KR20190111890A - 신규 유산균 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

균체외 다당으로서 N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 생성하는 본 발명의 신규 유산균은, 무화과로부터 얻을 수 있고, 히알루로니다제를 저해하는 활성, 항알코올상해 활성 등을 가져, 항알레르기 효과나 항알코올상해 효과 등을 발휘하는 음식품, 의약품, 사료, 화장품 등에 유용하다.

Description

신규 유산균 및 그 용도
본 발명은 신규 유산균 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은, 균체외 다당으로서 N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 생성하는 신규 유산균 및 그것을 함유하는 항알레르기 효과 등을 발휘하는 음식품 조성물, 의약 조성물 등의 조성물에 관한 것이다.
유산균은, 글루코스 등의 탄수화물을 발효하여 에너지를 획득해 다량의 락트산을 생성하는 한 무리의 세균으로, 비병원성이며 비포자형성성의 그람 양성균이다. 유산균은, 예로부터 요구르트, 치즈 등의 발효 식품 조제용으로 사용되고, 또한, 적절한 양으로 투여하면 숙주의 헬스 케어에 있어서 유익한 효과를 발휘하기 때문에, 프로바이오틱스로서도 널리 사용되고 있다.
프로바이오틱스로서 효과가 있는 유산균으로는, 예를 들어, 혈청 지질에 대한 효과를 갖는 락토바실러스·플란타럼(Lactobacillus plantarum) MA2주(비특허문헌 1), 콜레스테롤 저감 작용을 갖는 Lactobacillus plantarum PH04주(비특허문헌 2) 등이 알려져 있다. 또한, 식물 유래의 유산균으로서, 지방간의 개선과 체내 지방의 축적 억제 효과를 갖는 페디오코커스·펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) LP28주(비특허문헌 3) 등도 알려져 있다.
락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균주에 대해서도, 항알레르기 작용을 갖는 Lactobacillus paracasei K71주(특허문헌 1), 항인플루엔자·바이러스 활성을 갖는 Lactobacillus paracasei MCC1375주(특허문헌 2), 인터류킨-12 생성을 활성화하는 Lactobacillus paracasei KW3110주(비특허문헌 4) 등이 알려져 있다.
몇 가지 유산균주는, 인간의 건강의 유지나 향상에 기여하는 생리 활성 물질로서 균체외 다당(exopolysaccharide)을 생성하는 것이 알려져 있다. 유산균에 의해 생성되는 균체외 다당은 면역 조절 기능이나 항위염 작용을 발휘하는 것이 나타나 있다(비특허문헌 5 및 6). 또한, Lactobacillus paracasei에 속하는 유산균에 의해 생성되는 균체외 다당에 대해서도 알려져 있으며, Lactobacillus paracasei DG주는 람노스가 풍부한 균체외 다당을 생성하고(비특허문헌 7), Lactobacillus paracasei KB28주는 글루코스가 풍부한 균체외 다당을 생성하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 8). Lactobacillus paracasei 34-1주는, D-갈락토오스, 2-아세트아미드-2-디옥시-D-갈락토오스 및 sn-글리세롤 3-포스페이트로 이루어지는 균체외 다당을 생성하는 것도 보고되어 있다(비특허문헌 9).
국제 공개 제WO2009/131208호 국제 공개 제WO2012/133827호
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이러한 배경 기술 하에 있어서는, 새로운 프로바이오틱스로서 유용한 신규 유산균의 가일층의 개발이 요망되고 있다. 따라서, 본 발명은, 새로운 프로바이오틱스로서 기대되고, 음식품 조성물, 의약 조성물 등의 조성물의 유효 성분으로서 유효한 신규 유산균 및 그 용도를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 새로운 프로바이오틱스로서 유용한 신규 유산균을 개발하는 것을 목적으로 하여 예의 검토한 결과, 종래의 유산균에서는 전혀 볼 수 없었던 N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 새로운 중성 다당을 생성하는 유산균이 무화과로부터 얻어지는 것을 알아내고, 이러한 지견에 기초하여 더욱 연구를 거듭하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 국면에서는, 본 발명은, 균체외 다당으로서 N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 생성하는 유산균에 관한 것이다.
유산균은 락토바실러스(Lactobacillus)에 속하는 유산균이 바람직하고, 특히 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균이 바람직하다. 또한, 본 발명의 유산균은 무화과 유래의 유산균이 바람직하고, 그 중에서도 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주(수탁 번호 NITE BP-02242) 또는 그것과 동등한 유산균이 바람직하다.
또한, 이 유산균이 생성하는 중성 다당은, 특히 히알루로니다제 저해 활성을 갖는다.
본 발명의 다른 국면에서는, 본 발명은, 이들 유산균을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
조성물은 음식품 조성물이 바람직하고, 음식품으로는, 음료, 기능성 식품, 발효 식품 또는 서플리먼트가 바람직하다. 또한, 이 조성물은 의약 조성물, 사료 조성물 및 화장품 조성물이 바람직하다.
이들 조성물은, 바람직하게는, 히알루로니다제 저해, 항알레르기 또는 항알코올상해 등을 위하여 사용된다.
본 발명의 유산균이 균체외 다당으로서 생성하는 중성 다당 등의 다당은, 히알루론산을 가수분해하는 효소인 히알루로니다제를 저해하는 활성을 나타내기 때문에, 본 발명의 유산균은 항알레르기 효과 등을 발휘하는 음식품, 서플리먼트, 의약품 및 사료로서 유효하다. 또한, 본 발명의 유산균은, 알코올성 간염 유발 모델 마우스에 대하여, 알코올 상해의 검사 지표인 혈청 중의 AST(아스파라긴산 아미노트랜스페라제), ALT(알라닌아미노트랜스페라제), ALP(알칼리포스파타제) 등을 감소시키는 효과를 갖기 때문에, 항알코올상해를 위한 음식품이나 의약품으로서 유효하다.
나아가서는, 본 발명의 유산균은, 위산이나 담즙산에 대하여 높은 내성을 갖기 때문에, 특히 인간의 소화관에 있어서 효능을 발휘하는 음식품, 서플리먼트 및 의약품, 그리고 포유 동물, 가축류, 애완 동물 등의 사료로서 유효하다.
또한, 본 발명의 유산균은, 난백을 사용한 배지 중에서도 강한 증식 능력을 발휘하기 때문에, 난백 중에 존재하는, 세균 세포벽을 분해하는 효소인 리소자임이나, 킬레이트 작용에 의해 세균의 철 이용을 방해하는 작용을 갖는 트랜스페린 등에 대한 방위 기구가 강하고, 이 면에서도, 본 발명의 유산균은 음식품이나 의약품으로서 유효하게 이용할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명의 유산균은, 분해되면 청산을 발생할 가능성이 있는 아미그달린이나, 멜라닌 생성을 저해하여 미백 효과가 명시되어 있는 알부틴을 자화할 수 없다는 특징을 갖는 자화 능력을 갖고 있다. 나아가서는, 상기와 같이, 난백을 사용한 배지 중에서도 강한 증식 능력은 발휘하기 때문에, 예를 들어, 난백 등과 함께, 화장품으로서도 유효하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 의해 분리 동정된 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 현미경 사진이다. 도 1의 (A)가 그람 염색 현미경 사진, (B)가 주사형 전자 현미경(SEM) 사진이다.
도 2는 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 균체외 다당체의 음이온 교환 크로마토그래피(TOYOPEARL DEAE-650M 수지(토소 주식회사))에 의한 분리 프로파일이다. 0 mM~500 mM의 구배 농도의 NaCl(파선)로 균체외 다당체를 용출시키고, 각 획분 중의 균체외 다당을 페놀황산법에 의해 490 nm에서 모니터하였다(직선).
도 3은 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 균체외 다당체를 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 얻어진 균체외 중성 다당을, 프로톤-NMR 및 카본-NMR 처리하여 얻어진 각각의 NMR 프로파일을 나타낸다. 도 3의 (A)가 프로톤-NMR의 NMR 프로파일이고, (B)가 카본-NMR의 NMR 프로파일이다.
도 4는 NMR 프로파일로부터의 균체외 중성 다당의 구조 해석 결과를 나타낸다. 이 구조 해석 결과로부터, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 균체외 중성 다당은, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 것이 분명해졌다.
도 5는 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 게놈 DNA의 pcel 클러스터 및 pce2 클러스터라고 명명한 균체외 다당 생합성 유전자 클러스터의 조직도이다.
도 6은 (A)가 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주, ATCC 334주 및 JCM 8130T주의 3개의 유산균 사이의 게놈 재편성 맵을 나타내고, (B)가 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 pce1 유전자 클러스터와 JCM 8130T주에서의 유전자 클러스터의 대응이다.
도 7은 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 알코올성 간염 유발 모델 마우스의 혈청 중의 AST(아스파라긴산 아미노트랜스페라제)에 대한 영향을 나타내는 그래프이다.
도 8은 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 알코올성 간염 유발 모델 마우스의 혈청 중의 ALT(알라닌아미노트랜스페라제)에 대한 영향을 나타내는 그래프이다.
도 9는 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 알코올성 간염 유발 모델 마우스의 혈청 중의 ALP(알칼리포스파타제)에 대한 영향을 나타내는 그래프이다.
도 10은 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 알코올성 간염 유발 모델 마우스의 혈청 중의 LDH(락트산 탈수소 효소)에 대한 영향을 나타내는 그래프이다.
도 11은 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 알코올성 간염 유발 모델 마우스의 혈청 중의 LAP(류신아미노펩티다아제)에 대한 영향을 나타내는 그래프이다.
도 12는 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 알코올성 간염 유발 모델 마우스의 혈청 중의 LIP(리파아제)에 대한 영향을 나타내는 그래프이다.
도 13은 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주를, 난백을 사용한 배지에서 배양한 결과를 나타낸다.
도 14는 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주를, 난백에 글루코스 및 해수 농축 간수를 첨가한 배지에서 배양한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명의 유산균 및 그 용도에 대하여 상세하게 설명한다.
1. 본 발명의 유산균
본 발명의 유산균은, 균체외 다당으로서 N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 생성하는 유산균이다. N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 균체외 다당으로서 생성하는 유산균은 종래 알려져 있지 않고, 본 발명에 의해 처음으로 발견된 것이다. 본 발명의 유산균은, 이러한 특정한 구조를 갖는 중성 다당을 생성하는 유산균이면, 어느 유산균이라도 좋으며, 특정한 유산균에 한정되지 않는다.
본 발명의 유산균으로는, 예를 들어, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 페디오코커스(Pediococcus)속, 멜리소코커스(Melissococcus)속, 엔테로코커스(Enterococcus)속, 트리코코커스(Trichococcus)속, 락토코커스(Lactococcus)속, 카르노박테리움(Carnobacterium)속, 바고코커스(Vagococcus)속, 테트라게노코커스(Tetragenococcus)속, 아토포비움(Atopobium)속, 와이셀라(Weissella)속, 오에노코커스(Oenococcus)속, 아비오트로피아(Abiotrophia)속, 데스메지아(Desemzia)속, 파라락토바실러스(Paralactobacillus)속, 그라뉼리카텔라(Granulicatella)속, 알칼리박테리움(Alkalibacterium)속, 올세넬라(Olsenella)속, 이소바큘럼(Isobaculum)속, 마리니락티바실러스(Marinilactibacillus)속, 아토포스타이페스(Atopostipes)속, 락토밤(Lactovum)속, 필리박터(Pilibacter)속, 프룩토바실러스(Fructobacillus)속, 락티시게미움(Lacticigemium)속, 바바리코커스(Bavariicoccus)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 등에 속하는 유산균을 들 수 있다. 이들 중에서, 락토바실러스속에 속하는 유산균이 바람직하다.
락토바실러스속에 속하는 유산균으로는, 예를 들어, 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei), Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidifarinae, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylotrophicus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus antri, Lactobacillus apodemi, Lactobacillus aquaticus, Lactobacillus aviaries, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus bobalius, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus cacaonum, Lactobacillus camelliae, Lactobacillus capilatus, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus ceti, Lactobacillus coleohominis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus composti, Lactobacillus concavus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus crustorum, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus dextrinicus, Lactobacillus diolivorans, Lactobacillus equi, Lactobacillus equigenerosi, Lactobacillus fabifermentans, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus farraginis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus frumenti, Lactobacillus fuchuensis, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gastricus, Lactobacillus ghanensis, Lactobacillus graminis, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus harbinensis, Lactobacillus hayakitensis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus hordei, Lactobacillus iners, Lactobacillus ingluviei, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kalixensis, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kimchii, Lactobacillus kisonensis, Lactobacillus kitasatonis, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus mindensis, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nantensis, Lactobacillus nodensis, Lactobacillus oligofermentans, Lactobacillus oris, Lactobacillus otakiensis, Lactobacillus panis, Lactobacillus pantheris, Lactobacillus parabrevis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracollinoides, Lactobacillus parafarraginis, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus psittaci, Lactobacillus rapi, Lactobacillus rennini, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rimae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus saerimneri, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus satsumensis, Lactobacillus secaliphilus, Lactobacillus senmaizukei, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus siliginis, Lactobacillus spicheri, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus sunkii, Lactobacillus susicola, Lactobacillus taiwanensis, Lactobacillus thailandensis, Lactobacillus tucceti, Lactobacillus ultunensis, Lactobacillus uvarum, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus versmoldensis, Lactobacillus vini, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus zeae, Lactobacillus zymae 등을 들 수 있다. 이들 중에서, 락토바실러스·파라카제이가 바람직하다.
이들 유산균 중에서도, 본 발명의 유산균은, 무화과 유래의 유산균이 바람직하다. 구체적으로는, 본 발명에 의해, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 균체외 다당으로서 생성하는 유산균으로서, 무화과의 잎으로부터, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주가 단리 동정되었다. 이 균주는, 2016년 4월 19일에 독립행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 센터(우편번호 292-0818 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8 122호실)에 수탁 번호 NITE P-02242로서 국내 기탁되고, 그 후에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되어, 2017년 5월 26일에 NITE BP-02242로서 국제 기탁의 수탁 번호가 부여되어 있다.
무화과의 잎으로부터 단리 동정된 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주는, 도 1의 사진에 나타내는 바와 같이, 카탈라아제 음성의 그람 양성 간균이고, 또한, 백색 콜로니 형성성을 갖고, 조건적 헤테로 락트산 발효의 특성을 갖는다는 균학적 성질을 갖는다. 나아가서는, 다당체, 특히, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 생성하는 능력을 갖고 있다.
이 중성 다당은, 후술하는 실시예 4에 기재하는 바와 같이, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 배양물로부터 얻어지는 다당체를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리 정제함으로써 얻을 수 있다. 이 중성 다당은, 도 3에 나타내는 프로톤-NMR 및 카본-NMR의 NMR 프로파일로부터, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 것이 분명해졌다.
또한, 후술하는 실시예 3의 표 1에 나타내는 바와 같이, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주는 당류에 대한 자화 능력을 갖는다. 특히, 다른 Lactobacillus paracasei에 비하여, 분해되면 청산을 발생할 가능성이 있는 아미그달린이나, 멜라닌 생성을 저해하여 미백 효과가 명시되어 있는 알부틴을 자화하지 않는다는 특징을 갖는 당류 자화 능력을 갖고 있다.
Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 전체 게놈 서열의 해석으로부터, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 게놈 DNA는 GC 함량 46.37%의 3,084,917 bp로 이루어지고, 구조 유전자의 수는 2,963개라고 예측되었다. 또한, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주는 2개의 플라스미드를 갖고, 그 중의 하나가 적어도 51 kb이고, 다른 하나가 45,267 bp의 사이즈인 것을 나타냈다. 다른 유산균과 비교하면, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주는, 보다 큰 게놈 사이즈 및 구조 유전자수를 갖는다.
또한, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 게놈 DNA 서열에, 2개의 균체외 다당 생합성 유전자 클러스터가 발견되어, 그 중의 하나의 23 kb의 클러스터를 pcel 클러스터라고 명명하고, 다른 하나의 28 kb의 클러스터를 pce2 클러스터라고 명명하였다. 그리고, pce2 클러스터에 있어서, pce2J라고 명명한 글리코실트랜스페라제 유전자의 하나로부터 추정된 단백질은, 이미 알려져 있는 β-1,6-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제에 보이는 pfam02485 모티프 또는 도메인(Genes Dev., 1993 Mar; 7(3): 468-478 및 J. Biol. Chem., 1999 Jan 29; 274(5): 3215-3221)과 동일한 모티프 또는 도메인을 갖고 있는 것이 발견된 점에서, pce2 클러스터 중의 이 단백질을 코드하는 구조 유전자가 중성 다당의 생합성에 관여하고 있는 것이 시사되었다.
본 발명에서는, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주와 동등한 유산균도 본 발명의 유산균에 포함된다. 여기서, 동등한 유산균이란, Lactobacillus paracasei에 속하는 유산균으로서, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 생성하는 능력을 갖는 유산균을 가리킨다. 또한, 동등한 유산균이란, 락토바실러스·파라카제이에 속하는 균주로서, 그 16S rDNA 유전자의 염기 서열이, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 16S rDNA 유전자의 서열 번호 1의 염기 서열과 98% 이상, 바람직하게는 99% 이상, 보다 바람직하게는 100%의 동일성을 갖고, 또한, 바람직하게는 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주와 동일한 균학적 성질 및/또는 동일한 당류 자화 능력을 갖는 균주를 가리킨다. 또한, 동등한 유산균이란, 락토바실러스·파라카제이에 속하는 균주로서, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주가 갖는, 항알레르기 작용, 항알코올상해 작용, 내산성 등의 생물 활성과 동일한 생물 활성을 갖는 균주를 가리킨다.
이들 동등한 유산균은, 예를 들어, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주에 대하여 돌연변이, 유전자 재조합 등의 통상의 변이 처리 기술을 행함으로써 얻을 수 있고, 또한, Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 자연 변이주의 선택 등에 의해 육종된 균주여도 된다.
2. 본 발명의 유산균의 취득 및 증식
본 발명의 유산균은, 후술하는 실시예 4에 기재하는 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주가 생성하는 다당체의 분리 정제와 동일하게 하여, 유산균이 생성하는 균체외 다당을 단리하고, 그 다당이 N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당인지의 여부를 조사함으로써, 취득할 수 있다.
본 발명의 유산균은, 그들을 배양함으로써 용이하게 증식시킬 수 있다. 배양하는 방법은, 유산균을 증식할 수 있는 배양 방법이면 되며, 특정한 배양 방법에 한정되지 않고, 유산균의 배양에 통상 이용되는 방법을 그대로, 혹은 필요에 따라 적당히 수정하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 통상 25~50℃이면 되며, 35~42℃인 것이 바람직하다. 배양은 호기 조건 및 혐기 조건 하의 어느 쪽에서 행하여도 되며, 특히 혐기 조건 하에서 행하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 적절한 농도의 탄산 가스나 질소 가스 등의 혐기성 가스를 통기하면서 배양할 수 있다. 또한, 액체 정치 배양 등의 미호기 조건 하에서 배양해도 된다.
유산균을 배양하는 배지로는, 특별히 한정되지 않고, 유산균의 배양에 통상 사용되는 배지를 필요에 따라 적당히 수정하여 사용할 수 있다. 즉, 탄소원으로는, 예를 들어, 갈락토오스, 글루코스, 프룩토오스, 만노스, 소르보스, 만니톨, 살리신, 셀로비오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 전분 가수분해물, 폐당밀 등의 당류를 자화성에 따라 사용할 수 있다. 질소원으로는, 예를 들어, 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 등의 암모늄염류나 질산염류를 사용할 수 있다. 또한, 무기염류로는, 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 인산칼륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 질산칼슘, 염화망간, 황산제1철 등을 사용할 수 있다. 또한, 펩톤, 술지게미, 유청(훼이), 대두분, 탈지 대두박, 고기 엑기스, 효모 엑기스 등의 유기 성분을 사용해도 된다. 또한, 조제가 완료된 배지로는, 예를 들어 MRS 배지 또는 그 수정 배지를 호적하게 사용할 수 있다.
유산균은, 배양 후, 얻어진 배양물을 그대로 사용해도 되고, 얻어진 배양액을 희석 또는 농축하여 사용해도 되며, 배양물로부터 회수한 균체를 사용해도 된다. 또한, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 한, 배양 후에 가열, 및 동결 건조 등의 여러 추가 조작을 행할 수도 있다. 추가의 조작은, 생균의 생존율이 높은 것인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 유산균은, 생균이어도 되고 사균이어도 되며, 생균 및 사균의 양방이어도 된다. 사균은, 파쇄물이어도 된다.
3. 본 발명의 유산균의 용도
본 발명의 유산균이 균체외 다당으로서 생성하는 중성 다당이나 산성 다당 등의 다당체는, 히알루론산을 가수분해하는 효소인 히알루로니다제를 저해하는 활성을 나타낸다. 본 발명의 유산균은, 알코올성 간염 유발 모델 마우스에 대하여, 알코올 상해의 검사 지표인 혈청 중의 AST(아스파라긴산 아미노트랜스페라제) 등을 감소시키는 효과를 갖는다. 본 발명의 유산균은, 위산이나 담즙산에 대하여 높은 내성을 갖는다. 또한, 본 발명의 유산균은, 난백을 사용한 배지 중에서도 강한 증식 능력은 발휘하기 때문에, 난백 중에 존재하는, 세균 세포벽을 분해하는 효소인 리소자임이나, 킬레이트 작용에 의해 세균의 철 이용을 방해하는 작용을 갖는 트랜스페린 등에 대한 생체 방위 기구가 강하다.
이와 같이, 본 발명의 유산균은, 각종 생물 활성을 발휘하고, 생리학적 특징을 갖기 때문에, 음식품 조성물, 의약 조성물, 사료 조성물, 화장품 조성물 등의 각종 조성물의 유효 성분으로서 널리 사용할 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다제 저해용, 항알레르기용 또는 항알코올상해용 음식품 조성물, 의약 조성물 또는 사료 조성물의 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균은, 난백 등과 함께 화장품 조성물의 유효 성분으로서 사용할 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 유산균을 함유하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 의약 조성물은, 통상, 본 발명의 유산균을 생리적으로 허용되는 액체 또는 고체의 제제 담체에 배합해 제제화하여 사용된다.
본 발명의 의약 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는, 정제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 캡슐제, 시럽제, 좌제, 주사제, 연고제, 첩부제, 점안제, 및 점비제 등을 예시할 수 있다. 제제화에 있어서는, 제제 담체로서 통상 사용되는 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 안정제, 교미교취제, 희석제, 계면 활성제, 또는 주사제용 용제 등의 첨가제를 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 제제에 있어서의 유산균의 함유량은, 제형, 용법, 대상의 연령, 성별, 질환의 종류, 질환의 정도, 및 그 밖의 조건 등에 따라 임의 설정되는데, 통상 1 × 106~1 × 1012 cfu/g 또는 1 × 106~1 × 1012 cfu/ml의 범위 내인 것이 바람직하고, 1 × 107~1 × 1011 cfu/g 또는 1 × 107~1 × 1011 cfu/ml의 범위 내인 것이 보다 바람직하다. 유산균이 사균인 경우, cfu/g 또는 cfu/ml은, 개별세포/g 또는 개별세포/ml로 치환할 수 있다.
본 발명의 효과를 손상하지 않는 한, 본 발명의 유산균과, 다른 유효 성분으로서, 예를 들어, 면역 부활제 등을 용도에 따라 적당히 병용해도 된다.
본 발명의 의약 조성물의 투여 시기는 특별히 한정되지 않고, 적용 대상에 따라, 적당하게 투여 시기를 선택할 수 있다. 또한, 예방적으로 투여해도 되고, 유지 요법에 사용해도 된다. 투여 형태는 제제 형태, 투여 대상의 연령, 성별, 그 밖의 조건, 투여 대상의 증상의 정도 등에 따라 적당히 결정되는 것이 바람직하다. 본 발명의 의약 조성물은, 어느 경우도 1일 1회 또는 복수회로 나누어 투여할 수 있고, 또한, 수 일 또는 수 주일에 1회의 투여로 해도 된다.
본 발명의 의약 조성물은, 예를 들어, 투여 대상의 알레르기를 저하시키기 위하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은, 예를 들어, 알코올성 간 상해, 알코올 의존증, 알코올성 간염, 지방간 등의 치료나 완화 또는 예방용으로 사용할 수 있다.
본 발명의 유산균을 포함하는 음식품 조성물의 음식품은, 유산균을 함유하는 한 특별히 제한되지 않고, 음식품으로는, 청량 음료, 탄산 음료, 영양 음료, 과즙 음료, 유산균 음료 등의 음료, 이들 음료의 농축 원액, 조제용 분말 등; 아이스크림, 셔벗, 빙수 등의 빙과; 엿, 구미, 시리얼, 추잉껌, 캔디, 껌, 초콜릿, 정과, 스낵 과자, 비스킷, 젤리, 잼, 크림, 및 구운 과자 등의 과자류; 가공유, 유음료, 발효유, 드링크 요구르트, 버터 등의 유제품; 빵; 경장 영양식, 유동식, 육아용 밀크, 스포츠 음료; 퓌레 등의 식품; 기타 기능성 식품 등이 예시된다. 또한, 음식품은, 서플리먼트여도 되고, 예를 들어, 과립상, 분말상, 태블릿상의 서플리먼트여도 된다. 서플리먼트인 경우에는, 1일당의 식사량 및 섭취 칼로리에 대하여 다른 식품에 영향받지 않고, 유산균을 섭취할 수 있다.
상기와 같은 음식품은, 음식품의 원료에 유산균을 첨가함으로써 제조할 수 있고, 혹은 통상의 음식품과 동일하게 하여 제조할 수 있다. 유산균의 첨가는, 음식품의 제조 공정의 어느 단계에서 행하여도 된다. 첨가한 유산균에 의한 발효 공정을 거쳐, 음식품이 제조되어도 된다. 그러한 음식품으로는, 유산균 음료, 발효유 등의 발효 식품 등을 들 수 있다.
식품 또는 음료의 원료로는, 통상의 음료나 식품에 사용되고 있는 원료를 사용할 수 있다. 제조된 음식품은, 경구적으로 섭취하는 것이 가능하다.
본 발명의 음식품에는, 음식품 제조를 위한 원료, 및 식품 첨가물 등, 음식품의 제조 공정 또는 제조 후에 음식품에 첨가되는 것도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 유산균은, 발효유 제조용 스타터로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균을, 제조된 발효유에 나중에 첨가할 수도 있다.
음식품 조성물에 있어서의 유산균의 함유량은, 음식품의 양태에 따라 적당히 설정되는데, 통상, 음식품 중에 1 × 106~1 × 1012 cfu/g 또는 1 × 106~1 × 1012 cfu/ml의 범위 내인 것이 바람직하고, 1 × 107~1 × 1011 cfu/g 또는 1 × 107~1 × 1011 cfu/ml의 범위 내인 것이 보다 바람직하다. 유산균이 사균인 경우, cfu/g 또는 cfu/ml은, 개별세포/g 또는 개별세포/ml로 치환할 수 있다.
본 발명의 유산균을 포함하는 음식품 조성물은, 항알레르기 효과나 항알코올상해 효과를 이용하는 여러 용도로 사용할 수 있다.
본 발명의 유산균을 포함하는 음식품은, 그 용도가 표시된 음식품으로서 제조·판매할 수 있다. 그러한 음식품에는, 「알레르기 개선용」, 「알코올 상해 개선용」 등의 표시를 할 수 있다. 이것 이외에도, 그러한 개선 효과에 의해 이차적으로 발생하는 효과를 나타내는 표시이면, 사용할 수 있는 것은 말할 필요도 없다. 여기서, 「표시」란, 수요자에 대하여 상기 용도를 알리기 위한 모든 행위를 의미하며, 상기 용도를 상기·유추시킬 수 있는 것과 같은 표시이면, 표시의 목적, 표시의 내용, 표시하는 대상물 및 매체 등의 여하에 상관없이, 전부 「표시」에 해당한다. 그러나, 수요자가 상기 용도를 직접적으로 인식할 수 있는 것과 같은 표현에 의해 표시하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 본 발명의 음식품에 관련된 상품 또는 상품의 포장에 상기 용도를 표시하는 것을 예시할 수 있고, 특히 포장, 용기, 카탈로그, 팸플릿, POP 등의 판매 현장에 있어서의 선전재, 그 밖의 서류 등으로의 표시가 바람직하다. 또한, 표시로는, 예를 들어, 건강 식품, 기능성 식품, 경장 영양 식품, 특별 용도 식품, 영양 기능 식품, 의약용 부외품, 특정 보건용 식품 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 유산균을 포함하는 사료 조성물의 사료로는, 펫 푸드, 가축 사료, 양어 사료 등을 들 수 있다. 이러한 사료는, 일반적인 사료, 예를 들어, 곡류, 지게미류, 겨붙이류, 어분, 골분, 유지류, 탈지 분유, 유청(훼이), 간수, 광물질 사료, 효모류 등에 유산균을 혼합함으로써 제조할 수 있다. 또한, 예를 들어, 사일리지의 경우와 같이, 첨가한 유산균에 의한 발효 공정을 거쳐, 사료가 제조되어도 된다. 제조된 사료는, 일반적인 포유 동물, 가축류, 양어류, 애완 동물 등에 경구적으로 투여할 수 있다. 또한, 양어류의 경우에는, 본 발명의 유산균을 첨가한 발효물을 양어장에 뿌리는 방법을 채용할 수도 있다.
사료 조성물에 있어서의 유산균의 함유량은, 사료의 양태나 투여 대상에 따라 적당히 설정되는데, 1 × 106~1 × 1012 cfu/g 또는 1 × 106~1 × 1012 cfu/ml의 범위 내인 것이 바람직하고, 1 × 107~1 × 1011 cfu/g 또는 1 × 107~1 × 1011 cfu/ml의 범위 내인 것이 보다 바람직하다. 유산균이 사균인 경우, cfu/g 또는 cfu/ml은, 개별세포/g 또는 개별세포/ml로 치환할 수 있다.
본 발명의 유산균을 포함하는 사료 조성물은, 예를 들어, 항알레르기 효과를 이용하는 여러 용도로 사용할 수 있다.
본 발명의 유산균을 포함하는 화장품 조성물의 화장품으로는, 예를 들어, 비누, 바디 샴푸, 클렌징 크림, 세안료 등의 세정료; 화장수(로션), 배니싱 크림, 콜드 크림, 에몰리언트 크림, 마사지 크림 등의 크림; 유액, 미용액 등을 들 수 있다.
본 발명의 유산균을 포함하는 화장품 조성물에 있어서는, 예를 들어, 닭 등의 조류의 알을 할란하여 난황을 분리한 액상의 난백에 본 발명의 유산균을 첨가하여 발효시킴으로써 얻어지는 유산 발효 난백을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 유산 발효는, 일반적으로 영양원으로서 글루코스 등을 사용하여 필요에 따라 효모 엑기스 등의 발효 촉진 물질을 첨가하여, 발효시키는 것이 좋다. 유산 발효 난백의 형태는, 배합하는 화장품에 따라, 예를 들어, 액상, 분말상, 크림상, 페이스트상, 젤리상 등을 들 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물에 사용하는 유산균의 함유량은, 예를 들어, 유산 발효 난백의 건물(乾物) 환산으로 통상 0.001 중량% 이상, 나아가서는 0.01 중량% 이상으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 유산균을 포함하는 화장품 조성물은, 예를 들어, 항알레르기 효과를 이용하는 여러 용도로 사용할 수 있다. 또한, 미백 효과나 보습 효과를 나타내는 화장품으로서도 사용할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
유산균의 분리 및 동정
1. 유산균 샘플의 분리
무화과(품종 「토요미츠히메」)의 잎, 줄기, 및 과실을 선택하고, 살균 완료 핀셋과 가위를 사용하여 2~3 mm로 세단편화한 후, 멸균이 완료된 MRS 액체 배지가 들어간 시험관에 5~6개씩의 세편을 넣고, 28℃ 및 37℃에서, 유산균의 표준 배지인 MRS 배지가 흐려질(증식할) 때까지 정치 배양하였다. 덧붙여, 유산균 후보주의 증식을 목시할 수 있을 때까지 2~4일간을 필요로 하였다.
상기 유산균 후보주의 각 배양액의 일부를 MRS 한천 배지 상에 디스포저블 루프로 선화도균(線畵塗菌) 후, 정치 배양을 행하였다. 한천 배지 상에 형성된 콜로니 중, 「색, 윤기, 형상이 다른 것」을 전부 픽업하고, 프레시한 MRS 한천 배지 상에 선화도균을 행하여, 콜로니를 순화하였다.
순화된 각 콜로니에 대하여, 카탈라아제 효소의 생성 유무를 검증하기 위하여, H2O2 테스트를 행하였다. 이것은, 10%의 H2O2 용액에 균체를 노출시켰을 때에 일어나는, 카탈라아제가 존재하면 생성되는 산소의 발생 유무를 관찰하는 시험법이다. 덧붙여, 유산균은 카탈라아제를 생성하지 않는다.
무화과로부터의 탐색 분리를 시도한 결과, 무화과의 잎을 분리원으로 한 것으로부터, 카탈라아제 음성을 나타내는 유산균 후보주를 1주 얻을 수 있었다.
2. 분리주의 동정
상기 유산균 후보주를 MRS 액체 배지에서 다시 배양하고, 원심에 의해 균체를 취득하였다. 세포벽 용해 효소로 처리한 후, DNAzol 시약을 사용하여, 게놈 DNA를 추출하였다.
Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, pp.115-175. Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester: Wiley에 기재된 방법에 따라, 게놈 DNA를 주형으로 하여, 27f 프라이머(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(서열표의 서열 번호 1) 및 1525r 프라이머(5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3')(서열표의 서열 번호 2)를 사용한 PCR 반응에 의해 16S rDNA 부분을 증폭시키고, NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit(마슈레이·나겔사 제조)에 의해, 아가로스 겔로부터 목적 단편을 회수하였다. 염기 서열 결정을 위한 다이 터미네이터법에 의한 시퀀스 반응은, Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit ver.3.1(ThermoFisher Scientific사 제조)로 행하고, ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer(ThermoFisher Scientific사 제조)로 해석하였다. 해석한 16S rDNA의 염기 서열은 서열표의 서열 번호 1의 염기 서열을 갖고 있었다. 이 염기 서열에 대하여 BLAST program에 의한 상동성 검색을 행하고, DNA data bank(DDBJ/EMBL/GenBank)의 데이터베이스와 비교함으로써, 분리주의 분류학적 동정을 행하였다.
무화과의 잎으로부터 분리된 유산균 후보주를, IJH-SONE68주라고 명명하고, DNA data bank(DDBJ/EMBL/GenBank)에 이미 등록되어 있는 「Lactobacillus paracasei R094」의 균주에서 염기 서열의 accession 번호가 「NR_025880」인 염기 서열과 100% 일치하였기 때문에, Lactobacillus paracasei로 동정하였다.
이 균주는, 2016년 4월 19일에 독립행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 센터(우편번호 292-0818 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8 122호실)에 수탁 번호 NITE P-02242로서 국제 기탁되고, 그 후에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되어, 2017년 5월 26일에 NITE BP-02242로서 국제 기탁의 수탁 번호가 부여되어 있다.
3. 게놈 DNA의 서열 분석
IJH-SONE68주로부터의 게놈 DNA에 대하여, P6 폴리메라아제 및 C4 케미스트리(P6C4)를 사용한 단일 분자 리얼 타임(SMRT) 셀로, PacBio RS II(Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, U.S.A.)에 의해 게놈 DNA 서열 결정을 행하였다. 정제된 게놈 DNA 시료를, g-TUBE 키트(Covaris, Woburn, MA, U.S.A.)를 사용하여 단편으로 전단하였다. 이어서, 전단된 단편을 AMPure PB 키트(Pacific Biosciences)를 사용하여 정제하였다. PacBio DNA 템플레이트 조제 키트 1.0(Pacific Biosciences) 및 PacBio DNA/Polymerase Binding Kit P6(Pacific Biosciences)을 사용하여 DNA 라이브러리를 구축하였다. 짧은 단편을 Blue Pippin(Sage Science, Beverly, MA, U.S.A.)에 의해 제거하고, 이어서 정제 DNA 라이브러리를 PacBio SMRT 플랫폼 상에서 서열 결정하였다. 계층적 게놈 어셈블리 프로세스(HGAP) 프로토콜(Nat. Methods, 10, 563-56933)로 드노보 어셈블리를 행하고, 얻어진 전체 게놈 콘티그를 미생물 게놈 어노테이션 파이프라인(MiGAP)에 의해 어노테이션을 행하였다(The 20th International Conference on Genome Informatics(GIW2009) Poster and Software Demonstrations(Yokohama), S001-1-2).
4. 게놈 DNA의 서열 분석 결과
IJH-SONE68주의 전체 게놈 서열을 결정하고, 그 결과, 게놈 DNA는 GC 함량 46.37%의 3,084,917 bp로 이루어지고, 구조 유전자의 수는 MiGAP에 의해 2,963개라고 예측되었다. 또한, 서열의 결과로부터, IJH-SONE68주는 2개의 플라스미드를 포함하고, 그 중의 하나가 적어도 51 kbp이고, 또 하나가 45,267 bp의 사이즈인 것을 나타냈다. 다른 유산균과 비교하면, IJH-SONE68주는, 보다 큰 게놈 사이즈 및 구조 유전자수를 갖는다.
실시예 2
분리 동정된 유산균의 균학적 성질
분리 동정된 상기 유산균 IJH-SONE68주는, 도 1의 사진에 나타내는 바와 같이, 카탈라아제 음성의 그람 양성 간균이고, 또한, 백색 콜로니 형성성을 갖고, 조건적 헤테로 락트산 발효의 특성을 갖는 동시에, 다당체를 생성하는 능력을 갖고 있었다.
실시예 3
분리 동정된 유산균의 당류의 자화 능력
1. 자화 능력의 시험 방법
IJH-SONE68주의 49종류의 당류에 대한 자화 능력에 대하여 이하의 시험 방법에 의해 조사하였다.
IJH-SONE68주를 MRS 액체 배지에서 증식의 정상기까지 정치 배양하였다. 원심하여 얻어진 균체를 적량의 suspension medium(비오메류사 제조)으로 세정한 후, 최종적으로 2 mL의 suspension medium에 현탁하였다. 이 일부를, 5 mL의 suspension medium에 첨가하여 맥팔랜드 탁도가 2가 되는 양(n)을 구하였다. 계속해서, API 50 CHL 배지(비오메류사 제조)에 2 n의 균액을 첨가하고, 이것을 API 50 CHL 키트(비오메류사 제조, 각 웰의 바닥에는 각각 49종류의 당이 발라져 있다)의 각 웰에 분주하였다. 마지막으로 미네랄 오일을 중층하고, 멸균수를 넣은 트레이에 세트하였다. 37℃에서 48시간 배양한 후에, 각 웰에 있어서의 색조의 변화를 관찰함으로써, 자화능 유무의 판정을 행하였다.
2. 자화 능력의 시험 결과
IJH-SONE68주의 49종류의 당류에 대한 자화 능력을 조사한 결과는, 표 1에 나타낸 바와 같다. 표 1에는, 특허 공개 공보에 기재된, 다른 Lactobacillus paracasei에 대하여 동일한 키트를 사용하여 조사한 자화 능력도 더불어 나타냈다.
Figure pct00001
표 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, IJH-SONE68주는, 다른 Lactobacillus paracasei에 비하여, 분해되면 청산을 발생할 가능성이 있는 아미그달린이나, 멜라닌 생성을 저해하여 미백 효과가 명시되어 있는 알부틴을 자화할 수 없어, 분해되지 않기 때문에, 안전성이 우수하고, 화장품의 첨가제로서 사용한 경우에 미백 효과가 우수하다고 할 수 있다. 또한, 다른 Lactobacillus paracasei는 D-아도니톨을 자화할 수 없고, D-튜라노스를 자화할 수 있는 반면, IJH-SONE68주는 D-아도니톨을 자화할 수 있고, D-튜라노스를 자화할 수 없다는 특징도 갖는다.
실시예 4
1. IJH - SONE68주가 생성하는 다당체의 분리 정제
IJH-SONE68주가 생성하는 균체외 다당을 이하의 방법으로 분리 정제하였다.
IJH-SONE68주를 MRS 액체 배지에서 증식의 정상기까지 정치 배양하였다. 이 배양액 5 mL를 종배양액으로 하고, 5 L의 다당체 생성용 반합성 배지(그 조성은 후술한다)에 식균한 후, 37℃에서 120시간 정치 배양하였다. 배양액을 4℃로 냉각한 후, 배양액 상청 중에 포함되는 단백질을 변성시켜, 나중 단계에서 침전으로서 제거하기 위하여, 202.5 mL의 100% 트리클로로아세트산 수용액을 첨가하고, 혼화한 후에 30분간 정치하였다. 원심에 의해 침전을 제거하고, 회수한 상청에 등량의 아세톤을 첨가하여 혼화한 후, 4℃에서 하룻밤 정치시킴으로써, IJH-SONE68주가 생성하는 다당체를 침전시켰다. 침전물을 원심에 의해 회수한 후, 250 mL의 70% 에탄올로 침전물의 세정을 행하였다. 침전물을 바람 건조시킨 후, 75 mL의 50 mM Tris-HCl 버퍼(buffer)(pH 8.0)를 첨가하여 1시간 혼화함으로써, 침전물을 용해시켰다. 원심에 의해 불용성의 협잡물을 제거한 후, 회수한 상청에 대하여, 각각 750 μL의 1 mg/mL DNase 용액(Worthington사) 및 1 mg/mL RNase 용액(나카라이테스크사)을 첨가하고, 37℃에서 8시간 반응시켰다. 계속해서 750 μL의 2 mg/mL proteinase K 용액(와코 순약 공업사 제조)을 첨가하고, 37℃에서 16시간 반응시켰다. 반응 후의 용액을 4℃로 냉각한 후, 첨가한 각 효소를 변성시켜, 다음의 원심에서 침전으로서 제거하기 위하여, 8.75 mL의 100% 트리클로로아세트산 수용액을 첨가하여 혼화하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 원심에 의해 침전물을 제거하고, 얻어진 상청에 대하여 262.5 mL의 100% 에탄올을 첨가하여, 확실히 혼화한 후, 원심에 의해 IJH-SONE68주가 생성하는 다당체를 침전물로서 회수하였다. 50 mL의 70% 에탄올로 침전물을 세정한 후에 바람 건조시키고, 적량(약 25 mL)의 정제수를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 정치함으로써, 다당체를 용해시켰다. 용해 후의 다당체 샘플은, 10,000 MWCO의 한외 여과 유닛(메르크사)을 사용하여, 용매를 정제수로 치환하면서, 회수한 샘플 중의 단당류 등의 소분자를 제거하여, 정제된 다당체 샘플을 얻었다.
정제한 다당체 샘플을, 미리 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)로 평형화한 TOYOPEARL DEAE-650M 수지(토소 주식회사)를 충전한 오픈 칼럼(2.5 × 22 cm)에 어플라이하고, 중성 다당 획분과 산성 다당 획분으로 분리 정제하기 위한 칼럼 워크를 행하였다. 용액은 동 버퍼를 사용하고, 유속은 1 mL/min으로 고정하였다. 또한, 용출액은 6 mL마다 다른 시험관에 회수하였다. 먼저, 개시부터 240분까지의 동안에는 동 버퍼로 용출시켰다(시험관 번호 1-40). 다음으로, 240분의 시점부터 600분의 시점까지는, 동 버퍼를 사용한 0-500 mM NaCl의 농도 구배를 만들고, 용출을 계속하였다(시험관 번호 41-100). 칼럼 분리 스펙트럼을 도 2에 나타낸다. 시험관에 용출시킨 모든 샘플에 대하여, 페놀황산법(후술한다)에 의해 다당체의 존재를 확인한 후, 해당하는 시험관 내의 용액을 각각 중성 다당 획분, 산성 다당 획분으로서 정리하였다. 각각의 획분은 10,000 MWCO의 한외 여과 유닛을 사용하여, 용매를 정제수로 치환하면서, 회수한 샘플 중의 단당류 등의 소분자를 제거하였다.
이상에 의해, IJH-SONE68주가 생성하는 균체외 다당으로서 중성 다당 획분 및 산성 다당 획분이 분리 정제되었다.
다당체 생성용 반합성 배지는 Kimmel SA, Roberts RF. Development of a growth medium suitable for exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus RR. Int. J. Food Microbiol., 40, 87-92(1998)에 기재된 배지를 이하와 같이 개변하였다.
다당체 생성용 반합성 배지[g/L]
Glucose 20
Tween 80 1.0
Ammonium citrate 2.0
Sodium acetate 5.0
MgSO4·7H2O 0.1
MnSO4·5H2O 0.05
K2HPO4 2.0
Bacto casitone 10.0
Vitamine Soln. 2 mL
Trace element Soln. 1 mL
Vitamine Soln. [g/L]
4-aminobenzoic acid 0.05
Biotin 0.001
Folic acid 0.025
Lipoic acid 0.025
Nicotinic acid 0.1
Pantothenic acid 0.05
Pyridoxamin-HCl 0.25
Vitamine B12 0.05
Pyridoxine 0.025
Riboflavin 0.05
Thiamine 0.1
Trace element Soln.은, Kets EPW, Galinski EA, de Bont JAM. Carnitine: a novel compatible solute in Lactobacillus plantarum. Arch. Microbiol., 192, 243-248(1994)에 기재되어 있고, 그 조성은 이하와 같다.
Trace element Soln. [g/L]
25% HCl 10 mL
FeCl2·4H2O 1.5
CoCl2·6H2O 0.19
MnCl2·4H2O 0.1
ZnCl2 0.07
H3BO3 0.006
Na2MoO4·2H2O 0.036
NiCl2·6H2O 0.024
CuCl2·2H2O 0.002
페놀황산법(DuBois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F., Colorimetric method for determination of sugars and related substances., Anal. Chem., 28, 350-356(1956))
30 μL의 대상 샘플과 등량의 5 w/v % 페놀 수용액을 혼화한 후, 150 μL의 농황산을 첨가하여 혼화시키고, 반응을 개시시킨다. 10분 후에 즉시 빙냉하고, 반응을 정지시킨다. 반응액의 490 nm에 있어서의 흡광도를 측정함으로써, 당류의 농도를 측정하였다. 한편, 농도의 결정에는, 글루코스를 표품으로 하여 동 실험을 행함으로써 제작한 검량선을 사용하였다.
2. 균체외 다당의 분석
상기한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피(TOYOPEARL DEAE-650M 수지(토소 주식회사))에 의해 정제된 균체외 중성 다당을, 프로톤-NMR 및 카본-NMR 처리하여, 얻어진 각각의 NMR 프로파일을 도 3에 나타냈다. 이들 NMR 프로파일로부터의 균체외 중성 다당의 구조 해석 결과를 도 4에 나타냈다.
이 구조 해석 결과로부터, IJH-SONE68주가 생성하는 균체외 중성 다당은, N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 것이 밝혀졌다.
3. IJH - SONE68주의 균체외 다당의 생합성 유전자 클러스터의 해석
실시예 1에 기재한 IJH-SONE68주의 게놈 서열의 어노테이션에 기초하여, 2개의 균체외 다당 생합성 유전자 클러스터가 게놈 DNA 상에 발견되었다(도 5). 그 중의 하나의 23 kb의 클러스터를 pcel 클러스터라고 명명하며, 이 pcel 클러스터는, 기능 불명의 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 18개의 오픈 리딩 프레임(ORF(pce1A~R))으로 구성되어 있었다. 다른 하나의 28 kb의 클러스터를 pce2 클러스터라고 명명하며, 이 pce2 클러스터는, 12개의 완전한 ORF와 3개의 단축(truncated) ORF(pce2A~O)를 포함하고 있었다. 또한, 12개의 트랜스포사제 관련 유전자가 pce2 클러스터 상에 발견되었다.
균체외 다당의 생합성에 필요한 단백질을 코드하는 유전자에 관해서는, 쇄장 인자로서 작용하는 단백질-티로신포스파타제 Wzb를 코드하는 wzb 유전자(Yother J. Annu. Rev. Microbiol., 65, 563-581(2011))는 pcel 클러스터에는 발견되지 않았다. 한편, pce2 클러스터 상에는, 당 중합의 최초의 공정을 촉매하는 프라이밍 글리코실트랜스페라제(van Kranenburg R, Vos HR, van Swam II, Kleerebezem M, de Vos WM., J. Bacteriol., 1999 Oct; 181(20): 6347-6353)와 상동성을 나타내는 유전자는 존재하지 않았다.
IJH-SONE68주, ATCC 334주(Makarova, K. et. al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103(42), 15611-15616(2006)) 및 JCM 8130T주(Toh, H. et. al, PLoS ONE 8, e75073(2013))의 3개의 유산균 사이의 게놈 재편성 맵을 작성하였다(도 6). 이 맵으로부터, pce2 클러스터 영역이 IJH-SONE68주에 특이적인 것을 알 수 있다. 한편, pcel 클러스터에 상동성을 나타내는 유전자 클러스터는, ATCC334주의 게놈에서는 보이지 않지만, JCM8130T주에는 존재하였다.
상기한 상동성 검색에 기초하여, pcel 클러스터 및 pce2 클러스터 상에 wzb 유전자 및 프라이밍 글리코실트랜스페라제 유전자와 각각 상동의 유전자가 보였다. IJH-SONE68주의 게놈 DNA에는 다른 클러스터 등은 발견되지 않았으므로, 균체외 다당의 생합성에 필요한 유전자는 pcel 클러스터 및 pce2 클러스터에서 서로 보완되어 있다고 생각되었다. 실제로, pcel 클러스터 및 pce2 클러스터는 불과 34 kb밖에 떨어져 있지 않았다.
pce2 클러스터에 있어서, pce2J라고 명명한 글리코실트랜스페라제 유전자의 하나로부터 추정된 단백질은, 이미 알려져 있는 β-1,6-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제에 보이는 pfam02485 모티프 또는 도메인(Genes Dev. 1993 Mar; 7(3): 468-478 및 J. Biol. Chem., 1999 Jan 29; 274(5): 3215-3221)과 동일한 모티프 또는 도메인을 갖고 있는 것이 발견된 점에서, pce2 클러스터 중의 이 단백질을 코드하는 구조 유전자가 중성 다당의 생합성에 관여하고 있는 것이 시사되었다. 실제로, pce2 클러스터는, ATCC 334주 및 JCM 8130T주와 비교하여 IJH-SONE68주 게놈에 특이적이며, pce2 클러스터로부터 신규한 구조의 중성 다당이 생합성된다고 생각된다.
실시예 5
IJH - SONE68주가 생성하는 균체외 다당체의 히알루로니다제 활성 저해
실시예 4에서 얻어진 IJH-SONE68주가 생성하는 균체외 다당인, 중성 다당 획분 및 산성 다당 획분을 포함하는 다당 샘플, 그리고 중성 다당 획분 및 산성 다당 획분의 히알루로니다제 활성 저해를 조사하였다.
1. 시험 방법
실시예 4에서 얻어진 중성 다당 획분 및 산성 다당 획분을 포함하는 다당체 샘플, 중성 다당 획분 및 산성 다당 획분으로부터 임의의 농도로 조정한 다당을 포함하는 수용액 10 μL에 대하여, 5 μL의 히알루로니다제 효소 용액(MP Biomedicals사, 4 mg/mL, 100 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 4.0))을 첨가하고, 37℃에서 20분 인큐베이트하였다. 그 후, 10 μL의 효소 활성화 용액(0.5 mg/ml Compound 48/80(MP Biomedicals사), 3.75 mg CaCl2·2H2O, 100 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 4.0))을 첨가하고, 다시 37℃에서 20분간 인큐베이트하였다. 계속해서, 25 μL의 히알루론산나트륨 용액(와코 순약 공업사, 0.8 mg/mL, 100 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 4.0))을 첨가하고, 추가로 37℃에서 40분간 반응시켰다. 반응 후, 10 μL의 0.4 M NaOH 수용액을 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 계속해서 10 μL의 100 mM 붕산칼륨 버퍼(pH 10.0)를 첨가한 후에 100℃에서 3분간 가열하고, 즉시 빙냉하였다. 반응액 40 μL를 200 μL의 p-DMAB 용액(후술한다)과 혼화하고, 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 585 nm에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 컨트롤로서, 히알루로니다제 효소 용액을 포함하지 않는 반응액에 대해서도 동일하게 조제하고, 실험을 행하였다.
다당체 샘플에 있어서의 효소 활성 저해율에 대해서는, 이하의 식으로부터 구하였다.
저해율(%) = 100 - (S/C) × 100
이 식에 있어서, C는 샘플을 포함하지 않는 경우의 효소 활성, S는 샘플을 포함하는 경우의 효소 활성을 나타낸다. 또한, 다당체 샘플의 IC50값에 대해서는, 함유 농도를 변화시킨 데이터를 복수 취득한 후, X축에 다당체 샘플 농도, Y축에 저해율을 취한 그래프로 플롯하고, 다음의 근사식으로부터 구하였다.
[수학식 1]
Y = α/(1 + βe- γX)
식 중, α, β 및 γ는 정수를 나타낸다.
p-DMAB 용액(Fujitani N, Sakai S, Yamaguchi Y, Takenaka H. Inhibitory effects of microalgae on the activation of hyaluronidase. J. Appl. Phycol., 13, 489-492(2001))
10 × 스톡 용액(5 g의 p-dimethylaminobenzaldehyde, 6 ml의 10 M HCl, 44 ml의 아세트산)을 사용 직전에 아세트산으로 희석하여 p-DMAB 용액을 조제하였다.
2. 시험 결과
얻어진 히알루로니다제에 대한 활성의 저해의 시험 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
표 2의 결과로부터 분명한 바와 같이, IJH-SONE68주가 생성하는 균체외 다당인, 다당체 샘플(중성 다당 획분 및 산성 다당 획분을 포함한다), 중성 다당 획분 및 산성 다당 획분은 높은 히알루로니다제 저해 활성을 나타냈다. 특히, 다당체 샘플 및 중성 다당 획분은 항염증 작용을 갖는 글리시리진산디칼륨과 동일 정도의 히알루로니다제 저해 활성을 나타냈다.
실시예 6
IJH - SONE68주의 내산성 특성
IJH-SONE68주의 내산성 특성을 조사하기 위하여, 인공 위액 및 인공 담즙에 대한 내산성 시험을 행하였다.
1. 인공 위액에 대한 내산성 시험
(1) 시험 방법
인공 위액은 일본 약국방 붕괴 시험 제1액(pH 1.2) 및 일본 약국방 붕괴 시험 제2액(pH 6.8)(모두 와코 순약 공업사 제조)을 사용하여 조제하였다. 0.04 w/v % 펩신(1:10000, 와코 순약 공업사 제조)을 함유하는, pH 3.0의 인공 위액을 조제하고, MRS 액체 배지에서 정상 상태까지 정치 배양한 IJH-SONE68주의 종배양액을 일정량 접종한 후, 1, 3, 5시간 후에 있어서의 생균수를 카운트하였다. 접종 시점에 있어서의 생균수를 100%로 하고, 생존율을 구하였다. 한편, 생균수를 계측할 때에는, 각 시간 경과 후의 용액의 일부를 적당히 단계 희석하고, BCP 첨가 플레이트 카운트 아가(닛스이 제약사)를 사용하여 혼석 배양(37℃, 혐기, 수 일)시키고, 발생한 콜로니수를 카운트함으로써, 그 희석액 중에 존재하는 생균수를 산출하였다. 동시에, Lactobacillus bulgaricus B-5b(http://www.gene.affrc.go.jp/databases-micro_search_detail.php?maff=401001)에 대해서도 시험을 행하였다.
(2) 시험 결과
얻어진 내산성 시험 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
표 3의 결과로부터 분명한 바와 같이, IJH-SONE68주는, Lactobacillus bulgaricus B-5b에 비하여, 인공 위액에 대하여 높은 내산성 특성을 갖는다.
2. 인공 담즙에 대한 내산성 시험
(1) 시험 방법
0.1, 0.2, 0.3 w/v %의 담즙말(와코 순약 공업사 제조)을 함유하는 MRS 액체 배지를 조제하고, MRS 액체 배지에서 정상 상태까지 정치 배양한 IJH-SONE68주의 종배양액을 0.1 v/v % 접종하고, 37℃에서 24시간의 정치 배양을 행하였다. 배양 종료 후, 담즙말을 포함하지 않는 MRS 배지의 균체의 탁도(O.D. 600 nm)를 100%로 하고, 각 농도의 담즙말을 포함하는 MRS 배지의 균체 탁도의 비율을 산출하였다. 동시에, Lactobacillus acidophilus L-54(일본 유업 기술 협회로부터 제공되고 있다) 및 Lactobacillus bulgaricus B-5b에 대해서도 시험을 행하였다.
(2) 시험 결과
얻어진 내산성 시험 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
표 4의 결과로부터 분명한 바와 같이, IJH-SONE68주는, Lactobacillus acidophilus L-54 및 Lactobacillus bulgaricus B-5b에 비하여, 인공 담즙에 대하여 높은 내산성을 갖는다.
실시예 7
IJH - SONE68주의 알코올 상해에 대한 효과
IJH-SONE68주의 알코올 상해에 대한 효과를 조사하기 위하여, 알코올성 간염 유발 모델 마우스에 대한 IJH-SONE68주의 영향에 대하여 검토하였다.
1. 시험 방법
알코올 기호성을 갖는 C57BL/6J계의 웅성 마우스(닛폰 쿠레아, 8주령)에, 에탄올 함유 사료를 6주일 섭취시킴으로써 알코올성 간염 유발 모델 마우스를 제작하고, 그 동안의 유산균 섭취의 유무가 미치는 영향을 관찰하였다. 구체적으로는, 사육 기간 중, 마우스를 먹이의 차이에 따라 이하의 3군((1)~(3))으로 나누고, 사육 개시 6주일 후에 채혈을 행하였다.
1): 양성 컨트롤군(에탄올 함유 사료 L10016만)
2): 음성 컨트롤군(에탄올 비함유 사료 L10015만)
3): IJH-SONE68주 투여군(에탄올 함유 사료 L10016 + 유산균 생균체)
에탄올 함유 사료 L10016:
Pre-Mix L10016A(Research Diet사)에 물 및 에탄올을 사용 직전에 혼합하여 조제
에탄올 비함유 사료 L10015:
Pre-Mix L10016A(Research Diet사)에 물 및 말토덱스트린을 사용 직전에 혼합하여 조제
한편, 마우스는 7주령의 것을 구입하고, 1군당 5마리로 하고, 1주간 순치를 위하여, 미리 보통 식이(오리엔탈 효모 제조, MF)로 사육한 후에 실험에 제공하였다. 사육은 히로시마 대학 카스미 캠퍼스 내의 카스미 동물 실험 시설에서 행하고, 또한, 사육 기간 중, 습도는 40-60%, 기온은 20-26℃를 유지하고, 12시간마다 조명의 ON/OFF가 절환되는 환경에서 행하였다. 개개의 마우스의 식별은 꼬리 부분을 애니멀 마커(무로마치 기계사 제조)에 의해 나누어 칠함으로써 행하였다(빨강, 파랑, 초록, 노랑, 무착색으로 구별).
시험 식이는, MRS 배지에서 각 유산균주를 배양, 세정한 것을, 에탄올 사료에 혼합한 것이다. 실험 중, 식이는 급이 용기에 넣은 것을 매일 교환하고, 자유 섭취할 수 있게 하였다. 한편, 물을 포함하여, 다른 식이는 일체 주지 않았다. 또한, 식이의 잔량에 대해서도 계측을 행하였다. 사육을 개시하고 나서 6주일 경과 후, 이소플루란 흡입 및 펜토바르비탈 복강 내 투여에 의해 마우스를 안락사시키고, 채혈을 행하였다. 혈액으로부터 회수한 혈청은, -80℃에서 동결 보존하였다. 혈액 생화학 검사를 행하여, 알코올 상해의 검사 지표가 되는, 혈청 중의 AST(아스파라긴산 아미노트랜스페라제), ALT(알라닌아미노트랜스페라제), ALP(알칼리포스파타제), LDH(락트산 탈수소 효소), LAP(류신아미노펩티다아제) 및 LIP(리파아제)의 값을 측정하였다. 각 측정값의 통계 해석은, SPSS 17.0(SPSS Japan)에 의해 행하였다.
2. 시험 결과
양성 컨트롤군(PC), 음성 컨트롤군(NC) 및 IJH-SONE68주 투여군(SONE68)에 대한 AST, ALT, ALP, LDH, LAP 및 LIP의 각 측정값(IU/L)을 도 7~12의 그래프에 나타냈다. 도 7~12의 그래프로부터 알 수 있는 바와 같이, IJH-SONE68주는, AST, ALT, ALP, LDH, LAP 및 LIP의 값을 양성 컨트롤군(PC)보다 감소시켜, 알코올 상해에 대한 우수한 예방 개선 효과를 갖는다.
실시예 8
IJH - SONE68주의 퓌레로의 적용
IJH-SONE68주를, 무화과 과실, 술지게미 등으로 이루어지는 퓌레에 적용한 예를 이하에 나타낸다.
무화과 과실을 적당한 크기로 썰어, 중량에 대하여 1.0(w/w)%의 셀룰라아제 「오노즈카」 3S, 0.5(w/w)%의 펙티나아제 3S, 0.5(w/w)%의 아스코르브산나트륨, 2.0(w/w)%의 술지게미(양조 부산물) 분말, 및 100(w/w)%의 순수를 첨가하고, 통째로 엑기스 장치(토요 고압사 제조)를 사용하여 50℃, 100 MPa의 조건 하에서 24시간 처리를 행하였다. 구체적으로는, 식칼로 대략 균등하게 1/4 사이즈가 되도록 분할한 무화과 과실을 처리용 파우치(하이브리백, 코스모 바이오사 제조)에 필요량 투입해 두고, 거기에 상기의 시약 전부를 용해시킨 수용액을 첨가한 후, 기포를 가능한 한 제거하여 시일러(폴리시일러, 애즈원사 제조)에 의해 시일하였다. 시일 후의 백을 통째로 엑기스 장치(2 L 타입, 토요 고압사 제조)에 넣고, 상기 조건으로 처리를 행하였다. 한편, 배양 전에는 클린 벤치(SANYO사 제조) 내에서 무균적으로 파우치를 개봉하고(알코올로 멸균 처리한 가위로), 미리 고압 멸균기(토미 정공사 제조) 처리에 의해 멸균 처리를 행한 용기(아이보이, 애즈원사 제조)에 무균적으로 내용물을 옮겼다.
조제한 퓌레에 대하여, 미리 MRS 배지를 사용하여 37℃에서 2-3일간 종배양한 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주의 균체 현탁액을 1(v/v)% 상당량이 되도록 첨가하고, 37℃에서 48시간 정치 배양을 행하였다. 구체적으로는, 먼저 나사 장착 시험관에 10 mL씩 분주한 MRS 배지(메르크사 제조)를 118℃, 15 min의 조건으로 고압 멸균하고, 거기에 -80℃에서 동결 보존되어 있는 IJH-SONE68주의 균액 스톡을 클린 벤치 내에서 식균하였다. 밀전 후, 배양기에서 37℃, 2-3일간 시험관 대에 세운 채 배양하였다. 배양 후, 배양액의 혼탁이 균일해질 때까지 전도 혼화시키고, 15 mL 용량의 원심 튜브(Nunc사 제조)에 클린 벤치 내에서 내용물을 옮겼다. 원심(에펜도르프사 제조)에 의해 균체를 침전시킨 후, 클린 벤치 내에서 배양액 상청을 버리는 동시에, 퓌레를 10 mL만큼 첨가하고, 밀전 후, 볼텍스 머신(Scientific Industries사 제조)에 의해 침전된 균체를 재현탁시켰다. 그 후, 클린 벤치 내에서 퓌레에 필요량의 균체 현탁 퓌레를 첨가하고, 밀전 후, 배양기(야마토 과학사 제조)에서 37℃에서 2-3일간, 보틀을 세운 채 배양을 행하였다.
이상에 의해 얻어진 퓌레는, 균체 현탁액을 첨가하지 않고 얻어진 퓌레에 비하여, 산미가 더해져 양호한 식감과 풍미가 얻어졌다.
실시예 9
난백 배지를 사용한 배양
IJH-SONE68주를 난백 배지를 사용하여 배양하고, 그 증식을 조사하였다.
1. 난백 배지의 조제 및 배양
(1). 방법
껍질째 가볍게 에탄올로 소독한 계란을 클린 벤치 중에서 깨뜨려, 난황과 난백으로 분할하고, 난백 부분만을 취득하였다. 난백은 50 mL 용량 코니컬 튜브에 나눠 담고, 볼텍스에 의한 교반을 행함으로써 균일한 점도로 한 후, 배양용으로 다른 튜브에 균일한 양이 되도록 분주하였다.
종배양한 IJH-SONE68주의 유산균의 배양액을, 무균적으로 각각의 튜브에 최종농도 1 v/v %가 되도록 식균하고, 정치 배양을 행하였다. 마찬가지로, 다른 유산균인 페디오코커스·펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)(LP28주)를 사용하여 배양을 행하였다.
(2). 결과
배양 결과를 도 13에 나타냈다. 도 13으로부터 알 수 있는 바와 같이, IJH-SONE68주의 유산균은 난백을 사용한 배지에서, 매우 많이 증식하였다.
2. 난백에 글루코스 및 해수 농축 간수를 첨가한 배지의 조제 및 배양
(1). 방법
상기 1의 방법으로 배양을 행할 때, 난백에 최종농도가 1 w/v %가 되도록 글루코스를 첨가하고, 또한, 마찬가지로 최종농도가 1 v/v %가 되도록 해수 농축 간수(조성: Na+: 92 mg; Ca2 +: 3,500 mg; Mg2 +: 6,400 mg; 및 K+: 2,300 mg)를 첨가하여, 배양을 행하였다. 구체적으로는, 유산균의 배양 전에, 필터 멸균 처리를 행한 10 w/v % 글루코스 수용액을 난백의 1/10 용량, 그리고 마찬가지로 필터 멸균을 행한 해수 농축 간수를 난백의 1/100 용량, 각각 무균적으로 첨가하여, 배양을 행하였다.
(2). 결과
배양 결과를 도 14에 나타냈다. 도 14로부터 알 수 있는 바와 같이, IJH-SONE68주의 유산균은, 난백에 글루코스 및 해수 농축 간수를 첨가한 배지에서, 현저하게 증식하였다.
이들 결과로부터, IJH-SONE68주의 유산균은, 난백을 사용한 배지 중에서도 강한 증식 능력은 발휘하기 때문에, 난백 중에 존재하는, 세균 세포벽을 분해하는 효소인 리소자임이나, 킬레이트 작용에 의해 세균의 철 이용을 방해하는 작용을 갖는 트랜스페린 등에 대한 생체 방위 기능이 강한 것을 알 수 있다.
이상의 상세한 설명으로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 이하의 발명이 제공된다.
[1] 균체외 다당으로서 N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 생성하는 유산균.
[2] 유산균이 락토바실러스(Lactobacillus)속에 속하는 유산균인 상기 [1]에 기재된 유산균.
[3] 유산균이 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균인 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 유산균.
[4] 유산균이 무화과 유래의 유산균인 상기 [1]~[3] 중 어느 하나에 기재된 유산균.
[5] 유산균이 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주(수탁 번호 NITE BP-02242) 또는 그것과 동등한 유산균인 상기 [1]~[4] 중 어느 하나에 기재된 유산균.
[6] 중성 다당이 히알루로니다제 활성 저해를 갖는 상기 [1]~[5] 중 어느 하나에 기재된 유산균.
[7] 상기 [1]~[6] 중 어느 하나에 기재된 유산균을 함유하는 조성물.
[8] 조성물이 음식품 조성물인 상기 [7]에 기재된 조성물.
[9] 음식품이, 음료, 기능성 식품, 발효 식품 또는 서플리먼트인 상기 [8]에 기재된 조성물.
[10] 조성물이 의약 조성물인 상기 [7]에 기재된 조성물.
[11] 조성물이 사료 조성물인 상기 [7]에 기재된 조성물.
[12] 조성물이 화장품 조성물인 상기 [7]에 기재된 조성물.
[13] 히알루로니다제 저해를 위한 상기 [7]~[12] 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[14] 항알레르기를 위한 상기 [7]~[12] 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[15] 항알코올상해를 위한 상기 [7]~[12] 중 어느 하나에 기재된 조성물.
[16] 조성물의 유효 성분으로서의 상기 [1]~[6] 중 어느 하나에 기재된 유산균의 사용.
[17] 조성물이 음식품 조성물인 상기 [16]에 기재된 사용.
[18] 음식품이, 음료, 기능성 식품, 발효 식품 또는 서플리먼트인 상기 [17]에 기재된 사용.
[19] 조성물이 의약 조성물인 상기 [16]에 기재된 사용.
[20] 조성물이 사료 조성물인 상기 [16]에 기재된 사용.
[21] 조성물이 화장품 조성물인 상기 [16]에 기재된 사용.
[22] 조성물이 히알루로니다제 저해를 위한 조성물인 상기 [16]~[21] 중 어느 하나에 기재된 사용.
[23] 조성물이 항알레르기를 위한 조성물인 상기 [16]~[21] 중 어느 하나에 기재된 사용.
[24] 조성물이 항알코올상해를 위한 조성물인 상기 [16]~[21] 중 어느 하나에 기재된 사용.
[25] 상기 [1]~[6] 중 어느 하나에 기재된 유산균과 다른 성분을 혼합하는 것을 포함하는 조성물의 제조 방법.
[26] 조성물이 음식품 조성물인 상기 [25]에 기재된 제조 방법.
[27] 음식품이, 음료, 기능성 식품, 발효 식품 또는 서플리먼트인 상기 [26]에 기재된 제조 방법.
[28] 조성물이 의약 조성물인 상기 [25]에 기재된 제조 방법.
[29] 조성물이 사료 조성물인 상기 [25]에 기재된 제조 방법.
[30] 조성물이 화장품 조성물인 상기 [25]에 기재된 제조 방법.
[31] 조성물이 히알루로니다제 저해를 위한 조성물인 상기 [25]~[30] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[32] 조성물이 항알레르기를 위한 조성물인 상기 [25]~[30] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[33] 조성물이 항알코올상해를 위한 조성물인 상기 [25]~[30] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[34] 상기 [1]~[6] 중 어느 하나에 기재된 유산균을, 그것을 필요로 하는 대상에 적용하는 방법으로서, 상기 [1]~[6] 중 어느 하나에 기재된 유산균을 함유하는 조성물을 대상에 적용하는 것을 포함하는 적용 방법.
[35] 조성물이 음식품 조성물인 상기 [34]에 기재된 적용 방법.
[36] 음식품이, 음료, 기능성 식품, 발효 식품 또는 서플리먼트인 상기 [35]에 기재된 적용 방법.
[37] 조성물이 의약 조성물인 상기 [34]에 기재된 적용 방법.
[38] 조성물이 사료 조성물인 상기 [34]에 기재된 적용 방법.
[39] 조성물이 화장품 조성물인 상기 [34]에 기재된 적용 방법.
[40] 대상에 대하여 히알루로니다제 저해 작용을 발휘하는 상기 [34]~[39] 중 어느 하나에 기재된 적용 방법.
[41] 대상에 대하여 항알레르기 작용을 발휘하는 상기 [34]~[39] 중 어느 하나에 기재된 적용 방법.
[42] 대상에 대하여 항알코올상해를 발휘하는 상기 [34]~[39] 중 어느 하나에 기재된 적용 방법.
산업상 이용가능성
이상에 상세하게 설명한 바와 같이, 본 발명의 유산균은, 히알루로니다제 저해 활성을 발휘하여 항알레르기 효과를 나타내는 균체외 다당을 생성하고, 또한, 항알코올상해 효과를 나타낸다. 나아가서는, 본 발명의 유산균은 위산이나 담즙산에 대하여 높은 내성을 갖고, 난백을 사용한 배지 중에서도 강한 증식 능력을 발휘한다. 따라서, 본 발명의 유산균은, 음식품, 의약품, 사료, 화장품 등의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.
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Claims (15)

  1. 균체외 다당으로서 N-아세틸글루코사민이 α-1,6 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 중성 다당을 생성하는 유산균.
  2. 제1항에 있어서,
    유산균이 락토바실러스(Lactobacillus)속에 속하는 유산균인 유산균.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    유산균이 락토바실러스·파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 유산균인 유산균.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    유산균이 무화과 유래의 유산균인 유산균.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    유산균이 Lactobacillus paracasei IJH-SONE68주(수탁 번호 NITE BP-02242) 또는 그것과 동등한 유산균인 유산균.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    중성 다당이 히알루로니다제 저해 활성을 갖는 유산균.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 유산균을 함유하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    조성물이 음식품 조성물인 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    음식품이, 음료, 기능성 식품, 발효 식품 또는 서플리먼트인 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    조성물이 의약 조성물인 조성물.
  11. 제7항에 있어서,
    조성물이 사료 조성물인 조성물.
  12. 제7항에 있어서,
    조성물이 화장품 조성물인 조성물.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    히알루로니다제 저해를 위한 조성물.
  14. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    항알레르기를 위한 조성물.
  15. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    항알코올상해를 위한 조성물.
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