KR20190131981A

KR20190131981A - Pharmaceutical composition for use in preventing or treating Traumatic Brain Injury or stroke

Info

Publication number: KR20190131981A
Application number: KR1020180057084A
Authority: KR
Inventors: 최환근; 고은화; 고이경; 박진희; 이태관; 김희정; 이병대; 부영민; 배진현; 배윤희
Original assignee: 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단; 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2019-11-27
Also published as: WO2019221566A1

Abstract

The present invention pertains to a pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke. The pharmaceutical composition contains an LRRK2 inhibitor as an active component, exhibits the expression of wild-type LRRK2 which is overexpressed in traumatic brain injury or stroke, protects or repairs damage to neurons induced by traumatic brain injury or stroke, alleviates neurological behavioral outcomes or neuropathy occurring after traumatic brain injury, and has an excellent effect of treating, relieving, or alleviating brain pathologies caused by traumatic brain injury, thereby being able to be usefully used for treating traumatic brain injury or stroke.

Description

외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for use in preventing or treating Traumatic Brain Injury or stroke}Pharmaceutical composition for use in preventing or treating Traumatic Brain Injury or stroke}

외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.It relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke.

단백질 키나제는 아데노신삼인산(ATP)의 말단 인산기를 단백질의 특정 잔기(타이로신, 세린, 트레오닌)에 전이시키는 반응을 촉매하는 효소로서, 세포 매개체 및 환경의 변화에 대한 세포의 활성, 성장 및 분화를 조절하는 신호에 관여한다.Protein kinases are enzymes that catalyze the reaction that transfers the terminal phosphate groups of adenosine triphosphate (ATP) to specific residues of the protein (tyrosine, serine, threonine), and regulates cell activity, growth and differentiation against changes in cell mediators and the environment. Is involved in the signal.

부적절하게 높은 단백질 키나제 활성은 비정상 세포 작용으로부터 기인하는 다수의 질병과 직접적 또는 간접적으로 연관이 있다. 예를 들면, 돌연변이, 과잉-발현 또는 부적절한 효소 활성에 관련된 키나제의 적절한 조절메카니즘의 실패, 또는 사이토카인 또는 키나제의 업스트림 또는 다운스트림의 신호 전달에 참여하는 인자들의 과잉 또는 결핍 생성에 의해 질병이 야기될 수 있다. 따라서, 키나제 활성의 선택적인 억제는 질병 치료를 위한 신약 개발의 유익한 표적이 될 수 있다.Inappropriately high protein kinase activity is directly or indirectly associated with many diseases resulting from abnormal cellular action. For example, the disease may be caused by mutations, over-expression, or failure of the proper regulation of kinases involved in inappropriate enzyme activity, or by the production of excess or deficiency of factors involved in signal transduction upstream or downstream of cytokines or kinases. Can be. Thus, selective inhibition of kinase activity can be a beneficial target of drug development for disease treatment.

LRRK2(leucin-rich repeat kinase-2)는 류신 풍부 반복 키나제 집단(leucin-rich repeat kinase family)에 속하는 단백질이며, 종간 유사성이 높은 2527개의 아미노산 배열로 구성되어 있고, 특징적으로 하나의 단백질 안에 GTP 가수분해효소(GTPase)와 세린-트레오닌 키나제(Serine-threonine kinase) 활성을 모두 가지고 있다. 발현된 LRRK2는 뇌를 포함한 다양한 기관과 조직에서 관찰되고 있으며, 세포수준에서는 세포질 또는 세포막 및 미토콘드리아 외막에서 존재하는 것으로 알려져 있다. 현재 LRRK2의 정확한 생체 내 기능에 대해서는 연구가 활발히 진행되고 있는데, 기능상 중요한 5개의 도메인(domain)을 가지고 있어, 자가 인산화 작용(Autophosphorylation)에 의한 자가활성조절작용과 단백질 상호작용 및 효소작용을 통한 세포기능 조절작용이 예상되고 있으며, 특히 샤페론기전(chaperone machinery), 세포골격 배열(cytoskelecton arrangement), 단백질번역기전(protein translational machinery), 시냅스소포 세포내 유입(synaptic vesicle endocytosis), 미토젠-활성화 단백질 키나제 신호 전달과정(mitogen-activated protein kinases signaling cascades), 유비퀴틴/오토파지단백질 분해과정(ubiquitin/autophage protein degradation pathways)이 LRRK2에 의해 조절되는 것으로 알려져있다.LRRK2 (leucin-rich repeat kinase-2) is a protein belonging to the leucin-rich repeat kinase family and consists of 2527 amino acid sequences with high similarity between species. It has both GTPase and Serine-threonine kinase activity. The expressed LRRK2 is observed in various organs and tissues including the brain, and is known to exist in the cytoplasm or cell membrane and mitochondrial outer membrane at the cellular level. Currently, research on the exact in vivo function of LRRK2 is being actively conducted. As it has five functionally important domains, it is possible to regulate cell activation through autophosphorylation, protein interaction and enzyme reaction. Function regulation is expected, especially chaperone machinery, cytoskelecton arrangement, protein translational machinery, synaptic vesicle endocytosis, mitogen-activated protein kinase Mitogen-activated protein kinases signaling cascades and ubiquitin / autophage protein degradation pathways are known to be regulated by LRRK2.

또한, LRRK2는 알츠하이머병과 관련된 경도인지 손상의 전가, L-도파(Dopa) 유도된 운동 이상증, 뉴런 전구 분화와 관련된 CNS 장애, 암, 예컨대 신장암, 유방암, 전립선암, 혈액암 및 폐암 및 급성 골수성 백혈병, 유두상(papillary) 신장 및 갑상선 암종, 다발성 골수종, 근위축성 측삭 경화증, 류마티스 관절염 및 강직 척추염과 관련된 것으로 보고된 바 있어(특허문헌 1), LRRK2 활성을 조절하는 데에 효과적인 화합물 및 조성물은 신경퇴행성 질환, CNS 장애, 암, 급성 골수성 백혈병 및 다발성 골수종, 및 염증성 질환등의 치료효과를 제공할 수 있다.In addition, LRRK2 is also implicated in mild cognitive impairment associated with Alzheimer's disease, L-Dopa induced dyskinesia, CNS disorders associated with neuronal progenitor differentiation, cancers such as kidney cancer, breast cancer, prostate cancer, hematologic and lung cancer and acute myeloid Compounds and compositions effective in regulating LRRK2 activity have been reported to be associated with leukemia, papillary kidney and thyroid carcinoma, multiple myeloma, amyotrophic lateral sclerosis, rheumatoid arthritis and ankylosing spondylitis (Patent Document 1). Therapeutic effects such as neurodegenerative diseases, CNS disorders, cancer, acute myeloid leukemia and multiple myeloma, and inflammatory diseases.

한편, 외상성 뇌손상(Traumatic Brain Injury, TBI)은 외부 충격이 두부에 가해져 뇌에 손상이 발생하는 것으로, 뇌조직은 다른 조직에 비하여 자가 치료능력이 떨어짐으로 인하여 손상에 따른 운동 및 인지 기능의 영구적 손실과 기능 이상이 발생할 가능성이 높다. 신경세포의 기본적 특성으로 인하여 외상성 뇌손상에 수반하는 신경세포의 손실은 되돌릴 수 없으며, 일차적 손상으로 인하여 발생한 신경세포 손실을 최소화하며 더 이상 확장되지 않도록 조절하는 것이 기본적인 치료 전략이며, 현재 외상성 뇌손상의 치료제는 신경세포 사멸을 직접적으로 조절하거나, 뇌염증, 뇌부종, 흥분성 독성을 조절을 통한 간접적 신경세포 사멸을 억제할 수 있는 표적에 대한 치료제 개발이 주를 이루고 있다.Traumatic Brain Injury (TBI) is an external shock that affects the brain and causes damage to the brain. Brain tissues are less self-healing than other tissues. Loss and malfunction are likely. Due to the basic characteristics of neurons, the loss of neurons accompanying traumatic brain injury cannot be reversed, and the basic treatment strategy is to minimize the neuronal loss caused by primary damage and to prevent it from expanding anymore. The main focus of the treatment is to develop a therapeutic agent for a target that can directly control neuronal cell death or indirect neuronal cell death by controlling encephalitis, brain edema and excitatory toxicity.

현재까지 외상성 뇌손상 환자에게 사용이 되고 있는 대부분의 약물의 경우 뇌부종 감소, 뇌염증 반응 완화, 흥분성 독성 감소 등의 목적으로 사용이 되고 있으나, 상기 약물들의 경우 신경세포 손상을 직접적으로 조절하지 못하며 간접적 신경보호 효능을 가지는 한계를 가지고 있다.Most drugs that have been used in patients with traumatic brain injury have been used for the purpose of reducing brain edema, alleviating encephalopathy, and reducing excitatory toxicity. However, these drugs do not directly control neuronal damage and are indirect. There is a limit to neuroprotective efficacy.

이에, 그럼으로 현재 사용되고 있는 외상성 뇌손상 치료는 20년간의 진보에도 불구하고 사망률과 후유증의 발생률 감소에 효과적이지 못하며, 현재, 외상성 뇌손상의 병리적 현상을 대변하는 표적에 대한 치료제는 전무한 상황이며, 기존 치료 한계를 극복을 통한 보다 효과적 외상성 뇌손상 치료를 위한 신규 표적 치료제의 개발이 필요하다.Therefore, the current traumatic brain injury treatment is not effective in reducing mortality and the incidence of sequelae, despite 20 years of progress, and currently there is no treatment for targets representing pathological symptoms of traumatic brain injury. In addition, there is a need for the development of new targeted therapies for more effective traumatic brain injury treatment, overcoming existing limitations.

또한, 뇌졸중은 크게 뇌혈관이 막히는 허혈성 뇌졸중(뇌경색)과 뇌혈관이 터지는 출혈성 뇌졸중(뇌출혈)으로 구분된다. 허혈성 뇌졸중의 경우에서는 혈관의 동맥경화증으로 인한 뇌동맥의 혈전이나 색전과 심장질환 등에 의한 심인성 색전이 주된 원인이며, 뇌출혈의 경우는 고혈압에 의한 원발성 뇌출혈과 동정맥 기형이나 동맥류에 의한 지주막하 출혈이 중요한 원인이다.In addition, the stroke is largely divided into ischemic stroke (cerebral infarction) in which cerebrovascular occlusion and hemorrhagic stroke (cerebral hemorrhage) in which cerebrovascular burst. In ischemic stroke, the main cause is thromboembolism of the cerebral artery due to vascular atherosclerosis, or cardiac embolism due to embolism and heart disease.In case of cerebral hemorrhage, primary cerebral hemorrhage due to hypertension and subarachnoid hemorrhage due to arteriovenous malformation or aneurysm are important. to be.

뇌혈관이 막혀서 발생하게 되는 뇌경색은 다시 뇌혈전증과 뇌색전증으로 구분되는데, 뇌혈전증은 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 등에 의하여 동맥경화증이 초래되어 동맥의 벽이 두꺼워지거나 딱딱해지게 되고, 이로 인해 혈관이 좁아지고 혈관의 안벽이 상처받기 쉬워 매끄럽지 못해서 피가 엉겨 붙으면서 결국 막히게 되어 혈액의 공급이 현저히 줄거나 중단되어 뇌세포로 가는 산소 및 영양공급이 부족하여 뇌기능의 장애가 초래되는 경우에 해당하며, 뇌색전증은 심장판막증 또는 심방세동 등의 질환에 의하여 심장 내의 피의 흐름에 이상이 생겨 혈액의 일부가 심장 내에 부분적으로 정체, 응고되어 피찌꺼기(혈전)가 생기게 되며, 이것이 떨어져 나가 뇌혈관을 막게되어 뇌경색이 발생하게 된다.Cerebral infarction caused by clogged cerebral blood vessels is divided into thrombosis and cerebral embolism. Cerebrothrombosis is caused by arteriosclerosis due to hypertension, diabetes, hyperlipidemia, and the walls of arteries are thickened or hardened. The inner wall is susceptible to wounds, so it is not smooth, and the blood is entangled and eventually clogged, and the supply of blood is reduced or stopped, resulting in a lack of oxygen and nutrient supply to brain cells, leading to disorders of the brain function. Or atrial fibrillation or other diseases cause blood flow in the heart, part of the blood partially stagnated, coagulate in the heart, resulting in blood clots (thrombosis), which fall off to block the cerebral blood vessels resulting in cerebral infarction. .

뇌출혈의 경우에는 고혈압으로 인해 뇌혈관 내의 압력도 높아지기 때문에 작은 혈관의 벽이 견디지 못하고 터지는 원발성 뇌출혈, 혈관벽의 일부가 약해서 그 약한 부분의 벽이 늘어나 꽈리모양으로 불거져 나온 상태인 뇌동맥류가 어떤 계기에 터져서 발생하는 지주막하 출혈, 뇌동정맥 기형이 선천적으로 존재해 동맥의 높은 압력정맥으로 직접 전달되어 발생하는 뇌출혈로 나누며, 이 외에 혈액응고의 장애로 출혈 소인을 가진 경우에도 발생하게 된다.In the case of cerebral hemorrhage, the pressure in the cerebral blood vessels is increased due to high blood pressure, so that the walls of the small blood vessels are not able to withstand the small blood vessels. Subarachnoid hemorrhage, cerebral arteriovenous malformation caused by bursting is inherently present and is divided into cerebral hemorrhage caused by direct delivery to high pressure veins of arteries.

현재 뇌졸중 치료방법으로서는 항혈전제, 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등을 이용한 약물요법이 사용되고 있으나, 현재 유일하게 허가된 약물인 항혈전제(tPA)는 뇌경색 발생 후 4~5 시간 이내에만 효과를 나타낸다. 하지만, tPA는 출혈성 뇌졸중의 경우 병을 더욱 악화시키게 되며, 알러지 등의 부작용을 유발하게 된다. 즉, 뇌졸중은 진단도 쉽지 않고 조기 발견이 어려우며 아직까지도 근본적인 치료법이 없는 상태이다.Currently, anti-thrombotic, anticoagulant, antiplatelet, and thrombolytic drugs are used as a treatment for stroke, but currently the only approved drug, anti-thrombotic drug (tPA), is effective only within 4 to 5 hours after the occurrence of cerebral infarction. . However, tPA worsens the disease in case of hemorrhagic stroke and causes side effects such as allergy. In other words, stroke is difficult to diagnose, difficult to detect early, and there is no fundamental treatment yet.

WO 2007/149789WO 2007/149789

본 발명의 일 목적은, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke containing an LRRK2 inhibitor as an active ingredient.

또한, 본 발명의 다른 목적은 LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.In addition, another object of the present invention to provide a health functional food composition for the prevention or improvement of traumatic brain injury or stroke containing an LRRK2 inhibitor as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above object,

본 발명의 일 측면에 따라, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.According to one aspect of the invention, there is provided a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke containing an LRRK2 inhibitor as an active ingredient.

본 발명의 다른 측면에 따라, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물이 제공된다.According to another aspect of the invention, there is provided a health functional food composition for the prevention or improvement of traumatic brain injury or stroke containing an LRRK2 inhibitor as an active ingredient.

본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.According to another aspect of the invention, a traumatic brain injury or stroke comprising the step of administering to the subject a pharmaceutical composition or health functional food composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke containing the LRRK2 inhibitor as an active ingredient A method of preventing or treating is provided.

본 발명의 다른 측면에 따라, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료에 있어서의, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물의 용도가 제공된다.According to another aspect of the invention, the use of a pharmaceutical composition or health functional food composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke containing an LRRK2 inhibitor as an active ingredient in the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke Is provided.

본 발명에 따른 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하며, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중에서 과발현하는 야생형 LRRK2의 발현을 억제하고, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중으로 인해 유도된 손상된 신경세포를 보호 또는 회복시키고, 외상성 뇌손상 후 발생된 신경 행동 결과 또는 신경병증 현상을 개선시키고, 외상성 뇌손상에 의해 발생된 뇌병리 현상을 치료, 완화 또는 개선시키는 효과가 우수하므로, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke according to the present invention contains an LRRK2 inhibitor as an active ingredient, inhibits the expression of wild-type LRRK2 overexpressing in traumatic brain injury or stroke, and due to traumatic brain injury or stroke It is effective in protecting or restoring induced damaged neurons, improving neurobehavioral or neuropathy symptoms after traumatic brain injury, and treating, alleviating or ameliorating brain pathology caused by traumatic brain injury. It can be usefully used for the treatment of traumatic brain injury or stroke.

도 1은 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 LRRK2 발현 증가 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 외상성 뇌손상 마우스 뇌 조직에서의 LRRK2 mRNA의 발현 수준을 분석하여 나타낸 것이다.
(b): 외상성 뇌손상 마우스 뇌 조직에서의 LRRK2 단백질의 발현 수준을 분석하여 나타낸 것이다.
(c): 외상성 뇌손상 이후의 LRRK2 발현을 조직면역화학법에 의해서 분석한 것이다.
(d): 외상성 뇌손상 이후의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.
(e): 외상성 뇌손상 부위에서의 LRRK2 발현 세포 분석 위치를 표시하여 나타낸 것이다.
(f): 도 e의 표시된 영역에서의 LRRK2와 신경세포 표지자와 동시 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
(g): 도 e의 표시된 영역에서의 LRRK2와 미세아교세포 표지자와 동시 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
(h): 도 e의 표시된 영역에서의 LRRK2와 성상교세포 표지자와 동시 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 신경세포에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 면역 현광 염색 수행결과를 나타낸 것이다.
(b): 신경세포 표지자 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 3은 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 미세아교세포에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 면역 현광 염색 수행결과를 나타낸 것이다.
(b): 미세아교세포 표지자 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 4는 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 성상교세포에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 면역 현광 염색 수행결과를 나타낸 것이다.
(b): 성상교세포 표지자 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 5는 추가 LRRK2 항체를 이용한 외상성 뇌손상 조직에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 사용된 LRRK2 항체에 대한 에피토프 표시 그림이다.
(b): 추가 LRRK2 항체를 이용한 면역 블랏 수행 및 이의 정량화 결과이다.
(c): 추가 LRRK2 항체를 이용한 조직면역화학법 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 뇌졸중 동물 모델에서의 LRRK2 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 마우스 뇌졸중 동물 모델에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.
(b): 저산소증 처리 이후 신경세포에서의 LRRK2 mRNA 발현을 분석하여 나타낸 것이다.
(c) 저산소증 처리 이후 신경세포에서의 LRRK2 단백질 발현을 분석하여 나타낸 것이다.
도 7은 뇌졸중 동물 모델에서의 신경세포에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 마우스 뇌졸중 유도 이후 손상 뇌조직 내 신경세포에서의 LRRK2 발현 분석을 면역 형광 염색법을 통하여 분석한 결과이다.
도 8은 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차피질 신경세포에 스크래치 손상을 준 이후 LRRK2 mRNA의 발현을 분석하여 나타낸 것이다.
(b): 일차피질 신경세포에 스크래치 손상을 준 이후 LRRK2 단백질의 발현을 분석하여 나타낸 것이다.
(c): 면역 현광 염색법을 통한 신경세포에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다.
도 9는 다양한 신경 손상 동물 모델에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차피질 신경세포에 글루타민산 처리 이후 LRRK2 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(b): 글루타민산 처리 이후 신경세포 손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
(c): 일차피질 신경세포에 과산화수소 처리 이후 LRRK2 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(d): 과산화수소 처리 이후 신경세포 손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
(e): 일차피질 신경세포에 CoCl₂ 처리 이후 LRRK2 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(f): CoCl₂ 처리 이후 신경세포 손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 HIF-1a 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 HIF-1a 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(b): 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 LRRK와 HIF-1a의 발현을 면역 형광 염색법을 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
(c): HIF-1a 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포 수의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(d): 일차 피질 신경세포의 스크래치 손상 이후 HIF-1a 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 HIF-1a 발현 조절 및 활성 조절에 따른 LRRK2 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차 피질 신경세포에서 HIF-1a 야생형 및 우성 억제형 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(b): 일차 피질 신경세포에서 HIF-1a 야생형 및 우성 억제형 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(c): 일차 피질 신경세포에서 siHIF-1a 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(d): 일차 피질 신경세포에서 siHIF-1a 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(e): 일차 피질 신경세포에 HIF-1a 발현 저해제인 2ME2 처리 및 스크래치 손상 이후 LRRK2 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 HIF-1a 에 의한 LRRK2 전사 조절 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): LRRK2 프로모터 영역에서의 HIF-1a 결합 후보 영역 도식화이다.
(b): HIF-1a 결합 후보 영역들에 대한 돌연변이 제작 모식도이다.
(c): 일차 피질 신경세포에 스크래치 손상 이후 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(d): 일차 피질 신경세포에 HIF-1a 야생형 및 우성 억제형 발현 이후 스크래치 손상에 의한 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(e): 일차 피질 신경세포에 siRNA HIF-1a 발현 이후 스크래치 손상에 의한 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(f): 일차 피질 신경세포에 LRRK2 프로모터 영역 내 HIF-1a 결합 영역 돌연변이 발현 이후 스크래치 손상에 의한 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(g): LRRK2 프로모터 내 세번째 HIF-1a 결합 영역 돌연변이에 대한 크로마틴 면역 침전법 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 발현 조절에 따른 신경독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 shRNA 발현 이후 스크래치 손상에 따른 LRRK2 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(b), (c), (d) 및 (e): 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 shRNA 발현 이후 스크래치 손상에 따른 Alama blue 실험 결과(b), LDH 유출 실험 결과(c), 및 TUNEL 실험(d, e)을 통한 신경손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
(f): 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 shRNA 발현 이후 스크래치 손상에 따른 세포사멸 표지자 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 활성 조절에 따른 신경독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제(실시예 12, 실시예 23) 처리에 따른 LRRK2 인산화 감소 분석 결과를 나타낸 것이다.
(b), (c), (d) 및 (e): 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제(실시예 12, 실시예 23) 처리에 따른 Alama blue 실험(b), LDH 유출 실험(c) 및 TUNEL 실험(d, e)을 통한 신경손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
(f): 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제(실시예 12, 실시예 23) 처리에 따른 세포사멸 표지자 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 활성 조절에 따른 신경독성 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제 실시예 10(도 a), 실시예 21 및 20 (도 b) 처리에 따른 신경 독성 변화를 LDH 유출 실험을 통하여 분석하여 나타낸 것이다.
도 16은 저산소증 환경에서의 LRRK2에 의한 신경 독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차 피질 신경세포에서의 저산소증 처리 이후 신경 독성 확인 및 HIF-1a shRNA 발현에 따른 신경 독성 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
(b): 일차 피질 신경세포에서의 저산소증 처리 이후 신경 독성 확인 및 LRRK2 shRNA 발현에 따른 신경 독성 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 뇌손상 보호 효능 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): LRRK2 활성 저해제(실시예 12)처리 및 행동 실험 분석 실험 계획 모식도이다.
(b): 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 실시예 12 처리에 따른 LRRK2 인산화 변화 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(c) 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 실시예 12 처리 이후 균형 빔 테스트 결과를 나타낸 것이다.
(d) 및 (e): 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 실시예 12 처리 이후 새로운 물건 인지 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 뇌결손 보호 효능 분석 결과이다.
(a): 외상성 뇌손상 동물 모델에서 실시예 12 처리 이후 뇌 결손 변화 사진이다.
(b): 크래실 바이올릿 염색을 통한 뇌 손상 부위 분석 이미지이다.
(c): 도 (b)의 결과를 정량화한 것이다.
(d): 신경세포 표지자 (NeuN) 항체를 활용한 조직 면역 화학법 수행 결과를 나타낸 것이다.
(e): 대뇌피질 및 해마 부위에서의 LRRK2 활성 저해제 처리 전후 신경세포 수를 정량화한 것이다.
도 19는 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 신경세포 사멸 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): TUNEL 염색을 통한 외상성 뇌손상 마우스 뇌에서의 LRRK2 활성 저해제 (실시예12) 처리 이후 신경세포 독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(b): 도 (a)의 결과를 정량화한 것이다.
(c): 외상성 뇌손상 마우스 뇌에서의 LRRK2 활성 저해제 (실시예12) 처리 이후 세포사멸 표지자 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 뇌 병리 변화 분석를 나타낸 것이다.
(a): 외상성 뇌손상 동물 모델에서 실시예 12 처리 이후 미세아교세포 활성 분석을 위하여 각각의 표지자 항체를 이용한 조직면역화합법을 수행한 결과이다.
(b): 도 (a)의 결과를 정량화한 것이다.
(c): 외상성 뇌손상 동물 모델에서 실시예 12 처리 이후 성상교세포 활성 분석을 위하여 각각의 표지자 항체를 이용한 조직면역화합법을 수행한 결과이다.
(d): 도 (c)의 결과를 정량화한 것이다.
(e): 외상성 뇌손상 동물 모델에서 실시예 12 처리 이후 사이토카인 mRNA 발현 분석 결과이다.
(f): 외상성 뇌손상 동물 모델에서 실시예 12 처리 이후 뇌혈관장벽 (MMP2, MMP9) 및 뇌부종 (AQP4) 표지자 발현을 분석한 결과이다.Figure 1 shows the results of the analysis of increased LRRK2 expression in the mouse brain after traumatic brain injury.
(a): Traumatic Brain Injury The expression level of LRRK2 mRNA in mouse brain tissue was analyzed.
(B): Traumatic Brain Injury The expression level of LRRK2 protein in mouse brain tissue was analyzed.
(c): LRRK2 expression following traumatic brain injury was analyzed by histological immunohistochemistry.
(d): Quantification of the number of LRRK2 expressing cells following traumatic brain injury.
(e): LRRK2 expressing cell analysis site at the traumatic brain injury site is indicated.
(f): Simultaneous immunostaining with LRRK2 and neuronal markers in the indicated regions of FIG.
(g): Simultaneous immunostaining with LRRK2 and microglial markers in the indicated regions of FIG.
(h): Simultaneous immunostaining with LRRK2 and astrocyte markers in the indicated regions of FIG.
Figure 2 shows the results of time-phase analysis of LRRK2 expression in neurons in the mouse brain after traumatic brain injury.
(a): The results of immunofluorescence staining are shown.
(b): Quantify the number of LRRK2 expressing cells in neuronal marker expressing cells.
Figure 3 shows the results of time-phase analysis of LRRK2 expression in microglia in mouse brain after traumatic brain injury.
(a): The results of immunofluorescence staining are shown.
(b): Quantification of the number of LRRK2 expressing cells in microglial marker expressing cells.
Figure 4 shows the results of time-phase analysis of LRRK2 expression in astrocytes in the mouse brain after traumatic brain injury.
(a): The results of immunofluorescence staining are shown.
(b): Quantification of the number of LRRK2 expressing cells in astrocyte-expressing cells.
Figure 5 shows the results of LRRK2 expression analysis in traumatic brain injury tissue using additional LRRK2 antibody.
(a): Epitope label picture for LRRK2 antibody used.
(b): Immunoblot performed with additional LRRK2 antibody and quantification thereof.
(c): Tissue immunochemistry results using the additional LRRK2 antibody are shown.
Figure 6 shows the results of LRRK2 expression analysis in a stroke animal model.
(a): Time-phase analysis of LRRK2 expression in mouse stroke animal models.
(B): LRRK2 mRNA expression in neurons after hypoxia treatment.
(c) shows the analysis of LRRK2 protein expression in neurons after hypoxia treatment.
Figure 7 shows the analysis results of LRRK2 expression in neurons in animal models of stroke. Specifically, analysis of LRRK2 expression in neurons in damaged brain tissue after induction of mouse stroke was analyzed by immunofluorescence staining.
8 shows the results of LRRK2 expression analysis in a traumatic brain injury neuron model.
(a): Analysis of the expression of LRRK2 mRNA after scratch damage to primary cortical neurons.
(b): Analysis of the expression of LRRK2 protein after scratch damage to primary cortical neurons.
(c): The results of LRRK2 expression analysis in neurons by immunofluorescence staining.
Figure 9 shows the results of LRRK2 expression analysis in various neurological damage animal models.
(a): Analysis of LRRK2 protein expression and its quantification after glutamic acid treatment in primary cortical neurons.
(b): The results of nerve cell damage analysis after glutamic acid treatment.
(c): Analysis of LRRK2 protein expression and its quantification after hydrogen peroxide treatment in primary cortical neurons.
(d): The results of neuronal cell damage analysis after hydrogen peroxide treatment.
(e): Analysis of LRRK2 protein expression and its quantification after CoCl ₂ treatment in primary cortical neurons.
(f): Neuronal damage analysis results are shown after CoCl ₂ treatment.
10 shows the results of HIF-1a expression analysis in a traumatic brain injury animal model.
(a): Analysis of HIF-1a protein expression and quantification thereof in mouse brain after traumatic brain injury.
(b): Expression of LRRK and HIF-1a in mouse brain after traumatic brain injury was analyzed by immunofluorescence staining.
(c): Results of quantification of the number of LRRK2 expressing cells in HIF-1a expressing cells.
(d): HIF-1a expression analysis and quantification results after scratch damage of primary cortical neurons.
Figure 11 shows the analysis results of LRRK2 expression changes according to HIF-1a expression regulation and activity regulation.
(a): HIF-1a wild type and dominant inhibitory expression in primary cortical neurons and subsequent LRRK2 mRNA expression analysis in scratch injury.
(B): HIF-1a wild type and dominant inhibitory expression in primary cortical neurons and subsequent LRRK2 protein expression analysis in scratch damage.
(c): The results of siHIF-1a expression and subsequent LRRK2 mRNA expression analysis in primary cortical neurons.
(D): The results of siHIF-1a expression and subsequent LRRK2 protein expression analysis in primary cortical neurons.
(e): The results of analysis of changes in LRRK2 expression after treatment with 2ME2, an inhibitor of HIF-1a expression, and scratch damage in primary cortical neurons.
12 shows the results of LRRK2 transcriptional regulation analysis by HIF-1a.
(a): HIF-1a binding candidate region schematic in the LRRK2 promoter region.
(b): Schematic of mutagenesis for HIF-1a binding candidate regions.
(c): Lucifer laser activity of the LRRK2 promoter region after scratch injury in primary cortical neurons is shown.
(d): The results of luciferase activity analysis of the LRRK2 promoter region due to scratch damage after HIF-1a wild type and dominant inhibitory expression in primary cortical neurons.
(e): The results of luciferase activity analysis on the LRRK2 promoter region due to scratch damage after siRNA HIF-1a expression in primary cortical neurons.
(f): The results of luciferase activity analysis on the LRRK2 promoter region due to scratch damage after expression of the HIF-1a binding region mutation in the LRRK2 promoter region in primary cortical neurons.
(g): Results of chromatin immunoprecipitation for the third HIF-1a binding region mutation in the LRRK2 promoter.
Figure 13 shows the results of neurotoxicity according to the regulation of LRRK2 expression in a traumatic brain injury neuron model.
(a): Analysis of LRRK2 expression according to scratch damage after LRRK2 shRNA expression in primary cortical neurons and quantification thereof are shown.
(b), (c), (d) and (e): Alama blue test results according to scratch damage after LRRK2 shRNA expression in primary cortical neurons (b), LDH efflux test results (c), and TUNEL experiments ( d, e) shows the results of nerve damage analysis.
(f): Analysis of apoptosis marker expression according to scratch damage after LRRK2 shRNA expression in primary cortical neurons.
Figure 14 shows the results of neurotoxicity according to the regulation of LRRK2 activity in a traumatic brain injury neuron model.
(a): Results of LRRK2 phosphorylation reduction analysis according to treatment with LRRK2 activity inhibitors (Example 12, Example 23) after scratch damage in primary cortical neurons.
(b), (c), (d) and (e): Alama blue experiment (b), LDH efflux experiment following treatment with LRRK2 activity inhibitor (Example 12, Example 23) after scratch damage in primary cortical neurons (c) and TUNEL experiments (d, e) show the results of nerve damage analysis.
(f): Results of apoptosis marker expression analysis following treatment with LRRK2 activity inhibitors (Example 12, Example 23) after scratch damage in primary cortical neurons.
15 shows the results of neurotoxicity according to the regulation of LRRK2 activity in the traumatic brain injury neuron model. Specifically, changes in neurotoxicity following treatment with LRRK2 activity inhibitors Example 10 (FIG. A), Examples 21, and 20 (FIG. B) after scratch damage in primary cortical neurons are analyzed through LDH efflux experiments.
Figure 16 shows the results of neurotoxicity analysis by LRRK2 in hypoxia environment.
(a): Neurotoxicity was confirmed after hypoxia treatment in primary cortical neurons and neurotoxicity change analysis according to HIF-1a shRNA expression.
(b): Neurotoxicity was confirmed after hypoxia treatment in primary cortical neurons and neurotoxicity change analysis according to LRRK2 shRNA expression.
17 shows the results of an analysis of brain injury protection effect according to inhibition of LRRK2 activity in a traumatic brain injury animal model.
(a): Treatment of LRRK2 activity inhibitor (Example 12) and behavioral experiments.
(b): Analysis of LRRK2 phosphorylation changes according to the treatment of Example 12 in a traumatic brain injury animal model and results of quantification thereof.
(c) Balanced beam test results after Example 12 treatment in a traumatic brain injury animal model.
(d) and (e): New object recognition test results are shown after Example 12 treatment in a traumatic brain injury animal model.
18 is a result of analysis of brain defect protection efficacy according to the inhibition of LRRK2 activity in a traumatic brain injury animal model.
(a): Picture of brain defect change after Example 12 treatment in a traumatic brain injury animal model.
(b): Analytical image of brain injury site by cracil violet staining.
(c): The result of FIG. (b) was quantified.
(D) shows the results of performing tissue immunochemistry using neuronal marker (NeuN) antibody.
(e): Neuronal cell numbers before and after treatment with inhibitors of LRRK2 activity in the cerebral cortex and hippocampus.
19 shows the results of analysis of neuronal cell death according to inhibition of LRRK2 activity in a traumatic brain injury animal model.
(a): Neuronal cytotoxicity analysis results after treatment with LRRK2 activity inhibitor (Example 12) in traumatic brain injury mouse brain via TUNEL staining.
(b): The result of FIG. (a) was quantified.
(c): Results of analysis of apoptosis marker expression change after treatment with LRRK2 activity inhibitor (Example 12) in traumatic brain injury mouse brain.
20 shows analysis of brain pathological changes according to inhibition of LRRK2 activity in a traumatic brain injury animal model.
(a): In the animal model of traumatic brain injury, after the treatment of Example 12, tissue immunohistochemistry using each marker antibody was performed for analysis of microglial activity.
(b): The result of FIG. (a) was quantified.
(c): Tissue immunohistochemistry using respective marker antibodies for the analysis of astrocyte activity after the treatment of Example 12 in a traumatic brain injury animal model.
(d): The result of FIG. (c) was quantified.
(e): Result of cytokine mRNA expression analysis after Example 12 treatment in a traumatic brain injury animal model.
(f): Results of analysis of cerebrovascular barrier (MMP2, MMP9) and cerebral edema (AQP4) marker expression after Example 12 treatment in a traumatic brain injury animal model.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 측면은, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke containing an LRRK2 inhibitor as an active ingredient.

이때, 상기 LRK2는 야생형일 수 있다.In this case, the LRK2 may be wild type.

하나의 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.In one example, the LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is characterized in that the compound represented by the following formula (1), an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 1][Formula 1]

상기 화학식 1에서,In Chemical Formula 1,

R¹은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노, 또는 디C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노이고;R ¹ is —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, C _1-10 straight or branched chain alkyl, C _1-10 straight or branched chain alkoxy, C _1-5 straight or branched chain alkylamino Or straight or branched chain alkylamino of diC _1-5 ;

R²는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이거나, R²는 R³ 및 이들이 결합된 탄소원자와 함께 연결되어 N을 하나 이상 포함하는 비치환, 치환 또는 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 원자의 헤테로아릴을 형성할 수 있고,R ² is —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, or C _1-10 unsubstituted or substituted at least one halogen, straight or branched chain alkyl, or R ² is R ³ and the carbon atom to which they are attached May be linked together to form an unsubstituted, substituted or fused 5 to 8 membered heterocycloalkyl comprising one or more N, or an unsubstituted or substituted 5 to 6 membered heteroaryl comprising one or more N; ,

여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴은 독립적으로 -OH, =O, 할로겐 및 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고,Wherein the substituted heterocycloalkyl and heteroaryl may be independently substituted with one or more substituents selected from the group consisting of —OH, ═O, halogen and C _1-5 straight or branched chain alkyl,

여기서, 상기 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬은 비치환된 C_6-10의 아릴이 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고;Wherein said fused 5-8 membered heterocycloalkyl is a 5-8 membered heterocycloalkyl fused with an unsubstituted C _6-10 aryl;

R³는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노, 디C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬설포닐 C_6-10 아릴아미노, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬설포닐아미노 C_6-10 아릴아미노이거나, R²와 함께 연결되어 N을 하나 이상 포함하는 비치환, 치환 또는 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 원자의 헤테로아릴을 형성하고,R ³ is —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, C _1-10 straight or branched chain alkyl, C _1-10 straight or branched chain alkoxy, C _1-5 straight or branched chain alkylamino , di-C _1-5 straight or branched chain alkyl, straight or branched chain alkylsulfonyl C _6-10 arylamino, or a linear or branched alkyl sulfonylamino of C _1-5 of C _1-5 C _{6- 10} arylamino, unsubstituted, substituted or fused 5 to 8 membered heterocycloalkyl containing one or more N, linked together with R ² , or an unsubstituted or substituted 5 to 6 atom containing one or more N To form a heteroaryl,

Y는

또는

이고,Y is

or

ego,

상기 R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬, N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬카보닐이고,R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are independently —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, C _1-10 straight or branched chain alkyl, C _1-10 straight or branched chain alkoxy, N and Unsubstituted or substituted 5 to 8 membered heterocycloalkyl containing one or more heteroatoms selected from the group consisting of O, unsubstituted or substituted containing 5 or more heteroatoms selected from the group consisting of N and O Heterocycloalkylcarbonyl having 8 to 8 atoms,

여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은 디C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노 또는 하나 이상의 N을 포함하며 하나 이상의 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이 치환된 6 원자의 헤테로사이클로알킬으로 치환될 수 있고,Wherein said substituted heterocycloalkyl is a 6-membered heterocycloalkyl comprising straight or branched chain alkylamino of diC _1-5 or one or more N and substituted with at least one C _1-5 straight or branched chain alkyl Can be substituted,

상기 R⁷, R⁸ 및 R⁹는 독립적으로 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, 비치환 또는 하나 이상의 하이드록시가 치환된 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고,R ⁷ , R ⁸ and R ⁹ are independently —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, unsubstituted or substituted one or more hydroxy substituted C _1-10 straight or branched chain alkyl, or N and Unsubstituted or substituted 5 to 8 membered heterocycloalkyl comprising at least one hetero atom selected from the group consisting of O,

여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은 -OH, =O, 할로겐 및 O를 하나 포함하는 4 내지 5 원자의 비치환된 헤테로사이클로알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.Here, the substituted heterocycloalkyl may be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of 4 to 5 membered unsubstituted heterocycloalkyl including one -OH, = 0, halogen and O.

또한,In addition,

상기 R¹은 -H, 또는 -NH(CH₃₎이고;R ¹ is —H, or —NH (CH ₃₎ ;

R²는 -H, 할로겐, 또는 -CF₃이거나, R³와 함께 연결되어

또는

를 형성하고;R ² is —H, halogen, or —CF ₃ , or is linked with R ³

or

To form;

R³는 -H, -NH(CH₃₎, -NH(CH₂CH₃₎,

, 또는

이거나, R² 및 R³는 이들이 결합된 탄소원자와 함께 연결되어

또는

를 형성하고;R ³ is —H, —NH (CH ₃₎ , —NH (CH ₂ CH ₃₎ ,

, or

Or R ² and R ³ are linked together with the carbon atom to which they are attached

or

To form;

Y는

또는

이고,Y is

or

ego,

상기 R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 -H, 메톡시, 할로겐,

,

,

또는

이고,R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are independently -H, methoxy, halogen,

,

or

ego,

상기 R⁷, R⁸ 및 R⁹는 독립적으로 -H, 메틸, 할로겐,

또는

일 수 있다.R ⁷ , R ⁸ and R ⁹ are independently -H, methyl, halogen,

or

Can be.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:Examples of the compound represented by Formula 1 according to the present invention include the following compounds:

(1) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필설포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민;(1) 5-chloro-N4- (2- (isopropylsulfonyl) phenyl) -N2- (2-methoxy-4- (4- (4-methylpiperazin-1-yl) piperidine-1 -Yl) phenyl) pyrimidine-2,4-diamine;

(2) N-(2-(2-(3-클로로-4-메톡시페닐아미노)-5-플루오로피리미딘-4-일아미노)페닐)메탄설폰아미드;(2) N- (2- (2- (3-chloro-4-methoxyphenylamino) -5-fluoropyrimidin-4-ylamino) phenyl) methanesulfonamide;

(6) (4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)(3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)메타논;(6) (4- (dimethylamino) piperidin-1-yl) (3-methoxy-4- (4- (methylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-ylamino) Phenyl) methanone;

(8) N4-에틸-N2-(1-(3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-3-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민;(8) N4-ethyl-N2- (1- (3-fluoro-1- (oxetan-3-yl) piperidin-4-yl) -3-methyl-1H-pyrazol-4-yl) -5- (trifluoromethyl) pyrimidine-2,4-diamine;

(10) 2-[(2-메톡시-4-[[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카보닐]페닐)아미노]-5,11-디메틸-5,11-디하이드로-6H-피리미도[4,5-b][1,4]벤조디아제핀-6-온;(10) 2-[(2-methoxy-4-[[4- (4-methylpiperazin-1-yl) piperidin-1-yl] carbonyl] phenyl) amino] -5,11-dimethyl -5,11-dihydro-6H-pyrimido [4,5-b] [1,4] benzodiazepin-6-one;

(11) (4-(4-(에틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-2-플루오로-5-메톡시페닐)(모폴리노)메타논;(11) (4- (4- (ethylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-ylamino) -2-fluoro-5-methoxyphenyl) (morpholino) methanone;

(12) (3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)(모폴리노)메타논;(12) (3-methoxy-4- (4- (methylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-ylamino) phenyl) (morpholino) methanone;

(14) 1-(5-클로로-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-1H-피라졸-1-일)-2-메틸프로판-2-올;(14) 1- (5-chloro-4- (4- (methylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-ylamino) -1H-pyrazol-1-yl) -2-methyl Propan-2-ol;

(16) N2-(5-클로로-1-((3S,4R)-3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)-N4-메틸-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민.(16) N2- (5-chloro-1-((3S, 4R) -3-fluoro-1- (oxetan-3-yl) piperidin-4-yl) -1H-pyrazole-4- Yl) -N4-methyl-5- (trifluoromethyl) pyrimidine-2,4-diamine.

다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.In another embodiment, the LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is characterized in that the compound represented by the following formula (2), optical isomers thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 2][Formula 2]

상기 화학식 2에서,In Chemical Formula 2,

L¹ 및 L²는 독립적으로 -O-, -CH₂-, -NH-, 또는 -S-이고;L ¹ and L ² are independently —O—, —CH ₂ —, —NH—, or —S—;

A¹은 비치환 또는 치환된 C_3-10의 사이클로알킬이고, 여기서, 상기 치환된 사이클로알킬은 -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 및 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;A ¹ is unsubstituted or substituted C _3-10 cycloalkyl, wherein the substituted cycloalkyl is —OH, halogen, nitrile, nitro, C _1-5 straight or branched chain alkyl and C _{1- May} be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of ₅ straight or branched chain alkoxy;

A²는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 원자의 헤테로아릴이고, 여기서, 상기 치환된 헤테로아릴은 -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 및 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;A ² is an unsubstituted or substituted 5 to 6 membered heteroaryl comprising one or more heteroatoms selected from the group consisting of N, O and S, wherein the substituted heteroaryl is -OH, halogen, nitrile , Nitro, may be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of C _1-5 straight or branched alkyl and C _1-5 straight or branched alkoxy;

A³, A⁴ 및 A⁵는 독립적으로 -H, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이다.A ³ , A ⁴ and A ⁵ are independently —H, C _1-5 straight or branched alkyl or C _1-5 straight or branched alkoxy.

또한, 상기 L¹ 및 L²는 독립적으로 -CH₂-, -NH-, 또는 -S-이고;In addition, L ¹ and L ² are independently —CH ₂ —, —NH—, or —S—;

A¹은

또는

이고;A ¹ is

or

ego;

A²는

이고;A ² is

ego;

A³, A⁴ 및 A⁵는 독립적으로 -H 또는 메틸일 수 있다.A ³ , A ⁴ and A ⁵ may be independently —H or methyl.

본 발명에 따른 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:Examples of the compound represented by Formula 2 according to the present invention include the following compounds:

(7) (S)-3-(사이클로프로필티오)-7-메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로티에노[3,4-c]피리딘-4(5H)-온;(7) (S) -3- (cyclopropylthio) -7-methyl-1- (1H-pyrazol-3-yl) -6,7-dihydrothieno [3,4-c] pyridine-4 (5H) -one;

(9) 3-(사이클로펜틸티오)-6,6-디메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로벤조[c]티오펜-4(5H)-온.(9) 3- (cyclopentylthio) -6,6-dimethyl-1- (1H-pyrazol-3-yl) -6,7-dihydrobenzo [c] thiophen-4 (5H) -one.

다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.In another example, the LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is characterized in that the compound represented by the following formula (3), an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 3][Formula 3]

상기 화학식 3에서,In Chemical Formula 3,

L³은 부재, -NH-, 또는 -O-이고;L ³ is absent, -NH-, or -O-;

L⁴는 N, 또는 C이고;L ⁴ is N, or C;

E¹은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;E ¹ is —H, —OH, halogen, nitrile, nitro, C _1-5 straight or branched chain alkyl, or C _1-5 straight or branched chain alkoxy;

E²는 상기 L⁴가 N일 경우 부재이고, 상기 L⁴가 C일 경우

이고, 상기 E⁵는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이고;E ² is absent when L ⁴ is N, and when L ⁴ is C

E ⁵ is C 1-5 straight or branched alkyl;

E³은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 비치환 또는 치환된 C_6-10의 사이클로알킬, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고,E ³ is -H, -OH, halogen, nitrile, nitro, C _1-5 straight or branched chain alkyl, C _1-5 straight or branched chain alkoxy, unsubstituted or substituted C _6-10 cyclo Alkyl or unsubstituted or substituted 5 to 8 membered heterocycloalkyl comprising at least one heteroatom selected from the group consisting of N and O,

여기서, 상기 치환된 사이클로알킬 및 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 -OH, 할로겐, C_1-3의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C_1-3의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환될 수 있고;Wherein the substituted cycloalkyl and heterocycloalkyl are independently one or more substituents selected from the group consisting of —OH, halogen, C _1-3 straight or branched alkyl, and C _1-3 straight or branched alkoxy. Can be substituted;

E⁴는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬카보닐 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬; 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 원자의 헤테로아릴;이고,E ⁴ is unsubstituted or substituted 6 to 8 membered heterocycloalkylcarbonyl C _1-5 straight or branched chain alkyl comprising one or more N; Or unsubstituted or substituted 6 to 8 membered heteroaryl including one or more N;

여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴은 독립적으로 C_6-10의 아릴; 및 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 6 원자의 헤테로사이클로알킬;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환될 수 있고,Wherein the substituted heterocycloalkyl and heteroaryl are independently C _6-10 aryl; And an unsubstituted or substituted 6-membered heterocycloalkyl including one or more heteroatoms selected from the group consisting of N and O, and may be substituted with one or more selected from the group consisting of

여기서, 상기 치환된 6 원자의 헤테로사이클로알킬은 -OH, 할로겐, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이 치환될 수 있다.Herein, the substituted 6-membered heterocycloalkyl may be substituted with -OH, halogen, or C _1-5 unsubstituted or substituted C _1-5 straight or branched alkyl.

또한, 상기 L³은 부재, -NH-, 또는 -O-이고;In addition, L ³ is absent, -NH-, or -O-;

L⁴는 N, 또는 C이고;L ⁴ is N, or C;

E¹은 -H, 또는 메틸이고;E ¹ is -H, or methyl;

E²는 상기 L⁴가 N일 경우 부재이고, 상기 L⁴가 C일 경우

이고;E ² is absent when L ⁴ is N, and when L ⁴ is C

ego;

E³은 -H,

, 또는

이고;E ³ is -H,

, or

ego;

E⁴는

,

,

, 또는

일 수 있다.E ⁴ is

,

, or

Can be.

본 발명에 따른 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:Examples of the compound represented by Formula 3 according to the present invention include the following compounds:

(3) (R)-3-(4-(사이클로헥실아미노)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)-1-(3-페닐피페리딘-1-일)프로판-1-온;(3) (R) -3- (4- (cyclohexylamino) -1H-pyrazole [4,3-c] pyridin-3-yl) -1- (3-phenylpiperidin-1-yl) Propane-1-one;

(5) 4-(4-(6-메틸-4-(테트라하이드로-2H-파이란-4-일옥시)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)피리딘-2-일)모르폴린;(5) 4- (4- (6-methyl-4- (tetrahydro-2H-pyran-4-yloxy) -1H-pyrazole [4,3-c] pyridin-3-yl) pyridine-2- (1) morpholine;

(18) 3-(6-(4-(2-플루오로에틸)피페라진-1-일)피리미딘-4-일)-5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸;(18) 3- (6- (4- (2-fluoroethyl) piperazin-1-yl) pyrimidin-4-yl) -5- (1-methylcyclopropoxy) -1H-indazole;

(20) (2S,6R)-2,6-디메틸-4-(6-(5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸-3-일)피리미딘-4-일)모르폴린.(20) (2S, 6R) -2,6-dimethyl-4- (6- (5- (1-methylcyclopropoxy) -1H-indazol-3-yl) pyrimidin-4-yl) morpholine .

다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.As another example, the LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is characterized in that the compound represented by the following formula (4), optical isomers thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 4][Formula 4]

상기 화학식 4에서,In Chemical Formula 4,

L⁵는 N, 또는 CH이고;L ⁵ is N, or CH;

G¹은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로아릴아미노이고,G ¹ is unsubstituted or substituted containing one or more of -H, -OH, halogen, nitro, nitrile, C _1-5 straight or branched chain alkyl, C _1-5 straight or branched chain alkoxy, or N 5-8 membered heteroarylamino,

여기서, 상기 치환된 헤테로아릴은 -OH, 할로겐 및 C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환될 수 있고;Wherein said substituted heteroaryl may be substituted with one or more selected from the group consisting of —OH, halogen and C _1-3 straight or branched alkyl;

G²는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 비치환 또는 치환된 C_6-10의 아릴, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고,G ² is —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, C _1-5 straight or branched chain alkyl, C _1-5 straight or branched chain alkoxy, unsubstituted or substituted C _6-10 aryl Or an unsubstituted or substituted 5 to 8 membered heterocycloalkyl comprising at least one heteroatom selected from the group consisting of N and O,

여기서, 상기 치환된 아릴 및 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 및 N 및 O를 포함하는 6 원자의 비치환된 헤테로사이클로알킬 C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;Wherein said substituted aryl and heterocycloalkyl are independently a 6-membered unsubstituted heterocyclo comprising C _1-5 straight or branched alkyl, C _1-5 straight or branched alkoxy, and N and O. May be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of straight or branched chain alkyl of alkyl C _1-3 ;

G³은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 비치환 또는 하나 이상의 나이트릴이 치환된 C_6-10의 아릴 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로아릴이고, 상기 치환된 헤테로아릴은 -OH, 할로겐, 나이트릴 및 C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.G ³ is —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, C _1-5 straight or branched alkyl, C _1-5 straight or branched alkoxy, unsubstituted or substituted with one or more nitriles _{Unsubstituted} or substituted 5 to 8 membered heteroaryl containing one or more of _6-10 aryl or N, said substituted heteroaryl is -OH, halogen, nitrile and C _1-3 straight or branched chain alkyl; It may be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of.

또한, 상기 G¹은 -H, 또는

이고;In addition, G ¹ is -H, or

ego;

G²는

또는

이고;G ² is

or

ego;

G³은 나이트릴,

또는

일 수 있다.G ³ is nitrile,

or

Can be.

본 발명에 따른 상기 화학식 4로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:Examples of the compound represented by Formula 4 according to the present invention include the following compounds:

(19) 6-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-4-(3-메틸-4-(모폴리노메틸)페닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카보나이트릴;(19) 6- (1-methyl-1H-pyrazol-3-ylamino) -4- (3-methyl-4- (morpholinomethyl) phenyl) -1H-pyrrolo [2,3-b] Pyridine-3-carbonitrile;

(21) 3-(4-모르포리노-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일)벤조니트릴;(21) 3- (4-morpholino-1H-pyrrolo [2,3-b] pyridin-3-yl) benzonitrile;

(22) 1-메틸-4-(4-모르폴리노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-1H-피롤-2-카보나이트릴.(22) 1-methyl-4- (4-morpholino-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-yl) -1H-pyrrole-2-carbonitrile.

다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 5로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.In another example, the LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is characterized in that the compound represented by the formula (5), optical isomers thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 5][Formula 5]

상기 화학식 5에서,In Chemical Formula 5,

M¹은 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C_6-10의 아릴이고;M ¹ is C _6-10 aryl unsubstituted or substituted with one or more halogens;

M²는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환된 6 내지 8 원자의 헤테로아릴이고; 및M ² is unsubstituted 6 to 8 membered heteroaryl including one or more heteroatoms selected from the group consisting of N, O and S; And

M³는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 원자의 헤테로아릴이고, M ³ is an unsubstituted or substituted 6 to 8 membered heteroaryl containing one or more heteroatoms selected from the group consisting of N, O and S,

여기서, 상기 치환된 헤테로아릴은 할로겐 및 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환된 6 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬으로 치환될 수 있다.Wherein the substituted heteroaryl is a straight or branched chain alkyl of unsubstituted 6 to 8 membered heterocycloalkyl C _1-5 comprising at least one heteroatom selected from the group consisting of halogen and N, O and S Can be substituted.

또한, 상기 M¹은

또는

이고;In addition, M ¹ is

or

ego;

M²는

이고; 및M ² is

ego; And

M³는

또는

일 수 있다.M ³ is

or

Can be.

본 발명에 따른 상기 화학식 5로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:Examples of the compound represented by Formula 5 according to the present invention include the following compounds:

(4) 2-(4-플루오로벤질옥시)-5-(1-(2-모폴리노에틸)-1H-피라졸-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드;(4) 2- (4-fluorobenzyloxy) -5- (1- (2-morpholinoethyl) -1H-pyrazol-4-yl) -N- (pyridin-3-yl) benzamide;

(23) 2-(벤질옥시)-5-(2-플루오로피리딘-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드.(23) 2- (benzyloxy) -5- (2-fluoropyridin-4-yl) -N- (pyridin-3-yl) benzamide.

다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.As another example, the LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is characterized in that the compound represented by the following formula (6), optical isomers thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof.

[화학식 6][Formula 6]

상기 화학식 6에서,In Chemical Formula 6,

Q¹은 -H, 아미노, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;Q ¹ is —H, amino, C _1-5 straight or branched chain alkyl, or C _1-5 straight or branched chain alkoxy;

Q²는 -H, 비치환된 C_6-10의 사이클로알킬이고;Q ² is —H, unsubstituted C _6-10 cycloalkyl;

Q³은 -H, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고; 및Q ³ is —H, C _1-5 straight or branched alkyl, or C _1-5 straight or branched alkoxy; And

Q⁴는 N을 하나 이상 포함하며, 하나의 메틸이 치환된 5 원자의 헤테로아릴이다.Q ⁴ is at least one N and is 5 membered heteroaryl substituted with one methyl.

본 발명에 따른 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:Examples of the compound represented by Formula 6 according to the present invention include the following compounds:

(13) (R)-4-(1-사이클로프로필에틸아미노)-7-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)신놀린-3-카복스아미드.(13) (R) -4- (1-cyclopropylethylamino) -7- (1-methyl-1H-pyrazol-4-yl) cinnoline-3-carboxamide.

다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 7로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.As another example, the LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is characterized in that the compound represented by the following formula (7), optical isomers thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 7][Formula 7]

상기 화학식 7에서,In Chemical Formula 7,

T¹은 -H, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 비치환된 C_3-8의 사이클로알킬카보닐이다.T ¹ is —H, C _1-5 straight or branched chain alkyl, or unsubstituted C _3-8 cycloalkylcarbonyl.

본 발명에 따른 상기 화학식 7로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:Examples of the compound represented by Formula 7 according to the present invention include the following compounds:

(15) 사이클로프로필[10,11,14,15-테트라하이드로-1,16-에테노-4,8-(메테노)피라졸[3,4-j][1,4,7,9]옥사트리아자사이클로헥사데신-12(13H)-일]메타논.(15) cyclopropyl [10,11,14,15-tetrahydro-1,16-etheno-4,8- (metheno) pyrazole [3,4-j] [1,4,7,9] Oxatriazacyclohexadecine-12 (13H) -yl] methanone.

다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 8로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.In another example, the LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is characterized in that the compound represented by the following formula (8), optical isomers thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 8][Formula 8]

상기 화학식 8에서,In Chemical Formula 8,

Z¹은 -H, 아미노, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;Z ¹ is —H, amino, C _1-5 straight or branched chain alkyl, or C _1-5 straight or branched chain alkoxy;

Z²는 N을 하나 이상 포함하며, 하나의 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로아릴이고; 및Z ² comprises at least one N, and is a 5-8 membered heteroaryl substituted with one C _1-5 straight or branched alkyl; And

Z³는 -H, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이다.Z ³ is -H, or C _1-5 straight or branched alkyl, or C _1-5 straight or branched alkoxy.

본 발명에 따른 상기 화학식 8로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:Examples of the compound represented by Formula 8 according to the present invention include the following compounds:

(17) (4-(6-아미노-5-(1-이소프로필-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)피리딘-3-일)-2-메톡시페닐)(모폴리노)메타논.(17) (4- (6-amino-5- (1-isopropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) pyridin-3-yl) -2-methoxyphenyl) (morphopoly No) metanon.

본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitors according to the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and salts are useful as acid addition salts formed by pharmaceutically acceptable free acid. Acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid, phosphorous acid, aliphatic mono and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanes. It is obtained from non-toxic organic acids such as dioate, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids and the like, organic acids such as acetic acid, benzoic acid, citric acid, lactic acid, maleic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, 4-toluenesulfonic acid, tartaric acid, fumaric acid and the like. Examples of such pharmaceutically nontoxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, eye Odide, fluoride, acetate, propionate, decanoate, caprylate, acrylate, formate, isobutyrate, caprate, heptanoate, propiolate, oxalate, malonate, succinate, suve Latex, sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, hexane-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitro benzoate, hydroxybenzoate, Methoxybenzoate, phthalate, terephthalate, benzenesulfonate, toluenesulfonate, chlorobene Sulfonate, xylenesulfonate, phenylacetate, phenylpropionate, phenylbutyrate, citrate, lactate, β-hydroxybutyrate, glycolate, malate, tartrate, methanesulfonate, propanesulfonate, naphthalene-1 Sulfonates, naphthalene-2-sulfonates, mandelate and the like.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.Acid addition salts according to the present invention can be prepared by conventional methods, for example, a derivative of LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is dissolved in an organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, methylene chloride, acetonitrile and the like Alternatively, the precipitate formed by adding an inorganic acid may be prepared by filtration and drying, or the solvent and excess acid may be distilled under reduced pressure and dried to crystallize in an organic solvent.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts. Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving a compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is pharmaceutically suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt as the metal salt. Corresponding salts are also obtained by reacting alkali or alkaline earth metal salts with a suitable negative salt (eg silver nitrate).

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.In the pharmaceutical composition according to the present invention, the Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be administered in various dosage forms, orally and parenterally, during clinical administration. It may be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, etc. which are commonly used.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.Formulations for oral administration include, for example, tablets, pills, hard / soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, elixirs, troches, and the like. , Dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine), lubricants such as silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts and / or polyethylene glycols. Tablets may contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidine and the like, optionally with bores such as starch, agar, alginic acid or its sodium salt and the like. Release or boiling mixtures and / or absorbents, colorants, flavors, and sweeteners.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. Pharmaceutical compositions comprising the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention as an active ingredient can be administered parenterally, and parenteral administration is subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or chest By injection method.

이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.In this case, the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is mixed with water with a stabilizer or a buffer to prepare a parenteral formulation, and prepared as a solution or suspension, and it is an ampule or vial unit dosage form. It can be prepared by. The composition may contain sterile and / or preservatives, stabilizers, hydrating or emulsifying accelerators, auxiliaries such as salts and / or buffers for the control of osmotic pressure, and other therapeutically valuable substances, and conventional methods of mixing, granulating It may be formulated according to the formulation or coating method.

또한, 본 발명의 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 Kg인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1-1000 mg/일이며, 바람직하게는 1-500 mg/일이며, 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.In addition, the dosage of the pharmaceutical composition comprising the LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient is determined by the age, weight, sex, dosage form, and health status of the patient. And the degree of disease, based on an adult patient weighing 70 Kg, typically 0.1-1000 mg / day, preferably 1-500 mg / day, and also at the discretion of the physician or pharmacist Depending on the time interval may be administered once a day divided into several times.

본 발명의 다른 측면에 따라, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, a health functional food composition for preventing or improving traumatic brain injury or stroke containing an LRRK2 inhibitor as an active ingredient is provided.

여기서, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 상기 약학적 조성물의 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제와 동일한 것이므로 자세한 설명은 생략한다.Here, since the LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is the same as the LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor of the pharmaceutical composition, a detailed description thereof will be omitted.

본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, a traumatic brain injury or stroke comprising the step of administering to the subject a pharmaceutical composition or health functional food composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke containing the LRRK2 inhibitor as an active ingredient It provides a method of preventing or treating.

본 발명의 다른 측면에 따라, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료에 있어서의, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물의 용도를 제공한다.According to another aspect of the invention, the use of a pharmaceutical composition or health functional food composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke containing an LRRK2 inhibitor as an active ingredient in the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke to provide.

특히, 본 발명은 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중에서, LRRK2 야생형이 과발현됨을 최초로 규명하였으며, 상기와 같은 효과를 통해 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중을 치료할 수 있음에 대해서도 최초로 규명하였다. 이와 관련한 실험결과는 후술하는 실험예를 통해 상세히 설명한다.In particular, the present invention first identified the overexpression of the LRRK2 wild type in traumatic brain injury or stroke, and also for the first time that the traumatic brain injury or stroke can be treated through the above effects. The experimental results related to this will be described in detail through the following experimental examples.

이하, 본 발명을 후술하는 실시예와 실험예를 통해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples and experimental examples.

단, 후술하는 실시예와 실험예는 본 발명을 일부 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.However, Examples and Experimental Examples to be described later are merely illustrative of some of the present invention, the present invention is not limited thereto.

<실시예 1> 5-클로로-N4-(2-(이소프로필설포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민의 제조Example 1 5-Chloro-N 4-(2- (isopropylsulfonyl) phenyl) -N 2-(2-methoxy-4- (4- (4-methylpiperazin-1-yl) piperidine Preparation of -1-yl) phenyl) pyrimidine-2,4-diamine

표제 화합물을 WO 2004080980, WO 2005016894, WO 2009102446, WO 2012019132 또는 WO 2015077602 특허문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to WO 2004080980, WO 2005016894, WO 2009102446, WO 2012019132 or WO 2015077602 patent documents.

<실시예 2> N-(2-(2-(3-클로로-4-메톡시페닐아미노)-5-플루오로피리미딘-4-일아미노)페닐)메탄설폰아미드의 제조Example 2 Preparation of N- (2- (2- (3-chloro-4-methoxyphenylamino) -5-fluoropyrimidin-4-ylamino) phenyl) methanesulfonamide

표제 화합물을 WO 2009127642 특허문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to the WO 2009127642 patent document.

<실시예 3> (R)-3-(4-(사이클로헥실아미노)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)-1-(3-페닐피페리딘-1-일)프로판-1-온의 제조Example 3 (R) -3- (4- (cyclohexylamino) -1 H-pyrazole [4,3-c] pyridin-3-yl) -1- (3-phenylpiperidine-1- (1) Preparation of propane-1-one

표제 화합물을 WO 2010106333 특허문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to the WO 2010106333 patent document.

<실시예 4> 2-(4-플루오로벤질옥시)-5-(1-(2-모폴리노에틸)-1H-피라졸-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드의 제조Example 4 2- (4-fluorobenzyloxy) -5- (1- (2-morpholinoethyl) -1H-pyrazol-4-yl) -N- (pyridin-3-yl) benz Preparation of Amides

표제 화합물을 WO 2011038572 특허문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to the WO 2011038572 patent document.

<실시예 5> 4-(4-(6-메틸-4-(테트라하이드로-2H-파이란-4-일옥시)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)피리딘-2-일)모르폴린의 제조Example 5 4- (4- (6-methyl-4- (tetrahydro-2H-pyran-4-yloxy) -1H-pyrazole [4,3-c] pyridin-3-yl) pyridine- Preparation of 2-yl) morpholine

표제 화합물을 WO 2011141756 특허문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to the WO 2011141756 patent document.

<실시예 6> (4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)(3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)메타논의 제조Example 6 (4- (dimethylamino) piperidin-1-yl) (3-methoxy-4- (4- (methylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-yl Preparation of amino) phenyl) methanone

표제 화합물을 WO 2011151360 특허문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to the WO 2011151360 patent.

<실시예 7> (S)-3-(사이클로프로필티오)-7-메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로티에노[3,4-c]피리딘-4(5H)-온의 제조Example 7 (S) -3- (cyclopropylthio) -7-methyl-1- (1H-pyrazol-3-yl) -6,7-dihydrothieno [3,4-c] pyridine Preparation of -4 (5H) -one

표제 화합물을 WO 2012058193 특허문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to the WO 2012058193 patent document.

<실시예 8> N4-에틸-N2-(1-(3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-3-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민의 제조Example 8 N4-ethyl-N2- (1- (3-fluoro-1- (oxetan-3-yl) piperidin-4-yl) -3-methyl-1H-pyrazole-4- I) -5- (trifluoromethyl) pyrimidine-2,4-diamine

표제 화합물을 WO 2012062783 특허문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to the WO 2012062783 patent document.

<실시예 9> 3-(사이클로펜틸티오)-6,6-디메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로벤조[c]티오펜-4(5H)-온의 제조Example 9 3- (cyclopentylthio) -6,6-dimethyl-1- (1H-pyrazol-3-yl) -6,7-dihydrobenzo [c] thiophene-4 (5H)- Manufacture of

표제 화합물을 WO 2012118679 특허문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to WO 2012118679 Patent Document.

<실시예 10> 2-[(2-메톡시-4-[[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카보닐]페닐)아미노]-5,11-디메틸-5,11-디하이드로-6H-피리미도[4,5-b][1,4]벤조디아제핀-6-온의 제조Example 10 2-[(2-methoxy-4-[[4- (4-methylpiperazin-1-yl) piperidin-1-yl] carbonyl] phenyl) amino] -5,11 Preparation of -dimethyl-5,11-dihydro-6H-pyrimido [4,5-b] [1,4] benzodiazepin-6-one

표제 화합물을 WO 2010080712 또는 WO 2015176010 특허문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to WO 2010080712 or WO 2015176010 patent literature.

<실시예 11> (4-(4-(에틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-2-플루오로-5-메톡시페닐)(모폴리노)메타논의 제조Example 11 (4- (4- (ethylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-ylamino) -2-fluoro-5-methoxyphenyl) (morpholino) meta Discuss manufacturing

<실시예 12> (3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)(모폴리노)메타논의 제조Example 12 Preparation of (3-methoxy-4- (4- (methylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-ylamino) phenyl) (morpholino) methanone

실시예 12 화합물은 하기 두가지 방법에 의해 제조할 수 있다.Example 12 Compounds can be prepared by the following two methods.

<방법 1><Method 1>

<방법 2><Method 2>

단계 1: 2-클로로-5-요오도-N-메틸피리미딘-4-아민의 제조Step 1: Preparation of 2-chloro-5-iodo-N-methylpyrimidin-4-amine

2,4-디클로로-5-요오도피리미딘(1.0 당량)을 THF에 녹인 후, 0℃에서 메틸아민(3.5 wt% in EtOH, 1.1 당량)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반한 뒤, 용매를 제거하고 더 이상의 정제과정 없이 다음 단계에서 사용하였다(수율: 100%).2,4-Dichloro-5-iodopyrimidine (1.0 equiv) was dissolved in THF and then methylamine (3.5 wt% in EtOH, 1.1 equiv) was added at 0 ° C. The mixture was stirred at 0 ° C. for 2 hours, then the solvent was removed and used in the next step without further purification (yield: 100%).

단계 2: 2-클로로-N-메틸-5-(트리프루오로메틸)피리미딘-4-아민의 제조Step 2: Preparation of 2-chloro-N-methyl-5- (trifluoromethyl) pyrimidin-4-amine

Two-necked round-bottom flask를 질소 기채로 채운 후, CuI(5.0당량) 및 KF(5.0 당량)를 넣었다. 혼합물을 150℃로 온도를 가열한 뒤, 감압 상태에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 후, 온도를 상온으로 낮추고 질소하에서 DMF/NMP(1:1)에 용해된 트리메틸(트리플로로메틸)실란(5.0 당량)을 실린지(syringe)를 이용하여 첨가하였다. 30분 동안 반응시킨 뒤, DMF/NMP(1:1)에 용해된 2-클로로-5-요오도-N-메틸피리미딘-4-아민(1.0 당량)을 실린지를 이용하여 첨가하고, 50℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 상기 반응물에 물을 첨가하여 침전물을 형성시키고, 형성된 침전물을 여과하여 제거하였다. 수득된 여과액으로부터 EtOAc를 이용하여 유기물을 추출하였다(x3). 모아진 유기층은 브라인(brine)으로 세척하고, Na₂SO₄로 남은 물을 제거하였다. 물이 제거된 혼합물을 MPCL(EtOAc:Hex)를 이용하여 정제함으로써, 노란빛 고체의 목적 화합물을 수득하였다(수율: 70%).After filling the two-necked round-bottom flask with nitrogen, CuI (5.0 equiv) and KF (5.0 equiv) were added thereto. The mixture was heated to 150 ° C. and then stirred under reduced pressure for 2 hours. After the reaction, the temperature was lowered to room temperature and trimethyl (trifluoromethyl) silane (5.0 equiv) dissolved in DMF / NMP (1: 1) under nitrogen was added using a syringe. After reacting for 30 minutes, 2-chloro-5-iodo-N-methylpyrimidin-4-amine (1.0 equiv) dissolved in DMF / NMP (1: 1) was added using a syringe, and 50 ° C. Reaction was carried out for 18 hours. After the reaction, water was added to the reaction to form a precipitate, and the formed precipitate was removed by filtration. The organics were extracted from the filtrate obtained with EtOAc (x3). The combined organic layers were washed with brine and water remaining with Na ₂ SO ₄ was removed. The water-free mixture was purified using MPCL (EtOAc: Hex) to give the title compound as a yellowish solid (yield: 70%).

단계 3: (3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)(모폴리노)메타논의 제조Step 3: Preparation of (3-methoxy-4- (4- (methylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-ylamino) phenyl) (morpholino) methanone

2-클로로-N-메틸-5-(트리프루오로메틸)피리미딘-4-아민(1.0 당량)과 (4-아미노-3-메톡시페닐)(모르폴리노)메타논(1.0 당량)을 다이옥세인(dioxane)에 녹이고, 상온에서 p-톨루엔술폰산(p-toluensulfonic acid)(1.0 당량)을 첨가하였다. 이를 100℃에서 16시간 교반한 뒤, 상온으로 식힌다음 용매를 제거하고 얼음물을 첨가하였다. 유기물은 EtOAc를 이용하여 추출하였다(x3). 모아진 유기층은 브라인으로 세척하고, Na₂SO₄로 남은 물을 제거하였다. 물이 제거된 혼합물을 MPCL(EtOAc:Hex)를 이용하여 정제함으로써, 흰색 고체의 목적 화합물을 수득하였다(수율: 70%).2-chloro-N-methyl-5- (trifluoromethyl) pyrimidin-4-amine (1.0 equiv) and (4-amino-3-methoxyphenyl) (morpholino) methanone (1.0 equiv) Was dissolved in dioxane and p-toluensulfonic acid (1.0 equiv) was added at room temperature. After stirring for 16 hours at 100 ℃, cooled to room temperature, the solvent was removed and ice water was added. The organics were extracted with EtOAc (x3). The combined organic layers were washed with brine and water remaining with Na ₂ SO ₄ was removed. The water-free mixture was purified using MPCL (EtOAc: Hex) to give the title compound as a white solid (yield: 70%).

<실시예 13> (R)-4-(1-사이클로프로필에틸아미노)-7-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)신놀린-3-카복스아미드의 제조Example 13 Preparation of (R) -4- (1-cyclopropylethylamino) -7- (1-methyl-1H-pyrazol-4-yl) cinnoline-3-carboxamide

표제 화합물을 WO 2012162254 특허문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to WO 2012162254 Patent Document.

<실시예 14> 1-(5-클로로-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-1H-피라졸-1-일)-2-메틸프로판-2-올의 제조Example 14 1- (5-Chloro-4- (4- (methylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-ylamino) -1H-pyrazol-1-yl) -2 Preparation of -methylpropan-2-ol

<실시예 15> 사이클로프로필[10,11,14,15-테트라하이드로-1,16-에테노-4,8-(메테노)피라졸[3,4-j][1,4,7,9]옥사트리아자사이클로헥사데신-12(13H)-일]메타논의 제조Example 15 Cyclopropyl [10,11,14,15-tetrahydro-1,16-etheno-4,8- (metheno) pyrazole [3,4-j] [1,4,7, 9] Preparation of Oxatrizacyclohexadecine-12 (13H) -yl] methanone

표제 화합물을 WO 2013046029 특허문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to WO 2013046029 patent.

<실시예 16> N2-(5-클로로-1-((3S,4R)-3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)-N4-메틸-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민의 제조Example 16 N2- (5-Chloro-1-((3S, 4R) -3-fluoro-1- (oxetan-3-yl) piperidin-4-yl) -1H-pyrazole- Preparation of 4-yl) -N4-methyl-5- (trifluoromethyl) pyrimidine-2,4-diamine

표제 화합물을 Journal of Medicinal Chemistry (2014), 57(3), 921-936 문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to the Journal of Medicinal Chemistry (2014), 57 (3), 921-936.

<실시예 17> (4-(6-아미노-5-(1-이소프로필-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)피리딘-3-일)-2-메톡시페닐)(모폴리노)메타논의 제조Example 17 (4- (6-Amino-5- (1-isopropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) pyridin-3-yl) -2-methoxyphenyl) ( Preparation of morpholino) methanone

표제 화합물을 WO 2014106612 문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to WO 2014106612 document.

<실시예 18> 3-(6-(4-(2-플루오로에틸)피페라진-1-일)피리미딘-4-일)-5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸의 제조Example 18 3- (6- (4- (2-fluoroethyl) piperazin-1-yl) pyrimidin-4-yl) -5- (1-methylcyclopropoxy) -1H-indazole Manufacture

표제 화합물을 WO 2014137723 문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to WO 2014137723 document.

<실시예 19> 6-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-4-(3-메틸-4-(모폴리노메틸)페닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카보나이트릴의 제조Example 19 6- (1-Methyl-1H-pyrazol-3-ylamino) -4- (3-methyl-4- (morpholinomethyl) phenyl) -1H-pyrrolo [2,3- b] Preparation of pyridine-3-carbonitrile

표제 화합물을 WO 2014170248 문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to WO 2014170248.

<실시예 20> (2S,6R)-2,6-디메틸-4-(6-(5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸-3-일)피리미딘-4-일)모르폴린의 제조Example 20 (2S, 6R) -2,6-Dimethyl-4- (6- (5- (1-methylcyclopropoxy) -1 H-indazol-3-yl) pyrimidin-4-yl) Preparation of morpholine

<실시예 21> 3-(4-모르포리노-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일)벤조니트릴의 제조Example 21 Preparation of 3- (4-morpholino-1H-pyrrolo [2,3-b] pyridin-3-yl) benzonitrile

표제 화합물을 WO 2015092592 문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to WO 2015092592 document.

<실시예 22> 1-메틸-4-(4-모르폴리노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-1H-피롤-2-카보나이트릴의 제조Example 22 Preparation of 1-methyl-4- (4-morpholino-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-yl) -1H-pyrrole-2-carbonitrile

표제 화합물을 USA 20140005183 A1 문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to USA 20140005183 A1 literature.

<실시예 23> 2-(벤질옥시)-5-(2-플루오로피리딘-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드의 제조Example 23 Preparation of 2- (benzyloxy) -5- (2-fluoropyridin-4-yl) -N- (pyridin-3-yl) benzamide

표제 화합물을 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2012), 22, 5625-5629 문헌을 참조하여 준비하였다.The title compound was prepared with reference to Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2012), 22, 5625-5629.

하기 표 1에 상기 실시예 1-23에서 준비한 화합물의 구조를 나타내었다.Table 1 shows the structure of the compound prepared in Example 1-23.

실시예EXAMPLE 화학구조Chemical structure 실시예EXAMPLE 화학구조Chemical structure 1One

22

33

44

55

66

77

88

99

1010

1111

1212

1313

1414

1515

1616

1717

1818

1919

2020

2121

2222

2323

<실험재료의 준비> 및 <실험방법><Preparation of Experimental Materials> and <Experiment Method>

본 발명의 실험예에 사용된 재료(세포, 동물 모델 등)의 제조방법 및 실험방법을 하기에 나타내었다.The preparation method and experimental method of the material (cell, animal model, etc.) used in the experimental example of the present invention are shown below.

1. 일차 피질 신경세포 배양Primary Cortical Neuronal Cultures

일차 신경세포 배양은 태아 15일령 ICR 마우스로부터 재취한 대뇌 피질을 이용하여 배양하였다. 대뇌 피질은 분리 후 HBSS 배양액 상태에서 20 U/ml papain 및 10 U/ml DNase를 37°C에서 15분간 처리 한 후 10% FBS 포함 MEM 배양액으로 피질 조직을 3번 닦아주며 이후 신경세포를 분리하였다. 분리된 신경세포는 실험 목적에 맞게 50 mg/ml poly-D-lysine으로 코팅된 세포배양접시에 분주하였다. 이후 하루 밤 배양 이후 1% Glutamax 및 2% B27 supplement를 포함한 Neurobasal A 배양액에서 10-12일간 배양 이후 실험을 수행하였다.Primary neuronal cultures were cultured using cerebral cortex taken from fetal 15-day-old ICR mice. After separation, the cerebral cortex was treated with 20 U / ml papain and 10 U / ml DNase at 37 ° C for 15 minutes in HBSS culture, followed by wiping the cortical tissue three times with MEM medium containing 10% FBS. . Isolated neurons were dispensed into 50 mg / ml poly-D-lysine-coated cell culture dishes for experimental purposes. After the overnight culture, the experiment was performed after 10-12 days in Neurobasal A culture solution containing 1% Glutamax and 2% B27 supplement.

2. 외상성 뇌손상 신경세포 모델2. Traumatic Brain Injury Neuron Model

외상성 뇌손상의 신경세포 모델 구축을 위하여 배양된 일차 신경세포에 일정한 간격 (3mm 간격의 격자 모양)으로 파이펫 팁을 활용하여 배양접시 표면을 긁어주었다. 상처 이후 배양액을 교체하며 이후 일정한 시간 간격 이후 추가적인 실험을 수행하였다. 손상을 주지 않은 세포를 대조군으로 사용하였다. To build a neuronal model of traumatic brain injury, the surface of the culture dish was scraped using pipette tips at regular intervals (3 mm spacing lattice) on the primary neurons cultured. After the wound the culture was replaced and further experiments were performed after a certain time interval. Intact cells were used as controls.

3. 마우스 외상성 뇌손상 모델 제작3. Model of Mouse Traumatic Brain Injury

마우스를 활용한 외상성 뇌손상 동물 모델 구축을 위하여 제어피질 충격 동물 모델 (controlled cortical impact)을 사용하였다. 동물 모델의 제작 방법은 다음과 같다. 마우스를 2% isoflurane으로 마취를 시킨 이후 뇌정위 고정 장치에 고정 시킨 이후 정수리점을 기준으로 anterior-posterior (AP) -2 mm와 medial-lateral (ML) 2.0 mm 위치에 4mm 원형 모양으로 두개골을 절개하여 뇌를 노출 시켰다. 이후 대뇌피질 충격 장치 (Impact One^TM Stereotaxic Impactor for CCI, Leica)를 이용하여 2 mm 지름의 원형 충격팁으로 2m/sec 속도, 충격 지속 시간 300 msec, 깊이 2.5 mm, 발사각 25°로 대뇌피질에 충격을 가하였다. 이후 두개골을 복구 시킨 이후 37 ± 0.5℃보온 매트에서 마우스를 회복 시켰다. 대조군은 두개골 절개 이후 대뇌피질 충격을 주지 않은 마우스를 사용하였다.A controlled cortical impact animal model was used to construct a traumatic brain injury animal model using a mouse. The production method of the animal model is as follows. After anesthetizing the mouse with 2% isoflurane and fixing it to the cerebral stereo fixation device, the skull is incised in a 4 mm circular shape at the anterior-posterior (AP) -2 mm and medial-lateral (ML) 2.0 mm positions relative to the parietal point. By exposing the brain. Afterwards, a 2 mm diameter circular impact tip was used to impact the cerebral cortex at a speed of 2 m / sec, impact duration of 300 msec, depth of 2.5 mm, and launch angle of 25 ° using an Impact One ^TM Stereotaxic Impactor for CCI (Leica). Was added. After restoring the skull, the mice were recovered on a 37 ± 0.5 ℃ warm mat. As a control group, mice that had no cortical shock after cranial dissection were used.

4. 뇌졸중 동물 모델 제작4. Stroke Animal Model Creation

마우스를 70% N₂O와 30% O₂가 섞인 혼합가스에 5%의 이소플루란(isoflurane)으로 전신마취를 한 후, 목 전방 부위 중앙의 피부를 절개하고 오른쪽 경동맥과 외경동맥(ECA)을 주위조직과 신경들로부터 분리하였다. 외경동맥 분지인 상부갑상선동맥과 후두동맥을 전기소작기로 소작하고 내경동맥의 분지인익돌근구개동맥을 전기소작한 뒤, 외경동맥을 자르고 probe를 외경동맥에서 내경동맥으로 삽입하되 총경동맥분지에서 약 10 mm정도 삽입한 후 실로 고정하였다. 피부절개부위를 다시 봉합한 후 마취에서 자연회복시켰다. 유발 90분 후 같은방법으로 재마취하여 probe를 후퇴시켜 재관류시켰다. 모든 수술과정은 이소플루란을 2%로 유지하면서 수술현미경하에서 시행하였으며 체온이 37±0.5℃ 이하로 떨어지지 않도록 체온 유지장치를 이용하였다.Mice were subjected to general anesthesia with 5% isoflurane in a mixed gas of 70% N ₂ O and 30% O ₂ , followed by dissection of the skin in the center of the anterior neck and right carotid and external carotid arteries (ECA). Were isolated from surrounding tissues and nerves. The upper thyroid artery and the laryngeal artery, which are the branches of the external carotid artery, are cauterized with an electrocatheter, and the pterygoid palatal artery, which is the branch of the internal carotid artery, is cauterized. After inserting about 10 mm was fixed with a thread. The skin incision was resealed and then recovered naturally under anesthesia. 90 minutes after the induction, the anesthetized by the same method, the probe was retreated and reperfused. All surgical procedures were performed under the microscope under the condition of maintaining isoflurane at 2%. The body temperature was used to prevent the body temperature from dropping below 37 ± 0.5 ℃.

5. 약물 처리5. Drug treatment

본 발명의 실험에서, 약물은 본 발명에 따른 LRRK2 활성 저해제(본 발명의 실시예 화합물)를 의미한다.In the experiments of the present invention, the drug means an LRRK2 activity inhibitor (Example compound of the present invention) according to the present invention.

LRRK2 활성 저해제(본 발명의 실시예 화합물)를 마우스에 처리하기 위하여 5% dimethyl sulfoxide (DMSO)와 4% Tween 80을 포함한 생리식염수에 녹인 후 복강 주사를 통하여 50 mg/kg 농도로 처리하였다. 약물(본 발명의 실시예 화합물)은 매일 동일한 농도로 처리를 하였으며 대조군의 경우 5% dimethyl sulfoxide (DMSO)와 4% Tween 80을 포함한 생리식염수를 처리하였다.In order to treat LRRK2 activity inhibitor (Example compound of the present invention) in mice, it was dissolved in physiological saline containing 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 4% Tween 80 and then treated at a concentration of 50 mg / kg through intraperitoneal injection. The drug (Example compound of the present invention) was treated with the same concentration every day, and the control group was treated with saline containing 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 4% Tween 80.

6. RNA 분리 및 RT-PCR 실험6. RNA isolation and RT-PCR experiment

뇌조직 및 신경세포에서 전체 RNA의 분리는 Trizol를 이용하여 수행하였다. 2 mg 전체 RNA에서 M-MLV reverse transcriptase kit (Promega)를 활용하여 cDNA를 합성하였으며 아래 기술된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.Isolation of total RNA from brain tissue and neurons was performed using Trizol. CDNA was synthesized from 2 mg total RNA using M-MLV reverse transcriptase kit (Promega) and PCR was performed using the primers described below.

GAPDH (F: 5'- gtcatcatctccgcc-3', R: 5'-gatgcctgcttcaccaccttcttg-3'); GAPDH (F: 5'-gtcatcatctccgcc-3 ', R: 5'-gatgcctgcttcaccaccttcttg-3');

LRRK2 (F: 5'-agctggttctagtcgctctg-3', R: 5'-gtagtctgcacctcagcaac-3');LRRK2 (F: 5'-agctggttctagtcgctctg-3 ', R: 5'-gtagtctgcacctcagcaac-3');

HIF-1a (F: 5'-ctcatcagttgccacttcc-3', R: 5'-tcatcttcactgtctagaccac-3'); HIF-1a (F: 5'-ctcatcagttgccacttcc-3 ', R: 5'-tcatcttcactgtctagaccac-3');

IL-1b (F: 5'-tccaggatgaggacatgagcac-3', R: 5'-gaacgtcacacaccagcaggtta-3');IL-1b (F: 5'-tccaggatgaggacatgagcac-3 ', R: 5'-gaacgtcacacaccagcaggtta-3');

IL-6 (F: 5'-ccacttcacaagtcggaggctta-3', R: 5'-ccagtttggtagcatccatcatttc-3'); 및IL-6 (F: 5'-ccacttcacaagtcggaggctta-3 ', R: 5'-ccagtttggtagcatccatcatttc-3'); And

TNF-a (F: 5'-cttctgtctactgaacttcgg-3', R: 5'-caggcttgtcactcgaatttt-3').TNF-a (F: 5'-cttctgtctactgaacttcgg-3 ', R: 5'-caggcttgtcactcgaatttt-3').

7. 면역 블랏 분석7. Immune Blot Analysis

뇌조직과 세포는 40 mM Tri-HCl (pH 7.4), 10 mM EDTA, 120 mM NaCl, 0.1% Nonidet P-40, 1 mM glycerophosphate, 1 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM PMSF, 및 protease inhibitor cocktail을 포함하는 용해액에서 용해 후 SDS-PAGE에서 단백질을 분리 후, PVDF 막으로 단백질을 이동 시켰다. 이후, 각 실험 용도에 맞는 항체를 막에 처리 이후 이차 항체와 면역 활성 복합체를 ECL (enhanced chemiluminescence) 검출 시스템을 이용하여 x-ray 필름에 시각화 하였다.Brain tissue and cells were 40 mM Tri-HCl (pH 7.4), 10 mM EDTA, 120 mM NaCl, 0.1% Nonidet P-40, 1 mM glycerophosphate, 1 mM NaF, 1 mM Na ₃ VO ₄ , 1 mM PMSF, and After dissolution in lysate containing protease inhibitor cocktail, the protein was separated from SDS-PAGE, and the protein was transferred to PVDF membrane. Subsequently, after treatment of the antibody for each experimental use to the membrane, the secondary antibody and the immunoactive complex were visualized on the x-ray film using an enhanced chemiluminescence (ECL) detection system.

8. 일차 피질 신경세포 시료에 대한 면역형광법8. Immunofluorescence for Primary Cortical Neuronal Samples

커버슬립에서 배양한 일차 신경 세포를 4% PFA에서 20분간 처리한 후 0.2% Triton-X100 및 2% bovine serum albumin (BSA)을 포함하는 PBS에 각각 10분 및 30분간 순차적으로 처리하였다. 이후 커버슬립을 적절한 일차 항체와 이차 항체를 각각 처리하였다. 이후 슬라이드에 커버슬립을 올린 이후 lazer scanning confocal microscope (LSM700, Carl Zeiss)으로 형광 이미지를 얻었다.Primary neurons cultured on coverslips were treated with 4% PFA for 20 minutes and then sequentially treated with PBS containing 0.2% Triton-X100 and 2% bovine serum albumin (BSA) for 10 minutes and 30 minutes, respectively. The coverslips were then treated with the appropriate primary and secondary antibodies, respectively. After the cover slip on the slide, the fluorescence image was obtained by lazer scanning confocal microscope (LSM700, Carl Zeiss).

9. 플라즈미드 및 siRNA 형질 전환9. Plasmid and siRNA transformation

HA-HIF1alpha-pcDNA3은 Addgene (#18949)으로 구입하였으며, 우성 억제 인간 HIF-1a DNA (DNA 결합 및 transactivation 도메인이 제거된 형태)는 PCR을 통하여 제작하였다.HA-HIF1alpha-pcDNA3 was purchased as Addgene (# 18949), and dominant inhibitory human HIF-1a DNA (forms with DNA binding and transactivation domains removed) was prepared by PCR.

hHIF-1a-DN (F: 5'-ggggatccgccaccatgcgaagtaaagaatctg3', R: 5'-gggcggccgctcatttgtcaaagaggctact-3'). HIF-1a 및 이에 대한 대조군 siRNA는 Bioneer (Daejeon, South Korea)에서 합성하였다. 이에 대한 염기서열은 다음과 같다. hHIF-1a-DN (F: 5′-ggggatccgccaccatgcgaagtaaagaatctg3 ′, R: 5′-gggcggccgctcatttgtcaaagaggctact-3 ′). HIF-1a and its control siRNA were synthesized in Bioneer (Daejeon, South Korea). The base sequence for this is as follows.

SiHIF-1a-1 (F: 5'-cccauuccucauccgucaau-3', R: 5'-uggauagcgauauggucaaug-3'). SiHIF-1a-1 (F: 5'-cccauuccucauccgucaau-3 ', R: 5'-uggauagcgauauggucaaug-3').

일차 신경세포에 cDNA와 siRNA는 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 형질전환하였다.CDNA and siRNA were transformed into primary neurons using Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

10. shRNA 플라즈미드 제작10. shRNA plasmid construction

마우스 LRRK2 shRNA에 대한 lentiviral vector (pLL3.7) 제작을 위하여 다음과 같은 프라이머를 이용하여 제작하였다.To prepare a lentiviral vector (pLL3.7) for the mouse LRRK2 shRNA, a primer was prepared as follows.

shLRRK2-1 (F: 5'-tggcttactacttcacttcacgatattttcaagagaatatcgtgaagtagtaagccttttttc-3' R: 5'-tgcttactacttcacgatatttttcaagagaaaatatcgtgaagtagtaagcttttttc-3');shLRRK2-1 (F: 5'-tggcttactacttcacttcacgatattttcaagagaatatcgtgaagtagtaagccttttttc-3 'R: 5'-tgcttactacttcacgatatttttcaagagaaaatatcgtgaagtagtaagcttttttc-3');

shLRRK2-2 (F: 5'-taagttgatagtcaggctgaatttcaagagaattcagcctgactatcaacttttttttc-3' R: 5'-tcgagaaaaaaagttgatagtcaggctgaattctcttgaaattcagcctgactatcaactta-3'); 및shLRRK2-2 (F: 5'-taagttgatagtcaggctgaatttcaagagaattcagcctgactatcaacttttttttc-3 'R: 5'-tcgagaaaaaaagttgatagtcaggctgaattctcttgaaattcagcctgactatcaactta-3'); And

scramble (F: 5'-tcgctgagtacttcgaaatgtccttcaagagagacatttcgaagtactcagcgttttttc-3' R: 5'-tcgagaaaaaacgctgagtacttcgaaatgtctctcttgaagacatttcgaagtactcagcga-3'.scramble (F: 5'-tcgctgagtacttcgaaatgtccttcaagagagacatttcgaagtactcagcgttttttc-3 'R: 5'-tcgagaaaaaacgctgagtacttcgaaatgtctctcttgaagacatttcgaagtactcagcga-3'.

11. Lenti-virus 제작 및 신경세포에 접종11.Lenti-virus production and inoculation into neurons

100 mm 세포배양 접시에, 3-4 x 10⁶ 293FT 세포를 24시간 배양 이후, 4.5 mg lentiviral construct (shControl, shLRRK2-1, shLRRK2-2), 3 ug psPAX2 (Addgene), 그리고 1.5 mg pMD2.G (Addgene)를 같이 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 transfection하였다. 이후 48시간 세포를 배양한 이후 배양액을 모으며 이를 Lenti-X concentrator (Clontech)을 이용하여 바이러스를 농축 시켰다. 이후, 6 mg/ml polybrene와 함께 배양 농축액을 신경세포에 처리하였다.In a 100 mm cell culture dish, after 24 hours of incubation of 3-4 x 10 ⁶ 293FT cells, 4.5 mg lentiviral construct (shControl, shLRRK2-1, shLRRK2-2), 3 ug psPAX2 (Addgene), and 1.5 mg pMD2.G (Addgene) was transfected with Lipofectamine 2000 (Invitrogen) as well. After incubating the cells for 48 hours, the culture medium was collected and the virus was concentrated using Lenti-X concentrator (Clontech). Thereafter, the culture concentrate was treated with neurons with 6 mg / ml polybrene.

12. 마우스 및 인간 LRRK2 리포터 플라즈미드 제작 및 돌연변이 제작12. Mouse and Human LRRK2 Reporter Plasmid Construction and Mutation Construction

마우스 일차 피질신경세포로부터 얻어진 지놈 DNA로부터 아래 프라이머를 활용하여 LRRK2 프모모터 영역 (-2095 ~ -1-bp, 번역 시작점 기준)을 PCR을 통하여 얻어냄. (F: 5'-gggtaccgctgtggttggccatgtcag-3', R: 5'-gctcgagggtgcagccgggcggggact-3'). 얻어진 PCR 산물은 TOPO TA cloning kit (Invitrogen)을 이용하여 pCR2.1에 이동 시킴. 이후 Kpn I 및 Xho I 제한 효소 분해를 통하여 pGL3 basic vector (Promega)로 이동시켜 리포터 플라즈미드를 제작함. 네 개의 HIF-1a 결합 예측 영역에 대한 돌연 변이 제작을 위하여 Quick Change site-directed mutagenesis kit (Stratagene)을 이용하였으며 돌연변이 여부를 automatic DNA sequencing (Macrogen, South Korea)를 통하여 확인함. From the genome DNA obtained from mouse primary cortical neurons, the LRRK2 promoter region (-2095 ~ -1-bp, based on the translation start point) was obtained by PCR using the following primers. (F: 5'-gggtaccgctgtggttggccatgtcag-3 ', R: 5'-gctcgagggtgcagccgggcggggact-3'). The obtained PCR product was transferred to pCR2.1 using TOPO TA cloning kit (Invitrogen). Subsequently, the reporter plasmid was prepared by transferring to pGL3 basic vector (Promega) through Kpn I and Xho I restriction enzyme digestion. A quick change site-directed mutagenesis kit (Stratagene) was used to generate mutations for four HIF-1a binding predictive regions. Mutation was confirmed by automatic DNA sequencing (Macrogen, South Korea).

13. 크로마틴 면역침전 분석13. Chromatin Immunoprecipitation Assay

크로마틴 면역침전 분석은 ChIP assay kit (Millipore)를 활용하여 수행하였다. 일차 신경세포에 대한 스크래치 손상 24시간 이후 1% formaldehyde/phosphate-buffered saline 처리 이후 소니케이션을 통하여 100- ~ 500-bp DNA 조각을 얻었다. 5 mg anti-HIF-1a (Novus) 혹은 rabbit IgG (Sigma-Aldrich)을 이용한 면역 침전법에 의하여 크로마틴을 분리하였다. HIF-1a 결합영역에 대한 결합 여부는 다음의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 확인하였다.Chromatin immunoprecipitation analysis was performed using the ChIP assay kit (Millipore). After 24 hours of scratch injury to primary neurons, 100% to 500-bp DNA fragments were obtained through sonication after 1% formaldehyde / phosphate-buffered saline treatment. Chromatin was isolated by immunoprecipitation using 5 mg anti-HIF-1a (Novus) or rabbit IgG (Sigma-Aldrich). The binding to the HIF-1a binding region was confirmed by PCR using the following primers.

HRE3 (232-bp), (F: 5'-ggttacttggaagcaaatcc-3', R: 5'-gatgggtaagaggtggagg-3').HRE3 (232-bp), (F: 5'-ggttacttggaagcaaatcc-3 ', R: 5'-gatgggtaagaggtggagg-3').

14. 신경 생존 분석14. Neuronal Survival Analysis

신경 생존 여부는 AlamarBlue assay (Thermo Scientific)와 LDH assay (Promega)를 이용하여 분석하였다. 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. LDH assay(Lactate dehydrogenase (LDH))는 세포막 손상 및 신경세포 사멸에 대한 마커로 활용하였다. 일차 신경에 대한 손상 및 이후 약물, 유전자 발현 조작 이후 배양액을 모은 뒤 분비된 LDH 양을 CytoTox 96^R Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit (Promage)를 통하여 분석하였다.Nerve survival was analyzed using AlamarBlue assay (Thermo Scientific) and LDH assay (Promega). Analysis was performed according to the manufacturer's protocol. LDH assay (Lactate dehydrogenase (LDH)) was used as a marker for cell membrane damage and neuronal cell death. The amount of LDH secreted after the damage to the primary nerve and the culture after the drug and gene expression manipulation was analyzed by CytoTox 96 ^R Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit (Promage).

15. TUNEL 염색15.TUNEL Dyeing

NeuN과 TUNEL의 동시 염색을 위하여 먼저 조직 절편을 NeuN 항체를 이용하여 염색을 수행하였으며 이후 ApopTag Plus In Situ Apoptosis Fluorescein Detection Kit를 이용하여 TUNEL 염색을 수행하였다. 세포핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 통하여 염색을 하며 이후 형광 현미경 (OLYMPUS DX51)을 통하여 이미지를 얻으며 이후 DP2-BSW software (version 2.2) 및 Image Pro Plus 6.0를 이용하여 이미지를 분석하였다.For simultaneous staining of NeuN and TUNEL, tissue sections were stained using NeuN antibody first, followed by TUNEL staining using ApopTag Plus In Situ Apoptosis Fluorescein Detection Kit. Cell nuclei are stained using 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), and then imaged by fluorescence microscopy (OLYMPUS DX51), and then imaged using DP2-BSW software (version 2.2) and Image Pro Plus 6.0. Was analyzed.

16. 면역조직화학검사16. Immunohistochemistry

마우스를 sodium pentobarbital (50 mg/kg, 복강주사)로 마취를 시킨 후 PBS와 4% PFA (w/v in PBS)로 관류 시켰다. 이후 뇌를 4% PFA 및 30% sucrose (w/v in PBS)에 각각 24시간 처리하였다. 이후 30 mm 관상 절펼을 제작하였다.Mice were anesthetized with sodium pentobarbital (50 mg / kg, intraperitoneal injection) and then perfused with PBS and 4% PFA (w / v in PBS). The brains were then treated with 4% PFA and 30% sucrose (w / v in PBS) for 24 hours, respectively. Then a 30 mm coronal incision was produced.

17. 뇌 손상 영역 측정17. Measuring areas of brain damage

조직 절편을 poly-D-lysine으로 코팅된 슬라이드에 올리고 0.1% cresyl violet 용액에 20분간 처리하였다. 이후 100, 95, 70, 그리고 50% ethanol에서 순차적으로 2분간 탈수 과정을 진행하고 xylene으로 2분간 탈염색 과정을 수행하였다. 이후 손상 받은 전체 뇌반구 영역에 대한 손상 영역을 백분율로 환산하여 측정하였다.Tissue sections were placed on slides coated with poly-D-lysine and treated with 0.1% cresyl violet solution for 20 minutes. Thereafter, dehydration was performed sequentially for 2 minutes in 100, 95, 70, and 50% ethanol, followed by destaining for 2 minutes with xylene. Then, the damage area to the total damaged hemisphere area was measured in terms of percentage.

18. 운동 행동 평가-balance beam test18. Balanced behavior test

Balance beam test는 약물 처리 전 1일 이후 3일 7일에 수행함. 마우스를 목재 원형 막대 (5 mm 직경, 90 cm 길이, 50 cm 높이)의 중간에 위치한 후 아래의 기준에 따라 점수를 매김. (0 점: 마우스가 30초 이상 막대에 머무르지 못할 경우, 1 점: 마우스가 30 초 동안 막대에 머무르지만 움직이지 못할 경우, 2 점: 마우스가 막대에서 오른쪽이나 왼쪽으로 방향을 틀려고 시도할 경우, 3 점: 마우스가 막대에서 오른쪽이나 왼쪽으로 방향을 트나 이후 걷지 못할 경우, 4점: 마우스가 막대에서 방향을 튼 이후 한 걸음 이상 이동하며 50% 이상의 발 미끄러짐을 보일 경우, 5점: 50% 미만의 발 미끄러짐을 보일 경우 4점에 대한 추가 1점, 6점: 발 미끄러짐이 보이지 않을 경우 5점에 대한 추가 1점. Balance beam test is performed 3 days and 7 days after 1 day before drug treatment. The mouse is placed in the middle of a wooden circular bar (5 mm diameter, 90 cm long, 50 cm high) and then scored according to the criteria below. (0 points: If the mouse does not stay on the bar for more than 30 seconds, 1 point: If the mouse stays on the bar for 30 seconds but cannot move, 2 points: The mouse attempts to turn right or left on the bar) 3 points: if the mouse turns right or left on the bar but cannot walk later, 4 points: if the mouse moves more than one step after turning the bar and shows more than 50% foot slip, 5 points: An additional 1 point for 4 points if less than 50% of the slip of the foot is seen; an additional 1 point for 5 if no slip of the foot is seen.

19. 인지 행동 평가- Novel object recognition test19. Novel object recognition test

Novel object recognition (NOR) task는 뇌손상 이후 8일차에 수행하였다. 마우스를 검은색 나무로 제작된 천장이 없는 박스 (45 x 45 cm, 25 cm 높이) 안에 넣은 후 두개의 물건 (old object)에 30 분간 노출을 시켰다. 4시간 이후 마우스를 old object가 들어 있는 박스에 5분간 넣은 후 1시간 뒤, new object와 old object가 들어 있는 박스에 넣어주었다. 이후 마우스가 new object와 old object에 머무는 시간을 5분 동안 측정하였다.Novel object recognition (NOR) tasks were performed on day 8 after brain injury. The mouse was placed in a black wooden ceilingless box (45 x 45 cm, 25 cm high) and exposed to two old objects for 30 minutes. After 4 hours, the mouse was placed in the box containing the old object for 5 minutes, and then 1 hour later, in the box containing the new object and the old object. Then, the mouse stayed in the new object and the old object was measured for 5 minutes.

[수학식][Equation]

Discrimination index = (time spent exploring the new object - time spent exploring the old object)/(total time spent exploring both objects)Discrimination index = (time spent exploring the new object-time spent exploring the old object) / (total time spent exploring both objects)

<실험예 1> 제어 피질 충격 (controlled cortical impact) 마우스 뇌손상 동물 모델의 peri-contusional 지역에서 LRRK2 발현 증가 확인Experimental Example 1 Controlled Cortical Impact Confirmed Increased Expression of LRRK2 in Peri-Contusional Region of Mouse Brain Injured Animal Model

뇌손상 마우스에서, LRRK2 발현 정도를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 1, 2, 3, 4 및 5에 나타내었다. In brain-injured mice, the following experiment was performed to evaluate the degree of LRRK2 expression, and the results are shown in FIGS. 1, 2, 3, 4, and 5.

뇌 손상에 대한 LRRK2 발현을 연구하기 위해 외상성 뇌 손상을 생성하는 가장 일반적인 방법인 마우스 제어 피질 충격 (CCI) 동물 모델을 적용하였다. CCI 후, 동측 외피의 손상 부위 주변 조직을 수집하였으며, LRRK2 mRNA 및 단백질의 수준을 RT-PCR 및 면역 블롯으로 분석하였다. To study LRRK2 expression for brain injury, a mouse controlled cortical shock (CCI) animal model was applied, the most common method of generating traumatic brain injury. After CCI, tissues around the injury site of the ipsilateral cortex were collected and the levels of LRRK2 mRNA and protein were analyzed by RT-PCR and immunoblot.

LRRK2 mRNA (도 1a)와 단백질 (도 1b)은 모두 CCI 후 2 시간과 6 시간에 피크를 보였다. LRRK2 mRNA의 수준은 24 시간 후에 점차 하향 조절되었지만(도 1a), CCI 후 72 시간까지는 LRRK2 단백질의 수준이 유지되었다(도 1b). 뇌에서 LRRK2 발현을 확인하기 위해 뇌 절편에 면역 염색을 시행하였으며, LRRK2에 대한 면역 활성은 외피 및 해마 영역의 외전근 주변에서 증가됨을 확인하였다 (도 1c 및 1d). Both LRRK2 mRNA (Figure 1A) and protein (Figure 1B) showed peaks at 2 and 6 hours after CCI. The level of LRRK2 mRNA was gradually down regulated after 24 hours (FIG. 1A), but the level of LRRK2 protein remained until 72 hours after CCI (FIG. 1B). In order to confirm the expression of LRRK2 in the brain, brain sections were subjected to immunostaining, and it was confirmed that the immune activity against LRRK2 was increased around the abduction muscle of the cortex and hippocampal region (FIGS. 1C and 1D).

또한, 손상 부위에서의 LRRK2 발현의 세포 특이성 분석을 위하여 신경세포, 성상교세포, 미세아교세포 특이적 표지자인 NeuN (도 1f, 도 2), Iba-1 (도 1g, 도 3), GFAP (도 1h, 도 4)에 대한 항체와 LRRK2 항체의 동시 염색을 수행하였으며, 그 결과, LRRK2 발현이 신경세포에서 주로 증가함을 확인하였다.In addition, neuron, astrocyte, microglia specific markers NeuN (FIG. 1F, 2), Iba-1 (FIG. 1G, 3), GFAP (FIG. 1h, simultaneous staining of the antibody and LRRK2 antibody for Figure 4), and as a result, it was confirmed that LRRK2 expression is mainly increased in neurons.

나아가, 비특이적 면역 활성의 가능성을 없애기 위해 다른 에피토프(도 5a)를 인식하는 추가 3 가지 LRRK2 항체를 사용하였으며(도 5b 및 도 5c), 추가 LRRK2 항체가 있는 면역 블롯 (도 5b)과 면역조직화합법 (도 5c)은 외상성 뇌손상 후 도 1b 및 도 1c의 결과와 비슷한 LRRK2 발현 패턴으로, 외상성 뇌손상 후, LRRK2의 발현이 증가되었음을 확인하였다.Furthermore, to eliminate the possibility of nonspecific immune activity, three additional LRRK2 antibodies were recognized that recognize different epitopes (FIG. 5A) (FIGS. 5B and 5C), immunoblot with additional LRRK2 antibodies (FIG. 5B) and immunohistochemistry. FIG. 5C shows an LRRK2 expression pattern similar to the results of FIGS. 1B and 1C after traumatic brain injury. After traumatic brain injury, the expression of LRRK2 was increased.

도 1은 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 LRRK2 발현 증가 분석결과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the results of the analysis of increased LRRK2 expression in the mouse brain after traumatic brain injury.

(a): 외상성 뇌손상 마우스 뇌 조직에서의 LRRK2 mRNA의 발현 수준을 분석하여 나타낸 것이다.(a): Traumatic Brain Injury The expression level of LRRK2 mRNA in mouse brain tissue was analyzed.

(b): 외상성 뇌손상 마우스 뇌 조직에서의 LRRK2 단백질의 발현 수준을 분석하여 나타낸 것이다.(B): Traumatic Brain Injury The expression level of LRRK2 protein in mouse brain tissue was analyzed.

(c): 외상성 뇌손상 이후의 LRRK2 발현을 조직면역화학법에 의해서 분석한 것이다.(c): LRRK2 expression following traumatic brain injury was analyzed by histological immunohistochemistry.

(d): 외상성 뇌손상 이후의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.(d): Quantification of the number of LRRK2 expressing cells following traumatic brain injury.

(e): 외상성 뇌손상 부위에서의 LRRK2 발현 세포 분석 위치 표시하여 나타낸 것이다.(e): LRRK2 expressing cell analysis position at traumatic brain injury site.

(f): 도 e의 표시된 영역에서의 LRRK2와 신경세포 표지자와 동시 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.(f): Simultaneous immunostaining with LRRK2 and neuronal markers in the indicated regions of FIG.

(g): 도 e의 표시된 영역에서의 LRRK2와 미세아교세포 표지자와 동시 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.(g): Simultaneous immunostaining with LRRK2 and microglial markers in the indicated regions of FIG.

(h): 도 e의 표시된 영역에서의 LRRK2와 성상교세포 표지자와 동시 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.(h): Simultaneous immunostaining with LRRK2 and astrocyte markers in the indicated regions of FIG.

도 2는 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 신경세포에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.Figure 2 shows the results of time-phase analysis of LRRK2 expression in neurons in the mouse brain after traumatic brain injury.

(a): 면역 현광 염색 수행결과를 나타낸 것이다.(a): The results of immunofluorescence staining are shown.

(b): 신경세포 표지자 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.(b): Quantify the number of LRRK2 expressing cells in neuronal marker expressing cells.

도 3은 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 미세아교세포에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.Figure 3 shows the results of time-phase analysis of LRRK2 expression in microglia in mouse brain after traumatic brain injury.

(b): 미세아교세포 표지자 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.(b): Quantification of the number of LRRK2 expressing cells in microglial marker expressing cells.

도 4는 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 성상교세포에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.Figure 4 shows the results of time-phase analysis of LRRK2 expression in astrocytes in the mouse brain after traumatic brain injury.

(b): 성상교세포 표지자 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.(b): Quantification of the number of LRRK2 expressing cells in astrocyte-expressing cells.

도 5는 추가 LRRK2 항체를 이용한 외상성 뇌손상 조직에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다.Figure 5 shows the results of LRRK2 expression analysis in traumatic brain injury tissue using additional LRRK2 antibody.

(a): 사용된 LRRK2 항체에 대한 에피토프 표시 그림이다.(a): Epitope label picture for LRRK2 antibody used.

(b): 추가 LRRK2 항체를 이용한 면역 블랏 수행 및 이의 정량화 결과이다.(b): Immunoblot performed with additional LRRK2 antibody and quantification thereof.

(c): 추가 LRRK2 항체를 이용한 조직면역화학법 수행 결과를 나타낸 것이다.(c): Tissue immunochemistry results using the additional LRRK2 antibody are shown.

실험예 1 및 도 1 내지 5에 나타난 결과를 통하여, 뇌손상에서, LRRK2 발현이 신경세포에서 주로 유도됨을 알 수 있으며, 이는, LRRK2가 뇌 병리학에서 기능적 역할을 함축하고 있음을 시사한다.Experimental Example 1 and the results shown in Figures 1 to 5, in brain injury, it can be seen that LRRK2 expression is mainly induced in neurons, which suggests that LRRK2 has a functional role in brain pathology.

<실험예 2> 뇌졸중 동물 모델에서의 LRRK2 발현 증가 확인Experimental Example 2 Confirmation of Increased LRRK2 Expression in Stroke Animal Models

뇌손상 마우스에서, LRRK2 발현 정도를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 6 및 7에 나타내었다. In the brain injury mice, the following experiment was performed to evaluate the degree of LRRK2 expression, and the results are shown in FIGS. 6 and 7.

뇌졸중에서 LRRK2 발현 변화를 분석하기 위하여 랫트 국소뇌허혈 동물 모델(MCAo))과 저산소 처리 일차 피질신경세포 모델을 동시에 사용을 하였다. 국소뇌허혈 손상 부위 뇌조직에서 LRRK2의 발현의 증가를 보였으며 저산소 환경에서 발현되는 HIF-1a 발현 증가도 확인하였다(도 6a). 또한, 저산소 환경(1% O₂)에서 일차 피질신경세포에서의 LRRK2 mRNA 및 단백질의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 6b 및 도 6c). Rat local cerebral ischemia animal model (MCAo) and hypoxic primary cortical neuronal cell model were used simultaneously to analyze LRRK2 expression in stroke. The expression of LRRK2 was increased in the brain tissue of focal cerebral ischemia, and the expression of HIF-1a expressed in the hypoxic environment was also confirmed (FIG. 6A). In addition, it was confirmed that the expression of LRRK2 mRNA and protein in primary cortical neurons in hypoxic environment (1% O ₂ ) (Fig. 6b and 6c).

LRRK2 항체를 이용한 면역 형광 염색에서도 뇌졸중에서 LRRK2 발현이 증가됨을 확인하였다. 또한, 뇌졸중 동물 모델에서, 신경세포 표지자와 LRRK2의 동시 염색을 통해서 LRRK2 발현의 신경세포에 특이적으로 많이 발현하여, 신경 특이성이 있음을 확인하였다(도 7). In immunofluorescence staining using LRRK2 antibody, it was confirmed that LRRK2 expression was increased during stroke. In addition, in the animal model of stroke, the neuronal marker and LRRK2 were simultaneously stained to express abundantly specific neurons of LRRK2 expression, confirming that they had nerve specificity (FIG. 7).

도 6은 뇌졸중 동물 모델에서의 LRRK2 발현 분석 결과를 나타낸 것이다. Figure 6 shows the results of LRRK2 expression analysis in a stroke animal model.

(a): 마우스 뇌졸중 동물 모델에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.(a): Time-phase analysis of LRRK2 expression in mouse stroke animal models.

(b): 저산소증 처리 이후 신경세포에서의 LRRK2 mRNA 발현을 분석하여 나타낸 것이다.(B): LRRK2 mRNA expression in neurons after hypoxia treatment.

(c) 저산소증 처리 이후 신경세포에서의 LRRK2 단백질 발현을 분석하여 나타낸 것이다.(c) shows the analysis of LRRK2 protein expression in neurons after hypoxia treatment.

도 7은 뇌졸중 동물 모델에서의 신경세포에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 마우스 뇌졸중 유도 이후 손상 뇌조직 내 신경세포에서의 LRRK2 발현 분석을 면역 형광 염색법을 통하여 분석한 결과이다.Figure 7 shows the analysis results of LRRK2 expression in neurons in animal models of stroke. Specifically, analysis of LRRK2 expression in neurons in damaged brain tissue after induction of mouse stroke was analyzed by immunofluorescence staining.

실험예 2, 도 6 및 도 7에 나타난 결과를 통하여, 뇌졸중 또는 저산소증을 포함한 뇌병증 현상에서, LRRK2의 발현이 증가함을 확인하였으며, 이는, 뇌손상에 LRRK2가 연관되어 있음을 시사한다. 또한, 신경세포에 특이적으로 LRRK2가 많이 발현하는 바, LRRK2는 신경 특이성이 있음을 시사한다.Experimental Example 2, the results shown in Figures 6 and 7, it was confirmed that the expression of LRRK2 increased in encephalopathy including stroke or hypoxia, suggesting that LRRK2 is associated with brain damage. In addition, the expression of a large number of LRRK2 specifically in neurons, suggesting that LRRK2 has nerve specificity.

<실험예 3> 손상된 일차 피질신경세포에서 LRRK2 발현 증가 확인Experimental Example 3 Confirmation of Increased LRRK2 Expression in Injured Primary Cortical Neurons

외상성 뇌손상에서의 LRRK2 발현 정도를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 8 및 9에 나타내었다. In order to evaluate the expression level of LRRK2 in traumatic brain injury, the following experiment was performed, and the results are shown in FIGS. 8 and 9.

외상성 뇌손상(Traumatic Brain Injury, TBI)은 축삭 손상, 흥분 독성, 산화 스트레스, 저산소 손상 및 신경 염증 등 여러 병리학 질환으로 알려져있다. TBI에서 LRRK2 발현에 대한 병리학 적 단서를 분석하기 위해 배양된 일차 피질 뉴런에 스크래치 손상, 글루카민산, 과산화수소 및 저산소증 등을 유도 후 LRRK2의 발현 여부를 분석하였다. Traumatic Brain Injury (TBI) is known for several pathological diseases, including axon damage, excitatory toxicity, oxidative stress, hypoxic damage, and neurological inflammation. To analyze the pathological cues for LRRK2 expression in TBI, the expression of LRRK2 was analyzed after inducing scratch damage, glucamine acid, hydrogen peroxide and hypoxia in cultured primary cortical neurons.

먼저, 축삭손상 후 LRRK2의 표현을 조사하기 위해 생체 내 외상성뇌손상 유발 병리학을 모방 한 신경세포에 스크래치 손상 동물 모델을 적용하였으며, LRRK2 mRNA(도 8a) 및 단백질(도 8b)은 일차 피질 신경세포의 스크래치 손상 후 유의하게 증가함을 확인하였다(도 8a 및 8b). First, a scratch-damaged animal model was applied to neurons mimicking traumatic brain injury-induced pathology in vivo to investigate expression of LRRK2 after axon injury, and LRRK2 mRNA (FIG. 8A) and protein (FIG. 8B) were primary cortical neurons. It was confirmed that significantly increased after scratch damage (Figs. 8a and 8b).

일차 피질신경세포 배양에서 스크래치 손상 후 LRRK2의 발현이 현저하게 증가된 것을 알 수 있으며, 이로부터 LRRK2 발현 증가 양상은 외상성 뇌손상을 받은 뇌 조직에서의 LRRK2의 발현 양상과 동일함을 확인할 수 있다. 또한, LRRK2와 NeuN 항체를 이용한 동시 면역 염색을 통하여 LRRK2 면역 활성이 특히, 신경세포에서 많이 증가함을 확인하였다 (도 8c). In primary cortical neuronal cell culture, it was found that the expression of LRRK2 was significantly increased after scratch injury. From this, it was confirmed that the expression of LRRK2 was the same as that of LRRK2 in traumatic brain tissue. In addition, the simultaneous immunostaining using LRRK2 and NeuN antibody was confirmed that the LRRK2 immune activity is increased, especially in neurons (Fig. 8c).

또한, 손상된 신경세포는 글루타민산 및 활성산소 등의 여러 가지 유해한 인자를 방출한다. 이에, 손상된 뉴런으로부터 방출 된 성분의 효과를 조사하기 위해, 글루타민산(도 9a 및 9b)과 과산화수소(도 9c 및 9d) 처리 이후 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 발현을 확인한 결과 스크래치 손상과 동일하게 LRRK2 발현이 증가함을 면역 블랏을 통하여 확인하였다(도 9a, 도 9b, 도 9c, 도 9d).Damaged neurons also release various harmful factors, such as glutamic acid and free radicals. Therefore, in order to investigate the effect of the components released from the damaged neurons, after confirming the expression of LRRK2 in primary cortical neurons after treatment with glutamic acid (FIGS. 9A and 9B) and hydrogen peroxide (FIGS. 9C and 9D), the expression of LRRK2 is identical to that of scratch damage. This increase was confirmed by immunoblot (FIGS. 9A, 9B, 9C, 9D).

나아가, 저산소 상태를 모방하기 위해, 일차 피질 신경세포에 저산도 유도 물질인 CoCl₂를 처리하였으며, 저산소 유도시에서도 일차 피질 신경세포에서 LRRK2의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 9e 및 도 9f). Furthermore, to mimic the hypoxic state, the primary cortical neurons were treated with CoCl ₂ , a hypoxic inducer, and it was confirmed that the expression of LRRK2 was increased in the primary cortical neurons even during hypoxic induction (FIGS. 9E and 9F).

도 8은 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 발현 분석 결과를 나타낸 것이다. 8 shows the results of LRRK2 expression analysis in a traumatic brain injury neuron model.

(a): 일차피질 신경세포에 스크래치 손상을 준 이후 LRRK2 mRNA의 발현을 분석하여 나타낸 것이다.(a): Analysis of the expression of LRRK2 mRNA after scratch damage to primary cortical neurons.

(b): 일차피질 신경세포에 스크래치 손상을 준 이후 LRRK2 단백질의 발현을 분석하여 나타낸 것이다.(b): Analysis of the expression of LRRK2 protein after scratch damage to primary cortical neurons.

(c): 면역 현광 염색법을 통한 신경세포에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다.(c): The results of LRRK2 expression analysis in neurons by immunofluorescence staining.

도 9는 다양한 신경 손상 동물 모델에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다.Figure 9 shows the results of LRRK2 expression analysis in various neurological damage animal models.

(a): 일차피질 신경세포에 글루타민산 처리 이후 LRRK2 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.(a): Analysis of LRRK2 protein expression and its quantification after glutamic acid treatment in primary cortical neurons.

(b): 글루타민산 처리 이후 신경세포 손상 분석 결과를 나타낸 것이다.(b): The results of nerve cell damage analysis after glutamic acid treatment.

(c): 일차피질 신경세포에 과산화수소 처리 이후 LRRK2 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.(c): Analysis of LRRK2 protein expression and its quantification after hydrogen peroxide treatment in primary cortical neurons.

(d): 과산화수소 처리 이후 신경세포 손상 분석 결과를 나타낸 것이다. (d): The results of neuronal cell damage analysis after hydrogen peroxide treatment.

(e): 일차피질 신경세포에 CoCl₂ 처리 이후 LRRK2 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.(e): Analysis of LRRK2 protein expression and its quantification after CoCl ₂ treatment in primary cortical neurons.

(f): CoCl₂ 처리 이후 신경세포 손상 분석 결과를 나타낸 것이다.(f): Neuronal damage analysis results are shown after CoCl ₂ treatment.

실험예 3, 도 8 및 도 9에 나타난 결과를 통하여, 다양한 신경 독성의 병리적 원인들이 LRRK2 발현을 유도 할 수 있음을 확인하였으며, 이는, LRRK2 수준의 상향 조절 즉, LRRK2 발현의 증가에 공통적인 분자 메커니즘이 존재함을 시사한다.Experimental Example 3, the results shown in Figures 8 and 9, it was confirmed that a variety of pathological causes of neurotoxicity can induce LRRK2 expression, which is common to the upregulation of LRRK2 level, that is, increase in LRRK2 expression It suggests that a molecular mechanism exists.

<실험예 4> LRRK2 발현의 HIF-1α 의존적 조절 확인Experimental Example 4 HIF-1α-dependent Regulation of LRRK2 Expression

외상성 뇌손상 동물 모델에서,LRRK2 발현의 분자 메커니즘을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 10 및 11에 나타내었다. In the traumatic brain injury animal model, the following experiment was performed to confirm the molecular mechanism of LRRK2 expression, and the results are shown in FIGS. 10 and 11.

외상성 뇌손상 동물 모델에서 LRRK2 발현의 분자 메커니즘을 확인하기 위해 외상성 뇌손상 병리와 관련된 전사 인자에 초점을 맞춰, 하기의 여러 증거를 바탕으로 hypoxia inducible factor-1 (HIF-1)를 타겟으로 하여 실험을 수행하였다.Focusing on transcription factors associated with traumatic brain injury pathology to identify molecular mechanisms of LRRK2 expression in traumatic brain injury animal models, experiments targeting hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) based on the following evidence Was performed.

i) LRRK2 발현은 중대 뇌동맥 폐색(MCAo) 래트 동물 모델에서 증가하였다. 외상성 뇌손상 및 국소 빈혈 / 뇌졸중은 뇌에서 출혈, 저산소증, 신경 염증 및 흥분 독성과 같은 일반적인 병리 현상을 공유하는 것으로 알려져있다. i) LRRK2 expression was increased in major cerebral artery occlusion (MCAo) rat animal models. Traumatic brain injury and ischemia / stroke are known to share common pathological phenomena such as bleeding, hypoxia, nerve inflammation, and excitatory toxicity in the brain.

ii) 저산소 유도제, 글루타민산 및 과산화수소는 배양된 일차 피질 뉴런에서 LRRK2 및 HIF-1α 발현을 증가시켰다(도 9). ii) hypoxic inducers, glutamic acid and hydrogen peroxide increased LRRK2 and HIF-1α expression in cultured primary cortical neurons (FIG. 9).

iii) 마우스 LRRK2의 프로모터 영역에서 저산소 반응 요소(HRE)의 특정 서열을 발견하였다(도 12). iii) A specific sequence of hypoxic response element (HRE) was found in the promoter region of mouse LRRK2 (FIG. 12).

먼저, HIF-1α가 제어피질충격 및 스크래치 손상 외상성 뇌손상 동물 모델에서 각각 유도되는지 여부를 조사하였다. 도 10a 및 도 10d에 도시 된 바와 같이, HIF-1α 발현은 외상성 뇌손상 동물 및 신경세포 모델 모두에서 증가됨을 확인하였다.First, we investigated whether HIF-1α was induced in control cortical shock and scratch injury traumatic brain injury animal models, respectively. As shown in Figure 10a and 10d, it was confirmed that HIF-1α expression is increased in both traumatic brain injury animal and neuronal model.

또한, 면역 염색법을 통하여 외상성 뇌손상 동물 모델에서 LRRK2와 HIF - 1α가 동일한 세포에서 발현함을 확인하였다(도 10b). HIF - 1α 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 도 10c에 나타내었다. 도 10b 및 10c에 나타난 바와 같이, HIF - 1α 발현 세포에서 LRRK2의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.In addition, it was confirmed by immunostaining that LRRK2 and HIF-1α are expressed in the same cell in a traumatic brain injury animal model (FIG. 10B). The number of LRRK2 expressing cells in HIF-1α expressing cells was quantified and shown in FIG. 10C. As shown in Figure 10b and 10c, it was confirmed that the expression of LRRK2 is significantly increased in HIF-1α expressing cells.

LRRK2 발현에서의 HIF-1α의 역할을 분석하기 위해, 일차 피질 신경세포에 pcDNA3-HA-HIF-1α 야생형 또는 우성 억제 돌연변이를 각각 발현 시킨 이후 LRRK2 발현 변화를 분석한 결과 각각의 야생형 또는 우성 억제 돌연변이 HIF - 1α(HIF - 1α DN)에 의해서 LRRK2 증감을 mRNA (도 11a) 및 단백질 (도 11b)수준에서 평가하였으며, 그 결과, 스크래치 손상 전후 모두에서 야생형 HIF - 1α (HIF - 1α WT)존재에서는 LRRK2 발현이 증가하며, 우성 억제 돌연변이 HIF - 1α 존재에서는 LRRK2 발현이 감소함을 확인하였다. To analyze the role of HIF-1α in LRRK2 expression, changes in LRRK2 expression following the expression of pcDNA3-HA-HIF-1α wild-type or dominant inhibitory mutations in primary cortical neurons, respectively. LRRK2 increase was assessed at the mRNA (FIG. 11a) and protein (FIG. 11b) levels by HIF-1α (HIF-1α DN), and as a result, in the presence of wild type HIF-1α (HIF-1α WT) both before and after scratch injury. It was confirmed that LRRK2 expression was increased and LRRK2 expression was decreased in the presence of dominant inhibitory mutation HIF-1α.

또한, 스크래치 손상 이후 증가된 LRRK2의 발현을 HIF - 1α 우성 억제 돌연변이 및 siRNA HIF - 1α가 mRNA (도 11c) 및 단백질 (도 11d) 수준에서 감소 시킴을 역시 확인하였다. It was also confirmed that increased expression of LRRK2 after scratch injury reduced HIF-1α dominant inhibitory mutations and siRNA HIF-1α at the mRNA (FIG. 11C) and protein (FIG. 11D) levels.

나아가, HIF - 1α 저해제인 2ME2를 처리하였을 경우, HIF - 1α 및 LRRK2 발현이 모두 감소를 확인하였다 (도 11e). Furthermore, when treated with 2ME2, a HIF-1α inhibitor, both HIF-1α and LRRK2 expression was confirmed to decrease (FIG. 11E).

도 10은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 HIF-1a 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.10 shows the results of HIF-1a expression analysis in a traumatic brain injury animal model.

(a): 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 HIF-1a 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다. (a): Analysis of HIF-1a protein expression and quantification thereof in mouse brain after traumatic brain injury.

(b): 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 LRRK와 HIF-1a의 발현을 면역 형광 염색법을 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다. (b): Expression of LRRK and HIF-1a in mouse brain after traumatic brain injury was analyzed by immunofluorescence staining.

(c): HIF-1a 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포 수의 정량화 결과를 나타낸 것이다. (c): Results of quantification of the number of LRRK2 expressing cells in HIF-1a expressing cells.

(d): 일차 피질 신경세포의 스크래치 손상 이후 HIF-1a 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.(d): HIF-1a expression analysis and quantification results after scratch damage of primary cortical neurons.

도 11은 HIF-1a 발현 조절 및 활성 조절에 따른 LRRK2 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다. Figure 11 shows the analysis results of LRRK2 expression changes according to HIF-1a expression regulation and activity regulation.

(a): 일차 피질 신경세포에서 HIF-1a 야생형 및 우성 억제형 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.(a): HIF-1a wild type and dominant inhibitory expression in primary cortical neurons and subsequent LRRK2 mRNA expression analysis in scratch injury.

(b): 일차 피질 신경세포에서 HIF-1a 야생형 및 우성 억제형 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.(B): HIF-1a wild type and dominant inhibitory expression in primary cortical neurons and subsequent LRRK2 protein expression analysis in scratch damage.

(c): 일차 피질 신경세포에서 siHIF-1a 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.(c): The results of siHIF-1a expression and subsequent LRRK2 mRNA expression analysis in primary cortical neurons.

(d): 일차 피질 신경세포에서 siHIF-1a 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.(D): The results of siHIF-1a expression and subsequent LRRK2 protein expression analysis in primary cortical neurons.

(e): 일차 피질 신경세포에 HIF-1a 발현 저해제인 2ME2 처리 및 스크래치 손상 이후 LRRK2 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다. (e): The results of analysis of changes in LRRK2 expression after treatment with 2ME2, an inhibitor of HIF-1a expression, and scratch damage in primary cortical neurons.

실험예 4, 도 10 및 도 11에 나타난 결과를 통하여, HIF-1α가 외상성 뇌손상으로 유도된 LRRK2의 발현을 조절한다는 것을 알 수 있다.Experimental Example 4, the results shown in Figure 10 and 11, it can be seen that HIF-1α regulates the expression of LRRK2 induced by traumatic brain injury.

<실험예 5> HIF-1α에 의한 LRRK2의 전사 조절 확인Experimental Example 5 Confirmation of Transcription Regulation of LRRK2 by HIF-1α

HIF-1α에 의한 LRRK2 전사 조절을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다. In order to evaluate the regulation of LRRK2 transcription by HIF-1α, the following experiment was performed, and the results are shown in FIG. 12.

HIF-1α에 의한 LRRK2 전사 조절을 분석하기 위해 LRRK2 전사 개시 부위에 대한 nt -2094와 -1 사이의 마우스 LRRK2 유전자의 프로모터 부위를 루시퍼라제 보고 플라스미드, pGL3- Basic에 서브 클로닝 하였다(도 12a). To analyze LRRK2 transcriptional regulation by HIF-1α, the promoter region of the mouse LRRK2 gene between nt-2094 and -1 for the LRRK2 transcription initiation site was subcloned into the luciferase report plasmid, pGL3-Basic (FIG. 12A).

루시퍼라제 플라스미드의 형질 감염 후 스크래치 손상을 일차 피질신경세포에 적용하였으며 루시퍼라제 활성 증가 관찰을 통하여 HIF - 1α에 의한 LRRK2 전사 조절을 확인하였다(도 12c). 도 12c에 나타난 바와 같이, HIF - 1α에 의해 LRRK2의 전사량이 증가함을 알 수 있다.Scratch damage after transfection of the luciferase plasmid was applied to primary cortical neurons and confirmed the regulation of LRRK2 transcription by HIF-1α through observation of increased luciferase activity (FIG. 12C). As shown in FIG. 12C, it can be seen that the amount of transcription of LRRK2 is increased by HIF-1α.

HIF - 1α에 의한 LRRK2 전사 조절의 특이성 분석을 위하여 일차 피질 신경세포에은 루시퍼라제 보고 플라스미드와 HIF - 1α 야생형 혹은 우성억제 발현 플라스미드를 발현시켰으며, 이후 스크래치 손상 이후 루시퍼라제 활성이 각각 증가 및 감소함을 확인하였다(도 12d). 도 12d의 결과를 통하여, 스크래치 손상 이후에도 야생형 또는 우성 돌연변이 HIF - 1α에 의해 LRRK2의 전사량이 증가함을 알 수 있다. Primary cortical neurons expressed luciferase report plasmids and HIF-1α wild-type or dominant inhibitory expression plasmids for specificity analysis of LRRK2 transcription regulation by HIF-1α, and then increased and decreased luciferase activity after scratch damage, respectively. It was confirmed (Fig. 12d). 12D, it can be seen that the amount of transcription of LRRK2 is increased by wild type or dominant mutant HIF-1α even after scratch damage.

또한, siRNA HIF - 1α에 의한 HIF - 1α 발현 감소를 통하여 HIF - 1α 발현이 감소할수록 LRRK2 발현도 감소함을 확인하였다(도 12e). In addition, it was confirmed that LRRK2 expression decreased as HIF-1α expression decreased through HIF-1α expression by siRNA HIF-1α (FIG. 12E).

나아가, 프로모터 영역은 -1766과 -1770 (HRE1), -1418과 -1422 (HRE2), -1355와 1359 (HRE3), -970과 -974 사이에 위치한 4 개의 추정 HIF - 1α 결합 사이트를 포함한다. LRRK2 프로모터에 HIF - 1α의 결합 사이트를 분석하기 위해, HRE1, 2, 3 및 4에 대한 사이트 지정 돌연변이를 생성하였으며, 각 HRE 돌연변이 루시퍼라제 플라스미드의 형질 감염 후 스크래치 손상을 가하고 루시퍼라제 활성을 측정하였다(도 12b). Furthermore, the promoter region includes four putative HIF-1α binding sites located between -1766 and -1770 (HRE1), -1418 and -1422 (HRE2), -1355 and 1359 (HRE3), and -970 and -974 . To analyze the binding sites of HIF-1α to the LRRK2 promoter, site-directed mutations were generated for HRE1, 2, 3 and 4, scratch damage after transfection of each HRE mutant luciferase plasmid and luciferase activity was measured. (FIG. 12B).

그 결과, HRE3 돌연변이는 극적인 감소를 나타내고 HRE4 돌연변이는 루시퍼 라제 활성의 적당한 감소를 나타내지 만 HRE1 및 HRE2 돌연변이는 나타나지 않으므로, HIF - 1α가 HRE3에 결합되어 있음을 알 수 있었다(도 12f). As a result, the HRE3 mutation showed a dramatic decrease and the HRE4 mutation showed a moderate decrease in luciferase activity, but the HRE1 and HRE2 mutations were not seen, indicating that HIF-1α is bound to HRE3 (FIG. 12F).

LRRK2 프로모터 내 세번째 HIF-1a 결합 영역 돌연변이에 대한 크로마틴 면역 침전법 수행 결과, HIF-1α가 HRE3에 직접 결합하고 있음을 알 수 있었다(도 12g). Chromatin immunoprecipitation for the third HIF-1a binding region mutation in the LRRK2 promoter showed that HIF-1α binds directly to HRE3 (FIG. 12G).

도 12는 HIF-1a 에 의한 LRRK2 전사 조절 분석 결과를 나타낸 것이다.12 shows the results of LRRK2 transcriptional regulation analysis by HIF-1a.

(a): LRRK2 프로모터 영역에서의 HIF-1a 결합 후보 영역 도식화이다.(a): HIF-1a binding candidate region schematic in the LRRK2 promoter region.

(b): HIF-1a 결합 후보 영역들에 대한 돌연변이 제작 모식도이다. (b): Schematic of mutagenesis for HIF-1a binding candidate regions.

(c): 일차 피질 신경세포에 스크래치 손상 이후 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.(c): Lucifer laser activity of the LRRK2 promoter region after scratch injury in primary cortical neurons is shown.

(d): 일차 피질 신경세포에 HIF-1a 야생형 및 우성 억제형 발현 이후 스크래치 손상에 의한 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.(d): The results of luciferase activity analysis of the LRRK2 promoter region due to scratch damage after HIF-1a wild type and dominant inhibitory expression in primary cortical neurons.

(e): 일차 피질 신경세포에 siRNA HIF-1a 발현 이후 스크래치 손상에 의한 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.(e): The results of luciferase activity analysis on the LRRK2 promoter region due to scratch damage after siRNA HIF-1a expression in primary cortical neurons.

(f): 일차 피질 신경세포에 LRRK2 프로모터 영역 내 HIF-1a 결합 영역 돌연변이 발현 이후 스크래치 손상에 의한 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다. (f): The results of luciferase activity analysis on the LRRK2 promoter region due to scratch damage after expression of the HIF-1a binding region mutation in the LRRK2 promoter region in primary cortical neurons.

(g): LRRK2 프로모터 내 세번째 HIF-1a 결합 영역 돌연변이에 대한 크로마틴 면역 침전법 수행 결과를 나타낸 것이다.(g): Results of chromatin immunoprecipitation for the third HIF-1a binding region mutation in the LRRK2 promoter.

실험예 5 및 도 12에 나타난 결과는, 스크래치 손상 후 증가되는 LRRK 2 발현과 관련하여, HIF-1α 의존적으로 LRRK 2 전사 조절이 가능함을 시사한다.The results shown in Experimental Example 5 and FIG. 12 suggest that HIF-1α-dependent LRRK 2 transcriptional regulation is possible with respect to LRRK 2 expression increased after scratch injury.

<실험예 6> 스크래치 손상 이후 LRRK2 발현 증가에 따른 신경 독성 유도 확인Experimental Example 6 Induction of Neurotoxicity According to Increased Expression of LRRK2 after Scratch Damage

스크래치 손상 후 LRRK2 발현 증가의 기능적 결과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 13-15에 나타내었다. In order to evaluate the functional results of the increased LRRK2 expression after scratch damage, the following experiment was performed, and the results are shown in FIGS. 13-15.

스크래치 손상 후 LRRK2 발현 증가의 기능적 결과를 조사하기 위해, 일차 피질 신경세포에서 스크래치 손상 후 LRRK2 shRNA 및 LRRK2 키나아제 활성저해재를 각각 활용하여 발현 및 활성을 저해 시킨 이후 신경독성을 확인하였다. 신경 독성은 alamar blue 분석, LHD 유출 분석, TUNEL 염색 및 세포 사멸 표지 단백질 발현 측정을 모니터링하여 수행하였다. To investigate the functional consequences of increased LRRK2 expression after scratch injury, neurotoxicity was confirmed after inhibition of expression and activity using LRRK2 shRNA and LRRK2 kinase inhibitors, respectively, after scratch injury in primary cortical neurons. Neurotoxicity was performed by monitoring alamar blue assay, LHD runoff assay, TUNEL staining and cell death marker protein expression measurement.

먼저, shRNA LRRK2 (pLL3.7-shRNA LRRK2) 형질 도입을 위한 렌티 바이러스를 생성시키고 일차 피질신경세포에 감염시켰다. shRNA LRRK2 형질 도입 후 LRRK2 발현의 효율적인 하향 조절을 확인하였다(도 13a).First, lentiviruses for transduction of shRNA LRRK2 (pLL3.7-shRNA LRRK2) were generated and infected with primary cortical neurons. Efficient downregulation of LRRK2 expression was confirmed after shRNA LRRK2 transduction (FIG. 13A).

또한, shRNA LRRK2는 스크래치 손상에 의해 유도된 신경 독성을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다(도 13b, 도 13c, 도 13d 및 도 13e). 특히, 도 13d를 살펴보면, shControl은 스크래치 손상 후, 신경세포가 현저하게 손상되나, shRNA LRRK2는 스크래치 손상후에도 신경세포가 유지되어, 신경 독성이 감소되었음을 육안으로 확인할 수 있다.In addition, shRNA LRRK2 was found to significantly reduce neurotoxicity induced by scratch damage (FIG. 13B, FIG. 13C, FIG. 13D and FIG. 13E). Particularly, referring to FIG. 13D, the neurons are markedly damaged after scratch damage in shControl, but shRNA LRRK2 is visually confirmed that neurons are maintained even after scratch damage, thereby reducing neurotoxicity.

나아가, 스크레치 손상에 의해서 증가된 세포 사멸 표지자, 절단된 caspase-3, 절단된 PARP 및 p53의 감소도 확인하였다, 즉, 신경세포의 사멸이 감소하는 것을 알 수 있었다(도 13f).Furthermore, the decrease of cell death markers, cleaved caspase-3, cleaved PARP and p53 increased by scratch damage was also confirmed, i.e., neuronal cell death was reduced (FIG. 13F).

또한, 스크래치 손상으로 유발된 신경 독성에 대한 LRRK2 키나아제 활성의 역할을 연구하기 위해 본 발명에 따른 실시예 10, 12, 20, 21 및 23의 총 5 종의 LRRK2 활성 저해제를 손상된 일차 피질 신경세포에 처리하였으며 본 발명에 따른 실시예 화합물이 신경 보호 효능을 나타냄을 확인하였다. 또한 세포 사멸 표지자 절단된 caspase-3, 절단된 PARP 및 p53의 감소 역시 확인하였다(도 14, 도 15). In addition, to study the role of LRRK2 kinase activity on neurotoxicity induced by scratch damage, a total of five LRRK2 activity inhibitors of Examples 10, 12, 20, 21 and 23 according to the present invention were applied to damaged primary cortical neurons. It was confirmed that the Example compound according to the present invention showed neuroprotective efficacy. In addition, reduction of the apoptosis markers cleaved caspase-3, cleaved PARP and p53 was also confirmed (FIG. 14, FIG. 15).

도 13은 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 발현 조절에 따른 신경독성 분석 결과를 나타낸 것이다. Figure 13 shows the results of neurotoxicity according to the regulation of LRRK2 expression in a traumatic brain injury neuron model.

(a): 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 shRNA 발현 이후 스크래치 손상에 따른 LRRK2 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다. (a): Analysis of LRRK2 expression according to scratch damage after LRRK2 shRNA expression in primary cortical neurons and quantification thereof are shown.

(b), (c), (d) 및 (e): 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 shRNA 발현 이후 스크래치 손상에 따른 Alama blue 실험 결과(b), LDH 유출 실험 결과(c), 및 TUNEL 실험(d, e)을 통한 신경손상 분석 결과를 나타낸 것이다.(b), (c), (d) and (e): Alama blue test results according to scratch damage after LRRK2 shRNA expression in primary cortical neurons (b), LDH efflux test results (c), and TUNEL experiments ( d, e) shows the results of nerve damage analysis.

(f): 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 shRNA 발현 이후 스크래치 손상에 따른 세포사멸 표지자 발현 분석 결과를 나타낸 것이다. (f): Analysis of apoptosis marker expression according to scratch damage after LRRK2 shRNA expression in primary cortical neurons.

도 14는 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 활성 조절에 따른 신경독성 분석 결과를 나타낸 것이다.Figure 14 shows the results of neurotoxicity according to the regulation of LRRK2 activity in a traumatic brain injury neuron model.

(a): 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제(실시예 12, 실시예 23) 처리에 따른 LRRK2 인산화 감소 분석 결과를 나타낸 것이다. (a): Results of LRRK2 phosphorylation reduction analysis according to treatment with LRRK2 activity inhibitors (Example 12, Example 23) after scratch damage in primary cortical neurons.

(b), (c), (d) 및 (e): 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제(실시예 12, 실시예 23) 처리에 따른 Alama blue 실험(b), LDH 유출 실험(c) 및 TUNEL 실험(d, e)을 통한 신경손상 분석 결과를 나타낸 것이다. (b), (c), (d) and (e): Alama blue experiment (b), LDH efflux experiment following treatment with LRRK2 activity inhibitor (Example 12, Example 23) after scratch damage in primary cortical neurons (c) and TUNEL experiments (d, e) show the results of nerve damage analysis.

(f): 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제(실시예 12, 실시예 23) 처리에 따른 세포사멸 표지자 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.(f): Results of apoptosis marker expression analysis following treatment with LRRK2 activity inhibitors (Example 12, Example 23) after scratch damage in primary cortical neurons.

도 15는 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 활성 조절에 따른 신경독성 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제 실시예 10(도 a), 실시예 21 및 20 (도 b) 처리에 따른 신경 독성 변화를 LDH 유출 실험을 통하여 분석하여 나타낸 것이다.15 shows the results of neurotoxicity according to the regulation of LRRK2 activity in the traumatic brain injury neuron model. Specifically, changes in neurotoxicity following treatment with LRRK2 activity inhibitors Example 10 (FIG. A), Examples 21, and 20 (FIG. B) after scratch damage in primary cortical neurons are analyzed through LDH efflux experiments.

실험예 6 및 도 13 내지 도 15에 나타난 결과는, 스크래치 손상 이후 증가된 LRRK2 발현이 신경 독성에 관여함을 시사하며, 본 발명의 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 손상된 신경세포를 보호하는 효과를 나타냄을 입증한다.Experimental Example 6 and the results shown in FIGS. 13 to 15 suggest that increased LRRK2 expression after scratch injury is involved in neurotoxicity, and is a traumatic agent containing the LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor of the present invention as an active ingredient. It is demonstrated that a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of brain injury or stroke has the effect of protecting damaged neurons.

<실험예 7> 저산소 손상 이후 LRRK2 발현 증가에 따른 신경 독성 유도 평가Experimental Example 7 Evaluation of Induction of Neurotoxicity after Increasing Expression of LRRK2 after Hypoxic Injury

저산소증 신경세포 모델에서 증가된 HIF-1a 및 LRRK2 발현 억제를 통한 신경독성 변화를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다. In order to evaluate the neurotoxic change through the suppression of increased HIF-1a and LRRK2 expression in the hypoxia neuronal model, the following experiment was performed, the results are shown in FIG.

저산소증 신경세포 모델에서 증가된 HIF-1a 및 LRRK2 발현 억제를 통한 신경독성 변화를 측정하였다. Neurotoxic changes through inhibition of HIF-1a and LRRK2 expression were measured in hypoxic neuronal models.

저산소 환경에 신경세포를 노출 시킨 이후 증가된 신경 손상이 HIF-1a shRNA를 통하여 HIF-1a 및 LRRK2의 발현을 감소시켰을 때 세포 생존율이 급상승하는 것을 확인하여, 신경 독성이 감소됨을 확인하였다. 또한, LRRK2 shRNA를 통하여 LRRK2의 발현을 감소시켰을 때 역시 세포 생존율이 급상승하여, 신경손상이 감소됨을 확인하였다(도 16a 및 16b). After exposing the neurons to the hypoxic environment, the increased neuronal damage decreased the expression of HIF-1a and LRRK2 through HIF-1a shRNA, confirming that cell viability increased rapidly. In addition, when the expression of LRRK2 was reduced through LRRK2 shRNA, the cell survival rate also increased rapidly, and it was confirmed that neuronal damage was reduced (FIGS. 16A and 16B).

도 16은 저산소증 환경에서의 LRRK2에 의한 신경 독성 분석 결과를 나타낸 것이다. Figure 16 shows the results of neurotoxicity analysis by LRRK2 in hypoxia environment.

(a): 일차 피질 신경세포에서의 저산소증 처리 이후 신경 독성 확인 및 HIF-1a shRNA 발현에 따른 신경 독성 변화 분석 결과를 나타낸 것이다. (a): Neurotoxicity was confirmed after hypoxia treatment in primary cortical neurons and neurotoxicity change analysis according to HIF-1a shRNA expression.

(b): 일차 피질 신경세포에서의 저산소증 처리 이후 신경 독성 확인 및 LRRK2 shRNA 발현에 따른 신경 독성 변화 분석 결과를 나타낸 것이다. (b): Neurotoxicity was confirmed after hypoxia treatment in primary cortical neurons and neurotoxicity change analysis according to LRRK2 shRNA expression.

실험예 7 및 도 16에 나타난 결과를 통하여, 저산소 환경에서 유도되는 신경손상에서, LRRK2 발현이 증가됨을 확인하였으며, 이는, 외상성 뇌손상과 동일하게, 저산소 환경에서 유도되는 신경 손상도 LRRK2 발현 증가와 연관되어 있음을 시사한다. 또한, LRRK2 발현을 감소시킴으로써, 세포 생존율을 급격하게 상승시킬 수 있는 바, LRRK2 발현 조절을 통해 신경 손상을 예방 또는 회복 시킬 수 있을 것임을 알 수 있다.Experimental Example 7 and the results shown in Figure 16, it was confirmed that the expression of LRRK2 is increased in the neuronal damage induced in the hypoxic environment, which is the same as the traumatic brain injury, the neuronal damage induced in the hypoxic environment and also increased the LRRK2 expression Suggests a connection. In addition, by reducing the expression of LRRK2, it is possible to drastically increase cell survival rate, it can be seen that it is possible to prevent or recover nerve damage through the regulation of LRRK2 expression.

<실험예 8> LRRK2 활성 저해제에 의한 제어피질 충격 유도 뇌손상 보호 효능 확인Experimental Example 8 Controlled Cortical Shock Induced Brain Injury Protective Effect by LRRK2 Inhibitor

본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 운동 및 인지 기능 향상을 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다. To analyze the improvement of motor and cognitive function in a traumatic brain injury animal model of a pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke containing an LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor according to the present invention as an active ingredient Experiments were performed as shown in FIG. 17.

LRRK2 활성의 저해제에 의한 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 운동 및 인지 기능 향상을 분석하기 위하여 균형 빔 및 새로운 대상물 인식 (NOR) 테스트를 수행하였다(도 17a). Balanced beam and new object recognition (NOR) tests were performed to analyze motor and cognitive improvement in traumatic brain injury animal models by inhibitors of LRRK2 activity (FIG. 17A).

대조군 및 뇌손상 마우스 실험군에 본 발명의 실시예 12의 처리 후 LRRK2 활성의 억제를 확인하기 위해, 각 실험군에서 뇌조직을 면역 블랏을 이용하여 LRRK2 활성을 pS935 LRRK2 항체를 사용하여 확인하였으며, 본 발명의 실시예 화합물을 처리하여 효과적으로 LRRK2 활성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 17b). In order to confirm the inhibition of LRRK2 activity after the treatment of Example 12 of the present invention in the control group and brain injury mouse experimental group, brain tissues in each experimental group were confirmed by using an immunoblot and LRRK2 activity using pS935 LRRK2 antibody. Example compounds of can be treated to effectively reduce the LRRK2 activity (Fig. 17b).

이후, 각각의 실험군에 대한 균형 빔 및 새로운 대상물 인식 (NOR) 테스트를 수행하였으며, 실시예 12 처리에 의해서 뇌손상에 의해서 유도된 운동 및 인지 기능의 감소가 개선됨을 확인하였다(도 17c, 도 17d 및 도 17e).Subsequently, a balance beam and a new object recognition (NOR) test were performed for each experimental group, and it was confirmed that the reduction of motor and cognitive function induced by brain injury was improved by the treatment of Example 12 (FIGS. 17C and 17D). And FIG. 17E).

도 17은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 뇌손상 보호 효능 분석 결과를 나타낸 것이다.17 shows the results of an analysis of brain injury protection effect according to inhibition of LRRK2 activity in a traumatic brain injury animal model.

(a): LRRK2 활성 저해제(실시예 12)처리 및 행동 실험 분석 실험 계획 모식도이다. (a): Treatment of LRRK2 activity inhibitor (Example 12) and behavioral experiments.

(b): 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 실시예 12 처리에 따른 LRRK2 인산화 변화 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다. (b): Analysis of LRRK2 phosphorylation changes according to the treatment of Example 12 in a traumatic brain injury animal model and results of quantification thereof are shown.

(c) 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 실시예 12 처리 이후 균형 빔 테스트 결과를 나타낸 것이다.(c) Balanced beam test results after Example 12 treatment in a traumatic brain injury animal model.

(d) 및 (e): 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 실시예 12 처리 이후 새로운 물건 인지 테스트 결과를 나타낸 것이다.(d) and (e): New object recognition test results are shown after Example 12 treatment in a traumatic brain injury animal model.

실험예 8 및 도 17에 나타난 결과를 통하여, 본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2)저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 LRRK2 활성을 효과적으로 억제할 수 있으며, 이에 따라, 외상성 뇌손상 후, 신경 행동 결과를 개선시킴을 알 수 있다.Experimental Example 8 and the results shown in Figure 17, the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke containing LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor according to the invention as an active ingredient effectively inhibits LRRK2 activity Thus, it can be seen that, after traumatic brain injury, it improves neurobehavioral outcomes.

<실험예 9> LRRK2 활성 저해제에 의한 제어피질충격 유도 뇌조직 결손 회복 효능 평가Experimental Example 9 Evaluation of Controlled Cortical Shock Induced Brain Tissue Deficiency Recovery by LRRK2 Inhibitors

본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 뇌조직 손상 회복 및 신경세포 보호 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 18 및 19에 나타내었다. In order to determine whether the brain tissue damage recovery and neuronal cell protection of the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke containing LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor according to the present invention as an active ingredient Was performed, and the results are shown in FIGS. 18 and 19.

본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제로서, 실시예 12 화합물을 사용하였으며, 실시예 12의 화합물을 처리한 후 뇌조직 손상 회복 및 신경세포 보호 여부를 확인하기 위하여, 병변 면적, 신경 세포 손실 및 세포 사멸 표지자 발현을 분석하였다. As a LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor according to the present invention, the compound of Example 12 was used, and after treatment with the compound of Example 12, in order to confirm the recovery of brain tissue damage and neuronal protection, lesion area, nerve Cell loss and cell death marker expression were analyzed.

손상 후 8 일째에, 뇌손상 부위에 대한 관찰 결과 실시예 12처리 실험군에서 유의미한 손상 감소를 확인하였다(도 18a). At 8 days after the injury, observation of the brain injury site confirmed a significant reduction in damage in the experimental group treated with Example 12 (FIG. 18A).

뇌절편의 크레실 바이로릿 (cresyl violet) 염색을 통하여 뇌 조직을 염색 한 후, 손상 부위에 대한 면적을 측정한 결과 실시예 12 화합물 처리 실험군에서 뇌손상이 감소하였음을 확인하였다(도 18b 및 18c). After staining the brain tissues through cresyl violet staining of the brain sections, the area of the damaged area was measured, and it was confirmed that the brain damage was reduced in the compound treated in Example 12 (FIG. 18b and 18c).

대뇌피질과 해마 부위에서의 신경세포 생존 여부를 측정하기 위하여 NeuN 항체를 통하여 면역 염색법을 수행하였으며 각 영역별 신경세포의 수를 측정한 결과 실시예 12 화합물 처리 실험군에서 신경세포가 대조군에 비하여 증가함을 확인하였다(도 18d 및 도 18e). In order to measure the survival of neurons in the cerebral cortex and hippocampus, immunostaining was performed using NeuN antibody and the number of neurons in each region was measured. Was confirmed (FIGS. 18D and 18E).

또한, TUNEL 염색을 통하여 손상 부위에서의 세포 사멸 측정하고, 세포사멸 표지자 발현을 확인한 결과 실시예 12 처리 실험군에서 세포 사멸 감소와 세포사멸 표지자 발현 감소를 확인하였다(도 19a, 도 19b 및 도 19c). In addition, apoptosis was measured at the site of injury through TUNEL staining, and apoptosis marker expression was confirmed. As a result, the cell death and apoptosis marker expression reduction was confirmed in the experimental group treated with Example 12 (FIGS. .

도 18은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 뇌결손 보호 효능 분석 결과이다. 18 is a result of analysis of brain defect protection efficacy according to the inhibition of LRRK2 activity in a traumatic brain injury animal model.

(a): 외상성 뇌손상 동물 모델에서 실시예 12 처리 이후 뇌 결손 변화 사진이다.(a): Picture of brain defect change after Example 12 treatment in a traumatic brain injury animal model.

(b): 크래실 바이올릿 염색을 통한 뇌 손상 부위 분석 이미지이다.(b): Analytical image of brain injury site by cracil violet staining.

(c): 도 (b)의 결과를 정량화한 것이다.(c): The result of FIG. (b) was quantified.

(d): 신경세포 표지자 (NeuN) 항체를 활용한 조직 면역 화학법 수행 결과를 나타낸 것이다.(d): Tissue immunochemistry using neuronal marker (NeuN) antibody is shown.

(e): 대뇌피질 및 해마 부위에서의 LRRK2 활성 억제제 처리 전후 신경세포 수를 정량화한 것이다.(e): Quantification of neuronal cell numbers before and after treatment with LRRK2 activity inhibitors in cerebral cortex and hippocampus.

도 19는 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 신경세포 사멸 변화 분석 결과를 나타낸 것이다. 19 shows the results of analysis of neuronal cell death according to inhibition of LRRK2 activity in a traumatic brain injury animal model.

(a): TUNEL 염색을 통한 외상성 뇌손상 마우스 뇌에서의 LRRK2 활성 억제제 (실시예12) 처리 이후 신경세포 독성 분석 결과를 나타낸 것이다.(a): Neuronal cytotoxicity analysis results after treatment with LRRK2 activity inhibitor (Example 12) in traumatic brain injury mouse brain via TUNEL staining.

(b): 도 (a)의 결과를 정량화한 것이다.(b): The result of FIG. (a) was quantified.

(c): 외상성 뇌손상 마우스 뇌에서의 LRRK2 활성 억제제 (실시예12) 처리 이후 세포사멸 표지자 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.(c): Changes in apoptosis marker expression after analysis of LRRK2 activity inhibitor (Example 12) in traumatic brain injury mouse brain.

실험예 9 및 도 18 내지 도 19에 나타난 결과는, 외상성 뇌손상에 의해 유도된 신경병증 현상이 LRRK2 활성에 의한 신경세포 손상과 연관됨을 시사하며, 본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 외상성 뇌손상에 의해 유도된 신경병증 현상을 개선시키고, 신경세포 손상을 회복시킴을 입증한다.Experimental Example 9 and the results shown in FIGS. 18 to 19 suggest that neuropathy induced by traumatic brain injury is associated with neuronal damage caused by LRRK2 activity, and according to the present invention, LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) The pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke containing an inhibitor as an active ingredient demonstrates that the neuropathy induced by traumatic brain injury is improved and the nerve cell damage is restored.

<실험예 10> LRRK2 활성 저해제에 의한 CCI 유도 뇌병리 현상 완화 확인Experimental Example 10 Reduction of CCI-induced Brain Pathology by LRRK2 Inhibitors

외상성 뇌손상은 뇌 속 다양한 병리적 현상을 유도한다. 대표적으로 신경염증, 뇌혈관 장벽 손상 및 뇌부종이 있다. Traumatic brain injury leads to various pathological phenomena in the brain. Representatives include neuroinflammation, cerebrovascular barrier damage and cerebral edema.

본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 상기와 같은 외상성 뇌손상으로 인한 뇌속 다양한 병리 현상을 완화 또는 개선시키는 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 20에 나타내었다. To alleviate or improve the various pathologies in the brain due to such traumatic brain injury of the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke containing LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor according to the present invention as an active ingredient In order to confirm the effect, the following experiment was performed, and the results are shown in FIG. 20.

본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제로는, 실시예 12 화합물을 사용하였으며, 상기 실시예 12 화합물에 의한 이상의 뇌병리 현상 개선 효능 분석을 수행하였다. As a LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor according to the present invention, the compound of Example 12 was used, and the effect of improving the abnormal brain pathological phenomenon by the compound of Example 12 was performed.

뇌염증의 경우 성상 교세포 및 미세아교세포의 활성을 각각의 표지자인 GFAP와 Iba-1으로 면역 염색을 수행하였으며, HG-11-31-01 실험군에서 각각 성상교세포 (도 20a 및 20b) 및 미세아교세포 (도 20c 및 20d)의 활성이 감소함을 확인하였다.In case of encephalitis, the activity of astrocytes and microglia was immunostained with their respective markers, GFAP and Iba-1, and astrocytes (Figs. 20a and 20b) and microglia in the HG-11-31-01 experimental group, respectively. It was confirmed that the activity of the cells (FIGS. 20C and 20D) decreased.

또한, 뇌염증 관련 사이토카인 변화 분석을 통하여 IL-1b, IL-6 및 TNF-a의 감소를 확인하였다(도 20e). In addition, the reduction of IL-1b, IL-6 and TNF-a was confirmed by analyzing cytokine changes related to encephalitis (FIG. 20E).

나아가, 뇌혈관 장벽 손상 및 뇌부종 개선 효과를 확인하기 위하여 각각의 표지자인 MMP-2/9및 AQP4에 대한 면역 블랏의 수행 결과 실시예 12에 의한 각각의 표지자 감소를 확인하였다(도 20f). Furthermore, in order to confirm the effect of improving the cerebrovascular barrier damage and cerebral edema, the results of performing the immunoblot on the respective markers MMP-2 / 9 and AQP4 were confirmed to decrease the respective markers according to Example 12 (FIG. 20F).

실험예 10 및 도 20에 나타난 결과는, 외상성 뇌손상에 의한 뇌병리 현상이 LRRK2 발현과 연관됨을 시사하며, 본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 외상성 뇌손상에 의해 발생된 뇌병리 현상을 치료, 완화 또는 개선시킬수 있음을 입증한다.The results shown in Experimental Example 10 and Figure 20, suggests that the encephalopathy caused by traumatic brain injury is associated with the expression of LRRK2. Or demonstrate that a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of stroke can treat, alleviate or ameliorate the brain pathology caused by traumatic brain injury.

따라서, 본 발명에 따른 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하며, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중에서 과발현하는 야생형 LRRK2의 발현을 억제하고, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중으로 인해 유도된 손상된 신경세포를 보호 또는 회복시키고, 외상성 뇌손상 후 발생된 신경 행동 결과 또는 신경병증 현상을 개선시키고, 외상성 뇌손상에 의해 발생된 뇌병리 현상을 치료, 완화 또는 개선시키는 효과가 우수하므로, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.Thus, the pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke contains an LRRK2 inhibitor as an active ingredient, inhibits the expression of wild-type LRRK2 overexpressing in traumatic brain injury or stroke, and traumatic brain injury or stroke. Protects or repairs damaged neurons induced, improves neurobehavioral or neuropathy symptoms after traumatic brain injury, and treats, alleviates or improves brain pathology caused by traumatic brain injury. Therefore, it can be usefully used for the treatment of traumatic brain injury or stroke.

<제제예 1> 산제의 제조Preparation Example 1 Preparation of Powder

본 발명에 따른 LRRK2 저해제 2gLRRK2 inhibitors according to the invention 2 g

유당 1gLactose 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.The above ingredients were mixed and filled in airtight cloth to prepare a powder.

<제제예 2> 정제의 제조Preparation Example 2 Preparation of Tablet

본 발명에 따른 LRRK2 저해제 100 ㎎LRRK2 inhibitors according to the invention 100 mg

옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg

유당 100 ㎎Lactose 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 ㎎Magnesium Stearate 2 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.After mixing the above components, tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.

<제제예 3> 캡슐제의 제조Preparation Example 3 Preparation of Capsule

옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg

유당 100 ㎎Lactose 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 ㎎Magnesium Stearate 2 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.After mixing the above components, the capsule was prepared by filling in gelatin capsules according to the conventional method for producing a capsule.

<제제예 4> 주사제의 제조Preparation Example 4 Preparation of Injection

만니톨 180 ㎎Mannitol 180 mg

Na₂HPO₄ㆍ2H₂O 26 ㎎Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ O 26 mg

증류수 2974 ㎎Distilled water 2974 mg

통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.According to a conventional method for preparing an injection, an injection was prepared by containing the above components in the contents shown.

<제제예 5> 건강식품의 제조Preparation Example 5 Preparation of Health Food

본 발명에 따른 LRRK2 저해제 500ngLRRK2 inhibitors according to the invention 500ng

비타민 혼합물 적량Vitamin mixtures Appropriate

비타민 A 아세테이트 70mg Vitamin A Acetate 70mg

비타민 E 1.0mgVitamin E 1.0mg

비타민 0.13mgvitamin 0.13mg

비타민 B2 0.15mgVitamin B2 0.15mg

비타민 B6 0.5mgVitamin B6 0.5mg

비타민 B12 0.2mgVitamin B12 0.2mg

비타민 C 10mgVitamin c 10mg

비오틴 10mgBiotin 10mg

니코틴산아미드 1.7mgNicotinic acid amide 1.7mg

엽산 50mgFolic acid 50 mg

판토텐산 칼슘 0.5mgCalcium Pantothenate 0.5mg

무기질 혼합물 적량Mineral mixture Appropriate

황산제1철 1.75mgFerrous sulfate 1.75mg

산화아연 0.82mgZinc oxide 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3mgMagnesium carbonate 25.3 mg

제1인산칼륨 15mgPotassium phosphate monobasic 15 mg

제2인산칼슘 55mgDicalcium Phosphate 55 mg

구연산칼륨 90mgPotassium citrate 90 mg

탄산칼슘 100mgCalcium carbonate 100mg

염화마그네슘 24.8mgMagnesium chloride 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.Although the composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixtures is mixed with a component suitable for a health food in a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional health food manufacturing method. The granules may be prepared and used for preparing a health food composition according to a conventional method.

<제제예 6> 건강음료의 제조Preparation Example 6 Preparation of Health Beverage

구연산 1000mgCitric acid 1000 mg

올리고당 100goligosaccharide 100 g

매실농축액 2gPlum concentrate 2 g

타우린 1gTaurine 1 g

정제수를 가하여 전체 900mlAdd purified water 900 ml

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.After mixing the above components in accordance with a conventional healthy beverage preparation method, and stirred and heated at 85 ℃ for about 1 hour, the resulting solution is filtered and obtained in a sterilized container, sealed sterilization and refrigerated and then stored in a healthy beverage composition Used for preparation.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.Although the composition ratio is a composition that is relatively suitable for a preferred beverage in a preferred embodiment, the composition ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, and usage.

Claims

LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke containing LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor as an active ingredient.

제1항에 있어서,
상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,
R¹은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노, 또는 디C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노이고;

R²는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이거나, R²는 R³ 및 이들이 결합된 탄소원자와 함께 연결되어 N을 하나 이상 포함하는 비치환, 치환 또는 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 원자의 헤테로아릴을 형성할 수 있고,
여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴은 독립적으로 -OH, =O, 할로겐 및 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고,
여기서, 상기 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬은 비치환된 C_6-10의 아릴이 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고;

R³는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노, 디C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬설포닐 C_6-10 아릴아미노, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬설포닐아미노 C_6-10 아릴아미노이거나, R²와 함께 연결되어 N을 하나 이상 포함하는 비치환, 치환 또는 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 원자의 헤테로아릴을 형성하고,
여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴은 독립적으로 -OH, =O, 할로겐 및 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고,
여기서, 상기 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬은 비치환된 C_6-10의 아릴이 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고;

Y는

또는

이고,
상기 R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬, N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬카보닐이고,
여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은 디C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노 또는 하나 이상의 N을 포함하며 하나 이상의 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이 치환된 6 원자의 헤테로사이클로알킬으로 치환될 수 있고,

상기 R⁷, R⁸ 및 R⁹는 독립적으로 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, 비치환 또는 하나 이상의 하이드록시가 치환된 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고,
여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은 -OH, =O, 할로겐 및 O를 하나 포함하는 4 내지 5 원자의 비치환된 헤테로사이클로알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다).
The method of claim 1,
The LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is a compound represented by Formula 1, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, the pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke:
[Formula 1]

(In Formula 1,
R ¹ is —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, C _1-10 straight or branched chain alkyl, C _1-10 straight or branched chain alkoxy, C _1-5 straight or branched chain alkylamino Or straight or branched chain alkylamino of diC _1-5 ;

R ² is —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, or C _1-10 unsubstituted or substituted at least one halogen, straight or branched chain alkyl, or R ² is R ³ and the carbon atom to which they are attached May be linked together to form an unsubstituted, substituted or fused 5 to 8 membered heterocycloalkyl comprising one or more N, or an unsubstituted or substituted 5 to 6 membered heteroaryl comprising one or more N; ,
Wherein the substituted heterocycloalkyl and heteroaryl may be independently substituted with one or more substituents selected from the group consisting of —OH, ═O, halogen and C _1-5 straight or branched chain alkyl,
Wherein said fused 5-8 membered heterocycloalkyl is a 5-8 membered heterocycloalkyl fused with an unsubstituted C _6-10 aryl;

R ³ is —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, C _1-10 straight or branched chain alkyl, C _1-10 straight or branched chain alkoxy, C _1-5 straight or branched chain alkylamino , di-C _1-5 straight or branched chain alkyl, straight or branched chain alkylsulfonyl C _6-10 arylamino, or a linear or branched alkyl sulfonylamino of C _1-5 of C _1-5 C _{6- 10} arylamino, unsubstituted, substituted or fused 5 to 8 membered heterocycloalkyl containing one or more N, linked together with R ² , or an unsubstituted or substituted 5 to 6 atom containing one or more N To form a heteroaryl,
Wherein the substituted heterocycloalkyl and heteroaryl may be independently substituted with one or more substituents selected from the group consisting of —OH, ═O, halogen and C _1-5 straight or branched chain alkyl,
Wherein said fused 5-8 membered heterocycloalkyl is a 5-8 membered heterocycloalkyl fused with an unsubstituted C _6-10 aryl;

Y is

or

ego,
R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are independently —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, C _1-10 straight or branched chain alkyl, C _1-10 straight or branched chain alkoxy, N and Unsubstituted or substituted 5 to 8 membered heterocycloalkyl containing one or more heteroatoms selected from the group consisting of O, unsubstituted or substituted containing 5 or more heteroatoms selected from the group consisting of N and O Heterocycloalkylcarbonyl having 8 to 8 atoms,
Wherein said substituted heterocycloalkyl is a 6-membered heterocycloalkyl comprising straight or branched chain alkylamino of diC _1-5 or one or more N and substituted with at least one C _1-5 straight or branched chain alkyl Can be substituted,

R ⁷ , R ⁸ and R ⁹ are independently —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, unsubstituted or substituted one or more hydroxy substituted C _1-10 straight or branched chain alkyl, or N and Unsubstituted or substituted 5 to 8 membered heterocycloalkyl comprising at least one hetero atom selected from the group consisting of O,
Wherein the substituted heterocycloalkyl may be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of 4-5 membered unsubstituted heterocycloalkyl comprising one —OH, ═O, halogen and O).

제2항에 있어서,
R¹은 -H, 또는 -NH(CH₃₎이고;
R²는 -H, 할로겐, 또는 -CF₃이거나, R³와 함께 연결되어

또는

를 형성하고;
R³는 -H, -NH(CH₃₎, -NH(CH₂CH₃₎,

, 또는

또는

를 형성하고;

Y는

또는

이고,
상기 R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 -H, 메톡시, 할로겐,

,

,

또는

이고,
상기 R⁷, R⁸ 및 R⁹는 독립적으로 -H, 메틸, 할로겐,

또는

인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 2,
R ¹ is -H, or -NH (CH ₃₎ ;
R ² is —H, halogen, or —CF ₃ , or is linked with R ³

or

To form;
R ³ is —H, —NH (CH ₃₎ , —NH (CH ₂ CH ₃₎ ,

, or

or

To form;

Y is

or

ego,
R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are independently -H, methoxy, halogen,

,

or

ego,
R ⁷ , R ⁸ and R ⁹ are independently -H, methyl, halogen,

or

A pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke, characterized in that.

제2항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
(1) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필설포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(2) N-(2-(2-(3-클로로-4-메톡시페닐아미노)-5-플루오로피리미딘-4-일아미노)페닐)메탄설폰아미드;
(6) (4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)(3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)메타논;
(8) N4-에틸-N2-(1-(3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-3-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민;
(10) 2-[(2-메톡시-4-[[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카보닐]페닐)아미노]-5,11-디메틸-5,11-디하이드로-6H-피리미도[4,5-b][1,4]벤조디아제핀-6-온;
(11) (4-(4-(에틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-2-플루오로-5-메톡시페닐)(모폴리노)메타논;
(12) (3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)(모폴리노)메타논;
(14) 1-(5-클로로-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-1H-피라졸-1-일)-2-메틸프로판-2-올; 및
(16) N2-(5-클로로-1-((3S,4R)-3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)-N4-메틸-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민.
The method of claim 2,
Compound represented by the formula (1) is any one selected from the group of the following pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke:
(1) 5-chloro-N4- (2- (isopropylsulfonyl) phenyl) -N2- (2-methoxy-4- (4- (4-methylpiperazin-1-yl) piperidine-1 -Yl) phenyl) pyrimidine-2,4-diamine;
(2) N- (2- (2- (3-chloro-4-methoxyphenylamino) -5-fluoropyrimidin-4-ylamino) phenyl) methanesulfonamide;
(6) (4- (dimethylamino) piperidin-1-yl) (3-methoxy-4- (4- (methylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-ylamino) Phenyl) methanone;
(8) N4-ethyl-N2- (1- (3-fluoro-1- (oxetan-3-yl) piperidin-4-yl) -3-methyl-1H-pyrazol-4-yl) -5- (trifluoromethyl) pyrimidine-2,4-diamine;
(10) 2-[(2-methoxy-4-[[4- (4-methylpiperazin-1-yl) piperidin-1-yl] carbonyl] phenyl) amino] -5,11-dimethyl -5,11-dihydro-6H-pyrimido [4,5-b] [1,4] benzodiazepin-6-one;
(11) (4- (4- (ethylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-ylamino) -2-fluoro-5-methoxyphenyl) (morpholino) methanone;
(12) (3-methoxy-4- (4- (methylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-ylamino) phenyl) (morpholino) methanone;
(14) 1- (5-chloro-4- (4- (methylamino) -5- (trifluoromethyl) pyrimidin-2-ylamino) -1H-pyrazol-1-yl) -2-methyl Propan-2-ol; And
(16) N2- (5-chloro-1-((3S, 4R) -3-fluoro-1- (oxetan-3-yl) piperidin-4-yl) -1H-pyrazole-4- Yl) -N4-methyl-5- (trifluoromethyl) pyrimidine-2,4-diamine.

제1항에 있어서,
상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 2]

(상기 화학식 2에서,
L¹ 및 L²는 독립적으로 -O-, -CH₂-, -NH-, 또는 -S-이고;
A¹은 비치환 또는 치환된 C_3-10의 사이클로알킬이고, 여기서, 상기 치환된 사이클로알킬은 -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 및 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
A²는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 원자의 헤테로아릴이고, 여기서, 상기 치환된 헤테로아릴은 -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 및 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
A³, A⁴ 및 A⁵는 독립적으로 -H, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이다).
The method of claim 1,
The LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is a compound represented by Formula 2, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, the pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke:
[Formula 2]

(In Formula 2,
L ¹ and L ² are independently —O—, —CH ₂ —, —NH—, or —S—;
A ¹ is unsubstituted or substituted C _3-10 cycloalkyl, wherein the substituted cycloalkyl is —OH, halogen, nitrile, nitro, C _1-5 straight or branched chain alkyl and C _{1- May} be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of ₅ straight or branched chain alkoxy;
A ² is an unsubstituted or substituted 5 to 6 membered heteroaryl comprising one or more heteroatoms selected from the group consisting of N, O and S, wherein the substituted heteroaryl is -OH, halogen, nitrile , Nitro, may be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of C _1-5 straight or branched alkyl and C _1-5 straight or branched alkoxy;
A ³ , A ⁴ and A ⁵ are independently —H, C _1-5 straight or branched alkyl or C _1-5 straight or branched alkoxy).

제5항에 있어서,
L¹ 및 L²는 독립적으로 -CH₂-, -NH-, 또는 -S-이고;
A¹은

또는

이고;
A²는

이고;
A³, A⁴ 및 A⁵는 독립적으로 -H 또는 메틸인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 5,
L ¹ and L ² are independently —CH ₂ —, —NH—, or —S—;
A ¹ is

or

ego;
A ² is

ego;
A ³ , A ⁴ and A ⁵ is independently -H or methyl pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke.

제5항에 있어서,
상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
(7) (S)-3-(사이클로프로필티오)-7-메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로티에노[3,4-c]피리딘-4(5H)-온; 및
(9) 3-(사이클로펜틸티오)-6,6-디메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로벤조[c]티오펜-4(5H)-온.
The method of claim 5,
Compound represented by the formula (2) is any one selected from the group of the following pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke:
(7) (S) -3- (cyclopropylthio) -7-methyl-1- (1H-pyrazol-3-yl) -6,7-dihydrothieno [3,4-c] pyridine-4 (5H) -one; And
(9) 3- (cyclopentylthio) -6,6-dimethyl-1- (1H-pyrazol-3-yl) -6,7-dihydrobenzo [c] thiophen-4 (5H) -one.

제1항에 있어서,
상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 3]

(상기 화학식 3에서,
L³은 부재, -NH-, 또는 -O-이고;
L⁴는 N, 또는 C이고;

E¹은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;

E²는 상기 L⁴가 N일 경우 부재이고, 상기 L⁴가 C일 경우

이고, 상기 E⁵는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이고;

E³은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 비치환 또는 치환된 C_6-10의 사이클로알킬, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고,
여기서, 상기 치환된 사이클로알킬 및 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 -OH, 할로겐, C_1-3의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C_1-3의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환될 수 있고;

E⁴는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬카보닐 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬; 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 원자의 헤테로아릴;이고,
여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴은 독립적으로 C_6-10의 아릴; 및 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 6 원자의 헤테로사이클로알킬;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환될 수 있고,
여기서, 상기 치환된 6 원자의 헤테로사이클로알킬은 -OH, 할로겐, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이 치환될 수 있다).
The method of claim 1,
The LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is a compound represented by the following formula (3), an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, the pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke:
[Formula 3]

(In Chemical Formula 3,
L ³ is absent, -NH-, or -O-;
L ⁴ is N, or C;

E ¹ is —H, —OH, halogen, nitrile, nitro, C _1-5 straight or branched chain alkyl, or C _1-5 straight or branched chain alkoxy;

E ² is absent when L ⁴ is N, and when L ⁴ is C

E ⁵ is C 1-5 straight or branched alkyl;

E ³ is -H, -OH, halogen, nitrile, nitro, C _1-5 straight or branched chain alkyl, C _1-5 straight or branched chain alkoxy, unsubstituted or substituted C _6-10 cyclo Alkyl or unsubstituted or substituted 5 to 8 membered heterocycloalkyl comprising at least one heteroatom selected from the group consisting of N and O,
Wherein the substituted cycloalkyl and heterocycloalkyl are independently one or more substituents selected from the group consisting of —OH, halogen, C _1-3 straight or branched alkyl, and C _1-3 straight or branched alkoxy. Can be substituted;

E ⁴ is unsubstituted or substituted 6 to 8 membered heterocycloalkylcarbonyl C _1-5 straight or branched chain alkyl comprising one or more N; Or unsubstituted or substituted 6 to 8 membered heteroaryl including one or more N;
Wherein the substituted heterocycloalkyl and heteroaryl are independently C _6-10 aryl; And an unsubstituted or substituted 6-membered heterocycloalkyl including one or more heteroatoms selected from the group consisting of N and O, and may be substituted with one or more selected from the group consisting of
Wherein the substituted 6-membered heterocycloalkyl may be substituted with —OH, halogen, or C _1-5 straight or branched chain alkyl substituted with unsubstituted or one or more halogens).

제8항에 있어서,
L³은 부재, -NH-, 또는 -O-이고;
L⁴는 N, 또는 C이고;
E¹은 -H, 또는 메틸이고;
E²는 상기 L⁴가 N일 경우 부재이고, 상기 L⁴가 C일 경우

이고;
E³은 -H,

, 또는

이고;
E⁴는

,

,

, 또는

인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 8,
L ³ is absent, -NH-, or -O-;
L ⁴ is N, or C;
E ¹ is -H, or methyl;
E ² is absent when L ⁴ is N, and when L ⁴ is C

ego;
E ³ is -H,

, or

ego;
E ⁴ is

,

, or

제8항에 있어서,
상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
(3) (R)-3-(4-(사이클로헥실아미노)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)-1-(3-페닐피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(5) 4-(4-(6-메틸-4-(테트라하이드로-2H-파이란-4-일옥시)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)피리딘-2-일)모르폴린;
(18) 3-(6-(4-(2-플루오로에틸)피페라진-1-일)피리미딘-4-일)-5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸; 및
(20) (2S,6R)-2,6-디메틸-4-(6-(5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸-3-일)피리미딘-4-일)모르폴린.
The method of claim 8,
Compound represented by the formula (3) is any one selected from the group of the following pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke:
(3) (R) -3- (4- (cyclohexylamino) -1H-pyrazole [4,3-c] pyridin-3-yl) -1- (3-phenylpiperidin-1-yl) Propane-1-one;
(5) 4- (4- (6-methyl-4- (tetrahydro-2H-pyran-4-yloxy) -1H-pyrazole [4,3-c] pyridin-3-yl) pyridine-2- (1) morpholine;
(18) 3- (6- (4- (2-fluoroethyl) piperazin-1-yl) pyrimidin-4-yl) -5- (1-methylcyclopropoxy) -1H-indazole; And
(20) (2S, 6R) -2,6-dimethyl-4- (6- (5- (1-methylcyclopropoxy) -1H-indazol-3-yl) pyrimidin-4-yl) morpholine .

제1항에 있어서,
상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 4]

(상기 화학식 4에서,
L⁵는 N, 또는 CH이고;

G¹은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로아릴아미노이고,
여기서, 상기 치환된 헤테로아릴은 -OH, 할로겐 및 C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환될 수 있고;

G²는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 비치환 또는 치환된 C_6-10의 아릴, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고,
여기서, 상기 치환된 아릴 및 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 및 N 및 O를 포함하는 6 원자의 비치환된 헤테로사이클로알킬 C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;

G³은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 비치환 또는 하나 이상의 나이트릴이 치환된 C_6-10의 아릴 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로아릴이고, 상기 치환된 헤테로아릴은 -OH, 할로겐, 나이트릴 및 C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다).
The method of claim 1,
The LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is a compound represented by the following formula (4), its optical isomers, or a pharmaceutically acceptable salt thereof pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke:
[Formula 4]

(In Formula 4,
L ⁵ is N, or CH;

G ¹ is unsubstituted or substituted containing one or more of -H, -OH, halogen, nitro, nitrile, C _1-5 straight or branched chain alkyl, C _1-5 straight or branched chain alkoxy, or N 5-8 membered heteroarylamino,
Wherein said substituted heteroaryl may be substituted with one or more selected from the group consisting of —OH, halogen and C _1-3 straight or branched alkyl;

G ² is —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, C _1-5 straight or branched chain alkyl, C _1-5 straight or branched chain alkoxy, unsubstituted or substituted C _6-10 aryl Or an unsubstituted or substituted 5 to 8 membered heterocycloalkyl comprising at least one heteroatom selected from the group consisting of N and O,
Wherein said substituted aryl and heterocycloalkyl are independently a 6-membered unsubstituted heterocyclo comprising C _1-5 straight or branched alkyl, C _1-5 straight or branched alkoxy, and N and O. May be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of straight or branched chain alkyl of alkyl C _1-3 ;

G ³ is —H, —OH, halogen, nitro, nitrile, C _1-5 straight or branched alkyl, C _1-5 straight or branched alkoxy, unsubstituted or substituted with one or more nitriles _{Unsubstituted} or substituted 5 to 8 membered heteroaryl containing one or more of _6-10 aryl or N, said substituted heteroaryl is -OH, halogen, nitrile and C _1-3 straight or branched chain alkyl; It may be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of).

제11항에 있어서,
G¹은 -H, 또는

이고;
G²는

또는

이고;
G³은 나이트릴,

또는

인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 11,
G ¹ is -H, or

ego;
G ² is

or

ego;
G ³ is nitrile,

or

제11항에 있어서,
상기 화학식 4로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
(19) 6-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-4-(3-메틸-4-(모폴리노메틸)페닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카보나이트릴;
(21) 3-(4-모르포리노-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일)벤조니트릴; 및
(22) 1-메틸-4-(4-모르폴리노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-1H-피롤-2-카보나이트릴.
The method of claim 11,
Compound represented by the formula (4) is any one selected from the group of the following pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke:
(19) 6- (1-methyl-1H-pyrazol-3-ylamino) -4- (3-methyl-4- (morpholinomethyl) phenyl) -1H-pyrrolo [2,3-b] Pyridine-3-carbonitrile;
(21) 3- (4-morpholino-1H-pyrrolo [2,3-b] pyridin-3-yl) benzonitrile; And
(22) 1-methyl-4- (4-morpholino-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-yl) -1H-pyrrole-2-carbonitrile.

제1항에 있어서,
상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 5로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 5]

(상기 화학식 5에서,
M¹은 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C_6-10의 아릴이고;
M²는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환된 6 내지 8 원자의 헤테로아릴이고; 및
M³는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 원자의 헤테로아릴이고,
여기서, 상기 치환된 헤테로아릴은 할로겐 및 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환된 6 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬으로 치환될 수 있다).
The method of claim 1,
The LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is a compound represented by Formula 5, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, the pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke:
[Formula 5]

(In Chemical Formula 5,
M ¹ is C _6-10 aryl unsubstituted or substituted with one or more halogens;
M ² is unsubstituted 6 to 8 membered heteroaryl including one or more heteroatoms selected from the group consisting of N, O and S; And
M ³ is an unsubstituted or substituted 6 to 8 membered heteroaryl containing one or more heteroatoms selected from the group consisting of N, O and S,
Wherein said substituted heteroaryl is a straight or branched chain alkyl of unsubstituted 6 to 8 membered heterocycloalkyl C _1-5 containing one or more heteroatoms selected from the group consisting of halogen and N, O and S May be substituted).

제14항에 있어서,
M¹은

또는

이고;
M²는

이고; 및
M³는

또는

인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 14,
M ¹ is

or

ego;
M ² is

ego; And
M ³ is

or

제14항에 있어서,
상기 화학식 5로 표시되는 화합물은 하기 화합물인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
(4) 2-(4-플루오로벤질옥시)-5-(1-(2-모폴리노에틸)-1H-피라졸-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드; 및
(23) 2-(벤질옥시)-5-(2-플루오로피리딘-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드.
The method of claim 14,
The compound represented by Formula 5 is a pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke, characterized in that the following compounds:
(4) 2- (4-fluorobenzyloxy) -5- (1- (2-morpholinoethyl) -1H-pyrazol-4-yl) -N- (pyridin-3-yl) benzamide; And
(23) 2- (benzyloxy) -5- (2-fluoropyridin-4-yl) -N- (pyridin-3-yl) benzamide.

제1항에 있어서,
상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 6]

(상기 화학식 6에서,
Q¹은 -H, 아미노, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;
Q²는 -H, 비치환된 C_6-10의 사이클로알킬이고;
Q³은 -H, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고; 및
Q⁴는 N을 하나 이상 포함하며, 하나의 메틸이 치환된 5 원자의 헤테로아릴이다).
The method of claim 1,
The LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is a compound represented by Formula 6, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, the pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke:
[Formula 6]

(In Chemical Formula 6,
Q ¹ is —H, amino, C _1-5 straight or branched chain alkyl, or C _1-5 straight or branched chain alkoxy;
Q ² is —H, unsubstituted C _6-10 cycloalkyl;
Q ³ is —H, C _1-5 straight or branched alkyl, or C _1-5 straight or branched alkoxy; And
Q ⁴ comprises one or more N and is a 5-membered heteroaryl substituted with one methyl).

제17항에 있어서,
상기 화학식 6으로 표시되는 화합물은 하기 화합물인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
(13) (R)-4-(1-사이클로프로필에틸아미노)-7-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)신놀린-3-카복스아미드.
The method of claim 17,
Compound represented by the formula (6) is a pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke, characterized in that the following compounds:
(13) (R) -4- (1-cyclopropylethylamino) -7- (1-methyl-1H-pyrazol-4-yl) cinnoline-3-carboxamide.

제1항에 있어서,
상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 7로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 7]

(상기 화학식 7에서,
T¹은 -H, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 비치환된 C_3-8의 사이클로알킬카보닐이다).
The method of claim 1,
The LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is a compound represented by the following Formula 7, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, the pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke:
[Formula 7]

(In Chemical Formula 7,
T ¹ is —H, C _1-5 straight or branched chain alkyl, or unsubstituted C _3-8 cycloalkylcarbonyl).

제19항에 있어서,
상기 화학식 7로 표시되는 화합물은 하기 화합물인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
(15) 사이클로프로필[10,11,14,15-테트라하이드로-1,16-에테노-4,8-(메테노)피라졸[3,4-j][1,4,7,9]옥사트리아자사이클로헥사데신-12(13H)-일]메타논.
The method of claim 19,
Compound represented by the formula 7 is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke, characterized in that the following compounds:
(15) cyclopropyl [10,11,14,15-tetrahydro-1,16-etheno-4,8- (metheno) pyrazole [3,4-j] [1,4,7,9] Oxatriazacyclohexadecine-12 (13H) -yl] methanone.

제1항에 있어서,
상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 8로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 8]

(상기 화학식 8에서,
Z¹은 -H, 아미노, C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;
Z²는 N을 하나 이상 포함하며, 하나의 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로아릴이고; 및
Z³는 -H, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이다).
The method of claim 1,
The LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor is a compound represented by Formula 8, an optical isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the pharmaceutical composition for preventing or treating traumatic brain injury or stroke is:
[Formula 8]

(In Formula 8,
Z ¹ is —H, amino, C _1-5 straight or branched chain alkyl, or C _1-5 straight or branched chain alkoxy;
Z ² comprises at least one N, and is a 5-8 membered heteroaryl substituted with one C _1-5 straight or branched alkyl; And
Z ³ is —H, or C _1-5 straight or branched alkyl, or C _1-5 straight or branched alkoxy).

제21항에 있어서,
상기 화학식 8로 표시되는 화합물은 하기 화합물인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
(17) (4-(6-아미노-5-(1-이소프로필-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)피리딘-3-일)-2-메톡시페닐)(모폴리노)메타논.
The method of claim 21,
Compound represented by the formula (8) is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of traumatic brain injury or stroke, characterized in that the following compounds:
(17) (4- (6-amino-5- (1-isopropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) pyridin-3-yl) -2-methoxyphenyl) (morphopoly No) metanon.

LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.

Health functional food composition for the prevention or improvement of traumatic brain injury or stroke containing LRRK2 (Leucine Rich Repeat Kinase 2) inhibitor as an active ingredient.