KR20190113094A - MicroRNA-4732-5p for diagnosing or predicting recurrence of colorectal cancer and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 대장암 진단 또는 재발 예후 예측을 위한 마이크로RNA-4732-5p 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 대장암을 진단하거나 대장암 재발을 예측할 수 있는 마이크로RNA-4732-5p를 포함하는 마커 조성물, 상기 마이크로RNA-4732-5p의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단 또는 재발 예후 예측용 조성물 및 키트, 상기 마커를 이용하여 대장암을 진단하거나 재발 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to microRNA-4732-5p and its use for diagnosing colorectal cancer or predicting recurrence prognosis, and more particularly, a marker comprising microRNA-4732-5p that can diagnose colorectal cancer or predict colorectal cancer recurrence. A composition and kit for diagnosing or predicting recurrence prognosis for colorectal cancer, comprising a composition, an agent for measuring the expression level of the microRNA-4732-5p, and a method for diagnosing colorectal cancer or predicting a recurrence prognosis using the marker. .
대장암(colorectal cancer)이란 대장에 생긴 암세포로 이루어진 악성종양으로, 대장은 파이프 모양의 관으로 안쪽에서부터 점막층, 점막하층, 근육층, 장막층 등 4개의 층으로 나뉘어져 있는데, 대부분의 대장암은 대장의 점막에서 발생하는 선암이며, 이 외에도 림프종, 육종, 편평상피암, 다른 암의 전이성 병변 등이 있다. 대장암은 전 세계에서 세 번째로 많이 발병하는 암으로 연간 100만 건 이상이 발병하는 것으로 알려져 있고, 국내에서도 2015년 기준 남녀 전체에서 암 발생률 2위, 2016년 기준 암 사망률 3위를 기록하였으며, 사망 환자의 대부분은 전이에 의한 것으로 알려져 있다. 대장암은 초기에 진단이 될 경우 5년 생존율이 90%에 달하지만 초기 대장암은 아무런 증상이 없어 3, 4기로 진행된 후에야 발견되는 경우가 많고 s자 결장경이나 대장내시경 등을 통해서 진단해야하므로 조기진단에 많은 어려움이 있다. 또한, 대장암 수술을 받은 후 약 40%의 환자에서 대부분 2~3년 내에 원래 암이 있던 부위 또는 간, 폐, 골수 등에 재발이 나타난다고 보고되어 있다. 따라서 보다 간편하고 효율적인 대장암 검사를 통해 조기에 진단하는 것이 무엇보다 중요하며, 대장암 수술 후에도 재발여부를 쉽고 효율적으로 진단하는 것 또한 중요하다. Colorectal cancer is a malignant tumor consisting of cancerous cells of the large intestine. The large intestine is a pipe-shaped tube, which is divided into four layers from the inside to the mucosal layer, the submucosal layer, the muscle layer, and the mesenteric layer. Adenocarcinoma that occurs in the mucous membrane, including lymphoma, sarcoma, squamous cell carcinoma, metastatic lesions of other cancers. Colorectal cancer is the third most common cancer in the world, and it is known to cause more than 1 million cases annually.In Korea, it recorded the second highest cancer incidence rate among men and women in 2015 and the third highest cancer mortality rate in 2016. Most of the deceased patients are known to be metastasized. Colorectal cancer is diagnosed at an early stage, and the 5-year survival rate reaches 90%, but early colorectal cancer has no symptoms, so it is often detected only after the 3rd and 4th stages, and should be diagnosed through S-colon or colonoscopy. There are many difficulties in diagnosis. In addition, in about 40% of patients after surgery for colorectal cancer, recurrence has been reported in most of the original cancer site, liver, lung, bone marrow, etc. within 2 to 3 years. Therefore, it is important to diagnose early through a simpler and more efficient colon cancer test, and it is also important to easily and efficiently diagnose recurrence after colon cancer surgery.
현재까지 대장 내시경의 침습성, 고비용, 위험 인자 존재, 분변검사의 낮은 특이성이나 민감성의 단점이 제시되어옴에 따라서 덜 침습적이며 더욱 효과적이고 안정적인 대장암 진단 방법의 개발이 필요하게 되었으며, 이에 따라 대장암을 진단하거나 예후를 예측할 수 있는 바이오마커에 관한 연구가 다양하게 이루어져 왔다. 현재 대장암의 진단 및 예후 예측 등에 사용되는 바이오마커로써 CEA(Carcinoembryonic Antigen)가 대표적으로 임상에서 이용되고 있는데, CEA는 광범위한 상피성 악성종양에 대한 종양표지자로 여러 암에서 증가하는 경향을 보이지만 특히, 대장암의 병기, 예후 판정, 재발 판정에 보편적으로 이용되고 있다. 또한, 이와 더불어 CA199, CA125, 또는 CA153 등을 마커로 사용하기도 하지만 상기 마커들은 특이성 및 민감도가 낮아 위양성 판정의 가능성이 있다고 보고되어 있다(Zhou et al, 2012, Zhao et al, 2015). 따라서 대장암에서 특이성이 높은 바이오마커를 발굴하는 것이 매우 중요하다. To date, the disadvantages of invasiveness, high cost, presence of risk factors, and low specificity or sensitivity of fecal examination have been suggested. Therefore, it is necessary to develop a less invasive, more effective and stable method for diagnosing colorectal cancer. Various studies have been conducted on biomarkers that can diagnose or predict prognosis. As a biomarker used for the diagnosis and prognosis of colorectal cancer, CEA (Carcinoembryonic Antigen) is typically used in clinical trials. CEA is a tumor marker for a wide range of epithelial malignancies. It is widely used for staging, prognosis, and recurrence of colorectal cancer. In addition, although CA199, CA125, or CA153 is also used as a marker, the markers have low specificity and sensitivity and are reported to have a possibility of false-positive determination (Zhou et al, 2012, Zhao et al, 2015). Therefore, it is very important to identify high specific biomarkers in colorectal cancer.
한편, 마이크로RNA(microRNA)는 동식물 모두의 게놈에 존재하는 비암호화의 작은 RNA로 생물의 전반적인 모든 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 마이크로RNA는 ~22 정도 뉴클레오티드(nucleotide)의 짧은 헤어핀구조의 비암호화 그룹으로, 일반적으로 RNA 중합효소 II, 리보핵산가수분해효소(ribonuclease) Ⅲ인 drosha에 의해 주형 DNA로부터 초기 전사체(pri-miRNA), 전구체(pre-miRNA)로 변화하며, exportin-5라는 운반 단백질에 의해 핵에서 세포질로 이동한다. 세포질에서 pri-miRNA는 ribonuclease Ⅲ인 dicer에 의해 messenger RNA (mRNA) 이중가닥 구조로 변형되고, 이 과정에서 transactivation response RNA binding protein(TRBP 단백질) protein activator of PKR(PACT 단백질)에 의해 최종 mature-miRNA 형태를 이루며, RISC(RNA-induced silencing complex)와 결합하여 복합체를 이루고 최종적으로 mRNA 분해, 유전자 번역 과정(translation) 억제 기능을 갖는다. 분자생물학적인 주요 신호전달 체계인 WNT/β-catenin, EGFR, TGFβ, PI3K/AKT 신호체계는 마이크로RNA에 의해 조절되는 주요 메커니즘이며 이는 대장암의 분화, 성장, 발현, 전이 유도 과정에서 주요 기전으로 작용한다고 알려져 있다. 따라서 마이크로RNA는 표적 유전자의 상호작용에 의해 대장암 분화, 성장, 전이, 신생혈관생성, 세포사멸 등을 포함한 생물의 전반적인 과정을 조절할 수 있으며, 표적 유전자에 따라 대장암에서 마이크로RNA의 역할 및 기능이 좌우될 수 있다. On the other hand, microRNA (microRNA) is a non-coding small RNA existing in the genome of all plants and animals is known to be involved in the overall process of the organism. A microRNA is a non-coding group of short hairpin structures of about 22 nucleotides, and is usually an early transcript from template DNA by drosha, RNA polymerase II and ribonuclease III. ), It is transformed into a precursor (pre-miRNA) and migrates from the nucleus to the cytoplasm by a transport protein called exportin-5. In the cytoplasm, the pri-miRNA is transformed into a messenger RNA (mRNA) double-stranded structure by dicer, ribonuclease III, and in the process, the final mature-miRNA by the transactivation response RNA binding protein (TRBP protein) protein activator of PKR (PACT protein). It forms and forms a complex by combining with RISC (RNA-induced silencing complex), and finally has a function of inhibiting mRNA degradation and translation. WNT / β-catenin, EGFR, TGFβ, and PI3K / AKT signaling systems, which are the major molecular biology signaling systems, are the major mechanisms regulated by microRNAs, which are key mechanisms in the differentiation, growth, expression, and metastasis induction of colorectal cancer. It is known to work. Thus, microRNAs can regulate the overall processes of living organisms, including colon cancer differentiation, growth, metastasis, angiogenesis, and apoptosis, by the interaction of target genes. This can be influenced.
이에, 사람의 분변, 혈청, 혈장, 조직에서 마이크로RNA의 발현을 이용한 대장암 진단 마커로서의 가능성이 제시되어 다양하게 연구되어 오고 있으며, 현재까지 대표적으로 대장암 분변에서 13종, 혈장이나 혈청에서 7종의 마이크로RNA의 발현 변화가 보고되어 대장암 진단 마커로서 이용가능성이 제시되고 있다. 그러나 아직까지 효과적인 진단 또는 예후 예측용 마커 발굴에 대한 연구는 더 필요한 실정이다. Therefore, the potential as a diagnostic marker for colorectal cancer using microRNA expression in human feces, serum, plasma, and tissues has been suggested, and various studies have been conducted. Up to now, 13 types in colorectal cancer feces and 7 in plasma or serum have been studied. Changes in the expression of species microRNAs have been reported, suggesting their applicability as a diagnostic marker for colorectal cancer. However, further studies on the development of effective diagnostic or prognostic markers are still needed.
상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 정상인 및 대장암 환자에서 수술 전과 후의 혈청을 채취하고 이로부터 엑소좀(exosome) RNA를 분리한 후 NGS 분석을 통해 엑소좀 마이크로RNA의 발현수준을 비교분석한 결과, 정상인에 비해 대장암 환자에서 발현이 유의하게 증가하고 대장암 수술 전에 비해 수술 후에 발현이 유의하게 감소하는 마이크로RNA를 발견하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다. In order to solve the above conventional problems, the present inventors collected the serum before and after surgery in normal people and colorectal cancer patients, and after separating the exosome RNA from it, the expression level of the exosome microRNA through NGS analysis As a result of the comparative analysis, it was found that the microRNA was significantly increased in the colorectal cancer patients and the postoperative reduction in the colorectal cancer compared to the normal cancer compared to the normal person, and completed the present invention.
이에, 본 발명은 마이크로RNA-4732-5p(microRNA-4732-5p; miR-4732-5p)를 포함하는, 대장암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a marker composition for diagnosing or predicting colon cancer, including microRNA-4732-5p (microRNA-4732-5p; miR-4732-5p).
또한, 본 발명은 microRNA-4732-5p의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 대장암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다. In another aspect, the present invention provides a composition for diagnosing or predicting colorectal cancer, and a kit for diagnosing or predicting colorectal cancer comprising the composition, comprising an agent measuring the expression level of microRNA-4732-5p. do.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 microRNA-4732-5p의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다. In addition, another object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosing or predicting colon cancer, comprising measuring the expression level of microRNA-4732-5p in a biological sample derived from a subject.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다. However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problem, another task that is not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로RNA-4732-5p(microRNA-4732-5p; miR-4732-5p)를 포함하는, 대장암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다. In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a marker composition for diagnosing or predicting colon cancer, comprising microRNA-4732-5p (microRNA-4732-5p; miR-4732-5p).
또한, 본 발명은 마이크로RNA-4732-5p(microRNA-4732-5p)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 대장암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다. In addition, the present invention includes a composition for measuring the expression level of microRNA-4732-5p (microRNA-4732-5p), a composition for diagnosing or predicting colorectal cancer, and for diagnosing or prognostic colorectal cancer comprising the composition. Provide the kit.
본 발명의 일구현예로, 상기 microRNA-4732-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.In one embodiment of the invention, the microRNA-4732-5p may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 microRNA-4732-5p의 발현을 측정하는 제제는 상기 microRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다. In another embodiment of the present invention, the agent for measuring the expression of the microRNA-4732-5p may be a sense and antisense primer, or probe that complementarily binds to the microRNA.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 microRNA-4732-5p의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.The present invention also provides a method for providing information for diagnosing or predicting colon cancer, comprising measuring the expression level of microRNA-4732-5p in a biological sample derived from a subject.
본 발명의 일구현예로, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청 유래 엑소좀일 수 있다. In one embodiment of the invention, the biological sample may be blood or serum-derived exosomes.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 microRNA-4732-5p의 발현수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다. In another embodiment, the expression level of the microRNA-4732-5p is next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real time Measured by one or more methods selected from the group consisting of Real-time PCR, RNase protection assay (RPA), microarray, and northern blotting. Can be.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 예후는 재발, 생존, 또는 무병생존일 수 있다. In another embodiment of the invention, the prognosis may be relapse, survival, or disease free survival.
본 발명자들은 정상인 및 대장암 환자의 수술 전과 후의 혈액에서 분리한 엑소좀 내에 포함된 microRNA를 분석한 결과, 정상인에 비해 대장암 환자에서 유의하게 발현이 증가하고 환자의 수술 전과 비교하여 수술 후에는 발현이 다시 유의하게 감소하는 microRNA-4732-5p를 발굴하였는바, 상기 microRNA-4732-5p는 대장암의 진단과 함께 병의 재발과 같은 치료 및 수술 후의 예후를 예측하는데 유용한 바이오마커로써 임상에서 효율적으로 이용될 것으로 기대된다. The present inventors analyzed the microRNAs contained in the exosomes isolated from blood before and after surgery of normal and colorectal cancer patients, and significantly increased expression in colorectal cancer patients compared to normal, and after surgery compared to the preoperative surgery of patients. The microRNA-4732-5p was again found to be significantly reduced. The microRNA-4732-5p is a biomarker that is useful for the diagnosis of colorectal cancer and for predicting the prognosis after treatment and treatment such as recurrence of disease. It is expected to be used.
도 1은 대장암 수술 전(Pre)과 수술 후(Post)의 대장암 환자의 혈액 내 엑소좀에 존재하는 microRNA의 발현수준을 분석한 결과로서, 수술 전에 비해 수술 후 유의적으로 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소 또는 증가한 microRNA의 개수를 보여주는 결과 및 이러한 microRNAs의 발현수준에 따른 계층적 클러스터링을 수행한 히트맵 결과이다.
도 2는 수술 전과 후의 환자들에서 검출된 microRNA들의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과로서, 도 1에서 확인한 유의하게 발현이 변화하는 microRNA은 빨간색으로 표시하여 나타낸 것이다.
도 3은 정상인과 대장암 환자의 혈액 내 엑소좀에 존재하는 microRNA의 발현수준을 분석한 결과로서, 정상인에 비해 수술 전의 대장암 환자에서 유의적으로 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소 또는 증가한 microRNA의 개수를 보여주는 결과 및 이러한 microRNAs의 발현수준에 따른 계층적 클러스터링을 수행한 히트맵 결과이다.
도 4는 정상인과 수술 전 대장암 환자들에서 검출된 microRNA들의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과로서, 도 3에서 확인한 유의하게 발현이 변화하는 microRNA은 빨간색으로 표시하여 나타낸 것이다.
도 5는 정상인과 수술 전 대장암 환자 간의 hsa-miR-4732-5p의 발현수준 차이를 나타낸 결과이다. 1 is a result of analyzing the expression levels of microRNAs present in the exosomes in the blood of colorectal cancer patients before and after colorectal cancer surgery (Pre) and post-surgery (significantly). p <0.05) shows the number of microRNAs with reduced or increased expression, and the heat map results of hierarchical clustering according to the expression level of these microRNAs.
Figure 2 is a scatter plot according to the expression level of the microRNAs detected in patients before and after surgery, the significantly changed expression of microRNAs identified in Figure 1 is shown in red.
3 is a result of analyzing the expression level of microRNA in the exosomes in the blood of normal and colorectal cancer patients, significantly less than two-fold (p <0.05) in the preoperative colorectal cancer patients compared to normal or The results show the increased number of microRNAs and the heat map results of hierarchical clustering according to the expression level of these microRNAs.
FIG. 4 is a scatter plot according to the expression level of microRNAs detected in normal people and preoperative colorectal cancer patients. The significantly changed expression of microRNAs identified in FIG. 3 is shown in red.
Figure 5 shows the difference in the expression level of hsa-miR-4732-5p between normal and preoperative colorectal cancer patients.
본 발명자들은 대장암의 진단 및 예후 예측을 위한 유전자 마커를 발굴하기 위해 예의 연구한 결과, 대장암의 진단 또는 예후 예측에 이용할 수 있는 바이오마커로 마이크로RNA-4732-5p를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors completed the present invention by discovering microRNA-4732-5p as a biomarker that can be used for the diagnosis or prognosis of colorectal cancer. It was.
이에, 본 발명은 마이크로RNA-4732-5p(microRNA-4732-5p; miR-4732-5p)를 포함하는, 대장암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다. Accordingly, the present invention provides a marker composition for diagnosing or predicting colon cancer, including microRNA-4732-5p (microRNA-4732-5p; miR-4732-5p).
또한, 본 발명은 마이크로RNA-4732-5p(microRNA-4732-5p; miR-4732-5p)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 대장암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.In addition, the present invention comprises a composition for measuring the expression level of microRNA-4732-5p (microRNA-4732-5p; miR-4732-5p), colon cancer diagnosis or prognosis predictive composition and colon comprising the composition Provided are kits for cancer diagnosis or prognosis prediction.
본 발명자들은 본 발명의 실시예를 통해 대장암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커로써 상기 microRNA-4732-5p를 발굴하였다. The inventors of the present invention discovered the microRNA-4732-5p as a biomarker for diagnosing or prognosticting colon cancer through an embodiment of the present invention.
본 발명의 일실시예에서는, 대장암 환자에서 수술 전 후에 각각 혈청을 제공받아 혈청으로부터 엑소좀을 분리하여 엑소좀 내 microRNA의 발현수준을 비교분석하였으며, 수술 전에 비해 수술 후 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소하는 microRNA 7개, 발현이 증가하는 microRNA 4개를 확인하였다(실시예 2-1 참조).In one embodiment of the present invention, the colorectal cancer patients were provided with serum before and after surgery to separate the exosomes from the serum to compare and analyze the expression levels of microRNAs in the exosomes. 0.05) 7 microRNAs with reduced expression and 4 microRNAs with increased expression were identified (see Example 2-1).
본 발명의 다른 실시예에서는, 정상인과 수술 전의 대장암 환자들에서 제공받은 혈청으로부터 엑소좀을 분리하여 엑소좀 내 microRNA의 발현수준을 비교분석하였으며, 수술 전에 비해 수술 후 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소하는 microRNA 33개, 발현이 증가하는 microRNA 34개를 확인하였다(실시예 2-2 참조).In another embodiment of the present invention, the expression levels of microRNAs in exosomes were analyzed by separating exosomes from serum provided from normal and preoperative colorectal cancer patients, and more than two times after surgery (p <0.05). ) 33 microRNAs with reduced expression and 34 microRNAs with increased expression were identified (see Example 2-2).
나아가 상기 결과들을 종합하여 분석함으로써 정상인에 비해 대장암 환자에서 유의적으로 발현이 증가하고, 대장암 수술 전과 비교하여 수술 후에는 발현이 다시 유의적으로 감소하는 양상을 나타내는 microRNA로써 hsa-miR-4732-5p를 최종적으로 동정하였다. Furthermore, by analyzing the results, hsa-miR-4732 is a microRNA that shows a significant increase in expression in colorectal cancer patients compared to normal people, and a decrease in expression after surgery compared to preoperative colorectal cancer. -5p was finally identified.
본 발명의 상기 microRNA-4732-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.The microRNA-4732-5p of the present invention may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명에서 대상으로 하는 질병인 “대장암”은 대장에 생긴 암세포로 이루어진 악성 종양을 의미하며, 대장암 환자는 대부분 전이에 의해 사망하는 것으로 보고되어 있다. 대장암은 초기에 진단이 될 경우 5년 생존율이 90%에 달하지만 초기 대장암은 아무런 증상이 없어 3, 4기로 진행된 후에야 발견되는 경우가 많고 고비용의 침습성인 대장내시경 등을 통해서 진단해야하므로 조기진단에 많은 어려움이 있고, 수술 후의 재발율이 약 40%에 달한다고 알려져 있다. 따라서 보다 간편하고 효율적인 대장암 검사를 통해 조기에 진단하고 재발을 예측하는 것이 무엇보다 중요하다."Colon cancer", a disease targeted in the present invention, refers to a malignant tumor composed of cancer cells generated in the large intestine, and most of the patients with colorectal cancer are reported to die from metastasis. When diagnosed early, colorectal cancer reaches 90% in five years, but early colorectal cancer has no symptoms and should be detected only after the 3rd and 4th stages, and should be diagnosed through expensive invasive colonoscopy. There are many difficulties in diagnosis and it is known that the recurrence rate after surgery reaches about 40%. Therefore, it is important to diagnose early and predict recurrence through simpler and more efficient colon cancer screening.
본 발명에서 사용되는 용어, “진단(diagnosis)”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 대장암의 발병 여부 및 진행단계 수준 등을 판단하는 것이다.As used herein, the term “diagnosis” in the broad sense means to determine the actual condition of the patient's illness in all aspects. The contents of the judgment include the name of the disease, the etiology, the type of disease, the severity, the detailed mode of the condition, and the presence or absence of complications. Diagnosis in the present invention is to determine the onset and progression level of colorectal cancer.
본 발명에서 사용되는 용어, “예후(prognosis)”란, 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명에서 예후는 대장암의 재발, 생존(overall survival), 또는 무병생존(disease-free survival)을 의미하는 것이나, 이것으로 한정되는 것은 아니다. The term "prognosis" used in the present invention means a prediction about the progression and recovery of a condition and refers to a prospective or preliminary evaluation. Prognosis in the present invention means, but is not limited to recurrence, overall survival, or disease-free survival of colorectal cancer.
상기 microRNA-4732-5p의 발현을 측정하는 제제는 상기 microRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The agent measuring the expression of the microRNA-4732-5p may be, but is not limited to, a sense and antisense primer or probe that binds to the microRNA complementarily.
본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. As used herein, the term “primer” refers to an oligonucleotide synthesized for use in diagnosis, DNA sequencing and the like as a short gene sequence that is a starting point for DNA synthesis. The primers can be synthesized in a conventional length of 15 to 30 base pairs, but may vary depending on the purpose of use, and may be modified by methylation, capping, or the like by a known method.
본 발명에서 사용되는 용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다. As used herein, the term “probe” refers to a nucleic acid capable of specifically binding to mRNA of several to several hundred bases in length, which has been produced through enzymatic chemical separation or purification. The presence of mRNA can be confirmed by labeling radioisotopes or enzymes, and can be designed and modified by known methods.
본 발명의 진단 또는 예후 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.The kit for predictive diagnosis or prognosis of the present invention consists of one or more different component compositions, solutions or devices suitable for analytical methods.
예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. For example, the kit of the present invention may be used to perform genomic DNA derived from a sample to be analyzed, a primer set specific for the marker gene of the present invention, an appropriate amount of DNA polymerase, a dNTP mixture, a PCR buffer, and water to perform PCR. It may be a kit comprising. The PCR buffer may contain KCl, Tris-HCl and MgCl 2 . In addition, the components necessary for performing electrophoresis to confirm amplification of PCR products may be further included in the kit of the present invention.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. In addition, the kit of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR. RT-PCR kits include test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerases and reverse transcriptases, DNases, RNase inhibitors, DEPCs, as well as individual primer pairs specific for the marker gene. -May include DEPC-water, sterile water, and the like. It may also include primer pairs specific for the gene used as a quantitative control.
또한, 본 발명은 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 microRNA-4732-5p의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.The present invention also provides a method for providing information for diagnosing or prognostic colon cancer, comprising measuring the expression level of microRNA-4732-5p in a biological sample derived from a subject.
상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 혈액 또는 혈청 유래 엑소좀일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The biological sample derived from the subject may include tissue, cells, whole blood, blood, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine, and more preferably blood or serum-derived exosomes, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 방법에 따라 대장암 환자 유래 시료에서 분리한 엑소좀 내 microRNA-4732-5p 발현수준이 정상인보다 높을 경우 대장암으로 판정할 수 있고, 또한 대장암 수술 후의 환자 유래 시료에서 분리한 엑소좀 내 microRNA-4732-5p 발현수준을 동일한 환자의 수술 전과 비교하여 환자의 예후를 예측할 수 있다. In the present invention, when the expression level of microRNA-4732-5p in exosomes isolated from colon cancer patient-derived samples is higher than that of normal patients, it may be determined as colon cancer, and also isolated from patient-derived samples after colorectal cancer surgery. The prognosis of the patient can be predicted by comparing the microRNA-4732-5p expression level in one exosome with that of the same patient.
상기 microRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 또는 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Expression level of the microRNA is a conventional method known in the art polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection assay (RNase) protection assay (RPA), microarray, or northern blotting, or one or more methods selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
본 발명에서 사용되는 용어 "대장암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법"은 진단 또는 예후 예측을 위한 예비적 단계로써 대장암의 진단 또는 예후 예측을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다. The term "information providing method for diagnosis or prognosis of colorectal cancer" used in the present invention is a preliminary step for diagnosis or prognosis prediction and provides objective basic information necessary for diagnosis or prognosis of colorectal cancer. Clinical judgment or findings are excluded.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are provided to aid in understanding the present invention. However, the following examples are merely provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
[실시예]EXAMPLE
실시예 1. 실험준비 및 실험방법Example 1 Experiment Preparation and Experiment Method
1-1. 분석 대상 모집1-1. Recruitment of analysis subjects
본 발명자들은 대장암을 조기에 진단하고 병의 재발을 예측할 수 있는 마커를 발굴하고자, 정상인 및 대장암 환자들로부터 혈청 샘플을 채취하여 이들 간 차이를 나타내는 생체지표를 찾고자 하였다. The present inventors attempted to find markers for early diagnosis of colorectal cancer and for predicting disease recurrence, and to search for biomarkers representing serum differences from normal and colorectal cancer patients.
이를 위해 순천향대학교 천안병원에서 대장암으로 판정 받은 환자 56명과 순천향대학교 서울병원에서 정상으로 판정받은 사람 33명으로부터 혈청을 제공받았다. 이때 정상인은 당뇨, 비만, 혈압 질환, 및 암 등의 병이 없는 사람을 대상으로 하였으며, 상기 대장암으로 판정 받은 환자 중 12명의 환자는 대장암 수술을 받은 이후에 다시 한 번 혈청을 채취하였다. 한편, 본 연구는 순천향대학교의 임상연구윤리위원회의(IRB)의 승인을 받은 후 진행하였다.To this end, serum was provided from 56 patients who were diagnosed with colorectal cancer at Soonchunhyang University Cheonan Hospital and 33 patients who were judged normal at Soonchunhyang University Seoul Hospital. The normal subjects were those who had no disease such as diabetes, obesity, blood pressure, and cancer. Twelve patients among the patients diagnosed as colorectal cancer were collected once again after surgery for colorectal cancer. Meanwhile, this study was conducted after approval of the Institutional Review Board of Clinical Research Ethics (IRB) of Soonchunhyang University.
1-2. 혈청으로부터 RNA 분리 및 서열분석 수행1-2. RNA isolation and sequencing from serum
상기 실시예 1-1에서 대장암 환자 및 정상인으로부터 채취한 혈청 샘플에 대하여 Exoquick(SBI, USA)을 사용하여 엑소좀(exosome)을 분리하였고, 상기 분리된 엑소좀으로부터 Qiagen miRNeasy kit을 이용하여 총 RNA를 분리하였으며, 분리된 총 RNA의 질은 Agilent RNA Bioanalyzer를 이용해 제조사의 지시에 따라 측정하였다. Exoquick (SBI, USA) was used for serum samples collected from colon cancer patients and normal persons in Example 1-1, and exosomes were separated from the isolated exosomes using a Qiagen miRNeasy kit. RNA was isolated and total RNA quality was measured using an Agilent RNA Bioanalyzer according to the manufacturer's instructions.
이후 상기 분리된 RNA를 이용하여 마크로젠사에서 Takara SMARTer smRNA for illumina kit을 사용하여 라이브러리를 제작한 후 Hiseq 2500으로 차세대 염기서열 분석(NGS)을 실시하였으며, 2588개의 mature microRNA 중 대장암 수술 전과 후의 환자를 비교했을 대 338개의 마이크로RNA(microRNA; miRNA)가 검출되었고, 정상인과 수술 전의 대장암 환자를 비교했을 때 198개의 miRNA가 검출되었다. After the library was prepared using the isolated RNA using the Takara SMARTer smRNA for illumina kit from Macrogen, and then subjected to next-generation sequencing (NGS) with Hiseq 2500. Patients before and after colorectal cancer surgery among 2588 mature microRNAs 338 microRNAs (miRNAs) were detected and 198 miRNAs were detected when comparing normal patients with preoperative colorectal cancer patients.
실시예 2. 대장암 진단 또는 예후 예측용 miRNA 발굴Example 2. Excavation of miRNA for colorectal cancer diagnosis or prognosis prediction
2-1. 수술 전 vs. 후의 환자 간의 발현수준에 차이가 있는 miRNA 분석2-1. Preoperative vs. MiRNA analysis with differences in expression levels between later patients
먼저, 본 발명자들은 대장암 환자에서 수술 전(Pre)과 수술 후(Post)에 유의한 발현수준의 차이가 나타나는 miRNA를 동정하기 위하여, 상기 실시예 1-1 및 1-2의 방법에 따라 대장암 환자에서 수술 전과 후에 얻은 각각의 혈청으로부터 엑소좀을 분리하고 이에 포함되어 있는 miRNA의 발현수준을 비교하였다. First, the inventors of the present invention, in order to identify the miRNA that the difference in the expression level of the pre- and post-operative (Pre) in colorectal cancer patients, colon according to the method of Examples 1-1 and 1-2 Exosomes were isolated from each serum obtained before and after surgery in cancer patients and the expression levels of miRNAs contained therein were compared.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 상기 338개의 miRNA 중에 수술 전에 비해 수술 후 2배 이상(p < 0.05) 발현이 감소하는 miRNA가 7개, 발현이 증가하는 miRNA가 4개로 나타났다. 또한, 상기 유의한 발현 변화를 보이는 miRNA들의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과를 도 2에 나타내었다. 이에, 상기 결과는 수술 전에 비해 수술 후에 발현이 유의적으로 감소하거나 증가하는 상기 miRNA가 대장암의 재발 예측을 위한 바이오마커로 이용될 수 있음을 의미하는 것이다.As a result, as shown in FIG. 1, seven of the 338 miRNAs showed a reduction in expression of two or more miRNAs (p <0.05) and four miRNAs of increased expression. In addition, the scatter plot (scatter plot) according to the expression level of the miRNA showing the significant expression change is shown in FIG. Thus, the results indicate that the miRNA, whose expression is significantly decreased or increased after surgery, can be used as a biomarker for predicting recurrence of colorectal cancer.
2-2. 정상인 vs. 수술 전의 대장암 환자 간의 발현수준에 차이가 있는 miRNA 분석2-2. Normal vs. MiRNA analysis of differences in expression levels between patients with colorectal cancer before surgery
본 발명자들은 대장암의 재발 예측에 더하여 이와 동시에 대장암을 조기 진단할 수 있는 마커를 발굴하기 위해, 정상인에 비해 수술 전 환자에서 유의하게 발현이 변화하는 miRNA를 발굴하고 상기 수술전과 후의 환자에서 발현이 유의하게 변화한 miRNA와 중복되는 것이 있는지 조사하고자 하였다. 이를 위해, 상기 실시예 1-1 및 1-2의 방법에 따라 정상인과 수술 전의 대장암 환자에서 각각 채취한 혈청으로부터 엑소좀을 분리하고 이에 포함되어 있는 miRNA의 발현수준을 비교하였다. In addition to predicting recurrence of colorectal cancer, the present inventors have identified miRNAs whose expression changes significantly in pre-operative patients compared with normal patients, and expressed in pre- and post-operative patients in order to identify markers for early diagnosis of colorectal cancer. We attempted to investigate if there was any overlap with this significantly altered miRNA. To this end, according to the method of Examples 1-1 and 1-2, exosomes were isolated from serum collected from normal and preoperative colorectal cancer patients, respectively, and the expression levels of miRNAs contained therein were compared.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 이중 정상인의 것과 비교할 때 2배 이상(p < 0.05)발현이 감소하는 miRNA는 33개, 발현이 증가하는 miRNA가 34개로 나타났다. 또한 상기 유의한 발현 변화를 보이는 miRNA들의 발현수준에 따른 산점도(scatter plot) 결과를 도 4에 나타내었다. As a result, as shown in FIG. 3, 33 miRNAs decreased expression more than two times (p <0.05) and 34 miRNAs increased expression, compared with those of normal persons. In addition, the scatter plot (scatter plot) according to the expression level of the miRNA showing the significant expression change is shown in FIG.
종합적으로, 상기 실시예 결과들로부터, 정상인에 비해 수술 전의 대장암 환자에서 유의적으로 발현이 변화한 microRNA 결과와 상기 수술 전 환자에 비해 수술 후 환자에서 유의적으로 발현이 변화한 microRNA 결과를 비교분석하였다. 그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 hsa-miR-4732-5p가 정상인에 비해 대장암 환자에서 발현이 현저히 증가하며, 또한 수술 후 환자에서는 다시 정상인 수준으로 감소하는 것을 확인하였다. 정상인과 대장암 환자 간의 hsa-miR-4732-5p의 발현수준 차이는 도 5에 나타내었다. Overall, from the results of the above examples, the microRNA results of significantly changed expression in colorectal cancer patients before surgery compared to the normal group compared to the microRNA results of significantly changed expression in patients after surgery compared to the preoperative patients Analyzed. As a result, as shown in Table 1, it was confirmed that hsa-miR-4732-5p was significantly increased in colorectal cancer patients compared to normal patients, and also decreased to normal levels in patients after surgery. The difference in the expression level of hsa-miR-4732-5p between normal and colorectal cancer patients is shown in FIG. 5.
상기 결과는 hsa-miR-4732-5p를 대장암의 진단 및 재발 예측을 위한 바이오마커로 유용하게 이용될 수 있음을 보여주는 것이다.The results show that hsa-miR-4732-5p can be usefully used as a biomarker for diagnosing and predicting recurrence of colorectal cancer.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. The description of the present invention set forth above is for illustrative purposes, and one of ordinary skill in the art may understand that the present invention may be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. There will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are exemplary in all respects and not restrictive.
<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> MicroRNA-4732-5p for diagnosing or predicting recurrence of colorectal cancer and use thereof <130> PD18-012 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> hsa-miR-4732-5p <400> 1 uguagagcag ggagcaggaa gcu 23 <110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> MicroRNA-4732-5p for diagnosing or predicting recurrence of colorectal cancer and use <130> PD18-012 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> hsa-miR-4732-5p <400> 1 uguagagcag ggagcaggaa gcu 23
Claims (11)
Marker composition for diagnosing or predicting colon cancer, comprising microRNA-4732-5p (microRNA-4732-5p; miR-4732-5p).
상기 microRNA-4732-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
The method of claim 1,
The microRNA-4732-5p is a marker composition, characterized in that consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
Comprising an agent for measuring the expression level of microRNA-4732-5p (microRNA-4732-5p; miR-4732-5p), a composition for diagnosing or predicting colorectal cancer.
상기 microRNA-4732-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 대장암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
The method of claim 3, wherein
The microRNA-4732-5p is characterized by consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the composition for diagnosing or predicting colon cancer.
상기 microRNA-4732-5p의 발현을 측정하는 제제는 상기 microRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 대장암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
The method of claim 3, wherein
The agent for measuring the expression of the microRNA-4732-5p is characterized in that the sense and antisense primers, or probes that complementary to the microRNA, colon cancer diagnosis or prognostic composition.
Comprising a composition of claim 3, comprising a kit for diagnosing or predicting cancer.
A method of providing information for diagnosing or predicting colon cancer, comprising measuring the expression level of microRNA-4732-p (microRNA-4732-5p; miR-4732-5p) in a biological sample derived from a subject.
상기 microRNA-4732-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
The method of claim 7, wherein
The microRNA-4732-5p is characterized in that consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, information providing method.
상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청 유래 엑소좀인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
The method of claim 7, wherein
The biological sample is characterized in that the blood or serum-derived exosomes, information providing method.
상기 microRNA-4732-5p의 발현수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
The method of claim 7, wherein
The expression level of the microRNA-4732-5p is next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time). Information method, characterized in that it is measured by one or more methods selected from the group consisting of PCR), RNase protection assay (RPA), microarray, and northern blotting. .
상기 예후는 재발, 생존, 또는 무병생존인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.The method of claim 7, wherein
And the prognosis is relapse, survival, or disease free survival.
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| Kjersti Sellæg, ‘MicroRNA as Biomarkers in Colorectal Cancer’, Norwegian University of Science and Technology 석사학위논문 (2016.06.)* * |
| Oncotarget, 7(46): 76250-76260 (2016.11.15.)* * |
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