KR20190098549A

KR20190098549A - 우수한 살조능을 갖는 균주 및 이를 이용한 적조 제거 방법

Info

Publication number: KR20190098549A
Application number: KR1020180018635A
Authority: KR
Inventors: 이상섭; 김진수; 성혜영
Original assignee: 경기대학교 산학협력단
Priority date: 2018-02-14
Filing date: 2018-02-14
Publication date: 2019-08-22
Also published as: KR102033911B1

Abstract

본 발명은 우수한 살조능을 갖는 균주 및 이를 이용한 적조 제거 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 살조능을 갖는 로제이비르자(Roseivirga) 속 살조 미생물 균주, 상기 살조 미생물 균주, 균주의 배양물 또는 이들의 조합을 포함하는 적조 제거용 미생물 제제 및 상기 살조 미생물 균주, 균주의 배양물 또는 이들의 조합을 적조가 발생한 해역에 투입하는 단계를 포함하는 적조 제거 방법에 관한 것이다.

Description

우수한 살조능을 갖는 균주 및 이를 이용한 적조 제거 방법{SINGLE STRAIN HAVING EXCELLENT ALGICIDAL ACTIVITY AND METHOD FOR REMOVING RED TIDE USING THE SAME}

본 발명은 우수한 살조능을 갖는 균주 및 이를 이용한 적조 제거 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 적조 발생 원인 조류들 중 차토넬라 마리나(Chattonella marina), 아카시오 상기니아(Akashiwo sanguinea) 및 헤테로캡사 트리큐트라(Heterocapsa triquetra)에 대한 선별적 살조능이 우수한 균주 및 이를 이용한 적조 제거 방법에 관한 것이다.

적조란 일반적으로 해양에 서식하는 동식물성 플랑크톤, 원생동물 및 박테리아와 같은 미생물이 일시에 다량으로 증식되거나 또는 집적되어 바닷물의 색깔을 변색시키고 해양 생물에 나쁜 영향을 미치는 현상을 뜻한다. 적조 현상은 어패류를 폐사시키거나 독화시켜 수산업에 막대한 피해를 주고, 심지어 인간에까지 그 영향을 미쳐 직간접적으로 우리에게 심각한 문제를 야기시키고 있다. 이와 같은 적조 현상은 세계의 모든 연안 수역에서 널리 발생하며, 계절에 관계없이 상습적으로 발생하고 있고, 특히 적조 생물은 규조류에서 편모조류로 바뀌어 가고 고밀도화되어 가는 경향을 보이고 있다.

적조를 일으키는 생물은 식물성 플랑크톤으로 규조류(diatom), 편모조류(dinoflagellate), 남조류(blue-green algae), 미세조류(microalgae), 원생동물 등을 들 수 있는데, 우리나라에서 발견된 것만 해도 50여 종에 이른다. 플랑크톤의 종류에 따라 바닷물의 색깔은 적색으로 국한되지 않고 다갈색, 청색, 백색 등으로 나타나기도 한다.

한편, 지금까지 알려진 적조 원인 생물의 제거 방법은 화학 약품 살포법, 초음파 및 오존처리법, 해면회수 및 침강법, 황토 살포법 등이 있다. 이러한 방법 중 가장 많이 사용되고 있는 화학약품 살포법은 황산구리(CuSO₄), 이산화염소(ClO₂), 시마진(Simazine) 등을 살포하는 방법으로서 과거부터 이용되어 왔는데, 그 중 비용이 가장 저렴하여 널리 이용되는 황산구리는 유해성 편모조류에만 특이적(specific)이지 않아 적조 원인 생물 외에 다른 해양생물에까지 영향을 끼쳐, 수중의 다른 생물에 대한 독성 및 부식의 측면에서 문제를 일으킬 수 있으며, 또한 상기 황산구리는 일시적 효과만 나타내기 때문에 반복 사용해야 하며, 조류의 적조 발생시 수반되는 높은 알칼리성 환경 조건 하에서는 황산구리가 불안정해지기 때문에 많은 양을 처리하여야 하므로 비경제적이라는 단점이 있다.

대한민국등록특허 제0407829호에는 초음파 처리법을 통한 적조제거 방법이 개시되어 있는데, 이러한 기술은 초음파로 적조 원인 생물의 세포를 파괴하는 방법이고, 오존처리법은 적조 발생 수역에 고압의 오존을 투입하여 적조로 인한 독성을 중화시키는 방법으로, 두 방법 모두 실용화 단계에는 이르지 못하고 있다. 해면회수 및 침강법은 원심분리기, 응집본조, 혼합조 및 가압부상조로 구성된 가압부상분리장치를 이용하여 기포를 발생시켜 적조 생물을 흡착, 부상시키고 해표면에서 회수하는 방법으로 우리나라에서 널리 사용하고 있다. 또한, 대한민국 등록 특허 제0325396호에는 황토 살포법에 의한 적조 제거 방법이 개시되어 있는데, 즉, 황토(계면활성점토. Montmorillonite)를 해수 중에 살포하여 적조생물을 흡착 침강시키고, 황토 속의 알루미늄 이온이 적조 원인 생물의 세포를 파괴시키는 성질을 이용한 방법으로 우리나라에서 널리 사용하고 있다. 그러나, 해수 중에 황토를 살포하면 부유 물질이 증가되어 어류 양식장과 저층에 정착 생물이 살고 있는 어장에서는 어류 아가미 폐쇄로 인한 호흡 장애 발생 등과 같이 생물에 영향을 미칠 수 있으므로 주의를 요한다. 더불어, 황토는 적조 생물을 바다 밑으로 가라앉혀 죽이므로 바다 속에 2차 오염을 유발할 것으로 여겨진다.

적조 현상을 제어하기 위한 또 다른 방법으로 많은 생물학적인 방법들이 시도되고 있으며, 적조 현상에 있어서 박테리아의 역할이 중요하게 부각되고 있다.

따라서 상술한 문제점을 해소할 수 있으면서 동시에 적조를 효과적으로 제거할 수 있는 새로운 미생물이 제공되는 경우 관련 분야에서 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명의 한 측면은 살조능이 우수한 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 측면은 살조능이 우수한 균주를 포함하는 적조 제거용 미생물 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 살조능이 우수한 균주 또는 미생물 제제를 이용하여 효과적으로 적조를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 견지에 의하면, 살조능을 갖는 로제이비르자(Roseivirga) 속 살조 미생물 균주가 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 살조 미생물 균주, 균주의 배양액 및 균주의 배양액을 원심분리 후 획득한 상등액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 적조 제거용 미생물 제제가 제공된다.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 살조 미생물 균주, 균주의 배양액 및 균주의 배양액을 원심분리 후 획득한 상등액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 적조가 발생한 해역에 투입하는 단계를 포함하는 적조 제거 방법이 제공된다.

본 발명에 의하면, 2차 오염을 유발하거나 다른 생물에 유해한 영향을 미치지 않으면서 동시에 적조 미생물을 효과적으로 제거할 수 있는 새로운 살조능이 우수한 미생물 및 이를 이용한 적조 제거 방법이 제공되며, 본 발명의 의하면 적조 미생물을 효과적으로 제어함으로써, 해수, 양식장 등에서 발생하는 적조를 방제할 수 있다.

도 1은 차토넬라 마리나(Chattonella marina)에 영향을 미치지 않는 박테리아 배양배지의 선발을 위한 현미경 사진이다.
도 2(a)은 선발된 살조균(TF15)의 차토넬라 마리나(Chattonella marina)에 대한 대조군과 실험군의 살조율을 비교한 현미경 사진이며, 도 2(b)는 이와 관련한 그래프이다.
도 3(a)는 선발된 살조균(TF15)의 차토넬라 마리나(Chattonella marina)에 대한 시간 별 살조능의 변화를 나타낸 현미경 사진이며, 도 3(b)는 이와 관련한 그래프이다.
도 4는 선발된 살조균(TF15)의 배양 농도(O.D 600nm)에 따른 차토넬라 마리나(Chattonella marina)에 대한 살조효율을 나타낸 그래프이다.
도 5(a)는 선발된 살조균(TF15)의 아카시오 상기니아(Akashiwo sanguinea), 헤테로캡사 트리큐트라(Heterocapsa triquetra)에 대한 살조 효율을 나타낸 나타낸 현미경 사진이며, 도 5(b)는 다양한 적조 유해 조류에 대한 살조 효율을 나타낸 그래프이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면 살조능이 우수한 균주, 균주의 배양액 및 균주의 배양액을 원심분리 후 획득한 상등액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 미생물 제제 및 이들을 이용한 적조 제거 방법이 제공된다.

본 발명에 있어서, 살조능이 우수한 균주는 적조를 유발하는 조류(algea)를 효과적으로 살조(사멸)시키는 것을 의미하는 것이다. 이와 같은 작용에 의해 본 발명의 균주는 적조의 억제 또는 제거 등의 방제 활동에 널리 이용될 수 있다.

본 발명에 의하면, 우수한 살조능을 갖는 로제이비르자(Roseivirga) 속 살조 미생물 균주가 제공되며, 특히 상기 균주는 로제이비르자(Roseivirga) D-25 균주로, 로제이비르자 속 TF15(Roseivirga sp. TF15, 기탁번호 KACC81069BP)를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 로제이비르자 속 TF15(Roseivirga sp. TF15) KACC81069BP 균주는 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 2017년 11월 24일에 기탁하고, 2018년 1월 3일에 수탁번호 KACC81069BP로 수탁증을 획득하였다.

특히, γ-프로테오박테리아에 속하는 해양 세균이 살조균으로 많이 알려진 것에 비해 본 발명에 관한 살조능을 가진 상기 균주는 스핑고박테리아(Sphingobacteria)에 속하며, 이에 속하는 균에서의 살조능은 거의 밝혀지지 않은 상태이다. 또한, 상기 로제이비르자(Roseivirga) D-25 균주는 호기성 그람 음성, 로드 형태의 균 모양, 비운동성의 특징을 가지며, 최적 생장 온도는 30℃이고, 최적 염도는 2% Nacl, 최적 pH는 7.0 이다.

본 발명에 의한 상기 미생물 균주는 적조 미생물 중 특히 적조 발생 조류들 중 아카시오 상기니아(Akashiwo sanguinea), 헤테로캡사 트리큐트라(Heterocapsa triquetra) 또는 이들의 조합에 대한 선별적 살조능을 갖는 것이다.

특히, 살조 미생물 균주, 균주의 배양액 및 균주의 배양액을 원심분리 후 획득한 상등액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 이용하여 우수한 살조능을 발현할 수 있다.

한편, 본 발명에 의하면 상술한 바와 같은 우수한 살조능을 갖는 본 발명의 미생물 균주를 포함하는 적조 제거용 미생물 제제가 제공되며, 보다 상세하게는 상기 본 발명의 살조 미생물 균주, 균주의 배양액 및 균주의 배양액을 원심분리 후 획득한 상등액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 적조 제거용 미생물 제제가 제공된다.

상기 미생물 제제는 적조 발생 조류들 중 아카시오 상기니아(Akashiwo sanguinea), 헤테로캡사 트리큐트라(Heterocapsa triquetra) 또는 이들의 조합에 대한 선별적 살조능을 갖는 것이다.

상기 미생물 제제는 예를 들어 상기 균주를 담체에 고정화시켜 제조할 수 있으며, 이와 같이 담체를 이용하는 경우 적조 발생 해역에 적용하는 경우에는 균주의 안정적인 분포를 가능하게 하며, 해수에 희석되는 정도가 저감되고 이에 따라 지속적으로 살조능을 유지할 수 있도록 한다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 상술한 바와 같은 본 발명의 살조 미생물 균주, 균주의 배양액 및 균주의 배양액을 원심분리 후 획득한 상등액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 적조가 발생한 해역에 투입하는 단계를 포함하는 적조 제거 방법이 제공된다.

이때, 적조가 발생한 해역에 투입되는 살조 미생물 균주는 O.D 600nm에서 0.4 내지 1의 농도로 투입되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 O.D 600nm에서 0.6 내지 1의 농도로 투입되는 것이다.

도 4를 참고하면, 살조 미생물 균주의 농도가 O.D 600nm에서 0.4 이상인 경우 살조 효율이 50% 이상인 것을 확인할 수 있으며, 0.6 이상이 경우에는 90% 이상에 이르러 우수한 살조 효율을 발현할 수 있다.

이때, 상기 O.D 값의 기준(control)은 TF15의 균을 접종하지 않고 차토넬라 마리나(Chattonella marina) 조류에 R2A 3.5% Nacl 배지만 첨가하여 계수한 수치이다.

한편, 본 발명의 살조 미생물 균주에 의한 살조 효과는 적조제거를 위해 처리한 후 약 6시간 이후부터 현저한 살조 효과를 발현하는 것으로, 18시간 이후에는 약 90% 이상의 살조 효과를 나타낼 수 있다.

특히, 본 발명의 적조 제거 방법에 의해 처리 가능한 상기 적조는 적조 발생 조류들 중 아카시오 상기니아(Akashiwo sanguinea), 헤테로캡사 트리큐트라(Heterocapsa triquetra) 또는 이들의 조합을 포함하는 조류에 의해 발생한 적조인 것이다.

이와 같이 본 발명에 의하면, 2차 오염을 유발하거나 다른 생물에 유해한 영향을 미치지 않으면서 동시에 적조 미생물을 효과적으로 제거할 수 있는 새로운 살조능이 우수한 미생물 및 이를 이용한 적조 제거 방법이 제공되며, 본 발명의 의하면 적조 미생물을 효과적으로 제어함으로써, 해수, 양식장 등에서 발생하는 적조를 방제할 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 미생물 시료 채취

적조 제거 효율을 갖는 균주의 확보를 위하여 남해안에서 적조가 빈번히 발생하는 해역인 경남 거제시 사등면 창호리의 해수와 울산광역시 장생포항의 준설토를 채취하였다. 시료채취는 2017년 5월 8일 거제시 해수, 2017년 6월 12일 울산광역시 장생포항 준설토 1차, 2017년 6월 21일 울산광역시 장생포항 준설토 2차로 총 3회로 진행하였다. 해수 시료는 채수통을 이용하여 20L씩 채취하였으며, 준설토 시료는 10kg씩 채취하였다. 채수한 해수와 준설토 시료는 아이스박스에 담아 운반하였다.

2. 균주 분리

채취한 시료를 바탕으로 하여 살조 미생물을 확보하기 위한 균주 분리 작업을 수행하였다.

(1) 장생포항 준설토 시료에서의 균주 분리

울산광역시 장생포항에서 확보한 준설토 500g에 마린 브로스(Difco 2261, 표 1) 500ml을 넣은 후 150rpm 1시간 쉐이킹(shaking)한 후, 8000rpm에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 확보하였다. 이후 상등액을 0.2um 포어 사이즈의 필터에 필터링을 한 후 필터에 남은 균주들을 마린 브로스(Difco 2261, 표 1) 5ml에 넣은 후 이를 마린 아가(Difco 2261, 표 1)에 도말하여 호기 조건, 온도 30℃, 48시간 동안 배양하였다.

(2) 거제시 해수 시료에서의 균주 분리

경남 거제시 사등면 창호리에서 확보한 해수 시료 1L를 0.2um 포어 사이즈의 필터에 필터링하였다. 이후 필터에 남은 균주들을 마린 브로스(Difco 2261, 표 1) 5ml에 넣은 후 이를 마린아가 (Difco 2261, 표 1)에 도말하여 호기 조건, 온도 30℃, 48시간 동안 배양하였다.

마린 배지 2216의 배지 조성(조절 pH 7.6 ±0.2)

펩톤	5 g
효모 추출물	1 g
페릭 시트레이트	0.1 g
소듐 클로라이드	35 g
마그네슘 클로라이드	5.9 g
마그네슘 설페이트	3.24 g
칼슘 클로라이드	1.8 g
포타슘 클로라이드	0.55 g
소듐 바이카보네이트	0.16 g
포타슘 브로마이드	0.08 g
스크론튬 클로라이드	34 mg
보릭산	22 mg
소듐 실리케이트	4 mg
소듐 플루오라이드	2.4 mg
암모늄 니트레이트	1.6 mg
디소듐 포스페이트	8 mg
D.W.	1000 ml

채취한 시료의 종류에 따른 분리균의 수를 하기 표 2에 나타내었다. 총 3회로 진행된 샘플링 과정을 통하여 분리된 균주의 수는 총 101종이었다. 이와 같이 분리된 균주들을 이용하여 살조능을 실험하였다. 하기 표 1에서 준설토 1차와 2차는 동일 지역에서 다른 날짜에 샘플링한 것이다.

	거제시 해수 (2017.05.08샘플링)	울산 장생포항 1차 (2017.06.12 샘플링)	울산 장생포항 2차 (2017.06.21 샘플링)	합
분리 균주 수	24	35	42	101

3. 적조생물의 선택 및 배양

(1) 적조 생물 및 배지의 선택

연안에서 가장 빈번히 발생하는 적조 미생물을 선택하기 위하여 기존의 논문과 자료를 토대로 적조류 별 빈도를 조사하였다. 이때 국내에 발표된 적조관련 논문 및 해양수산과학원, 해양과학기술원 등의 데이터베이스를 활용하였다. 그 중 발생 빈도 수가 꾸준히 증가 추세에 있으며, 발생 시 어류의 아가미 기능 손상으로 질식사 위험을 높여 심각한 피해를 일으키고 있는 차토넬라 마리나(Chattonella marina)를 선택하여 살조 실험에 사용하였다. 선별한 적조는 한국해양과학기술원 남해연구소의 해양시료도서관으로부터 분양받았다. 분양받은 조류는 f/2 배지(표 3)를 사용하여 20℃ 12,000Lux, 명암주기 14:10으로 배양하였다.

성분	스탁 용액(Stock Solution)	양
NaNO₃	75 g/L dH₂O	1 mL
NaH₂PO₄H₂O	5 g/L dH₂O	1 mL
Na₂SiO₃9H₂O	30 g/L dH₂O	1 mL
미량 금속 용액	(see recipe below)	1 mL
비타민 용액	(see recipe below)	0.5 ml
해수		1L

하기 표 4는 f/2배지의 미량 금속 용액(trace metal solution)의 조성을 나타낸 것이고, 표 5는 f/2배지의 비타민 용액의 조성을 나타낸 것이다.

성분	프라이머리 스탁 용액(Primary Stock Solution)	양
FeCl₃6H₂O	-	3.15 g
Na₂EDTA2H₂O	-	4.36 g
CuSO₄5H₂O	9.8 g/L dH₂O	1 mL
Na₂MoO₄2H₂O	6.3 g/L dH₂O	1 mL
ZnSO₄7H₂O	22.0 g/L dH₂O	1 mL
CoCl₂6H₂O	10.0 g/L dH₂O	1 mL
MnCl₂4H₂O	180.0 g/L dH₂O	1 mL
D.W		1L

성분	프라이머리 스탁 용액(Primary Stock Solution)	양
티아민 HCl(vit. B₁)	-	200 mg
비오틴(vit. H)	0.1 g/L dH₂O	10 mL
시아노코발라민 (vit.B₁₂)	1.0 g/L dH₂O	1 ml
D.W		1L

(2)차토넬라 마리나(Chattonella marina)에 영향을 미치지 않는 배지의 선정

차토넬라 마리나(Chattonella marina)의 경우 살조능 스크리닝 과정에서 박테리아 배양배지의 영양성분 농도가 높을수록 박테리아 배지의 영향으로 사멸됨을 확인하였다. 따라서 차토넬라 마리나(Chattonella marina)가 사멸되지 않는 박테리아의 배지를 일차적으로 선정하였다.

총 4가지 배양배지 (마린 브로스(marine broth), 50% 마린 브로스(50% marine broth), 엘비 브로스(LB broth) 및 3.5% Nacl 알투에이 브로스(3.5% Nacl R2A broth))와 차토넬라 마리나(Chattonella marina)를 9:1 비율로 혼합배양하여 24시간 후 현미경 관찰을 통하여 차토넬라 마리나(Chattonella marina)의 사멸 여부를 확인하였다. 이때, 상기 3.5% Nacl R2A 브로스의 조성은 표 6에 나타내었다.

3.5% Nacl R2A 브로스의 조성(조절 pH 7.2 ± 0.2)

프로테오스 펩톤	0.5 g
효모 추출물	0.5 g
카제인의 산소화물(acid digest)	0.5 g
글루코즈	0.5 g
가용성 녹말	0.5 g
디포타슘 포스페이트	0.3 g
마그네슘 설페이트	0.024 g
소듐 피루베이트	0.3 g
소듐 클로라이드	35 g
D.W.	1000 ml

그 결과 3.5% Nacl 알투에이 브로스(3.5% Nacl R2A broth)에서만 배지의 영향을 받지 않고 차토넬라 마리나(Chattonella marina)가 활발히 움직이는 것을 확인하였다(도 1 참조). 따라서 3.5% Nacl 알투에이 브로스(3.5% Nacl R2A broth)에 박테리아를 접종하여 스크리닝을 수행하였다.

4. 살조능 균주의 스크리닝

분리된 해양 미생물 균주와 차토넬라 마리나(Chattonella marina)간의 혼합 배양액을 통해 각 해양 미생물 균주의 살조능을 조사하였다. 이때 사용된 방법은 현미경에서 조류 세포를 직접 계수하는 방법을 사용하였다. 살조능을 가진 균주의 스크린은 24 트랜스플레이트 웰(Transplate Well)에 조류 배양액 0.9mL과 분리된 박테리아(3.5%Nacl R2A 브로스, O.D 600nm 0.8 배양)의 배양액, 원심분리 후 상등액, 원심분리 후 펠렛 부유액 각각을 0.1ml 섞어 총 1.0ml으로 20℃ 12,000Lux, 명암주기 14:10으로 혼합배양 하였다. 그 후 24시간 후에 Sedgwick-Rafter 챔버에 1ml를 옮겨 lugol's 용액 1%로 조류를 고정하고 현미경 상에서 조류 수를 직접 계수하였다. 살조능은 하기 식 1을 참조하여 계산하였다.

[식 1]

이때, 하기와 같이 총 3가지 샘플을 준비하여 차토넬라 마리나에 대한 살조능 실험을 수행하였다.

-1번 샘플: TF15 배양액 샘플(3.5%Nacl R2A 브로스, O.D 600nm 0.8 배양) 1ml

-2번 샘플: TF15 배양액 1ml을 13000rpm에서 3분간 원심분리 후 얻은 상등액 샘플

-3번 샘플: TF15 배양액 1ml을 13000rpm에서 3분간 원심분리 후 상등액을 제거한 페렛(pellet)을 3.5% NaCl 1ml로 부유한 샘플

그 결과 로제이비르자(Roseivirga) TF15의 배양액(1번 샘플)과 상기 배양액을 원심분리 후 획득한 상등액(2번 샘플)에서 90% 이상의 살조능을 보이는 것을 확인하였으며, 반면 원심분리 후 상등액을 제거한 펠렛 부유액(3번 샘플)에서는 살조능이 없었다(표 7, 도 2 참조). 이는 TF15가 살조 물질을 세포 밖으로 분비함을 의미한다.

그동안 γ-프로테오박테리아에 속하는 해양 세균이 살조균으로 많이 알려진 것에 비해 이번 연구를 통해 선별된 균주, 로제이비르자(Roseivirga)속의 TF15는 스핑고박테리아(Sphingobacteria)에 속하며, 이에 속하는 균에서의 살조능은 거의 밝혀지지 않은 상태이다.

샘플	균주	차토넬라 마리나
샘플	균주	제거율 (%)	계수 (number of cells/mL)
1번 샘플	로제이비르자(Roseivirga) TF15 배양액	95.7	8.51×10²(control: 1.97×10⁴)
2번 샘플	로제이비르자(Roseivirga) TF15 원심분리 후 상등액	95.9	7.89×10²(control: 1.97×10⁴)
3번 샘플	로제이비르자(Roseivirga) TF15 원심분리 후 펠렛 부유액	4.1	1.89×10⁴ (control: 1.97×10⁴)

5. 로제이비르자 균주의 동정

본 발명의 로제이비르자(Roseivirga) TF15의 형태적인 동정은 마린아가(Marine Agar) 배지에서 배양형태를 관찰하였고, 마린아가(Marine Agar) 배지에서 자란 균주의 세부 구조를 광학현미경을 관찰하여 동정하였으며, 분자생물학적인 동정은 16s ribosomal RNA 부분 유전자 염기서열을 분석하였다. 분석에 사용된 16s ribosomal RNA (1448 bp) 부분 유전자 염기서열은 다음과 같다.

CAGGATGAACGCTAGCGGCAGGCCTAATACATGCAAGTCGAACGGTAGACTACTTTCGGGTAGTTGAGAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATGCAACCTACCTTGTACAGGGGGATAGCCCGAAGAAATTCGGATTAATACCCCATAGCATTACCAGATGGCATCTGAAGGTAATTAAAGATTTATCGGTACAAGATGGGCATGCGTGACATTAGTTAGTTGGTAGGGTAACGGCCTACCAAGACTATGATGTCTAGGGGTTCTGAGAGGATGATCCCCCACACTGGTACTGAGATACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTGGTCAATGGGCGAGAGCCTGAACCAGCCATGCCGCGTGCAGGAAGACGGCCTTCTGGGTTGTAAACTGCTTTTATACGGGAAGAAAAGACCCTTGCGAGGGAGATTGCCGGTACCGTATGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGGCCTTTAAGTCAGTGGTGAAAGCCTGCAGCTTAACTGTAGAACTGCCATTGATACTGGAGGCCTTGAGTGTACTAGAGGTAGGCGGAATTTATGGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATACCATAAAGAACACCGATAGCGTAGGCAGCTTACTGGAGTACAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTCGATGTTGGCGATACACTGTCAGCGTCCAAGCGAAAGCGTTAAGTAATCCACCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGTCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCTGGGCTAGAATGTGAGCGAATGATCCAGAGATGGATCAGTCTTCGGACGCGAAACAAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCAGCACGTAAAGGTGGGGACTCTAACAAGACTGCCTACGCAAGTAGAGAGGAAGGAGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGCCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGAGAGTACAGAGGGTCGCTACCTGGTAACAGGATGCCAATCTCAAAAAGCTCTTCTCAGTTCGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGCAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGACCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGGAGTTGGGTGGACCTGAAGATGGTTGCTGCAAGGCGCTATTTAGGGTAAAACCAGCGACTGGGGCTAAGTCG

로제이비르자(Roseivirga) TF15 균주의 16s rRNA 1448bp를 ncbi 검색 결과 Roseivirga sp . D-25 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 와 100% 동일하게 매칭됨을 확인하였다.

이에 본 발명자들은 상기와 같이 형태적, 분자적 특징을 종합하여 로제이비르자(Roseivirga) TF15 균주를 로제이비르자 D-25 (Roseivirga sp. D-25 )로 동정하였으며, 상기 균주를 기탁기관인 국립농업과학원 농업 유전자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2017년 11월 24일에 기탁하였다 (기탁번호 KACC 81069BP).

6. 고효율 균주의 시간 별 , 박테리아 농도 별 살조능 확인

로제이비르자(Roseivirga) TF15의 높은 살조능을 확인 후 세부적인 시간별 살조능 및 박테리아 농도 별 살조능을 확인하는 실험을 수행하였다.

(1) 고효율 균주의 시간 별 살조능 확인

24시간 혼합 배양을 통해 선발된 살조균의 시간별 살조능의 변화를 보기 위해서 매 6시간씩 계수하여 본 발명의 고효율 균주 로제이비르자(Roseivirga) TF15의 시간별 살조능을 확인하였다.

차토넬라 마리나 배양액 9ml에 3.5% Nacl R2A 브로스에 접종하여 O.D 0.9까지 배양한 로제이비르자(Roseivirga) TF15의 배양액 1ml을 넣어 총 10ml을 20℃의 온도, 12,000Lux, 명암주기 14:10으로 혼합 배양한 후 0시간부터 6시간, 12시간, 18시간, 24시간 별로 샘플링하여 Sedgwick-Rafter 챔버에 1ml씩 옮겨 현미경 상에서 조류의 수를 직접 계수하였다. 이때, 살조능은 상기 식 1을 동일하게 참조하여 계산하였다.

그 결과, 6시간 경과 시 79%의 살조능을 보였으며 24시간 경과 시에는 95% 이상의 살조능을 보였다(도 3 참조).

(2) 고효율 균주의 농도 별 ( O.D 600nm) 살조능 확인

24시간 혼합 배양을 통해 선발된 살조균 로제이비르자(Roseivirga) TF15의 농도 별 살조능의 변화를 보기 위해 아래와 같은 실험을 진행하였다.

차토넬라 마리나 배양액 0.9ml에 3.5% Nacl R2A 브로스에 접종한 TF15 배양액 0.1ml을 농도 별로(O.D 600nm 0.1 ~ O.D 600nm 1.0) 넣어 총 1ml씩 20℃의 온도에서, 12,000Lux, 명암주기 14:10으로 24시간 혼합 배양하였다. 그 후 Sedgwick-Rafter 챔버에 1ml를 옮겨 현미경 상에서 조류의 수를 직접 계수하였다. 이때, 살조능은 상기 식 1을 동일하게 참조하여 계산하였다.

그 결과 TF15의 O.D 600nm 0.4 이상에서 50% 이상, O.D 600nm 0.6 이상에서 90% 이상의 살조능을 보이는 것을 확인하였다(도 4 참조).

7. 로제이비르자 ( Roseivirga ) TF15의 다른 유해조류 살조능 확인

차토넬라 마리나 (Chattonella marina)에 우수한 살조능을 가지는 로제이비르자(Roseivirga) TF15가 우리나라 연안에서 자주 발견되는 다른 적조류에도 살조능을 보이는지 확인하는 실험을 수행하였다.

실험에 사용한 적조생물은 총 6가지이며 보다 상세하게, 아카시오 상기니아(Akashiwo sanguinea), 헤테로시그마 아카시오(Heterosigma akashiwo), 프로로센튬 미니멈(Prorocentrum minimum), 헤테로캡사 트리큐트라(Heterocapsa triquetra), 코클로디늄 폴리클리코이드(Cochlodinium polykrikoides) 및 스켈레토네마 코스타튬(Skeletonema costatum)이다.

상기의 적조생물 각각의 조류 배양액 0.9mL과 로제이비르자 TF15(3.5%Nacl R2A 브로스, O.D 600nm 0.8 배양)의 배양액 0.1ml을 섞어 총 1.0ml으로 혼합한 후 20℃ 12,000Lux, 명암주기 14:10으로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 Sedgwick-Rafter 챔버에 1ml를 옮겨 lugol's 용액 1%로 조류를 고정하고 현미경상에서 조류 수를 직접 계수하여 살조 효율을 측정하였다. 이때, 상기 O.D 값의 기준(control)은 TF15의 균을 접종하지 않고 차토넬라 마리나(Chattonella marina) 조류에 R2A 3.5% Nacl 배지만 첨가하여 계수한 수치이다.

그 결과 TF15의 배양액은 아카시오 상기니아(Akashiwo sanguinea), 헤테로캡사 트리큐트라(Heterocapsa triquetra)에 각각 86.3%, 76.3%의 살조능을 보였으며, 헤테로시그마 아카시오(Heterosigma akashiwo), 프로로센튬 미니멈(Prorocentrum minimum), 코클로디늄 폴리클리코이드(Cochlodinium polykrikoides) 및 스켈레토네마 코스타튬(Skeletonema costatum)에는 10% 미만의 낮은 살조능을 보였다(도 5 참조).

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

<110> Kyonggi University Industry & Academia Cooperation Foundation <120> SINGLE STRAIN HAVING EXCELLENT ALGICIDAL ACTIVITY AND METHOD FOR REMOVING RED TIDE USING THE SAME <130> DPP172433 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1448 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> RoseivirgaTF15 <400> 1 caggatgaac gctagcggca ggcctaatac atgcaagtcg aacggtagac tactttcggg 60 tagttgagag tggcgcacgg gtgcgtaacg cgtatgcaac ctaccttgta cagggggata 120 gcccgaagaa attcggatta ataccccata gcattaccag atggcatctg aaggtaatta 180 aagatttatc ggtacaagat gggcatgcgt gacattagtt agttggtagg gtaacggcct 240 accaagacta tgatgtctag gggttctgag aggatgatcc cccacactgg tactgagata 300 cggaccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatattg gtcaatgggc gagagcctga 360 accagccatg ccgcgtgcag gaagacggcc ttctgggttg taaactgctt ttatacggga 420 agaaaagacc cttgcgaggg agattgccgg taccgtatga ataagcaccg gctaactccg 480 tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttgtc cggatttatt gggtttaaag 540 ggtgcgtagg cgggccttta agtcagtggt gaaagcctgc agcttaactg tagaactgcc 600 attgatactg gaggccttga gtgtactaga ggtaggcgga atttatggtg tagcggtgaa 660 atgcatagat accataaaga acaccgatag cgtaggcagc ttactggagt acaactgacg 720 ctgaggcacg aaagcatggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa 780 acgatgatta ctcgatgttg gcgatacact gtcagcgtcc aagcgaaagc gttaagtaat 840 ccacctgggg agtacgctcg caagagtgaa actcaaagga attgacgggg gtccgcacaa 900 gcggtggagc atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttacctgg gctagaatgt 960 gagcgaatga tccagagatg gatcagtctt cggacgcgaa acaaggtgct gcatggctgt 1020 cgtcagctcg tgccgtgagg tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccctattgtt 1080 agttgccagc acgtaaaggt ggggactcta acaagactgc ctacgcaagt agagaggaag 1140 gaggggacga cgtcaagtca tcatggccct tacgcccagg gctacacacg tgctacaatg 1200 gagagtacag agggtcgcta cctggtaaca ggatgccaat ctcaaaaagc tcttctcagt 1260 tcggattgag gtctgcaact cgacctcatg aagttggaat cgctagtaat cgcgtatcag 1320 caatgacgcg gtgaatacgt tcccggacct tgtacacacc gcccgtcaag ccatgggagt 1380 tgggtggacc tgaagatggt tgctgcaagg cgctatttag ggtaaaacca gcgactgggg 1440 ctaagtcg 1448

Claims

살조능을 갖는 로제이비르자(Roseivirga) 속 살조 미생물 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 로제이비르자 속 TF15(Roseivirga sp. TF15, 기탁번호KACC81069BP)를 포함하는 살조 미생물 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 적조 발생 조류들 중 아카시오 상기니아(Akashiwo sanguinea), 헤테로캡사 트리큐트라(Heterocapsa triquetra) 또는 이들의 조합에 대한 선별적 살조능을 갖는 살조 미생물 균주.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 살조 미생물 균주, 균주의 배양액 및 균주의 배양액을 원심분리 후 획득한 상등액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 적조 제거용 미생물 제제.
제4항에 있어서, 상기 미생물 제제는 적조 발생 조류들 중 아카시오 상기니아(Akashiwo sanguinea), 헤테로캡사 트리큐트라(Heterocapsa triquetra) 또는 이들의 조합에 대한 선별적 살조능을 갖는 적조 제거용 미생물 제제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 살조 미생물 균주, 균주의 배양액 및 균주의 배양액을 원심분리 후 획득한 상등액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 적조가 발생한 해역에 투입하는 단계를 포함하는 적조 제거 방법.
제6항에 있어서, 적조가 발생한 해역에 투입되는 살조 미생물 균주는 O.D 600nm에서 0.4 내지 1의 농도로 투입되는, 적조 제거 방법.
제6항에 있어서. 적조가 발생한 해역에 투입되는 살조 미생물 균주는 O.D 600nm에서 0.6 내지 1의 농도로 투입되는, 적조 제거 방법.
제6항에 있어서, 상기 적조는 적조 발생 조류들 중 아카시오 상기니아(Akashiwo sanguinea), 헤테로캡사 트리큐트라(Heterocapsa triquetra) 또는 이들의 조합을 포함하는 조류에 의해 발생한 적조인, 적조 제거 방법.