muscle mass, protein intake, drug, and the like, there is a disadvantage in that it does not reflect changes in renal function in real time. In other words, since serum creatinine is elevated only when kidney function is lowered by 50% or more, the diagnostic method using serum creatinine has a limitation in early diagnosis of kidney damage.

상술한 한계점을 극복하기 위하여, 혈액검사와 소변 검사를 이용할 수 있으나, 이는 그 정확도가 낮고, 초기 진단이 어려워 중증도가 높은 질환으로 발전하기 전에 판별이 불가능하다는 단점이 있다.In order to overcome the above-mentioned limitations, blood tests and urine tests can be used, but this has a disadvantage in that the accuracy is low and the initial diagnosis is difficult, so it is impossible to discriminate before developing into a disease with high severity.

즉, 신장 기능이 50% 이상 저하되기 이전에 신장의 손상을 진단하는 것이 매우 중요하며, 신장의 손상은 네프론의 부위에 따라 발생하므로, 정확한 진단과 치료를 위해서 각 부위의 손상을 검출해내는 것이 요구되고 있다. 허나 대부분의 진단 방법은 사구체의 기능 이상에 국한되어 있어, 세뇨관 세포 손상을 구분하고, 이로부터 발생하는 질환을 예방하는 것은 미진한 실정이다.In other words, it is very important to diagnose the damage to the kidney before the functioning of the kidney is reduced by more than 50%, and the damage to the kidney occurs according to the site of the nephron. It is required. However, most diagnostic methods are limited to glomerular dysfunction, and it is insufficient to distinguish tubular cell damage and to prevent diseases caused therefrom.

게다가 약물의 개발에 있어서도, 일반적으로 몇 천명의 참가자로 구성된 임상 실험단계에서, 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상 여부는 쉽게 관찰되지 않고, 약물의 시판이 승인되어 수 많은 환자들에게 약물을 투여한 후에야 신장 독성 효과가 관찰되는 경우가 빈번하므로, 시판되기 전 미리 신장 세뇨관 세포에 미치는 독성을 예측하는 것이 용이하다. 그러나 초기 사구체 또는 세뇨관의 기능장애와 관련된 기전을 검출할 수 있는 진단 기술이 아직 구축되지 않은 상태에서, 약물을 시판하기 전 미리 신장 사구체 또는 세뇨관 세포에 대한 약물의 독성을 예측하는 것이 용이하지 않은 실정이다. 즉 약물 투여의 초기 단계에서 신속하고 민감하게 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 유발할 수 있는 가능성을 미리 감지하고 판단할 수 있는 방법의 개발 역시 요구되고 있다. Furthermore, in the development of the drug, in the clinical trials, which generally consist of thousands of participants, the renal glomeruli or tubule cell damage is not easily observed, and the kidneys are only approved after the drug has been approved and marketed to many patients. Since toxic effects are often observed, it is easy to predict the toxicity on renal tubule cells before they are marketed. However, it is not easy to predict the toxicity of drugs to renal glomeruli or tubule cells before they are marketed, as diagnostic techniques for detecting mechanisms related to early glomerular or tubular dysfunction have not yet been established. to be. In other words, there is a need to develop a method for detecting and judging the possibility of causing renal glomeruli or tubule cell damage rapidly and sensitively at an early stage of drug administration.

따라서 본 발명자들은 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상과 관련하여 이를 빠르고 간편하게 진단할 수 있는 기술을 개발하기 위하여 예의 노력하였고, 그 결과, 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상시, 배출되는 단백질의 검출을 통하여 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상 여부를 확인할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Therefore, the present inventors have made diligent efforts to develop a technique capable of quickly and easily diagnosing renal glomeruli or tubular cell damage. As a result, the renal glomeruli or renal glomeruli may be detected through detection of the released protein in renal glomeruli or tubular cell injury. By confirming that the damage to tubule cells can be confirmed, the present invention has been completed.

특허문헌 1. 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0061144호Patent Document 1. Republic of Korea Patent Publication No. 10-2017-0061144

본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 신장 세포 손상을 진단하기 위한 진단용 키트를 제공하는 것이다. The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a diagnostic kit for diagnosing renal cell damage.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 다른 목적은 신장 세포 손상을 진단하기 위한 정보를 제공하기 위한 방법을 제공하는 것이다.The present invention has been made in view of the above problems, and another object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosing renal cell damage.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 또 다른 목적은 약물에 의한 신장 세포 손상을 예측 및 진단방법을 제공하는 것이다.The present invention has been made in view of the above problems, and another object of the present invention is to provide a method for predicting and diagnosing kidney cell damage caused by drugs.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 또 다른 목적은 신장 세포 손상을 억제하는 후보물질을 스크리닝하기 위한 방법을 제공하는 것이다.The present invention has been made in view of the above problems, and another object of the present invention is to provide a method for screening a candidate substance for inhibiting renal cell damage.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, Sirt1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1), 아세틸화된 HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1), CA9(Carbonic anhydrase IX) 및 Bnip3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장 세포 손상 진단용 키트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a Silent mating-type information regulation 2 homologue 1 (Silt1), acetylated HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor-1), Carbonic anhydrase IX (CA9) and Bnip3 (BCL2 / adenovirus E1B). 19 kDa protein-interacting protein 3) Provided is a kit for diagnosing renal cell damage, comprising a preparation for measuring protein levels.

상기 신장 세포 손상은 Sirt1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1)이 감소하고, 아세틸화된 HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1)가 증가하되, CA9(Carbonic anhydrase IX) 및 Bnip3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) 증가하는 것일 수 있다.The renal cell damage is reduced in Sirt1 (silent mating-type information regulation 2 homologue 1), acetylated HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor-1), but CA9 (Carbonic anhydrase IX) and Bnip3 (BCL2 / adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) may be increased.

상기 신장 세포 손상은 저산소 또는 약물에 의한 신장 손상인 것일 수 있다.The kidney cell damage may be kidney damage caused by hypoxia or drugs.

상기 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.The agent may be an antibody that specifically binds to the protein.

상기 Sirt1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1)는 서열번호 1로 표시되고, HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1)는 서열번호 2로 표시되며, CA9(Carbonic anhydrase IX)는 서열번호 3으로 표시되며, Bnip3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3)는 서열번호 4로 표시되는 것일 수 있다.The Sirt1 (silent mating-type information regulation 2 homologue 1) is represented by SEQ ID NO: 1, HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor-1) is represented by SEQ ID NO: 2, CA9 (Carbonic anhydrase IX) is SEQ ID NO: 3 Bnip3 (BCL2 / adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) may be represented by SEQ ID NO: 4.

본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, The present invention to achieve the above other object,

(a) 신장 세포 손상이 의심되는 피검체의 생물학적 시료로부터 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하는 단계;(a) measuring the levels of Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins from biological samples of subjects suspected of renal cell damage;

(b) 상기 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 Sirt1은 저하되고, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3는 증대되는 경우 신장 세포의 손상이 발생하는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 신장 세포 손상을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.(b) As a result of measuring the levels of the Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins, Sirt1 is lowered and the acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 are increased compared to the normal control group. A method is provided for providing information for diagnosing renal cell damage, comprising determining that damage occurs.

상기 생물학적 시료는 피검체로부터 분리된 소변, 혈액, 신장 조직, 신장 사구체 조직 또는 신장 세뇨관 조직일 수 있다.The biological sample may be urine, blood, kidney tissue, renal glomerular tissue or renal tubule tissue isolated from the subject.

상기 측정은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 것일 수 있다.The measurement may be by Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoproliferation method, oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS or protein chip.

본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여,The present invention to achieve the above another object,

(Ⅰ) 약물에 의한 신장 세포 손상이 의심되는 생물학적 시료로부터 Sirt1, HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및(I) measuring the levels of Sirt1, HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins from biological samples suspected of renal cell damage by the drug; And

(Ⅱ) 정상 대조군 시료로부터 상기 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하고, 상기 (Ⅰ) 단계의 측정 결과와 비교하는 단계를 포함하는 신장 손상을 예측 및 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.(II) measuring the levels of said Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins from a normal control sample and comparing them with the measurement results of step (I) to predict and diagnose kidney damage Provides a way to provide information.

상기 생물학적 시료는 피검체로부터 분리된 소변, 혈액, 신장 조직 또는 신장 세뇨관 조직일 수 있다.The biological sample may be urine, blood, kidney tissue or kidney tubule tissue isolated from the subject.

상기 측정은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 것일 수 있다.The measurement may be by Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoproliferation method, oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS or protein chip.

본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여,The present invention to achieve the above another object,

(ⅰ) 저산소 또는 신장 독성을 갖는 약물의 존재 하에서, 신장 세포에 시험물질을 처리하는 단계; (Iii) treating the test cell with kidney cells in the presence of a drug having hypoxic or renal toxicity;

(ⅱ) 상기 신장 세포에서 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (Ii) measuring the levels of Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins in said kidney cells; And

(ⅲ) 상기 측정된 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 정상 대조군과 비교하여, Sirt1은 증대되고, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3는 저하되는 경우 상기 시험물질을 후보물질로 선택하는 단계;를 포함하는 신장 세포 손상을 억제하는 후보물질을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다.(Iii) the test substance when Sirt1 is increased and acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 are lowered by comparing the levels of the Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins measured with the normal control group; It provides a method for screening a candidate to inhibit renal cell damage comprising the step of selecting as a candidate.

상기 측정은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 것일 수 있다.The measurement may be by Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoproliferation method, oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS or protein chip.

본 발명은 신장 세포의 손상에서 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준 변화를 확인한 바, 저산소 혹은 약물에 의해 신장 세포 손상이 발생한 경우 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 변화를 통해 진단할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 이를 활용하여 세포를 기반으로 하는 특이적인 진단키트, 진단방법, 약물의 신장 세포 손상 예측 및 진단 방법 및 후보물질 스크리닝 방법의 개발에 이용될 수 있다.The present invention confirms the changes in the levels of Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins in the damage of renal cells. When kidney cell damage is caused by hypoxia or drugs, Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and It was confirmed that the diagnosis can be made through the change of the Bnip3 protein. Therefore, it can be used in the development of cell-based specific diagnostic kits, diagnostic methods, methods for predicting and diagnosing kidney cell damage of drugs, and screening candidate materials.

도 1a, c는 노화 생쥐와 젊은 생쥐로부터 회수된 신장조직에서의 Sirt1, BNIP3 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진(a)과 이로부터 계산된 Sirt1, BNIP3의 Fold change 그래프(c)이다. *P<0.05. 도 1b는 노화 생쥐와 젊은 생쥐로부터 회수된 신장조직에서의 HIF-1α의 아세틸화 수준을 면역염색으로 특정하여 나타낸 형광 현미경 사진이다.
도 2는 Sirtinol을 처리한 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)에서 Cleaved caspase3(a), cleaved PARP(b), Collagen Ⅰ(c), Collagen Ⅳ(d) 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진(상단)과 이로부터 계산된 Cleaved caspase3(a), cleaved PARP(b), Collagen Ⅰ(c), Collagen Ⅳ(d)의 Fold change 그래프(하단)이다.
도 3은 Scramble siRNA 또는 Sirt1 siRNA 처리된 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)에서 Sirt1(a), Cleaved caspase3(b), cleaved PARP(c), Collagen Ⅰ(d), Collagen Ⅳ(e) 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진(상단)과 이로부터 계산된 Sirt1(a), Cleaved caspase3(b), cleaved PARP(c), Collagen Ⅰ(d), Collagen Ⅳ(e)의 Fold change 그래프(하단)이다.
도 4는 Empty Vector로 형질감염된 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)와 Sirt1 과발현 사람 신세뇨관 상피세포(Sirt1 OE)에서 Sirt1, Cleaved PARP, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅳ 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진이다.
도 5a는 일반(Hypoxia -) 또는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포주의 HIF-1α, Cleaved PARP, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅳ 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진이다.
도 5b는 일반(Hypoxia -) 또는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포주의 Sirt1 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진(상단)과 이로부터 계산된 Sirt1의 Fold change 그래프(하단)이다.
도 5c는 일반(Hypoxia -) 또는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포주의 Sirt1, HIF-1α 상호작용을 확인하고자, 면역침강 및 면역블롯팅으로 분석한 결과이다.
도 6a는 일반(Hypoxia -) 또는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포주의 HIF-1α로 면역침강 분석법을 수행한 뒤(IP), 아세틸화된 HIF-1α를 분별하기 위하여 Acetyl-lysine을 이용해서 면역블롯(IB)을 수행한 결과이고, 도 6b는 HRE 루시퍼라아제 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. HRE는 HIF-1 responsive element를 의미한다.
도 6c, d는 일반(Hypoxia -) 또는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포주의 CA6, BNIP3 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하여 나타낸 그래프이다(실험과정은 실험예 5-2 참조).
도 7a는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포에 레스베라트롤(resveratrol +)을 첨가하거나, 첨가하지 않은 뒤(resveratrol -), 이의 HIF-1α로 면역침강 분석법을 수행하였고(IP), 다음으로 아세틸화된 HIF-1α를 분별하기 위하여 Acetyl-lysine을 이용해서 면역블롯(IB)을 수행한 결과 그래프이다. 도 7b는 HRE 루시퍼라아제 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. HRE는 HIF-1 responsive element를 의미한다. 도 7c, d는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포에 레스베라트롤(resveratrol +)을 첨가하거나, 첨가하지 않은(resveratrol -) 후, CA9, BNIP3 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 레스베라트롤을 처리한 저산소로 손상된 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)에서 Cleaved caspase3(a), cleaved PARP(b), Collagen Ⅰ(c), Collagen Ⅳ(d), Fibronectin(e) 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진(상단)과 이로부터 계산된 Cleaved caspase3(a), cleaved PARP(b), Collagen Ⅰ(c), Collagen Ⅳ(d), Fibronectin(e)의 Fold change 그래프(하단)이다.
도 9a는 대조군(control), 레스베라트롤만 처리한 군(resveratrol), 저산소 하에서 손상된 세포군(Hypoxia), 저산소 하에서 레스베라트롤을 처리한 군(Hypoxia+resveratrol)에 대하여 미토콘드리아 밀도(mitochondrial density)를 전자현미경으로 촬영한 것이고, 도 9b는 9a를 정량화 한 것이며, 도 9c, d, e, f는 대조군(control), 레스베라트롤만 처리한 군(resveratrol), 저산소 하에서 손상된 세포군(Hypoxia), 저산소 하에서 레스베라트롤을 처리한 군(Hypoxia+resveratrol)에 대하여 Complex Ⅰ, Complex Ⅲ, Complex Ⅳ를 측정하여 나타낸 웨스턴블롯(c)과 이를 수치화한 그래프(d,e,f)이다.
도 10은 Empty Vector로 형질감염된 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)와 Sirt1 과발현 사람 신세뇨관 상피세포(Sirt1 OE)를 일반 배양조건에서 배양한 경우와, 저산소환경에 노출한 경우, CA9, BNIP3 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 계산한 그래프이다.
도 11은 Empty Vector로 형질감염된 세포(Empty Vector), HIF-1α 과발현 세포(HIF-1α OE), 레스베라트롤을 처리한 HIF-1α 과발현 세포(HIF-1α OE;Res), HIF-1α과 Sirt1이 동시에 과발현되는 세포(Sirt1 OE; HIF-1α OE)를 일반 배양조건에서 배양한 경우 CA9, BNIP3 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 계산한 그래프이다.
도 12는 일측요로폐쇄 모델(UUO)과 정상 모델(control)로부터 전체 신장조직을 얻고, 이로부터 면역형광염색하여, 사구체와 세뇨관 조직 부위를 촬영한 것이다.
도 13은 일측요로폐쇄 모델(UUO)과 정상 모델(control)로부터 전체 신장조직을 얻고, 이로부터 면역형광염색하여, 세뇨관 조직 부위를 촬영한 것이다.
도 14는 제2형 당뇨유발 모델(ZDF)과 정상 모델(control)로부터 전체 신장조직을 얻고, 이로부터 면역형광염색하여, 사구체와 세뇨관 조직 부위를 촬영한 것이다.
도 15는 제2형 당뇨유발 모델(ZDF)과 정상 모델(control)로부터 전체 신장조직을 얻고, 이로부터 면역형광염색하여, 세뇨관 조직 부위를 촬영한 것이다.1a and c are photographs showing Sirt1 and BNIP3 protein expression levels in renal tissue recovered from aging mice and young mice by Western blot, and Fold change graphs of Sirt1 and BNIP3 calculated therefrom. (c). * P <0.05. Figure 1b is a fluorescence micrograph showing the immunostaining of the acetylation level of HIF-1α in renal tissue recovered from aging mice and young mice.
2 is a Western blot for expression levels of cleaved caspase3 (a), cleaved PARP (b), Collagen I (c), and Collagen IV (d) proteins in Sirtinol-treated human renal tubule epithelial cells (HK-2). ) Is a picture (top) and the Fold change graph (bottom) of Cleaved caspase3 (a), cleaved PARP (b), Collagen I (c) and Collagen IV (d).
Figure 3 shows Sirt1 (a), Cleaved caspase3 (b), cleaved PARP (c), Collagen I (d), Collagen IV (e) proteins in human renal tubular epithelial cells (HK-2) treated with Scramble siRNA or Sirt1 siRNA Picture (top) showing expression level measured by Western blot and calculated from Sirt1 (a), Cleaved caspase3 (b), cleaved PARP (c), Collagen I (d), Collagen IV (e) Fold change graph at the bottom.
4 shows Western blot expression levels of Sirt1, Cleaved PARP, Collagen I and Collagen IV proteins in human renal tubule epithelial cells (HK-2) and Sirt1 overexpressing human renal tubule epithelial cells (Sirt1 OE) transfected with Empty Vector. It is a photograph measured by).
Figure 5a is a photograph showing the measurement of the expression level of HIF-1α, Cleaved PARP, Collagen I, Collagen IV protein HK-2 cell line cultured in a normal (Hypoxia-) or hypoxia (Hypoxia +) by Western blot to be.
FIG. 5B is a photograph showing the Sirt1 protein expression level of the HK-2 cell line cultured in a normal (Hypoxia −) or hypoxia (Hypoxia +) measurement by Western blot (top) and the calculated Fold of Sirt 1 therefrom. The change graph (bottom).
Figure 5c is a result of analysis by immunoprecipitation and immunoblotting to confirm the Sirt1, HIF-1α interaction of HK-2 cell line cultured in a normal (Hypoxia-) or hypoxia (Hypoxia +).
Figure 6a shows that after performing immunoprecipitation assay with HIF-1α HK-2 cell line cultured in a normal (Hypoxia-) or hypoxia (Hypoxia +) (IP), Acetyl- in order to fractionate acetylated HIF-1α Immunoblot (IB) was performed using lysine, and FIG. 6B is a graph showing the measurement of HRE luciferase activity. HRE stands for HIF-1 responsive element.
Figure 6c, d is a graph showing the measurement of the CA6, BNIP3 protein expression level of HK-2 cell line cultured in a normal (Hypoxia-) or hypoxia environment (Hypoxia +) by Western blot (see Experimental Example 5-2 for the experimental procedure) ).
FIG. 7A shows that the HK-2 cells cultured in a hypoxic environment (Hypoxia +) were added with or without resveratrol + (resveratrol −), and immunoprecipitation assays were performed with their HIF-1α (IP). Next, an immunoblot (IB) was performed using Acetyl-lysine to fractionate acetylated HIF-1α. 7B is a graph showing the measurement of HRE luciferase activity. HRE stands for HIF-1 responsive element. Figure 7c, d is shown by measuring the western blot of the CA9, BNIP3 protein expression level after the addition or without (resveratrol +) to HK-2 cells cultured in a hypoxic environment (Hypoxia +) It is a graph.
Figure 8 is cleaved caspase3 (a), cleaved PARP (b), Collagen I (c), Collagen IV (d), Fibronectin (e) proteins in hypoxic human renal tubule epithelial cells (HK-2) treated with resveratrol Picture (top) showing expression level measured by Western blot and calculated from Cleaved caspase3 (a), cleaved PARP (b), Collagen I (c), Collagen IV (d), Fibronectin (e) Fold change graph at the bottom.
FIG. 9A is an electron microscope photograph of the mitochondrial density of a control group, a resveratrol-treated group (resveratrol), a damaged cell group (Hypoxia) under hypoxia, and a group treated with resveratrol under hypoxia (Hypoxia + resveratrol). 9b is a quantification of 9a, Figures 9c, d, e, f is a control group, resveratrol-only group (resveratrol), damaged cell group under hypoxia (Hypoxia), resveratrol group under hypoxia (Hypoxia + resveratrol) is a Western blot (c) showing the measurement of Complex I, Complex III, Complex IV and the numerical value (d, e, f).
FIG. 10 shows human renal tubule epithelial cells (HK-2) and Sirt1 overexpressing human renal tubule epithelial cells (Sirt1 OE) transfected with an Empty Vector under normal culture conditions and when exposed to a hypoxic environment, CA9, BNIP3. It is a graph calculated by measuring the protein expression level by Western blot.
Figure 11 shows the cells transfected with Empty Vector (Empty Vector), HIF-1α overexpressing cells (HIF-1α OE), resveratrol-treated HIF-1α overexpressing cells (HIF-1α OE; Res), HIF-1α and Sirt1 Simultaneously overexpressing cells (Sirt1 OE; HIF-1α OE) is a graph calculated by measuring the western blot (CA9, BNIP3 protein expression levels) when cultured under normal culture conditions.
Figure 12 shows the whole kidney tissue from unilateral urinary obstruction model (UUO) and the normal model (control), and immunofluorescent staining from the glomeruli and tubule tissue region.
FIG. 13 shows the whole kidney tissue obtained from the unilateral urinary obstruction model (UUO) and the normal model (control), and immunofluorescence staining from the tubular tissue region.
FIG. 14 is a diagram showing glomeruli and tubule tissues obtained by immunofluorescent staining from whole kidney tissues from a type 2 diabetes induction model (ZDF) and a normal model (control).
FIG. 15 shows the whole kidney tissue obtained from the type 2 diabetes induction model (ZDF) and the normal model (control), and immunofluorescence staining from the capillary tissue region.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
Hereinafter, various aspects and various embodiments of the present invention will be described in more detail.

신장 세뇨관 손상은, 다양한 원인에 의해서 발생되는 것으로 알려져 있고, 크게 신장으로 가는 혈류의 부족이나 신장을 손상시키는 약물 그리고 심한 전신 감염에 의한 것으로 볼 수 있다. 이러한 신장 세뇨관 손상은 다른 신장병과 마찬가지로 초기에 임상 증상이 나타나지 않으므로, 진단이 어려워 신부전으로 발전할때까지 방치되는 경우가 대부분이다. 신장 세뇨관 손상은 손상을 야기하는 원인물질의 사용을 금하는 것만으로도 증상이 호전되는 경우가 많아, 회복율이 높다. 그러나 신장 세뇨관 손상이 방치되어, 신장의 기능이 15% 미만으로 저하될 경우 투석이나 신장대체요법들이 적용되어야 하는 중증도가 높은 질환인 진행성 신부전이 유도되며, 상기 진행성 신부전은 회복율이 현저히 낮다. 따라서 신장 세뇨관 세포 손상이 유발되었는지 여부를 초기에 진단할 수 있다면, 중증의 질환으로 발전하는 것을 조기에 치료하거나 예방할 수 있다는 장점을 갖는다. 또한 새로운 약물을 적용할 경우 발생할 수 있는 이차적인 신장 세뇨관 세포의 손상 여부를 진단함으로써, 미리 약물의 신장 독성을 쉽고 간편하게 예측하고 방지할 수 있다.
Renal tubule damage is known to be caused by a variety of causes, largely due to lack of blood flow to the kidneys, drugs that damage the kidneys, and severe systemic infections. These renal tubular damages, like other kidney disease, do not show clinical symptoms at first, and thus are difficult to diagnose and are often left until they develop kidney failure. Renal tubule damage often improves only by prohibiting the use of the causative agent that causes the damage, and the recovery rate is high. However, when renal tubular damage is neglected, and the kidney function is lowered to less than 15%, progressive renal failure, which is a severe disease to which dialysis or renal replacement therapy should be applied, is induced. Therefore, if the early diagnosis of renal tubular cell damage is induced, the development of a serious disease has the advantage that can be treated or prevented early. In addition, by diagnosing the damage of secondary renal tubule cells that can occur when applying a new drug, it is possible to easily and easily predict and prevent the renal toxicity of the drug in advance.

본 발명은 HIF-1α가 탈아세틸화되지 않거나 아세틸화되면, HIF-1α 안정화가 증가하고, 이러한 HIF-1α의 안정화에 의해 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상이 증폭된다는 발견에 근거한 것이다. 구체적으로 신장 세뇨관 세포에서 HIF-1α의 아세틸화/탈아세틸화 활성이 Sirt1 단백질의 발현에 따라 조절되었고, CA9, Bnip3 단백질의 발현 역시 제어되는 것을 확인한 바, 이러한 현상은 신장 사구체 또는 세뇨관 세포의 손상과 억제로 이어지는 것을 규명하였다.The present invention is based on the discovery that when HIF-1α is not deacetylated or acetylated, HIF-1α stabilization is increased and renal glomeruli or tubule cell damage is amplified by stabilization of HIF-1α. Specifically, it was confirmed that the acetylation / deacetylation activity of HIF-1α in renal tubule cells was regulated according to the expression of Sirt1 protein, and the expression of CA9 and Bnip3 proteins was also controlled. This phenomenon was caused by damage of renal glomeruli or tubule cells. It was found that leading to over suppression.

본 발명에서 규명한 Sirt1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1), 아세틸화된 HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1), CA9(Carbonic anhydrase IX) 및 Bnip3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) 단백질의 발현 수준은, 저산소나 외부적인 약물의 투여를 통해 발생하는 신장 세뇨관 세포의 손상과 관련되어 있음을 확인하였으므로, 본 발명에서 규명된 상술한 기전을 이용하여 신장 세뇨관 세포 손상을 진단하는 것이 가능하다.Sirt1 (silent mating-type information regulation 2 homologue 1), acetylated HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor-1), CA9 (Carbonic anhydrase IX) and Bnip3 (BCL2 / adenovirus E1B 19 kDa protein-) interacting protein 3) Since the expression level of the protein is related to the damage of renal tubule cells occurring through the administration of hypoxic or external drugs, the mechanism of renal tubular cell damage can be repaired using the mechanism described above. It is possible to diagnose.

본 발명의 일 측면은 Sirt1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1), 아세틸화된 HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1), CA9(Carbonic anhydrase IX) 및 Bnip3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장 세뇨관 세포 손상 진단용 키트에 관한 것이다.One aspect of the present invention is a silent mating-type information regulation 2 homologue 1 (Sirt1), acetylated HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor-1), Carbonic anhydrase IX (CA9) and Bnip3 (BCL2 / adenovirus E1B 19 kDa protein) -interacting protein 3) relates to a kit for diagnosing renal tubule cell damage, comprising an agent for measuring protein levels.

본 발명에서 상기 Sirt1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1)는 서열번호 1로 표시되는 단백질이고, CA9(Carbonic anhydrase IX)는 서열번호 3으로 표시되는 단백질이며, Bnip3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3)는 서열번호 4로 표시되는 단백질 일 수 있다.In the present invention, the Sirt1 (silent mating-type information regulation 2 homologue 1) is a protein represented by SEQ ID NO: 1, CA9 (Carbonic anhydrase IX) is a protein represented by SEQ ID NO: 3, Bnip3 (BCL2 / adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) may be a protein represented by SEQ ID NO: 4.

가장 먼저 Sirt1 감소가 진행되고, 이어서 HIF-1아세틸화가 유도되며, CA9과 bnip3의 전사가 증가하게 된다. First, Sirt1 decreases, followed by HIF-1 acetylation, followed by an increase in the transcription of CA9 and bnip3.

HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1)는 서열번호 2로 표시되는 단백질이며, 아세틸화되는 부위는 서열번호 2로 표시되는 HIF-1α의 아미노산 서열의 리신(lysine)일 수 있다.HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor-1) is a protein represented by SEQ ID NO: 2, and the site to be acetylated may be a lysine (lysine) of the amino acid sequence of HIF-1α represented by SEQ ID NO: 2.

본 발명에서 진단이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 신장의 기능이 상실되는 중증의 신장질환이 발병되기 전에, 신장 사구체 또는 세뇨관 세포의 손상 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.Diagnosis in the present invention means confirming the presence or characteristic of a pathological state. For the purposes of the present invention, the diagnosis may be interpreted as determining whether the kidney glomeruli or tubule cells are damaged before the onset of severe kidney disease in which kidney function is lost.

신장 사구체 또는 세뇨관 이란, 신장의 네프론(nephron)을 이루는 가장 기본 구조로, 신장의 겉 부분의 신소체에서 시작하며, 신장에서 소변이 생성될 때 소변 속 체액과 무기질을 재흡수하는 세포를 의미하며, 본 발명의 목적상 이 부분에 손상이 발생할 경우(아포토시스 혹은 괴사), 신장 세뇨관 세포 손상이라고 하며, 특별히 이에 제한되지 않는다.Renal glomeruli or tubules are the most basic structures that make up the nephron of the kidney, starting from the outer body of the kidney, and means cells that reabsorb fluid and minerals in the urine when urine is produced in the kidney. When damage occurs to this part (apoptosis or necrosis) for the purposes of the present invention, it is called renal tubular cell damage, and is not particularly limited thereto.

저산소 환경 하에서, 신장 세뇨관 세포의 손상과정에 상기 Sirt1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1), 아세틸화된 HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1), CA9(Carbonic anhydrase IX) 및 Bnip3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3)가 관여되어 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명에서는 저산소 혹은 약물에 의한 신장 세뇨관 세포 손상에 따라 단백질 발현 수준이 변화하는, 의존적인 단백질들을 확인하였고, 그 결과 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질을 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 진단 및 판단할 수 있도록 하는 바이오마커임을 밝혀냈다. 본 발명에서 저산소라 함은 상대적인 개념이나, 바람직하게는 1% 이하의 산소 농도 조건을 의미한다.In a hypoxic environment, sirt1 (silent mating-type information regulation 2 homologue 1), acetylated HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor-1), CA9 (Carbonic anhydrase IX) and Bnip3 (BCL2) / adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) was confirmed to be involved. Therefore, in the present invention, it was confirmed that dependent proteins whose protein expression levels change according to renal tubular cell damage caused by hypoxia or drugs, and as a result, Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins were identified as renal glomeruli or tubule cells. It has been found to be a biomarker that allows diagnosis and judgment of damage. Low oxygen in the present invention is a relative concept, but preferably means an oxygen concentration condition of less than 1%.

본 발명자들은 구체적인 실험에 따라 저산소 환경을 통해 얻은 손상된 신장 세뇨관 세포를 이용하여, 생체 외 단백질 발현 수준을 분석한 결과, 손상이 진행될수록 Sirt1는 감소하고, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3은 증대되는 것을 확인하였다. 또한 동일한 저산소 환경에서 Sirt1 단백질을 과발현시킨 신장 세뇨관 세포의 경우, 아세틸화된 HIF-1은 감소하고(탈아세틸화된 HIF-1α 증가함), CA9 및 Bnip3이 정상 대조군과 유사한 수준으로 회복되고 있음을 확인함으로써, 상기 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 발현 수준을 통해 신장 세뇨관 세포의 손상을 예측 또는 진단할 수 있음을 입증하였다. 즉, Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질은 단순 신장의 기능 장애에 의한 신장 질환을 진단하는 것이 아닌, 신장 중에서 세뇨관 세포의 손상 여부를 판별할 수 있는 것으로써, 저산소 혹은 약물에 의한 신장 세뇨관 세포의 손상을 쉽고 간단한 측정과정을 통해 정확하고 명확하게 판별할 수 있다는 장점을 갖는다.The inventors analyzed in vitro protein expression levels using damaged kidney tubule cells obtained through a hypoxic environment according to specific experiments. As the damage progressed, Sirt1 decreased, and acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 It confirmed that it increased. In addition, in renal tubule cells overexpressing Sirt1 protein in the same hypoxic environment, acetylated HIF-1 is decreased (deacetylated HIF-1α is increased), and CA9 and Bnip3 are recovering to levels similar to normal controls. By confirming, the expression levels of the Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins demonstrated that damage to renal tubule cells can be predicted or diagnosed. In other words, Sirt1, acetylated HIF-1, CA9, and Bnip3 proteins are not for diagnosing kidney disease due to simple kidney dysfunction, but are capable of determining whether the tubule cells are damaged in the kidney and thus, Damage to renal tubule cells caused by the easy and simple measurement process has the advantage that can be accurately and clearly discriminated.

본 발명에서 신장 중에서 세뇨관 세포의 손상 여부를 정확히 판별하기 위해서는, 신장 세뇨관 세포에서 아세틸화된 HIF-1, Sirt1 단백질의 발현 수준만을 측정하는 것보다, CA9, Bnip3 단백질의 발현 수준을 동시에 검출하는 것이 바람직하다.In order to accurately determine whether the tubule cells are damaged in the kidney in the present invention, rather than measuring the expression level of the acetylated HIF-1, Sirt1 protein in the kidney tubule cells, detecting the expression level of CA9, Bnip3 protein at the same time desirable.

본 발명자들은 처음 손상된 신장 세뇨관 세포에서, Sirt1 단백질 발현이 감소함을 확인하였고, 신장 세뇨관 손상과 Sirt1 단백질의 기전을 연구하던 중, Sirt1 단백질의 발현이 감소하면 HIF-1α의 아세틸화가 증가되고 HIF-1α의 전사활성이 증가되고, 이어 CA9와 BNIP3 전사가 증가하는 일련의 과정을 통해 제어되는 것을 확인하였다.We first found that Sirt1 protein expression decreased in damaged kidney tubule cells, and while studying the mechanisms of kidney tubule damage and Sirt1 protein, decreased expression of Sirt1 protein resulted in increased acetylation of HIF-1α and HIF- It was confirmed that the transcriptional activity of 1α is increased, followed by a series of processes in which CA9 and BNIP3 transcription are increased.

따라서, 아세틸화된 HIF-1, Sirt1 단백질의 발현 수준뿐만 아니라, CA9와 BNIP3 단백질의 발현 수준도 동시에 측정하는 것이 진단에서의 높은 정확성을 얻을 수 있다.Therefore, measuring the expression levels of the CA9 and BNIP3 proteins as well as the expression levels of the acetylated HIF-1 and Sirt1 proteins at the same time can achieve high accuracy in diagnosis.

또한, 종래에 신장질환에 효과를 갖는다고 알려진 레스베라트롤을, 저산소에 의해 손상된 신장 세뇨관 세포에 처리할 경우, Sirt1 단백질의 발현이 증가하게 되고, HIF-1α의 탈아세틸화가 증가하므로 HIF-1α 전사활성이 억제되며, 이어 CA9와 BNIP3 전사가 억제되는 것을 확인하였는 바, 본 발명은 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1 뿐만 아니라, CA9 및 Bnip3 단백질 수준을 측정함으로써 신장 세뇨관 세포 손상 정도를 정확하고 재현성있게 판별할 수 있음을 확인하였다.In addition, when resveratrol is known to have an effect on renal disease, the renal tubule cells damaged by hypoxia increase the expression of Sirt1 protein and increase the deacetylation of HIF-1α. HIF-1α transcriptional activity It was confirmed that the inhibition of CA9 and BNIP3 transcription, and the present invention, by measuring the levels of Sirt1, acetylated HIF-1, as well as CA9 and Bnip3 protein levels accurately and reproducibly determine the extent of renal tubular cell damage It was confirmed that it can be done.

신장 질환에 있어서, 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상은 다른 질환과는 달리 별개의 경로로 신장 사구체 세포와 신장 세뇨관 세포(소변이 생성될 때 소변 속 체액과 무기질을 재흡수하는 세포)에 손상이 생겨 유발되는 것으로써, 특히 신장 세뇨관 세포 손상에 의한 질환으로는 급성 세뇨관 괴사가 이에 속한다. 이는 신장으로 가는 혈류의 부족이나 신장을 손상시키는 약물 그리고 심한 전신 감염에 의해 발생되는 것으로 알려져 있으며, 신장 사구체 또는 세뇨관 손상으로 급성 사구체 또는 세뇨관 괴사가 야기된다. 신장 사구체 또는 세뇨관 세포의 손상의 경우 임상 증상이 거의 나타나지 않고, 진단을 통해 검출이 어려워, 대부분 신부전과 같은 중증의 질환으로 발전되는데, 본 발명의 경우 신부전과 같은 중증질환으로 발전하기 이전에 신장 세뇨관 세포 손상이 발생하였는지 여부를 쉽고 간단하고 효율적으로 진단할 수 있다는 장점을 갖는다.In kidney disease, renal glomeruli or tubular cell damage, unlike other diseases, is caused by damage to renal glomeruli cells and renal tubule cells (cells that reabsorb fluid and minerals in the urine when urine is produced) in a separate pathway. In particular, diseases caused by renal tubular cell damage belong to acute tubular necrosis. It is known to be caused by a lack of blood flow to the kidneys, drugs that damage the kidneys, and severe systemic infections. Acute glomeruli or tubule necrosis is caused by renal glomeruli or tubule damage. In the case of damage of renal glomeruli or tubule cells, clinical symptoms are rarely detected, and it is difficult to detect through diagnosis, and most of them develop severe diseases such as renal failure. In the present invention, renal tubules are developed before developing severe diseases such as renal failure. It has the advantage of being able to easily and simply and efficiently diagnose whether cell damage has occurred.

또한 본 발명은 저산소 조건이 아닐 때, Sirt1 siRNA를 통해 신장 세뇨관 세포에서 Sirt1 단백질을 의도적으로 저하시켜, 세포의 손상을 유도하였을 때에도 정상 대조군에 비해 HIF-1α의 아세틸화가 증가하므로 HIF-1α 전사활성이 증가하게 되고, 이어 CA9와 BNIP3 전사가 증가되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질 발현 수준을 측정함으로써 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상, 특히 신장 세뇨관 세포 손상을 예측 및 진단하는 효과가 있음을 시사하는 것이다. In addition, the present invention intentionally lowered the Sirt1 protein in renal tubule cells via Sirt1 siRNA when not under hypoxic conditions, and HIF-1α transcriptional activity is increased since acetylation of HIF-1α is increased compared to the normal control group even when cell damage is induced. This increased, followed by increased CA9 and BNIP3 transcription. This suggests that by measuring the Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 protein expression levels of the present invention, it is effective in predicting and diagnosing renal glomeruli or tubule cell damage, in particular renal tubule cell damage.

상기 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상은 저산소 또는 약물에 의한 신장 사구체 또는 세뇨관 손상인 것일 수 있다. 상기 약물은 종래 개발된 약물이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 아미노글리코시드계 항생제(예, 겐타마이신, 토브라마이신), 암포테리신 B(중증의 전신 진균 감염을 치료하는 데 사용되는 약물), 콜리스티메탄(다른 질환으로 입원한 환자들에서 발생하는 감염 치료에 사용되는 항생제), 반코마이신(다른 항생제들에 내성을 보이고 2주 이상 동안 고용량으로 투여할 때 신장 손상을 야기할 수 있는 감염 치료에 사용되는 항생제), 비스테로이드성 항염증제(NSAID) 등 일 수 있다.The renal glomeruli or tubule cell damage may be renal glomeruli or tubule damage by hypoxia or drugs. The drug is not particularly limited as long as it is a drug developed in the prior art, for example, aminoglycoside antibiotics (eg, gentamycin, tobramycin), amphotericin B (drugs used to treat severe systemic fungal infections) ), Colistimethane (an antibiotic used to treat infections in patients hospitalized with other diseases), vancomycin (an infection that is resistant to other antibiotics and can cause kidney damage when administered at high doses for more than two weeks) Antibiotics used for treatment), nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), and the like.

상기 Sirt1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1), 아세틸화된 HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1), CA9(Carbonic anhydrase IX) 및 Bnip3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) 단백질의 증대 또는 감소는 상기 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 단백질의 발현 수준은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 구체적으로 상기 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정하는 것일 수 있다.Silt mating-type information regulation 2 homologue 1), acetylated HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor-1), CA9 (Carbonic anhydrase IX) and Bnip3 (BCL2 / adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) Increasing or decreasing the protein can be seen by confirming the expression level of the protein. Separation of the protein from the biological sample can be carried out using a known process, the expression level of the protein can be measured by various methods known to those skilled in the art. Specifically, the preparation may be measured using an antibody that specifically binds to the protein.

상기 '항체'는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하며, 본 발명의 목적상 항체는 본 발명의 Sirt1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1), 아세틸화된 HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1), CA9(Carbonic anhydrase IX) 및 Bnip3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 모두 포함할 수 있다. 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태를 비롯하여, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다. 상기 항체는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것이라면 모두 사용할 수 있다.The term 'antibody' refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site, and for the purposes of the present invention, the antibody may be a Sirt1 (silent mating-type information regulation 2 homologue 1), acetylated HIF-1 ( Hypoxia-Inducible Factor-1), CA9 (Carbonic anhydrase IX) and Bnip3 (BCL2 / adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) are antibodies that can specifically bind to polyclonal antibodies, monoclonal Both antibodies and antibodies, such as recombinant antibodies can be included. As well as special antibodies such as humanized antibodies. The antibody may comprise functional fragments of antibody molecules, including complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains. The functional fragment of the antibody molecule means a fragment having at least antigen binding function, and may be Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv. The antibodies can be used as long as those skilled in the art are prepared using known techniques.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상이 의심되는 피검체로부터 채취한 시료를 의미하며, 바람직하게는 소변, 혈액, 신장 조직, 신장 사구체 조직 또는 신장 세뇨관 조직을 포함한다.In the present invention, the "biological sample" refers to a sample taken from a kidney suspected of damage to glomeruli or tubule cells, and preferably includes urine, blood, kidney tissue, renal glomerular tissue or renal tubule tissue.

본발명의 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 선택적으로, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.Kits of the present invention may optionally comprise a secondary antibody labeled with a chromophore or fluorophore and a substrate of the label for immunological detection of the antibody. Furthermore, kits according to the invention can be produced in a number of separate packaging or compartments comprising the reagent components described above.

상기 키트는 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 진단할 수 있는 마이크로어레이 형태일 수 있다. 구체적으로 상기 마이크로어레이는 상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 항체가 고정되어 있는 것으로, 상기 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.The kit may be in the form of a microarray capable of diagnosing renal glomeruli or tubule cell damage. Specifically, the microarray is immobilized with an antibody capable of measuring the expression level of the protein. The antibody is used as a hybridizable array element and immobilized on a substrate. Preferred substrates may include suitable rigid or semi-rigid supports, such as membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic beads or nonmagnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries. have. The hybridization array element is arranged and immobilized on the substrate, and such immobilization can be performed by a chemical bonding method or by a covalent method such as UV. For example, the hybridization array element can be bonded to a glass surface modified to include an epoxy compound or an aldehyde group, and can also be bonded by UV at the polylysine coating surface. In addition, the hybridization array element may be coupled to the substrate via a linker (eg, ethylene glycol oligomer and diamine).

상기 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나, 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.The coloring enzyme is not particularly limited to this, peroxidase (peroxidase), alkaline phosphatase (Alkaline Phosphatase) may be used, the fluorescent material is not particularly limited to this may be FITC, RITC, etc., the coloring substrate is particularly ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine), but is not limited thereto.

상기 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상은 신장질환이 발현되기 이전에 임상 증상으로 판단이 어려운 신장 사구체 또는 세뇨관의 세포 손상 여부를 진단 및 판별하기 위한 것으로써, 본 발명의 진단용 키트 역시, 신장질환이 발현되지 이전 신장 세뇨관의 세포 손상 여부를 진단하기 위한 것이다.
The renal glomeruli or tubular cell damage is for diagnosing and determining whether the cells of the renal glomeruli or tubules are difficult to judge as clinical symptoms before renal disease is expressed. The diagnostic kit of the present invention also does not express renal disease. For diagnosing cellular damage to previous renal tubules.

본 발명의 다른 측면은 하기 단계를 포함하는 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.Another aspect of the invention relates to a method of providing information for diagnosing renal glomeruli or tubule cell damage comprising the following steps.

(a) 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상이 의심되는 피검체의 생물학적 시료로부터 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및(a) measuring the levels of Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins from biological samples of subjects suspected of renal glomeruli or tubule cell damage; And

(b) 상기 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 Sirt1은 저하되고, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3는 증대되는 경우 신장 사구체 또는 세뇨관 세포의 손상이 발생하는 것으로 판정하는 단계.(b) When the levels of the Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins were measured, Sirt1 was lowered and the acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 were increased compared to the normal control group. Determining that damage to tubule cells occurs.

상기 생물학적 시료는 피검체로부터 분리된 소변, 혈액, 신장 조직, 신장 사구체 조직 또는 신장 세뇨관 조직일 수 있고, 바람직하게는 생체 외(in vitro) 상에서의 신장 세뇨관 세포일 수 있다.The biological sample may be urine, blood, kidney tissue, renal glomerular tissue or renal tubular tissue isolated from the subject, preferably renal tubular cells in vitro.

상기 정상 대조군은 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상이 발생하지 않은 정상의 피검체로부터 회수한 생물학적 시료 또는 생체 외에서 손상되지 않은 신장 세뇨관 세포를 의미한다.The normal control means a biological sample recovered from a normal subject without renal glomeruli or tubule cell damage or an intact renal tubule cell in vitro.

본 발명에서 진단 또는 판정이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 신장의 기능이 상실되는 중증의 신장질환이 발병되기 전에, 신장 사구체 또는 세뇨관 세포의 손상이 발생하였는지 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.Diagnosis or determination in the present invention means confirming the presence or characteristic of a pathological state. For the purposes of the present invention, the diagnosis may be interpreted as determining whether damage to renal glomeruli or tubule cells has occurred before the development of severe renal disease, in which renal function is lost.

상기에서 단백질의 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다. 상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 예를 들어, 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay: RIA), 방사선 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정분석법, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
The method for measuring the level of protein in the above may be carried out including a known process for separating proteins from biological samples using known techniques. The protein level may be measured using an antibody, in which case the marker protein in the biological sample and the antibody specific thereto form a conjugate, i.e., an antigen-antibody complex, and the amount of antigen-antibody complex formed is a detection label. Quantitative measurements can be made through the magnitude of the signal at the detection label. Such detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules, and radioisotopes, but are not limited thereto. Assays for measuring protein levels include, for example, Western blots, enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs), radioimmunoassays (RIAs), radioimmunodiffusions, immunoprecipitation assays, It can be any one selected from the group consisting of Oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, FACS and protein chip.

본 발명의 다른 측면은 (Ⅰ) 약물에 의한 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상이 의심되는 피검체의 생물학적 시료로부터 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (Ⅱ) 정상 대조군 시료로부터 상기 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하고, 상기 (Ⅰ) 단계의 측정 결과와 비교하는 단계를 포함하는 약물에 의한 신장 사구체 또는 세뇨관 손상을 예측 및 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method for treating a kidney glomeruli or tubule cell damage by a drug, comprising: (I) measuring levels of Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins from a biological sample of a subject suspected of damaging the renal glomeruli or tubule cells; And (II) measuring levels of said Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins from a normal control sample, and comparing them with the measurement results of step (I). A method is provided for providing information for predicting and diagnosing damage.

상기 약물은 종래 개발 중이거나, 상용화되어 있는 약물 중에서, 투여시 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 야기할 것이라 의심되는 것이라면 특별히 이에 제한되지 않는다.The drug is not particularly limited as long as it is suspected of causing renal glomeruli or tubule cell damage upon administration, among drugs that are under development or are commercially available.

구체적으로, 본 발명의 약물에 의한 신장 사구체 또는 세뇨관 손상을 예측 및 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법은 (Ⅰ) 약물에 의한 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상이 의심되는 피검체의 생물학적 시료로부터 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하고, (Ⅱ) 정상 대조군 시료로부터 상기 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하여, 이를 상기 (Ⅰ) 단계에서 측정된 결과와 비교하여, 정상 대조군보다도 (Ⅰ) 단계에서 측정된 수치에서 측정된 Sirt1 단백질의 수준은 낮고, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준은 높은 경우, 상기 약물에 의해 신장 사구체 또는 세뇨관 세포의 손상이 발생한 것으로 판정할 수 있다.Specifically, a method for providing information for predicting and diagnosing renal glomeruli or tubule damage by a drug of the present invention is provided by (I) Sirt1, Acetyl, and Acetyl from a biological sample of a subject suspected of renal glomeruli or tubule cell damage by the drug. The level of the HIF-1, CA9 and Bnip3 protein is quantified, and (II) the level of the Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 protein is measured from the normal control sample. Compared with the measured results, when the level of Sirt1 protein measured at the level measured in step (I) than the normal control is low, and the level of acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 protein is high, the kidney Damage to glomeruli or tubule cells may be determined to have occurred.

상기 피검체는 척추동물일 수 있고, 보다 구체적으로 인간을 제외한 척추동물을 의미하며 예를 들어 마우스, 랫트 및 햄스터를 포함하는 설치류, 토끼, 말, 소, 개, 고양이, 원숭이, 기니피그 등을 포함할 수 있다.The subject may be a vertebrate, and more specifically, refers to vertebrates other than humans, and includes, for example, rodents including mice, rats, and hamsters, rabbits, horses, cows, dogs, cats, monkeys, guinea pigs, and the like. can do.

상기 생물학적 시료는 피검체로부터 분리된 소변, 혈액, 신장 조직, 신장 사구체 조직 또는 신장 세뇨관 조직일 수 있고, 바람직하게는 생체 외(in vitro) 상에서의 신장 세뇨관 세포일 수 있다.The biological sample may be urine, blood, kidney tissue, renal glomerular tissue or renal tubular tissue isolated from the subject, preferably renal tubular cells in vitro.

상기 정상 대조군은 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상이 발생하지 않은 정상의 피검체로부터 회수한 생물학적 시료 또는 생체 외에서 손상되지 않은 신장 사구체 또는 세뇨관 세포를 의미한다.The normal control means a biological sample recovered from a normal subject without renal glomeruli or tubule cell damage or an intact renal glomeruli or tubule cells in vitro.

본 발명에 있어서, (Ⅲ) 상기 (Ⅱ) 단계의 비교 결과, 정상 대조군보다도 (Ⅰ) 단계에서 측정된 수치가 Sirt1은 낮고, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3는 높은 경우, 상기 약물에 의해 신장 사구체 또는 세뇨관 세포의 손상이 발생한 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다In the present invention, (III) when the value measured in step (I) is lower than the normal control, Sirt1 and acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 are higher than the normal control, And determining that damage to the renal glomeruli or tubule cells has occurred.

상기에서 단백질의 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다. 상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 예를 들어, 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay: RIA), 방사선 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정분석법, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.The method for measuring the level of protein in the above may be carried out including a known process for separating proteins from biological samples using known techniques. The protein level may be measured using an antibody, in which case the marker protein in the biological sample and the antibody specific thereto form a conjugate, i.e., an antigen-antibody complex, and the amount of antigen-antibody complex formed is a detection label. Quantitative measurements can be made through the magnitude of the signal at the detection label. Such detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules, and radioisotopes, but are not limited thereto. Assays for measuring protein levels include, for example, Western blots, enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs), radioimmunoassays (RIAs), radioimmunodiffusions, immunoprecipitation assays, It can be any one selected from the group consisting of Oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, FACS and protein chip.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군의 단백질의 양과 약물에 노출된 경우의 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 정상 대조군과 비교함으로써 약물에 의한 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 예측 및 진단할 수 있다.
Therefore, the present invention can determine the amount of protein of the normal control group and the amount of protein when exposed to the drug through the detection method as described above, and by comparing the degree of the expression amount with the normal control group of kidney glomeruli or tubules by the drug Cell damage can be predicted and diagnosed.

본 발명의 또 다른 측면은 다음 단계를 포함하는 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 억제하는 후보물질을 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이다.Another aspect of the invention is directed to a method for screening a candidate for inhibiting renal glomeruli or tubular cell damage, comprising the following steps.

(ⅰ) 저산소 또는 신장 독성을 갖는 약물의 존재 하에서, 신장 사구체 또는 세뇨관 세포에 시험물질을 처리하는 단계;(Iii) treating the test substance with renal glomeruli or tubule cells in the presence of a drug having hypoxic or renal toxicity;

(ⅱ) 상기 신장 사구체 또는 세뇨관 세포에서 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (Ii) measuring the levels of Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins in said renal glomeruli or tubule cells; And

(ⅲ) 상기 측정된 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 정상 대조군과 비교하여, Sirt1은 증대되고, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3는 저하되는 경우 상기 시험물질을 후보물질로 선택하는 단계.(Iii) the test substance when Sirt1 is increased and acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 are lowered by comparing the levels of the Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins measured with the normal control group; Selecting as a candidate.

상기 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 억제하는 후보물질을 스크리닝하기 위한 방법은 저산소 혹은 신장 독성을 갖는 약물로 인해 신장 사구체 또는 세뇨관 세포의 손상이 유발되는 조건에서, 이를 억제할 수 있는 물질을 선별할 수 있는 생체외에서의 방법에 관한 것이다. 구체적으로 신장 사구체 또는 세뇨관 세포의 손상과 관련된 Sirt1 단백질을 활성화하고, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 발현을 억제하는 것을 목표로 하는 약물을 선별하기 위한 것일 수도 있다.The method for screening a candidate substance for inhibiting renal glomeruli or tubular cell damage may select a substance capable of inhibiting renal glomeruli or tubule cells due to a hypoxic or renal toxicity drug. To an ex vivo method. Specifically, it may be for screening drugs that activate Sirt1 protein associated with damage of renal glomeruli or tubule cells and inhibit the expression of acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins.

상기 신장 사구체 또는 세뇨관 세포는 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상이 유발된 동물 또는, 유발되지 않은 정상의 동물로부터 분리된 것으로, 생체 외(in vitro) 상에서의 신장 사구체 또는 세뇨관 세포일 수 있다. 상기 동물은 척추동물일 수 있고, 보다 구체적으로 인간을 제외한 척추동물을 의미하며 예를 들어 마우스, 랫트 및 햄스터를 포함하는 설치류, 토끼, 말, 소, 개, 고양이, 원숭이, 기니피그 등을 포함할 수 있다.The renal glomeruli or tubule cells are isolated from an animal in which renal glomeruli or tubule cell damage is induced, or a normal animal which is not induced, and may be renal glomeruli or tubule cells in vitro. The animal may be a vertebrate, and more specifically, refers to vertebrates other than humans and may include, for example, rodents including mice, rats, and hamsters, rabbits, horses, cattle, dogs, cats, monkeys, guinea pigs, and the like. Can be.

상기 신장에 독성을 갖는 약물은 신장을 손상시키는 약물이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 아미노글리코시드계 항생제(예, 겐타마이신, 토브라마이신), 암포테리신 B(중증의 전신 진균 감염을 치료하는 데 사용되는 약물), 콜리스티메탄(다른 질환으로 입원한 환자들에서 발생하는 감염 치료에 사용되는 항생제), 반코마이신(다른 항생제들에 내성을 보이고 2주 이상 동안 고용량으로 투여할 때 신장 손상을 야기할 수 있는 감염 치료에 사용되는 항생제), 비스테로이드성 항염증제(NSAID) 및 아미노글리코사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The drug which is toxic to the kidney is not particularly limited as long as it is a drug that damages the kidney. Preferably, aminoglycoside antibiotics (eg, gentamycin, tobramycin), amphotericin B (severe systemic fungal infections) Drugs used to treat), colistimethane (an antibiotic used to treat infections in patients hospitalized with other diseases), vancomycin (renal damage to other antibiotics and when administered at high doses for two weeks or more) Antibiotics used to treat infections that can cause cancer), nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), and aminoglycosides.

상기 시험물질은 신장 사구체 또는 세뇨관 손상을 억제하는 효과를 가질 것이라 예상되는 물질이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 세포 추출물, 세포배양 상층액, 미생물 배양산물, 추출물, 정제되거나 천연 상태의 단백질, 펩타이드, 화합물, 미세분자 합성화합물 및 천연화합물으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The test substance is not particularly limited as long as it is expected to have an effect of inhibiting renal glomeruli or tubule damage, for example, cell extracts, cell culture supernatants, microbial cultures, extracts, purified or natural proteins, peptides. It may be one or more selected from the group consisting of compounds, micromolecular synthetic compounds and natural compounds.

구체적으로, 본 발명의 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 억제하는 후보물질을 스크리닝하기 위한 방법은 (ⅰ) 저산소 또는 신장 독성을 갖는 약물의 존재 하에서, 신장 사구체 또는 세뇨관 세포에 시험물질을 처리한 후, (ⅱ) 상기 신장 사구체 또는 세뇨관 세포에서 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정한 다음, (ⅲ) 상기 측정된 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 정상 대조군과 비교하여, Sirt1은 증대되고, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3는 저하되는 경우 상기 시험물질을 신장 사구체 또는 세뇨관 손상을 방지하는 예방제 또는 치료하는 치료제로서 사용할 수 있을 것으로 판정할 수 있다. Specifically, the method for screening a candidate substance that inhibits renal glomeruli or tubular cell damage of the present invention comprises (i) treating the renal glomeruli or tubule cells with a test substance in the presence of a drug having hypoxic or renal toxicity, (Ii) measuring the levels of Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins in the renal glomeruli or tubule cells, and (iii) measuring the levels of Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins. Compared to normal controls, levels of Sirt1 are elevated and acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 are determined to be usable as prophylactic or therapeutic agents for preventing renal glomeruli or tubular damage can do.

다시말해, 저산소 혹은 신장 독성을 야기하는 약물을 처리하여, 신장 사구체 또는 세뇨관 세포에서 손상이 발생할 수 있는 조건일 때, 시험물질을 처리한 다음 상기 단백질의 수준을 측정한다. 단백질 수준의 비교를 위한 대조군은, 저산소 혹은 신장 독성을 야기하는 약물을 처리하여, 신장 사구체 또는 세뇨관 세포에서 손상이 발생할 수 있는 조건에서, 시험물질을 처리하지 않고, 상기 단백질의 수준을 측정한다. 이후 양자를 비교한다. 그 결과, 시험물질이 존재할 때, 상기 시험물질의 존재하지 않는 경우(대조군)보다 상기 Sirt1은 증대되고, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3는 저하되는 경우 상기 시험물질을 신장 사구체 또는 세뇨관 손상을 방지하는 예방제 또는 치료하는 치료제로서 사용할 수 있을 것으로 판정할 수 있다.
In other words, a drug that causes hypoxic or renal toxicity is treated to treat the test substance and then to measure the protein level when the condition may cause damage in renal glomeruli or tubule cells. Controls for comparison of protein levels are treated with drugs that cause hypoxic or renal toxicity, thereby measuring the level of the protein without treatment of the test substance under conditions where damage may occur in renal glomeruli or tubule cells. Then compare the two. As a result, when the test substance is present, the test substance is increased when Sirt1 is increased and acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 are lowered than when the test substance is not present (control). It can be determined that it can be used as a prophylactic agent for preventing or a therapeutic agent for treating.

상기에서 단백질의 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다. 상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 예를 들어, 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay: RIA), 방사선 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정분석법, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.The method for measuring the level of protein in the above may be carried out including a known process for separating proteins from biological samples using known techniques. The protein level may be measured using an antibody, in which case the marker protein in the biological sample and the antibody specific thereto form a conjugate, i.e., an antigen-antibody complex, and the amount of antigen-antibody complex formed is a detection label. Quantitative measurements can be made through the magnitude of the signal at the detection label. Such detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules, and radioisotopes, but are not limited thereto. Assays for measuring protein levels include, for example, Western blots, enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs), radioimmunoassays (RIAs), radioimmunodiffusions, immunoprecipitation assays, It can be any one selected from the group consisting of Oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, FACS and protein chip.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 시험물질이 존재하지 않은 대조군의 단백질의 양과 시험물질에 노출된 경우의 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 시험물질의 신장 사구체 또는 세뇨관 손상 예방 또는 치료효과를 예측할 수 있다.Therefore, the present invention can determine the amount of protein of the control group and the amount of protein when exposed to the test substance through the detection method as described above, by comparing the degree of the expression amount with the test substance Prevent or treat renal glomeruli or tubule damage

상기에서 단백질의 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다. 상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 예를 들어, 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay: RIA), 방사선 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정분석법, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
The method for measuring the level of protein in the above may be carried out including a known process for separating proteins from biological samples using known techniques. The protein level may be measured using an antibody, in which case the marker protein in the biological sample and the antibody specific thereto form a conjugate, i.e., an antigen-antibody complex, and the amount of antigen-antibody complex formed is a detection label. Quantitative measurements can be made through the magnitude of the signal at the detection label. Such detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules, and radioisotopes, but are not limited thereto. Assays for measuring protein levels include, for example, Western blots, enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs), radioimmunoassays (RIAs), radioimmunodiffusions, immunoprecipitation assays, It can be any one selected from the group consisting of Oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, FACS and protein chip.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and the like, but the scope and contents of the present invention are not limited or interpreted by the following examples. In addition, if it is based on the disclosure of the present invention including the following examples, it will be apparent that those skilled in the art can easily carry out the present invention, the results of which are not specifically presented experimental results, these modifications and modifications are attached to the patent It goes without saying that it belongs to the claims.

실험예 1. 신장 손상에 따른 진단마커 발굴Experimental Example 1. Discovery of diagnostic markers due to kidney damage

1) 연령에 따른 동물모델로부터 신장조직 분리1) Isolation of Kidney Tissues from Animal Models According to Age

수컷 5주령과 24월령의 생쥐를 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Ochang, Korea)로부터 구입하였다. 모든 생쥐는 항온(22~26 ℃), 항습(55~60%)이 되는 무균 시설에서 사육 및 보관하였고, 시설 조건은 12 시간의 명암주기를 유지하고, 일반 고형사료(Cargill Agri Purina, Gunsan, Korea)와 물을 자유롭게 충분히 공급하면서 1 주일 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 모든 실험은 순천향대학교 실험실 동물관리 및 윤리 규정에 따라 임상시험 관리위원회의 승인을 받은 후 시행하였다.Male 5 and 24 month old mice were purchased from Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Ochang, Korea). All mice were bred and stored in a sterile facility with constant temperature (22-26 ℃) and humidity (55-60%), and the conditions of the facility maintained a 12-hour contrast cycle and general solid feed (Cargill Agri Purina, Gunsan, Korea) and water were used for experiment after adapting for a week while supplying sufficient water freely. All experiments were conducted after approval from the Institutional Review Board in accordance with Soonchunhyang University Laboratory Animal Care and Ethics Regulations.

상기 생쥐를 절차에 따라 안락사한 후, 신장을 적출한 다음, 신장조직을 얻었다. 이의 대조군으로 5주령된 생쥐의 신장조직을 사용하였다.The mice were euthanized according to the procedure, kidneys were extracted, and kidney tissues were obtained. Kidney tissues of 5 week old mice were used as control.

2) 면역형광염색2) Immunofluorescence Staining

상기 생쥐로부터 분리한 신장 조직을 PBS 세척한 후, 면역형광염색을 실시하였다. 상기 면역형광염색은 파라핀-봉입 섹션(paraffin-embedded sections, 3 μm)을 사용하여 수행하였다. 10% 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 1시간 블로킹한 후, 상기 섹션을 항-HA(Cell Signaling), 항-HIF-1a(Novus Biologicals) 및 항-아세틸 리신(anti-acetyl lysine, Cell Signaling) 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 항체 염색은 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스(Alexa Fluor 488 goat anti-mouse) 또는 Alexa 568 염소 항-토끼(Alexa 568 goat anti-rabbit)로 시각화하였다. DAPI(Sigma-Aldrich)를 사용하여 10분 동안 세포 핵을 염색하였다. 슬라이드를 공촛점 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.Kidney tissues isolated from the mice were washed with PBS, followed by immunofluorescence staining. The immunofluorescence staining was performed using paraffin-embedded sections (3 μm). After 1 hour blocking with 10% normal goat serum, the sections were subjected to anti-HA (Cell Signaling), anti-HIF-1a (Novus Biologicals) and anti-acetyl lysine (Cell Signaling). ) Were incubated overnight at 4 ° C. with antibody. Antibody staining was visualized with Alexa Fluor 488 goat anti-mouse or Alexa 568 goat anti-rabbit. Cell nuclei were stained for 10 minutes using DAPI (Sigma-Aldrich). Slides were observed by confocal microscopy (LSM 700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).

3) 웨스턴블롯3) Western Blot

상기 분리한 신장조직 또는 HK2 세포주를 ATCC로부터 구입하여 사용하였다. 상기 조직 및 세포 용해물(cell lysates)을 표준 절차를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. Membranes는 콜라겐 I/IV(Southern Biotech, Birmingham, AL), fibronectin(Abcam, 영국 캠브리지), Sirt1(Danvers, MA, 미국), Bnip3(Abcam), HIF-1α(Cell Signaling), cleaved-caspase 3(Cell Signaling), cleaved PARP(Cell Signaling), mitochondrial complexes I, III, IV(Abcam) 및 β-액틴(Sigma-Aldrich)에 대한 항체로 이어지는 적절한 2차 항체로 면역블롯팅을 수행하였다.
The isolated kidney tissue or HK2 cell line was purchased from ATCC and used. The tissue and cell lysates were subjected to Western blot analysis using standard procedures. Membranes include collagen I / IV (Southern Biotech, Birmingham, AL), fibronectin (Abcam, Cambridge, UK), Sirt1 (Danvers, MA, USA), Bnip3 (Abcam), HIF-1α (Cell Signaling), cleaved-caspase 3 ( Immunblotting was performed with appropriate secondary antibodies leading to cell signaling, cleaved PARP (Cell Signaling), mitochondrial complexes I, III, IV (Abcam) and β-actin (Sigma-Aldrich).

도 1a, c는 노화 생쥐와 젊은 생쥐로부터 회수된 신장조직에서의 Sirt1, BNIP3 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진(a)과 이로부터 계산된 Sirt1, BNIP3의 Fold change 그래프(c)이다. *P<0.05. 도 1b는 노화 생쥐와 젊은 생쥐로부터 회수된 신장조직에서의 HIF-1α의 아세틸화 수준을 면역염색으로 특정하여 나타낸 형광 현미경 사진이다.1a and c are photographs showing Sirt1 and BNIP3 protein expression levels in renal tissue recovered from aging mice and young mice by Western blot, and Fold change graphs of Sirt1 and BNIP3 calculated therefrom. (c). * P <0.05. Figure 1b is a fluorescence micrograph showing the immunostaining of the acetylation level of HIF-1α in renal tissue recovered from aging mice and young mice.

도 1에 나타난 바와 같이 24월령의 노화 생쥐는 6주령의 대조군에 비해 신장조직에서 Sirt1 발현이 감소되었음을 확인하였다. Sirt1의 감소에 의해, HIF-1α의 아세틸화가 증가되어 있는 것을 확인하였다. Sirt1 단백질 발현 수준이 감소된 노화 신장 조직에서는 HIF-1α가 대부분 아세틸화된 형태임을 알 수 있고, HIF-1α에 의하여 BNIP3 단백질 발현이 증가되었음을 확인하였다.As shown in FIG. 1, aging mice of 24 months of age were confirmed to have reduced Sirt1 expression in renal tissue compared with 6-week-old controls. It was confirmed that acetylation of HIF-1α was increased by decreasing Sirt1. In senescent kidney tissues with reduced Sirt1 protein expression levels, HIF-1α was found to be the most acetylated form, and it was confirmed that BNIP3 protein expression was increased by HIF-1α.

결론적으로, 노화되어 세포가 손상된 신장조직에서는 일반 신장 조직과는 달리 Sirt1 발현이 감소하였고, HIF-1α 아세틸화와 활성은 증가되는 것을 알 수 있다. 따라서 신장에서의 세포의 손상을 진단할 수 있는 진단 마커 후보로서 Sirt1, HIF-1α 단백질의 가능성을 검증하였다.
In conclusion, unlike normal kidney tissues, Sirt1 expression was decreased and HIF-1α acetylation and activity were increased in renal tissues damaged by aging cells. Therefore, the possibility of Sirt1 and HIF-1α proteins as a diagnostic marker candidate for diagnosing cell damage in the kidney was verified.

실험예 2: 신장 세뇨관 손상에 있어서, Sirt1 단백질 발현의 영향-1Experimental Example 2: Effect of Sirt1 Protein Expression on Renal Tubular Injury-1

1) 세포배양1) Cell Culture

사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)는 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 세포는 5 ng/ml recombinant epidermal growth factor와 0.05 mg/ml bovine pituitary extract가 함유된 keratinocyte-SFM 배지를 사용하여 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 세포가 배양용기를 채웠을 때 Sirtinol 10 μM을 처리하여 1 시간 동안 반응한 후, caspase3, PARP, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅳ단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯 방법을 사용하여 분석하였다. 대조군(control)으로 Sirtinol을 처리하지 않은 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)를 사용하였다.Human renal tubule epithelial cells (HK-2) were purchased from ATCC. Cells were cultured in a 37 ℃ cell culture using keratinocyte-SFM medium containing 5 ng / ml recombinant epidermal growth factor and 0.05 mg / ml bovine pituitary extract. When the cells were filled with the culture vessel, the cells were treated with Sirtinol 10 μM for 1 hour, and then caspase3, PARP, Collagen I, and Collagen IV protein expression levels were analyzed using Western blot. As a control, human renal tubule epithelial cells (HK-2) not treated with Sirtinol were used.

2) 웨스턴 블롯2) Western blot

American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 HK2 세포를 구입하였다. 구입한 HK2 세포를 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 이때, 배지는 10% FBS(LifeTechnologies)가 함유된 F12 배지(LifeTechnologies)와 DMEM(Lifetechnologies, Carlsbad, NY, USA) 배지가 1:1(v/v)로 혼합된 것을 사용하였다. 컨플루언스 세포(confluent cells) 상태에 도달하였을 때, 배지를 혈청이 없는 배지로 교체하고, 24 시간 동안 더 배양하여 세포주기를 정지시키고 일치시켰다.HK2 cells were purchased from the American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). The purchased HK2 cells were incubated at 5% CO 2, 37 ° C. In this case, the medium used was a mixture of F12 medium (LifeTechnologies) containing 10% FBS (LifeTechnologies) and DMEM (Lifetechnologies, Carlsbad, NY, USA) medium at 1: 1 (v / v). When confluent cells were reached, the medium was replaced with serum-free medium and incubated for another 24 hours to stop and match the cell cycle.

이후, 상기 세포를 5% CO₂/1% O_{2 ,} 94% N₂(v/v)를 함유한 BDGAS-PAKEZ 호기성 파우치(BD, Sparks, MD, USA)를 사용하여 무산소실에서의, 저산소 조건으로 배양하였다. 일부 실험의 경우 세포를 미리 처리하거나 지정된 기간 동안 resveratrol(10 mM, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 또는 sirtinol(10 mM, Sigma-Aldrich)으로 처리하였다.The cells were then hypoxic, in anoxia, using BDGAS-PAKEZ aerobic pouch (BD, Sparks, MD, USA) containing 5% CO ₂ /1% O _{2 ,} 94% N ₂ (v / v). Cultured under conditions. For some experiments, cells were either pretreated or treated with resveratrol (10 mM, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) or sirtinol (10 mM, Sigma-Aldrich) for a designated period of time.

상기 조직 및 세포 용해물(cell lysates)을 표준 절차를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. Membranes는 콜라겐 I/IV(Southern Biotech, Birmingham, AL), fibronectin(Abcam, 영국 캠브리지), Sirt1(Danvers, MA, 미국), Bnip3(Abcam), HIF-1α(Cell Signaling), cleaved-caspase 3(Cell Signaling), cleaved PARP(Cell Signaling), mitochondrial complexes I, III, IV(Abcam) 및 β-액틴(Sigma-Aldrich)에 대한 항체로 이어지는 적절한 2차 항체로 면역블롯팅을 수행하였다.
The tissue and cell lysates were subjected to Western blot analysis using standard procedures. Membranes include collagen I / IV (Southern Biotech, Birmingham, AL), fibronectin (Abcam, Cambridge, UK), Sirt1 (Danvers, MA, USA), Bnip3 (Abcam), HIF-1α (Cell Signaling), cleaved-caspase 3 ( Immunblotting was performed with appropriate secondary antibodies leading to cell signaling, cleaved PARP (Cell Signaling), mitochondrial complexes I, III, IV (Abcam) and β-actin (Sigma-Aldrich).

도 2는 Sirtinol을 처리한 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)에서 Cleaved caspase3(a), cleaved PARP(b), Collagen Ⅰ(c), Collagen Ⅳ(d) 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진(상단)과 이로부터 계산된 Cleaved caspase3(a), cleaved PARP(b), Collagen Ⅰ(c), Collagen Ⅳ(d)의 Fold change 그래프(하단)이다.2 is a Western blot for expression levels of cleaved caspase3 (a), cleaved PARP (b), Collagen I (c), and Collagen IV (d) proteins in Sirtinol-treated human renal tubule epithelial cells (HK-2). ) Is a picture (top) and the Fold change graph (bottom) of Cleaved caspase3 (a), cleaved PARP (b), Collagen I (c) and Collagen IV (d).

도 2에 나타난 바와 같이 HK-2 신장 세뇨관 세포주에 sirtinol 10 μM을 처리하여 Sirt1을 억제하면, 세포사멸과 세포외기질 합성이 증가하여 신장 세뇨관 세포가 손상됨을 확인할 수 있다.
As shown in FIG. 2, when Sirt1 was inhibited by treating sirtinol 10 μM in the HK-2 renal tubule cell line, the cell death and extracellular matrix synthesis were increased to confirm that the renal tubule cells were damaged.

실험예 3: 신장 세뇨관 손상에 있어서, Sirt1 단백질 발현의 영향-2Experimental Example 3: Effect of Sirt1 Protein Expression on Renal Tubular Injury-2

Sirt1 단백질의 존재 유무에 따른 신장 세뇨관 세포의 세포사멸 정도를 분석하고자, Sirt1 유전자를 siRNA 넉다운(knockdown) 방법으로 감소시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 Sirt1 단백질의 발현량 감소와 이를 통해 다른 단백질 발현량 변화를 확인하였다.To analyze the degree of apoptosis of renal tubule cells in the presence or absence of Sirt1 protein, the Sirt1 gene was reduced by siRNA knockdown method, and Western blot decreased the expression level of Sirt1 protein and changed the expression level of other protein. Confirmed.

상기 실험은 다음과 같이 수행하였다. 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)를 60 ㎜ 플레이트에 웰 당 1×10⁵ 개씩 5 ng/ml recombinant epidermal growth factor와 0.05 mg/ml bovine pituitary extract가 함유된 keratinocyte-SFM 배지를 사용하여 37℃에서 24 시간 배양하고, Sirt1 siRNA를 세포 내 유입시켜 48시간동안 37 ℃에서 넉다운(knockdown) 시킨 후, 고속 원심분리기를 이용해 단백질을 추출하여 세포들 당 30 ㎍의 단백질을 웨스턴 블롯법으로 전기영동하여 단백질을 분리한 다음, PVDF 막에 트랜스퍼하여 cleaved caspase3, cleaved PARP, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅳ 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 4℃에서 12시간 반응 후 15분간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척 후 2차 항체를 5% skim milk에 각 1:2000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고 15분 간 3번씩 TBS-T 버퍼로 세척하여 ECL 버퍼를 이용하여 PDVF 막의 발광을 유도하여 X-ray 필름을 이용하여 각 항체에 대한 단백질의 발현 정도를 관찰하였다.The experiment was performed as follows. Human renal tubule epithelial cells (HK-2) were treated at 37 ° C using keratinocyte-SFM medium containing 5 ng / ml recombinant epidermal growth factor and 0.05 mg / ml bovine pituitary extract at 60 mm plates, 1 × 10 ⁵ per well. Incubated for 24 hours, Sirt1 siRNA was introduced into cells, knocked down at 37 ° C. for 48 hours, protein was extracted using a high-speed centrifuge, and electrophoresis of 30 μg of protein per cell was performed by Western blotting. Proteins were separated and transferred to PVDF membranes, whereby cleaved caspase3, cleaved PARP, Collagen I, and Collagen IV antibodies were diluted 1: 2000 in 5% skim milk at 12 ° C for 12 hours, followed by TBS- After washing with T buffer, the secondary antibody was diluted in a ratio of 1: 2000 in 5% skim milk, and reacted at room temperature for 2 hours, washed with TBS-T buffer for 15 minutes three times to induce luminescence of PDVF membrane using ECL buffer. Using X-ray film The degree of expression of the protein for each antibody was observed.

상기 분리한 신장조직 또는 HK2 세포주를 ATCC로부터 구입하여 사용하였다. 상기 조직 및 세포 용해물(cell lysates)을 표준 절차를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. Membranes는 콜라겐 I/IV(Southern Biotech, Birmingham, AL), fibronectin(Abcam, 영국 캠브리지), Sirt1(Danvers, MA, 미국), Bnip3(Abcam), HIF-1α(Cell Signaling), cleaved-caspase 3(Cell Signaling), cleaved PARP(Cell Signaling), mitochondrial complexes I, III, IV(Abcam) 및 β-액틴(Sigma-Aldrich)에 대한 항체로 이어지는 적절한 2차 항체로 면역블롯팅을 수행하였다.
The isolated kidney tissue or HK2 cell line was purchased from ATCC and used. The tissue and cell lysates were subjected to Western blot analysis using standard procedures. Membranes include collagen I / IV (Southern Biotech, Birmingham, AL), fibronectin (Abcam, Cambridge, UK), Sirt1 (Danvers, MA, USA), Bnip3 (Abcam), HIF-1α (Cell Signaling), cleaved-caspase 3 ( Immunblotting was performed with appropriate secondary antibodies leading to cell signaling, cleaved PARP (Cell Signaling), mitochondrial complexes I, III, IV (Abcam) and β-actin (Sigma-Aldrich).

도 3은 Scramble siRNA 또는 Sirt1 siRNA 처리된 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)에서 Sirt1(a), Cleaved caspase3(b), cleaved PARP(c), Collagen Ⅰ(d), Collagen Ⅳ(e) 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진(상단)과 이로부터 계산된 Sirt1(a), Cleaved caspase3(b), cleaved PARP(c), Collagen Ⅰ(d), Collagen Ⅳ(e)의 Fold change 그래프(하단)이다.Figure 3 shows Sirt1 (a), Cleaved caspase3 (b), cleaved PARP (c), Collagen I (d), Collagen IV (e) proteins in human renal tubular epithelial cells (HK-2) treated with Scramble siRNA or Sirt1 siRNA Picture (top) showing expression level measured by Western blot and calculated from Sirt1 (a), Cleaved caspase3 (b), cleaved PARP (c), Collagen I (d), Collagen IV (e) Fold change graph at the bottom.

도 2에 나타난 바와 같이 HK2 신장 세뇨관 세포주에서 sirt1에 대한 siRNA를 이용하여 Sirt1을 억제하였을 때 sirtinol과 유사하게 세포사멸과 세포외기질 합성이 증가하여 손상됨.
As shown in FIG. 2, the inhibition of Sirt1 using siRNA against sirt1 in the HK2 renal tubule cell line results in increased cell death and extracellular matrix synthesis similar to sirtinol.

실험예 4: 신장 세뇨관 손상에 있어서, Sirt1 단백질 발현의 영향-2Experimental Example 4: Effect of Sirt1 Protein Expression on Renal Tubular Injury-2

1) Sirt1 과발현 HK-2 세포주(Sirt1 OE) 제작 및 배양1) Preparation and culture of Sirt1 overexpressing HK-2 cell line (Sirt1 OE)

- 벡터 설계-Vector design

일시적인 형질 감염을 위해, 하위융합(subconfluent) 세포는 Trans IT 2020(Mirus Bio LLC, Madison, WI)를 사용한 pECE-flag-Sirt1(Addgene, Cambridge, MA, USA), pECE empty vector(Addgene), HA-HIF-1a-wt-pcDNA3, HA-HIF-1-K709R-pcDNA3, pGL2-hypoxia responsive element(HRE) 플라스미드(Addgene)로 구성된 플라스미드 2 ㎍으로 제조사의 지침에 따라 처리하였다. 루시퍼라제 분석을 위해, 이중 루시퍼라제 분석키트(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 HRE 용 pGL2 루시퍼라제 리포터 벡터(Addgene)를 반딧불이(Firefly) 및 Gaussia 루시퍼라제 대조군 플라스미드로 동시 형질 감염시켰다. 루시퍼라제 활성은 루미노미터(luminometer)를 사용하여 측정하였다.For transient transfection, subconfluent cells were transferred to pECE-flag-Sirt1 (Addgene, Cambridge, MA, USA), pECE empty vector (Addgene), HA using Trans IT 2020 (Mirus Bio LLC, Madison, Wis.). 2 μg of plasmid consisting of -HIF-1a-wt-pcDNA3, HA-HIF-1-K709R-pcDNA3, pGL2-hypoxia responsive element (HRE) plasmid (Addgene) was treated according to the manufacturer's instructions. For the luciferase assay, a double luciferase assay kit (Thermo Scientific, Rockford, Ill., USA) was used to co-transfect the pGL2 luciferase reporter vector (Addgene) for HRE with Firefly and Gaussia luciferase control plasmids. . Luciferase activity was measured using a luminometer.

2) 웨스턴 블롯2) Western blot

상기 실험은 다음과 같이 수행하였다. Empty Vector로 형질감염된 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2) 또는 Sirt1 과발현 HK-2 세포주(Sirt1 OE) 를 준비하였다. 상기 세포 용해물(cell lysates)을 표준 절차를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. Membranes는 콜라겐 I/IV(Southern Biotech, Birmingham, AL), fibronectin(Abcam, 영국 캠브리지), Sirt1(Danvers, MA, 미국), Bnip3(Abcam), HIF-1α(Cell Signaling), cleaved-caspase 3(Cell Signaling), cleaved PARP(Cell Signaling), mitochondrial complexes I, III, IV(Abcam) 및 β-액틴(Sigma-Aldrich)에 대한 항체로 이어지는 적절한 2차 항체로 면역블롯팅을 수행하였다.
The experiment was performed as follows. Human renal tubule epithelial cells (HK-2) or Sirt1 overexpressing HK-2 cell line (Sirt1 OE) transfected with Empty Vector were prepared. The cell lysates were subjected to Western blot analysis using standard procedures. Membranes include collagen I / IV (Southern Biotech, Birmingham, AL), fibronectin (Abcam, Cambridge, UK), Sirt1 (Danvers, MA, USA), Bnip3 (Abcam), HIF-1α (Cell Signaling), cleaved-caspase 3 ( Immunblotting was performed with appropriate secondary antibodies leading to cell signaling, cleaved PARP (Cell Signaling), mitochondrial complexes I, III, IV (Abcam) and β-actin (Sigma-Aldrich).

도 4는 Empty Vector로 형질감염된 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)와 Sirt1 과발현 사람 신세뇨관 상피세포(Sirt1 OE)에서 Sirt1, Cleaved PARP, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅳ 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진이다. 이에 따르면 sirt1가 과발현되도록 재조합된 사람 신세뇨관 상피세포에서는 Cleaved PARP, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅳ의 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 즉, Sirt1 단백질 발현이 증가할 경우, Empty Vector로 형질감염된 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)와 달리 세포사멸과 세포외기질 합성이 억제되므로 세포 손상이 줄어듬을 확인하였다. 다시 말해. 세뇨관 세포에서 sirt1 단백질의 발현이 증가하면 세포손상을 억제하여 보호하는 효과가 있음을 알 수 있다.
4 shows Western blot expression levels of Sirt1, Cleaved PARP, Collagen I and Collagen IV proteins in human renal tubule epithelial cells (HK-2) and Sirt1 overexpressing human renal tubule epithelial cells (Sirt1 OE) transfected with Empty Vector. It is a photograph measured by). According to the results, it was confirmed that cleaved PARP, Collagen I and Collagen IV expression was suppressed in human renal tubule epithelial cells recombined to overexpress sirt1. In other words, when the expression of Sirt1 protein is increased, cell damage is reduced since cell death and extracellular matrix synthesis are inhibited unlike human renal tubule epithelial cells (HK-2) transfected with Empty Vector. In other words. Increasing the expression of sirt1 protein in tubule cells has been shown to be effective in inhibiting and protecting cell damage.

실험예 5: 저산소 조건에서 HK-2 손상에 따른 단백질 발현 변화 검증Experimental Example 5: Verification of protein expression change by HK-2 damage in hypoxic condition

1) 저산소에 의해 손상된 HK-2 세포 배양1) HK-2 cell culture damaged by hypoxia

사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)는 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 세포는 5 ng/ml recombinant epidermal growth factor와 0.05 mg/ml bovine pituitary extract가 함유된 keratinocyte-SFM 배지를 사용하여 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 세포가 배양용기를 채웠을 때 저산소환경에 노출하여 24시간 동안 반응시킨 후 단백질 발현을 분석하였다. 저산소 상태는 저산소 상태를 유지하는 주머니(Gaspak pouch system, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)를 사용하여 1% 산소 환경으로 유지하였다. 이의 대조군(control)으로 저산소 환경이 아닌 일반적인 배양조건으로 배양한 세포를 사용하였다(Hypoxia -로 표기)Human renal tubule epithelial cells (HK-2) were purchased from ATCC. Cells were cultured in a 37 ℃ cell culture using keratinocyte-SFM medium containing 5 ng / ml recombinant epidermal growth factor and 0.05 mg / ml bovine pituitary extract. When the cells were filled with a culture vessel, the cells were exposed to hypoxic environment and reacted for 24 hours, and then protein expression was analyzed. The hypoxic state was maintained in a 1% oxygen environment using a bag that maintained a hypoxic state (Gaspak pouch system, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA). As a control thereof, cells cultured under general culture conditions, not in a hypoxic environment, were used (denoted as Hypoxia).

2) 웨스턴 블롯2) Western blot

상기 실험은 다음과 같이 수행하였다. 일반(Hypoxia -) 또는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포주를 준비하였다. 상기 세포 용해물(cell lysates)을 표준 절차를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. Membranes는 콜라겐 I/IV(Southern Biotech, Birmingham, AL), fibronectin(Abcam, 영국 캠브리지), Sirt1(Danvers, MA, 미국), Bnip3(Abcam), HIF-1α(Cell Signaling), cleaved-caspase 3(Cell Signaling), cleaved PARP(Cell Signaling), mitochondrial complexes I, III, IV(Abcam) 및 β-액틴(Sigma-Aldrich)에 대한 항체로 이어지는 적절한 2차 항체로 면역블롯팅을 수행하였다.The experiment was performed as follows. HK-2 cell lines cultured in normal (Hypoxia −) or hypoxic environment (Hypoxia +) were prepared. The cell lysates were subjected to Western blot analysis using standard procedures. Membranes include collagen I / IV (Southern Biotech, Birmingham, AL), fibronectin (Abcam, Cambridge, UK), Sirt1 (Danvers, MA, USA), Bnip3 (Abcam), HIF-1α (Cell Signaling), cleaved-caspase 3 ( Immunblotting was performed with appropriate secondary antibodies leading to cell signaling, cleaved PARP (Cell Signaling), mitochondrial complexes I, III, IV (Abcam) and β-actin (Sigma-Aldrich).

3) 면역침전 및 면역블롯팅 분석3) Immunoprecipitation and Immunoblotting Analysis

총 단백질 약 1 ㎎을 항-Sirt1 항체(Cell Signaling) 또는 항-HIF-1a 항체(Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)를 사용하여 4 ℃에서 밤새 배양한 다음 protein A/G-Plus-agarose(Santa Cruz, Dallas, Texas, USA) 20 mL에서 4 시간동안 4 ℃에서 침전시켰다. 상기 침전된 복합물을 항 HIF-1a(Novus Biologicals) 또는 항-아세틸 리신(Cell Signaling)으로 면역침전시켰다.
Approximately 1 mg of total protein was incubated overnight at 4 ° C. using anti-Sirt1 antibody (Cell Signaling) or anti-HIF-1a antibody (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), followed by protein A / G-Plus-agarose ( Santa Cruz, Dallas, Texas, USA) was precipitated at 4 ° C for 4 hours in 20 mL. The precipitated complex was immunoprecipitated with anti-HIF-1a (Novus Biologicals) or anti-acetyl lysine (Cell Signaling).

도 5a는 일반(Hypoxia -) 또는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포주의 HIF-1α, Cleaved PARP, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅳ 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진이고, 도 5b는 일반(Hypoxia -) 또는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포주의 Sirt1 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진(상단)과 이로부터 계산된 Sirt1의 Fold change 그래프(하단)이다.Figure 5a is a photograph showing the measurement of the expression level of HIF-1α, Cleaved PARP, Collagen I, Collagen IV protein HK-2 cell line cultured in a normal (Hypoxia-) or hypoxia (Hypoxia +) by Western blot 5B is a photograph (top) and Sirt1 calculated from Western blot of Sirt1 protein expression levels of HK-2 cell lines cultured in a normal (Hypoxia −) or hypoxia environment (Hypoxia +). Fold change graph at the bottom.

도 5c는 일반(Hypoxia -) 또는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포주의 Sirt1, HIF-1α 상호작용을 확인하고자, 면역침강 및 면역블롯팅으로 분석한 결과이다.Figure 5c is a result of analysis by immunoprecipitation and immunoblotting to confirm the Sirt1, HIF-1α interaction of HK-2 cell line cultured in a normal (Hypoxia-) or hypoxia (Hypoxia +).

도 5에 나타난 바와 같이, 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)를 1% 산소, 즉 저산소환경에 노출할 경우, HIF-1α 단백질 발현이 증가하면서 세포사멸과 세포외기질 합성이 증가되어 세포가 손상됨을 알 수 있다. 이때 Sirt1 단백질 발현도 감소되나, HIF-1α 단백질 발현이 증가하게 되므로, HIF-1α와 Sirt1의 상호작용이 증가하고 있음을 확인하였다. 결과적으로 일반적인 산소 농도에서는 관찰되지 않던 세포의 HIF-1α와 Sirt1 단백질의 상호작용이 저산소 환경에서 발견되었기 때문에, 저산소 상황에서 Sirt1 저하되고, HIF-1α의 발현이 증가하고, Sirt1과 HIF-1α 상호작용을 형성한다는 것을 확인하였다.
As shown in FIG. 5, when human renal tubule epithelial cells (HK-2) are exposed to 1% oxygen, that is, a hypoxic environment, HIF-1α protein expression is increased while cell death and extracellular matrix synthesis are increased. It can be seen that it is damaged. In this case, Sirt1 protein expression was also reduced, but since HIF-1α protein expression was increased, it was confirmed that the interaction between HIF-1α and Sirt1 was increased. As a result, the HIF-1α and Sirt1 protein interactions in the cells, which were not observed at normal oxygen concentrations, were found in a hypoxic environment, resulting in Sirt1 degradation, increased expression of HIF-1α, and Sirt1 and HIF-1α interactions in hypoxic conditions. It was confirmed that it forms an action.

실험예 6: Sirt1 단백질과 HIF-1α의 상호작용 검증Experimental Example 6: Validation of Sirt1 protein interaction with HIF-1α

1) 저산소에 의해 손상된 HK-2 세포 배양1) HK-2 cell culture damaged by hypoxia

사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)는 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 세포는 5 ng/ml recombinant epidermal growth factor와 0.05 mg/ml bovine pituitary extract가 함유된 keratinocyte-SFM 배지를 사용하여 37 ℃ 세포배양기에서 배양하였다. 세포가 배양용기를 채웠을 때 저산소 환경에 노출하여 24시간 동안 반응시킨 후 단백질 발현을 분석하였다. 저산소 상태는 저산소 상태를 유지하는 주머니(Gaspak pouch system, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)를 사용하여 1% 산소 환경으로 유지하였다. 이의 대조군(control)으로 저산소 환경이 아닌 일반적인 배양조건으로 배양한 세포를 사용하였다(Hypoxia -로 표기)Human renal tubule epithelial cells (HK-2) were purchased from ATCC. Cells were cultured in a 37 ℃ cell culture using keratinocyte-SFM medium containing 5 ng / ml recombinant epidermal growth factor and 0.05 mg / ml bovine pituitary extract. When the cells were filled with the culture vessel, the reaction was performed for 24 hours after exposure to a hypoxic environment, and the protein expression was analyzed. The hypoxic state was maintained in a 1% oxygen environment using a bag that maintained a hypoxic state (Gaspak pouch system, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA). As a control thereof, cells cultured under general culture conditions, not in a hypoxic environment, were used (denoted as Hypoxia).

2) 면역침전 및 면역블롯팅 분석2) Immunoprecipitation and Immunoblotting Analysis

총 단백질 약 1 ㎎을 항-Sirt1 항체(Cell Signaling) 또는 항-HIF-1a 항체(Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)를 사용하여 4 ℃에서 밤새 배양한 다음 protein A/G-Plus-agarose(Santa Cruz, Dallas, Texas, USA) 20 mL에서 4 시간동안 4 ℃에서 침전시켰다. 상기 침전된 복합물을 항 HIF-1a(Novus Biologicals) 또는 항-아세틸 리신(Cell Signaling)으로 면역침전시켰다.Approximately 1 mg of total protein was incubated overnight at 4 ° C. using anti-Sirt1 antibody (Cell Signaling) or anti-HIF-1a antibody (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), followed by protein A / G-Plus-agarose ( Santa Cruz, Dallas, Texas, USA) was precipitated at 4 ° C for 4 hours in 20 mL. The precipitated complex was immunoprecipitated with anti-HIF-1a (Novus Biologicals) or anti-acetyl lysine (Cell Signaling).

3) 리포터 어세이(reporter assay)3) reporter assay

일시적인 형질 감염을 위해, 하위융합(subconfluent) 세포는 Trans IT 2020(Mirus Bio LLC, Madison, WI)를 사용한 pECE-flag-Sirt1(Addgene, Cambridge, MA, USA), pECE empty vector(Addgene), HA-HIF-1a-wt-pcDNA3, HA-HIF-1-K709R-pcDNA3, pGL2-hypoxia responsive element(HRE) 플라스미드(Addgene)로 구성된 플라스미드 2 ㎍으로 제조사의 지침에 따라 처리하였다. 루시퍼라제 분석을 위해, 이중 루시퍼라제 분석키트(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 HRE 용 pGL2 루시퍼라제 리포터 벡터(Addgene)를 반딧불이(Firefly) 및 Gaussia 루시퍼라제 대조군 플라스미드로 동시 형질 감염시켰다. 루시퍼라제 활성은 루미노미터(luminometer)를 사용하여 측정하였다.
For transient transfection, subconfluent cells were transferred to pECE-flag-Sirt1 (Addgene, Cambridge, MA, USA), pECE empty vector (Addgene), HA using Trans IT 2020 (Mirus Bio LLC, Madison, Wis.). 2 μg of plasmid consisting of -HIF-1a-wt-pcDNA3, HA-HIF-1-K709R-pcDNA3, pGL2-hypoxia responsive element (HRE) plasmid (Addgene) was treated according to the manufacturer's instructions. For the luciferase assay, a double luciferase assay kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) was used to co-transfect the pGL2 luciferase reporter vector (Addgene) for HRE with Firefly and Gaussia luciferase control plasmids. . Luciferase activity was measured using a luminometer.

도 6a는 일반(Hypoxia -) 또는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포주의 HIF-1α로 면역침강 분석법을 수행한 뒤(IP), 아세틸화된 HIF-1α를 분별하기 위하여 Acetyl-lysine을 이용해서 면역블롯(IB)을 수행한 결과이고, 도 6b는 HRE 루시퍼라아제 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. HRE는 HIF-1 responsive element를 의미한다. 도 6c, d는 일반(Hypoxia -) 또는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포주의 CA6, BNIP3 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하여 나타낸 그래프이다(실험과정은 실험예 5-2 참조).Figure 6a shows that after performing immunoprecipitation assay with HIF-1α HK-2 cell line cultured in a normal (Hypoxia-) or hypoxia (Hypoxia +) (IP), Acetyl- in order to fractionate acetylated HIF-1α Immunoblot (IB) was performed using lysine, and FIG. 6B is a graph showing the measurement of HRE luciferase activity. HRE stands for HIF-1 responsive element. 6c and d are graphs showing Western blot measurement of CA6 and BNIP3 protein expression levels of HK-2 cell lines cultured under normal (Hypoxia −) or hypoxia (Hypoxia +) (see Experimental Example 5-2 for experimental procedures). ).

도 6에 나타난 바와 같이, HIF-1α의 아세틸화가 증가하고 있음을 확인하였다. 또한, HIF-1의 아세틸화가 증가할수록 HIF-1의 활성을 증가시켜 전사활성이 증가되고, CA9, Bnip3의 전사가 증가되는 것을 확인하였다, 결론적으로 저산소환경과 같이, 외부적인 요인으로 Sirt1 단백질의 저하가 발생하면, HIF-1 단백질의 아세틸화가 증가하게 되고, CA9, Bnip3의 전사가 증가되며, 세포사멸, 세포외 기질합성이 증가하여 세포가 손상되고 있음을 다시금 확인하였다.
As shown in Figure 6, it was confirmed that the acetylation of HIF-1α is increasing. In addition, as the acetylation of HIF-1 increases, the transcriptional activity is increased by increasing HIF-1 activity, and the transcription of CA9 and Bnip3 is increased. When the degradation occurs, the acetylation of HIF-1 protein is increased, the transcription of CA9, Bnip3 is increased, cell death, extracellular matrix synthesis is increased to confirm that the cells are damaged.

실험예 7: 도출한 진단마커 Sirt1의 가능성 검증Experimental Example 7: Validation of the derived diagnostic marker Sirt1

종래 알려진 후보물질 중에서, 레스베라트롤을 저산소에 의해 손상된 세포에 처리하였을 때, 세포의 손상이 회복되거나 예방되는 치료제인지 검증에 Sirt1, HIF-1α, CA9, BNIP3 단백질이 효과적인지를 확인하고자 하였다. 저산소에 의해 손상된 HK-2 세포에 레스베라트롤을 처리하였을 때, Sirt1, HIF-1α의 아세틸화와 발현 변화를 관찰하고, 이어 CA9, BNIP3 단백질 발현을 관찰하였다. 이들 전반적인 실험과정은 저산소에 의해 손상된 HK-2 세포에 레스베라트롤(resveratrol)을 10 mM 처리하였고, 대조군은 레스베라트롤을 처리하지 않은 저산소에 의해 손상된 HK-2 세포를 사용하고 있다는 점을 제외하고는 실험예 6에 언급된 바와 같이 수행하였다.
Among the known candidates, when resveratrol was treated to cells damaged by hypoxia, it was intended to confirm whether Sirt1, HIF-1α, CA9, and BNIP3 proteins are effective in verifying whether the treatment of cells is repaired or prevented. When resveratrol was treated to hypoxia-injured HK-2 cells, acetylation and expression changes of Sirt1 and HIF-1α were observed, followed by expression of CA9 and BNIP3 proteins. The overall experimental procedure was performed except that 10 mM of resveratrol was treated to HK-2 cells damaged by hypoxia and the control group was using HK-2 cells damaged by hypoxia not treated with resveratrol. It was carried out as mentioned in 6.

도 7a는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포에 레스베라트롤(resveratrol +)을 첨가하거나, 첨가하지 않은 뒤(resveratrol -), 이의 HIF-1α로 면역침강 분석법을 수행하였고(IP), 다음으로 아세틸화된 HIF-1α를 분별하기 위하여 Acetyl-lysine을 이용해서 면역블롯(IB)을 수행한 결과 그래프이다. 도 7b는 HRE 루시퍼라아제 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. HRE는 HIF-1 responsive element를 의미한다. 도 7c, d는 저산소 환경(Hypoxia +)하에서 배양한 HK-2 세포에 레스베라트롤(resveratrol +)을 첨가하거나, 첨가하지 않은(resveratrol -) 후, CA6, BNIP3 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하여 나타낸 그래프이다.FIG. 7A shows that the HK-2 cells cultured in a hypoxic environment (Hypoxia +) were added with or without resveratrol + (resveratrol −), and immunoprecipitation assays were performed with their HIF-1α (IP). Next, an immunoblot (IB) was performed using Acetyl-lysine to fractionate acetylated HIF-1α. 7B is a graph showing the measurement of HRE luciferase activity. HRE stands for HIF-1 responsive element. Figure 7c, d is a Western blot measured by measuring the CA6, BNIP3 protein expression level after the addition of resveratrol (+), or without (resveratrol-) to HK-2 cells cultured in a hypoxic environment (Hypoxia +) It is a graph.

도 7은 저산소환경에서 레스베라트롤(resveratrol)을 이용하여 Sirt1의 활성을 증가시켰을 때, 저산소환경에 의해 세포 손상을 억제하고, 회복하는 것을 확인하였다. 구체적으로 Sirt1 단백질 발현이 증가하고, HIF-1α의 전사활성이 증가할 경우, 이어 CA9, BNIP3 단백질의 전사도 증가하게 됨을 확인한 바, 본 실험을 통해 레스베라트롤은 세포 손상이 억제될뿐만 아니라 회복효과도 갖는 치료 물질일 것이라 판단할 수 있었다.7 shows that when the activity of Sirt1 is increased by using resveratrol in a low oxygen environment, cell damage is suppressed and restored by the low oxygen environment. Specifically, when Sirt1 protein expression was increased and HIF-1α transcription activity was increased, it was confirmed that the transcription of CA9 and BNIP3 proteins was also increased. Through this experiment, resveratrol not only inhibited cell damage but also repair effect. It could be judged that it is a therapeutic substance having.

즉, Sirt1, HIF-1 탈아세틸화를 유도하는 물질이라면 HIF-1 활성을 감소시켜, CA9, BNIP3의 단백질 발현을 억제할 수 있고, 따라서 신장 세뇨관 세포 손상에 효과적으로 작용할 것임을 확인할 수 있었다.
In other words, if a substance inducing Sirt1 and HIF-1 deacetylation, HIF-1 activity could be reduced, and protein expression of CA9 and BNIP3 could be suppressed, and thus it would be effective in renal tubular cell damage.

실험예 8: 검증된 치료 후보물질인 레스베라트롤의 신장 세뇨관 조직에 대한 회복 효과 분석Experimental Example 8: Analysis of the recovery effect of resveratrol, a proven candidate for treatment, on renal tubular tissue

1) 실험설계1) Experimental Design

사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)는 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 세포는 5 ng/ml recombinant epidermal growth factor와 0.05 mg/ml bovine pituitary extract가 함유된 keratinocyte-SFM 배지를 사용하여 37 ℃ 세포배양기에서 배양하였다.Human renal tubule epithelial cells (HK-2) were purchased from ATCC. Cells were cultured in a 37 ℃ cell culture using keratinocyte-SFM medium containing 5 ng / ml recombinant epidermal growth factor and 0.05 mg / ml bovine pituitary extract.

상기 세포에 아무것도 처리하지 않은 대조군(Resveratrol -, Hypoxia -; Control)과 상기 세포에 레스베라트롤을 처리하여 24시간 동안 반응시킨 레스베라트롤군(Resveratrol +, Hypoxia -; Resveratrol), 상기 세포를 저산소환경에 노출하여 24시간 동안 반응시킨 저산소 하에서 손상된 세포군(Resveratrol -, Hypoxia +; Hypoxia), 상기 세포를 저산소환경에 노출시키고, 레스베라트롤을 처리하여 24시간 동안 반응시킨 저산소 하에서 레스베라트롤을 처리한 군(Resveratrol +, Hypoxia +;Hypoxia+resveratrol)을 준비하였다.Resveratrol +, Hypoxia-Resveratrol (Resveratrol-, Hypoxia-; Control) that did not process anything to the cells and the cells were treated with resveratrol for 24 hours and then exposed to hypoxic environment Resveratrol-, Hypoxia +; Hypoxia, a group of cells that were damaged under hypoxia reacted for 24 hours, and the cells were exposed to a hypoxic environment and treated with resveratrol under hypoxia treated for 24 hours by treatment with resveratrol (Resveratrol +, Hypoxia +). ; Hypoxia + resveratrol) was prepared.

저산소 상태는 저산소 상태를 유지하는 주머니(Gaspak pouch system, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)를 사용하여 1% 산소 환경으로 유지하였다.The hypoxic state was maintained in a 1% oxygen environment using a bag that maintained a hypoxic state (Gaspak pouch system, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA).

2) 미토콘드리아수 측정(mitochondrial density)2) Mitochondrial density measurement

상기 각기 다른 군에서의 세포를 PBS로 3회 세척하고, 미토콘드리아의 양을 측정하기 위하여 37 ℃에서 30 분간 25 nM의 미토트레커 레드(mitotracker Red; Molecular Probes, Invitrogen)으로 염색한 후 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여 측정하였다. Cells from the different groups were washed three times with PBS, stained with mitotracker red (Molecular Probes, Invitrogen) at 25 ° C. for 30 minutes at 37 ° C. to measure the amount of mitochondria, followed by flow cytometry (flow). It was measured by flow cytometry.

3) 3) 웨스턴Weston 블랏Blot 분석(도 9) Analysis (Figure 9)

상기 각기 다른 군에서의 세포 용해물(cell lysates)을 표준 절차를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. Membranes는 mitochondrial complexes I, III, IV(Abcam) 및 β-액틴(Sigma-Aldrich)에 대한 항체로 이어지는 적절한 2차 항체로 면역블롯팅을 수행하였다.
Cell lysates from these different groups were subjected to Western blot analysis using standard procedures. Membranes were immunoblotted with appropriate secondary antibodies leading to antibodies against mitochondrial complexes I, III, IV (Abcam) and β-actin (Sigma-Aldrich).

도 8은 레스베라트롤을 처리한 저산소로 손상된 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)에서 Cleaved caspase3(a), cleaved PARP(b), Collagen Ⅰ(c), Collagen Ⅳ(d), Fibronectin(e) 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 나타낸 사진(상단)과 이로부터 계산된 Cleaved caspase3(a), cleaved PARP(b), Collagen Ⅰ(c), Collagen Ⅳ(d), Fibronectin(e)의 Fold change 그래프(하단)이다.Figure 8 is cleaved caspase3 (a), cleaved PARP (b), Collagen I (c), Collagen IV (d), Fibronectin (e) proteins in hypoxic human renal tubule epithelial cells (HK-2) treated with resveratrol Picture (top) showing expression level measured by Western blot and calculated from Cleaved caspase3 (a), cleaved PARP (b), Collagen I (c), Collagen IV (d), Fibronectin (e) Fold change graph at the bottom.

도 9a는 대조군(control), 레스베라트롤만 처리한 군(resveratrol), 저산소 하에서 손상된 세포군(Hypoxia), 저산소 하에서 레스베라트롤을 처리한 군(Hypoxia+resveratrol)에 대하여 미토콘드리아 밀도(mitochondrial density)를 전자현미경으로 촬영한 것이고, 도 9b는 도 9a를 정량화한 것이며, 도 9c, d, e, f는 대조군(control), 레스베라트롤만 처리한 군(resveratrol), 저산소 하에서 손상된 세포군(Hypoxia), 저산소 하에서 레스베라트롤을 처리한 군(Hypoxia+resveratrol)에 대하여 Complex Ⅰ, Complex Ⅲ, Complex Ⅳ를 측정하여 나타낸 웨스턴 블롯(c)과 이를 수치화한 그래프(d,e,f)이다.FIG. 9A is an electron microscope photograph of the mitochondrial density of a control group, a resveratrol-treated group (resveratrol), a cell group damaged under hypoxia, and a group treated with resveratrol under hypoxia (Hypoxia + resveratrol). Figure 9b is a quantification of Figure 9a, Figures 9c, d, e, f is a control, resveratrol-treated group (resveratrol), damaged cell group under hypoxia (Hypoxia), treated with resveratrol under hypoxia Western blots (c) and complex graphs (d, e, and f) of the group (Hypoxia + resveratrol) were measured and measured for Complex I, Complex III and Complex IV.

도 8, 9에 나타난 바와 같이, Sirt1 활성제로 알려져 있는 레스베라트롤을 처리하였을 때, HIF-1의 탈아세틸화를 유도하여 HIF-1 활성을 감소시킴과 동시에 HK2 세뇨관 세포주의 사멸과 세포외기질 합성 증가, 미토콘드리아 손상 등 세포 손상을 정상수준으로 억제함을 확인하였다.As shown in Figures 8 and 9, treatment with resveratrol, known as the Sirt1 activator, induces deacetylation of HIF-1 to decrease HIF-1 activity, and at the same time kills HK2 tubular cell lines and increases extracellular matrix synthesis. It was confirmed that cell damage, such as mitochondrial damage, was suppressed to normal levels.

본 발명에서와 같이 Sirt1, HIF-1α, CA9, BNIP3 단백질 발현 수준을 통해 신장 세뇨관 세포를 손상으로 보호하고, 예방하고, 회복시키는 치료물질을 진단할 수 있음을 확인하였다.
Sirt1, HIF-1α, CA9, BNIP3 protein expression level as in the present invention was confirmed that it is possible to diagnose a therapeutic agent that protects, prevents, and restores renal tubule cells with damage.

실험예 9: Sirt1 과발현 HK-2에서의 효과 분석Experimental Example 9: Analysis of effects on Sirt1 overexpression HK-2

1) Sirt1 과발현 HK-2 세포주(Sirt1 OE) 제작 및 배양1) Preparation and culture of Sirt1 overexpressing HK-2 cell line (Sirt1 OE)

- 벡터 설계-Vector design

일시적인 형질 감염을 위해, 하위융합(subconfluent) 세포는 Trans IT 2020(Mirus Bio LLC, Madison, WI)를 사용한 pECE-flag-Sirt1(Addgene, Cambridge, MA, USA), pECE empty vector(Addgene), HA-HIF-1a-wt-pcDNA3, HA-HIF-1-K709R-pcDNA3, pGL2-hypoxia responsive element(HRE) 플라스미드(Addgene)로 구성된 플라스미드 2 ㎍으로 제조사의 지침에 따라 처리하였다. 루시퍼라제 분석을 위해, 이중 루시퍼라제 분석키트(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 HRE 용 pGL2 루시퍼라제 리포터 벡터(Addgene)를 반딧불이(Firefly) 및 Gaussia 루시퍼라제 대조군 플라스미드로 동시 형질 감염시켰다. 루시퍼라제 활성은 루미노미터(luminometer)를 사용하여 측정하였다.For transient transfection, subconfluent cells were transferred to pECE-flag-Sirt1 (Addgene, Cambridge, MA, USA), pECE empty vector (Addgene), HA using Trans IT 2020 (Mirus Bio LLC, Madison, Wis.). 2 μg of plasmid consisting of -HIF-1a-wt-pcDNA3, HA-HIF-1-K709R-pcDNA3, pGL2-hypoxia responsive element (HRE) plasmid (Addgene) was treated according to the manufacturer's instructions. For the luciferase assay, a double luciferase assay kit (Thermo Scientific, Rockford, Ill., USA) was used to co-transfect the pGL2 luciferase reporter vector (Addgene) for HRE with Firefly and Gaussia luciferase control plasmids. . Luciferase activity was measured using a luminometer.

2) 실험설계2) Experimental Design

상기 실험은 다음과 같이 수행하였다. Empty Vector로 형질감염된 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)와 Sirt1 과발현 HK-2 세포주(Sirt1 OE)를 일반 배양 조건 또는, 저산소환경에 노출시켜 24시간 동안 반응시켜 준비하였다. 저산소 환경에 노출시킨 세포는 Hypoxia로 그래프의 하단에 표기하였다.The experiment was performed as follows. Human renal tubule epithelial cells (HK-2) and Sirt1 overexpressing HK-2 cell line (Sirt1 OE) transfected with Empty Vector were prepared by reacting for 24 hours by exposure to normal culture conditions or hypoxic environment. Cells exposed to the hypoxic environment are labeled Hypoxia at the bottom of the graph.

저산소 상태는 저산소 상태를 유지하는 주머니(Gaspak pouch system, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)를 사용하여 1% 산소 환경으로 유지하였다.The hypoxic state was maintained in a 1% oxygen environment using a bag that maintained a hypoxic state (Gaspak pouch system, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA).

상기 세포 용해물(cell lysates)을 표준 절차를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. Membranes는 콜라겐 I/IV(Southern Biotech, Birmingham, AL), fibronectin(Abcam, 영국 캠브리지), Sirt1(Danvers, MA, 미국), Bnip3(Abcam), HIF-1α(Cell Signaling), cleaved-caspase 3(Cell Signaling), cleaved PARP(Cell Signaling), mitochondrial complexes I, III, IV(Abcam) 및 β-액틴(Sigma-Aldrich)에 대한 항체로 이어지는 적절한 2차 항체로 면역블롯팅을 수행하였다.
The cell lysates were subjected to Western blot analysis using standard procedures. Membranes include collagen I / IV (Southern Biotech, Birmingham, AL), fibronectin (Abcam, Cambridge, UK), Sirt1 (Danvers, MA, USA), Bnip3 (Abcam), HIF-1α (Cell Signaling), cleaved-caspase 3 ( Immunblotting was performed with appropriate secondary antibodies leading to cell signaling, cleaved PARP (Cell Signaling), mitochondrial complexes I, III, IV (Abcam) and β-actin (Sigma-Aldrich).

도 10은 Empty Vector로 형질감염된 사람 신세뇨관 상피세포(HK-2)와 Sirt1 과발현 사람 신세뇨관 상피세포(Sirt1 OE)를 일반 배양조건에서 배양한 경우와, 저산소환경에 노출한 경우, CA9, BNIP3 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 계산한 그래프이다.FIG. 10 shows human renal tubule epithelial cells (HK-2) and Sirt1 overexpressing human renal tubule epithelial cells (Sirt1 OE) transfected with an Empty Vector under normal culture conditions and when exposed to a hypoxic environment, CA9, BNIP3. It is a graph calculated by measuring the protein expression level by Western blot.

도 10에 나타난 바와 같이, 다양한 조건과 환경으로 배양된 세포들을 준비하였고, 이로부터 CA9, BNIP3 단백질 발현을 검출한 결과, As shown in FIG. 10, cells cultured in various conditions and environments were prepared, and the expression of CA9 and BNIP3 proteins was detected therefrom.

본 발명을 통해 도출되고 검증된 치료물질인 레스베라트롤 대신에 Sirt1 과발현시킨 세포의 경우에도 HIF-1α의 탈아세틸화가 유도되어 활성이 감소되므로, CA9, BNIP3이 현저히 저하되었음을 확인하였다. 즉, 저산소에 의해 유발되는 신관 세뇨관 세포 손상이 Sirt1 발현 증가, HIF-1α 탈아세틸화(활성 감소)와 관련이 있고, 이를 통해 CA9, BNIP3도 저하되므로, 이들을 통해 신장 세뇨관 세포 손상을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 치료물질을 검증할 수 있음을 확인하였다.
In the case of cells overexpressing Sirt1 instead of resveratrol, which is a therapeutic substance derived and validated through the present invention, deacetylation of HIF-1α was induced and the activity was decreased, and thus CA9 and BNIP3 were significantly reduced. In other words, neural tubular cell damage caused by hypoxia is associated with increased Sirt1 expression and HIF-1α deacetylation (decreased activity), which in turn lowers CA9 and BNIP3, thereby diagnosing renal tubular cell damage. In addition, it was confirmed that the therapeutic substance could be verified.

실험예 10:HIF-1α 과발현 환경에서 진단 및 검증 효과Experimental Example 10 Diagnosis and Validation Effect in HIF-1α Overexpression Environment

도 11은 Empty Vector로 형질감염된 세포(Empty Vector), HIF-1α 과발현 세포(HIF-1α OE), 레스베라트롤을 처리한 HIF-1α 과발현 세포(HIF-1α OE;Res), HIF-1α과 Sirt1이 동시에 과발현되는 세포(Sirt1 OE; HIF-1α OE)를 일반 배양조건에서 배양한 경우 CA9, BNIP3 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하여 계산한 그래프이다.11 shows cells transfected with Empty Vector (Empty Vector), HIF-1α overexpressing cells (HIF-1α OE), HIF-1α overexpressing cells (HIF-1α OE; Res) treated with resveratrol, HIF-1α and Sirt1. Simultaneously overexpressing cells (Sirt1 OE; HIF-1α OE) is a graph calculated by measuring the western blot (CA9, BNIP3 protein expression levels) when cultured under normal culture conditions.

도 11에 나타난 바와 같이 저산소 환경이 아닌 HIF-1α 과발현 세포에서도 CA9, BNIP3 단백질 발현이 현저히 증가함을 확인가능한 바, 세포의 손상이 발생함을 알 수 있다.As shown in FIG. 11, it can be seen that CA9 and BNIP3 protein expression is significantly increased even in HIF-1α overexpressing cells that are not in a hypoxic environment, indicating that cell damage occurs.

여기에 Sirt1 활성제 레스베라트롤이나 Sirt1 과발현 세포를 이용할 경우, Sirt1 활성을 증가시키면 HIF-1 활성을 감소되고, 이어 CA9, Bnip3의 전사를 억제되어, 세포의 손상이 억제되거나 회복되는 것을 확인하였다.
Herein, when the Sirt1 activator resveratrol or Sirt1 overexpressing cells were used, increasing the Sirt1 activity decreased HIF-1 activity, and then inhibited the transcription of CA9 and Bnip3, thereby inhibiting or repairing cell damage.

실험예 11: 만성신장질환 중의 하나인 일측요로폐쇄(uniateral ureteral obstruction) 모델에서 사구체 또는 세뇨관 세포 손상 진단 및 검증 효과Experimental Example 11 Diagnosis and Validation of Glomerular or Tubular Cell Damage in a Unilateral Rureteral Obstruction Model of Chronic Kidney Disease

1) 일측요로폐쇄 모델(uniateral ureteral obstruction) 구축1) unilateral ureteral obstruction

in vivo에서의 일측요로폐쇄 모델은 논문 [Kinter et al., Kidney International (1999) 55, 1327-334]을 참조하여 구축하였다. 마우스를 마취시킨 후, 왼쪽 신장에서 나오는 뇨관을 결찰함으로써 신장기능을 억제하여 만성신장질환을 유발하였다.Unilateral urinary obstruction model in vivo was constructed with reference to Kinter et al., Kidney International (1999) 55, 1327-334. After anesthetizing the mouse, ligation of the urinary tract from the left kidney was inhibited, leading to chronic kidney disease.

2) 일측요로폐쇄 모델에서의 면역형광염색을 통한 HIF-1 아세틸화 조사.2) HIF-1 acetylation investigation through immunofluorescence staining in unilateral urinary obstruction model.

본 발명의 아세틸화 HIF-1α가 일측요로폐쇄 모델(UUO)에서도 효율적으로 검출되는지 확인하기 위하여, 상기 모델로부터 회수한 조직을 다음과 같이 면역형광염색을 실시하였다.In order to confirm that the acetylated HIF-1α of the present invention is efficiently detected in a unilateral urinary obstruction model (UUO), the tissue recovered from the model was subjected to immunofluorescence staining as follows.

상기 일측요로폐쇄 모델(UUO)과 정상 모델(control)로부터 분리된 신장 사구체 및/또는 세뇨관 조직을 PBS 세척한 후, 파라핀-봉입 섹션(paraffin-embedded sections, 3 μm)을 사용하여 수행하였다. 10% 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 1시간 블로킹한 후, 상기 섹션을 항-HA(Cell Signaling), 항-HIF-1a(Novus Biologicals) 및 항-아세틸 리신(anti-acetyl lysine, Cell Signaling) 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 항체 염색은 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스(Alexa Fluor 488 goat anti-mouse) 또는 Alexa 568 염소 항-토끼(Alexa 568 goat anti-rabbit)로 시각화하였다. DAPI(Sigma-Aldrich)를 사용하여 10분 동안 세포 핵을 염색하였다. 슬라이드를 공촛점 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.
Renal glomeruli and / or tubule tissues isolated from the unilateral urinary obstruction model (UUO) and the normal model (PU) were washed with PBS and then paraffin-embedded sections (3 μm) were used. After 1 hour blocking with 10% normal goat serum, the sections were subjected to anti-HA (Cell Signaling), anti-HIF-1a (Novus Biologicals) and anti-acetyl lysine (Cell Signaling). ) Incubated overnight at 4 ° C. with antibody. Antibody staining was visualized with Alexa Fluor 488 goat anti-mouse or Alexa 568 goat anti-rabbit. Cell nuclei were stained for 10 minutes using DAPI (Sigma-Aldrich). Slides were observed by confocal microscopy (LSM 700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).

도 12는 일측요로폐쇄 모델(UUO)과 정상 모델(control)로부터 전체 신장조직을 얻고, 이로부터 면역형광염색하여, 사구체와 세뇨관 조직 부위를 촬영한 것이고, 도 13은 일측요로폐쇄 모델(UUO)과 정상 모델(control)로부터 전체 신장조직을 얻고, 이로부터 면역형광염색하여, 세뇨관 조직 부위를 촬영한 것이다. 도면에서 적색은 아세틸-리신으로 표지된 것이고, 초록색은 HIF-1α를 나타내며, 파란색은 DAPI로 염색된 것이다.FIG. 12 shows the whole kidney tissue obtained from the unilateral urinary obstruction model (UUO) and the normal model (control), and immunofluorescence staining from the glomeruli and tubule tissue is taken. FIG. 13 shows the unilateral urinary obstruction model (UUO). The whole kidney tissue is obtained from a normal model and a control, and immunofluorescent staining is performed to photograph tubular tissue. In the figure, red is labeled with acetyl-lysine, green represents HIF-1α, and blue is stained with DAPI.

도 12 및 13에 나타난 바와 같이 정상 모델(control)에 비하여 일측요로폐쇄 모델(UUO)에서 아세틸화된 HIF-1α가 증가되었음을 확인할 수 있었다. 즉, 아세틸화된 HIF-1α의 증가여부를 확인하면 신장 사구체 또는 세뇨관 세포의 손상 정도를 진단할 수 있음을 알 수 있다.
As shown in FIGS. 12 and 13, it was confirmed that acetylated HIF-1α was increased in the unilateral urinary obstruction model (UUO) compared to the normal model (control). In other words, confirming the increase of acetylated HIF-1α it can be seen that the degree of damage of renal glomeruli or tubule cells can be diagnosed.

실험예 12: 제2형 당뇨유발 모델(Zucker Diabetic Fatty (ZDF))에서 사구체 또는 세뇨관 세포 손상 진단 및 검증 효과Experimental Example 12: Diagnosis and Validation of Glomerular or Tubular Cell Damage in Type 2 Diabetes Induction Model (Zucker Diabetic Fatty (ZDF))

1) 제2형 당뇨유발 모델(Zucker Diabetic Fatty (ZDF)) 구축1) Development of type 2 diabetes inducing model (Zucker Diabetic Fatty (ZDF))

제2형 당뇨유발 모델은 Zucker Diabetic Fatty (ZDF) Rat를 이용한 것으로, ZDF 랫트는 태어난 후부터 성장함에 따라 점차적으로 당뇨가 유발되는 유전자 이식(transgenic) 동물 모델이다. 이는 사람의 제2형 당뇨 모델로 일반적으로 널리 사용되고 있다. 특히, 생후 8개월부터 점차 당뇨가 유발되기 시작하여 혈중 glucose농도가 증가되며, 고지방 식이를 할 경우 당뇨는 급속하게 진행된다는 것이 알려져 있는데, 본 발명에서도 ZDF 쥐에 Purina 5008식이를 공급하여 당뇨를 유발시켰다.Type 2 diabetes-induced model is using Zucker Diabetic Fatty (ZDF) Rat. ZDF rat is a transgenic animal model in which diabetes is gradually induced as it grows after birth. It is commonly used as a type 2 diabetes model in humans. In particular, it is known that diabetes mellitus is gradually induced from 8 months of age and the blood glucose concentration is increased, and when a high fat diet is used, diabetes is rapidly progressed. In the present invention, diabetes is induced by supplying Purina 5008 diet to ZDF rats. I was.

2) 제2형 당뇨유발 모델(Zucker Diabetic Fatty (ZDF))에서의 면역형광염색을 통한 HIF-1 아세틸화 조사.2) Investigation of HIF-1 acetylation via immunofluorescence staining in type 2 diabetes inducing model (Zucker Diabetic Fatty (ZDF)).

본 발명의 아세틸화 HIF-1α가 제2형 당뇨유발 모델(ZDF)에서도 효율적으로 검출되는지 확인하기 위하여, 상기 모델로부터 회수한 조직을 다음과 같이 면역형광염색을 실시하였다.In order to confirm whether the acetylated HIF-1α of the present invention is efficiently detected in the type 2 diabetes-induced model (ZDF), the tissue recovered from the model was subjected to immunofluorescence staining as follows.

상기 제2형 당뇨유발 모델(ZDF)과 정상 모델(control)로부터 분리된 신장 사구체 및/또는 세뇨관 조직을 PBS 세척한 후, 파라핀-봉입 섹션(paraffin-embedded sections, 3 μm)을 사용하여 수행하였다. 10% 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 1시간 블로킹한 후, 상기 섹션을 항-HA(Cell Signaling), 항-HIF-1a(Novus Biologicals) 및 항-아세틸 리신(anti-acetyl lysine, Cell Signaling) 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 항체 염색은 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스(Alexa Fluor 488 goat anti-mouse) 또는 Alexa 568 염소 항-토끼(Alexa 568 goat anti-rabbit)로 시각화하였다. DAPI(Sigma-Aldrich)를 사용하여 10분 동안 세포 핵을 염색하였다. 슬라이드를 공촛점 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.
Renal glomeruli and / or tubule tissues isolated from the Type 2 diabetes induction model (ZDF) and the normal model (PDF) were washed with PBS, followed by using paraffin-embedded sections (3 μm). . After 1 hour blocking with 10% normal goat serum, the sections were subjected to anti-HA (Cell Signaling), anti-HIF-1a (Novus Biologicals) and anti-acetyl lysine (Cell Signaling). ) Incubated overnight at 4 ° C. with antibody. Antibody staining was visualized with Alexa Fluor 488 goat anti-mouse or Alexa 568 goat anti-rabbit. Cell nuclei were stained for 10 minutes using DAPI (Sigma-Aldrich). Slides were observed by confocal microscopy (LSM 700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).

도 14는 제2형 당뇨유발 모델(ZDF)과 정상 모델(control)로부터 전체 신장조직을 얻고, 이로부터 면역형광염색하여, 사구체와 세뇨관 조직 부위를 촬영한 것이고, 도 15는 제2형 당뇨유발 모델(ZDF)과 정상 모델(control)로부터 전체 신장조직을 얻고, 이로부터 면역형광염색하여, 세뇨관 조직 부위를 촬영한 것이다. 도면에서 적색은 아세틸-리신으로 표지된 것이고, 초록색은 HIF-1α를 나타내며, 파란색은 DAPI로 염색된 것이다.FIG. 14 shows the whole kidney tissue obtained from the type 2 diabetes induction model (ZDF) and the normal model (control), and immunofluorescence staining from the glomeruli and tubule tissues is taken. FIG. 15 shows the type 2 diabetes induction. The whole kidney tissue is obtained from the model (ZDF) and the normal model (control), and immunofluorescent staining is performed to photograph the tubular tissue region. In the figure, red is labeled with acetyl-lysine, green represents HIF-1α, and blue is stained with DAPI.

도 14 및 15에 나타난 바와 같이 정상 모델(control)에 비하여 제2형 당뇨유발 모델(ZDF)에서 아세틸화된 HIF-1α가 증가되었음을 확인할 수 있었다. 즉, 아세틸화된 HIF-1α의 증가여부를 확인하면 신장 사구체 또는 신장 세뇨관 세포의 손상 정도를 진단할 수 있음을 알 수 있다.As shown in FIGS. 14 and 15, it was confirmed that acetylated HIF-1α was increased in the type 2 diabetes-induced model (ZDF) compared to the normal model (control). In other words, confirming the increase of acetylated HIF-1α it can be seen that the degree of damage of renal glomeruli or renal tubule cells can be diagnosed.

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Asp Glu 115 120 125 Gly Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ile Gly Tyr Arg Asp 130 135 140 Asn Leu Leu Phe Gly Asp Glu Ile Ile Thr Asn Gly Phe His Ser Cys 145 150 155 160 Glu Ser Asp Glu Glu Asp Arg Ala Ser His Ala Ser Ser Ser Asp Trp 165 170 175 Thr Pro Arg Pro Arg Ile Gly Pro Tyr Thr Phe Val Gln Gln His Leu 180 185 190 Met Ile Gly Thr Asp Pro Arg Thr Ile Leu Lys Asp Leu Leu Pro Glu 195 200 205 Thr Ile Pro Pro Pro Glu Leu Asp Asp Met Thr Leu Trp Gln Ile Val 210 215 220 Ile Asn Ile Leu Ser Glu Pro Pro Lys Arg Lys Lys Arg Lys Asp Ile 225 230 235 240 Asn Thr Ile Glu Asp Ala Val Lys Leu Leu Gln Glu Cys Lys Lys Ile 245 250 255 Ile Val Leu Thr Gly Ala Gly Val Ser Val Ser Cys Gly Ile Pro Asp 260 265 270 Phe Arg Ser Arg Asp Gly Ile Tyr Ala Arg Leu Ala Val Asp Phe Pro 275 280 285 Asp Leu Pro Asp Pro Gln Ala Met Phe Asp Ile Glu Tyr Phe Arg Lys 290 295 300 Asp Pro Arg Pro Phe Phe Lys Phe Ala Lys Glu Ile Tyr Pro Gly Gln 305 310 315 320 Phe Gln Pro Ser Leu Cys His Lys Phe Ile Ala Leu Ser Asp Lys Glu 325 330 335 Gly Lys Leu Leu Arg Asn Tyr Thr Gln Asn Ile Asp Thr Leu Glu Gln 340 345 350 Val Ala Gly Ile Gln Arg Ile Ile Gln Cys His Gly Ser Phe Ala Thr 355 360 365 Ala Ser Cys Leu Ile Cys Lys Tyr Lys Val Asp Cys Glu Ala Val Arg 370 375 380 Gly Asp Ile Phe Asn Gln Val Val Pro Arg Cys Pro Arg Cys Pro Ala 385 390 395 400 Asp Glu Pro Leu Ala Ile Met Lys Pro Glu Ile Val Phe Phe Gly Glu 405 410 415 Asn Leu Pro Glu Gln Phe His Arg Ala Met Lys Tyr Asp Lys Asp Glu 420 425 430 Val Asp Leu Leu Ile Val Ile Gly Ser Ser Leu Lys Val Arg Pro Val 435 440 445 Ala Leu Ile Pro Ser Ser Ile Pro His Glu Val Pro Gln Ile Leu Ile 450 455 460 Asn Arg Glu Pro Leu Pro His Leu His Phe Asp Val Glu Leu Leu Gly 465 470 475 480 Asp Cys Asp Val Ile Ile Asn Glu Leu Cys His Arg Leu Gly Gly Glu 485 490 495 Tyr Ala Lys Leu Cys Cys Asn Pro Val Lys Leu Ser Glu Ile Thr Glu 500 505 510 Lys Pro Pro Arg Thr Gln Lys Glu Leu Ala Tyr Leu Ser Glu Leu Pro 515 520 525 Pro Thr Pro Leu His Val Ser Glu Asp Ser Ser Ser Pro Glu Arg Thr 530 535 540 Ser Pro Pro Asp Ser Ser Val Ile Val Thr Leu Leu Asp Gln Ala Ala 545 550 555 560 Lys Ser Asn Asp Asp Leu Asp Val Ser Glu Ser Lys Gly Cys Met Glu 565 570 575 Glu Lys Pro Gln Glu Val Gln Thr Ser Arg Asn Val Glu Ser Ile Ala 580 585 590 Glu Gln Met Glu Asn Pro Asp Leu Lys Asn Val Gly Ser Ser Thr Gly 595 600 605 Glu Lys Asn Glu Arg Thr Ser Val Ala Gly Thr Val Arg Lys Cys Trp 610 615 620 Pro Asn Arg Val Ala Lys Glu Gln Ile Ser Arg Arg Leu Asp Gly Asn 625 630 635 640 Gln Tyr Leu Phe Leu Pro Pro Asn Arg Tyr Ile Phe His Gly Ala Glu 645 650 655 Val Tyr Ser Asp Ser Glu Asp Asp Val Leu Ser Ser Ser Ser Cys Gly 660 665 670 Ser Asn Ser Asp Ser Gly Thr Cys Gln Ser Pro Ser Leu Glu Glu Pro 675 680 685 Met Glu Asp Glu Ser Glu Ile Glu Glu Phe Tyr Asn Gly Leu Glu Asp 690 695 700 Glu Pro Asp Val Pro Glu Arg Ala Gly Gly Ala Gly Phe Gly Thr Asp 705 710 715 720 Gly Asp Asp Gln Glu Ala Ile Asn Glu Ala Ile Ser Val Lys Gln Glu 725 730 735 Val Thr Asp Met Asn Tyr Pro Ser Asn Lys Ser 740 745 <210> 2 <211> 719 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hypoxia-inducible factor 1 <400> 2 Met Glu Asp Asn Arg Lys Arg Asn Met Glu Arg Arg Arg Glu Thr Ser 1 5 10 15 Arg His Ala Ala Arg Asp Arg Arg Ser Lys Glu Ser Asp Ile Phe Asp 20 25 30 Asp Leu Lys Met Cys Val Pro Ile Val Glu Glu Gly Thr Val Thr His 35 40 45 Leu Asp Arg Ile Ala Leu Leu Arg Val Ala Ala Thr Ile Cys Arg Leu 50 55 60 Arg Lys Thr Ala Gly Asn Val Leu Glu Asn Asn Leu Asp Asn Glu Ile 65 70 75 80 Thr Asn Glu Val Trp Thr Glu Asp Thr Ile Ala Glu Cys Leu Asp Gly 85 90 95 Phe Val Met Ile Val Asp Ser Asp Ser Ser Ile Leu Tyr Val Thr Glu 100 105 110 Ser Val Ala Met Tyr Leu Gly Leu Thr Gln Thr Asp Leu Thr Gly Arg 115 120 125 Ala Leu Arg Asp Phe Leu His Pro Ser Asp Tyr Asp Glu Phe Asp Lys 130 135 140 Gln Ser Lys Met Leu His Lys Pro Arg Gly Glu Asp Thr Asp Thr Thr 145 150 155 160 Gly Ile Asn Met Val Leu Arg Met Lys Thr Val Ile Ser Pro Arg Gly 165 170 175 Arg Cys Leu Asn Leu Lys Ser Ala Leu Tyr Lys Ser Val Ser Phe Leu 180 185 190 Val His Ser Lys Val Ser Thr Gly Gly His Val Ser Phe Met Gln Gly 195 200 205 Ile Thr Ile Pro Ala Gly Gln Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Ser Ala 210 215 220 Met Thr Lys Tyr Thr Glu Ser Pro Met Gly Ala Phe Thr Thr Arg His 225 230 235 240 Thr Cys Asp Met Arg Ile Thr Phe Val Ser Asp Lys Phe Asn Tyr Ile 245 250 255 Leu Lys Ser Glu Leu Lys Thr Leu Met Gly Thr Ser Phe Tyr Glu Leu 260 265 270 Val His Pro Ala Asp Met Met Ile Val Ser Lys Ser Met Lys Glu Leu 275 280 285 Phe Ala Lys Gly His Ile Arg Thr Pro Tyr Tyr Arg Leu Ile Ala Ala 290 295 300 Asn Asp Thr Leu Ala Trp Ile Gln Thr Glu Ala Thr Thr Ile Thr His 305 310 315 320 Thr Thr Lys Gly Gln Lys Gly Gln Tyr Val Ile Cys Val His Tyr Val 325 330 335 Leu Gly Ile Gln Gly Ala Glu Glu Ser Leu Val Val Cys Thr Asp Ser 340 345 350 Met Pro Ala Gly Met Gln Val Asp Ile Lys Lys Glu Val Asp Asp Thr 355 360 365 Arg Asp Tyr Ile Gly Arg Gln Pro Glu Ile Val Glu Cys Val Asp Phe 370 375 380 Thr Pro Leu Ile Glu Pro Glu Asp Pro Phe Asp Thr Val Ile Glu Pro 385 390 395 400 Val Val Gly Gly Glu Glu Pro Val Lys Gln Ala Asp Met Gly Ala Arg 405 410 415 Lys Asn Ser Tyr Asp Asp Val Leu Gln Trp Leu Phe Arg Asp Gln Pro 420 425 430 Ser Ser Pro Pro Pro Ala Arg Tyr Arg Ser Ala Asp Arg Phe Arg Thr 435 440 445 Thr Glu Pro Ser Asn Phe Gly Ser Ala Leu Ala Ser Pro Asp Phe Met 450 455 460 Asp Ser Ser Ser Arg Thr Ser Arg Pro Lys Thr Ser Tyr Gly Arg Arg 465 470 475 480 Ala Gln Ser Gln Gly Ser Arg Thr Thr Gly Ser Ser Ser Thr Ser Ala 485 490 495 Ser Ala Thr Leu Pro His Ser Ala Asn Tyr Ser Pro Leu Ala Glu Gly 500 505 510 Ile Ser Gln Cys Gly Leu Asn Ser Pro Pro Ser Ile Lys Ser Gly Gln 515 520 525 Val Val Tyr Gly Asp Ala Arg Ser Met Gly Arg Ser Cys Asp Pro Ser 530 535 540 Asp Ser Ser Arg Arg Phe Ser Ala Leu Ser Pro Ser Asp Thr Leu Asn 545 550 555 560 Val Ser Ser Thr Arg Gly Ile Asn Pro Val Ile Gly Ser Asn Asp Val 565 570 575 Phe Ser Thr Met Pro Phe Ala Asp Ser Ile Ala Ile Ala Glu Arg Ile 580 585 590 Asp Ser Ser Pro Thr Leu Thr Ser Gly Glu Pro Ile Leu Cys Asp Asp 595 600 605 Leu Gln Trp Glu Glu Pro Asp Leu Ser Cys Leu Ala Pro Phe Val Asp 610 615 620 Thr Tyr Asp Met Met Gln Met Asp Glu Gly Leu Pro Pro Glu Leu Gln 625 630 635 640 Ala Leu Tyr Asp Leu Pro Asp Phe Thr Pro Ala Val Pro Gln Ala Pro 645 650 655 Ala Ala Arg Pro Val His Ile Asp Arg Ser Pro Pro Ala Lys Arg Met 660 665 670 His Gln Ser Gly Pro Ser Asp Leu Asp Phe Met Tyr Thr Gln His Tyr 675 680 685 Gln Pro Phe Gln Gln Asp Glu Thr Tyr Trp Gln Gly Gln Gln Gln Gln 690 695 700 Asn Glu Gln Gln Pro Ser Ser Tyr Ser Pro Phe Pro Met Leu Ser 705 710 715 <210> 3 <211> 459 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Carbonic anhydrase 9 <400> 3 Met Ala Pro Leu Cys Pro Ser Pro Trp Leu Pro Leu Leu Ile Pro Ala 1 5 10 15 Pro Ala Pro Gly Leu Thr Val Gln Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Val Pro Val His Pro Gln Arg Leu Pro Arg Met Gln Glu Asp Ser Pro 35 40 45 Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly Glu Glu Asp 50 55 60 Leu Pro Ser Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu 65 70 75 80 Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro 85 90 95 Glu Val Lys Pro Lys Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys Leu Glu Asp 100 105 110 Leu Pro Thr Val Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Glu Pro Gln Asn Asn 115 120 125 Ala His Arg Asp Lys Glu Gly Asp Asp Gln Ser His Trp Arg Tyr Gly 130 135 140 Gly Asp Pro Pro Trp Pro Arg Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe 145 150 155 160 Gln Ser Pro Val Asp Ile Arg Pro Gln Leu Ala Ala Phe Cys Pro Ala 165 170 175 Leu Arg Pro Leu Glu Leu Leu Gly Phe Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu 180 185 190 Leu Arg Leu Arg Asn Asn Gly His Ser Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro 195 200 205 Gly Leu Glu Met Ala Leu Gly Pro Gly Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gln 210 215 220 Leu His Leu His Trp Gly Ala Ala Gly Arg Pro Gly Ser Glu His Thr 225 230 235 240 Val Glu Gly His Arg Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser 245 250 255 Thr Ala Phe Ala Arg Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu 260 265 270 Ala Val Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala 275 280 285 Tyr Glu Gln Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu Ile Ala Glu Glu Gly Ser 290 295 300 Glu Thr Gln Val Pro Gly Leu Asp Ile Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp 305 310 315 320 Phe Ser Arg Tyr Phe Gln Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys 325 330 335 Ala Gln Gly Val Ile Trp Thr Val Phe Asn Gln Thr Val Met Leu Ser 340 345 350 Ala Lys Gln Leu His Thr Leu Ser Asp Thr Leu Trp Gly Pro Gly Asp 355 360 365 Ser Arg Leu Gln Leu Asn Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg 370 375 380 Val Ile Glu Ala Ser Phe Pro Ala Gly Val Asp Ser Ser Pro Arg Ala 385 390 395 400 Ala Glu Pro Val Gln Leu Asn Ser Cys Leu Ala Ala Gly Asp Ile Leu 405 410 415 Ala Leu Val Phe Gly Leu Leu Phe Ala Val Thr Ser Val Ala Phe Leu 420 425 430 Val Gln Met Arg Arg Gln His Arg Arg Gly Thr Lys Gly Gly Val Ser 435 440 445 Tyr Arg Pro Ala Glu Val Ala Glu Thr Gly Ala 450 455 <210> 4 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3 [Homo sapiens] <400> 4 Met Gly Asp Ala Ala Ala Asp Pro Pro Gly Pro Ala Leu Pro Cys Glu 1 5 10 15 Phe Leu Arg Pro Gly Cys Gly Ala Pro Leu Ser Pro Gly Ala Gln Leu 20 25 30 Gly Arg Gly Ala Pro Thr Ser Ala Phe Pro Pro Pro Ala Ala Glu Ala 35 40 45 His Pro Ala Ala Arg Arg Gly Leu Arg Ser Pro Gln Leu Pro Ser Gly 50 55 60 Ala Met Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly Met Gln Glu Glu Ser Leu Gln 65 70 75 80 Gly Ser Trp Val Glu Leu His Phe Ser Asn Asn Gly Asn Gly Gly Ser 85 90 95 Val Pro Ala Ser Val Ser Ile Tyr Asn Gly Asp Met Glu Lys Ile Leu 100 105 110 Leu Asp Ala Gln His Glu Ser Gly Arg Ser Ser Ser Lys Ser Ser His 115 120 125 Cys Asp Ser Pro Pro Arg Ser Gln Thr Pro Gln Asp Thr Asn Arg Ala 130 135 140 Ser Glu Thr Asp Thr His Ser Ile Gly Glu Lys Asn Ser Ser Gln Ser 145 150 155 160 Glu Glu Asp Asp Ile Glu Arg Arg Lys Glu Val Glu Ser Ile Leu Lys 165 170 175 Lys Asn Ser Asp Trp Ile Trp Asp Trp Ser Ser Arg Pro Glu Asn Ile 180 185 190 Pro Pro Lys Glu Phe Leu Phe Lys His Pro Lys Arg Thr Ala Thr Leu 195 200 205 Ser Met Arg Asn Thr Ser Val Met Lys Lys Gly Gly Ile Phe Ser Ala 210 215 220 Glu Phe Leu Lys Val Phe Leu Pro Ser Leu Leu Leu Ser His Leu Leu 225 230 235 240 Ala Ile Gly Leu Gly Ile Tyr Ile Gly Arg Arg Leu Thr Thr Ser Thr 245 250 255 Ser Thr Phe <110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> A kit for detecting renal cell damage, method for detecting renal          tubular cell damage and method for screening a therapeutic agent          for renal tubular cell damage <130> HPC7911 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 747 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HUMAN Sirtuin (Silent mating type information regulation 2          homolog) 1 <400> 1 Met Ala Asp Glu Ala Ala Leu Ala Leu Gln Pro Gly Gly Ser Pro Ser   1 5 10 15 Ala Ala Gly Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ser Ser Pro Ala Gly Glu Pro              20 25 30 Leu Arg Lys Arg Pro Arg Arg Asp Gly Pro Gly Leu Glu Arg Ser Pro          35 40 45 Gly Glu Pro Gly Gly Ala Ala Pro Glu Arg Glu Val Pro Ala Ala Ala      50 55 60 Arg Gly Cys Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Leu Trp Arg Glu Ala Glu  65 70 75 80 Ala Glu Ala Ala Ala Ala Gly Gly Glu Gln Glu Ala Gln Ala Thr Ala                  85 90 95 Ala Ala Gly Glu Gly Asp Asn Gly Pro Gly Leu Gln Gly Pro Ser Arg             100 105 110 Glu Pro Pro Leu Ala Asp Asn Leu Tyr Asp Glu Asp Asp Asp Asp Glu         115 120 125 Gly Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ile Gly Tyr Arg Asp     130 135 140 Asn Leu Leu Phe Gly Asp Glu Ile Ile Thr Asn Gly Phe His Ser Cys 145 150 155 160 Glu Ser Asp Glu Glu Asp Arg Ala Ser His Ala Ser Ser Ser Asp Trp                 165 170 175 Thr Pro Arg Pro Arg Ile Gly Pro Tyr Thr Phe Val Gln Gln His Leu             180 185 190 Met Ile Gly Thr Asp Pro Arg Thr Ile Leu Lys Asp Leu Leu Pro Glu         195 200 205 Thr Ile Pro Pro Pro Glu Leu Asp Asp Met Thr Leu Trp Gln Ile Val     210 215 220 Ile Asn Ile Leu Ser Glu Pro Pro Lys Arg Lys Lys Arg Lys Asp Ile 225 230 235 240 Asn Thr Ile Glu Asp Ala Val Lys Leu Leu Gln Glu Cys Lys Lys Ile                 245 250 255 Ile Val Leu Thr Gly Ala Gly Val Ser Val Ser Cys Gly Ile Pro Asp             260 265 270 Phe Arg Ser Arg Asp Gly Ile Tyr Ala Arg Leu Ala Val Asp Phe Pro         275 280 285 Asp Leu Pro Asp Pro Gln Ala Met Phe Asp Ile Glu Tyr Phe Arg Lys     290 295 300 Asp Pro Arg Pro Phe Phe Lys Phe Ala Lys Glu Ile Tyr Pro Gly Gln 305 310 315 320 Phe Gln Pro Ser Leu Cys His Lys Phe Ile Ala Leu Ser Asp Lys Glu                 325 330 335 Gly Lys Leu Leu Arg Asn Tyr Thr Gln Asn Ile Asp Thr Leu Glu Gln             340 345 350 Val Ala Gly Ile Gln Arg Ile Ile Gln Cys His Gly Ser Phe Ala Thr         355 360 365 Ala Ser Cys Leu Ile Cys Lys Tyr Lys Val Asp Cys Glu Ala Val Arg     370 375 380 Gly Asp Ile Phe Asn Gln Val Val Pro Arg Cys Pro Arg Cys Pro Ala 385 390 395 400 Asp Glu Pro Leu Ala Ile Met Lys Pro Glu Ile Val Phe Phe Gly Glu                 405 410 415 Asn Leu Pro Glu Gln Phe His Arg Ala Met Lys Tyr Asp Lys Asp Glu             420 425 430 Val Asp Leu Leu Ile Val Ile Gly Ser Ser Leu Lys Val Arg Pro Val         435 440 445 Ala Leu Ile Pro Ser Ser Ile Pro His Glu Val Pro Gln Ile Leu Ile     450 455 460 Asn Arg Glu Pro Leu Pro His Leu His Phe Asp Val Glu Leu Leu Gly 465 470 475 480 Asp Cys Asp Val Ile Ile Asn Glu Leu Cys His Arg Leu Gly Gly Glu                 485 490 495 Tyr Ala Lys Leu Cys Cys Asn Pro Val Lys Leu Ser Glu Ile Thr Glu             500 505 510 Lys Pro Pro Arg Thr Gln Lys Glu Leu Ala Tyr Leu Ser Glu Leu Pro         515 520 525 Pro Thr Pro Leu His Val Ser Glu Asp Ser Ser Ser Pro Glu Arg Thr     530 535 540 Ser Pro Pro Asp Ser Ser Val Ile Val Thr Leu Leu Asp Gln Ala Ala 545 550 555 560 Lys Ser Asn Asp Asp Leu Asp Val Ser Glu Ser Lys Gly Cys Met Glu                 565 570 575 Glu Lys Pro Gln Glu Val Gln Thr Ser Arg Asn Val Glu Ser Ile Ala             580 585 590 Glu Gln Met Glu Asn Pro Asp Leu Lys Asn Val Gly Ser Ser Thr Gly         595 600 605 Glu Lys Asn Glu Arg Thr Ser Val Ala Gly Thr Val Arg Lys Cys Trp     610 615 620 Pro Asn Arg Val Ala Lys Glu Gln Ile Ser Arg Arg Leu Asp Gly Asn 625 630 635 640 Gln Tyr Leu Phe Leu Pro Pro Asn Arg Tyr Ile Phe His Gly Ala Glu                 645 650 655 Val Tyr Ser Asp Ser Glu Asp Asp Val Leu Ser Ser Ser Ser Cys Gly             660 665 670 Ser Asn Ser Asp Ser Gly Thr Cys Gln Ser Pro Ser Leu Glu Glu Pro         675 680 685 Met Glu Asp Glu Ser Glu Ile Glu Glu Phe Tyr Asn Gly Leu Glu Asp     690 695 700 Glu Pro Asp Val Pro Glu Arg Ala Gly Gly Ala Gly Phe Gly Thr Asp 705 710 715 720 Gly Asp Asp Gln Glu Ala Ile Asn Glu Ala Ile Ser Val Lys Gln Glu                 725 730 735 Val Thr Asp Met Asn Tyr Pro Ser Asn Lys Ser             740 745 <210> 2 <211> 719 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hypoxia-inducible factor 1 <400> 2 Met Glu Asp Asn Arg Lys Arg Asn Met Glu Arg Arg Arg Glu Thr Ser   1 5 10 15 Arg His Ala Ala Arg Asp Arg Arg Ser Lys Glu Ser Asp Ile Phe Asp              20 25 30 Asp Leu Lys Met Cys Val Pro Ile Val Glu Glu Gly Thr Val Thr His          35 40 45 Leu Asp Arg Ile Ala Leu Leu Arg Val Ala Ala Thr Ile Cys Arg Leu      50 55 60 Arg Lys Thr Ala Gly Asn Val Leu Glu Asn Asn Leu Asp Asn Glu Ile  65 70 75 80 Thr Asn Glu Val Trp Thr Glu Asp Thr Ile Ala Glu Cys Leu Asp Gly                  85 90 95 Phe Val Met Ile Val Asp Ser Asp Ser Ser Ile Leu Tyr Val Thr Glu             100 105 110 Ser Val Ala Met Tyr Leu Gly Leu Thr Gln Thr Asp Leu Thr Gly Arg         115 120 125 Ala Leu Arg Asp Phe Leu His Pro Ser Asp Tyr Asp Glu Phe Asp Lys     130 135 140 Gln Ser Lys Met Leu His Lys Pro Arg Gly Glu Asp Thr Asp Thr Thr 145 150 155 160 Gly Ile Asn Met Val Leu Arg Met Lys Thr Val Ile Ser Pro Arg Gly                 165 170 175 Arg Cys Leu Asn Leu Lys Ser Ala Leu Tyr Lys Ser Val Ser Phe Leu             180 185 190 Val His Ser Lys Val Ser Thr Gly Gly His Val Ser Phe Met Gln Gly         195 200 205 Ile Thr Ile Pro Ala Gly Gln Gly Thr Thr Asn Ala Asn Ala Ser Ala     210 215 220 Met Thr Lys Tyr Thr Glu Ser Pro Met Gly Ala Phe Thr Thr Arg His 225 230 235 240 Thr Cys Asp Met Arg Ile Thr Phe Val Ser Asp Lys Phe Asn Tyr Ile                 245 250 255 Leu Lys Ser Glu Leu Lys Thr Leu Met Gly Thr Ser Phe Tyr Glu Leu             260 265 270 Val His Pro Ala Asp Met Met Ile Val Ser Lys Ser Met Lys Glu Leu         275 280 285 Phe Ala Lys Gly His Ile Arg Thr Pro Tyr Tyr Arg Leu Ile Ala Ala     290 295 300 Asn Asp Thr Leu Ala Trp Ile Gln Thr Glu Ala Thr Thr Ile Thr His 305 310 315 320 Thr Thr Lys Gly Gln Lys Gly Gln Tyr Val Ile Cys Val His Tyr Val                 325 330 335 Leu Gly Ile Gln Gly Ala Glu Glu Ser Leu Val Val Cys Thr Asp Ser             340 345 350 Met Pro Ala Gly Met Gln Val Asp Ile Lys Lys Glu Val Asp Asp Thr         355 360 365 Arg Asp Tyr Ile Gly Arg Gln Pro Glu Ile Val Glu Cys Val Asp Phe     370 375 380 Thr Pro Leu Ile Glu Pro Glu Asp Pro Phe Asp Thr Val Ile Glu Pro 385 390 395 400 Val Val Gly Gly Glu Glu Pro Val Lys Gln Ala Asp Met Gly Ala Arg                 405 410 415 Lys Asn Ser Tyr Asp Asp Val Leu Gln Trp Leu Phe Arg Asp Gln Pro             420 425 430 Ser Ser Pro Pro Pro Ala Arg Tyr Arg Ser Ala Asp Arg Phe Arg Thr         435 440 445 Thr Glu Pro Ser Asn Phe Gly Ser Ala Leu Ala Ser Pro Asp Phe Met     450 455 460 Asp Ser Ser Ser Arg Thr Ser Arg Pro Lys Thr Ser Tyr Gly Arg Arg 465 470 475 480 Ala Gln Ser Gln Gly Ser Arg Thr Thr Gly Ser Ser Ser Thr Ser Ala                 485 490 495 Ser Ala Thr Leu Pro His Ser Ala Asn Tyr Ser Pro Leu Ala Glu Gly             500 505 510 Ile Ser Gln Cys Gly Leu Asn Ser Pro Pro Ser Ile Lys Ser Gly Gln         515 520 525 Val Val Tyr Gly Asp Ala Arg Ser Met Gly Arg Ser Cys Asp Pro Ser     530 535 540 Asp Ser Ser Arg Arg Phe Ser Ala Leu Ser Pro Ser Asp Thr Leu Asn 545 550 555 560 Val Ser Ser Thr Arg Gly Ile Asn Pro Val Ile Gly Ser Asn Asp Val                 565 570 575 Phe Ser Thr Met Pro Phe Ala Asp Ser Ile Ala Ile Ala Glu Arg Ile             580 585 590 Asp Ser Ser Pro Thr Leu Thr Ser Gly Glu Pro Ile Leu Cys Asp Asp         595 600 605 Leu Gln Trp Glu Glu Pro Asp Leu Ser Cys Leu Ala Pro Phe Val Asp     610 615 620 Thr Tyr Asp Met Met Gln Met Asp Glu Gly Leu Pro Pro Glu Leu Gln 625 630 635 640 Ala Leu Tyr Asp Leu Pro Asp Phe Thr Pro Ala Val Pro Gln Ala Pro                 645 650 655 Ala Ala Arg Pro Val His Ile Asp Arg Ser Pro Pro Ala Lys Arg Met             660 665 670 His Gln Ser Gly Pro Ser Asp Leu Asp Phe Met Tyr Thr Gln His Tyr         675 680 685 Gln Pro Phe Gln Gln Asp Glu Thr Tyr Trp Gln Gly Gln Gln Gln Gln     690 695 700 Asn Glu Gln Gln Pro Ser Ser Tyr Ser Pro Phe Pro Met Leu Ser 705 710 715 <210> 3 <211> 459 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> carbonic anhydrase 9 <400> 3 Met Ala Pro Leu Cys Pro Ser Pro Trp Leu Pro Leu Leu Ile Pro Ala   1 5 10 15 Pro Ala Pro Gly Leu Thr Val Gln Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu              20 25 30 Val Pro Val His Pro Gln Arg Leu Pro Arg Met Gln Glu Asp Ser Pro          35 40 45 Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly Gly Glu Glu Asp      50 55 60 Leu Pro Ser Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu  65 70 75 80 Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro                  85 90 95 Glu Val Lys Pro Lys Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys Leu Glu Asp             100 105 110 Leu Pro Thr Val Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Glu Pro Gln Asn Asn         115 120 125 Ala His Arg Asp Lys Glu Gly Asp Asp Gln Ser His Trp Arg Tyr Gly     130 135 140 Gly Asp Pro Pro Trp Pro Arg Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe 145 150 155 160 Gln Ser Pro Val Asp Ile Arg Pro Gln Leu Ala Ala Phe Cys Pro Ala                 165 170 175 Leu Arg Pro Leu Glu Leu Leu Gly Phe Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu             180 185 190 Leu Arg Leu Arg Asn Asn Gly His Ser Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro         195 200 205 Gly Leu Glu Met Ala Leu Gly Pro Gly Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gln     210 215 220 Leu His Leu His Trp Gly Ala Ala Gly Arg Pro Gly Ser Glu His Thr 225 230 235 240 Val Glu Gly His Arg Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser                 245 250 255 Thr Ala Phe Ala Arg Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu             260 265 270 Ala Val Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala         275 280 285 Tyr Glu Gln Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu Ile Ala Glu Glu Gly Ser     290 295 300 Glu Thr Gln Val Pro Gly Leu Asp Ile Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp 305 310 315 320 Phe Ser Arg Tyr Phe Gln Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys                 325 330 335 Ala Gln Gly Val Ile Trp Thr Val Phe Asn Gln Thr Val Met Leu Ser             340 345 350 Ala Lys Gln Leu His Thr Leu Ser Asp Thr Leu Trp Gly Pro Gly Asp         355 360 365 Ser Arg Leu Gln Leu Asn Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg     370 375 380 Val Ile Glu Ala Ser Phe Pro Ala Gly Val Asp Ser Ser Pro Arg Ala 385 390 395 400 Ala Glu Pro Val Gln Leu Asn Ser Cys Leu Ala Ala Gly Asp Ile Leu                 405 410 415 Ala Leu Val Phe Gly Leu Leu Phe Ala Val Thr Ser Val Ala Phe Leu             420 425 430 Val Gln Met Arg Arg Gln His Arg Arg Gly Thr Lys Gly Gly Val Ser         435 440 445 Tyr Arg Pro Ala Glu Val Ala Glu Thr Gly Ala     450 455 <210> 4 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL2 / adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3 [Homo          sapiens] <400> 4 Met Gly Asp Ala Ala Ala Asp Pro Pro Gly Pro Ala Leu Pro Cys Glu   1 5 10 15 Phe Leu Arg Pro Gly Cys Gly Ala Pro Leu Ser Pro Gly Ala Gln Leu              20 25 30 Gly Arg Gly Ala Pro Thr Ser Ala Phe Pro Pro Pro Ala Ala Glu Ala          35 40 45 His Pro Ala Ala Arg Arg Gly Leu Arg Ser Pro Gln Leu Pro Ser Gly      50 55 60 Ala Met Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly Met Gln Glu Glu Ser Leu Gln  65 70 75 80 Gly Ser Trp Val Glu Leu His Phe Ser Asn Asn Gly Asn Gly Gly Ser                  85 90 95 Val Pro Ala Ser Val Ser Ile Tyr Asn Gly Asp Met Glu Lys Ile Leu             100 105 110 Leu Asp Ala Gln His Glu Ser Gly Arg Ser Ser Ser Lys Ser Ser His         115 120 125 Cys Asp Ser Pro Pro Arg Ser Gln Thr Pro Gln Asp Thr Asn Arg Ala     130 135 140 Ser Glu Thr Asp Thr His Ser Ile Gly Glu Lys Asn Ser Ser Gln Ser 145 150 155 160 Glu Glu Asp Asp Ile Glu Arg Arg Lys Glu Val Glu Ser Ile Leu Lys                 165 170 175 Lys Asn Ser Asp Trp Ile Trp Asp Trp Ser Ser Arg Pro Glu Asn Ile             180 185 190 Pro Pro Lys Glu Phe Leu Phe Lys His Pro Lys Arg Thr Ala Thr Leu         195 200 205 Ser Met Arg Asn Thr Ser Val Met Lys Lys Gly Gly Ile Phe Ser Ala     210 215 220 Glu Phe Leu Lys Val Phe Leu Pro Ser Leu Leu Leu Ser His Leu Leu 225 230 235 240 Ala Ile Gly Leu Gly Ile Tyr Ile Gly Arg Arg Leu Thr Thr Ser Thr                 245 250 255 Ser thro phe            

Claims (12)

아세틸화된 HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1), Sirt1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1), CA9(Carbonic anhydrase IX) 및 Bnip3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상 진단용 키트.Acetylated Hypoxia-Inducible Factor-1 (HIF-1), silent mating-type information regulation 2 homologue 1 (Sirt1), Carbonic anhydrase IX (CA9), and Bnip3 (BCL2 / adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) proteins Kit for diagnosing renal glomeruli or tubule cell damage, characterized in that it comprises an agent for measuring the level. 제1항에 있어서,
상기 신장 세뇨관 세포 손상은 Sirt1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1)이 감소하고, 아세틸화된 HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor-1)가 증가하되, CA9(Carbonic anhydrase IX) 및 Bnip3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) 증가하는 것을 특징으로 하는 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상 진단용 키트.The method of claim 1,
The renal tubular cell damage is reduced in the silent mating-type information regulation 2 homologue 1 (Sirt1), the acetylated HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor-1) is increased, CA9 (Carbonic anhydrase IX) and Bnip3 (BCL2) / adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) A kit for diagnosing renal glomeruli or tubule cell damage characterized by an increase. 제1항에 있어서,
상기 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상은 저산소 또는 약물에 의한 신장 세뇨관 손상인 것을 특징으로 하는 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상 진단용 키트. The method of claim 1,
The kidney glomeruli or tubule cell damage is renal glomeruli or tubule cell damage diagnostic kit, characterized in that the renal tubule damage by hypoxia or drugs. 제2항에 있어서,
상기 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 키트.The method of claim 2,
The agent is a kit, characterized in that the antibody that specifically binds to the protein. (a) 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상이 의심되는 피검체의 생물학적 시료로부터 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 Sirt1은 저하되고, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3는 증대되는 경우 신장 사구체 또는 세뇨관 세포의 손상이 발생하는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.(a) measuring the levels of Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins from biological samples of subjects suspected of renal glomeruli or tubule cell damage; And
(b) When the levels of the Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins were measured, Sirt1 was lowered and the acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 were increased compared to the normal control group. A method for providing information for diagnosing renal glomeruli or tubule cell damage, comprising determining that damage to tubule cells occurs. 제5항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 피검체로부터 분리된 소변, 혈액, 신장 조직, 신장 사구체 조직 또는 신장 세뇨관 조직인 것을 특징으로 하는 신장 사구체 또는 세뇨관 손상을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 5,
Wherein said biological sample is urine, blood, kidney tissue, renal glomerular tissue, or renal tubular tissue isolated from a subject. 제5항에 있어서,
상기 측정은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 것을 특징으로 하는 신장 사구체 또는 세뇨관 손상을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 5,
The measurement is characterized by Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS or protein chip How to provide information for diagnosing renal glomeruli or tubule damage. (Ⅰ) 약물에 의한 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상이 의심되는 생물학적 시료로부터 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(Ⅱ) 정상 대조군 시료로부터 상기 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하고, 상기 (Ⅰ) 단계의 측정 결과와 비교하는 단계를 포함하는 신장 사구체 또는 세뇨관 손상을 예측 및 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.(I) measuring the levels of Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins from biological samples suspected of drug renal glomeruli or tubular cell damage; And
(II) predicting renal glomeruli or tubule damage comprising measuring levels of said Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins from normal control samples and comparing them with the measurement results of step (I); and How to provide information for diagnosis. 제8항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 피검체로부터 분리된 소변, 혈액, 신장 조직, 신장 사구체 조직 또는 신장 세뇨관 조직인 것을 특징으로 하는 신장 사구체 또는 세뇨관 손상을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 8,
Wherein said biological sample is urine, blood, kidney tissue, renal glomerular tissue, or renal tubular tissue isolated from a subject. 제8항에 있어서,
상기 측정은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 것임을 특징으로 하는 신장 사구체 또는 세뇨관 손상을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법. The method of claim 8,
The measurement is characterized by Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS or protein chip How to provide information for diagnosing renal glomeruli or tubule damage. (ⅰ) 저산소 또는 신장 독성을 갖는 약물의 존재 하에서, 신장 사구체 또는 세뇨관 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(ⅱ) 상기 신장 사구체 또는 세뇨관 세포에서 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 측정된 Sirt1, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3 단백질의 수준을 정상 대조군과 비교하여, Sirt1은 증대되고, 아세틸화된 HIF-1, CA9 및 Bnip3는 저하되는 경우 상기 시험물질을 후보물질로 선택하는 단계;를 포함하는 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 억제하는 후보물질을 스크리닝하기 위한 방법.(Iii) treating the test substance with renal glomeruli or tubule cells in the presence of a drug having hypoxic or renal toxicity;
(Ii) measuring the levels of Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins in said renal glomeruli or tubule cells; And
(Iii) the test substance when Sirt1 is increased and acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 are lowered by comparing the levels of the Sirt1, acetylated HIF-1, CA9 and Bnip3 proteins measured with the normal control group; Selecting as a candidate; a method for screening a candidate for inhibiting renal glomeruli or tubular cell damage. 제9항에 있어서,
상기 (ⅱ) 단계에서 단백질 수준을 측정하기 위한 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신장 사구체 또는 세뇨관 세포 손상을 억제하는 후보물질을 스크리닝하기 위한 방법.The method of claim 9,
The method for measuring the protein level in step (ii) includes Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation A method for screening a candidate for inhibiting renal glomeruli or tubule cell damage, characterized in that it is any one selected from the group consisting of assays, FACS and protein chips.

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