KR20190073707A - A pharmaceutical composition and a method of providing information on drug selection for enhancing tumor suppressive effect of BRAF(V600E) mutation anaplastic thyroid cancer - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 BRAF V600E 돌연변이를 특징으로 하는 역형성 갑상선암(anaplastic thyroid cancer)의 치료에 있어서, BRAF 억제제 투여 후 Src 단백질의 발현이 증가하는 기전을 근거로 하여 BRAF 억제제의 저항성 극복을 위한 약학 조성물 및 약물 선택을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition and a pharmaceutical composition for overcoming the resistance of a BRAF inhibitor on the basis of an increase in the expression of Src protein after administration of a BRAF inhibitor in the treatment of anaplastic thyroid cancer characterized by a BRAF V600E mutation And a method of providing information for selection.
갑상선암은 내분비계에서 발생하는 가장 흔한 악성 종양으로 여성이 남성에 비해 3배 정도 많이 발생하는 것으로 알려져 있다. 최근 전세계적으로 갑상선암 발생률이 급증하는 것으로 보고되고 있으며, 우리나라의 경우 그 증가율이 매우 높아서 2011년 여성암 발생률 1위를 보이고 있다. 전체 갑상선암종의 약 2~5%를 차지하는 역형성암은 흔하지 않지만 고도로 침습적이며, 분화성 갑상선암의 치료를 근간을 이루는 수술적 치료, 수술후 방사성 동위원소치료 및 L-티록신(L-thyroxine) 치료는 물론이고 적극적인 방사선 치료나 항암요법의 다학제간의 치료에도 불구하고 진단 후 평균 생존율이 약 5개월일 정도로 그 예후가 극히 불량하다. 이는 진단 초기에 이미 국소 전이나 폐, 뼈, 간 등으로의 전신 전이가 급속도로 진행하기 때문이다.Thyroid cancer is the most common malignant tumor in the endocrine system, which is known to occur three times more often in women than in men. In recent years, the incidence of thyroid cancer has been reported to surge globally. In Korea, the rate of cancer incidence is very high. Thyroid carcinoma, which accounts for approximately 2% to 5% of all thyroid carcinomas, is rare. However, surgical treatment based on the treatment of highly invasive, differentiated thyroid carcinoma, postoperative radionuclide treatment and L-thyroxine treatment Of course, despite the interdisciplinary treatment of active radiotherapy or chemotherapy, the average survival rate after diagnosis is about 5 months, and its prognosis is extremely poor. This is due to the rapid progression of systemic metastasis to the lung, bone, liver,
갑상선의 종양 발생 과정(tumorigenesis)에 다양한 유전적인 변이가 관여되고 있음이 보고되고 있다. 갑상선 체세포 돌연변이에는 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호전달체계가 관여하고 있는데, 유전적 변이로 인한 세포막의 RET 티로신 키나제(RET tyrosine kinase)가 MAPK 경로를 활성화시켜 세포내 신호전달인자인 RAS와 BRAF를 상향 조절하고, 이는 다시 MEK(mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated kinase)와 ERK(extracellular single-regulated kinase)를 활성화시켜 세포증식, 분화 및 생존 등을 포함하는 다양한 세포내 기전에 대한 핵내 신호전달을 야기하게 된다. 갑상선암종에서 가장 많은 연구가 되고 가장 흔하게 발견되는 유전적인 이상이 BRAF 돌연변이이다. BRAF는 RAS에 의해 활성화되고 결합되어 세포막에 전위된 세린-트레오닌 키나제(serine-threonine kinase)로서, 갑상선암에서 가장 흔하게 발견되는 변이는 600번 아미노산인 발린(valine; V)이 글루탐산(glutamic acid; E)으로 치환된 것(V600E)으로 1799번 뉴클레오티드의 점돌연변이가 원인이다. BRAF(V600E) 돌연변이는 유두암에서 가장 흔하지만, 미분화암이나 역형성암의 1/3에서도 발견된다. BRAF 돌연변이는 BRAF 키나제(BRAF kinase)의 항시 작용, MEK과 ERK 키나제(ERK kinase)의 인산화를 통해 MAPK 경로를 지속적으로 활성화 시키며 최근 들어 많은 연구에서 BRAF 돌연변이와 갑상선암의 공격적인 임상 및 병리학적 특징, 즉 림프절 전이, 갑상선 피막외 침습, 진행된 임상병기, 종양 재발, 재수술, 암관련 사망 등과 상관 관계가 높다고 보고되고 있다. 특히, BRAF 돌연변이 암종이 재발한 경우나 미분화 양상을 보이는 경우, 나트륨 요오드 공수송체(sodium iodide symporter)의 기능 변화로 방사성요오드 결합활성(radioiodine avidity)의 감소, 방사성 동위원소 치료의 저항성으로 이어지는 임상적인 특징을 보이는 경우가 많다.It has been reported that various genetic mutations are involved in the tumorigenesis of the thyroid gland. Mutations in the thyroid gland involve mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling. The RET tyrosine kinase (RET tyrosine kinase) in the cell membrane due to genetic mutations activates the MAPK pathway, resulting in intracellular signaling pathways, RAS and BRAF (Extracellular signal-regulated kinase) and ERK (extracellular single-regulated kinase) to regulate the nuclear signal for various cellular mechanisms including cell proliferation, differentiation and survival Transmission. The most common and most common genetic abnormality in thyroid carcinoma is the BRAF mutation. BRAF is a serine-threonine kinase that is activated and bound by RAS to the cell membrane. The most common mutation found in thyroid cancer is valine (V), the amino acid at position 600, and glutamic acid (E ) (V600E), which is caused by point mutation at nucleotide 1799. BRAF (V600E) mutations are most common in papillary cancer, but are also found in one-third of undifferentiated or inverted cancers. The BRAF mutation continuously activates the MAPK pathway through the action of BRAF kinase (BRAF kinase), phosphorylation of MEK and ERK kinase (ERK kinase), and in recent years many studies have demonstrated the aggressive clinical and pathological features of BRAF mutation and thyroid cancer Lymph node metastasis, extrathoracic invasion, advanced clinical stage, tumor recurrence, reoperation, and cancer-related mortality. In particular, when BRAF mutant carcinoma recurs or has undifferentiated features, a change in the function of the sodium iodide symporter results in a decrease in radioiodine avidity, a clinical effect that leads to resistance to radioisotope therapy There are many features that can be seen.
BRAF(V600E) 돌연변이는 갑상선암 이외에도 악성 흑색종(melanoma)의 약 50%, 대장-직장암의 약 15%, 모양세포성백혈병(hairy-cell leukemia)의 거의 모든 경우에서도 발견된다(Nikiforova MN et.al., J Clin Endocrinol Metab ., 88:5399-5404, 2003; Takano T et.al., Br J Cancer., 96:1549-1553, 2007; Hall RD et.al., Cancer Control., 21:221-230, 2014). 최근 들어 선택적 BRAF 억제제인 PLX4032(Vemurafenib)의 BRAF(V600E) 돌연변이 전이성 악성 흑색종(metastatic melanoma)에 대한 적용이 미국 FDA의 승인을 받게 되면서 환자들의 약 80%에서 무진행 생존율(progression-free survival, PFS)과 전체 생존율(overall survival)을 향상시킬 수 있음이 보고되었고, 모양세포성백혈병(hairy-cell leukemia)에서도 치료 반응이 향상됨을 발견하였다. 비록 PLX4032와 같은 BRAF 억제제의 투여가 BRAF 돌연변이 악성 흑색종에서 높은 치료반응을 보인데 반해, 다른 BRAF 돌연변이 고형암종에서의 효과는 미미하였다(Kopetz S et.al., J Clin Oncol ., 28:15s, 2010). 이처럼 치료 반응이 상이한 것은 표적 치료제에 대한 내인성 저항성 기전 발현에 따른 것으로, BRAF 억제제에 대한 치료 반응의 저항성을 보이는 갑상선암과 같은 고형암종에서 BRAF 억제제에 의한 내성 획득 기전을 구체적으로 밝혀 표적 치료의 효과를 극대화할 필요가 있다. In addition to thyroid cancer, the BRAF (V600E) mutation is found in almost all cases of hairy-cell leukemia, approximately 50% of malignant melanoma, approximately 15% of colorectal cancer (Nikiforova MN et al. . , J Clin Endocrinol Metab . , 88: 5399-5404, 2003; Takano T et al. , Br J Cancer. , 96: 1549-1553, 2007; Hall RD et al. , Cancer Control. , 21: 221-230, 2014). In recent years, the approval of US FDA for the application of selective BRAF inhibitor, PLX4032 (Vemurafenib) to metastatic melanoma BRAF (V600E) mutation metastatic melanoma has led to progression-free survival in approximately 80% PFS) and overall survival, and found that the treatment response was also improved in hairy-cell leukemia. Although the administration of BRAF inhibitors such as PLX4032 has shown a high therapeutic response in BRAF mutant malignant melanoma, the effect on other BRAF mutant solid tumor species was minimal (Kopetz S et al. , J Clin Oncol . , 28: 15s, 2010). The difference in treatment response is due to the expression of the endogenous resistance mechanism in the target therapeutic agent. The mechanism of acquiring resistance to BRAF inhibitors in solid tumor types such as thyroid cancer, which shows resistance to the BRAF inhibitor, There is a need to maximize.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 BRAF 표적 치료제의 약제 내성을 극복하고, BRAF(V600E) 돌연변이 역형성 갑상선암의 종양 억제능을 극대화할 수 있는 치료제 및 치료제 병용 요법을 개발하고자 예의 노력한 결과, BRAF 돌연변이 역형성 갑상선암 세포주인 8505C에서 BRAF 억제제 투여시 Src의 발현량이 현저히 증가함을 확인하고, BRAF(V600E) 돌연변이 역형성 갑상선암을 대상으로 BRAF 억제제 및 Src 억제제의 병합요법(combinatorial therapy)에 따른 이중 억제(dual inhibition) 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.Under these circumstances, the present inventors have made extensive efforts to overcome the drug resistance of BRAF target therapeutic agents and to develop therapies and therapies that can maximize tumor inhibiting ability of BRAF (V600E) mutant inverse thyroid cancer. As a result, BRAF mutation- The expression of Src in BRAF (V600E) mutant inverse thyroid carcinoma was significantly higher than that of BRAF inhibitor in the
본 발명의 목적은 BRAF V600E 돌연변이를 특징으로 하는 역형성 갑상선암(anaplastic thyroid cancer)의 치료에 있어서, BRAF 억제제 투여 후 Src 단백질의 발현이 증가하는 기전을 근거로 하여 BRAF 억제제의 저항성 극복을 위한 약학 조성물 및 약물 선택을 위한 정보 제공 방법을 제공하기 위한 것이다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for overcoming the resistance of BRAF inhibitors based on the mechanism by which the expression of Src protein is increased after administration of BRAF inhibitor in the treatment of anaplastic thyroid cancer characterized by BRAF V600E mutation And a method for providing information for drug selection.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Src 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, BRAF V600E 돌연변이를 특징으로 하는 역형성 갑상선암(anaplastic thyroid cancer)의 치료를 위해 BRAF 억제제와 병용 투여하기 위한 약학 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for treating anaplastic thyroid cancer characterized by a BRAF V600E mutation, which comprises an Src inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, in combination with a BRAF inhibitor 0.0 > pharmaceutically < / RTI >
또한, 본 발명은 역형성 갑상선암(anaplastic thyroid cancer) 환자에서 분리한 생물학적 시료로부터 Src 발현 정도를 확인하고, Src 단백질이 과발현된 경우, 역형성 갑상선암의 치료를 위해 Src 억제제와 BRAF 억제제를 병용 투여하도록 정보를 제공하는 것을 포함하는, BRAF V600E 돌연변이를 특징으로 하는 역형성 갑상선암의 치료용 약물 선택을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.In addition, the present invention confirms the expression level of Src from biological samples isolated from patients with anaplastic thyroid cancer, and co-administration of Src inhibitors and BRAF inhibitors for the treatment of inverse thyroid cancer when Src protein is overexpressed Providing a method of providing information for therapeutic drug selection for the treatment of inverse-forming thyroid carcinoma characterized by a BRAF V600E mutation, including providing information.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
하나의 양태로서, 본 발명은 Src 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, BRAF V600E 돌연변이를 특징으로 하는 역형성 갑상선암(anaplastic thyroid cancer)의 치료를 위해 BRAF 억제제와 병용 투여하기 위한 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment, the present invention provides a method of treating anaplastic thyroid cancer characterized by a BRAF V600E mutation, comprising an Src inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, in combination with a BRAF inhibitor ≪ / RTI >
본 발명에서 용어 "역형성 갑상선암(anaplastic thyroid cancer, ATC)"은 갑상선암의 드문 종류로, 갑상선암 전체의 2~3%를 차지하는 것으로 알려져 있다. 역형성 갑상선암은 매우 빨리 자라고 급격하게 퍼지기 때문에 예후가 매우 좋지 않으며, 초기 진단시 종양이 크고, 주위 조직으로의 침습이 심하며, 원격 전이를 동반하는 경우가 많아 수술적 치료가 불가능한 경우가 많다. 수술, 방사선 조사, 항암화학요법을 시행하여도 예후가 불량하여 진단 후 평균 생존기간이 4~5개월에 불과한 갑상선암이다.The term "anaplastic thyroid cancer (ATC)" in the present invention is a rare type of thyroid cancer, which is known to account for 2 to 3% of the total thyroid cancer. Thyroid carcinoma has a very poor prognosis because it grows very rapidly and spreads rapidly. In early diagnosis, the tumor is large, the invasion to the surrounding tissues is severe, and remote metastasis is often accompanied by many cases. Surgery, radiotherapy, and chemotherapy are the only thyroid cancer with poor prognosis, with an average survival of only 4 to 5 months.
본 발명에서 용어 "BRAF"는 RAS에 의해 활성화되고 결합되어 세포막에 전위된 세린-트레오닌 키나아제(serine-threonine kinase)로서, 갑상선암에서 가장 흔하게 발견되는 변이는 600번 아미노산인 발린(valine)이 글루탐산(glutamic acid)으로 치환된 것(V600E)으로 1799번 뉴클레오티드의 점돌연변이가 원인이다. 상기 "BRAF V600E 돌연변이"는 유두암에서 가장 흔하지만, 미분화암이나 역형성암의 1/3에서도 발견된다. 한편, BRAF V600E 돌연변이는 갑상선암 이외에도 악성 흑색종(melanoma)의 약 50%, 대장-직장암의 약 15%, 모양(毛樣) 세포성 백혈병(hairy-cell leukemia)의 거의 모든 경우에서도 발견된다.In the present invention, the term "BRAF" is serine-threonine kinase activated and bound by RAS and transferred to the cell membrane. The most common mutation found in thyroid cancer is valine, which is a 600 amino acid, glutamic acid) (V600E), which is caused by point mutation at nucleotide 1799. The above-mentioned "BRAF V600E mutation" is the most common in papillary cancer, but is also found in 1/3 of undifferentiated or inverted cancers. The BRAF V600E mutation is found in almost all cases of thyroid cancer, about 50% of malignant melanoma, about 15% of colorectal cancer, and hairy-cell leukemia.
본 발명의 일실시예에 있어서, BRAF V600E 돌연변이를 갖는 역형성 갑상선암 세포주 8505C에 BRAF 억제제인 PLX4032를 투여한 후 c-Met 및 Src 발현량이 현저히 증가함을 확인하였다(도 1).In one embodiment of the present invention, the amount of c-Met and Src expression was significantly increased after administration of the BRAF inhibitor PLX4032 to the inverse-forming thyroid
이에, BRAF 억제제에 대한 내성 획득 역형성 갑상선암 세포주 8505C의 세포 사멸을 위한 약물 조합 선정을 위해, BRAF 억제제인 PLX4032, c-Met 억제제인 PHA665752 및 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib) 3종의 약물을 각각 농도별로 조합하여 병용 투여하고, 약물 조합별 투여에 따른 8505C의 세포 성장능을 분석한 결과, PLX4032 및 PHA665752의 조합에 비해, PLX4032 및 다사티닙의 조합이 전반적으로 세포 성장 억제능이 강한 경향을 보였다. 또한, 병용 투여하는 두 약물을 개별로 각각 연속 투여(A→B)하는 경우보다는, 병용 투여하는 두 약물을 한 번에 동시 투여(A+B)하는 경우에 종양 억제 효능이 더 큼을 확인하였다(도 4).Thus, resistance to BRAF inhibitors, acquiring a reverse proliferative thyroid
또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, BRAF 억제제인 PLX4032, c-Met 억제제인 PHA665752 및 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib) 3종의 각 약물 투여 조건별 종양 침습능/이동능을 분석한 결과, PLX4032를 단독 투여한 조건에 비해 병합 요법의 작용 효과가 더 컸으며, PLX4032 및 PHA665752 약물의 병합 요법에 비해, PLX4032 및 다사티닙의 병합 요법의 조합이 세포 이동능 억제 효과가 더 우수함을 확인하였다(도 5).In addition, in one embodiment of the present invention, analysis of tumor invasiveness / migration ability of each of the three drug administration conditions of BRAF inhibitor PLX4032, c-Met inhibitor PHA665752 and Src inhibitor dasatinib , The combination of PLX4032 and PLA403232 alone was more effective than the combination therapy of PLX4032 and PHA665752, and the combination of PLX4032 and dasatinib was more effective in suppressing cell migration. (Fig. 5).
아울러, in vivo 상에서 BRAF 억제제 내성 획득 역형성 갑상선암의 치료 효과를 분석해 본 결과, BRAF 억제제인 PLX4032 및 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib) 병용 투여군의 종양 성장능이 현저히 억제됨을 확인하였으며, 영상학적 평가 결과에서도 상기 약물의 단독 투여 또는 PLX4032 및 PHA665752 약물 투여 군에 비해 종양의 부피가 가장 작고, 약물의 효과가 가장 큼을 확인하였다(도 7 및 도 8).In addition, the in vivo effects of BRAF inhibitor-resistant reverse-forming thyroid cancer were analyzed, and it was found that the tumor growth potential of BRXF inhibitor PLX4032 and the Src inhibitor, dasatinib, (Fig. 7 and Fig. 8), the volume of tumor was the smallest and the effect of the drug was the largest in comparison with the single administration of the drug or the administration of the drug of PLX4032 and PHA665752.
본 발명에 있어서, 상기 "역형성 갑상선암"은 BRAF V600E 돌연변이를 특징으로 하는 역형성 갑상선암으로, BRAF 억제제에 대한 치료 반응의 저항성을 보이는, 즉, BRAF 억제제에 대한 내성을 획득한 갑상선암일 수 있다. 한편, 상기 역형성 갑상선암은 이에 제한되지는 않으나, BRAF 억제제에 의해 c-Met 및 Src 단백질의 발현량이 증가 되어 있는 상태의 갑상선암일 수 있다.In the present invention, the "inverse thyroid cancer" may be a thyroid cancer that is a reversible thyroid carcinoma characterized by a BRAF V600E mutation, which shows resistance to a treatment response to the BRAF inhibitor, i.e., has acquired resistance to a BRAF inhibitor. The inverse thyroid cancer may be, but is not limited to, thyroid cancer in which the expression level of c-Met and Src protein is increased by a BRAF inhibitor.
본 발명에서 용어 "Src"는 약 60kDa 크기의 단백질로 다양한 막 수용체 단백질에 의해 인산화되며, 활성화된 Src 단백질은 세포 신호 전달에 관여하여 세포 증식, 분화, 골격 유지 등 다양한 세포 내 반응을 매개한다.In the present invention, the term "Src " is a protein of about 60 kDa size, which is phosphorylated by various membrane receptor proteins. The activated Src protein participates in cell signal transduction and mediates various intracellular responses such as cell proliferation, differentiation and skeletal maintenance.
본 발명에서 용어 "Src 억제제"는 Src 유전자의 발현 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 활성을 억제함으로써, 세포 신호 전달에 관여하여 세포 증식, 분화, 골격 유지 등 다양한 세포 내 반응 매개를 차단하는 약물을 의미한다.In the present invention, the term "Src inhibitor" refers to a substance that inhibits expression of the Src gene or the activity of a protein encoded by the gene, thereby inhibiting a variety of intracellular reaction mediators such as cell proliferation, differentiation, it means.
본 발명에 있어서, 상기 "Src 억제제"는 Src를 억제함으로써 암 발생 단백질의 생성을 억제하는 약물일 수 있으며, 예컨대 다사티닙(dasatinib), 사라카티닙(saracatinib), 보수티닙(bosutinib) 또는 퀘르세틴(quercetin) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the "Src inhibitor" may be a drug that inhibits the generation of cancer-producing proteins by inhibiting Src, and may be a drug such as dasatinib, saracatinib, bosutinib or quercetin but is not limited to, quercetin.
본 발명에 있어서, 상기 Src 억제제는 다사티닙(dasatinib)일 수 있다.In the present invention, the Src inhibitor may be dasatinib.
본 발명에서 용어 "BRAF 억제제"는 BRAF 변이를 표적으로 하여, BRAF 돌연변이를 가진 암을 치료하는 약물을 의미한다. 구체적으로, BRAF V600E 돌연변이를 표적으로 한 역형성 갑상선암에 대한 항암제일 수 있다. 예컨대, BRAF 억제제는 베무라페닙(vemurafenib; PLX4032), PLX4720, 다브라페닙(dabrafenib; GSK-2118436), 소라페닙(Sorafenib) 또는 CEP-32496일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The term "BRAF inhibitor" in the present invention refers to a drug that targets a BRAF mutation and treats a cancer with a BRAF mutation. Specifically, it may be an anticancer agent for a reverse-formed thyroid cancer that targets the BRAF V600E mutation. For example, the BRAF inhibitor may be, but is not limited to, vemurafenib (PLX4032), PLX4720, dabrafenib (GSK-2118436), Sorafenib or CEP-32496.
본 발명에 있어서, 상기 BRAF 억제제는 베무라페닙(vemurafenib; PLX4032)일 수 있다In the present invention, the BRAF inhibitor may be vemurafenib (PLX4032)
본 발명에서 용어 "c-Met"은 세포 표면에 존재하는 대표적인 수용체 타이로신 카이네이즈(Receptor Tyrosine Kinase; RTK)로서, 그 리간드인 간세포성장인자(Hepatocyte Growth Factor; HGF)와 결합하여 세포 내 신호전달을 촉진시켜 세포의 성장을 촉진할 뿐 아니라 암세포에 과발현되어 암 발생, 암 전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생 혈관 형성에도 광범위하게 관여한다. c-Met은 많은 종류의 암에서 과발현되고 있으며, 특히 c-Met의 과발현이 있는 환자들은 암의 치료 예후가 나쁜 (Poor prognosis) 경우가 대부분이다. In the present invention, the term "c-Met" is a representative receptor tyrosine kinase (RTK) present on the cell surface and binds to its ligand, Hepatocyte Growth Factor (HGF) Not only promotes cell growth, but is also over-expressed in cancer cells and is widely involved in cancer development, cancer metastasis, cancer cell migration, cancer cell infiltration, and neovascularization. c-Met is overexpressed in many types of cancer, and patients with overexpression of c-Met are most likely to have poor prognosis.
본 발명에서 용어 "c-Met 억제제"는 c-Met의 작용을 저해하는 약물로서, c-Met 유전자의 발현 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 활성을 억제하여 암세포 또는 암 조직의 감소, 암세포 또는 암 조직의 사멸, 암 전이와 관련된 암세포의 이동 및/또는 침투의 억제 등의 효과를 나타낸다.The term "c-Met inhibitor" in the present invention is a drug which inhibits the action of c-Met, and inhibits the expression of the c-Met gene or the activity of the protein encoded by the gene to reduce cancer cells or cancer tissues, Death of tissue, inhibition of migration and / or penetration of cancer cells associated with cancer metastasis, and the like.
본 발명에 있어서, 상기 "c-Met 억제제"는 예컨대, PHA-665752, 크리조티닙(crizotinib), 카보잔티닙(cabozantinib), 또는 포레티닙(foretinib) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the "c-Met inhibitor" may be, but is not limited to, PHA-665752, crizotinib, cabozantinib, or foretinib.
본 발명에 있어서, 상기 c-Met 억제제는 PHA-665752일 수 있다.In the present invention, the c-Met inhibitor may be PHA-665752.
본 발명에 있어서, Src 억제제의 약제학적으로 허용가능한 염은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효 작용을 갖는 농도로서, 이 염에 기인한 부작용이 Src 억제제의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 염은 유기산 또는 무기산을 이용하여 형성된 산 부가염일 수 있으며, 상기 유기산은, 예를 들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 디클로로아세트산, 아미노옥시 아세트산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 및 메탄술폰산계 염을 포함하며 무기산은 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 및 붕산계 염을 포함한다. 바람직하게는 염산염 또는 아세트산염 형태일 수 있다. 또한, 알칼리 금속염(나트륨염, 칼류염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염) 등일 수 있다.In the present invention, pharmaceutically acceptable salts of Src inhibitors are those which have a relatively nontoxic and innocuous effective action on the patient, such that the side effects caused by this salt do not detract from the beneficial effects of the Src inhibitor, . For example, the pharmaceutically acceptable salt may be an acid addition salt formed using an organic or inorganic acid, and the organic acid may be, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, lactic acid, butyric acid, isobutyric acid, trifluoroacetic acid, , Malonic acid, malonic acid, fumaric acid, succinic acid, succinic acid monoamide, glutamic acid, tartaric acid, oxalic acid, citric acid, glycolic acid, glucuronic acid, ascorbic acid, benzoic acid, phthalic acid, salicylic acid, anthranilic acid, dichloroacetic acid, Sulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and methanesulfonic acid-based salts, and the inorganic acid includes, for example, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, carbonic acid and boric acid-based salts. Preferably in the hydrochloride or acetate form. Further, it may be an alkali metal salt (sodium salt, kagura salt, etc.) and an alkaline earth metal salt (calcium salt, magnesium salt).
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 Src 억제제 및 BRAF 억제제를 각각 포함하는 약학 조성물로 제제화되어, 두 약물을 동시적 또는 순차적으로 투여하기 위한 형태일 수 있으며, 바람직하게는 두 약물을 동시적으로 투여하기 위한 형태일 수 있다. 이 경우, 상기 약학 조성물은 유효성분으로 Src 억제제를 포함하는 제1 약학 조성물 및 유효성분으로 BRAF 억제제를 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하는, 동시적 또는 순차적 투여를 위한 약학 조성물일 수 있으며, 바람직하게는 동시적 투여를 위한 약학 조성물일 수 있다.In the present invention, the pharmaceutical composition may be formulated into a pharmaceutical composition containing a Src inhibitor and a BRAF inhibitor, respectively, and may be in a form for simultaneous or sequential administration of two drugs, preferably two drugs simultaneously For example. In this case, the pharmaceutical composition may be a pharmaceutical composition for simultaneous or sequential administration, comprising a first pharmaceutical composition comprising an Src inhibitor as an active ingredient and a second pharmaceutical composition comprising a BRAF inhibitor as an active ingredient, May be a pharmaceutical composition for simultaneous administration.
상기와 같이 Src 억제제와 BRAF 억제제를 각각 포함하는 약학 조성물로 제제화되어 투여되는 경우, 상기 약물들은 각각의 약물에 따른 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. As described above, when formulated as a pharmaceutical composition containing a Src inhibitor and a BRAF inhibitor, the medicines may include a pharmaceutically acceptable carrier according to each drug. As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" refers to a carrier or diluent that does not substantially stimulate the organism and does not interfere with the biological activity and properties of the administered ingredients.
상기 Src 억제제와 BRAF 억제제를 각각 포함하는 약학 조성물로 제제화되는 경우, 약학적으로 허용 가능한 담체는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체로는 락토스, 전분, 셀룰로오스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있고, 비경구 투여용 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 포함할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조제제)로 제형화할 수도 있다. 또한, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.When formulated into a pharmaceutical composition comprising the Src inhibitor and the BRAF inhibitor, respectively, the pharmaceutically acceptable carrier may comprise, for example, a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration. The carrier for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, etc. The carrier for parenteral administration may be saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin Solution, glycerol, ethanol, and one or more components of these components. If necessary, other conventional additives such as an antioxidant, a buffer, and a bacteriostatic agent may be added to prepare an injection solution suitable for injection into tissues or organs And the like. In addition, it may be formulated into an isotonic sterile solution or, in some cases, a dry preparation (especially a lyophilized preparation) which may be an injectable solution by adding sterile water or physiological saline. In addition, a target organ specific antibody or other ligand can be used in combination with the carrier so as to specifically act on the target organ.
또한, 바람직하게 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다.In addition, preferably, the composition of the present invention may further include a filler, an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, and the like. The composition of the present invention may also be formulated using methods known in the art so as to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to the mammal.
본 발명에서 용어 "투여"는 본 발명의 조성물을 어떠한 적절한 방법으로 치료적 유효량을 환자에게 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The term "administering" as used herein means introducing a therapeutically effective amount of a composition of the present invention into a patient by any suitable method, and the administration route of the composition of the present invention may be administered orally or parenterally Lt; / RTI > But are not limited to, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, topical, intranasal, intrathecal, rectal.
상기 "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.The "effective amount" means an amount necessary to delay or totally stop the onset or progression of the particular disease to be treated. In the present invention, the composition may be administered in a pharmaceutically effective amount. It will be apparent to those skilled in the art that the appropriate total daily dose may be determined by the practitioner within the scope of sound medical judgment.
상기 약학 조성물 또는 BRAF 억제제의 적절한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 100mg/kg 범위 내이다. 예컨대, 상기 약학 조성물 또는 BRAF 억제제의 1일 투여량은 0.001 내지 1000mg/kg, 구체적으로 0.01 내지 100mg/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50mg/kg 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition or the BRAF inhibitor may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, . A preferred dosage of the composition is in the range of 0.001 to 100 mg / kg on an adult basis. For example, the daily dose of the pharmaceutical composition or the BRAF inhibitor may be in the range of 0.001 to 1000 mg / kg, specifically 0.01 to 100 mg / kg, more specifically 0.1 to 50 mg / kg, but is not limited thereto. The daily dose may be formulated into a single dosage form in unit dose form, formulated in an appropriate amount, or intruded into a multi-dose container.
상기 약학 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. The pharmaceutical composition may be prepared in a unit dose form by formulating it with a pharmaceutically acceptable carrier and / or an excipient according to a method that can be easily practiced by those skilled in the art, or may be prepared by inserting it into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은,According to another aspect of the present invention,
역형성 갑상선암(anaplastic thyroid cancer) 환자에서 분리한 생물학적 시료로부터 Src 발현 정도를 확인하고,The level of Src expression was determined from biological specimens isolated from patients with anaplastic thyroid cancer,
Src 단백질이 과발현된 경우, 역형성 갑상선암의 치료를 위해 Src 억제제와 BRAF 억제제를 병용 투여하도록 정보를 제공하는 것을 포함하는,Comprising administering a combination of a Src inhibitor and a BRAF inhibitor for the treatment of < RTI ID = 0.0 > inverse < / RTI > thyroid cancer when the Src protein is overexpressed,
BRAF V600E 돌연변이를 특징으로 하는 역형성 갑상선암의 치료용 약물 선택을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.Provides a method of providing information for drug selection for the treatment of inverse-forming thyroid carcinoma characterized by a BRAF V600E mutation.
보다 구체적으로, 본 발명은 역형성 갑상선암 환자로부터 분리한 생물학적 시료에 존재하는 Src 발현 정도를 확인함으로써, Src가 과발현된 경우 해당 시료의 환자에게 상기 역형성 갑상선암의 치료를 위해 Src 억제제 및 BRAF 억제제를 병용 투여하도록 정보를 제공하는 것이다.More specifically, the present invention confirms the expression level of Src present in biological samples isolated from patients with inverse thyroid cancer, and thus, when Src is overexpressed, Src inhibitor and BRAF inhibitor To provide information to be used in combination.
본 발명에 있어서, 상기 정보 제공 방법은 의사가 BRAF V600E 돌연변이를 특징으로 하는 역형성 갑상선암을 치료하기 위해 Src 억제제와 BRAF 억제제를 병용 투여하기 위한 병용 투여 대상을 선별하는 방법일 수 있다.In the present invention, the information providing method may be a method for screening a co-administration subject for administering a combination of a Src inhibitor and a BRAF inhibitor to treat a reversed-type thyroid cancer in which a physician is characterized by a BRAF V600E mutation.
본 발명에 있어서, 상기 BRAF V600E 돌연변이 역형성 갑상선암의 경우 BRAF 억제제의 투여 후, Src 단백질의 발현 수준이 증가 되어 있는 상태일 수 있으며, BRAF 억제제에 대한 내성을 획득한 상태일 수 있다. 한편, 상기 BRAF 억제제는 베무라페닙(vemurafenib; PLX4032)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, in the case of BRAF V600E mutant inverse thyroid cancer, the expression level of Src protein may be increased after administration of BRAF inhibitor, and the BRAF inhibitor may have acquired resistance to BRAF inhibitor. Meanwhile, the BRAF inhibitor may be, but is not limited to, vemurafenib (PLX4032).
본 발명에 있어서, 상기 정보 제공 방법은 BRAF 억제제에 대한 내성을 획득한 BRAF V600E 돌연변이 역형성 갑상선암 환자에서 Src 유전자 또는 단백질의 발현 수준의 증가 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In the present invention, the information providing method may further include the step of confirming whether the expression level of the Src gene or protein is increased in a BRAF V600E mutated inverse thyroid cancer patient who has acquired resistance to the BRAF inhibitor.
본 발명에 있어서, Src 유전자 및 단백질의 검출에는 당업계에서 알려진 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 노던 블랏팅(northern blotting), 현장혼성화 분석법(in situ hybridization assay) 유전자칩(DNA chip), 웨스턴 블랏팅(western blotting), RTK 분석(RTK array) 또는 마이크로어레이(microarray)를 이용해 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, various methods known in the art can be used for detection of Src gene and protein. For example, reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR, northern blotting, In situ hybridization assays can be performed using, but not limited to, DNA chips, western blotting, RTK assays, or microarrays.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 환자의 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 변, 타액, 눈물, 척수액, 세포 또는 조직일 수 있으나, 시료가 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the biological sample may be blood, plasma, serum, urine, feces, saliva, tears, spinal fluid, cells or tissue of a patient, but the sample is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 "BRAF V600E 돌연변이 역형성 갑상선암 환자"는 역형성 갑상선암 환자 중 BRAF 억제제에 대한 치료 반응의 저항성을 보이는, 즉, BRAF 억제제에 내성을 갖는 역형성 갑상선암 환자로부터 분리한 생물학적 시료에서 Src가 과발현된 상태의 환자를 의미한다.In the present invention, the above-mentioned "BRAF V600E mutated inverse thyroid cancer patient" is a biological sample that is resistant to a BRAF inhibitor in patients with reversed-type thyroid cancer, that is, a BRAF inhibitor- Means patients with overexpression of Src.
본 발명에 있어서, Src 억제제 및 BRAF 억제제는 상기 약학 조성물에서 기술한 모든 내용을 그대로 적용할 수 있다.In the present invention, the Src inhibitor and the BRAF inhibitor can be applied to all the contents described in the above pharmaceutical composition as they are.
본 발명에 있어서, Src 발현 정도는 상기 환자로부터 분리한 생물학적 시료에 존재하는 DNA를 분석하는 액체 생체검사(liquid biopsy) 등의 비침습적 검체 분석 방법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 통상적으로 사용되는 모든 방법을 적용할 수 있다.In the present invention, the degree of expression of Src may be determined by a non-invasive sample analysis method such as liquid biopsy for analyzing DNA present in a biological sample isolated from the patient, but is not limited thereto. All methods can be applied.
본 발명에 있어서, 상기 Src 과발현 BRAF V600E 돌연변이 역형성 갑상선암은 베무라페닙(vemurafenib; PLX4032)에 대해 내성을 획득하거나 또는 내성을 획득하지 않은 경우를 모두 포함할 수 있다.In the present invention, the Src overexpressing BRAF V600E mutant inverse thyroid cancer may include both cases in which resistance to vEMFRAbIM (PLX4032) is acquired or resistance is not obtained.
본 발명에 있어서, 상기 베무라페닙에 대한 내성 획득 여부는 세포 수준에서 확인할 수 있다. 구체적으로, 베무라페닙에 저항성을 보이는 Src 과발현 BRAF V600E 돌연변이 역형성 갑상선암 세포주에 대해 MTT assay, phosphorylated RTK assay 등의 분석법을 이용하여 베무라페닙에 대한 내성 획득 여부를 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, whether the resistance to bemurafenid is obtained can be confirmed at the cellular level. Specifically, we can confirm the resistance to bemura penipib by using MTT assay and phosphorylated RTK assay for the Src overexpressing BRAF V600E mutant thyroid carcinoma cell line that is resistant to bemura-penip, but not limited to no.
본 발명에 있어서, 시료에 존재하는 Src 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하기 위해서는, 이들을 검출할 수 있는 각종 제제들을 사용할 수 있다.In the present invention, in order to measure the expression level of the Src gene or protein present in the sample, various agents capable of detecting them can be used.
본 발명에 있어서, 상기 "발현 수준을 측정할 수 있는 제제"란, 환자의 시료 내에서 Src 유전자 또는 단백질의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 상기 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 Src 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드 등이 될 수 있다. 상기 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Src 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다.In the present invention, the expression "agent capable of measuring the expression level" means a substance that can be used to detect the presence of a Src gene or protein in a sample of a patient. The agent capable of measuring the expression level may be a primer, a probe, an antisense oligonucleotide, or the like capable of complementarily binding to the Src gene. It is preferable that the primer, the probe, and the antisense oligonucleotide bind specifically to the base sequence of the Src gene and do not specifically bind to the base sequence of the other nucleic acid material.
이때, 상보적으로 결합한다는 것은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 Src 유전자 타겟에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.Herein, complementary binding means that the antisense oligonucleotide is sufficiently complementary to selectively hybridize to the Src gene target under a predetermined hybridization or annealing condition, preferably under physiological conditions, and is substantially complementary, And perfectly complementary, and preferably means completely complementary.
한편, 상기 Src 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체; 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, "항체"는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 단백질 분자를 의미한다. 상기 단백질은 공지된 단백질이므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다. 예컨대, Src 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 제제는 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.Meanwhile, agents capable of measuring the expression level of the Src protein include antibodies such as polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies that specifically bind to the protein; Or an app tamer. In the present invention, "antibody" means a protein molecule that specifically binds to an antigenic site. Since the protein is a known protein, it can be easily produced using techniques known to those of ordinary skill in the art by using it. In addition, the antibody includes functional fragments of antibody molecules as well as complete forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 and Fv. For example, the agent for measuring the expression level of the Src protein may be an antibody that specifically recognizes the protein.
또한, 본 발명에 있어서, "앱타머"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하게 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다. 본 발명의 목적상 앱타머는 상기 Src 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다.In the present invention, "aptamer" means a nucleic acid molecule having a binding activity to a predetermined target molecule. The aptamer may be RNA, DNA, modified nucleic acid, or a mixture thereof. The aptamer may be in the form of a linear or cyclic form. Generally, the shorter the sequence of the nucleotide constituting the aptamer, the better the chemical synthesis and mass production It is known that it is easy to use, has excellent advantages in cost, has excellent chemical stability and stability in vivo, and has low toxicity. For purposes of the present invention, an aptamer can be interpreted as a means by which the expression level of the protein can be measured by binding to the Src protein.
따라서, 본 발명의 약물의 병용 투여 대상 선별을 위한 정보 제공 방법은 BRAF 억제제에 내성을 갖는 Src 과발현 BRAF V600E 돌연변이 역형성 갑상선암 환자에게 Src 과발현 BRAF V600E 돌연변이 역형성 갑상선암의 치료를 위한 약물 선택의 정보를 제공할 수 있고, 상기 Src 과발현 BRAF V600E 돌연변이 역형성 갑상선암 환자에게 Src 억제제와 BRAF 억제제를 병용 투여함으로써 치료 효과를 기대할 수 있다.Therefore, the information providing method for screening a drug combination according to the present invention is to provide information on drug selection for the treatment of Src overexpressing BRAF V600E mutant inverse thyroid cancer in a Src overexpressing BRAF V600E mutation inversely forming thyroid cancer patient resistant to BRAF inhibitor And a Src inhibitor and a BRAF inhibitor may be administered to the above Src overexpressing BRAF V600E mutated inverse thyroid cancer patient.
본 발명은 BRAF V600E 돌연변이를 특징으로 하는 역형성 갑상선암(anaplastic thyroid cancer)의 치료에 있어서, BRAF 억제제 투여 후 Src 단백질의 발현이 증가하는 기전을 근거로 하여 BRAF 억제제의 저항성을 극복하기 위한 약학 조성물 및 약물 선택을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 BRAF 억제제와 Src 억제제를 병용 투여함으로써 BRAF V600E 돌연변이 역형성 갑상선암의 치료 효과를 극대화할 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for overcoming the resistance of a BRAF inhibitor on the basis of an increase in the expression of Src protein after administration of BRAF inhibitor in the treatment of anaplastic thyroid cancer characterized by a BRAF V600E mutation According to the present invention, the therapeutic effect of BRAF V600E mutant inverse thyroid cancer can be maximized by using a combination of a BRAF inhibitor and a Src inhibitor.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 역형성 갑상선암 세포주 8505C에 BRAF 억제제인 PLX4032 처리에 따른 RTK 어레이(RTK array) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 역형성 갑상선암 세포주 8505C에 BRAF 억제제인 PLX4032, c-Met 억제제인 PHA665752 및 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib) 3종의 약물을 각각 농도별로 단독 투여 후, 실시간 세포 거동 모니터링을 통한 약물 반응성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 역형성 갑상선암 세포주 8505C에 PLX4032 투여에 따른 세포 표현형의 변화를 관찰한 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 PLX4032, PHA665752 및 다사티닙(dasatinib) 3종의 약물을 조합하여 역형성 갑상선암 세포주에 병용 투여하고, 이에 따른 BRAF 억제제 내성 획득 역형성 갑상선암 세포주의 세포 성장능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 역형성 갑상선암 세포주 8505C에 PLX4032, PHA665752 및 다사티닙(dasatinib) 3종의 각 약물의 투여 조건별 종양 침습능을 확인한 현미경 사진이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 이소성(ectopic) 동물 모델 구축 개략도를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 이소성 동물 모델을 이용한 PLX4032, PHA665752 및 다사티닙(dasatinib) 3종의 약물 조합 조건별 종양 크기 및 부피 정보를 분석하여 종양 억제능을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 이소성 동물 모델에 PLX4032, PHA665752 및 다사티닙(dasatinib) 3종의 각 약물의 투여 조건별 종양 특성을 영상학적으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.FIG. 1 is a graph showing the results of analysis of RTK array (RTK array) according to treatment of PLX4032, which is a BRAF inhibitor, on an inverse thyroid
FIG. 2 is a graph showing the effect of the BRAF inhibitor PLX4032, the c-Met inhibitor PHA665752, and the Src inhibitor, dasatinib, on the inverse thyroid
FIG. 3 is a micrograph showing changes in cell phenotype upon administration of PLX4032 to an inverse thyroid
FIG. 4 is a graph showing that the combination of three drugs of PLX4032, PHA665752 and dasatinib according to an embodiment of the present invention is used in combination with an inverse-formed thyroid cancer cell line, and the cell growth of the BRAF inhibitor- Fig. 2 shows the results of analysis of the performance.
FIG. 5 is a micrograph showing the tumor invasiveness of each of the three drugs PLX4032, PHA665752, and dasatinib in the inverse degenerating thyroid
Figure 6 is a schematic diagram of an ectopic animal model construction in accordance with one embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a graph showing the results of evaluating tumor inhibiting ability by analyzing tumor size and volume information according to drug combination conditions of three kinds of PLX4032, PHA665752 and dasatinib using an ectopic animal model according to an embodiment of the present invention to be.
FIG. 8 is a diagram showing the results of imaging analysis of tumor characteristics according to the administration conditions of each of three drugs PLX4032, PHA665752 and dasatinib in an ectopic animal model according to an embodiment of the present invention.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the constitution and effects of the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예Example 1: One: BRAFBRAF 억제제에 의한 By inhibitor BRAFBRAF (( V600EV600E ) 돌연변이 Mutation 역형성Inverse formation 갑상선암 세포의 내성 기전 분석 Analysis of resistance mechanism of thyroid carcinoma cells
BRAF 억제제에 의한 BRAF(V600E) 돌연변이 역형성 갑상선암 세포의 내성 획득 기전을 규명하고자, 역형성 갑상선암 세포주인 8505C에 BRAF 억제제인 베무라페닙(vemurafenib; PLX4032)을 처리하고, RTK 어레이(Receptor tyrosine kinases array)를 수행하여 PLX4032 처리에 따른 RTK(Receptor tyrosine kinases) 발현량 변화를 확인하였다. 이때, RTK 어레이는 여러 RTK의 발현량을 동시에 스크리닝할 수 있는 RTK 어레이 분석 키트를 이용하여 메뉴얼에 따라 수행하였다.To investigate the mechanism of BRAF (V600E) mutant inverse thyroid cancer cell acquisition, BRAF inhibitor, vemurafenib (PLX4032) was treated with 8505C inverse thyroid cancer cell line and RTK array (Receptor tyrosine kinases array ) Was performed to confirm the change in expression amount of RTK (receptor tyrosine kinases) according to PLX4032 treatment. At this time, the RTK array was performed according to the manual using an RTK array assay kit capable of simultaneously screening the expression levels of various RTKs.
구체적으로, BRAF 억제제인 PLX4032를 역형성 갑상선암 세포주인 8505C에 1 μM 농도로 9시간 동안 처리한 후 세포 용해물(cell lysate)을 수거하였다. PathScan RTK signaling antibody array kit(#7949S, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)에 포함되어 있는 어레이 블로킹 버퍼(Array blocking buffer)를 이용하여 멀티-웰 바스켓(multi-well basket)을 블로킹(blocking)하였다. 이후, 블로킹된 멀티-웰 바스켓(multi-well basket)에 상기 수거한 세포 용해물 150㎕를 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 동안 반응시킨 후, 어레이 세척 버퍼(Array wash buffer)로 5분간 3회 이상 세척하고, 검출 항체 칵테일(Detection Antibody Cocktail)을 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후, 어레이 세척 버퍼로 5분간 4회 세척하고, DyLight 680®-결합 스트렙트아비딘(DyLight 680®-linked Streptavidin)을 이용하여 RTK 단백질들의 발현 변화를 검증하였다.Specifically, PLX4032, a BRAF inhibitor, was treated with a 1 μM concentration of 8505C, a reverse-formed thyroid cancer cell line, for 9 hours, and cell lysate was collected. Well basket was blocked using an array blocking buffer included in the PathScan RTK signaling antibody array kit (# 7949S, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) Respectively. Then, 150 쨉 l of the collected cell lysate was added to a blocked multi-well basket and reacted at room temperature for 2 hours. After 2 hours of reaction, the cells were washed with array wash buffer for 3 minutes or more for 5 minutes, and the detection antibody cocktail was reacted at room temperature for 1 hour. 1 hour after the reaction, washed 45 minutes twice with wash buffer, and the array, DyLight 680 ® - using a combination streptavidin (DyLight 680 ® -linked Streptavidin) was verified the change in the expression of RTK protein.
그 결과, 하기 도 1에 나타낸 바와 같이, 역형성 갑상선암 세포주 8505C에서 BRAF 억제제인 PLX4032에 의해 두드러지게 c-Met 및 Src 발현량이 현저히 증가함을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 1, it was confirmed that the expression amount of c-Met and Src remarkably increased by the BRAF inhibitor PLX4032 in the inverse-formed thyroid
실시예Example 2: 실시간 세포 거동 2: Real-time cell behavior 모니터링을Monitoring 통한 약물 반응성 평가 Assessment of drug responsiveness through
상기 실시예 1에서 역형성 갑상선암 세포주 8505C에서 BRAF 억제제인 PLX4032에 의해 c-Met 및 Src 발현량이 현저히 증가함을 확인하였다.In Example 1, the amount of c-Met and Src expression was significantly increased by the BRAF inhibitor PLX4032 in the inverse thyroid
이에, BRAF 억제제, c-Met 억제제 및 Src 억제제에 의한 역형성 갑상선암 세포의 약물 반응성을 평가하고자, 역형성 갑상선암 세포주인 8505C에 BRAF 억제제인 PLX4032, c-Met 억제제인 PHA665752 및 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib) 3종의 약물을 각각 농도별로 단독 투여하고, 세포 증식을 반영하는 지표인 세포 지수(cell index)의 실시간 변화를 실시간 세포분석장비(Real Time Cell Analyzer, RTCA)를 이용하여 확인하였다.In order to evaluate the drug responsiveness of inverse thyroid cancer cell by BRAF inhibitor, c-Met inhibitor and Src inhibitor, PLA4032, c-Met inhibitor PHA665752 and Src inhibitor dasatinib (dasatinib) were individually administered to each concentration, and the real time change of the cell index, which is an index reflecting cell proliferation, was confirmed using a real time cell analyzer (RTCA).
구체적으로, E-plate 16(ACEA Biosciences, San Diego, CA, USA)에 웰(well) 당 1×104개(cells/well)의 세포수로 역형성 갑상선암 세포주 8505C를 시딩(seeding)하고, xCELLigenceTM DP system(Roche Diagnostics GmbH, Berlin, Germany)에 장착하였다. 세포가 부착될 때까지 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, BRAF 억제제인 PLX4032, c-Met 억제제인 PHA665752 및 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib)을 각각 처리한 후 세포 지수 변화를 확인하였다. 이때, BRAF 억제제인 PLX4032는 0.001 μM, 0.01 μM, 0.1 μM, 1 μM, 및 10 μM 농도로 각각 처리하였으며, c-Met 억제제인 PHA665752는 0.005 μM, 0.05 μM, 0.5 μM, 5 μM, 및 50 μM 농도로 각각 처리하였다. 또한, Src 억제제인 다사티닙(dasatinib)은 0.01 μM, 0.05 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 및 10 μM 농도로 각각 처리하였다.Specifically, an inverse-forming thyroid
세포 지수(cell index)는 세포의 부착능, 형태, 성장 등의 복합적인 상태를 임피던스(impedance) 값으로 인식하여 도출되는 값으로, 하기 도 2에 나타낸 바와 같이 6시간 간격으로 도식화 하였다. The cell index is a value derived by recognizing the complex state of cell adhesion, shape, growth, and the like as an impedance value, and is plotted at intervals of 6 hours as shown in FIG. 2 below.
실시간 세포분석장비(Real Time Cell Analyzer, RTCA)를 이용하여 상기 3종의 각각의 약물 스크리닝 결과, 특이적으로 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib)의 경우, 0.1 μM 이하의 농도로 처리한 실험군과 0.5 μM 이상의 농도로 처리한 실험군의 세포성장 억제 효과가 확연하게 다른 양상을 나타냄을 확인하였다.For each of the three drug screening results using Real Time Cell Analyzer (RTCA), specifically for the dasatinib Src inhibitor, the experimental group treated with 0.1 μM or less The cell growth inhibition effect of the experimental group treated with 0.5 μM or more was significantly different.
실시예Example 3: 3: BRAF 억제제BRAF inhibitor 투여에 따른 세포 표현형의 변화 관찰 Observation of cell phenotype change by administration
BRAF 억제제인 PLX4032 투여에 따른 세포 표현형의 변화를 관찰하고자, 생세포 이미징 시스템(Live Cell Imaging system; DMI6000B, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)과 공초점 레이저 현미경(Confocal Microscopy; LSM700, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 PLX4032 약물을 투여하기 전과 후의 역형성 갑상선암 세포주인 8505C의 세포 상태를 확인하였다.(Live Cell Imaging System, DMI6000B, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) and Confocal Microscopy (LSM700, Carl Zeiss, Jena, Germany) to observe the changes in cell phenotype upon administration of PLX4032, a BRAF inhibitor, ) Was used to confirm the cellular state of 8505C, an inverse-formed thyroid cancer cell line before and after administration of PLX4032 drug.
구체적으로, 세포의 형태학적 변화를 확인하기 위해 6-웰 플레이트(6-well plate)에 8505C 세포를 웰 당 2×105개(cells/well)의 세포수로 시딩(seeding)하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 1 μM의 PLX4032 약물을 6시간 동안 처리하고, DMI6000B 현미경(DMI6000B microscope)을 이용하여 세포 상태를 촬영하였다. 이때, 대조군으로서 1 μM의 PLX4032 약물을 6시간 동안 처리하기 전의 세포 상태를 촬영하여 비교하였다.Specifically, in order to confirm the morphological changes of cells, 8505C cells were seeded on a 6-well plate at 2 × 10 5 cells / well, For 24 hours. After incubation, 1 [mu] M of PLX4032 drug was treated for 6 hours and cell status was photographed using a DMI6000B microscope (DMI6000B microscope). At this time, cell conditions before treatment with 1 μM of PLX4032 drug as a control group for 6 hours were photographed and compared.
또한, BRAF 억제제인 PLX4032 투여에 따른 세포의 상피간엽이행(EMT, epithelial to mesenchymal transition)을 확인하기 위해, 역형성 갑상선암 세포주인 8505C에 PLX4032 약물을 투여하고 세포를 형광 염색하여 현미경 관찰을 수행하였다. 이때, 세포의 상피간엽이행 확인을 위한 대표적인 마커인 비멘틴(vimentin)과 세포의 골격 변화를 확인하기 위한 마커인 F-액틴(F-actin)에 대해 형광 염색을 실시하였다. In order to confirm the EMF (epithelial to mesenchymal transition) of PLX4032, which is a BRAF inhibitor, PLX4032 drug was administered to 8505C, an inverse thyroid cancer cell line, and cells were subjected to fluorescence staining and microscopic observation. At this time, fluorescence staining was performed on vimentin, which is a typical marker for confirming the epithelial mesenchymal transition of cells, and F-actin, which is a marker for confirming cell skeletal change.
구체적으로, 커버슬립(coverslip)을 장착시킨 4-웰 플레이트(4-well plate)에 8505C 세포를 웰 당 5×104개(cells/well)의 세포수로 시딩(seeding)하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 1 μM의 PLX4032 약물을 6시간 동안 처리하였다. 이때, 1 μM의 PLX4032 약물을 6시간 동안 처리하지 않은 세포를 대조군으로 사용하였다.Specifically, 8505C cells were seeded on a 4-well plate equipped with a coverslip at 5 × 10 4 cells / well, and cultured at 37 ° C. And cultured for 24 hours. After incubation, 1 [mu] M PLX4032 drug was treated for 6 hours. At this time, cells not treated with 1 μM of PLX4032 drug for 6 hours were used as a control.
PLX4032 약물 처리 6시간 후, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde; PFA, #P2031, Biosesang, Seongnam-si, Gyeonggi-do, Republic of Korea)를 이용하여 상온에서 30분간 세포를 고정하였다. 고정 후, 1×PBS(phosphate buffered saline; #LB001, WEGENE, Gyeongsan-si, Gyeongsangbuk-do, Republic of Korea)를 이용하여 3회 세척하였다. 세척 후, 0.5% 트립톤 X-100(Triton X-100)이 포함된 PBS 용액을 15분간 처리하여 세포막 투과성을 높이고, PBS로 3회 세척하였다. 이후, 0.1% BSA(Bovine Serum Albumin; #0332, Amresco, Solon, OH, USA)와 0.001% 소디움 아자이드(Sodium Azide; #10195-0301, JUNSEI Chemical, Tokyo, Japan)가 포함된 PBS 용액을 이용하여 30분 동안 블로킹(Blocking) 과정을 실시하였다. 블로킹 후, 1:200의 농도 비율로 희석한 빈쿨린(vinculin) 1차 항체(Mouse anti-vinculin monoclonal antibody, #ab18058, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)를 처리하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 1차 항체 반응 후, 블로킹 버퍼(Blocking buffer)로 3회 세척하고, 1:500의 농도 비율로 희석한 2차 항체(Goat Anti-Mouse IgG Antibody, (H+L) FITC Conjugated, #AP124F, Merck Millipore, Darmstadt, Germany)와 F-액틴(F-actin) 염색 시약(Acti-stain 555 phalloidin, #PHDH1-A, Cytoskeleton Inc., Denver, CO, USA)을 처리하여 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 마지막으로 PBS로 3회 세척한 후, 핵 염색 시약인 호크스트33342(Hoechst33342; #H3570, Molecular Probes, Waltham, MA, USA)를 1:300의 농도 비율로 희석하여 처리한 후 15분간 상온에서 반응시켰다. 반응 후, PBS로 3회 세척하고, 마운팅 (mounting) 과정을 거친 샘플을 LSM-700 현미경으로 촬영하였다.Cells were fixed for 30 minutes at room temperature using 4% paraformaldehyde (PFA, # P2031, Biosesang, Seongnam-si, Gyeonggi-do, Republic of Korea) after 6 hours of PLX4032 drug treatment. After fixation, the cells were washed three times with 1 × PBS (phosphate buffered saline; # LB001, WEGENE, Gyeongsan-si, Gyeongsangbuk-do, Republic of Korea). After washing, PBS solution containing 0.5% tryptone X-100 (Triton X-100) was treated for 15 minutes to increase cell membrane permeability and washed three times with PBS. Thereafter, PBS solution containing 0.1% BSA (Bovine Serum Albumin; # 0332, Amresco, Solon, OH, USA) and 0.001% sodium azide (# 10195-0301, JUNSEI Chemical, Tokyo, Japan) Followed by blocking for 30 minutes. After blocking, the vinculin primary antibody (mouse anti-vinculin monoclonal antibody, # ab18058, Abcam Inc., Cambridge, Mass., USA) diluted at a concentration of 1: 200 was added and reacted at room temperature for 30 minutes . After the primary antibody reaction, the cells were washed three times with a blocking buffer and then diluted with a secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, (H + L) FITC Conjugated, # AP124F, Merck (Acti-stain 555 phalloidin, # PHDH1-A, Cytoskeleton Inc., Denver, CO, USA) and F-actin staining reagent (Millipore, Darmstadt, Germany) Finally, the cells were washed three times with PBS, diluted with a nuclear staining reagent, Hoechst 33342 (# H3570, Molecular Probes, Waltham, MA, USA) at a concentration of 1: 300, . After the reaction, the plate was washed three times with PBS, and the sample subjected to mounting was photographed with an LSM-700 microscope.
그 결과, 하기 도 3에 나타낸 바와 같이, BRAF 억제제인 PLX4032을 투여한 경우, 세포 모양이 방추형으로 길어지고(도 3의 A), 비멘틴(vimentin) 및 F-액틴(F-actin) 형광 염색을 통해 상피간엽이행(EMT, epithelial to mesenchymal transition)에 따른 여러 세포 골격의 변화를 확인할 수 있었다(도 3의 B).As a result, as shown in FIG. 3, when PLX4032, which is a BRAF inhibitor, was administered, the cell shape became lengthened to a spindle shape (Fig. 3A), and vimentin and F- actin fluorescent staining (EMT, epithelial to mesenchymal transition) of the epithelial mesenchymal transition (Fig. 3B).
실시예Example 4: 약물 병용 투여에 따른 4: Depending on the drug combination BRAFBRAF 억제제에 대한 내성 획득Obtain resistance to inhibitors 역형성Inverse formation 갑상선암 세포주의 세포 성장능 평가 Assessment of cell growth potential of thyroid cancer cell line
BRAF 억제제에 대한 내성 획득 역형성 갑상선암 세포주 8505C의 세포 사멸을 위한 약물 조합 선정을 위해, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실시간 세포분석장비(Real Time Cell Analyzer, RTCA)를 이용하여 세포 성장능을 평가하였다.Acquired Resistance to BRAF Inhibitors Drugs for Cell Death of Degenerative Thyroid
구체적으로, BRAF 억제제인 PLX4032, c-Met 억제제인 PHA665752 및 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib) 3종의 약물을 각각 농도별로 조합하여 병용 투여하고, 약물 조합별 투여에 따른 8505C의 세포 성장능을 실시간 세포분석장비를 이용하여 확인하였다. 상기 약물 조합별 투여에 따른 8505C의 세포 성장능은 RTCA 분석에 의해 얻은 세포 지수(cell index)를 통해 평가하였다. 이때, PLX4032 : PHA665752 : 다사티닙(dasatinib) 조합별 약물 투여 농도는 각각 1 μM : 5 μM : 0.05 μM, 1 μM : 5 μM : 5 μM, 및 5 μM : 5 μM : 5 μM로 설정하여 수행하였다.Specifically, the combination of the BRAF inhibitor PLX4032, the c-Met inhibitor PHA665752, and the Src inhibitor dasatinib, in combination with each other at various concentrations, were administered concurrently, and the cell growth potential of 8505C Real - time cell analysis equipment. The cell growth potential of 8505C according to the administration of each drug combination was evaluated through cell index obtained by RTCA analysis. At this time, drug concentration of PLX4032: PHA665752: dasatinib combination was set to 1 μM: 5 μM: 0.05 μM, 1 μM: 5 μM: 5 μM, and 5 μM: 5 μM: 5 μM Respectively.
그 결과, 하기 도 4에 나타낸 바와 같이, BRAF 억제제인 PLX4032 및 c-Met 억제제인 PHA665752의 조합에 비해, BRAF 억제제인 PLX4032 및 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib)의 조합이 전반적으로 세포 성장 억제능이 강한 경향을 보였다. 또한, 병용 투여하는 두 약물을 개별로 각각 연속 투여(A→B)하는 경우보다는, 병용 투여하는 두 약물을 한 번에 동시 투여(A+B)하는 경우에 종양 억제 효능이 더 큼을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 4, the combination of BRAF inhibitor PLX4032 and the Src inhibitor dasatinib, compared to the combination of BRAF inhibitor PLX4032 and c-Met inhibitor PHA665752, Showed a strong tendency. In addition, it was confirmed that tumor suppression efficacy was greater when two drugs administered simultaneously (A + B) were administered simultaneously (A + B), rather than when each of the two drugs administered concomitantly was administered continuously (A → B).
특이적으로, 다사티닙(dasatinib)을 0.05 μM 농도로 투여한 조건하에서는 BRAF 억제제인 PLX4032 및 Src 억제제인 다사티닙의 병합 요법이 종양 억제 효과가 가장 우수하였으며, 다사티닙을 5 μM 농도로 투여한 조건하에서는 다사티닙 단독 투여와 PLX4032 및 다사티닙 병합 요법이 동일한 수준으로 종양 억제능이 가장 큼을 확인하였다.Specifically, the combination of PLA4032, a BRAF inhibitor, and dasatinib, a Src inhibitor, provided the best tumor suppression under the condition of 0.05 μM dasatinib, and the concentration of dasatinib at 5 μM Under the conditions of administration, it was confirmed that the administration of dasatinib alone and the combination therapy of PLX4032 and dasatinib showed the greatest tumor inhibitory ability at the same level.
실시예Example 5: 약물 병용 투여에 따른 5: Depending on the drug combination BRAFBRAF 억제제에 대한 내성 획득Obtain resistance to inhibitors 역형성Inverse formation 갑상선암 세포주의 세포 Cells of thyroid cancer cell line 이동능Mobile ability 평가 evaluation
BRAF 억제제에 대한 내성 획득 역형성 갑상선암 세포주 8505C의 세포 사멸을 위한 약물 조합 선정을 위해, BRAF 억제제인 PLX4032, c-Met 억제제인 PHA665752 및 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib) 3종의 각 약물 투여 조건별 종양 침습능/이동능을 평가하였다.Acquired Resistance to BRAF Inhibitors Drugs for Cell Death of Degenerative Thyroid
구체적으로, 상기 실시예 4에서 PLX4032 : PHA665752 : 다사티닙(dasatinib) 조합별 약물 투여 농도 조건 중 1 μM : 5 μM : 5 μM, 및 5 μM : 5 μM : 5 μM의 농도를 설정하여 각각 8505C 세포에 병용 투여하고, 상처치유 분석(wound healing assay)을 수행하였다. 상기 상처치유 분석을 통해 각 약물 농도별 조합에 의한 BRAF 억제제 내성 획득 역형성 갑상선암 8505C 세포의 이동능을 평가하였다.Specifically, the concentrations of 1 μM: 5 μM: 5 μM and 5 μM: 5 μM: 5 μM in the drug concentration conditions of PLX4032: PHA665752: dasatinib combination in Example 4 were set to 8505C Cells were co-administered and a wound healing assay was performed. The wound healing analysis was used to assess the ability of 8505C cells to obtain BRAF inhibitor-resistant, inverse-forming thyroid carcinoma cells in combination with each drug concentration.
보다 구체적으로, 6-웰 플레이트(6-well plate)에 8505C 세포를 웰 당 2×105개(cells/well)의 세포수로 시딩(seeding)하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 각 약물 농도별 조합을 부착된 세포의 밀집도(Cell confluence)가 70~80%에 이르면 처리하고, 플라스틱 파이펫 팁(plastic pipette tip)을 이용하여 상처(wound)를 내어 DMI6000B 현미경(DMI6000B microscope)을 이용하여 10분 간격으로 세포 침습 정도를 촬영하였다.More specifically, 8505C cells were seeded on a 6-well plate at 2 × 10 5 cells / well and incubated at 37 ° C. for 24 hours. After incubation, the combination of each drug concentration was treated at a cell confluence of 70-80%, wound using a plastic pipette tip, and stained with a DMI 6000B microscope DMI6000B microscope) at intervals of 10 minutes.
그 결과, 하기 도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군으로서 약물을 투여하지 않은 조건 및 BRAF 억제제인 PLX4032를 단독 투여한 조건에 비해 병합 요법의 작용 효과가 더 큼을 확인하였다. 한편, PLX4032(1 μM 또는 5 μM) 및 PHA665752(5 μM) 약물의 병합 요법에 비해, PLX4032(1 μM 또는 5 μM) 및 다사티닙(5 μM)의 병합 요법의 조합이 세포 이동능 억제 효과가 더 우수함을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the effect of the combination therapy was greater than the condition in which the drug was not administered as a control group and the condition in which PLX4032 alone, a BRAF inhibitor, was administered alone. On the other hand, the combination of PLX4032 (1 μM or 5 μM) and dasatinib (5 μM) combination therapy compared with the combination therapy of PLX4032 (1 μM or 5 μM) and PHA665752 (5 μM) .
실시예Example 6: 이소성( 6: ectopic ( ectopicectopic ) 동물 모델 구축) Animal model construction
상기 실시예 4 및 실시예 5에서 BRAF 억제제인 PLX4032, c-Met 억제제인 PHA665752 및 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib) 3종 약물의 농도별 조합에 따른 병용 투여에 따라 BRAF 억제제 내성 획득 역형성 갑상선암 8505C 세포의 성장능 및 침습능이 억제됨을 확인하였다. 즉, in vitro 상에서 상기 3종 약물의 농도별 조합에 따른 병용 투여에 따라 BRAF 억제제 내성 획득 역형성 갑상선암 치료 효과가 있음을 확인하였다.In Examples 4 and 5, BRAF inhibitor-resistant reverse transcription-forming thyroid cancer was induced by combination of the BRAF inhibitor PLX4032, the c-Met inhibitor PHA665752 and the Src inhibitor dasatinib, 8505C cells were inhibited in growth and invasiveness. That is, it was confirmed that the combined treatment according to the concentration combinations of the above three drugs in vitro is effective in treating BRAF inhibitor resistant reverse transcription thyroid cancer.
이에, 상기 3종 약물의 농도별 조합에 따른 병용 투여에 의해 BRAF 억제제 내성 획득 역형성 갑상선암의 치료 효과가 있는지를 in vivo 상에서 확인하기 위해 이소성(ectopic) 동물 모델을 구축하였다(도 6).Thus, an ectopic animal model was constructed to confirm in vivo whether the treatment effect of BRAF inhibitor-resistant reverse transverse thyroid cancer was effected by combination administration according to combinations of concentrations of the above three drugs (Fig. 6).
구체적으로, 1×106개의 BRAF 억제제 내성 획득 역형성 갑상선암 세포주인 8505C를 10% FBS(Fetal Bovine Serum; GIBCO, Carlsbad, CA, USA)가 포함된 RPMI1640(GIBCO) 세포 성장 배지 100㎕에 분산시킨 후, 4주령의 Balb/c 누드 마우스 20마리의 대퇴부 피하에 주입하여 종양을 형성시켰다. 종양 형성 시기는 세포 주입 10일 후이며, 종양 크기가 약 200㎣에 도달한 28일(3주차)부터 마우스를 케이지(cage) 당 각각 5마리씩 무작위 분류하여 그룹을 나누고, 그룹별 조건에 따라 약물을 투여하였다. 각 그룹별 약물 투여 조건은 하기 표 1과 같다. 이때, 약물 투여 간격은 주 5회로 실시하였으며, 약물은 마우스의 복강에 투여(Intraperitoneal injection) 하였다. 2주간 총 10회 약물을 투여한 후, 약물 투여를 중지하였으며, 9주까지 각 그룹별 종양 크기 및 부피를 측정하였다.Specifically, 1 × 10 6 BRAF inhibitor-resistant reverse transcription-forming thyroid
실시예Example 7: 약물 병용 투여에 따른 종양 성장 억제 효과 평가 7: Assessment of tumor growth inhibition effect by drug combination
상기 실시예 6에서 구축한 이소성(ectopic) 동물 모델을 통해 수득한, 약물 조합 조건별 종양 크기 및 부피 정보를 분석하여 종양 억제능을 평가하였다. 이때, 카플란 메이어(Kaplan meier) 생존 곡선은 종양 크기가 500㎣에 도달했을 때를 기준으로 프리즘 프로그램(Prism program)을 이용하여 도식화하였다. Tumor inhibitory potency was evaluated by analyzing tumor size and volume information for each drug combination condition obtained through the ectopic animal model constructed in Example 6 above. At this time, the survival curves of Kaplan Meier were plotted using a prism program based on when the tumor size reached 500 kPa.
종양 억제능을 평가한 결과, 하기 도 7에 나타낸 바와 같이, BRAF 억제제인 PLX4032 및 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib) 병용 투여군이 약물 투여 기간 중 종양 크기 및 부피가 가장 작았으며, 약물 병용 투여 중단 이후에도 종양 성장이 가장 둔화 되어 있음을 확인하였다.As shown in FIG. 7, as shown in FIG. 7, the tumor size and volume of the BRAF inhibitor PLX4032 and the Src inhibitor, dasatinib, were the smallest during the administration of the drug, and even after discontinuation of the drug combination It was confirmed that tumor growth was the slowest.
실시예Example 8: 약물 병용 투여에 따른 종양 특성 8: Tumor characteristics due to drug administration 영상학적Imaging 평가 evaluation
약물 병용 투여에 따른 종양 특성을 영상학적으로 평가하기 위해, 상기 실시예 6에서 제작한 이소성(ectopic) 동물 모델 중 각 약물 조합 투여군별로 대표 마우스 한 마리를 선정하였다. 9.4T MRI(Bruker Biospec 9.4T Animal MRI system)를 이용하여 선정한 각 그룹의 대표 마우스에 대한 T2 관상면(coronal), T2 축(axial) 영상 이미지를 확보하고 DWI(diffusion weighted image) 촬영 기법에 의해 얻어진 ADC(apparent diffusion coefficient) 값을 종양 면적/부피 대비로 MIPAV 프로그램을 통해 산출하였다. ADC 값은 종양 내 세포 충실도를 의미하는 것으로, 물 분자 자체가 가진 역학적 에너지에 의해 불규칙하게 움직이는 현상에 의한 확산 정도를 신호 강도로 나타내며, 약물의 효과를 간접적으로 볼 수 있는 영상학적 평가 방법으로 이용된다.In order to evaluate the tumor characteristics according to the drug combination administration, a representative mouse was selected for each drug combination administration group among the ectopic animal models prepared in Example 6 above. T2 coronal and axial images of representative mice of each group selected using 9.4T MRI (Bruker Biospec 9.4T Animal MRI system) were acquired and analyzed by diffusion weighted image (DWI) The obtained apparent diffusion coefficient (ADC) value was calculated by MIPAV program in terms of tumor area / volume ratio. The ADC value refers to the cell fidelity in the tumor. The signal intensity indicates the degree of diffusion due to the phenomenon of irregular movement due to the mechanical energy of the water molecule itself. The ADC value is used as an imaging evaluation method to indirectly see the effect of the drug do.
약물 병용 투여에 따른 종양 특성을 영상학적으로 평가한 결과, 하기 도 8에 나타낸 바와 같이, BRAF 억제제인 PLX4032 및 Src 억제제인 다사티닙(dasatinib) 병용 투여군의 경우, MRI 영상에 의해 얻어진 종양의 면적이 가장 작은 것으로 확인되었으며, 반대로 ADC 값은 가장 큰 것으로 확인되었다.As shown in FIG. 8, when the combination of PLX4032, which is a BRAF inhibitor, and dasatinib, which is a Src inhibitor, was administered, the area of the tumor obtained by MRI imaging , And the ADC value was found to be the largest.
Claims (14)
A pharmaceutical composition for use in combination with a BRAF inhibitor for the treatment of anaplastic thyroid cancer characterized by a BRAF V600E mutation comprising an Src inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the Src inhibitor and the BRAF inhibitor are each administered as a single drug when administered concomitantly.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the inverse thyroid cancer characterized by a BRAF V600E mutation is an inverse thyroid cancer that is resistant to a BRAF inhibitor.
The pharmaceutical composition of claim 1 wherein the inverse formed thyroid carcinoma characterized by a BRAF V600E mutation is in an increased expression of Src protein following administration of a BRAF inhibitor.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the Src inhibitor is selected from the group consisting of dasatinib, saracatinib, bosutinib, and quercetin.
6. The pharmaceutical composition according to claim 5, wherein the Src inhibitor is dasatinib.
The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the BRAF inhibitor is selected from the group consisting of vemurafenib (PLX4032), PLX4720, dabrafenib (GSK-2118436), Sorafenib, and CEP-32496 .
8. The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the BRAF inhibitor is vemurafenib (PLX4032).
Src 단백질이 과발현된 경우, 역형성 갑상선암의 치료를 위해 Src 억제제와 BRAF 억제제를 병용 투여하도록 정보를 제공하는 것을 포함하는,
BRAF V600E 돌연변이를 특징으로 하는 역형성 갑상선암의 치료용 약물 선택을 위한 정보 제공 방법.
The level of Src expression was determined from biological specimens isolated from patients with anaplastic thyroid cancer,
Comprising administering a combination of a Src inhibitor and a BRAF inhibitor for the treatment of < RTI ID = 0.0 > inverse < / RTI > thyroid cancer when the Src protein is overexpressed,
Methods for providing information for drug selection for the treatment of inverse thyroid cancer characterized by a BRAF V600E mutation.
10. The method of claim 9, wherein in the case of a patient with inverse thyroid cancer, the expression level of the Src protein is increased after the administration of the BRAF inhibitor.
10. The method according to claim 9, wherein the biological sample is blood, plasma, serum, urine, feces, saliva, tears, spinal fluid, cell or tissue.
10. The method of claim 9, wherein the Src inhibitor is selected from the group consisting of dasatinib, saracatinib, bosutinib, and quercetin.
The method of claim 9, wherein the BRAF inhibitor is selected from the group consisting of vemurafenib (PLX4032), PLX4720, dabrafenib (GSK-2118436), Sorafenib, and CEP- Delivery method.
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Non-Patent Citations (4)
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