KR20190074608A - Markers for ***e addiction - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 코카인 중독 특이적 바이오 마커에 관한 것으로, 구체적으로, 코카인의 급성 또는 만성 투여시 발현이 유의적으로 변화하는 바이오 마커들에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker specific for ***e poisoning, and specifically relates to a biomarker in which expression of ***e is significantly changed upon acute or chronic administration.
약물남용이란 약물을 의도적으로 다른 목적 (비의학적 목적)을 위해 사용하는 것을 말하며, 약물남용은 사용자의 의도에 따라 약물오용과 구별된다. 아편, 대마, 코카인, 메스암페타민 등과 같은 많은 약물들이 쾌락, 불안해소, 기분전환을 위해 남용되고 있는 가운데, 최근에는 이런 종류뿐만 아니라 진정제, 각성제, 흡입제, 호르몬제 등의 다양한 물질들이 남용되고 있다. 이들 물질들의 반복적인 사용은 뇌에서의 장기적인 변화를 초래하게 되는 심각한 질환을 야기 시킬 뿐만아니라 개인과 사회 모두에게 해를 끼치고, 이러한 약물남용은 특정 사회, 경제적 집단에 한정된 것이 아니라 사회전체에 널리 영향을 미치기 때문에 국가적으로 이들 약물의 사용을 규제하고 있다.남용 약물은 약물추구행동(drug- seeking behavior)을 유도하고, 이러한 현상은 일차적으로 약물 섭취와 관련하여 강한 보상작용(reward)에 의한 정신적 의존성(psychological dependence)이 형성되며, 계속되는 남용은 내성(tolerance)과 만성적 의존을 일으킨다. 약물 사용을 중단하면 신체적 의존성(physical dependence)이 나타나고, 이러한 현상은 신체를 정상으로 유지하려는 생리적 기능 때문에 생기는 현상이며, 그 결과로 생리적으로 견디기 어려운 금단증상(withdrawal, abstinence syndrome)이 나타나며 그 증상은 약물에 따라 다르다.Drug abuse is the intentional use of drugs for other purposes (non-medical purposes), and substance abuse is distinct from drug abuse according to the user's intent. Many drugs such as opiates, hemp, ***e, and methamphetamine have been abused for pleasure, anxiety, and mood swings. Recently, however, various substances such as sedatives, stimulants, inhalants and hormones have been abused. Repeated use of these substances not only causes serious illnesses that lead to long-term changes in the brain, but also harms both individuals and society. Such substance abuse is not limited to specific social and economic groups, , The use of these drugs is regulated nationally. Abuse drugs induce drug-seeking behaviors, which are primarily related to drug dependence, (psychological dependence) is formed, and subsequent abuse causes tolerance and chronic dependence. Discontinuation of drug use leads to physical dependence, which is caused by the physiological function of keeping the body normal, resulting in withdrawal (abstinence syndrome), which is physiologically unacceptable. It depends on the drug.
코카인 또는 암페타민과 같은, 정신 흥분제(Psychostimulants)는 기민함을 증가시키고 인간 내 물리적 역량을 증가시킨다. 이러한 물질들은 처음에는 도파민 투과를 증가시키나, 장기간 약물 사용은 뇌 보상 시스템의 조절장애(dysregulation) 및 정신불안을 이끌어내면서 결과적으로 도파민 활동성이 감소된다. 만성적 코카인 남용은 주요한 건강 상의 문제를 일으킨다. 코카인 사용자는 혈관 수축, 동공 확대, 및 체온, 심장 박동수 및 혈압 증가를 통해 심장 마비 또는 뇌졸중과 같은, 돌연사로 이어질 수 있는 급성 심혈관 또는 뇌혈관 응급 상황을 경험할 수 있으며, 과자극(hyperstimulation), 빈맥(tachycardia), 고혈압(hypertension), 산동(mydriasis), 근육 뒤틀림(muscle twitching), 불면증(sleeplessness), 극단적 신경예민(extreme nervousness), 망상(hallucinations), 편집증(paranoia), 공격적 행위, 및 의기소침의 증상이 발생한다. 코카인 사용과 관련된 기타 합병증은 심장 리듬 장애, 흉통 및 호흡 부전, 발작, 두통, 및 복통 및 구역질과 같은 위장관 합병증을 포함한다. 또한, 코카인이 식욕을 감소시키는 경향이 있기 때문에, 많은 장기 사용자들은 영양 실조 상태가 될 수 있다. 나아가, 니코틴, 코카인 및 알코올을 동시적으로 남용하는 것이 흔하다는 것이 익히 알려져 있다. 코카인 및 알코올의 병용은 인간에서 어느 하나의 약물 단독으로보다 더 많은 심혈관 독성을 발휘하는 것으로 나타났다.Psychostimulants, such as ***e or amphetamines, increase agility and increase physical capacity in humans. These substances initially increase dopamine transmission, but long-term drug use leads to dysregulation and mental anxiety in the brain-compensating system, resulting in decreased dopaminergic activity. Chronic ***e abuse causes major health problems. Cocaine users can experience acute cardiovascular or cerebrovascular emergencies that can lead to sudden death, such as vasoconstriction, dilated pupils, and increased body temperature, heart rate and blood pressure, such as heart attacks or strokes, tachycardia, hypertension, mydriasis, muscle twitching, sleeplessness, extreme nervousness, hallucinations, paranoia, aggressive behavior, and depression Of the symptoms occur. Other complications associated with ***e use include cardiac rhythm disturbances, chest pain and respiratory failure, seizures, headache, and gastrointestinal complications such as abdominal pain and nausea. Also, since ***e tends to reduce appetite, many long-term users can become malnourished. Furthermore, it is well known that it is common to abuse nicotine, ***e and alcohol simultaneously. The combination of ***e and alcohol has been shown to exert more cardiovascular toxicity in humans than either drug alone.
역사적으로, 화학물질 의존성 치료는 주로 해당 물질의 사용을 자발적으로 중단하도록 환자를 설득하는 시도(행동요법)를 수반하였다. 그러나, 코카인, 모르핀, 암페타민, 니코틴 및 알코올, 및 기타 유형의 도파민-생성제는 중독성이 강한 물질이며, 이러한 약물에 대한 의존은 끊기가 더 어려울 수 있고, 대부분의 다른 중독성 물질들에 대한 의존보다 피해가 상당히 더 크다. 특히, 알코올, 코카인 및 헤로인 의존은 통상 만성 재발성 장애이다. 정신적 의존은 거의 언제나 신체적 의존에 선행하지만 반드시 신체적 의존으로 발전되는 것은 아니며, 내성은 동일한 효과를 얻기 위해 보다 많은 용량의 투여를 필요로 하는 약물효과에 대한 반응의 감소를 의미하고, 내성의 종류로는 약물을 만성적으로 사용한 후 약물의 대사가 증대되는 대사성 내성(metabolic tolerance), 약물의 효과를 보상하는 행동적 내성(behavioral tolerance: behavioral sensitization), 약물수용체, 효소 또는 생체막에 대한 작용의 보상적 변화인 기능적 내성(functional tolerance)이 있다.Historically, chemical-dependent therapies have involved attempts to persuade patients (behavioral therapy) to voluntarily stop using the substance. However, ***e, morphine, amphetamines, nicotine and alcohol, and other types of dopamine-producing agents are highly toxic substances, and dependence on these drugs may be more difficult to break off and depend on most other toxic substances The damage is considerably greater. In particular, alcohol, ***e and heroin dependence are usually chronic recurring disorders. Mental dependence almost always precedes physical dependence but does not necessarily lead to physical dependence. Tolerance refers to a reduction in response to a drug effect that requires more dosing to achieve the same effect. (Eg, metabolic tolerance, which increases the metabolism of a drug after chronic use of the drug, behavioral tolerance to compensate for the drug's effects, compensatory change of action on the drug receptor, Functional tolerance.
이러한 약물 중독 및 의존성 연구를 위하여, 중추신경흥분제의 의존성 발현 기전 연구가 있어 왔으며, 데시프라민(Desipramine), 아만타딘(amantadine) 및 브로모크립틴(bromocriptine)은 코카인 금단 증상을 감소시키고, 디술피람이 코카인 의존성의 치료에 사용될 수 있다는 것이 최근 제시되었다 (예를 들어, Bonet et al., Journal of Substance Abuse Treatment, 26 (2004), 225-232 참조). 또한, 최근 마이크로어레이 기술을 적용하여 약물남용에 의한 중추신경계의 분자생물학적 표지마커 또는 바이오마커를 발굴하고자 하는 연구가 진행되고 있다. Desipramine, amantadine, and bromocriptine have been shown to reduce ***e withdrawal symptoms and have been shown to be effective in the treatment of drug addiction and dependence, Can be used in the treatment of ***e dependence (see, for example, Bonet et al., Journal of Substance Abuse Treatment, 26 (2004), 225-232). In recent years, studies have been conducted to find molecular marker markers or biomarkers of the central nervous system by drug abuse by applying microarray technology.
본 발명에서는 코카인을 사용하였을 때 발현의 변화를 보여 약물 중독 여부를 판단하는데 주요한 증거가 될 수 있는 유전자와 단백질 마커를 발굴함으로써 급성 또는 만성 코카인 중독 (또는 노출)을 진단하는데 이용하는 것을 목적으로 한다.In the present invention, it is intended to diagnose acute or chronic ***e poisoning (or exposure) by locating genes and protein markers which are major evidence for judging drug poisoning by showing changes in expression when ***e is used.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 코카인 중독 및 의존성 확인용 바이오 마커를 제공한다.To achieve the above object, the present invention provides a biomarker for ***e poisoning and dependence confirmation.
또한, 본 발명은 급성 및 만성 코카인 중독 및 의존성 구별용 바이오 마커를 제공한다.The present invention also provides biomarkers for acute and chronic ***e poisoning and dependency discrimination.
또한, 본 발명은 코카인 중독 및 의존성 확인용 바이오마커 단백질을 제공한다.The present invention also provides biomarker proteins for ***e poisoning and dependence identification.
또한, 본 발명은 코카인 중독 및 의존성 확인용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for identifying ***e poisoning and dependence.
또한, 본 발명은 코카인 중독 및 의존성 확인용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for identifying ***e poisoning and dependence.
아울러, 본 발명은 코카인 노출 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for providing information necessary for ***e exposure diagnosis.
본 발명에 따르면, ARHGEF7, PTOV1, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1 (GRIA1X3, GRIA1X4), GRIA2 (GRIA2X6, GRIA2X7), HDAC5, HDAC10, NCAM1, NPY, SNCA, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B, MCM3AP, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE, ADCY5, AKT3, KCNJ2, LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7, CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 및 TNFRSF1A는 코카인의 급성 또는 만성 투여시 mRNA 및 단백질의 발현량이 유의적으로 상향 또는 하향 조절되므로, 코카인의 급성 또는 만성 노출에 의한 코카인 중독 및 의존성 확인에 유용하게 이용될 수 있다.According to the present invention, ARHGEF7, PTOV1, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1 (GRIA1X3, GRIA1X4), GRIA2 (GRIA2X6, GRIA2X7), HDAC5, HDAC10, NCAM1, NPY, SNCA, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6 , NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B, MCM3AP, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE, ADCY5, AKT3, KCNJ2, LOC101865389, Since the expression levels of mRNA and protein are significantly upregulated or downregulated at the time of acute or chronic administration of ***e, the expression levels of mRNA and protein are significantly elevated in the case of ***e, Can be usefully used to identify ***e poisoning and dependence due to acute or chronic exposure to ***e.
도 1은 본 발명의 전체적인 실험 프로토콜의 도식도이다.
도 2는 해마에서의 급성/만성 코카인 중독에 따른 발현 변화 유전자들을 벤 다이어그램 분석을 통해 발굴하는 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 급성/만성 코카인 중독에 따라 해마에서 발현이 변화한 유전자 ARHGEF7, PTOV1, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1 (GRIA1X3, GRIA1X4), GRIA2 (GRIA2X6, GRIA2X7), HDAC5, HDAC10, NCAM1, NPY, SNCA, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, MCM3AP 및 WNT10B의 발현량을 나타낸 도이다:
Con: 코카인 무처리군;
CA: 급성 코카인 투여군;
CC: 만성 코카인 투여군;
Acute Cocaine: 급성 코카인 투여군; 및
Chronic Cocaine: 만성 코카인 투여군.
도 4는 선조체에서의 급성/만성 코카인 중독에 따른 발현 변화 유전자들을 벤 다이어그램 분석을 통해 발굴하는 과정을 나타낸 도이다.
도 5는 급성/만성 코카인 중독에 따라 선조체에서 발현이 변화한 유전자 DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE, ADCY5, AKT3, KCNJ2, LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7, CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 및 TNFRSF1A의 발현량을 나타낸 도이다:
Con: 코카인 무처리군;
CA: 급성 코카인 투여군; 및
CC: 만성 코카인 투여군.
도 6은 급성/만성 코카인 중독에 따라 선조체에서 발현이 변화한 유전자 DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE, ADCY5, AKT3, KCNJ2, LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7, CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 및 TNFRSF1A의 피어슨 상관 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 급성/만성 코카인 중독에 따라 선조체에서 발현이 변화한 유전자 CAMK2A 및 CASP9의 mRNA 발현 변화와 단백질 발현량 변화를 확인한 도이다:
a: CAMK2A 및 CASP9의 mRNA 발현량;
b: 인산화 CAMK2A, CAMK2A 및 절단된 CASP9의 단백질 발현량;
c: pCAMK2A/CAMK2A의 정량화;
d: 절단된 CASP9의 정량화;
Con: 코카인 무처리군;
CA: 급성 코카인 투여군; 및
CC: 만성 코카인 투여군.
도 8은 인간 뇌조직에서의 CAMK2A 발현 조절 양상을 검증한 도이다.
도 9는 CAMK2A에 대한 기능성 단백질 네트워크를 확인한 도이다.Figure 1 is a schematic diagram of the overall experimental protocol of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a process of extracting genes expressing expression due to acute / chronic ***e poisoning in the hippocampus through analysis of a Venn diagram.
FIG. 3 is a graph showing changes in expression in the hippocampus according to acute / chronic ***e poisoning. FIG. 3 is a graph showing changes in expression in the hippocampus according to acute / chronic ***e poisoning. , CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, MCM3AP and WNT10B.
Con: Cocaine-free treated group;
CA: acute ***e treated group;
CC: chronic ***e treated group;
Acute Cocaine: Acute ***e treated group; And
Chronic Cocaine.
FIG. 4 is a diagram showing a process of identifying genes for expression changes due to acute / chronic ***e poisoning in a striatum through analysis of a Venn diagram.
FIG. 5 is a graph showing the change in expression in the striatum according to acute / chronic ***e poisoning. FIG. 5 is a graph showing the change in expression in the striatum according to acute / chronic ***e poisoning. , CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 and TNFRSF1A:
Con: Cocaine-free treated group;
CA: acute ***e treated group; And
CC: Chronic ***e administered group.
FIG. 6 is a graph showing the change in expression in the striatum according to acute / chronic ***e poisoning. FIG. 6 is a graph showing the change in expression in the striatum according to acute / chronic ***e poisoning. , CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 and TNFRSF1A.
FIG. 7 shows changes in mRNA expression and protein expression levels of genes CAMK2A and CASP9, which are expressed in striatum according to acute / chronic ***e poisoning.
a: mRNA expression level of CAMK2A and CASP9;
b: protein expression of phosphorylated CAMK2A, CAMK2A and truncated CASP9;
c: Quantification of pCAMK2A / CAMK2A;
d: Quantification of truncated CASP9;
Con: Cocaine-free treated group;
CA: acute ***e treated group; And
CC: Chronic ***e administered group.
Fig. 8 is a graph verifying the regulatory pattern of CAMK2A expression in human brain tissue.
FIG. 9 shows a functional protein network for CAMK2A. FIG.
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to embodiments of the present invention. It should be understood, however, that the invention is not limited thereto and that various changes and modifications may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims and their equivalents. .
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.Unless otherwise indicated, nucleic acids are recorded in a 5 'to 3' orientation from left to right. The numerical ranges recited in the specification include numerals defining the ranges and include each integer or any non-integral fraction within a defined range.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice of testing the present invention, the preferred materials and methods are described herein.
본 발명에서 용어, "대상체" 또는 "환자"는 인간, 유인원, 원숭이, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 원숭이와 인간을 대상으로 하였다.The term "subject" or "patient" in the present invention refers to any single individual requiring treatment, including humans, apes, monkeys, cows, dogs, guinea pigs, rabbits, chickens, insects and the like. In addition, any subject who participates in a clinical study test that does not show any disease clinical findings, or who participates in epidemiological studies or used as a control group is included. In one embodiment of the present invention, monkeys and humans were included.
본 발명에서 용어, "조직" 또는 "시료(샘플)"는 대상 또는 환자로부터 얻은 조직 또는 세포를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.The term "tissue" or "sample (sample) " in the present invention means a tissue or a cell obtained from a subject or a patient. The source of the tissue or cell sample may be a solid tissue from fresh, frozen and / or preserved organ or tissue sample or biopsy or aspirate; Blood or any blood components; It may be a cell at any point in the pregnancy or development of the subject. Tissue samples can also be primary or cultured cells or cell lines.
본 발명에서 용어, "코카인 중독(***e Addiction)"은 중독성 약물인 코카인의 남용으로 약물에 대한 의존성(dependence)이 생기고, 사용할 때마다 양을 늘려야 효과가 생기는 내성(tolerance)이 생기고, 사용하지 않으면 온 몸에 견디기 힘든 이상을 일으키는 금단증상(withdrawal symptoms)이 생기는 현상이며, 코카인에 장기간 노출된 "만성 중독"과 단기간 노출된 "급성 중독"을 포함한다.In the present invention, the term "***e addiction" refers to the abuse of ***e, which is an addictive drug, to cause drug dependence, and to increase the amount of each use, tolerance is produced. It is a phenomenon that results in withdrawal symptoms that cause an unbearable abnormality in the whole body. It includes long-term "chronic poisoning" and short-term "acute poisoning" in ***e.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.All technical terms used in the present invention are used in the sense that they are generally understood by those of ordinary skill in the relevant field of the present invention unless otherwise defined. Also, preferred methods or samples are described in this specification, but similar or equivalent ones are also included in the scope of the present invention. The contents of all publications referred to herein are incorporated herein by reference.
일 측면에서, 본 발명은 코카인 노출시 발현 변화를 나타내는 ARHGEF7, PTOV1, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1 (GRIA1X3, GRIA1X4), GRIA2 (GRIA2X6, GRIA2X7), HDAC5, HDAC10, NCAM1, NPY, SNCA, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B, MCM3AP, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE, ADCY5, AKT3, KCNJ2, LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7, CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 및 TNFRSF1A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는, 코카인 중독 및 의존성 확인용 바이오 마커에 관한 것이며, 상기 유전자들은 표 1 및 2에 기재된 Accession no.로 정의된다. 일 실시예에서, 급성/만성 코카인 투여에 따라 발현량이 변화하는 유전자들을 확인하기 위해, 도 1에 나타낸 바와 같이 분석을 수행한 결과, 상기 유전자군들의 발현량이 유의미하게 상향 또는 하향 조절된 것을 확인하였다.In one aspect, the present invention provides a method of inhibiting ***e exposure, comprising administering an effective amount of a compound selected from the group consisting of ARHGEF7, PTOV1, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1 (GRIA1X3, GRIA1X4), GRIA2 (GRIA2X6, GRIA2X7), HDAC5, HDAC10, NCAM1, NPY, SNCA, CDH7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B, MCM3AP, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE , Or one or more genes selected from the group consisting of ADCY5, AKT3, KCNJ2, LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7, CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 and TNFRSF1A Wherein the genes are defined by the Accession no. As described in Tables 1 and 2. The biomarkers for ***e poisoning and dependence identification, In one embodiment, in order to identify genes whose expression levels vary according to the administration of acute / chronic ***e, analysis was performed as shown in FIG. 1, and as a result, it was confirmed that the expression levels of the gene groups were significantly increased or decreased .
일 구현예에서, 급성 코카인 노출시 PTOV1, HDAC5, HDAC10, NPY, SNCA, KDM2BX10, KDM2BX13, KIFAP3, WNT10B, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, GNG7, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, LOC101925175 및 CASP9로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현이 상향 조절되고, MCM3AP, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1X3, GRIA1X4, GRIA2X6, GRIA2X7, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, CAMK2A, EGLN2, TNFRSF1A 및 BCL2L1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현이 하향 조절될 수 있다. In one embodiment, at the time of acute ***e exposure, PTOV1, HDAC5, HDAC10, NPY, SNCA, KDM2BX10, KDM2BX13, KIFAP3, WNT10B, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, GNG7, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, LOC101925175 and CASP9 And upregulated expression of one or more genes selected from the group consisting of MCM3AP, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1X3, GRIA1X4, GRIA2X6, GRIA2X7, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, CAMK2A, EGLN2, TNFRSF1A And BCL2L1 can be down-regulated.
일 구현예에서, 만성 코카인 노출시 ARHGEF7, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, SLC18A3, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, TNFRSF1A, BCL2L1 및 BAD로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현이 상향 조절되고, MCM3AP, PTOV1, GTF2I, AKT3, CAMK2A 및 LOC101866246로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현이 하향 조절될 수 있다. In one embodiment, the expression of one or more genes selected from the group consisting of ARHGEF7, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, SLC18A3, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, TNFRSF1A, BCL2L1 and BAD is upregulated upon chronic ***e exposure , MCM3AP, PTOV1, GTF2I, AKT3, CAMK2A and LOC101866246 can be down-regulated.
일 측면에서, 본 발명은 ARHGEF7, PTOV1 및 GTF2I 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는, 급성 및 만성 코카인 중독 및 의존성 구별용 바이오 마커에 관한 것이며, 상기 ARHGEF7, PTOV1 및 GTF2I 유전자의 발현 조절 패턴으로 급성 및 만성 코카인 중독 및 의존성을 구별할 수 있다. 일 실시예에서, ARHGEF7는 만성 코카인 중독군에서 발현이 증가하였고, PTOV1는 급성 코카인 중독군에서 발현이 증가하고 만성 코카인 중독군에서는 발현이 감소하였으며, GTF2I는 급성 및 만성 코카인 중독군에서 발현이 감소하였으나 급성 코카인 중독군에서의 발현 감소가 만성 코카인 중독군에 비해 현저한 것으로 나타났다 (도 3a 위쪽 그래프 참조).In one aspect, the present invention relates to a biomarker for acute and chronic ***e poisoning and dependence discrimination, comprising ARHGEF7, PTOV1 and GTF2I genes or a protein encoded by the gene, wherein the expression pattern of the ARHGEF7, PTOV1 and GTF2I genes Can distinguish between acute and chronic ***e poisoning and dependence. In one embodiment, the expression of ARHGEF7 was increased in the chronic ***e addiction group, PTOV1 was increased in the acute ***e addiction group and decreased in the chronic ***e addiction group, and GTF2I was decreased in the acute and chronic ***e addiction group , But the decrease in the expression in the acute ***e addiction group was more significant than that in the chronic ***e addiction group (see the upper graph of Fig. 3a).
일 측면에서, 본 발명은 코카인 노출시 단백질 발현량이 변화하는 CAMK2A 단백질, GRIN1 단백질 및 CASP9 단백질을 포함하는, 코카인 중독 및 의존성 확인용 바이오마커 단백질에 관한 것이다. 일 구현예에서 DLG1 마커 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 코카인 노출시 CAMK2A 유전자 발현이 감소하고, CASP9의 발현이 증가하였으나, 단백질 수준에서는 급성 및 만성 코카인 노출시 CAMK2A 단백질의 인산화가 감소하였으며, 만성 코카인 노출시 CAMK2A 단백질의 발현량이 감사하였고, 급성 코카인 노출시 절단된 CASP9이 증가한 반면, 만성 코카인 노출시 절단된 CASP9가 관찰되지 않았다 (도 7 참조). In one aspect, the invention relates to a biomarker protein for ***e poisoning and dependence identification, comprising a CAMK2A protein, a GRIN1 protein, and a CASP9 protein, wherein the amount of protein expressed upon ***e exposure changes. In one embodiment, it may further comprise a DLGl marker protein. In one embodiment, CAMK2A gene expression decreased and CASP9 expression increased at ***e exposure, but at the protein level, CAMK2A protein phosphorylation decreased upon acute and chronic ***e exposure, and the expression level of CAMK2A protein upon exposure to chronic ***e was appreciated , CASP9 cleaved at acute ***e exposure was increased, whereas CASP9 cleaved at chronic ***e exposure was not observed (see FIG. 7).
일 측면에서, 본 발명은 코카인 노출시 발현 변화를 나타내는 ARHGEF7, PTOV1, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1 (GRIA1X3, GRIA1X4), GRIA2 (GRIA2X6, GRIA2X7), HDAC5, HDAC10, NCAM1, NPY, SNCA, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B, MCM3AP, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE, ADCY5, AKT3, KCNJ2, LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7, CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 및 TNFRSF1A으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오 마커의 검출 시약을 포함하는 코카인 중독 및 의존성 확인용 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention provides a method of inhibiting ***e exposure, comprising administering an effective amount of a compound selected from the group consisting of ARHGEF7, PTOV1, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1 (GRIA1X3, GRIA1X4), GRIA2 (GRIA2X6, GRIA2X7), HDAC5, HDAC10, NCAM1, NPY, SNCA, CDH7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B, MCM3AP, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE A detection reagent for one or more biomarkers selected from the group consisting of: ATCC1, AKT5, AKT3, KCNJ2, LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7, CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 and TNFRSF1A To a composition for identifying ***e poisoning and dependence.
일 구현예에서, 검출 시약은 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약일 수 있다.In one embodiment, the detection reagent may be a reagent capable of detecting the marker at the protein or nucleic acid level.
일 구현예에서, 마커의 핵산 수준 검출 시약은 상기 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 또는 프로브, 또는 프라이머쌍 및 프로브를 포함할 수 있으며, 이를 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏, DNA 칩을 포함하는 유전자 발현량 분석 방법에 이용할 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. In one embodiment, the nucleic acid level detection reagent of the marker is selected from the group consisting of a nucleic acid sequence of the marker, a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence, a primer pair specifically recognizing the nucleic acid sequence and a fragment of the complementary sequence, (RT-PCR), competitive RT-PCR (Competitive RT-PCR), and Nuclease protection assay (RT-PCR) But are not limited to, RNase, S1 nuclease assay, in situ hybridization, nucleic acid microarray, Northern blot, and DNA chip.
일 구현예에서, 본 발명의 유전자 마커들에 대한 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍, 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍, 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍, 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍, 서열번호 17 및 18의 프라이머 쌍, 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍, 서열번호 21 및 22의 프라이머 쌍, 서열번호 23 및 24의 프라이머 쌍, 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍, 서열번호 27 및 28의 프라이머 쌍, 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍, 서열번호 33 및 34의 프라이머 쌍, 서열번호 35 및 36의 프라이머 쌍, 서열번호 37 및 38의 프라이머 쌍, 서열번호 39 및 40의 프라이머 쌍, 서열번호 41 및 42의 프라이머 쌍, 서열번호 43 및 44의 프라이머 쌍, 서열번호 45 및 46의 프라이머 쌍, 서열번호 47 및 48의 프라이머 쌍, 서열번호 49 및 50의 프라이머 쌍, 서열번호 51 및 52의 프라이머 쌍, 서열번호 53 및 54의 프라이머 쌍, 서열번호 55 및 56의 프라이머 쌍, 서열번호 57 및 58의 프라이머 쌍, 서열번호 61 및 62의 프라이머 쌍, 서열번호 63 및 64의 프라이머 쌍, 서열번호 65 및 66의 프라이머 쌍, 서열번호 67 및 68의 프라이머 쌍, 서열번호 69 및 70의 프라이머 쌍, 서열번호 71 및 72의 프라이머 쌍, 서열번호 73 및 74의 프라이머 쌍, 서열번호 75 및 76의 프라이머 쌍, 서열번호 77 및 78의 프라이머 쌍, 서열번호 79 및 80의 프라이머 쌍, 서열번호 81 및 82의 프라이머 쌍, 서열번호 83 및 84의 프라이머 쌍, 서열번호 85 및 86의 프라이머 쌍, 서열번호 87 및 88의 프라이머 쌍, 서열번호 89 및 90의 프라이머 쌍, 서열번호 91 및 92의 프라이머 쌍, 서열번호 93 및 94의 프라이머 쌍, 서열번호 95 및 96의 프라이머 쌍, 서열번호 97 및 98의 프라이머 쌍, 서열번호 99 및 100의 프라이머 쌍, 서열번호 101 및 102의 프라이머 쌍, 서열번호 103 및 104의 프라이머 쌍, 서열번호 105 및 106의 프라이머 쌍, 서열번호 107 및 108의 프라이머 쌍, 서열번호 109 및 110의 프라이머 쌍, 서열번호 111 및 112의 프라이머 쌍, 및 서열번호 113 및 114의 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment, the primer pair for the genetic markers of the present invention comprises a primer pair of SEQ ID NOS: 1 and 2, a pair of primers of SEQ ID NOS: 3 and 4, a pair of primers of SEQ ID NOS: 5 and 6, a primer pair of SEQ ID NOS: 7 and 8 A pair of primers of SEQ ID NOs: 9 and 10, a pair of primers of SEQ ID NOs: 11 and 12, a pair of primers of SEQ ID NOs: 13 and 14, a pair of primers of SEQ ID NOs: 15 and 16, a pair of primers of SEQ ID NOs: And primer pairs of 20, primer pairs of SEQ ID Nos. 21 and 22, primer pairs of SEQ ID Nos. 23 and 24, primer pairs of SEQ ID Nos. 25 and 26, primer pairs of SEQ ID Nos. 27 and 28, primer pairs of SEQ ID Nos. 29 and 30 The primer pair of SEQ ID NOs: 31 and 32, the primer pair of SEQ ID NOs: 33 and 34, the primer pair of SEQ ID NOs: 35 and 36, the primer pair of SEQ ID NOs: 37 and 38, the primer pair of SEQ ID NOs: 39 and 40, 42 primer pairs, The primer pair of SEQ ID NOs: 43 and 44, the primer pair of SEQ ID NOs: 45 and 46, the primer pair of SEQ ID NOs: 47 and 48, the primer pair of SEQ ID NOs: 49 and 50, the primer pair of SEQ ID NOs: 51 and 52, The primer pair of SEQ ID NOs: 55 and 56, the primer pair of SEQ ID NOs: 57 and 58, the primer pair of SEQ ID NOs: 61 and 62, the primer pair of SEQ ID NOs: 63 and 64, the primer pair of SEQ ID NOs: 65 and 66, The primer pair of SEQ ID NOS: 67 and 68, the primer pair of SEQ ID NOS: 69 and 70, the primer pair of SEQ ID NOS: 71 and 72, the primer pair of SEQ ID NOS: 73 and 74, the primer pair of SEQ ID NOS: 75 and 76, A pair of primers of SEQ ID Nos. 79 and 80, a pair of primers of SEQ ID Nos. 81 and 82, a pair of primers of SEQ ID Nos. 83 and 84, a pair of primers of SEQ ID Nos. 85 and 86, a pair of primers of SEQ ID Nos. 87 and 88, 89 and 90 prades Primer pairs of SEQ ID Nos. 93 and 94, primer pairs of SEQ ID Nos. 95 and 96, primer pairs of SEQ ID Nos. 97 and 98, primer pairs of SEQ ID Nos. 99 and 100, primer pairs of SEQ ID Nos. 103 and 104, primer pairs of SEQ ID NOs: 105 and 106, primer pairs of SEQ ID NOs: 107 and 108, primer pairs of SEQ ID NOs: 109 and 110, primers of SEQ ID NOs: 111 and 112, primer pairs of SEQ ID NOs: And a pair of primers of SEQ ID NOS: 113 and 114,
일 구현예에서, 마커의 단백질 수준 검출 시약은 상기 마커의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함할 수 있으며, 이를 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이를 포함하는 단백질 양 분석 방법에 이용할 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. In one embodiment, the protein level detection reagent of the marker is an antibody, antibody fragment, aptamer, avidity multimer or peptidomimetics that specifically recognize the protein full length or fragment thereof. ), And these can be detected by Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, immunoelectrophoresis, tissue immuno staining, immunoprecipitation assay, , Complement Fixation Assay (FACS), mass spectrometry, or a method for analyzing the amount of proteins including protein microarrays.
본 발명에서 사용된 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.The term "detection" or "measurement" as used herein means to quantify the concentration of a detected or measured subject.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 코카인의 급성 또는 만성 중독 (노출)에 의해 발현이 변화하는 유전자에 특이적인 센스 및 안티센스 프라이머를 이용해 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 수준의 측정을 통해 mRMA 발현 정도를 판별할 수 있다. 상기 PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으나 본 발명에서는 서열번호 1 내지 114의 프라이머 쌍을 이용하여 각각의 유전자의 발현 정도를 확인하였다.As used herein, the term "primer" refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 hydroxyl group that can form base pairs with a complementary template and is a starting point for template strand copy Short nucleic acid sequence " Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents for the polymerization reaction (i. E., DNA polymerate or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates at the appropriate buffer solution and temperature. In the present invention, PCR amplification is carried out using a sense and antisense primer specific to a gene whose expression is changed by acute or chronic intoxication (exposure) of ***e, and the degree of mRMA expression can be determined by measuring the level of a desired product. The PCR conditions, the lengths of the sense and antisense primers can be modified based on those known in the art. In the present invention, the expression level of each gene was confirmed using the primer pairs of SEQ ID NOS: 1-114.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 코카인의 급성 또는 만성 중독 (노출)에 의해 발현이 변화하는 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 각각의 유전자 발현 정도를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.In the present invention, the term "probe" means a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a short period of a few nucleotides or several hundreds of nucleotides capable of specifically binding with mRNA, . The probe may be prepared in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, or an RNA probe. In the present invention, hybridization is performed using a probe complementary to a gene whose expression is changed by acute or chronic intoxication (exposure) of ***e, and the degree of expression of each gene can be diagnosed through hybridization. The selection and hybridization conditions of a suitable probe can be modified on the basis of those known in the art, so that the present invention is not particularly limited thereto.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, capping, substitution of one or more natural nucleotides with one or more homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers such as methylphosphonate, phosphotriester, Amidates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 코카인의 급성 또는 만성 중독 (노출)에 의해 발현이 변화하는 마커인 유전자들에서 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 제조방법은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.The term "antibody" as used herein in the present invention means a specific protein molecule indicated for an antigenic site as a term known in the art. For purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to a protein expressed in genes that are markers whose expression is changed by acute or chronic intoxication (exposure) of the ***e of the present invention. The method can be prepared using well known methods. Also included are partial peptides that can be made from the protein. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and any polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding antibody thereof may be included in the antibody of the present invention and include all immunoglobulin antibodies. Furthermore, the antibodies of the present invention include special antibodies such as humanized antibodies.
본 발명의 코카인 중독 및 의존성 확인용 조성물은 대상체의 코카인 중독 및 의존성을 확인하기 위한 것 뿐 아니라, 코카인 중독 및 의존성의 예방 내지 치료 약물을 개발하기 위하여 코카인을 대상체에 투여하거나 처치한 경우 나타나는 바이오마커들의 변화를 확인하기 위한 "중독 및 의존성"의 정도 내지 변화의 확인을 포함한다.The composition for identifying ***e poisoning and dependence of the present invention is not only for confirming ***e poisoning and dependence of a subject, but also for identifying a biomarker when the ***e is administered or treated to a subject in order to develop a drug for preventing or treating ***e poisoning and dependence &Quot; Addiction and Dependency "to confirm the change in the degree of change.
일 측면에서, 본 발명은 ARHGEF7, PTOV1, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1 (GRIA1X3, GRIA1X4), GRIA2 (GRIA2X6, GRIA2X7), HDAC5, HDAC10, NCAM1, NPY, SNCA, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B, MCM3AP, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE, ADCY5, AKT3, KCNJ2, LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7, CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 및 TNFRSF1A으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오 마커의 검출 시약을 포함하는 코카인 중독 및 의존성 확인용 키트에 관한 것이다.In one aspect, the present invention provides a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the compound is selected from the group consisting of ARHGEF7, PTOV1, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1 (GRIA1X3, GRIA1X4), GRIA2 (GRIA2X6, GRIA2X7), HDAC5, HDAC10, NCAM1, NPY, SNCA, CCNG2, CDC7, , NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B, MCM3AP, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE, ADCY5, AKT3, KCNJ2, Identification of ***e poisoning and dependence including detection reagents of one or more biomarkers selected from the group consisting of LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7, CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 and TNFRSF1A For example.
일 구현예에서, 상기 키트는 대상체 또는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다.In one embodiment, the kit may further comprise tools and / or reagents for collecting a biological sample from a subject or patient, as well as tools and / or reagents for preparing genomic DNA, cDNA, RNA or protein from the sample have. For example, it may comprise a PCR primer to amplify the relevant region of genomic DNA. The kit may comprise a probe of a genetic element useful for pharmacogenetic profiling. Also, in the use of such kits, the labeled oligonucleotides can be used to facilitate identification during analysis.
일 구현예에서, 상기 키트는 DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP), 형광물질 등의 표지 물질을 추가로 더 함유할 수 있다.In one embodiment, the kit may further comprise a DNA polymerase and a labeling substance such as dNTPs (dGTP, dCTP, dATP and dTTP), a fluorescent substance and the like.
일 측면에서, 본 발명은 검사 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 ARHGEF7, PTOV1, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1 (GRIA1X3, GRIA1X4), GRIA2 (GRIA2X6, GRIA2X7), HDAC5, HDAC10, NCAM1, NPY, SNCA, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B, MCM3AP, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE, ADCY5, AKT3, KCNJ2, LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7, CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 및 TNFRSF1A으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오 마커의 핵산 또는 단백질의 농도를 검출하는 단계; 상기 핵산 또는 단백질의 농도에 대한 검출 결과를 정상 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 정상 대조군 시료와 비교하여, 대상체 유래 시료에서 상기 정상 대조군 시료와 비교하여, 대상체 유래 시료에서 PTOV1, HDAC5, HDAC10, NPY, SNCA, KDM2BX10, KDM2BX13, KIFAP3, WNT10B, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, GNG7, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, LOC101925175, CASP9, ARHGEF7, SLC18A3, TNFRSF1A, BCL2L1 및 BAD로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질이 상향 조절되고, MCM3AP, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1X3, GRIA1X4, GRIA2X6, GRIA2X7, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, CAMK2A, EGLN2, TNFRSF1A, BCL2L1, PTOV1, AKT3 및 LOC101866246로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질이 하향 조절되면 코카인 노출로 판정하는 단계를 포함하는, 코카인 노출 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a method of screening for a biological sample derived from a test sample, comprising the steps of: (a) CDH7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B, MCM3AP, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE , Nucleic acid or protein of at least one biomarker selected from the group consisting of: Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Detecting a concentration of the compound; Comparing the detection result for the concentration of the nucleic acid or protein to a corresponding result of a corresponding marker of a normal control sample; And comparing the sample from the normal control sample with the normal control sample in comparison with the normal control sample in comparison with the normal control sample. One or more genes or proteins selected from the group consisting of PPP2R2B, GNG7, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, LOC101925175, CASP9, ARHGEF7, SLC18A3, TNFRSF1A, BCL2L1 and BAD are upregulated and MCM3AP, GTF2I, ADAM23, CDH2, When one or more genes or proteins selected from the group consisting of GRIA1X3, GRIA1X4, GRIA2X6, GRIA2X7, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, CAMK2A, EGLN2, TNFRSF1A, BCL2L1, PTOV1, AKT3 and LOC101866246 are down- And determining a ***e exposure. The present invention also relates to a method for providing information necessary for ***e exposure diagnosis.
일 구현예에서, 상기 방법은 정상 대조군 시료와 비교하여, PTOV1, HDAC5, HDAC10, NPY, SNCA, KDM2BX10, KDM2BX13, KIFAP3, WNT10B, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, GNG7, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, LOC101925175 및 CASP9로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질이 상향 조절되고; 및 MCM3AP, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1X3, GRIA1X4, GRIA2X6, GRIA2X7, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, CAMK2A, EGLN2, TNFRSF1A 및 BCL2L1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질이 하향 조절되면 급성 코카인 노출인 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, the method comprises comparing to a normal control sample, wherein the method comprises the steps of: comparing a sample with a control sample; , KCNJ2, LOC101925175, and CASP9 are upregulated; And one or more genes or proteins selected from the group consisting of MCM3AP, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1X3, GRIA1X4, GRIA2X6, GRIA2X7, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, CAMK2A, EGLN2, TNFRSF1A and BCL2L1 And if it is down-regulated it can be determined to be an acute ***e exposure.
일 구현예에서, 상기 방법은 정상 대조군 시료와 비교하여, ARHGEF7, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, SLC18A3, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, TNFRSF1A, BCL2L1 및 BAD로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질이 상향 조절되고; 및 MCM3AP, PTOV1, GTF2I, AKT3, CAMK2A 및 LOC101866246로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질이 하향 조절되면 만성 코카인 노출인 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, the method further comprises administering one or more compounds selected from the group consisting of ARHGEF7, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, SLC18A3, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, TNFRSF1A, BCL2L1 and BAD The gene or protein is upregulated; And determining that at least one gene or protein selected from the group consisting of MCM3AP, PTOVl, GTF2I, AKT3, CAMK2A, and LOC101866246 is downregulated to be chronic ***e exposure.
상기 “검사 대상체 유래의 생물학적 시료”란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 구체적인 방법은 상기 유전자의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 유전자 또는 단백질의 발현 수준은 원숭이의 해마 또는 선조체에서 분리한 조직을 이용하여 수행되었다.The "biological sample derived from the test object" includes, but is not limited to, tissue, cell, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine. In addition, a specific method for measuring the expression level of the mRNA or the protein of the gene can detect the expression of the gene at the mRNA level or protein level, and the mRNA or protein is isolated from the biological sample using a known process can do. In one embodiment of the invention, the level of expression of the gene or protein was performed using tissue isolated from the hippocampus or striatum of the monkey.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for the purpose of illustrating the present invention, and thus the present invention is not limited thereto.
실시예 1. 해마에서의 급성/만성 코카인 중독 특이적 바이오 마커Example 1. Acute / chronic ***e poisoning-specific biomarkers in the hippocampus
1-1. 급성/만성 코카인 중독에 따른 발현 변화 유전자들 발굴1-1. Detection of gene expression changes due to acute / chronic ***e poisoning
평균 3.1 ± 0.1 kg 몸무게의 약 5 내지 6연령의 암컷 게먹이 원숭이(crab-eating macaque, Macaca fascicularis) (Suzhou, China)를 대조군 (n = 2), 급성 코카인 투여군 (CA, n = 2~4) 및 만성 코카인 투여군 (CC, n = 2~3)으로 구분하였다. 염산 코카인(Cocaine hydrochloride) (Johnson Matthey Macfarlan Smith, Edinburgh, Scotland)을 투여 직전에 0.9% 식염수에 완전히 용해시킨 후 원숭이들에게 5일 내지 8주 동안 일 회 1~3 mg/kg (body weight)/day의 용량으로 4:00 p.m.에 근육 주사하였다. 코카인 투여 후, 원숭이들을 희생시키고 해마(hippocampus)를 수득하였다. 모든 과정은 KRIBB IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) (Approval No. KRIBB-AEC-16070 및 KRIBB-AEC-17079)의 관리 감독하에 수행하였다. TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)를 이용하여 해마로부터 전체 RNA를 분리한 뒤, 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 RIN(RNA integrity number) 값이 7 이상인 것을 확인하였다. RNA-Seq(RNA sequencing)를 위해, TruSeq RNA library preparation kit (Illumina, San Diego, CA, USA)를 이용하여 RNA 라이브러리를 제조한 뒤, oligo-dT 부착 마그네틱 비드를 이용하여 mRNA를 정제하였다. 정제된 mRNA는 절단되고 랜덤 프라이머와 역전사 효소를 이용하여 cDNA로 역전사되었으며, RNA 주형을 제거한 후 이에 대한 상보 서열이 합성되었다. 말단 수리, 3' 아데닐레이션 및 아답터 연결을 수행한 뒤 정제한 cDNA 라이브러리가 PCR로 농축되었다. 제작된 라이브러리는 Illumina HiSeq 2000 sequencer (Macrogen, Seoul, Korea)로 시퀀싱되었다. RNA-Seq로부터 얻은 서열들을 FastQC (version 0.10.0, http://www.bioinformatics. babraham.ac.uk/projects/fastqc/)로 확인한 뒤 아답터 서열, 오염된 DNA 및 PCR 복제물을 포함하는 낮은 퀄리티의 판독 결과 및 아티팩트를 Trimmomatic ver. 0.32 (Bolger, Lohse & Usadel, 2014)로 제거하였다. 판독 결과는 TopHat (version 2.0.13) 소프트웨어를 이용하여 참고 게놈으로 매핑되었다. 각 시료의 전사물은 FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads) 방법에 기초한 Cufflinks (version 2.2.1) (Trapnell et al., 2010)로 어셈블되었다. 전사물의 FPKM 값에 기초하여 시료들 사이에서 발현 차이를 나타낸 유전자들을 선별하였으며, 시료들 사이의 유사성은 MDS(multidimensional scaling) 플롯으로 나타냈다. RNA-seq 데이터는 GEO(Gene Expression Omnibus)에 수탁하였다 (accession number GSE104332). 그 결과, 대조군, 급성 코카인 중독 및 만성 코카인 중독군에서 특정 쌍에서 |fold change| ≥ 2 및 P < 0.05을 만족하는 954개의 유전자(전사물)을 확인하였으며, 상기 군들 사이의 계층적 군집 분석(hierarchical clustering analysis)을 수행하고 (도 2a), 상기 군들 중 2개의 군들 (two pair-wise groups) 사이에서 상향 및 하향 조절되는 유전자들의 수를 계수하였다 (도 2b). 급성 코카인 중독 (노출)군 및 만성 코카인 중독 (노출)군 사이에서 408개의 유전자가 상향 조절되고, 381개의 유전자가 하향 조절되었으며, 이는 대조군 vs CA 또는 대조군 vs CC에 비해 현저히 높게 나타났다. 벤다이어그램 분석에서 세 쌍의 군에 대한 비교를 통해 중복된 세개의 유전자 ARHGEF7(Rho guanine nucleotide exchange factor 7), PTOV1(prostate tumor overexpressed 1) 및 GTF2I(general transcription factor Iii)를 선별하였다 (도 2c). (N = 2), acute ***e-treated group (CA, n = 2 to 4), a mean of 3.1 ± 0.1 kg of body weight and about 5 to 6 years of age were fed with crab-eating macaque (Macaca fascicularis) ) And chronic ***e administered group (CC, n = 2 ~ 3). Cocaine hydrochloride (Johnson Matthey Macfarlan Smith, Edinburgh, Scotland) was completely dissolved in 0.9% saline immediately prior to administration and monkeys were given 1 to 3 mg / kg body weight / day for 5 to 8 weeks, day at 4:00 pm. After ***e administration, monkeys were sacrificed and hippocampus was obtained. All courses were conducted under the supervision of the KRIBB Institutional Animal Care and Use Committee (Approval No. KRIBB-AEC-16070 and KRIBB-AEC-17079). Total RNA was isolated from the hippocampus using TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA), and the RNA integrity number (RIN) value was found to be 7 or more using a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, Calif. Respectively. For RNA sequencing, an RNA library was prepared using a TruSeq RNA library preparation kit (Illumina, San Diego, Calif., USA) and mRNA was purified using oligo-dT magnetic beads. The purified mRNA was cleaved, reverse transcribed with cDNA using random primers and reverse transcriptase, and complementary sequences were synthesized after removing the RNA template. After performing end repair, 3 'adenylation and adapter linkage, the purified cDNA library was concentrated by PCR. The library was sequenced with the Illumina HiSeq 2000 sequencer (Macrogen, Seoul, Korea). Sequences from RNA-Seq were identified by FastQC (version 0.10.0, http: //www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), followed by low-quality DNA sequences, including adapter sequences, contaminated DNA and PCR copies ≪ / RTI > and Trimmomatic ver. 0.32 (Bolger, Lohse & Usadel, 2014). The reading results were mapped to the reference genome using TopHat (version 2.0.13) software. The transcripts of each sample were assembled into Cufflinks (version 2.2.1) (Trapnell et al., 2010) based on the FPKM (fragments per kilobase of transcript per million mapped reads) method. Based on the FPKM values of transcripts, genes showing differences in expression between samples were selected and similarities between samples were represented by MDS (multidimensional scaling) plots. RNA-seq data was deposited with GEO (Gene Expression Omnibus) (accession number GSE104332). As a result, in the control group, acute ***e poisoning and chronic ***e poisoning, | fold change | 954 genes (transcripts) satisfying ≥ 2 and P <0.05 were identified and hierarchical clustering analysis was performed between the groups (Fig. 2a), and two groups -wise groups) were counted (Fig. 2B). 408 genes were upregulated and 381 genes were downregulated among acute ***e poisoning (exposure) and chronic ***e poisoning (exposure) groups, which were significantly higher than control vs CA or control vs CC. Three overlapping genes ARHGEF7 (Rho guanine nucleotide exchange factor 7), PTOV1 (prostate tumor overexpressed 1), and GTF2I (general transcription factor Iii) were selected in a Venn diagram analysis (Fig. 2c) .
또한, 상기 유전자 3개에 추가로 NCBI(National Center for Biotechnology Information database)에서 신경 발생 또는 중독과 관련된 유전자로 알려진 ADAM23, CDH2, GRIA1 (GRIA1X3 및 GRIA1X4 포함), GRIA2 (GRIA2X6 GRIA2X7 포함), HDAC10, HDAC5, NCAM1, NPY 및 SNCA과 관련성이 알려지지 않은 유전자 CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10 및 KDM2BX13 포함), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B 및 MCM3AP를 선택하였다. In addition to the above three genes, ADAM23, CDH2, GRIA1 (including GRIA1X3 and GRIA1X4), GRIA2 (including GRIA2X6 GRIA2X7), HDAC10, HDAC5 (which includes genes related to neurogenesis or poisoning) in the National Center for Biotechnology Information Database (Including KDM2BX10 and KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B, and MCM3AP were selected for the genes NCAM1, NPY and SNCA that are not known to be related to the genes CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, DOCK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, .
1-2. 급성/만성 코카인 중독에 따른 유전자들의 mRNA 발현 패턴 비교1-2. Comparison of mRNA expression pattern of genes due to acute / chronic ***e poisoning
전체 RNA 1 μg을 키트 (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, USA)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. 제조된 cDNA, 상기 실시예 1-1에서 선택한 유전자들에 대한 프라이머 세트 (표 1)와 SYBR Green Core Reagents (SYBR Premix Ex Taq II, Takara, Japan)를 이용하여 qRT-PCR(Real time quantitative PCR)을 수행하였다. 참고로, 본 발명의 프라이머 세트들은 NCBI cynomolgus monkey 게놈 서열 데이터베이스에 대해 BLAST에 의해 확인되어 특이성이 확인되었다. 구체적으로, 상기 시료를 95℃에서 3분 간 변성시키고 (1 사이클), 증폭을 위해 90℃에서 10초 및 65℃에서 30초 동안 어닐링한 후 최종 용융 곡선으로 95℃에서 10초 동안 변성 및 60℃에서 30초 동안 처리하였다. 데이터는 ViiA7 Real-Time PCR 시스템인 Applied Biosystems (Carlsbad, CA, USA)의 2-ΔΔCT 방법으로 분석하였다. 분석 최종 산물은 2% 아가로오즈 젤에서 전기영동한 뒤 UV로 밴드를 확인하였다.1 μg of total RNA was reverse transcribed with cDNA using a kit (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, USA). Real time quantitative PCR was performed using the prepared cDNA, a primer set for the genes selected in Example 1-1 (Table 1) and SYBR Green Core Reagents (SYBR Premix Ex Taq II, Takara, Japan) Respectively. For reference, the primer sets of the present invention were confirmed by BLAST against the NCBI cynomolgus monkey genome sequence database, and their specificity was confirmed. Specifically, the sample was denatured at 95 DEG C for 3 minutes (1 cycle), annealed at 90 DEG C for 10 seconds and 65 DEG C for 30 seconds for amplification, denatured for 10 seconds at 95 DEG C with a final melting curve, Lt; 0 > C for 30 seconds. Data were analyzed by the 2-ΔΔCT method of Applied Biosystems (Carlsbad, CA, USA), a ViiA7 real-time PCR system. Analysis The final product was electrophoresed on 2% agarose gel and UV band confirmed.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, CA 군에서 PTOV1, HDAC5, HDAC10, NPY, SNCA, KDM2BX10, KDM2BX13, KIFAP3 및 WNT10B의 발현이 유의적으로 상향 조절되었으며, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1X3, GRIA1X4, GRIA2X6, GRIA2X7, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN 및 MCM3AP의 발현이 유의적으로 하향 조절되었다. 또한, CC 군에서 ARHGEF7의 발현이 유의적으로 상향 조절되었고, PTOV1, MCM3AP 및 GTF2I의 발현이 유의적으로 하향 조절되었다 (도 3a 내지 f). 특히, 구체적으로, ARHGEF7의 발현이 CC 군에서만 유의적으로 증가하였으며 PTOV1의 발현은 CA 군에서는 현저히 증가하고 CC 군에서는 현저히 감소하였다. 또한, GTF2I는 CA 및 CC 군에서 모두 감소하였으며 CA 군에서의 감소가 CC 군에 비해 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 또한, KDM2BX13 및 KIFAP3은 CA 군에서만 증가하는 것으로 나타났다.As shown in FIG. 3, expression of PTOV1, HDAC5, HDAC10, NPY, SNCA, KDM2BX10, KDM2BX13, KIFAP3 and WNT10B was significantly upregulated in the CA group and GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1X3, GRIA1X4, Expression of GRIA2X6, GRIA2X7, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN and MCM3AP was significantly downregulated. In addition, the expression of ARHGEF7 was significantly up-regulated in the CC group and the expression of PTOV1, MCM3AP, and GTF2I was significantly down regulated (Figs. 3a-f). Specifically, expression of ARHGEF7 was significantly increased only in CC group and expression of PTOV1 was significantly increased in CA group and significantly decreased in CC group. In addition, GTF2I was decreased in CA and CC group, and the decrease in CA group was significantly decreased compared to CC group. In addition, KDM2BX13 and KIFAP3 were found to increase only in the CA group.
이를 통해, 상기 마커들의 조절 패턴과 ARHGEF7, PTOV1 및 GTF2I의 발현 조절을 통해 CA 및 CC를 구별할 수 있음을 알 수 있었다 (CA: PTOV1 발현 증가, GTF2I 감소/CC: ARHGEF7 증가, PTOV1 감소, GRF2I CA보다 현저히 적게 감소)(CA: increase in PTOV1 expression, decrease in GTF2I / increase in CC: ARHGEF7, decrease in PTOV1, decrease in expression of GRF2I, and decrease in expression of PTOV1) by controlling the expression pattern of the markers and the expression of ARHGEF7, PTOV1 and GTF2I Significantly less than CA)
실시예 2. 선조체에서의 급성/만성 코카인 중독 특이적 바이오 마커Example 2 Acute / Chronic Cocaine Poisoning in Striatum Specific biomarkers
2-1. 벤다이어 그램 분석을 통한 유전자들의 선별2-1. Selection of genes by Vendor Gram analysis
코카인을 급성/만성으로 투여한 경우 선조체(striatum)에서 발현이 유의적으로 변화하는 유전자들을 확인하기 위해, 평균 3.1 ± 0.1 kg 몸무게의 약 5 내지 6연령의 암컷 게먹이 원숭이(crab-eating macaque, Macaca fascicularis) (Suzhou, China)를 대조군 (n = 2), 급성 코카인 투여군 (CA, n = 2) 및 만성 코카인 투여군 (CC, n = 3)으로 구분하였다. 모든 과정은 KRIBB IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) (Approval No. KRIBB-AEC-16070)의 관리 감독하에 수행하였다. 염산 코카인(Cocaine hydrochloride) (Johnson Matthey Macfarlan Smith, Edinburgh, Scotland)을 투여 직전에 0.9% 식염수에 완전히 용해시킨 후 원숭이들에게 5일 내지 8주 동안 일 회 1~3 mg/kg (body weight)/day의 용량으로 4:00 p.m.에 근육 주사하였다. 코카인 투여 후, 원숭이들을 희생시키고 선조체를 수득하였다. TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)를 이용하여 각 군의 선조체로부터 전체 RNA를 분리한 뒤, 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 RIN(RNA integrity number) 값이 7 이상인 것을 확인하였다. RNA-Seq(RNA sequencing)를 위해, TruSeq RNA library preparation kit (Illumina, San Diego, CA, USA)를 이용하여 RNA 라이브러리를 제조한 뒤, oligo-dT 부착 마그네틱 비드를 이용하여 mRNA를 정제하였다. 정제된 mRNA는 절단되고 랜덤 프라이머와 역전사 효소를 이용하여 cDNA로 역전사되었으며, RNA 주형을 제거한 후 이에 대한 상보 서열이 합성되었다. 말단 수리, 3' 아데닐레이션 및 아답터 연결을 수행한 뒤 정제한 cDNA 라이브러리가 PCR로 농축되었다. 제작된 라이브러리는 Illumina HiSeq 2000 sequencer (Macrogen, Seoul, Korea)로 시퀀싱되었다. RNA-Seq로부터 얻은 서열들을 FastQC (version 0.10.0, http://www.bioinformatics. babraham.ac.uk/projects/fastqc/)로 확인한 뒤 아답터 서열, 오염된 DNA 및 PCR 복제물을 포함하는 낮은 퀄리티의 판독 결과 및 아티팩트를 Trimmomatic ver. 0.32 (Bolger, Lohse & Usadel, 2014)로 제거하였다. 판독 결과는 TopHat (version 2.0.13) 소프트웨어를 이용하여 참고 게놈 Macaca_fascicularis_5.0 (BioSample: SAMN00811240)으로 매핑되었다. 각 시료의 전사물은 FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads) 방법에 기초한 Cufflinks (version 2.2.1) (Trapnell et al., 2010)로 어셈블되었다. 전사물의 FPKM 값에 기초하여 시료들 사이에서 발현 차이를 나타낸 유전자들을 선별하였으며, 시료들 사이의 유사성은 MDS(multidimensional scaling) 플롯으로 나타냈다. RNA-seq 데이터는 GEO(Gene Expression Omnibus)에 수탁하였다 (accession number GSE103419). 대조군, 급성 코카인 중독 및 만성 코카인 중독군은 MRI 분석 및 헤마톡실린 및 에오신 염색에서는 서로 유의적인 차이를 나타내지 않았으나 (데이터 미도시), 상기 군들 사이의 계층적 군집 분석(hierarchical clustering analysis)을 수행한 결과, 발현량 2배 이상 및 P <0.05를 만족시키는 1613개의 유전자들 확인하였다 (도 4a 및 b). 또한, 2.0 이상의 배수 변화 및 0.05 미만의 P 값을 갖는 1613개의 유전자들 중 급성 코카인에 노출된 선조체에서 총 263개가 차등 발현되었으며, 만성 코카인에 노출된 선조체에서 총 178개가 차등 발현되었고, 총 1413개의 유전자가 급성 및 만성 코카인 중독(노출) 선조체 사이에서 서로 상이하게 발현량이 변화하였다 (도 4c). 또한, BioVenn (http://www.biovenn.nl/) (Hulsen, de Vlieg & Alkema, 2008)을 사용하여 그룹 간 벤 다이어그램 (Control vs. CA, Control vs. CC, CA vs. CC)을 분석한 결과, 13개의 유전자 SNAP25, CAMK2A, LOC101867149, KCNAB2, LOC102137553, RBM14, ADD3, PTPRZ1, LOC101865389, ARFGEF2, KCNJ10, LOC101925503 및 GOPC을 선별할 수 있었다 (도 4d 및 e).In order to identify genes whose expression is significantly changed in the striatum when ***e was administered acutely / chronically, crab-eating macaques (about 5 to 6 years of age) weighing 3.1 ± 0.1 kg on average, Macaca fascicularis (Suzhou, China) was divided into control (n = 2), acute ***e (CA, n = 2) and chronic ***e (CC, n = 3) All courses were conducted under the supervision of the KRIBB IACUC (Approval No. KRIBB-AEC-16070). Cocaine hydrochloride (Johnson Matthey Macfarlan Smith, Edinburgh, Scotland) was completely dissolved in 0.9% saline immediately prior to administration and monkeys were given 1 to 3 mg / kg body weight / day for 5 to 8 weeks, day at 4:00 pm. After ***e administration, monkeys were sacrificed and striations were obtained. Total RNA was isolated from the striatum of each group using TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) and RNA integrity number (RIN) value of 7 was measured using a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, . For RNA sequencing, an RNA library was prepared using a TruSeq RNA library preparation kit (Illumina, San Diego, Calif., USA) and mRNA was purified using oligo-dT magnetic beads. The purified mRNA was cleaved, reverse transcribed with cDNA using random primers and reverse transcriptase, and complementary sequences were synthesized after removing the RNA template. After performing end repair, 3 'adenylation and adapter linkage, the purified cDNA library was concentrated by PCR. The library was sequenced with the Illumina HiSeq 2000 sequencer (Macrogen, Seoul, Korea). Sequences from RNA-Seq were identified by FastQC (version 0.10.0, http: //www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), followed by low-quality DNA sequences, including adapter sequences, contaminated DNA and PCR copies ≪ / RTI > and Trimmomatic ver. 0.32 (Bolger, Lohse & Usadel, 2014). The reading results were mapped to the reference genome Macaca_fascicularis_5.0 (BioSample: SAMN00811240) using TopHat (version 2.0.13) software. The transcripts of each sample were assembled into Cufflinks (version 2.2.1) (Trapnell et al., 2010) based on the FPKM (fragments per kilobase of transcript per million mapped reads) method. Based on the FPKM values of transcripts, genes showing differences in expression between samples were selected and similarities between samples were represented by MDS (multidimensional scaling) plots. The RNA-seq data was deposited with GEO (Gene Expression Omnibus) (accession number GSE103419). The control group, acute ***e poisoning and chronic ***e poisoning group showed no significant difference in MRI analysis and hematoxylin and eosin staining (data not shown), but hierarchical clustering analysis between the groups As a result, 1613 genes having an expression level of 2 times or more and satisfying P < 0.05 were identified (FIGS. 4A and 4B). A total of 263 genes were differentially expressed in the striatum exposed to acute ***e among 1613 genes with a multiple change of 2.0 or more and a P value of less than 0.05. A total of 178 genes were differentially expressed in the striatum exposed to chronic ***e, and a total of 1413 The expression levels of the genes were different between acute and chronic ***e poisoning (exposure) striations (Fig. 4C). In addition, using the BioVenn (http://www.biovenn.nl/) (Hulsen, de Vlieg & Alkema, 2008), the inter-group vane diagram (Control vs. CA, Control vs. CC, CA vs. CC) As a result, 13 genes SNAP25, CAMK2A, LOC101867149, KCNAB2, LOC102137553, RBM14, ADD3, PTPRZ1, LOC101865389, ARFGEF2, KCNJ10, LOC101925503 and GOPC were selected (Fig.
2-2. 기능적 주석 및 경로 분석을 통한 유전자들의 선별2-2. Selection of genes by functional annotation and pathway analysis
상기 13개의 유전자의 서열을 인간 BLAST 데이터베이스를 사용하여 확인한 결과, Macaca fascicularis 게놈은 호모 사피엔스와 92.8%의 동일성을 나타냈다 (Ebeling et al., 2011). 또한, 상기 유전자들과 관련된 생물학적 반응과 다양한 표준 경로를 분석하기 위해 KEGG 경로 (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html) 분석을 사용했으며, 코카인이 신경 세포의 발달 및 신호 전달 경로에 영향을 미치는 것으로 나타났으므로, KEGG 경로 중 도파민 성, 콜린성, HIF 및 세포 사멸 관련 경로와 같은 신경학적 경로에 관련된 유전자 27개를 선택하여 (도파민성: DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B; 콜린성: ACHE, ADCY5, AKT3, KCNJ2, LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7; HIF1 알파 경로: CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246; 및 세포 사멸: BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175, TNFRSF1A) 하기 표 2의 프라이머쌍을 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 또한 급성 및 만성 코카인 중독 간의 유전자 발현 관계를 결정하기 위해 qRT-PCR 분석 결과에서 이들 전사 인자의 발현 수준에 대한 피어슨 상관 분석을 수행 하였다.The sequences of the above 13 genes were confirmed using the human BLAST database. As a result, the Macaca fascicularis genome showed 92.8% identity with homo sapiens (Ebeling et al., 2011). In addition, the KEGG pathway (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html) analysis was used to analyze the biological responses and various standard pathways associated with the genes, and ***e was used for neuronal development and signaling (Dopamine: DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, and GNG7), which are related to neurological pathways such as dopaminergic, cholinergic, HIF and apoptotic pathways among the KEGG pathways BCC, BCL2L1, CASP9, and LPS101865389, LOC101926461, PPP2R2B, cholinergic: ACHE, ADCY5, AKT3, KCNJ2, LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7; HIF1 alpha pathway: CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246; , LOC101925175, TNFRSF1A) qRT-PCR was performed using the primer pairs shown in Table 2 below. To determine the gene expression relationship between acute and chronic ***e poisoning, Pearson correlation analysis was performed on the expression levels of these transcription factors in qRT-PCR analysis results.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, CA 군에서 DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, GNG7, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, LOC101925175 및 CASP9의 발현이 상향 조절되고, CAMK2A, EGLN2, TNFRSF1A 및 BCL2L1이 하향 조절되었다. 이들 중 GNG7, LOC101925175 및 CASP9은 CA에만 특이적으로 발현이 상향 조절되었으며, EGLN2 및 BCL2L1은 CA에서만 특이적으로 하향 조절되었다. 또한, CC 군에서 DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, SLC18A3, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, TNFRSF1A, BCL2L1 및 BAD가 상향조절되고, AKT3, CAMK2A 및 LOC101866246이 하향조절되었다. 이들 중 BAD은 CC 군 특이적으로 발현이 상향 조절되었다. 또한, 대조군, CA 및 CC에 따라 유의적으로 발현량이 변화한 유전자는 DRD1, DRD3, PPP2R2B, GNG7, ACHE, CAMK2A, BCL2L1으로 나타났다. 아울러, 피어슨 상관 분석 결과, 상기 유전자들은 급성 및 만성 코카인 투여 후 상관 관계가있는 것으로 나타났다 (R = 0.587, P = 0.0013) (도 6).As shown in FIG. 5, expression of DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPG2R2B, GNG7, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, LOC101925175 and CASP9 was upregulated in the CA group and CAMK2A, EGLN2, TNFRSF1A and BCL2L1 Was downwardly adjusted. Of these, GNG7, LOC101925175 and CASP9 were specifically up-regulated only in CA and EGLN2 and BCL2L1 were specifically downregulated in CA only. In the CC group, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, SLC18A3, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, TNFRSF1A, BCL2L1 and BAD were upregulated and AKT3, CAMK2A and LOC101866246 were downregulated. Among these, BAD was specifically upregulated in the CC group. DRD1, DRD3, PPG2R2B, GNG7, ACHE, CAMK2A, and BCL2L1 were significantly different in the expression level of the control group, CA and CC. In addition, Pearson correlation analysis showed that the genes correlated with acute and chronic ***e administration (R = 0.587, P = 0.0013) (FIG. 6).
2-3. 코카인 투여에 따른 CAMK2A의 발현 조절 확인2-3. Control of CAMK2A expression by ***e administration
2-3-1. CAMK2A 및 CASP9의 mRNA 발현 변화 확인2-3-1. Changes in mRNA expression of CAMK2A and CASP9
상기 독립적인 벤 다이어그램 분석 결과 (도 4e) 및 HIF 알파 경로 분석 (도 5c)에 모두 포함된 CAMK2A와, KEGG 경로 중에서 세포 항상성에 중요한 세포 사멸 경로와 관련된 CASP9를 선택하여 이들의 급성/만성 코카인 투여에 의한 유전자 발현 및 단백질 발현 양상을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2-1에서와 같이 급성/만성 코카인 투여 후 원숭이의 뇌 선조체에서 분리한 RNA를 이용하여 RT-PCR 분석한 최종 산물을 아가로오스 젤에 전기영동하여 이들의 mRNA 수준을 확인하였다. 그 결과, 상기 RNA-seq 및 qRT-PCR 데이터와 유사하게 코카인 투여에 의해 CAMK2A의 발현이 감소한 반면, CASP9는 발현이 증가하는 것으로 나타났다 (도 7a). CAMK2A, which is included both in the independent Venn diagram analysis (FIG. 4E) and in the HIF alpha pathway analysis (FIG. 5C), and CASP9, which is involved in cell homeostasis-critical apoptosis pathway, among the KEGG pathways were selected and their acute / chronic ***e administration And the expression pattern of the protein was confirmed. Specifically, RT-PCR analysis of the RNA isolated from the monkey brain stroma after acute / chronic ***e administration as in Example 2-1 was performed on the agarose gel to determine the mRNA level of the final product Respectively. As a result, the expression of CAMK2A was decreased by the administration of ***e, while the expression of CASP9 was increased similarly to the RNA-seq and qRT-PCR data (Fig. 7A).
2-3-2. CAMK2A 및 CASP9의 단백질 수준 변화 확인2-3-2. Confirmation of changes in protein levels of CAMK2A and CASP9
CAMK2A 및 CASP9의 발현은 단백질 수준에서 확인하기 위해, 상기 실시예 2-1에서와 같이 급성/만성 코카인 투여 후 원숭이의 뇌 선조체에서 전체 RNA를 준비한 후, 나머지는 1 % SDS 완충액으로 조직을 용해시켰다. 동량의 단백질을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis)로 젤에서 전기영동하고 니트로셀롤로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane) (Whatman, dassel, Germany)으로 트랜스퍼하였다. 1% 스킴밀크 (TBST, 20mM Tris, 137mM NaCl 및 0.1% Tween 20) 로 1시간 동안 블로킹한 뒤, 항-pCAMK2A, 항-CAMK2A, 항-절단된 CASP9 (Abcam, Cambridge, UK) 및 항-GAPDH (Cell 신호, Danvers, Massachusetts, USA) 항체와 인큐베이션시켰다. 그 후, 2차 항체로 1 : 10,000로 희석된 horseradish peroxidase 결합된 항-토끼 IgG (Thermo scientific)로 인큐베이션한 뒤, 밴드를 PXi4 Chemiluminscent 및 Fluorescent Imaging System (Syngene, Boston, MA, USA)로 시각화하였다. 각 밴드의 강도의 정량화, GAPDH에 대한 평균화 및 대조군에 대한 상대적 비율은 Image J 소프트웨어 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 계산되었다. 그 결과, 코카인 투여에 의해 CAMK2A의 단백질 수준 및 이의 인산화가 감소하였고, 특히, 만성 코카인 투여시 급격하게 감소하는 것으로 나타났으며 (도 7b 및 c), 급성 코카인 투여된 선조체에서 절단된 CASP9가 증가하는 것으로 나타났다 (도 7b 및 d). To confirm the expression of CAMK2A and CASP9 at the protein level, total RNA was prepared from the monkey brain striatum after acute / chronic ***e administration as in Example 2-1, and the remaining tissues were dissolved with 1% SDS buffer . The same amount of protein was electrophoresed in gel with 10% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis) and transferred to a nitrocellulose membrane (Whatman, dassel, Germany). Anti-CAMK2A, anti-cleaved CASP9 (Abcam, Cambridge, UK), and anti-GAPDH (anti-pCAMK2A) were blocked for 1 hour with 1% skim milk (TBST, 20 mM Tris, 137 mM NaCl and 0.1% Tween 20) (Cell signal, Danvers, Massachusetts, USA). The bands were then incubated with horseradish peroxidase conjugated anti-rabbit IgG (Thermo scientific) diluted 1: 10,000 with secondary antibody and visualized with PXi4 Chemiluminscent and Fluorescent Imaging System (Syngene, Boston, MA, USA) . Quantification of the intensity of each band, averaging for GAPDH, and relative ratios to control were calculated using Image J software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). As a result, the level of CAMK2A protein and its phosphorylation decreased by the administration of ***e, in particular, it was found to decrease sharply upon administration of chronic ***e (Fig. 7b and c), and CASP9 cleaved in acute ***e- (Figs. 7B and 7D).
2-3-3. 인간 뇌조직에서의 CAMK2A 발현 조절 양상 검증2-3-3. Verification of CAMK2A expression regulation in human brain tissue
NCBI (National Center for Biotechnology Information) Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스 포털 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, accession number : GSE54839, GSE7762 , 및 GSE44456)를 사용하여 CAMK2A의 mRNA 수준이 인간 뇌 조직에서도 코카인의 투여에 의해 변화하는지를 확인하였다. 구체적으로, 만성 코카인 투여시 인간 뇌에서의 CAMK2A의 mRNA 발현 변화 (GSE54839, GDS5047, 프로브 ID : ILMN_1666445), 만성 알코올 투여시 인간 뇌에서의 CAMK2A의 mRNA 발현 변화 (GSE44456, GDS4879, control n=19, Alcoholic n=20) 및 만성 몰핀 투여시 마우스 선조체에서의 CAMK2A의 mRNA 발현 변화 (GSE7762, GDS2815, n=36)를 확인하였다. 그 결과, 만성 코카인 남용자 (n=10, triplicate)의 중뇌에서의 CAMK2A의 상대적 mRNA 발현이 대조군 조직에서보다 현저하게 감소된 것으로 나타났으나 (** P <0.01), 알코올 및 몰핀에 의해서는 발현에 변화가 없는 것으로 나타났다 (도 8). 따라서, CAMK2A의 발현이 인간 중뇌에서 만성 코카인 투여에 의해 하향 조절되는 것을 확인할 수 있었다.CAMK2A < / RTI > mRNA < RTI ID = 0.0 > (SEQ ID NO: < / RTI > Levels were also altered by administration of ***e in human brain tissue. Specifically, changes in the mRNA expression of CAMK2A in the human brain (GSE44486, GDS5047, probe ID: ILMN_1666445) and changes in CAMK2A mRNA expression in the human brain (GSE44456, GDS4879, control n = Alcoholic n = 20) and mRNA expression of CAMK2A in mouse striatum during chronic morphine administration (GSE7762, GDS2815, n = 36). As a result, the relative mRNA expression of CAMK2A in the midbrain of chronic ***e abuser (n = 10, triplicate) was significantly reduced (** P <0.01) (Fig. 8). Thus, it was confirmed that the expression of CAMK2A was down-regulated by administration of chronic ***e in the human midbrain.
2-4. CAMK2A에 대한 기능성 단백질 네트워크 확인2-4. Identification of functional protein network for CAMK2A
CAMK2A와 기능적으로 관련된 유전자들이 코카인 투여에 의해 바뀌었는지 확인하기 위해, STRING 데이터베이스 (Szklarczyk et al., 2017)를 이용하여 CAMK2A에 대한 기능성 단백질 네트워크를 확인하였다. 그 결과, GRIN1 및 DLG1가 CAMK2A와 기능적으로 연결되어 있는 것을 확인하였다 (도 9a). 이에, CAMK2A, GRIN1 및 DLG1의 발현 수준을 상기 실시예에 기재된 방법으로 확인한 결과, GRIN1은 CAMK2A와 유사하게 급성/만성 코카인 투여시 발현이 하향 조절되었으나, DLG1은 급성 코카인 투여에서는 다소 하향 조절되고 만성 코카인 투여에서는 오히려 상향 조절되는 것으로 나타났다 (도 9b). 또한, GRIN1 및 DLG1의 발현 수준을 상기 실시예 2-3-3에서와 같이 GEO 데이터에서 확인한 결과, DLG1가 유의미한 변화를 나타내지 않은 것과 달리 (도 9d), GRIN1은 만성 코카인 중독된 인간 뇌조직에서도 CAMK2A와 유사하게 하향 조절되는 발현 패턴을 나타냈다 (도 9c 내지 f). 이를 통해, CAMK2A과 GRIN1이 코카인 중독과 관련되어 있음을 알 수 있었다. The functional protein network for CAMK2A was identified using the STRING database (Szklarczyk et al., 2017) to confirm that functionally related genes with CAMK2A were altered by ***e administration. As a result, it was confirmed that GRIN1 and DLG1 were functionally linked to CAMK2A (Fig. 9A). Expression levels of CAMK2A, GRIN1 and DLG1 were confirmed by the methods described in the above examples. As a result, GRIN1 was down-regulated when acute / chronic ***e administration was similar to CAMK2A. However, DLG1 was down- And was rather upregulated in ***e administration (Fig. 9B). In addition, the level of expression of GRIN1 and DLG1 was examined in GEO data as in Example 2-3-3 above. As a result, GRIN1 was also found in chronic ***e poisoned human brain tissue Lt; RTI ID = 0.0 > CAMK2A < / RTI > (Figures 9c-f). This indicates that CAMK2A and GRIN1 are associated with ***e poisoning.
실시예 3. 통계적 분석Example 3. Statistical analysis
유전자 발현 수준은 평균 ± 표준 편차로 표현되며, Student's t- 검정을 사용하여 두 그룹 간의 유전자 발현 수준의 차이를 비교 하였다. SPSS 21 소프트웨어 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 일원배치 분산 분석을 통해 그룹간의 차이를 분석하였다. qRT-PCR을 통해 유의한 차이가 있는 CA 및 CC 군의 각각의 발현값은 SPSS 21 소프트웨어 및 GraphPad PRISM 5 (CA, USA)를 이용한 피어슨 상관 분석(Pearson's correlation coefficients)을 이용하여 분석되어, P 값이 0.05 미만인 결과 (q-values < 0.2)는 유의적인 것으로 간주하였다.Gene expression levels were expressed as mean ± standard deviation, and Student's t-test was used to compare differences in gene expression levels between the two groups. Differences between groups were analyzed by one-way ANOVA using SPSS 21 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). The expression of each of the CA and CC groups, which differed significantly by qRT-PCR, was analyzed using Pearson's correlation coefficients using SPSS 21 software and GraphPad PRISM 5 (CA, USA) Were less than 0.05 (q-values <0.2).
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> MARKERS FOR COCAINE ADDICTION <130> PN1712-461 <160> 116 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARHGEF7 forward primer <400> 1 gacattaaaa ctctgggcaa cg 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARHGEF7 reverse primer <400> 2 ccaacgacag gaatgacaat c 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTOV1 forward primer <400> 3 catcccctac gaccagagc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTOV1 reverse primer <400> 4 gagcccaaca gtcggtcca 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GTF2I forward primer <400> 5 gtatggaatc ccgaggct 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GTF2I reverse primer <400> 6 cggaagcaag tggaagag 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADAM23 forward primer <400> 7 catcaaccaa gactcggaaa g 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Artificial Sequence <220> <223> NCAM1 reverse primer <400> 24 ctggcttcct tggcatcata c 21 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPY forward primer <400> 25 gactgaccct cgccctgt 18 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPY reverse primer <400> 26 cttgccatac ctctgcctg 19 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNCA forward primer <400> 27 gagttgtggc tgctgctg 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNCA reverse primer <400> 28 caccaccgct cctccaac 18 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCNG2 forward primer <400> 29 gggctgagtt tgattgaggc 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCNG2 reverse primer <400> 30 gaacagactc caatgcaaga c 21 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDC7 forward primer <400> 31 ctgacctgtg actgctatg 19 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDC7 reverse primer <400> 32 gtatcgtcca ctaagcaaag 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH8 forward primer <400> 33 gctataaaaa gacttgaccg g 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH8 reverse primer <400> 34 gcgttgtcat tgatgtcttg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DLG3 forward primer <400> 35 caggacgggg atgattgagt 20 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DLG3 reverse primer <400> 36 gaactgcttt cgctgtcact g 21 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOCK3 forward primer <400> 37 ctttggcttt gcattctcac 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOCK3 reverse primer <400> 38 tattagggca gccattgtag 20 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEUROD6 forward primer <400> 39 cctcaacgac gctctggac 19 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEUROD6 reverse primer <400> 40 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tcctctgact cg 22 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIFAP3 forward primer <400> 49 gcttatctgt gaaggaaatg g 21 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIFAP3 reverse primer <400> 50 aactcctctt cctcatcatt ag 22 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBM10 forward primer <400> 51 ggacgctaca cgatggatgg 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBM10 reverse primer <400> 52 ctgctctgcc tctgacttgg 20 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBM14 forward primer <400> 53 ctacgccgca caagccac 18 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBM14 reverse primer <400> 54 gagtgcggta aggagctgc 19 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TP53I11 forward primer <400> 55 cagttcgtct ctgctgtgct c 21 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TP53I11 reverse primer <400> 56 ccaagaactg gaccccgaag 20 <210> 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Sequence <220> <223> DRD3 forward primer <400> 65 cagccagcat cctgaacctc 20 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRD3 reverse primer <400> 66 ccaaacagaa gagggcagga c 21 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GNAL forward primer <400> 67 ccaagtggac aaagtgaac 19 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GNAL reverse primer <400> 68 gactctctca gcctgttgg 19 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GNG7 forward primer <400> 69 cgtatcaagg tctccaaagc gg 22 <210> 70 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GNG7 reverse primer <400> 70 taaaggggtt ctcggaggca gg 22 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101865389 forward primer <400> 71 cgaagtaggt tgcggaatgc 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101865389 reverse primer <400> 72 cataggtgtc tgagccgaac 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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forward primer <400> 81 cagaacgacc aaagccaaac ac 22 <210> 82 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AKT3 reverse primer <400> 82 cttcttgcct ctgcagtctg tc 22 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KCNJ2 forward primer <400> 83 gaaagatggt cactgtaacg 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KCNJ2 reverse primer <400> 84 tatcaaccaa aacacacagc 20 <210> 85 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101865389 forward primer <400> 85 gaacaaatcg attccagt 18 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101865389 reverse primer <400> 86 cgaatctctt tgttgctgtc c 21 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101926461 forward primer <400> 87 ctgaagcaaa tagagcatac 20 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101926461 reverse primer <400> 88 gaatgttagc actatctgag c 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLCB1 forward primer <400> 89 cttaccgttg accagatgat g 21 <210> 90 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLCB1 reverse primer <400> 90 cattcaaatc cagtttctca gg 22 <210> 91 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC18A3 forward primer <400> 91 cctacggaga gcgaagacg 19 <210> 92 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC18A3 reverse primer <400> 92 cgaacagcgt ggcgtagtc 19 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC5A7 forward primer <400> 93 ccttgctgac gaagactgtg 20 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC5A7 reverse primer <400> 94 gggtaatagc cagggtagaa g 21 <210> 95 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMK2A forward primer <400> 95 gctgctgaag cccttaag 18 <210> 96 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMK2A reverse primer <400> 96 cgatggtggt gttggtgc 18 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGLN2 forward primer <400> 97 gctacagcca cctctaccac 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGLN2 reverse primer <400> 98 ctcctggttc tcttgcctgg 20 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ENO2 forward primer <400> 99 aaggtctttt cagggctgca g 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ENO2 reverse primer <400> 100 cgatggtgga gttgatgtgg t 21 <210> 101 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101866179 forward primer <400> 101 ggaggagaag caaatcatc 19 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101866179 reverse primer <400> 102 cactggaatc actaactgg 19 <210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101866246 forward primer <400> 103 cgtgagggca atgagaaag 19 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101866246 reverse primer <400> 104 catcaagtat tggtctctcg 20 <210> 105 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD forward 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Artificial Sequence <220> <223> LOC101865389 reverse primer <400> 86 cgaatctctt tgttgctgtc c 21 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101926461 forward primer <400> 87 ctgaagcaaa tagagcatac 20 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101926461 reverse primer <400> 88 gaatgttagc actatctgag c 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLCB1 forward primer <400> 89 cttaccgttg accagatgat g 21 <210> 90 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLCB1 reverse primer <400> 90 cattcaaatc cagtttctca gg 22 <210> 91 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC18A3 forward primer <400> 91 cctacggaga gcgaagacg 19 <210> 92 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC18A3 reverse primer <400> 92 cgaacagcgt ggcgtagtc 19 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC5A7 forward primer <400> 93 ccttgctgac gaagactgtg 20 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC5A7 reverse primer <400> 94 gggtaatagc cagggtagaa g 21 <210> 95 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMK2A forward primer <400> 95 gctgctgaag cccttaag 18 <210> 96 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMK2A reverse primer <400> 96 cgatggtggt gttggtgc 18 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGLN2 forward primer <400> 97 gctacagcca cctctaccac 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGLN2 reverse primer <400> 98 ctcctggttc tcttgcctgg 20 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ENO2 forward primer <400> 99 aaggtctttt cagggctgca g 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ENO2 reverse primer <400> 100 cgatggtgga gttgatgtgg t 21 <210> 101 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101866179 forward primer <400> 101 ggaggagaag caaatcatc 19 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101866179 reverse primer <400> 102 cactggaatc actaactgg 19 <210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101866246 forward primer <400> 103 cgtgagggca atgagaaag 19 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101866246 reverse primer <400> 104 catcaagtat tggtctctcg 20 <210> 105 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD forward primer <400> 105 gggacaggcc ctcagactc 19 <210> 106 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD reverse primer <400> 106 cgaagggatg gaggaggag 19 <210> 107 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL2L1 forward primer <400> 107 ggagaccccc agtgccat 18 <210> 108 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL2L1 reverse primer <400> 108 gctgggatgt caggtcac 18 <210> 109 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CASP9 forward primer <400> 109 ccttcgttca tctcctgctt ag 22 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CASP9 reverse primer <400> 110 atcaccgaat cctccagaac c 21 <210> 111 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101925175 forward primer <400> 111 gagaacctgg agaagaagac gg 22 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOC101925175 reverse primer <400> 112 ctgctccagg tcagccatcg 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFRSF1A forward primer <400> 113 cacctgaaaa agagggggag 20 <210> 114 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> TNFRSF1A reverse primer <400> 114 catctctctg cgggaagcc 19 <210> 115 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 115 acaacagcct caagatcgtc ag 22 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 116 actgtggtca tgagtccttc c 21
Claims (18)
2) 상기 핵산 또는 단백질의 농도에 대한 검출 결과를 코카인이 투여되지 않은 정상 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및
3) 상기 정상 대조군 시료와 비교하여, 대상체 유래 시료에서 PTOV1, HDAC5, HDAC10, NPY, SNCA, KDM2BX10, KDM2BX13, KIFAP3, WNT10B, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, GNG7, ACHE, SLC5A7, ADCY5, KCNJ2, LOC101925175, CASP9, ARHGEF7, SLC18A3, TNFRSF1A, BCL2L1 및 BAD로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질이 상향 조절되고, MCM3AP, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1X3, GRIA1X4, GRIA2X6, GRIA2X7, CCNG2, CDC7, CDH8, DLG3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, CAMK2A, EGLN2, TNFRSF1A, BCL2L1, PTOV1, AKT3 및 LOC101866246로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질이 하향 조절되면 코카인 노출로 판정하는 단계를 포함하는, 코카인 노출 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.1) From the biological sample derived from the test subject, ARHGEF7, PTOV1, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1 (GRIA1X3, GRIA1X4), GRIA2 (GRIA2X6, GRIA2X7), HDAC5, HDAC10, NCAM1, NPY, SNCA, CCNG2, CDC7, ACK3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, KDM2B (KDM2BX10, KDM2BX13), KIFAP3, RBM10, RBM14, TP53I11, WNT10B, MCM3AP, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, GNG7, LOC101865389, LOC101926461, PPP2R2B, ACHE, ADCY5, AKT3, The concentration of the nucleic acid or protein of at least one biomarker selected from the group consisting of KCNJ2, LOC101865389, LOC101926461, PLCB1, SLC18A3, SLC5A7, CAMK2A, EGLN2, ENO2, LOC101866179, LOC101866246, BAD, BCL2L1, CASP9, LOC101925175 and TNFRSF1A step;
2) comparing the detection result for the concentration of the nucleic acid or protein to a corresponding result of a corresponding marker of a normal control sample to which ***e has not been administered; And
3) Compared with the normal control sample, PTOV1, HDAC5, HDAC10, NPY, SNCA, KDM2BX10, KDM2BX13, KIFAP3, WNT10B, DRD1, DRD2, DRD3, GNAL, PPP2R2B, GNG7, ACHE, SLC5A7, ADCY5, One or more genes or proteins selected from the group consisting of KCNJ2, LOC101925175, CASP9, ARHGEF7, SLC18A3, TNFRSF1A, BCL2L1, and BAD are upregulated and upregulated by one or more of MCM3AP, GTF2I, ADAM23, CDH2, GRIA1X3, GRIA1X4, GRIA2X6, GRIA2X7, CCNG2, CDC7 , And wherein the one or more genes or proteins selected from the group consisting of CDH8, DLG3, NEUROD6, NEUROG2, SPEN, CAMK2A, EGLN2, TNFRSF1A, BCL2L1, PTOV1, AKT3 and LOC101866246 are down- How to provide the information needed to diagnose the exposure.
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR20090130125A (en) * | 2007-04-11 | 2009-12-17 | 오메로스 코포레이션 | Compositions and methods for prophylaxis and treatment of addictions |
| KR20140113021A (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-24 | 삼육대학교산학협력단 | Biomarkers for confirmation of drug addiction and dependence |
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2017
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| International Journal of Neuropsychopharmacology (2011) 14(8):1099-1110* * |
| Neuropsychopharmacology (2006) 31:2304-2312* * |
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