KR20190117681A - Her3 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체 - Google Patents

Her3 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HER3 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 서열번호 1의 제1폴리펩타이드, 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드, 서열번호 3 및 5로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드, 및 서열번호 4 및 6으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함함으로써 면역세포의 HER3-양성 세포에 대한 특이적 유도(engaging) 효과가 우수하고, HER3-양성 세포의 성장 억제 및 사멸 효과가 우수하며, 비특이적 세포 독성에 의한 부작용을 유발하지 않는 항체에 관한 것이다.

Description

HER3 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체
본 발명은 HER3 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
대부분의 인체 암은 특정 암유전자 및 암 억제 유전자의 변이만으로 발생하지 않으며 여러 과정의 다양한 유전적 변화를 동반한다. 인간 게놈 프로젝트 (human genome project)의 결과로 암 환자의 혈청이나 암조직으로 cDNA 마이크로어레이 (microarray)를 이용하여 다양한 유전자들의 변화를 신속하고 경제적으로 분석할 수 있게 되었다.
그러나 유전자 분석의 결과를 이용하여 동정한 여러 유전자들의 증폭 또는 결손이 특정 질환에 관여하는가의 여부는 일정 모수 이상의 동일 질환에서 특정 유전자의 발현 변화를 분석하여 확인하는 것이 필수 과정이다. 이러한 과정을 거쳐 특정 암질환에 관여하는 것이 확인된 유전자는 암의 진단뿐 아니라 치료 약제의 개발에도 이용되고 있다.
암 치료를 위해 수술, 방사선 치료, 화학요법 등의 다양한 치료법이 개발되어 사용되고 있으나, 항암요법은 독성이 강하여 심각한 부작용 등의 문제점이 있고, 암의 종류 및 환자의 상태에 따라서는 상기 치료법의 적용이 어려운 경우가 있으며, 재발 가능성이 높다는 단점이 있다.
이에 따라, 환자의 면역기능을 이용한 면역치료(immunotherapy)에 대한 관심이 높아지고 있는데, 면역치료는 다양한 기능을 가진 면역세포들의 복잡한 상호작용을 통해 종양을 제거하는 특성을 이용하는 것이다. 암세포를 직접 제거하는 면역세포로는 NK 세포와 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 등이 있으며, 이들 효력세포(effector cell)에게 항원을 제시해 주는 항원제시세포(antigenpresenting cell)로는 수지상세포(dendritic cell, DC)나 B 세포가 있다. 그밖에 각종 사이토카인(cytokine)을 분비하는 보조 T 세포(Helper T cell, Th cell), 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg cell) 등이 함께 관여하게 된다.
CD3은, T 세포 수용체 복합체(TCR)와 관련하여 T 세포 상에 발현되는 동종이량체성 또는 이종이량체성 단백질이고, T 세포 활성화를 위해 요구된다. 기능성 CD3은 4개의 상이한 쇄들: 엡실론, 제타, 델타 및 감마 중 2개의 이량체성 회합으로부터 형성된다. CD3 이량체성 배열로는 감마/엡실론, 델타/엡실론 및 제타/제타가 포함된다.
CD3에 대한 항체는, T 세포 상에 CD3을 클러스터링함으로써 펩타이드-부하된 MHC 분자에 의한 TCR의 연결(engagement)과 유사한 방식으로 T 세포 활성화를 야기하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 항-CD3 항체는, T 세포의 활성화를 포함하는 치료학적 목적을 위해 사용될 수 있다.
한편, 인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3, ErbB3)으로 알려진 ErbB 패밀리의 세 번째 멤버는 1989년에 Kraus 등에 의해 확인되었으며 (Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 9193-9197), 암 성장에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. (Horst et al. (2005) 115, 519-527; Xue et al. (2006) CancerRes. 66, 1418-1426). HER3는 유방암, 폐암 및 골육종 등의 여러가지 암에서 암세포의 성장, 증식, 항암제 내성 및 암 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Cancer Cell 2009 15:353, Oncogene 2001 20, 1465, Nat Med Rev 2007 13(6):675, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jan 15; 105(2):692-7., Science 2007 316, 1039).
HER3 유전자는 EGFR 및 HER2와 현저한 구조적 유사성을 지니는 1342개 아미노산의 단백질을 엔코딩한다. 전체 크기, 2개의 시스테인 클러스터(도메인 II 및 IV)를 갖는 4개의 세포외 서브도메인(I-IV), 및 티로신 키나제 도메인과 같은 특징은 EGFR 및 HER2와 구조적 유사성을 나타낸다 (Cho and Leahy (2002) Science, 297: 1330-1333). HER3의 티로신 키나제 도메인은 EGFR의 티로신 키나제 도메인과 59%의 서열 상동성을 나타낸다 (Brennan et al. (2000) Oncogene, 19: 6093-6101).
이중특이적 항체는 두 가지의 서로 다른 항체에 동시에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 이러한 이중특이적 항체는 면역치료에 있어서 T세포 등의 면역세포가 특정 타겟 세포 (예컨대, 특정 암세포)에 대해서만 독성을 나타내고 그 외의 정상세포들에 대해서는 독성을 나타내지 않게 할 수 있으므로, 치료 효과를 극대화 하면서도 부작용을 최소화할 수 있어 T-세포 매개된 사멸이 요구되는 치료 현장에서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명자들은 CD3 및 HER3에 특이적으로 결합하는 새로운 이중특이적 항체를 개발하고 우수한 항암 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 HER3를 발현하는 세포에 CD3를 발현하는 면역세포를 효과적으로 유도(engaging)하여, HER3-특이적 세포 사멸을 효과적으로 유도할 수 있는 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 HER3 발현, 과발현 및 활성화에 의한 암 또는 암 전이를 효과적으로 예방 또는 치료하기 위한 항체, 항체-약물 접합체, 약학 조성물 및 치료방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 위와 같은 항체를 제조하기 위한 유전자를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
1. 서열번호 1의 제1폴리펩타이드; 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드; 서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드; 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함하는 항체.
2. 위 1에 있어서, 상기 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 상기 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 상기 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 상기 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역인, 항체.
3. 위 1에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및 서열번호 9를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 10을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 11을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 12를 포함하는 제2중쇄, 서열번호 37을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 38을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 39를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 40를 포함하는 제2중쇄, 또는 서열번호 41을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 42를 포함하는 제2중쇄;를 포함하는 것인, 항체.
4. 위 1에 있어서, 상기 항체는 제1경쇄중쇄접합체 및 제2경쇄중쇄접합체를 포함하는 것인, 항체.
5. 위 4에 있어서, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 1의 제1폴리펩타이드 및 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함하는 것인, 항체.
6. 위 5에 있어서, 상기 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 상기 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 상기 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 상기 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역인, 항체.
7. 위 4에 있어서, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 9를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 10을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 11을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 12를 포함하는 제2중쇄, 서열번호 37을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 38을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 39를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 40를 포함하는 제2중쇄, 또는 서열번호 41을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 42를 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것인, 항체.
8. 위 4에 있어서, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 13을 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 14, 15, 43, 44 및 45로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 것인, 항체.
9. 위 4에 있어서, 상기 제1경쇄중쇄접합체 및 상기 제2경쇄중쇄접합체는 놉-인투-홀(knob-into-hole)로 결합된 것인, 항체.
10. 위 1에 있어서, 상기 항체는 HER3의 세포외 도메인 및 CD3의 엡실론 도메인에 결합하는 것인, 항체.
11. 위 1 내지 10 중 어느 하나의 항체와 약물이 결합된 항체-약물 접합체.
12. 위 11에 있어서, 상기 약물은 독소, 화학요법제, 항암제, 항생제, ADP-라이보실 트랜스퍼라제(ADP-ribosyl transferase), 핵산 분해 효소, 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, DNA 인터컬레이터, 단백질제제, miRNA, shRNA, siRNA, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인, 항체-약물 접합체.
13. 위 11에 있어서, 상기 약물은 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065(세포독성화합물), 칼리케아미신 및 다른 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈데신, 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 다우노마이신, 에토포시드, 테니포시드, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드, 그의 입체이성질체, 동배체, 동족체 또는 유도체, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 기타 삽입제인 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산 분해 효소, 항생제, 독소(세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소), 시스플라틴, CPT-11, 독소루비신, 파클리탁셀 및 도세탁셀로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인, 항체-약물 접합체.
14. 위 1 내지 10 중 어느 하나의 항체를 포함하는 암 또는 암 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
15. 위 14에 있어서, 상기 암은 HER3-양성 고형암 및 전이암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
16. 위 14에 있어서, 상기 암은 HER3-양성 위암, 유방암, 폐암, 식도암, 갑상선, 두경부암, 췌장암, 대장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
17. 위 14에 있어서, 상기 항체는 독소, 화학요법제, 항암제, 항생제, ADP-라이보실 트랜스퍼라제(ADP-ribosyl transferase), 핵산 분해 효소, 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, DNA 인터컬레이터, 단백질제제, miRNA, shRNA, siRNA, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나와 결합된 것인, 약학 조성물.
18. 위 14에 있어서, 상기 항체는 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065(세포독성화합물), 칼리케아미신 및 다른 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈데신, 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 다우노마이신, 에토포시드, 테니포시드, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드, 그의 입체이성질체, 동배체, 동족체 또는 유도체, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 기타 삽입제인 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산 분해 효소, 항생제, 독소(세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소), 시스플라틴, CPT-11, 독소루비신, 파클리탁셀 및 도세탁셀로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나와 결합된 것인, 약학 조성물.
19. 서열번호 16 내지 30, 및 46 내지 60으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자.
본 발명에 따른 항체는 HER3에 높은 특이성 및 높은 결합력으로 결합하는 동시에 CD3에 높은 특이성 및 높은 결합력으로 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 HER3를 발현하는 세포의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 HER3를 발현하는 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 암세포의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 암세포의 증식 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 HER3-양성 고형암 및 전이암의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 HER3-양성 고형암 및 전이암의 증식 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 항암제에 내성을 갖는 HER3-양성 고형암 및 전이암 세포의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 항암제에 내성을 갖는 HER3-양성 고형암 및 전이암의 증식 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 HER3-양성 암세포가 존재하는 조건에서만, HER3-양성 암세포에 대해서만 특이적으로 높은 수준의 세포 사멸 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 비특이적 세포 독성 (예컨대, 항체-의존적 세포 독성)에 의한 부작용을 유발하지 않을 수 있다.
도 1은 HER3 표적 항체를 발현 후 사이즈 배제 크로마토그래피로 정제하는 과정을 보여준다.
도 2는 CD3 표적 항체를 발현 후 사이즈 배제 크로마토그래피로 정제하는 과정을 보여준다.
도 3은 HER3/CD3 이중표적항체를 발현 후 사이즈 배제 크로마토그래피로 정제하는 과정을 보여준다.
도 4는 정제된 HER3/CD3 이중항체가 HER3 항체 절편 또는 CD3 항체 절편을 포함하지 않음을 보여준다.
도 5 는 SNU719, BT-20, T47D, MDA-MB-453의 암세포주에서 HER3의 상대적 발현량을 보여준다.
도 6은 IgG 형태의 카이메릭 OKT3 항체, Hu38 항체, A15, E15, A07 항체와 이중 항체로 제작한 Y1103/cOKT3-LALA, Y1103/Hu38-LALA, Y1103/A15-LALA, Y1103/E15-LALA, Y1103/A07-LALA의 H9세포주에 대한 결합 양상을 보여준다.도 7은 실시예 4에 따른 T세포관여항체 후보의 인비트로 세포 사멸 효능 평가 실험을 나타내는 개요도이다.도 8은 실시예 4에 따른 Y1103/Hu38-LALA, Y1103/A15-LALA, Y1103/E15-LALA의 인비트로 세포 사멸 효능을 나타낸다.
도 9는 실시예 4에 따른 Y1103/Hu38-LALA와 Y1103/OKT3-LALA의 인비트로 세포 사멸 효능을 나타낸다.
도 10은 HER3/CD3 이중항체에 의한 MDA-MB-453, T47D에서 T cell activation을 나타낸다.
본 발명은 HER3 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 서열번호 1의 제1폴리펩타이드; 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드; 서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드; 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함함으로써 면역세포의 HER3-양성 세포에 대한 특이적 유도(engaging) 효과가 우수하고, HER3-양성 세포의 성장 억제 및 사멸 효과가 우수하며, 비특이적 세포 독성에 의한 부작용을 유발하지 않는 항체에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 항체는, 서열번호 1의 제1폴리펩타이드; 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드; 서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드; 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 항체는 HER3에 특이적으로 결합하는 동시에 CD3에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항체는 HER3에 특이적으로 결합하는 항원결합부와 CD3에 특이적으로 결합하는 항원결합부를 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 제1폴리펩타이드 및 제2폴리펩타이드는 HER3에 대해 특이적으로 결합하는 항원결합부를 형성할 수 있으며, 제3폴리펩타이드 및 제4폴리펩타이드는 CD3에 대해 특이적으로 결합하는 항원결합부를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항체의 제1 내지 제4폴리펩타이드는 각각 항체의 경쇄가변영역 또는 중쇄가변영역일 수 있다.
예컨대, 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역일 수 있다.
또한 예컨대, 제1폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 제2폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역일 수 있다.
또한 예컨대, 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 제3폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역이고, 제4폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역일 수 있다.
또한 예컨대, 제1폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 제2폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 제3폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역이고, 제4폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1경쇄가변영역과 제1중쇄가변영역은 각각 별도의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 것일 수도 있고 (예컨대, 일반적인 IgG의 형태), 하나의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 것일 수도 있다 (예컨대, 경쇄중쇄접합체 또는 단일사슬항체절편(ScFv)의 형태). 경쇄중쇄접합체는 경쇄와 중쇄가 하나의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 것일 수 있다. 단일사슬항체절편은 경쇄가변영역과 중쇄가변영역이 하나의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 것일 수 있다.
제1경쇄가변영역과 제1중쇄가변영역이 각각 별도의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 경우, 제1경쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드 사슬과 제1중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 서로 이황화결합 등으로 결합될 수 있다.
제1경쇄가변영역과 제1중쇄가변영역이 하나의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 경우, 제1경쇄가변영역과 제1중쇄가변영역은 직접 연결되거나, 링커에 의해 연결되거나, 그 외 추가적인 폴리펩타이드 서열에 의해 연결될 수 있다.
제2경쇄가변영역과 제2중쇄가변영역은 각각 별도의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 것일 수도 있고 (예컨대, 일반적인 IgG의 형태), 하나의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 것일 수도 있다 (예컨대, 경쇄중쇄접합체 또는 단일사슬항체절편(ScFv)의 형태).
제2경쇄가변영역과 제2중쇄가변영역이 각각 별도의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 경우, 제2경쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드 사슬과 제2중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 서로 이황화결합 등으로 결합될 수 있다.
제2경쇄가변영역과 제2중쇄가변영역이 하나의 폴리펩타이드 사슬에 포함되는 경우, 제2경쇄가변영역과 제2중쇄가변영역은 직접 연결되거나, 링커에 의해 연결되거나, 그 외 추가적인 폴리펩타이드 서열에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및 서열번호 9를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 10을 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및 서열번호 11을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 12를 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및 서열번호 37을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 38을 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및 서열번호 39를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 40을 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및 서열번호 41을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 42를 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항체는 제1경쇄중쇄접합체 및 제2경쇄중쇄접합체를 포함하는 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 1의 제1폴리펩타이드 및 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제1 내지 제4폴리펩타이드는 각각 항체의 경쇄가변영역 또는 중쇄가변영역일 수 있다. 예컨대, 상기 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 상기 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 상기 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 상기 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 9를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 10을 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 11을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 12를 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 37을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 38을 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 39를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 40을 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고, 상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 41을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 42를 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1경쇄중쇄접합체와 제2경쇄중쇄접합체는 서로 이황화결합 또는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 등으로 결합될 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면 제1경쇄중쇄접합체와 제2경쇄중쇄접합체는 서로 놉-인투-홀(knob-into-hole)로 결합될 수 있다. 놉-인투-홀(knob-into-hole)로 결합되는 경우, 제1경쇄중쇄접합체에 놉(knob)이 형성되고 제2경쇄중쇄접합체에 홀(hole)이 형성될 수 있으며, 보다 구체적인 일 실시예에 따르면 제1경쇄중쇄접합체의 중쇄(예컨대 중쇄불변영역)에 놉이 형성되고 제2경쇄중쇄접합체의 중쇄(예컨대 중쇄불변영역)에 홀이 형성될 수 있다. 제1경쇄중쇄접합체와 제2경쇄중쇄접합체가 이와 같이 놉-인투-홀(knob-into-hole)로 결합되는 경우, 제조 공정에 있어서 제1경쇄중쇄접합체와 제2경쇄중쇄접합체의 이형이합체(heterodimer) 형성 효율이 향상될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항체는 위에 기술한 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역에 더하여 경쇄불변영역 및 중쇄불변영역을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 항체는 제1경쇄가변영역, 제1경쇄불변영역, 제1중쇄가변영역 및 제1중쇄불변영역을 포함하는 것일 수 있다. 제1중쇄불변영역은 2개 이상 (예컨대 3개) 포함될 수 있다. 예컨대, 항체는 제1경쇄가변영역, 제1경쇄불변영역, 제1중쇄가변영역, 제1중쇄불변영역A, 제1중쇄불변영역B 및 제1중쇄불변영역C를 포함하는 것일 수 있다. 또한 예컨대, 항체는 제2경쇄가변영역, 제2경쇄불변영역, 제2중쇄가변영역 및 제2중쇄불변영역을 포함하는 것일 수 있다. 제2중쇄불변영역은 2개 이상 (예컨대 3개) 포함될 수 있다. 예컨대, 항체는 제2경쇄가변영역, 제2경쇄불변영역, 제2중쇄가변영역, 제2중쇄불변영역A, 제2중쇄불변영역B 및 제2중쇄불변영역C를 포함하는 것일 수 있다.
제1경쇄가변영역과 제1중쇄가변영역은 HER3에 특이적으로 결합하는 제1항원결합부를 형성하는 것일 수 있으며, 제2경쇄가변영역과 제2중쇄가변영역은 CD3에 특이적으로 결합하는 제2항원결합부를 형성하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 HER3에 높은 특이성 및 높은 결합력으로 결합하는 동시에 CD3에 높은 특이성 및 높은 결합력으로 결합할 수 있어, CD3를 발현하는 면역세포(예컨대 T세포, 자연살해세포 등)를 HER3를 발현하는 세포(예컨대 암세포)에 효과적으로 표적화(targeting) 또는 유도(engaging)할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 Fc 부분에 LALA 돌연변이 (L243A, L245A)가 존재하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 Fc 부분에 LALA 돌연변이가 존재하는 항체는, 항체-의존적 세포독성 효능 (ADCC, antibody-dependent cell cytotoxicity efficacy)을 나타내지 않아, HER3를 발현 또는 과발현 하는 세포(예컨대, 암세포)가 존재할 때만 해당 암세포에 대해 선택적으로 세포 독성(예컨대 세포 사멸 효능)을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 항체는, HER3를 발현 또는 과발현하는 세포의 사멸을 유도하거나 증식을 억제거나 전이를 억제할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 항체는 암세포의 사멸을 유도하거나, 증식을 억제하거나, 전이를 억제할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 위의 암세포는 HER3-양성 고형암 및 전이암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 암세포일 수 있으며, 예컨대 유방암, 폐암 또는 골육종 세포일 수 있으며, 예컨대 전이성 암세포일 수 있고, 또한 예컨대 항암제에 저항성이 있는 암세포일 수 있다. 위의 항암제는 예컨대 라파티닙 (lapatinib)일 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명에 따른 항체와 약물이 결합된 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate, ADC)를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 약물은 독소, 화학요법제, 항암제, 항생제, ADP-라이보실 트랜스퍼라제(ADP-ribosyl transferase), 핵산 분해 효소, 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, DNA 인터컬레이터, 단백질제제, miRNA, shRNA, siRNA, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적인 일 실시예에 따르면 상기 약물은 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065(세포독성화합물), 칼리케아미신 및 다른 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈데신, 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 다우노마이신, 에토포시드, 테니포시드, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드, 그의 입체이성질체, 동배체, 동족체 또는 유도체, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 기타 삽입제인 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산 분해 효소, 항생제, 독소(세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소), 시스플라틴, CPT-11, 독소루비신, 파클리탁셀 및 도세탁셀로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 방사성 동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 및 186Re 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
구체적인 일 실시예에 따르면 상기 독소는 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프 테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드로부터 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 항체는, 인체에 적용하기 위하여 면역원성을 감소시킨 카이메릭 항체 및 인간화 항체 등으로 전환될 수 있다. 예컨대, 카이메릭 항체는 본 발명의 경쇄가변영역을 인간 항체의 경쇄불변영역 및 중쇄불변영역과 재조합한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 및 항체-약물 접합체를 포함하는 암 또는 암 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한, 상기 항암 조성물은 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물 등이 있다.
본 발명의 약학 조성물은 0.1mg/kg(body) 내지 100mg/kg(body)로 투여될 수 있다. 예컨대, 0.5 mg/kg(body) 내지 50mg/kg(body), 또한 예컨대 1mg/kg(body) 내지 10 mg/kg(body)으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체, 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 약학 조성물을 개체에 유효량으로 투여하여 암 또는 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 예컨대, 유효량은 암 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한 예컨대, 본 발명의 항체, 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 약학 조성물은 그 이외의 약리학적 또는 생리학적 성분과 병용 투여 (예컨대, 동시에 또는 순차적으로 투여)될 수 있으며, 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다.
본 발명에서, "개체"는 본 발명에 따른 항체, 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 약학 조성물을 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물 (예컨대, 인간)일 수 있다.
본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 예컨대, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 신규한 유전자를 제공한다.
본 발명의 유전자는 서열번호 16 내지 30, 및 46 내지 60으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자이다.
서열번호 16 내지 30의 유전자는 서열번호 1 내지 15의 아미노산 서열에 대응되는 뉴클레오티드 서열이고, 서열번호 46 내지 60의 유전자는 서열번호 31 내지 45에 대응되는 뉴클레오티드 서열이다.
전술한 바와 같이, 상기 아미노산 서열들은 항체에 구성요소로서 포함될 수 있는 것들로서, 본 발명의 유전자는 그러한 구성요소들을 코딩하는 유전자이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 예시한 것들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. HER3/CD3 이중특이적 항체 발현, 정제, 분석
1. 항체 발현을 위한 벡터 transfection
1.1. Transfection 수행 24 시간 전에 Expi293F 세포를 2.0X106 cells/㎖로 Expi293 media 를 이용하여 예상 필요량에 맞추어 37℃, 8% CO2 shaking incubator에서 125±10 rpm으로 계대한다.
1.2. Transfection 수행 당일, 세포 수와 세포 생존율(viability)을 측정한다. 세포 생존율은 95% 이상이어야 한다.
1.3. 500 ㎖ 배양 플라스크에 5 X 108cell 을 넣고, Expi293 배지를 첨가하여 최종 170 ㎖ 로 조정한다. (200 ㎖ 기준)
1.4. 200 ㎍의 항체 발현 벡터를 Opti-MEM I 배지를 이용하여 총 1500 ㎕가 되도록 섞어 주고 실온에서 5분간 incubation 한다.
1.5. 540 ㎕의 transfection reagent 를 Opti-MEM I 배지를 이용하여 총 1500 ㎕가 되도록 섞어주고 상온에서 5 분간 incubation 한다.
1.6. 벡터와 transfection reagent가 각각 들어있는 Opti-MEM I 을 부드럽게 섞어주고 20분간 상온에서 반응시킨 후, 미리 준비해 놓은 Expi293F 세포가 있는 플라스크에 넣어준다.
1.7. 37℃, 8% CO2 shacking incubator에서 125±10 rpm으로 16~20 시간 동안 배양한 후에 transfection enhancer I을 1㎖, enhancer II 를 10㎖ 첨가하고, 6일간 배양 후 harvest 한다.
2. Protein A resin을 이용한 항체 정제
2.1. 배양액을 4000 rpm 에서 30분간 원심분리하고, 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 cell debris 를 제거하고 상등액을 얻는다.
2.2. MabselectXtra resin 1 ㎖을 컬럼에 넣고, resin volume 의 10배에 해당하는 Protein A binding buffer 를 이용하여 평형을 수행한다.
2.3. 상등액을 gravity 를 이용하여 컬럼에 loading 한다.
2.4. Loading 이 끝나면 resin volume 의 10배에 해당하는 Protein A binding buffer 를 이용하여 컬럼을 washing 한다.
2.5. IgG elution buffer 를 컬럼에 elution 수행하여, Eppen tube 에 1 ㎖씩 분취하여, 1.5M Tris-Cl 을 eluate 1 ㎖ 당 25 ㎕를 넣어 중화한 후, OD 280 nm 에서 농도를 측정한다.
2.6. 농도가 측정된 eluate 는 dialysis 를 통해 PBS 로 buffer 를 치환하였다.
3. 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용한 항체 정제
3.1. 시료를 약 1.0~2.0 g/L이 되도록 농축 또는 희석하고, 이를 AKTA purifier 900에 장착된 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 컬럼에 로딩한다.
3.2. 이동상은 200 mM의 염화나트륨을 포함하는 20 mM sodium phosphate (pH 7.0)을 사용하고, 유속 1.0 ㎖/min로 흘려주었다. AKTA system의 peak 값을 기준으로 약 50~70분후에 용출되는 피크를 1㎖ 단위로 수집한다. 해당 elution fraction을 4-12% Bis-Tris PAGE를 사용하여 coomassie blue staining을 통해 확인한다. Staining gel의 band pattern을 기준으로 150 kDa의 항체가 포함된 fraction을 모아서 30kDa Amicon 원심 필터 유닛을 사용하여 농축하였다.
4. 이중항체 순도를 확인하기 위한 isoelectric focusing(IEF)
4.1. 정제된 항체 8~10㎍을 샘플버퍼를 사용하여 IEF 젤에 로딩하였다. 러닝은 100V로 1시간, 200V로 1시간, 500V로 30분간 러닝하였다.
4.2. 러닝된 gel은 12% TCA 용액을 이용하여 30분간 단백질을 고착(fixation) 하였다. 이 후 coomassie blue staining solution을 이용하여 30분간 염색한 후 탈색 버퍼를 이용하여 탈색을 한 다음 band intensity를 통해 이중항체의 순도를 계산할 수 있었다.
5. 결과 및 고찰
5.1. HER3 타겟 항체 발현 벡터를 Expi293F에 transfection하여 배양한 상등액으로부터 protein A로 항체를 정제하고, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 시료를 분취한 후 150kDa에 해당하는 단백질 시료만을 취하였다. (도 1)
5.2. CD3 타겟 항체 발현 벡터를 Expi293F에 transfection하여 배양한 상등액으로부터 protein A로 항체를 정제하고, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 시료를 분취한 후 150kDa에 해당하는 단백질 시료만을 취하였다. (도 2)
5.3. HER3 타겟 항체 발현 벡터와 CD3 타겟 항체 발현 벡터를 Expi293F에 transfection하여 배양한 상등액으로부터 protein A로 항체를 정제하고, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 시료를 분취한 후 150kDa에 해당하는 단백질 시료만을 취하였다. (도 3)
5.4. 도면 1, 2, 3에서 얻은 3 종류의 단백질 시료를 IEF gel analysis를 통해 분석한 결과 HER3/CD3 이중항체 시료에는 HER3 항체 절편, 또는 CD3 항체 절편이 거의 없음을 확인하였다. (도 4)
실시예 2. HER3를 발현하는 암종 선별을 위한 flow cytometry 분석
1. FACS analysis
1.1. 5㎖ tube에 2x105cells을 100㎕의 FACS buffer(2% FBS/sheath buffer)에 준비한다.
1.2. 1차 항체를 튜브당 1 ㎍씩 처리하고, 30분간 빛을 차단하고, 4℃에서 incubation한다.
1.3. 3㎖ FACS buffer를 넣어주고, 4℃, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 제거한다.
1.4. 1차 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 형광색소로 표지된 2차 항체를 100㎕의 FACS buffer에 0.2 ㎍씩 처리하고 30분간 빛을 차단하고, 4℃에서 incubation한다.
1.5. 3㎖ FACS buffer를 넣어주고, 4℃, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 제거한다.
1.6. 200㎕의 BD CytofixTM를 넣어주고 cell을 suspension하여 LSR Fortessa로 분석한다.
2. 결과 및 고찰
2.1. SNU719, BT-20, T47D, MDA-MB-453, 총 4종의 암세포주에 대해 HER3 항원의 발현정도를 비교한 결과 BT-20 < SNU719 < T47D < MDA-MB-453순으로 HER3의 발현이 높은 것으로 확인되었다. 그리고 irrelevant control로 사용하는 negative control 항체에 대해서는 4종 세포 모두 binding하지 않았다(도 5).
실시예 3. HER3/CD3 이중특이적 항체의 T 세포에 대한 결합력 분석
H9 (ATCC, HTB-176TM, T lymphoma) 세포주를 이용해 CD3에 대한 항체의 결합력을 평가하고자 하였다.
1. FACS analysis
1.1. 5㎖ tube에 2x105cells을 100㎕의 FACS buffer(2% FBS/sheath buffer)에 준비한다.
1.2. 1차 항체를 튜브당 5, 1, 0.2, 0.04, 0.008 ㎍/mL로 처리하고, 30분간 빛을 차단하고, 4℃에서 incubation한다.
1.3. 3㎖ FACS buffer를 넣어주고, 4℃, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 제거한다.
1.4. 1차 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 형광색소로 표지된 2차 항체를 100㎕의 FACS buffer에 0.2 ㎍씩 처리하고 30분간 빛을 차단하고, 4℃에서 incubation한다.
1.5. 3㎖ FACS buffer를 넣어주고, 4℃, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 제거한다.
1.6. 200㎕의 BD CytofixTM 를 넣어주고 cell을 suspension하여 LSR Fortessa로 분석한다.
2. 결과 및 고찰
2.1. H9세포주에 대하여 IgG 형태의 카이메릭 OKT3 항체, Hu38 항체, A15, E15, A07 항체와 이중 항체로 제작한 Y1103/cOKT3-LALA, Y1103/Hu38-LALA, Y1103/A15-LALA, Y1103/E15-LALA, Y1103/A07-LALA의 결합을 비교한 결과, 이중항체의 CD3에 대한 결합 정도가 Y1103/Hu38에서 가장 높고 Y1103/A15와 Y1103/E15가 다음순서로 높게 나타남을 확인하였다. Y1103/cOKT3의 경우 낮은 결합력을 보였으며, Y1103/A07은 결합력을 거의 보이지 않았다. (도6).
실시예 4. 종양 세포주에 대한 이중특이적 항체의 세포 사멸 효능 평가
본 실험에서는 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cell)와 항 HER3/CD3 이중특이적 항체를 이용하여 HER3+ 종양 세포(MDA-MB-453)에 대해 HER3-특이적 종양 세포 사멸 효능을 확인하고자 하였다 (도 7).
1. 실험방법
1.1. 타겟 세포주 준비
1.1.1. 1x Trypsin-EDTA 용액으로 세포들을 수확(harvest)한 후, 1200 rpm으로 4 ℃에서 5분간 원심분리 하였다.
1.1.2. 상층액을 제거한 후 cRPMI (RPMI, A10491-01+10% FBS+55 μM β-ME)에 재현탁하고, 세포 수를 정량하고, 각 세포주 현탁액을 2x105/㎖로 준비하고, 96-웰 플레이트에 100 ㎕/well씩 넣고, 플레이트들을 37℃ CO2 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다.
1.2. 말초혈액단핵세포 준비
1.2.1. 냉동보존된(Cryopreserved) 말초혈액단핵세포(PBMC)를 37℃ 수조에서 신속하게 녹인 후 50 ㎖ 코니컬 튜브(conical tube)로 옮겨, 튜브를 흔들어주면서 해동 배지(thawing media)(RPMI, 11875-093+10% FBS+55 μM β-ME)를 한 방울씩 점적하여 잘 섞어 주었다.
1.2.2. 1200 rpm으로 4 ℃에서 10분간 원심분리하여, 상층액을 제거하고 30㎖의 해동 배지에 재현탁한 다음, 세포 수를 정량 하였다.
1.2.3. 각 공여자(donor)별로 cRPMI에 현탁 하여 1x106cells/㎖ 농도로 맞추었다.
1.3. 말초혈액단핵세포 및 항체 플레이팅
1.3.1. 각 항체를 cRPMI로 희석한 후 10nM에서부터 1/5씩 희석하여 하루 전에 타겟 세포를 플레이팅한 웰에 처리하였다.
1.3.2. 위에서 준비한 PBMC를 타겟 : PBMC = 1 : 5 비율이 되도록 100 ㎕/well씩 넣어 주고, 37℃, CO2 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다.
1.4. MTT 에세이
1.4.1. 멀티채널마이크로파이펫을 이용해 CBA 에세이용 상층액을 50 ㎕/well씩 덜어내어 96-웰 플레이트에 옮겼다. 그리고, 멀티채널마이크로파이펫을 이용해 CellTiter 96® AQueous One Solution을 30 ㎕/well씩 넣어주었다. 그리고, 37℃ CO2 인큐베이터에서 1~2시간 동안 배양하였다. 그리고, 마이크로플레이트 리더기(Microplate reader)로 측정하였다 (490nm).
2. 결과 및 고찰
2.1. HER3를 발현하는 MDA-MB-453 암세포에 대해 HER3/CD3 이중항체에 의한 HER3 특이적 세포 사멸이 용량 의존적으로(dose dependent) 나타남을 확인하였다(도 8, 9). Irrelevant Ab와 Hu38항체를 연결한 이중항체((-)/Hu38-LALA)는 사멸을 유도하지 않았다.
실시예 5. HER3/CD3 이중항체에 의한 T세포 활성화 분석
HER3-CD3 target 이중항체에 의한 T cell activation 효능을 보기 위해 HER3 발현 암세포주 2종에 대해 IL2-luc2P Jurkat cell line(Promega)을 이용하여 T cell activation 효능을 분석하였다.
1. 실험 방법
1.1. 타겟 세포주 준비 : HER3를 발현하는 유방암 세포주인 MDA-MB-453, T47D 세포를 각각 96 well plate에 well당 3x104 세포로 100㎕ 컬쳐 배지(Culture Medium)를 이용해 깔아주고, 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터(humidified incubator)에서 18시간동안 배양하였다.
1.2. Effector 세포주 준비 : 37℃ 수조에서 2분간 GloResponseTM Frozen Thaw and Use (FTU) IL-2-luc2P Jurkat Effector Cells를 녹이고, 15㎖ 코니컬 원심분리 튜브(conical centrifuge tube)에 4㎖ pre-warmed Assay Medium (10%FBS가 포함된 RPMI medium)을 넣은 후, 녹여놓은 effector cell 1㎖을 첨가해 천천히 섞어주었다.
1.3. 항체와 effector 세포주 처리
1.3.1. 타겟 세포가 깔려있는 96-웰 플레이트에서 배지 75㎕를 제거하고, FTU IL2-Luc2P Jurkat cells을 웰당 1x105세포가 되도록 25㎕를 플레이트에 첨가하였다.
1.3.2. 항체는 1 nM에서부터 1/3씩 희석하여 3X 도즈(dose)를 10 포인트(points) 만들어 준비하였다. 그리고, 위에서 준비한 FTU IL2-Luc2P Jurkat 세포가 포함된 96-웰 플레이트에 준비된 10개 농도의 항체를 1X 도즈(dose)가 되도록 25㎕씩 넣어주었다.
1.3.3. 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터(humidified incubator)에서 5시간동안 인큐베이션 한 후에 인큐베이터에서 꺼내 실온에 맞게 10~15분간 방치하였다. 그리고, Bio-Glo™ 시약을 웰당 75㎕ 씩 넣어주었다. 그리고, 5분간 방치하였다가 GloMax™ Multi 및 멀티웰 플레이트 리더(multiwell plate reader)를 사용하여 측정하였다.
2. 결과 및 고찰
2.1. 실험결과 HER3/CD3 이중항체에 의해 MDA-MB-453, T47D에서 T cell activation을 확인할 수 있었다. Irrelevant Ab와 Hu38을 이용하여 제작한 이중항체는 T cell activation을 유도하지 않았다(도 10). 이는 HER3/CD3 이중표적 항체가 항원특이적으로 암세포와 T 세포를 연결한다는 것을 보여주는 결과라고 생각한다.
<110> Green Cross Corporation Mogam Institute for Biomedical Research <120> Bispecific antibody binding HER3 and CD3 <130> 04004 <150> KR 10-2017-0052449 <151> 2017-04-24 <160> 60 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Y1103-CEW-LALA Variable Light <400> 1 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Asn Lys Ile Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Leu Phe 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Val Gly Ile Pro Glu Arg Ile Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Leu Met Asp Pro 85 90 95 Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Y1103-CEW-LALA Variable Heavy <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr 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ccgtcctggt atcagatggc tccttcaccc tgtatagcaa actgactgtg 1260 gataaaagca gatggcagca gggaaacgtt ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctt 1320 cataatcatt atacccagaa aagccttagt ctgagtcccg gc 1362 <210> 54 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E15-RCVT-LALA Light chain DNA <400> 54 caagcagttg taacacaaga gcctagtctg accgtctctc ccggcggcac cgtgactctt 60 acatgcagaa gttccaccgg agccgtcaca acctcaaatt acgccaactg ggtccagcag 120 aaacccgggc aggccccaag aggattgatc ggcggtacta acaagcgagc accatggacc 180 cccgccagat ttagtggcag ccttctgggc ggcaaagcag cactgacctt atcaggcgcc 240 cagcctgagg atgaggccga gtattattgt gccctgtggt acagcaattt gtgggtattc 300 ggcggcggga cgaaactcac tgttctcggc cagccaaagg ccaaccctac ggtcactctt 360 ttcccgccta gcagtgagga actgcaggca aacaaggcaa cactggtgtg tctgattagc 420 gacttttatc ctggggcggt gactgtggcc tggaaagctg atggctcccc agttaaggcc 480 ggcgtggaaa ccaccaagcc cagcaaacag agcaataata agtatgccgc gtcaagctac 540 ctgagcctta caccagagca atggaaaagc catagatcat acagctgtca agtaacacac 600 gaaggctcca 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gtggtgacag tgccatcaag cagccttgga acgcagactt atatatgtaa cgttaaccac 1380 aagccatcta acactaaagt ggacaaaaag gtcgagccta agagctgtga taagacccac 1440 acatgccccc cctgcccagc ccccgaggcg gctggtggcc ccagtgtttt cctgtttcct 1500 cctaagccta aagacaccct gatgatctca aggacaccgg aggtcacctg tgttgtggtg 1560 gacgtgtccc acgaggaccc agaggtcaag tttaactggt acgtggacgg tgtggaagtt 1620 cataacgcaa aaacaaagcc acgcgaggaa cagtacaatt caacatacag agtggtgtct 1680 gtgctgacag tgctgcacca ggattggctg aatgggaaag agtacaagtg caaggtgtcc 1740 aataaagccc tccccgcccc gattgagaag acaattagca aagctaaagg acagccaaga 1800 gaacctagag tatacaccct ccctccctgc cgggatgagt tgacaaagaa tcaagtgtct 1860 ttaacctgtc tggttaaagg cttctacccc tcggacatcg ctgtggaatg ggaaagcaat 1920 gggcagcccg aaaacaacta taagaccact cctcccgtcc tggtatcaga tggctccttc 1980 accctgtata gcaaactgac tgtggataaa agcagatggc agcagggaaa cgttttcagc 2040 tgctccgtga tgcacgaggc ccttcataat cattataccc agaaaagcct tagtctgagt 2100 cccggc 2106 <210> 59 <211> 2106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E15-RCVT-LALA Light chain and heavy chain fusion DNA <400> 59 caagcagttg taacacaaga gcctagtctg accgtctctc ccggcggcac cgtgactctt 60 acatgcagaa gttccaccgg agccgtcaca acctcaaatt acgccaactg ggtccagcag 120 aaacccgggc aggccccaag aggattgatc ggcggtacta acaagcgagc accatggacc 180 cccgccagat ttagtggcag ccttctgggc ggcaaagcag cactgacctt atcaggcgcc 240 cagcctgagg atgaggccga gtattattgt gccctgtggt acagcaattt gtgggtattc 300 ggcggcggga cgaaactcac tgttctcggc cagccaaagg ccaaccctac ggtcactctt 360 ttcccgccta gcagtgagga actgcaggca aacaaggcaa cactggtgtg tctgattagc 420 gacttttatc ctggggcggt gactgtggcc tggaaagctg atggctcccc agttaaggcc 480 ggcgtggaaa ccaccaagcc cagcaaacag agcaataata agtatgccgc gtcaagctac 540 ctgagcctta caccagagca atggaaaagc catagatcat acagctgtca agtaacacac 600 gaaggctcca ccgtggagaa gacagtggcc cccactgaat gctcgggtgg cggtagtggc 660 ggaggcagcg agggcggcgg aagcgagggc gggggtagcg agggtggcgg cagcgagggc 720 ggcggcagcg gaggcggctc aggcgaagtc caactggtgg agtcaggagg aggcctggtt 780 cagcccggcg gcagcctgaa gctgagctgc gcagcgagcg gattcacatt caacacctac 840 gccatgaact gggttagaca ggcctctggg aaaggattag agtgggtggc cagaattaga 900 agtaagtaca acaattacgc tacttattac gctgactcgg tgaaagatag attcacaatc 960 agcagagacg acagtaagaa tactgcctat ctgcagatga acagcttgaa gactgaagac 1020 acggctgtgt attactgcgt gagacacggc aactttggga attcttacgt gtcttggttt 1080 gcttattggg gccagggcac cttggtgaca gtcagtagcg cctccaccaa gggcccaagc 1140 gtctttccct tagcaccctc gagcaaatcc actagcgggg gcaccgccgc actcggatgt 1200 ctggtgaagg attattttcc tgaacctgtg accgtaagtt ggaatagcgg cgccctgacc 1260 agcggtgttc atacgttccc cgctgtattg caatccagcg gcctctactc actgagcagt 1320 gtggtgacag tgccatcaag cagccttgga acgcagactt atatatgtaa cgttaaccac 1380 aagccatcta acactaaagt ggacaaaaag gtcgagccta agagctgtga taagacccac 1440 acatgccccc cctgcccagc ccccgaggcg gctggtggcc ccagtgtttt cctgtttcct 1500 cctaagccta aagacaccct gatgatctca aggacaccgg aggtcacctg tgttgtggtg 1560 gacgtgtccc acgaggaccc agaggtcaag tttaactggt acgtggacgg tgtggaagtt 1620 cataacgcaa aaacaaagcc acgcgaggaa cagtacaatt caacatacag agtggtgtct 1680 gtgctgacag tgctgcacca ggattggctg aatgggaaag agtacaagtg caaggtgtcc 1740 aataaagccc tccccgcccc gattgagaag acaattagca aagctaaagg acagccaaga 1800 gaacctagag tatacaccct ccctccctgc cgggatgagt tgacaaagaa tcaagtgtct 1860 ttaacctgtc tggttaaagg cttctacccc tcggacatcg ctgtggaatg ggaaagcaat 1920 gggcagcccg aaaacaacta taagaccact cctcccgtcc tggtatcaga tggctccttc 1980 accctgtata gcaaactgac tgtggataaa agcagatggc agcagggaaa cgttttcagc 2040 tgctccgtga tgcacgaggc ccttcataat cattataccc agaaaagcct tagtctgagt 2100 cccggc 2106 <210> 60 <211> 2106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A07-RCVT-LALA Light chain and heavy chain fusion DNA <400> 60 caggcggtgg tgacccagga accatctctc actgtatcac ctggaggaac cgtaaccctt 60 acctgcagat ccagcaccgg ggctgtcaca acaagcaact acgctaattg gtttcagcag 120 aaaccgggcc aagcacctag aggtttaatc ggaggcacga ataaacgggc accttggacg 180 ccagccagat ttagtggttc acttctggga gggaaagcgg ctctgactct gagcggtgca 240 cagccagaag atgaggcgga gtattattgt gctctgtggt acagcaactt gtgggttttt 300 ggtggcggca caaagttgac tgtgctaggg cagccaaagg ctaatcccac tgtcacactg 360 tttcctccct cgagtgagga attgcaggcc aacaaggcta cactggtctg tctgattagc 420 gacttctacc ccggcgctgt gaccgtcgcc tggaaagccg acggttcacc cgtgaaggcc 480 ggagtggaga ccaccaagcc gagcaagcaa agcaataaca aatatgcagc aagcagctac 540 ttaagtctga ccccagaaca atggaagagc catcggtctt atagctgcca agtgacccac 600 gagggctcta ccgtggaaaa gactgttgct cccactgaat gctcgggtgg cggtagtggc 660 ggaggcagcg agggcggcgg aagcgagggc gggggtagcg agggtggcgg cagcgagggc 720 ggcggcagcg gaggcggctc aggcgaagtg cagctggtag agtctggcgg aggcctagtt 780 cagcctgggg gcagcctgaa gttgagctgt gctgccagcg gcttcacctt caacacatac 840 gccatgaatt gggtgcgaca ggcaagcggc aaaggcctgg agtgggtggg aagaattagg 900 agcaaatata acaattacgc cacctattac gccgactcgg tcaaagatag attcaccatc 960 agtagagacg atagcaagaa caccgcctat ctgcagatga actcattaaa aacagaagat 1020 acagccgtgt actactgtgt gagacacgga aactttggca atagctatgt ttcatggttc 1080 gcctattggg gccagggaac tctcgttact gtgtctagcg cctccaccaa gggcccaagc 1140 gtctttccct tagcaccctc gagcaaatcc actagcgggg gcaccgccgc actcggatgt 1200 ctggtgaagg attattttcc tgaacctgtg accgtaagtt ggaatagcgg cgccctgacc 1260 agcggtgttc atacgttccc cgctgtattg caatccagcg gcctctactc actgagcagt 1320 gtggtgacag tgccatcaag cagccttgga acgcagactt atatatgtaa cgttaaccac 1380 aagccatcta acactaaagt ggacaaaaag gtcgagccta agagctgtga taagacccac 1440 acatgccccc cctgcccagc ccccgaggcg gctggtggcc ccagtgtttt cctgtttcct 1500 cctaagccta aagacaccct gatgatctca aggacaccgg aggtcacctg tgttgtggtg 1560 gacgtgtccc acgaggaccc agaggtcaag tttaactggt acgtggacgg tgtggaagtt 1620 cataacgcaa aaacaaagcc acgcgaggaa cagtacaatt caacatacag agtggtgtct 1680 gtgctgacag tgctgcacca ggattggctg aatgggaaag agtacaagtg caaggtgtcc 1740 aataaagccc tccccgcccc gattgagaag acaattagca aagctaaagg acagccaaga 1800 gaacctagag tatacaccct ccctccctgc cgggatgagt tgacaaagaa tcaagtgtct 1860 ttaacctgtc tggttaaagg cttctacccc tcggacatcg ctgtggaatg ggaaagcaat 1920 gggcagcccg aaaacaacta taagaccact cctcccgtcc tggtatcaga tggctccttc 1980 accctgtata gcaaactgac tgtggataaa agcagatggc agcagggaaa cgttttcagc 2040 tgctccgtga tgcacgaggc ccttcataat cattataccc agaaaagcct tagtctgagt 2100 cccggc 2106

Claims (19)

  1. 서열번호 1의 제1폴리펩타이드;
    서열번호 2 의 제2폴리펩타이드;
    서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드; 및
    서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드;
    를 포함하는 항체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 상기 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 상기 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 상기 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역인,
    항체.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체는
    서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄; 및
    서열번호 9를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 10을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 11을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 12를 포함하는 제2중쇄, 서열번호 37을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 38을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 39를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 40를 포함하는 제2중쇄, 또는 서열번호 41을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 42를 포함하는 제2중쇄;
    를 포함하는 것인,
    항체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 제1경쇄중쇄접합체 및 제2경쇄중쇄접합체를 포함하는 것인, 항체.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 1의 제1폴리펩타이드 및 서열번호 2 의 제2폴리펩타이드를 포함하고,
    상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 3, 5, 31, 33, 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 제3폴리펩타이드 및 서열번호 4, 6, 32, 34 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 제4폴리펩타이드를 포함하는 것인,
    항체.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 제1폴리펩타이드는 제1경쇄가변영역이고, 상기 제2폴리펩타이드는 제1중쇄가변영역이고, 상기 제3폴리펩타이드는 제2경쇄가변영역이고, 상기 제4폴리펩타이드는 제2중쇄가변영역인,
    항체.
  7. 청구항 4에 있어서,
    상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 7을 포함하는 제1경쇄 및 서열번호 8을 포함하는 제1중쇄를 포함하고,
    상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 9를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 10을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 11을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 12를 포함하는 제2중쇄, 서열번호 37을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 38을 포함하는 제2중쇄, 서열번호 39를 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 40를 포함하는 제2중쇄, 또는 서열번호 41을 포함하는 제2경쇄 및 서열번호 42를 포함하는 제2중쇄를 포함하는 것인,
    항체.
  8. 청구항 4에 있어서,
    상기 제1경쇄중쇄접합체는 서열번호 13을 포함하고,
    상기 제2경쇄중쇄접합체는 서열번호 14, 15, 43, 44 및 45로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 것인,
    항체.
  9. 청구항 4에 있어서, 상기 제1경쇄중쇄접합체 및 상기 제2경쇄중쇄접합체는 놉-인투-홀(knob-into-hole)로 결합된 것인, 항체.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 HER3의 세포외 도메인 및 CD3의 엡실론 도메인에 결합하는 것인, 항체.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 항체와 약물이 결합된 항체-약물 접합체.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 약물은 독소, 화학요법제, 항암제, 항생제, ADP-라이보실 트랜스퍼라제(ADP-ribosyl transferase), 핵산 분해 효소, 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, DNA 인터컬레이터, 단백질제제, miRNA, shRNA, siRNA, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인, 항체-약물 접합체.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 약물은 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065(세포독성화합물), 칼리케아미신 및 다른 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈데신, 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 다우노마이신, 에토포시드, 테니포시드, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드, 그의 입체이성질체, 동배체, 동족체 또는 유도체, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 기타 삽입제인 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산 분해 효소, 항생제, 독소(세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소), 시스플라틴, CPT-11, 독소루비신, 파클리탁셀 및 도세탁셀로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인, 항체-약물 접합체.
  14. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 암 또는 암 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 암은 HER3-양성 고형암 및 전이암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 암은 HER3-양성 위암, 유방암, 폐암, 식도암, 갑상선, 두경부암, 췌장암, 대장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 항체는 독소, 화학요법제, 항암제, 항생제, ADP-라이보실 트랜스퍼라제(ADP-ribosyl transferase), 핵산 분해 효소, 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, DNA 인터컬레이터, 단백질제제, miRNA, shRNA, siRNA, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나와 결합된 것인, 약학 조성물.
  18. 청구항 14에 있어서, 상기 항체는 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065(세포독성화합물), 칼리케아미신 및 다른 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈데신, 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 다우노마이신, 에토포시드, 테니포시드, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드, 그의 입체이성질체, 동배체, 동족체 또는 유도체, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 기타 삽입제인 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산 분해 효소, 항생제, 독소(세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소), 시스플라틴, CPT-11, 독소루비신, 파클리탁셀 및 도세탁셀로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나와 결합된 것인, 약학 조성물.
  19. 서열번호 16 내지 30, 및 46 내지 60으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자.
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