KR20190079810A - Ｒｉｐ1을 포함하는 폐암 전이 진단용 바이오 마커 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RIP1의 발현량으로 폐암 전이능을 판단할 수 있는 폐암 전이 진단용 바이오 마커, 이를 이용한 폐암 전이 진단용 키트 및 폐암 전이 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

Description

ＲＩＰ1을 포함하는 폐암 전이 진단용 바이오 마커 및 이의 이용{BIOMARKER FOR LUNG CANCER METASTASIS DIAGNOSIS COMPRISING ＲＩＰ1 AND USE THEREOF}

본 발명은 RIP1(Receptor-interacting protein 1)을 포함하는 폐암 전이 진단용 바이오 마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 RIP1의 발현량으로 폐암 전이능을 판단할 수 있는 폐암 전이 진단용 바이오 마커, 이를 이용한 폐암 전이 진단용 키트 및 폐암 전이 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

2008년 기준 통계에서 인구 70명당 1명이 암치료중이거나 암치료 후의 생존자였고, 우리나라 국민들이 평균수명(81세)까지 생존할 경우, 암에 걸릴 확률은 36.9%였으며, 남자(77세)는 3명 중 1명(37.2%), 여자(83세)는 10명 중 1명(30.5%)에서 암이 발생할 것으로 추정되고 있다. 2013년 암 발생률은 인구 10만 명당 445.7명(남자 449.9명, 여자 441.5명)이다. 또한 암 발생이 연령에 따라 증가하고 있는 통계치가 보여주듯이 사회의 급속한 노령화는 암환자의 급증을 불러올 가능성이 매우 크다.

지난 20년간 암환자의 5년 생존율은 괄목하게 증가하였으나, 아직도 제1의 사망원인은 암이며, 특히 암환자의 삶의 질 향상 문제 및 인구 감소, 노인 인구 증가에 따른 사회 비용 증가의 문제가 당면한 현실로서, 지속적인 암 연구를 통한 암 치료율 및 환자의 삶의 질 향상에 따른 사회 비용 감소가 국가적 과제로 부각되고 있다.

암에서 RIP1에 의한 연구 결과들은 세포사멸 기전이 주를 이루었으나, 최근 RIP1에 의한 암세포의 증식 및 생존 기전에 관한 연구 결과들이 보고 있다. 또한, RIP1에 의한 전이 기전 연구가 시작되는 단계에 있으며, 암 치료에서 전이억제는 중요하다고 여겨지고 있고, 많은 연구자들이 암의 전이를 막는 연구를 진행하고 있다.

폐암(lung cancer)은 남자나 여자 모두에게 있어서 암 관련 사망의 가장 흔한 요인이다. 2005년 미국에서, 폐암은 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer) 및 대장암(colon cancer)을 모두 합친 것보다 더 많은 사망률을 차지하고 있다. 이러한 폐암에서도 전이가 중요하게 여겨지고 있는데, 폐암의 전이에 관여하는 유전자들이 많이 알려져 있지 않은 상태여서, 폐암의 전이를 진단함으로써 표적 치료가 가능하게 하는 폐암 전이 진단용 바이오 마커의 개발이 필요하다.

대한민국 특허공개공보 제2012-0077567호 대한민국 특허공개공보 제2013-0129347호

본 발명자들은, RIP1이 폐암세포의 침윤성 및 전이성을 증가시키는 기능을 가진 것을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 RIP1을 포함하는 폐암 전이 진단용 바이오 마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 RIP1의 발현량을 측정할 수 있는 수단을 포함하는 폐암 전이 진단용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 폐암 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 폐암 전이 진단용 바이오 마커는 RIP1(Receptor-interacting protein 1)을 포함할 수 있다.

본 발명의 폐암 전이 진단용 키트는 RIP1의 발현량을 측정할 수 있는 수단을 포함할 수 있다.

상기 수단은 RIP1 단백질의 발현량을 측정하는 것일 수 있다.

상기 RIP1 단백질의 발현량을 측정하는 수단은 항체, 항체 단편, 단백질 마이크로어레이 및 앱타머로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 수단은 RIP1의 mRNA의 발현량을 측정하는 것일 수 있다.

상기 RIP1의 mRNA의 발현량을 측정하는 수단은 프라이머 및 프로브로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 폐암 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다.

(1) 폐암 환자 시료로부터 RIP1 발현량을 측정하는 단계;

(2) 정상대조군 시료로부터 RIP1 발현량을 측정하는 단계; 및

(3) 상기 (1) 단계의 발현량과 상기 (2) 단계의 발현량을 비교하는 단계.

본 발명에 따른 폐암 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 (2) 단계의 발현량이 상기 (1) 단계의 발현량과 동등 이상일 경우, 폐암 전이능이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 RIP1 발현량 측정은 단백질 또는 mRNA의 양을 측정하는 것일 수 있다.

상기 단백질 양의 측정은 항원-항체 반응에 의한 측정일 수 있다.

상기 항원-항체 반응에 의한 측정은 웨스턴 블라팅, 항원-항체 반응, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 측정일 수 있다.

상기 mRNA 양의 측정은 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 노던 블라팅 또는 핵산 마이크로어레이에 의한 측정일 수 있다.

본 발명은 폐암 전이 진단용 바이오 마커, 이를 이용한 폐암 전이 진단용 키트 및 폐암 전이 진단 정보 제공방법을 제공함으로써, 폐암 전이 발생 여부를 신속, 정확하고 손쉽게 예측할 수 있게 하며, 나아가 폐암 전이를 억제할 수 있는 특이적 치료제의 개발에 있어 특정 타겟으로 활용할 수 있어, 임상의에 의한 향후 치료의 효과적인 프로토콜을 계획 및 수행하는데 관한 정확한 기초 정보를 제공할 수 있다.

도 1은 폐암환자에서의 RIP1 및 비멘틴의 발현을 분석한 임상 데이터이다.
도 2는 MEF 및 폐암세포에서의 EMT 발현 분석을 나타낸 것이다.
도 3은 RIP1 과발현 세포의 EMT 활성 및 세포 이동성 증가에 대한 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 RIP1 키나아제에 의한 세포 이동성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 RIP1 키나아제 억제 세포에서의 세포 이동성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 RIP1에 의한 세포 이동성에 관여하는 신호전달을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 RIP1에 의한 EGFR 신호 전달의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 RIP1에 의한 염증반응의 활성화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 RIP1과 NF-κB 신호전달의 연관성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 동물모델에서의 RIP1에 의한 전이 능력 증가 및 생존률 감소를 나타낸 것이다.
도 11은 5-aza에 의한 세포 이동성의 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 5-aza에 의한 RIP1 및 비멘틴의 발현을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 구체예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 구체예들에 한정되는 것이 아니라, 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 발명의 구체예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않은 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

이하, 본 발명에 따른 RIP1을 포함하는 폐암 전이 진단용 바이오 마커, 이를 이용한 폐암 전이 진단용 키트 및 폐암 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 대하여 상세히 설명한다.

RIP1은 세포의 생사를 결정짓는 데 중요한 작용을 하는 키나아제로 여겨지고 있다. RIP1에는 네크롭토시스에 필요한 세린/트레오닌 키나아제 도메인, 동형성 상호 작용 모티브를 포함하는 중간 도메인, 그리고 아폽토시스 활성을 위한 사멸 도메인(death domain)까지 총 3개의 도메인이 있다. RIP1의 유비퀴틴화는 세포생존을 촉진하고, 디유비퀴틴화는 반대로 세포내에서 세포사멸을 일으키게 된다. RIP1에는 여러 개의 도메인이 존재하기에 RIP1의 활성화는 NF-κB, 미토겐 활성화 단백질키나아제(MAPK), 아폽토시스나 네크롭토시스 등 다양한 결과를 초래할 수 있다. 네크로스타틴-1(nec-1)은 RIP1 키나아제 활성을 차단하여 사멸수용에 의해 유도되는 네크롭토시스를 막는다. RIP3은 프로그램된 네크롭토시스를 조절하고, 네크로좀에서의 RIP1 모집(recruitment)을 늘인다. RIP1과 RIP3 키나아제 외에도 여러 다른 키나아제들이 RIP1과 RIP3의 인산화에 관여하기도 한다.

상기와 같이, 암에서 RIP1에 의한 연구들은 세포사멸 기전이 주를 이루었으나, 최근 RIP1에 의한 암세포의 증식 및 생존 기전에 관한 연구 결과들이 보고되고 있고, RIP1에 의한 전이기전 연구가 시작되는 단계에 있다. 암 치료에서 전이억제는 중요하게 여겨지고 있고, 많은 연구자들이 암의 전이를 막는 연구를 진행하고 있다. 폐암에서도 또한 전이가 중요하게 여겨지고 있고, 전이에 관여하는 유전자들이 많이 알려져 있지 않은 상태로서 폐암의 전이를 억제하는 유전자를 찾아내어 기능을 알아내는 연구가 필요하고, 더 나아가 이 유전자를 타겟으로 하는 치료방법 개발이 필요하다.

따라서, 본 발명에서는 RIP1을 폐암 전이 유발에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있는 후보로 추정, 즉, RIP1이 폐암 세포의 침윤성 및 전이성을 증가시키는 기능을 가진 것으로 추정하였으며, 이에 대한 연구를 진행하여 다음의 사항들을 규명하였다:

세포내에서 RIP1과 EMT(상피중간엽세포이행; Epithelial-mesenchymal transition)의 연관성을 확인하여 RIP1이 EMT를 유도할 수 있음을 규명하였고, RIP1에 의한 EMT 유발이 암세포의 이동 및 침윤 증가를 증대할 수 있는지를 실험하여 관찰하였으며, RIP1의 다양한 신호전달 기작중에 어떠한 신호전달 기작이 세포 이동성에 연관되어 있는지 규명하였다. 그 결과, RIP1의 키나아제 효과가 세포 이동성을 유발함을 확인하였고, RIP1의 키나아제 효과는 EGFR-Src 인산화를 통하여 신호전달이 유도되는 것을 확인하여 Src 하위 신호전달을 통하여 STAT3 전사인자가 활성화되는 것을 규명하였다. 여기에 더불어 본 발명자는 RIP1에 의해 염증반응의 대표적 마커인 IL-1β이 증가함을 확인하여, RIP1이 암세포의 증식 및 전이에 연관되는 염증반응에도 관련되어 있다는 것을 규명하였다. RIP1이 과발현된 폐암 세포에서 1L-1β에 의한 EMT 마커 발현을 관찰한 결과, RIP1에 의해 세포 이동성 및 염증반응 관련 유전자의 발현이 증가하고, 염증반응 유전자 중 하나인 IL-1β에 의해 세포 이동성이 증가하는 것을 확인함으로써, RIP1의 폐암 전이 진단용 바이오 마커로서의 용도를 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 RIP1(Receptor-interacting protein 1)을 포함하는 폐암 전이 진단용 바이오 마커를 제공한다.

상기 RIP1의 유전자 및 단백질 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 에 등록되어 있다.[RIP1 유전자의 reference sequence No NM_001354930.1, RIP1 단백질의 reference sequence No.Q13546.3]

본 발명에서, “바이오 마커”는 폐암 전이 진단의 예측을 목적으로 하는 분자 표지를 의미하는 것으로서, 개인에서 정상 또는 비정상적 진행의 표지(sign) 또는 개인에서 질병 또는 다른 상태의 표지이거나 그것을 나타내는 표적 분자를 칭하기 위하여 상호교환적으로 사용된다. 더욱 상세하게는, 상기 바이오마커는 정상 또는 비정상이든지 간에, 만약 비정상이라면 만성인지 급성인지, 특정 생리학적 상태 또는 진행의 존재와 관련된 해부, 생리, 생화학 또는 분자학적 파라미터이다. 바이오마커는 실험실 검정법 및 의료용 영상을 포함하는 다양한 방법에 의하여 검출가능하고, 측정가능하다.

또한, 본 발명은 RIP1의 발현량을 측정할 수 있는 수단을 포함하는 폐암 전이 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에서, "RIP1의 발현량"이라 함은 RIP1의 단백질 발현량 또는 RIP1의 mRNA 발현량을 의미한다.

상기 수단은 공지된 분자생물학적 수단 또는 면역화학적 수단일 수 있다. 바람직한 구체예로서, 상기 수단은 프라이머, 프로브, 항체, 항체 단편, 단백질 마이크로어레이 및 앱타머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 측정 수단일 수 있다. 여기에서, 항체, 항체 단편, 단백질 마이크로어레이 또는 앱타머는 단백질의 발현량을 측정하는 수단에 해당하고, 프라이머, 프로브 또는 핵산 마이크로어레이는 mRNA의 발현량을 측정하는 수단에 해당한다.

상기 "프라이머"는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머는 주형인 RIP1 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.

상기 "프로브"는 천연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드인 RIP1의 염기 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명에서 상기 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드, 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 등 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 등 포함), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 "항체"는 상기 RIP1 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등을 포함할 수 있다.

상기 항체는 상업적으로 구입하여 사용할 수 있으며, RIP1 단백질의 아미노산 서열은 공지되어 있으므로, 상기 아미노산 서열을 이용하여 항체를 직접 제조하여 사용할 수도 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 또한, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F (ab'), F (ab') 2 및 Fv 등이 있다.

항체 제조 방법은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 공지된 다양한 항체 생산 기술을 이용할 수 있으며, 예컨대, 다클론 항체의 경우에는, RIP1 항원을 동물에 주사하고, 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나, 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

상기 "항체 단편"은 항체 분자의 기능적인 단편을 의미하며, 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 항체 단편으로서, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

상기 "마이크로어레이"는, 예를 들어 RIP1 유전자를 검출하기 위한 핵산 마이크로어레이 또는 RIP1 단백질을 검출하기 위한 단백질 마이크로어레이일 수 있다.

본 발명에서, 마이크로어레이는 RIP1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

상기 "앱타머"는 RIP1 단백질에 친화성을 갖는 핵산 올리고머를 의미한다. 상기 앱타머는 무작위적으로 합성된 약 60염기로 이루어지는 DNA 올리고머를 합성하고, 이들 중에서 RIP1 단백질과 결합하는 DNA 올리고머를 친화성 컬럼으로 분리하고, 이를 증폭 및 상기 분리 과정을 반복하여 RIP1에 친화성을 갖는 앱타머를 제조할 수 있다.

본 발명의 폐암 전이 진단용 키트는 RIP1 유전자 검출용 또는 RIP1 단백질 검출용일 수 있다.

본 발명의 폐암 전이 진단용 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 유전자 증폭용인 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 폐암 전이 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 RIP1 단백질 검출용인 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명에 따른 폐암 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다.

(1) 폐암 환자 시료로부터 RIP1 발현량을 측정하는 단계;

(2) 정상대조군 시료로부터 RIP1 발현량을 측정하는 단계; 및

(3) 상기 (1) 단계의 발현량과 상기 (2) 단계의 발현량을 비교하는 단계.

본 발명에 따른 폐암 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 (2) 단계의 발현량이 상기 (1) 단계의 발현량과 동등 이상일 경우, 폐암 전이능이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 환자의 시료는 폐암 전이 진단용 바이오 마커인 RIP1의 과발현을 측정할 수 있는 시료를 말하며, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서는 정상 대조군에서의 RIP1의 발현량을 폐암 의심 환자 또는 증상이 경미한 폐암 초기 환자에서의 RIP1의 발현량과 비교함으로써 암 의심 환자 또는 증상이 경미한 암 초기 환자의 실제 폐암 전이 여부를 진단할 수 있다. 즉, 환자의 시료로부터 RIP1의 발현량을 측정하고, 정상인의 시료로부터 RIP1의 발현량을 측정하여 양자를 비교한 후, 환자의 시료 내 RIP1의 발현량이 정상인의 시료의 것보다 동등 이상으로 발현되면 폐암 전이를 예측할 수 있는 것이다.

상기 RIP1 발현량 측정은 단백질 또는 mRNA의 양을 측정하는 것이 바람직하다.

상기 단백질 양의 측정은 항원-항체 반응에 의한 측정인 것이 바람직하다.

상기 항원-항체 반응에 의한 측정은 웨스턴 블라팅, 항원-항체 반응, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 측정인 것이 바람직하다.

상기 mRNA 양의 측정은 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 노던 블라팅 또는 핵산 마이크로어레이에 의한 측정인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예>

1. RIP1에 의해 조절되는 상피중간엽세포이행(Epithelial-mesenchymal transition; EMT)의 TCGA 임상데이터

RIP1의 세포내 신호 전달 기전과 EMT와의 연관성 규명을 위하여 실험을 수행하였다. 우선적으로 RIP1과 EMT가 임상에서 연관성을 가짐을 확인하였고, 폐암환자의 암 조직에서 RIP1과 EMT 마커인 비멘틴 발현의 상호 연관성을 확인하였다.

[실험 방법]

TCGA 임상데이터를 바탕으로 폐암환자의 조직(total:폐암환자에서의 전체조직, NO:폐암환자에서의 원발암조직)에서의 RIP1, 비멘틴 발현의 연관성을 도 1의 그래프로 나타태었다.

[결과]

도 1에 나타낸 바와 같이, 폐암환자에서 RIP1과 비멘틴의 연관성을 TCGA 임상데이터를 이용하여 확인한 결과, RIP1의 발현이 높은 환자의 조직에서 비멘틴의 발현도 높게 나타났다. 이 결과로 RIP1과 비멘틴은 상호 연관성을 가지고 있음을 보여주며 RIP1이 전이에 영향을 주는 것을 확인하였다.

2. MEF 및 폐암 세포내에서의 RIP1에 의해 조절되는 상피중간엽세포이행(Epithelial-mesenchymal transition)

앞선 임상 데이터를 바탕으로 실제로 세포내에서의 RIP1과 EMT의 연관성을 규명하였다. RIP1은 TNF-α 신호 전달에 관련되어 있다고 다른 연구 결과에서 보고되어 있어 넉아웃(knockout) MEF 세포주와 폐암세포주에서 RIP1과 비멘틴 발현 및 EMT 관련 분자 발현 확인하였다.

1) MEF 세포에서 RIP1, TRADD, TNFR1, TRAF2의 발현을 넉아웃시킨 후, RIP1과 비멘틴의 발현 양상 및 TRAF2, TRADD의 발현을 확인하였다.

[실험 방법]

MEF(WT), MEF (RIP1, TRADD, TNFR1, TRAF2 knockout) 세포주를 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩(seeding) 후, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, 비멘틴, MMP2, MMP9 및 액틴의 발현을 확인하였다.

[결과]

도 2A에 나타낸 바와 같이, MEF 세포에서 RIP1을 넉아웃하였을 경우, EMT 마커인 MMP2, MMP9, 비멘틴의 발현이 약화되었음을 알 수 있다.

2) 폐암 세포주를 이용하여 RIP1 발현에 따른 비멘틴의 발현 변화를 확인하였다.

[실험 방법]

A549, H460, H1299, LU99 폐암세포주들을 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩후 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, 비멘틴, MMP2, MMP9의 발현을 확인하였다.

[결과]

도 2B에 나타낸 바와 같이, RIP1을 과하게 발현하는 폐암세포주인 H1299, LU99와 RIP1을 약하게 발현하는 폐암세포주인 A549, H460을 이용하여 폐암세포주에서 RIP1의 발현과 EMT 마커들의 발현 양상을 확인하였다.

RIP1을 과하게 발현하는 세포주들은 비멘틴의 발현이 강했으며, RIP1을 약하게 발현하는 세포주들은 상대적으로 비멘틴의 발현이 약하됨을 웨스턴 블롯을 수행하여 확인하였다.

이상의 결과로부터, RIP1의 발현에 따라 비멘틴의 발현이 변화하였고, 이는 RIP1과 비멘틴은 상호 연관성을 가짐을 확인하였다. RIP1과 비멘틴의 상호 연관성은 RIP1이 EMT 발생을 유도할 수 있음을 규명하였다.

3. RIP1에 의한 EMT 유발이 암세포의 이동 및 침윤 증가에 미치는 영향

RIP1이 EMT를 유도할 수 있음을 앞선 실험 결과로 확인하여, RIP1에 의한 EMT 유발이 암세포의 이동 및 침윤 증가를 증강할 수 있는지를 관찰하기 위하여, 폐암 세포주인 A549, H460 세포에 RIP1을 과발현하는 세포주를 제작한 후 침윤 및 이동 분석을 실시하여, RIP1의 발현 증가로 인해 세포 이동성이 촉진하는지를 관찰하였다.

[실험 방법]

1) A549, H460에 RIP1을 형질주입(transfection)하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩한 후, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, His, 비멘틴, MMP2, MMP9 및 액틴의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 3A의 상단에 나타내었다.

2) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 60π 접시에 5×10⁵로 시딩한 후, 24시간 후에 무혈청배양액으로 갈아주고, 18시간 후에 상청액을 수확하여 젤라틴을 젤(gel)에 로딩하고, 젤을 쿠마시브릴리언트블루로 염색하여 MMP2, MMP9의 활성을 확인였으며, 그 결과를 도 3A의 하단에 나타내었다.

3) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 마티겔 코팅 트랜스웰(matigel coating trnaswell)에 5×10⁴씩 상부 챔버에 넣고, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 침윤(invasion)을 확인하였으며, 그 결과를 도 3B에 나타내었다.

4) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 콜라겐 코팅 트랜스웰에 2×10⁴ 씩 상부 챔버에 넣고, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣어주며, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 이동(migration)을 확인하였고, 그 결과를 도 3C에 나타내었다.

[결과]

도 3A에 나타낸 바와 같이, RIP1 과발현 세포주에서 RIP1 및 EMT 마커의 발현을 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰하였고, MMP2, MMP9의 활성을 젤라틴 지모그래피 시험법(gelatin zymography assay)을 수행하였는데, RIP1, EMT 마커의 발현은 증가하였고 MMP2, MMP9의 활성도 증가하였음을 확인하였다.

도 3B 및 도 3C에 나타낸 바와 같이, RIP1을 과발현한 세포를 이용하여 침윤(invasion) 및 이동(migration) 분석을 실행하여 세포 이동성을 확인한 결과, RIP1의 발현이 강할수록 세포 이동성이 증가하였음을 확인하였다.

상기의 결과로부터, RIP1에 의해 EMT에 관여하는 유전자들이 활성화되었고, 그 결과로 세포 이동성이 증가하였음을 확인하였다.

4. 세포 이동성에 영향을 미치는 RIP1의 신호전달 기작

RIP1의 신호전달 기작 중에 키나아제 효과는 주요 신호전달 기작으로 알려져 있어, 이러한 키나아제의 기능이 EMT의 유도 및 세포 이동성에는 어떠한 역할을 하는지를 관찰하였다. 즉, RIP1 키나아제의 억제제를 이용하여 키나아제 기능을 억제한 후, EMT의 활성화를 관찰하였다.

[실험 방법]

1) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 마티겔 코팅 트랜스웰에 5×10⁴씩 상부 챔버에 넣고 네크로스타틴으로 처리하였으며, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 침윤을 확인하였고, 그 결과를 도 4A에 나타내었다.

2) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 콜라겐 코팅 트랜스웰에 2×10⁴씩 상부 챔버에 넣고 네크로스타틴 처리하였으며, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 이동을 확인하였으며, 그 결과를 도 4B에 나타내었다.

3) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩한 후 네크로스타틴으로 처리하고, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, 비멘틴, MMP2, MMP9의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 4C의 상단에 나타내었다.

4) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 60π 접시에 5×10⁵ 시딩한 후, 네크로스타틴 처리 후 24시간 후에 무혈청배양액으로 갈아주고, 18시간 후에 상청액을 수확하여 젤라틴을 젤에 로딩하고, 젤을 쿠마시브릴리언트블루로 염색하여 MMP2, MMP9의 활성을 확인하였고, 그 결과를 도 4C의 하단에 나타내었다.

[결과]

도 4A 및 도 4B에 나타낸 바와 같이, RIP1의 키나아제 억제제인 네크로스타틴 처리 후, 침윤, 이동 분석을 수행하여 세포 침윤 및 세포 이동을 관찰하였고, 그 결과 네크로스타틴에 의해 침윤 및 이동이 감소한 것을 확인하였다.

도 4C에 나타낸 바와 같이, RIP1의 키나아제 효과 억제 시, EMT 마커의 발현을 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰하였고, MMP2, MMP9의 활성을 젤라틴 지모그래피 시험법을 수행하여 측정하였으며, 키나아제 효과 억제 시, EMT 마커의 발현 감소, MMP2, MMP9 활성이 감소한 것을 확인하였다.

상기의 결과로부터, RIP1에 의한 EMT 활성에 따른 세포 이동성 증가는 RIP1의 키나아제 신호전달 기작 활성에 의해 EMT가 활성화되어, 세포 이동성이 증가함을 확인하였다.

5. EGFR-Src 신호전달을 통한 RIP1 키나아제에 의한 세포 이동성 증가

본 실험에서는 RIP1 키나아제의 기능을 억제제 처리뿐만 아니라, RIP1 키나아제 억제 세포주를 제작하여, RIP1의 키나아제 기능을 세포수준에서 억제하여 EMT 유도 및 세포 이동성을 관찰함으로써 RIP1의 키나아제 효과는 EGFR-Src 인산화를 통하여 신호전달을 유도한다는 것을 규명하는 실험을 수행하였다.

[실험 방법]

1) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1) 및 키나아제 억제 세포주(K45A)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 마티겔 코팅 트랜스웰에 5×10⁴씩 상부 챔버에 넣고, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 침윤을 확인하였고, 그 결과를 도 5A에 나타내었다.

2) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1) 및 키나아제 억제 세포주(K45A)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 콜라겐 코팅 트랜스웰에 2×10⁴씩 상부 챔버에 넣고, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 이동을 확인하였으며, 그 결과를 도 5B에 나타내었다.

3) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1) 및 키나아제 억제 세포주(K45A)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩한 후, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, 비멘틴, MMP2, MMP9, p-Src, p-EGFR, EGFR의 발현을 확인하였으며, 그 결과를 도 5C(왼쪽)에 나타내었다.

4) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)및 키나아제 억제 세포주(K45A)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 60π 접시에 5×10⁵ 시딩한 후 24시간 후에 무혈청배양액으로 갈아주고 18시간 후에 상청액을 수확하였다. 그런 다음, 젤라틴을 젤에 로딩하고, 젤을 쿠마시브릴리언트블루로 염색하여 MMP2, MMP9의 활성을 확인하였고, 그 결과를 도 5C(오른쪽)에 나타내었다.

[결과]

도 5A 및 도 5B에 나타낸 바와 같이, RIP1의 키나아제 억제 세포주에서 침윤 및 이동 분석을 수행하여 세포 침윤 및 세포 이동을 관찰하였다. 그 결과, RIP1 키나아제 억제에 의해 세포 침윤 및 세포 이동이 감소하였음을 확인하였다.

도 5C에 나타낸 바와 같이, RIP1의 키나아제 억제 시, EMT 마커, EGFR 신호전달을 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰하였고, MMP2, MMP9의 활성을 젤라틴 지모그래피 시험법을 수행하여 측정하였다. 그 결과, RIP1 키나아제 억제 시, EMT 마커 및 FR-Src의 발현 감소, MMP2 및 MMP9의 활성이 감소한 것을 확인하였으며, 이상의 결과들로부터 RIP1에 의한 세포 이동성 증가는 RIP1 키나아제의 활성을 통하여 EMT가 유발되며, EGFR-Src 신호전달을 통하여 유도되는 것을 규명하였다.

6. EGFR-Src에 의한 STAT3 전사인자의 활성화

본 실험에서는 EGFR-Src의 하위 신호전달을 통하여 STAT3 전사인자가 활성화되는지에 대한 실험을 수행하였다. 즉, EMT의 신호전달에서 전사인자인 STAT3가 활성화된다고 보고되어, EGFR-Src에 의한 STAT3의 활성화를 관찰하였다.

[실험 방법]

1) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩한 후, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 p-Src, Src, p-STAT3 및 STAT3의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 6A에 나타내었다.

2) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩한 후 네크로스타틴으로 처리하고, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 p-Src, Src, p-STAT3, STAT3의 발현을 확인하여, 그 결과를 도 6B에 나타내었다.

3) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 마티겔 코팅 트랜스웰에 5×10⁴씩 상부 챔버에 넣고, STAT3 억제제로 처리하였다. 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 침윤을 확인하였고, 그 결과를 도 6C에 나타내었다.

4) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 콜라겐 코팅 트랜스웰에 2×10⁴씩 상부 챔버에 넣고, STAT3 억제제로 처리하였다. 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 이동을 확인하였고, 그 결과를 도 6D에 나타내었다.

5) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶ 으로 시딩한 후, STAT3 억제제(도 6E), Src 억제제(도 6F)로 처리하고, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, 비멘틴, MMP2, MMP9, p-Src, Src, p-STAT3, STAT3의 발현을 확인하였으며, 그 결과를 각각 도 6E(STAT3 억제제) 및 도 6F(Src 억제제)에 나타내었다.

6) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 60π 접시에 5×10⁵ 시딩한 후, 네크로스타틴 처리 후 24시간 후에 무혈청배양액으로 갈아주고, 18시간 후에 상청액을 수확하였다. 그런 다음 젤라틴을 젤에 로딩하고, 젤을 쿠마시브릴리언트블루로 염색하여 MMP2, MMP9의 활성을 확인하였고, 그 결과를 도 6E의 최하단에 나타내었다.

[결과]

도 6A에 나타낸 바와 같이 RIP1에 의한 세포 침윤 및 세포 이동을 증가시키는 신호전달 기작을 관찰하였다. RIP1에 의해 Src-STAT3 신호전달 기작 활성화를 웨스턴 블롯을 수행하여 확인하였다.

도 6B에 나타낸 바와 같이, RIP1의 키나아제 효과 억제에 의한 신호전달 기작을 관찰하였는데, Src-STAT3 신호전달의 감소를 웨스턴 블롯을 수행하여 확인하였다.

도 6C 및 도 6D에 나타낸 바와 같이, STAT3 억제제 처리 시 침윤 및 이동 분석을 수행하여 세포 침윤 및 세포 이동 감소를 관찰하였고, 그 결과 STAT3 억제제 처리 시 침윤 및 이동 억제됨을 확인하였다.

도 6E 및 도 6F에 나타낸 바와 같이, STAT3 억제제 및 Src 억제제 처리 시, EMT 마커 발현과 신호전달 기작에 대하여 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰하였다. 그 결과, EMT 마커 발현 감소 및 Src, STAT3 발현이 감소하였음을 확인하였다.

이상의 결과로부터, RIP1에 의한 EMT 활성화는 EGFR-Src-STAT3 신호전달에 의해 일어나며, 최종적으로 세포 이동성이 증가함을 확인하였다.

7. RIP1에 의한 EGFR 신호전달의 활성화

EGFR 신호전달 기작은 세포 이동성 신호전달 기작 중에서 중요한 신호전달 기작임을 상기 실시예에서 확인하였고, EGFR 신호전달 기작을 확인하여, 이러한 EGFR 신호전달이 RIP1에 의해 활성화 되는지를 확인하는 실험을 수행하였다.

[실험 방법]

1) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 마티겔 코팅 트랜스웰에 5×10⁴씩 상부 챔버에 넣고, EGFR 억제제로 처리하였다. 그런 다음, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 침윤을 확인하였으며, 그 결과를 도 7A에 나타내었다.

2) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 콜라겐 코팅 트랜스웰에 2×10⁴씩 상부 챔버에 넣고, EGFR 억제제로 처리하였다. 그런 다음, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 이동을 확인하였으며, 그 결과를 도 7A에 함께 나타내었다.

3) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩한 후 처리하고, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 p-EGFR, EGFR의 발현을 확인하였으며, 그 결과를 도 7B에 나타내었다.

4) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶ 으로 시딩한 후 네크로스타틴으로 처리하고, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, 비멘틴, MMP2, MMP9, p-EGFR, EGFR, p-Src, Src, p-STAT3, STAT3의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 7C, 도 7D 및 도 7E에 각각 나타내었다.

5) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶ 으로 시딩한 후 네크로스타틴, STAT3 억제제를 처리하고, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 p-EGFR, EGFR의 발현을 확인하였고, 그 결과를 각각 도 7F 및 도 7G에 각각 나타내었다.

[결과]

도 7A에 나타낸 바와 같이, EGFR 억제 시 침윤 및 이동 분석을 수행하여 세포 침윤 및 세포 이동 감소를 관찰하였으며, EGFR 억제제 처리 시 세포 침윤 및 세포 이동이 억제되는 것을 확인하였다.

도 7B에 나타낸 바와 같이, RIP1에 의한 세포 침윤 및 세포 이동을 증가시키는 신호전달 기작을 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰하였으며, RIP1에 의해 EGFR 인산화 증가를 통하여 EGFR 신호전달 기작이 활성화됨을 확인하였다.

도 7C, 7D 및 7E에 나타낸 바와 같이, EGFR 억제에 의한 신호전달 기작을 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰하였고, EGFR 억제 시, EMT 마커 및 Src, STAT3의 신호전달이 감소하였고, 또한 EGFR 신호전달 감소도 확인하였다.

도 7F 및 도 7G에 나타낸 바와 같이, RIP1 키나아제 효과 및 STAT3 억제제 처리 시, EGFR 신호전달 기작을 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰하였으나, EGFR의 인산화가 감소하지 않음을 확인하였다.

이상의 결과로부터, RIP1에 의해 EGFR의 인산화가 유도되며, EGFR 인산화에 의해 하위 분자인 Src-STAT3의 활성화가 일어나며, EMT 유도에 의해 세포 이동성이 증가함을 규명하였다.

8. RIP1에 의한 염증반응 활성화

RIP1은 키나아제의 기능만 있는 것이 아니라 염증반응에도 관련 되어있다고 알려져 있다. 최근의 연구에 의하면, 염증반응은 암세포의 증식 및 전이에 연관되어 있다고 보고되어, 본 발명에서는 RIP1 염증반응 활성화를 확인하였고, 세포 이동성에는 어떠한 영향을 주는지에 대한 실험을 수행하였다.

[실험 방법]

1) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 칩 어레이를 수행하여 유전자 분석을 실행하였고, 그 결과를 도 8A에 나타내었다.

2) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1) 및 키나아제 억제 세포주(K45A)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩한 후, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 IL-1β의 발현을 확인하였으며, 그 결과를 도 8B에 나타내었다.

3) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩한 후, IL-1β 처리 후 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, MMP2, MMP9, 비멘틴, β-액틴의 발현을 확인하였으며, 그 결과를 도 8C에 나타내었다.

4) A549, H460, H1299 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩한 후, IL-1β 처리 후 24시간 후에 세포를 수확하고, 그런 다음 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 비멘틴, RIP1, IL-1β, MMP2, MMP9, β-액틴의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 8D에 나타내었다.

5) A549, H460, H1299 세포주들을 마티겔 코팅 트랜스웰에 5×10⁴씩 상부 챔버에 넣고, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣었으며, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 침윤을 확인하였으며, 그 결과를 도 8E에 나타내었다.

6) A549, H460, H1299에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1, H1299 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC, H1299 PC)을 콜라겐 코팅 트랜스웰에 2×10⁴씩 상부 챔버에 넣고, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 이동을 확인하였으며, 그 결과를 도 8E에 함께 나타내었다.

[결과]

도 8A에 나타낸 바와 같이, A549, H460 세포와 RIP1이 과발현된 A549, H460 세포로 칩 어레이를 수행하여 유전자 분석을 실행하였다. 그 결과, RIP1이 과발현된 세포에서 세포 이동성 유전자 및 염증 반응 유전자의 발현이 증가하였음을 확인하였다.

도 8B에 나타낸 바와 같이, RIP1에 의한 염증반응 활성화를 웨스턴 블롯을 수행하여 확인하였고, RIP1에 의해 염증반응의 대표적 마커인 IL-1β(Interleukin 1β)이 증가함을 확인하였다.

도 8C에 나타낸 바와 같이, RIP1이 과발현된 A549, H460 세포에서 IL-1β에 의한 EMT 마커 발현을 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰하였고, 그 결과 IL-1β 처리 시 EMT 마커의 발현이 증가함을 확인하였다.

도 8D에 나타낸 바와 같이, A549, H460 세포에서 IL-1β에 의한 EMT 마커를 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰하였고, 침윤 및 이동 분석을 수행하여 세포 침윤 및 세포 이동을 관찰하였다. 그 결과, IL-1β에 의해 EMT 마커 발현 및 침윤 및 이동이 증가하였음을 확인하였다.

이상의 결과로부터, RIP1에 의해 세포 이동성 및 염증반응 관련 유전자의 발현이 증가하였으며, 염증반응 유전자 중 하나인 IL-1β에 의해 세포 이동성이 증가함을 확인하였다. 즉, RIP1에 의한 IL-1β의 활성 증가로 RIP1에 의해 염증반응이 증가함을 확인하였다.

9. RIP1의 NF-κB 활성화 기작 및 세포 이동성에 대한 영향

앞선 실험에서 RIP1에 의한 염증반응을 유도하는 IL-1β의 활성이 확인되었는데, IL-1β는 NF-κB에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있어, RIP1이 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 활성화 기작 및 세포 이동성에 영향을 주는지에 대한 실험을 수행하였다.

[실험 방법]

1) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩한 후, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 p-IκBα, p-P65, p50, p105의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 9A에 나타내었다.

2) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 마티겔 코팅 트랜스웰에 5×10⁴씩 상부 챔버에 넣고, NF-κB 억제제로 처리하였다. 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 침윤을 확인하였고, 그 결과를 도 9B에 나타내었다.

3) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 콜라겐 코팅 트랜스웰에 2×10⁴씩 상부 챔버에 넣고, NF-κB 억제제로 처리하였다. 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 이동을 확인하였고, 그 결과를 도 9C에 나타내었다.

4) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들을 60π 접시에 1×10⁶으로 시딩한 후 NF-κB 억제제로 처리 후, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, 비멘틴, MMP2, MMP9, 액틴의 발현을 확인하였으며, 그 결과를 도 9D에 나타내었다.

5) A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1) 및 키나아제 억제 세포주(K45A)를 만들고, 벡터 제어 세포주들(A549 PC, H460 PC)을 60π 접시에 1×10⁶로 시딩한 후, 24시간 후에 세포를 용해(lysis)한 후에 세포질과 핵을 분리하여 방사성동위원소로 표지한 NF-κB 프로브를 핵에 넣어준 후, 핵내에 존재하는 NF-κB와 반응시킨 후, 겔 로딩 후에 밴드의 위치를 확인하여 핵내에 존재하는 NF-κB를 확인하였으며, 그 결과를 도 9E에 나타내었다.

[결과]

도 9A에 나타낸 바와 같이, RIP1이 과발현된 세포에서의 NF-κB 신호전달을 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰하였으며, RIP1에 의해 NF-κB 신호전달에 관여하는 분자들의 발현이 증가함을 확인하였다.

도 9B, 도 9C, 도 9D에 나타낸 바와 같이, NF-κB 억제제 처리에 의한 세포 침윤 및 세포 이동의 변화를 침윤 및 이동 분석을 수행하여 확인하였고, EMT 마커 발현을 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰한 결과, NF-κB 억제제 처리 시 세포 침윤 및 세포 이동이 감소하였고 EMT 마커 발현이 감소하였음을 확인하였다.

도 9E에 나타낸 바와 같이, NF-κB의 활성화를 EMSA(Electrophoric Mobility Shift Assay)를 수행하여 관찰하였으며, 그 결과 RIP1에 의해 NF-κB가 활성화되고, 키나아제 억제시 NF-κB 활성이 감소함을 확인하였다.

이상의 결과로부터, RIP1은 키나아제 효과를 이용하여 NF-κB를 활성화시키며, NF-κB 활성은 세포 이동성을 증강시킴을 규명하였다.

10. 동물모델에서의 RIP1에 의한 EMT의 활성화

앞선 세포실험에서 RIP1에 의해 EMT가 활성화되어 세포 이동성이 증가함을 확인하였다. 이러한 세포 실험이 동물모델에서도 일어나는지 확인하기 위해 동물모델을 이용하여 동물실험을 진행하였다. 또한, 동물모델에 A549 RIP1 과발현 세포주를 이용하여 암세포의 전이능력 증가 및 전이증가로 인한 동물 생존율에는 어떠한 영향을 미치는지에 대한 실험을 수행하였다.

[실험 방법]

A549, H460에 RIP1을 형질주입하여 RIP1 과발현 세포주(A549 RIP1, H460 RIP1)를 만들고, 벡터 제어 세포주(A549 PC, H460 PC)도 제작하였다. 그런 다음, 각 세포주들에 루시페라아제를 세포내로 형질주입하여 세포주를 제작하였고, 이렇게 제작한 세포주들을 누드 마우스 5주령 꼬리에 1×10⁶으로 정맥주사를 실행하였다. 그런 다음, 매주마다 루시페라아제(100ug)를 복강주사로 주입한 후에 루시페라아제의 활성을 형광기계로 측정하고, 마우스의 생존률을 측정하였으며, 그 결과를 도 10A 및 도 10B에 나타내었다.

[결과]

도 10A 및 도 10B에 나타낸 바와 같이, 동물모델에서 RIP1의 전이 능력 및 동물의 생존율을 마우스 동물모델을 이용하여 관찰하였으며, RIP1은 생체내에서 암세포의 전이 능력을 20%정도 증가시키고, 동물의 생존율을 25%정도 감소시켰음을 확인하였다.

이상의 결과로부터, 세포 실험을 이용한 RIP1의 세포 이동성 증가는 동물모델을 이용한 실험에서 나타났으므로, RIP1은 생체내에서 암세포의 전이능력을 증가시키고, 최종적으로 생존율도 감소시키는 것으로 규명되었다.

11. RIP1의 발현에 영향을 미치는 기작

앞선 실험에서 RIP1에 의한 EMT 활성화 및 염증반응에 의한 세포 이동성 증가 기작을 규명하였다. 그런데, 이러한 RIP1은 A549, H460 세포에서 발현이 강하지 않은 결과를 나타내었다. 따라서, 이러한 RIP1의 발현이 어떤 기작에 의해 조절되는지 확인하는 실험을 수행하였다. RIP1 조절기작으로 최근 연구에서 RIP 패밀리들이 메틸레이션에 의해 조절된다는 연구 결과를 바탕으로 RIP1의 발현을 메틸레이션에 의해 조절하고, 세포 이동성에는 어떠한 영향을 주는지 관찰하였으며, 그 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다.

도 11A를 살펴보면, A549, H460 세포에 5-aza 처리시 RIP1 및 EMT 마커가 발현됨을 관찰하였다. 5-aza 처리 시, RIP1의 발현이 증가하였고, EMT가 활성화된 것을 확인할 수 있었다.

도 11B에 나타낸 바와 같이, 5-aza에 의한 세포 사멸에 대하여 관찰하였으나, 5-aza에 처리 시 5-aza에 의한 세포 사멸은 유도되어지지 않았음을 확인할 수 있었다.

도 11C에 나타낸 바와 같이, 5-aza 처리 시 세포 침입 및 세포 이동 변화가 관찰되었고, 5-aza에 의해 세포 침입 및 세포 이동이 증가하였음을 확인하였다.

도 12는 세포내에서 5-aza에 의한 RIP1 및 비멘틴의 발현을 형광 현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 것으로서, 세포내에서 RIP1 및 비멘틴 발현이 증가하고 복합체(complex)를 형성하는 것이 관찰되었다.

이상의 결과로부터, A549, H460 세포에서는 RIP1이 메틸레이션에 의해 발현이 조절되며, RIP1의 발현 조절을 억제 시 EMT가 활성화되고 세포 이동성이 증가함을 확인하였다.

Claims (12)

1. RIP1(Receptor-interacting protein 1)을 포함하는 폐암 전이 진단용 바이오 마커.
2. RIP1의 발현량을 측정할 수 있는 수단을 포함하는 폐암 전이 진단용 키트.
3. 제2항에 있어서,
   상기 수단은 RIP1 단백질의 발현량을 측정하는 것인 폐암 전이 진단용 키트.
4. 제3항에 있어서,
   상기 수단은 항체, 항체 단편, 단백질 마이크로어레이 및 앱타머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폐암 전이 진단용 키트.
5. 제2항에 있어서,
   상기 수단은 RIP1의 mRNA의 발현량을 측정하는 것인 폐암 전이 진단용 키트.
6. 제5항에 있어서,
   상기 수단은 프라이머 및 프로브로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폐암 전이 진단용 키트.
7. (1) 폐암 환자 시료로부터 RIP1 발현량을 측정하는 단계;
   (2) 정상대조군 시료로부터 RIP1 발현량을 측정하는 단계; 및
   (3) 상기 (1) 단계의 발현량과 상기 (2) 단계의 발현량을 비교하는 단계를 포함하는 폐암 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 (2) 단계의 발현량이 상기 (1) 단계의 발현량과 동등 이상일 경우, 폐암 전이능이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 방법.
9. 제7항에 있어서,
   상기 RIP1 발현량 측정은 단백질 또는 mRNA의 양을 측정하는 것인 방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 단백질 양의 측정은 항원-항체 반응에 의한 측정인 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 항원-항체 반응에 의한 측정은 웨스턴 블라팅, 항원-항체 반응, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 측정인 방법.
12. 제9항에 있어서,
    상기 mRNA 양의 측정은 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 노던 블라팅 또는 핵산 마이크로어레이에 의한 측정인 방법.
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

Images