KR20190129926A - 암 면역요법의 신규 바이오마커 - Google Patents

암 면역요법의 신규 바이오마커 Download PDF

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세이지 마츠모토
류지 스즈키
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가꼬우호우징 효고 이카다이가쿠
레퍼토리 제네시스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명에 있어서, 암 면역요법을 개시하기 전에 유효 환자를 예측하는 기술을 제공한다. 본 발명은 피험체의 T세포 수용체(TCR) 다양성을 그 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성의 지표로서 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물로서, T세포의 TCR 다양성이 높은 피험체에서 암을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 TCR 다양성을 이용한 컴패니언 의약에도 관한 것이다.

Description

암 면역요법의 신규 바이오마커
본 발명은 암 면역요법의 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는 암 면역요법에 대한 피험체의 응답성 예측 및 예측에 기초한 암 면역요법을 이용한 치료에 관한 것이다. 다른 국면에서 본 발명은 대규모 고효율 레퍼토리 해석의 신규 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 대규모 고효율 레퍼토리 해석에 의해 얻어진 다양성 지수를 이용한 암 면역요법에 대한 피험체의 응답성 예측에 관한 것이다.
암에 대한 치료로서 암 면역요법이 주목받고 있다. 특히, 면역 체크포인트 저해제, 예를 들어 항PD-1 항체인 니볼루맙은 비소세포 폐암에 대해 종래 표준 치료였던 도세탁셀에 대해 전체 생존 기간에서 크게 웃도는 결과를 나타내어 표준 치료가 되고 있다.
그러나, 면역 체크포인트 저해제를 받은 환자에는 암의 진행이 정지되거나 또는 암이 관해되는 것과 같은 현저한 효과를 나타내는 환자가 존재하는 반면, 항PD-1 항체 임상시험에서는 3개월 이내에 병세가 더욱 악화되는 「무효군」이 인정된다. 그러나, 효율적으로 무효군을 판정할 수 있는 수법은 알려지지 않았다.
본 발명의 하나의 실시형태에서는 T세포의 T세포 수용체(TCR) 다양성을 암 면역요법에 대한 응답성의 지표로서 이용하는 방법이 제공된다. 일반적으로 암 면역요법은 생체 방어 기구를 이용하는 것이기 때문에 치료에 대한 응답에 개인차가 존재하는 바, 그 개인차를 치료 전에 판정할 수 있는 바이오마커(예를 들어 T세포에서의 특정의 표면 마커를 발현하는 세포의 비율, 종양에 발현하는 표면 단백질 등)가 탐색되었다. 그러나, 종양을 공격하고 있다고 생각되는 세포의 조성(예를 들어 CD8+PD-1+ 세포의 비율) 등은 암 면역요법에 대한 유효 환자와 비유효 환자의 사이에서 차가 없어(도 4) 바이오마커로서 사용할 수 없다. 본 발명자들은 놀랍게도 피험체의 T세포의 TCR 다양성이 피험체의 치료에 대한 응답 예측에 이용할 수 있음을 발견하였다. 예를 들어 폐암 환자에 대해 항PD-1 항체(Nivolumab)에 유효한 환자는 20~30%이다. 면역 체크포인트 저해제를 포함한 암 면역요법은 매우 고가의 것인 경우가 많아 항PD-1 항체 등에 의한 치료를 개시하기 전에 유효 환자를 예측할 수 있으면 보다 효과적인 치료를 실현하여 의료비의 낭비를 없애고 급등하는 사회보장비의 저감에 기여할 수 있다. 따라서, 본 발명은 암 면역요법에 대한 응답성을 예측하기 위한 신규 바이오마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 실시형태에서는 암 면역요법은 면역 체크포인트 저해제의 투여를 포함한다. 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제일 수 있다. PD-1 저해제는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙을 포함한 항PD-1 항체일 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태는 T세포의 T세포 수용체(TCR) 다양성을 면역 체크포인트 저해제에 대한 응답성의 지표로서 이용하는 방법을 제공한다.
TCR 다양성으로서는 복수의 지표가 이용되고 있고, 예를 들어 Shannon 지수, Simpson 지수, 역심슨 지수, 표준화 Shannon 지수, DE 지수(예를 들어 DE50 지수, DE30 지수, DE80 지수) 또는 Unique 지수(예를 들어 Unique30 지수, Unique50 지수, Unique80 지수) 등이다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, TCR 다양성은 DE 지수이다. 본 발명의 보다 바람직한 실시형태에 있어서, TCR 다양성은 DE50 지수이다.
본 발명의 하나의 실시형태에서는 TCR 다양성은 피험체의 T세포의 TCR 다양성이다. 하나의 실시형태에서는 T세포로서는 T세포 억제계 세포 표면 마커가 양성인 것이 사용될 수 있다. 혹은 다른 실시형태에서는 T세포로서는 T세포 자극계 세포 표면 마커가 양성인 것이 사용될 수 있다. T세포로서는 CD8, PD-1, CD28, CD154(CD40L), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), CD27, CD152(CTLA-4), CD366(TIM-3), CD223(LAG-3), CD272(BTLA), CD226(DNAM-1), TIGIT 및 CD367(GITR)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포 표면 마커가 양성인 T세포의 TCR 다양성을 이용한다. 하나의 실시형태에서는 T세포는 CD8+인 것이 바람직하다. 추가적인 실시형태에서는 T세포는 CD8+이며, 또한 T세포 억제계 세포 표면 마커가 양성이다. 추가적인 실시형태에서는 T세포는 CD8+이며, 또한 T세포 자극계 세포 표면 마커가 양성이다. 추가적인 실시형태에서는 T세포는 CD8+이며, 또한 T세포 억제계 세포 표면 마커 및 T세포 자극계 세포 표면 마커가 양성이다. 하나의 실시형태에서는 T세포는 CD8+이며, 또한 PD-1, CD28, CD154(CD40L), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), CD27, CD152(CTLA-4), CD366(TIM-3), CD223(LAG-3), CD272(BTLA), CD226(DNAM-1), TIGIT 및 CD367(GITR)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포 표면 마커가 양성이다. 하나의 실시형태에서는 T세포는 CD8+PD1+, CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 및 CD8+CTLA4+ T세포로 이루어지는 군에서 선택된다. 바람직하게는 T세포는 CD8+PD-1+ T세포일 수 있다. T세포는 말초혈 중의 T세포일 수 있다.
TCR 다양성은 TCRα의 다양성이거나 또는 TCRβ의 다양성으로 할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서는 이러한 TCR 다양성이 높은 것은 피험체가 유효 환자임을 나타낸다.
본 발명의 다른 실시형태는 TCR 다양성이 높은 피험체에 암 면역요법을 실시하는 것을 포함한다. 하나의 실시형태에서는 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물로서, T세포의 TCR 다양성이 높은 피험체에서 암을 치료하기 위한 조성물이 제공된다. 추가적인 실시형태에서는 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물로서, 말초혈 중의 CD8+PD-1+ T세포의 TCR 다양성이 높은 피험체에서 암을 치료하기 위한 조성물이 제공된다.
일부의 실시형태에서는 피험체의 TCR 다양성이 문턱값보다 높은 경우에 피험체가 암 면역요법의 유효 환자인 것이 나타난다. 다른 실시형태에서는 피험체의 TCR 다양성이 문턱값보다 낮은 경우에 피험체가 암 면역요법의 비유효 환자인 것이 나타난다. DE 지수를 이용하는 경우에는 리드수에 대해 표준화한 DE 지수를 이용하거나 리드수에 대해 조정한 문턱값과의 비교에 의해 피험체가 암 면역요법의 유효 환자임을 나타낼 수 있다. 하나의 실시형태에서는 피험체의 TCRα의 30000 리드로 표준화한 DE50 지수가 0.39% 이상인 경우 피험체가 유효 환자인 것이 나타난다. 다른 실시형태에서는 피험체의 TCRβ의 30000 리드로 표준화한 DE50 지수가 0.24% 이상인 경우 피험체가 유효 환자인 것이 나타난다. 임의의 리드수로 표준화한 DE50 지수와 그 리드수에 대응하는 문턱값의 비교에 의해 피험체가 유효 환자인 것 또는 피험체가 비유효 환자인 것을 나타낼 수 있다. 리드수와 문턱값의 조합의 예는 본 명세서에서 제공되어 있다.
일부의 실시형태에서는 ROC 해석에 기초하여 문턱값을 결정한다. 일부의 실시형태에서는 특이도에 기초하여 문턱값을 결정하고, 예를 들어 비응답의 최대값보다 높은 값을 문턱값으로 한다. 일부의 실시형태에서는 감도에 기초하여 문턱값을 결정하고, 예를 들어 응답자의 최저 라인보다 낮은 값을 문턱값으로 한다. 본 발명에 있어서, 이러한 문턱값을 결정하는 공정을 포함할 수도 있고, 또한 이와 같이 하여 결정된 문턱값을 이용할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시형태는 피험체로부터 T세포를 단리하는 공정과, T세포의 TCR 다양성을 측정하는 공정을 포함하는 방법이며, T세포는 CD8, PD-1, CD28, CD154(CD40L), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), CD27, CD152(CTLA-4), CD366(TIM-3), CD223(LAG-3), CD272(BTLA), CD226(DNAM-1), TIGIT 및 CD367(GITR)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포 표면 마커가 양성인 것을 단리할 수 있다. 하나의 실시형태에서는 T세포는 CD8+인 것이 바람직하다. 추가적인 실시형태에서는 T세포는 CD8+이며, 또한 T세포 억제계 세포 표면 마커가 양성이다. 하나의 실시형태에서는 T세포는 CD8+PD1+, CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 및 CD8+CTLA4+ T세포로 이루어지는 군에서 선택된다. 추가적인 실시형태에서는 T세포는 CD8+이며, 또한 T세포 자극계 세포 표면 마커가 양성이다. 특히 바람직하게는 피험체의 말초혈 샘플로부터 CD8+PD-1+ T세포를 단리하는 공정과, CD8+PD-1+ T세포의 TCR 다양성을 측정하는 공정을 포함하는 방법이다.
대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 이용하는 것은 저빈도(1/10,000~1/100,000 또는 그 이하)의 유전자를 동정(同定)할 수 있기 때문에 바람직한 경우가 있다. 본 발명의 하나의 실시형태는 TCR 다양성을 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 결정하는 공정을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시형태는 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석에 의해 결정한 TCR 다양성을 피험체의 의료적 상태, 특히 치료에 대한 응답성의 지표로서 이용하는 방법이다.
본 발명의 하나의 실시형태는 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하는 방법으로서, in vitro로 피험체의 T세포의 TCR 다양성을 측정하는 공정과, TCR 다양성이 높은 경우 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 좋다고 판정하는 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다. 혹은 TCR 다양성이 낮은 경우 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 나쁘다고 판정하는 것도 가능하다. T세포는 CD8+PD-1+일 수 있다. 나아가 T세포는 피험체의 말초혈 유래의 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하는 방법으로서, 피험체로부터 말초혈 샘플을 얻는 공정과, 피험체의 말초혈 중의 T세포의 TCR 다양성을 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 측정하는 공정과, TCR 다양성이 높은 경우 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 좋다고 판정하는 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다. 혹은 TCR 다양성이 낮은 경우 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 나쁘다고 판정하는 것도 가능하다. T세포는 CD8+PD-1+일 수 있다.
본 발명의 추가적인 실시형태에서는 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하여 피험체의 암을 치료하는 방법으로서, 피험체로부터 말초혈 샘플을 얻는 공정과, 피험체의 말초혈 중의 T세포의 TCR 다양성을 측정하는 공정과, TCR 다양성이 기준값보다 높은 경우 피험체에 암 면역요법을 실시하는 공정을 포함하는 방법이 제공된다. T세포는 CD8+PD-1+일 수 있다.
본 발명은 또한 대규모 고효율 레퍼토리 해석에 의해 얻어진 다양성 지수를 이용하여 암 면역요법에 대한 피험체의 응답성을 예측하는 기술을 제공한다.
예를 들어 본 발명은 이하의 항목을 제공한다.
(항목 1) 피험체의 T세포의 T세포 수용체(TCR) 다양성을 그 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성의 지표로서 이용하는 방법.
(항목 2) 상기 T세포가 CD8+이며, 또한 하나 이상의 T세포 억제계 세포 표면 마커가 양성인, 상기 항목에 기재된 방법.
(항목 3) 상기 T세포가 CD8+이며, 또한 하나 이상의 T세포 자극계 세포 표면 마커가 양성인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 4) 상기 T세포가 CD8+이며, 또한 PD-1, CD28, CD154(CD40L), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), CD27, CD152(CTLA-4), CD366(TIM-3), CD223(LAG-3), CD272(BTLA), CD226(DNAM-1), TIGIT 및 CD367(GITR)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포 표면 마커가 양성인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 5) 상기 T세포가 CD8+PD-1+ T세포인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 6) 상기 T세포가 상기 피험체의 말초혈 중의 T세포인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 7) 상기 암 면역요법이 면역 체크포인트 저해제의 투여를 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 8) 상기 면역 체크포인트 저해제가 PD-1 저해제인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 9) 상기 PD-1 저해제가 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 10) 상기 TCR 다양성이 Shannon 지수, Simpson 지수, 역Simpson 지수, 표준화 Shannon 지수, Unique50 지수, DE30 지수, DE80 지수 또는 DE50 지수로 나타나는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 11) 상기 TCR 다양성이 DE50 지수로 나타나는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 12) 상기 TCR이 TCRα인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 13) 이하의 표:
[표 1a]
Figure pct00001
에 기재되는 리드수 중 어느 하나로 표준화한 상기 피험체의 DE50 지수가 그 표에 기재되는 그 리드수에 대응하는 문턱값 이상인 경우 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나거나, 또는 상기 문턱값 미만인 경우 그 피험체가 비유효 환자인 것이 나타나는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 14) 상기 TCR이 TCRβ인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 15) 이하의 표:
[표 1b]
Figure pct00002
에 기재되는 리드수 중 어느 하나로 표준화한 상기 피험체의 DE50 지수가 그 표에 기재되는 그 리드수에 대응하는 문턱값 이상인 경우 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나거나, 또는 상기 문턱값 미만인 경우 그 피험체가 비유효 환자인 것이 나타나는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 16) 상기 피험체의 말초혈 샘플로부터 CD8+PD-1+ T세포를 단리하는 공정과,
이 CD8+PD-1+ T세포의 TCR 다양성을 결정하는 공정을 더 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 17) 상기 TCR 다양성이 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 결정되는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 18) 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물로서, T세포의 TCR 다양성이 높은 피험체에서 암을 치료하기 위한 조성물.
(항목 18A) 상기 항목 중 어느 하나 또는 복수에 기재되는 특징을 갖는, 상기 항목에 기재된 조성물.
(항목 19) 상기 T세포가 CD8+이며, 또한 하나 이상의 T세포 억제계 세포 표면 마커가 양성인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 20) 상기 T세포가 CD8+이며, 또한 하나 이상의 T세포 자극계 세포 표면 마커가 양성인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 21) 상기 T세포가 CD8+이며, 또한 PD-1, CD28, CD154(CD40L), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), CD27, CD152(CTLA-4), CD366(TIM-3), CD223(LAG-3), CD272(BTLA), CD226(DNAM-1), TIGIT 및 CD367(GITR)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포 표면 마커가 양성인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 22) 상기 T세포가 CD8+PD-1+ T세포인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 23) 상기 T세포가 상기 피험체의 말초혈 중의 T세포인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 24) 상기 면역 체크포인트 저해제가 PD-1 저해제인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 25) 상기 PD-1 저해제가 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 26) 상기 피험체의 T세포의 TCR 다양성이 Shannon 지수, Simpson 지수, 역Simpson 지수, 표준화 Shannon 지수, Unique50 지수, DE30 지수, DE80 지수 또는 DE50 지수로 나타나는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 27) 상기 피험체의 T세포의 TCR 다양성이 DE50 지수로 나타나는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 28) 상기 TCR이 TCRα인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 29) 이하의 표:
[표 1c]
Figure pct00003
에 기재되는 리드수 중 어느 하나로 표준화한 상기 피험체의 DE50 지수가 그 표에 기재되는 그 리드수에 대응하는 문턱값 이상인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 30) 상기 TCR이 TCRβ인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 31) 이하의 표:
[표 1d]
Figure pct00004
에 기재되는 리드수 중 어느 하나로 표준화한 상기 피험체의 DE50 지수가 그 표에 기재되는 그 리드수에 대응하는 문턱값 이상인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 32) 상기 피험체의 TCR 다양성이 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 결정되는, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(항목 33) 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하는 방법으로서,
in vitro로 그 피험체의 T세포의 TCR 다양성을 측정하는 공정과,
상기 TCR 다양성이 높은 경우 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 좋다고 판정하거나, 또는 상기 TCR 다양성이 낮은 경우 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 나쁘다고 판정하는 공정을 포함하는 방법.
(항목 33A) 상기 항목 중 어느 하나 또는 복수에 기재된 특징을 갖는, 상기 항목에 기재된 방법.
(항목 34) 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하는 방법으로서,
그 피험체로부터 말초혈 샘플을 얻는 공정과,
그 피험체의 말초혈 중의 T세포의 TCR 다양성을 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 측정하는 공정과,
상기 TCR 다양성이 높은 경우 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 좋다고 판정하거나, 또는 상기 TCR 다양성이 낮은 경우 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 나쁘다고 판정하는 공정을 포함하는 방법.
(항목 34A) 상기 항목 중 어느 하나 또는 복수에 기재된 특징을 갖는, 상기 항목에 기재된 방법.
(항목 35) 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하여 그 피험체의 암을 치료하는 방법으로서,
그 피험체로부터 말초혈 샘플을 얻는 공정과,
그 피험체의 말초혈 중의 T세포의 TCR 다양성을 측정하는 공정과,
상기 TCR 다양성이 기준값보다 높은 경우 그 피험체에 암 면역요법을 실시하는 공정을 포함하는 방법.
(항목 35A) 상기 항목 중 어느 하나 또는 복수에 기재된 특징을 갖는, 상기 항목에 기재된 방법.
(항목 36) 대규모 고효율 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 결정된 레퍼토리의 다양성을 피험체의 치료에 대한 응답성의 지표로서 이용하는 방법.
(항목 36A) 상기 항목 중 어느 하나 또는 복수에 기재된 특징을 갖는, 상기 항목에 기재된 방법.
(항목 37) 상기 치료는 면역 반응에 관련된 치료인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 38) 상기 레퍼토리 해석은 TCR 레퍼토리 해석인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법.
(항목 39) 상기 피험체의 TCR 다양성을 나타내는 다양성 지수가 문턱값 이상인 것은 그 피험체가 유효 환자인 것의 지표이거나, 또는 상기 다양성 지수가 문턱값 미만인 것은 그 피험체가 비유효 환자인 것의 지표인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 상기 문턱값이 ROC 해석에 기초하여 정해지거나 감도에 기초하여 정해지거나 또는 특이도에 기초하여 결정된 것인 방법.
(항목 40) 상기 피험체의 TCR 다양성을 나타내는 다양성 지수가 문턱값 이상인 것은 그 피험체가 유효 환자인 것의 지표이거나, 또는 상기 다양성 지수가 문턱값 미만인 것은 그 피험체가 비유효 환자인 것의 지표인, 상기 항목 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 상기 문턱값이 그 피험체의 다양성 지수의 산출에 이용된 리드수에 대해 표준화된 것인 방법.
본 발명에 있어서, 상기 하나 또는 복수의 특징은 명시된 조합에 더하여 추가로 조합하여 제공될 수 있는 것이 의도된다. 본 발명의 추가적인 실시형태 및 이점은 필요에 따라 이하의 상세한 설명을 읽고 이해하면 당업자에게 인식된다.
본 발명은 시료 채취가 용이한 말초혈 세포에서의 TCR 레퍼토리 해석을 행하여 얻어진 다양성 지표는 암 면역요법의 효과 예측을 위한 바이오마커로서 이용 가능하다. 이에 의해 컴패니언 치료나 개별 개량이 가능해지고, 사회보험료를 저감시킬 수 있으며, 개인에게 있어서는 적확한 치료를 받는 것이 가능해진다.
도 1은 항PD-1 항체에 의한 치료를 받는 환자의 치료 효과를 예측하기 위한 TCR 레퍼토리 해석의 예시적인 순서를 나타내는 도면이다.
도 2a는 항PD-1 항체에 의한 치료를 받은 환자#1 및 환자#2의 치료 개시 전 및 치료 개시 후의 CT 화상 진단에 의한 임상 평가를 나타내는 도면이다.
도 2b는 항PD-1 항체에 의한 치료를 받은 환자#3의 치료 개시 전 및 치료 개시 후의 CT 화상 진단에 의한 임상 평가와, 환자#4의 치료 개시 전 및 치료 개시 후의 FDG-PET 화상 진단에 의한 임상 평가를 나타내는 도면이다.
도 3은 환자#1에 대한 FACS 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 항PD-1 항체 유효 환자와 비유효 환자 사이의 PD1 양성 세포의 비교를 나타내는 도면이다. 항PD-1 항체 치료 유효 환자(Responder, n=6)와 비유효 환자(Non-Responder, n=6)의 치료 전의 CD8+ T세포 중의 PD1+ 세포의 비율(좌측)과 말초혈 세포의 림프구 분획에서 차지하는 CD8+PD1+ 세포의 비율(우측)을 나타내었다. CD8+ T세포 중에 차지하는 PD1+ 세포의 비율은 두 군에서 거의 차가 없었다.
도 5는 치료 전 PD-1 항체 유효 환자와 비유효 환자 사이의 TCRα의 다양성 지표의 비교를 나타내는 도면이다. 항PD-1 항체 치료 환자(n=12)의 치료 전에 환자 전혈로부터 말초혈 단핵구 세포를 단리하고, FACS 소터에 의해 CD8+PD-1+ 세포를 분획하였다. CD8+PD1+ 세포로부터 RNA를 추출하고 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 실시하여 그 다양성 지수를 산출하였다(TCRα). Shannon 지수(A), 표준화 Shannon 지수(B), Simpson 지수(C), 역Simpson 지수(D) 및 DE50 지수(E)의 다양성 지수를 이용하여 PD-1 항체 유효 환자(Responder, n=6)와 비유효 환자(Non-Responder, n=6) 사이에서 비교하였다. 모든 다양성 지수에서 PD-1 항체 치료 유효 환자가 비유효 환자에 비해 높은 다양성을 나타내었다.
도 6은 치료 전 PD-1 항체 유효 환자와 비유효 환자 사이의 TCRβ의 다양성 지표의 비교를 나타내는 도면이다. 항PD-1 항체 치료 환자의 치료 전의 CD8+PD1+ 세포로부터 RNA를 추출하고 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 실시하여 그 다양성 지수를 산출하였다(TCRβ). Shannon 지수(A), 표준화 Shannon 지수(B), Simpson 지수(C), 역Simpson 지수(D) 및 DE50 지수(E)의 다양성 지수를 이용하여 PD-1 항체 유효 환자(Responder, n=6)와 비유효 환자(Non-Responder, n=6) 사이에서 비교하였다. 그 결과, 모든 다양성 지수에서 PD-1 항체 치료 유효 환자가 비유효 환자에 비해 높은 다양성을 나타내었다.
도 7은 실시예 1에서 이용한, 각 환자의 TCRα 및 TCRβ의 다양성 지수 각각을 지표로서 이용한 경우에 문턱값을 다양하게 변화시켰을 때의 감도와 1-특이도를 플롯한 ROC 곡선이다. 위는 TCRα의 다양성 지수를 이용한 것이고, 아래는 TCRβ의 다양성 지수를 이용한 것이다.
도 8은 TCRα에 대한 각 다양성 지수(Shannon 지수, 표준화 Shannon 지수, Simpson 지수, 역Simpson 지수, DE30 지수, DE50 지수, DE80 지수, Unique30 지수, Unique50 지수 및 Unique80 지수)의 리드수에 따른 변화를 나타내는 도면이다. 실시예 1에서 얻어진 데이터로부터 여러 가지 리드수를 랜덤 리샘플링함으로써 각 리드수에 대응하는 다양성 지수를 산출하고, 100회의 랜덤 리샘플링의 중앙값을 각 피험자에 대해 플롯하였다. 각 도트는 본 명세서 실시예 1의 각 피험체를 나타낸다(n=12). 가로축은 리샘플 리드수(로그)이며, 세로축은 다양성 지수의 값이다. DE 지수에 대해서는 세로축도 로그축으로 나타내고 있다. 각 개체에 대해서는 각각의 지수에서 동일한 색을 사용하여 표시하였다.
도 9는 TCRβ에 대한 각 다양성 지수(Shannon 지수, 표준화 Shannon 지수, Simpson 지수, 역Simpson 지수, DE30 지수, DE50 지수, DE80 지수, Unique30 지수, Unique50 지수 및 Unique80 지수)의 리드수에 따른 변화를 나타내는 도면이다. 실시예 1에서 얻어진 데이터로부터 여러 가지 리드수를 랜덤 리샘플링함으로써 각 리드수에 대응하는 다양성 지수를 산출하고, 100회의 랜덤 리샘플링의 중앙값을 각 피험자에 대해 플롯하였다. 각 도트는 본 명세서 실시예 1의 각 피험체를 나타낸다(n=12). 가로축은 리샘플 리드수(로그)이며, 세로축은 다양성 지수의 값이다. DE 지수에 대해서는 세로축도 로그축으로 나타내고 있다. 각 개체에 대해서는 각각의 지수에서 동일한 색을 사용하여 표시하였다.
도 10a는 치료 전 PD-1 항체 유효 환자와 비유효 환자 사이의 TCRα의, 30000 리드로 표준화한 다양성 지표의 비교를 나타내는 도면이다. 항PD-1 항체 치료 환자(n=12)의 치료 전에 환자 전혈(全血)로부터 말초혈 단핵구 세포를 단리하고, FACS 소터에 의해 CD8+PD-1+ 세포를 분획하였다. CD8+PD1+ 세포로부터 RNA를 추출하고 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 실시하여 그 다양성 지수를 산출하였다(TCRα). Shannon 지수(A), 표준화 Shannon 지수(B), Simpson 지수(C), 역Simpson 지수(D), DE30 지수(E), DE50 지수(F), DE80 지수(G), Unique30 지수(H), Unique50 지수(I) 및 Unique80 지수(J)의 다양성 지수를 이용하여 PD-1 항체 유효 환자(Responder, n=6)와 비유효 환자(Non-Responder, n=6) 사이에서 비교하였다. 30000 리드로 표준화한 모든 다양성 지수에서 PD-1 항체 치료 유효 환자가 비유효 환자에 비해 높은 다양성을 나타내었다.
도 10b는 치료 전 PD-1 항체 유효 환자와 비유효 환자 사이의 TCRα의, 30000 리드로 표준화한 다양성 지표의 비교를 나타내는 도면이다. 항PD-1 항체 치료 환자(n=12)의 치료 전에 환자 전혈로부터 말초혈 단핵구 세포를 단리하고, FACS 소터에 의해 CD8+PD-1+ 세포를 분획하였다. CD8+PD1+ 세포로부터 RNA를 추출하고 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 실시하여 그 다양성 지수를 산출하였다(TCRα). Shannon 지수(A), 표준화 Shannon 지수(B), Simpson 지수(C), 역Simpson 지수(D), DE30 지수(E), DE50 지수(F), DE80 지수(G), Unique30 지수(H), Unique50 지수(I) 및 Unique80 지수(J)의 다양성 지수를 이용하여 PD-1 항체 유효 환자(Responder, n=6)와 비유효 환자(Non-Responder, n=6) 사이에서 비교하였다. 30000 리드로 표준화한 모든 다양성 지수에서 PD-1 항체 치료 유효 환자가 비유효 환자에 비해 높은 다양성을 나타내었다.
도 11a는 치료 전 PD-1 항체 유효 환자와 비유효 환자 사이의 TCRβ의, 30000 리드로 표준화한 다양성 지표의 비교를 나타내는 도면이다. 항PD-1 항체 치료 환자(n=12)의 치료 전에 환자 전혈로부터 말초혈 단핵구 세포를 단리하고, FACS 소터에 의해 CD8+PD-1+ 세포를 분획하였다. CD8+PD1+ 세포로부터 RNA를 추출하고 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 실시하여 그 다양성 지수를 산출하였다(TCRα). Shannon 지수(A), 표준화 Shannon 지수(B), Simpson 지수(C), 역Simpson 지수(D), DE30 지수(E), DE50 지수(F), DE80 지수(G), Unique30 지수(H), Unique50 지수(I) 및 Unique80 지수(J)의 다양성 지수를 이용하여 PD-1 항체 유효 환자(Responder, n=6)와 비유효 환자(Non-Responder, n=6) 사이에서 비교하였다. 30000 리드로 표준화한 모든 다양성 지수에서 PD-1 항체 치료 유효 환자가 비유효 환자에 비해 높은 다양성을 나타내었다.
도 11b는 치료 전 PD-1 항체 유효 환자와 비유효 환자 사이의 TCRβ의, 30000 리드로 표준화한 다양성 지표의 비교를 나타내는 도면이다. 항PD-1 항체 치료 환자(n=12)의 치료 전에 환자 전혈로부터 말초혈 단핵구 세포를 단리하고, FACS 소터에 의해 CD8+PD-1+ 세포를 분획하였다. CD8+PD-1+ 세포로부터 RNA를 추출하고 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 실시하여 그 다양성 지수를 산출하였다(TCRα). Shannon 지수(A), 표준화 Shannon 지수(B), Simpson 지수(C), 역Simpson 지수(D), DE30 지수(E), DE50 지수(F), DE80 지수(G), Unique30 지수(H), Unique50 지수(I) 및 Unique80 지수(J)의 다양성 지수를 이용하여 PD-1 항체 유효 환자(Responder, n=6)와 비유효 환자(Non-Responder, n=6) 사이에서 비교하였다. 30000 리드로 표준화한 모든 다양성 지수에서 PD-1 항체 치료 유효 환자가 비유효 환자에 비해 높은 다양성을 나타내었다.
도 12는 TCRα에 대한 각 다양성 지수(Shannon 지수, 표준화 Shannon 지수, Simpson 지수, 역Simpson 지수, DE30 지수, DE50 지수, DE80 지수, Unique30 지수, Unique50 지수 및 Unique80 지수)의 ROC 해석에 기초한 문턱값의 리드수에 따른 변화를 나타내는 도면이다. 가로축은 리샘플 리드수(로그축)를 나타내고, 세로축은 각 지수의 값을 나타낸다. DE 지수의 문턱값은 세로축도 로그축으로 나타난다. DE 지수의 문턱값은 양 로그축에서 리드수와 직선 관계를 갖는 것이 이해된다.
도 13은 TCRβ에 대한 각 다양성 지수(Shannon 지수, 표준화 Shannon 지수, Simpson 지수, 역Simpson 지수, DE30 지수, DE50 지수, DE80 지수, Unique30 지수, Unique50 지수 및 Unique80 지수)의 ROC 해석에 기초한 문턱값의 리드수에 따른 변화를 나타내는 도면이다. 가로축은 리샘플 리드수(로그축)를 나타내고, 세로축은 각 지수의 값을 나타낸다. DE 지수의 문턱값은 세로축도 로그축으로 나타난다. DE 지수의 문턱값은 양 로그축에서 리드수와 직선 관계를 갖는 것이 이해된다.
도 14는 TCRα 및 TCRβ의 DE50 지수의 문턱값의 리드수에 따른 변화의 양 로그축에서의 선형 회귀에 의한 추정값을 나타내는 도면이다.
도 15는 T세포 분획 사이의 리드수의 상관 해석을 나타내는 도면이다. X축은 CD8+PD-1+ 분획에서의 각 TCRβ 클론의 리드수, Y축은 각 세포 분획(CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+, CD8+CTLA4+)에서의 리드수를 나타내고 있다. 도트는 개개의 TCRβ 클론을 나타내고 있다. R은 Pearson의 상관계수를 나타내었다.
도 16은 치료 유효 환자의 PBMC로부터 FACS 소트에 의해 분리된 CD8+PD-1+, CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 및 CD8+CTLA4+ 분획에서의 TCRα쇄의 Shannon 지수, Normalized Shannon 지수, Inverse Simpson 지수, %DE50 지수를 산출한 값을 나타낸다(중앙). 치료 유효 환자(n=6, 좌측) 및 비유효 환자(n=6, 우측)의 CD8+PD-1+에서의 다양성 지수도 나타내었다. 치료 유효 환자의 CD8+PD-1+ 세포는 비유효 환자에 비해 유의하게 높고, 동시에 CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 및 CD8+CTLA4+ 분획은 CD8+PD-1+ 세포와 동일한 정도의 다양도를 나타내었다.
도 17은 치료 유효 환자의 PBMC로부터 FACS 소트에 의해 분리된 CD8+PD-1+, CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 및 CD8+CTLA4+ 분획에서의 TCRβ쇄의 Shannon 지수, Normalized Shannon 지수, Inverse Simpson 지수, %DE50 지수를 산출한 값을 나타낸다(중앙). 치료 유효 환자(n=6, 좌측) 및 비유효 환자(n=6, 우측)의 CD8+PD-1+에서의 다양성 지수도 나타내었다. 각 T세포 분획은 TCRα쇄와 같이 CD8+PD-1+ 세포와 동일한 정도의 다양도를 나타내었다.
이하, 본 발명을 가장 좋은 형태를 나타내면서 설명한다. 본 명세서의 전체에 걸쳐 단수형의 표현은 특별히 언급하지 않는 한 그 복수형의 개념도 포함하는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 단수형의 관사(예를 들어 영어의 경우는 「a」, 「an」, 「the」 등)는 특별히 언급하지 않는 한 그 복수형의 개념도 포함하는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 특별히 언급하지 않는 한 해당 분야에서 통상 이용되는 의미로 이용되는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 그 밖에 정의되지 않는 한 본 명세서 중에서 사용되는 모든 전문 용어 및 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 모순되는 경우 본 명세서(정의를 포함하여)가 우선된다.
이하에 본 명세서에서 특히 사용되는 용어의 정의 및/또는 기본적 기술 내용을 적절히 설명한다.
(암 면역요법)
본 명세서에서 「암 면역요법」이란 생물이 갖는 면역 기능을 이용하여 암을 치료하는 방법을 말한다. 암 면역요법에는 크게 나누어 암에 대한 면역 기능을 강화하는 것에 의한 암 면역요법과, 암의 면역 회피 기능을 저해하는 것에 의한 암 면역요법이 존재한다. 나아가 암 면역요법에는 체내에서의 면역 기능을 부활화(賦活化)하는 능동 면역요법과, 체외에서 면역 기능을 부활화시키거나 또는 증식시킨 면역 세포를 체내로 되돌리는 것에 의한 수동 면역요법이 있다.
본 발명에 기재되는 방법에 의해 이러한 암 면역요법의 치료 효과에 대한 응답성을 TCR 레퍼토리의 다양성을 지표로 하여 예측할 수 있음을 발견하였다.
암 면역요법의 예로서는 비특이적 면역 부활약, 사이토카인 요법, 암백신 요법, 수지상 세포 요법, 양자 면역 요법, 비특이적 림프구 요법, 암항원 특이적 T세포 요법, 항체 요법, 면역 체크포인트 저해 요법, CAR-T 요법 등을 들 수 있다.
면역 체크포인트 저해제를 이용한 면역 체크포인트 (저해) 요법은 최근에 큰 주목을 끌고 있다(Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2012 Mar 22; 12(4):252-64.). 암세포는 다양한 단백질을 표면에 발현시키는데, 이것이 T세포 등의 면역 세포에 의한 공격으로부터의 회피로 이어지기 때문에 통상적인 상태에서는 생체의 면역 기능만으로는 암조직을 배제할 수 없게 되어 있다고 생각된다. 면역 체크포인트 저해제는 이러한 암조직에서 면역 기능으로의 억제적 시그널의 전달을 담당하는 리간드-수용체 상호작용 등을 저해함으로써 생체의 면역 기능에 의한 효율적인 암의 배제를 가능하게 하는 것이다. 본 발명의 하나의 실시형태는 T세포(예를 들어 CD8+PD-1+ T세포)의 T세포 수용체(TCR) 다양성을 이하에 기재하는 바와 같은 면역 체크포인트 저해제에 대한 피험체의 응답성을 예측하기 위한 지표로서 이용하는 방법이다. 본 발명의 다른 실시형태는 T세포 수용체(TCR) 다양성에 기초하여 선택한 (응답성의) 피험체에 이하에 나타내는 바와 같은 면역 체크포인트 저해제를 투여하는 방법이다. 다른 실시형태에서는 T세포 수용체(TCR) 다양성에 기초하여 응답성이 아닌 것이 판명된 피험체에 대한 면역 체크포인트 저해제를 중단 또는 중지 혹은 회피하는 방법이 제공된다.
면역 체크포인트 저해제의 대표적인 예는 PD-1 저해제이다. PD-1 저해제로서는 항PD-1 항체인 니볼루맙(Nivolumab; 옵디보™로서 판매되고 있음) 및 펨브롤리주맙(Pembrolizumab; 키트루다™로서 판매되고 있음)을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 하나의 바람직한 실시형태에서는 니볼루맙이 대상으로서 선택될 수 있다. 이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, 니볼루맙을 이용한 요법이 바람직한 하나의 이유로서는 본 발명의 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석으로 산출된 다양성 지수를 이용하면 응답성의 피험자와 비응답성 피험자를 명확하게 식별할 수 있는 것이 실시예에서 나타나 있고, 특히 DE50 지수를 이용하는 특정의 문턱값에 의해 명확하게 응답성과 비응답성을 구별할 수 있는 것이 판명되어 있기 때문이다. 물론 다른 PD-1 저해제에 대해서도 동일한 정도로 다양성 지수를 이용할 수 있다고 생각된다.
항PD-1 항체는 PD-1 시그널에 의한 T세포 활성화의 억제를 해제함으로써 항암 효과를 나타내는 것으로 생각된다. PD-1(programmed death 1)과 PD-L1 혹은 PD-L2가 상호작용하면 PD-1의 세포질 도메인에 티로신탈인산화 효소의 일종인 SHP-2가 리크루트되고, T세포 수용체 시그널 전달 단백질인 ZAP70을 비활성화시킴으로써 T세포의 활성화가 억제된다고 생각된다(Okazaki, T., Chikuma, S., Iwai, Y. et al.: A rheostat for immune responses: the unique properties of PD-1 and their advantages for clinical application. Nat. Immunol., 14, 1212-1218(2013)). 그 밖에 PD-L1은 CD80과도 상호작용하여 T세포 활성화를 억제한다고도 생각된다(Butte, M. J., Keir, M. E., Phamduy, T. B. et al.: PD-L1 interacts specifically with B7-1 to inhibit T cell proliferation. Immunity, 27, 111-122(2007)).
PD-1은 암조직에 침윤되어 있는 킬러 T세포 및 내추럴킬러 세포에서 높게 발현되어 있고, 종양 상의 PD-L1에 의해 면역 응답이 감약되어 있다고 생각된다. 이 PD-1 시그널에 의한 면역 응답의 감약을 항PD-1 항체에 의해 저해하면 항종양 면역 응답의 증강 효과를 얻을 수 있다.
면역 체크포인트 저해제의 다른 예로서는 PD-L1 저해제(예를 들어 항PD-L1 항체인 아벨루맙, 더발루맙 또는 아테졸리주맙)를 들 수 있다.
PD-L1 저해제는 상기 PD-1 경로를 PD-L1의 측에 결합하여 저해하여 항종양 면역 응답을 발생시킨다.
면역 체크포인트 저해제의 다른 예로서는 CTLA-4 저해제(예를 들어 항CTLA-4 항체인 이필리무맙 또는 트레멜리무맙)를 들 수 있다.
CTLA-4 저해제는 PD-1 저해와는 다른 경로로 T세포를 활성화하여 항종양 면역 응답을 발생시킨다. T세포는 표면의 CD28이 CD80 또는 CD86과 상호작용함으로써 활성화된다. 그러나, 일단 활성화된 T세포이어도 표면에 발현한 CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4)가 CD80 또는 CD86과 CD20보다 높은 친화성으로 우선적으로 상호작용하고, 이에 따라 활성화가 억제된다고 생각된다. CTLA-4 저해제는 CTLA-4를 저해함으로써 CD20과 CD80 또는 CD86의 상호작용이 저해되는 것을 막음으로써 항종양 면역 응답을 발생시킨다.
추가적인 실시형태에서는 면역 체크포인트 저해제는 TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin containing protein-3), LAG-3(lymphocyte activation gene-3), B7-H3, B7-H4, B7-H5(VISTA) 또는 TIGIT(T cell immuno receptor with Ig and ITIM domain) 등의 면역 체크포인트 단백질을 표적으로 해도 된다.
상기와 같은 면역 체크포인트는 자기 조직에 대한 면역 응답을 억제하고 있다고 생각되는데, 바이러스 등의 항원이 생체 내에 장기간 존재하는 경우에도 T세포에 면역 체크포인트가 증가한다. 종양 조직에 대해서도 생체 내에 장기간 존재하는 항원으로 되어 있기 때문에 이들 면역 체크포인트에 의해 항종양 면역을 회피하고 있다고 생각되고, 상기와 같은 면역 체크포인트 저해제는 이러한 회피 기능을 무효화하여 항종양 효과를 나타낸다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 암을 갖는 피험체의, 암 면역요법에 대한 응답성 예측의 지표가 제공된다.
본 발명에서 대상이 되는 암으로서는 폐암, 비소세포 폐암, 신장(신세포)암, 전립선암, 위암, 정소암, 간(장)암, 피부암, 식도암, 흑색종, 췌장암, 췌암, 골종양·골육종, 대장암, 연부 종양, 담도암, 다발성 골수종, 악성 림프종(호지킨 림프종, 비호지킨 림프종), 방광암, 후두암, 자궁암(체부·경부), 두경부암, 난소암, 유방암 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 하나의 실시형태에서는 폐암을 갖는 피험체의 TCR 다양성을 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성의 지표로서 이용하는 방법이 제공된다.
(TCR 다양성)
면역 시스템에 의한 생체 방어 기구는 주로 T세포나 B세포에 의해 담당되는 특이적 면역에 크게 의존하고 있다. T세포나 B세포는 자기 세포나 분자에는 반응하지 않고 바이러스나 세균 등의 외래성의 병원체를 특이적으로 인식하여 공격할 수 있다. 그 때문에 T세포나 B세포는 세포 표면 상에 발현한 수용체 분자에 의해 자기 항원과 함께 다른 생물 유래의 다양한 항원을 인식하여 식별할 수 있는 기구를 가지고 있다. T세포에서는 T세포 수용체(T cell receptor, TCR)가 항원 수용체로서 작용한다. 이들 항원 수용체로부터의 자극에 의해 세포 내 시그널이 전달되어 염증성 사이토카인이나 케모카인 등의 생산이 항진되고 세포 증식이 증진되어 다양한 면역 응답이 개시된다.
TCR은 항원 제시 세포 상에 발현하는 주요 조직 적합 유전자 복합체(Major histocompatibility complex, MHC)의 펩티드 결합홈에 결합한 펩티드(peptide-MHC complex, pMHC)를 인식함으로써 자기와 비자기를 식별함과 아울러 항원 펩티드를 인식하고 있다(Cell 1994, 76, 287-299). TCR은 2개의 TCR 폴리펩티드쇄로 이루어지는 헤테로다이머 수용체 분자이며, 통상의 T세포가 발현하는 αβ형 TCR과 특수한 기능을 갖는 γδ형 TCR이 존재한다. α 및 β쇄 TCR 분자는 복수의 CD3 분자(CD3ζ쇄, CD3ε쇄, CD3γ쇄, CD3δ쇄)와 복합체를 형성하고 항원 인식 후의 세포 내 시그널을 전달하여 다양한 면역 응답을 개시시킨다. 바이러스 감염에 따라 세포 내에서 증식한 바이러스 항원이나 암세포 유래의 암항원 등의 내재성 항원은 MHC 클래스 I분자 상에 항원 펩티드로서 제시된다. 또한, 외래 미생물 유래의 항원은 엔도사이토시스에 의해 항원 제시 세포에 도입되어 프로세싱을 받은 후에 MHC 클래스 II분자 상에 제시된다. 이들 항원은 각각 CD8+ T세포 혹은 CD4+ T세포가 발현하는 TCR에 의해 인식된다. TCR 분자를 통한 자극에는 CD28, ICOS, OX40 분자 등의 공자극 분자가 중요한 것도 알려져 있다.
TCR 유전자는 게놈 상에서는 다른 영역에 코드된 다수의 V영역(variable region, V), J영역(joining region, J), D영역(diversity region, D)과 정상 영역의 C영역(constant region, C)으로 이루어진다. T세포의 분화 과정에서 이들 유전자 단편이 다양한 조합으로 유전자 재구성되어 α쇄 및 γ쇄 TCR은 V-J-C로 이루어지는 유전자를, β쇄 및 δ쇄 TCR은 V-D-J-C로 이루어지는 유전자를 발현한다. 이들 유전자 단편의 재구성에 의해 다양성이 창출됨과 아울러 V와 D 혹은 D와 J유전자 단편의 사이에 하나 이상의 염기의 삽입이나 결실이 일어남으로써 랜덤의 아미노산 서열이 형성되고, 보다 다양성이 높은 TCR 유전자 서열이 만들어지고 있다.
TCR 분자와 pMHC 복합체 표면이 직접 결합하는 영역(TCR 풋프린트)은 V영역 내의 다양성이 풍부한 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) CDR1, CDR2 및 CDR3 영역으로 구성된다. 그 중에서도 CDR3 영역은 V영역의 일부, 랜덤 서열에 의해 형성되는 V-D-J영역과 J영역의 일부를 포함하고, 가장 다양성이 풍부한 항원 인식 부위를 형성하고 있다. 한편, 다른 영역은 FR(framework region)이라고 불리며, TCR 분자의 골격이 되는 구조를 형성하는 역할을 하고 있다. 흉선에서의 T세포의 분화 성숙 과정에서 β쇄 TCR이 최초로 유전자 재구성되고 pTα분자와 회합하여 pre-TCR 복합체 분자를 형성한다. 그 후, α쇄 TCR이 재구성되어 αβTCR 분자가 형성됨과 아울러 기능적 αβTCR이 형성되지 않은 경우는 다른 한쪽의 α쇄 TCR 유전자 대립(allele)에서 재구성이 일어난다. 흉선에서의 정(正)·부(負)의 선택을 받아 적절한 친화성을 가진 TCR이 선택되고, 항원 특이성을 획득하는 것이 알려진다(Annual Review Immunology, 1993, 6, 309-326).
T세포는 특정의 항원에 대해 높은 특이성을 가진 1종류의 TCR을 생산한다. 생체에는 다수의 항원 특이적 T세포가 존재함으로써 다양한 TCR 레퍼토리가 형성되어, 다양한 병원체에 대한 방어 기구로서 유효하게 기능할 수 있다.
본 명세서에서 「TCR 다양성」이란 어떤 피험체의 T세포 수용체의 레퍼토리의 다양성을 말하고, 당업자는 해당 분야에서 공지의 다양한 수단을 이용하여 측정할 수 있다. TCR 다양성을 나타내는 지수를 「TCR 다양성 지수」라고 한다. TCR 다양성 지수로서는 해당 분야에서 공지의 임의의 것을 이용할 수 있고, 예를 들어 섀넌-위버 지수(Shannon-Weaver index), 심슨 지수(Simpson index), 역심슨 지수(Inverse Simpson index), 표준화 섀넌-위버 지수(Normalized Shannon-Weaver index), DE 지수(예를 들어 DE50 지수, DE30 지수, DE80 지수) 또는 Unique 지수(예를 들어 Unique50 지수, Unique30 지수, Unique80 지수) 등의 다양성 지수를 TCR에 적용하여 이용할 수 있다.
하나로는 시료 중의 T세포가 개개의 V쇄를 어느 정도 사용하는지를 특정의 Vβ쇄 특이적 항체를 이용하여 개개의 Vβ쇄를 발현하는 T세포의 비율을 플로 사이토메트리로 해석하는 방법(FACS 해석)이 있다.
그 밖에 인간 게놈 서열로부터 입수되는 TCR 유전자의 정보를 기초로 분자 생물학적 수법에 의한 TCR 레퍼토리 해석이 고안되어 왔다. 세포 시료로부터 RNA를 추출하고 상보적 DNA를 합성 후 TCR 유전자를 PCR 증폭하여 정량하는 방법이 있다.
세포 시료로부터의 핵산의 추출은 RNeasy Plus Universal Mini Kit(QIAGEN) 등의 해당 기술 분야에서 공지의 툴을 이용하여 행할 수 있다. TRIzol LS 시약에 용해된 세포로부터 RNeasy Plus Universal Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 전체 RNA의 추출 및 정제를 행할 수 있다.
추출된 RNA로부터의 상보적 DNA의 합성은 Superscript III™(Invitrogen) 등의 해당 기술 분야에서 공지의 임의의 역전사 효소를 이용하여 행할 수 있다.
TCR 유전자의 PCR 증폭은 해당 기술 분야에서 공지의 임의의 폴리메라아제를 이용하여 당업자가 적절히 행할 수 있다. 그러나, TCR 유전자와 같은 변동이 큰 유전자의 증폭에서는 「비바이어스」로 증폭할 수 있으면 정확한 측정을 위해서는 유리한 효과가 있다고 할 수 있다.
PCR 증폭을 위해 이용하는 프라이머로서는 개개의 TCR V쇄 특이적 프라이머를 다수 설계하여 별개로 실시간 PCR법 등으로 정량하는 방법 혹은 이들 특이적 프라이머를 동시에 증폭하는 방법(Multiple PCR)이 이용되어 왔다. 그러나, 각 V쇄에 대해 내재성 컨트롤을 이용하여 정량하는 경우에서도 이용하는 프라이머가 많으면 정확한 해석이 불가능하다. 나아가 Multiple PCR법에서는 프라이머 사이의 증폭 효율의 차가 PCR 증폭시의 바이어스를 일으키는 결점이 있다. 이 Multiple PCR법의 결점을 극복하기 위해 츠루타 등은 TCR 유전자의 이본쇄(이중가닥) 상보적 DNA의 5'말단에 어댑터를 부가한 후에 공통의 어댑터 프라이머와 C영역 특이적 프라이머에 의해 모든 γδTCR 유전자를 증폭하는 Adaptor-ligation PCR법을 보고하였다(Journal of Immunological Methods, 1994, 169, 17-23). 나아가 αβTCR 유전자의 증폭에도 응용하여 개개의 V쇄에 특이적인 올리고 프로브에 의해 정량하는 Reverse dot blot법(Journal of Immunological Methods, 1997, 201, 145-15.)이나 Microplate hybridization assay법(Human Immunology, 1997, 56, 57-69)이 개발되었다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서는 WO2015/075939(Repertoire Genesis Inc.)에 기재되어 있는 바와 같은, 1종의 포워드 프라이머와 1종의 리버스 프라이머로 이루어지는 1세트의 프라이머에서 모든 아이소타입이나 서브타입 유전자를 포함하는 TCR 유전자를 존재 빈도를 바꾸지 않고 증폭하여 TCR 다양성을 결정한다. 이하와 같은 프라이머 설계는 비바이어스적인 증폭에 유리하다.
TCR 혹은 BCR 유전자의 유전자 구조에 착안하여 고도의 다양성을 갖는 V영역에 프라이머를 설정하지 않고 그 5'말단에 어댑터 서열을 부가함으로써 모든 V영역을 포함하는 유전자를 증폭한다. 이 어댑터는 염기 서열 상에서 임의의 길이와 서열이며 20염기쌍 정도가 최적이지만, 10염기에서 100염기까지의 서열을 사용할 수 있다. 3'말단에 부가된 어댑터는 제한 효소에 의해 제거되고, 20염기쌍의 어댑터와 동일 서열의 어댑터 프라이머와 공통 서열인 C영역에 특이적인 리버스 프라이머에 의해 증폭함으로써 모든 TCR 유전자를 증폭한다.
TCR 혹은 BCR 유전자 메신저 RNA로부터 역전사 효소에 의해 상보쇄 DNA를 합성하고, 이어서 이본쇄 상보적 DNA를 합성한다. 역전사 반응이나 이본쇄 합성 반응에 따라 다른 길이의 V영역을 포함하는 이본쇄 상보적 DNA가 합성되고, 이들 유전자의 5'말단부에 20염기쌍과 10염기쌍으로 이루어지는 어댑터를 DNA 리가아제 반응에 의해 부가한다.
TCR의 α쇄, β쇄, γ쇄, δ쇄의 C영역에 리버스 프라이머를 설정하고, 이들의 유전자를 증폭할 수 있다. C영역에 설정되는 리버스 프라이머는 TCR의 각 Cβ, Cα, Cγ, Cδ의 서열에 일치하고, 또한 다른 C영역 서열에는 프라이밍하지 않는 정도의 미스매치를 갖는 프라이머를 설정한다. C영역의 리버스 프라이머는 어댑터 프라이머와의 증폭이 가능하도록 염기 서열, 염기 조성, DNA 융해 온도(Tm), 자기 상보 서열의 유무를 고려하여 최적으로 제작한다. C영역 서열에서의 대립유전자 서열 사이에서 다른 염기 서열을 제외한 영역에 프라이머를 설정함으로써 모든 대립유전자를 균일하게 증폭할 수 있다. 증폭 반응의 특이성을 높이기 위해 복수 단계의 nested PCR을 행한다.
어떤 프라이머든 대립유전자 서열 사이에서 다른 서열을 포함하지 않는 서열에 대해 프라이머 후보 서열의 길이(염기수)는 특별히 제한되지 않지만, 10~100염기수이고, 바람직하게는 15~50염기수이며, 보다 바람직하게는 20~30염기수이다.
이러한 비바이어스적인 증폭을 이용하는 것은 저빈도(1/10,000~1/100,000 또는 그 이하)의 유전자의 동정에 유리하여 바람직하다.
이상과 같이 증폭한 TCR 유전자를 시퀀싱함으로써 얻어진 리드 데이터로부터 TCR 다양성을 결정할 수 있다.
인간 시료로부터 TCR 유전자를 PCR 증폭하고 차세대 시퀀스 해석 기술을 이용함으로써 종래는 소규모이고 V쇄 사용 빈도 등 한정된 정보를 얻는 TCR 레퍼토리 해석으로부터 클론 레벨의 보다 상세한 유전자 정보를 입수하여 해석하는 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석이 실현 가능하게 되었다.
시퀀싱의 수법은 핵산 시료의 서열을 결정할 수 있는 한 한정되지 않고, 해당 기술 분야에서 공지의 임의의 것을 이용할 수 있지만, 차세대 시퀀싱(NGS)을 이용하는 것이 바람직하다. 차세대 시퀀싱으로서는 파이로시퀀싱, 합성에 의한 시퀀싱(시퀀싱 바이신세시스), 라이게이션에 의한 시퀀싱, 이온 반도체 시퀀싱 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
얻어진 리드 데이터를 V, D, J유전자를 포함하는 참조 서열에 매핑함으로써 유니크 리드수를 도출하여 TCR 다양성을 결정할 수 있다.
하나의 실시형태에서는 사용되는 참조 데이터베이스는 V, D, J유전자 영역마다 준비한다. 전형적으로는 IMGT에 의해 공개되어 있는 영역마다, 대립유전자마다의 핵산 서열 데이터 세트를 사용하지만, 이에 한정하지 않고, 각 서열에 고유의 ID가 할당되어 있는 데이터 세트이면 이용 가능하다.
얻어진 리드 데이터(트리밍 등의 적당한 처리를 필요에 따라 행한 것을 포함함)를 입력 서열 세트로 하여 유전자 영역마다의 참조 데이터베이스와 상동성 검색하여 가장 가까운 참조 대립유전자 및 그 서열과의 얼라인먼트를 기록한다. 여기서 상동성 검색에는 C를 제외하고 미스매치 허용성이 높은 알고리즘을 사용하게 된다. 예를 들어 상동성 검색 프로그램으로서 일반적인 BLAST를 사용하는 경우, 윈도우 크기의 단축, 미스매치 패널티의 저감, 갭 패널티의 저감 등의 설정을 영역마다 행하게 된다. 가장 가까운 참조 대립유전자의 선택에서는 상동성 스코어, 얼라인먼트 길이, 커널 길이(연속하여 일치하는 염기열의 길이), 일치 염기수를 지표로 하고, 이들을 정해진 우선순위에 따라 적용한다. 본 발명에서 사용되는 V 및 J가 확정한 입력 서열에 대해서는 참조 V 상의 CDR3 선두 및 참조 J 상의 CDR3 말미를 표지로 CDR3 서열을 추출한다. 이를 아미노산 서열로 번역함으로써 D영역의 분류에 사용한다. D영역의 참조 데이터베이스가 준비되어 있는 경우는 상동성 검색 결과와 아미노산 서열 번역 결과의 조합을 분류 결과로 한다.
상기에 의해 입력 세트 중의 각 서열에 대해 V, D, J의 각 대립유전자가 할당된다. 이어서, 입력 세트 전체에서 V, D, J의 각 출현 빈도 혹은 그 조합의 출현 빈도를 산출함으로써 TCR 레퍼토리를 도출한다. 분류에 요청되는 정확함에 따라 출현 빈도는 대립유전자 단위 혹은 유전자명 단위로 산출된다. 후자는 각 대립유전자를 유전자명으로 번역함으로써 가능해진다.
리드 데이터에 V영역, J영역, C영역이 할당된 후 일치하는 리드를 집계하고, 유니크 리드(그 밖에 동일한 서열을 갖지 않는 리드)별로 시료 중에 검출된 리드수 및 전체 리드수에 차지하는 비율(빈도)을 산출할 수 있다.
샘플수, 리드 종류, 리드수 등의 데이터를 사용하여 ESTIMATES 혹은 R(vegan) 등의 통계 해석 소프트웨어를 이용하여 다양성 지수 혹은 유사성 지수를 산출할 수 있다. 바람직한 실시형태에서는 TCR 레퍼토리 해석 소프트웨어(Repertoire Genesis Inc.)를 이용한다.
상기와 같이 하여 얻어진 각 유니크 리드의 리드수 데이터로부터 다양성 지수를 구할 수 있다. 예를 들어 섀넌-위버 지수(Shannon-Weaver index)(단지 Shannon 지수라고도 표기함), 심슨 지수(Simpson index), 표준화 섀넌-위버 지수(Normalized Shannon-Weaver index) 및 DE50 지수는 다음 수식에 따라 산출할 수 있다. N: 전체 리드수, ni: i번째 유니크 리드의 리드수, S: 유니크 리드수, S50: 전체 리드의 50%를 차지하는 상위 유니크 리드의 수
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Figure pct00008
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다른 다양성의 지표로서는 역심슨 지수(1/λ), 모리시타의 β지수, McIntosh의 균형도 지수, McNaughton의 우점도 지수, 모토무라의 1/α, Fisher의 다양도 지수, Sheldon의 eH ', Pielou의 균형도 지수, Preston의 1/σ2, 모리시타의 번영 지수 Nβ, Pielou의 H'N 등을 이용해도 된다. DE50 지수를 포함한 DE 지수는 비율 또는 퍼센트(%)에 의해 표기하는 것도 가능하고, 당업자는 표기되는 수치의 의미를 명확하고 적절히 이해하여 문턱값을 환산하여 본 발명을 실시하는 것이 가능하다. DE 지수는 전체 리드의 임의의 비율(1~99%)을 차지하는 상위 유니크 리드의 수/유니크 리드수로서 산출할 수 있고, 본 발명에서의 다양성 지표로서 사용하는 것이 가능하다.
DE 지수로서는 DE50 지수 외에 S50(전체 리드의 50%를 차지하는 상위 유니크 리드의 수) 대신에 Sx(x=0~100의 임의의 수치)에 기초한 DEX 지수를 이용하는 것이 가능하다. 예를 들어 S30(전체 리드의 30%를 차지하는 상위 유니크 리드의 수) 및 S80(전체 리드의 80%를 차지하는 상위 유니크 리드의 수)을 이용한 DE30 지수 및 DE80 지수를 이용하는 것도 가능하다. 또한, DE 지수는 리드수에 대해 표준화한 값(예를 들어 80000 리드, 30000 리드, 10000 리드 등에 대해 표준화)을 이용하는 것이 가능하다.
또한, DE 지수의 분자인 Sx를 직접 이용하는 UniqueX 지수도 이용할 수 있다. Unique 지수로서는 예를 들어 Unique30, Unique50 또는 Unique80 지수 등을 들 수 있다.
(대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석)
본 발명의 바람직한 실시형태에서는 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 이용하여 TCR 다양성을 측정한다. 본 명세서에서 「대규모 고효율 레퍼토리 해석」이란 WO2015/075939(이 문헌의 개시는 본 명세서에서 그 전체가 필요에 따라 참고로서 원용됨)에 기재되어 있고, 대상이 TCR인 경우 「대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석」이라고 부른다. 대규모 고효율 레퍼토리 해석에서는 데이터베이스를 이용하여 피험체의 레퍼토리(Repertoire)(T세포 리셉터(TCR) 또는 B세포 리셉터(BCR)의 가변 영역)를 정량적으로 해석하는 방법이며, 이 방법은 (1) 그 피험자로부터 비바이어스적으로 증폭한, T세포 리셉터(TCR) 또는 B세포 리셉터(BCR)의 핵산 서열을 포함하는 핵산 시료를 제공하는 공정; (2) 그 핵산 시료에 포함되는 상기 핵산 서열을 결정하는 공정; 및 (3) 결정된 상기 핵산 서열에 기초하여 각 유전자의 출현 빈도 또는 그 조합을 산출하고, 그 피험체의 레퍼토리를 도출하는 공정을 포함하고, 상기 (1)은 이하의 공정(1-1) 표적이 되는 세포에 유래하는 RNA 시료를 주형으로 하여 상보적 DNA를 합성하는 공정; (1-2) 그 상보적 DNA를 주형으로 하여 이본쇄 상보적 DNA를 합성하는 공정; (1-3) 그 이본쇄 상보적 DNA에 공통 어댑터 프라이머 서열을 부가하여 어댑터 부가 이본쇄 상보적 DNA를 합성하는 공정; (1-4) 그 어댑터 부가 이본쇄 상보적 DNA와 그 공통 어댑터 프라이머 서열로 이루어지는 공통 어댑터 프라이머와 제1 TCR 또는 BCR의 C영역 특이적 프라이머를 이용하여 제1 PCR 증폭 반응을 행하는 공정으로서, 그 제1 TCR 또는 BCR의 C영역 특이적 프라이머는 그 TCR 또는 BCR의 목적으로 하는 C영역에 충분히 특이적이고, 또한 다른 유전자 서열에 상동성이 없는 서열을 포함하며, 또한 증폭된 경우에 하류에 서브타입 사이에 불일치 염기를 포함하도록 설계되는 공정; (1-5) (1-4)의 PCR 증폭 산물과 그 공통 어댑터 프라이머와 제2 TCR 또는 BCR의 C영역 특이적 프라이머를 이용하여 제2 PCR 증폭 반응을 행하는 공정으로서, 그 제2 TCR 또는 BCR의 C영역 특이적 프라이머는 그 제1 TCR의 C영역 특이적 프라이머의 서열보다 하류의 서열에서 그 TCR 또는 BCR의 C영역에 완전 매치의 서열을 가지지만 다른 유전자 서열에 상동성이 없는 서열을 포함하고, 또한 증폭된 경우에 하류에 서브타입 사이에 불일치 염기를 포함하도록 설계되는 공정; 및 (1-6) (1-5)의 PCR 증폭 산물과 그 공통 어댑터 프라이머의 핵산 서열에 제1 추가 어댑터 핵산 서열을 포함하는 부가 공통 어댑터 프라이머와 제2 추가 어댑터 핵산 서열 및 분자 동정(MID Tag) 서열을 제3 TCR 또는 BCR의 C영역 특이적 서열에 부가한 어댑터 부착된 제3 TCR의 C영역 특이적 프라이머를 이용하여 제3 PCR 증폭 반응을 행하는 공정으로서, 그 제3 TCR의 C영역 특이적 프라이머는 그 제2 TCR 또는 BCR의 C영역 특이적 프라이머의 서열보다 하류의 서열에서 상기 TCR 또는 BCR의 C영역에 완전 매치의 서열을 가지지만 다른 유전자 서열에 상동성이 없는 서열을 포함하고, 또한 증폭된 경우에 하류에 서브타입 사이에 불일치 염기를 포함하도록 설계되며, 그 제1 추가 어댑터 핵산 서열은 DNA 포착 비즈에 대한 결합 및 emPCR 반응에 적절한 서열이고, 그 제2 추가 어댑터 핵산 서열은 emPCR 반응에 적절한 서열이며, 그 분자 동정(MID Tag) 서열은 증폭 산물이 동정할 수 있도록 유니크함을 부여하기 위한 서열인 공정을 포함한다. 이 방법의 구체적인 상세는 WO2015/075939에 기재되어 있고, 당업자는 이 문헌 및 본 명세서의 실시예 등을 적절히 참조하여 해석을 실시할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시형태에서는 T세포의 아집단의 TCR 다양성을 이용하는 방법이 제공된다. 하나의 실시형태에서는 T세포로서는 T세포 억제계 세포 표면 마커가 양성인 것이 사용될 수 있다. 혹은 다른 실시형태에서는 T세포로서는 T세포 자극계 세포 표면 마커가 양성인 것이 사용될 수 있다. 예를 들어 CD8, PD-1, CD28, CD154(CD40L), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), CD27, CD152(CTLA-4), CD366(TIM-3), CD223(LAG-3), CD272(BTLA), CD226(DNAM-1), TIGIT 및 CD367(GITR)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포 표면 마커가 양성인 T세포의 아집단의 TCR 다양성을 이용할 수 있다. 하나의 실시형태에서는 T세포는 CD8+PD1+, CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 및 CD8+CTLA4+ T세포로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 명세서에서 「T세포 자극계 세포 표면 마커」란 T세포를 활성화시키는 시그널을 전달하는 세포 표면 분자를 말한다. 「T세포 자극계 세포 표면 마커」의 예로서는 CD28, CD154(CD40L), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS) 또는 CD27 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 「T세포 억제계 세포 표면 마커」란 T세포를 억제하는 시그널을 전달하는 세포 표면 분자를 말한다. 「T세포 억제계 세포 표면 마커」의 예로서는 PD-1, CD152(CTLA-4), CD366(TIM-3), CD223(LAG-3), CD272(BTLA), CD226(DNAM-1), TIGIT 또는 CD367(GITR) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
이론에 구속되는 것은 아니지만, 이러한 세포 표면 마커를 발현하고 있는 T세포 아집단의 TCR 다양성이 높은 것은 그 아집단 중에 암조직의 표면 항원을 인식하는 TCR을 갖는 것이 확실히 존재하기 때문에 면역 체크포인트 저해제에 의한 치료에 의해 이익을 받기 쉬운 것으로 생각하는 것이 가능하다.
T세포의 아집단은 예를 들어 CD8+ T세포의 집단이다. 바람직하게는 CD8+이며, 또한 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 발현하고 있는 T세포 아집단이고, 예를 들어 CD8+ 또한 PD-1, CD28, CD154(CD40L), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), CD27, CD152(CTLA-4), CD366(TIM-3), CD223(LAG-3), CD272(BTLA), CD226(DNAM-1), TIGIT 및 CD367(GITR)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포 표면 마커가 양성인 T세포의 아집단이다. 하나의 실시형태에서는 T세포는 CD8+이다. 일부의 실시형태에서는 T세포 자극계 세포 표면 마커가 양성인 T세포의 아집단의 TCR 다양성을, T세포 억제계 세포 표면 마커가 양성인 T세포의 아집단의 TCR 다양성, 혹은 T세포 자극계 세포 표면 마커 및 T세포 억제계 세포 표면 마커가 양성인 T세포의 아집단의 TCR 다양성을 이용할 수 있다. 일부의 경우에는 T세포의 아집단은 PD-1+ T세포의 집단일 수 있다. TCR의 다양성은 T세포의 아집단마다 결정할 수 있고, 본 발명의 바람직한 실시형태에서는 T세포의 아집단은 CD8+PD-1+ T세포의 집단이다. 적절한 아집단에 대한 TCR 다양성은 피험체의 의료적 상태의 지표로서 이용한 경우에 보다 정확한 지표로서 이용할 수 있는 경우가 있다.
이러한 T세포의 아집단을 분리하는 방법은 해당 기술 분야에서 공지이며, 적절한 셀 소터(예를 들어 BD FACSAria III 셀 소터(BD Bioscience))를 이용하여 행할 수 있다. 당업자는 분리하고자 하는 아집단을 구별하는 세포 표면 마커에 대한 표지 항체를 적절히 이용할 수 있다. 분리한 아집단으로부터 추출한 핵산 시료를 이용하여 상기한 바와 같이 TCR 레퍼토리 해석을 행하면 특정의 T세포 아집단에 대한 TCR 다양성을 결정할 수 있다.
특정 세포를 분획하지 않는 방법으로 PBMC에서의 TCR 다양성을 조사한 보고(https://meetinglibrary.asco.org/record/126066/abstract)에서는 특정 세포를 분획하지 않는 경우에는 항PD-1 항체에 대한 유효 환자와 비유효 환자를 TCR 해석에 따라서는 유의하게 준별할 수 없었음이 보고되었다. 본 명세서에서 실증되는 바와 같이, 특정의 세포 집단에서의 TCR 다양성이 암 면역요법에 대한 유효 환자와 비유효 환자의 구별에 사용할 수 있다는 지견은 예상 밖의 것이다.
T세포는 임의의 조직으로부터 취득해 온 것을 사용할 수 있다. T세포로서는 예를 들어 말초혈, 종양 부위, 정상 조직중, 골수 또는 흉선 등으로부터 취득할 수 있다. 바람직한 실시형태에서는 피험체의 말초혈 중의 T세포의 TCR 다양성을 결정한다. 말초혈로부터의 T세포의 채취는 비침습적이고 간편하다.
TCR을 측정하는 TCR쇄는 α쇄, β쇄, γ쇄 및/또는 δ쇄이다. 하나의 실시형태에서는 TCRα의 다양성이 이용된다. 다른 실시형태에서는 TCRβ가 이용된다.
(진단)
암 면역요법에 대한 응답은 RECIST v1.1(New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline(version 1.1))에 기초하여 결정할 수 있다.
암치료의 효과는 종양의 크기 변화 등으로부터 완전 유효(Complete Response: CR), 부분 유효(Partial Response: PR), 진행(Progressive Disease: PD) 또는 안정(Stable Disease: SD)으로서 판정할 수 있다.
본 명세서에서 「유효 환자」(Responder)란 암치료에 대해 완전 유효 또는 부분 유효를 나타내는 피험체를 말한다. 본 명세서에서 「비유효 환자」(Non-Responder)란 암치료에 대해 진행 또는 안정을 나타내는 피험체를 말한다.
피험체의 암치료에 대한 응답성은 피험체가 「유효 환자」인 것 또는 피험체가 「비유효 환자」인 것을 포함한다. 따라서, 피험체의 암치료에 대한 응답성의 판단은 피험체가 유효 환자인지 비유효 환자인지를 판단하는 것을 포함한다.
본 발명의 하나의 국면은 TCR 다양성을 이용하여 피험체가 「유효 환자」인 것 또는 피험체가 「비유효 환자」인 것을 예측 또는 판단한다. 판단의 시기는 치료의 개시 전에 예측하는 것이 바람직하지만, 치료 개시 후에도 된다. 현재 행하고 있는 치료가 적절한지 어떤지를 판단하는 것도 의료상 유용성을 가지기 때문이다. 혹은 본 발명의 TCR 다양성을 이용하여 예후를 판단할 수도 있다. 예를 들어 본 발명의 TCR 다양성을 이용하여 유효 환자가 비유효가 되는 것, 즉 재발을 예측하는 것이 가능하다. 나아가 판단의 시기로서는 암 면역요법을 실시한 후(예를 들어 면역 체크포인트 저해제의 투여 후) 경시적으로 레퍼토리 해석을 실시하여 다양성 지표로부터 예후를 판단하는 것이 가능하다.
(바람직한 실시형태)
이하에 본 발명의 바람직한 실시형태를 설명한다. 이하에 제공되는 실시형태는 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 범위는 이하의 기재에 한정되지 않아야 할 것으로 이해된다. 따라서, 당업자(관련분야 통상의 기술자)는 본 명세서 중의 기재를 참작하여 본 발명의 범위 내에서 적절히 개변을 행할 수 있는 것은 명백하다. 또한, 본 발명의 이하의 실시형태는 단독으로도 사용되고 혹은 이들을 조합하여 사용할 수 있는 것으로 이해된다.
(응답성의 지표)
하나의 국면에서 본 발명은 피험체의 T세포의 T세포 수용체(TCR) 다양성을 그 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성의 또는 그 응답성의 진단의 지표로서 이용하는 방법을 제공한다. 여기서, TCR 다양성은 다양성 지수로서 제공될 수 있다. T세포는 말초혈 중의 CD8+PD-1+일 수 있다.
다른 국면에서 본 발명은 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하는 방법으로서, in vitro로 그 피험체의 T세포의 TCR 다양성을 측정하는 공정과, 상기 TCR 다양성이 높은 경우 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 좋다고 판정하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다. 혹은 TCR 다양성이 낮은 경우 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 나쁘다고 판정하는 것도 가능하다. T세포는 말초혈 중의 CD8+PD-1+ T세포일 수 있다.
또 다른 국면에서는 본 발명은 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하는 방법으로서, 그 피험체로부터 말초혈 샘플을 얻는 공정과, 그 피험체의 말초혈 중의 T세포의 TCR 다양성을 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 측정하는 공정과, 상기 TCR 다양성이 높은 경우 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 좋다고 판정하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다. 혹은 TCR 다양성이 낮은 경우 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 나쁘다고 판정하는 것도 가능하다. T세포는 말초혈 중의 CD8+PD-1+ T세포일 수 있다.
이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, 본 발명자들은 피험체의 TCR 다양성의 높음, 즉 다양성 지수가 높은 값이면 암 면역요법에 대한 보다 좋은 응답성과 상관되어 있음을 발견하였다. 특히, CD8+PD-1+ T세포의 TCR 다양성은 면역 체크포인트 저해제, 특히 PD-1 저해제(예를 들어 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙)에 의한 치료에 대한 응답성의 유리한 지표로서 유용하다.
피험체의 섀넌-위버 지수(Shannon-Weaver index), 역심슨 지수(Inverse Simpson index), 심슨 지수(Simpson index), 표준화 섀넌-위버 지수(Normalized Shannon-Weaver index), DEX 지수(X는 0~100, 예를 들어 DE30 지수, DE50 지수, DE80 지수 등) 및/또는 UniqueX(X는 0~100, 예를 들어 Unique30 지수, Unique50 지수, Unique80 지수 등)를 이용하여 이들이 높은 것을 암 면역요법에 대한 보다 좋은 응답성의 지표로서 이용할 수 있다.
이론에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명의 실시예의 결과로부터, 암을 공격하는 CD8+ T세포(킬러 T세포 또는 세포 상해성 T세포(CTL)) 집단 중에 암조직의 표면 항원을 인식하는 TCR을 갖는 것이 존재하지 않거나 또는 적은 경우 면역 체크포인트를 저해하였다고 해도 항종양 효과를 그다지 얻을 수 없다는 것을 생각할 수 있다. TCR 다양성이 높은 피험체에서는 암조직의 표면 항원을 인식하는 TCR을 갖는 것이 확실히 존재하기 때문에 면역 체크포인트 저해제에 의한 치료에 의해 이익을 받기 쉬운 것으로 생각하는 것이 가능하다.
나아가 암은 똑같은 세포 집단이 아니라 복수의 세포 집단에 의해 구성되어 있는 것이 알려져 있다. 이들 다양한 암세포는 세포마다 다른 암항원을 발현하고 있다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 실시예의 결과로부터 암세포를 억제하는 데는 보다 다양한 항원을 인식하는 면역 세포가 필요해진다고 예측되고, 다양한 T세포를 갖는 환자에서는 면역 체크포인트 저해약에 의한 효과가 발휘되기 쉽다고 생각하는 것이 가능하다.
본 발명의 하나의 실시형태에서는 피험체의 TCR의 섀넌-위버 지수(Shannon-Weaver index), 역심슨 지수(Inverse Simpson index), 심슨 지수(Simpson index), 표준화 섀넌-위버 지수(Normalized Shannon-Weaver index), DEX 지수(X는 0~100, 예를 들어 DE30 지수, DE50 지수, DE80 지수 등) 및/또는 UniqueX(X는 0~100, 예를 들어 Unique30 지수, Unique50 지수, Unique80 지수 등)의 값에 기초하여 본 명세서에 기재되는 어느 하나의 암 면역요법에 대해 그 피험체가 유효 환자인 것을 결정하거나 유효 환자가 아닌 것을 결정하거나 비유효 환자인 것을 결정하거나 또는 비유효 환자가 아닌 것을 결정한다.
본 발명의 하나의 실시형태에서는 본 명세서에서 기재되는 다수 해석에 기초한 수치를 문턱값으로서 이용하는 것이 가능하다. 본 명세서에서 기재되는 문턱값은 어디까지나 예시이며, 당업자는 새로운 피험체 집단에서의 판정 결과에 기초하여 새로운 문턱값을 정하여 이용하는 것도 가능하다. 본 명세서에서는 문턱값을 정하는 방법에 대해서도 개시되고, 본 발명의 방법은 문턱값을 정하는 공정을 포함해도 되고, 이러한 방법에 따라 미리 정해져 있는 문턱값을 사용해도 된다.
다양성 지수의 문턱값은 일정수의 유효 환자와 비유효 환자의 다양성 지수를 산출하여 유효 환자와 비유효 환자를 감별하는 수치를 결정함으로써 설정할 수 있다. 감별하는 수치의 결정 방법으로서는 유효 환자 집단의 최소값을 이용하는 것(유효 환자를 확실히 유효라고 판정함, 감도가 100%가 됨), 비유효 환자 집단의 최대값을 이용하는 것(비유효 환자를 유효 환자라고 판정하지 않음, 특이도가 100%가 됨) 또는 ROC 해석을 이용하는 것(감도와 특이도의 균형에 의한 판정의 유효성을 최대화함)을 들 수 있다.
다른 수법으로서 비유효군 또는 유효군의 수치로부터 기준 범위(기준값)를 구함으로써 이러한 기준 범위를 초과한 이상값으로 감별하는 것도 가능하다. 기준 범위는 예를 들어 평균값±표준편차(SD)나 평균값±2SD 등의 범위일 수 있고, 그 기준 범위의 상한 또는 하한은 기준값이 될 수 있다. 일부의 경우에는 비유효군의 수치로부터 평균값+SD 또는 평균값+2SD 등을 산출함으로써 문턱값을 결정하는 것이 가능하다. 일부의 경우에는 유효군의 수치로부터 평균값-SD 또는 평균값-2SD 등을 산출함으로써 문턱값을 결정하는 것이 가능하다.
다양성 지표나 문턱값이 리드수에 영향을 받는 경우는 리드수의 표준화 처리를 행하여 문턱값을 설정하거나 혹은 재표본화(리샘플링)에 의해 다른 리드수에서의 문턱값을 산출하고 리드수와 문턱값의 회귀 분석 등으로부터 주어지는 예측식(예를 들어 리드수: X, 문턱값: Y로 한 경우에 일반식 Y=aX＾b 등으로 나타날 수 있음)을 이용하여 문턱값을 설정하는 것을 들 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 섀넌-위버 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 3.2~4.4, 바람직하게는 약 3.3~약 4.2의 범위에서 설정할 수 있고, 구체적 문턱값으로서는 예를 들어 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)일 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 역심슨 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 9~약 19, 바람직하게는 약 10~약 18의 범위에서 설정할 수 있고, 구체적 문턱값으로서는 예를 들어 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)일 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 심슨 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 0.86~약 0.96, 바람직하게는 약 0.88~약 0.94의 범위에서 설정할 수 있고, 구체적 문턱값으로서는 예를 들어 약 0.86, 약 0.87, 약 0.88, 약 0.89, 약 0.90, 약 0.91, 약 0.92, 약 0.93, 약 0.94, 약 0.95, 약 0.96 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)일 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 표준화 섀넌-위버 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 0.41~약 0.51, 바람직하게는 약 0.42~약 0.49의 범위에서 설정할 수 있고, 구체적 문턱값으로서는 예를 들어 약 0.42, 약 0.43, 약 0.44, 약 0.45, 약 0.46, 약 0.47, 약 0.48, 약 0.49 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)일 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 DE50 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 0.0007~약 0.0015의 범위에서 설정할 수 있고, 바람직하게는 약 0.0008~약 0.0014, 약 0.0009~약 0.0013, 약 0.0010~약 0.0011 등의 범위에서 적절히 결정할 수 있으며, 구체적 문턱값으로서는 예를 들어 약 0.0007, 약 0.0008, 약 0.0009, 약 0.0010, 약 0.0011, 약 0.0012, 약 0.0013, 약 0.0014, 약 0.0015 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)을 들 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRβ의 섀넌-위버 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 3.2~약 4.3, 바람직하게는 약 3.4~약 4.1의 범위에서 설정할 수 있고, 구체적 수치로서는 예를 들어 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)을 들 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRβ의 역심슨 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 약 8~32, 바람직하게는 약 10~약 30의 범위에서 설정할 수 있으며, 구체적 수치로서는 예를 들어 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)을 들 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRβ의 심슨 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 0.90~약 0.96, 바람직하게는 약 0.92~약 0.95의 범위에서 설정할 수 있고, 구체적 문턱값으로서는 예를 들어 약 0.90, 약 0.91, 약 0.92, 약 0.93, 약 0.94, 약 0.95, 약 0.96 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)일 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 표준화 섀넌-위버 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 약 0.37~약 0.48, 바람직하게는 약 0.38~약 0.47의 범위에서 설정할 수 있으며, 구체적 수치로서는 예를 들어 약 0.38, 약 0.39, 약 0.40, 약 0.41, 약 0.42, 약 0.43, 약 0.44, 약 0.45, 약 0.46, 약 0.47 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)을 들 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 DE50 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 약 0.0004~약 0.0012, 바람직하게는 약 0.0005~약 0.0012의 범위에서 설정할 수 있으며, 구체적 수치로서는 예를 들어 약 0.0005, 약 0.0006, 약 0.0007, 약 0.0008, 약 0.0009, 약 0.0010, 약 0.0011, 약 0.0012 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)을 들 수 있다.
따라서, 본 발명의 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하는 방법은 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 좋다고 판정하기 위한 문턱값을 특정하는 공정을 포함할 수 있다. 이러한 특정하기 위한 방법은 실시예 등에서 예시되는 바와 같은 임상 시험을 행하고, 다양성 지수를 산출하며, 필요에 따라 통계학적 처리를 행함으로써 특정할 수 있다.
피험체의 TCR 다양성을 측정하여 산출한 상기와 같은 지수의 값은 적절히 사사오입하여(예를 들어 DE50이면 소수점 이하 5자릿수를 사사오입하는 등) 문턱값과의 비교를 행할 수 있다. 유효 숫자는 검출 한계를 고려하여 2자릿수 또는 1자릿수를 채용할 수 있다.
또, 본 명세서의 실시예의 결과로부터 Responder군의 평균값-SD, 평균값-2SD를 하한으로 한 수치 이상 및 ROC 해석으로부터 산출된 문턱값을 채용할 수 있다. 예를 들어 본 명세서의 실시예에서의 일부의 다양성 지수에 대한 Responder군의 평균값-SD는 하기와 같다.
TCRα의 섀넌-위버 지수: 3.37
TCRα의 역심슨 지수: 9.83
TCRα의 표준화 섀넌-위버 지수: 0.422
TCRα의 DE50 지수: 0.0013605
TCRβ의 섀넌-위버 지수: 3.69
TCRβ의 역심슨 지수: 15.84
TCRβ의 표준화 섀넌-위버 지수: 0.433
TCRβ의 DE50 지수: 0.0009545
또한, Responder군의 평균값-2SD는 하기와 같다.
TCRα의 섀넌-위버 지수: 2.66
TCRα의 역심슨 지수: -4.19
TCRα의 표준화 섀넌-위버 지수: 0.366
TCRα의 DE50 지수: 0.0007697
TCRβ의 섀넌-위버 지수: 3.03
TCRβ의 역심슨 지수: 1.43
TCRβ의 표준화 섀넌-위버 지수: 0.385
TCRβ의 DE50 지수: 0.0005064
문턱값(컷오프값)의 설정은 ROC 해석(Receiver Operating Characteristic analysis)을 이용하여 행할 수 있다. ROC 해석을 이용하여 결정한 컷오프값을 이용하여 예를 들어 항PD-1 항체 치료 환자에서의 치료 전의 효과 예측을 행할 수 있다.
ROC 해석에서는 컷오프값을 변화시켜간 경우의 양성률을 감도로서 세로축에, 위양성률(1-특이도)을 가로축에 플롯한 ROC 곡선을 작성한다. 컷오프값을 설정하는 경우, ROC 곡선의 좌측 상부 모서리와의 거리가 최소가 되는 점을 컷오프값으로 하는 방법과, ROC 곡선에서의 곡선 하면적(AUC)이 0.500이 되는 비스듬한 점선으로부터 가장 떨어진 포인트, 즉 (감도+특이도-1)을 계산하여 그 최대값이 되는 포인트(Youden index)를 컷오프값으로 하는 방법이 있다. 본 명세서에 기재되는 각 다양성 지표에서의 ROC 곡선은 도 7에 나타나 있다. 본 명세서의 실시예 1에 기초하여 Youden 지수로부터 산출된 컷오프값은 표 12에 나타나 있고, 이와 같이 예시된 수치를 문턱값으로서 사용할 수 있다.
본 명세서에서 「감도」란 양성으로 판정되어야 할 것을 올바르게 양성으로 판정하는 확률을 말하고, 감도가 높으면 위음성이 줄어든다는 관계에 있다. 감도가 높으면 제외 진단(rule out)에 유용하다.
본 명세서에서 「특이도」란 음성의 것을 올바르게 음성으로 판정하는 확률을 말하고, 특이도가 높으면 위양성이 줄어든다는 관계에 있다. 특이도가 높으면 확정 진단에 유용하다.
예를 들어 TCRα의 섀넌-위버 지수의 컷오프값으로서 약 3.7, TCRα의 역심슨 지수의 컷오프값으로서 약 13, TCRα의 표준화 섀넌-위버 지수의 컷오프값으로서 약 0.43, TCRα의 DE50 지수의 컷오프값으로서 약 0.0012, TCRβ의 섀넌-위버 지수의 컷오프값으로서 3.8, TCRβ의 역심슨 지수의 컷오프값으로서 약 17, TCRβ의 표준화 섀넌-위버 지수의 컷오프값으로서 약 0.42, TCRβ의 DE50 지수의 컷오프값으로서 약 0.0007을 이용할 수 있다.
그러나, 예시된 이들 수치에 한정되지 않고, 당업자는 ROC 해석에 기초하여 원하는 감도 및/또는 특이도에 따라 문턱값을 조절하는 것이 가능하다. 또한, 본 명세서의 실시예에 예시되는 것에 한정되지 않고, 새로운 피험체에 대한 정보를 이용하여 ROC 해석을 행하여 컷오프값을 결정할 수 있다.
하나의 실시형태에서는 이들 컷오프값 미만에서는 항PD-1 항체에 의한 높은 치료 효과를 기대할 수 없다고 예측할 수 있다.
다양성 지표는 샘플링된 양에 따라 영향을 받는 경우가 있을 수 있다. 즉, 일부의 TCR 다양성의 지표는 시퀀싱의 리드수에 따라 변동한다. 이러한 다양성 지표를 이용하는 경우에는 특정 리드수에 대응하는 표준화를 행함으로써 보다 정확한 응답성의 평가가 가능하다. 섀넌, 심슨, 역심슨 지수는 리드수에 관계없이 거의 일정한 수치로 되어 있고, 특히 실제 해석 레벨인 1만 리드 이상에서는 리드수의 영향은 거의 받지 않는다고 생각되며, 이러한 경우에는 지수를 표준화하는 것은 반드시 필요하지 않다.
DE 지수는 리드수의 증가에 따라 일반적으로 감소하는 경향을 가진다. 피험체 사이 또는 피험체와 참조 피험체의 사이에서 시퀀싱 리드수의 차가 커지는 경우(예를 들어 10배 이상의 변동이 있는 경우), 일정한 리드수에 대해 표준화한 DE 지수를 이용함으로써 보다 정확한 응답성의 평가가 가능하다고 생각된다.
표준화의 하나의 방법으로서는 DE 지수는 리드수와 양 로그축에서 직선 관계를 갖는 것으로 근사할 수 있고, 이 관계성에 기초하여 지수를 표준화하는 것이 가능하다. 따라서, 어떤 리드수에서의 DE 지수를 직선 관계에 따라 조절한 문턱값과 비교함으로써 응답성의 평가를 하는 것이 가능하다.
직선 관계의 일례로서 본 명세서의 실시예에 기재되는 DE 지수의 문턱값과 리드수의 직선 관계는 이하의 식:
Figure pct00010
(식 중, y는 문턱값이며, x는 리드수임)에 의해 나타나고, 당업자는 이 관계를 이용하여 표준화를 행할 수 있다. 즉, 리드수 x에 기초하여 얻어진 DE 지수를 상기 y와 비교함으로써 응답성의 평가를 할 수 있다. 또한, 당업자는 복수의 시퀀싱 결과로부터 새로 직선 관계를 도출하여 표준화에 이용하는 것도 가능하다.
또한, 문턱값의 직선 관계에 대해서는 폭을 갖는 것으로서 취급할 수 있다. 예를 들어 다양성 지수의 값을 세로축, 리드수를 가로축으로 한 경우에 띠형상으로 나타낼 수 있다. 그 상한 이상이면 유효자로 판정하고, 그 하한 이하이면 비유효자로 판정하며, 중간이면 의사의 재량으로 투여를 판단한다는 지표의 사용법도 가능하다. 변동폭은 예를 들어 fitting curve의 95% 신뢰성 구간을 이용할 수 있고, 일례가 본 명세서의 실시예에 나타나 있다. 이러한 계산을 행함으로써 특이도 또는 감도를 최대화시킬 수 있다.
또한, 다른 표준화 방법으로서 시퀀싱에 의해 얻어진 리드로부터 일정수의 리드를 리샘플링하고, 리샘플링된 리드에 기초하여 다양성 지수를 산출함으로써 표준화하는 것도 가능하다. 리샘플링은 얻어진 리드로부터 랜덤으로 리드를 취득함으로써 행할 수 있다. 또한, 리샘플링은 복수회 행해도 되고, 이러한 경우에는 시행마다의 다양성 지수의 대표값(중앙값, 평균값 등)을 표준화된 다양성 지수로서 이용할 수 있다.
표준화의 기준으로 하는 리드수는 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 1000, 10000, 20000, 40000, 80000, 100000 또는 200000 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)일 수 있다. 일부의 실시형태에서는 30000 리드에 대해 표준화한 DE50 지수를 이용한다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 30000 리드에 대해 표준화한 섀넌-위버 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 2.8~4.1, 바람직하게는 약 3.9~약 4.1의 범위에서 설정할 수 있고, 구체적 문턱값으로서는 예를 들어 약 2.8, 약 2.9, 약 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)일 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 30000 리드에 대해 표준화한 역심슨 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 8~약 16, 바람직하게는 약 13~약 15의 범위에서 설정할 수 있고, 구체적 문턱값으로서는 예를 들어 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)일 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 30000 리드에 대해 표준화한 심슨 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 0.89~약 0.94, 바람직하게는 약 0.92~약 0.94의 범위에서 설정할 수 있고, 구체적 문턱값으로서는 예를 들어 약 0.89, 약 0.90, 약 0.91, 약 0.92, 약 0.93, 약 0.94 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)일 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 30000 리드에 대해 표준화한 표준화 섀넌-위버 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 0.41~약 0.54, 바람직하게는 약 0.50~약 0.52의 범위에서 설정할 수 있고, 구체적 문턱값으로서는 예를 들어 약 0.41, 약 0.42, 약 0.43, 약 0.44, 약 0.45, 약 0.46, 약 0.47, 약 0.48, 약 0.49, 약 0.50, 약 0.51, 약 0.52, 약 0.53, 약 0.54 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)일 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 30000 리드에 대해 표준화한 DE50 지수(%)가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 0.36~0.40 등의 범위에서 적절히 결정할 수 있고, 구체적 문턱값으로서는 예를 들어 약 0.36, 약 0.37, 약 0.38, 약 0.39, 약 0.40 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)을 들 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRβ의 30000 리드에 대해 표준화한 섀넌-위버 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 3.2~약 4.0, 바람직하게는 약 3.7~약 3.9의 범위에서 설정할 수 있고, 구체적 수치로서는 예를 들어 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)을 들 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRβ의 30000 리드에 대해 표준화한 역심슨 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 약 10~23, 바람직하게는 약 12~약 22의 범위에서 설정할 수 있으며, 구체적 수치로서는 예를 들어 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)을 들 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRβ의 30000 리드에 대해 표준화한 심슨 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 대상 환자에 대해 소극적 또는 적극적인 임상 시험을 행하여 결정할 수 있으며, 하나의 구체적인 실시형태에서는 문턱값은 약 0.90~약 0.97, 바람직하게는 약 0.92~약 0.96의 범위에서 설정할 수 있고, 구체적 문턱값으로서는 예를 들어 약 0.90, 약 0.91, 약 0.92, 약 0.93, 약 0.94, 약 0.95, 약 0.96, 약 0.97 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)일 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 30000 리드에 대해 표준화한 표준화 섀넌-위버 지수가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 약 0.42~약 0.53, 바람직하게는 약 0.47~약 0.52의 범위에서 설정할 수 있으며, 구체적 수치로서는 예를 들어 약 0.42, 약 0.43, 약 0.44, 약 0.45, 약 0.46, 약 0.47, 약 0.48, 약 0.49, 약 0.50, 약 0.51, 약 0.52, 약 0.53 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)을 들 수 있다.
하나의 실시형태에서는 피험체의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα의 30000 리드에 대해 표준화한 DE50 지수(%)가 문턱값 이상인 경우에 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나고, 문턱값은 약 0.22~약 0.26, 바람직하게는 약 0.23~약 0.25의 범위에서 설정할 수 있으며, 구체적 수치로서는 예를 들어 약 0.22, 약 0.23, 약 0.24, 약 0.25, 약 0.26 등(이들 특정 수치 사이의 다른 임의의 특정 수치를 이용해도 됨)을 들 수 있다.
표준화한 다양성 지수에 대해 상기와 같이 ROC 해석에 기초하여 산출한 문턱값을 사용할 수 있고, 예를 들어 30000 리드에 대해 표준화한 다양성 지수에 대해 본 명세서에 예시되어 있는 문턱값을 이용하는 것이 가능하다.
예를 들어 TCRα의 30000 리드에 대해 표준화한 섀넌-위버 지수의 컷오프값으로서 약 3.9, TCRα의 30000 리드에 대해 표준화한 역심슨 지수의 컷오프값으로서 약 14, TCRα의 30000 리드에 대해 표준화한 심슨 지수의 컷오프값으로서 약 0.92, TCRα의 30000 리드에 대해 표준화한 표준화 섀넌-위버 지수의 컷오프값으로서 약 0.51, TCRα의 30000 리드에 대해 표준화한 DE50 지수의 컷오프값으로서 약 0.39, TCRβ의 30000 리드에 대해 표준화한 섀넌-위버 지수의 컷오프값으로서 3.8, TCRβ의 30000 리드에 대해 표준화한 역심슨 지수의 컷오프값으로서 약 22, TCRβ의 30000 리드에 대해 표준화한 심슨 지수의 컷오프값으로서 약 0.95, TCRβ의 30000 리드에 대해 표준화한 표준화 섀넌-위버 지수의 컷오프값으로서 약 0.51, TCRβ의 30000 리드에 대해 표준화한 DE50 지수의 컷오프값으로서 약 0.24를 이용할 수 있다.
또한, 컷오프값은 목적에 따라 조절하여 선택하는 것이 가능하고, 예를 들어 (i) 비응답 환자를 배제하거나(사회보장비의 관점) 또는 (ii) 응답 환자의 누락을 없애는(의사·치료의 관점) 등의 목적에 따라 결정하는 것이 가능하다. (i)을 위해서는 비응답의 최고 라인보다 높은 값을 컷오프값으로 함으로써 달성할 수 있고, (ii)를 위해서는 응답자의 최저 라인보다 낮은 값을 컷오프값으로 함으로써 달성할 수 있다. 이들 값은 피험체 집단의 다양성 지수에 기초하여 당업자가 결정할 수 있고, 또는 본 명세서에 기재되는, 비응답 및 응답 피험체가 나타내는 다양성 지수의 최대값 또는 최소값의 예에 기초하여 문턱값을 설정하는 것이 가능하다.
일반적으로 생물학적 마커는 불균일을 가진 데이터가 되어 비교하는 2군이 명확하게 분리될 수 있는 경우는 드물다. 통상은 다수의 데이터로부터 정상값의 문턱값을 마련하고 이를 기준으로 하여 이상값인지 어떤지를 판별할 수 있으면 마커로서 사용하는 것이 가능하고, 예를 들어 키트루다(PD-L1 항체)의 적용에 관해 PD-1 고양성이 마커가 되어 있지만 실제 유효율은 50% 정도이다. 마커로서는 100%의 예측이 불가능해도 충분히 가치가 있는 바, 2군의 분리를 감도·특이도 모두 100%로 행할 수 있는 마커(예를 들어 TCR 다양성의 DE50 지수)는 매우 유리한 것이라고 할 수 있다.
하나의 바람직한 실시형태에서는 TCR은 TCRα이다. 다른 바람직한 실시형태에서는 TCR은 TCRβ이다. TCRβ가 바람직할 수 있다. 이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, TCRβ의 다양성 지수는 응답성 피험체와 비응답성 피험체가 나타내는 수치에 중복이 없기 때문이다. 그러나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, TCRα이어도 된다. 이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, 예를 들어 DE50 지수를 이용함으로써 준별하는 것이 가능하다는 것이 나타나 있기 때문이다.
하나의 실시형태에서는 본 발명에서 이용되는 다양성은 피험체의 말초혈 샘플로부터 CD8+PD-1+ T세포를 단리하는 공정과, CD8+PD-1+ T세포의 TCR 다양성을 측정, 결정 또는 산출하는 공정을 이용하여 산출할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시형태는 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하는 방법으로서, 상기 TCR 다양성이 높은 경우 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 좋다고 판정하는 공정을 포함하는 방법이다.
바람직하게는 여기서 산출되는 TCR 다양성은 본 명세서에서 상술하는 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석(WO2015/075939)을 이용하는 것이 유리하다. 이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, 다른 TCR 레퍼토리 해석을 이용하는 경우, 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석으로 검출할 수 있는 유니크 리드를 일부 검출할 수 없다. 그 때문에 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석으로 산출되는 다양성 지수가 보다 정밀한 것으로, 피험체의 상황을 보다 정확하게 반영한다. 그리고, 이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, 실제로 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석에서의 다양성 지수는 응답성과 비응답성을 명확하게 식별할 수 있는 것에 반해, 종래의 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석 이외의 레퍼토리 해석에서는 응답성과 비응답성의 식별이 충분하지 않다고 생각된다. 따라서, 대규모 고효율 레퍼토리 해석을 이용하여 측정한 TCR 다양성을 이용한 경우, 종래 해석보다 정확한 평가 결과를 줄 수 있다.
본 발명의 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하는 방법에 있어서, 피험체의 T세포의 TCR 다양성을 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 측정한 후, 그 TCR 다양성이 높은 경우 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 좋다고 판정한다. TCR 다양성이 높은지 어떤지는 상대적으로 판단해도 되고, 혹은 미리 정한 다양성 지수의 문턱값(예를 들어 본 명세서에 기재되는 것)과 대비하여 다양성이 높은지 여부를 판정할 수 있다. 그리고, 다양성 지수가 높은 경우는 암 면역요법에 대해 응답성이 좋거나 또는 있다고 판단하고, 적절히 필요에 따라 그 후의 치료를 행할 수 있다. 사용될 수 있는 T세포는 본 명세서에서 기재되는 임의의 종류 중 하나 또는 복수의 T세포일 수 있고, 바람직하게는 말초혈 중의 CD8+PD-1+ T세포일 수 있다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하여 그 피험체의 암을 치료하는 방법으로서, 피험체의 T세포의 TCR 다양성을 측정하는 공정과, 그 TCR 다양성이 기준값보다 높은 경우 그 피험체에 암 면역요법을 실시하는 공정을 포함하는 방법(이른바 컴패니언 진단 또는 컴패니언 치료)이다. TCR 다양성의 기준값 또는 문턱값은 본 명세서의 기재에 기초하여 당업자가 적절히 정하는 것이 가능하고, 그 구체적인 다양성 지수의 수치는 본 명세서에서 예시되어 있으며 적절히 채용할 수 있다. 사용될 수 있는 T세포는 본 명세서에서 기재되는 임의의 종류 중 하나 또는 복수의 T세포일 수 있고, 바람직하게는 T세포는 말초혈 중의 CD8+PD-1+ T세포일 수 있다.
(면역 체크포인트 저해제의 컴패니언 용도)
본 발명의 추가적인 국면에서 본 발명은 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물로서, T세포의 TCR 다양성이 높은 피험체에서 암을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 이러한 면역 체크포인트 저해제가 T세포의 TCR 다양성이 높은 피험체에 투여하는 것이 유리한 것이 본 발명자들에 의해 발견되었다. 그리고, T세포의 TCR 다양성이 낮은 피험체에는 비유효 환자라고 판단할 수 있고, 면역 체크포인트 저해제를 투여하지 않거나 또는 투여를 중단 혹은 중지한다는 판단도 행할 수 있다. TCR 다양성을 측정하는 T세포는 본 명세서에서 기재되는 임의의 종류 중 하나 또는 복수의 T세포일 수 있고, 바람직하게는 말초혈 중의 CD8+PD-1+ T세포일 수 있다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 의약 조성물이며, 그 유효 성분으로서 포함되는 면역 체크포인트 저해제로서는 예를 들어 PD-1 저해제를 들 수 있다. PD-1 저해제로서는 항PD-1 항체인 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙을 들 수 있다.
조성물은 에어졸, 액제, 엑기스제, 엘릭시르제, 캡슐제, 과립제, 환제, 연고, 산제, 정제, 용액, 현탁액, 에멀젼 등의 임의의 제형으로 제제화할 수 있다. 조성물은 해당 기술분야에서 공지의 임의의 약학적으로 허용되는 첨가물 및/또는 부형제를 포함해도 된다.
본 발명의 조성물은 당업자에 의해 결정되는 임의의 적절한 경로에 의해 투여할 수 있고, 한정되는 것은 아니지만 정맥주사, 점적, 경구, 비경구, 경피 등을 들 수 있다.
하나의 실시형태에서는 T세포의 TCR의 Shannon 지수, Simpson 지수, 표준화 Shannon 지수 또는 DE50 지수가 높은 피험체에서 암을 치료하기 위한 조성물이 제공된다. 바람직한 실시형태에서는 T세포의 TCR의 DE50 지수가 높은 피험체에서 암을 치료하기 위한 조성물이 제공된다.
말초혈 중의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRα에 대해 30000 리드로 표준화한 DE50 지수가 0.39% 이상인 피험체에서 암을 치료하기 위한 조성물이 제공된다.
말초혈 중의 CD8+PD-1+ T세포의 TCRβ에 대해 30000 리드로 표준화한 DE50 지수가 0.24% 이상인 피험체에서 암을 치료하기 위한 조성물이 제공된다.
(대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석의 신규 용도)
하나의 국면에서는 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 결정된 레퍼토리의 다양성을 피험체의 치료에 대한 응답성의 지표로서 이용하는 방법을 제공한다. 이 수법은 1종의 정방향 프라이머와 1종의 역방향 프라이머로 이루어지는 1세트의 프라이머에서 모든 아이소타입이나 서브타입 유전자를 포함하는 TCR 유전자 또는 BCR 유전자를 존재 빈도를 바꾸지 않고 증폭하여 레퍼토리의 다양성을 결정한다. 본 명세서에 기재되고 WO2015/075939에서도 기재되는 바와 같이 이 프라이머 설계는 비바이어스적인 증폭에 유리하다.
다른 레퍼토리 해석을 이용하는 경우, 대규모 고효율 레퍼토리 해석으로 검출할 수 있는 유니크 리드를 일부 검출할 수 없다. 그 때문에 대규모 고효율 레퍼토리 해석으로 산출되는 다양성 지수가 보다 정밀한 것으로, 피험체의 상황을 보다 정확하게 반영한다. 그리고, 이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, 실제로 대규모 고효율 레퍼토리 해석에서의 다양성 지수는 치료에 대한 응답성과 비응답성을 명확하게 식별할 수 있는 것에 반해, 종래의 대규모 고효율 레퍼토리 해석 이외의 레퍼토리 해석에서는 그 치료에 대한 응답성과 비응답성의 식별이 충분하지 않다고 생각된다.
하나의 실시형태에서는 대상이 되는 치료는 면역 반응에 관련된 치료이다. 다른 바람직한 실시형태에서는 이용되는 레퍼토리 해석은 TCR 레퍼토리 해석이다.
(주기)
본 명세서에서 「또는」은 문장 중에 열거되어 있는 사항의 「적어도 하나 이상」을 채용할 수 있을 때에 사용된다. 「혹은」도 마찬가지이다. 본 명세서에서 「2개의 값」의 「범위 내」라고 명기한 경우, 그 범위에는 2개의 값 자체도 포함한다.
본 명세서에서 인용된 과학 문헌, 특허, 특허출원 등의 참고 문헌은 그 전체가 각각 구체적으로 기재된 것과 동일한 정도로 본 명세서에서 참고로서 원용된다.
이상, 본 발명을 용이한 이해를 위해 바람직한 실시형태를 나타내어 설명하였다. 이하에 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하지만, 상술한 설명 및 이하의 실시예는 예시의 목적으로만 제공되고, 본 발명을 한정하는 목적으로 제공한 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 범위는 본 명세서에 구체적으로 기재된 실시형태에도 실시예에도 한정되지 않고, 청구범위에 의해서만 한정된다.
실시예
이하에 실시예를 기재한다. 필요한 경우, 이하의 실시예에서 모든 실험은 효고 의과대학 윤리위원회에서 승인된 가이드라인에 따라 실시하였다. 또한, 문부과학성·후생노동성·경제산업성 작성의 「사람을 대상으로 하는 의학계 연구에 관한 윤리 지침」(2014년 12월 22일 26문과진 제475호 후생노동성 발과 1222 제1호 의정 발송 1222 제1호)의 지침에 따라 행하였다. 또한, 인간 유전자 해석 연구의 윤리 지침에 준거하였다. 실험은 효고 의과대학 윤리위원회에서의 심사 후 승인 하에 실시하였다. 시약류는 구체적으로는 실시예 중에 기재한 제품을 사용하였지만, 다른 제조사(Sigma-Aldrich, 와코 순약, Nacalai Tesque, R&D Systems, USCN Life Science INC 등)의 동등품으로도 대용 가능하다.
(실시예 1: 항PD-1 항체 치료를 받는 환자의 TCR 다양성)
(1. 재료와 방법)
1.1. 말초혈 단핵구 세포(PBMC)의 분리
12예의 폐암 환자에서의 항PD-1 항체(nivolumab, 옵디보) 치료 개시 전에 전혈을 헤파린 함유 채혈관에 8mL 채취하였다. 전혈은 Ficoll-Hypaque를 이용한 비중 원심 분리에 의해 PBMC를 분리하고 혈구계수반에서 세포수를 카운트하였다. 단리된 PBMC는 직접 면역 세포 염색하거나 혹은 세포용 동결 보존액 STEM-CELLBANKER에 현탁하여 액체 질소 중에서 보관되었다.
1.2. 항CD8 항체 및 항PD-1 항체에 의한 이중 염색
PBMC는 하기의 순서에 따라 면역 염색하였다.
1. 동결 보관한 세포는 STEM-CELLBANKER를 제거하기 위해 Stain Buffer(PBS, 0.1% BSA, 0.1% Sodium Azide)에 현탁하여 원심 후에 상청을 버림으로써 2회 세정하였다.
2. 신선 혹은 보관 PBMC를 1×106/tube가 되도록 Stain buffer에 현탁하여 1,000rpm으로 5분간 4℃에서 원심하였다.
3. 세포는 100μL의 항체 희석액(5μl/test 항인간 CD8 항체, 2.0μg 항인간 PD-1 항체) 중에서 실온 30분간 차광 하에서 염색하였다.
4. 항체 염색 후 2mL의 Stain buffer에 현탁하여 1,000rpm, 5분간 4℃에서 원심 후 상청을 버림으로써 2회 세정하였다.
5. 세정 후 100μL의 Stain buffer에 현탁하여 5μL의 7-AAD를 첨가하고 차광 하 실온에서 10분간 반응시켰다.
6. 세포에 500μL의 Stain buffer를 더하고 여과(filtration)를 행하였다.
7. 염색 세포는 BD FACSAria III 셀 소터(BD Bioscience)를 이용하여 7AAD-CD8+PD-1+ 세포 집단을 소팅 분리하였다.
8. 소팅한 세포는 1.5mL 에펜 튜브로 옮겨 1,000rpm, 5분간 4℃에서 원심하였다.
9. 50μL의 상청을 남기고 Stain buffer를 제거 후 750μL의 TRIzol LS 시약(Invitrogen)을 더하여 피펫팅함으로써 세포를 용해하였다.
10. 용해한 TRIzol액에 200μL의 DEPC Water를 더하고 1000μL로 조정한 후 Vortex에 의한 혼화 후에 -80℃에서 동결 보관하였다.
1.3. RNA 추출
TRIzol LS 시약에 용해된 세포로부터의 전체 RNA의 추출과 정제는 RNeasy Plus Universal Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 행하였다. 정제된 RNA를 Nanodrop 흡광도계(Thermo Scientific) 혹은 TapeStation 2200(Agilent)을 이용하여 정량하였다.
1.4. 상보적 DNA 및 이본쇄 상보적 DNA의 합성
추출된 RNA를 이용하여 상보적 DNA를 합성하기 위해 1.25μL의 BSL-18E 프라이머(표 1)와 3.75μL의 RNA를 혼화하여 70℃에서 8분간 어닐링하였다.
Figure pct00011
빙상에서 냉각 후, 하기의 조성에서 RNase 저해제(RNAsin)의 존재하에서 역전사 반응을 행하여 상보적 DNA를 합성하였다.
Figure pct00012
이어서, 하기의 이본쇄 DNA 합성 완충액 중, E. coli DNA polymerase I, E. coli DNA Ligase, RNase H의 존재하에서 16℃로 2시간 보온하여 이본쇄 상보적 DNA를 합성하였다. 추가로 T4 DNA polymerase를 16℃에서 5분간 반응시켜 5'말단 평활화 반응을 행하였다.
Figure pct00013
이본쇄 DNA는 MiniElute Reaction Cleanup Kit(QIAGEN)에 의해 칼럼 정제된 후, 하기의 T4 리가아제 완충액 중, P20EA/10EA 어댑터(표 4) 및 T4 ligase의 존재하에서 16℃로 밤새 보온하여 라이게이션 반응을 행하였다.
Figure pct00014
전술한 바와 같이 칼럼에 의해 정제된 어댑터 부가 이본쇄 DNA는 3'말단에 부가한 어댑터를 제거하기 위해 Not I 제한 효소(50U/μL, Takara)를 이용하여 하기의 조성으로 소화되었다.
Figure pct00015
또, 소화 시간은 적절히 변경할 수 있다.
1.5. PCR
이본쇄 상보적 DNA로부터 표 2에 나타내는 공통 어댑터 프라이머 P20EA와 C영역 특이적 프라이머(CG1, CK1 또는 CL1)를 이용하여 1st PCR 증폭을 행하였다. PCR은 다음에 나타내는 조성으로 95℃ 20초, 60℃ 30초, 72℃ 1분의 사이클을 20사이클 행하였다.
Figure pct00016
다음으로 1st PCR 증폭 산물을 이용하여 P20EA 프라이머와 C영역 특이적 프라이머(CA2 또는 CB2)를 이용하여 다음에 나타내는 반응 조성으로 2nd PCR을 행하였다. PCR은 다음에 나타내는 조성으로 95℃ 20초, 60℃ 30초, 72℃ 1분의 사이클을 20사이클 행하였다.
Figure pct00017
얻어진 2nd PCR 증폭 산물 10μL를 Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)를 이용하여 증폭 산물을 정제하였다. 최종 용출액 30μL 중 5μL를 주형으로 하여 Tag 부가 PCR을 행하였다. 증폭에는 도 1에 도시된 P22EA-ST1-R과 mCG-ST1-R, mCK-ST1-R 또는 mCL-ST1-R 프라이머를 이용하였다. PCR 사이클은 95℃ 20초, 60℃ 30초, 72℃ 1분을 20사이클 행하였다.
Figure pct00018
얻어진 Tag PCR 증폭 산물 10μL를 Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)를 이용하여 증폭 산물을 정제하였다. 최종 용출액 30μL 중 2μL를 주형으로 하여 Nextera XT Index Kit v2 SetA(Illumina)를 이용하여 INDEX를 부가하였다. PCR 사이클은 95℃ 20초, 55℃ 30초, 72℃ 30초를 12사이클 행하였다. PCR 증폭을 확인하기 위해 10μL의 증폭 산물을 2% 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다. 얻어진 INDEX화 PCR 증폭 산물은 Qubit 2.0 Fluorometer(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 정량되고 적절한 농도로 희석된 후, MiSeq 시퀀서(Illumina)를 이용하여 시퀀스되었다. 시퀀스 장치의 조작 및 순서는 MiSeq 사용설명서 및 매뉴얼에 따랐다.
시퀀스에 의해 얻어진 Fastq 데이터는 Repertoire Genesis사 레퍼토리 해석 소프트(Repertoire Genesis)를 이용하여 이미 알고 있는 레퍼런스 서열과 V, D, J 및 C영역의 대조 및 CDR3 아미노산 서열의 결정을 행하였다. 서열이 동일한 것을 유니크 리드로 하여 그 카피수를 카운트함으로써 전체에 차지하는 비율을 구하였다.
1.6. 다양성 지수의 산출
얻어진 각 유니크 리드의 리드수 데이터로부터 다양성 지수를 구하였다. 섀넌-위버 지수(Shannon-Weaver index), 심슨 지수(Simpson index), 역심슨 지수(Inverse Simpson index)(1/λ) 및 DE50 지수는 다음 수식에 따라 산출되었다. N: 전체 리드수, ni: i번째 유니크 리드의 리드수, S: 유니크 리드수, S50: 전체 리드의 50%를 차지하는 상위 유니크 리드의 수
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
계산은 Repertoire Genesis사 해석 서버에서 레퍼토리 해석 프로그램의 해석 프로그램의 일부로서 실시되었다(http://www.repertoire.co.jp/). 그 밖에 S50(전체 리드의 50%를 차지하는 상위 유니크 리드의 수) 대신에 S30(전체 리드의 30%를 차지하는 상위 유니크 리드의 수) 및 S80(전체 리드의 80%를 차지하는 상위 유니크 리드의 수)을 이용한 DE30 지수 및 DE80 지수, S부분을 그대로 이용하는 Unique 지수에 대해서도 계산을 행하였다.
(2. 결과)
2.1. 임상 평가
항PD-1 항체 치료 개시 전 및 치료 후 3개월 후에 환자 흉부 CT 혹은 PET 화상 진단을 행하여 종양량의 형태적 평가 및 종양량의 변화에 기초하여 치료 효과를 평가하였다(도 1). 일부 환자의 효과 판정 결과(완전 유효, 부분 유효, 안정, 진행) 및 주요 치료 경과는 표 9에 나타내었다. 일부 환자의 흉부 CT 화상을 도 2에 나타내었다. 도 2에 도시된 4예 중 2예의 환자가 치료 후 3개월의 시점에서 부분 유효(PR)로 판정되고, 다른 2예는 비유효로 판정되었다.
Figure pct00023
2.2. FACS 소팅
12예의 폐암 환자 치료 전에 채취된 PBMC를 이용하여 FACS 해석을 행하였다. PBMC는 PE-Cy7 표지 항인간 CD8 항체 및 FITC 표지 항PD-1 항체로 염색되었다. FSC/SSC 게이팅에 의해 림프구 분획을, 나아가 7AAD에 의해 죽은 세포를 제거하였다. FACS Aria III 셀 소터에 의해 7AAD-CD8+PD-1+ T세포를 모아 TRIzol LS RNA 추출 시약에 용해하였다. 도 3에 FACS 해석 결과의 일부를 나타낸다. FSC/SSC에 의한 림프구 게이트(상단) 및 CD8 항체 및 PD-1 항체의 이중 염색(하단)을 나타내었다. 림프구 분획에 대해 7AAD-CD8+PD-1+ 세포 분획(P3)을 FACS 소팅에 의해 분취하였다(도 3).
각 환자에서의 림프구에 차지하는 CD8+PD-1+ 세포의 비율 및 CD8+ T세포에 차지하는 CD8+PD-1+ 세포의 비율에 대해 항PD-1 항체 치료 유효 환자(n=6)와 비유효 환자(n=6)의 사이에서 비교하였다(도 4). 전자는 비유효 환자가 유효 환자에 비해 높은 경향을 나타내고, 한편 후자는 명확한 차가 보이지 않았다.
2.3. CD8+PD-1+ T세포의 TCR 레퍼토리 해석
FACS 소팅에 의해 회수한 CD8+PD-1+ T세포를 이용하여 방법에 기재된 방법에 따라 차세대 시퀀서에 의한 TCR 유전자의 망라적 염기 서열의 결정을 행하였다. FACS 소팅에 의해 회수된 세포수 및 RNA량을 표 10에 나타낸다. 각 샘플로부터 획득한 TCR 리드수, 할당된 리드수, In-frame 리드수 및 유니크 리드수를 표 11에 나타낸다.
Figure pct00024
Figure pct00025
획득된 TCR 리드수와 유니크 리드수가 비유효 환자인 환자 4가 가장 많고, TCR 리드수 혹은 유니크 리드수와 치료 효과의 관련은 보이지 않았다.
2.4. 다양성 지표를 이용한 CD8+PD-1+ T세포의 치료 환자 사이에서의 다양성 비교
항PD-1 항체 치료 환자의 사이에서 CD8+PD-1+ T세포의 다양성을 비교하기 위해 12예의 폐암 환자 시료로부터 서열 결정된 TCR 리드 데이터를 이용하여 다양성 지표를 산출하여 비교하였다. 개개의 유니크 리드와 그 리드수(카피수)를 이용하여 방법에 기재된 수식에 따라 다양성 지표를 산출하였다. 다양성 지표로는 Shannon-Weaver index, Normalized Shannon-Weaver index, Simpson index, 역Simpson index 및 DE50 index를 이용하였다(도 5 및 6). 유의차 검정은 논파라메트릭한 맨-휘트니 검정(양측 검정)을 이용하였다. TCRα쇄에서 Shannon-Weaver index는 Non-Responder에 비해 Responder에서 유의하게 높은 값을 나타내었다(평균값±표준편차, Non-Responder vs. Responder, 2.796±0.9519 vs. 4.081±0.7124, P=0.0411). 마찬가지로 Normalized Shannon-Weaver index, 역Simpson index 및 DE50의 다양성 지표는 각각 0.3327±0.1018 vs. 0.4771±0.05547(P=0.0260), 7.530±4.906 vs. 23.85±14.02(P=0.0152), 0.0006220±0.0003472 vs. 0.001951±0.0005909(P=0.0022)이고, 모두 Non-Responder에 비해 Responder에서 유의하게 높은 값을 나타내었다. 또한, 마찬가지로 TCRβ쇄에서도 모든 지표에서 Non-Responder에 비해 Responder에서 유의하게 높은 값을 나타내었다. 평균값±표준편차는 각각 3.129±0.6742 vs. 4.345±0.6555, P=0.0087(Shannon-Weaver index), 0.3528±0.0612 vs. 0.4815±0.04832, P=0.0087(Normalized Shannon-Weaver index), 8.198±3.551 vs. 30.25±14.41, P=0.0087(역Simpson index), 0.0003910±0.00007243 vs. 0.001403±0.0004480, P=0.0022(DE50)이었다. 이들 결과로부터 CD8+PD-1+ T세포의 다양성은 Non-Responder에 비해 Responder가 명백하게 높은 것이 밝혀졌다.
2.5. 컷오프값의 설정
항PD-1 항체 치료 환자에서의 치료 전의 효과 예측을 하기 위해 각 다양성 지표의 컷오프값의 설정을 ROC 해석(Receiver Operating Characteristic analysis)을 이용하여 행하였다. ROC 해석에서는 컷오프값을 변화시킨 경우의 양성률을 감도로 하여 세로축에, 위양성률(1-특이도)을 가로축에 플롯한 ROC 곡선이 작성된다. 컷오프값을 설정하는 경우, ROC 곡선의 좌측 상부 모서리와의 거리가 최소가 되는 점을 컷오프값으로 하는 방법과, ROC 곡선에서의 곡선 하면적(AUC)이 0.500이 되는 비스듬한 점선으로부터 가장 떨어진 포인트, 즉 (감도+특이도-1)을 계산하여 그 최대값이 되는 포인트(Youden index)를 컷오프값으로 하는 방법이 있다. 각 다양성 지표에서의 ROC 곡선을 도 7에 나타내었다. DE50은 다른 다양성 지표와 비교하여 TCRα, TCRβ 모두 AUC가 가장 높은 값을 나타내고 예측 능력이 가장 우수하다고 시사되었다. 각 다양성 지표에서의 컷오프값은 R 프로그램(ROCRpackage)을 이용하여 Youden 지수로부터 산출되어 표 12에 나타났다. 이들 컷오프값 미만에서는 항PD-1 항체에 의한 높은 치료 효과를 기대할 수 없다고 예측되게 된다.
Figure pct00026
또한, 이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, TCRα 레퍼토리 다양성보다 TCRβ 레퍼토리 다양성이 보다 명확하게 준별할 수 있는 경향이 있는 것이 관찰된다. 또한, DE50 지수이면 어떤 레퍼토리에서도 보다 명확하게 준별할 수 있는 경향이 있는 것이 관찰된다.
(3. 고찰)
CD8+PD-1+ T세포는 항PD-1 항체에 의해 면역 억제가 해제되고 항종양 효과를 발휘하는 것이 알려져 있다. 본 실험으로부터 폐암 환자의 말초혈 중의 CD8+PD-1+ T세포의 다양성이 높은 환자일수록 항PD-1 항체에 대한 치료 효과가 높은 것을 알 수 있었다. 종양 침윤 T세포는 종양 특이적 항원을 인식하여 항종양 효과를 발휘한다. 종양 세포는 종양화 과정에서 많은 유전자 변이를 축적하여 정상 세포에는 발현하지 않는 신생 항원(네오안티겐)을 생산하게 된다. 면역 체크포인트 저해약 등의 면역요법은 보다 많은 유전자 변이를 축적하는 종양에 대한 효과가 높은 것이 알려져 있다. 보다 다수의 신생 항원이 T세포의 타겟이 되는 것이 종양을 억제하기 위해 중요하다고 생각된다. 항PD-1 항체에 유효한 환자에게는 치료 전에 면역 억제된 다수의 신생 항원에 반응하는 다양한 T세포가 존재한다고 추측된다. 이들이 항PD-1 항체에 의해 억제 해제되어 보다 높은 치료 효과를 가져온다고 추측된다. 폐암 환자에 대해 항PD-1 항체(Nivolumab)에 유효한 환자는 20~30%이다. 항PD-1 항체 치료 전에 유효 환자를 예측할 수 있으면 보다 효과적인 치료를 실현하여 의료비의 낭비를 없앨 수 있다. 시료 채취가 용이한 말초혈 세포에서의 TCR 레퍼토리 해석을 행하여 다양성 지표를 바이오마커로서 이용하면 지금까지 불가능하였던 항PD-1 항체 치료의 효과 예측이 가능해진다고 기대된다.
(실시예 2: 리드수에 따른 다양성 지수의 변화 검토)
다양성 지수는 샘플수, 즉 시퀀싱에 의해 얻어진 리드수의 영향을 받아 변동할 가능성이 있다. 그 때문에 실시예 1에서 얻어진 각 피험체의 데이터로부터 랜덤 샘플링에 의해 일정 리드수(100, 300, 1000, 3000, 10000, 30000, 80000)를 취득하고, 그 리드에 기초한 다양성 지수(Shannon-Weaver 지수, Simpson 지수, 표준화 Shannon 지수, 역Simpson 지수, DE30 지수, DE50 지수, DE80 지수, Unique30 지수, Unique50 지수, Unique80 지수)를 각각 산출하여 플롯하였다. 리샘플링은 100회 시행하여 각 다양성 지표의 중앙값을 각각의 리드수에 대해 표준화된 값으로서 이용하였다. TCRα 및 TCRβ의 다양성 지수에 대한 리드수에 따른 변화는 도 8 및 도 9에 각각 나타난다.
섀넌, 심슨, 역심슨 지수는 리드수에 관계없이 거의 일정한 수치로 되어 있고, 특히 실제 해석 레벨인 1만 리드 이상에서는 리드수의 영향은 거의 받지 않는다고 생각된다. 한편, DE 지수는 리드수의 영향을 받아 리드수가 많아지면 지수가 저하되는 경향이 관찰된다. DE50 이외의 DE 지수인 DE30, DE80에 대해서도 동일한 경향을 나타낸다. 따라서, DE 지수에 대해 문턱값으로서 특정 수치를 이용하는 경우에는 리드수의 영향을 고려한 문턱값을 설정하는 것이 유리하다고 생각된다.
나아가 실시예 1의 유효군과 비유효군의 TCR 다양도 지수를 30000 리드로 표준화한 비교 결과를 도 10 및 11에 나타내었다. 각각의 피험체에 대해 각 다양성 지수를 100, 300, 1000, 3000, 10000, 30000 및 80000 리드로 표준화한 값은 이하의 표 13~33에 나타난다. Clinical의 란에는 각 피험체의 치료 효과가 나타난다. Res_min은 응답군에서의 지수의 최소값을 나타내고, Non_max는 비응답군에서의 지수의 최대값을 나타낸다. 표 13~33에서, Discrim은 응답군에서의 지수의 최소값이 비응답군에서의 지수의 최대값보다 큰지 여부를 나타낸다. 응답군 및 비응답군 사이의 다양성 지수의 t통계값이 ttest의 란에 나타난다.
Figure pct00027
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Figure pct00045
Figure pct00046
이와 같이 하여 표준화한 다양성 지수에 대해 실시예 1에서 검출된 유효군(n=6)과 비유효군(n=6)의 유의차가 어느 리드수에서도 마찬가지로 검출되는지를 검정하였다. 유의차 검정은 비등분산, t검정으로 행하였다. 결과는 표 13~32에 나타나 있고, 섀넌, 심슨, DE50 등 실시예 1에서 이용한 모든 다양성 지수는 리드수의 영향을 받지 않고 유의차를 나타내었다. 리드수는 DE50 지수 등의 DE 지수의 절대값에는 영향을 주지만 유의차에는 영향을 주지 않고, 다양성 지수에 의한 효과 예측의 의의는 바뀌지 않는 것으로 생각된다.
따라서, 다양성 지수는 리드수에 대해 표준화하여 비교하는 것이 가능하고, 절대값이 변화하는 DE 지수의 경우에는 특정 문턱값과의 비교에 대해서는 리드수에 대해 표준화하는 것이 유리하다고 할 수 있다.
나아가 DE50값은 실시예 1의 데이터로부터 유효군과 비유효군의 분리가 잘 된 것을 알 수 있다. 본 실시예에서는 일정 리드수(100, 300, 1000, 3000, 10000, 30000, 80000)로 표준화한 경우에도 마찬가지로 준별성이 좋은지 어떤지를 조사하였다. 유효군의 최소값이 비유효군의 최대값을 웃도는 「선명한」 분리를 나타내는(ROC 곡선의 AUC가 1이 되는) 지수 및 리드수를 탐색하고, 이러한 지표에 대해 표 13~32의 Discrim의 란에서 Yes로서 나타내고 있다. DE50에서 이러한 완전한 분리가 가능한 것이 실증되었다. 또한, DE30에서는 유의차가 없어지는 경우가 있지만 DE50 지수에서는 리드수도 10000 리드에서 80000 리드까지 거의 동일한 정도의 식별성을 나타내는 것을 알 수 있었다. DE 지수 중에서는 DE50값이 가장 좋고, 예상할 수 없었던 준별성이 DE50을 사용함으로써 달성할 수 있는 것이 실증되었다.
나아가 이러한 표준화한 다양성 지수를 이용하여 응답성을 평가하는 경우에 이용하는 문턱값에 대해 검토하였다. 우선, 각 다양성 지수를 각 리드수로 표준화한 경우의 값에 기초하여 ROC 해석을 행하여 문턱값을 구하였다. ROC 해석에 기초하여 산출된 각 다양성 지수의 컷오프값은 이하의 표 33(TCRα) 및 표 34(TCRβ)에 나타내었다. 예를 들어 산출한 각 리드수에 대한 문턱값은 각 리드수에 대해 표준화한 지수를 이용하여 응답성을 평가하는 경우에 사용하는 것이 가능하다.
Figure pct00047
Figure pct00048
나아가 (i) 비응답 환자를 배제하거나(사회보장비의 관점) 또는 (ii) 응답 환자의 누락을 없애는(의사·치료의 관점) 등의 목적에 따라 사용하는 문턱값을 결정하기 위해 30000 리드로 표준화한 경우의 각 다양성 지수의 문턱값에 대해 더욱 검토하였다. 30000 리드로 표준화한 비응답 및 응답 피험체가 나타내는 다양성 지수의 최대값 또는 최소값의 예와 ROC 해석에 기초한 문턱값은 이하의 표 35(TCRα) 및 표 36(TCRβ)에 나타난다. 이러한 값의 예에 기초하여 문턱값을 설정함으로써 상기 목적을 달성하는 것과 같은 응답성의 평가가 가능하다.
Figure pct00049
Figure pct00050
나아가 랜덤 리샘플링에 의한 다양성 지수의 문턱값 변동에 대해 검토하였다. 각 다양성 지수에 대해 각 리드수로 표준화한 값에 기초한 ROC 해석으로부터 산출한 문턱값을 플롯하였다(도 12 및 도 13). 섀넌, 심슨, 역심슨 지수, Unique 지수에 대한 문턱값은 리드수에 관계없이 거의 일정한 수치로 되어 있다. 리드수의 증가에 동반하여 감소하는 경향을 나타내고 있는 DE 지수의 문턱값은 log-log 플롯(양(兩) 로그)에서 1차 함수에 근사되는 것이 발견되었다(도 12 및 도 13). 특히, 실제 해석에서 사용할 가능성이 높은 3000 리드 이상의 플롯에서는 상관 계수도 매우 높다. DE50 지수에 대해 α쇄는 y=1892.344x^(-0.8239), β쇄는 y=993.116x^(-0.8072)와 근사하는 것이 가능하다(x=리드수, y=DE50 지수의 문턱값)(도 14). 따라서, 어떤 리드수에 대해 산출된 DE50 지수를 상기 관계로부터 도출되는 그 리드수에서의 DE50 지수의 문턱값과 비교함으로써 피험체의 응답성을 평가하는 것이 가능하다고 생각된다.
다른 DE 지수에 대해서는 이하와 같이 근사하는 것이 가능하다.
Figure pct00051
(x=리드수, y=DE 지수의 문턱값)
이러한 직선 관계가 적용되는 범위를 검토하기 위해 이들 fitting curve에 대한 95% 신뢰성 구간을 계산하였다. 계산된 95% 신뢰성 구간은 하기 표 37에 나타낸다.
Figure pct00052
나아가 각 포인트의 데이터(값)가 10% 변동한 경우에 최대와 최소값에서 어느 정도 Slope와 intercept가 변동하는지를 구하였다. 결과는 이하의 표 38에 나타난다.
Figure pct00053
또한, 유효자의 판정에 관해 유효 환자의 최소값 및/또는 비유효 환자의 최대값을 문턱값으로서 이용할 수 있고, 이러한 값의 리드수에 대한 직선적인 변동에 대해서도 검토하였다. Res_Min 이상에서는 유효, NonRes_Max 이하에서는 비유효라는 사용 구분도 가능하다. 변동 결과는 이하의 표 39에 나타난다.
Figure pct00054
(실시예 3: 면역 억제 분자 발현 T세포 분획에서의 TCR 다양성)
(1. 재료와 방법)
1. 말초혈 단핵구 세포(PBMC)의 분리
1예의 항PD-1 항체(nivolumab, 옵디보) 치료 유효 환자의 전혈을 헤파린 함유 채혈관에 20mL 채취하였다. Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)를 이용한 비중 원심 분리에 의해 PBMC를 분리하고 혈구계수반에서 세포수를 카운트하였다. 단리된 PBMC는 세포용 동결 보존액 STEM-CELLBANKER(TaKaRa Bio)에 현탁하여 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.
2. PBMC의 항체 염색
PBMC는 하기의 순서에 따라 면역 염색하였다.
2.1 동결 보관한 PBMC를 용해하고, 표 41에 나타나는 세포수를 Stain Buffer에 현탁하였다.
2.2 STEM-CELLBANKER를 제거하기 위해 Stain Buffer로 현탁 후 800×g로 5분간 4℃에서 원심하여 2회 세정하였다.
2.3 세포를 Stain buffer에 현탁하고, 하기 표 40의 항체를 첨부 설명서의 지시에 따라 첨가하여 차광, 실온에서 30분간 세포와 반응시켰다.
Figure pct00055
2.4 세정 후 100μL의 Stain buffer에 현탁하여 5μL의 7-AAD를 첨가하고 차광하 실온에서 10분간 반응시켰다.
2.5 세포에 500μL의 Stain buffer를 더하고 여과를 행한 후, BD FACSAria III 셀 소터(BD Bioscience) 혹은 FACSMelody 셀 소터(BD Bioscience)를 이용하여 상기 소트 분획을 소팅 분리하였다.
2.6 소팅 분획은 800×g, 5분간, 4℃에서 원심함으로써 회수하였다.
2.7 상청을 250μl 남기고 제거 후, Trizol LS 시약(Invitrogen)을 750μl 더하고 피펫팅하여 세포를 용해하였다.
2.8 RNA 추출 후의 TCR 레퍼토리 해석은 실시예 1의 「1.3. RNA 추출」, 「1.4. 상보적 DNA 및 이본쇄 상보적 DNA의 합성」 및 「1.5. PCR」의 방법에 따라 실시하였다.
2.9 항체 염색 후, 2mL의 Stain buffer에 현탁하여 800×g, 5분간 4℃에서 원심 후 상청을 버림으로써 2회 세정하였다.
(2. 결과)
CD8+PD1+, CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 및 CD8+CTLA4+ T세포 분획의 림프구에 차지하는 비율(%)과 FACS 소팅에 의해 회수된 세포수를 표 41에 나타내었다. CD8과 각 분자 마커를 공발현하는 약 1×104~1×105의 T세포를 회수하고, 이들 T세포 분획으로부터 RNA를 추출하여 정법에 따라 TCR 레퍼토리 해석을 행하였다. TCR 시퀀스 해석의 결과, 각 시료로부터 얻어진 전체 리드수, 유니크 리드수, In-frame 리드수를 표 42 및 표 43에 나타내었다. 모든 시료에서 10만 리드 이상의 리드를 획득할 수 있었다.
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
(각 T세포 분획 사이의 TCR 레퍼토리의 공통성)
TCR 레퍼토리 해석에 의해 획득된 TCR 클론의 서열에 대해 CD8P+PD1+, CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 및 CD8+CTLA4+ T세포 분획 사이에서 공통되는 클론을 비교하였다. 모든 분획 사이 혹은 복수의 분획 사이에 공통적으로 존재하는 TCR 클론을 표 44에 나타내었다. CD8+PD-1+ 분획에 고빈도로 존재하는 TCR 클론은 CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 혹은 CD8+CTLA4+ 분획에도 고빈도로 존재하는 것이 명백해졌다. 이는 CD8+PD-1+ T세포가 4-1BB, TIM3, OX40, TIGIT 혹은 CTLA4 분자를 공발현하고 있을 가능성을 시사하였다. 또한, TCR 클론의 리드수에 대해 각 T세포 분획 사이의 상관을 조사하였다(도 15). 고빈도로 존재하는 TCR 클론은 공통적으로 각 T세포 분획에 존재하여 높은 상관을 나타내었다. 다음으로 CD8+PD-1+ T세포와 CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 혹은 CD8+CTLA4+ T세포의 사이에서 공통되는 TCR 클론의 리드의 비율을 조사하였다(표 45). CD8+PD-1+의 TCR 클론이 각 분획에 차지하는 리드의 비율은 대조의 CD8+ T세포에 비해 명백하게 CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 혹은 CD8+CTLA4+ T세포에서 높았다. 이는 CD8+PD-1+ T세포에 함유되는 종양 특이적 T세포의 종양 특이적 TCR이 4-1BB, TIM3, OX40, TIGIT 또는 CTLA-4 양성의 T세포 분획에도 고빈도로 포함되는 것을 시사하였다. 이로부터 말초혈 중의 CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+, CD8+CTLA4+의 어떤 T세포 분획도 TCR 다양성에 의한 바이오마커로서 이용할 수 있는 것으로 기대된다.
Figure pct00059
Figure pct00060
치료 유효 환자의 PBMC로부터 FACS 소트에 의해 분리된 CD8+PD1+, CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 및 CD8+CTLA4+ 분획에 대해 TCR 레퍼토리 해석을 실시하여 Shannon 지수, Normalized Shannon 지수, Inverse Simpson 지수, DE50 지수를 산출하였다. 그 결과, CD8+PD1+ T세포의 다양성 지수는 동일한 환자의 CD8+4-1BB+, CD8+TIM3+, CD8+OX40+, CD8+TIGIT+ 혹은 CD8+CTLA4+ T세포와 동일한 정도의 다양도를 나타내었다. 또한, 어떤 분획도 치료 유효 환자(N=6)의 CD8+PD-1+ T세포와 동일한 정도로 비유효 환자(N=6)의 CD8+PD-1+ T세포보다 명백하게 높은 다양성 지수를 나타내었다(도 16 및 도 17). 이로부터 CD8+PD1+ T세포에 한정하지 않고, 4-1BB+, TIM3+, OX40+, TIGIT+ 혹은 CTLA4+ 등의 T세포 표면 마커를 갖는 CD8+ T세포를 해석함으로써 면역 체크포인트 저해약의 치료 효과 예측의 바이오마커로서 이용할 수 있다고 기대된다.
(주기)
이상과 같이 본 발명의 바람직한 실시형태를 이용하여 본 발명을 예시하였지만, 본 발명은 청구범위에 의해서만 그 범위가 해석되어야 하는 것이 이해된다. 본 명세서에서 인용한 특허, 특허출원 및 문헌은 그 내용 자체가 구체적으로 본 명세서에 기재되어 있는 것과 같이 그 내용이 본 명세서에 대한 참고로서 원용되어야 하는 것이 이해된다.
시료 채취가 용이한 말초혈 세포에서의 TCR 레퍼토리 해석을 행하여 얻어진 다양성 지표는 암 면역요법의 효과 예측을 위한 바이오마커로서 이용 가능하다.
서열표 프리텍스트
서열번호 1: BSL-18E 프라이머
서열번호 2: P20EA 프라이머
서열번호 3: P10EA 프라이머
서열번호 4: P22EA-ST1-R 프라이머
서열번호 5: CA1 프라이머
서열번호 6: CA2 프라이머
서열번호 7: CA-ST1-R 프라이머
서열번호 8: CB1 프라이머
서열번호 9: CB2 프라이머
서열번호 10: CB-ST1-R 프라이머
서열번호 11~60: 실시예 3에서의 각 TCRβ쇄 클론의 CDR3 서열
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Cys Ala Ser Ser Pro Ala Pro Thr Phe Leu Gly Ser Tyr Asn Glu Gln 1 5 10 15 Phe Phe <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Cys Ala Ser Asn Pro Val Pro Thr Phe Leu Gly Ser Tyr Asn Glu Gln 1 5 10 15 Phe Phe <210> 55 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Cys Ala Asn Ser Pro Leu Ala Gly Val Ala Tyr Asn Glu Gln Phe Phe 1 5 10 15 <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Cys Ala Ser Ser Pro Val Ser Thr Phe Leu Gly Ser Tyr Asn Glu Gln 1 5 10 15 Phe Phe <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Cys Ala Ser Ser Pro Val Pro Thr Phe Pro Gly Ser Tyr Asn Glu Gln 1 5 10 15 Phe Phe <210> 58 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Cys Ala Ser Ser Pro Asp Pro Thr Phe Leu Gly Ser Tyr Asn Glu Gln 1 5 10 15 Phe Phe <210> 59 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Cys Ala Ser Ser Pro Leu Ala Gly Val Ala Tyr Asn Gly Gln Phe Phe 1 5 10 15 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Cys Ala Ser Ser Pro Leu Ala Gly Gly Ala Tyr Asn Glu Gln Phe Phe 1 5 10 15

Claims (40)

  1. 피험체의 T세포의 T세포 수용체(TCR) 다양성을 그 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성의 지표로서 이용하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 T세포가 CD8+이며, 또한 하나 이상의 T세포 억제계 세포 표면 마커가 양성인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 T세포가 CD8+이며, 또한 하나 이상의 T세포 자극계 세포 표면 마커가 양성인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 T세포가 CD8+이며, 또한 PD-1, CD28, CD154(CD40L), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), CD27, CD152(CTLA-4), CD366(TIM-3), CD223(LAG-3), CD272(BTLA), CD226(DNAM-1), TIGIT 및 CD367(GITR)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포 표면 마커가 양성인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 T세포가 CD8+PD-1+T세포인 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T세포가 상기 피험체의 말초혈 중의 T세포인 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암 면역요법이 면역 체크포인트 저해제의 투여를 포함하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 저해제가 PD-1 저해제인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 PD-1 저해제가 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙인 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR 다양성이 Shannon 지수, Simpson 지수, 역Simpson 지수, 표준화 Shannon 지수, Unique50 지수, DE30 지수, DE80 지수 또는 DE50 지수로 나타나는 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR 다양성이 DE50 지수로 나타나는 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR이 TCRα인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    이하의 표:
    [표 46]
    Figure pct00061

    에 기재되는 리드수 중 어느 하나로 표준화한 상기 피험체의 DE50 지수가 그 표에 기재되는 그 리드수에 대응하는 문턱값 이상인 경우 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나거나, 또는 상기 문턱값 미만인 경우 그 피험체가 비유효 환자인 것이 나타나는 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR이 TCRβ인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    이하의 표:
    [표 47]
    Figure pct00062

    에 기재되는 리드수 중 어느 하나로 표준화한 상기 피험체의 DE50 지수가 그 표에 기재되는 그 리드수에 대응하는 문턱값 이상인 경우 그 피험체가 유효 환자인 것이 나타나거나, 또는 상기 문턱값 미만인 경우 그 피험체가 비유효 환자인 것이 나타나는 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험체의 말초혈 샘플로부터 CD8+PD-1+ T세포를 단리하는 공정과,
    이 CD8+PD-1+ T세포의 TCR 다양성을 결정하는 공정을 더 포함하는 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR 다양성이 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 결정되는 방법.
  18. 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 조성물로서, T세포의 TCR 다양성이 높은 피험체에서 암을 치료하기 위한 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 T세포가 CD8+이며, 또한 하나 이상의 T세포 억제계 세포 표면 마커가 양성인 조성물.
  20. 청구항 18에 있어서,
    상기 T세포가 CD8+이며, 또한 하나 이상의 T세포 자극계 세포 표면 마커가 양성인 조성물.
  21. 청구항 18에 있어서,
    상기 T세포가 CD8+이며, 또한 PD-1, CD28, CD154(CD40L), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), CD27, CD152(CTLA-4), CD366(TIM-3), CD223(LAG-3), CD272(BTLA), CD226(DNAM-1), TIGIT 및 CD367(GITR)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포 표면 마커가 양성인 조성물.
  22. 청구항 18에 있어서,
    상기 T세포가 CD8+PD-1+ T세포인 조성물.
  23. 청구항 18 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T세포가 상기 피험체의 말초혈 중의 T세포인 조성물.
  24. 청구항 18 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 저해제가 PD-1 저해제인 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 PD-1 저해제가 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙인 조성물.
  26. 청구항 18 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험체의 T세포의 TCR 다양성이 Shannon 지수, Simpson 지수, 역Simpson 지수, 표준화 Shannon 지수, Unique50 지수, DE30 지수, DE80 지수 또는 DE50 지수로 나타나는 조성물.
  27. 청구항 18 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험체의 T세포의 TCR 다양성이 DE50 지수로 나타나는 조성물.
  28. 청구항 18 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR이 TCRα인 조성물.
  29. 청구항 28에 있어서,
    이하의 표:
    [표 48]
    Figure pct00063

    에 기재되는 리드수 중 어느 하나로 표준화한 상기 피험체의 DE50 지수가 그 표에 기재되는 그 리드수에 대응하는 문턱값 이상인 조성물.
  30. 청구항 18 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR이 TCRβ인 조성물.
  31. 청구항 30에 있어서,
    이하의 표:
    [표 49]
    Figure pct00064

    에 기재되는 리드수 중 어느 하나로 표준화한 상기 피험체의 DE50 지수가 그 표에 기재되는 그 리드수에 대응하는 문턱값 이상인 조성물.
  32. 청구항 18 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험체의 TCR 다양성이 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 결정되는 조성물.
  33. 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하는 방법으로서,
    in vitro로 그 피험체의 T세포의 TCR 다양성을 측정하는 공정과,
    상기 TCR 다양성이 높은 경우 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 좋다고 판정하거나, 또는 상기 TCR 다양성이 낮은 경우 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 나쁘다고 판정하는 공정을 포함하는 방법.
  34. 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하는 방법으로서,
    그 피험체로부터 말초혈 샘플을 얻는 공정과,
    그 피험체의 말초혈 중의 T세포의 TCR 다양성을 대규모 고효율 TCR 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 측정하는 공정과,
    상기 TCR 다양성이 높은 경우 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 좋다고 판정하거나, 또는 상기 TCR 다양성이 낮은 경우 그 피험체가 암 면역요법에 대해 응답성이 나쁘다고 판정하는 공정을 포함하는 방법.
  35. 피험체의 암 면역요법에 대한 응답성을 진단하여 그 피험체의 암을 치료하는 방법으로서,
    그 피험체로부터 말초혈 샘플을 얻는 공정과,
    그 피험체의 말초혈 중의 T세포의 TCR 다양성을 측정하는 공정과,
    상기 TCR 다양성이 기준값보다 높은 경우 그 피험체에 암 면역요법을 실시하는 공정을 포함하는 방법.
  36. 대규모 고효율 레퍼토리 해석을 포함하는 방법에 의해 결정된 레퍼토리의 다양성을 피험체의 치료에 대한 응답성의 지표로서 이용하는 방법.
  37. 청구항 36에 있어서,
    상기 치료는 면역 반응에 관련된 치료인 방법.
  38. 청구항 36 또는 청구항 37에 있어서,
    상기 레퍼토리 해석은 TCR 레퍼토리 해석인 방법.
  39. 상기 피험체의 TCR 다양성을 나타내는 다양성 지수가 문턱값 이상인 것은 그 피험체가 유효 환자인 것의 지표이거나, 또는 상기 다양성 지수가 문턱값 미만인 것은 그 피험체가 비유효 환자인 것의 지표인 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 기재된 방법으로서, 상기 문턱값이 ROC 해석에 기초하여 정해지거나 감도에 기초하여 정해지거나 또는 특이도에 기초하여 결정된 것인 방법.
  40. 상기 피험체의 TCR 다양성을 나타내는 다양성 지수가 문턱값 이상인 것은 그 피험체가 유효 환자인 것의 지표이거나, 또는 상기 다양성 지수가 문턱값 미만인 것은 그 피험체가 비유효 환자인 것의 지표인 청구항 1 내지 청구항 17 또는 청구항 39 중 어느 한 항에 기재된 방법으로서, 상기 문턱값이 그 피험체의 다양성 지수의 산출에 이용된 리드수에 대해 표준화된 것인 방법.
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