KR20200004108A - Zpbp 유전자의 메틸화를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 이를 이용한 산자수 예측방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ZPBP 유전자의 메틸화를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 이를 이용한 예측방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 ZPBP 유전자의 메틸화를 이용하여, 다산성 돼지의 조기 선발 및 산자수를 예측할 수 있다.

Description

ZPBP 유전자의 메틸화를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 이를 이용한 산자수 예측방법{Composition for prediction of swine fecundity using methylation status of ZPBP gene and method for predictioin of swine fecundity using the same}

본 발명은 ZPBP 유전자의 메틸화를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 이를 이용한 예측방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 다산성 돼지를 조기에 선발할 수 있고 산자수를 정확하게 예측할 수 있는, 산자수 연관 ZPBP 유전자의 DNA 메틸화 마커, 이를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 이를 이용한 산자수 예측방법에 관한 것이다.

모돈의 최적의 생산성과 수태 효율을 유지하는 것은 양돈 산업의 경제적 측면에서 매우 중요한 요소이다. 그러나, 돼지의 산자수는 복잡한 생리학적 특성으로 인해 배란율, 수정력, 배아의 생존력 및 태아의 생존력과 같은 여러 요소에 의해 영향을 받게 된다. 이러한 복합적인 요인 때문에, 돼지의 산자수에 대한 유전력은 대략 10% 내외로, 낮은 편이다.

따라서, 환경적 요인과 유전적 요인에 의한 돼지 산자수에 대한 영향을 연구하기 위해서는 후성유전학(Epigenetics)적인 접근이 필요하다. 특히 DNA 메틸화(Mehtylation)는 화학적으로 매우 안정된 후성유전학적 변형으로 세대에 걸쳐 유전되는 특징이 있어, 상기 연구에 유용하다.

DNA의 메틸화는 초기 배아 발생이나 생식세포 발생 시기 등 포유류의 특정 발생 과정에서 생성되는 것으로 알려져 있으나, 체세포상에서의 DNA 메틸화 패턴은 안정적으로 유지된다.

또한, 비정상적인 DNA 메틸화는 암이나 여러 질병과도 연관되어 있는 것이 알려져 있다. 이러한 DNA 메틸화는 유전학적으로 다산능을 가진 모돈을 선발하는데 주요한 마커로 활용될 수 있으며, 기존의 교배를 통한 장기적이고 고비용이 드는 육종기술에 비해 단기간에 우수한 개체를 선발하여 산자수를 증대시킬 수 있는 기술이 필요한 실정이다.

수년간 호르몬 처치 등을 통해, 배란율이나 배아의 수를 증가시키는 기술은 다양하게 발전해왔다. 그러나, 배아의 수가 증가함에 따라, 새끼 돼지의 생존률과 생시 체중은 감소하는 것으로 나타났다. 이는 돼지의 자궁이 임신 중 지탱할 수 있는 새끼 돼지의 수가 제한적이기 때문이며, 산자수를 증가시키기 위해서는, 자궁의 생산능력(capacity)이 우수한 개체를 선발하는 것이 중요하게 인식된다. 예를들어, 중국의 재래종인 메이시안(Meishan)종은 자궁의 생산능력이 우수하여 산자수가 많은 것으로 이미 잘 알려져 있다.

본 발명에 대한 배경기술로 대한민국 등록특허 제10-185666(2018.05.01)호에는 돼지의 총산자수 예측용 SNP 마커 및 이를 이용한 예측방법에 대해 기재되어 있다.

본 발명의 목적은 다산성 돼지를 조기에 선발할 수 있고 산자수를 정확하게 예측할 수 있는, 산자수와 연관된 ZPBP 유전자의 후성유전체 마커(Epigenome marker) 및 이를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 예측용 조성물을 이용한 다산성 돼지를 조기 선발할 수 있는 돼지의 산자수 예측방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

일 측면에 따르면, ZPBP 유전자의 발현수준 및 메틸화 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 돼지의 산자수 예측용 조성물이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 메틸화 부위를 증폭할 수 있는 제제를 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 제제는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍을 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 CpG 부위의 메틸화 정도를 측정할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 메틸화 특이적 제한효소 쌍인 HpaII와 MspI을 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 돼지는 흑돼지일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 흑돼지는 버크셔일 수 있다.

다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트가 제공된다.

일 실시예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 DNA로부터 ZPBP 유전자의 발현수준 및 메틸화 정도를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 메틸화 정도가 평균 메틸화 수준보다 낮은 돼지를 그렇지 않은 돼지보다 더 높은 산자수를 갖는 돼지로 예측하는 단계를 포함하는 돼지의 산자수 예측방법이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 상기 피검체는 혈액, 모근 또는 자궁내막 조직일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 ZPBP 유전자의 발현수준 및 메틸화 정도를 측정하는 단계는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍으로 유전자를 증폭하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 메틸화 정도를 측정하는 단계는 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 파이로시퀀싱, 메틸화된 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제, 바이설파이트 시퀀싱 또는 PMP 어세이(Porcine methylation-specific restriction enzyme PCR assay)분석방법을 이용할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 본원의 예측용 조성물을 이용하면, 돼지의 혈액 또는 모근을 통해 손쉽게 피검체를 획득하여, 돼지의 산자수를 신속하고 정확하게 예측할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 본원의 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 예측방법을 이용하면, 다산성 개체를 조기 선발하여, 육종할 수 있고, 상기 우수한 돼지의 계통을 개량할 수 있어, 이를 통해 양돈 산업의 경쟁력 및 부가가치를 매우 높일 수 있다.

도 1은 돼지의 산자수에 따라 차이가 나는 DMR을 선발하기 위한 워크플로를 나타낸 도면이다.
도 2는 돼지의 산자수가 우수한 그룹(a)와 열등한 그룹(b)에서 전체 CpG영역과 CHG 영역에서 메틸화 수준의 분포를 백분율로 나타낸 도면이다.
도 3은 돼지의 산자수가 우수한 그룹(a)와 열등한 그룹(b)에서 CpG영역의 메틸화 수준의 분포를 지놈(genome) 수준에서 나타낸 도면이다.
도 4는 메틸화 차이를 보이는 영역의 유전자들을 기능에 따라 분류한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5는 돼지의 산자수가 우수한 그룹과 열등한 그룹의 혈액샘플로부터 메틸화 특이적 중합효소 연쇄반응(PMP assay)에 의한 ZPBP 유전자의 메틸화 수준을 보여주는 도면이다. U는 대조군으로써 제한효소를 처리하지 않은 DNA(Uncutted DNA)를 말한다.
도 6은 단순선형회귀분석을 통해 ZPBP유전자의 메틸화 마커와 돼지의 산자수 형질인 총산자수(TNB) 및 실산자수(NBA)의 상관관계를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.

그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 명세서에서의 용어 ‘메틸화’는 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부탁되는 것을 말한다. 본 발명에서 메틸화 여부는 특정 유전자의 특정 CpG 부뉘의 사이토신에서 일어나는 메틸화 여부를 의미한다. 메틸화가 일어난 경우, 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제되며, 반대로 비메틸화(메틸화가 일어나지 않은) 또는 저메틸화가 일어나는 경우, 특정 유전자의 발현이 증가하게 된다.

본 명세서에서 용어 ‘과메틸화(hypermethylation)’는 테스트되는 DNA 시료의 DNA 서열 내에서 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드에서 5-메틸시토신의 양이, 정상 대조군 DNA 시료 내에서의 대응하는 CpG 디뉴클레오티드에서 발견되는 5-메틸시토신의 양과 비교하여 증가되어 있는 메틸화 상태를 의미한다.

본 명세서에서 용어 ‘저메틸화(hypomethylation)’은 테스트되는 DNA 시료의 DNA 서열내에서 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드에서 5-메틸시토신의 양이, 정상 대조군 DNA 시료 내에서의 대응하는 CpG 디뉴클레오티드에서 발견되는 5-메틸시토신의 양과 비교하여 감소되어 있는 메틸화 상태를 의미한다.

본 명세서에서 용어 ‘프로브’는 표적 핵산과 부분적으로 또는 완전히 상보적인 핵산 가닥으로서, 표적 핵산과 염기 특이적인 방식으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 이에 한정하는 것은 아니나, 표적 핵산과 염기 특이적인 방식으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 적합할 수 있다. 상기 프로브는 핵산뿐만 아니라, 펩티드 핵산을 포함한 상보적 결합을 할 수 있는 종래 알려진 임의의 핵산 유도체가 포함된다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부한 도면들을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 흑돼지 종에서 지놈와이드 바이설파이트 시퀀싱(Genome wide bisulfite sequencing) 방법을 이용하여 돼지의 산자수 연관 유전자의 메틸화(methylation) 마커를 발굴하여 돼지의 산자수를 예측하여 산자수가 우수한 개체를 조기 선발할 수 있도록 하였다.

본 발명은 흑돼지 종에서, 산자수가 우수한 돼지와 열등한 돼지의 자궁조직으로부터 각각 gDNA(genomic DNA)를 분리하였다. 상기 분리한 gDNA를 지놈 와이드 바이설파이트 시퀀싱(Genome wide bisulfite sequencing)을 이용하여, 돼지의 산자수와 ZPBP 유전자의 메틸화(methylation)의 상관관계를 정립하였다. 이후 혈액샘플로부터, gDNA를 분리하여, 산자수 연관된 유전자의 메틸화 정도에 대해 PMP 어세이를 통해 메틸화 수준을 분석하고 산자수와 관련된 2가지 성질(평균총산자수 및 평균실산자수)과의 상관관계를 통계학적으로 분석하여, 최종적으로 돼지의 산자수 연관 유전자인 ZPBP의 메틸화 정도가 연관이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

일 측면에 따르면, ZPBP(NC_010451.3)유전자의 발현수준 및 메틸화 정도를 측정하는 제제를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 조성물이 제공될 수 있다.

투명대 결합단백질(zona pellucida binding protein, ZPBP) 유전자는 난자의 투명대 단백질에 결합하는 결합단백질로, 산자수가 우수한 돼지 그룹에서 저메틸화(Hypomethylation)되는 양상을 보이고, 산자수가 열등한 돼지 그룹에서 과메틸화(Hypermethylation)되는 양상을 보인다.

상기 ‘유전자의 발현 수준의 측정’은 mRNA 수준 또는 단백질 수준을 측정하는 것일 수 있다. 상기 ‘mRNA의 수준을 측정’은 이에 한정하는 것은 아니나, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호분석법, 노던 블롯팅, DNA 마이크로어레이 또는 종래 알려진 임의의 방법에 의하여 분석될 수 있다. 상기 유전자로부터 선택된 하나 이상의 유전자에 특이적인 프로브가 고정화되어 있는 마이크로어레이 상에 상기 생물학적 시료로부터 분리된 mRNA 또는 그로부터 유도된 cDNA를 혼성화시키고, 그 결과 얻어진 혼성화 정도를 측정함으로써 이루어질 수 있다. 상기 혼성화 정도는 형광 측정 및 전기적 측정과 같은 당업계에 알려진 임의의 측정 방법에 의하여 측정될 수 있다. 이 경우, 상기 프로브 또는 표적 핵산은 검출 가능한 적절한 표지로 표지되어 있을 수 있다. 상기 cDNA는 상기 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 마커 유전자를 표적으로 하는 센스 및 안티센스 프라이머 쌍을 프라이머로 한 RT-PCR에 의하여 직접적으로 증폭된 것일 수 있다.

상기 '단백질의 수준의 측정'은 종래 알려진 임의의 단백질 측정 또는 검출 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 분석방법이 사용될 수 있다. 항체를 이용한 단백질 분석 방법에는, 이에 한정하는 것은 아니나, 웨스턴블롯팅, ELISA, 방사선 면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역기 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법 및 FACS 등에서 선택될 수 있다. 상기 ELISA에는 직접적 ELISA, 간접적 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA 및 간접적 샌드위치 ELISA 등이 포함될 수 있다.

상기 웨스턴 블롯팅이란, 전체 단백질을 분리하고, 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시키고, 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법이다. 그 외에 단백질 수준을 측정하는 방법에는, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 효소, 기질, 조효소, 리간드 등을 이용하는 방법이 사용될 수 있다.

또한, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 시료로부터 분리된 RNA를 주형으로 한, 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의하여 수행된 핵산 증폭에 의하여 얻어진 증폭 산물의 양을 측정함으로써 결정되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, "메틸화 정도를 측정하는 제제"란, 유전자의 메틸화 수준을 검출 또는 증폭할 수 있다면 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 공지의 수단을 이용할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 메틸화 마커를 증폭 및 PMP assay 방법을 통해 판독하여 돼지의 산자수를 예측할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 상기 메틸화 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 및 PMP assay 방법에 이용되는 메틸화 특이적 제한효소를 의미할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 메틸화 특이적 제한효소 쌍인 HpaII와 MspI을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자의 메틸화 수준은 피검체로부터 분리된 gDNA가 메틸화 특이적 제한효소에 의해 절단된 DNA를 주형으로 한, 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의하여 수행된 핵산 증폭에 의하여 얻어진 증폭 산물의 양을 측정함으로써 결정되는 것일 수 있다.

상기 조성물에는 시료 중의 상기 마커 유전자 또는 그로부터 발현된 핵산 발현 산물과의 혼성화 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물에는 상기 프로브를 안정화시키고, 반응의 매질이 되는 버퍼, 용매 등을 더 포함할 수 있다.

프로브와 표적 핵산의 결합(일반적으로, 혼성화)은, 서열 의존적으로 일어나는 것으로 다양한 조건에서 수행될 수 있다. 일반적으로 혼성화 반응은 특정한 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 Tm 보다 약 5℃ 낮은 온도에서 이루어진다. 상기 Tm은 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%가 표적 서열에 결합한 상태를 의미한다. 혼성화 반응 조건의 예는, pH 7.0 내지 8.3에서 0.01 내지 1.0M Na⁺ 이온 농도일 수 있다. 또한, 표적 핵산과 프로브의 특이성을 높이기 위하여 표적 핵산과 프로브의 결합을 불안정하게 하는 조건, 예를 들면, 높은 온도, 높은 농도의 불안정화제(예를 들면 포름아미드)의 존재하에서 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 메틸화 정도의 측정은 다음과 같은 방법을 활용할 수 있다.

1. 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR)

게놈 DNA에 바이설파이트(bisulfite)를 처리하면 5'-CpG-3' 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비 메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 대하여 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비 메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하고, 게놈 DNA를 바이설파이트로 변환시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비 메틸화인 경우에는 비 메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어지므로 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.

2. 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR)

실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 게놈 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TanMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 LCgreen을 이용하여 검출할 수 있다. 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다.

3. 파이로시퀀싱

파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 시퀀싱 방법을 정량적인 실시간 시퀀싱으로 변환한 방법이다. 바이설파이트 시퀀싱과 마찬가지로 게놈 DNA를 바이설파이트를 처리하여 전환시킨 다음, 5'-CpG-3' 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하고 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 상기 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 시퀀싱 프라이머를 이용하여 실시간 염기서열 분석을 수행하면 5'-CpG-3' 부위에서 시토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메틸화 정도를 지수로 나타낼 수 있다.

4. 메틸화된 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩

메틸화된 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 게놈 DNA를 메틸화된 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하고 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정할 수 있다.

또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션 시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다.

5. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제

차별적 메틸화의 측정은 메틸화되지 않은 CpG 부위만을 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 핵산 샘플을 접촉시켜 비 메틸화된 핵산을 절단하는 것으로 수행할 수 있다.

상기 "메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제"는 인식 부위에 CG를 포함하고, C가 메틸화되지 않았을 때와 비교하여 C가 메틸화되었을 때 활성을 가지는 제한효소이다. 예를 들면, SmaI가 적합할 수 있다. 상기 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 비제한적 예로써는, MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI 효소에서 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 다른 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레오티드로는 SacII 및 EagI를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머(isochizomer)는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 동일한 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제이며, 메틸화된 CGs와 비 메틸화된 CGs를 모두 절단하는데, 예를 들면, MspI가 있다.

6. 바이설파이트 시퀀싱

메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비 메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비 메틸화 핵산을 구별하여 메틸화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이에 한정하는 것은 아니나, 상기 증폭 단계는 더 포함될 수 있다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메틸화 및 비 메틸화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이다. 미국특허 제5,786,146호에는 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트 시퀀싱에 관하여 기재되어 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 메틸화 정도를 증폭할 수 있는 제제를 더 포함할 수 있다. 상기 제제는 프라이머쌍을 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 메틸화되어 바이설페이트에 의해 변형되지 않은 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다. 상기 프라이머는 이에 한정하는 것은 아니나, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍일 수 있다(표 6 참조).

일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 CpG 부위의 메틸화 정도를 측정할 수 있다. 상기 유전자의 CpG부위란 상기 유전자의 DNA 상에 존재하는 CpG 부위를 의미한다. 상기 유전자의 DNA는 상기 유전자가 발현하는데 필요하며, 서로 작동가능하게 연결되어 있는 일련의 구성 단위를 모두 포함하는 개념으로, 이에 한정하는 것은 아니나, 프로모터 영역, 단백질코딩영역(open reading frame, ORF) 및 터미네이터(terminator) 영역을 포함할 수 있다. 본 발명에서는 ZPBP 유전자의 특정 CpG 위치에서 일어나는 메틸화 정도를 측정하여, 메틸화 정도가 평균 메틸화 정도 이상일 경우, 다산성 돼지라고 예측할 수 있음을 확인하였다. 유전자의 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키기 위하여, 이에 제한되는 것은 아니나, 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염을 이용할 수 있다. 상기 바이설파이트 또는 이의 염을 이용하면, 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 CpG 부위의 메틸화 여부를 검출할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 돼지는 흑돼지일 수 있다. 이에 한정하는 것은 아니나, 상기 흑돼지는 버크셔가 더 적합할 수 있다.

다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트가 제공될 수 있다. 상기 키트는 메틸화 검출에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 조성물 및 키트에는 상기 제제 이외에도 중합효소, 아가로스 전기영동에 필요한 완충 용액 등이 추가로 포함될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 키트는 이에 한정하는 것은 아니나, RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있고, 이외 당해 업계에서 잘 알려진 키트일 수 있다.

다른 측면에 따르면, 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 DNA로부터 ZPBP 유전자의 발현수준 및 메틸화 정도를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 메틸화 정도가 평균 메틸화 수준보다 낮은 돼지를 그렇지 않은 돼지보다 더 높은 산자수를 갖는 돼지로 예측하는 단계를 포함하는, 돼지의 산자수 예측방법이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 상기 피검체는 혈액, 모근 또는 자궁내막 조직일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 ZPBP 유전자의 발현수준 및 메틸화 정도를 측정하는 단계는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍으로 유전자를 증폭하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 메틸화 정도를 측정하는 단계는 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 파이로시퀀싱, 메틸화된 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제, 바이설파이트 시퀀싱 또는 PMP 어세이(Porcine methylation-specific restriction enzyme PCR assay)분석방법이 이용될 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예

I. DNA 메틸화 프로파일링

1. 자궁 내막조직 채취 및 지노믹 DNA 추출

DNA 메틸화 프로파일링을 위해, 흑돼지(Berkshire) 모돈은 표 1과 같이 산자수가 우수한 그룹(평균 산자수 11두 이상)과 열등한 그룹(평균 산자수 7두 이하)으로 나누어 각각 3두씩 선정하였다. 자궁 내막조직은 도축 직후 자궁각에서 일정량을 절취하고 인산완충용액(PBS)으로 씻어 액체질소로 얼려서 사용하였다.

지노믹 DNA (gDNA)는 DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 기 채취한 자궁 내막조직으로부터 분리하였고, NanoDrop™ ND-1000 분광광도계(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 통해 지노믹 DNA를 정량 및 정성 분석하여 준비하였다.

2. 지놈 와이드 바이설파이트 시퀀싱(Genome wide bisulfite sequencing; GWBS) 분석

EZ DNA Methylation-Gold™ Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA)를 사용하여 지노믹 DNA 샘플 6 μg에 소듐 바이설페이트(sodium bisulfite)을 처리하였다. 바이설페이트(Bisulfite)에 의한 전환된 DNA산물은 Quant-iT™ dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Life Technologies, Rockville, MD, USA)를 이용하여 정량하였고 Illumina HiSeq 2500 플렛폼(Illumina, San Diego, CA, USA)로 분석하였다.

3. DNA 메틸화 프로파일링 및 돼지 산자수 연관 DMR 선별

전체 지놈 DNA 메틸화 프로파일링에 대하여, 메틸화가 발생한 부위(site)를 계수(counting)한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 산자수가 우수한 그룹과 열등한 그룹 모두 CG 부위에서 우월적으로 메틸화가 발생하였다. 상대적으로 CHG 부위는 매우 낮은 메틸화 경향을 보였다. 메틸화가 발생한 부위는 로리드(raw read)에서 산자수가 우수한 그룹 및 열등한 그룹이 각각 1,249백만개와 1,217백만개가 확인되었고, 그 중 각각 53.08%와 50.48%가 돼지 지놈에 맵핑되었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 지놈 수준에서 각 구조에 대한 평균 CG 메틸화를 측정해 본 결과 TSS (transcription start site) 주위에서 메틸화 수준이 낮아지고, 전사된 위치(Transcribed site, gene body)부분에서는 평균 75% 수준으로 나타나는 것으로 관찰되었다.

또한, TTS (transcription termination site) 및 다운스트림(downstream) 1 kb에서는 전사된 위치(Transcribed resion, gene body) 보다 약간 낮은 메틸화 빈도가 관찰되었다. 결론적으로, 산자수 그룹에 따른 전사된 영역(gene body)에서의 메틸화 빈도 분포 패턴은 일반적으로 유사한 것으로 나타났다.

도 1에 나타난 워크플로우에 따라, 돼지의 산자수에 따라 차이가 나는 메틸화 위치(Differentially methylated region, DMR)를 분석하였다. 그 결과, 하기 표 2에 기재된 바와 같이 과메틸화 위치(Hypermethylated region) 1,566개와 저메틸화 위치(Hypomehtylated region) 1,703개가 확인되었다.

특히, 지놈 구조상에서 CG 부위에 DMR의 분포는 프로모터 (up1kb)에서 92개, 전사된 위치(cording sequence(CDS), 인트론(intron))에서 1,313개이다(표 3 참고).

도 4에 나타난 바와 같이, DMR을 이용하여 유전자들을 기능별로 분석하기위해 GO(gene ontology) 분석을 실시하였다. 과메틸화 영역은 세포골격조직(cytoskeleton organization), 인산화(phosphorylation), 세포부착(cell adhesion)에 해당하는 유전자들로 이루어져 있으며 저메틸화 되는 영역은 대표적으로 원형질막 부위(plasma membrane part)에 해당하는 유전자들과, 배아형태발생(embryonic morphogenesis), 유전자발현 저해조절(negative reulation of gene expression)로 이루어져 있었다.

이들 중 돼지 산자수와 연관된 메틸화 마커를 선별하기 위해, 생식(reproduction)에 해당하는 유전자를 대상으로 메틸화 차이 0.2 이상, P value < 0.01 및 FDR (Q value) < 0.01에 부합하는 유전자를 선별하였고, 그 결과 ZPBP 유전자가 선발되었다(표 4 참조).

II. ZPBP 유전자의 DNA 메틸화 마커의 유용성과 재현성 검증

1. 혈액 채취 및 동물정보 수집

선별된 유전자의 DNA 멜틸화의 재현성 검증을 위해, 흑돼지(Berkshire) 종 모돈 137두에서 혈액을 채취하고 각 모돈의 평균 총산자수(Avg. of TNB; Average of total number of born) 및 평균 실산자수(Avg. of NBA; Average of number of born alive)를 확인하였다(표 5 참조).

2. 메틸화 특이적 중합효소 연쇄반응(PMP assay; Porcine methylation-specific restriction enzyme PCR assay)

메틸화 특이적 중합효소 연쇄반응(PMP assay)는 메틸화 특이적 제한효소를 이용하여 특정 CpG 사이트의 메틸화 정도를 직접적으로 평가할 수 있는 간단한 방법이다.

재현성 검증을 위해, 지노믹 DNA는 DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 추출하였다. 지노믹 DNA 10 μg/μL는 메틸화 특이적 제한효소 쌍(mehtylation-sensitive isoschizomer)인 HpaII(메틸화 특이 제한효소)와 MspI(메틸화 비특이 제한효소)를 이용하여 절단한 뒤, 표 6의 ZPBP 유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머(oligonucleotide primers)를 이용하여 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 전기영동하여 밴드의 강도를 확인하여 메틸화 정도를 분석하였다(표 6 참조).

3. 통계분석

ZPBP 유전자의 메틸화 정도와 돼지의 산자수 형질(총산자수, 실산자수)들과의 상관관계는 SPSS (IBM Statistics SPSS Statistics, Inc., Somers, NY, USA) 프로그램 (version 20.0)을 사용하여 단순선형회귀분석을 통해 분석하였다.

4. 혈액샘플에서 메틸화 마커로써 ZPBP 유전자의 유용성 확인

돼지의 자궁조직에서 산자수에 따라 메틸화 차이를 보이는 ZPBP 유전자를 메틸화 마커로써의 가능성을 돼지의 혈액샘플에서 검증하였다. 이는 돼지를 혈액샘플을 이용하여 산자수가 우수한 돼지를 조기에 선발하기 위해 필수적인 과정으로, 혈액의 지노믹 DNA에서 ZPBP 유전자의 메틸화 패턴이 자궁조직에서의 결과와 일치하는지 확인하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 혈액샘플에서 메틸화 특이적 중합효소 연쇄반응(PMP assay)에 의한 ZPBP 유전자의 메틸화 정도는 자궁조직에서 바이설페이트 시퀀싱(bisulfite sequcing)에 의한 결과와 동일하게 산자수가 우수한 그룹에서 저메틸화(Hypermethylation)되는 양상을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 ZPBP 유전자의 메틸화가 혈액을 이용하여 산자수가 우수한 돼지를 조기에 선발하기 위한 마커로서 유용할 수 있음을 보여주는 것이다.

5. PMP assay에 의해 ZPBP 유전자의 DNA 메틸화 마커 검증

ZPBP 유전자의 DNA 메틸화 마커 검증을 위해, 흑돼지(Berkshire) 종 모돈 137두의 혈액샘플에서 PMP assay 통해 ZPBP 유전자의 메틸화 정도와 돼지의 산자수 형질인 총산자수(TNB)과 실산자수(NBA)의 상관관계를 분석하였다.

하기 표 7에서와 같이, ZPBP 유전자의 메틸화 정도와 평균총산자수(Average of TNB)는 비표준화계수(unstandardized coefficients)에 의해 평균총산자수(y) = -6.6545 * ZPBP(x) + 11.096와 같은 회귀식이 도출되었으며, ZPBP 유전자의 메틸화 정도에 대한 회귀계수는 음의 값을 가지며, 통계적으로 유의한 것으로 나타났다.

따라서, ZPBP 유전자의 메틸화 정도는 흑돼지 모돈의 평균총산자수에 영향을 미치며, 특히 회귀계수가 음의 값을 가지고 있으므로 ZPBP 유전자의 메틸화가 감소할수록 총산자수가 증가하는 음의 상관관계를 가지는 것으로 확인되었다. 이때, t 값은 비표준화계수를 표준오차로 나눈값이 된다.

또한, 하기 표 8에서와 같이, ZPBP 유전자의 메틸화 마커와 평균실산자수(Average of NBA)는 비표준화계수(unstandardized coefficients)에 의해 평균실산자수(y) = -5.1436 * ZPBP(x) + 9.5116과 같은 회귀식이 도출되며, ZPBP 유전자의 메틸화 마커에 대한 회귀계수는 음의 값을 가지며, 통계적으로 유의한 것으로 나타났다.

따라서, ZPBP 유전자의 메틸화 마커는 흑돼지 모돈의 평균실산자수에 영향을 미치며, 특히 회귀계수가 음의 값을 가지고 있으므로 ZPBP 유전자의 메틸화 감소할수록 실산자수가 증가하는 음의 상관관계를 가지는 것으로 확인되었다.

이상 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량할 수 있음이 명백하다. 본 발명의 단순한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

Claims (13)

1. ZPBP 유전자의 발현수준 및 메틸화 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 돼지의 산자수 예측용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 메틸화 부위를 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 제제는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는, 돼지의 산자수 예측용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 CpG 부위의 메틸화 정도를 측정하는, 돼지의 산자수 예측용 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   메틸화 특이적 제한효소 쌍인 HpaII와 MspI을 포함하는, 돼지의 산자수 예측용 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 돼지는 흑돼지인, 돼지의 산자수 예측용 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 흑돼지는 버크셔인, 돼지의 산자수 예측용 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 돼지의 산자수 예측용 조성물을 포함하는, 돼지의 산자수 예측용 키트.
9. 제8항에 있어서,
   상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 돼지의 산자수 예측용 키트.
10. 돼지 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계;
    상기 DNA로부터 ZPBP 유전자의 발현수준 및 메틸화 정도를 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 메틸화 정도가 평균 메틸화 수준보다 낮은 돼지를 그렇지 않은 돼지보다 더 높은 산자수를 갖는 돼지로 예측하는 단계를 포함하는, 돼지의 산자수 예측방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 피검체는 혈액, 모근 또는 자궁내막 조직인, 돼지의 산자수 예측방법.
12. 제10항에 있어서,
    상기 ZPBP 유전자의 발현수준 및 메틸화 정도를 측정하는 단계는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍으로 유전자를 증폭하는 단계를 더 포함하는, 돼지의 산자수 예측방법.
13. 제10항에 있어서,
    상기 메틸화 정도를 측정하는 단계는 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 파이로시퀀싱, 메틸화된 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제, 바이설파이트 시퀀싱 또는 PMP 어세이(PCR assay) 분석방법을 이용하는, 돼지의 산자수 예측방법.
    

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