KR20190066811A - DNA aptamer binding to ODAM(Odontogenic Ameloblast-Associated protein) with specificity and Uses thereof - Google Patents
DNA aptamer binding to ODAM(Odontogenic Ameloblast-Associated protein) with specificity and Uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR20190066811A KR20190066811A KR1020170166589A KR20170166589A KR20190066811A KR 20190066811 A KR20190066811 A KR 20190066811A KR 1020170166589 A KR1020170166589 A KR 1020170166589A KR 20170166589 A KR20170166589 A KR 20170166589A KR 20190066811 A KR20190066811 A KR 20190066811A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- odam
- aptamer
- nucleic acid
- associated protein
- dna
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/18—Dental and oral disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 오담(ODAM, Odontogenic Ameloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 오담에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 서로 다른 핵산 앱타머와 이를 이용한 오담 검출방법 및 검출용 조성물, 센서, 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a nucleic acid aptamer specifically binding to odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) and a use thereof, and more particularly, to a nucleic acid aptamer which specifically binds to odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) And a composition, a sensor and a kit for detection.
오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)은 잇몸(치은)의 접합상피가 치아에 부착하는데 있어 필수적인 단백질이다. 잇몸에 치주염이 발생하여 치아와 상피간의 부착이 상실되면, 상피에 있던 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 이 치주낭으로 유리되어 구강 내 치은열구액 및 타액에서 검출된다. 이를 바탕으로 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)을 초기 잇몸질환 (치주질환, 임플란트 주위염)을 조기에 진단할 수 있는 초기 치주염 특이 바이오마커로 활용하고자 한다(KR 10-2016-0060288). 치주염은 환자 스스로의 자각증상이 늦게 나타나는 만성질환으로, 환자가 느끼지 못하는 사이에 염증이 진행되어 치아 주변 조직의 심한 파괴를 야기한다(Lee et al., J Biol Chem. Vol. 290(23), PP. 14740-53, 2015). 따라서 발치가 요구되는 상태로 뒤늦게 치과에 내원하는 경우가 흔하며 이는 임플란트 및 틀니 치료를 요구하여 막대한 경제적 손실을 가져온다. 이에 대해 현재 사용되고 있는 진단 방법은 질환의 결과만을 보여줄 수 있기 때문에 현재 질환의 활성화 상태를 보여줄 수는 없으며, 더불어 높은 거짓 양성을 보이는 한계점을 지닌다. 따라서 치과 혹은 다른 내과 영역에서의 이용이 용이한 형태의 진단 도구, 더 나아가서는 환자 스스로 집에서 손쉽게 자가 진단할 수 있는 진단 키트의 개발이 필요한 실정이다. Odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) is an essential protein in the connective epithelium of the gum (gingiva) to adhere to teeth. If periodontal disease occurs in the gum and adhesion between the tooth and epithelium is lost, odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) is released into the periodontal pouch and detected in the oral gingival crevicular fluid and saliva. Based on this, ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein) is used as an early periodontal disease-specific biomarker that can diagnose early periodontal disease (periodontal disease, implant periosteum) early (KR 10-2016-0060288). Gingival inflammation is a chronic disease in which the patient's own subjective symptoms are delayed, and the inflammation progresses while the patient does not feel, resulting in severe destruction of the tissues surrounding the tooth (Lee et al., J Biol Chem. Vol. Pp. 14740-53, 2015). Therefore, it is very common to require dentures in a delayed state in a state requiring extraction, which causes great economic loss by requiring implant and denture treatment. The currently used diagnostic method can not show the current state of the disease because it can only show the result of the disease, and it also has a limit showing high false positive. Therefore, it is necessary to develop a diagnostic tool that is easy to use in the dental or other medical field, and further, a self-diagnostic kit that can be easily self-diagnosed at home.
앱타머(aptamer)는 1012~14 정도의 다양성을 가지는 랜덤 핵산 라이브러리로부터 얻어지는 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA 분자 구조체를 말한다. 또한, 앱타머는 센서 분야에서 이용되는 기존의 감지물질인 항체와는 달리 핵산구조체 이므로 열 안정성이 우수하며, 시험관내(in vitro)에서 합성되기 때문에, 동물이나 세포가 따로 필요하지 않아 생산 비용 면에서도 경제적이며, 타겟 물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자 물질부터 환경호르몬, 항생제, 잔류 의약품 등의 저분자 유기화학 물질, 박테리아, 바이러스 등의 다양한 타겟에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 따라서 다양한 타겟 물질에 대한 앱타머가 만들어지고 있으며, 표적 물질과 특이성과 강한 친화도를 가지고 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약 개발, 약물 전달 시스템 그리고 바이오센서 등에 응용하는 많은 연구가 이루어지고 있다. 따라서, 앱타머는 인체 유래물 내 극미량의 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 농도 측정에 매우 적절한 물질이며, 이를 활용한 나노 바이오 기술을 통해 치주염 관련 질환과 연관된 특정 단백질을 검출하는데도 응용할 수 있다.Aptamers are single-stranded DNA or RNA molecular structures that have high specificity and affinity for a particular target obtained from a random nucleic acid library of about 10 12 to 14 diversity. In addition, aptamers are nucleic acid constructs, unlike antibodies, which are used in the field of sensors, and therefore have excellent thermal stability. Since they are synthesized in vitro, they do not require animals or cells, Economical and unlimited target material, it is possible to synthesize aptamers for various targets such as biomolecular substances such as proteins and amino acids, low molecular organic chemicals such as environmental hormones, antibiotics, residual drugs, bacteria and viruses. Therefore, aptamers for various target substances are being made, and due to the characteristics of aptamers that combine with target substances, specificity and strong affinity, a lot of studies recently applied aptamers to new drug development, drug delivery systems and biosensors . Thus, aptamers are very suitable for the measurement of ODAM (Odontogenic Ameloblast-Associated protein) concentration in human body, and nanobiotechnology using this can be applied to the detection of specific proteins associated with periodontal disease-related diseases.
앱타머 개발 방법에 있어서 가장 중요한 요소는 타겟물질에 결합한 DNA (혹은 RNA)와 결합하지 않은 DNA를 구별하는 것인데, 이를 위하여 타겟을 고정하거나 DNA 랜덤 라이브러리를 고정하여 DNA를 구별하는 방법이 시도되었다. 그러나 이러한 고정화 방식은 고정화 수율이 낮고 고정화 수율 자체를 분석하는데 많은 비용과 시간이 소모된다. 또한 고정화에 사용되는 분리용 물질 (자성 비드, 컬럼 등)에 DNA가 비특이적으로 결합할 가능성을 완전히 배제할 수 없으며 고정된 타겟에 결합한 DNA를 다시 분리해내는 과정에서 DNA 풀의 손실이 일어날 수 있다는 것 등이 여전히 문제이다. 그 외에도 중금속 이온 등은 고정화 자체가 어려워 고정화 방식을 이용한 앱타머의 합성은 타겟 선정에도 제약이 있을 수 있다. 이에, 고정화 방식의 한계를 극복하는 비고정화 방식의 앱타머 개발 기술이 시도되었다. 그러나 비고정화 방식의 미세전자기계 시스템 (MEMS), 모세관 전기이동 시스템 (Capillary Electrophoresis) 기술은 고가의 장비, 장치 사용의 복잡성, 숙련된 인력의 필요성 드이의 문제점이 나타났다. 한편, 그래핀은 2차원 구조의 탄소 구조체이므로 열안정성, 전기적 특성 및 강도가 매우 우수하며, 단일가닥 DNA의 염기 부분과 π-스태킹을 통해 결합하기 때문에 이런 특성을 응용한 광범위한 연구가 진행되고 있다.The most important factor in the development of aptamer is to distinguish between DNA (or RNA) bound to a target substance and DNA that is not bound. To this end, a method has been attempted in which a target is fixed or a DNA random library is fixed to distinguish DNA. However, such an immobilization method has a low immobilization yield and requires much time and cost to analyze the immobilization yield itself. In addition, the possibility of non-specific binding of DNA to the separating material (magnetic beads, columns, etc.) used for immobilization can not be totally excluded, and loss of DNA pool may occur in the process of separating DNA bound to a fixed target It is still a problem. In addition, heavy metal ions are difficult to immobilize. Therefore, synthesis of aptamer using immobilization method may have a limitation in target selection. Accordingly, an attempt has been made to develop a non-fixing type aptamer for overcoming the limitation of the immobilization method. However, MEMS and Capillary Electrophoresis technology of non-cleaning type showed problems of expensive equipments, complexity of device use, and necessity of skilled manpower. On the other hand, since graphene is a two-dimensional carbon structure, it has excellent thermal stability, electrical characteristics and strength, and is bound to a base portion of single-stranded DNA through π-stacking. .
FRET(fluorescence resonance energy transfer) 진단법은 그 준비의 편리성과 간단한 작동법으로 인해 앱타머의 작동여부를 빠르고 간단하게 확인하는데 적합하다. 그래핀옥사이드는 소광물질(quencher)로서 FAM이라는 형광물질과 특정 거리 내에 존재할 때 520nm 근처에서 방출하는 FAM의 빛 에너지를 흡수한다. 이러한 현상을 FRET이라고 하며 이 실험은 다음과 같은 원리로 이루어진다. FAM으로 단일 가닥 DNA의 3’끝을 표지하고 이를 그래핀옥사이드와 반응시킨다. 그래핀옥사이드는 단일 가닥 DNA와 π-π 결합을 통해 비특이적으로 결합하고 이에 의해 FAM의 형광은 그래핀옥사이드에 의해 소광된다. 이 후 타겟을 넣어주면 단일 가닥 DNA와 타겟 간의 친화도가 그래핀옥사이드와의 친화도보다 큰 경우에 DNA가 그래핀 옥사이드로부터 떨어져 나와 다시 FAM의 형광이 나타난다. 반면 DNA와 타겟 사이 친화도가 더 낮은 경우에는 표적 단백질이 그래핀옥사이드에서 DNA 를 분리하지 못해 형광은 소광된 상태를 유지한다. 결합력의 차이가 형광의 방출량 차이로 나타나는 이러한 특성을 바탕으로 형광을 측정함으로써 단일 가닥 DNA과 타겟 간의 결합력을 확인할 수 있다(Zhu Y et al., ACS Appl Mater Interfaces, Vol 7(14, pp. 7492-7496, 2015). 또한, 앱타머를 사용하여 타겟의 유무를 판단하는데도 사용할 수 있다. The fluorescence resonance energy transfer (FRET) diagnosis method is suitable for quick and simple checking of the operation of the aptamer due to its convenient preparation and simple operation. Graphene oxide is a quencher that absorbs the fluorescent energy of FAM and the light energy of FAM that emits near 520 nm when it is within a certain distance. This phenomenon is called FRET, and this experiment consists of the following principle. The 3 'end of single stranded DNA is labeled with FAM and reacted with graphene oxide. Graphenol oxide nonspecifically binds to single-stranded DNA through a π-π bond, whereby the fluorescence of FAM is quenched by graphene oxide. Then, when the target is added, the affinity between the single strand DNA and the target is greater than the affinity with the graphene oxide, the DNA is separated from the graphene oxide and fluorescence of FAM appears again. On the other hand, if the affinity between the DNA and the target is lower, the target protein can not separate DNA from the graphene oxide and the fluorescence remains in the extinction state. Based on this characteristic, the difference in binding force is due to the difference in fluorescence emission, fluorescence can be measured to confirm the binding force between the single strand DNA and the target (Zhu Y et al., ACS Appl. Interfaces, Vol 7 -7496, 2015), and can also be used to determine the presence or absence of a target using an aptamer.
SPR(surface plasmon resonance) 진단법은 매우 민감한 진단법으로 타겟의 존재 양을 민감하게 확인하는데 유용하다. SPR 칩의 금속 표면에 일정 질량 이상이 결합하게 되면 이는 금속표면에 형성되는 플라스몬(plasmon)을 동요시켜 공명 파장 변화를 일으키는데 이는 결과적으로 표면 위 굴절률 변화로 나타난다. SPR 칩 위에 스트렙타아비딘(streptavidin)-비오틴(biotin) 결합을 이용해 앱타머를 고정시키고 그 위로 타겟을 흘려주면 앱타머와 결합한 타겟의 양에 비례하여 SPR 신호가 증가한다. 이러한 특성을 바탕으로 SPR을 통해 타겟 단백질을 정량적으로 검출할 수 있다(Lee et al., Anal CHem, Vol 80(8), pp. 2867-2873, 2008). 뿐만 아니라, 하나의 타겟 단백질의 서로 다른 부위 혹은 여러 개의 동일한 부위에 결합할 수 있는 앱타머 듀오를 스크리닝하고 이를 타겟 검출법에 활용함으로써, 타겟에 대한 앱타머의 민감도를 향상시킬 수 있다.Surface plasmon resonance (SPR) diagnosis is a very sensitive diagnostic method and is useful for sensitively detecting the presence of a target. When a certain mass or more is bonded to the metal surface of the SPR chip, the plasmon formed on the metal surface is fluctuated to cause a resonance wavelength change, resulting in a change in refractive index on the surface. Immobilizing the aptamer using streptavidin-biotin binding on the SPR chip and flowing the target over it will increase the SPR signal in proportion to the amount of target associated with the aptamer. Based on these properties, target proteins can be quantitatively detected by SPR (Lee et al., Anal. Chem., Vol. 80 (8), pp. 2867-2873, 2008). In addition, the sensitivity of the aptamer to the target can be improved by screening the aptamer duo capable of binding to different sites or several identical sites of one target protein and using it for target detection.
이에, 본 발명자들은 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 검출 방법의 개선을 위해 예의 연구 노력한 결과, 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 DNA 앱타머를 SELEX를 통해 개발하였다. 또한, 상기 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 포함하는 SPR 칩을 제조하여 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made extensive efforts to improve the detection method of ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein). As a result, the inventors of the present invention have found that a DNA construct that has a specifically high affinity for odontogenic AMELoblast- Developed apt tamer through SELEX. In addition, it has been confirmed that ODRAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein) can be efficiently detected by preparing an SPR chip containing a DNA aptamer capable of binding specifically to ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein) Thus completing the present invention.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.The information described in the Background section is intended only to improve the understanding of the background of the present invention and thus does not include information forming a prior art already known to those skilled in the art .
본 발명의 목적은 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a nucleic acid aptamer capable of specifically detecting ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein) and its use.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 18 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는, 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a nucleic acid aptamer which specifically binds to Odontogenic Ameloblast-Associated Protein (ODAM) represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 18.
본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머를 이용한 오담의 검출방법을 제공한다. The present invention also provides a method for detecting odor using the nucleic acid aptamer.
본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 오담 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for diagnosing orphan-related diseases comprising the nucleic acid aptamer.
본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머가 고상담체에 고정되어 있는 복합체를 제공한다. The present invention also provides a complex wherein the nucleic acid aptamer is immobilized on a solid support.
본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머 또는 상기 복합체를 포함하는 오담 검출용 조성물, 센서, 및 검출용 키트를 제공한다. The present invention also provides compositions, sensors, and kits for detecting mutations that contain the nucleic acid aptamer or the complex.
본 발명에 따르면 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 이용하여 체내의 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)을 보다 간편하게 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 오담 검출 방법 및 장치에 이용하여 극소량의 오담이 포함되어 있는 시료에서 타겟을 선택적으로 측정할 수 있다. 따라서, 인간의 혈중 내에 존재하는 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 농도를 쉽고 빠르게 측정함으로써 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 관련 질병 진단에 유용하다.According to the present invention, ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein) can be more easily detected using a DNA aptamer capable of binding specifically to odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM). In addition, the target can be selectively measured in a sample containing a very small amount of saturating agent by using the method of the present invention and the apparatus for detecting and detecting a DNA aptamer of the present invention. Therefore, it is useful for diagnosing ODAM (odontogenic ameloblast-associated protein) -related disease by measuring the odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) concentration in human blood easily and quickly.
도 1은 앱타머를 이용한 FRET 분석법을 나타낸 것이다.
도 2는 그래핀옥사이드를 이용하여 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머 제조 과정의 모식도이다.
도 3은 selection round 에서부터 얻어진 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 결합하는 ssDNA 의 양이 증가함을 보여주는 그래프이다
도 4 내지 도 21은 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 18의 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 22는 DNA 앱타머의 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 대한 친화도에 대한 FRET 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 DNA 앱타머 OD 5R-35 및 OD 5R-64를 이용한 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)과 타액 내에 가장 많이 존재하며 오담 단백질과 구분되어야 할 대표 단백질인 알파 아멜라아제(alpha amylase)와의 앱타머 반응정도를 SPR 로 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 DNA 앱타머 OD 5R-64를 이용한 다양한 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 농도에 대해 OD 5R-35 앱타머 듀오를 샌드위치 방식으로 반응시킨 후 SPR 분석 결과를 두 가지 그래프로 나타낸 것이다. Figure 1 shows a FRET assay using an aptamer.
2 is a schematic diagram of a DNA aptamer preparation process capable of specifically binding ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein) using graphene oxide.
FIG. 3 is a graph showing that the amount of ssDNA binding to odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) obtained from the selection round is increased
4 to 21 show the secondary structure of a DNA aptamer capable of specifically binding to ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein) of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 18 according to the present invention.
FIG. 22 shows the results of FRET analysis of the affinity for ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein) of DNA aptamer.
FIG. 23 is a graph showing the results of a comparison between ODAM (Odontogenic Ameloblast-Associated protein) using
FIG. 24 shows the results of SPR analysis in two graphs after the
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 GO-SELEX 프로세스를 이용하여 선별하였다. 그 결과, 서열번호 1 내지 18의 염기서열로 표시되는 핵산 앱타머가 상기 오담에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 오담에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 GO-SELEX 프로세스를 이용하여 선별한 것이다.According to one aspect of the present invention, a DNA aptamer capable of specifically binding to odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) was selected using the GO-SELEX process. As a result, it was confirmed that the nucleic acid aptamer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1 to 18 specifically binds to the above mutant. That is, in one embodiment of the present invention, a DNA aptamer capable of specifically binding to oram is selected using the GO-SELEX process.
본 발명의 용어 “GO-SELEX 프로세스”란 임의적으로 합성된 DNA 또는 RNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA 또는 RNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법(J.W. Park, R.Tatavarty, D.W.Kim, H.T.Jung and M.B.Gu (2012), Immobilization-free screening of aptamers assisted by graphene oxide, Chemical Communications, 48,15,2071-2073)을 말한다.The term " GO-SELEX process " according to the present invention is a method of selectively extracting DNA or RNA having a high binding capacity for a specific molecule from an arbitrarily synthesized DNA or RNA assembly to obtain a DNA binding sequence of the molecule Immobilization-free screening of aptamers assisted by graphene oxide, Chemical Communications, 48, 15, 2071-2073).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 18 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는, 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머에 관한 것이다.Accordingly, in one aspect, the present invention relates to a nucleic acid aptamer that specifically binds to Odontogenic Ameloblast-Associated Protein (ODAM) represented by any one of SEQ ID NOS: 1-18.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 앱타머가 RNA인 경우에는 상기 핵산서열에서 T는 U임을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, when the nucleic acid aptamer is RNA, T is U in the nucleic acid sequence.
본 발명의 핵산 앱타머는 GO-SELEX 공정에 의해 선택된, 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합하는 임의의 염기서열의 핵산 앱타머일 수 있다.The nucleic acid aptamer of the present invention may be a nucleic acid aptamer of any base sequence that specifically binds to Odontogenic Ameloblast-Associated Protein (ODAM) selected by the GO-SELEX process.
더욱 구체적으로, 본 발명의 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합할 수 있는 상기 핵산 앱타머는 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:More specifically, the nucleic acid aptamer capable of specifically binding to an ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein) of the present invention can be produced by a method comprising the steps of:
a) 양끝에 PCR용 프라이머 영역을 포함하고 중앙에 30 내지 50개의 임의의 염기를 가지는 단일가닥 핵산 풀 (pool)과 카운터 타겟물질을 완충용액에서 혼합하여 상온에서 결합을 유도하는 단계;a) mixing a single-stranded nucleic acid pool having a primer region for PCR at both ends with 30 to 50 arbitrary bases in the center and a counter target material in a buffer solution to induce binding at room temperature;
b) 상기 혼합액에 그래핀을 첨가하여 카운터 타겟물질에 결합하지 않는 단일가닥 핵산이 그래핀 표면에 흡착하도록 유도하는 단계; b) adding graphene to the mixed solution to induce a single-stranded nucleic acid not binding to the counter target material to adsorb on the graphene surface;
c) 상기 카운터 타겟물질에 결합하는 타겟 비특이적인 단일가닥 핵산을 제거하고, 오담을 첨가하여 그래핀에 결합된 타겟 특이적인 단일가닥 핵산에 대해 타겟에 의한 배좌 변위(conformational change)를 유발시켜 그래핀으로부터 타겟 특이적인 앱타머를 분리하는 단계; c) removing the target nonspecific single-stranded nucleic acid binding to the counter target material, and adding an uncertainty to cause a conformational change by the target on the target-specific single-stranded nucleic acid bound to the graphene, Separating a target-specific aptamer from the target-specific aptamer;
d) 상기 단계에서 얻은 타겟물질에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산에 대해 상기 PCR용 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭시키는 단계; 및 d) performing PCR by using the primer for PCR on a single-stranded nucleic acid that specifically binds to the target substance obtained in the above step, and amplifying; And
e) 상기 단계에서 얻은 PCR 생산물로부터 단일가닥 핵산을 분리하고 상기 단일가닥 핵산을 a) 단계의 혼합액에 첨가하여 그래핀 기반 선별과정을 반복 수행하는 단계. e) separating the single-stranded nucleic acid from the PCR product obtained in the step and adding the single-stranded nucleic acid to the mixed solution of step a) to repeat the graphene-based screening process.
상기 핵산 앱타머 제조방법의 d) 단계에서, 프라이머 쌍 중 하나에 플루오레세인(fluorescein)이 붙여진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 전기영동을 통해 기 변성된 단일가닥 DNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the step d) of the method for preparing a nucleic acid aptamer, PCR is performed using a primer having fluorescein attached to one of the primer pairs, followed by separation of the unmodified single strand DNA through electrophoresis And further comprising
본 발명은 다른 관점에서, 본 발명의 핵산 앱타머를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)의 검출방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a method for detecting Odontogenic Ameloblast-Associated Protein (ODAM) comprising contacting a nucleic acid aptamer of the present invention with a sample.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 뇨로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 시료는 포유류, 바람직하게는 인체에서 분리된 것으로, 최소 침습으로 확보 가능한 시료 또는 분비체액, in vitro 세포배양액 성분 시료 등 오담을 포함하고 있을 수 있는 시료이면, 상기에 한정되지 않음은 자명하다. 보다 바람직하게는 타액 일 수 있다. In the present invention, the sample may be selected from the group consisting of tissue, cell, blood, serum, plasma, saliva, sputum and urine, but is not limited thereto. It is obvious that the sample is not limited to the above, provided that it is a sample separated from a mammal, preferably a human body, a sample or secretory fluid which can be obtained by minimal invasion, a sample of an in vitro cell culture fluid component, and the like. More preferably, Lt; / RTI >
본 발명에 있어서, 상기 검출은 표면 플라스몬 공명(SPR, Surface Plasmon Resonance), FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 및 금 나노입자 기반 색도 분석으로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 검출하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the detection may be performed by a method selected from the group consisting of Surface Plasmon Resonance (SPR), Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) and gold nanoparticle-based chromaticity analysis , But is not limited thereto.
본 발명에서 상기 검출은 금 나노입자 표면을 변형하여 앱타머를 금 나노입자 표면에 공유결합 등으로 고정하여 타겟 물질이 있을 때 두 개 이상의 금 나노입자 거리가 서로 가까워짐으로 인해 응집(aggregation)이 일어나서 금 나노입자 용액의 색이 붉은색에서 푸른색 계열로 변하는 특징을 이용하거나, 변형되지 않은 금 나노입자 표면에 앱타머가 물리적으로 흡착되어 있다가 타겟 물질이 있을 때 흡착되어 있던 앱타머과 타겟과의 결합으로 인해 금 나노입자의 표면에서 떨어져 나오는 현상에 의해 색이 변하는 특성을 이용하여 오담을 검출할 수 있다. In the present invention, the detection is performed by modifying the gold nanoparticle surface to fix the aptamer to the gold nanoparticle surface by covalent bonding or the like so that aggregation occurs due to the fact that two or more gold nanoparticle distances approach each other when the target substance is present The gold nanoparticle solution changes its color from red to blue, or when the aptamer is physically adsorbed on the surface of the undoped gold nanoparticles and when the target material is present, , It is possible to detect the defect by using the property that the color changes due to the phenomenon that the gold nanoparticles are separated from the surface.
상기 검출은 또한, 금 칩(gold chip)을 이용한 자기공명분석 SPR (Surface Plasmon Resonance) 장비로 오담을 검출할 수 있다. 즉, 금 칩 (gold chip)에 앱타머를 공유결합 등으로 고정하여 타겟 물질이 있을 때 증가하는 response unit 값을 측정하는 방식을 이용하여 오담을 검출할 수 있다. The detection can also detect an impairment with magnetic resonance analysis SPR (Surface Plasmon Resonance) equipment using a gold chip. That is, it is possible to detect an impairment by using a method of measuring an increasing response unit value when a target material is present by fixing an aptamer to a gold chip by covalent bonding or the like.
상기 검출은 또한, 그래핀옥사이드 기반 FRET 방법으로 오담을 검출할 수 있다. 즉, 그래핀옥사이드는 소광물질(quencher)로서 FAM이라는 형광물질과 특정 거리 내에 존재할 때 520nm 근처에서 방출하는 FAM의 빛 에너지를 흡수한다. 이러한 현상을 FRET이라고 하며 이 실험은 다음과 같은 원리로 이루어진다. FAM으로 단일 가닥 DNA(본원 발명의 앱타머)의 3’끝을 표지하고 이를 그래핀옥사이드와 반응시킨다. 그래핀옥사이드는 단일 가닥 DNA(본원 발명의 앱타머)와 π-π 결합을 통해 비특이적으로 결합하고 이에 의해 FAM의 형광은 그래핀옥사이드에 의해 소광된다. 이 후 시료 내 오담이 존재할 경우, 단일 가닥 DNA(본원 발명의 앱타머)와 오담 간의 친화도가 그래핀옥사이드와의 친화도보다 큰 경우에 DNA가 그래핀 옥사이드로부터 떨어져 나와 다시 FAM의 형광이 나타난다. 반면 DNA(본원 발명의 앱타머)와 오담 사이 친화도가 더 낮은 경우에는 오담이 그래핀옥사이드에서 DNA 를 분리하지 못해 형광은 소광된 상태를 유지한다. 결합력의 차이가 형광의 방출량 차이로 나타나는 이러한 특성을 바탕으로 형광을 측정함으로써 단일 가닥 DNA과 오담 간의 결합력을 확인할 수 있다. The detection can also detect an impairment by the graphene oxide-based FRET method. In other words, graphene oxide is a quencher that absorbs the light energy of FAM, which emits near 520 nm when it is within a certain distance from a fluorescent substance called FAM. This phenomenon is called FRET, and this experiment consists of the following principle. The 3 'end of single stranded DNA (an aptamer of the present invention) is labeled with FAM and reacted with graphene oxide. Graphene oxide binds nonspecifically with a single stranded DNA (aptamer of the present invention) through a pi-pi bond, whereby the fluorescence of FAM is quenched by graphene oxide. When there is an opacity in the sample, when the affinity between single-stranded DNA (aptamer of the present invention) and Odame is higher than that of graphene oxide, DNA is separated from graphene oxide and fluorescence of FAM appears again . On the other hand, when the affinity between DNA (the aptamer of the present invention) and Odame is lower, the DNA can not be separated from the opaque graphene oxide, and the fluorescence remains in the extinction state. The binding force between single strand DNA and audam can be confirmed by measuring fluorescence based on the difference in binding force between fluorescence emission amount.
본 발명의 앱타머는 이 기술분야에서 이미 공지된 방법에 의해 화학 합성할 수도 있다.The aptamers of the present invention may be chemically synthesized by methods well known in the art.
본 발명의 핵산 앱타머는, 오담에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기 (예를 들어, 리보오스나 디옥시리보스)가 수식된 것이어도 좋다. 당잔기에서 수식되는 부위로서는, 예컨대 당잔기의 2'부위, 3'부위 및/또는 4'부위의 산소원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대 플루오로화, O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예, -NH)를 들 수 있다. 이러한 당잔기의 변형은, 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다 (Sproat et al.,(1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145). The nucleic acid aptamer of the present invention may be one in which a sugar residue (for example, ribose or deoxyribose) of each nucleotide is modified so as to improve binding, stability and the like to orgasm. Examples of the moiety modified in the sugar residue include those obtained by substituting oxygen atoms at the 2'-, 3'-and / or 4'-positions of the sugar residue with other atoms. Examples of the types of the formulas include fluorination, O-alkylation (e.g. O-methylation, O-ethylation), O-allylation, S-alkylation (e.g., S-methylation, S- , And amination (e.g., -NH). Such modification of sugar residues can be carried out by a method known per se (Sproat et al., (1991) Nucle. Acid Res 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145).
본 발명의 핵산 앱타머는 또한 오담에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산염기 (예를 들면, 푸린, 피리미딘)가 변형 (예를 들면, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 변형으로서는, 예컨대, 5부위 피리미딘 변형, 6 및/또는 8부위 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환을 들 수 있다. The nucleic acid aptamer of the present invention may also be a nucleic acid base (for example, purine, pyrimidine) modified (for example, chemically substituted) so as to enhance the binding to the oram. Such modifications include, for example, a 5-site pyrimidine modification, a 6 and / or 8-site purine modification, a modification in an exocyclic amine, a substitution with 4-thiouridine, a 5-bromo or 5-iodo- And substitution with a silyl group.
또한, 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성을 갖도록, 본 발명의 핵산 앱타머에 포함되는 인산기가 변형되어 있어도 좋다. 예컨대, P(0)0기가, P(0)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR2(아미데이트), P(O)R, R(O)OR', CO 또는 CH2(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 치환되어 있어도 좋다. 여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬 (예, 메틸, 에틸)이다. 연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고, 이들의 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다. In addition, the phosphate group contained in the nucleic acid aptamer of the present invention may be modified so as to have resistance to nuclease and hydrolysis. (O) R (O) R (O) R (O) R (O) OR ', CO or CH2 (formacetal) or 3'-amine (-NH-CH2-CH2-). Wherein each R or R 'is independently H, or substituted or unsubstituted alkyl (e.g., methyl, ethyl). As the linking group, -O-, -N- or -S- are exemplified, and they can be bonded to adjacent nucleotides through these linking groups.
본 발명에서의 변형은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 변형을 포함하여도 좋다. Variations in the present invention may also include 3 ' and 5 ' modifications such as capping.
변형은 또한, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일 (Myristoyl), 리쏘콜릭-올레일 (Lithocolic-oleyl), 도코사닐 (Docosanyl), 라우로일 (Lauroyl), 스테아로일 (Stearoyl), 팔미토일 (Palmitoyl), 올레오일 (Oleoyl), 리놀레오일 (Linoleoyl), 그 외 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다. 이러한 변형에 대해서는, 예컨대 미국특허 제5,660,985호, 미국특허 제5,756,703호를 참조한다. Deformations may also be achieved by the addition of one or more excipients such as polyethylene glycols, amino acids, peptides, inverted dT, nucleic acids, nucleosides, Myristoyl, Lithocolic-oleyl, Docosanyl, Lauroyl, Stearoyl, Palmitoyl, Oleoyl, Linoleoyl, other lipids, steroids, cholesterol, caffeine, vitamins, pigments, fluorescent substances, anticancer agents, toxins, enzymes, Radioactive material, biotin or the like at the terminal thereof. See, for example, U.S. Patent No. 5,660,985, U.S. Patent No. 5,756,703 for such modifications.
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 서열번호 1 내지 18로 표시되는 핵산 앱타머 중 가장 높은 친화도를 보인 서열번호 4로 표시되는 핵산 앱타머인 OD 5R-35 및 서열번호 6으로 표시되는 핵산 앱타머인 OD 5R-64에 대하여, SPR 칩 기반 결합력 분석을 수행한 결과, 오담에 해당 앱타머가 특이적으로 결합함을 확인하였다.In another embodiment of the present invention,
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 오담 관련 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.Therefore, the present invention relates, in another aspect, to a composition for diagnosing ovarian-related diseases comprising the nucleic acid aptamer.
본 발명에 있어서, 오담 관련 질환은 오담의 농도가 정상 범위를 벗어나게 되어 발생하는 질환이면 모두 이용 가능하나, 바람직하게는 치주염, 치은염, 상피성 치주암, 두개내 동맥류 및 임플란트 주위염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, othman-related diseases can be used as long as they are diseases that occur when the concentration of otham is out of the normal range, but it is preferable that the ophthalmologic diseases include periodontitis, gingivitis, epithelial periodontal cancer, Implant periosteum, and implant periosteum.
상기 오담 관련 질환의 진단은 상기 앱타머와 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 뇨 중에서 선택되는 시료와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 시료는 포유류, 바람직하게는 인체에서 분리된 것으로, 최소 침습으로 확보가 가능한 시료 또는 분비체액, in vitro 세포배양액 성분 시료 등 오담을 포함하고 있을 수 있는 시료이면, 상기에 한정되지 않음은 자명하다. The diagnosis of ovarian-related disease may include contacting the aptamer with a sample selected from tissues, cells, blood, serum, plasma, saliva, sputum and urine. It is obvious that the sample is not limited to the above, provided that the sample is separated from a mammal, preferably a human body, and may contain a sample such as a sample or secretory fluid capable of securing by minimal invasion, a sample of an in vitro cell culture medium component .
본 발명은 또 다른 관점에서 본 발명의 핵산 앱타머가 고상담체에 고정되어 있는 복합체에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a complex wherein the nucleic acid aptamer of the present invention is immobilized on a solid support.
본 발명에 있어서, 상기 고상 담체는 기판, 수지, 플레이트, 필터, 카트리지, 컬럼 및 다공재질인 고상 담체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the solid support may be selected from the group consisting of a substrate, a resin, a plate, a filter, a cartridge, a column, and a solid support in the form of a porous material.
본 발명에 있어서, 상기 기판은 니켈-PTFE (폴리테트라플루오로에틸렌) 기판, 유리 기판, 아파타이트 (apatite) 기판, 실리콘 기판, 금 기판, 은 기판, 그래핀 옥사이드 기판 및 알루미나 기판으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the substrate may be selected from the group consisting of a nickel-PTFE (polytetrafluoroethylene) substrate, a glass substrate, an apatite substrate, a silicon substrate, a gold substrate, a silver substrate, a graphene oxide substrate and an alumina substrate However, the present invention is not limited thereto.
본 발명의 기판은 칩이나 단백질 칩 등에 사용되고 있는 것 등일 수 있고, 예컨대 니켈-PTFE (폴리테트라플루오로에틸렌) 기판이나 유리 기판, 아파타이트 (apatite) 기판, 실리콘 기판, 금, 은, 그래핀 옥사이드 또는 알루미나 기판 등으로, 이들의 기판에 폴리머 등의 코팅을 실시한 것을 들 수 있다.The substrate of the present invention can be used or the like such as a chip or a protein chip, for example nickel -PTFE (polytetrafluoroethylene) substrates, glass substrates, apatite (apatite) substrate, a silicon substrate, a gold, silver, and graphene oxide or An alumina substrate, and the like, and these substrates are coated with a polymer or the like.
상기 수지는 아가로스 (agarose) 입자, 실리카 입자, 아크릴아미드와 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체, 폴리스티렌 가교 디비닐벤젠 입자, 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교한 입자, 셀룰로오스파이버, 알릴덱스트란과 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교폴리머, 단분산계 합성폴리머, 단분산계 친수성폴리머, 세파로오스 (Sepharose) 또는 토요펄(Toyopearl) 등을 들 수 있고, 또한 이들의 수지에 각종 관능기를 결합시킨 수지를 사용할 수 있다. The resin may be selected from the group consisting of agarose particles, silica particles, copolymers of acrylamide and N, N'-methylenebisacrylamide, particles of polystyrene crosslinked divinylbenzene, particles of crosslinked dextran with epichlorohydrin, , A crosslinked polymer of allyldextran and N, N'-methylenebisacrylamide, a monodispersed synthetic polymer, a monodispersed hydrophilic polymer, Sepharose or Toyopearl, and the like. A resin obtained by bonding various functional groups may be used.
상기 고상담체는 오담의 정제, 오담 단백질의 검출 또는 정량에 유용할 수 있다. The solid carrier may be useful for the purification of oram, the detection or quantification of opaque protein.
본 발명의 핵산 앱타머는 공지의 방법에 의해 고상담체에 고정할 수 있다. 예컨대, 친화성 물질이나 소정의 관능기를 본 발명의 앱타머에 도입하고, 계속해서 이 친화성 물질이나 소정의 관능기를 이용하여 고상담체에 고정화하는 방법을 들 수 있다. 소정의 관능기는 커플링 반응에 제공하는 것이 가능한 관능기일 수 있고, 예컨대 아미노기, 티올기, 히드록실기, 카르복실기를 들 수 있다. 예를 들어, 상기 앱타머의 말단에 바이오틴을 결합시켜 복합체를 형성하고, 상기 칩 등의 기판 표면에 스트렙타비딘을 고정화시켜, 상기 바이오틴과 기판 표면에 고정화된 스트렙타비딘의 상호작용에 의하여 상기 앱타머를 기판 표면에 고정화시킬 수 있다. The nucleic acid aptamer of the present invention can be immobilized on a solid support by a known method. For example, a method of introducing an affinity substance or a predetermined functional group into an aptamer of the present invention and subsequently immobilizing the affinity substance or a predetermined functional group on the solid carrier using the affinity substance or a predetermined functional group. The specific functional group may be a functional group capable of providing a coupling reaction, and examples thereof include an amino group, a thiol group, a hydroxyl group, and a carboxyl group. For example, by binding biotin to the end of the aptamer to form a complex, immobilizing streptavidin on the surface of the chip or the like, and reacting the biotin with streptavidin immobilized on the surface of the substrate, The aptamer can be immobilized on the substrate surface.
앱타머가 고정화된 고상담체를 이용하여 오담 단백질을 검출하는 방법은, 예를 들어, 본 발명의 DNA 앱타머를 칩 (chip)상에 형광물질, 발색물질 또는 항체 등과 함께 스팟팅 한 후 혈액샘플을 반응시킴으로써 검출 시료, 예를 들어, 혈액 중에 포함된 미량의 오담의 수준을 신속하게 측정할 수 있다. 또 다른 방법으로는 자성 비드에 상기 DNA 앱타머를 고정화시켜 오담을 결합시키게 되면 결합된 DNA 앱타머-오담 복합체를 자석을 이용하여 분리할 수 있게 되고, 이 복합체로부터 다시 오담을 분리함으로써 오담만을 선택적으로 검출할 수 있게 된다. For example, a method of detecting an oram protein using an immobilized solid phase carrier can be performed by, for example, spotting a DNA aptamer of the present invention on a chip together with a fluorescent substance, a coloring substance or an antibody, By the reaction, it is possible to quickly measure the level of a trace amount of a test sample, for example, a trace amount of blood contained in the blood. In another method, when the DNA aptamer is immobilized on the magnetic beads and the defect is bound, the bound DNA aptamer-otham complex can be separated by using a magnet. By separating the ocum again from the complex, As shown in FIG.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 핵산 앱타머 또는 상기 핵산 앱타머가 고상담체에 고정되어 있는 복합체를 포함하는 오담 검출용 조성물에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a composition for detecting odor comprising a nucleic acid aptamer of the present invention or a complex wherein the nucleic acid aptamer is immobilized on a solid support.
본 발명의 오담 검출용 조성물은 오담을 검출하기 위한 것으로, 오담의 검출을 위해 본 발명의 핵산 앱타머를 이용하여 어떠한 형태로도 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 앱타머를 자성비드에 고정화시켜 오담을 결합시키게 되면 결합된 DNA 앱타머-어딤 복합체(complex)를 자석을 이용하여 분리할 수 있게 되고, 이 복합체로부터 다시 오담을 분리함으로서 오담만을 선택적으로 검출할 수 있게 된다. The composition for detecting odalum of the present invention is for detecting an impairment and can be used in any form using the nucleic acid aptamer of the present invention for detecting odor. For example, when the nucleic acid aptamer of the present invention is immobilized on a magnetic bead to bind an open cell, the bound DNA aptamer-adide complex can be separated using a magnet, and the open cell is separated again from the complex It is possible to selectively detect Odam.
본 발명의 조성물을 이용하는 오담의 제거방법의 한 예를 들면, 상기 핵산 앱타머가 고정화된 자성비드를 컬럼 (column)에 채운 후 오담을 포함하는 시료를 통과시켜 오담만을 선택적으로 제거할 수 있다. As an example of a method of removing odor using the composition of the present invention, a magnetic bead having the nucleic acid aptamer immobilized thereon may be filled in a column, and then the sample containing the impurity may be passed through to selectively remove odor.
본 발명의 다른 실시 예에서는 상기 서열번호 1 내지 18로 표시되는 핵산 앱타머 중 가장 높은 친화도를 보인 서열번호 6으로 표시되는 핵산 앱타머 OD 5R-64에 대하여 SPR 칩 및 금 나노입자로 표지된 OD 5R-35 기반의 샌드위치 분석을 수행한 결과, 상기 샌드위치 방식을 사용할 경우, 오담에 대한 민감도가 증가함을 확인하였다.
In another embodiment of the present invention, the nucleic
따라서 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 서열번호 6으로 표시되는 앱타머가 고상담체에 고정되어 있는 복합체, 또는 서열번호 6으로 표시되는 앱타머를 함유하는 키트 또는 센서에 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 서열번호 4로 표시되는 앱타머를 추가로 접촉시키는 단계; 를 포함하는 오담(ODAM, Odontogenic Ameloblast-Associated protein) 검출방법에 관한 것이다.Accordingly, in another aspect, the present invention provides a method for detecting a cancer, comprising the steps of: (a) contacting a sample to a kit or sensor containing a complex wherein the aptamer of SEQ ID NO: 6 is immobilized on a solid support or an aptamer of SEQ ID NO: 6; And (b) further contacting an aptamer represented by SEQ ID NO: 4; To an ODAM (Odontogenic Ameloblast-Associated protein) detection method.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 4로 표시되는 앱타머는 금 나노입자로 표지되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the aptamer represented by SEQ ID NO: 4 may be characterized by being labeled with gold nanoparticles, but the present invention is not limited thereto.
본 발명은 또한, 상기 오담에 특이적으로 결합하는 앱타머 또는 상기 핵산 앱타머가 고상담체에 고정되어 있는 복합체를 함유하는 오담의 검출센서에 관한 것이다.The present invention also relates to a detection sensor comprising an aptamer specifically binding to said sesame or a complex in which said nucleic acid aptamer is immobilized on a solid support.
상기 오담에 특이적으로 결합하는 앱타머 또는 상기 핵산 앱타머가 고상담체에 고정되어 있는 복합체를 함유하는 검출 센서 시스템은, 키트(kit)의 형태로 제공될 수 있다. 오담 검출용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다. A detection sensor system containing an aptamer that specifically binds to the hypothalamus or a complex in which the nucleic acid aptamer is immobilized on a solid support may be provided in the form of a kit. The kit for detecting odds may take the form of a bottle, a tub, a sachet, an envelope, a tube, an ampoule, etc., which may be partly or wholly made of plastic, glass, paper, foil, wax And the like. The container may be fitted with a cap which is initially part of the container or can be fully or partially detachable, which may be attached to the container by mechanical, adhesive, or other means. The container may also be equipped with a stopper, which is accessible to the contents by the injection needle. The kit may include an external package, and the external package may include instructions for use of the components.
본 발명에 따른 오담에 특이적으로 결합하는 앱타머는 또한, 오담만을 특이적으로 검출하는바, 이를 포함하여 오담의 검출 또는 제거용 조성물을 제공할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에게 자명한 것이다. The aptamer specifically binding to orophyllum according to the present invention can also provide a composition for detecting or eliminating oram as well as a specific detection of oedam, and it is an object of the present invention to a person skilled in the art It is.
본 발명은 또 다른 관점에서, 오담에 특이적으로 결합하는 앱타머 또는 상기 핵산 앱타머가 고상담체에 고정되어 있는 복합체를 이용한 오담의 제거방법에 관한 것이다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 바람직하게는 상기 앱타머가 고정된 비드를 컬럼에 충진하고 오담이 포함된 시료를 통과시켜 오담을 제거할 수 있다. In another aspect, the present invention relates to a method for eliminating odam using aptamer specifically binding to odam or a complex in which the nucleic acid aptamer is immobilized on a solid support. According to an aspect of the present invention, preferably, the aptamer can fill the column with fixed beads and pass through a specimen containing odam to remove the impurities.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for illustrating the present invention and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
실시예 1: 임의의 염기서열을 가지는 DNA pool 합성Example 1: DNA pool synthesis with arbitrary base sequence
56mer DNA pool로서 양 끝에 PCR을 위한 프라이머 영역(primer region)이 있고 중앙에 임의의 염기를 가진 DNA pool을 아래와 같은 방법으로 합성하였다. 본 발명에 사용된 DNA pool은 Genotech Inc. Korea에 화학적으로 합성을 의뢰하였다.As a 56mer DNA pool, a DNA pool with a primer region for PCR and an arbitrary base at the center was synthesized as follows. The DNA pool used in the present invention was obtained from Genotech Inc. Korea for chemical synthesis.
CCATTCGTACGCAACAGG -random region- GTGGATGGCTCTGAATGCCCATTCGTACGCAACAGG -random region- GTGGATGGCTCTGAATGC
서열번호 19: CCATTCGTACGCAACAGGSEQ ID NO: 19: CCATTCGTACGCAACAGG
서열번호 20: GCATTCAGAGCCATCCACSEQ ID NO: 20: GCATTCAGAGCCATCCAC
실시예 2: GO-SELEX 프로세스를 이용한 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이 DNA 앱타머의 선별Example 2: Screening of ODAM (odontogenic ameloblast-associated protein) -specific DNA aptamers using GO-SELEX process
실시예 1에서 합성한 랜덤 DNA pool을 버퍼용액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4)에 넣고 그래핀옥사이드 용액과 혼합하여 30분간 상온에서 반응시켰으며, 그래핀옥사이드와 결합하지 않은 DNA를 원심분리 후 상층액을 제거함으로써 제거하였다. 본 혼합액에 타겟을 혼합하여 30 분간 4 ℃에서 반응시킨 다음, 원심분리를 통해 그래핀옥사이드를 제거한 후, 에탄올 침전법으로 타겟에 의해 그래핀옥사이드에서 분리된 DNA를 확보하였다.The random DNA pool synthesized in Example 1 was added to a buffer solution (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4), mixed with a graphene oxide solution, reacted at room temperature for 30 minutes, DNA was removed by centrifugation and then the supernatant was removed. The target mixture was mixed with the mixed solution for 30 minutes at 4 ° C. Then, the graphene oxide was removed by centrifugation, and the DNA isolated from the graphene oxide was obtained by the ethanol precipitation method.
수득한 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합하는 DNA의 양을 측정한 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 각 선별단계 (selection round) 에서 수득한 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 에 결합하는 DNA의 양이 증가하는 것을 확인하였다.The amount of DNA specifically binding to the odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) was measured. As a result, the ODAM obtained in each selection step as shown in FIG. 3, Odontogenic AMeloblast-Associated protein was increased by increasing the amount of DNA bound to the protein.
GO-Counter SELEX에서는 랜덤 DNA pool과 그래핀옥사이드를 반응시킨 후 카운터 타겟[타액]을 혼합하여 30분간 4 ℃에서 반응시킨 후, 원심분리하여 상층액을 제거함으로써 카운터 타겟에 의해 그래핀옥사이드로부터 분리된 DNA를 제거한 다음, 타겟[오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)]를 넣고 30분간 4 ℃에서 반응시키고 나서, 원심분리를 통해 그래핀옥사이드를 제거한 후 에탄올 침전법으로 타겟에 얻어진 그래핀옥사이드에서 분리된 DNA를 확보하였다. In GO-Counter SELEX, a random DNA pool was reacted with graphene oxide, and counter-target [saliva] was mixed. After reacting at 4 ° C for 30 minutes, the supernatant was removed by centrifugation to separate it from graphene oxide (ODAM, Odontogenic Ameloblast-Associated protein) was added thereto, followed by reaction at 4 占 폚 for 30 minutes. Then, graphene oxide was removed by centrifugation, and then graphene oxide DNA was isolated from the cells.
실시예 3: 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 에 결합 가능한 DNA 앱타머 pool의 제조Example 3: Preparation of a DNA aptamer pool capable of binding ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein)
오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)과 결합 특이적인 DNA의 양을 늘리기 위해 이미 알고 있는 프라이머 영역을 이용하여 PCR을 수행하였다. To increase the amount of DNA specific for ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein), PCR was performed using a known primer region.
PCR 생산물은 두 가닥의 DNA이므로 이를 단일가닥으로 분리하기 위한 과정을 위하여, 아래와 같이 하나의 프라이머에는 플루오레세인(fluorescein)을 고정하였다.Since the PCR product is two strands of DNA, for the purpose of separating it into a single strand, one primer was immobilized with fluorescein as follows.
forward (APTFf) 5-fluorescein- CCATTCGTACGCAACAGG-3forward (APTFf) 5-fluorescein-CCATTCGTACGCAACAGG-3
: 서열번호19: SEQ ID NO: 19
reverse (APTR) 5- GCATTCAGAGCCATCCAC-3: 서열번호 20reverse (APTR) 5- GCATTCAGAGCCATCCAC-3: SEQ ID NO: 20
PCR 반응물을 정제키트(purification kit)를 이용하여 정제한 후, 이중가닥의 DNA를 단일가닥으로 만들기 위해 폴리아크릴아마이드젤 전기영동을 실시하였다.The PCR reaction product was purified using a purification kit, and then subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to make double stranded DNA into a single strand.
10%의 폴리아크릴아마이드 젤에는 6M의 요소(urea), 20%의 포름아마이드(formamaid)가 포함되어 있어 전기영동 후에는 두 개의 밴드가 생기는데, 이는 전기영동 과정에서 두 가닥의 DNA가 변성되어 플루오레세인이 붙어있는 DNA 가닥은 위에, 붙어있지 않은 DNA 가닥은 아래에 각각 위치하게 된다. 플루오레세인이 붙어 있는 DNA 밴드를 잘라내어 젤 추출(gel extraction)을 실시한 후, 다시 에탄올 침전법으로 분리된 DNA를 확보하였다. The 10% polyacrylamide gel contains 6M urea and 20% formamide, resulting in two bands after electrophoresis, in which the two strands of DNA are denatured by electrophoresis, The DNA strands attached to the resein are located on the underside, while the DNA strands that are not attached are located below. The DNA bands with fluororesin were cut out and subjected to gel extraction. DNA isolated by ethanol precipitation was obtained again.
이 때 확보된 DNA pool은 다시 처음의 타겟이 들어 있는 버퍼용액과 혼합하여 새로운 선별과정을 시작한다. 이러한 과정의 모식도를 도 2 에 나타내었고, 일련의 과정(SELEX process)을 한 번의 선별 (selection)이라 하면 GO-SELEX 는 총 4번의 선별과정과 2번의 카운터 선별과정을 거쳐 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 결합하는 DNA pool을 얻었다. The DNA pool is then mixed with the buffer solution containing the first target to initiate a new screening process. 2, the SELEX process is referred to as a selection. In the case of GO-SELEX, four selection processes and two counter selection processes are used to determine ODAM, Odontogenic AMeloblast -Associated protein) was obtained.
최종적으로 얻어진 DNA pool을 Qiagen cloning kit를 이용하여 클로닝(cloning)하고 얻어진 콜로니에서부터 DNA를 추출하여 염기분석을 시행할 결과 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합하는 핵산 구조체를 확보하였다.The resulting pool of DNA was cloned using a Qiagen cloning kit. DNA was extracted from the obtained colonies and subjected to base analysis. As a result, a nucleic acid construct specifically binding to ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein) was obtained Respectively.
실시예 4: DNA 앱타머의 염기서열 분석 및 특이성 분석Example 4: Sequence analysis and specificity analysis of DNA aptamer
오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 DNA의 염기서열을 분석한 결과를 하기 표 1에 제시하였다. 또한, 이 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 앱타머의 2차 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 예측한 결과를 도 4 내지 도 21에 나타내었다.Table 1 shows the results of analyzing the nucleotide sequence of DNA that specifically binds to ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein) with high affinity. Further, the results of predicting the secondary structure of the odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) aptamer by using the m-fold program are shown in Figs. 4 to 21.
상기의 DNA 앱타머가 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 대한 특이성이 있는지를 확인하였다.It was confirmed that the DNA aptamer has specificity for odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM).
3’말단에 FAM을 연결한 DNA 16nM과 20분간 초음파처리한 그래핀옥사이드 6.4ug/ml를 각 125ul을 상온에서 30분간 로테이터 상에서 반응시킨 후, 64 nM의 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 250ul를 첨가해 추가로 30분간 반응시킨 다음, 검은 96-well 플레이트 상에서 멀티플레이트 리더기를 이용하여 형광 값을 측정하였다. 이 때 여기파장(excitation wavelength)은 480nm를 사용하였다. DNA와 그래핀옥사이드 두 가지 만을 반응 시켰을 때 나타나는 형광값을 F0로 하고 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 와 반응했을 때 형광값을 F라고 정의하였으며, (F-F0)/F0 결과 값을 측정한 결과, 도 22에 개시된 바와 같이, 모든 압타머의 (F-F0)/F0 값이 타겟이 존재할 경우가 그렇지 않을 때 보다 증가하는 것을 통해, 각각의 앱타머가 오담에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.16 ng of DNA with FAM ligated at the 3 'end and 6.4 ug / ml of graphene oxide sonicated for 20 minutes were reacted on a rotator for 30 minutes at room temperature. Then, 64 nM odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) , And the fluorescence value was measured using a multi-plate reader on a black 96-well plate. At this time, the excitation wavelength was 480 nm. (F-F0) / F0 (F-F0) / F0 (F-F0) / F0 is defined as fluorescence when F0 is reacted with odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) As a result of the measurement, it can be seen that the values of (F-F0) / F0 of all the pressure gauges increase more when the target is present than when not, I could confirm.
실시예 5: DNA 앱타머의 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 과의 결합력 분석Example 5 Analysis of Binding Ability with ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated Protein) of DNA Aptamer
서로 다른 18종의 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)과 결합하는 앱타머 중에서 OD 5R-35 및 OD 5R-64 의 타겟에 대한 Dose-dependency 및 Specificity 를 다음과 같이 SPR 분석법을 통하여 확인하였다. Dose-dependency and specificity of the
SPR 금칩(gold chip)을 DTPA(Dithiophosphoric acid)로 처리 후, 칩의 금 표면을 200mM EDC/50mM NHS (Carbodiimide/ N-Hydroxysuccinimide)에서 1시간, 100ug/ml 스트렙타아비딘 1시간 30분, 50mM 에탄올아민 30분, 비오틴 표지한 앱타머 1uM 1시간, 50ug/ml BSA 1시간을 차례로 상온에서 반응시켰다. 매 단계 3차 증류수로 금 표면을 씻어내고 질소 건을 이용해 건조 시켜주는 과정을 반복한였다. The SPR gold chip was treated with DTPA (dithiophosphoric acid), and the gold surface of the chip was immersed in 200 mM EDC / 50 mM NHS (Carbodiimide / N-Hydroxysuccinimide) for 1 hour, 100 ug /
상기 과정을 통해 앱타머를 고정시킨 SPR 칩을 SPR 기계에 삽입하고 칩 위로 버퍼 용액 (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4) 10분, 타겟 단백질[오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)], 혹은 카운터 타겟 [alpha-amylase] 10분, 버퍼용액 10분을 30ul/sec로 흘려주어 측정한 Response Unit (RU) 값은 도 23에 개시된 바와 같이, 두 종류의 앱타머 모두 오담의 농도에 비례하여 RU 값이 증가하는 것을 확인하였으며, 알파 아밀라아제에는 결합하지 않는 것을 확인할 수 있었다.Through the above procedure, an SPR chip fixed with an aptamer was inserted into an SPR machine and a buffer solution (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4) for 10 minutes and ODAM, Odontogenic Ameloblast-Associated The response unit (RU) value, which was measured by flowing the buffer solution for 10 minutes and the buffer solution for 30 minutes at 30 μl / sec, is shown in FIG. 23, It was confirmed that the RU value was increased in proportion to the concentration, and it was confirmed that the RU value did not bind to the alpha amylase.
실시예 6: DNA 앱타머의 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein) 과의 앱타머 듀오로서의 결합력 분석Example 6: Analysis of binding force as an aptamer duo with ODAM (Odontogenic AMeloblast-Associated protein)
서로 다른 18종의 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합하는 앱타머 중 OD 5R-35 및 OD 5R-64가 앱타머 듀오로서 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)과 결합할 수 있는지의 여부를 SPR 장비를 통해 분석하였다.
실시예 5의 방법으로 앱타머 OD 5R-64를 고정시킨 SPR 칩을 SPR 기계에 삽입 후, PBS 10분, 샘플 10분, PBS 10분을 차례로 흘려주었다. 이 때 샘플은 0 nM, 1 nM, 2 nM, 4 nM, 8 nM, 16 nM, 32 nM, 64 nM 의 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)이고, PBS 10분을 흘려 OD 5R-64 에 붙지 못한 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)을 씻어낸 다음, 차례로 금 나노입자로 표지한 OD 5R-35 를 10분간 흘려주었다. 동일하게 PBS 10분을 다시 흘려줌으로써 오담 (ODAM, Odontogenic AMeloblast-Associated protein)에 붙지 못한 금 나노입자로 표지된 OD 5R-35 를 씻어내었다. The SPR chip in which the
즉, OD 5R-64를 포함하는 SPR 칩과, 금 나노입자로 표지한 OD 5R-35를 동시에 듀오로서 이용하여, 결합력을 측정한 결과, 도 24에 개시된 바와 같이, 앱타머 듀오를 샌드위치 방식으로 이용할 경우, 그 민감도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. That is, the SPR
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereto will be. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> DNA aptamer binding to ODAM(Odontogenic Ameloblast-Associated protein) with specificity and Uses thereof <130> P17-B291 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-17 <400> 1 ccattcgtac gcaacagggc gtgcgatatc ggacccccgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 2 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-29 <400> 2 ccattcgtac gcaacaggga gcaatcaatt cgacaaccgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 3 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-32 <400> 3 ccattcgtac gcaacaggct agagcgaaga caccgaaagt ggatggctct gaatgc 56 <210> 4 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-35 <400> 4 ccattcgtac gcaacaggcg acctaaacaa cgcatcaggt ggatggctct gaatgc 56 <210> 5 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-39 <400> 5 ccattcgtac gcaacaggga cgtatgaatc actcgcgtgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 6 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-64 <400> 6 ccattcgtac gcaacaggga tgcatcgact gtaaacacgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 7 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-78 <400> 7 ccattcgtac gcaacaggta acctcactca tgctaggcgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 8 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-82 <400> 8 ccattcgtac gcaacaggac agctggcatc ctaacaccgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 9 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-9 <400> 9 ccattcgtac gcaacaggga cgtatgaacc actcgcgtgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 10 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-13 <400> 10 ccattcgtac gcaacaggga cgtatgaatc actcgcgtgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-14 <400> 11 ccattcgtac gcaacaggga gcaatcaatc gacaaccgtg gatggctctg aatgc 55 <210> 12 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-18 <400> 12 ccattcgtac gcaacaggga gcaatcaatt cgacaaccgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 13 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-37 <400> 13 ccattcgtac gcaacaggcg cagaacaagc attccttgtg gatggctctg aatgc 55 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-55 <400> 14 ccattcgtac gcaacaggtc caatcagaaa taaacctggt ggatggctct gaatgc 56 <210> 15 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-58 <400> 15 ccattcgtac gcaacaggcc aatgtagaca tagtccagtg gatggctctg aatgc 55 <210> 16 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-61 <400> 16 ccattcgtac gcaacaggcg caggccaagg atcatacagt ggatggctct gaatgc 56 <210> 17 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-64 <400> 17 ccattcgtac gcaacaggcc gcaccatgca gcaaactagt ggatggctct gaatgc 56 <210> 18 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-65 <400> 18 ccattcgtac gcaacaggtc tacaccatgc cacaacgcgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APTFf <400> 19 ccattcgtac gcaacagg 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APTR <400> 20 gcattcagag ccatccac 18 <110> Korea University Research and Business Foundation <120> DNA aptamer binding to ODAM (Odontogenic Ameloblast-Associated protein) with specificity and Uses thereof <130> P17-B291 <160> 20 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-17 <400> 1 ccattcgtac gcaacagggc gtgcgatatc ggacccccgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 2 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-29 <400> 2 ccattcgtac gcaacaggga gcaatcaatt cgacaaccgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 3 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-32 <400> 3 ccattcgtac gcaacaggct agagcgaaga caccgaaagt ggatggctct gaatgc 56 <210> 4 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-35 <400> 4 ccattcgtac gcaacaggcg acctaaacaa cgcatcaggt ggatggctct gaatgc 56 <210> 5 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-39 <400> 5 ccattcgtac gcaacaggga cgtatgaatc actcgcgtgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 6 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-64 <400> 6 ccattcgtac gcaacaggga tgcatcgact gtaaacacgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 7 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-78 <400> 7 ccattcgtac gcaacaggta acctcactca tgctaggcgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 8 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 5R-82 <400> 8 ccattcgtac gcaacaggac agctggcatc ctaacaccgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 9 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-9 <400> 9 ccattcgtac gcaacaggga cgtatgaacc actcgcgtgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 10 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-13 <400> 10 ccattcgtac gcaacaggga cgtatgaatc actcgcgtgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-14 <400> 11 ccattcgtac gcaacaggga gcaatcaatc gacaaccgtg gatggctctg aatgc 55 <210> 12 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-18 <400> 12 ccattcgtac gcaacaggga gcaatcaatt cgacaaccgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 13 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-37 <400> 13 ccattcgtac gcaacaggcg cagaacaagc attccttgtg gatggctctg aatgc 55 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-55 <400> 14 ccattcgtac gcaacaggtc caatcagaaa taaacctggt ggatggctct gaatgc 56 <210> 15 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-58 <400> 15 ccattcgtac gcaacaggcc aatgtagaca tagtccagtg gatggctctg aatgc 55 <210> 16 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-61 <400> 16 ccattcgtac gcaacaggcg caggccaagg atcatacagt ggatggctct gaatgc 56 <210> 17 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-64 <400> 17 ccattcgtac gcaacaggcc gcaccatgca gcaaactagt ggatggctct gaatgc 56 <210> 18 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD 8R-65 <400> 18 ccattcgtac gcaacaggtc tacaccatgc cacaacgcgt ggatggctct gaatgc 56 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APTFf <400> 19 ccattcgtac gcaacagg 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APTR <400> 20 gcattcagag ccatccac 18
Claims (13)
여기서, 상기 핵산 앱타머가 RNA인 경우에는 상기 핵산서열에서 T는 U임을 특징으로 함.
A nucleic acid aptamer which specifically binds to odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 18,
Herein, when the nucleic acid aptamer is RNA, T is U in the nucleic acid sequence.
A method for detecting ODAM (Odontogenic Ameloblast-Associated protein) comprising contacting the nucleic acid aptamer of claim 1 with a sample.
[3] The method according to claim 2, wherein the sample is selected from the group consisting of tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, sputum and urine.
The method according to claim 3, wherein the detection is performed by a method selected from the group consisting of Surface Plasmon Resonance (SPR), Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), and gold nanoparticle- (ODAM, Odontogenic Ameloblast-Associated protein).
A composition for diagnosing Odontogenic Ameloblast-Associated Protein (ODAM) -related disease comprising the nucleic acid aptamer of claim 1.
The composition according to claim 6, wherein the ODAM (Odontogenic Ameloblast-Associated protein) -related disease is selected from the group consisting of periodontitis, gingivitis, epithelial periodontal cancer, intracranial aneurysms, and implant periostitis.
A complex wherein the nucleic acid aptamer of claim 1 is immobilized on a solid support.
8. The composite according to claim 7, wherein the solid carrier is selected from the group consisting of a substrate, a resin, a plate, a filter, a cartridge, a column and a solid carrier which is a porous material.
The method of claim 8, wherein the substrate is selected from the group consisting of a nickel-PTFE (polytetrafluoroethylene) substrate, a glass substrate, an apatite substrate, a silicon substrate, a gold substrate, ≪ / RTI >
A composition for detecting ODAM (Odontogenic Ameloblast-Associated protein) comprising the nucleic acid aptamer of claim 1 or the complex of claim 7.
A sensor for detecting ODAM (Odontogenic Ameloblast-Associated protein) comprising the nucleic acid aptamer of claim 1 or the complex of claim 7.
A kit for detecting Odontogenic Ameloblast-Associated Protein (ODAM) comprising the nucleic acid aptamer of claim 1 or the complex of claim 7.
(b) 서열번호 4로 표시되는 앱타머를 추가로 접촉시키는 단계;
를 포함하는 오담(ODAM, Odontogenic Ameloblast-Associated protein) 검출방법.(a) contacting a sample to a kit or sensor containing a complex wherein the aptamer of SEQ ID NO: 6 is immobilized on a solid support, or an aptamer of SEQ ID NO: 6; And
(b) further contacting an aptamer represented by SEQ ID NO: 4;
(ODAM). ≪ / RTI >
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170166589A KR102009016B1 (en) | 2017-12-06 | 2017-12-06 | DNA aptamer binding to ODAM(Odontogenic Ameloblast-Associated protein) with specificity and Uses thereof |
| PCT/KR2018/012958 WO2019112178A1 (en) | 2017-12-06 | 2018-10-30 | Dna aptamer binding specifically to odam and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170166589A KR102009016B1 (en) | 2017-12-06 | 2017-12-06 | DNA aptamer binding to ODAM(Odontogenic Ameloblast-Associated protein) with specificity and Uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190066811A true KR20190066811A (en) | 2019-06-14 |
| KR102009016B1 KR102009016B1 (en) | 2019-08-08 |
Family
ID=66751092
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170166589A KR102009016B1 (en) | 2017-12-06 | 2017-12-06 | DNA aptamer binding to ODAM(Odontogenic Ameloblast-Associated protein) with specificity and Uses thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102009016B1 (en) |
| WO (1) | WO2019112178A1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111537489A (en) * | 2020-06-09 | 2020-08-14 | 郑州轻工业大学 | Aptamer, method for regulating signal intensity of aptamer and application |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130024551A (en) * | 2011-08-31 | 2013-03-08 | 고려대학교 산학협력단 | Novel aptamer screening method based on graphene without target immobilization and the nampt specific aptamers obtained from the above method |
| KR20160101889A (en) * | 2016-08-18 | 2016-08-26 | 서울대학교산학협력단 | Use of ODAM as a biomarker for periodontal disease |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101222437B1 (en) * | 2010-03-17 | 2013-01-15 | 경북대학교 산학협력단 | Biomarker |
| WO2012122640A1 (en) * | 2011-03-17 | 2012-09-20 | Université de Montréal | Compositions, diagnostic methods using epithelial extracellular matrix proteins |
| EP3396383A1 (en) * | 2012-09-10 | 2018-10-31 | Koninklijke Philips N.V. | Analysis of saliva proteome for biomarkers of gingivitis and periodontitis using ft-icr-ms/ms |
-
2017
- 2017-12-06 KR KR1020170166589A patent/KR102009016B1/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-10-30 WO PCT/KR2018/012958 patent/WO2019112178A1/en active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130024551A (en) * | 2011-08-31 | 2013-03-08 | 고려대학교 산학협력단 | Novel aptamer screening method based on graphene without target immobilization and the nampt specific aptamers obtained from the above method |
| KR20160101889A (en) * | 2016-08-18 | 2016-08-26 | 서울대학교산학협력단 | Use of ODAM as a biomarker for periodontal disease |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019112178A1 (en) | 2019-06-13 |
| KR102009016B1 (en) | 2019-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9562907B2 (en) | Aptamers screening method based on graphene without target immobilization and the aptamers obtained from the method | |
| KR20140143140A (en) | Methods and devices for detection and measurement of analytes | |
| JP4111984B2 (en) | Target substance detection method | |
| US20130196341A1 (en) | Methods and compositions for detection of analytes | |
| JP2022522480A (en) | Electrochemiluminescent labeled probe for use in immunoassays, method of using the probe and kit containing the probe | |
| CN113195722B (en) | DNA aptamer specifically bound to chikungunya virus E2 and application thereof | |
| Tombelli et al. | Aptamers biosensors for pharmaceutical compounds | |
| KR101200553B1 (en) | An Aptamer of specifically binding vaspin, a method of preparing the same and a use of the same | |
| KR101970963B1 (en) | DNA aptamer binding specifically to yellow fever virus envelope protein domain III (YFV EDIII) and uses thereof | |
| Li et al. | PD-L1 aptamer isolation via Modular-SELEX and its applications in cancer cell detection and tumor tissue section imaging | |
| KR101913163B1 (en) | Signal Probe Using Double-stranded Nucleic Acid and a Method for Detecting a Target Molecule Using the Same | |
| KR20190066811A (en) | DNA aptamer binding to ODAM(Odontogenic Ameloblast-Associated protein) with specificity and Uses thereof | |
| KR101327249B1 (en) | DNA aptamers for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome(PRRS) virus | |
| KR20170116820A (en) | Biosensors using antigen-binding fragment | |
| KR20190031705A (en) | DNA aptamer specifically binding to Avian influenza virus and uses thereof | |
| KR101297417B1 (en) | Novel aptamer screening method based on graphene without target immobilization and the Nampt specific aptamers obtained from the above method | |
| KR101911859B1 (en) | Signal Probe Using Double-stranded Nucleic Acid and a Method for Detecting a Target Molecule Using the Same | |
| KR101678946B1 (en) | Nucleic Acid Aptamer Capable of Specifically Binding to 25-hydroxy Vitamin D3 and Uses Thereof | |
| CN105821044A (en) | Aptamer of L-serine and application of aptamer | |
| KR101801227B1 (en) | Nucleic Acid Aptamer Capable of Specifically Binding to Follistatin and Uses Thereof | |
| CN105821046A (en) | Specific L-serine aptamer and application thereof | |
| KR101990103B1 (en) | DNA aptamer binding to progesterone with specificity and Uses thereof | |
| JP2008175750A (en) | Detection method of substance to be inspected | |
| KR101816104B1 (en) | DNA aptamer binding to progesterone with specificity and Uses thereof | |
| CN114410641B (en) | Aptamer for detecting rubella virus, kit and application |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |