KR20190093165A - Composition for promoting stability of Fusion Polypeptide Comprising GLP-1 and Immunoglobulin Hybrid Fc - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a composition for promoting stability of a fusion polypeptide comprising a glucagon like peptide (GLP) and an immunoglobulin hybrid Fc, a method for promoting stability, and the like. The composition for promoting stability of the fusion polypeptide comprises a fusion polypeptide; and one or more substances selected from the group consisting of buffers, surfactants, amino acids, sugars, and tonicity modifiers.

Description

GLP-1 및 면역글로불린 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드의 안정성 증진용 조성물 {Composition for promoting stability of Fusion Polypeptide Comprising GLP-1 and Immunoglobulin Hybrid Fc}Composition for promoting stability of Fusion Polypeptide Comprising GLP-1 and Immunoglobulin Hybrid Fc}

본 발명은 GLP-1 및 면역글로불린 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드의 안정성 증진용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 버퍼, 계면활성제, 아미노산, 당류, 및 장성 변형제로 구성된 군으로부터 하나 이상의 물질을 포함하는, GLP(glucagon like peptide)-1 또는 이의 유사체 및 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드의 안정성 증진용 조성물; 상기 융합 폴리펩타이드의 안정성 증진 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for enhancing the stability of GLP-1 and an immunoglobulin hybrid Fc fusion polypeptide, specifically comprising one or more substances from the group consisting of buffers, surfactants, amino acids, sugars, and tonicity modifiers, GLP ( composition for enhancing stability of a fusion polypeptide comprising glucagon like peptide) -1 or an analog thereof and an immunoglobulin Fc polypeptide; It relates to a method for enhancing the stability of the fusion polypeptide.

당뇨병은 유전적, 환경적 원인에 의해 인슐린 분비에 문제 또는 인슐린 기능에 이상이 생겨 혈액 속의 포도당이 세포의 에너지원이 되지 못하고 혈중에 높게 남아 있는 고혈당증(hyperglycemia) 증상을 보이는 대사성 질환으로, 합병증을 동반하여 현대에 가장 심각한 만성 질병이다. 이러한 당뇨병의 치료를 위하여 기본적으로 운동 및 식이요법이 선행되나, 이를 통해 혈당의 조절이 어려울 경우 당뇨병 치료제의 단독 혹은 병용 투여를 진행하게 된다. Diabetes mellitus is a metabolic disorder that causes hyperglycemia, a condition in which insulin secretion or insulin function is caused by genetic or environmental causes and glucose in the blood is not a cell energy source and remains high in the blood. Accompanying is the most serious chronic disease in modern times. For the treatment of diabetes, exercise and diet are basically preceded, but if it is difficult to control the blood sugar through this alone or in combination administration of diabetes treatment.

그러나, 현재 임상에서 사용되고 있는 기존 경구용 당뇨 치료제의 경우, 지속적인 혈당의 정상화 유지라는 긍정적인 측면 이외에 장기 복용시 저혈당 유발, 설사, 체중 증가, 심혈관계 문제, 간 독성 등과 같은 다양한 부작용을 일으킬 뿐 아니라 결국에는 췌장의 β 세포가 파괴되고 최후에 인슐린을 주사하게 된다. 또한, 최후의 치료 방법인 인슐린 투여 역시 매일 2-3회 피하주사를 해야 하기 때문에 불편함이 있으며 가장 큰 부작용인 저혈당 유발 가능성이 있다.However, the existing oral diabetes treatments currently used in the clinic, in addition to the positive aspects of maintaining a steady blood glucose normalization, in addition to causing various side effects such as hypoglycemia, diarrhea, weight gain, cardiovascular problems, liver toxicity, etc. Eventually, the β cells in the pancreas are destroyed and eventually injected with insulin. In addition, insulin treatment, which is the last treatment method, is also inconvenient because it requires subcutaneous injection 2-3 times daily, which may cause hypoglycemia, which is the biggest side effect.

이러한 문제점을 보완하기 위하여, 최근 차세대 당뇨병 치료제로 부각되는 것이 GLP-1 이다. GLP-1 및 그의 유사체와 유도체는 제2형 당뇨병 치료를 위한 임상 시험에서 좋은 가능성을 나타내며, 인슐린 분비 자극, 글루카곤 분비 저해, 위 공복화 저해, 위 운동성 또는 장 운동성 저해, 및 체중 감량 유도와 같은 수많은 생물학적 효과를 유도한다. 그러나, 생체 내에서는 DPP-4 라는 효소에 의하여 상기 GLP-1이 절단되어 불활성화되고, 그에 따라 매우 짧은 생체 내 반감기를 가져 치료제로써의 개발에 어려움이 있어 왔으며, 이에 생물학적 활성을 유지하면서 GLP-1의 반감기를 연장시키거나 신체로부터 펩타이드의 제거율을 감소시키기 위하여 다양한 접근법이 수행되어 왔다. To solve this problem, GLP-1 has recently emerged as a next-generation diabetes treatment. GLP-1 and its analogs and derivatives show good potential in clinical trials for the treatment of type 2 diabetes, such as stimulating insulin secretion, inhibiting glucagon secretion, inhibiting gastric fasting, inhibiting gastric or intestinal motility, and inducing weight loss. Induces numerous biological effects. However, in vivo, the GLP-1 is cleaved and inactivated by an enzyme called DPP-4, and thus has a very short in vivo half-life, thus making it difficult to develop a therapeutic agent, thereby maintaining GLP- Various approaches have been taken to extend the half-life of 1 or to reduce the removal rate of peptides from the body.

이와 관련하여, 본 발명자들은 GLP에 특이적으로 최적화된 면역글로불린 Fc를 선택하여, 증가된 반감기를 가지면서도 DPP-4 효소에 대해 우수한 저항성을 가지는 신규한 융합 폴리펩타이드를 제조하였다 (한국특허공개공보 제10-2016-0083810호). 다만, 상기 융합 폴리펩타이드를 효율적으로 운반, 보관하기 위해, 융합 폴리펩타이드 자체의 안정성과, 다양한 스트레스 요인에 대한 저항성을 증진시키기 위한 기술이 필요한 실정이다.In this regard, the present inventors have selected immunoglobulin Fc specifically optimized for GLP to prepare novel fusion polypeptides with increased half-life and excellent resistance to DPP-4 enzymes. 10-2016-0083810). However, in order to efficiently transport and store the fusion polypeptide, a technology for improving the stability of the fusion polypeptide itself and resistance to various stressors is required.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 기본 버퍼에 계면활성제, 아미노산, 당류, 및 장성 변형제와 같은 첨가제를 혼합한 조성물을 활용하여, 상기 융합 폴리펩타이드의 제형 안정성, 스트레스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Under this background, the present inventors can utilize the composition in which an additive such as surfactant, amino acid, saccharide, and tonicity modifier are mixed in the basic buffer to increase the formulation stability of the fusion polypeptide and resistance to stress. The present invention was completed by confirming.

한국특허공개공보 제10-2016-0083810호Korean Patent Publication No. 10-2016-0083810 한국공개특허공보 제10-2013-0110476호Korean Patent Publication No. 10-2013-0110476 한국공개특허공보 제10-2013-0034701호Korean Patent Publication No. 10-2013-0034701

본 발명의 하나의 목적은, GLP(glucagon like peptide)-1 또는 이의 유사체, 및 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드; 및 버퍼, 계면활성제, 아미노산, 당류, 및 장성 변형제로 구성된 군으로부터 하나 이상의 물질을 포함하는, 융합 폴리펩타이드의 안정성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is a fusion polypeptide comprising a glucagon like peptide (GLP) -1 or an analog thereof, and an immunoglobulin Fc polypeptide; And at least one substance from the group consisting of buffers, surfactants, amino acids, sugars, and tonicity modifiers.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은, GLP(glucagon like peptide)-1 또는 이의 유사체, 및 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드; 및 버퍼, 계면활성제, 아미노산, 당류, 및 장성 변형제로 구성된 군으로부터 하나 이상의 물질을 혼합하는 단계를 포함하는, 융합 폴리펩타이드의 안정성 증진 방법을 제공하는 것이다.Another object of the invention is a fusion polypeptide comprising a glucagon like peptide (GLP) -1 or an analog thereof, and an immunoglobulin Fc polypeptide; And admixing one or more substances from the group consisting of buffers, surfactants, amino acids, sugars, and tonicity modifiers.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.This will be described in detail as follows. In addition, each description and embodiment disclosed in this invention is applicable to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed in the present invention fall within the scope of the present invention. In addition, the scope of the present invention is not to be limited by the specific description described below.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 GLP(glucagon like peptide)-1 또는 이의 유사체, 및 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드; 및 버퍼, 계면활성제, 아미노산, 당류, 및 장성 변형제로 구성된 군으로부터 하나 이상의 물질을 포함하는, 융합 폴리펩타이드의 안정성 증진용 조성물을 제공한다.One aspect of the present invention for achieving the above object is a fusion polypeptide comprising a glucagon like peptide (GLP) -1 or an analog thereof, and an immunoglobulin Fc polypeptide; And at least one substance from the group consisting of buffers, surfactants, amino acids, sugars, and tonicity modifiers.

본 발명에서 상기 융합 폴리펩타이드는 한국특허공개공보 제10-2016-0083810호에 기재된 융합 폴리펩타이드일 수 있으며, GLP-hyFc, GLP-1-hyFc, GLP-1-hyFc 등으로 표현될 수 있다. 본 발명에서 상기 융합 폴리펩타이드에 대한 구체적인 내용 및 설명은 한국특허공개공보 제10-2016-0083810호에 서술된 내용을 준용할 수 있다.In the present invention, the fusion polypeptide may be the fusion polypeptide described in Korean Patent Publication No. 10-2016-0083810, and may be represented by GLP-hyFc, GLP-1-hyFc, GLP-1-hyFc, or the like. Details and description of the fusion polypeptide in the present invention may apply mutatis mutandis described in Korean Patent Publication No. 10-2016-0083810.

상기 융합 폴리펩타이드는 (a) GLP 또는 이의 유사체; (b) 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 상기 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드는 (i) 분리된 IgD 힌지 영역; 및 (ii) CH2 및 CH3 영역을 포함할 수 있다.The fusion polypeptide may comprise (a) GLP or an analog thereof; (b) an immunoglobulin Fc polypeptide, wherein said immunoglobulin Fc polypeptide comprises (i) an isolated IgD hinge region; And (ii) CH2 and CH3 regions.

바람직하게는, 상기 GLP 또는 이의 유사체의 C-말단이 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드의 N-말단과 결합된 것일 수 있으며, 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드 내에서는 IgD 힌지 영역의 C-말단이 CH2 및 CH3 영역의 N-말단과 결합된 것일 수 있다. 그에 따라, N-말단으로부터 C-말단 방향으로 GLP 또는 이의 유사체; IgD 힌지 영역; 및 CH2 및 CH3 영역이 차례로 결합되어 포함되는 것일 수 있다. 본 발명에서 "융합 폴리펩타이드"는 상기 GLP와 같은 생물학적 활성 분자와 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드가 융합된 형태를 의미하며, "Fc 융합 폴리펩타이드", "융합 단백질"과 같은 용어와 혼용될 수 있다.Preferably, the C-terminus of the GLP or analog thereof may be bound to the N-terminus of the immunoglobulin Fc polypeptide, and in the immunoglobulin Fc polypeptide the C-terminus of the IgD hinge region is the CH2 and CH3 region. It may be combined with the N-terminus. Accordingly, GLP or analog thereof from the N-terminus to the C-terminus; IgD hinge region; And CH2 and CH3 region may be included in order to combine. In the present invention, "fusion polypeptide" refers to a form in which a biologically active molecule such as GLP and an immunoglobulin Fc polypeptide are fused, and may be used interchangeably with terms such as "Fc fusion polypeptide" and "fusion protein".

본 발명에서 상기 GLP(glucagon like peptide, 글루카곤 유사 펩타이드)는 GLP-1 또는 GLP-2를 모두 포함하는 개념이다.In the present invention, the GLP (glucagon like peptide, glucagon-like peptide) is a concept including both GLP-1 or GLP-2.

본 발명의 용어 "GLP-1(glucagon like peptide-1)"은, 소화기관에서 분비되는 호르몬인 인크레틴의 일종으로, 섭취에 의존적으로 장관 내의 L 세포에서 분비되어 췌장의 인슐린 분비를 증가시키는 역할과 글루카곤의 분비를 억제하여 이로 인해 식후 혈당의 상승을 억제하는 역할을 하는 것으로 알려진 단백질이다. 이렇듯, GLP-1은 기존에 당뇨병 치료 용도가 널리 알려져 있었으며, 식욕의 생리적 조절에도 관여하여 체중 감소 효과도 보고되어 있다.The term "GLP-1 (glucagon like peptide-1)" of the present invention is a type of incretin, a hormone secreted by the digestive tract, and is secreted by L cells in the intestinal tract depending on ingestion to increase insulin secretion of the pancreas. It is a protein known to play a role in inhibiting the secretion of glucagon and thereby raising the post-prandial blood sugar level. As such, GLP-1 has been widely known for its use in treating diabetes, and has been reported to be involved in weight loss by participating in physiological control of appetite.

본 발명의 상기 조성물에는 상기 융합 폴리펩타이드 이외에도, 버퍼, 계면활성제, 아미노산, 당류, 및 장성 변형제로 구성된 군으로부터 하나 이상의 물질이 포함될 수 있다.In addition to the fusion polypeptide, the composition of the present invention may include one or more substances from the group consisting of buffers, surfactants, amino acids, sugars, and tonicity modifiers.

본 발명에서 상기 '버퍼(buffer)'란 버퍼 용액으로, 용액의 pH를 일정하게 유지하는 완충 작용을 갖는 용액을 의미하며, '기본 버퍼'로도 불릴 수 있다. 본 발명에서는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 pH를 유지하며, 구체적으로 상기 버퍼는 시트레이트, 히스티딘, 및 인산 나트륨(NaPi)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 버퍼일 수 있다. In the present invention, the 'buffer' refers to a buffer solution, a solution having a buffering action to maintain a constant pH of the solution, and may also be referred to as a 'basic buffer'. In the present invention maintains the pH of the composition comprising the fusion polypeptide, specifically the buffer may be one or more buffers selected from the group consisting of citrate, histidine, and sodium phosphate (NaPi).

상기 시트레이트는 포스포-시트레이트(Phospho-citrate) 또는 시트레이트 단일 수화물 (Citric acid monohydrate)인 것일 수 있다. 상기 히스티딘은 L-히스티딘 또는 L-히스티딘 - L-히스티딘 모노수화염화물 (L-Histidine monohydrochloride monohydrate)인 것일 수 있다. 상기 인산나트륨은 디-나트륨 하이드로젠포스페이트 디하이드레이트 (Di-sodium hydrogenphosphate dihydrate) 또는 나트륨 디수소 인산염 디하이드레이트(Sodium dihydrogen phosphate dihydrate) 인 것일 수 있다.The citrate may be phospho-citrate or citric acid monohydrate. The histidine may be L-histidine or L-histidine-L-histidine monohydrochloride (L-Histidine monohydrochloride monohydrate). The sodium phosphate may be di-sodium hydrogenphosphate dihydrate or sodium dihydrogen phosphate dihydrate.

상기 버퍼 또는 기본 버퍼는 pH가 조절된 것일 수 있으며, 구체적으로 pH 6.0 내지 7.6, 6.2 내지 7.6, 6.4 내지 7.6, 6.4 내지 7.4, 6.4 내지 7.2, 6.4 내지 7.0, 6.4 내지 6.8, 6.4 내지 6.7, 6.4 초과 6.7 이하, 6.5 내지 7.6, 6.5 내지 7.4, 6.5 내지 7.2, 6.5 내지 7.0, 6.6 내지 7.4, 6.6 내지 7.2, 6.6 내지 7.0, 또는 6.6 내지 6.8일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 버퍼는 pH 6.4 초과 6.7 이하의 히스티딘, pH 6.4 내지 6.8의 시트레이트, 또는 pH 7.0 내지 7.4의 인산 나트륨일 수 있다.The buffer or the basic buffer may be pH adjusted, specifically pH 6.0 to 7.6, 6.2 to 7.6, 6.4 to 7.6, 6.4 to 7.4, 6.4 to 7.2, 6.4 to 7.0, 6.4 to 6.8, 6.4 to 6.7, 6.4 Greater than 6.7 or less, 6.5 to 7.6, 6.5 to 7.4, 6.5 to 7.2, 6.5 to 7.0, 6.6 to 7.4, 6.6 to 7.2, 6.6 to 7.0, or 6.6 to 6.8. More specifically, the buffer may be histidine above pH 6.4 and below 6.7, citrate at pH 6.4 to 6.8, or sodium phosphate at pH 7.0 to 7.4.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 시트레이트, 히스티딘, NaPi 3종 버퍼에 대한 실험을 진행한 결과, pH 6.4 초과 6.7 이하의 히스티딘, pH 6.6의 시트레이트, 인산 나트륨(NaPi)를 적절한 기본 버퍼로 사용할 수 있음을 확인하였다(표 6).In a specific embodiment of the present invention, the experiments for the citrate, histidine, NaPi three buffers, as a result, histidine pH of more than 6.4 and less than 6.7, citrate of pH 6.6, sodium phosphate (NaPi) as an appropriate basic buffer It was confirmed that it could be used (Table 6).

본 발명에서 상기 '계면활성제(surfactant)'란 묽은 용액 속에서 계면에 흡착하여 그 표면장력을 감소시키는 물질을 의미하며, 본 발명의 조성물에 첨가제로 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 계면활성제는 Polysorbae 20(Tween20), Polysorbae 80 (Tween80), 및 Poloxamer 188(F-68)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 계면활성제일 수 있으며, 보다 구체적으로 Tween20 또는 F-68일 수 있다.In the present invention, the 'surfactant' refers to a substance that adsorbs to the interface in dilute solution to reduce its surface tension, and may be included as an additive in the composition of the present invention. Specifically, the surfactant may be at least one surfactant selected from the group consisting of Polysorbae 20 (Tween20), Polysorbae 80 (Tween80), and Poloxamer 188 (F-68), and more specifically, may be Tween20 or F-68. .

상기 계면활성제는 본 발명의 전체 조성물 대비 0.01 내지 0.10, 0.01 내지 0.08, 0.01 내지 0.06, 0.02 내지 0.10, 0.02 내지 0.08, 0.02 내지 0.06, 0.01 내지 0.03, 또는 0.05 내지 0.07%로 포함될 수 있다.The surfactant may be included as 0.01 to 0.10, 0.01 to 0.08, 0.01 to 0.06, 0.02 to 0.10, 0.02 to 0.08, 0.02 to 0.06, 0.01 to 0.03, or 0.05 to 0.07% relative to the total composition of the present invention.

본 발명에서 상기 아미노산 및/또는 당류는 본 발명의 조성물에 첨가제로 포함되어, 융합 폴리펩타이드의 안정성을 증진시킬 수 있다. In the present invention, the amino acid and / or sugars may be included as an additive in the composition of the present invention, thereby enhancing the stability of the fusion polypeptide.

상기 아미노산은 아르기닌, 글리신, 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산인 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 글리신 또는 히스티딘일 수 있다. 상기 아미노산은 조성물에 10 내지 200, 10 내지 150, 30 내지 150, 30 내지 70, 40 내지 60, 50, 80 내지 120, 90 내지 110, 100, 130 내지 170, 140 내지 160, 또는 150mM로 포함될 수 있다.The amino acid may be one or more amino acids selected from the group consisting of arginine, glycine, and histidine, and more specifically, may be glycine or histidine. The amino acid may be included in the composition 10 to 200, 10 to 150, 30 to 150, 30 to 70, 40 to 60, 50, 80 to 120, 90 to 110, 100, 130 to 170, 140 to 160, or 150mM have.

상기 당류는 트레할로스 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 당류인 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 수크로스일 수 있다. 상기 당류는 전체 조성물 대비 1 내지 10, 1 내지 8, 2 내지 6, 1 내지 3, 2, 5 내지 7, 또는 6%로 포함될 수 있다.The sugar may be one or more sugars selected from the group consisting of trehalose and sucrose, more specifically sucrose. The sugars may be included in 1 to 10, 1 to 8, 2 to 6, 1 to 3, 2, 5 to 7, or 6% of the total composition.

본 발명에서 상기 '장성 변형제(tonicity modifier)'와 관련하여, '장성(tonicity)'이란 세포를 용액에 담갔을 때 나타나는 삼투압을 의미한다. 장성 변형제란 이러한 용액의 장성을 변화시킬 수 있는 제제를 의미한다. 본 발명에서 장성 변형제는 솔비톨, 만니톨 및 염화 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 장성 변형제일 수 있다In the present invention, with respect to the 'tonicity modifier', 'tonicity' refers to the osmotic pressure that appears when the cells are immersed in the solution. Tonicity modifiers refer to agents that can change the tonicity of such solutions. In the present invention, the tonicity modifier may be one or more tonicity modifiers selected from the group consisting of sorbitol, mannitol and sodium chloride.

보다 구체적으로, 상기 장성 변형제는 전체 조성물 대비 1 내지 10, 1 내지 8, 2 내지 6, 1 내지 3, 2, 5 내지 7, 또는 6%로 포함되는 솔비톨 또는 만니톨인 것일 수 있으며, 10 내지 200, 10 내지 150, 30 내지 150, 30 내지 70, 40 내지 60, 50, 80 내지 120, 90 내지 110, 100, 130 내지 170, 140 내지 160, 또는 150mM로 포함되는 염화 나트륨일 수 있다.More specifically, the tonicity modifier may be sorbitol or mannitol contained in 1 to 10, 1 to 8, 2 to 6, 1 to 3, 2, 5 to 7, or 6% of the total composition, 10 to 200, 10-150, 30-150, 30-70, 40-60, 50, 80-120, 90-110, 100, 130-170, 140-160, or 150 mM sodium chloride.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 다양한 첨가제의 효과를 확인한 결과, 아미노산, 당류, 당알콜 또는 염화 나트륨을 첨가하는 경우, 산화스트레스에 대한 내성이 증가하였으며, 특히 50mM 초과의 아르기닌, 50mM 초과의 글리신, 2% 초과의 트레할로스, 2% 초과의 수크로스, 2% 초과의 솔비톨 또는 2% 초과의 만니톨을 사용하는 경우, 단독 첨가만으로도 충분한 스트레스 저항성이 나타났음을 확인하였다 (표 8).In a specific embodiment of the present invention, as a result of confirming the effects of the various additives, the addition of amino acids, sugars, sugar alcohols or sodium chloride, the resistance to oxidative stress was increased, in particular more than 50mM arginine, more than 50mM glycine, When using more than 2% trehalose, more than 2% sucrose, more than 2% sorbitol or more than 2% mannitol, it was confirmed that the addition alone showed sufficient stress resistance (Table 8).

본 발명의 상기 조성물은 융합 폴리펩타이드의 안정성을 증진하는 것일 수 있으며, 상기 안정성은 제형 안정성 또는 보관 안정성 등을 포함하는 개념이다.The composition of the present invention may be to enhance the stability of the fusion polypeptide, the stability is a concept including formulation stability or storage stability and the like.

또한, 본 발명의 상기 조성물은 다양한 스트레스 조건에 대한 저항성을 갖는 것일 수 있다. 상기 스트레스 조건에는 산화 스트레스, 온도 스트레스, 교반 스트레스 또는 냉동/해동 스트레스가 포함될 수 있다.In addition, the composition of the present invention may have resistance to various stress conditions. The stress condition may include oxidative stress, temperature stress, stirring stress or freezing / thawing stress.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 GLP(glucagon like peptide)-1 또는 이의 유사체, 및 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드; 및 버퍼, 계면활성제, 아미노산, 당류, 및 장성 변형제로 구성된 군으로부터 하나 이상의 물질을 혼합하는 단계를 포함하는, 융합 폴리펩타이드의 안정성 증진 방법을 제공한다.Another aspect of the invention is a fusion polypeptide comprising a glucagon like peptide (GLP) -1 or an analog thereof, and an immunoglobulin Fc polypeptide; And admixing one or more substances from the group consisting of buffers, surfactants, amino acids, sugars, and tonicity modifiers.

상기 GLP-1, 융합 폴리펩타이드, 버퍼, 계면활성제, 아미노산, 당류, 장성 변형제, 안정성에 대해서는 전술한 바와 같다.The GLP-1, fusion polypeptides, buffers, surfactants, amino acids, sugars, tonicity modifiers, and stability are as described above.

본 발명의 일 실시예에서는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 상기 버퍼 및 첨가제를 혼합한 결과 조성물의 스트레스 저항성, 안정성이 증진됨을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the stress resistance and stability of the composition were improved by mixing the buffer and the additive with the composition including the fusion polypeptide.

본 발명의 조성물은 본 발명은 GLP 및 면역글로불린 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드의 산화 스트레스, 온도 스트레스, 교반 스트레스, 냉동/해동 스트레스에 대한 저항성을 부여하며, 이물 생성을 억제하므로, 상기 융합 폴리펩타이드의 장기 보관, 운송, 유통에 유용하게 활용될 수 있다.The composition of the present invention provides resistance to oxidative stress, temperature stress, agitation stress, freezing / thawing stress of the GLP and immunoglobulin hybrid Fc fusion polypeptides, and inhibits foreign substance generation, thereby prolonging the long-term It can be useful for storage, transportation and distribution.

도 1 및 도 2는 GLP-1-hyFc 제형에 적합한 첨가제의 스크리닝 결과를 IEF를 통하여 확인한 것이다.1 and 2 Screening results of additives suitable for GLP-1-hyFc formulations were confirmed via IEF.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1: 기본 버퍼, 첨가제 준비 및 가혹 시료 조건 설정Example 1: Basic Buffer, Additive Preparation and Harsh Sample Condition Settings

한국특허공개공보 제10-2016-0083810호의 실시예 1의 GLP-1-hyFc의 보존, 제형에 적합한 버퍼 및 첨가제의 종류, 조합을 확인하고자 하였다.It was intended to confirm the preservation of GLP-1-hyFc of Example 1 of Korean Patent Publication No. 10-2016-0083810, types of buffers and additives suitable for formulation, and combinations thereof.

먼저, GLP-1-hyFc와 함께 첨가될 기본 버퍼 또는 첨가제를 하기 표 1과 같이 준비하였다.First, a basic buffer or additive to be added with GLP-1-hyFc was prepared as shown in Table 1 below.

기본 버퍼/첨가제 (Basal buffer/Excipient) 정보Basic buffer / excipient information 카테고리category 브랜드brand 기본 버퍼Default buffer Citric acid monohydrateCitric acid monohydrate MERCKMERCK Di-sodium hydrogenphosphate dihydrateDi-sodium hydrogenphosphate dihydrate MERCKMERCK Sodium dihydrogen phosphate dihydrateSodium dihydrogen phosphate dihydrate MERCKMERCK L-Histidine *L-Histidine * MERCKMERCK L-Histidine, monohydrochloride monohydrate * L-Histidine, monohydrochloride monohydrate * MERCKMERCK 계면활성제
(Surfactant)Surfactants
(Surfactant) Tween20Tween20 MERCKMERCK Tween80Tween80 MERCKMERCK F-68 (poloxamer 188)F-68 (poloxamer 188) MERCKMERCK 아미노산amino acid ArginineArginine MERCKMERCK GlycineGlycine MERCKMERCK 당Party TrehaloseTrehalose CALBIOCHEMCALBIOCHEM SucroseSucrose MERCKMERCK 장성 변형제
(Tonicity modifier)Wall Modifier
(Tonicity modifier) SorbitolSorbitol MERCKMERCK MannitolMannitol SigmaSigma Sodium chlorideSodium chloride MERCKMERCK

다음으로, GLP-1-hyFc를 포함하는 조성물(검액)이 처할 수 있는 환경적 스트레스로서, 산화 스트레스, 온도 스트레스, 교반 스트레스, 냉동/해동 스트레스를 하기 표 2와 같이 설정하였다.Next, oxidative stress, temperature stress, agitation stress, freezing / thawing stress were set as shown in Table 2 as the environmental stress that the composition (sample solution) containing GLP-1-hyFc may face.

가혹 시료 준비Harsh Sample Preparation 가혹 조건(Stress Condition)Stress Condition 응용(Practical application)Practical application 모니터링할 문제 (Problem to monitor)Problem to monitor 1One 산화Oxidation Peroxide spike
(2% H₂O₂_상온_4시간)Peroxide spike
(2% H ₂ O ₂ _ room temperature _4 hours) 저장성, 부형제 안정성, 불순물 발생 여부
(Storage, excipient stability, impurity)Shelf life, excipient stability, impurities
(Storage, excipient stability, impurity) 산화 정도, 불활성 여부
(Oxidations, inactivation)Degree of oxidation, inert or not
(Oxidations, inactivation) 22 온도Temperature 50℃ (3/5일, 1주)50 ℃ (3/5 days, 1 week) 저장성, 운반성, 취급, 유통성
(Storage, shipping,
handling, delivery)Storage, transport, handling, distribution
(Storage, shipping,
handling, delivery) 보관 중 변화 (Structure change (precipitation, aggregation, recovery loss)), 용해도(solubility), 모든 분해에 대한 증가 속도 (increased reaction rate for all degradations)Structure change (precipitation, aggregation, recovery loss), solubility, increased reaction rate for all degradations 37℃ (1주)37 ℃ (1 week) 33 교반 (Agitation)Agitation 상온, 24hr Room temperature, 24hr 44 냉동 (-80℃) & 해동(상온, 20~25℃)Freezing (-80 ℃) & Defrosting (room temperature, 20 ~ 25 ℃) 5 회5 times

실시예 2: 구체적인 물성 평가 방법Example 2: Specific Physical Property Evaluation Method

2-1. 검액의 육안 관찰 및 적합 여부 판정2-1. Visual observation and determination of suitability

성상 관찰용 검액을 밝은 빛 아래에서 육안 관찰하였다. 입자(particle) 형태의 이물이 생기거나 탁도가 증가한 경우 부적합한 것으로 판정하였다.A visual observation sample solution was visually observed under bright light. Particles in the form of foreign matter or turbidity were determined to be inadequate.

2-2. pH 측정2-2. pH measurement

검액 및 캘리브레이션(calibration) 용액들을 사용하기 전에 실온 (20~25℃)에 두어 용액을 상온화 시켰다. 상온화 된 캘리브레이션 용액을 이용하여 pH 캘리브레이션을 진행(1일 1회 진행)하고 난 후, 검액의 pH를 측정하였다.The solution was allowed to room temperature by placing at room temperature (20-25 ° C.) before using the sample and calibration solutions. PH calibration was performed using a calibrated solution at room temperature (once a day), and then the pH of the test solution was measured.

pH 측정 기기, 기구 및 용액으로서, S47-KS, SevenMulti^TM pH and conductivity version kit (Mettler Toledo), pH 완충 용액 4.01, 7.00, 10.01 (Mettler Toledo, 51340057, 51340069, 51340056)을 이용하였다.As pH measuring instruments, instruments and solutions, S47-KS, SevenMulti ^™ pH and conductivity version kit (Mettler Toledo), pH buffer solutions 4.01, 7.00, 10.01 (Mettler Toledo, 51340057, 51340069, 51340056) were used.

2-3. SE-HPLC (Size exclusion-high performance liquid chromatography)2-3. SE-HPLC (Size exclusion-high performance liquid chromatography)

하기 표 3의 분석 조건으로 SE-HPLC을 시행하였다. 구체적인 방법으로, 제형 버퍼를 이용하여 검액을 1mg/ml 농도로 희석한 다음, 0.22um PES sartolab BT 500 필터로 여과 후, 바이알(vial)에 넣어 표기(labeling)하였다. 준비한 검액(1 mg/mL)을 20 uL(20 ug/injection) 취하여 HPLC system에 주입하여 분석하였다. 검출 파장(Detection wavelength)은 214 nm이고, 펌프 모드(pump mode)는 등용매용리(isocratic)이었다.SE-HPLC was performed under the analysis conditions shown in Table 3 below. Specifically, the sample solution was diluted to a concentration of 1 mg / ml using the formulation buffer, filtered through a 0.22 um PES sartolab BT 500 filter, and then labeled in a vial. 20 uL (20 ug / injection) of the prepared sample solution (1 mg / mL) was injected into the HPLC system for analysis. The detection wavelength was 214 nm and the pump mode was isocratic.

분석 완료 후, 엠파워 소프트웨어(empower software)를 이용하여 결과를 계산하였다. 이때 공시험액에서 검출되지 않는 결과물 피크(product peak)를 적분하였으며, 이 경우 분석 결과의 메인 피크(main peak) %가 순도 % 에 해당한다.After completion of the analysis, the results were calculated using empower software. At this time, the product peak which is not detected in the blank test solution was integrated. In this case, the main peak% of the analysis result corresponds to the purity%.

상기 SE-HPLC에는 기기 및 기구로서 HPLC (Waters, e2695 Separation Modules with Waters 2489 UV/Visible detector), HPLC 소프트 웨어 (Empowr software, ver 2.0 or 3.0), 초음파 분해기(Sonicator) 〔Branson, 5510E〕, Column, TSK-GEL G3000SWxL (7.8 mm * 300 mm) (TOSOH), Guard column, TSK-GEL GUARD SWxL (7.8 mm) (TOSOH)을 사용하였다.The SE-HPLC includes HPLC (Waters, e2695 Separation Modules with Waters 2489 UV / Visible detector), HPLC software (Empowr software, ver 2.0 or 3.0), Sonicator (Branson, 5510E), Column , TSK-GEL G3000SWxL (7.8 mm * 300 mm) (TOSOH), Guard column, TSK-GEL GUARD SWxL (7.8 mm) (TOSOH) was used.

SE-HPLC 분석 조건 SE-HPLC Assay Conditions Basal mobile phaseBasal mobile phase 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.9)50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.9) NaCl conditionNaCl condition 300 mM300 mM ACN conditionACN condition 10 %10% Detection WavelengthDetection Wavelength 214 nm214 nm Flow rateFlow rate 0.5 mL/min0.5 mL / min Run timeRun time 40 min40 min InjectionInjection 20 ug/injection20 ug / injection Column temperatureColumn temperature 25 ℃25 ℃ Sample temperatureSample temperature 5 ℃5 ℃

2-4. Gel-IEF (Gel-isoelectric focusing)2-4. Gel-isoelectric focusing

Gel-IEF에는 사용 기기 및 기구로서 Novex pH 3-7 IEF gel 1.0mm, 10well (Invitrogen, EC6645BOX), pI standard (IEF Marker 3-10) (SERVA, 39212)를 사용하였다.Gel-IEF used Novex pH 3-7 IEF gel 1.0mm, 10well (Invitrogen, EC6645BOX), and pI standard (IEF Marker 3-10) (SERVA, 39212).

구체적인 방법으로, 먼저 탈이온수를 이용하여 검액을 1mg/ml 로 희석한 후, 샘플 버퍼(sample buffer)(2x)와 1:1 비율로 혼합하여 최종 농도가 10ug/20ul/well이 되도록 조제하였다. 조제한 검액을 잘 혼합한 후 기준 마커(standard marker) (5ul/well), 검액 순으로 젤에 로딩(loading)한 다음 아래 표 4의 조건으로 전기영동을 진행하였다. 이 경우, 러닝(running) 시 열이 발생하므로 아이스 박스에 얼음을 넣거나, 저온실에서 진행하여 저온이 유지되게 하였다.As a specific method, first, the sample solution was diluted to 1 mg / ml using deionized water, and then mixed with a sample buffer (2x) in a 1: 1 ratio to prepare a final concentration of 10 ug / 20 ul / well. After mixing the prepared sample well, the standard marker (5ul / well), and then loaded on the gel in the sample solution (electrophoresis) and then electrophoresis was performed under the conditions of Table 4 below. In this case, since heat is generated during running, ice is put in the ice box, or the low temperature is maintained by proceeding in a low temperature room.

StepStep VoltageVoltage Run timeRun time 1One 100V100 V 1hour1hour 22 200V200 V 1hour1hour 33 500V500 V 1hour1hour

전기영동이 완료된 젤을 분리한 후 TCA 용액으로 고정하였다. 고정된 젤에 염색/탈색(Stainig/destaining) 과정을 진행 한 후 검액의 주요 pI(Main pI) 범위를 확인하였다.After the gel was electrophoresis was separated and fixed with TCA solution. After the staining / destaining process on the fixed gel, the main pI (Main pI) range of the sample was confirmed.

2-5. UV concentration2-5. UV concentration

UV concentration에는 사용 기기 및 기구로서 UV spectrophotometer (Agilent, CARY 100 UV-Vis / UV1108M072), Cuvettes (Hellma Absorption Micro cells, 108.002B,QS.10mm)를 사용하였다.UV spectrophotometer (Agilent, CARY 100 UV-Vis / UV1108M072) and Cuvettes (Hellma Absorption Micro cells, 108.002B, QS.10mm) were used for the UV concentration.

구체적인 방법으로, 먼저 제형 버퍼 및 검액을 사용하기 전에 실온(20~25℃)에 두어 용액을 상온화 시켰다. 상기 용액에 대하여, 280, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350nm 파장에서 제형 버퍼를 이용하여 블랭크 레퍼런스(blank reference)의 흡광도를 측정한 후 검액에 대한 값을 측정하였다. 검액의 280nm에서의 총 흡광값에, 빛의 산란에서 기인된 흡광값을 가감하여 검액의 측정값을 보정하고, 보정 흡광도를 이용하여 검액의 단백질 농도를 계산하였다. 실험 조건은 하기 표 5에 나타내었다.As a specific method, the solution was allowed to room temperature by first placing it at room temperature (20-25 ° C.) before using the formulation buffer and the sample solution. For the solution, the absorbance of the blank reference was measured using a formulation buffer at wavelengths of 280, 320, 325, 330, 335, 340, 345, and 350 nm, and then a value for the sample solution was measured. To the total absorbance value at 280 nm of the sample solution, the measured value of the sample solution was corrected by subtracting the absorbance value resulting from scattering of light, and the protein concentration of the sample solution was calculated using the corrected absorbance. Experimental conditions are shown in Table 5 below.

InstrumentInstrument Cary 100 UV Vis-Spectrophotometer [Agilent, FE-4-016]Cary 100 UV Vis-Spectrophotometer [Agilent, FE-4-016] CuvetteCuvette Absorption cells micro cells [Hellma, #108.002B.QA, 10mm]Absorption cells micro cells [Hellma, # 108.002B.QA, 10mm] Wavelength (nm)Wavelength (nm) 280,320,325,330,335,340,345,350280,320,325,330,335,340,345,350 ave. Time (sec)ave. Time (sec) 0.50.5 SBW (nm)SBW (nm) 1.01.0 ReplicateReplicate 33 Ext. coefficientExt. coefficient 1.2701.270

2-6. 삼투압 측정2-6. Osmotic pressure measurement

삼투압 측정에는 사용 기기 및 기구로서 삼투압 측정기 (gonotec, OSMOMAT® 30), 300mOsmol/kg 교정 표준기(calibration standard) (gontec, 30.9.0020)를 사용하였다. Osmotic pressure was used as the instrument and instrument for osmotic pressure measurement (gonotec, OSMOMAT® 30) and a 300mOsmol / kg calibration standard (gontec, 30.9.0020).

삼투압 측정기를 탈이온수와 standard를 이용하여 보정한 후, 검액의 삼투압을 측정하였다.Osmotic pressure was calibrated with deionized water and standard, and the osmotic pressure of the sample solution was measured.

2-7. DLS (동적 광산란, Dynamic light scattering) 측정2-7. DLS (Dynamic Light Scattering) Measurement

동적 광산란 (DLS)과 제타 포텐셜 Zetasizer Nano ZS90 장치 (MalvernInstruments, Worcestershire, UK)를 사용하여 다양한 농도에서 에타너셉트(etanercept)의 정전기 상호 작용을 평가하였다. 상기 장치는 10 ℃의 작동 온도에서 평형을 이루었으며, 준비된 각 시료 1mL는 수력학적 크기의 일회용 사이징 큐벳 (Sarstedt, Num-brecht, Germany)을 사용하여 측정하였다. 일회용 모세관 셀 (Malvern Instruments)은 제타 전위를 위한 것이다. 각각의 샘플을 30 초의 간격으로 5회 측정하였고 Zetasizer software 버전 6.32 (Malvern Instruments)를 사용하여 자동 상관 함수로부터 계산 된 제타 평균 크기, 다 분산 지수 (polydispersity index, PDI) 및 제타 전위를 계산하였다. Dynamic light scattering (DLS) and zeta potential Zetasizer Nano ZS90 devices (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) were used to evaluate the electrostatic interactions of etanercept at various concentrations. The apparatus was equilibrated at an operating temperature of 10 ° C., and 1 mL of each prepared sample was measured using a hydraulically sized disposable sizing cuvette (Sarstedt, Num-brecht, Germany). Disposable capillary cells (Malvern Instruments) are for zeta potential. Each sample was measured five times at intervals of 30 seconds and Zetasizer software version 6.32 (Malvern Instruments) was used to calculate the zeta mean size, polydispersity index (PDI) and zeta potential calculated from the autocorrelation function.

단백질 용액에서 단백질 입자는 콜로이드 상태를 유지하고 있으며, 입자 사이의 전자기적 반발력이 단백질 안정성에 영향을 준다. 입자간 전자기적 반발력이 약해질 경우 단백질 입자끼리의 응집이 발생하므로, 전자기적 반발력이 적당한 pH 범위를 찾는 것이 중요하다.In protein solutions, protein particles remain colloidal, and electromagnetic repulsion between particles affects protein stability. When the electromagnetic repulsive force between particles weakens, aggregation of protein particles occurs, so it is important to find a suitable pH range for electromagnetic repulsive force.

상기 Z-Sizer & Z-Potential은 콜로이드 상태에서 브라운 운동을 하는 입자들에 빛을 쏘아 굴절되는 빛을 검출함으로써 입자의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius)를 측정하고, 전하를 띤 입자에 수시로 변화하는 전극을 적용 시켜, 그에 따른 입자의 이동을 통하여 측정하였다.The Z-Sizer & Z-Potential measures the hydrodynamic radius of particles by detecting light that is refracted by emitting light to particles that move Brown in the colloidal state, and the electrode changes frequently to the charged particles. It was measured through the movement of the particles according to the application.

Z-평균 사이즈는 fragments, monomers, aggregates 등 단백질 용액의 혼합물들의 평균값이며, aggregates의 작은 변화 등에도 민감한 값 변화를 보인다. PdI (Polydispersity index)는 단위가 없으며, 0.7보다 값이 큰 경우 사이즈 크기의 범위가 넓으며 DLS를 적용하기에 부적합할 수 있다.The Z-average size is the average of mixtures of protein solutions such as fragments, monomers and aggregates, and is sensitive to small changes in aggregates. PdI (Polydispersity index) has no unit, and if the value is larger than 0.7, the size range is wide and may not be suitable for applying DLS.

Zeta potential은 단백질 상호간의 전기적 반발력을 수치화하여 안정성을 비교하는데 사용하는 값으로, 대체로 절대값이 '0'보다 클수록 반발력이 증가하여 단백질 용액의 안정성이 증가할 가능성이 높다.Zeta potential is a value that is used to quantify the electrical repulsive force between proteins and to compare the stability. In general, the greater the absolute value is '0', the higher the repulsive force is, which increases the stability of the protein solution.

실시예 3: GLP-1-hyFc 제형에 적합한 버퍼의 스크리닝Example 3: Screening of Buffers Suitable for GLP-1-hyFc Formulations

GLP-1-hyFc의 제형에 적합한 버퍼의 종류 및 조건을 찾기 위하여 버퍼 스크리닝을 수행하였다. Buffer screening was performed to find the type and condition of buffer suitable for the formulation of GLP-1-hyFc.

시트레이트(citrate), 히스티딘(histidine) 및 NaPi(인산 나트륨, sodium phosphate) 버퍼를 pH 별로 준비한 후, 스트레스 조건에서의 물성변화를 측정하였다. 스트레스 조건은 고온(37도) 또는 냉동/해동(Freezing/thawing) 조건을 사용하였고 (표 6), 각 실험군은 10 내지 20 mg/ml의 GLP-1-hyFc를 포함하도록 하였다.Citrate, histidine, and NaPi (sodium phosphate) buffers were prepared for each pH, and then physical property changes under stress conditions were measured. Stress conditions were used at high temperature (37 degrees) or freezing / thawing conditions (Table 6), each experimental group was to contain 10 to 20 mg / ml GLP-1-hyFc.

그 결과, pH 6.4의 히스티딘 버퍼에서 이물이 생성된 점에서, pH 6.4 이하의 히스티딘 버퍼가 가장 부적합한 것으로 평가되었다. pH 7 이상일 경우 순도 변화 폭이 상대적으로 크게 나타났으나, 3종 버퍼의 순도 변화 값이 5% 미만이므로 사용 가능함을 확인하였다. pH 6.5 내외의 버퍼를 사용하는 경우에는 시트레이트 또는 히스티딘이 적합함을 확인하였다.As a result, since foreign substances were produced in histidine buffer of pH 6.4, histidine buffer of pH 6.4 or less was evaluated as the most inadequate. When pH 7 or more, the change in purity was relatively large, but the purity change of the three buffers was less than 5%. It was confirmed that citrate or histidine is suitable when using a buffer of pH 6.5.

종합하면, pH 6.4 초과 6.7 이하의 히스티딘, pH 6.6의 시트레이트, NaPi를 버퍼 (basal buffer)로 사용할 수 있음을 확인하였다. 순도변화가 가장 적은것은 pH 6.4 초과 6.7 이하의 히스티딘 버퍼였으므로, 해당 pH 범위의 히스티딘 버퍼나, 히스티딘을 아미노산으로서 첨가하는 것이 바람직하다.Taken together, it was confirmed that histidine, pH 6.6 and below, citrate, pH 6.6, and NaPi can be used as a buffer. Since the least change in purity was the histidine buffer of pH 6.4 or more and 6.7 or less, it is preferable to add histidine buffer or histidine as the amino acid in the pH range.

실시예 4: GLP-1-hyFc 제형에 적합한 첨가제의 스크리닝Example 4: Screening of Additives Suitable for GLP-1-hyFc Formulations

GLP-1-hyFc의 제형에 적합한 첨가제의 종류 및 조건을 찾기 위하여 첨가제 스크리닝을 수행하였다. Additive screening was performed to find the type and conditions of additives suitable for the formulation of GLP-1-hyFc.

4-1. 기본 버퍼로 히스티딘 사용4-1. Use histidine as the default buffer

기본 버퍼는 30mM 히스티딘, pH 6.8을 사용하였고, 버퍼에 각 첨가제를 농도별로 포함시킨 후 상기 방법에 따라 산화스트레스 또는 온도스트레스를 주고 (표 7) 각 실험군의 물성을 평가하였다. 30 mM histidine, pH 6.8 was used as a basic buffer, and each additive was included in the buffer by concentration, followed by oxidative stress or temperature stress according to the above method (Table 7), and the physical properties of each experimental group were evaluated.

첨가제는 계면활성제로서 Tween20, Tween80 및 F-68을, 아미노산으로서 아르기닌(Arginine) 및 글리신(Glycine)을, 당류로서 트레할로스(Trehalose) 및 수크로스(sucrose)를, 장성 변형제(Tonicity modifier)로서 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol) 및 염화 나트륨(sodium chloride)를 사용하였다.Additives include Tween20, Tween80 and F-68 as surfactants, Arginine and Glycine as amino acids, Trehalose and sucrose as saccharides, and Sorbitol as Tonicity modifiers. (sorbitol), mannitol and sodium chloride were used.

그 결과 표 7에서 알 수 있듯이, 먼저 대조군(실험군 1, 실험군 2)의 경우, 첨가제 없이 버퍼만 존재하는 경우에도 산화스트레스 및 온도스트레스에 내성이 있음을 확인하였다. 0.02~0.06%의 F-68(실험군 7, 실험군 8)의 경우, 온도스트레스에 취약한 것으로 나타나 단독으로 사용하기에 부적합한 것으로 나타났다. 150mM의 염화나트륨(실험군 21)는 산화스트레스에 취약하여 단독 사용 하기에 부적합한 것으로 평가되었다.As a result, as can be seen in Table 7, firstly, in the case of the control group (Experimental Group 1, Experimental Group 2), even in the presence of a buffer without additives, it was confirmed that the resistance to oxidative stress and temperature stress. F-68 (Experimental Group 7, Experimental Group 8) of 0.02 ~ 0.06% was found to be vulnerable to temperature stress, making it unsuitable for use alone. 150 mM sodium chloride (Experimental 21) was vulnerable to oxidative stress and was evaluated as unsuitable for single use.

제형에 히스티딘이 포함되는 경우, Tween20, 글리신, 트레할로즈, 수크로즈, 소르비톨, 만니톨 및 150mM 미만의 염화나트륨이 첨가에 바람직함을 확인하였다.When histidine was included in the formulation, it was found that Tween20, glycine, trehalose, sucrose, sorbitol, mannitol, and less than 150 mM sodium chloride are preferred for addition.

동일한 실험군에서 HPLC를 수행하였으며, 물질의 순도를 측정한 결과를 하기 표 8에 나타내었다.HPLC was performed in the same experimental group, and the results of measuring the purity of the material are shown in Table 8 below.

그 결과, 대부분의 첨가제가 온도스트레스에 대한 내성에 미치는 영향이 적음을 알 수 있었다. 그러나 150mM 이상의 아르기닌을 사용하는 경우, 물질의 순도에 영향을 주어 단독으로 사용하기에는 적합하지 않음을 확인하였다. 한편, 대조군(실험군 1, 실험군 2)의 경우 산화스트레스에 취약한 것으로 나타났는데, 여기에 아미노산, 당류, 당알콜 또는 염화 나트륨을 첨가하는 경우, 산화스트레스에 대한 내성이 증가하였다. 특히 50mM 초과의 아르기닌, 50mM 초과의 글리신, 2% 초과의 트레할로스, 2% 초과의 수크로스, 2% 초과의 솔비톨 또는 2% 초과의 만니톨을 사용하는 경우, 단독 첨가만으로도 충분한 효과가 나타났음을 확인하였다.As a result, it was found that most of the additives had little effect on the resistance to temperature stress. However, when using arginine of 150mM or more, it was confirmed that the purity of the material is not suitable for use alone. On the other hand, the control group (Experimental Group 1, Experimental Group 2) was found to be vulnerable to oxidative stress, when the addition of amino acids, sugars, sugar alcohol or sodium chloride increased resistance to oxidative stress. In particular, when using more than 50 mM arginine, more than 50 mM glycine, more than 2% trehalose, more than 2% sucrose, more than 2% sorbitol, or more than 2% mannitol, it was confirmed that the addition alone showed sufficient effect. .

4-2. 기본 버퍼로 포스포-시트레이트 사용4-2. Use phospho-citrate as the default buffer

다음으로, 기본 버퍼를 변경하여 동일한 실험을 수행하였다. 기본 버퍼는 30mM phosphate/citrate, pH 7.0을 사용하였고, 버퍼에 각 첨가제를 농도별로 함유시킨 후 상기 방법에 따라 산화스트레스 또는 온도스트레스를 주고 각 실험군의 물성을 평가하였다. Next, the same experiment was performed by changing the default buffer. The basic buffer was 30mM phosphate / citrate, pH 7.0, and each additive was added to the buffer at different concentrations, followed by oxidative stress or temperature stress according to the above method, and the physical properties of each experimental group were evaluated.

그 결과 상기 표 9에서 알 수 있듯이, 대조군(실험군 1, 실험군 2)의 경우, 첨가제 없이 버퍼만 존재하는 경우에도 산화스트레스 및 온도스트레스에 내성이 있음을 확인 하였다. 0.02% 이하의 Tween80(실험군 6)의 경우 가혹조건 시험 전에 이물이 발생하는 것이 관찰되어 단독으로 사용하기 부적합한 것으로 평가되었다. 0.06% 이상의 Tween20(실험군 3) 및 50~150mM의 sodium chloride(실험군 23, 실험군 24)의 경우, 산화스트레스에 취약한 것으로 나타나 단독으로 사용하기에 부적합한 것으로 나타났다. As a result, as can be seen in Table 9, in the case of the control group (Experimental Group 1, Experimental Group 2), it was confirmed that the resistance to oxidative stress and temperature stress even in the presence of a buffer without additives. In the case of Tween 80 (experimental group 6) of less than 0.02%, foreign matter was observed before the harsh condition test, and thus it was judged to be unsuitable for use alone. More than 0.06% of Tween20 (Experimental Group 3) and 50-150 mM sodium chloride (Experimental Group 23, Experimental Group 24) were found to be vulnerable to oxidative stress, making them unsuitable for use alone.

제형에 포스포-시트레이트 버퍼를 사용하는 경우, 0.06% 초과의 Tween20, 0.02% 미만의 Tween80, F-68, 글리신, 히스티딘, 트레할로즈, 수크로즈, 소르비톨 및 만니톨이 첨가에 바람직함을 확인하였다.If phospho-citrate buffer is used in the formulation, greater than 0.06% Tween20, less than 0.02% Tween80, F-68, glycine, histidine, trehalose, sucrose, sorbitol and mannitol are preferred for addition It was.

동일 실험군에서 HPLC를 수행하였으며, 물질의 순도를 측정한 결과를 표 10에 나타내었다.HPLC was performed in the same experimental group, and the results of measuring the purity of the material are shown in Table 10.

그 결과, 대부분의 첨가제가 온도스트레스에 대한 내성에 미치는 영향이 적음을 알 수 있었다. 그러나 50mM 초과의 아르기닌을 사용하는 경우, 물질의 순도에 영향을 주어 단독으로 사용하는 것은 적합하지 않음을 확인하였다. 한편, 대조군(실험군 1, 실험군 2)의 경우 산화스트레스에 취약함을 나타냈는데, 아미노산, 당류, 당알콜 또는 염화나트륨을 첨가하는 경우, 스트레스에 대한 내성이 증가하였다. 특히 50mM 초과의 아르기닌, 50mM 초과의 글리신, 2% 초과의 트레할로스, 2% 초과의 수크로스, 0.1%이상의 솔비톨 또는 0.1% 이상의 만니톨을 사용하는 경우, 단독 첨가만으로도 충분한 효과를 나타내었다. As a result, it was found that most of the additives had little effect on the resistance to temperature stress. However, when using more than 50mM arginine, it was confirmed that it is not suitable to use alone because it affects the purity of the material. On the other hand, the control group (Experimental Group 1, Experimental Group 2) was shown to be vulnerable to oxidative stress, the addition of amino acids, sugars, sugar alcohol or sodium chloride increased the resistance to stress. In particular, when more than 50mM arginine, more than 50mM glycine, more than 2% trehalose, more than 2% sucrose, more than 0.1% sorbitol, or more than 0.1% mannitol, alone addition showed sufficient effect.

이러한 결과들은 젤 IEF를 통하여 다시 한번 확인할 수 있었다 (도 1 및 도 2).These results could be confirmed once again via gel IEF (FIGS. 1 and 2).

실시예 5. GLP-1-hyFc 기본 버퍼 조건 시험Example 5 GLP-1-hyFc Base Buffer Condition Test

각 버퍼의 기본 스트레스 내성을 측정하기 위하여, 온도스트레스 조건 및 동결/해동(Freezing/thawing) 스트레스 조건에서 순도변화와 DLS 값 및 pH 변화를 측정하였다. 각 실험군은 10 내지 20 mg/ml의 GLP-1-hyFc를 포함하도록 하였고 실험군의 조건은 다음과 같다: 30mM 시트레이트 (pH6.6), 30mM 히스티딘 (pH6.6), 30mM 히스티딘 (pH7.0), 15mM 포스포-시트레이트(Phospho-Citrate) (pH6.6), 15mM Phospho-Citrate (pH7.0).In order to measure the basic stress resistance of each buffer, the purity change, the DLS value and the pH change were measured under the conditions of temperature stress and freezing / thawing stress. Each experimental group was comprised between 10 and 20 mg / ml GLP-1-hyFc and the conditions of the experimental groups were as follows: 30 mM citrate (pH6.6), 30 mM histidine (pH6.6), 30 mM histidine (pH7.0). ), 15 mM Phospho-Citrate (pH6.6), 15 mM Phospho-Citrate (pH 7.0).

기본 버퍼 조건 시험 결과Basic buffer condition test result 30mM Citrate (pH6.6)30mM Citrate (pH6.6) 30mM Histidine (pH6.6)30 mM Histidine (pH6.6) 30mM Histidine (pH7.0)30 mM Histidine (pH7.0) 15mM
Phospho-Citrate (pH6.6)15 mM
Phospho-Citrate (pH6.6) 15mM
Phospho-Citrate (pH7.0)15 mM
Phospho-Citrate (pH7.0) Purity
(SE-HPLC)Purity
(SE-HPLC) 37℃
(1 week)37 ℃
(1 week) -3.97-3.97 -2.62-2.62 -2.18-2.18 -3.97-3.97 -4.14-4.14 F/T
(5 times)F / T
(5 times) -0.05-0.05 0.020.02 0.030.03 -0.01-0.01 -0.01-0.01 DLSDLS SizeSize 11.63011.630 9.1369.136 5.3525.352 9.9999.999 10.71010.710 PdIPdI 0.1240.124 0.1240.124 0.2210.221 0.2290.229 0.1800.180 Zeta potentialZeta potential -9.653-9.653 -6.640-6.640 -9.557-9.557 -6.740-6.740 -13.950-13.950 pHpH -0.046
(6.62→6.58)-0.046
(6.62 → 6.58) 0.056
(6.56→6.61)0.056
(6.56 → 6.61) -0.054
(6.78→6.73)-0.054
(6.78 → 6.73) -0.090
(6.62→6.53)-0.090
(6.62 → 6.53) -0.029
(6.95→6.92)-0.029
(6.95 → 6.92)

그 결과 상기 표 11에서 알 수 있듯이, 온도 가혹(37℃, 1주)에 대한 SE-HPLC 분석 결과, 모든 버퍼가 기본적으로 내성이 있음을 확인하였으며, 30mM 히스티딘 (pH7.0)과 30mM 히스티딘 (pH6.6) 기본 버퍼 (basal buffer)의 경우 순도 변화가 약 -2%로 가장 적음이 확인되었다. F/T에 대한 SE-HPLC 분석결과 5종 기본 버퍼에서 차이가 없음이 확인되었다.As a result, as can be seen in Table 11, SE-HPLC analysis of temperature harshness (37 ℃, 1 week), it was confirmed that all buffers are basically resistant, 30mM histidine (pH7.0) and 30mM histidine ( pH6.6) In the case of basal buffer, the purity change was found to be the smallest at about -2%. SE-HPLC analysis of F / T showed no difference in the five basic buffers.

pH 측정결과 가혹 조건에서 pH 변화는 5종의 기본 버퍼에서 차이가 없음을 확인하였다. As a result of the pH measurement, it was confirmed that the pH change was not different in the five basic buffers under severe conditions.

그러나 30mM 히스티딘 (pH7.0)의 경우, GLP-1-hyFc 용해시 pH가 6.78로 떨어지므로, 30mM 히스티딘의 경우 pH를 6.8로 조정하여 시험하기로 하였다.However, in the case of 30 mM histidine (pH 7.0), the pH dropped to 6.78 when dissolving GLP-1-hyFc, so in the case of 30 mM histidine, the pH was adjusted to 6.8.

실시예 6. GLP-1-hyFc 첨가제 조건 시험Example 6 GLP-1-hyFc Additive Condition Test

우선 30mM 히스티딘 (pH6.8) 조건에서 각 첨가제(Excipient)의 스트레스 내성을 평가하였다. 스트레스 테스트는 보다 가혹한 환경에서 진행하였다. 산화스트레스의 경우 Peroxide spike(2% H2O2, 상온 4시간) 조건에서 수행하였고, 온도스트레스는 50 (1주) 조건에서 평가하여 하기 표 12에 결과를 나타내었다.First, the stress resistance of each excipient was evaluated under 30 mM histidine (pH6.8). Stress tests were conducted in more harsh environments. In the case of oxidative stress was carried out under Peroxide spike (2% H 2 O 2, room temperature 4 hours) conditions, the temperature stress was evaluated under 50 (1 week) conditions and the results are shown in Table 12 below.

ExcipientExcipient ConcentrationConcentration AppearanceAppearance pHpH SE-HPLCSE-HPLC ControlControl Oxi.Oxi. Temp.Temp. Oxi.(%)Oxi. (%) Temp.(%)Temp. (%) SurfactantSurfactant Tween20Tween20 0.06%0.06% XX XX XX 6.76.7 -42.40-42.40 -4.5-4.5 0.02%0.02% XX XX XX 6.76.7 -43.25-43.25 -4.0-4.0 Tween80Tween80 0.06%0.06% OO XX XX 6.76.7 -43.45-43.45 -4.1-4.1 0.02%0.02% OO XX XX 6.76.7 -43.56-43.56 -3.9-3.9 F-68F-68 0.06%0.06% XX XX OO 6.76.7 -44.46-44.46 -3.6-3.6 0.02%0.02% XX XX OO 6.76.7 -44.13-44.13 -3.6-3.6 Amino acidAmino acid ArginineArginine 150mM150mM XX XX XX 9.89.8 -4.96-4.96 -21.5-21.5 50mM50mM XX XX XX 9.29.2 -25.61-25.61 -2.9-2.9 GlycineGlycine 150mM150mM XX XX XX 6.86.8 -26.52-26.52 -2.9-2.9 50mM50mM XX XX XX 6.86.8 -35.08-35.08 -3.0-3.0 SugarSugar TrehaloseTrehalose 6%6% XX XX XX 6.86.8 0.000.00 -2.5-2.5 2%2% XX XX XX 6.86.8 -33.55-33.55 -2.8-2.8 SucroseSucrose 6%6% XX XX XX 6.76.7 -0.04-0.04 -2.1-2.1 2%2% XX XX XX 6.86.8 -32.93-32.93 -2.7-2.7 Tonicity modifierTonicity modifier SorbitolSorbitol 6%6% XX XX XX 6.76.7 -0.03-0.03 -2.5-2.5 2%2% XX XX XX 6.76.7 -31.59-31.59 -2.9-2.9 MannitolMannitol 6%6% XX XX XX 6.76.7 -0.21-0.21 -2.3-2.3 2%2% XX XX XX 6.76.7 -37.32-37.32 -2.7-2.7 Sodium chlorideSodium chloride 150mM150mM XX OO XX 6.86.8 -35.28-35.28 -3.6-3.6 50mM50mM XX XX XX 6.86.8 -50.31-50.31 -3.7-3.7

그 결과, 계면활성제(Surfactant)의 경우 모든 조건에서 이물이 관찰되지 않은 Tween20이 GLP-1-hyFc 보호능력이 가장 뛰어남을 확인하였다. Tween80 의 경우 용해도를 높일 수 있는 첨가물을 사용하여야 하며, F-68의 경우 온도스트레스에 내성을 부여할 수 있는 첨가물을 조합하는 것이 바람직함을 알 수 있었다. 당류의 경우, 트레할로스 및 수크로스 모두 순도 변화에 큰 차이가 없었다.As a result, in the case of surfactant (Surfactant) Tween20, the foreign substance was not observed under all conditions, it was confirmed that the best protection of GLP-1-hyFc. In the case of Tween 80, additives to increase the solubility should be used, and in the case of F-68, it was found that a combination of additives capable of imparting resistance to temperature stress was found. In the case of sugars, both trehalose and sucrose showed no significant difference in purity change.

다음으로 15mM phospho-citrate (pH7.0) 조건에서 각 첨가제의 스트레스 내성을 평가하였다. 스트레스 테스트는 보다 가혹한 환경에서 진행하였다. 산화스트레스의 경우 Peroxide spike(2% H2O2, 상온 4시간) 조건에서 수행하였고, 온도스트레스는 50 (1주) 조건에서 평가하여 표 13에 결과를 나타내었다.Next, the stress resistance of each additive was evaluated under 15 mM phospho-citrate (pH 7.0). Stress tests were conducted in more harsh environments. Oxidative stress was performed under Peroxide spike (2% H2O2, room temperature 4 hours), and the temperature stress was evaluated under 50 (1 week).

ExcipientExcipient ConcentrationConcentration AppearanceAppearance pHpH SE-HPLCSE-HPLC ControlControl Oxi.Oxi. Temp.Temp. Oxi.(%)Oxi. (%) Temp.(%)Temp. (%) SurfactantSurfactant Tween20Tween20 0.06%0.06% XX XX XX 7.17.1 -40.08-40.08 -3.93-3.93 0.02%0.02% XX OO XX 7.07.0 -40.35-40.35 --2.87--2.87 Tween80Tween80 0.06%0.06% XX XX XX 7.17.1 -39.83-39.83 -3.45-3.45 0.02%0.02% OO XX XX 7.17.1 -40.28-40.28 -2.88-2.88 F-68F-68 0.06%0.06% XX XX XX 7.07.0 -40.38-40.38 -2.56-2.56 0.02%0.02% XX XX XX 7.07.0 -40.28-40.28 -2.62-2.62 Amino acidAmino acid ArginineArginine 150mM150mM XX XX XX 10.210.2 -1.47-1.47 -41.2-41.2 50mM50mM XX XX XX 9.79.7 -23.48-23.48 -13.8-13.8 GlycineGlycine 150mM150mM XX XX XX 6.96.9 -0.09-0.09 -2.4-2.4 50mM50mM XX XX XX 7.07.0 -24.87-24.87 -2.4-2.4 HistidineHistidine 100mM100 mM XX XX XX 7.57.5 -12.02-12.02 -0.1-0.1 50mM50mM XX XX XX 7.27.2 -28.32-28.32 -1.0-1.0 SugarSugar TrehaloseTrehalose 6%6% XX XX XX 7.07.0 -0.23-0.23 -2.2-2.2 2%2% XX XX XX 7.07.0 -9.22-9.22 -2.0-2.0 SucroseSucrose 6%6% XX XX XX 7.07.0 -0.20-0.20 -1.8-1.8 2%2% XX XX XX 7.07.0 -8.95-8.95 -2.0-2.0 Tonicity modifierTonicity modifier SorbitolSorbitol 6%6% XX XX XX 6.96.9 -0.23-0.23 -2.1-2.1 2%2% XX XX XX 7.07.0 -4.18-4.18 -2.1-2.1 MannitolMannitol 6%6% XX XX XX 6.96.9 -0.17-0.17 -1.9-1.9 2%2% XX XX XX 7.07.0 -3.56-3.56 -1.9-1.9 Sodium chlorideSodium chloride 150mM150mM XX OO XX 6.86.8 -21.07-21.07 -3.3-3.3 50mM50mM XX OO XX 6.96.9 -43.31-43.31 -3.0-3.0

순도 변화를 측정한 결과, 계면활성제의 경우 모든 조건에서 스트레스에 대하여 모두 유사한 내성을 가짐을 확인하였다.As a result of measuring the purity change, it was confirmed that the surfactant had similar resistance to stress under all conditions.

3종의 아미노산 그룹의 경우, 아르기닌이 pH 및 순도 변화가 큰 것으로 확인되었다.In the case of three amino acid groups, arginine was found to have a large change in pH and purity.

당 그룹(트레할로스, 수크로스)에 대한 분석결과, 서로 유사한 효과를 가짐을 확인하였으며, 장성 변형제(솔비톨, 만니톨)에 대한 분석결과, 만니톨과 솔비톨이 유사한 스트레스 내성 효과를 나타냄을 확인하였다.As a result of the analysis of sugar groups (trehalose, sucrose), it was confirmed that they had similar effects, and analysis of the tonicity modifiers (sorbitol, mannitol), it was confirmed that mannitol and sorbitol showed similar stress resistance effect.

실시예Example 7. 농축 시험 7. Concentration test

pH 6.8의 히스티딘 버퍼를 사용하여 GLP-1-hyFc에 대한 농축시험을 진행하였다. 그 결과, 시료의 농도가 높아짐에 따라 pH가 감소하는 것으로 관찰되었다. A concentration test for GLP-1-hyFc was performed using histidine buffer of pH 6.8. As a result, the pH was observed to decrease with increasing concentration of the sample.

pH 측정값pH measurement 30mg/mL30 mg / mL 50mg/mL50 mg / mL pHpH 6.7156.715 6.5696.569

이에 히스티딘 버퍼는 중성 pH에서 버퍼효과가 우수한 것으로 알려진 NaPi 버퍼로 대체(삼투압: 320±20 mOsmol/Kg)하기로 하였다. 히스티딘은 GLP-1-hyFc 제형에 있어서 다양한 조건에서 스트레스 내성이 높은 것으로 평가되었으므로, 아미노산으로서 첨가하였다.The histidine buffer was replaced with NaPi buffer (osmotic pressure: 320 ± 20 mOsmol / Kg), which is known to have excellent buffering effect at neutral pH. Histidine was evaluated as having high stress resistance under various conditions in the GLP-1-hyFc formulation, and was added as an amino acid.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art will appreciate that the present invention can be implemented in other specific forms without changing the technical spirit or essential features. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are exemplary in all respects and not limiting. The scope of the present invention should be construed that all changes or modifications derived from the meaning and scope of the following claims and equivalent concepts rather than the detailed description are included in the scope of the present invention.

Claims (21)

GLP(glucagon like peptide)-1 또는 이의 유사체, 및 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드; 및 버퍼, 계면활성제, 아미노산, 당류, 및 장성 변형제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는, 융합 폴리펩타이드의 안정성 증진용 조성물.
Fusion polypeptides including glucagon like peptide (GLP) -1 or an analog thereof, and an immunoglobulin Fc polypeptide; And at least one substance selected from the group consisting of buffers, surfactants, amino acids, sugars, and tonicity modifiers.
제1항에 있어서, 상기 버퍼는 시트레이트, 히스티딘, 및 인산 나트륨(NaPi)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 버퍼인 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the buffer is one or more buffers selected from the group consisting of citrate, histidine, and sodium phosphate (NaPi).
제1항에 있어서, 상기 버퍼의 pH는 pH 6.6 내지 7.4인 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the pH of the buffer is pH 6.6 to 7.4.
제2항에 있어서, 상기 히스티딘의 pH는 pH 6.4 초과 6.7 이하인 것인, 조성물.
The composition of claim 2, wherein the histidine has a pH greater than 6.4 and less than or equal to 6.7.
제2항에 있어서, 상기 시트레이트의 pH는 pH 6.4 내지 6.8인 것인, 조성물.
The composition of claim 2, wherein the pH of the citrate is pH 6.4 to 6.8.
제2항에 있어서, 상기 인산나트륨의 pH는 pH 7.0 내지 7.4인 것인, 조성물.
The composition of claim 2, wherein the pH of sodium phosphate is pH 7.0 to 7.4.
제2항에 있어서, 상기 시트레이트는 포스포-시트레이트(Phospho-citrate) 또는 시트레이트 단일 수화물 (Citric acid monohydrate)인 것인, 조성물.
The composition of claim 2, wherein the citrate is Phospho-citrate or Citric acid monohydrate.
제2항에 있어서, 상기 히스티딘은 L-히스티딘 또는 L-히스티딘 모노수화염화물 (L-Histidine monohydrochloride monohydrate)인 것인, 조성물.
The composition of claim 2, wherein the histidine is L-histidine or L-histidine monohydrochloride monohydrate.
제2항에 있어서, 상기 인산나트륨은 디-나트륨 하이드로젠포스페이트 디하이드레이트 (Di-sodium hydrogenphosphate dihydrate) 또는 나트륨 디수소 인산염 디하이드레이트(Sodium dihydrogen phosphate dihydrate) 인 것인, 조성물.
The composition of claim 2, wherein the sodium phosphate is di-sodium hydrogenphosphate dihydrate or sodium dihydrogen phosphate dihydrate.
제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 Tween20, Tween80, 및 F-68로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 계면활성제인 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the surfactant is one or more surfactants selected from the group consisting of Tween20, Tween80, and F-68.
제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 전체 조성물 대비 0.01 내지 0.10%로 포함되는 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the surfactant is included in an amount of 0.01 to 0.10% of the total composition.
제1항에 있어서, 상기 아미노산은 아르기닌, 글리신, 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산인 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the amino acid is one or more amino acids selected from the group consisting of arginine, glycine, and histidine.
제1항에 있어서, 상기 아미노산은 10mM 내지 200mM의 농도로 포함되는 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the amino acid is included at a concentration of 10 mM to 200 mM.
제1항에 있어서, 상기 당류는 트레할로스 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 당류인 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the sugar is one or more sugars selected from the group consisting of trehalose and sucrose.
제1항에 있어서, 상기 당류는 전체 조성물 대비 1% 내지 10%로 포함되는 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the saccharide is included in 1% to 10% of the total composition.
제1항에 있어서, 상기 장성 변형제는 솔비톨, 만니톨 및 염화 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 장성 변형제인 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the tonicity modifier is one or more tonicity modifiers selected from the group consisting of sorbitol, mannitol and sodium chloride.
제1항에 있어서, 상기 장성 변형제는 전체 조성물 대비 1% 내지 10%로 포함되는 솔비톨 또는 만니톨인 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the tonicity modifier is sorbitol or mannitol included in an amount of 1% to 10% relative to the total composition.
제1항에 있어서, 상기 장성 변형제는 10mM 내지 200mM의 농도로 포함되는 염화 나트륨인 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the tonicity modifier is sodium chloride, which is included at a concentration of 10 mM to 200 mM.
제1항에 있어서, 상기 안정성은 제형 안정성 또는 보관 안정성인 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the stability is formulation stability or storage stability.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 산화 스트레스, 온도 스트레스, 교반 스트레스 또는 냉동/해동 스트레스에 저항성을 갖는 것인, 조성물.
The composition of claim 1, wherein the composition is resistant to oxidative stress, temperature stress, agitation stress or freeze / thaw stress.
GLP(glucagon like peptide)-1 또는 이의 유사체, 및 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드; 및 버퍼, 계면활성제, 아미노산, 당류, 및 장성 변형제로 구성된 군으로부터 하나 이상의 물질을 혼합하는 단계를 포함하는, 융합 폴리펩타이드의 안정성 증진 방법.
Fusion polypeptides including glucagon like peptide (GLP) -1 or an analog thereof, and an immunoglobulin Fc polypeptide; And admixing one or more substances from the group consisting of buffers, surfactants, amino acids, sugars, and tonicity modifiers.

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