KR20190042079A - T 세포 구획에서 자가반응성을 감소시킴에 의해 면역 장애-관련 질환을 치료하는 방법 - Google Patents

T 세포 구획에서 자가반응성을 감소시킴에 의해 면역 장애-관련 질환을 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

기술된 발명은 치료량의 교육된 단핵 세포 생성물을 포함하는 약학적 조성물, 교육된 단핵 세포 생성물을 제조하는 방법, 및 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 질병이 있는 대상체로부터의 단핵 세포는 교육된 단핵 세포 생성물을 형성하기 위해 적어도 80% 컨플루언스의 부착성 제대혈 줄기 세포의 생육가능 집단과 공동-배양된다. 치료량의 교육된 단핵 세포 생성물은 혈관내 주입에 의해 대상체에게 돌려 보내진다. 치료량은 대상체의 T 세포 구획에서 자가반응성을 조절하고 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병의 증상을 감소시키는데 효과적이다.

Description

T 세포 구획에서 자가반응성을 감소시킴에 의해 면역 장애-관련 질환을 치료하는 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2016년 8월 29일 출원된 미국 가특허 출원 62/380,904호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
발명의 분야
기술된 발명은 T 세포 구획에서 자가반응성을 갖는 환자를 치료하기 위한 장치, 약학적 조성물 및 방법에 관한 것이다.
면역 반응의 특징
일반적으로 말하면, 면역 반응은 개체와 외래 항원성 물질, 예를 들어, 감염성 미생물 간의 만남에 의해 개시된다. 감염된 개체는 면역원의 항원성 결정인자/에피토프에 특이적인 항체 분자의 생산 및 사이토카인 및 살해 T 세포를 생산하는 둘 모두의 세포를 포함하는 항원-특이적 조절성 및 이펙터 T-림프구의 팽창 및 분화와 신속하게 반응하여, 감염된 세포를 용해시킬 수 있다. 주어진 미생물에 의한 일차 면역화는 그 미생물에서 발견되는 항원성 결정인자/에피토프에 특이적이지만 일반적으로 관련이 없는 미생물에 의해 발현되는 항원성 결정인자를 인지하지 못하거나 단지 불충분하게만 인지하는 항체 및 T 세포를 유발한다[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999), at p. 102].
이 초기 반응의 결과로, 면역화된 개체는 면역학적 기억 상태를 발달시킨다. 동일하거나 밀접하게 관련된 미생물과 다시 만나면, 이차 반응이 뒤따른다. 이 이차 반응은 일반적으로 보다 신속하고, 크기가 더 크며, 항원에 더 큰 친화력으로 결합하여 신체로부터 미생물을 제거하는데 더욱 효과적인 항체들로 구성된 항체 반응, 및 유사하게 향상되고 종종 더 효과적인 T-세포 반응으로 구성된다. 그러나, 감염성 제제에 대한 면역 반응이 항상 병원체의 제거로 이어지는 것은 아니다. Id.
면역 반응은 이의 반응성에서 매우 특이적이지만, 면역 시스템에에 의해 구별될 수 있는 항원 특이성의 범위는 거대하다.
면역 시스템의 세포
면역 시스템의 세포는 림프구, 단핵구/대식세포, 수지상 세포, 밀접하게 관련된 랑게르한스 세포, 자연 살해(NK) 세포, 비만 세포, 호염기구, 및 골수 계통의 세포의 다른 구성원을 포함한다. 또한, 일련의 특수화된 상피 및 간질 세포는 반응의 유도 및 이펙터 단계에서도 직접적인 역할을 하는, 면역 시스템의 세포에서 성장 및/또는 유전자 활성화를 조절하는 중요한 인자를 종종 분비함으로써, 면역을 발생시키는 해부학적 환경을 제공한다. Id.
면역 시스템의 세포는 비장, 림프절, 소장의 파이어판(Peyer's patches) 및 편도와 같은 말초 기질화 조직에서 발견된다. 림프구는 또한 중심 림프 기관, 흉선, 및 골수에서 발견되며, 이들은 성숙 면역 시스템의 무수한 반응을 매개하기 위한 준비를 갖추기 위한 발달 단계를 거친다. 림프구 및 대식세포의 상당 부분은 혈액 및 림프에서 발견되는 세포의 재순환 풀(pool)을 포함하여, 면역적격 세포를 이들을 필요로 하는 부위에 전달하고 국소적으로 생성된 면역이 보편화되도록 하는 수단을 제공한다. Id.
용어 "림프구"는 신체를 통틀어 림프 조직에서 형성되는 작은 백혈구를 지칭하고 정상 성인에서 순환 혈액 중 백혈구의 총 수의 약 22-28%를 구성하며 질병에 대해 신체를 방어하는데 큰 역할을 한다. 개별 림프구는 구조적으로 관련된 항원의 제한된 세트에 반응하도록 투입(committed)된다는 점에서 특수화된다. 면역 시스템과 주어진 항원의 최초 접촉 전에 존재하는 이러한 투입은 림프구의 표면 막에 있는 항원의 결정인자(에피토프)에 특이적인 수용체의 존재에 의해 발현된다. 각 림프구는 수용체의 집단을 보유하며, 이들 모두는 동일한 조합 부위를 갖는다. 림프구의 한 세트 또는 클론은 이의 수용체의 조합 영역의 구조에서 또 다른 클론과 상이하므로 이것이 인지할 수 있는 에피토프에 있어 상이하다. 림프구는 수용체의 특이성 뿐만 아니라 이들의 기능에서도 서로 다르다. Id.
두 가지 광범위한 부류의 림프구가 인지된다: 항체-분비 세포의 전구체인 B-림프구(B-세포), 및 T-림프구(T-세포).
B-림프구
B-림프구는 골수의 조혈 세포로부터 유래된다. 성숙 B-세포는 이의 세포 표면에 의해 인지되는 에피토프를 발현하는 항원으로 활성화될 수 있다. 활성화 과정은 항원에 의한 막 Ig 분자의 가교-결합에 의존하여 직접적일 수 있거나(가교-결합-의존성 B-세포 활성화), 인지체(cognate) 도움으로 지칭되는 과정에서, 헬퍼 T-세포와의 상호작용을 통해 간적접일 수 있다. 많은 생리학적 상황에서, 수용체 가교-결합 자극 및 인지체 도움은 상승작용하여 보다 활발한 B-세포 반응을 유도한다[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)].
가교-결합 의존성 B-세포 활성화는 각 B-세포가 동일한 가변 영역을 갖는 Ig 분자를 발현시키므로 항원이 세포 표면 수용체의 결합 부위에 상보적인 에피토프의 다중 카피를 발현할 것을 요구한다. 그러한 요구는 반복적인 에피토프를 갖는 다른 항원, 예를 들어, 미생물의 캡슐 다당류 또는 바이러스 외피 단백질에 의해 충족된다. 가교-결합-의존성 B-세포 활성화는 이들 미생물에 대한 주요 보호 면역 반응이다[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)].
인지체 도움은 B 세포가 수용체에 가교-결합할 수 없는 항원에 대한 반응을 일으키도록 하고, 동시에, 약한 가교-결합 사건에 의해 자극될 때 B 세포를 불활성화로부터 구제하는 공자극 신호를 제공한다. 인지체 도움은 B-세포의 막 면역글로불린(Ig)에 의한 항원의 결합, 항원의 세포내이입, 및 세포의 엔도솜/리소솜 구획 내에서 이의 펩티드로의 단편화에 의존적이다. 생성된 펩티드 중 일부는 클래스 II 주조직적합성 복합체(MHC) 분자로 알려진 세포 표면 단백질의 특수화된 세트의 그루브(groove)로 부하된다. 생성된 클래스 II/펩티드 복합체는 세포 표면에서 발현되고 CD4+ T-세포로 지정된 T-세포의 세트의 항원-특이적 수용체에 대한 리간드로서 작용한다. CD4+ T 세포는 B-세포의 클래스 II/펩티드 복합체에 특이적인 수용체를 그 표면에 보유한다. B-세포 활성화는 T-세포 수용체(TCR)를 통한 T 세포의 결합에 의존할 뿐만 아니라, 이 상호작용은 또한 T-세포 상의 활성화 리간드(CD40 리간드)가 B-세포 상의 그 수용체(CD40)에 결합하도록 하여 B-세포 활성화의 신호를 보낸다. 또한, T 헬퍼 세포는 B 세포 상의 사이토카인 수용체에 결합함에 의해 자극된 B-세포의 성장 및 분화를 조절하는 여러 사이토카인을 분비한다[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction, "Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)].
항체 생산을 위한 인지체 도움 동안, CD40 리간드는 활성화된 CD4+ T 헬퍼 세포에서 일시적으로 발현되고, 이것은 항원-특이적 B 세포 상의 CD40에 결합하여, 제2 공자극 신호를 전달한다. 후자의 신호는 B 세포 성장 및 분화 그리고 항원과 만난 배중심 B 세포의 아폽토시스를 방지함으로써 기억 B 세포의 생성에 필수적이다. B 및 T 세포 둘 모두에서 CD40 리간드의 과발현은 인간 SLE 환자에서 병원성 자가항체 생산에 관여한다[Desai-Mehta, A. et al., "Hyperexpression of CD40 ligand by B and T cells in human lupus and its role in pathogenic autoantibody production," J. Clin. Invest. Vol. 97(9), 2063-2073, (1996)].
T-림프구
T-림프구는 조혈 조직의 전구체로부터 유래하고, 흉선에서 분화를 거친 다음, 말초 림프 조직 및 림프구의 재순환 풀로 시딩된다. T-림프구 또는 T 세포는 광범위한 면역학적 기능을 매개한다. 이는 B 세포가 항체-생산 세포로 발달하는 것을 돕는 능력, 단핵구/대식세포의 살균 작용을 증가시키는 능력, 특정 유형의 면역 반응의 억제, 표적 세포의 직접 사멸, 및 염증 반응의 동원을 포함한다. 이러한 효과는 특정 세포 표면 분자의 발현 및 사이토카인의 분비에 좌우된다[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)].
T 세포는 B 세포와 항원 인지 메커니즘이 다르다. B 세포의 수용체인 면역글로불린은 가용성 분자 또는 미립자 표면 상의 개별 에피토프에 결합한다. B-세포 수용체는 천연 분자의 표면에 발현된 에피토프를 본다. 항체 및 B-세포 수용체가 세포외 유체에서 미생물에 결합하여 이에 대한 보호를 위해 진화하는 한편, T 세포는 다른 세포의 표면에 있는 항원을 인지하고 이러한 항원-제시 세포(APC)와 상호작용하여 이들의 거동을 변경시킴에 의해 기능을 매개한다. 말초 림프관에는 T 세포를 활성화시킬 수 있는 세 가지 주요 유형의 항원-제시 세포가 있다: 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포. 이들 중 가장 강력한 것은 수지상 세포이고, 이의 유일한 기능은 T 세포에 외래 항원을 제시하는 것이다. 미성숙 수지상 세포는 피부, 창자, 및 호흡 기관을 포함하는 신체 전반의 조직에 위치한다. 이들이 이러한 부위에서 침입 미생물과 만나면, 이들은 병원체 및 그 생성물을 흡수하고, 이들을 림프를 통해 국소 림프절이나 창자 관련 림프 기관으로 옮긴다. 병원체와의 만남은 수지상 세포가 항원-포획 세포에서 T 세포를 활성화시킬 수 있는 항원-제시 세포(APC)로 성숙되도록 유도한다. APC는 이펙터 세포가 되기 위해 T 세포를 활성화시키는 역할을 하는 세 가지 유형의 단백질 분자를 이들 표면에 나타낸다: (1) 외래 항원을 T 세포 수용체에 제시하는 MHC 단백질; (2) T 세포 표면의 상보적인 수용체에 결합하는 공자극 단백질; 및 (3) T 세포가 활성화될 만큼 충분히 길게 항원-제시 세포(APC)에 결합할 수 있게 하는 세포-세포 부착 분자["Chapter 24: The adaptive immune system," Molecular Biology of the Cell, Alberts, B. et al., Garland Science, NY, (2002)].
T-세포는 이들이 발현하는 세포 표면 수용체에 기반하여 2개의 별개의 부류로 세분된다. 대다수의 T 세포는 α 및 β 사슬로 구성된 T 세포 수용체(TCR)를 발현한다. 작은 그룹의 T 세포는 γ 및 δ 사슬로 이루어진 수용체를 발현한다. α/β T 세포 중에는 공수용체 분자 CD4(CD4+ T 세포)를 발현하는 것과 CD8(CD8+ T 세포)을 발현하는 것의 2개의 하위-계통이 존재한다. 이들 세포는 항원을 인지하는 방법 및 이들의 이펙터 및 조절 기능에 있어 상이하다.
CD4+ T 세포는 면역 시스템의 주요 조절 세포이다. 이들의 조절 기능은 T 세포가 활성화될 때 발현이 유도되는 CD40 리간드 및 활성화될 때 이들이 분비하는 광범위한 종류의 사이토카인과 같은 세포-표면 분자의 발현 둘 모두에 의존한다.
T 세포는 또한 중요한 이펙터 기능을 매개하는데, 그 중 일부는 이들이 분비하는 사이토카인의 패턴에 의해 결정된다. 사이토카인은 표적 세포에 직접적으로 독성일 수 있고 강력한 염증 메커니즘을 동원할 수 있다.
또한, T 세포, 특히 CD8+ T 세포는 세포독성 T-림프구(CTL)에 의해 인지되는 항원을 발현하는 표적 세포를 효율적으로 용해시킬 수 있는 CTL로 발달할 수 있다[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)].
T 세포 수용체(TCR)는 클래스 II 또는 클래스 I MHC 단백질의 특수화된 그루브에 결합된 항원의 단백질분해에 의해 유래된 펩티드로 구성된 복합체를 인지한다. CD4+ T 세포는 펩티드/클래스 II 복합체만을 인지하는 반면, CD8+ T 세포는 펩티드/클래스 I 복합체를 인지한다[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)].
TCR의 리간드(즉, 펩티드/MHC 단백질 복합체)는 항원-제시 세포(APC) 내에 생성된다. 일반적으로, 클래스 II MHC 분자는 세포내이입 과정을 통해 APC에 의해 흡수된 단백질로부터 유래된 펩티드에 결합한다. 이러한 펩티드-부하된 클래스 II 분자는 이후 세포의 표면에서 발현되고, 여기서 CD4+ T 세포에 의해 발현된 세포 표면 복합체를 인지할 수 있는 TCR과 결합하는데 이용될 수 있다. 따라서, CD4+ T 세포는 세포외 공급원으로부터 유래된 항원과 반응하도록 특수화된다[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)].
대조적으로, 클래스 I MHC 분자는 바이러스 단백질과 같은 내부적으로 합성된 단백질로부터 유래된 펩티드로 주로 부하된다. 이러한 펩티드는 프로테오솜에 의한 단백질분해에 의해 세포질 단백질로부터 생산되고 조면 세포질세망으로 전위된다. 일반적으로 9개 아미노산 길이로 구성된 그러한 펩티드는 클래스 I MHC 분자에 결합하여 세포 표면으로 이동하는데, 여기서 이들은 적절한 수용체를 발현시키는 CD8+ T 세포에 의해 인지될 수 있다. 이것은 비록 무손상 형태의 유기체의 나머지 세포(예를 들어, 바이러스 항원) 또는 돌연변이체 항원(예를 들어, 활성 종양유전자 생성물)의 단백질이 세포 표면에서 발현되거나 분비되지 않더라도, T 세포 시스템, 특히 CD8+ T 세포에 이들 단백질과 다르거나 훨씬 많은 양의 단백질을 발현하는 세포를 검출하는 능력을 제공한다[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)].
T 세포는 또한 헬퍼 T 세포처럼 기능에 따라 분류될 수 있다; 세포 면역을 유도하는데 관여하는 T 세포; 억제성 T 세포; 및 세포독성 T 세포.
헬퍼 T 세포
헬퍼 T 세포는 B 세포를 자극하여 단백질 및 다른 T 세포-의존성 항원에 대한 항체 반응을 일으키는 T 세포이다. T 세포-의존성 항원은 개별 에피토프가 B 세포의 막 면역글로불린(Ig)을 가교시키기 못하거나 매우 비효율적으로 가교시키도록 단 1회 또는 제한된 횟수로 나타나는 면역원이다. B 세포는 이들의 막 Ig를 통해 항원에 결합하고, 복합체는 세포내이입을 겪는다. 엔도솜 및 리소솜 구획 내에서, 항원은 단백질분해 효소에 의해 펩티드로 단편화되고 생성된 펩티드 중 하나 이상은 이 소포 구획을 통과하는 클래스 II MHC 분자로 부하된다. 이후 생성된 펩티드/클래스 II MHC 복합체는 B-세포 표면 막으로 유출된다. 펩티드/클래스 II 분자 복합체에 특이적인 수용체를 갖는 T 세포는 B-세포 표면에서 이 복합체를 인지한다. [Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999)].
B-세포 활성화는 이의 TCR을 통한 T 세포의 결합 및 T-세포 CD40 리간드(CD40L)와 B 세포 상의 CD40의 상호작용 둘 모두에 의존한다. T 세포는 CD40L을 구성적으로 발현하지 않는다. 오히려, CD40L 발현은 T 세포의 TCR 및 CD80 또는 CD86에 의해 인지되는 둘 모두의 인지체 항원을 발현하는 APC와의 상호작용의 결과로서 유도된다. CD80/CD86은 활성화된 B 세포 및 T 세포를 포함하는 헬퍼 상호작용이 효율적인 항체 생산을 유도할 수 있도록 휴지기가 아닌 활성화된 B 세포에 의해 일반적으로 발현된다. 그러나, 많은 경우에, T 세포 상에서 CD40L의 초기 유도는 수지상 세포와 같이 CD80/86을 구성적으로 발현하는 APC의 표면의 항원 인지에 의존적이다. 그러한 활성화된 헬퍼 T 세포는 이후 B 세포와 효율적으로 상호작용하고 B 세포를 도울 수 있다. B 세포에서 막 Ig의 가교-결합은, 비록 비효율적일지라도, CD40L/CD40 상호작용과 상승작용하여 활발한 B-세포 활성화를 일으킬 수 있다. 증식, Ig 분비, 및 (발현되는 Ig 부류의) 부류 전환을 포함하는 B-세포 반응의 후속 사건은 T 세포-유래된 사이토카인의 작용에 의존하거나 이에 의해 증가된다[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)].
CD4+ T 세포는 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-10(TH2 세포)을 주로 분비하는 세포 또는 IL-2, IFN-γ, 및 림포톡신(TH1 세포)을 주로 생산하는 세포로 분화되는 경향이 있다. TH2 세포는 B-세포가 항체-생산 세포로 발달하는 것을 돕는데 매우 효과적인 반면, TH1 세포는 단핵구 및 대식세포의 살균 활성의 증가를 수반하여, 결과적으로 세포내 소포 구획에서 미생물을 용해시키는 효율을 증가시키는 세포 면역 반응의 효과적인 유도인자이다. TH2 세포의 표현형(즉, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)을 갖는 CD4+ T 세포가 효율적인 헬퍼 세포이지만, TH1 세포도 헬퍼가 될 수 있는 능력을 갖는다[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction, "Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)].
세포 면역의 유도에 관여하는 T 세포
T 세포는 또한 단핵구 및 대식세포가 세포내 미생물을 파괴하는 능력을 향상시키도록 작용할 수 있다. 특히, 헬퍼 T 세포에 의해 생산된 인터페론-감마(IFN-γ)는 단핵 식세포가 산화질소의 생성 및 종양 괴사 인자(TNF) 생산의 유도를 포함하는 세포내 박테리아 및 기생충을 파괴하는 몇 가지 메커니즘을 향상시킨다. TH1 세포는 IFN-γ를 생성하기 때문에 살균 작용을 향상시키는데 효과적이다. 대조적으로, TH2 세포에 의해 생산된 주요 사이토카인 중 2개인 IL-4 및 IL-10은 이러한 활성을 차단한다[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)].
억제성 또는 조절성 T(Treg) 세포
면역 항상성은 면역 반응의 시작 및 하향조절 간에 균형을 제어함으로써 유지된다. 아폽토시스 및 T 세포 아네르기(T 세포가 항원 만남 후 본질적으로 기능적으로 불활성화되는 내성 메커니즘[Scwartz, R. H., "T cell anergy", Annu. Rev. Immunol., Vol. 21: 305-334 (2003)] 둘 모두의 메커니즘은 면역 반응의 하향조절에 기여한다. 제3 메커니즘은 억제성 또는 조절성 CD4+ T(Treg) 세포에 의해 활성화된 T 세포의 활성 억제에 의해 제공된다[Reviewed in Kronenberg, M. et al., "Regulation of immunity by self-reactive T cells", Nature, Vol. 435: 598-604 (2005)]. IL-2 수용체 알파(IL-2Rα) 사슬(CD4+CD25+)을 구성적으로 발현하는 CD4+ Treg는 자연적으로 발생하는 아네르기성 및 억제성 T 세포 서브세트이다[Taams, L. S. et al., "Human anergic/suppressive CD4+CD25+ T cells: a highly differentiated and apoptosis-prone population", Eur. J. Immunol. Vol. 31: 1122-1131 (2001)]. CD4+CD25+ Treg의 고갈은 마우스에서 전신적 자가면역 질환을 초래한다. 또한, 이러한 Treg의 전달은 자가면역 질환의 발병을 예방한다. 뮤린 대응부와 유사하게, 인간 CD4+CD25+ Treg는 흉선에서 생성되고 세포-세포 접촉-의존성 메카니즘을 통해 반응자 T 세포의 증식을 억제하는 능력, IL-2 생산 능력의 부재, 및 시험관내 아네르기성 표현형을 특징으로 한다. 인간 CD4+CD25+ T 세포는 CD25 발현의 수준에 따라, 억제(CD25high) 및 비억제(CD25low) 세포로 나뉠 수 있다. 전사 인자의 포크헤드 패밀리의 구성원인 FOXP3은 뮤린 및 인간 CD4+CD25+ Treg에서 발현되는 것으로 나타났고 CD4+CD25+ Treg 발달을 조절하는 마스터 유전자인 것으로 보인다[Battaglia, M. et al., "Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+Foxp3+ regulator T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients", J. Immunol., Vol. 177: 8338-8347, (2006)].
세포독성 T 림프구(CTL)
표적 세포 내에서 생산된 단백질로부터 펩티드를 인지하는 CD8+ T 세포는 표적 세포의 용해를 유도한다는 점에서 세포독성 성질을 갖는다. CTL-유도된 용해의 메커니즘은 CTL에 의한 퍼포린, 즉, 표적 세포의 막에 삽입되어 그 세포의 용해를 촉진시킬 수 있는 분자의 생산을 포함한다. 퍼포린-매개된 용해는 활성화된 CTL에 의해 생산되는 일련의 효소인 그랜자임에 의해 증가된다. 많은 활성 CTL은 또한 그 표면에 다량의 fas 리간드를 발현한다. CTL 표면 상의 fas 리간드와 표적 세포의 표면 상의 fas의 상호작용은 표적 세포에서 아폽토시스를 개시하여, 이들 세포의 사멸을 발생시킨다. CTL-매개된 용해는 바이러스에 감염된 세포를 파괴하는 주요 메커니즘인 것으로 보인다.
프라이밍
본원에서 사용되는 용어 "프라이밍되지 않은 세포"(버진(virgin), 나이브(naive), 또는 미경험 세포로도 지칭됨)는 특정 특이성의 항원 수용체(T 세포의 경우 TCR, B 세포의 경우 BCR)를 생성하지만, 그 항원을 만난 적이 없는 T 세포 및 B 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "프라이밍"은 T 세포 및 B 세포 전구체가 이에 특이적인 항원을 만나는 과정을 지칭한다.
예를 들어, 헬퍼 T 세포와 B 세포가 상호작용하여 특이적 항체를 생산할 수 있기 전에, 항원-특이적 T 세포 전구체는 프라이밍되어야 한다. 프라이밍은 여러 단계에 관여한다: 항원 섭취, 처리, 및 항원 제시 세포에 의해 클래스 II MHC 분자에 결합된 세포 표면 발현, 림프 조직에서 헬퍼 T 세포 전구체의 재순환 및 항원-특이적 트래핑(trapping), 및 T 세포 증식 및 분화[Janeway, CA, Jr., "The priming of helper T cells", Semin. Immunol., Vol. 1(1): 13-20 (1989)]. 헬퍼 T 세포는 CD4를 발현하지만, 모든 CD4 T 세포가 헬퍼 세포는 아니다. Id. 헬퍼 T 세포의 클론 확장에 필요한 신호는 다른 CD4 T 세포가 필요로 하는 신호와 다르다. 헬퍼 T 세포 프라이밍을 위한 중요한 항원-제시 세포는 대식세포인 것으로 보인다; 헬퍼 T 세포 성장을 위한 중요한 제2 신호는 대식세포 생성물 인터루킨 1(IL-1)이다. Id. 프라이밍된 T 세포 및/또는 B 세포가 제2의 공-자극 신호를 받으면, 이들은 활성화된 T 세포 또는 B 세포가 된다.
림프구 활성화
용어 "활성화" 또는 "림프구 활성화"는 특이적 항원, 비특이적 미토겐, 또는 RNA, 단백질 및 DNA의 합성 및 림포카인의 생산을 발생시키는 동종이계 세포에 의한 림프구의 자극을 지칭한다; 다양한 이펙터 및 기억 세포의 증식 및 분화가 뒤따른다. 예를 들어, 성숙 B 세포는 이의 세포 표면 면역글로불린 Ig에 의해 인지되는 에피토프를 발현하는 항원과의 만남에 의해 활성화될 수 있다. 활성화 과정은 항원에 의한 막 Ig 분자의 가교-결합에 의존하는 직접적인 것(교차-결합-의존성 B 세포 활성화) 또는 헬퍼 T 세포와의 친밀한 상호작용의 맥락에서 가장 효율적으로 발생하는 간접적인 것("인지체 도움 과정")일 수 있다. T-세포 활성화는 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자의 그루브에 결합된 펩티드인 TCR/CD3 복합체와 이의 인지체 리간드의 상호작용에 의존한다. 수용체 진입에 의해 움직이는 분자 사건은 복잡하다. 가장 초기 단계 중에는 여러 신호전달 경로를 조절하는 기질 세트의 티로신 인산화를 발생시키는 티로신 키나제의 활성화가 있는 것으로 보인다. 이는 TCR을 ras 경로에 연결시키는 어댑터 단백질의 세트, 포스포리파제 Cγ1, 즉, 촉매 활성을 증가시키고 이노시톨 인지질 대사 경로와 결합하여 세포내 자유 칼슘 농도의 상승 및 단백질 키나제 C의 활성화를 발생시키는 티로신 인산화, 및 세포 성장 및 분화를 조절하는 일련의 다른 효소를 포함한다. T 세포의 완전한 반응성은, 수용체 진입에 추가하여, 부속 세포-전달된 공자극 활성, 예를 들어, 항원 제시 세포(APC) 상의 CD80 및/또는 CD86에 의한 T 세포 상의 CD28의 진입을 필요로 한다. 활성화된 B 림프구의 가용성 생성물은 면역글로블린(항체)이다. 활성화된 T 림프구의 가용성 생성물은 림포카인이다.
케모카인은 화학주성 사이토카인이고, 이는 보존된 시스테인 잔기의 상대적 위치에 기반하여 4개의 서브패밀리(C, CC, CXC 및 CX3C)로 분류될 수 있는 [Rossi D. et al., "The biology of chemokines and their receptors", Annu Rev Immunol,, Vol. 18: 217-242, (2000)] 다양한 면역 및 신경 기능을 갖는 저 분자량(8-11 kDa)의 구조적으로-관련된 단백질의 패밀리를 구성한다[Mackay C.R., "Chemokines: immunology's high impact factors", Nat Immunol., Vol. 2: 95-101, (2001)]; [Youn B. et al., "Chemokines, chemokine receptors and hematopoiesis", Immunol Rev, Vol. 177: 150-174, (2000)]. 케모카인은 혈액, 림프절 및 조직 사이의 백혈구 이동을 유도하는 필수 분자이다. 이들은 항상 한 유형의 수용체로 국한되는 것은 아니므로 복잡한 신호전달 네트워크를 구성한다[Loetscher P. et al., "The ligands of CXC chemokine receptor 3, I-TAC, Mig, and IP10, are natural antagonists for CCR3", J. Biol. Chem., Vol. 276: 2986-2991, (2001)]. 케모카인은 7개-막통과-도메인 G-단백질-커플링된 수용체인 표면 수용체를 활성화시킴으로써 세포에 영향을 미친다. 특정 케모카인에 대한 백혈구 반응은 케모카인 수용체의 발현에 의해 결정된다. 수용체에 대한 케모카인의 결합은 생물학적 반응의 활성화에서 최고점에 달하는 사이토카인의 작용과 유사하게 다양한 신호전달 캐스케이드를 활성화시킨다. CCR5 수용체에 대한 리간드의 분비, 활성화시 조절된 정상 T 세포 발현 및 분비(RANTES), 대식세포 염증 단백질(MIP)-1α/및 MIP-1β[Schrum S. et al., "Synthesis of the CC-chemokines MIP-1alpha, MIP-1beta, and RANTES is associated with a type 1 immune response", J Immunol, Vol. 157: 3598-3604, (1996)] 및 유도된 단백질 (IP)-10인 CXC 케모카인 수용체 3(CXCR3)에 대한 리간드[Taub D.D. et al., "Recombinant human interferon-inducible protein 10 is a chemoattractant for human monocytes and T lymphocytes and promotes T cell adhesion to endothelial cells", J Exp Med., Vol. 177:1809-1814, (1993)]는 원하지 않는 TH1 반응의 증가와 관련이 있었다. 추가로, IL-2 및 IFN-γ의 상승된 손상 전-염증성 사이토카인 수준은 T1D와 상관관계가 있다[Rabinovitch A. et al., "Roles of cytokines in the pathogenesis and therapy of type 1 diabetes", Cell Biochem Biophys, Vol. 48(2-3): 159-63, (2007)]. T 세포 침윤을 특징으로 하는 TH1 췌장 침윤물 및 다른 염증성 병변에서 케모카인이 관찰되었다[Bradley L.M. et al., "Islet-specific Th1, but not Th2, cells secrete multiple chemokines and promote rapid induction of autoimmune diabetes", J Immunol, Vol. 162:2511-2520, (1999)].
혈장에서 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α와 같은 전-염증성 사이토카인이 주로 검출되었고 이는 항-염증 및 면역 억제 사이토카인 TGF-β1 및 IL-10에 의해 저지 및 조절되는 T2D의 발달 및 인슐린 내성에 관여한다[Alexandraki K. et al., "Inflammatory process in type 2 diabetes: The role of cytokines", Annals of the New York Academy of Sciences, 1084: 89-117, (2006)]; [Kumar N.P. et al. 2015. Eur J Immunol. doi: 10.1002/eji.201545973 ahead of print]. IL-17A는 여러 자가면역 질환에 관여하는 널리 공지된 전-염증성 사이토카인이다.
면역 내성
면역 시스템은 자가-항원에 내성이고, 즉, 외래 물질에서 발현된 항원성 결정인자와 숙주의 조직에 의해 발현된 항원성 결정인자를 구별할 수 있다. 면역 내성 또는 면역학적 내성으로 지칭되는 숙주 항원을 무시하는 시스템의 능력은 면역학적 내성을 통해 자가-항원을 인지할 수 있는 세포의 제거 또는 불활성화를 포함하는 능동적 과정이다[Fundamental immunology, 4th Edn, William E. Paul, Ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999), at p. 2].
면역 내성은 그 상태가 원래 유도되는 위치에 따라, 즉, 이것이 흉선 및 골수(중추)에 있는지 또는 다른 조직 및 림프절(말초)에 있는지에 따라 1) 중추 내성 또는 2) 말초 내성으로 분류된다. 이러한 형태의 내성이 확립되는 생물학적 메커니즘은 다르지만, 결과적인 효과는 유사하다[Raker V. K. et al., "Tolerogenic Dendritic Cells for Regulatory T Cell Induction in Man", Front Immunol, Vol., 6(569): 1-11, (2015)].
면역 시스템이 자기-분자를 비-자기-분자와 구별하도록 교육받는 주요 방법인 중추 내성은 이들이 완전한 면역적격 세포로 성숙되기 전 시점에 자가반응성 림프구 클론을 삭제함으로써 확립된다. 이것은 T 및 B 림프구에 대해 각각 흉선 및 골수에서 림프구 발생 동안 일어난다[Sprent J. et al., "The thymus and central tolerance", Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, Vol. 356(1409): 609-616, (2001)]. 이러한 조직에서, 성숙한 림프구는 흉선 상피 세포 및 흉선 수지상 세포, 또는 골수 세포에 의해 제시된 자가-항원에 노출된다. 자가-항원은 내인성 발현, 순환 혈액을 통한 말초 부위로부터의 항원의 도입, 및 흉선 간질 세포의 경우, 전사 인자 AIRE의 작용에 의한 다른 비-흉선 조직의 단백질의 발현으로 인해 존재한다[Murphy, Kenneth. Janeway's Immunobiology: 8th ed. Chapter 15: Garland Science. (2012), pp. 611-668]; [Klein L., "Aire gets company for immune tolerance", Cell, Vol. 163(4):794-795, (2015)]. 자가-항원에 강하게 결합하는 수용체를 갖는 림프구는 자가반응성 세포의 아폽토시스, 또는 비-반응성 상태를 의미하는 아네르기의 유도에 의해 제거된다[Id. at pp. 275-334]. 약한 자가반응성 B 세포는 또한 B 세포 수용체의 자극에 반응하지 않는 면역학적 무활성의 상태로 남아 있을 수 있다. 일부 약하게 자가-인지하는 T 세포는 대안적으로 자연 조절성 T 세포(nTreg 세포)로 분화되고, 이는 T 세포 자가반응의 잠재적 경우를 낮추기 위해 말초 내에서 센티넬 역할을 한다[Id. at pp. 611-668].
삭제 임계값은 B 세포보다 T 세포에 대해 더 엄격한데, 그 이유는 T 세포가 직접적인 조직 손상을 유발할 수 있는 세포의 주요 집단이기 때문이다. 또한, 유기체는 이의 B 세포가 보다 다양한 항원을 인지하게 하여, 이들이 매우 다양한 병원체에 대한 항체를 유도할 수 있게 하는 것이 더욱 유리하다. B 세포는 동일한 항원을 인지하는 더욱 자체-제한된 T 세포에 의한 확인 후에만 완전히 활성화될 수 있기 때문에, 자가반응이 잘 저지된다[Murphy, Kenneth. Janeway's Immunobiology: 8th ed. Chapter 8: Garland Sciences. pp. 275-334].
이 음성적 선택 과정은 잠재적으로 개체 자신의 조직에 대한 강력한 면역 반응을 개시할 수 있는 T 및 B 세포가 외래 항원을 인지하는 능력을 보존하면서 파괴되도록 보장한다. 림프구 교육의 이 단계는 자가면역을 예방하는데 해롭다. 림프구 발달 및 교육은 태아 발달에서 가장 활발하지만, 미성숙 림프구가 생성됨에 따라 일생을 통틀어 계속되며, 성년기에 흉선이 퇴화되고 골수가 줄어들면서 느려진다[Murphy, Kenneth. Janeway's Immunobiology: 8th ed. Chapter 8: Garland Sciences. (2012), pp. 275-334]; [Jiang T.T., "Regulatory T cells: new keys for further unlocking the enigma of fetal tolerance and pregnancy complications", J Immunol., Vol. 192(11): 4949-4956, (2014)].
T 및 B 세포가 성숙하여 말초 조직 및 림프절에 들어간 후 말초 내성이 발생한다[Murphy, Kenneth. Janeway's Immunobiology: 8th ed. Chapter 8: Garland Sciences. pp. 275-334]. 이것은 면역 반응을 조율하고 B 세포가 항체 생산을 진행하기 위해 필요로 하는 확인 신호를 B 세포에 제공하는, T 세포, 특히 CD4+ 헬퍼 T 세포의 수준에서 대개 제어에 관여하는 다수의 중첩 메커니즘에 의해 설명된다. 흉선에 남아 있는 T 세포는 비교적 안전하지만 완전히 안전하지는 않기 때문에, 흉선에서 제거되지 않은 정상 자가-항원에 대한 부적절한 반응이 발생할 수 있다. 일부는 T 세포가 흉선에서 만나지 못한 자가-항원에 반응할 수 있는 수용체(TCR)를 가질 것이다[Murphy, Kenneth. Janeway's Immunobiology: 8th ed. Chapter 8: Garland Sciences. (2012), pp. 275-334]. 흉선내 음성적 선택을 피한 자가-반응성 T 세포는 이들이 말초 조직에서 주로 nTreg 세포에 의해 삭제되지 않는 한 세포 상해를 일으킬 수 있다.
CCR7은 이차 림프 기관으로의 T, B 및 수지상 세포 이동에 중요한 귀소 수용체이다[Forster R. et al., "CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs", Cell, Vol. 99: 23-33, (1999)]. 중추 및 말초 내성의 유도 및 유지를 포함하는 [Hugues S. et al., " Immunity, 16:169-181, (2002)] CCR7에 대한 여러 역할이 기술되었다[Hopken U. E. et al., "The chemokine receptor CCR7 controls lymph node-dependent cytotoxic T cell priming in alloimmune responses", Eur J Immunol., Vol. 34:461-470, (2004)], CD45 백혈구의 두 가지 아이소형의 발현에 기반하여, T 세포는 종종 나이브 및/또는 이펙터 CD45RA+ T 세포 또는 기억 CD45RO+ T 세포로 특성화된다.
일반적으로 흉선 속질 상피 세포에서 발현되는 자가면역 조절제(Aire)는 말초 자가-항원의 딴곳 발현을 매개하고 자가-반응성 T 세포의 삭제를 매개함에 의해 면역 내성에서의 역할을 담당한다. [Metzger T.C. et al., "Control of central and peripheral tolerance by Aire", Immunol. Rev. 2011, Vol. 241: 89-103, (2011)].
특정 항원에 대한 적절한 반응성은 또한 반복 노출 후에 내성의 유도에 의해 억제될 수 있다. 나이브 CD4+ 헬퍼 T 세포는 말초 조직에서 유도된 Treg 세포(iTreg 세포)로 분화되거나, 이에 따라 가까운 림프 조직(림프절, 점막-관련 림프 조직 등)에서 분화된다. 이 분화는 T 세포 활성화시에 생산된 IL-2, 및 수지상 세포(DC) 또는 다른 항원 제시 세포를 용인하는 것을 포함하여, 임의의 다양한 공급원으로부터의 TGF-β에 의해 매개된다[Curotto de Lafaille et al., "Effective recruitment and retention of older adults in physical activity research: PALS study", Immunity, Vol. 30(6): 626-635, (2009)].
T 기억 세포
적응 면역 반응을 통한 병원체의 인지 및 근절 이후에, 대다수(90-95%)의 T 세포는 아폽토시스를 겪고 나머지 세포는 중추 기억 T 세포(TCM), 이펙터 기억 T 세포(TEM), 및 상주 기억 T 세포(TRM)로 지정되는 기억 T 세포의 풀을 형성한다[Clark, R.A., "Resident memory T cells in human health and disease", Sci. Transl. Med., 7, 269rv1, (2015)].
표준 T 세포와 비교하여, 이들 기억 T 세포는 특정 표면 마커의 발현, 상이한 사이토카인 프로파일의 신속한 생산, 직접적인 이펙터 세포 기능의 능력, 및 독특한 귀소 분포 패턴과 같은 명료한 표현형으로 오래 지속된다. 기억 T 세포는 오펜더(offender)의 재감염을 제거하여 면역 시스템의 균형을 신속하게 복구하기 위해 이들의 개개 항원에 재-노출시 빠른 반응을 나타낸다. 자가면역 기억 T 세포가 자가면역 질환을 치료하거나 치유하려는 대부분의 시도를 방해한다는 것을 입증하는 증거가 증가하고 있다[Clark, R.A., "Resident memory T cells in human health and disease", Sci. Transl. Med., Vol. 7, 269rv1, (2015)].
자가면역
숙주 분자 상의 항원성 결정인자/에피토프에 대해 유도된 조직-손상 면역 반응을 야기하는 자가-항원의 비정상적인 제시 또는 면역학적 내성을 확립하지 못하면 종종 신체의 조직이 그 자신의 면역 시스템에 의해 공격받을 때 발생하는 질병을 의미하는 자가면역 질환이 발생한다[Round J.L. et al., "Coordination of tolerogenic immune responses by the commensal microbiota", J Autoimmun, Vol. 34(3): 220-225, (2010)]; [Choi J. et al., "The pathogenesis of systemic lupus erythematosus-an update", Curr Opin Immunol, Vol. 24(6): 651-657, (2012)]. 자가면역이거나 주요 자가면역 성분을 갖는 예시적인 질환은 비제한적으로 애디슨병, 원형 탈모(AA), 아밀로이드증, 셀리악병, 크론병, 사구체신염, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 타입 1 당뇨병, 중증근무력증, 다발근육염, 건선, 류마티스 관절염, 공피증, 쇼그렌 증후군, 및 전신홍반루푸스를 포함한다. 한 자가면역 질환의 존재는 또 다른 동시 자가면역 질환이 발병할 기회를 증가시킨다.
글루코스 항상성
일반적으로, 글루코스 섭취 후, 혈장 글루코스 농도의 증가는 인슐린 방출을 촉진하고, 이는 내장(간 및 위장 조직) 및 말초 글루코스 흡수를 자극하고, 내인성(주로 간) 글루코스 생산을 억제한다. 건강한 성인에서, 혈당치는 70 내지 99 mg/dL의 범위 내로 엄격하게 조절되고, 특정 호르몬(예를 들어, 인슐린, 글루카곤, 인크레틴) 뿐만 아니라 중추신경계 및 말초신경계에 의해 유지되어 대사 요건을 충족시킨다. 뇌, 근육, 위장관, 간, 신장 및 지방 조직 내의 다양한 세포 및 조직은 또한 흡수, 대사, 저장 및 분비에 의해 혈당 조절과 관련된다[DeFronzo R.A., "Pathogenesis of type 2 diabetes mellitus" Med. Clin. N. Am., Vol. 88: 787-835 (2004)]; Gerich J.E., "Physiology of glucose homeostasis", Diabetes Obes. Metab. Vol. 2: 345-350, (2000)]. 정상 생리학적 환경 하에서, 글루코스 수준은 고-탄수화물 식사의 섭취 후에도 거의 140 mg/dL 이상으로 증가하지 않는다.
강력한 항지질분해(지방 분해 억제) 호르몬인 인슐린은 인슐린-민감성 세포로의 글루코스의 수송을 촉진하고, 췌장의 랑게르한스 섬 내에서의 글리코겐합성(글루코스의 글리코겐으로의 전환) 및 지방형성(지방 형성)을 통한 저장 화합물로의 이의 전환을 촉진함으로써 혈당치를 감소시키는 것으로 공지되어 있으며, β-세포는 인슐린을 생산한다.
글루코스 항상성에서 또한 일정한 역할을 하는 호르몬인 글루카곤은 낮은 정상 글루코스 수준 또는 저혈당증에 대해 반응하여 랑게르한스 섬 내에서 α-세포에 의해 생산되며, 글리코겐분해를 가속화하고, 글루코스신합성을 촉진함으로써 글루코스 수준을 증가시키는 작용을 한다. 글루코스-함유 식사 후, 글루카곤 분비는 고인슐린혈증에 의해 억제되며, 이는 간 글루코스 생산의 억제 및 정상 식후 내당능의 유지에 기여한다.
글루코스-의존성 인슐린자극 폴리펩티드(GIP) 및 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1)을 포함하는 인크레틴이 또한 인슐린 및 글루카곤에 대한 이의 효과에 의해 부분적으로 혈당 조절에 관여한다[Drucker D.J. et al., "The incretin system: glucagon-like peptide-1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type 2 diabetes", Lancet, Vol. 368: 1696-1705, (2006)]. GLP-1 및 GIP 둘 모두는 글루코스-의존성 호르몬으로 간주되며, 이는 이들이 글루코스 수준이 정상 공복 혈장 글루코스 수준 이상으로 증가하는 경우에만 분비됨을 의미한다. 일반적으로, 이들 호르몬은 식사에 반응하여 방출되며, 췌장 β-세포 상의 특정 수용체를 활성화시킴으로서, 이들은 인슐린 분비 자극에 도움을 준다. 그러나, 글루코스 수준이 낮은 경우, GLP-1 및 GIP 수준(및 인슐린 분비에 대한 이들의 자극 효과)이 감소된다[Drucker D.J., "The biology of incretin hormones", Cell Metab. Vol. 3: 153-165, (2006)].
프리프로글루카곤-유래된 펩티드 글루카곤인 GLP1 및 GLP2는 프리프로글루카곤 유전자에 의해 인코딩되며, 이는 중추신경계, 장 L-세포, 및 췌장 및 위 α-세포에서 발현된다. 프로호르몬 전환효소(PC)에 의한 번역후 절단은 모든 이들 펩티드를 발생시키는 프리글루카곤 호르몬의 성숙을 담당한다. 각각의 조직에서의 상이한 PC 서브타입의 발현은 각각의 상이한 펩티드의 생산을 매개한다. α-세포에서, 프로단백질 전환효소 섭틸리신(subtilisin)/켁신(kexin) 타입 2(PCSK2)의 우세는 생성물 글리센틴(glicentin), 글리센틴-반복 췌장 폴리펩티드, 개재 펩티드 1 및 주요 프로글루카곤 단편과 함께 글루카곤의 생산을 발생시킨다[Dey A. et al., "Significance of prohormone convertase 2, PC2, mediated initial cleavage at the proglucagon interdomain site, Lys70-Arg71, to generate glucagon", Endocrinol., Vol. 146: 713-727, (2005)]. 장 내분비 세포에서, PCSK1/3 효소는 프리프로글루카곤 호르몬을 절단하여 글리센틴, 개재 펩티드 1 및 옥신토모둘린과 함께 GLP1 및 GLP2를 생성시킨다[Mojsov S., "Preproglucagon gene expression in pancreas and intestine diversifies at the level of post-translational processing", J. Biol. Chem., Vol. 261: 11880-11889 (1986)]. 특정 조건 하에, 섬 α 세포는 GLP-1 생산을 위한 장외 부위이다[Portha B. et al., "Activation of the GLP-1 receptor signalling pathway: a relevant strategy to repair a deficient beta-cell mass", Exptl Diabetes Res. Article 376509: 1-11, (2011)]. GLP-1의 많은 관찰된 세포 효과 중 하나는 전압-의존성 칼슘 채널을 통한 Ca2+ 유입을 개시하고, 인슐린의 세포외 방출을 촉발시키는 β-세포 KATP 채널의 억제이다[MacDonald P.E. et al., "The multiple actions of GLP-1 on the process of glucose-stimulated insulin secretion", Diabetes, Vol. 51 (Suppl. 3): S434-S442, (2002)].
세포로의 글루코스의 수송
글루코스는 모든 세포막을 통해 용이하게 확산될 수 없으므로, 이는 대부분의 세포에 진입하기 위해 인슐린 및 수송 단백질(촉진된 글루코스 수송체[GLUT] 분자)의 패밀리 둘 모두로부터의 도움을 필요로 한다[Bryant, et al, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. "Regulated transport of the glucose transporter GLUT 4", Vol. 3(4): 267-277, (2002)]. GLUT는 글루코스가 더욱 용이하게 이동할 수 있는, 달리 소수성인 세포막을 가로지르는 수성 포어를 형성한다. 12개의 공지된 GLUT 분자 중, GLUT4은 지방, 근육, 및 심장 조직에 대한 주요 수송체로 간주되는 반면, GLUT 1, 2, 3, 및 8은 다른 기관(예를 들어, 뇌, 간)으로의 글루코스 진입을 촉진한다. GLUT4의 활성화, 및 차례로 근육 및 지방 조직으로의 촉진된 글루코스 확산은 인슐린의 존재에 의존적인 반면, 다른 GLUT의 기능은 인슐린에 더욱 독립적이다[Uldry M. et al., "The SLC2 family of facilitated hexose and polyol transporters", Thorens B, Eur. J. Physiol. 2004; Vol. 447: 480-489, (2004)].
말초 조직에서의 대부분의 글루코스 흡수(80% 이상)는 근육에서 발생하며, 여기서 글루코스는 에너지를 위해 즉시 사용되거나 글리코겐으로서 저장될 수 있다. 골격근은 인슐린-의존적이며, 따라서 글리코겐의 생산을 조절하는 주요 효소인 글리코겐 신타제의 활성화를 위해 인슐린을 필요로 한다. 지방 조직은 말초 글루코스 흡수의 훨씬 적은 양을 담당하는 반면(2%-5%), 이는 저장된 트리글리세라이드로부터의 자유 지방산(글루코스신합성을 증가시킴)의 방출을 조절하여 근육 및 간에서의 인슐린 민감성에 영향을 줌으로써 전신 글루코스 항상성의 유지에 중요한 역할을 한다.
간은 글루코스 흡수를 촉진하기 위해 인슐린을 필요로 하지 않으나, 글루코스 생산을 조절하기 위해 인슐린을 필요로 한다. 따라서, 예를 들어, 인슐린 농도가 낮은 경우, 간 글루코스 생산이 증가한다. 또한, 인슐린은 간이 흡수된 글루코스 대부분을 글리코겐의 형태로 저장하는 것을 돕는다.
신장은 순환으로의 글루코스의 방출(글루코스신합성), 신장 에너지 요구를 충족시키기 위한 순환으로부터의 글루코스의 흡수, 및 근위 세관에서의 글루코스의 재흡수를 통해 글루코스 항상성에 일정한 역할을 한다. 신장은 또한 소변에서의 배설을 촉진함으로써 과량의 글루코스(수준이 약 180 mg/dL을 초과하는 경우, 이러한 임계값은 만성 고혈당증 동안 상승할 수 있음)의 제거를 돕는다.
인간 섬의 세포구조
인간 섬에서, 인슐린-함유 β-세포는 섬 내의 다른 세포 유형과 혼합되어 있으며, 즉, 인슐린-, 글루카곤-, 및 소마토스타틴-함유 세포는 인간 섬 전체에 걸쳐 분포되어 있는 것으로 밝혀졌다[Cabrera O. et al., "The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function", Proc. Natl Acad. Sci. U.S., Vol. 103: 2334-2339, (2006)]. 인간 섬은 명백한 구획을 나타내지 않지만, α-세포의 90%는 β-세포와 직접 접촉하며, β-세포는 섬 전체에 걸쳐 다른 내분비 세포와 자유롭게 혼합되어 있다. β, α, 및 δ-세포는 섬 내의 혈관에 동등하고 무작위적으로 접근하며, 이는 상이한 내분비 세포가 혈관 주위의 층으로 조직될 가능성을 배제한다. 이들 결과는 섬 관류의 설정 순서가 없고, 임의의 제공된 세포 유형이 자체 세포 유형을 포함하여 다른 세포 유형에 영향을 미칠 수 있다는 모델을 지지한다[G. da Silva Xavier et al.," Per-arnt-sim (PAS) domain-containing protein kinase is downregulated in human islets in type 2 diabetes and regulates glucagon secretion", Diabetologia, Vol. 54: 819-827, (2011)].
자가면역 질환으로서의 당뇨병
당뇨병은 고혈당증을 특징으로 하는 대사 질환 그룹이다. 만성 고혈당증은 안구, 신장, 신경, 심장 및 혈관을 포함하는 기관의 장기간의 손상, 기능장애, 및 잠재적 기능부전과 관련된다. 당뇨병을 치료하기 위한 이상적인 치료제는 아직 개발되지 않았다.
타입 1 당뇨병(T1D)
타입 1 당뇨병에서, β 세포는 자가면역 과정에 의해 파괴되며, 대체로 α-세포로 대체된다. [Unger R.H. et al., "Paracrinology of islets and the paracrinopathy of diabetes", Proc. Natl Acad. Sci., U.S., Vol. 107(37): 16009-16012, (2010)]. 이들 α-세포는 병렬된 β-세포로부터의 인슐린의 높은 국소 농도에 의해 일반적으로 제공되는 긴장 억제가 결여되어 부적절한 고글루카곤혈증을 발생시키며[Raskin P. et al. Glucagon and diabetes. The Medical Clinics of North America 62, 713 (1978)]; [Habener J. F. et al., "Alpha cells some of age", Trends in Endocrinology & Metabolism: TEM Vol. 24, 153-163 (2013)]; [Unger R.H. et al., "Glucagonocentric restructuring of diabetes: a pathophysiologic and therapeutic makeover", J. Clinical Investig. Vol. 122(1): 4-12, (2012)]; [Vuguin P.M. et al. "Novel insight into glucagon receptor action: lessons from knockout and transgenic mouse models", Diabetes, Obesity & Metabolism, Vol. 13(1), 144-150, (2011)], 이는 글루카곤 분비를 증가시키는 고혈당증의 급상승을 유발시킨다[Unger R.H. et al., "Glucagonocentric restructuring of diabetes: a pathophysiologic and therapeutic makeover", J. Clinical Investig. Vol. 122(1): 4-12, (2012)]. 정상 섬에서 인접한 β-세포가 α-세포에 주는 인슐린을 매치시키기 위해 이상 인슐린 수준이 필요하다. 이는 대상체를 혈관벽에서 저밀도 지질단백질(LDL)의 축적으로서 상기 후유증을 증가시키는 저혈당증의 빈번한 발생빈도에 노출시켜 죽상경화증, 및 관상 동맥 질환의 차단을 야기시키는 평생의 고인슐린혈증을 발생시킨다.
T1D의 4개의 병리학적 특징은 혈당치, 헤모글로빈 A1C, 글루카곤 및 C-펩티드이다
T1D의 면역 기능장애는 복잡하며, 췌장 섬 및 췌장 외부 둘 모두에 영향을 미친다. 면역 시스템의 상이한 성분[예를 들어, CD4+, CD8+ T 세포, T 조절성 세포(Treg), B 세포, 수지상 세포(DC), 단핵구/대식세포(Mo/M
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), 자연 살해 T 세포(NKT)]은 모두 T1D의 자가면역 반응에 활발히 기여할 것으로 예견되며, 따라서 상기 질환을 갖는 개체 전체에서 작용할 효과적이고 성공적인 치료 또는 치료법을 개발하려는 잠재적 노력을 복잡하게 만든다. 여러 임상 시험[Bach J.F., "Anti-CD3 antibodies for type 1 diabetes: beyond expectations", Lancet., Vol. 378: 459-460, (2011)]; [Wherrett D.K. et al., "Antigen-based therapy with glutamic acid decarboxylase (GAD) vaccine in patients with recent-onset type 1 diabetes: a randomized double-blind trial", Lancet., Vol. 378: 319-327, (2011)]은 T1D에 대한 요법을 개발하고 치료법을 찾는데 있어서의 장애를 강조하며, 면역 시스템의 하나 또는 몇 가지 구성요소의 췌장 효과를 표적화하기보다는 국소 췌장 및 전신 수준 둘 모두에서의 포괄적인 면역 조절을 발생시키는 접근법의 필요성을 지적한다.
T1D에서의 자가면역을 위한 가능한 촉발제는 자가면역의 발달을 독립적으로 또는 공동으로 개시하거나 강화시키는 작용을 할 수 있는 유전적, 후성적, 신체적, 사회적, 및 환경적 요인을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 면역 시스템에서의 T1D-관련 기능장애는 T 세포, B 세포, 조절성 T 세포(Treg), 단핵구/대식세포, 수지상 세포(DC), 자연 살해(NK) 세포, 및 자연 살해 T(NKT) 세포를 포함하는 다수의 세포 유형 및 표적에서의 기능장애에 대해 추적되었다[Lehuen A. et al., "Immune cell crosstalk in type I diabetes", Nat Rev Immunol. Vol. 10: 501-513, (2010)]. T1D-관련 자가면역 반응의 폴리클로날 특성 및 T1D 환자에서의 면역 조절의 총체적 난제로 인해, 자가면역 반응의 하나 또는 몇 가지 구성요소만을 표적으로 하는 요법 및 시험은 T 세포에 대한 항-CD3 Ab, B 세포에 대한 항-CD19 Ab, 및 GAD 65 예방접종을 포함하는 최근의 시험이 실패한 바와 마찬가지로 실패할 가능성이 있다[Bach J.F., "Anti CD-3 antibodies for type 1 diabetes: beyond expectations", Lancet, Vol. 378: 459-460, (2011)]; [Mathieu C. et al., "Arresting type I diabetes after diagnosis: GAD is not enough", Lancet, Vol. 378: 291-292, (2011)].
줄기 세포 요법은 파괴된 췌장 섬 β-세포를 대체하는 수단으로 연구되어 왔으나, 이러한 접근법은 근본적인 자가면역 반응의 감소가 없으면 거의 효과가 없다.
T1D 환자에서의 자가면역 반응의 폴리클로날 특성 및 면역 조절의 총체적 난제로 인해[Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cells and the journey to a cure for type 1 diabetes", Autoimmun Rev., Vol. 10: 103-107, (2010)]; [Abdi R. et al., "Immunomodulation by mesenchymal stem cells: a potential therapeutic strategy for type 1 diabetes", Diabetes, Vol. 57: 1759-1767, (2008)]; [Aguayo-Mazzucato C. et al., "Stem cell therapy for type I diabetes", Nat Rev Endocrinol., Vol. 6: 139-148, (2010)]; [Uccelli A. et al., "Mesenchymal stem cells in health and disease", Nat Rev Immunol., Vol. 8: 726-736, (2008)]; [Zhao Y. et al.," Immune regulation of T lymphocyte by a newly characterized human umbilical cord blood stem cell", Immunol Lett., Vol. 108: 78-87, (2007)], T1D에서의 근본적인 자가면역을 다루기 위한 시도는 성공적이지 못했다[Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cells and the journey to a cure for type 1 diabetes", Autoimmun Rev., Vol. 10: 103-107, (2010)]. 이들 난제를 다루기 위해 개별적 접근법의 조합이 제안되었으나[Aguayo-Mazzucato C et al., "Stem cell therapy for type I diabetes mellitus", Nat Rev Endocrinol, Vol. 6: 139-148, (2010)]; [Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cell-modulated regulatory T lymphocytes reverse the autoimmune-caused type 1 diabetes in nonobese diabetic (NOD) mice", PLoS ONE, Vol. 4: e4226, (2009)]; [Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet β-cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med. Vol. 10(3), 1-11, (2012)], 이들 접근법에 대한 고수는 여전히 복잡하고, 종종 비용이 많이 든다.
타입 2 당뇨병
타입 2 당뇨병(T2D)은 β-세포가 존재하고, 따라서 타입 1 당뇨병과 구별되는 고혈당 장애이다. 다수의 요인이 T2D의 발달에 기여하나, 호르몬 작용의 복잡한 경로에서 하나 이상의 지점에서 부적절한 인슐린 분비(인슐린 결핌) 및/또는 인슐린에 대한 감소된 조직 반응(인슐린 내성)이 중추적인 결함이다[Triplitt C.L., "Examining the mechanisms of glucose regulation", Am. J. Manag. Care, Vol. 18 (1 Suppl) S4-S10, (2012)]. 인슐린 결핍 및 인슐린 내성은 종종 공존하나, 고혈당증에 대한 기여는 T2D의 스펙트럼에 따라 매우 가변적일 수 있다.
T2D의 병인이 췌장 섬 β-세포에 영향을 미치는 염증을 개시하는 자가면역 성분을 포함한다는 증거가 존재하며, 이는 면역 조절을 통한 인슐린 내성의 메커니즘 및 잠재적 치료에 대한 새로운 통찰을 제공한다. 일부 임상 연구는 T2D 환자[Jagannathan-Bogdan M. et al., "Elevated proinflammatory cytokine production by a skewed T cell compartment requires monocytes and promotes inflammation in type 2 diabetes", J Immunol, Vol. 186: 1162-1172, (2011)] 및 비만 환자[Sumarac-Dumanovic M. et al.," Increased activity of interleukin-23/interleukin-17 proinflammatory axis in obese women", Int J Obes (Lond), Vol. 33: 151-156, (2009)]에서의 IL-17 생산의 증가하는 수준을 나타내었다. 다른 연구는 TH1-관련 사이토카인 IL-12의 수준이 T2D 대상체에서 증가하는 것을 나타낸다[Wu H.P. et al., "High interleukin-12 production from stimulated peripheral blood mononuclear cells of type 2 diabetes patients", Cytokine, Vol. 51: 298-304, (2010)].
조직 구획
다세포 유기체에서, 일반적인 기능을 수행하는데 특수화된 세포는 대개 분비된 세포외 거대분자인 세포외 매트릭스(ECM)의 복잡한 네트워크에 임베딩된 협동 어셈블리로 조직화되어 특수화된 조직 구획을 형성한다. 그러한 조직 구획 내의 개별 세포는 ECM 거대분자와 접촉한다. ECM은 세포 및 구획을 함께 유지하는데 도움이 되며 세포가 이동하고 서로 상호작용할 수 있는 조직화된 격자 또는 스캐폴드를 제공한다. 많은 경우에, 구획 내의 세포는 직접적인 세포-세포 부착에 의해 그 자리에 유지될 수 있다. 척추동물에서, 그러한 구획은 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 3개의 배아 배엽층으로부터 유래된 4개의 주요 유형일 수 있다: 결합 조직 구획, 상피 조직 구획, 근육 조직 구획 및 신경 조직 구획. 신경 조직 구획 및 상피 구획의 일부는 외배엽으로부터 분화된다; 결합 조직 구획, 근육 조직 구획 및 상피 조직 구획의 추가 부분은 중배엽으로부터 유래된다[Kiecker C. et al., "Molecular specification of germ layers in vertebrate embryos", Cell Mol Life Sci., Epub ahead of print, (2015) PMID: 26667903].
줄기 세포 기생위치(Niche)
성체 조직 구획은 신체 내에서의 이들의 위치에 따라 결정된 내배엽, 중배엽 또는 외배엽 운명의 다양한 세포 계통으로 분화될 수 있는 성체 줄기 세포의 내인성 기생위치를 함유한다. 예를 들어, 적절한 내부 및 외부 신호 세트의 존재 하에, 골수-유래된 성체 조혈 줄기 세포(HSC)는 혈액, 내피, 간 및 근육 세포로 분화될 가능성을 갖고; 뇌-유래된 신경 줄기 세포(NSC)는 뉴런, 별아교세포, 희소돌기아교세포 및 혈액 세포로 분화될 가능성을 갖고; 창자- 및 표피-유래된 성체 상피 줄기 세포(EpSC)는 상피성 움 및 표피층의 세포를 발생시킬 가능성을 갖고; 지방-유래된 줄기 세포(ASC)는 지방, 근육, 연골, 내피 세포, 뉴런-유사 세포 및 골모세포를 발생시킬 가능성을 갖고; 골수-유래된 성체 중간엽 줄기 세포(MSC)는 뼈, 연골, 힘줄, 지방, 근육, 골수 간질 및 뉴런 세포를 발생시킬 가능성이 있다[Hodgkinson T. et al., "Adult stem cells in tissue engineering", Expert Rev Med Devices, Vol. 6(6): 621-640].
내인성 성체 줄기 세포는 주어진 조직 구획의 ECM 구성요소 내에 임베딩되어, 지지 세포와 함께, 세포 기생위치를 형성한다. 주변의 미세환경과 함께 ECM 스캐폴드 내의 그러한 세포 기생위치는 특수화된 표현형 및 기능 특성을 갖는 성체 조직 세포를 형성하기 위해 투입된 전구체 세포로의 줄기 세포 분화 및 후속 전구체 세포 성숙을 개시하는데 요구되는 성장 인자 및 전사 인자를 포함하는 중요한 생화학적 및 물리적 신호에 기여한다[Hodgkinson T. et al., "Adult stem cells in tissue engineering", Expert Rev Med Devices, Vol. 6(6): 621-640].
성장 인자
성장 인자는 세포내 신호전달 경로를 유발하는 세포-표면 수용체에 결합하여, 증식, 분화, 또는 다른 세포 반응을 유도하는 세포외 폴리펩티드 분자이다. 이러한 경로는 단백질 및 다른 거대분자의 축적을 자극하며, 합성 속도를 증가시키고 분해 속도를 감소시킴에 의해 그렇게 한다. 성장 인자 수용체에 의해 활성화된 하나의 세포내 신호전달 경로는 ATP로부터 포스페이트를 형질 막의 이노시톨 인지질의 3 위치에 첨가하는 효소 PI 3-키나제를 포함한다. PI 3-키나제의 활성화는 S6 키나제를 포함하는 여러 단백질 키나제의 활성화를 발생시킨다. S6 키나제는 리보솜 단백질 S6을 인산화시켜, 대부분이 리보솜 성분을 인코딩하는 mRNA의 서브세트를 번역하는 리보솜의 능력을 증가시키며, 결과적으로 단백질 합성이 증가한다. S6 키나제를 인코딩하는 유전자가 드로소필라(Drosophila)에서 불활성화되면, 세포 수는 정상이지만 세포 크기는 비정상적으로 작으며, 돌연변이체 파리는 작다. 성장 인자는 또한 eIF4E라 불리는 번역 개시 인자를 활성화시켜, 단백질 합성 및 세포 성장을 추가로 증가시킨다[Farrar W.L. et al., "Hematopoietic growth-factor signal transduction and regulation of gene expression", Vol. 49: 379-410, (1990)].
성장 인자 자극은 또한 미토겐에 의한 신호전달에서 일부를 담당하는 유전자 조절성 단백질 Myc의 생산을 증가시킨다. Myc는 세포 대사 및 거대분자 합성에 관여하는 단백질을 인코딩하는 많은 유전자의 전사를 증가시킨다. 이 방법으로, 이것은 세포 대사 및 세포 성장 둘 모두를 자극한다[Grifoni D. et al., "Drosophila Myc: A master regulator of cellular performance", Vol. 1849(5): 570-581].
혈소판-유래된 성장 인자(PDGF)를 포함하는 일부 세포외 신호 단백질은 성장 인자 및 미토겐 둘 모두로서 작용하여, 세포 성장 및 세포-주기 진행 둘 모두를 자극할 수 있다. 이러한 기능적 중첩은 이들 두 가지 과정을 제어하는 세포내 신호전달 경로의 중첩에 의해 부분적으로 달성된다. 신호전달 단백질 Ras는, 예를 들어, 성장 인자 및 미토겐 둘 모두에 의해 활성화된다. 이것은 PI3-키나제 경로를 자극하여 세포 성장을 촉진시키고 MAP-키나제 경로를 자극하여 세포-주기 진행을 유발할 수 있다. 유사하게, Myc는 세포 성장 및 세포-주기 진행 둘 모두를 자극한다. 성장 인자 및 미토겐 둘 모두로서 작용하는 세포외 인자는 세포가 증식할 때 이들이 적당한 크기를 유지하도록 보장하는 것을 돕는다[Kim W. S. et al., "The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells", Vol. 30(7), 793-799].
많은 미토겐, 성장 인자, 및 생존 인자가 세포-주기 진행, 세포 성장, 및 세포 생존의 양성적 조절인자이기 때문에, 이들은 기관 및 유기체의 크기를 증가시키는 경향이 있다. 그러나, 일부 조직에서, 세포 및 조직 크기는 또한 양성 조절인자에 반대하는 억제성 세포외 신호 단백질의 영향을 받아 기관 성장을 억제한다. 가장 잘 이해된 억제성 신호 단백질은 TGF-I3 및 이의 관련인자이다. TGF-I3은 G1의 세포-주기 진행을 차단하거나 아폽토시스를 자극함에 의해, 여러 세포 유형의 증식을 억제한다. TGF-I3는 세포 표면 수용체에 결합하여 Smad라고 불리는 유전자 조절성 단백질의 활성을 변화시키는 세포내 신호전달 경로를 개시한다. 이는 세포 분열 및 세포 사멸의 조절인자를 인코딩하는 유전자의 전사에 복잡한 변화를 가져온다.
TGF-I3 패밀리 구성원인 골형성단백질(BMP)은 마우스 발에서 발달하는 발가락 사이의 조직을 제거하는 아폽토시스의 유발을 돕는다. TGF-13과 마찬가지로, BMP는 세포 사멸을 조절하는 유전자 전사의 변화를 자극한다[Ehrlich M., "Endocytosis and trafficking of BMP receptors: Regulatory mechanisms for fine-tuning the signaling response in different cellular contexts", Cytokine Growth Factor Rev. Epub ahead of print PMID:26776724, (2016)].
섬유모세포 성장 인자(FGF)
섬유모세포 성장 인자(FGF) 패밀리는 현재 구조적으로 관련된 12개 이상의 구성원을 갖는다. FGF1은 산성 FGF로도 알려져 있다. FGF2는 때로 염기성 FGF(bFGF)라고 불리며 FGF7은 때로 각질세포 성장 인자라는 이름을 갖는다. 척추동물에서 12개가 넘는 상이한 FGF 유전자가 알려져 있다. 이들은 다른 조직에서 RNA 스플라이싱 또는 개시 코돈을 변화시킴에 의해 수백 가지의 단백질 아이소형을 생성할 수 있다. FGF는 섬유모세포 성장 인자 수용체(FGFR)라고 불리는 수용체 티로신 키나제의 세트를 활성화시킬 수 있다. 수용체 티로신 키나제는 세포막을 통해 연장되는 단백질이다. 주변분비 인자에 결합하는 단백질의 부분은 세포외측에 있고, 휴면 티로신 키나제(즉, ATP를 분열시켜 또 다른 단백질을 인산화시킬 수 있는 단백질)는 세포내측에 있다. FGF 수용체가 FGF에 결합할 때(그리고 FGF와 결합할 때만), 휴면 키나제가 활성화되고, 반응 세포 내에서 특정 단백질을 인산화시켜, 이들 단백질을 활성화시킨다[Li X. et al., "Fibroblast growth factors, old kids on the new block", Semin Cell Dev Biol. Epub ahead of print, PMID: 26768548, (2016)].
FGF는 혈관신생(혈관 형성), 중배엽 형성, 및 축삭 확장을 포함하는 여러 발달 기능과 관련되어 있다. FGF가 종종 서로를 대신할 수 있지만, 이들의 발현 패턴은 이들에게 별개의 기능을 제공한다. FGF2는 혈관신생에서 특히 중요하지만, FGF8은 중뇌 및 사지의 발달에 관여한다[Peng et al., "Stems Cells and Development", Vol. 17: 761-774, (2008)].
VEGF, IGF, PDGF, HGF, FGF, TGFβ, 앤지오포에이틴-1, 및 줄기 세포 인자(SCF)와 같은 혈관신생 인자의 발현 수준은 뼈-유래-, 연골-유래, 및 지방-유래 MSC 사이에서 다르게 발견되었다[Peng et al., "Stems Cells and Development", Vol. 17: 761-774, (2008)].
인슐린-유사 성장 인자(IGF-1)
인슐린과 분자 구조가 유사한 호르몬인 IGF-1은 신체의 거의 모든 세포, 특히 골격근, 연골, 뼈, 간, 신장, 신경, 피부, 조혈 세포, 및 폐에 성장-촉진 효과를 갖는다. 이것은 소아 성장에 중요한 역할을 하고 성인에서 동화 효과를 계속하여 갖는다. IGF-1은 내분비 호르몬으로서 간에 의해 주로 생산될 뿐만 아니라 주변분비/자가분비 방식으로 표적 조직에서 생산된다. 생산은 성장 호르몬(GH)에 의해 자극되고 영양결핍, 성장 호르몬 무감응, 성장 호르몬 수용체의 결핍, 또는 SHP2 및 STAT5B를 포함하는 하류 신호전달 분자의 실패에 의해 지연될 수 있다. 이의 주요 작용은 많은 조직에서 많은 세포 유형에 존재하는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF1R)와 같은 이의 특정 수용체에 결합함에 의해 매개된다. 수용체 티로신 키나제인 IGF1R에 결합하면 세포내 신호전달을 개시한다; IGF-1은 AKT 신호전달 경로의 가장 강력한 자연 활성인자 중 하나이고, 세포 성장 및 증식의 자극제이며, 프로그램된 세포 사멸의 강력한 억제제이다. IGF-1은 성장 호르몬(GH)의 효과에 대한 주요 매개체이다. 성장 호르몬은 뇌하수체에서 만들어지고, 혈류로 방출된 다음, 간을 자극하여 IGF-1을 생산한다. 이후 IGF-1은 전신 성장을 자극한다. 인슐린-유사 효과 외에도, IGF-1은 또한, 특히 신경 세포에서 세포 성장 및 발달, 뿐만 아니라 세포 DNA 합성을 조절할 수 있다[Aquirre G.A. et al., "Insulin-like growth factor-1 deficiency and metabolic syndrome, J. Trans. Med., Vol. 14(1): 1-23, (2016)].
형질전환 성장 인자 베타 TGF-β
TGF-β 슈퍼패밀리의 30개가 넘는 구조적으로 관련된 구성원이 존재하고, 이들은 발달에서의 가장 중요한 상호작용의 일부를 조절한다. TGF-β 슈퍼패밀리 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 카르복시-말단 영역이 성숙 펩티드를 함유하도록 처리된다. 이러한 펩티드는 동종이합체(그들 자신) 또는 이종이합체(다른 TGF-β 펩티드와 함께)로 이합체화되어 세포로부터 분비된다. TGF-β 슈퍼패밀리는 TGF-β패밀리, 액티빈 패밀리, 골형성단백질(BMP), Vg-1 패밀리 및 다른 단백질, 예를 들어, 신경아교-유래된 신경영양 인자(신장 및 장 뉴런 분화에 필수적인 GDNF) 및 포유동물 성 결정에 관여하는 Mullerian 억제성 인자를 포함한다. TGF-β 패밀리 구성원 TGF-β 1, 2, 3 및 5는 세포 사이의 세포외 기질 형성을 조절하고 세포 분열을 조절하는데 중요하다(양성적 및 음성적 둘 모두). TGF-β1은 세포외 기질 상피 세포의 양을 증가시켜 콜라겐 및 피브로넥틴 합성을 촉진하고 기질 분해를 억제함으로써 둘 모두를 만든다. TGF-β는 상피조직이 분지되어 신장, 폐 및 침샘의 관을 형성할 수 있는 시기 및 위치를 제어하는데 중요할 수 있다[Aschner Y. et al., "Transforming Growth Factor-β: Master Regulator of the Respiratory System in Health and Disease", Am J Respir Cell Mol Biol, Epub ahead of print PMID: 26796672, (2016)].
BMP 패밀리의 구성원은 원래 뼈 형성을 유도하는 능력에 의해 발견되었다. 그러나, 뼈 형성은 이들의 많은 기능 중 하나일 뿐이며, 이들은 세포 분열, 아폽토시스(프로그램된 세포 사멸), 세포 이동, 및 분화를 조절하는 것으로 밝혀졌다. BMP는 성숙 폴리펩티드에 9개라기보다 7개의 보존된 시스테인을 가짐으로써 TGF-β 슈퍼패밀리의 다른 구성원과 구별될 수 있다. BMP는 결절(좌-우 축 형성을 담당함) 및 BMP4(신경관 극성, 안구 발달, 및 세포 사멸에 중요함)와 같은 단백질을 포함한다[Nettersheim D. et al., "BMP Inhibition in Seminomas Initiates Acquisition of Pluripotency via NODAL Signaling Resulting in Reprogramming to an Embryonal Carcinoma, PLOS Genet. Vol. 11(7): 1-26, (2015)].
줄기 세포
본원에서 사용되는 용어 "줄기 세포"는 하나 초과의 별개의 세포 표현형으로 최종 분화를 겪을 수 있는 딸 세포를 생성할 수 있는 자가-재생 능력을 갖는 높은 증식 가능성을 갖는 미분화된 세포를 지칭한다. 줄기 세포는 두 가지 특성에 의해 다른 세포 유형과 구별된다. 첫째, 이들은, 때로 오랜 기간의 무활동 후에 세포 분열을 통해 스스로를 재생할 수 있는 미특수화된 세포이다. 둘째, 특정 생리학적 또는 실험적 조건 하에, 이들은 특수한 기능을 가진 조직- 또는 기관-특이적 세포가 되도록 유도될 수 있다. 창자 및 골수와 같은 일부 기관에서, 줄기 세포는 정기적으로 분열되어 마모되거나 손상된 조직을 복구하고 대체한다. 그러나, 췌장 또는 심장과 같은 다른 기관에서, 줄기 세포는 특수한 조건 하에서만 분열한다[Romito A. et al., "Pluripotent Stem Cells: Current Understanding and Future Directions", Stem Cells Int., ID 9451492, 2016)].
배아 줄기 세포(EmSC)는 다능성인 배아로부터 유래된 줄기 세포이고, 즉, 이들은 시험관내에서 내배엽, 중배엽 및 외배엽 세포 유형으로 분화될 수 있다. [Thomson J. A. et al., "Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts", Science, Vol. 282(5391): 1145-1147, (1992)].
성체(체세포) 줄기 세포는 조직 또는 기관의 분화된 세포에서 발견되는 미분화된 세포이다. 생체내에서 이들의 주요 역할은 이들이 발견된 조직을 유지하고 복구하는 것이다. 성체 줄기 세포는 뇌, 골수, 말초 혈액, 혈관, 골격근, 피부, 치아, 위장관, 간, 난소 상피, 및 고환을 포함하는 많은 기관 및 조직에서 확인되었다. 성체 줄기 세포는 줄기 세포 기생위치로 알려진 각 조직의 특정 부위에 존재하는 것으로 생각되며, 여기서 이들은 더 많은 세포를 조직에 유지해야 하는 정상적인 필요성, 또는 질병이나 조직 손상에 의해 활성화될 때까지 오랜 기간 동안 정지된 채로(비-분열) 남아있을 수 있다. 성체 줄기 세포의 예는 조혈 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다[Dzierzak E. et al., "Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells", Nature Immunol., Vol. 9(2): 129-136, (2008)].
조혈 줄기 세포(HSC)
조혈 줄기 세포(골수 및 림프 세포(CFU-M, L), 또는 CD34+ 세포의 집락-형성 단위로도 알려져 있음)는 일생 동안 혈액 세포의 지속적인 생산을 담당하는 혈액-형성 기관 내의 드문 다능성 세포이다[Li Y. et al., "Inflammatory signaling regulates embryonic hematopoietic stem and progenitor cell production", Genes Dev., Vol. 28(23): 2596-2612, (2014)].
조혈 줄기 세포에 의해 배타적으로 발현되는 단일 세포 표면 마커는 존재하지 않지만, 일반적으로 인간 HSC는 항원성 프로파일 CD34+, CD59+, Thyl+(CD90), CD38 low/- 및 C-kit-/low를 가진다는 것이 인정되었다. CD45는 또한 혈소판 및 적혈구를 제외하고, HSC의 일반적인 마커이다. HSC는 적혈구, 호중구, 호염기구, 호산구, 혈소판, 비만 세포, 단핵구, 조직 대식세포, 파골세포, 및 T 및 B 림프구를 포함하는 다양한 세포 유형을 생성할 수 있다. 조혈 줄기 세포의 조절은 자가-재생, 생존 및 증식, 계통 투입 및 분화를 수반하는 복잡한 과정이고, 고유 세포 프로그래밍 및 외부 자극, 예를 들어, 미세-환경 간질과의 유착 상호작용 및 사이토카인의 작용을 포함하는 다양한 메커니즘에 의해 조율된다.
상이한 주변분비 인자는 조혈 줄기 세포가 특정 경로를 따라 분화되도록 하는데 있어 중요하다. 혈액 세포 및 림프구 형성에 관여하는 주변분비 인자는 사이토카인이라 불린다. 사이토카인은 여러 세포 유형으로 이루어질 수 있지만, 조혈 부위의 간질(중간엽) 세포의 세포외 기질에 의해 수집되고 농축된다. 예를 들어, 과립구-대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF) 및 다중계통 성장 인자 IL-3 둘 모두는 골수 간질의 헤파란 설페이트 글리코사미노글리칸에 결합한다. 이후 세포외 기질은 이들 인자를 이들의 수용체에 결합하기에 충분한 높은 농도로 줄기 세포에 제공한다[Alvarez S. et al., "GM-CSF and IL-3 activities in schistosomal liver granulomas are controlled by stroma-associated heparan sulfate proteoglycans", J Leukoc Biol., Vol. 59(3): 435-441, (1996)].
중간엽 줄기 세포(MSC)
중간엽 줄기 세포(MSC)(골수 간질 줄기 세포 또는 골격 줄기 세포로도 알려져 있음)는 다양한 조직에서 발견되는 비-혈액 성체 줄기 세포이다. 이들은 형태상으로 스핀들-모양; 그 세포 표면에서의 특정 마커의 발현; 그리고 적절한 조건 하에 최소 3개의 계통(골형성, 연골형성, 및 지방형성)을 따라 분화하는 능력을 특징으로 한다[Najar M. et al., "Mesenchymal stromal cells and immunomodulation: A gathering of regulatory immune cells", Cytotherapy, Vol. 18(2): 160-171, (2016)].
생체내에서 MSC를 명확하게 묘사하는 단일 마커는 MSC 표현형에 대한 의견 일치의 부족으로 확인되지 않았지만, 일반적으로 MSC는 세포 표면 마커 CD105, CD166, CD90, 및 CD44에 양성이고 MSC는 CD45, CD34, 및 CD14와 같은 전형적인 조혈 항원에 음성인 것으로 고려된다. MSC의 분화 가능성에 관해서, 연구들은 골수-유래된 MSC의 집단이 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 뼈, 연골, 힘줄, 근육, 지방 조직, 및 조혈 지지 간질을 포함하는 최종 분화된 중간엽 표현형으로 발달할 수 있는 능력을 갖는다고 보고하였다. 트랜스제닉 및 녹아웃 마우스 및 인간 근골격 장애를 이용한 연구는 MSC가 배아 발달 및 성체 항상성 동안 여러 계통으로 분화한다고 보고하였다[Najar M. et al., "Mesenchymal stromal cells and immunomodulation: A gathering of regulatory immune cells", Cytotherapy, Vol. 18(2): 160-171, (2016)].
생체내 과정을 되풀이하는 적절한 조건 하에 MSC의 시험관내 분화 분석은 줄기 세포 투입에 필수적인 다양한 요인을 확인하였다. 그 중, 분비된 분자 및 그 수용체(예를 들어, 형질전환 성장 인자-(β), 세포외 기질 분자(예를 들어, 콜라겐 및 프로테오글리칸), 액틴 세포골격, 및 세포내 전사 인자(예를 들어, Cbfal/Runx2, PPARy, Sox9, 및 MEF2)는 특정 계통으로의 다분화능(multipotent) MSC의 투입을 유도하고, 이들의 분화된 표현형을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다[Davis L.A. et al., "Mesodermal fate decisions of a stem cell: the Wnt switch", Cell Mol Life Sci., Vol. 65(17): 2568-2574, (2008)].
골수는 성숙한 혈액 세포의 전구체 세포인 조혈 세포 및 광범위한 결합 조직 세포의 전구체인 간질 세포를 포함하는 다양한 전구체 및 성숙 세포 유형을 함유하고, 둘 모두는 다른 세포 유형으로 분화될 수 있다[Wang J. S. et al., "The coronary delivery of marrow stromal cells for myocardial regeneration: pathophysiologic and therapeutic implications", J. Thorac. Cardiovasc. Surg., Vol. 122: 699-705, (2001)]; [Tomita S. et al., "Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function", Circulation, Vol. 100 (Suppl. II): 247-256, (1999)]; [Saito, T. et al., "Myogenic Expression of Mesenchymal Stem Cells within Myotubes of mdx Mice in Vitro and in Vivo", Tissue Eng., Vol. 1: 327-343, (1995)]. 변형되지 않은(즉, 분획화되지 않은) 골수 또는 혈액-유래된 세포가, 예를 들어, 여러 임상 연구에 사용되었다[Hamano K. et al., "Local implantation of autologous bone marrow cells for therapeutic angiogenesis in patients with ischemic heart disease: clinical trial and preliminary result", Japan Cir. J., Vol. 65: 845-847, (2001)]; [Strauer B. E., et al., "Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans", Circulation, Vol. 106: 1913-1918, (2002)]; [Assmus et al., "Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI)", Circulation., Vol. 106: 3009-3017, (2002)]; [Dobert N. et al., "Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI)", Eur. J. Nuel. Med. Mol. Imaging., Vol. 8: 1146-51, (2004)]; [Wollert K. C. et al., "Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial", Lancet, Vol. 364: 141-148, (2004)]. 골수의 단핵 분획은 간질 세포, 조혈 전구체, 및 내피 전구체를 함유하므로, 관찰된 효과에 대한 이들 집단 각각의 상대적인 기여도는, 있다 하더라도, 아직 알려져 있지 않다.
마우스 모델은 Treg의 조절이 자가면역 질환의 치료를 강화시킬 수 있다고 제안하였다[Allenbach et al., "Role of regulatory T cells in a new mouse model of experimental autoimmune myositis", Am J. Pathol., Vol. 174(3): 989-998, (2014)].
제대 줄기 세포
제대 줄기 세포는 상피 조직 구획의 세포의 예이다. 생체내에서, 두 가지 유형의 제대 줄기 세포, 즉, 조혈 줄기 세포(UC-MS) 및 중간엽 줄기 세포(UC-MS)가 발견될 수 있고, 이들은 차례로 제대혈(UC-MS) 또는 와튼 젤리(UC-MM)에서 발견될 수 있다. 제대혈은 여러 이유로 이식을 위한 줄기 세포의 중요한 공급원으로서 오랫동안 연구자들의 관심을 받아 왔다: (1) 이것은 부피 단위 당 더 많은 수의 원시 조혈 줄기 세포(HSC)를 함유하고, 이는 골수보다 더욱 빠르게 증식한다; (2) 이식 후 거부 위험이 적다; (3) 이식은 완벽한 HLA 항원 일치(골수의 경우와 달리)를 필요로 하지 않는다; (4) UC 혈액은 이미 선천 대사 장애의 치료에 성공적으로 사용되었다; 그리고 (5) 제대혈로부터의 단핵 세포의 수집 및 저장을 위한 새로운 기술이 필요하지 않은데, 그 이유는 그러한 방법이 오랫동안 확립되었기 때문이다[Mihu C. et al.,"Isolation and characterization of stem cells from the placenta and the umbilical cord", Romanian Journal of Morphology and Embryology, 2008, 49(4):441-446, (2008)].
제대(UC) 혈관 및 주변 중간엽(와튼 젤리로 알려진 결합 조직을 포함함)은 배아 및/또는 배아외 중배엽으로부터 유래된다. 따라서, 이러한 조직 뿐만 아니라 원시 생식 세포는, 배아의 원시 계통 형성시, MSC 및 심지어 다능성 잠재력을 갖는 일부 세포를 함유하는 근위 배아덩이위판으로부터 분화된다. UC 기질 물질은 원시 중간엽으로부터 유래되는 것으로 추측되며, 이는 성체 골수 중간엽으로의 전이 상태에 있다[Mihu C. et al.,"Isolation and characterization of stem cells from the placenta and the umbilical cord", Romanian Journal of Morphology and Embryology, 2008, Vol. 49(4):441-446, (2008)].
태반 및 제대로부터의 혈액은 항응고 물질을 함유하는 일반적인 헌혈 백에 비교적 쉽게 수집된다. 단핵 세포를 Ficoll 구배에 대한 원심분리에 의해 분리하고, 이로부터 2개의 줄기 세포 집단이 분리될 것이다: (1) 특정한 특징적인 마커(CD34, CD133)를 발현시키는 조혈 줄기 세포(HSC); 및 (2) 특정 조건 하에 배양 표면에 부착하는 중간엽 줄기 세포(MSC)(예를 들어, 변형된 McCoy 배지 및 우태아 혈청(FBS) 또는 태아 송아지 혈청(FCS)으로 용기의 라이닝)[Munn D. et al., "Prevention of allogeneic fetal rejection by tryptophan catabolism", Science, Vol. 281: 1191-1193, (1998)]; [Munn D. et al., "Inhibition of T cell proliferation by macrophage tryptophan catabolism", J Exp Med, Vol. 189: 1363-1372, (1999)]. 제대혈 MSC(UC-MS)는 골수 MSC와 비교하여 공여자에서의 그라프팅 및 시험관내 HSC 생존을 촉진하는 사이토카인을 생산할 수 있다[Zhang X. et al., "Successful immortalization of mesenchymal progenitor cells derived from human placenta and the differentiation abilities of immortalized cells", Biochem Biophys Res Commun, Vol. 351: 853-859, (2006)].
배아 세포 마커(예를 들어, 전사 인자 OT-4 및 Nanog, 단계 특이적 배아 항원(SSEA)-3 및 SSEA-4)를 나타내는 매우 낮은 면역원성의 제대혈-유래된 다분화능 줄기 세포(CB-SC)의 집단, 및 이들을 조혈 줄기 세포(HSC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 및 단핵구/대식세포(Mo/M
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)를 포함하는 다른 공지된 줄기 세포 유형과 구별하는, CD34에 대해 음성인, 백혈구 공통 항원 CD45가 기술되었다[Zhao Y. et al., "Successful immortalization of mesenchymal progenitor cells derived from human placenta and the differentiation abilities of immortalized cells", Exp. Cell Res., Vol. 312: 2454-2464, (2006)]; [Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet β-cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med., Vol. 10(3), 1-11, (2012)]; [Zhao Y. et al., "Immune regulation of T lymphocyte by a newly characterized human umbilical cord blood stem cell", Immunol. Lett., Vol. 108: 78-87, (2010)].
인간 제대혈-유래된 줄기 세포(CB-SC) 및 중간엽 줄기 세포(MSC)는 시험관내에서 면역 활성을 조절하는 것으로 나타났다[Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cells and the journey to a cure for type 1 diabetes", Autoimmun Rev., Vol. 10: 103-107, (2010]; [Abdi R. et al., "Immunomodulation by mesenchymal stem cells, A potential therapeutic strategy for type I diabetes", Diabetes, Vol. 57: 1759-1767, (2008)]; [Aguayo-Mazzucato C. et al., "Stem cell therapy for type I diabetes", Nat Rev Endocrinol, Vol. 6: 139-148, (2010)]; [Uccelli A. et al., "Mesenchymal stem cells in health and disease", Nat Rev Immunol, Vol. 8: 726-736, (2008)]; [Zhao Y. et al.," Immune regulation of T lymphocyte by a newly characterized human umbilical cord blood stem cell", Immunol Lett., Vol. 108: 78-87, (2007)]. 후속 연구는 CB-SC가 비-비만 당뇨병 마우스(NOD)에서 면역 기능을 변화시키고 T1D의 마커를 개선시키는데 사용될 수 있다는 것을 증명하였고[Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cell-modulated regulatory T lymphocytes reverse the autoimmune-caused type 1 diabetes in nonobese diabetic (NOD) mice", PLoS ONE, Vol. 4: e4226, (2009)], CB-SC는 공동-배양물에서 T1D 환자-유래된 섬 세포-특이적 병원성 T 세포 클론의 면역 기능을 조절하는 것으로 나타났다[Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cells and the journey to a cure for type 1 diabetes", Autoimmun Rev., Vol. 10: 103-107, (2010)]. 동물 모델에서의 연구는 이러한 결과를 입증하고, CB-SC 치료가 줄기 세포 이식 없이 섬 β-세포의 천연 집단의 재생을 허용할 수 있다고 제안한다[Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cell-modulated regulatory T lymphocytes reverse the autoimmune-caused type 1 diabetes in nonobese diabetic (NOD) mice", PLoS ONE, Vol. 4: e4226, (2009)]; [Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cells and the journey to a cure for type 1 diabetes", Autoimmun Rev., Vol. 10: 103-107, (2010].
Zhao 등은 전혈로부터 림프구를 분리하고, 부착성 CB-SC의 존재 하에 림프구를 간단히 공동-배양한 다음, "교육된" 림프구를 환자의 순환으로 돌려 보내는 생물반응기 장치라 불리는 연속 폐쇄 루프 시스템을 통해 환자의 혈액이 순환되는 절차를 개발하였다[Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med, Vol. 10:3, (2012]. 오픈-라벨 1/2상 연구에서, T1D를 가진 아시아 혈통의 12명의 환자는 생물반응기 장치로 단일 치료를 받았고, 아시아 혈통의 3명의 환자는 부착성 CB-SC 없이 생물반응기 장치로 단일 치료를 받았다(즉, 단지 공정 대조군). 16게이지 IV 바늘을 왼쪽(또는 오른쪽) 팔오금중간정맥에 놓고, 환자의 혈액을 Blood Cell Separator MCS+(Haemonetics®, Braintree, MA)를 통해 35 mL/분으로 6 내지 7시간 동안 통과시켜 제조업체의 권장된 프로토콜에 따라 림프구를 분리하였다. 수집된 림프구를 동종이계 CB-SC(또는 CB-SC가 없는 공정 대조군)에 노출시키기 위해 장치로 옮기고, 다른 혈액 성분을 환자에게 돌려 보냈다. 장치에서 2 내지 3시간 후, 림프구를 생리식염수로 중력 흐름 제어(2 내지 3 mL/분) 하에 손의 등쪽 정맥을 통해 환자의 순환으로 돌려 보냈다. 약 10,000 mL의 혈액이 절차 중에 처리되어 림프구 분획에 대해 약 2회의 반복 교육을 발생시켰다. 환자는 체온을 모니터링하고 치료 후 부작용에 대한 정기적인 실험실 혈액 검사를 수행하기 위해 이틀 동안 입원하였다. 한 그러한 치료.
소그룹의 아시아 참가자들을 대상으로 한 초기 결과는 이 요법이 2회의 정맥천자로부터의 최소 통증과 부작용 없이 모든 참가자들에게 잘 용인되었고, C-펩티드 수준을 현저하게 개선시킬 수 있고, 중간 당화 혈색소 A1C(HbA1C) 값을 감소시켰고, 일부 잔류 β-세포 기능을 갖는 환자(n = 6)에서 인슐린의 중간 일일 용량을 감소시키는 것을 보여주었다.
참가자들의 말초 혈액에서 CD4+CD25+Foxp3+ Treg의 백분율은 생물반응기 장치 요법의 4주 후에 유의하게 증가되었지만, 가상 치료를 받은 참가자들의 말초 혈액에서의 Treg의 백분율은 기준선에서 변화가 없었다. 치료 그룹의 참가자는 4주 추적-검사에서 TGFβ1의 혈장 수준의 유의한 증가를 나타내었지만, 가상 대조군과 비교하여, IL-10의 혈장 수준은 변화가 없었다. 유세포분석은 생물반응기 장치 요법 4주 후에 Treg의 확립, 유지 및 효능에 필수적인 CD28 및 유도성 공자극(ICOS)의 증가를 나타내었지만[Bour-Jourdan H. et al., "Intrinsic and extrinsic control of peripheral T-cell tolerance by costimulatory molecules of the CD28/-B7 family", Immunol. Rev., Vol. 241: 180-205, (2011)]; [Hornbach A. A. et al., "Effective proliferation of human regulatory T cells requires a strong costimulatory CD28 signal that cannot be substituted by IL-2", J. Immunol., Vol. 179: 7924-7931, (2007)]; [Hori S., "Effective proliferation of human regulatory T cells requires a strong costimulatory CD28 signal that cannot be substituted by IL-2", Eur. J. Immunol., Vol. 40: 664-667, (2010)]; [Tang Q et al., "CTLA4 Expression Is an Indicator and Regulator of Steady-State CD4+FoxP3+ T Cell Homeostasis", J. Immunol., Vol., 171: 3348-3352, (2003)]; [Vang K.B., et al., "Cutting edge: CD28 and c-Rel-dependent pathways initiate regulatory T cell development" , J. Immunol., Vol. 184: 4074-77, (2010)]; [Herman A.E. et al., "CD4+CD25+ T regulatory cells dependent on ICOS promote regulation of effector cells in the prediabeti clesion", J. Expt Med. Vol. 199: 1479-1489, (2004)]; [Gotsman I. et al., "Impaired regulatory T-cell response and enhanced atherosclerosis in the absence of inducible costimulatory molecule", Circulation, Vol. 114: 2047-2055, (2006)]; [Nurieva R.I. et al., "Molecular mechnisms for T cell tolerance", Immunol. Rev. Vol, 241: 133-144, (2014)]; [Rudensky A.Y., "Regulatory T cells and Foxp3", Immunol. Rev., Vol. 241: 260-268, (2011)], 둘 모두의 분자의 수준은 가상 대조군에서 변화가 없었다. IL-4 및 IL-12의 발현은 유의하게 증가하였고, IL-5 및 IL-13의 발현은 감소하였다. 전-염증성 IL-17A의 생산은 또한 치료 4주 후에 감소되었다. 가상 치료 후에 이들 사이토카인의 수준에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
연속 폐쇄 루프 시스템을 사용한 치료는, 제안적이긴 하지만, 인큐베이션의 사용 기간 동안 수행원을 필요로 하고, 고용 비용이 비싸기 때문에 인큐베이션의 효율이 제한된다는 점에서 상업적 사용에는 비실용적이다.
기술된 발명은 교육된 단핵 세포 생성물을 제조하기 위한 처리 시설을 사용하는 실용적인 불연속 시스템을 제공한다. 상기 치료는 단지 2회의 정맥천자를 필요로 하고, 전형적인 수혈보다 감염의 위험이 적으며, 줄기 세포나 사용 시약을 환자에게 도입하지 않는다. 또한, CB-SC는 면역원성이 매우 낮기 때문에, 치료 전에 인간 백혈구 항원(HLA) 일치에 대한 필요성을 제거한다. 이 접근법은 다수의 자가면역 질환에 대한 CB-SC-매개된 면역 조절 요법을 제공하면서, 다른 접근법과 관련된 안전성 및 윤리적 문제를 완화시킬 수 있다. 상기 접근법의 상대적 단순성은 또한 다른 접근법에 비해 비용 및 시간 절약을 제공할 수 있다.
발명의 개요
한 양태에 따르면, 기술된 발명은, 순서대로: (1) 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병을 앓고 있는 대상체로부터 단핵 세포를 함유하는 전혈 샘플을 무균 조건 하에 획득하고; (2) (1)의 전혈 샘플을 처리 시설로 수송하고; (3) 전혈 샘플로부터 단핵 세포(MNC)를 무균 정제하여 단핵 세포 제조물을 형성하고; (4) 단핵 세포 제조물을 부착성 제대혈 줄기 세포(UC-SC)의 생육가능 집단을 포함하는 생물반응기 장치에 도입하고, 이 때 부착성 UC-SC는 적어도 80% 컨플루언트(confluent)이며; (5) 단핵 세포 제조물 중의 단핵 세포 및 CB-SC가 적어도 0.1시간, 적어도 0.2시간, 적어도 0.3시간, 적어도 0.4시간, 적어도 0.5시간, 적어도 0.6시간, 적어도 0.7시간, 적어도 0.8시간, 적어도 0.9시간, 적어도 1.0시간, 적어도 1.5시간, 적어도 2시간, 적어도 2.5시간, 적어도 3시간, 적어도 3.5시간, 적어도 4시간, 적어도 4.5시간, 적어도 5시간, 적어도 5.5시간, 적어도 6시간, 적어도 6.5시간, 적어도 7시간, 적어도 7.5시간, 또는 적어도 8시간 동안 무균 조건 하에 상호작용할 수 있도록 단핵 세포 제조물을 CB-SC와 공동-배양하여 교육된 단핵 세포 생성물을 형성하고; (6) 교육된 단핵 세포 생성물을 무균 조건 하에 생물반응기 장치로부터 수확하고; (7) 적어도 104, 적어도 105, 적어도 106, 적어도 107, 적어도 108, 적어도 109, 또는 적어도 1010개 단핵 세포를 갖는 교육된 단핵 세포 생성물의 순도, 무균성, 및 생육성 퍼센트를 확인하고; (8) 교육된 단핵 세포 생성물을 대상체로의 혈관내 주입을 위해 임상 시설로 수송하고; 그리고 (9) 치료적 유효량의 교육된 단핵 세포 생성물을 대상체에 혈관내 주입하고; 그리고 (10) 단계 (1) 내지 (9)를 순서대로, 대상체의 일생 동안 필요에 따라 복수의 주입 일에 반복하는 것을 포함하는 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 치료적 유효량의 교육된 단핵 세포 생성물은 대상체의 T 세포 구획에서 자가반응성을 조절하고, 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병의 증상을 감소시키는데 효과적일 수 있다. 한 구체예에 따르면, 대상체는 백인이다. 또 다른 구체예에 따르면, 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병은 자가면역 질환이다. 또 다른 구체예에 따르면, 자가면역 질환은 당뇨병이다. 또 다른 구체예에 따르면, 자가면역 질환은 타입 1 당뇨병이다. 또 다른 구체예에 따르면, 자가면역 질환은 타입 2 당뇨병이다. 또 다른 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포는 분리된 단핵 세포에 동종이계이다. 또 다른 구체예에 따르면, 상기 방법은, 순서대로: (a) 건강한 공여자에게서 얻은 새로운 제대혈 유닛을 수득하고; (b) 제대혈로부터 단핵 세포 분획을 밀도 구배 원심분리에 의해 분리하고; (c) 적혈구를 제거하고; (d) UC-단핵 세포를 생리학적 완충 염수로 세척하고; (e) 생물반응기의 UC 단핵 세포를 적어도 1x106개 세포의 시딩 밀도로 혈청-비함유 배양 배지에 시딩하고; (f) 혈청-비함유 배양 배지에서 UC 단핵 세포를 배양하고, 비부착 세포를 제거하기 위해 2-3일마다 적어도 10일 동안 절반/배지를 변화시켜 적어도 80% 컨플루언스로 성장시키고; 그리고 (g) (f)의 컨플루언트 부착성 UC-SC의 샘플의 무균성 및 생육성을 확인하는 것을 포함하는 방법에 의해 UC-SC를 포함하는 생물의학적 장치를 제조하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 기술된 발명은 치료량의 교육된 단핵 세포 생성물을 포함하는 약제를 제공하고, 상기 교육된 단핵 세포 생성물은 (1) 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병을 앓고 있는 대상체로부터 단핵 세포를 함유하는 전혈 샘플을 무균 조건 하에 획득하고; (2) (1)의 전혈 샘플을 처리 시설로 수송하고; (3) 전혈 샘플로부터 단핵 세포(MNC)를 무균 정제하여 단핵 세포 제조물을 형성하고; (4) 단핵 세포 제조물을 부착성 제대혈 줄기 세포(UC-SC)의 생육가능 집단을 포함하는 생물반응기 장치에 도입하고, 이 때 부착성 UC-SC는 적어도 80% 컨플루언트이며; (5) 단핵 세포 제조물 중의 단핵 세포 및 CB-SC가 적어도 0.1시간, 적어도 0.2시간, 적어도 0.3시간, 적어도 0.4시간, 적어도 0.5시간, 적어도 0.6시간, 적어도 0.7시간, 적어도 0.8시간, 적어도 0.9시간, 적어도 1.0시간, 적어도 1.5시간, 적어도 2시간, 적어도 2.5시간, 적어도 3시간, 적어도 3.5시간, 적어도 4시간, 적어도 4.5시간, 적어도 5시간, 적어도 5.5시간, 적어도 6시간, 적어도 6.5시간, 적어도 7시간, 적어도 7.5시간, 또는 적어도 8시간 동안 무균 조건 하에 상호작용할 수 있도록 단핵 세포 제조물을 CB-SC와 공동-배양하여 교육된 단핵 세포 생성물을 형성하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산되고, 여기서 치료적 유효량의 교육된 단핵 세포 생성물은 대상체의 T 세포 구획에서 자가반응성을 조절하고, 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병의 증상을 감소시키는데 효과적이고, 상기 교육된 단핵 세포 생성물은 적어도 1 x 108, 적어도 1 x 109, 또는 적어도 1 x 1010개 단핵 세포; 및 (ii) TEM CD4+, TEM CD8+, TCM CD4+ CD45RA-CCR7+, TCM CD8+ CCR7+, TCM CD45RO+ CCR7+, TEM CD45RO+ CCR7-, TCM CD4+, TCM CD8+, 나이브 CD4+ CCR7+, 나이브 CD8+ CCR7+, 나이브 CD4+ CD45RA+ CCR7+, TEM CCR7+ CD4+, TEM CCR7+ CD8+, TEM CD45RO+ CD62L-, TEM CD8+ CCR7+, CD4+HLA-DR+ 및 CD8+HLA-DR+ 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 T 세포의 조절된 집단을 포함한다. 한 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 미처리된 대조군과 비교하여 감소된 TEM CD4+ 세포의 하위집단 및 TEM CD8+ 세포의 하위집단을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 TCM CD4+ CD45RA-CCR7+ 세포의 하위집단 및 증가된 TCM CD8+ CCR7+ 세포의 하위집단을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 TCM CD45RO+ CCR7+ 세포의 하위집단을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 미처리된 대조군과 비교하여 감소된 TEM CD45RO+ CCR7- 세포의 하위집단을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 TCM CD4+ 세포의 하위집단 및 TCM CD8+ 세포의 하위집단을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 나이브 CD4+ CCR7+ T 세포의 하위집단 및 나이브 CD8+ CCR7+ T 세포의 하위집단을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 나이브 CD4+ CD45RA+ CCR7+ T 세포의 하위집단을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 미처리된 대조군과 비교하여 감소된 TEM CD4+ 세포의 하위집단 및 TEM CD8+ 세포의 하위집단을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 TEM CCR7+ CD4+ 세포의 하위집단 및 TEM CCR7+ CD8+ 세포의 하위집단을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 미처리된 대조군과 비교하여 감소된 CD4+HLA-DR+ T 세포의 하위집단 및 CD8+HLA-DR+ T 세포의 하위집단을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 TEM CD45RO+ CD62L- 세포의 하위집단을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병은 타입 1 당뇨병이고, 대상체의 T 세포 구획에서 조절된 자가반응성은 β-세포 기능의 개선을 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, β-세포 기능의 개선은 혈청 C-펩티드 수준의 증가를 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 조성물은 인슐린, 인슐린 유사체, 비구아니드, 티아졸리딘디온, 분비촉진제, 설포닐우레아, 비설포닐우레아 분비촉진제, 글리니드, 메트포르민, 알파-글루코시다제 억제제, 메글리티니드, 알파-글루코시다제 억제제, 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 모방체, 글루카곤-유사 펩티드1(GLP-1) 효능제, 아밀린 유사체, 디펩티딜 펩티다제-4 억제제, 인크레틴 모방체, 위장 억제 펩티드 유사체, 아밀린 유사체, 글리코수릭(glycosuric), 피나스테리드, 두타스테리드, 미녹시딜, 케토코나졸, 스피로노락톤, 플루타미드, 사이클로스포린, 클로베타솔, 항-CD3 항체, 인슐린 수용체의 소분자 활성제, 플루오시노니드 또는 이의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 치료제를 추가로 포함한다.
도 1은 기술된 발명의 구체예에 따른 자가면역 질환을 치료하는 방법의 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 시스템에서 사용하기 위한 생물반응기 장치의 개략도이다.
도 3a-d는 환자의 혈액이 순환되고, 단핵 세포가 전혈로부터 분리되고 CB-SC의 부착성 집단과 접촉하여 간단히 공동-배양된 다음, 교육된 자가 세포가 환자의 순환으로 돌려 보내지는 연속 폐쇄 루프 장치로의 치료 후 대사 조절의 개선을 나타낸다. 도 3a는 T2D 대상체에서 12주 추적-검사된 HbA1C 수준을 나타낸다. 도 3b는 처리 4주 후에 HOMA-IR C-펩티드에 의한 인슐린 민감성의 분석을 나타낸다. 도 3c는 손상된 섬 β-세포 기능을 갖는 그룹 C T2D 대상체에서 56주 추적-검사 C-펩티드 수준을 나타낸다. 도 3d는 치료 후 12주 추적-검사에서 HOMA-B C-펩티드에 의한 섬 β-세포 기능의 분석을 나타낸다.
도 4a-d는 연속 폐쇄 루프 장치를 사용한 치료의 항-염증 효과를 나타낸다. 도 4a는 기준선 및 치료 4주 후에 T2D 환자에서 TGF-β1의 혈장 수준의 상향-조절을 나타낸다. 도 4b는 치료 4후 후에 주요 인터루킨에 대해 상이한 효과를 나타내는 세포-내 사이토카인의 흐름 분석을 나타낸다. 도 4c는 기준선 및 치료 4주 후에 T2D 환자에서 CD86+ CD14+ 단핵구의 하향-조절 백분율을 나타낸다. 도 4d는 치료 4주 후에 Treg의 백분율에 변화가 없음을 보여주는 CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg의 흐름 분석을 나타낸다.
도 5a-f는 단핵구에 대한 CB-SC의 면역 조절의 시험관내 연구를 나타낸다. 도 5a는 위상차 현미경에 의한 18시간 동안 단핵구와 CB-SC의 공동-배양을 나타낸다(좌측 하단 패널). CB-SC는 대조군으로 사용된 림프구와 공동-배양된다(우측 상단 패널). 손상된 CB-SC는 단핵구와의 공동-배양 후 회복되어 증식하였고 7-10일 후에 90 내지 100% 컨플루언트가 되었다(우측 하단). 원래 배율, x100. 도 5b는 18시간 동안 단핵구와 CB-SC의 공동-배양으로부터 부유 세포의 아폽토틱 분석을 나타낸다. 도 5c는 웨스턴 블롯에 의해 결정된 CB-SC의 4개 제조물에서, 아폽토시스 단백질(cIAP) 2가 아닌, cIAP1의 세포 억제제의 발현을 나타낸다. 도 5d 웨스턴 블롯팅은 CB-SC의 4개 제조물에서, 종양 괴사 인자 수용체 I(TNF-RI)이 아닌 TNF R II의 발현을 나타낸다. 도 5e TNF-α는 용량-반응 방식으로 CB-SC의 증식을 억제한다. 세포 증식은 CyQUANTR Cell Proliferation Assay Kit(Millipore, OR)를 사용하여 평가되었다. 도 5f는 iNOS 억제제 1400W를 이용한 차단 실험이 CB-SC-유래된 산화질소(NO)가 단핵구에 대한 CB-SC의 면역 조절에 기여한다는 것을 입증하는 것을 보여준다. 단핵구를 처음에 리포폴리사카라이드(LPS, 10 μg/mL)로 8시간 동안 자극한 다음, 1400W(100 nM)의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 1:5 비의 CB-SC:단핵구로 CB-SC와 공동-배양한 후, Autoimmunity & Inflammation PCR Array 키트(SABiosciences, Valencia, CA)용 인간 Th17을 사용하여 실시간 PCR 분석하였다.
도 6은 1/2상 임상 시험에서 백인 T1D 대상체에서 불연속 줄기 세포 교육(SCE) 시스템으로 치료하기 위한 치료 요법 및 추적-검사 연구를 예시한다.
도 7a-g는 1/2상 임상 시험에서 연속 SCE 시스템으로 치료 후 백인 T1D 환자에서 면역 마커의 변화를 나타낸다. 모든 대상체는 불연속 SCE 시스템으로 2회 치료를 받았다. 0시에, 환자들은 첫 번째 치료를 받았다; 모든 대상체는 3개월 후에 두 번째 치료를 받았다. 추적-검사 방문은 임상 평가 및 실험실 검사를 위해 치료 2, 8, 12, 26, 40 및 56주에 예정되었다. 환자 림프구를 기준선 및 치료 후 상이한 시점에 T1D 환자의 유세포분석을 위해 Ficoll-Hypaque(γ = 1.077)에 의해 말초 혈액으로부터 분리하였다. 아이소형-일치 IgG를 대조군으로 사용하였다. 도 7a는 말초 혈액에서의 면역 세포 정량을 나타낸다. 도 7b는 말초 혈액에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 7c는 말초 혈액에서 나이브 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 흐름 분석을 나타내고, 치료 26주 후에 나이브 CD4+ T 세포의 백분율 증가를 입증한다. 도 7d는 말초 혈액에서 CD4+ TCM 및 CD8+ TCM 세포의 흐름 분석을 나타내고, 치료 18주 후에 CD4+ TCM 세포의 백분율 증가를 입증한다. 도 7e는 말초 혈액에서 CD4+TEM 및 CD8+ TEM 세포의 흐름 분석을 나타내고, 치료 18주 후 및 26주 후에 각각 CD4+ TEM 및 CD8+ TEM 세포의 백분율 감소를 입증한다. 도 7f는 말초 혈액에서 CD4+HLA-DR+의 흐름 분석을 나타내고, 치료 26주 후에 그 백분율 감소를 입증한다. 도 7g는 말초 혈액에서 CD8+HLA-DR+ T 세포의 흐름 분석을 나타내고, 치료 26주 후에 그 백분율 감소를 입증한다. 데이터는 모든 통계 분석(도 7a-g), 페어드 스튜던트 t 테스트(도 7a-g)에 대해 평균 ± SD로 표시된다.
도 8a-e는 1/2상 임상 시험에서 SCE 치료 후 백인 T1D 환자에서 T 세포에 대한 CCR7 발현의 상향-조절을 나타낸다. 모든 대상체는 SCE 장치 요법으로 2회 치료를 받았다: 첫 번째 치료는 t=0이었고, 두 번째 치료는 3개월 후였다. 추적-검사 방문은 임상 평가 및 실험실 검사를 위해 치료 2, 8, 12, 18, 26, 40 및 56주 후에 예정되었다. 환자 림프구를 기준선 및 SCE 장치 요법 후 상이한 시점에 T1D 환자의 유세포분석을 위해 Ficoll-Hypaque(γ = 1.077)에 의해 말초 혈액으로부터 분리하였다. 아이소형-일치 IgG를 대조군으로 사용하였다. CCR7 발현 수준은 Kaluza Flow Cytometry Analysis Software에 의해 분석되었고 임의 단위(a.u.)로 제시된다. 도 8a는 나이브 CD4+ T 세포에 대한 CCR7 발현의 상향-조절을 나타낸다. 도 8b는 나이브 CD8+ T 세포에 대한 CCR7 발현의 상향-조절을 나타낸다. 도 8c는 CD4+ TCM 세포에 대한 CCR7 발현의 상향-조절을 입증한다. 도 8d는 CD8+ TCM 세포에 대한 CCR7 발현의 상향-조절을 나타낸다. 도 8e는 CD4+ 및 CD8+ TEM 세포에 대한 CCR7 발현의 조절을 나타낸다. 데이터는 모든 통계 분석(도 8a-e), 페어드 스튜던트 t 테스트(도 8a-e)에 대해 평균 ± SD로 표시된다.
도 9a-c는 생체외 연구에 의한 T 세포에 대한 CCR7 발현의 상향-조절의 확인을 나타낸다. 도 9a는 혼합된 백혈구 반응(MLR)에서 CB-SC의 부재 하에(좌측 패널) 상이한 크기를 갖는 세포 클러스터의 형성을 나타내지만, CB-SC의 존재 하에(우측 패널) 세포 클러스터가 사라짐을 보여주는 위상차 현미경사진을 나타낸다. (b 및 c) 혼합된 백혈구 반응으로부터의 세포를 5일 동안 공동-배양 후 흐름 분석을 위해 수집하였다. 반응자 세포(R)를 CB-SC의 존재 하에 동종이계 자극제 세포(S)와 공동-배양하였다. R:S의 비는 1:2였고; CB-SC:R의 비는 1:10이었다. 도 9b는 게이팅된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 대한 CCR7 발현의 유세포분석을 나타낸다. 미처리된 CD4+ 림프구는 2개의 집단을 나타내었다: 하나는 CCR7 발현에 양성이었고; 또 다른 것은 CCR7 발현에 음성이었다(또는 매우 희미함)(좌측 상단 패널). 둘 모두의 집단의 평균 형광 강도는 CB-SC로의 치료 후 증가하였다(좌측 하단 패널). 도 9c는 게이팅된 CD4+ T 세포에서 나이브 CD4+ T 세포, CD45RO+ CCR7+ TCM 및 CD45RO+ CCR7- TEM에 대한 유세포분석 CCR7 발현에 의해 입증된다. 상기 데이터는 CB-SC의 존재 하에 나이브 CD4+ T 세포 및 CD4+ TCM의 백분율 증가를 나타내었다. CD4+ TEM의 백분율은 CB-SC로의 치료 후 감소하였다.
도 10a-f는 1/2상 임상 시험에서 백인 T1D 대상체에서 β-세포 기능에 대한 SCE 치료의 효과를 나타낸다. 모든 대상체는 SCE 장치 요법으로 2회 치료를 받았다(도 10a-f). T1D 대상체는 시작 및 3개월째에 각각 SCE 장치 요법으로 2회 치료를 받았다. 공복(청색) 및 글루카곤-자극된 C-펩티드 수준(갈색)은 프로토콜에 따라 다른 시점에 조사되었다. 글루카곤-자극된 C-펩티드 생산을 위해, 글루카곤(1 mg, i.v.)을 30초 이내에 투여하고, 6분 후, C-펩티드 시험을 위해 Ultrasensitive C-펩티드 ELISA 키트로 혈장 샘플을 수집하였다. 이들 데이터는 약간의 잔류 섬 β-세포 기능을 갖는 6명의 T1D 대상체로부터 얻었다(그룹 A)(도 10a-f). 회복된 공복 및 글루카곤-자극된 C-펩티드 수준은 치료 56주 후에 최종 추적-검사를 통해 대상체 1-4에서 유지되었다(도 10a-d). 도 10e-f는 대상체 5 및 6이 T1D의 진단 후 10년 넘게 약간의 잔류 섬 β-세포 기능을 나타내었음을 보여준다. SCE 요법을 받은 후, 대상체 5에서의 공복 C-펩티드 수준은 처음에는 감소하였지만, 이후 40주에는 증가하였다; 대상체 6에서의 공복 C-펩티드 수준은 처음에는 26주에 0.09 ng/mL로 감소하였지만 40주에는 0.21 ng/mL로 개선되었다. 이들의 글루카곤-자극된 C-펩티드는 공복 C-펩티드 수준과 유사한 경향을 보였다.
도 11은 전향적, 단일 아암, 오픈 라벨, 단일-센터 파일롯 연구에서 SCE 치료 및 추적-검사에 대한 치료 요법을 묘사한다. 단핵 세포는 성분채집술에 의해 각 대상체로부터 무균 상태 하에 얻어지며, 처리 시설로 수송되고, 처리 시설에서 밤새 SCE 장치로 처리된 다음, 대상체로의 재주입을 위해 임상 시설로 다시 수송될 것이다.
도 12a-c는 불연속 SCE 장치의 제조 및 사용을 위한 단계의 개략도를 나타낸다. 도 12a는 SCE 장치의 cGMP 생산을 위한 단계를 예시한다. 도 12b는 cGMP 처리 시설에서 제대혈 줄기 세포(CB-SC)와의 밤새 공동-배양에 의해 대상체의 단핵 세포(MNC)를 생체외 처리하는 단계를 묘사한다. 도 12c는 공정의 개요를 묘사한다.
발명의 상세한 설명
용어 "알파 세포"또는 "α-세포"는 혈당치가 너무 낮을 때 호르몬 글루카곤을 만들어 방출하는 췌장의 세포 유형을 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 글루카곤은 에너지를 위해 간을 자극하여 글루코스를 혈액으로 방출한다.
용어 "A1C, 당화(glycated) 혈색소, 당화(glycosylated) 혈색소, 혈색소 A1C, HgA1c 및 HbA1c"는 과거 2 내지 3개월 동안의 평균 혈당을 반영하는, 당으로 코팅된(당화된) 혈색소의 백분율을 측정하는 진단 시험을 기술하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. A1C 수준이 높을수록, 혈당 조절이 어려워지고, 당뇨 합병증의 위험이 높아진다. 당뇨병은 ≥ 6.5%의 A1C로 진단된다.
본원에서 사용되는 용어 "투여하다"는 제공하거나 적용하는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "투여"는 생체내 투여 뿐만 아니라 생체외 조직으로의 직접 투여를 포함한다.
용어 "성인" 또는 "성인 인간"은 연령에 관계없이 성숙한 유기체 또는 성숙한 세포, 예를 들어, 성숙한 인간 또는 성숙한 인간 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "동종이계"는 동일한 종에 속하거나 이로부터 수득되지만 유전적으로 상이함을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "개선하다"는 어떤 것을 더 낫게 만들거나 나아지거나, 질병 상태가 개선되는 것을 의미한다. 질병 상태는 비제한적으로 타입 I 당뇨병 또는 타입 II 당뇨병과 같은 염증성 질환일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유사체"는 다른 것과 구조적으로 유사하지만 조성에 있어 약간 상이하고(한 원자가 다른 원소의 원자로 대체되거나 특정 작용기의 존재 하에서와 같이), 모 화합물로부터 유래되거나 유래되지 않을 수도 있는 화학적 화합물을 지칭한다. "유도체"는 모 화합물이 "유도체"를 생성하기 위한 출발 물질일 수 있는 반면, 모 화합물이 반드시 "유사체"를 생성하기 위한 출발 물질로 사용되는 것은 아닐 수도 있다는 점에서 "유사체"와 상이하다.
본원에서 사용되는 "아네르기"는 외래 물질에 대한 신체 방어 메커니즘에 의한 반응의 부족을 지칭하고, 말초 림프구 내성의 직접 유도로 구성된다.
본원에서 사용되는 용어 "성분채집술"은 공여자 또는 환자의 혈액이 하나의 특정 구성요소를 분리하고 나머지를 공여자 또는 환자의 순환으로 다시 돌려 보내는 장치를 통과하는 의료 기술을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "적용하다"는 접촉하거나 놓거나 바르는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "곡선하 면적(AUC)"은 약물 투여 후 시간에 대한 약물의 혈장 농도의 플롯 아래의 면적을 지칭한다. 상기 면적은 사다리꼴 공식에 의해 결정된다: 데이터 포인트를 직선 세그먼트로 연결하고, 가로 좌표로부터 각 데이터 포인트로 수직선을 그리고, 이렇게 구성된 삼각형 및 사다리꼴의 면적의 합을 계산한다. 전형적으로, 상기 면?은 약물 투여시 시작하여 혈장 내의 농도가 무시할 수 있을 때 끝나도록 계산된다. 실제로, 약물 농도는 시간에 맞춰 특정 이산 점에서 측정되고, 사다리꼴 공식을 사용하여 AUC를 추정한다. AUC는 약물의 생체이용률을 추정하고 약물의 총 제거율을 추정하는데 유용하다.
용어 "자가분비 신호전달"은 세포가 자신이나 동일한 유형의 다른 인접 세포에 작용하는 신호 분자를 분비하는 세포 신호전달의 유형을 지칭한다.
용어 "자가면역 장애" 및 "자가면역 질환"은 면역 시스템이 건강한 신체 조직의 자가-구성요소를 실수로 공격하고 파괴할 때 발생하는 질환을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 자가면역 질환은 하나 이상의 기관 또는 조직 유형에 영향을 줄 수 있다. 일반적으로 자가면역 장애의 영향을 받는 기관 및 조직은 혈관, 결합 조직, 갑상선이나 췌장과 같은 내분비선, 관절, 근육, 적혈구, 및 피부를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "베타 세포" 또는 "β-세포"는 인슐린을 만드는 췌장 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "혈당치"는 주어진 양의 혈액 중의 글루코스의 양을 지칭한다. 이것은 데시리터 중 밀리그램, 또는 mg/dL로 표시된다.
본원에서 사용되는 용어 "혈당 모니터링"은 당뇨병을 관리하기 위해 정기적으로 혈당치를 확인하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 세포 "배양물"은 전형적으로 세포 성장에 적합하거나 이의 생육성을 유지하기 위한 규정된 경계 공간 및 성장 조건 내에서 세포를 제공하는 것을 지칭한다. 마찬가지로, 동사로 사용되는 용어 "배양하다"는 세포의 성장 또는 이의 생육성을 유지하기에 적합한 공간 및 성장 조건의 공정을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "CD3"(TCR 복합체)는 4개의 별개 사슬로 구성된 단백질 복합체를 지칭한다. 포유동물에서, 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 및 2개의 CD3ε 사슬을 함유하고, 이들은 T 세포 수용체(TCR) 및 ζ-사슬과 회합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. TCR, ζ-사슬 및 CD3 분자는 함께 TCR 복합체를 구성한다. CD3 분자의 세포내 꼬리는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)로 알려진 보존된 모티프를 함유하며, 이는 TCR의 신호전달 능력에 필수적이다. ITAM의 인산화시, CD3 사슬은 T 세포의 신호전달 캐스케이드에 관여하는 키나제인 ZAP70(제타 관련 단백질)에 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "CD4"는 T 헬퍼 세포, 단핵구, 대식세포, 및 수지상 세포와 같은 면역 세포의 표면에서 발견되는 당단백질을 지칭한다. CD4는 항원-제시 세포와의 통신에서 T 세포 수용체(TCR)를 보조하는 공동-수용체이다. CD4는 항원-제시 세포 표면의 주조직적합성 복합체(MHC) II 분자와 직접 상호작용한다[Dalgleish A. G. et al., "The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus", Nature, Vol. 312: 763-768, (1984)].
본원에서 사용되는 용어 "CD8"은 T 세포 수용체(TCR)에 대한 공동-수용체로서 작용하는 막통과 당단백질을 지칭한다. TCR과 마찬가지로, CD8은 주조직적합성복합체(MHC) 분자에 결합하지만, 클래스 I MHC 단백질에 특이적이다[Leahy D. J. et al., "Crystal structure of a soluble form of the human T cell coreceptor CD8 at 2.6 A resolution", Cell, Vol. 68(6): 1145-62, (1992)].
본원에서 사용되는 용어 "CD13"은 일부 유형의 급성 비림프구 백혈병에서 발현되는 펩티드로부터 NH2-말단 아미노산의 제거를 촉매하는 아연-결합 금속프로테아제로서 작용하는 골수 세포에서 발견되는 타입 II 막통과 단백질을 지칭한다[Xu W. et al., "Progress in the development of aminopeptidase N (APN/CD13) inhibitors", Curr Med Chem Anticancer Agents., Vol. 5(3): 281-301, (2005)].
본원에서 사용되는 용어 "CD20"은 B-림프구 항원 CD20을 지칭하고, 전-B 상(CD45R+)에서 시작하여 성숙될 때까지 점진적으로 농도가 증가하는 모든 B-세포의 표면 상에 발현되는 활성화-당화된 인단백질이다[Tedder T. F. et al., "Isolation and structure of a cDNA encoding the B1 (CD20) cell-surface antigen of human B lymphocytes", Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 85(1): 208-212, (1998)].
본원에서 사용되는 용어 "CD25"는 CD122와 회합하여 IL-2에 대한 고-친화성 수용체로서 작용할 수 있는 이종이합체를 형성하는 활성화 T 세포, 활성화 B 세포, 일부 흉선세포, 골수 전구체, 및 희소돌기아교세포 상에 존재하는 타입 I 막통과 단백질을 지칭한다[Triplett, T. A. et al., European Journal of Immunology, Vol. 42(7): 1893-1898, (2012)].
본원에서 사용되는 용어 "CD34"는 인간에서 세포-세포 부착 인자로서 기능하는 단백질인, CD34 항원으로도 공지된 조혈 기원 세포 항원 CD34를 지칭한다. 이것은 또한 줄기 세포가 골수 세포외 기질 또는 직접적으로 간질 세포에 부착하는 것을 매개할 수 있다[Simmons D. L. et al.," Molecular cloning of a cDNA encoding CD34, a sialomucin of human hematopoietic stem cells", J. Immunol,, Vol. 148(1): 267-271, (1992)].
본원에서 사용되는 용어 "CD38"은 림프구와 내피 세포 사이의 부착을 매개할 수 있는, 대식세포, 수지상 세포, 및 활성화된 B 및 NK 세포 상에 존재하는 단백질 마커를 지칭한다[Orciani M. et al., "CD38 is constitutively expressed in the nucleus of human hematopoietic cells", J. Cell. Biochem., Vol. 105(3): 905-912, (2008)].
본원에서 사용되는 용어 "CD45"는 세포 활성화를 돕는 적혈구를 제외한 모든 조혈 세포 상에 존재하고; 림프종, B-세포 만성 림프구 백혈병, 털세포 백혈병, 및 급성 비림프구 백혈병에서 발현되는 타입 I 막통과 단백질인 백혈구 공통 항원을 지칭한다. 이것은 적혈구와 혈소판을 제외한 모든 조혈 세포에 위치한 단백질 티로신 포스파타제를 지칭한다[Kaplan R. et al., "Cloning of three human tyrosine phosphatases reveals a multigene family of receptor-linked protein-tyrosine-phosphatases expressed in brain", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, Vol. 87(18): 7000-7004, (1990)].
본원에서 사용되는 용어 "CD59"는 인간 세포를 보체-매개 용해로부터 보호하는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-결합 막 당단백질을 지칭한다[Huang Y. et al., "Defining CD59-C9 binding interaction", J. Biol. Chem., Vol. 281(37): 27398-27404, (2006)].
본원에서 사용되는 용어 "CD62L(L-셀렉틴)"은 나이브 T 세포의 표면에서 공통적으로 발견되는 세포 마커를 지칭한다[Kohn L. A. et al., "Lymphoid priming in human bone marrow begins before expression of CD10 with upregulation of L-selectin", Nat. Immunol., Vol. 13(10): 963-971, (2012)].
본원에서 사용되는 용어 "CD69(분화 클러스터 69")는 CD69 유전자에 의해 인코딩되는 인간 막통과 C-타입 렉틴 단백질을 지칭한다. 생체내 및 시험관내 둘 모두에서 T 림프구 및 자연 살해(NK) 세포의 활성화는 CD69의 발현을 유도한다[Cambiaggi C. et al., "Constitutive expression of CD69 in interspecies T-cell hybrids and locus assignment to human chromosome 12", ,Immunogenetics, Vol. 36(2): 117-120, (1992)].
본원에서 사용되는 용어 "CD80"은 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공자극 신호를 제공하는 활성화된 B 세포 및 단핵구에서 발견되는 단백질을 지칭한다[Zuccarino-Catania G. V. et al., "CD80 and PD-L2 define functionally distinct memory B cell subsets that are independent of antibody isotype", Nat Immunol., Vol. 15(7):631-637, (2012)].
본원에서 사용되는 용어 "CD86"은 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공자극 신호를 제공하는 항원-제시 세포 상에서 발현되는 단백질을 지칭한다[Jellis C. L. et al., "Genomic organization of the gene coding for the costimulatory human B-lymphocyte antigen B7-2 (CD86)", Immunogenetics, Vol. 42: 85-89, (1995)].
본원에서 사용되는 용어 "CD90"(분화 클러스터 90)은 원래 흉선세포 항원으로서 발견된, 단일 V-유사 면역글로블린 도메인을 갖는 25-35 kDa의 크게 N-당화된 글리코포스파티딜이노시톨(GPI) 고정 보존된 세포 표면 단백질을 지칭한다[Wetzel A. et al., "Human Thy-1 (CD90) on activated endothelial cells is a counterreceptor for the leukocyte integrin Mac-1 (CD11b/CD18)", J. Immunol., 172: 3850-3857, (2004)].
본원에서 사용되는 용어 "CD100"은 세마포린 패밀리의 단백질을 지칭한다. 세마포린은 축삭 성장 원추 유도 분자로서 작용하는 분비된 막 단백질의 부류이다. 이들은 주로 단거리 억제 신호로서 작용하고 다합체 수용체 복합체를 통해 신호를 보낸다[Elhabazi A.., "Structure and function of the immune semaphorin CD100/SEMA4D", Crit Rev Immunol., Vol. 23(1-2): 65-81, (2003)].
본원에서 사용되는 용어 "CD223"은 T 세포 기능에 대한 다양한 생물학적 효과를 갖는 세포 표면 분자를 지칭하고 이들 중 하나는 면역 체크포인트 수용체이다[Castelli C., "Lymphocyte activation gene-3 (LAG-3, CD223) in plasmacytoid dendritic cells (pDCs): a molecular target for the restoration of active antitumor immunity", Oncoimmunology, Vol. 3(11): 1-4, (2014)].
본원에서 사용되는 용어 "케모카인"은 백혈구가 특정 방향으로 이동하도록 신호를 보내는 화학주성 사이토카인의 부류를 지칭한다. 케모카인은 작은 사이토카인의 패밀리이거나, 세포에 의해 분비되는 신호전달 단백질이다. 이들의 명칭은 인근 반응성 세포에서 지시된 화학주성을 유도하는 능력으로부터 유래되며, 따라서, 이들은 화학주성 사이토카인이다.
본원에서 사용되는 용어 "케모카인 수용체 7"은 케모카인이라 불리는 유형의 사이토카인과 상호작용하는, 예를 들어, T 세포의 표면에서 발견되는 사이토카인 수용체를 지칭한다. 포유동물에서 20개의 별개의 케모카인 수용체가 기술되었다. 각각은 7-막통과(7TM) 구조를 갖고 세포 내에서 신호 전달을 위해 G-단백질에 커플링되어, 이들을 G 단백질-커플링 수용체의 큰 단백질 패밀리의 구성원으로 만든다[Griffith J. W., "Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defence and immunity", Annual Review of Immunology, Vol. 32: 659-702, (2014)].
본원에서 사용되는 용어 "화학주성"은 화학적 자극을 향한 또는 화학적 자극을 피하는 화학적 농도 구배에 따른 세포의 이동 또는 배향을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "화학주성"은 운동 세포 또는 일부가 매력적으로 여겨지는 환경 조건을 향해 및/또는 기피를 발견한 주변으로부터 멀어지는 지시된 운동을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "집락 자극 인자"는 백혈구의 생산을 조절하는 역할을 하는 사이토카인을 지칭한다. 유형에는 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 및 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "상용성"은 조성물의 구성요소들이 통상적인 사용 조건 하에 조성물의 효능을 실질적으로 감소시킬 상호작용이 없도록 하는 방식으로 서로 조합될 수 있음을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "구성요소"는 구성 부분, 요소, 또는 성분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "질환"은 다양한 건강 상태를 지칭하고, 임의의 기본적인 메커니즘, 장애, 또는 상해에 의해 초래되는 장애 또는 질병을 포함하고자 한다.
본원에서 사용되는 용어 "결과"는 이전에 발생한 어떤 것의 효과, 결과 또는 성과를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "접촉" 및 이의 모든 문법적 형태는 닿거나 바로 옆에 있거나 국소적으로 근접한 상태 또는 조건을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "연결 펩티드"또는 "C-펩티드"는 프로인슐린 분자에서 인슐린의 A-사슬을 이의 B-사슬에 연결하는 짧은 31-아미노산 폴리펩티드를 지칭한다. 이것은 당뇨병과 같은 자가면역 질환의 마커로서 사용된다. 증가된 수준은 인슐린 방출에 대한 지표인데, 그 이유는 이들이 등몰량으로 방출되고 환자에 더 좋은 결과이기 때문이다. 매우 낮은 C-펩티드는 타입 1 당뇨병 및 인슐린 의존성을 확인시키며, 이는 높은 글루코스 가변성, 글루코스 항상성의 부족 및 불량한 결과를 갖는 합병증 증가와 관련이 있다. C-펩티드 수준의 측정은 적당한 β-세포 기능의 평가에 의해 임상적으로 검증된다[Wahren J. et al., "The clinical potential of C-peptide in replacement in type 1 diabetes", Diabetes, Vol. 61(4), 761-772, (2012)].
용어 "제대혈-유래 줄기 세포(CB-SC)" 및 "제대혈 단핵 세포"는 용어 "제대혈 단핵 줄기 세포"와 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "배양 배지"는 일반적으로 살아 있는 세포의 배양에 사용되는 임의의 제조물을 지칭한다. "세포 배양물"은 시험관내에서 배양된 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "사이토카인"은 다른 세포에 대해 다양한 효과를 갖는 세포에 의해 분비되는 작은 가용성 단백질 물질을 지칭한다. 사이토카인은 성장, 발달, 상처 치유, 및 면역 반응을 포함하는 많은 중요한 생리학적 기능을 매개한다. 이들은 세포막에 위치한 세포-특이적 수용체에 결합함에 의해 작용하여, 세포에서 별개의 신호 전달 캐스케이드가 시작되도록 하고, 이는 결국 표적 세포에서 생화학적 및 표현형 변화를 일으킬 것이다. 일반적으로, 사이토카인은 국소적으로 작용한다. 이들은 많은 인터루킨 뿐만 아니라 여러 조혈 성장 인자를 포함하는 타입 I 사이토카인; 인터페론 및 인터루킨-10을 포함하는 타입 II 사이토카인; TNF 및 림포톡신을 포함하는 종양 괴사 인자("TNF")-관련 분자; 인터루킨 1("IL-1")을 포함하는 면역글로불린 슈퍼-패밀리 구성원; 및 광범위한 범위의 면역 및 염증 기능에 결정적인 역할을 하는 분자의 패밀리인 케모카인을 포함한다. 동일한 사이토카인은 세포의 상태에 따라 세포에 다른 효과를 가질 수 있다. 사이토카인은 종종 다른 사이토카인의 발현을 조절하고 그 캐스케이드를 유발한다. 사이토카인의 비제한적인 예는, 예를 들어, IL-1.알파, IL-베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12/IL-23 P40, IL13, IL-17, IL-18, TGF-베타, IFN-감마, GM-CSF, Gro-알파, MCP-1 및 TNF-알파를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "세포계수법"은 단일 세포, 또는 더 나아가, 대략 동일한 크기 또는 단계의 다른 생물학적 또는 비생물학적 입자의 물리적 및/또는 화학적 특성을 측정하는 공정을 지칭한다. 유세포분석법에서, 측정은 세포 또는 입자가 유체 스트림에서 측정 장치(유세포분석기)를 통과할 때 이루어진다. 세포 분류기, 또는 흐름 분류기는 사용자-선택된 값의 범위 내에 있는 측정된 특성을 갖는 세포(또는 다른 소입자)를 우회시켜 수집하기 위해 전기 및/또는 기계적 수단을 사용하는 유세포분석기이다.
본원에서 사용되는 용어 "분화"는 세포 또는 세포들이 상이한 그리고 표현형에 의해 구별되는 세포 유형으로 변화하는 과정을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "분화 유도제"는 세포 분화 과정의 직접적 또는 간접적인 원인 제제인 화합물을 지칭한다. "분화 유도제"는 분화를 유발하기에 충분하긴 하지만 분화에 필수적인 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "질병" 또는 "장애"는 건강의 손상 또는 비정상적인 기능 상태를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "염료"("형광색소" 또는 "형광단"으로도 지칭됨)는 분자가 형광성이 되게 하는 분자의 성분을 지칭한다. 상기 성분은 특정 파장의 에너지를 흡수하고 다른(그러나 동등하게 특정한) 파장에서 에너지를 재방출하는 분자 중의 작용기이다. 방출되는 에너지의 양 및 파장은 염료 및 염료의 화학적 환경 둘 모두에 따라 달라진다. FITC, R-피코에리트린(PE), PE-텍사스 레드 탠덤(Texas Red Tandem), PE-Cy5 탠덤, 프로피듐 이오뎀(propidium iodem), EGFP, EYGP, ECF, DsRed, 알로피코시아닌(allophycocyanin)(APC), PerCp, SYTOX 그린, 쿠마린(courmarin), 알렉사 플루오르(Alexa Fluors)(350, 430, 488, 532, 546, 555, 568, 594, 633, 647, 660, 680, 700, 750), Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Hoechst 33342, DAPI, Hoechst 33258, SYTOX 블루, 크로모마이신(chromomycin) A3, 미트라마이신(mithramycin), YOYO-1, SYTOX 오렌지, 에티듐 브로마이드, 7-AAD, 아크리딘 오렌지, TOTO-1, TO-PRO-1, 티아졸 오렌지, TOTO-3, TO-PRO-3, 티아졸 오렌지, 프로피듐 아이오다이드(PI), LDS 751, Indo-1, Fluo-3, DCFH, DHR, SNARF, Y66F, Y66H, EBFP, GFPuv, ECFP, GFP, AmCyanl, Y77W, S65A, S65C, S65L, S65T, ZsGreenl, ZsYellowl, DsRed2, DsRed 단합체, AsRed2, mRFP1, HcRedl, 모노클로로비만(monochlorobimane), 칼세인(calcein), DyLight 플루오르, 시아닌, 하이드록시쿠마린, 아미노쿠마린, 메톡시쿠마린, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), NBD, PE-Cy5 컨쥬게이트, PE-Cy7 컨쥬게이트, APC-Cy7 컨쥬게이트, Red 613, 플루오레세인, FluorX, BODIDY-FL, TRITC, X-로다민, 리사민 로다민(Lissamine Rhodamine) B, 텍사스 레드, TruRed, GFP[Prendergast F.G. et al, "Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forskalea". Biochemistry, Vol. 17(17): 3448-53, (1978)], 및 이의 유도체를 비제한적으로 포함하는 많은 염료가 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "교육된"은 2개의 세포 집단이 상호 효과를 갖거나 서로 영향을 미치는 것을 의미하는, 상호작용할 수 있는 조건 하에 환자 단핵 세포 및 UC-SC를 공동-배양시킨 결과를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "농축시키다(enrich)"는 요망되는 물질의 비율을 증가시키는 것, 예를 들어, 세포 집단에서의 자연적 빈도와 비교하여 세포 서브타입의 상대적 빈도를 증가시키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "유세포분석법"은 세포의 표현형 및 특성을 조사하기 위한 도구를 지칭한다. 이것은 세포 또는 입자가 액체 스트림에서 감지 영역을 통과하는 레이저(방사선의 자극된 방출에 의한 광 증폭)/광선을 통해 이동할 때 세포 또는 입자를 감지한다. 현미경적 입자의 상대적인 광-산란 및 색-판별된 형광이 측정된다. 세포의 분석 및 분화는 크기, 입도, 및 세포가 항체 또는 염료의 형태로 형광 분자를 운반하는지 여부에 기반한다. 세포가 레이저 빔을 통과할 때, 빛은 모든 방향으로 산란되고, 축으로부터 낮은 각도(0.5-10˚)의 정방향으로 산란되는 빛은 구의 반경의 제곱 및 이에 따라 세포 또는 입자의 크기에 비례한다. 빛은 세포로 들어갈 수 있다; 따라서 90˚ 광(직각, 측면) 산란은 형광색소-결합 항체로 표지되거나 형광 막, 세포질, 또는 핵 염료로 염색될 수 있다. 따라서, 세포 유형의 분화, 막 수용체 및 항원의 존재, 막 전위, pH, 효소 활성, 및 DNA 함량이 촉진될 수 있다. 유세포분석기는 다중파라미터로서, 각 세포에 대한 여러 측정치를 기록한다; 따라서, 이종 집단 내에서 동종 하위집단을 확인할 수 있다[Marion G. Macey, Flow cytometry: principles and applications, Humana Press, 2007].
본원에서 사용되는 용어 "FOXP3(포크헤드 박스 P3; 또는 스쿠르핀(scurfin))"은 면역 시스템 반응에 관여하는 단백질을 지칭한다. FOX 단백질 패밀리의 구성원인 FOXP3는 조절성 T 세포의 발달 및 기능에서 전사 인자 조절인자로서 기능한다. 조절성 T 세포는 일반적으로 면역 반응을 감소시키므로 자가반응성 T 세포를 제어하는 역할을 한다[Kornete M. et al., "Th1-Like ICOS+ Foxp3+ Treg Cells Preferentially Express CXCR3 and Home to β-Islets during Pre-Diabetes in BDC2.5 NOD Mice", PLoS One., Vol. 10(5): 1-16, (2015)].
본원에서 사용되는 용어 "새로운"은 환자로부터 적어도 1시간 내에 수집되거나, 4℃에서 저장되지만, 생물학적 물질이 동결 및 해동되지 않은 생물학적 물질을 지칭한다. 생물학적 물질은 말초 혈액, 제대혈, 백혈구 연층, 골수 등으로부터 분리된 백혈구, 단핵 세포 또는 줄기 세포일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "이식편"은 이식을 위한 임의의 조직 또는 기관을 지칭한다. 이것은 동일한 개체의 한 신체 부위로부터 다른 부위로 옮겨진 자가-조직("자가 이식편"), 유전적으로 동일한 개체 간에 옮겨지거나 조직 이식을 허용하기에 면역학적으로 충분히 상용성인 조직("동계 이식편"), 동일한 종의 유전적으로 상이한 구성원 간에 옮겨진 조직("동종이계 이식편" 또는 "동종이식편"), 및 상이한 종 간에 옮겨진 조직("이종이식편")을 비제한적으로 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "성장"은 세포 집단 및/또는 세포 크기의 확대를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "성장 인자"는 세포 성장의 속도 또는 정도를 유도하거나 변형시키는 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "조혈 줄기 세포"는 스스로 재생할 수 있고, 골수 밖의 순환 혈액 내로 동원되는 다양한 특수화된 세포로 분화될 수 있고, 프로그램된 세포 사멸(아폽토시스)을 겪을 수 있는 혈액으로부터 또는 골수로부터 분리된 세포를 지칭한다. 기술된 발명의 일부 구체예에 따르면, 인간 대상체로부터 유래된 조혈 줄기 세포는 CDS34, CD38, HLA-DR, c-kit, CD59, Sca-1, Thy-1, 및/또는 CXCR-4, 또는 이의 조합물을 비제한적으로 포함하는 세포 표면 마커의 적어도 한 유형을 발현시킨다.
본원에서 사용되는 용어 "HLA-DR"은 항원-제시 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, 및 활성화된 T 세포를 포함하는 여러 세포 유형에 존재하는 인간 클래스 II 조직적합성 항원을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "호르몬"은 신체의 한 부분에서 생산되고 신체의 특정 기능을 유발하거나 조절하기 위해 혈액으로 방출되는 화학물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 장애-관련 질환"은 면역 시스템의 이상이 질환의 발병기전에 기여하는 질환을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 내성" 또는 "면역학적 내성"은 일반적으로 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 갖는 물질에 대한 면역 시스템의 무반응 상태를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역조절 세포(들)"는 케모카인, 사이토카인 및 면역 반응의 다른 매개체를 발현함에 의해 면역 반응을 증대시키거나 감소시킬 수 있는 세포(들)를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "내당능 장애(IGT)"는 혈당치가 정상보다 높지만 당뇨병으로 진단하기에 충분히 높지 않은 상태를 지칭한다. 전-당뇨병으로도 불리는 IGT는 경구 글루코스 부하 시험(OGTT)을 시작한지 2시간 후 140 mg/dL 내지 199 mg/dL의 수준이다. 전-당뇨병을 갖는 대부분의 개체는 타입 2 당뇨병의 발병 위험이 증가한다.
본원에서 사용되는 용어 "염증성 사이토카인" 또는 "염증성 매개체"는 염증 과정의 분자 매개체를 지칭하고, 이는 전- 또는 항-염증성이 되도록 그 효과를 조절할 수 있다. 이러한 가용성, 확산성 분자는 국소적으로 조직 손상 및 감염 부위에서 그리고 더 먼 부위에서 모두 작용할 수 있다. 일부 염증 매개체는 염증 과정에 의해 활성화되는 반면, 다른 것들은 급성 염증에 반응하여 또는 다른 가용성 염증 매개체에 의해 세포 공급원으로부터 합성되고/거나 방출된다. 염증 반응의 염증성 매개체의 예는 혈장 프로테아제, 보체, 키닌, 응고 및 섬유소용해 단백질, 지질 매개체, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 혈소판-활성화 인자(PAF), 펩티드 및 아민, 예를 들어, 비제한적으로 히스타민, 세로토닌, 및 뉴로펩티드, 전-염증성 사이토카인, 예를 들어, 비제한적으로 인터루킨-1-베타(IL-1β), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 인터페론-감마(IF-γ), 및 인터루킨-12(IL-12)를 비제한적으로 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "주입하다(infuse)" 및 이의 다른 문법적 형태는 치료 목적으로 인간을 포함하는 대상체의 혈관 내로 혈액 이외의 유체를 도입하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "주입 용액"은 25 USP 단위/mL의 헤파린 및 1% 인간 혈청 알부민(HSA)이 보충된 인산염 완충 염수(PBS)를 함유하고 혈청-비함유인 용액을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "염증"은 해독 및 수복과 관련된 세포가 염증성 매개체에 의해 손상된 부위로 동원되는 감염 및 상해에 대한 생리학적 반응을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "급성 염증"은 혈관 및 삼출 과정이 우세한 전형적인 징후를 특징으로 하는, 일반적으로 갑작스런 발병의 염증을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "만성 염증"은 느린 진행의 염증을 지칭하고 신규한 결합 조직의 형성에 의해 주로 나타난다. 이것은 급성 형태 또는 장기간의 저-등급 형태의 지속일 수 있고, 대개 영구적인 조직 손상을 일으킨다.
개시제에 관계 없이, 급성 염증을 수반하는 생리학적 변화는 네 가지 주요 특징을 포함한다: (1) 혈액 흐름의 순 증가를 발생시키는 혈관확장은 급성 조직 손상에 대한 가장 빠른 신체 반응 중 하나이다; (2) 염증자극에 반응하여, 세정맥의 내층인 내피 세포가 수축하여, 세포내 연접을 넓혀 틈을 만들고, 이는 혈장 밖으로 혈장 단백질 및 혈구의 누출을 허용하는 증가된 혈관 투과성을 발생시킨다; (3) 염증은 종종 염증 부위의 백혈구, 특히 호중구(다형핵 세포)의 강한 침윤을 특징으로 한다. 이들 세포는 독성 물질을 방출함에 의해 혈관벽에서 또는 손상되지 않은 조직에서 조직 손상을 촉진한다; 그리고 (4) 특정 자극에 반응하여 백혈구로부터 방출되는 발열원에 의해 발생한 발열.
염증 과정 동안, 염증 반응의 가용성 염증 매개체는 신체적 고통을 유발하는 제제를 억누르고 제거하려는 시도에서 전신적인 방식으로 세포 성분과 함께 작용한다. 매개체와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "염증성" 또는 "면역-염증성"은 염증 과정의 분자 매개체를 지칭한다. 이러한 가용성, 확산성 분자는 국소적으로 조직 손상 및 감염 부위에서 그리고 더 먼 부위에서 모두 작용할 수 있다. 일부 염증 매개체는 염증 과정에 의해 활성화되는 반면, 다른 것들은 급성 염증에 반응하여 또는 다른 가용성 염증 매개체에 의해 세포 공급원으로부터 합성되고/거나 방출된다. 염증 반응의 염증성 매개체의 예는 혈장 프로테아제, 보체, 키닌, 응고 및 섬유소용해 단백질, 지질 매개체, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 혈소판-활성화 인자(PAF), 펩티드 및 아민, 예를 들어, 비제한적으로 히스타민, 세로토닌, 및 뉴로펩티드, 전-염증성 사이토카인, 예를 들어, 비제한적으로 인터루킨-1, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-8, 종양 괴사 인자(TNF), 인터페론-감마, 및 인터루킨 12를 비제한적으로 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "억제하다" 및 이의 다양한 문법적 형태, 예를 들어, 비제한적으로 "억제하는" 또는 "억제는 공정의 양 또는 속도를 감소시키거나, 과정을 완전히 중지시키거나, 이의 작용 또는 기능을 감소, 제한, 또는 차단하는 것을 지칭한다. 억제는 물질의 양, 속도, 작용 기능, 또는 공정의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%만큼의 감소 또는 하락을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "억제제"는 첫 번째 분자에 결합하여 첫 번째 분자의 활성을 감소시키는 두 번째 분자를 지칭한다. 억제제는 종종 이들의 특이성 및 효력에 의해 평가된다.
본원에서 사용되는 용어 "인슐린 내성"은 주어진 양의 인슐린에 대한 신체의 정상 반응이 감소되는 상태를 지칭한다. 결과적으로, 적절한 효과를 가지려면 이를 위해 더 높은 수준의 인슐린이 필요하다. 췌장은 더 이상 신체의 요구에 충분한 인슐린을 생산할 수 없을 때까지 더 많은 인슐린을 생산한다. 이후 혈당이 상승한다. 인슐린 내성은 타입 2 당뇨병의 발병 위험 인자인다.
본원에서 사용되는 용어 "인터루킨"은 다른 백혈구와의 통신 수단으로서 백혈구에 의해 분비된 사이토카인을 지칭한다. 인터루킨은 세포 성장, 분화, 및 운동성을 조절하고, 염증과 같은 면역 반응을 자극한다. 인터루킨의 예는 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 및 인터루킨-12(IL-12)를 비제한적으로 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 비제한적으로 자연 발생 환경에서 발견되는 바와 같이 일반적으로 동반되거나 상호작용하는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는 세포 또는 세포 집단과 같은 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "백혈구(leukocyte)" 또는 "백혈구(white blood cell)(WBC)"는 면역 세포의 유형을 지칭한다. 대부분의 백혈구는 골수에서 만들어지고 혈액 및 림프 조직에서 발견된다. 백혈구는 신체가 감염 및 다른 질병과 싸우는 것을 돕는다. 과립구, 단핵구, 및 림프구는 백혈구이다.
본원에서 사용되는 용어 "림프구"는 질병에 대해 신체를 방어하는데 큰 역할을 하는 작은 백혈구(백혈구)를 지칭한다. 두 가지 주요 유형의 림프구가 있다: B 세포 및 T 세포. B 세포는 박테리아 및 독소를 공격하는 항체를 만들고 T 세포는 신체 세포 자체를 공격한다. 림프구는 많은 다른 유형의 세포의 기능적 활성을 조절하는 생성물(림포카인)을 분비하고 종종 만성 염증의 부위에 존재한다.
본원에서 사용되는 용어 "대식세포"는 골수에서 단핵구 줄기 세포로부터 발생하는 단핵의 활성 식세포를 지칭한다. 이들 세포는 신체에 널리 분포되어 있고 형태 및 운동성이 다양하다. 식세포 활성은 전형적으로 특정 면역글로불린 및 보체 시스템의 성분을 포함하는 혈청 인지 인자에 의해 매개되지만, 비특이적일 수도 있다. 대식세포는 또한 항체의 생산 및 세포-매개 면역 반응 둘 모두에 관여하고, 특히 림프구에 대한 항원 제시에 관여한다. 이들은 다양한 면역-조절 분자를 분비한다.
본원에서 사용되는 용어 "주조직적합성 복합체(MHC)"는 조직적합성을 결정함에 의해 모든 척추동물에서 면역 시스템의 필수 부분을 조절하는 세포 표면 분자를 인코딩하는 유전자의 세트를 지칭한다. MHC 분자의 주요 기능은 병원체로부터 유래된 펩티드 단편에 결합하여 이들을 적절한 T-세포에 의한 인지를 위해 세포 표면에 표시하는 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "모방체"는 펩티드의 활성을 모방하는 화학적 모이어티를 함유하는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 펩티드가 기능적 활성을 갖는 2개의 하전된 화학적 모이어티를 함유하는 경우, 모방체는 하전된 화학적 기능이 3차원 공간에서 유지되도록 하는 공간적 배향 및 강제적인 구조로 2개의 하전된 화학적 모이어티를 배치한다. 모방체는 자체가 펩티드일 수 있다. 모방체는 또한 비-펩티드일 수 있고/거나 비-펩티드 결합, 예를 들어, 비제한적으로, psi 결합에 의해 연결된 아미노산을 포함할 수 있고[Benkirane, N., et al. J. Biol. Chem., Vol. 271: 33218-33224, (1996)], 미국 특허 5,637,677호 및 이의 특허 출원은 모방체의 생산에 대한 상세한 지침을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "분열촉진 화합물"은 성장 또는 배양에 적합한 적어도 한 세트의 조건 하에 적어도 하나의 세포 유형에 대한 세포 분열의 속도에 영향을 줄 수 있는 화합물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "조절하다"는 특정 치수 또는 비율에 대한 규제, 변경, 적응, 또는 조정을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "다분화능(multipotent)"은 하나 초과의 세포 유형으로 발달할 수 있지만, 다능성 세포보다 더욱 제한적인 세포를 지칭한다. 성체 줄기 세포 및 제대혈 줄기 세포는 다분화능으로 간주된다.
본원에서 사용되는 용어 "음성적 선택"은 잔류하는 관심 세포 유형을 제외한 모든 세포 유형을 고갈시키거나 제거하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "경구 글루코스 부하 시험(OGTT)"은 밤새 금식 후에 건강 관리 전문가에 의해 제공되는 전-당뇨병 및 당뇨병을 진단하는 검사를 지칭한다. 혈액 샘플을 채취한 다음, 환자는 고-글루코스 음료를 마신다. 혈액 샘플을 2 내지 3시간 간격으로 채취한다. 시험 결과를 표준과 비교하고 이는 신체가 글루코스를 시간에 따라 얼마나 사용하는지를 보여준다. 당뇨병은 2-시간 혈당이 200 mg/dL 이상인 경우에 진단된다.
본원에서 사용되는 용어 "주변분비 신호전달"은 인접한 세포에 작용하는 분비된 신호 분자를 통한 단거리 세포-세포 통신을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "전-당뇨병"은 혈당치가 정상보다 높지만 당뇨병으로 진단하기에 충분히 높지 않은 상태를 지칭한다. 전-당뇨병이 있는 사람들은 타입 2 당뇨병의 발병 위험 및 심장 질환 및 뇌졸중의 위험이 높다. 전당뇨병을 나타내는 결과는 다음을 포함한다: 5.7% - 6.4%의 A1C. 100 mg/dL - 125 mg/dL의 공복 혈당, 및 140 mg/dL - 199 mg/dL의 경구 글루코스 부하 시험(OGTT) 2시간 혈당.
용어 "다능성"은 신체를 구성하는 모든 세포 유형을 발생시킬 수 있는 세포를 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기 세포는 다능성으로 간주된다. 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)는 배아 줄기 세포의 규정 성질을 유지하는데 중요한 유전자 및 인자를 강제적으로 발현함에 의해 배아 줄기 세포-유사 상태로 유전적으로 재프로그램된 성체 세포이다. 다능성 마커는 비제한적으로 Oct-4, Nanog, 및 Sox-2를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "양성적 선택"은 표적 세포 집단의 분리를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "기원 세포"는 단지 분화는 할 수 있지만, 더 이상 자신을 성숙시킬 수 없는 줄기 세포의 초기 자손을 지칭한다. 기원 세포는 성숙한 표현형으로 성숙되는 하는 전구 세포로 성숙된다. 기원 세포는 집락-형성 단위(CFU) 또는 집락-형성 세포(CFC)로 지칭된다. 기원 세포의 특정 계통은 비제한적으로 CFU-E(적혈구), CFU-F(섬유모세포), CFU-GM(과립구/대식세포), 및 CFU-GEMM(다능성 조혈 기원 세포)와 같은 접미사로 표시된다.
본원에서 사용되는 용어 "증식하다" 및 이의 다양한 문법적 형태는 수의 증가를 지칭한다. 용어 "증식" 및 "확장"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "번식하다" 또는 "번식"은 재생을 유도하여, 수 또는 양을 증가시키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "정제하다"는 외래 또는 관련 없는 요소를 없애는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "감소된" 또는 "감소시키는"은 정도, 강도, 규모, 크기, 양, 밀도 또는 수의 축소, 감소, 감쇠 또는 경감을 지칭한다.
본원에서 사용되는, 이전에 억제제 T 세포로서 공지된 "조절성 T 세포(Treg)"라는 용어는 면역 시스템을 조절하여 자가-항원에 대한 내성을 유지하고 자가면역 질환을 없애는 T 세포의 하위집단을 지칭한다.
본원에서 명사로서 사용되는 용어 "수복"은 기능을 복원하는 임의의 수정, 보강, 재생, 구제, 보충, 보완, 갱신, 수선, 패칭 등을 지칭한다. 동사로 사용될 때, 이것은 수정, 보강, 재생, 구제, 보충, 보완, 갱신, 수선, 패칭, 또는 달리 기능을 복원하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "줄기 세포"는 하나 초과의 별개의 세포 표현형으로 최종 분화를 겪을 수 있는 딸 세포를 생성할 수 있는 자가-재생 능력을 갖는 높은 증식 가능성을 갖는 미분화된 세포를 지칭한다.
용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "환자"는 인간, 비인간 영장류; 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 가축; 개 및 고양이와 같은 가정내 포유동물; 마우스, 래트 및 기니피그와 같은 설치류를 포함하는 실험실 동물 등을 비제한적으로 포함하는 포유동물 기원의 동물 종의 구성원을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료를 필요로 하는 대상체"는 (i) 자가면역 성분을 갖는 장애로 고통받을 환자; (ii) 자가면역 성분을 갖는 장애로 고통받고 있는 환자; 또는 (iii) 자가면역 성분을 갖는 장애로 고통받아 왔던 환자를 지칭한다. 일부 구체예에 따르면, 상기 어구는 또한 어구의 문맥 및 사용에서 달리 지시되지 않는 한 (i) 기술된 줄기 세포 교육자(SCE) 치료를 받을 환자; (b) 기술된 SCE 치료를 받고 있는 환자; 또는 (c) 기술된 SCE 치료를 받아 왔던 환자를 지칭하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적인", "실질적으로", "본질적인" 또는 "본질적으로"는 이들 용어에 의해 기술된 특징이 현재 청구된 발명의 실시를 위해 관련된 기술적 효과를 제공하는 양으로 존재하거나 영향력을 갖는다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 조성물 중 물질의 "실질적인 양"은 그 물질에 기인하는 기술적 효과를 제공하는 양이다. 마찬가지로, 조성물이 특정 물질을 "실질적으로 포함하지 않는다고" 표시될 때, 이는 상기 물질의 사소한 양이 조성물의 다른 성분에 임의의 기술적 영향을 미치지 않고 그 자체로 "차이를 만들지" 않는 한, 조성물이 이러한 양을 포함할 수 있음을 의미하거나 다른 말로 표현하자면, "실질적으로 없다" 및 "본질적으로 없다"는 것은, 예를 들어, 미량 또는 효과가 전반적인 기술적 영향을 미치지 않는 한 이들이 존재할 수 있음을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "본질적으로 없다" 또는 "실질적으로 없다"는 오염 물질, 불순물 또는 물질이 상당히 또는 현저히 없음을 지칭하고, 예를 들어, 오염 물질, 불순물 또는 물질은 분석 프로토콜에 의해 결정시 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만의 양으로 존재한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포에 적용될 때 "실질적으로 균일한"이라는 용어는 집단 내의 세포의 적어도 약 70%가 분화의 하나 이상의 마커에 대한 검정으로 측정시 동일한 세포 유형을 갖는 세포의 집단을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "억제하다"는 생물학적 사건을 억제, 차폐 또는 폐지시키는 것을 의미한다.
용어 "표면 항원"은, 예를 들어, 세포막과의 결합에 의해 전형적으로 세포의 외부 표면에 국소화된 물질을 의미한다. 세포 "마커"는 그 세포 또는 세포 유형의 특성을 나타내도록, 세포와 충분히 관련된 검출 가능한 요소이다. 예를 들어, 세포 표면 마커는 세포 활성을 최소한으로 방해하면서 검출될 수 있고, 세포 유형의 특성화, 이의 식별, 및 궁극적으로 이의 분리를 용이하게 할 수 있다. 세포 분류 기술은 세포 표면 마커가 양성적 선택 또는 음성적 선택, 즉, 세포 집단으로부터 포함 또는 배제를 위해 사용될 수 있는 세포 바이오마커에 기반한다.
본원에서 사용되는 용어 "T 세포 구획"은 구획의 세포가 이동하여 서로 상호작용할 수 있는 분비된 세포외 거대분자의 복잡한 네트워크에 임베딩된 T 림프구의 협력적 어셈블리를 지칭한다. T-세포 구획의 예시적인 구성원은 나이브 T 세포 집단, 항원-경험 T 세포 집단, 조절성 T 세포 집단(Treg), 헬퍼 T 세포 집단, 세포독성 T 세포 집단, 기억 T 세포 집단(TCM), 이펙터 T 세포 집단(TEM)을 포함한다.
용어 "치료량", "치료적 유효량", "효과적인 양", "유효량", 또는 "약학적 유효량"은 의도된 치료 이익을 제공하기에 충분한 양을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 그러나, 노출 수준은 상해 유형, 연령, 체중, 성별, 환자의 의학적 상태, 질환의 중증도, 투여 경로, 및 사용된 특정 활성제를 포함하는 다양한 요인에 기반한다. 따라서, 투여 요법은 광범위하게 변할 수 있지만, 표준 방법을 사용하여 의사가 일상적으로 결정할 수 있다. 추가로, 용어 "치료적 유효량" 및 "약학적 유효량"은 방지적 또는 예방적 양을 포함한다. 기술된 발명의 방지적 또는 예방적 적용에서, SCE 장치 및 치료는 질병, 장애 또는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 이의 합병증, 및 질병, 장애 또는 질환의 발달 중에 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함하는, 질병, 장애 또는 질환의 위험을 제거 또는 감소시키거나, 중증도를 줄이거나, 발병을 지연시키기에 충분한 양으로 질병, 장애 또는 질환에 걸리기 쉽거나, 또는 달리 위험한 환자를 치료하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 성분"은 집단의 백분율로 특정 질병 소견의 진행을 제거, 감소 또는 예방하는 치료적 유효량(즉, 투여 용량 및 빈도)을 지칭한다. 일반적으로 사용되는 치료 성분의 예는 ED50이고, 이는 집단의 50%에서 특정 질병 소견에 치료적으로 효과적인 특정 투여량의 용량을 설명한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 효과"는 치료의 결과를 의미하고, 그 결과는 요망되고 유익한 것으로 판단된다. 치료 효과는 직접 또는 간접적으로 질병 소견의 저지, 감소, 또는 제거를 포함할 수 있다. 치료 효과는 또한 직접 또는 간접적으로 질병 소견의 진행의 저지, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다.
용어 "치료 윈도우(therapeutic window)"는 허용될 수 없는 독성 없이 치료 효능을 제공하는 농도 범위를 지칭한다. 약물 용량의 투여 후, 그 효과는 대개 특징적인 일시적 패턴을 나타낸다. 약물 농도가 요망되는 효과에 대한 최소 유효 농도("MEC")를 초과하기 전에 지연기가 존재한다. 반응의 시작 후, 효과의 강도는 약물이 계속하여 흡수되고 분비됨에 따라 증가한다. 이것은 피크에 도달하고, 그 후 약물 제거는 약물 농도가 MEC 아래로 떨어질 때 사라지는 효과의 강도에서의 감소를 발생시킨다. 따라서, 약물의 작용 지속기간은 농도가 MEC를 초과하는 기간에 의해 결정된다. 치료 목표는 최소한의 독성과 함께 요망되는 반응을 위한 치료 윈도우 내의 농도를 수득하고 유지하는 것이다. 요망되는 효과에 대한 MEC 이하의 약물 반응은 치료량-아래(sub-therapeutic)일 것이지만, 부작용의 경우, 독성의 확률은 MEC 이상에서 증가할 것이다. 약물 투여량을 증가 또는 감소시키는 것은 반응 곡선을 강도 스케일의 위 또는 아래로 이동시키고 이는 약물의 효과를 조절하는데 사용된다. 용량을 증가시키는 것은 또한 약물의 작용 지속기간을 연장시키지만 부작용의 가능성이 증가할 위험이 있다. 따라서, 약물이 무독성이 아닌 한, 용량을 증가시키는 것은 약물의 작용 지속기간을 연장시키는 유용한 전략이 아니다.
대신, 농도를 치료 윈도우 내에 유지하기 위해 또 다른 용량의 약물이 제공되어야 한다. 일반적으로, 약물의 치료 범위의 하한은 가능한 가장 큰 치료 효과의 약 절반을 생산하는 약물 농도와 대략 같은 것으로 보이고, 치료 범위의 상한은 환자의 약 5% 내지 약 10% 이하가 독성 효과를 경험할 약물 농도이다. 이들 수치는 매우 다양할 수 있고, 일부 환자는 치료 범위를 초과하는 약물 농도로부터 큰 이점을 얻을 수 있지만, 다른 환자는 훨씬 낮은 값에서 현저한 독성을 겪을 수 있다. 치료 목표는 치료 윈도우 내에서 정상-상태의 약물 수준을 유지하는 것이다. 대부분의 약물의 경우, 이 요망되는 범위와 관련된 실제 농도는 알려져 있지 않고 알 필요가 없으며, 효능 및 독성은 일반적으로 농도-의존성이고, 약물 투여량 및 투여 빈도가 약물 수준에 어떤 영향을 미치는지를 이해하는 것으로 충분하다. 효능 및 독성을 발생시키는 농도 사이에 작은(2 내지 3배) 차이가 있는 소수의 약물에 대해, 효과적인 요법과 관련된 혈장-농도 범위가 정의되었다.
이러한 경우에, 효능 및 최소 독성과 관련된 약물의 요망되는 목표 정상-상태 농도(일반적으로 혈장내)를 선택하고, 이 값을 달성할 것으로 예상되는 투여량을 계산하는 목표 수준 전략이 타당하다. 후속하여 약물 농도를 측정하고 필요한 경우 목표에 더 가깝게 비슷해지도록 투여량이 조정된다.
대부분의 임상 상황에서, 약물은 일련의 반복 용량 또는 연속 주입으로 투여되어 치료 윈도우와 관련된 약물의 정상-상태 농도를 유지한다. 선택된 정상-상태 또는 목표 농도("유지 용량")를 유지하기 위해, 약물 투여 속도는 투입 속도가 손실 속도와 같도록 조정된다. 임상의가 혈장에서 약물의 요망되는 농도를 선택하고 특정 환자에서 그 약물에 대한 제거율 및 생체이용률을 알고 있는 경우, 적절한 용량과 투여 간격이 계산될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전능 세포"는 신체의 임의의 및 모든 세포 유형은 물론 배아외 또는 태반 세포를 생성할 가능성을 갖는 세포를 지칭한다. 수정 후 세포 분열의 처음 몇 개 내의 배아 세포는 전능 세포이다.
용어 "치료하다" 또는 "치료하는"은 질병, 질환 또는 장애의 진행을 폐지, 실질적으로 억제, 지연 또는 역전시키고, 질환의 임상적 또는 심미적 증상을 실질적으로 개선시키고, 질병, 질환 또는 장애의 임상적 또는 심미적 증상의 출현을 실질적으로 예방하고, 유해하거나 성가신 증상으로부터 보호하는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료하는"은 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 추가로 지칭한다: (a) 장애의 중증도의 감소; (b) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 발달 제한; (c) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화 제한; (d) 이전에 장애(들)를 가졌던 환자에서 장애(들)의 재발 제한; 및 (e) 이전에 장애(들)에 대한 증상이 있었던 환자에서 증상의 재발 제한.
본원에서 사용되는 용어 "타입 1 당뇨병"은 신체의 면역 시스템이 췌장에서 인슐린-생산 베타 세포를 공격하여 이들을 파괴할 때 발생하는 인슐린 총 부족에 의해 초래된 높은 혈당치를 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 이후 췌장은 인슐린을 거의 또는 전혀 생산하지 못한다. 타입 1 당뇨병은 젊은 사람들에서 가장 흔하게 발생하지만 성인에서 나타날 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "타입 2 당뇨병"은 인슐린이 부족하거나 신체가 인슐린을 효율적으로 사용할 수 없어서 초래된 높은 혈당치를 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 타입 2 당뇨병은 중년 및 고령자에서 가장 흔하게 발생하지만 젊은 사람들에서 나타날 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "제대혈(UC) 단핵 세포(MNC)", "(UC-MNC)"는 림프구, 단핵구, 줄기 및 기원 세포와 같은 조혈 계통의 세포, 및 제대혈(CB)로부터 유래된 중간엽 간질 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "미분화된"은 보다 특수화된 세포의 특징을 발달시키지 않은 세포를 지칭한다. "분화된" 세포는 보다 특수화된 세포의 특징을 갖는 세포이다. 용어 "미분화된" 및 "분화된"은 서로에 대해 상대적이다. 분화된 세포 및 미분화된 세포는, 예를 들어, 상대적인 크기 및 형태, 세포질 부피에 대한 핵 부피의 비와 같은 형태학적 특징; 및 분화의 공지된 마커의 검출 가능한 존재와 같은 발현 특징에 의해 서로 구별된다. 예시적인 분화 마커는 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산, 기능적 특징 및 형태학적 특징을 포함한다.
림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병의 치료 방법
한 양태에 따르면, 기술된 발명은
(1) 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병을 앓고 있는 대상체로부터 단핵 세포를 함유하는 전혈 샘플을 무균 조건 하에 획득하고;
(2) (1)의 전혈 샘플을 처리 시설로 수송하고;
(3) 전혈 샘플로부터 단핵 세포(MNC)를 무균 정제하여 단핵 세포 제조물을 형성하고;
(4) 단핵 세포 제조물을 부착성 제대혈 줄기 세포(UC-SC)의 생육가능 집단을 포함하는 생물반응기 장치에 도입하고, 이 때 부착성 UC-SC는 적어도 80% 컨플루언트이며;
(5) 단핵 세포 제조물 중의 단핵 세포 및 CB-SC가 적어도 0.1시간, 적어도 0.2시간, 적어도 0.3시간, 적어도 0.4시간, 적어도 0.5시간, 적어도 0.6시간, 적어도 0.7시간, 적어도 0.8시간, 적어도 0.9시간, 적어도 1.0시간, 적어도 1.5시간, 적어도 2시간, 적어도 2.5시간, 적어도 3시간, 적어도 3.5시간, 적어도 4시간, 적어도 4.5시간, 적어도 5시간, 적어도 5.5시간, 적어도 6시간, 적어도 6.5시간, 적어도 7시간, 적어도 7.5시간, 또는 적어도 8시간 동안 무균 조건 하에 상호작용할 수 있도록 단핵 세포 제조물을 CB-SC와 공동-배양하여 교육된 단핵 세포 생성물을 형성하고;
(6) 교육된 단핵 세포 생성물을 무균 조건 하에 생물반응기 장치로부터 수확하고;
(7) 적어도 104, 적어도 105, 적어도 106, 적어도 107, 또는 적어도 108개 단핵 세포를 갖는 교육된 단핵 세포 생성물의 순도, 무균성, 및 생육성 퍼센트를 확인하고;
(8) 교육된 단핵 세포 생성물을 대상체로의 혈관내 주입을 위해 임상 시설로 수송하고; 그리고
(9) 치료적 유효량의 교육된 단핵 세포 생성물을 대상체에 혈관내 주입하고;
(10) 단계 (1) 내지 (9)를 순서대로, 대상체의 일생 동안 필요에 따라 복수의 주입 일에 반복하는 것을 포함하는 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병을 치료하는 방법을 제공하고,
여기서 치료적 유효량의 교육된 단핵 세포 생성물은 대상체의 T 세포 구획에서 자가반응성을 조절하고, 면역 질환의 증상을 감소시키는데 효과적이다.
일부 구체예에 따르면, 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병은 타입 1 당뇨병(T1D) 또는 타입 2 당뇨병(T2D)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에 따르면, 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병은 당뇨병이다. 일부 구체예에 따르면, 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병은 타입 1 당뇨병이다. 일부 구체예에 따르면, 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병은 타입 2 당뇨병이다.
일부 구체예에 따르면, 단핵 세포 집단은 면역조절 세포의 집단을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 면역조절 세포의 집단은 백혈구의 집단을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 백혈구의 집단은 림프구의 집단, 과립구의 집단, 호염기구의 집단, 단핵구의 집단, 또는 이의 조합물을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 면역조절 세포의 집단은 항원-포획 세포의 집단, 항원 제시 세포의 집단, 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 항원 제시 세포의 집단은 CD80, CD86, 또는 둘 모두를 발현시킨다. 일부 구체예에 따르면, 항원 제시 세포의 집단은 대식세포, 수지상 세포 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 림프구의 집단은 T 림프구의 집단, B 림프구의 집단, 자연 살해(NK) 세포의 집단, 또는 이의 조합물을 포함한다.
일부 구체예에 따르면, T 림프구의 집단은 T 세포의 하나 이상의 집단을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, T 세포의 집단은 활성화된 T 세포를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 활성화된 T 세포의 집단은 나이브 T 세포, 프라이밍된 T-세포, 활성화된 T 세포, 이펙터 T 세포, 세포독성 T 세포, T 헬퍼 세포, 기억 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포로부터 선택된다. 일부 구체예에 따르면, T 세포의 집단은 하나 이상의 염증성 매개체(림포카인)를 발현시키는 T 세포를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 염증성 매개체는 인터루킨-1-베타(IL-1β), IL-2, 인터루킨-4(IL-4), IL-5, 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(Il-8), IL-10, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 인터페론-감마(IFN-γ), 인터루킨-12(IL-12), 및 림포톡신으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에 따르면, T 림프구의 집단은 T 세포 수용체(TCR)/CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD40 리간드(CD40L), Fox3, fas, MHC I, MHCII, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM), ZAP70(제타 관련 단백질)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현시키는 T 세포를 포함한다.
일부 구체예에 따르면, B 림프구의 집단의 B 세포의 하나 이상의 집단을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, B 세포의 집단은 활성화된 B 세포를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, B 세포의 집단은 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포, 플라즈마플라스트(plasmaplast), 및 기억 B 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에 따르면, B 림프구의 집단은 MHC 클래스 II, CD40, 면역글로불린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현시키는 B 세포를 포함한다.
전혈 샘플로부터 단핵 세포를 정제하는 방법은 잘 알려져 있다. 한 구체예에 따르면, 적혈구로부터 백혈구 연층을 분리하기 위해, 적혈구를 밀도 구배 원심분리에 의해, 예를 들어, Ficoll Paque 분획화를 사용하여 제거한다. 용어 "백혈구 연층"은 대부분의 백혈구를 함유하는 혈액 샘플의 얇은 회백색 분획을 지칭한다.
일부 구체예에 따르면, 전혈 샘플로부터 단핵 세포의 정제는 자동화 성분채집술 분리기를 사용하는 성분채집술에 의해 이루어진다. 간단히 말하자면, 전혈을 환자로부터 채취한 다음 방사 챔버를 함유하는 장치를 통해 통과시킨다. 혈액은 챔버의 벽을 따라 중력에 의해 그 성분들(혈장, 혈소판-풍부한 혈장, 백혈구 및 적혈구)로 분리된다. 단핵 세포를 분류하고 나머지 혈액 성분을 환자의 혈류로 다시 재도입한다.
일부 구체예에 따르면, 자성 비드 활성화된 세포 분류는 말초 혈액 단핵 세포로부터 특정 세포 집단을 정제하는데 사용되는 양성적 선택 기술이다. 그러한 프로토콜 후에 요망되는 세포의 양 및 활성이 감소할 수 있기 때문에, 일부는 보다 부드러운 기질 부착 및 음성적 선택 프로토콜을 선호한다.
일부 구체예에 따르면, 생물반응기 장치는 부착성 제대혈 줄기 세포(UC-SC)의 생육가능 집단을 포함하는 하나 이상의 표면을 포함한다. 순서대로:
(a) 건강한 공여자에게서 얻은 새로운 제대혈 유닛을 수득하고;
(b) 제대혈로부터 단핵 세포 분획을 밀도 구배 원심분리에 의해 분리하고;
(c) 적혈구를 제거하고;
(d) UC-단핵 세포를 생리학적 완충 염수액으로 세척하고;
(e) 생물반응기의 UC 단핵 세포를 적어도 1x106개 세포의 시딩 밀도로 혈청-비함유 배양 배지에 시딩하고;
(f) 혈청-비함유 배양 배지에서 UC 단핵 세포를 배양하고, 비부착 세포를 제거하기 위해 2-3일마다 적어도 10일 동안 절반/배지를 변화시켜 적어도 80% 컨플루언스로 성장시키고; 그리고
(g) CB-SC 배양물 샘플의 무균성 및 생육성을 확인하는 것을 포함하는 방법에 의해 UC-SC를 포함하는 생물반응기를 제조하는 방법.
CB-SC의 배양물은 원형이며 생물반응기 장치의 바닥 표면에 부착된다. 일부 구체예에 따르면, 생물반응기 장치의 표면은 코팅되지 않은 플라스틱이다. 일부 구체예에 따르면, 생물반응기 장치의 표면은 양으로 하전된 표면이다. 일부 구체예에 따르면, 생물반응기 장치의 표면은 소수성 표면, 예를 들어, 폴리스티렌 또는 유리이다. 일부 구체예에 따르면, 생물반응기 장치의 표면은 코팅된다. 일부 구체예에 따르면, 생물반응기 장치의 표면은 세포 영양층을 포함하지 않는다.
일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 80% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 85% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 90% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 95% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 96% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 97% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 99% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 99% 컨플루언스로 성장한다.
환자로부터의 단핵 세포 제조물은 환자의 단핵 세포 및 UC-SC 세포를 공동-배양하기 위해 생물반응기로 도입된다. 일부 구체예에 따르면, 단핵 세포 제조물은 UC-CB 층으로부터 분리된다. 일부 구체예에 따르면, 환자의 단핵 세포는 비부착성이다. 일부 구체예에 따르면, 환자의 단핵 세포는 UC-CB 층의 세포와 접촉한다. 일부 구체예에 따르면, 배양 배지는 성장 인자, 가용성 염증 매개체 등을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 배양 배지는 환자의 단핵 세포 및 UC-CB 세포층 둘 모두를 지지하기에 효과적이다. 일부 구체예에 따르면, 배양 배지는 환자의 단핵 세포 및 UC-CB 세포에 의해 생산된 면역조절 매개체 및 가용성 인자를 포함한다.
일부 구체예에 따르면, 상호작용 조건은 생물반응기의 부드러운 흔들기를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 생물반응기의 부드러운 흔들기는 간헐적이다. 일부 구체예에 따르면, 배지는 생물반응기를 통해 순환된다.
환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 2시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 3시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 4시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 5시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 6시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 7시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 8시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 9시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 10시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 11시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 12시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 13시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 14시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 15시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 16시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 17시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 18시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 19시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 20시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 21시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 22시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 23시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 24시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다.
일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:2의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:5의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:10의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:20의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:50의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:60의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:70의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:80의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:90의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:100의 비로 공동-배양된다.
이 상호작용의 결과는 교육된 단핵 세포 생성물이다.
교육된 단핵 세포 생성물은 생물반응기 장치로부터 무균 조건 하에 수확된다.
교육된 단핵 세포 생성물의 순도, 무균성, 및 생육성을 확인하기 위한 검정; 생육성 퍼센트는 다음을 포함한다.
일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물의 내독소 수준은 약 0.5 내독소 단위/mL 미만이고, 교육된 단핵 세포 생성물은 그램 염색 음성이다. 교육된 단핵 세포 생성물은 또한 마이코플라스마 및 무균성에 대해, 예를 들어, 미국 FDA Good Laboratory Practice Regulations의 요건에 따라 실시간 PCR에 의해 시험된다.
"검출 가능한 반응"은 검정에서 검출될 수 있는 임의의 신호 또는 반응을 말하며, 이는 검출 시약을 사용하거나 사용하지 않고 수행될 수 있다. 검출 가능한 반응은 방사성 붕괴 및 에너지(예를 들어, 형광, 자외선, 적외선, 가시광선) 방출, 흡수, 편광, 형광, 인광, 전송, 반사 또는 공명 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 검출 가능한 반응은 또한 크로마토그래피 이동도, 혼탁도, 전기영동 이동도, 질량 스펙트럼, 자외선 스펙트럼, 적외선 스펙트럼, 핵 자기 공명 스펙트럼 및 x-선 회절을 포함한다. 대안적으로, 검출 가능한 반응은 융점, 밀도, 전도도, 표면 음향파, 촉매 활성 또는 원소 조성과 같은 생물학적 물질의 하나 이상의 성질을 측정하기 위한 검정의 결과일 수 있다. "검출 시약"은 관심 물질의 존재 또는 부재를 나타내는 검출 가능한 반응을 생성하는 임의의 분자이다. 검출 시약은 항체, 핵산 서열 및 효소와 같은 다양한 분자 중 임의의 것을 포함한다. 검출을 용이하게 하기 위해, 검출 시약은 마커를 포함할 수 있다.
마커는 임의의 다양한 확립된 방법에 의해 검정될 수 있다. 항체-기반 기술은 형광 활성화 세포 분류(FACS) 면역형광, 효소 면역조직화학, 및 면역블롯팅을 비제한적으로 포함한다. 추가 검정은 사이토카인 수준 또는 mRNA의 검출을 위한 검정 또는 특정 마커의 인코딩을 검출하는 "웨스턴 블롯" 기술을 포함할 수 있다. 용어 "웨스턴 블롯"은 복잡한 혼합물에서 단백질을 확인하는 방법을 지칭한다; 단백질은 겔 배지에서 전기영동에 의해 분리되고; 겔로부터 관심 단백질(들)에 결합하고, 위치를 찾아내고, 시각화를 가능하게 하는 특정 항체에 노출된 분리된 단백질을 함유하는 단백질 결합 시트 또는 막으로 옮겨진다. 추가 검정은 중합효소 연쇄 반응, 블롯 하이브리드화(노던 블롯으로도 공지됨) 및 동일계내 하이브리드화를 포함할 수 있다. 상기 및 다른 그러한 검정의 상세한 설명은, 예를 들어, 미국 특허 5,656,493; 5,333,675; 5,234,824; 5,187,083호(각각은 본원에 참조로서 포함됨) 및 문헌[J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd ed., 2001; F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th ed., 2002; and E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.]을 포함하는 표준 참고문헌에 기재되어 있다.
일부 구체예에 따르면, 검출 가능한 마커는, 비제한적으로, 자가면역 조절제(Aire), CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD16+, CD19+, CD25+, CD45+, CD56+, CD80+, CD86+, CD270, Foxp3+, IL-Y, IL-β, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, TGF-β1, 산화질소(NO), PD-L1, BTLA, TNF-α, Th1/Th2, C-펩티드, CCR-7, OCT-4, Nanog, 단계-특이적 배아 항원(SSEA)-3, 및 SSEA-4를 포함한다.
세포 생육성은 개재 DNA 염료 7-아미노액티노마이신 D(7AAD)를 흡수하는 죽어가는 세포를 배제시킴에 의해 결정된다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 7-AAD에 의해 적어도 약 70% 생육성이다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 7-AAD에 의해 적어도 약 75% 생육성이다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 7-AAD에 의해 적어도 약 80% 생육성이다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 7-AAD에 의해 적어도 약 90% 생육성이다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 7-AAD에 의해 적어도 약 95% 생육성이다.
유세포분석에 의해 세포 수를 결정하기 위해, 말초 혈액 샘플로부터 수득된 세포를 PerCP/Cy5.5-컨쥬게이션된 항-CD3, PerCP/Cy5.5-컨쥬게이션된 항-CD4, PE-컨쥬게이션된 항-CD8, FITC-컨쥬게이션된 항-CD45RA, PE-컨쥬게이션된 항-CD45RO, PE-컨쥬게이션된 항-CD56, APC-컨쥬게이션된 항-CCR7을 포함하는 마우스 항-인간 mAb(BioLegend, San Diego, CA)를 갖는 마우스와 인큐베이션한다. 세포를 BD MultiTEST 시약 CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC 및 CD3 FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC(BD Biosciences, San Jose, CA)으로 면역염색한다. 아이소형-일치 마우스 항-인간 IgG 항체(Beckman Coulter)는 모든 플루오레신-컨쥬게이션된 IgG mAb에 대한 음성 대조군으로서 작용한다. 염색 후, 세포를 수집하고 BD FACScalibur™ Cytometer를 사용하여 분석한다. 최종 데이터를 CellQuest Pro Software(Becton Dickinson, MD)를 사용하여 분석한다.
생체외 연구를 위해, 세포를 실온에서 30분 동안 염색한 다음 흐름 분석 전에 PBS로 세척한다. 세포를 APC-AF 750-컨쥬게이션된 항-CD4, APC-AF 750- 또는 Krome Orange-컨쥬게이션된 항-CD8, PE- 또는 FITC-컨쥬게이션된 항-CD45RA, FITC-컨쥬게이션된 항-CD45RO, ECD-컨쥬게이션된 항-CD62L, 및 PE-Cy7-컨쥬게이션된 항-CCR7을 포함하는 마우스 항-인간 모노클로날 Ab(mAb)로 염색한다. 아이소형-일치 마우스 항-인간 IgG 항체(Beckman Coulter)는 모든 플루오레신-컨쥬게이션된 IgG mAb에 대한 음성 대조군으로서 작용한다. 염색 후, 세포를 수집하고 최대 10개의 색을 동시에 판독하기 위해 3개의 레이저(488 nm 청색, 638 적색 및 405 보라색 레이저)가 장착된 Gallios Flow Cytometer(Beckman Coulter)를 사용하여 분석한다. 최종 데이터를 Kaluza Flow Cytometry Analysis Software(Beckman Coulter)를 사용하여 분석한다.
일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물에 존재하는 UC-SC는 비제한적으로 OCT-4, Nanog, 단계-특이적 배아 항원(SSEA)-3, 및 SSEA-4를 포함하는 바이오마커를 사용하여 유세포분석에 의해 검출될 것이다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 2% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 1% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.9% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.8% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.7% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.6% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.5% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.4% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.3% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.2% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.1% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.009% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.008% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.007% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.006% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.005% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.004% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.003% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.002% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.001% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다.
일부 구체예에 따르면, 대상체 내로 혈관내 주입된 치료적 유효량의 교육된 단핵 세포 생성물은 적어도 104, 적어도 105, 적어도 106, 적어도 107, 적어도 108, 적어도 109, 또는 적어도 1010개 단핵 세포를 포함한다.
일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 24시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 25시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 26시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 27시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 28시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 29시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 30시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 31시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 32시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 33시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 34시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 35시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 36시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 37시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 38시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 39시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 40시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 41시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 42시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 43시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 44시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 45시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 46시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 49시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 50시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 51시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 52시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 53시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 54시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 55시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 56시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 57시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 58시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 59시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 60시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 61시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 62시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 63시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 64시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 65시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 66시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 67시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 68시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 69시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 70시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 71시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 72시간이다.
일부 구체예에 따르면, 치료적 유효량의 교육된 단핵 세포 생성물은 대상체의 T 세포 구획에서 자가반응성을 조절하고 면역 질환의 증상을 감소시키는데 효과적이다. 일부 구체예에 따르면, 생물학적 효과, 즉, T 세포 구획에서 자가반응성을 감소시키는 것은 적합한 바이오 마커를 측정함으로써 측정 가능하다. 용어 "바이오마커"(또는 "생체신호")는 생물학적 상태의 지표로 사용되는 펩티드, 단백질, 핵산, 항체, 유전자, 대사산물, 또는 임의의 다른 물질을 지칭한다. 이는 객관적으로 측정되고 정상적인 생물학적 과정, 병원성 과정, 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 반응의 세포 또는 분자 지표로서 평가되는 특성이다. 본원에서 사용되는 용어 "지표"는 시간의 함수로서 상대적인 변화를 나타낼 수 있는 일련의 관찰된 사실로부터 도출된 임의의 물질, 수 또는 비; 또는 가시적이거나 실재 또는 존재의 증거인 신호, 징후, 표시, 언급 또는 증상을 지칭한다. 일단 제안된 바이오마커가 검증되면, 개체에서 질병 위험, 질병의 존재를 진단하거나, 개체에서 질병에 대한 치료법을 결정하는데 사용될 수 있다(약물 치료 또는 투여 요법의 선택). 일부 구체예에 따르면, 기술된 요법을 평가함에 있어, 하나 이상의 바이오마커는 생존 또는 비가역적인 이환율과 같은 자연 종말점에 대한 대용으로서 사용될 수 있다. 치료가 바이오마커를 변경하고, 그 변화가 건강 개선과 직접적인 관련이 있는 경우, 바이오마커는 임상적 이익을 평가하기 위한 대용 종말점의 역할을 할 수 있다. 임상적 종말점은 환자가 어떻게 느끼거나, 기능하거나, 생존하는지를 측정하는데 사용할 수 있는 변수이다. 대용 종말점은 임상적 종말점을 대신하도록 의도된 바이오마커이다; 이러한 바이오마커는 규제 기관 및 임상 협회가 허용할 수 있는 신뢰 수준으로 임상적 종말점을 예측하는 것으로 입증된다.
일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 생성물의 치료량은 발병의 지연, 진행의 지연, 대상체의 T 세포 구획에서 자가반응성 조절, 면역 질환의 증상 감소, 또는 이들의 조합에 효과적이다. 일부 구체예에 따르면, 조절의 결과는 일부 잔류 β 세포 기능을 갖는 대상체의 췌장에서 기능적 β 세포의 성장, 증식, 또는 둘 모두의 증가를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 조절은 전염증성 사이토카인, 예를 들어, IL-4, IL-5, IL-12 및 IL-17의 분비를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 조절은 교육된 단핵 생성물 이식편에서 단핵 세포의 집단을 변경하는 것을 포함한다.
일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 1개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 2개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 3개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 4개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 5개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 6개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 7개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 8개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 9개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 10개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 11개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 12개월 동안 지속된다.
일부 구체예에 따르면, 상기 방법의 단계는 필요에 따라 대상자의 일생에 걸쳐 복수의 주입 일에 순서대로 반복된다.
일부 구체예에 따르면, 상기 방법은 잔류 β-세포 기능을 갖는 개체에서 섬 β-세포 기능을 유지 및 개선시키는데 효과적일 수 있다. 일부 구체예에 따르면, 상기 방법은 T 기억 집단을 변경시키는데 효과적일 수 있다. 일부 구체예에 따르면, 상기 방법은 교육된 단핵 세포 생성물 중의 세포 일부를 내성 제제(tolerizing agent)로 전환시키는데 효과적일 수 있다.
조성물
또 다른 양태에 따르면, 기술된 발명은 치료량의 교육된 단핵 세포 생성물을 포함하는 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하고, 여기서 치료적 유효량의 교육된 단핵 세포 생성물은 대상체의 T 세포 구획에서 자가반응성을 조절하고, 면역 질환의 증상을 감소시키는데 효과적이고, 상기 교육된 단핵 세포 생성물은,
(1) 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병을 앓고 있는 대상체로부터 단핵 세포를 함유하는 전혈 샘플을 무균 조건 하에 획득하고;
(2) (1)의 전혈 샘플을 처리 시설로 수송하고;
(3) 전혈 샘플로부터 단핵 세포(MNC)를 무균 정제하여 단핵 세포 제조물을 형성하고;
(4) 단핵 세포 제조물을 부착성 제대혈 줄기 세포(UC-SC)의 생육가능 집단을 포함하는 생물반응기 장치에 도입하고, 이 때 부착성 UC-SC는 적어도 80% 컨플루언트이며;
(5) 단핵 세포 제조물 중의 단핵 세포 및 CB-SC가 적어도 0.1시간, 적어도 0.2시간, 적어도 0.3시간, 적어도 0.4시간, 적어도 0.5시간, 적어도 0.6시간, 적어도 0.7시간, 적어도 0.8시간, 적어도 0.9시간, 적어도 1.0시간, 적어도 1.5시간, 적어도 2시간, 적어도 2.5시간, 적어도 3시간, 적어도 3.5시간, 적어도 4시간, 적어도 4.5시간, 적어도 5시간, 적어도 5.5시간, 적어도 6시간, 적어도 6.5시간, 적어도 7시간, 적어도 7.5시간, 또는 적어도 8시간 동안 무균 조건 하에 상호작용할 수 있도록 단핵 세포 제조물을 CB-SC와 공동-배양하여 교육된 단핵 세포 생성물을 형성하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산되고;
여기서 치료적 유효량의 교육된 단핵 세포 생성물은 대상체의 T 세포 구획에서 자가반응성을 조절하고 면역 질환의 증상을 감소시키는데 효과적이고,
교육된 단핵 세포 생성물은,
(i) 적어도 1x1010개 단핵 세포; 및
(ii) TEM CD4+, TEM CD8+, TCM CD4+ CD45RA-CCR7+, TCM CD8+ CCR7+, TCM CD45RO+ CCR7+, TEM CD45RO+ CCR7-, TCM CD8+, 나이브 CD4+ CCR7+, 나이브 CD8+ CCR7+, TEM CD4+CCR7+, TEM CD45RO+ CD62L-, TEM CD8+ CCR7+, CD4+HLA-DR+ 및 CD8+HLA-DR+ 세포로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포의 조절된 집단을 포함한다.
일부 구체예에 따르면, 단핵 세포 집단은 면역조절 세포의 집단을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 면역조절 세포의 집단은 백혈구의 집단을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 백혈구의 집단은 림프구의 집단, 과립구의 집단, 호염기구의 집단, 단핵구의 집단, 또는 이의 조합물을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 면역조절 세포의 집단은 항원-포획 세포의 집단, 항원 제시 세포의 집단, 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 항원 제시 세포의 집단은 CD80, CD86, 또는 둘 모두를 발현시킨다. 일부 구체예에 따르면, 항원 제시 세포의 집단은 대식세포, 수지상 세포 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 림프구의 집단은 T 림프구의 집단, B 림프구의 집단, 자연 살해(NK) 세포의 집단, 또는 이의 조합물을 포함한다.
일부 구체예에 따르면, T 림프구의 집단은 T 세포의 하나 이상의 집단을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, T 세포의 집단은 활성화된 T 세포를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 활성화된 T 세포의 집단은 나이브 T 세포, 프라이밍된 T-세포, 활성화된 T 세포, 이펙터 T 세포, 세포독성 T 세포, T 헬퍼 세포, 기억 T 세포, NK 세포, 및 Treg 세포로부터 선택된다. 일부 구체예에 따르면, T 세포의 집단은 하나 이상의 염증성 매개체(림포카인)를 발현시키는 T 세포를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 염증성 매개체는 인터루킨-1-베타(IL-1β), IL-2, 인터루킨-4(IL-4), IL-5, 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(Il-8), IL-10, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 인터페론-감마(IFN-γ), 인터루킨-12(IL-12), 및 림포톡신으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에 따르면, T 림프구의 집단은 T 세포 수용체(TCR)/CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD40 리간드(CD40L), Fox3, fas, MHC I, MHCII, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM), ZAP70(제타 관련 단백질)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현시키는 T 세포를 포함한다.
일부 구체예에 따르면, B 림프구의 집단의 B 세포의 하나 이상의 집단을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, B 세포의 집단은 활성화된 B 세포를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, B 세포의 집단은 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포, 플라즈마플라스트, 및 기억 B 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에 따르면, B 림프구의 집단은 MHC 클래스 II, CD40, 면역글로불린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현시키는 B 세포를 포함한다.
전혈 샘플로부터 단핵 세포를 정제하는 방법은 잘 알려져 있다. 한 구체예에 따르면, 적혈구로부터 백혈구 연층을 분리하기 위해, 적혈구를 밀도 구배 원심분리에 의해, 예를 들어, Ficoll Paque 분획화를 사용하여 제거한다. 용어 "백혈구 연층"은 대부분의 백혈구를 함유하는 혈액 샘플의 얇은 회백색 분획을 지칭한다.
일부 구체예에 따르면, 전혈 샘플로부터 단핵 세포의 정제는 자동화 성분채집술 분리기를 사용하는 성분채집술에 의해 이루어진다. 간단히 말하자면, 전혈을 환자로부터 채취한 다음 방사 챔버를 함유하는 장치를 통해 통과시킨다. 혈액은 챔버의 벽을 따라 중력에 의해 그 성분들(혈장, 혈소판-풍부한 혈장, 백혈구 및 적혈구)로 분리된다. 단핵 세포를 분류하고 나머지 혈액 성분을 환자의 혈류로 다시 재도입한다.
일부 구체예에 따르면, 자성 비드 활성화된 세포 분류는 말초 혈액 단핵 세포로부터 특정 세포 집단을 정제하는데 사용되는 양성적 선택 기술이다. 그러한 프로토콜 후에 요망되는 세포의 양 및 활성이 감소할 수 있기 때문에, 일부는 보다 부드러운 기질 부착 및 음성적 선택 프로토콜을 선호한다.
일부 구체예에 따르면, 생물반응기 장치는 부착성 제대혈 줄기 세포(UC-SC)의 생육가능 집단을 포함하는 하나 이상의 표면을 포함한다. UC-SC를 포함하는 생물반응기를 제조하는 방법은
(a) 건강한 공여자에게서 얻은 새로운 제대혈 유닛을 수득하고;
(b) 제대혈로부터 단핵 세포 분획을 밀도 구배 원심분리에 의해 Ficoll HISTOPAQUE를 사용하여 분리하고;
(c) 적혈구를 제거하고;
(d) UC-단핵 세포를 생리학적 완충된 염수로 세척하고;
(e) 생물반응기의 단핵 세포를 혈청-비함유 배양 배지에 시딩하고; 이 때 시딩 밀도는 적어도 1x106개 세포이며;
(f) 혈청-비함유 배양 배지에서 단핵 세포를 배양하고, 비부착 세포를 제거하기 위해 2-3일마다 적어도 10일 동안 절반/배지를 변화시켜 적어도 80% 컨플루언스로 성장시키고; 그리고
(g) 생물반응기에서 37℃로 인큐베이션하고; 그리고
(h) CB-SC 배양물 샘플의 무균성 및 생육성을 확인하는 것을 포함한다.
CB-SC의 배양물은 원형이며 생물반응기 장치의 바닥 표면에 부착된다. 일부 구체예에 따르면, 생물반응기 장치의 표면은 코팅되지 않은 플라스틱이다. 일부 구체예에 따르면, 생물반응기 장치의 표면은 양으로 하전된 표면이다. 일부 구체예에 따르면, 생물반응기 장치의 표면은 소수성 표면, 예를 들어, 폴리스티렌 또는 유리이다. 일부 구체예에 따르면, 생물반응기 장치의 표면은 코팅된다. 일부 구체예에 따르면, 생물반응기 장치의 표면은 세포 영양층을 포함하지 않는다.
일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 80% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 85% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 90% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 95% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 96% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 97% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 99% 컨플루언스로 성장한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 공동-배양 전 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일 또는 적어도 21일 동안 적어도 99% 컨플루언스로 성장한다.
환자로부터의 단핵 세포 제조물은 환자의 단핵 세포 및 UC-SC 세포를 공동-배양하기 위해 생물반응기로 도입된다. 일부 구체예에 따르면, 단핵 세포 제조물은 UC-CB 층으로부터 분리된다. 일부 구체예에 따르면, 환자의 단핵 세포는 비부착성이다. 일부 구체예에 따르면, 환자의 단핵 세포는 UC-CB 층의 세포와 접촉한다. 일부 구체예에 따르면, 배양 배지는 성장 인자, 가용성 염증 매개체 등을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 배양 배지는 환자의 단핵 세포 및 UC-CB 세포층 둘 모두를 지지하기에 효과적이다. 일부 구체예에 따르면, 배양 배지는 환자의 단핵 세포 및 UC-CB 세포에 의해 생산된 면역조절 매개체 및 가용성 인자를 포함한다.
일부 구체예에 따르면, 상호작용 조건은 생물반응기의 부드러운 흔들기를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 생물반응기의 부드러운 흔들기는 간헐적이다. 일부 구체예에 따르면, 배지는 생물반응기를 통해 순환된다.
환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 2시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 3시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 4시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 5시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 6시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 7시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 8시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 9시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 10시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 11시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 12시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 13시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 14시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 15시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 16시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 17시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 18시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 19시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 20시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 21시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 22시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 23시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다. 환자의 단핵 세포 제조물 및 CB-SC는 무균 조건 하에 적어도 24시간 동안 상호작용 조건 하에 공동-배양된다.
일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:2의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:5의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:10의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:20의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:50의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:60의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:70의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:80의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:90의 비로 공동-배양된다. 일부 구체예에 따르면, 제대혈 단핵 줄기 세포 및 환자 단핵 세포는 적어도 1:100의 비로 공동-배양된다.
이 상호작용의 결과는 교육된 단핵 세포 생성물이다.
교육된 단핵 세포 생성물은 생물반응기 장치로부터 무균 조건 하에 수확된다.
교육된 단핵 세포 생성물의 순도, 무균성, 및 생육성을 확인하기 위한 검정; 생육성 퍼센트는 다음을 포함한다.
일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물의 내독소 수준은 약 0.5 내독소 단위/mL 미만이고, 교육된 단핵 세포 생성물은 그램 염색 음성이다. 교육된 단핵 세포 생성물은 또한 마이코플라스마 및 무균성에 대해, 예를 들어, 미국 FDA Good Laboratory Practice Regulations의 요구 사항에 따라 실시간 PCR에 의해 시험된다.
"검출 가능한 반응"은 검정에서 검출될 수 있는 임의의 신호 또는 반응을 말하며, 이는 검출 시약을 사용하거나 사용하지 않고 수행될 수 있다. 검출 가능한 반응은 방사성 붕괴 및 에너지(예를 들어, 형광, 자외선, 적외선, 가시광선) 방출, 흡수, 편광, 형광, 인광, 전송, 반사 또는 공명 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 검출 가능한 반응은 또한 크로마토그래피 이동도, 혼탁도, 전기영동 이동도, 질량 스펙트럼, 자외선 스펙트럼, 적외선 스펙트럼, 핵 자기 공명 스펙트럼 및 x-선 회절을 포함한다. 대안적으로, 검출 가능한 반응은 융점, 밀도, 전도도, 표면 음향파, 촉매 활성 또는 원소 조성과 같은 생물학적 물질의 하나 이상의 성질을 측정하기 위한 검정의 결과일 수 있다. "검출 시약"은 관심 물질의 존재 또는 부재를 나타내는 검출 가능한 반응을 생성하는 임의의 분자이다. 검출 시약은 항체, 핵산 서열 및 효소와 같은 다양한 분자 중 임의의 것을 포함한다. 검출을 용이하게 하기 위해, 검출 시약은 마커를 포함할 수 있다.
마커는 임의의 다양한 확립된 방법에 의해 검정될 수 있다. 항체-기반 기술은 형광 활성화 세포 분류(FACS) 면역형광, 효소 면역조직화학, 및 면역블롯팅을 비제한적으로 포함한다. 추가 검정은 사이토카인 수준 또는 mRNA의 검출을 위한 검정 또는 특정 마커의 인코딩을 검출하는 "웨스턴 블롯" 기술을 포함할 수 있다. 용어 "웨스턴 블롯"은 복잡한 혼합물에서 단백질을 확인하는 방법을 지칭한다; 단백질은 겔 배지에서 전기영동에 의해 분리되고; 겔로부터 관심 단백질(들)에 결합하고, 위치를 찾아내고, 시각화를 가능하게 하는 특정 항체에 노출된 분리된 단백질을 함유하는 단백질 결합 시트 또는 막으로 옮겨진다. 추가 검정은 중합효소 연쇄 반응, 블롯 하이브리드화(노던 블롯으로도 공지됨) 및 동일계내 하이브리드화를 포함할 수 있다. 상기 및 다른 그러한 검정의 상세한 설명은, 예를 들어, 미국 특허 5,656,493; 5,333,675; 5,234,824; 5,187,083호(각각은 본원에 참조로서 포함됨) 및 문헌[J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd ed., 2001; F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th ed., 2002; and E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.]을 포함하는 표준 참고문헌에 기재되어 있다.
일부 구체예에 따르면, 검출 가능한 마커는, 비제한적으로, 자가면역 조절제(Aire), CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD16+, CD19+, CD25+, CD45+, CD56+, CD80+, CD86+, CD270, Foxp3+, IL-Y, IL-β, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, TGF-β1, 산화질소(NO), PD-L1, BTLA, TNF-α, Th1/Th2, C-펩티드, CCR-7, OCT-4, Nanog, 단계-특이적 배아 항원(SSEA)-3, 및 SSEA-4를 포함한다.
세포 생육성은 개재 DNA 염료 7-아미노액티노마이신 D(7AAD)를 흡수하는 죽어가는 세포를 배제시킴에 의해 결정된다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 7-AAD에 의해 적어도 약 70% 생육성이다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 7-AAD에 의해 적어도 약 75% 생육성이다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 7-AAD에 의해 적어도 약 80% 생육성이다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 7-AAD에 의해 적어도 약 90% 생육성이다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 7-AAD에 의해 적어도 약 95% 생육성이다.
유세포분석에 의해 세포 수를 결정하기 위해, 말초 혈액 샘플로부터 수득된 세포를 PerCP/Cy5.5-컨쥬게이션된 항-CD3, PerCP/Cy5.5-컨쥬게이션된 항-CD4, PE-컨쥬게이션된 항-CD8, FITC-컨쥬게이션된 항-CD45RA, PE-컨쥬게이션된 항-CD45RO, PE-컨쥬게이션된 항-CD56, APC-컨쥬게이션된 항-CCR7을 포함하는 마우스 항-인간 mAb(BioLegend, San Diego, CA)를 갖는 마우스와 인큐베이션한다. 세포를 BD MultiTEST 시약 CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC 및 CD3 FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC(BD Biosciences, San Jose, CA)으로 면역염색한다. 아이소형-일치 마우스 항-인간 IgG 항체(Beckman Coulter)는 모든 플루오레신-컨쥬게이션된 IgG mAb에 대한 음성 대조군으로서 작용한다. 염색 후, 세포를 수집하고 BD FACScalibur™ Cytometer를 사용하여 분석한다. 최종 데이터를 CellQuest Pro Software(Becton Dickinson, MD)를 사용하여 분석한다.
생체외 연구를 위해, 세포를 실온에서 30분 동안 염색한 다음 흐름 분석 전에 PBS로 세척한다. 세포를 APC-AF 750-컨쥬게이션된 항-CD4, APC-AF 750- 또는 Krome Orange-컨쥬게이션된 항-CD8, PE- 또는 FITC-컨쥬게이션된 항-CD45RA, FITC-컨쥬게이션된 항-CD45RO, ECD-컨쥬게이션된 항-CD62L, 및 PE-Cy7-컨쥬게이션된 항-CCR7을 포함하는 마우스 항-인간 모노클로날 Ab(mAb)로 염색한다. 아이소형-일치 마우스 항-인간 IgG 항체(Beckman Coulter)는 모든 플루오레신-컨쥬게이션된 IgG mAb에 대한 음성 대조군으로서 작용한다. 염색 후, 세포를 수집하고 최대 10개의 색을 동시에 판독하기 위해 3개의 레이저(488 nm 청색, 638 적색 및 405 보라색 레이저)가 장착된 Gallios Flow Cytometer(Beckman Coulter)를 사용하여 분석한다. 최종 데이터를 Kaluza Flow Cytometry Analysis Software(Beckman Coulter)를 사용하여 분석한다.
일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물에 존재하는 UC-SC는 비제한적으로 OCT-4, Nanog, 단계-특이적 배아 항원(SSEA)-3, 및 SSEA-4를 포함하는 바이오마커를 사용하여 유세포분석에 의해 검출될 수 있다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 2% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 1% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.9% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.8% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.7% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.6% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.5% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.4% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.3% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.2% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.1% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.009% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.008% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.007% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.006% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.005% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.004% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.003% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.002% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 세포 생성물은 0.001% 미만의 제대혈 단핵 줄기 세포를 함유한다.
일부 구체예에 따르면, 대상체 내로 혈관내 주입된 치료적 유효량의 교육된 단핵 세포 생성물은 적어도 104, 적어도 105, 적어도 106, 적어도 107, 적어도 108, 적어도 109, 또는 적어도 1010개 교육된 단핵 세포를 포함한다.
일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 24시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 25시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 26시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 27시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 28시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 29시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 30시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 31시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 32시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 33시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 34시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 35시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 36시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 37시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 38시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 39시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 40시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 41시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 42시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 43시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 44시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 45시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 46시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 49시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 50시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 51시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 52시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 53시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 54시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 55시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 56시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 57시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 58시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 59시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 60시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 61시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 62시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 63시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 64시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 65시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 66시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 67시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 68시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 69시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 70시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 71시간이다. 일부 구체예에 따르면, 대상체로부터 전혈 샘플을 수득하는 것으로부터 교육된 단핵 세포 생성물을 동일한 대상체로 다시 주입하는 최소 시간은 약 72시간이다.
일부 구체예에 따르면, 교육된 단핵 생성물의 치료량은 발병의 지연, 진행의 지연, 대상체의 T 세포 구획에서 자가반응성 조절, 면역 질환의 증상 감소, 또는 이들의 조합에 효과적이다. 일부 구체예에 따르면, T 세포 구획은 CD4+ TCM(CD45RA-CCR7+), Treg, CD4+HLA-DR+ 또는 CD8+HLA-DR+ T 세포 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 조절의 결과는 대상체의 췌장에서 기능적 β-세포의 성장, 증식, 또는 둘 모두의 증가를 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 조절은 전염증성 사이토카인, 예를 들어, IL-4, IL-5, IL-12 및 IL-17의 분비를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에 따르면, 조절은 교육된 단핵 생성물 이식편에서 단핵 세포의 집단을 변경하는 것을 포함한다.
일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 1개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 2개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 3개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 4개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 5개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 6개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 7개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 8개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 9개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 10개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 11개월 동안 지속된다. 일부 구체예에 따르면, 자가반응성의 조절 기간은 적어도 12개월 동안 지속된다.
일부 구체예에 따르면, 상기 방법의 단계는 필요에 따라 대상자의 일생에 걸쳐 복수의 주입 일에 순서대로 반복된다.
일부 구체예에 따르면, 상기 방법은 잔류 β-세포 기능을 갖는 개체에서 섬 β-세포 기능을 유지 및 개선시키는데 효과적이다. 일부 구체예에 따르면, 상기 방법은 T 기억 집단을 변경시키는데 효과적이다. 일부 구체예에 따르면, 상기 방법은 MNC를 세포를 용인할 수 있는 내성 제제로 전환시키는데 효과적이다.
일부 구체예에 따르면, 기술된 조성물은 용매를 포함하지만 이에 한정되지 않는 부형제, 담체 또는 비히클과 함께 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "부형제", "담체", 또는 "비히클"은 본원에 기재된 조성물의 제형화 및 투여에 적합한 담체 물질을 지칭한다. 본원에서 유용한 담체 및 비히클은 비독성이고 다른 성분과 상호작용하지 않는 당 분야에 공지된 임의의 그러한 물질을 포함한다. 본원에서 사용되는 어구 "약학적으로 허용되는 담체"는 본 발명의 화학주성 조혈 줄기 세포 생성물이 안정하고 생체 이용 가능하게 유지될 본 발명의 조성물의 제형화 및 투여에 사용될 수 있는 임의의 실질적으로 비독성인 담체를 지칭한다.
약학적으로 허용되는 담체는 치료되는 포유동물로의 투여에 적합해지기에 충분히 높은 순도 및 충분히 낮은 독성을 지녀야 한다. 이것은 또한 교육된 단핵 세포 생성물의 안정성 및 생체이용률을 유지해야 한다. 기술된 발명의 조성물에 대한 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로 완충액, 희석제 및 다른 적합한 첨가제를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "완충액"은 이의 화학적 구성이 pH에서의 유의한 변화 없이 산 또는 염기를 중화시키는 용액 또는 액체를 지칭한다. 본 발명에 의해 계획된 완충액의 예는 둘베코 포스페이트 완충된 염수(PBS), 링거 용액, 물 중 5% 덱스트로스(D5W), 정상/생리식염수(0.9% NaCl)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구체예에 따르면, 주입 용액은 대상체 조직에 등장성이다. 일부 구체예에 따르면, 주입 용액은 대상체 조직에 고장성이다. 기술된 발명의 조성물은 멸균 수용액, 알콜과 같은 일반적인 용매 중 비수성 용액, 또는 액체 오일 베이스의 용액과 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 본 발명의 조성물의 담체는 서방성 또는 지연 방출 담체와 같은 방출제를 포함할 수 있다. 그러한 구체예에 따르면, 담체는 보다 효과적인 투여를 제공하고, 예를 들어, 조성물의 적은 빈도 및/또는 감소된 투여량을 발생시키고, 취급의 용이성을 개선시키고, 치료, 예방 또는 촉진되는 질병, 장애, 질환, 증후군 등에 대한 효과를 연장시키거나 지연시키기 위해 활성제를 지속 또는 지연 방출시킬 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 그러한 담체의 비제한적인 예는 리포솜, 마이크로스폰지, 마이크로스피어, 또는 천연 및 합성 중합체의 마이크로 캡슐 등을 포함한다. 리포솜은 다양한 인지질, 예를 들어, 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린으로부터 형성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 무균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액의 형태로 비경구로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구적" 또는 "비경구로"는 비제한적으로 주입 기술을 포함하는 주사(즉, 주사에 의한 투여)에 의한 신체로의 도입을 지칭한다. 화학주성 조혈 줄기 세포 생성물을 포함하는 본 발명의 조성물은 선택된 해부학적 구조로의 유체 조성물(즉, 흐를 수 있는 조성물)의 전달에 적합화된 벌룬 카테터(balloon catheter)에 의해 대상체에게 전달된다.
기술된 발명의 무균 약학적 조성물은 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 무균 용액 또는 현탁액일 수 있다. 용액은 일반적으로 2개 이상의 물질의 균질한 혼합물로 간주된다; 이것은 반드시 그럴 필요는 없지만 종종 액체이다. 용액에서, 용질의 분자(또는 용해된 물질)는 용매 사이에 균일하게 분포되어 있다. 현탁액은 미세하게-분할된 종을 또 다른 종과 조합시킨 분산액(혼합물)이고, 전자는 아주 미세하게 분할되어 빠르게 가라 앉지 않은 채로 혼합되어 있다. 일상 생활에서, 가장 흔한 현탁액은 액체인 물 중의 고체이다. 사용될 수 있는 예시적인 비히클 및 용매는 물, 링거 용액, 및 등장성 소듐 클로라이드(염수) 용액이다. 일부 구체예에 따르면, 고장성 용액이 사용된다. 또한, 용매 또는 현탁 매질로서 무균 고정유가 사용될 수 있다. 비경구 사용을 위해, 예시적인 비히클은 유성 또는 수성액과 같은 용액 뿐만 아니라 현탁액, 에멀젼, 또는 임플란트로 구성된다. 수성 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있고, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함할 수 있다.
기술된 발명의 추가적인 조성물은 본원에 참조로서 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th or 19th editions, published by the Mack Publishing Company of Easton, Pa.]에 기술된 바와 같은 당 분야에 공지된 기술을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 약학적 조성물은 교육된 단핵 세포 생성물에 의해 제공되는 것 이외의 또 다른 약학적 효과를 조성물에 제공하는 것을 목적으로 하는 하나 이상의 상용성 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "상용성"은 상기 조성물의 활성 성분이 통상적인 사용 조건 하에 각 활성 성분 또는 조성물의 효능을 실질적으로 감소시킬 상호작용이 없도록 하는 방식으로 서로 조합될 수 있음을 의미한다. 일부 구체예에 따르면, 조합 요법은 치료량의 교육된 단핵 세포 생성물 및 면역 질환의 증상을 치료하는데 효과적인 치료제를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 면역 질환은 당뇨병이고, 치료제는 인슐린, 인슐린 유사체, 비구아니드, 티아졸리딘디온, 분비촉진제, 설포닐우레아, 비설포닐우레아 분비촉진제, 글리니드, 메트포르민, 알파-글루코시다제 억제제, 메글리티니드, 알파-글루코시다제 억제제, 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 모방체, 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 효능제, 아밀린 유사체, 디펩티딜 펩티다제-4 억제제, 인크레틴 모방체, 위장 억제 펩티드 유사체, 아밀린 유사체, 글리코수릭(glycosuric), 피나스테리드, 두타스테리드, 미녹시딜, 케토코나졸, 스피로노락톤, 플루타미드, 사이클로스포린, 클로베타솔, 항-CD3 항체, 인슐린 수용체의 소분자 활성제, 플루오시노니드 또는 이의 조합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
값의 범위가 제공되는 경우, 각각의 개재된 값은, 문맥에서 달리 명확하게 언급하지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 및 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 개재된 값 사이에 있는 하한 단위의 10분의 1까지 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있는 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 언급된 범위에서 특별히 배제된 임의의 한계를 조건으로 하여, 본 발명 내에 또한 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 양쪽을 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기술되어 있으나, 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 기술된 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기술하기 위해 본원에 참조로서 포함된다.
본원 및 첨부된 청구 범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 용어 "포함한다", "포함하는", "함유한다", "함유하는", "갖는" 및 이들의 활용은 "포함하지만 이에 제한되지 않음"을 의미한다. 본 출원에서 사용되는 용어 및 어구 및 이의 변형은, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 제한과 반대로 개방된 것으로 해석되어야 한다. 전술한 예로서, 용어 "포함하는"은 "비제한적으로 포함하는" 의미 등으로 해석되어야 한다. 용어 "예시"는 논의 중인 항목의 예시적인 경우를 제공하기 위해 사용된 것이며, 이의 배타적이거나 제한적인 목록이 아니다. 예를 들어, "통상적인", "전통적인", "공지된" 및 유사한 의미의 용어와 같은 형용사는 기술된 항목을 주어진 기간으로, 또는 주어진 시간에 이용 가능한 항목으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 대신 이러한 용어는 공지된 현재, 또는 앞으로 언제든지 이용될 수 있는 통상적, 전통적, 정상적, 또는 표준적 기술을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 마찬가지로, 접속사 "및"으로 연결된 항목의 그룹은 해당 항목의 각각 및 하나하나가 그룹화에 존재하도록 요구하는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 명시적으로 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"으로 해석되어야 한다. 유사하게, 접속사 "또는"으로 연결된 항목의 그룹은 해당 그룹간에 상호 배타성을 요구하는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 명시적으로 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"으로 또한 해석되어야 한다. 일부 경우에 확장된 단어 및 어구, 예를 들어, "하나 이상", "적어도", "예를 들어 비제한적으로", 또는 다른 유사한 어구의 존재는 경우에 있어 더 좁은 경우가 의도되거나 요구된다는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 안되며, 그러한 확장 어구는 부재할 수 있다.
추가로, 예를 들어, 시스템 및 방법의 임의의 사건(들) 및/또는 사건의 시간 순서가 본원에 기술되는데, 이러한 기술은 예시적인 것이고 본질적으로 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 공정 단계는 사건 또는 시간 순서로 도시되고 설명될 수 있지만, 이들이 반드시 임의의 특정 사건 또는 순서로 수행되는 것으로 한정되는 것은 아님을 이해하여야 한다.
기술된 발명이 본원에서 일부 구체예를 참조로 하여 기술되고 예시되었지만, 다른 구체예가 유사한 기능을 수행하고/거나 유사한 결과를 달성할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 기술된 구체예의 개시된 다양한 특징 및 양태는 개시된 발명의 다양한 형태를 형성하기 위해 서로 조합되거나 대체될 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 변형, 적응, 수정, 및 등가의 구성과 같은 많은 상이한 구체예가 기술된 발명의 범위 및 사상 내에 있다.
본원에서 논의된 간행물은 기술된 발명의 출원일 이전에 이들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원의 어떤 것도 기술된 발명이 종래 발명으로 인해 상기 공개에 앞설 자격이 없는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 제공되는 간행물의 날짜는 실제 공개 날짜와 다를 수 있으며, 이는 독립적으로 확인될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 기술된 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된 것이고, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 의도이거나 아래의 실험이 수행된 실험의 전부 또는 유일한 실험임을 나타내려는 의도가 아니다. 사용된 숫자와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였지만 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 하다. 달리 언급되지 않는 한, 부는 중량 기준이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 대기압에 가깝다.
폐쇄 루프 생물반응기 장치
폐쇄 루프 생물반응기 장치는 Class 100K 클린 룸에서 제작되었고 제대혈 단핵 세포를 도입하기 전에 감마-조사되었다. 생물반응기 장치에서, 환자의 혈액으로부터 분리된 림프구는 부착성 제대혈 단핵 세포를 갖는 물질의 적층 디스크를 천천히 통과하고, 바닥 판의 구멍을 통해 수집된 림프구는 환자에게 다시 돌려 보내진다. 상기 장치를 생산하는데 사용된 재료는 미국 약전(즉, Grade Class VI Plastic)에 따라 생체내 사용이 승인되었다.
도 1은 성분채집술 장치(14), 줄기 세포 생물반응기 장치(20) 및 유체 복귀 도관(18)과 함께, 환자(2)로부터 혈액을 추출하기 위한 유체 도관(12)을 갖는 자가면역 질환의 치료를 위한 기술된 발명의 일부 구체예에 따른 시스템(10)을 예시한다. 사용시, 혈액은 유체 도관(12)을 통해, 예를 들어, 혈류역학적 펌프로 대상체(2)로부터 추출되고 성분채집술 장치(14)에 의해 처리되어 림프구를 혈액으로부터 분리한다. 혈액은 유체 복귀 도관(18)을 통해 환자(2)로 돌려 보내질 수 있다. 분리된 림프구는 생물반응기 장치(20)로 전달되고, 여기서 림프구 집단의 일부는 생물반응기 장치(20) 내의 제대혈 단핵 세포와의 상호작용에 의해 조절된다.
도 2는 챔버(22), 유체 유입 도관(23), 제대혈 단핵 줄기 세포(26)가 시딩된 복수의 기질 표면층(24)을 포함하는 본 발명에 따른 생물반응기 장치(20)의 개략도를 제공한다. 층 사이의 통로(25)는 림프구(21)가 유입구(23)로부터 유출구(27)로 흐르게 허용한다. 사용시, 성분채집술 장치로부터의 림프구는 림프구(21)의 조절/활성화가 일어나는 챔버(22)로 공급된다. 적절한 기간 후에, 활성화되고 조절된 림프구(21)는 생물반응기 장치(20)로부터 제거되어 환자(2)로 돌려 보내질 수 있다.
실시예 1: 중국인 환자에서 타입 1 당뇨병의 치료를 위한 부착성 UC-SC 세포를 포함하는 폐쇄 루프 생물반응기 장치의 사용
오픈-라벨, 1상/2상 연구에서, 오래된 T2D을 지닌 중국인 환자(N = 36)를 3개의 그룹으로 나누었다(그룹 A, 경구 약물처치, n = 18; 그룹 B, 경구 약물처치 + 인슐린 주입, n = 11; 경구 약물처치 + 인슐린 주입된 손상된 β-세포 기능을 갖는 그룹 C, n = 7). 모든 환자는 전혈에서 단핵 세포를 분리하고, 이들을 부착성 제대혈 줄기 세포(UC-SC)와 간단히 공동-배양하고, 이렇게-교육된 자가 세포를 환자의 순환으로 돌려 보내는 폐쇄 루프 시스템을 통해 환자의 혈액을 순환시키는 장치로 한 번의 치료를 받았다[Zhao et al., "Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial", BMC Med., Vol. 11: 160, (2013)].
임상 결과는 이들 T2D 환자가 상기 치료 후에 개선된 대사 조절 및 염증 마커의 감소된 발현을 달성하였음을 나타낸다. 그룹 A 및 그룹 B에서의 중간 HbA1C은 기준선의 8.61% ± 1.12로부터 12주에 7.25% ± 0.58로(p = 2.62E-06), 그리고 치료 1년 후에 7.33% ± 1.02로(p = 0.0002) 현저하게 감소하였다. 인슐린 내성(HOMA-IR)의 항상성 모델 평가(HOMA)는 인슐린 민감성이 치료 후 개선되었음을 보여 주었다. C-펩티드 수준의 복구에 의해 입증된 바와 같이, 그룹 C 대상체의 섬 β-세포 기능은 현저하게 회복되었다. 기계적 연구는 상기 치료가 단핵구의 면역 조절 및 Th1/Th2/Th3 사이토카인 생산의 균형을 통해 면역 기능장애를 역전시켰음을 나타내었다.
T2D를 갖는 36명의 중국인 환자는 안전성 연구에서 이 장치로 치료를 받았고, 그 결과는 T1D 참가자의 안전성 평가와 유사하다[Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet β-cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med., Vol. 10(3): 1-11, (2012)]. 어떤 참가자도 치료 과정 동안 그리고 치료 후 1년 넘게 임의의 현저한 부작용을 경험하지 않았다. 환자의 불만은 정맥천자시 팔오금중간정맥의 부위에서 가벼운 불편함 및 성분채집술 후 신속하게 해소되는 팔의 약간의 동통으로 제한되었다.
이 장치로의 치료 후 T2D 환자에서 혈당 조절이 개선되었다. 이 요법을 받고 병원에서 퇴원한 후, 환자는 정기적인 약물처치를 계속하였다. 추적-검사 연구에 따르면, 그룹 A(n = 18)와 그룹 B(n = 11)의 중간 당화 혈색소(HbA1C)는 기준선의 8.61% ± 1.12로부터 치료 4주 후에 7.9% ± 1.22(p = 0.0004), 치료 12주 후에 7.25% ± 0.58(p = 0.003)(도 3a) 그리고 그룹 C 환자(n = 7)에서 치료 1년 후에 7.33% ± 1.02(p = 0.036)로 현저하게 낮아졌다. 성인 당뇨병의 치료를 위한 미국 당뇨병 협회(ADA)에서 권장하는 A1C 목표(<7%)에 따르면, 그룹 A의 대상체의 28%(5/18), 그룹 B의 대상체의 36%(4/11), 및 그룹 C의 대상체의 29%(2/7)가 치료 12주 후에 이 목표를 달성하였다. 총 대상체의 31% 초과는 <7% 표준을 달성하고 1년 넘게 유지하였다. 추가로, 효능 기준에 기반하여, 그룹 A의 대상체 18명 중 11명(61.1%), 그룹 B의 대상체 11명 중 8명(72.7%), 및 그룹 C의 대상체 7명 중 4명(57.1%)은 치료 4주 후에 A1C 값이 감소하였다(> 0.5%). 그룹 A의 대상체 18명 중 13명(72.2%), 그룹 B의 대상체 11명 중 9명(81.8%), 및 그룹 C의 대상체 7명 중 6명(85.7%)은 A1C 값의 감소를 보였다(> 0.5%). 총 대상체 36명 중 28명(78%)의 A1C 값은 치료 12주 후에 1.28 ± 0.66만큼 감소하였다.
인슐린 민감성의 변화를 조사하기 위해, 그룹 A 및 B에서 공복 혈장 글루코스 및 C-펩티드(인슐린 주사를 맞은 대상체로 인해 인슐린 대신)의 인슐린 내성(HOMA-IR) 생성물의 항상성 모델 평가(HOMA)를 측정하였다. 상기 데이터는 HOMA-IR c-pep의 수준이 4주의 추적-검사에서 현저하게 감소되었음을 나타내었고(도 3b), 이는 치료 후 인슐린 민감성이 개선되었음을 보여준다. 개선된 β-세포 기능과 일관되게, 메트포르민의 중간 일일 용량은 33%-67% 감소하였고, 인슐린은 치료 12주 후에 35% 감소하였다.
공복 C-펩티드의 수준은 손상된 섬 β-세포 기능을 갖는 오래된 T2D 대상체에서 현저하게 증가하였다(그룹 C, 당뇨병 지속기간 14 ± 6년, n = 7, P = 0.0073)(도 3c). 치료 12주 후에, 공복 C-펩티드 수준은 정상 생리학적 수준에 도달하였고, 이 측정 동안 최종 추적-검사를 통해 유지되었다(56주)(기준선의 0.36 ± 0.19 ng/mL 대 치료 1년 후에 1.12 ± 0.33 ng/mL, p = 0.00045, 도 3c). HOMA-B C-펩티드를 이용한 β-세포 기능 분석은 섬 β-세포의 기능이 그룹 C 대상체에서 치료를 받은 후에 현저하게 향상되었음을 입증한다(도 3d). 상기 데이터는 C-펩티드의 복구가 타입 1 당뇨병에서의 이전의 연구에서 입증된 바와 같이 섬 β-세포의 재생과 관련될 수 있음을 보여준다[Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet β-cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med., Vol. 10(3): 1-11, (2012)].
면역 기능장애를 바로잡는 효능 결과
대사 조절 개선의 기초가 되는 분자 및 세포 메커니즘을 결정하기 위해, T2D에서 줄기 세포 생물반응기 장치 요법의 항-염증 및 면역 조절의 효과를 조사하였다. ELISA는 주로 인슐린 내성 및 T2D에 관여하는 혈장 중 전-염증성 사이토카인 IL-1, IL-6, 및 TNF-α를 조사하는데 사용되었다. 이들 오래된 T2D 대상체에서 IL-1, IL-6, 및 TNF-α는 모두 배경 수준이었고, 치료 후 변화를 보이지 않았는데(각각 p = 0.557, p = 0.316, p = 0.603), 이는 아마도 대사성 염증이 만성 서브-등급 염증이기 때문이다[Shoelson S.E. et al., "Inflammation and insulin resistance", J Clin Invest, Vol. 116: 1793-1801, (2006)] and the serum samples which were directly collected from the blood of T2D patients, not from the lipopolysaccharide (LPS)-activated monocytes of T2D subjects [Devaraj S. et al., "Low-density lipoprotein postsecretory modification, monocyte function, and circulating adhesion molecules in type 2 diabetic patients with and without macrovascular complications: the effect of alpha-tocopherol supplementation", Circulation, Vol. 102: 191-196, (2000)]. 항-염증 및 면역 억제 사이토카인 TGF-β1은 기준선 수준에 비해 치료 4주 후에 T2D 대상체의 혈장에서 현저하게 증가하였다(도 4a). 그러나, IL-10은 모든 참가자에서 변화가 없었다(p = 0.497). 이러한 결과는 TGF-β1의 상향-조절이 이 치료에 의한 인슐린 내성의 역전에 기여할 수 있는 가능성 있는 메커니즘임을 보여준다.
다음으로, 보다 민감한 세포내 유세포분석을 사용하여, T2D 대상체의 말초 혈액에서 인터루킨-17(IL-17, IL-17A로도 알려짐) 및 Th1/Th2 면역 반응-관련 사이토카인을 조사하였다. IL-17A는 자가면역 질환에 관여하는 널리 공지된 전염증성 사이토카인이다. IL-17, IL-12, 및 Th2-관련 사이토카인 IL-4 및 IL-5의 생산은 모두 이 치료 후에 현저하게 감소하였다(도 4b).
Th1/Th2 면역 반응에 대한 조절의 기초가 되는 세포 메커니즘을 탐색하기 위해, 본 발명자들은 T2D의 만성 염증 및 비만-관련 인슐린 내성의 발병시 중요한 역할을 하는 전문 항원-제시 세포인 단핵구/대식세포에서 발현되는 공-자극 분자 CD80/CD86의 변화에 초점을 두었다. 결과는 CD86+CD14+ 단핵구의 백분율이 치료 4주 후에 현저하게 감소하였음을 보여주었다(도 4c, P = 0.0212). CD80+CD14+ 단핵구의 수준에는 유의한 변화가 없었다(P = 0.13). CD86+CD14+ 단핵구/CD80+CD14+ 단핵구의 비율은 3.86 ± 2.56에서 1.22 ± 0.48로 감소되었다(P = 0.01). 림프구에서 발현되는 CD28/CTLA-4인 CD80/CD86의 리간드의 추가 흐름 분석은 CTLA-4의 발현이 줄기 세포 생물반응기 장치 요법을 받은지 4주 후에 현저하게 증가하였음을 나타내었다(치료 전 0.51% ± 0.5 대 치료 후 1.98% ± 0.51, P = 9.02E-05). 그러나, 흐름 분석은 공-자극 분자 CD28의 발현에서 차이를 보이지 않았다(치료 전 69.98% ± 14.17 대 치료 후 61.5% ± 10.89, P = 0.225). 추가로, 줄기 세포 교육자 요법을 받은 후 CD4+CD25+Foxp3+ Treg 집단에서의 변화를 조사하였다. 흐름 분석은 기준선 및 치료 4주 또는 12주 후 사이에 어떤 차이도 확인하지 못했다(도 4d, P = 0.689). 따라서, 이러한 데이터는 이 치료가 Treg라기보다 항원-제시 세포 단핵구의 작용을 통해 Th1/Th2 면역 반응을 조절한다는 것을 보여준다.
단핵구에 대한 CB-SC의 면역 조절의 시험관내 기계적 연구
단핵구에 대한 CB-SC의 면역 조절 효과를 더 잘 이해하기 위해, 인간 말초 혈액으로부터 정제된 CD14+ 단핵구를 사용하여 시험관내 공동-배양 실험을 수행하였다. 정제된 CD14+ 단핵구를 상이한 비율의 CB-SC와 공동-배양하였다. CD14+ 단핵구를 CB-SC에 첨가한 후 강한 반응이 나타났다(도 5a, 좌측 하단 패널). 흐름 분석은 18시간 동안 CB-SC와의 공동-배양이 1:5 비의 CB-SC:단핵구에서 단핵구의 현저한 아폽토시스를 발생시켰음을 보여주었다(도 5b). 따라서, CB-SC의 세포 생육성 및 부착성 둘 모두는 또한 아폽토틱 단핵구의 존재에 의해 영향을 받았다(도 5a, 좌측 하단 패널). 구조적으로, CB-SC의 세포 과정은 길이가 감소되었지만, 대부분은 여전히 바닥에 붙어 있었다(도 5a, 좌측 하단 패널). 이러한 손상된 CB-SC는 2-3일 동안 공동-배양 후 복원되었다; 이들은 계속적으로 증식하여 7-10일 후에 90-100% 컨플루언트가 되었다(도 5a, 우측 하단 패널). 기계적 연구로부터 CB-SC가 단핵구의 세포독성 효과에 대해 CB-SC를 보호하여, 이들을 생존하고 증식하게 하는 아폽토시스 단백질의 세포 억제제(cIAP) 1을 나타내었음이 밝혀졌다(도 5c). 본 발명자들은 CB-SC가 종양 괴사 인자 수용체 II(TNF R II)를 발현하지만 TNF RI는 발현하지 않음을 발견하였다(도 5d). 재조합 TNF는 CB-SC에 상이한 용량으로 세포독성을 나타내었다(도 5e). CB-SC는 TNF RII mAb(20 μg/mL)와 1:10의 비로 전처리되었고 이는 단핵구의 독성 작용을 현저하게 차단하였고 양호한 세포 생육성 및 형태학으로 CB-SC의 50%를 보호한다.
단핵구에 대한 CB-SC에 의한 면역 조절 효과를 더 연구하기 위해, 리포폴리사카라이드(LPS)-자극된 정제된 CD14+ 단핵구를 CB-SC와 함께 공동-배양하였다. 실시간 PCR 어레이는 CB-SC와의 공동-배양이 신호전달 경로 분자 NF-κB와 함께, 케모카인, 다중 사이토카인, 및 기질 금속펩티다제를 포함하는 LPS-자극된, 염증-관련 유전자의 수를 현저하게 하향-조절할 수 있었음을 보여주었다(도 5f). 이러한 데이터는 단핵구와 CB-SC의 시험관내 공동-배양이 단핵구에서 염증-관련 유전자 발현의 실질적인 하향-조절을 일으킨다는 것을 입증한다.
이전의 연구는 CB-SC가 산화 질소(NO) 생산을 통해 림프구의 면역 조절제로서 기능한다는 것을 나타내었다[Zhao Y. et al., "Immune regulation of T lymphocyte by a newly characterized human umbilical cord blood stem cell", Immunol Lett, Vol. 108: 78-87, (2007)]. NO가 단핵구에 대한 CB-SC의 면역 조절에 관여하는지를 결정하기 위해, 특정 유도성 산화 질소 신타제(iNOS) 억제제 1400W를 공동-배양 시스템에 적용하였다. 상기 데이터는 LPS-자극된 단핵구에 대한 CB-SC의 억제 효과가 iNOS 억제제 1400W의 존재 하에 현저하게 역전될 수 있었음을 입증하였다(도 5f). CB-SC에서 NO 생산을 차단하면 단핵구에서 케모카인 CCL20및 사이토카인(예를 들어, IL-1α, IL-6, IL-8, IL-23, 및 TNF-α)의 발현을 현저하게 증가시킬 수 있었다. 이러한 결과는 CB-SC-유래된 NO가 단핵구에 대한 CB-SC의 면역 조절 및 항-염증 효과에 필수적인 역할을 한다는 것을 보여준다.
실시예 2: 백인 환자에서 타입 1 당뇨병의 치료를 위한 부착성 UC-SC 세포를 포함하는 폐쇄 루프 생물반응기 장치의 사용
백인 환자에서 타입 1 당뇨병의 치료를 위한 부착성 UC-SC 세포를 포함하는 폐쇄 루프 생물반응기 장치의 면역 조절 효과를 평가하기 위해, 확립된 T1D를 갖는 15명의 대상체에서 1/2상 임상 시험을 수행하였다.
Endocrinology and Nutrition Service, Hospital Universitario Central de Asturias(Oviedo, Spain)에서 치료를 받는 T1D 환자는 2012년 11월 27일부터 2014년 10월 1일까지 수행된 1상/2상, 오픈-라벨 임상 시험에 등록되었다. 주조사자는 임상 시험을 설계하고 Regional Committee for Clinical Research Ethics와 Comision Permanente de Trasplantes del Consejo Interterritorial del Sistema Nacional de Salud로부터 임상 치료 프로토콜에 대한 윤리적 승인 및 동의서를 받았다. 서명된 사전 동의서를 각 참가자로부터 받았다. 임상 시험은 확립된 T1D를 갖는 15명의 대상체에서 수행되었다(표 1A; 잔류 섬 β-기능을 갖는 그룹 A T1D 환자 및 표 1B; 잔류 섬 β-기능이 없는 그룹 B T1D 환자). 대상체는 아래 1/2상 임상 시험의 다이어그램 흐름도 1에 도시된 대로, 이들이 미국 당뇨병 학회(ADA)의 2012 진단 표준을 충족하고 혈액 검사에서 췌장 섬 β-세포에 대한 적어도 하나의 자가항체의 존재를 나타낸 경우, 모집을 위한 자격을 얻었다. 주요 제외 기준은 임상적으로 유의한 간(AST 또는 ALT 정상 상한의 2 ≥ x), 신장(크레아티닌 ≥ 2.0 mg/dl), 또는 심장병; 임신 또는 모유수유중인 여성; 면역억제성 약물처치; 바이러스 질환으로 알려진 활성 감염; 또는 면역결핍과 관련된 질병; 또는 혈색소 <10 g/dL 또는 혈소판 < 100 k/mL; 1개월 이내에 면역억제성 약물처치의 사용을 포함하였다.
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치료 및 추적-검사
이 연구의 모든 참가자는 부착성 UC-SC 세포(Tianhe Stem Cell Biotechnology®, USA)를 포함하는 폐쇄 루프 생물반응기로 2회 치료를 받았다. CB-SC 배양물 및 폐쇄 루프 장치의 제조는 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다[Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med, Vol. 10:3, (2012)]. 간단히 말해, 건강한 동종이계 공여자로부터 유래된 인간 제대혈 유닛을 Centro Comunitario de Sangre y Tejidos de Asturias(CCST, Oviedo, Spain)로부터 얻었다. 모든 제대혈 샘플을 HIV I&II, HBsAg, HBcAg, HCV, HIVNAT, STS, HBVNAT, HCVNAT, HTLV I/II, 웨스트 나일(West Nile), Chagas, 및 CMV에 대해 스크리닝하였고, 병원체-비함유 제대혈 유닛만을 임상 치료에 사용하였다. 인간 CB-SC를 새로운 제대혈 유닛(적어도 100 mL/유닛)으로부터 분리하였다. 이것은 50 mL 튜브를 사용하여 수행되었고 홀더에 보관되었다. 3 mL의 HISTOPAQUE(R)-1077을 각 튜브에 첨가하고(20 mL 원뿔형 원심분리 튜브) 실온이 되게 하여 CB-SC를 분리하였다. 3 mL의 전혈을 조심스럽게 HISTOPAQUE(R)-1077 위에 적층시켰다. 원심분리는 실온에서 30분 동안 400 x g에서 수행되었다. 원심분리 후, 상부층을 CB-SC를 함유하는 불투명한 계면의 0.5 cm 이내로 흡인하였다. 불투명한 계면을 깨끗한 새로운 20 mL 원뿔형 튜브로 옮겼다. 세포를 10 mL 등장성 포스페이트 완충된 염수 용액으로 세척하였다. 혼합하고 250 x g에서 수 분 동안 원심분리함에 의해 수행된 세척 후에, 상청액을 버리고 두 번 더 세척한 후, CB-SC를 0.5 mL 등장성 포스페이트 완충된 염수 용액에 재현탁시켰다. 인간 CB-SC를 생산하고 제대혈 단핵 세포를 RPMI 1640 배지 중 적어도 1×106개 세포/mL, 25 mL/디쉬의 밀도로 150×15 mm 페트리 디쉬(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, not tissue culture-treated dishes)에 플레이팅하고, 37℃에서 8% CO2에서 인큐베이션하였다. 제대혈 단핵 세포를 혈청-비함유 배양 배지의 생물반응기 장치에서 플레이팅하고(Lonza, Walkersville, MD) 37℃, 8% CO2에서 약 2-3주 동안 인큐베이션하였다. CB-SC 세포가 원형이 되었는지 관찰하고, 페트리 디쉬의 바닥 상에 부착에 대해 추가로 확인하였다. 2-3주 후, CB-SC를 성분채집술을 통해 분리된 MNC와 함께 공동-배양하였다(식별번호 [0393]의 아래 참조). 임상 시험을 위해 80% 컨플루언스(약 1x107개 세포/장치)으로 성장한 CB-SC를 준비하였다. 한 제대혈 유닛으로부터 하나의 생물반응기 장치가 생성되었고, 한 명의 대상체에 대한 1회 치료에 사용되었다.
생물반응기 장치 요법을 위해, 16-게이지 IV 바늘을 좌측 또는 우측 팔오금중간정맥에 놓고, 환자의 혈액을 Blood Cell Separator MCS+(Haemonetics®, Braintree, MA)를 통해 통과시켜 단핵 세포를 분리하였다. 성분채집술에 의한 MNC 수집의 단일 세션에 대해, 약 10 L의 혈액이, 약 1 × 1010개 MNC의 수집과 함께, 6-7간 내에 각 등록된 대상체로부터 처리되었다. 분리된 단핵 세포를 동종이계 CB-SC로 연속 치료하기 위해 생물반응기 장치로 옮기고, 다른 혈액 성분을 환자의 순환으로 자동으로 돌려 보냈다. 생물반응기 장치에서, 환자의 말초 혈액으로부터 분리된 MNC를 부착성 CB-SC를 갖는 적층된 디스크를 통해 1:20의 CB-SC:MNC 비로, 1:30의 비로, 1:40의 비로 또는 1:50의 비로 천천히 통과시켰다. 2-3시간 동안 접촉 후, CB-SC-처리된 단핵 세포를 생리식염수와 함께 손의 등쪽 정맥을 통해 환자의 혈액 순환으로 돌려 보냈다. 이것은 8-9시간이 걸렸다. 환자를 하루 동안 입원시켜 체온을 모니터링하고 치료 후 부작용에 대한 혈구 계수 검사를 수행하였다. 3개월 후, 모든 대상체는 상기 기술된 대로, 생물반응기 장치 요법으로 2차 치료를 받았다. 추적-검사 방문은 임상 평가 및 실험실 검사를 위해 치료 2, 8, 12, 18, 26, 40 및 56주 후에 예정되었다(도 6).
β-세포 기능을 평가하기 위해, 공복 및 글루카곤-자극된 C-펩티드 수준을 기준선 및 부착성 UC-SC 세포를 포함하는 폐쇄 루프 생물반응기 장치로의 치료 후에 조사하였다. 글루카곤-자극된 C-펩티드 시험을 수행하였다. 5-10 mL 정맥혈의 샘플을 기준선 C-펩티드 측정을 위해 공복 상태의 각 대상체로부터 채취하였다. 글루카곤 시험은 1 mg 글루카곤을 정맥내 주입하고, 6분 후에 별도의 정맥 부위로부터 5-10ml의 두 번째 채혈에 의해 수행되었다. 글루카곤 시험을 위한 대상체의 선택은 단순하게 시험을 완료하기로 한 이들의 동의에 기반하였다.
혈액 샘플의 원심분리 후, 혈청을 분리한 다음 -20℃에서 동결시켰다.
주요 연구 종말점은 치료 후 56주 동안 폐쇄 루프 치료의 실행 가능성 및 안전성 그리고 T1D 대상체에서 면역 마커를 변화시키는 요법의 효능에 대한 예비 평가였다. 이차 연구 종말점은 β-세포 기능의 개선에 있어 요법의 효능에 대한 예비 증거였다. 기준선 혈액 샘플을 폐쇄 루프 치료 전에 수집하였다.
혼합된 림프구 반응(MLR) 및 생체외 공동-배양
인간 백혈구 연층 혈액 유닛을 Blood Center of New Jersey(East Orange, NJ)로부터 구입하였다. CB-SC는 이전에 기술된 바와 같이 수확되었다[Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet β-cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med., Vol. 10(3), 1-11, (2012)]; [Zhao Y. et al., "Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial",BMC Med., Vol. 11: 160, (2013)]. 이것은 50 mL 튜브를 사용하여 수행되었고 홀더에 보관되었다. 3 mL의 HISTOPAQUE(R)-1077을 각 튜브에 첨가하고(20 mL 원뿔형 원심분리 튜브) 실온이 되게 하여 CB-SC를 분리하였다. 3 mL의 전혈을 조심스럽게 HISTOPAQUE(R)-1077 위에 적층시켰다. 원심분리는 실온에서 30분 동안 400 x g에서 수행되었다. 원심분리 후, 상부층을 CB-SC를 함유하는 불투명한 계면의 0.5 cm 이내로 흡인하였다. 불투명한 계면을 깨끗한 새로운 20 mL 원뿔형 튜브로 옮겼다. 세포를 10 mL 등장성 포스페이트 완충된 염수 용액으로 세척하였다. 혼합하고 250 x g에서 수 분 동안 원심분리함에 의해 수행된 세척 후에, 상청액을 버리고 두 번 더 세척한 후, CB-SC를 0.5 mL 등장성 포스페이트 완충된 염수 용액에 재현탁시켰다. 혼합 백혈구 반응(MLR)을 통해 T 세포에 대한 CB-SC의 면역 조절 효과를 조사하기 위해, 반응자 세포를 CB-SC의 존재 또는 부재 하에, 3000 rad에서 1:2의 R:S 비로 조사된 동종이계 자극제 세포와 함께 공동-배양하였다. CB-SC:반응자의 비는 1:10이었다. 4-5일의 공동-배양 후, 세포를 Olympus IX71 도립 현미경으로 사진촬영하고 흐름 분석을 위해 수집하였다.
CD45RO+CD62L- TEM 세포에 대한 CCR7 발현을 분석하기 위해, 성체 말초 혈액-단핵 세포(PBMC)를 혈청-비함유 배양 배지(Lonza, Walkersville, MD)에서 1:10의 CB-SC:PBMC로 CB-SC와 공동-배양하고 37℃에서 8% CO2에서 인큐베이션하였다. 처리되지 않은 PBMC는 대조군으로 사용되었다. CB-SC-처리된 PBMC를 유세포분석을 위해 24시간 및 48시간에 각각 수집하였다.
생체외 연구를 수행하기 위해, 인간 제대혈 유닛은 Cord:Use Cord Blood Bank(Orlando, FL)로부터 제공되었다. 병원체-비함유 제대혈 유닛만을 CB-SC를 분리하는데 사용하였다. 인간 CB-SC를 새로운 제대혈 유닛(적어도 100 mL/유닛)으로부터 분리하였다. 이것은 50 mL 튜브를 사용하여 수행되었고 홀더에 보관되었다. 3 mL의 HISTOPAQUE(R)-1077을 각 튜브에 첨가하고(20 mL 원뿔형 원심분리 튜브) 실온이 되게 하여 CB-SC를 분리하였다. 3 mL의 전혈을 조심스럽게 HISTOPAQUE(R)-1077 위에 적층시켰다. 원심분리는 실온에서 30분 동안 400 x g에서 수행되었다. 원심분리 후, 상부층을 CB-SC를 함유하는 불투명한 계면의 0.5 cm 이내로 흡인하였다. 불투명한 계면을 깨끗한 새로운 20 mL 원뿔형 튜브로 옮겼다. 세포를 10 mL 등장성 포스페이트 완충된 염수 용액으로 세척하였다. 혼합하고 250 x g에서 수 분 동안 원심분리함에 의해 수행된 세척 후에, 상청액을 버리고 두 번 더 세척한 후, CB-SC를 0.5 mL 등장성 포스페이트 완충된 염수 용액에 재현탁시켰다. 인간 CB-SC를 생산하고 제대혈 단핵 세포를 RPMI 1640 배지 중 적어도 1×106개 세포/mL, 25 mL/디쉬의 밀도로 150×15 mm 페트리 디쉬(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, not tissue culture-treated dishes)에 플레이팅하고, 37℃에서 8% CO2에서 인큐베이션하였다. 제대혈 단핵 세포를 혈청-비함유 배양 배지의 생물반응기 장치에서 플레이팅하고(Lonza, Walkersville, MD) 37℃, 8% CO2에서 약 2-3주 동안 인큐베이션하였다. CB-SC가 원형이 되었는지 관찰하고 페트리 디쉬의 바닥 상에 부착에 대해 추가로 확인하였다. 동종이계 림프구와의 공동-배양을 위해 80% 컨플루언스(약 1x107개 세포/장치)로 성장한 CB-SC를 준비하였다.
임상 시험을 준비하기 위해, 치료 전 및 치료 후 각각 2, 8, 18, 26 및 56주에 환자로부터 말초 혈액 샘플(대상체 당 10 mL)을 얻었다. 세포를 PerCP/Cy5.5-컨쥬게이션된 항-CD3, PerCP/Cy5.5-컨쥬게이션된 항-CD4, PE-컨쥬게이션된 항-CD8, FITC-컨쥬게이션된 항-CD45RA, PE-컨쥬게이션된 항-CD45RO, PE-컨쥬게이션된 항-CD56, APC-컨쥬게이션된 항-CCR7을 포함하는 마우스 항-인간 mAb(BioLegend, San Diego, CA)와 인큐베이션하였다. 말초 혈액의 상이한 서브세트의 백분율 및 절대 세포 수를 시험하기 위해, 세포를 BD MultiTEST 시약 CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC 및 CD3 FITC/CD16 + CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC(BD Biosciences, San Jose, CA)로 면역염색하였다. 아이소형-일치 마우스 항-인간 IgG 항체(Beckman Coulter)는 모든 플루오레신-컨쥬게이션된 IgG mAb에 대한 음성 대조군으로서 작용하였다. 염색 후, 세포를 수집하고 BD FACScalibur™ Cytometer를 사용하여 분석하였다. 최종 데이터를 CellQuest Pro Software(Becton Dickinson, MD)를 사용하여 분석하였다.
생체외 연구, 유세포분석을 위해, 세포를 실온에서 30분 동안 염색한 다음 흐름 분석 전에 PBS로 세척하였다. 본 발명자들은 APC-AF 750-컨쥬게이션된 항-CD4, APC-AF 750- 또는 Krome Orange-컨쥬게이션된 항-CD8, PE- 또는 FITC-컨쥬게이션된 항-CD45RA, FITC-컨쥬게이션된 항-CD45RO, ECD-컨쥬게이션된 항-CD62L, 및 PE-Cy7-컨쥬게이션된 항-CCR7을 포함하는 여러 마우스 항-인간 모노클로날 Ab(mAb)를 사용하였다. 아이소형-일치 마우스 항-인간 IgG 항체(Beckman Coulter)는 모든 플루오레신-컨쥬게이션된 IgG mAb에 대한 음성 대조군으로서 작용하였다. 염색 후, 세포를 수집하고 최대 10개의 색을 동시에 판독하기 위해 3개의 레이저(488 nm 청색, 638 적색 및 405 보라색 레이저)가 장착된 Gallios Flow Cytometer(Beckman Coulter)를 사용하여 분석하였다. 최종 데이터를 Kaluza Flow Cytometry Analysis Software(Beckman Coulter)를 사용하여 분석하였다.
치료 의향(intention-to treat) 접근법을 사용하였고, 15명의 환자가 부착성 UC-SC 세포를 포함하는 폐쇄 루프 생물반응기 장치로 치료받았다. 모든 참가자는 안전성 분석에 포함되었다. 치료의 실행 가능성은 요법을 완료할 수 없는 환자의 수와 12개월 방문 이전에 추적-검사에 실패한 환자의 수를 분석하여 평가하였다. 일차 효능 종말점은 기준선과 추적-검사 사이의 면역 마커의 변화였다. 데이터의 통계적 분석을 투-테일드 페어드 스튜던트 t-테스트에 의해 수행하여 기준선과 추적-검사 사이의 통계적 유의성을 결정하였다. 값은 평균 ± SD(표준 편차)로 제공되었다.
결과
백인 T1D 대상체에서 생물반응기 장치 요법으로의 2회 치료의 안전성 프로파일 및 실행 가능성
이전의 임상 시험에서, 모든 대상체는 1회 치료를 받았다[Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet β-cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med., Vol. 10(3), 1-11, (2012)]; [Zhao Y. et al., "Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial", BMC Med,, Vol. 11: 160, (2013)]. 상당수의 병원성 자가면역 세포가 절차 중에 혈류로 들어가지 못하고 림프절 및 다른 조직에 남아 있을 수 있어, CB-SC에 대한 노출을 피할 수 있기 때문에, 이들 T1D 대상체에서(n = 15) 초기 세션 3개월 후에 이차 치료를 첨가하였다. 어떤 참가자도 생물반응기 장치 요법 또는 56주의 추적-검사 동안 2회 치료 과정 중에 임의의 현저한 부작용을 경험하지 않았다. 절차 중, 정맥천자의 부위(팔오금중간정맥)에서 단지 가벼운 불편함 및 팔의 약간의 동통이 일부 참자가에게 나타났다. 추적-검사 연구 동안 발열 또는 거부 반응은 관찰되지 않았다.
백인 대상체의 기억 T 세포 구획의 조절에서 폐쇄 루프 치료의 임상 효능
폐쇄 루프 치료의 면역 조절 효과를 평가하기 위해, 유세포분석을 사용하여 폐쇄 루프 치료 후 15명의 참가자에서 면역 마커를 조사하였다. 임상 데이터에 따르면 1년의 추적-검사 동안 백혈구 공통 항원 CD45+ 유핵 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD56+ NK 세포, 및 CD20+ B 세포를 포함하는 각 세포 집단의 총 세포 수에는 변화가 없었다(도 7a). 말초 혈액에서 총 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 백분율의 정량은 1년 동안 매우 안정하게 유지되었다(도 7b).
상이한 T-세포 하위집단에 대한 폐쇄 루프 치료의 조절 효과를 CD45RA 및 CCR7과 같은 나이브 및 기억 T 세포의 특성화를 위한 공통 표면 마커를 사용하여 조사하였다. 나이브 CD4+ T(CD45RA+ CCR7+) 세포의 백분율은 폐쇄 루프 치료 26주 후에 현저하게 증가하였고(P = 0.0042), 최종 추적-검사 내내 유지되었다(치료 56주 후, P = 0.0021)(도 7c). 나이브 CD8+ T 세포의 백분율은 임의의 추적-검사에서 유의한 변화를 나타내지 않았다(도 7c). 이러한 결과는 SCE 요법이 정상적인 면역 능력의 필수적인 부분인 나이브 CD4+ T 세포의 재생을 회복시켰음을 시사하였다.
기억 T 세포에 대한 폐쇄 루프 치료의 효과를 연구하기 위해, 중추 기억 T 세포 및 이펙터 기억 T 세포(각각 TCM 및 TEM)를 유세포분석에 의해 조사하였다. 이들 대상체에서의 전반적인 분석은 CD4+ TCM(CD45RA-CCR7+) 세포의 백분율이 생물반응기 장치 요법을 받은 후 18주에 현저하고 지속적으로 증가하였음을 입증하였다(P = 0.018)(도 7d). 대조적으로, CD8+ T 세포의 백분율은 18주에 단지 일시적으로 개선되었지만(P = 0.034), 계속된 추적-검사 동안 기준선 수준으로 되돌아갔다(도 7d). 그룹 B 대상체와 비교하여(4/9, 44%), 그룹 A 대상체(4/6, 67%)에서 CD4+ TCM 세포의 백분율은 18주 추적-검사에서 30% 이상의 양성 세포로 더욱 효율적으로 증가하였다(데이터는 도시되지 않음). TEM(CD45RA+ CCR7-) 세포의 전반적인 분석은 CD4+ 세포 및 CD8+ T 세포 둘 모두가 18주(P = 0.03) 및 26주(P = 0.0024)에 각각 상당히 감소하였음을 보여주었다(도 7e). 그룹 A 대상체(6/6, 100%)에서 CD8+ T 세포의 백분율은 26주 추적-검사에서 그룹 B 대상체(7/9, 78%)와 비교하여 15% 이상의 양성 세포로 더욱 효율적으로 감소하였다; 26주 추적-검사에서 CD4+ T 세포의 감소에 대해 그룹 A 대상체의 5/6(83%) 대 그룹 B 대상체의 7/9(78%)(데이터는 도시되지 않음). 또한, HLA-DR을 T 세포에 대한 활성화 마커로서 사용하여, 임상 데이터는 CD4+HLA-DR+ T 세포 및 CD8+HLA-DR+ T 세포의 백분율이 기준선 수준과 비교하여 26주 추적-검사에서 현저하게 감소하였음을 입증하였다(각각 P = 0.002 및 P = 0.006)(도 7f 및 g).
백인 T1D 대상체에서 폐쇄 루프 치료 후 T 세포에 대한 CCR7 발현의 상향-조절
C-C 케모카인 수용체 7(CCR7)는 고 내피 세정맥을 통한 T-세포의 림프절 귀소 및 T-세포 항상성을 매개하는데 중요한 역할을 한다[Forster R. et al., "CCR7 and its ligands: balancing immunity and tolerance", Nat Rev Immunol, Vol. 8: 362-371, (2008)]; [Moschovakis G.L. et al., "Multifaceted activities of CCR7 regulate T-cell homeostasis in health and disease", Eur J Immunol, Vol. 42: 1949-1955, (2012)]. 폐쇄 루프 치료의 면역조절 효과를 추가로 연구하기 위해, 나이브 T, TCM, 및 TEM 세포에 대한 CCR7 발현 수준을 유세포분석에 의해 분석하였다. 임상 데이터는 그룹 A 및 B 대상체 둘 모두가 나이브 CD4+ T 세포(도 8a), 나이브 CD8+ T 세포(도 8b) 및 CD4+ T 세포(도 8c)에 대한 CCR7의 발현을 유의하게 증가시켰음을 나타내었다. 그룹 A 대상체에서 나이브 CD4+ T 세포의 현저한 반응은 그룹 B 대상체에서 26주의 지연된 반응과 비교하여, 폐쇄 루프 치료 후 8주만큼 빨리 발생하였다(도 8a). 나이브 CD8+ T 세포에 대한 CCR7 발현의 상향-조절은 그룹 A 및 B 대상체 둘 모두에서 8주의 추적-검사에서 동시에 나타났다(도 8b). 그룹 A 대상체에서 CD8+ T 세포에 대한 CCR7의 발현도 개선되었고 18주 추적-검사에서 시작되었지만(도 8d), 그룹 B 대상체에서의 반응은 56주 추적-검사로 지연되었다(P = 0.046, 도 8d). CD4+ T 및 CD8+ T 세포 둘 모두에 대한 CCR7 발현 수준은 둘 모두의 그룹에서 줄기 세포 생물반응기 치료 요법을 받은 후 56주 추적-검사에서 현저하게 향상되었다(도 8e). 상기 데이터는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 CCR7 발현의 상향-조절이 폐쇄 루프 치료 후 T1D 대상체에서 T 세포의 재분배를 유도할 수 있음을 보여준다.
CB-SC로 폐쇄 루프 치료 후 생체외 연구에 의한 T 세포에 대한 CCR7 발현의 상향-조절
CCR7은 상이한 T-세포 하위집단의 특성화에 중요한 마커이고, 그 발현은 여러 요인에 의해 조절될 수 있다(Britschgi et al., 2008). 나이브 T, TCM 및 TEM 세포에 대한 CCR7의 상향 조절을 추가로 입증하기 위해, 혼합 백혈구 반응(MLR)을 CB-SC의 존재 또는 부재하에 적용하였다. 위상차 현미경 검사는 CB-SC 부재 하에 상청액에 부유하는 상당한 수의 다양한 크기의 세포 클러스터를 나타내었지만(도 9a, 좌측 패널), CB-SC의 존재 하에는 그러지 않았다(도 9a, 우측 패널). 이것은 T 세포의 증식에 대한 CB-SC의 억제 활성을 나타내었다. 유세포분석은 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 CCR7 발현의 전반적인 수준이 CB-SC로 처리한 후 증가하였음을 보여주었다(도 9b).
게이팅된 CD4+ T 세포에 대한 CCR7 발현을 추가로 분석하였다. CB-SC-미처리된 그룹과 비교하여(반응자 단독 또는 반응자 + 자극제), CCR7 발현의 백분율 및 평균 형광 강도(MFI) 둘 모두는 CB-SC-처리된 그룹에서(반응자 + 자극제 + CB-SC 또는 반응자 또는 CB-SC) 나이브 T(CD45RA+ CCR7+) 세포에 대해 증가하였다(도 9c, 좌측 패널). TCM 세포(CD45RO+ CCR7+)의 백분율은 CB-SC-처리된 그룹에서 증가하였다. 대조적으로, TEM 세포(CD45RO+ CCR7-)의 백분율은 CB-SC-처리된 그룹에서 감소하였다(도 9c, 우측 패널). TEM세포(CD45RO+ CCR7-)에 대한 CCR7 발현의 평균 형광 강도는 CB-SC-미처리된 그룹의 1.85 ± 0.07로부터 CB-SC-처리된 그룹의 2.24 ± 0.01로 상향-조절되었다(P = 0.017).
TEM 세포에 대한 CCR7 발현의 상향-조절을 추가로 확인하기 위해, 또 다른 주요 림프절 귀소 수용체 CD62L을 인간 TEM 세포(CD45RO+ CD62L-)에 대한 마커로서 사용하였다[Lefrancois et al., Immunol. Rev., Vol. 211: 93-103, (2006)]. CB-SC로의 처리 후, CCR7 발현 수준을 게이팅된 CD45RO+ CD62L- TEM 세포에 대해 분석하였다. 데이터는 CD45RO+ CD62L- TEM 세포에 대한 CCR7 발현의 평균 형광 강도가 CB-SC로의 처리 후 기준선 수준 1.87 ± 0.04로부터 2.09 ±0.07로 상향조절되었음을 입증하였다(P = 0.02).
따라서, 이러한 데이터는 TEM 세포에 대한 CCR7 발현이 CB-SC의 처리에 의해 조절될 수 있음을 보여준다.
백인 대상체의 췌장 β-세포 기능의 개선에서의 줄기 세포 생물반응기 장치 요법의 임상 효능
백인 T1D 대상체의 대사 조절에서 줄기 세포 생물반응기 장치 요법의 치료 가능성을 시험하기 위해, 섬 β-세포 기능을 공복 혈장 C-펩티드 및 글루카곤-자극된 C-펩티드 수준의 측정을 통해 조사하였다. 그룹 A 대상체에서, 임상 결과는 2명의 최근-발병 T1D 대상체(즉, 잔류 β-세포 집단을 가질 가능성이 가장 높음)에서 12주에 공복 및 및 글루카곤-자극된 C-펩티드 수준 둘 모두의 상향-조절을 입증하였다(도 10a 및 b). 회복된 공복 및 글루카곤-자극된 C-펩티드 수준은 치료 56주 후에 최종 추적-검사를 통해 대상체 1에서 유지되었다(도 10a). 대상체 2의 글루카곤-자극된 C-펩티드 수준은 1년 추적-검사 동안 안정하였으나, 공복 C-펩티드 수준은 약간 감소하였다(도 10b). 연구 시점에 10년째 T1D를 갖는 대상체 3은 공복 C-펩티드가 기초의 0.25 ng/mL로부터 56주에 0.36 ng/mL로 증가하고 글루카곤-자극된 C-펩티드 수준이 기초의 0.4 ng/mL로부터 26주에 0.52 ng/mL로 증가하는 것을 포함하는 완만한 개선을 여전히 달성하였다(도 10c). 연구 시점에 3년째 T1D를 갖는 대상체 4는 공복 C-펩티드 수준이 기준선의 1.05 ng/mL로부터 40주에 0.88 ng/mL 그리고 글루카곤-자극된 C-펩티드가 기준선의 2.18 ng/mL로부터 40주에 2.01 ng/mL로, 시간에 따라 현저한 변화가 없는 정상 β-세포 기능을 유지하였다(도 10d). 대상체 5 및 6은 T1D의 진단 후 10년 넘게 약간의 잔류 섬 β-세포 기능을 나타내었다. 폐쇄 루프 치료를 받은 후, 대상체 5에서의 공복 C-펩티드 수준은 기준선의 0.23 ng/mL로부터 26주에 0.14 ng/mL로 초기에 감소하였지만, 40주에 0.3 ng/mL로 증가하였다(도 10e). 대상체 6의 공복 C-펩티드 수준은 기준선의 0.26 ng/mL로부터 26주에 0.09 ng/mL로 초기에 감소하였지만 40주에 0.21 ng/mL로 개선되었다(도 10f). 이들의 글루카곤-자극된 C-펩티드 수준은 공복 C-펩티드 수준과 유사한 경향을 보였다.
요약해 보면, 그룹 A의 참가자(즉, 일부 잔류 섬 β 세포 기능을 갖는 대상체)는 치료 56주 후에 이들의 공복 C-펩티드 수준을 유지하였다(0.46 ± 0.33 ng/mL 대 기준선의 0.52 ± 0.34 ng/mL, P = 0.78)(표 2A 및 2B). 일관되게, 인슐린의 중간 일일 용량(0.37 ± 0.16 U/체중 kg 대 기준선의 0.38 ± 0.16, P = 0.84) 및 중간 당화 혈색소(HbA1C)(7.8 ± 1.48 대 기준선의 7.6 ± 1.3, P = 0.81)는 치료 56주 후에 안정화되었다. 데이터는 그룹 A 환자의 잔류 β-세포 기능이 폐쇄 루프 치료를 받은 후 T1D의 자연력(natural history)으로서 유의한 선형 쇠퇴 없이 구제 및 보존되었음을 입증한다. 추가로, 2회 SCE 요법을 받은 후 잔류 췌장 섬 β-세포 기능이 없는 오래된 중증 그룹 B 환자의 공복 C-펩티드 수준에서는 변화가 관찰되지 않았다(표 2A 및 2B). SCE 요법에 대한 이들의 반응은 오래된 중증 중국인 T1D 환자에서 보고된 것과 크게 다르다.
Figure pct00006
Figure pct00007
추가로, 2회 생물반응기 장치 요법을 받은 후 잔류 췌장 섬 β-세포 기능이 없는 오래된 중증 그룹 B 환자의 공복 C-펩티드 수준에서는 변화가 관찰되지 않았다(표 2A 및 2B 및 표 3A 및 3B). 폐쇄 루프 치료에 대한 이들의 반응은 오래된 중증 중국인 T1D 환자에서 보고된 것과 크게 다르다[Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet β-cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med., Vol. 10(3), 1-11, (2012)] and [Zhao Y., "Stem cell educator therapy and induction of immune balance", Curr Diab Rep., Vol.,12: 517-523, (2012)]. 이 차이의 기초가 되는 잠재적 메커니즘은 더 연구될 필요가 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
자가면역 기억을 극복하는 것은 T1D 및 다른 자가면역 질환에서 자가-면역을 제거하는데 필수적이다. 기술된 연구는 대상체의 면역 시스템에서 상이한 세포 구획의 수 및 비율을 크게 변경하지 않으며, 폐쇄 루프 치료에 의한 2회-치료 접근법의 안전성 및 실행 가능성을 입증하였다. CD4+ TEM 및 CD8+ TEM 세포의 둘 모두의 백분율은 SCE 요법을 받은 후 유럽 배경의 백인 T1D 대상체의 말초 혈액에서 실질적으로 감소한 반면, CD4+ TCM이 폐쇄 루프 치료에 의해 선호되는 것으로 나타났다. 특히, 나이브 T 및 TCM 세포에 대한 CCR7 발현 수준은 폐쇄 루프 치료 후에 현저히 증가하였고, 이는 생체외 연구에 의해 추가로 확인되었다. CCR7+ TCM의 백분율은 CCR7- TEM을 희생하여 증가하였다. 이러한 발견은 T1D의 자가면역 기억 구획을 바꾸는 해결책을 제공한다.
나이브 T 세포는 혈액 및 림프를 도관으로 사용하여 이차 림프 조직(SLT) 사이를 끊임없이 재순환한다. 본 연구는 나이브 CD4+ T 세포의 백분율이 폐쇄 루프 치료를 받은 후 T1D 대상체에서 현저히 증가하였음을 보여주었다. 총 CD4+ T 세포의 수는 1년 추적-검사 동안 말초 혈액에서 일정하게 유지되었다. 대부분의 T 세포의 경우 짧은 수명으로 인해(3개월), 상기 데이터는 나이브 CD4+ T 세포의 증식이 폐쇄 루프 치료에 의한 T1D 대상체에 대한 면역 시스템 균형의 정상적인 회복을 나타내었다고 제안한다. 임상 증거는 TEM의 집단이 만성 부비동염과 같은 만성 염증 또는 자가면역 질환[Pant et al., "Accumulation of effector memory CD8+ T cells in nasal polyps", Am. J. Rhinol. Allergy, Vol. 27(5): 117-126, (2013)] 및 오래된 T1D 대상체[Matteucci et al., "Altered proportions of naive, central memory and terminally differentiated central memory subsets among CD4+ and CD8+ T cells expressing CD26 in patients with type 1 diabetes", J. Clin. 31: 977-984, (2011)]에서 증가한다는 것을 입증한다. 또한, 나이브 T 세포 및 TCM의 백분율 및 절대 세포 수 둘 모두는 오래된 T1D 대상체에서 감소하였다[Matteucci et al., "Altered proportions of naive, central memory and terminally differentiated central memory subsets among CD4+ and CD8+ T cells expressing CD26 in patients with type 1 diabetes", J. Clin. Immunol, Vol. 31: 977-984, (2011)]. 특히, 본 임상 데이터는 나이브 CD4+ T 세포 및 TCM의 백분율이 폐쇄 루프 치료를 받은 후 이들 T1D 대상체에서 모두 현저하게 증가하였으나, CD4+ TEM 및 CD8+ TEM은 감소하였음을 입증하였다. 따라서, 데이터는 폐쇄 루프 치료가 TEM의 기능 장애를 바로잡고 오래된 T1D 대상체에서 TCM의 분화를 지지하였음을 입증한다. 다르게는, CD4+ TCM 및 TEM 둘 모두는, CD8+ TCM(CD8+ TEM 아님)과 함께, CD2+ T 세포를 표적화하여 삭제하는 유전적으로 공학처리된 융합 단백질을 사용하는 접근법인 Alefacept 요법에 의한 신규-발병 T1D 환자의 치료에 의해 T1D 시험에서 모두 감소하였다.
실시예 3: T1D를 갖는 환자의 치료를 위한 불연속 치료 요법의 안전성, 실행 가능성 및 효능을 평가하기 위한 전향적, 단일 아암, 오픈-라벨, 단일-센터 파일롯 연구
연구 목표
일차 목표: T1D를 갖는 환자 대상체의 파일롯 그룹에서 불연속 치료 요법의 안전성 평가.
이차 목표
T1D를 갖는 환자에서 불연속 치료의 실행 가능성 평가.
12개월까지 T1D를 갖는 환자에서 β-세포 기능을 개선시키기 위한 불연속 치료의 예비 효능 평가.
불연속 치료 후 T1D 환자에서 면역 기능의 마커 평가.
일반적인 연구 설계
이것은 T1D를 갖는 환자의 치료를 위한 불연속 치료의 안전성, 실행 가능성, 및 효능을 평가하기 위한 전향적, 단일 아암, 오픈-라벨, 단일-센터 파일롯 연구이다. 자격 기준을 충족하는 최대 10명의 환자가 등록된다. T1D를 갖는 환자는 연구 주조사자 또는 공동-조사자에 의해 평가된다. 초기 스크리닝 방문시 사전 동의서를 받는다. 초기 스크리닝 방문은 치료 개시 후 30일 이내에 이루어진다(표 4). 두 번째 스크리닝 방문은 요법 7일 이내에 이루어진다. 모든 기준을 충족하는 대상체는 치료를 위한 일정을 잡는다. 모든 등록된 대상체의 단핵 세포는 부착성 UC-SC 세포를 포함하는 생물반응기 장치로 치료를 받는다. 단핵 세포는 성분채집술에 의해 단일 세션에서 수집되며 이 때 혈액의 10-12 L(약 1x1010개 단핵 세포)는 -1일에 처리된다. 각 대상체로부터의 단핵 세포를 함유하는 MNC 생성물을 이후 17시간 동안 장치에 노출시켜 줄기 세포 교육된 MNC 생성물을 형성한다. 0일에, 교육된 MNC 생성물을 3-5시간에 걸쳐 환자에게 다시 정맥내 주입한다. 치료된 모든 대상체는 급성 부작용 +7 ± 1일을 모니터링하기 위해 +1일에 추적-검사 평가를 위한 전화를 받는다. 추적-검사 방문은 요법 후 1, 3, 6, 9, 및 12개월(± 5일)에 이루어진다. 대상체는 매일 인슐린 용량, 당 수치, 및 신체 활동을 기록하도록 지시받는다. 교육된 MNC 생성물의 주입 후, 매일 인슐린 용량은 의사에 의해 모니터링되고 조정된다.
CB-SC 배양물 및 장치 단위는 이전에 기술된 대로 제조된다[Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet β-cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med., Vol. 10(3): 1-11, (2012)]. 간단히 말해, 건강한 동종이계 공여자로부터 유래된 인간 제대혈을 FDA-등록된 CORD USE Cord Blood Bank(Orlando, FL)로부터 얻는다. 모든 제대혈 샘플을 HIV 1/2, HBsAg, HBcAg, HCV, HIVNAT, STS, HBVNAT, HCVNAT, AbScr, HTLV I/II, 웨스트 나일, Chagas, 및 CMV에 대해 스크리닝하고, 병원체-비함유 제대혈 유닛만을 임상 치료에 사용한다. 인간 CB-SC를 새로운 제대혈 유닛(적어도 100 mL/유닛)으로부터 분리한다. 50 mL 튜브를 홀더에 보관한다. 3 mL의 HISTOPAQUE(R)-1077을 각 튜브에 첨가하고(20 mL 원뿔형 원심분리 튜브) 실온이 되게 하여 CB-SC를 분리한다. 3 mL의 전혈을 조심스럽게 HISTOPAQUE(R)-1077 위에 적층시킨다. 원심분리는 실온에서 30분 동안 400 x g에서 수행된다. 원심분리 후, 상부층을 CB-SC를 함유하는 불투명한 계면의 0.5 cm 이내로 흡인한다. 불투명한 계면을 깨끗한 새로운 20 mL 원뿔형 튜브로 옮긴다. 세포를 10 mL 등장성 포스페이트 완충된 염수 용액으로 세척한다. 혼합하고 250 x g에서 수 분 동안 원심분리함에 의해 수행된 세척 후에, 상청액을 버리고 두 번 더 세척한 후, CB-SC를 0.5 mL 등장성 포스페이트 완충된 염수 용액에 재현탁시킨다. 인간 CB-SC를 생산하고 제대혈 단핵 세포를 RPMI 1640 배지 중 적어도 1×106개 세포/mL, 25 mL/디쉬의 밀도로 150×15 mm 페트리 디쉬(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, not tissue culture-treated dishes)에 플레이팅하고, 37℃에서 8% CO2에서 인큐베이션한다. 제대혈 단핵 세포를 혈청-비함유 배양 배지의 생물반응기 장치에서 플레이팅하고(Lonza, Walkersville, MD) 37℃, 8% CO2에서 약 2-3주 동안 인큐베이션한다. CB-SC는 원형이 되었는지 관찰되며 페트리 디쉬의 바닥 상에 부착에 대해 추가로 확인된다. 임상 시험을 위해 80% 컨플루언스(약 1x107개 세포/장치)으로 성장한 CB-SC를 준비한다. 요망되는 내독소 수준은 <0.05 EU/mL이다. 하나의 장치가 하나의 제대혈 유닛에서 생성되어, 한 대상체에 사용된다.
MNC 생성물과 CB-SC의 밤새 공동-배양 후, 장치-처리된 MNC 생성물을 수집하고 3시간, 4시간, 또는 5시간에 걸쳐 다시 대상체에게 정맥내(i.v.) 주입한다.
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일차 연구 종말점
일차 연구 종말점은 치료-관련된 부작용의 발생을 포함한다. 요법 중(특히 요법을 일시적으로 또는 영구적으로 중단해야 하는 경우) 및 12개월 추적-검사 기간 동안 발생하는 부작용을 평가하다.
이차 연구 종말점(실행 가능성 종말점)
실행 가능성 종말점은 불연속 치료를 완료할 수 없는 환자 수 및 12개월 추적-검사 방문 전에 추적-검사에 실패한 환자수를 포함한다.
요법 중단에 대한 부작용과 관련이 없는 모든 이유를 기록한다(예를 들어, 장치의 기술적 문제).
이차 연구 종말점(효능 종말점)
효능 종말점은 다음을 포함한다:
· 3시간 혼합 식사 내성 검사(MMTT)의 처음 2시간 동안 C-펩티드 곡선하 면적(AUC), 및 12개월에 AUC 및 시간 경과에 따른 변화의 평가;
· 3시간 MMTT 동안 피크 C-펩티드 수준, 12개월에 피크 C-펩티드 수준 및 시간 경과에 따른 변화의 평가;
· 12개월에 기초 C-펩티드 및 시간 경과에 따른 변화의 평가;
· 일일 인슐린 요건의 평가;
· 시간 경과에 따른 HbA1C 수준에서 변화의 평가; 및
· 시간 경과에 따른 자가-항체 수준에서 변화의 평가.
이차 연구 종말점(탐색 종말점)
탐색 종말점은 기준선, 1, 3, 6, 9, 및 12개월에 정기적인 면역 세포 마커의 측정 및 기준선, 1, 3, 6, 9, 및 12개월에 기억 T 세포 마커의 유세포분석을 포함한다. 시험용 혈액 샘플은 NIH/NIDDK 지정된 North American Autoantibody/HLA Core Laboratory at Barbara Davis Center for Diabetes, School of Medicine, University of Colorado로 발송된다.
대상체 선택 및 철회
본 연구는 다음의 자격 기준을 충족하는 총 10명의 대상체를 등록한다:
포함 기준
1) 성인 환자(≥ 18세).
2) 당뇨병의 2015년 American Diabetes Association criteria for the Clarification and Diagnosis에 기반하여 타입 1 당뇨병 진단을 받아야 한다.
3) 췌장 섬 β-세포에 대한 적어도 하나의 자가항체의 존재를 확인하는 혈액 검사를 받아야 한다(ICA, IAA, IA2, GAD 65, ZnT8).
4) 공복 C-펩티드 수준 > 0.3 ng/mL.
5) 성분채집술을 위한 적절한 정맥 접근.
6) 사전 동의서를 제공할 수 있음.
7) 모든 연구 요건을 준수하고 모든 연구 방문을 기꺼이 완료할 것에 동의해야 한다.
배제 기준
임의의 다음 기준을 충족하는 잠재적인 대상체는 참가로부터 배제된다:
1) AST 또는 ALT 정상 상한의 2 > x.
2) 크레아티닌 > 2.0 mg/dl.
3) 심장전문의에 의한 심장 청소율(cardiac clearnace)이 수득되지 않는 한 관상 동맥 질환 또는 관상 동맥 질환을 암시하는 EKG가 알려져 있다.
4) 활성 감염이 알려져 있다.
5) 임신 또는 모유수유 중인 여성.
6) 등록 1개월 내에 프레드니손, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, 및 화학요법을 비제한적으로 포함하는 면역억제성 약물처치의 사용.
1) 임의의 다른 자가면역 질환의 존재(루푸스, 류마티스 관절염, 공피증 등).
2) 아세틸살리실산(ASA) 이외의 항응고제.
3) 혈색소 <10 g/dL 또는 혈소판 < 100 k/mL.
4) 사전 동의서를 제공할 수 없거나 원치 않는 경우.
5) 조사자의 의견으로, 참가를 배제할 임의의 다른 신체적 또는 정신적 의료 상태의 존재.
대상체 모집 및 스크리닝
임상 시험에 참가할 대상체의 동의가 얻어지면, 상기 포함 또는 배제 기준을 충족시키는데 필요한 진단 시험을 수행한다. 스크리닝 요건의 목록은 정기적인 혈구 계수 분석, 췌장 섬 베타-세포에 대한 적어도 하나의 자가항체의 존재를 확인하는 혈액 검사, 및 임상적으로 중요한 간, 신장, 또는 심장 질환; 임신; 면역억제성 약물처치; 바이러스 질환; 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 관련된 질환을 제외하기 위한 다른 관련 검사를 포함한다.
대상체의 조기 철회
환자에 대한 위험도는 최소이며 표준 성분채집술 절차와 유사할 것으로 예상된다. 환자에게 돌려 보내지는 세포는 CB-SC에 의해 처리(또는 교육)될 자가 세포이다. 본 연구에서 환자는 이 프로토콜에서 빠질 수 있다.
· 환자가 SCE 처리된 세포에 일부 유형의 알레르기 또는 과민 반응을 일으켜 생성물을 주입하지 못하게 되는 경우,
· 기술적인 어려움으로 성분채집술이 완료되지 못하는 경우.
· 환자가 필요한 치료 후 추적-검사를 완료하기를 원하지 않는 경우.
이 시험에 참가하는 것은 모든 대상체에 대해 자발적이다. 대상체가 참가하지 않기로 결정한 경우, 대상체는 의료 시설에서의 추후 관리에 영향을 미치지 않고 언제든지 자유롭게 동의를 철회하고 참가를 중단할 수 있다. 환자가 상기 또는 임의의 다른 예상치 못한 이유로 빠진 경우, 이들은 치료 관련 문제에 대해 계속하여 의학적 관리를 받을 수 있다.
철회된 대상체에 대한 데이터 수집 및 추적-검사
비록 대상체가 연구에서 조기에 빠질 수 있지만, 이후 12주 동안 독성 데이터를 수집하는 것이 필수적이다. 본 발명자들은 가능한 모든 방법(예를 들어, 대상체와 전화 통화 수, 가능한 경우 HIPPA 양식에 기재된 친인척과 전화 통화, 인증 서신 등)을 사용하여 대상체가 진정으로 추적-검사될 수 없음을 확인한다. 환자가 12개월 추적-검사를 하기 전에 연구에서 빠진 경우, 대체 환자가 등록된다.
연구 장치
연속 폐쇄 루프 시스템의 일부로서 림프구와 CB-SC의 공동-배양을 위한 챔버(160x160x200cm)[Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet β-cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med., Vol. 10(3), 1-11, (2012)] 및 T2D[Zhao Y. et al., "Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial", BMC Med., Vol. 11: 160, (2013)]가 기재되어 있고, 이 파일롯 연구는 불연속 시스템을 이용하며, 즉, 대상체로부터 얻은 전혈 샘플을 처리 시설로 보내고, 처리 시설은 교육된 MNC 생성물을 제조하고, 교육된 MNC 생성물이 방출 기준을 충족하면, 교육된 MNC 생성물을 대상체로의 주입을 위해 임상 시설로 다시 보낸다.
각각의 생물반응기 장치는 Class 100K 클린 룸에서 설계, 제조, 어셈블링 및 포장된다. 감마-조사(세슘-137)에 의해 멸균된 후, 각 장치를 세포 분리 및 배양을 위해 FDA-승인된 시설인 Class 100K 클린 룸의 어두운 캐비넷에 실온에서 보관한다. 상기 장치를 생산하는데 사용된 물질은 미국 약전(즉, Grade Class VI Plastic)에 따라 생체내 사용이 FDA-승인되었다. 멸균된 장치는 일회용이다. CB-SC는 한 대상체 적용을 위해 하나의 제대혈 유닛으로부터 생성된다. CB-SC는 고유한 부착 능력으로 인해 장치 내부에 남아 있다[Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet β-cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med., Vol. 10(3), 1-11, (2012)].
치료 요법
모든 기준을 충족하는 대상체는 다음 불연속 방법에 의한 치료를 위해 일정을 잡는다. 전혈 샘플을 각 대상체로부터 수집하고 단핵 세포를 성분채집술에 의해 수집한다; 혈액의 10-12 L(약 1x1010개 단핵 세포)는 -1일에 처리된다. 단핵 세포 제조물을 cGMP 처리 시설로 보낸다. 처리 시설에서 단핵 세포 제조물을 17시간의 기간 동안 부착성 UC-SC 세포를 함유하는 생물반응기 장치로 도입한다. 교육된 단핵 세포 생성물을 무균성, 생육성 및 순도에 대해 시험한다; 일단 방출 기준이 만족되면, 처리 시설은 교육된 단핵 세포 생성물을 임상 시설로 보낸다. 0일에 생성물을 환자에게 다시 정맥내 주입한다. 치료된 모든 대상체는 급성 부작용을 모니터링하기 위해 +1일에 추적-검사 평가를 위한 전화를 받는다. 모든 치료된 대상체는 +7 ± 1일에 안전성 방문에 참석하다. 추적-검사 방문은 도 11에 도시된 대로 요법 후 1, 3, 6, 9, 및 12개월(± 5일)에 이루어진다. 대상체는 매일 인슐린 용량, 당 수치, 및 신체 활동을 기록하도록 지시받는다. 치료 후, 환자의 일일 인슐린 용량을 주치의가 모니터링하고 조정한다.
대상체를 치료 그룹에 할당하는 방법
섬-β 세포 기능의 지표로서, 공복 C-펩티드 수준(인슐린 생합성의 부산물, 정상 참조 범위 0.8-3.1 ng/mL)에 기반하여, 모든 참가자는 특성화되고 일부 잔류 β-세포 기능을 갖는 중등도 T1D를 갖는 한 그룹으로 할당된다(공복 C-펩티드 수준 ≥ 0.3 ng/mL, n = 10). 각 참가자는 1회 치료를 받는다.
연구 장치의 준비 및 사용
MNC 제조물을 처리하기 위한 부착성 UC-SC 세포를 포함하는 생물반응기 장치의 사용은 cGMP 처리 시설에서 단핵 세포 및 CB-SC의 밤새 공동-배양을 통해 17시간까지 연장된다. SCE 장치의 준비 및 사용을 위한 프로토콜은 도 12a-c의 다이어그램과 같은 다음 단계로서 및 하기 설명된 대로 제시된다.
단계 1: 인간 제대혈 유닛의 수집
건강한 공여자로부터 유래된 인간 제대혈 유닛은 FDA-등록된 CORD: USE Cord Blood Bank Inc.로부터 제공된다. 모든 제대혈 샘플은 규제 기관의 요청에 따라 전염병에 대해 스크리닝된다.
단계 2: 장치에서 CB-SC의 제조
CB-SC를 장치에 도입하기 전에, 제대혈 단핵 세포를 다음의 프로토콜에 따라 새로운 제대혈 유닛(적어도 100 mL/유닛)으로부터 분리한다.
1) 50 mL 튜브를 사용하여 홀더에 보관한다: 일반적으로 4개의 튜브 사용.
2) 단핵 세포를 분리하기 위해 HISTOPAQUE®-1077을 각 튜브에 20 mL/튜브로 첨가한다.
3) 단핵 세포를 장치에서(Tianhe Stem Cell Biotechnologis Inc) 혈청-비함유 배양 배지에서 1x106개 세포/mL, 25-30 mL/디쉬로 심는다;
4) 세포를 37℃, 8% CO2 조건에서 10-20일 동안 인큐베이션한다.
5) 세포 관찰: CB-SC는 원형이며 디쉬의 바닥에 부착된다. 세포 밀도가 적어도 80%의 컨플루언스에 도달하면, CB-SC를 임상 적용을 위해 준비할 수 있다.
단계 3: 내독소 및 그램 염색에 대한 CB-SC 배양물의 시험
내독소에 대한 시험
CB-SC의 배양물로부터의 상청액을 1.8 mL의 무균 튜브에 수집한다. 내독소를 Endosafe-PTS 휴대용 검사 시스템(Charles River, Charleston, SC) 및 Endosafe-Licensed PTS 내독소 카트리지(0.05 EU/mL 감도, Fisher Scientific)를 사용하여 시험한다. 표준 내독소 수준은 < 0.5 EU/mL이다. 이 표준을 충족하는 SCE 장치만이 임상 시험에 사용될 수 있다.
그램 염색
CB-SC의 배양물로부터의 상청액을 1.8 mL의 무균 튜브에 수집한다. 그램 염색은 그램 염색 키트(BD Diagnostic Systems, Sparks, MD)를 사용하여 수행된다. 음성으로 염색된 장치만이 임상 시험에 사용될 수 있다. 시험 견본은 CB-SC의 배양물로부터의 상청액의 얇고 균일한 도말표본을 생산하는 방식으로 깨끗한 유리 슬라이드에 적용된다. 도말표본은 공기 건조된다. 도말표본은 다음의 기술 중 하나를 사용하여 슬라이드에 고정된다.
슬라이드를 낮은 화염에 2-3회 통과시켜 열 고정한다. 슬라이드를 염색 전에 실온으로 냉각한다. 또는, 1-2분 동안 무수 메탄올에 침수시켜 슬라이드를 고정하고 염색 전에 수돗물로 헹군다.
시험 절차
그램 염색을 위한 시험 절차는 다음과 같다:
· 고정된 도말표본을 일차 염색제(Gram Crystal Violet)에 침수시켜 1분 동안 염색한다.
· 차가운 수돗물로 부드럽게 세척하여 일차 염색을 제거한다.
· 슬라이드를 매염제(그램 요오드 또는 안정화된 그램 요오드)에 침수시키고 1분 동안 슬라이드 위에 유지한다.
· 수돗물로 부드럽게 세척하여 매염제를 제거한다.
· 슬라이드로부터 흐르는 용매가 무색이 될 때까지(3-60초) 매염제를 탈색한다(그램 탈색제).
· 슬라이드를 차가운 수돗물로 부드럽게 세척한다.
· 슬라이드를 대조염색제(Gram Safranin 또는 Gram Basic Fuchsin)에 침수시키고 30-60초 동안 염색한다.
· 슬라이드를 차가운 수돗물로 세척한다.
· 슬라이드를 종이 또는 종이 타올로 닦아내거나 공기 건조시킨다.
· 도말표본을 오일 침지 렌즈 아래에서 검사한다.
단계 4: 생물반응기 장치의 준비
장치는 다음 단계를 실행함에 의해 처리 시설에서 준비된다:
1) 장치의 준비를 위해 GMP 시설에서 후드를 소독한다;
2) 70% 에탄올 거즈로 장치의 측면을 청소하고 모든 캡을 조심스럽게 제거한다;
3) 장치 내부의 모든 상청액을 제거한다;
4) 생리식염수를 각 층에 20 mL/층으로 첨가하고, 각 층을 세척하고, 모든 부유 세포 및 찌꺼기를 제거한다;
5) 생리식염수로 추가 세척한다(20 mL/층);
6) 상부 및 하부에서 캡을 제거하고, Plastisol Horseshoe Y 커넥터로 교체하고, Medical Device Super Glue로 밀봉한다(이들 접착제는 의료 장치에 사용하기 위한 USP Class 6 기준을 충족한다);
7) 생리식염수를 각 층에 15-20 mL/층으로 첨가하고, 캡을 닫는다;
8) 장치를 뒤집어 누출에 대해 점검한다;
9) 무균 용기에 넣는다;
단계 5: CB-SC의 부착성 단층을 포함하는 장치로의 통과에 의한 단핵 세포 생성물의 공동-배양
1) -1일에 환자는 혈액의 10-12L(약 1010개 단핵 세포)를 처리하는 최적의 목표를 가진 임상 시설에서 성분채집술에 의한 정상 상태의 단핵 세포 수집술을 받는다. 내성과 정맥 접근에 기반하여 목표에 도달하기 전에 성분채집술은 중단될 수 있다. 다음 단계로 진행하려면 최소 6 L의 처리가 필요하다. 혈장을 성분채집술의 끝에 250 mL의 생성물 부피를 목표로 수집 백에 첨가한다. 생성물의 라벨링은 혈액 및 골수 이식 프로그램 라벨링 정책에 따라 공여자로부터 생성물을 분리하기 전에 수행된다.
2) 생성물은 혈액 및 골수 이식 프로그램 SOP에 따라 GMP 시설에 의해 포장, 보관 및 픽업된다.
3) 일단 GMP 시설에 도착하면, GMP 시설은 MNC 생성물을 장치에 노출시킨다.
4) 0일에, 교육된 단핵 세포(MNC) 생성물은 혈액 및 골수 이식 프로그램 세포 주입 SOP에 따라 환자에게 주입된다.
연구 치료 용품의 수령시, 물품 목록이 작성되어야 하고 발송을 수락한 사람은 장치 수령 기록부를 채우고 서명해야 한다. 지정된 연구원은 발송물이 발송 물품 목록에 기록된 모든 항목을 포함하는지 세어 보고 확인하는 것이 중요하다. 제공된 발송물 중 임의의 손상되거나 사용할 수 없는 연구 장치는 연구 파일에 기록된다. 조사자는 조사자의 현장에 공급된 임의의 손상되거나 사용할 수 없는 연구 치료제를 연구 스폰서에게 알려야 한다.
장치는 세포 배양에 적합한 GMP 시설의 어두운 캐비넷에 실온에서 저장된다. 빛으로부터 보호할 필요는 없다. 저장시 고려사항은 장치를 떨어뜨리거나 장치 위에 무거운 것을 올려 놓는 것을 피하는 것을 포함한다.
모든 빈 장치(줄기 세포 없음)는 동일한 품질을 갖는다. 모든 단일 장치는 임의의 단일 대상체에 할당되고 분배된다.
유일한 기준은 장치에서 배양된 CB-SC의 품질이다. 세포 밀도가 ≥80%의 컨플루언스, 내독소 수준 <0.5 EU/mL에 도달하면, CB-SC를 갖는 장치를 대상체에 할당하고 임상 적용을 위해 준비할 수 있다. 장치 할당, 사용된 장치, 남아 있는 장치, 및 실수로 손상된 장치를 기록하기 위해 정기적인 연구 장치 조정이 수행된다. 이 조정은 장치 책임 양식에 기록되며, 연구 팀이 서명하고 날짜를 적는다.
장치는 기관의 생물재해 폐기물 처리 SOP에 따라 치료가 끝나면 폐기된다. 연구의 완료시, 발송된 장치, 소비된 장치, 및 남아 있는 장치에 대한 최종 조정이 이루어진다. 이 조정은 장치 조정 양식에 기록되며, 서명하고, 날짜를 적는다. 언급된 임의의 불일치 사항은 미사용된 연구 장치의 반환 또는 폐기 전에 조사, 해결, 및 기록된다. 현장에서 폐기된 모든 장치는 연구 파일에 기록된다.
단계 6: 내독소, 그램 염색, 마이코플라스마, 및 줄기 세포 마커에 대한 처리된 MNC 생성물(이하 최종 생성물) 시험
내독소에 대한 시험
CB-SC-처리된 MNC로부터의 샘플을 1.8 mL 무균 튜브에 수집한다. 내독소를 Endosafe-PTS 휴대용 검사 시스템(Charles River, Charleston, SC) 및 Endosafe-Licensed PTS 내독소 카트리지(0.05 EU/mL 감도, Fisher Scientific)를 사용하여 시험한다. 일상적인 PTS LAL 검정을 PTS 장비의 간단한 지시에 따라 수행한다. 다음은 통상적인 검정 절차를 나타낸다:
장비 작동
· PTS 키패드의 MENU 키를 눌러 장비를 켠다(Menu 5는 장비를 끈다).
· PTS Reader는 최대 37℃까지 가열됨에 따라 "SYSTEM SELF TEST"를 시작한다 - 이것은 약 5분이 걸린다.
· PTS Reader는 "SELF TEST OK" 및 이후 "INSERT CARTRIDGE"를 표시한다.
샘플의 삽입
· 카트리지를 삽입한다.
· 사용 전에 카트리지가 파우치에서 실온이 되게 한다.
· 파우치에서 카트리지를 꺼내어 PTS Reader 앞면의 슬롯에 샘플 저장소가 위를 향하게 하여 삽입한다.
· 카트리지를 슬롯에 단단히 누른다.
필수 정보 입력
· 카트리지가 PTS Reader에 단단히 삽입되면, PTS Reader는 사용자에게 다음 정보를 입력하도록 한다:
· OID(운영자 ID)를 입력하라.
· Lot #(카트리지 Lot #)을 입력하라.
· 교정 코드를 입력하라(특정 lot #에 대한 교정 코드가 이미 입력되어 있는 경우, PTS Reader는 코드를 다시 묻지 않는다. (모든 저장된 lot # 및 상응하는 교정 모드를 지우려면, 초기 메뉴에서 menu, 2, 다음에 4를 선택하라).
Lot #(입력된 카트리지 lot 번호 확인)
· 샘플 Lot #을 입력하라.
· 샘플 ID를 입력하라(샘플 ID Header 아래의 메뉴 키로 선택 및 스크롤하면 50개의 샘플을 입력하고 저장할 수 있다).
· 희석 배수를 입력하라.
· 상기 정보가 PTS Reader에 입력되는 동안, 카트리지가 예열된다.
샘플 분배
· 모든 시험 정보가 입력되면, PTS Reader는 다음을 표시한다:
· 샘플을 첨가하고; ENTER를 치시오.
· 삽입된 카트리지의 4개 모두의 샘플 저장소로 25 μL의 샘플을 피펫핑하고 PTS Reader 키패드의 Enter를 누른다.
· 펌프는 샘플 분취량을 시험 채널로 끌어 들여, 시험을 시작한다.
· 결과는 약 15분 후에 얻을 것이다. 시험이 완료되면, PTS Reader는 검정이 완료되었다는 들리는 알림을 제공한다. 시험이 끝나면, 내독소 측정치 및 검정 수용 기준이 스크린에 표시된다.
표준 내독소 수준은 < 0.5 EU/mL이다. 이 표준을 충족하는 최종 생성물만이 임상 주입에 사용될 수 있다.
그램 염색
CB-SC의 배양물로부터의 상청액을 1.8 mL의 무균 튜브에 수집한다. 그램 염색은 그램 염색 키트(BD Diagnostic Systems, Sparks, MD)를 사용하여 수행된다. 음성으로 염색된 장치만이 임상 시험에 사용될 수 있다. 이는 시험 견본을 CB-SC의 배양물로부터의 상청액의 얇고 균일한 도말표본을 생산하는 방식으로 깨끗한 유리 슬라이드에 적용함에 의해 수행된다. 도말표본은 공기 건조된다. 도말표본은 다음의 기술 중 하나를 사용하여 슬라이드에 고정된다.
슬라이드를 낮은 화염에 2-3회 통과시켜 열 고정한다. 슬라이드를 염색 전에 실온으로 냉각한다. 또는, 1-2분 동안 무수 메탄올에 침수시켜 슬라이드를 고정하고 염색 전에 수돗물로 헹군다.
시험 절차
그램 염색을 위한 시험 절차는 다음과 같다:
· 고정된 도말표본을 일차 염색제(Gram Crystal Violet)에 침수시켜 1분 동안 염색한다.
· 차가운 수돗물로 부드럽게 세척하여 일차 염색을 제거한다.
· 슬라이드를 매염제(그램 요오드 또는 안정화된 그램 요오드)에 침수시키고 1분 동안 슬라이드 위에 유지한다.
· 수돗물로 부드럽게 세척하여 매염제를 제거한다.
· 슬라이드로부터 흐르는 용매가 무색이 될 때까지(3-60초) 매염제를 탈색한다(그램 탈색제).
· 슬라이드를 차가운 수돗물로 부드럽게 세척한다.
· 슬라이드를 대조염색제(Gram Safranin 또는 Gram Basic Fuchsin)에 침수시키고 30-60초 동안 염색한다.
· 슬라이드를 차가운 수돗물로 세척한다.
· 압지 또는 종이 타올로 닦아내거나 공기 건조되게 한다.
· 오일 침지 렌즈 아래의 도말표본을 조사한다.
마이코플라스마, 세포 생육성 및 무균성에 대한 시험
CB-SC-처리된 MNC로부터의 샘플에서 마이코플라스마의 무균성 및 오염은 다음의 방법에 의해 평가될 수 있다.
정기적인 세포 배양물에 대해, 세포 생육성을 위상차 현미경 아래서 모니터링하여 마이코플라스마 및 다른 박테리아의 오염을 배제할 수 있다.
대안적으로, 세포 생육성은 개재 DNA 염료 7-아미노액티노마이신 D(7AAD)를 흡수하는 죽어가는 세포를 배제시킴에 의해 결정된다)[Brocklebank A. M. et al., "Enumeration of CD34+ cells in cord blood: a variation on a single-platform flow cytometric method based on the ISHAGE gating strategy", Cytometry. Vol. 46: 254-261, (2001)]; [Barnett D, et al., "Absolute CD4+ T-lymphocyte and CD34+ stem cell counts by single-platform flow cytometry: the way forward", Br. J Haematol. Vol. 106: 1059-1062, (1999)]; [Sutherland, et al., "The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering", J Hematotherapy. Vol. 5: 213-226, (1996)], 및 미국 특허 번호 4,520,110; 4,859,582; 5,055,556; 유럽 특허 번호 76.695; 캐나다 특허 번호 1,179,942(PE, APC); 미국 특허 번호 4,876,190(PerCP); 미국 특허 번호 5,286,486; 5,486,616; 5,569,587; 5,569,766; 5,627,027(Cy); 미국 특허 번호 4,714,680; 4,965,204, 5,035,994(CD34); 미국 특허 번호 5,776,709(Lyse/no-wash method); 미국 특허 번호 5,723,218 및 5,187,288(TruCOUNT Tubes), 이들 각각의 내용은 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
실시간 PCR: 교육된 MNC 생성물의 샘플을 1.8 mL 무균 튜브에 수집하고 BioReliance(Rockville, MD)에 의해 US FDA Good Laboratory Practice Regulations(21 CFR 58)의 요건에 따라 시험한다. 3).
무균성 시험은 Direct Inoculation Method at BioReliance Company를 사용하여 수행된다.
유세포분석에 의한 줄기 세포 마커 CD45 및 OCT3/4의 시험
CB-SC를 갖는 교육된 MNC 생성물의 오염을 배제하기 위해 CB-SC 마커 CD45 및 OCT3/4에 대한 이중-염색을 사용한 유세포분석을 수행한다.
대상체 준수 모니터링
대상체는 생물반응기 장치로 1회 치료를 받는다. 추적-검사 방문은 이전에 기술된 대로 임상 평가 및 실험실 검사를 위해 치료 후 1, 3, 6, 9 및 12개월(± 5일)에 예정된다. 세포 주입 다음 날 전화 추적-검사를 수행한다.
사전 및 동시 요법
모든 T1D 대상체는 연구 전 또는 동안에 매일 인슐린 주입을 받아야 한다. 일일 인슐린 용량은 불연속 치료 후에 연구 PI가 아닌 대상체의 주치의에 의해 조정된다. 본 연구 동안 다른 새로운 당뇨병 약제나 요법은 허용되지 않는다.
포장
생물반응기 장치는 박스(4개 장치/박스)로 포장되고 Good Manufacturing Practices(GMP) Labeling System에 의해 cGMP 시설로 운송된다.
장치로의 처리 후, 교육된 MNC 생성물은 무균 냉각기에서 임상 현장으로 발송된다. 한 제대혈 유닛으로부터의 CB-SC를 함유하는 하나의 장치가 각 대상체에 사용된다.
블라인딩
이 단일-아암 연구에서, 모든 대상체로부터 획득되고 농축된 MNC 생성물은 장치에 의한 오픈 라벨 처리를 받게 된다.
연구 절차 - 방문 1
등록을 위한 스크리닝:
첫째, 동의한 모든 대상체는 불연속 치료의 포함 및 배제 기준에 따라 등록 심사를 받는다. 환자가 American Diabetes Association의 2015년 진단 표준을 충족하고 혈액 검사 결과 췌장 섬 베타 세포 자체에 대한 적어도 하나의 자가항체가 존재하는 것으로 확인되면 환자는 등록 자격을 갖는다.
다른 면역 세포 마커에 의한 온혈구 계수(CBC).
EKG.
혈액 및 골수 이식 프로그램 SOP에 따른 정맥 평가. 성분채집술 유량을 유지할 수 있는 중심 정맥 카테터 배치를 위해 충분한 정맥 접근성이 없는 환자에 표시를 한다. 카테터 배치는 성분채집술 절차 전 5일 이내에 수행되고 교육된 MNC 생성물의 주입 후 제거된다.
특히 섬 세포 세포질(ICA), 인슐린 자가항체(IAA), 인슐린종-관련 항원-2(IA2), 글루탐산 데카르복실라제(GAD) 및 췌장 베타-세포-특이적 아연 수송체 ZnT8에 대한 자가항체의 존재에 대한 시험을 수행한다(표 4 참조).
감염성 질환 검사(HIV, HTLV, Hep B, cAB, Hep C ab를 수행한다.
기관 SOP에 따른 정맥 평가를 수행한다.
혼합 식사 내성 검사(MMTT): MMTT 검사는 대상체가 금식하는 동안 아침에 이루어져야 한다. 대상체는 물을 제외하고 자정 이후에 입으로 아무것도 소비하지 않는다(NPO). 단당류만을 함유하는 액체를 사용하여 연구 전 밤과 아침에 저혈당증을 치료하거나 예방할 수 있다. 검사 시작시 목표 혈당치는 T1 DM을 갖는 대상체의 경우 70 내지 200 mg/dL이어야 한다.
인슐린 적용: T1DM을 갖는 대상체는 검사 전날 저녁에 이들의 보통 인슐린 용량을 복용해야 한다. Lantus® 또는 Levemir®의 대상체는 평상시처럼 검사 전날 저녁 및 검사일 아침에 평상시 주사를 맞아야 한다. 지속적인 피하 인슐린 주입(CSII)되는 대상체는 검사 전날 밤에 평상시의 기본 설정을 계속해야 한다. 속효성 인슐린 유사체의 일반적인 용량은 검사 전날 저녁 자정까지 사용된다. 연구 시작시 혈당치를 <150 mg/dL로 달성하기 위해 필요한 경우 속효성 인슐린 유사체의 소량 교정 용량을 또한 시험 전 최대 4시간까지 사용할 수 있다. 중성 프로타민 Hagedorn(NPH) 인간 인슐린(rDNA 기원) 및 속효성 인슐린 유사체의 일반적인 용량은 검사일 아침에는 제공되지 않는다.
혈액 샘플링: 혈장 글루코스, c-펩티드 및 글루카곤의 측정을 위해 -10, 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 및 180분에 혈액을 얻는다. 품질 관리를 위한 분할-이중 샘플도 수집된다. IV 라인은 혈액 샘플링을 위해 한 팔에 삽입된다.
부스트 용량: 사용된 혼합 식사는 Boost High Protein Nutritional Energy Drink®(Mead-Johnson)이다.
MMTT는 수행하는데 180분이 걸린다. Boost High Protein Nutritional Energy Drink®(Mead-Johnson) 혼합 식사의 용량은 0분에 제공시 6kcal/kg(@ 1kcal/mL = 6mL/kg)이다. 상기 용량은 5분 이내에 소비되어야 한다.
연구 절차 - 방문 2
10명의 참가자는 부착성 UC-SC 세포를 포함하는 생물반응기로 단일 치료를 받는다.
연구 절차 - 방문 3
추적-검사 방문 1은 표 4에 따른 임상 평가(예를 들어, 공복 혈당, C-펩티드, HbA1C) 및 실험실 검사를 위해 치료 1개월(± 5일) 후에 예정된다.
연구 절차 - 방문 4
추적-검사 방문 2는 표 4에 따른 임상 평가(예를 들어, 공복 혈당, C-펩티드, HbA1C) 및 실험실 검사를 위해 치료 3개월(± 5일) 후에 예정된다.
연구 절차 - 방문 5
추적-검사 방문 3은 표 4에 따른 임상 평가(예를 들어, 공복 혈당, C-펩티드, HbA1C) 및 실험실 검사를 위해 치료 6개월(± 5일) 후에 예정된다.
연구 절차 - 방문 6
추적-검사 방문 4는 표 4에 따른 임상 평가(예를 들어, 공복 혈당, C-펩티드, HbA1C; 75 g-OGTT 및 MMTT 이후 C-펩티드 수준) 및 실험실 검사를 위해 치료 9개월(± 5일) 후에 예정된다.
연구 절차 - 방문 7
추적-검사 방문 5는 표 4에 따른 임상 평가 및 실험실 검사를 위해 치료 12개월(± 5일) 후에 예정된다.
통계 계획
통계적 방법
치료 의향 접근법을 사용하여, 10명의 환자가 불연속 요법을 사용한 치료를 받는다. 모든 환자는 안전성 분석에 포함된다.
일차 효능 종말점은 기준선과 추적-검사 사이의 C-펩티드 분비의 변화이다. 데이터의 통계적 분석은 Power and Precision software(www.power-analysis.com)를 사용하여 t-테스트에 의해 수행된다. 페어드 t 테스트는 기준선과 추적-검사 사이의 유의성을 연구하는데 사용된다. 공복 혈당치 및 혈장 C-펩티드 뿐만 아니라 경구 글루코스 부하 시험(OGTT) 또는 MMTT 이후 이들의 수준을 파라미터로 사용하여, 본 발명자들은 0.8 ng/mL의 효과 크기를 갖는 SCE 요법 후 차이를 2.5% 유의 수준, 80% 출력, 한 측면으로 검출하고자 한다. 본 발명자들의 계산에 따르면, 이 차이를 찾기 위해 10명의 대상체가 필요하다.
분석을 위한 대상체 집단(들)
모든 프로토콜-준수 대상체 집단은 안전성 분석에 포함된다. 일차 효능 종말점은 기준선과 추적-검사 사이의 C-펩티드 분비의 변화이다.
안전성 및 부작용 - 정의
다음 기준을 모두 충족하는 임의의 사건, 경험, 또는 결과:
· 특성, 중증도, 또는 빈도가 예상치 못한 경우(즉, IRB-승인된 프로토콜 또는 동의서 양식, 조사자 브로셔 등과 같은 연구-관련 문서에 기술되지 않음).
· 연구 참가와 관련되거나 관련이 있을 수 있음(즉, 관련이 있을 수 있다는 것은 사건 경험 또는 결과가 연구와 관련된 절차로 인해 야기되었을 합리적인 가능성이 있음을 의미한다.
· 심각함(하기 정의된 바와 같음) "심각한"은 AE에 등급을 적용하는 CTC 기준에 보고된 "중증도"와 다르다.
부작용
부작용(AE)은 연구 과정 동안 발생하거나 중증도가 심해지는 임의의 증상, 징후, 질병 또는 경험이다. 공존하는 질병 또는 부상은 부작용으로 간주되어야 한다. 진단 절차의 비정상적인 결과는 비정상적인 경우 부작용으로 간주된다.
· 연구 철회 발생.
· 심각한 부작용과 관련.
· 임상 징후 또는 증상과 관련.
· 추가 치료 또는 추가 진단 검사로 이어짐.
· 조사자에 의해 임상적 유의성이 있다고 간주됨.
심각한 부작용
부작용은 심각하거나 심각하지 않은 것으로 분류된다. 심각한 부작용은 다음과 같은 임의의 부작용이다:
· 치명적임.
· 생명을 위협함.
· 병원 입원을 필요로 하거나 연장시킴.
· 지속적이거나 중대한 장애 또는 무능력을 초래함.
· 선천성 이상 또는 출생 결함.
· 중요한 의료 사건.
중요한 의료 사건은 즉각적으로 생명을 위협하지 않을 수 있으나, 명백히 주요 임상적 유의성을 갖는 사건이다. 이들은 대상체를 위태롭게 할 수 있고, 상기 언급된 다른 심각한 결과 중 하나를 예방하기 위해 중재를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 약물 과용량 또는 남용, 입원-환자 입원으로 이어지지 않는 발작, 또는 응급실에서 기관지연축의 집중 치료는 전형적으로 심각한 것으로 간주된다. 심각성에 대한 임의의 기준을 충족하지 않는 모든 부작용은 심각하지 않은 부작용으로 간주되어야 한다.
부작용 보고 기간
부작용이 보고되어야 하는 연구 기간은 일반적으로 임의의 연구 절차의 개시로부터 연구 치료 추적-검사의 끝까지의 기간으로 정의된다. 본 연구를 위해, 연구 치료 추적-검사는 연구 치료제의 투여 후 30일로 정의된다. 심각한 부작용은 사건이 발생한 시점으로부터 7-10일 이내에 현지 IRB 및 FDA에 보고되어야 한다. 경미한 사건은 연례 보고서에 보고될 수 있다.
선재 조건
선재 상태는 연구가 시작될 때 존재하는 상태이다. 선재 상태는 연구 기간 동안 상태의 빈도, 강도, 또는 특성이 악화되는 경우 부작용으로 기록되어야 한다.
일반적인 신체 검사 결과
스크리닝시, 임의의 임상적으로 유의한 이상은 선재 상태로서 기록되어야 한다. 연구의 끝에, 부작용의 정의를 충족시키는 임의의 새로운 임상적으로 유의한 발견/이상이 또한 기록되고 부작용으로 기록되어야 한다.
연구 후 부작용
모든 미해결 부작용은 사건이 해결되거나, 대상체가 추적-검사에 실패하거나, 부작용이 달리 설명될 때까지 조사자가 지켜 보아야 한다. 마지막으로 예정된 방문시, 조사자는 각 대상체로 하여금 대상체 또는 대상체의 주치의가 본 연구의 참가와 합리적으로 관련이 있다고 생각하는 임의의 후속 사건(들)을 보고하도록 지시하여야 한다. 조사자는 연구 참가를 중단하거나 종료한 후 언제든지(6개월 추적-검사 동안) 본 연구와 합리적으로 관련이 있는 발생한 임의의 사망 또는 부작용을 연구 스폰서에게 알려야 한다. 조사자가 암의 발생 또는 본 연구에 참가한 대상체가 이후 임신한 자녀의 선천성 이상을 알게 된 경우 이를 또한 스폰서에게 알려야 한다.
비정상적인 실험실 값
다음 조건 중 임의의 하나가 충족되는 경우 임상 실험실 이상을 부작용으로 기록해야 한다:
· 실험실 이상은 이상을 확인하기 위해 반복 검사를 통해 달리 반박되지 않는다.
· 이상은 질병 및/또는 기관 독성을 시사한다.
· 이상은 능동적 관리가 요구되는 정도이다; 예를 들어, 용량의 변경, 약물의 중단, 더 빈번한 추적-검사 평가, 추가 진단 조사 등.
입원, 장기 입원 또는 수술
입원 또는 장기 입원을 초래하는 임의의 부작용은 본 프로토콜에서 특별히 달리 지시되지 않는 한 심각한 부작용으로 기록되어 보고되어야 한다. 상태가 부작용 기준 및 부작용을 충족시키는 경우 수술의 원인이 되는 모든 상태는 부작용으로 기록되어야 한다. 상태, 입원, 장기 입원, 또는 수술은 다음의 상황에서 부작용으로 보고되지 않는다:
· 선재 상태에 대한 진단적 또는 선택적 수술 절차를 위한 입원 또는 장기 입원. 수술은, 있더라도, 부작용의 결과로서 보고되어서는 안된다.
· 수술의 목적은 선택적이거나 진단적이었고 결과는 특별하지 않았다.
· 연구에 대한 효능 측정을 위해 요구되는 입원 또는 장기 입원.
· 임상 조사자에 의해 판단시 악화되거나 병원 입원의 빈도를 증가시키지 않는 한, 연구의 표적 질환의 요법을 위한 입원 또는 장기 입원.
부작용의 기록
중국인 및 백인 환자를 포함하는 200명 대상체의 임상 데이터에 기반하여 유의한 부작용은 생물반응기 장치를 사용한 폐쇄 루프 치료, 및 4년 동안 치료 후 추적-검사 연구 동안 나타나지 않았다. 어떤 참가자도 치료 과정에서 임의의 유의한 부작용을 경험하지 않았다. 대부분의 환자는 정맥천자 동안 가벼운 불편함과 성분채집술 동안 팔의 약간의 동통을 경험하였으나, 절차가 끝나면 불편함 및 동통은 신속하게 해소되었다. 4년 동안 폐쇄 루프 치료를 받은 후 모든 대상체에서 종양 형성 및 다른 안전성 문제는 없었다.
대상체와의 접촉이 있을 때마다, 조사자는 특정 질문 및, 적절한 경우, 검사에 의해 부작용에 대한 정보를 찾아야 한다. 모든 부작용에 대한 정보는 원본 문서 및 또한 사례 보고 양식(CRF)의 적절한 부작용 모듈에 즉시 기록되어야 한다. 모든 명백하게 관련된 징후, 증상, 및 이상 진단적 절차 결과는 원본 문서에 기록되어야 하지만, 1회 진단으로 그룹화되어야 한다.
연구 기간 동안 발생하는 모든 부작용이 기록되어야 한다. 해소, 안정화, 또는 연구 치료 또는 참가가 원인이 아닌 것으로 판단될 때까지 각 사건의 임상 경과를 추적하여야 한다. 연구 기간의 끝에 여전히 진행 중인 심각한 부작용은 최종 결과를 결정할 때까지 지켜보아야 한다. 연구 기간 후에 발생하고 연구 치료 또는 연구 참가와 아마도 관련이 있다고 여겨지는 임의의 심각한 부작용은 즉시 기록되고 보고되어야 한다.
심각한 부작용 및 예기치 않은 문제의 보고
조사자 및 프로토콜 스폰서는 이들이 책임지고 있는 다양한 실체의 부작용 보고 타임라인, 형식 및 요건을 준수해야 하지만, 보고되어야 하는 사건은 최소한 다음과 같다:
· 연구 참가와 관련됨,
· 예상치 못함, 그리고
· 대상체 또는 다른 사람에 대해 심각하거나 수반된 위험.
보고서가 서술로 제공되는 경우, 초기 보고서 작성시 제공되어야 하는 최소한의 필수 정보는 다음을 포함한다:
· 연구 식별자.
· 연구 센터.
· 대상체 번호.
· 사건의 설명.
· 시작 날짜.
· 현재 상태.
· 연구 치료가 중단되었는지 여부.
· 사건이 심각한 것으로 분류된 이유.
· 사건 및 연구 치료 간의 연관성에 대한 조사자 평가.
조사자 보고: 연구 스폰서에게 통보
대상체 또는 다른 사람에게 유해한 위험을 제기할 임의의 연구-관련된 예기치 못한 문제, 및 임의의 유형의 심각한 부작용은 사건 24시간 이내에 전화로 연구 스폰서에게 보고되어야 한다. 그러한 사건을 보고하기 위해, 심각한 부작용(SAE) 양식을 조사자가 작성하여 24시간 이내에 연구 스폰서에게 팩스로 보내야 한다. 조사자는 SAE 양식 사본을 연구 사이트에 파일로 보관한다.
다음 48시간 이내에, 조사자는 심각한 부작용 또는 예기치 못한 문제에 대한 추가 정보를 서면 서술의 형태로 제공하여야 한다. 이것은 완료된 심각한 부작용 양식의 사본, 및 사건의 이해를 돕기 위한 임의의 다른 진단 정보를 포함하여야 한다. 진행 중인 심각한 부작용에 대한 중요한 새로운 정보는 연구 스폰서에게 즉시 제공되어야 한다.
조사자 보고
보고 가능한 사망의 경우, IRB에 대한 초기 제출은 IRB 국장 또는 부국장과 연락하여 수행될 수 있다. AE/예기치 못한 문제 양식은 초기 제출에 대한 후속 조치로 필요하다.
다른 보고 가능한 사건:
임상 약물 시험을 위해, 다음의 사건들이 또한 IRB에 보고될 수 있다:
· 세밀한 분석 없이도, 약물 노출의 부재 하에 드문 심각한 예상치 못한 부작용(예를 들어, 무과립구증, 간 괴사, 스티븐스-존슨스 증후군)을 나타내는 임의의 불리한 경험.
· 스폰서가 조사자 브로셔, 프로토콜 또는 사전 동의서 양식을 수정하게 하거나, 인간 대상체의 보호를 보장하기 위해 IRB에 의한 다른 행동을 재촉할 임의의 부작용.
· 중증도 또는 빈도의 측면에서, 연구의 위험 또는 잠재적 이익에 변화를 나타내는 정보. 예를 들어:
- 중간 분석은 참가자가 처음 예상했던 것보다 치료에 대한 반응의 비율이 낮다는 것을 나타낸다.
- 안전성 모니터링은 특정 부작용이 처음에 예상했던 것보다 더 심각하거나 더 빈번하다는 것을 나타낸다.
- 당신의 조사 연구의 아암이 치료적 가치가 없다는 것을 보여주는 논문이 또 다른 연구로부터 발표되었다.
· 연구 프로토콜에 사용된 약물, 장치, 또는 생물학제의 마케팅으로부터 FDA 안전성 라벨링의 변화 또는 철회.
· 비밀 위반.
· 연구 참가자에 대한 명백한 즉각적인 위험을 제거하기 위해 사전 IRB 검토 없이 취해진 프로토콜에 대한 변경.
· 연구가 이전에 Subpart C에 의해 승인되지 않았고 조사자가 연구에 남는 것이 그 대상체의 최우선 관심사라고 여길 때 참가자의 감금.
· 불만이 예상치 못한 위험을 나타내거나 불만이 연구 팀에 의해 해결될 수 없을 때의 참가자의 불만.
· 조사자의 의견으로 한 명 이상의 참가자가 증가된 위험에 처했거나, 대상체의 권리 또는 복지에 영향을 주는 프로토콜 위반(IRB 승인된 프로토콜로부터 우연한 또는 의도치 않은 편차를 의미함).
임상 시설 연구 사이트에 가입하지 않은 조사자는 현지 IRB에 안전성 보고의 책임이 있다. 조사자는 현지 IRB의 보고 요건을 준수할 책임이 있지만, 늦어도 10 근무일 전에 IRB에 필요한 보고서를 제출하여야 한다. 각 보고서 사본 및 IRB 통지서 및 영수증에 대한 문서는 조사자의 연구 파일에 보관된다.
스폰서 보고: FDA에 통보
이 프로토콜이 FDA IND 하에 수행되는 경우, FDA에 특정 부작용 또는 예기치 못한 문제를 보고하는 것은 연구 규제 스폰서, 즉 IND 홀더의 책임이다.
연구 스폰서는 특정 연구 사건을 신속하게 FDA에 보고하여야 한다. 부작용에 대한 이러한 서면 통보를 IND 안전성 보고서라고 한다. 다음은 보고 및 관련 사건 유형에 대한 안전성 보고 요건을 타임라인으로 기술한다:
· 7일 이내
다음과 같은 임의의 연구 사건:
- 연구 약물의 사용과 관련됨
- 예상치 못함,
- 치명적이거나 생명을 위협함, 및
· 15일 이내
다음과 같은 임의의 연구 사건:
- 연구 약물의 사용과 관련됨
- 예상치 못함, 그리고
- 심각하지만, 치명적이거나 생명을 위협하지 않음 -또는-
- 초기에 보고 가능하다고 여겨지지 않았으나 나중에 보고 기준에 맞는 것이 발견된 이전의 부작용(사건이 보고 가능하다고 간주된 시점으로부터 15일 이내에 보고).
실험실 동물 시험으로부터의 모든 발견:
- 돌연변이유발성, 최기형성, 또는 발암성에 대한 보고를 포함하여 인간 대상체에 대한 유의한 위험을 제시.
스폰서는 또한 유사한 부작용에 관한 모든 이전 보고서를 IND 안전성 보고서에서 확인하고 이전 보고서에 비추어 현재 사건의 중요성을 분석할 것이 요구된다.
보고 프로세스
부작용은 FDA 양식 3500A 또는 서술 형식으로 제출될 수 있다. 서술 형식으로 제공되는 경우, 제공되어야 하는 최소 정보는 상기에 명시되어 있다.
스폰서 보고: 참가 조사자에게 통보
모든 참가 조사자에게 심각하고 예상치 못한 약물의 사용과 관련된 임의의 부작용 뿐만 아니라 인간 대상체에 대한 유의한 위험을 암시하는 실험실 동물 시험으로부터의 모든 발견을 서면 IND 안전성 보고서로 통보하는 것은 연구의 책임이다. 추가로, 스폰서는 또한 유사한 부작용에 관한 모든 이전 보고서를 IND 안전성 보고서에서 확인하고 이전 보고서에 비추어 현재 사건의 중요성을 분석할 것이 요구된다.
언블라인딩 절차
블라인드는 대상체의 의학적 관리에 필수적이거나, 진행 중인 시험의 수행을 위해 관련될 수 있는 치료에 대한 중요한 안전성 정보를 제공할 수 있는 경우(예를 들어, 모니터링, 사전 동의서) 심각하고 예상치 못한 사건으로 인해 깨질 수 있다. 드물게 필요한 것으로 여겨지는 경우에, 해당 환자의 치료 할당을 밝힐 수 있는 단계가 준비되어 있어야 한다. 그러한 사건을 보고하기 위해, 심각한 부작용(SAE) 양식을 작성하여야 한다. 이를 위해, 조사자는 치료가 언블라인딩되지 않은 모든 대상체를 스폰서에게 알려야 한다. 언블라인딩은 하루 24시간, 일주일에 7일이며; 스폰서의 통보는 전화 또는 팩스로 24시간 이내에, 이후 48시간 이내에 사건의 서면 서술로 진행된다.
중지 규칙
모든 환자가 1회 용량의 동일한 실험 치료를 받는 단일-아암 연구에서, 치료 안전성 및 효능을 평가한다. 일차 안전성 종말점 및 효능 종말점이 달성되었고/거나, 치료가 안전하고 효과적이라고 확인된 경우, 이에 따라 이 시험의 수행은 시험이 끝나는 상황 및 이후 취해질 조치를 정한 중지 규칙에 의해 중지될 수 있다.
의료 모니터링
현장에서 연구의 안전성을 감독하는 것이 주조사자의 임무이다. 안전성 모니터링은 상기 언급된 부작용의 신중한 평가 및 적절한 보고 뿐만 아니라 현장 데이터 및 안전성-모니터링 계획의 수립 및 시행을 포함한다(감사, 모니터링 및 검사 참조). 의료 모니터링은 심각한 부작용의 수 및 유형의 정기적인 평가를 포함한다.
내부 데이터 및 안전성 모니터링 위원회 또는 DSMP
새로운 프로토콜의 초기 검토는 후원 또는 지원과 무관하게, 각 시험이 데이터 및 안전성 모니터링에 대한 적절한 계획을 포함하는 것을 보장하기 위해 새로운 시험을 검토함에 있어 Institutional Review Board(IRB)의 책임이다. 데이터 및 안전성 모니터링 위원회(DSMB)는 연방, 기관 또는 산업 지원에 관계 없이 임상 시설 조사자가 서술한 모든 조사자-주도 시험(IIT)을 모니터링할 책임이 있다. 이것은 단일 현장 IIT는 물론 주조사자에 의한 데이터 관리 및 현장 조정과 함께 임상 시설 조사자에 의해 조정된 다센터 IIT를 포함하고 시설에서 수행된 임상 시험의 모든 단계를 포함한다. 임상 시설에서 DSMB의 구성원은 임상의, 생물통계학자, 생명윤리학자, 및 연구 과학자이다. 적절한 경우, 시험(예를 들어, 고 위험, 다센터)에 대한 외부/독립적 DSMB의 사용이 권장된다.
일단 시험이 내부 DSMB에 의해 모니터링에 적절하다고 판단되면, DSMB는 연구를 계속 검토하고 모니터링할 책임이 있다. DSMB의 검토 및 감독은 그러한 시험에 대한 IRB-승인된 프로토콜에 기록된다. DSMB는 언블라인드 분석에 의해 다음 정보를 검토함으로써 연구 진행 및 안전성에 대한 감독을 제공한다.
· 1) 발생 및 발생 잔류율.
· 2) 부작용(AE) 및 심각한 부작용(SAE)의 빈도 및 중증도.
· 3) 적절한 경우, 반응률.
· 4) 시험과 관련된 새로운 정보, 즉, 대상체 안전성 또는 윤리적 문제에 영향을 미칠 수 있는 공개된 과학 보고서 또는 다른 새로이 전개된 사건.
· 5) 연구 지속에 영향을 미칠 예상되는 위험/이익 비에 대한 임의의 변화.
· 6) 프로토콜 편차 및 위반.
· 7) 어떤 조사자 또는 연구원에 의한 심각한 오류 또는 잠재적인 위법 행위, 즉, 비밀 유지, 연구 사기에 속하는 사항.
· 8) 대상체 불만.
· 9) 이해 상충.
DSMB에 의한 시험 검토 타임라인은 IRB의 승인을 얻어 연구 착수시에 결정된다. 프로토콜에 필요한 DSMB 검토의 빈도(즉, 6개월, 매년)는 PRMS 관리자가 기록하고 예정된 DSMB 회의에 앞서 연구 팀에서 적절한 DSMB 제출 문서를 요청하기 위해 추적된다. 주조사자(PI) 및 임상 연구 조정자(CRC)에게 필요한 문서를 DSMB에 제출하기 위한 양식이 제공된다.
데이터 처리 및 기록 보관
비밀유지
연구 대상체에 대한 정보는 Health Insurance Portability and Accountability Act of 1996(HIPAA)의 요건에 따라 비밀로 유지되고 관리된다. 이러한 규정은 다음 사항을 대상체에게 알리는 서명된 대상체 승인을 요구한다.
· 누가 정보에 접근할 수 있으며 그 이유는 무엇인가.
· 누가 정보를 사용하거나 공개하는가.
· PHI 사용 승인을 취소할 수 있는 연구 대상체의 권리.
대상체가 PHI를 수집하거나 사용할 수 있는 승인을 취소한 경우, 조사자는 규정에 따라 대상체 승인의 취소 전에 수집된 모든 정보를 사용할 수 있는 권한을 보유한다. PHI를 수집하거나 사용할 수 있는 승인을 취소한 대상체의 경우, 예정된 연구 기간의 끝에 적어도 생체 상태(즉, 대상체가 살아 있음)를 수집할 수 있는 허락을 얻기 위한 시도가 이루어져야 한다.
원본 문서
원본 데이터는 시험의 재구성 및 평가에 필요한 임상 시험의 모든 정보, 임상 결과의 최초 기록, 관찰, 또는 다른 활동이다. 원본 데이터는 원본 문서에 포함되어 있다. 이러한 원본 문서 및 데이터 기록의 예는 병원 기록, 임상 및 사무실 차트, 실험실 기록, 메모, 대상체 일지 또는 평가 체크리스트, 약국 조제 기록, 자동화 장비로 기록된 데이터, 검증을 거쳐 정확하고 완전하다고 인정된 사본 또는 필사본, 마이크로피시(microfiches), 네거티브 사진(photographic negative), 마이크로필름 또는 자기 매체, x-선, 대상체 파일, 및 약국, 실험실, 및 임상 시험에 관여된 의학-기술 부서에 보관된 기록을 포함한다.
사례 보고 양식
연구 사례 보고 양식(CRF)은 연구의 주요 데이터 수집 도구이다. CRF에 요청된 모든 데이터가 기록되어야 한다. 누락된 모든 데이터를 설명하여야 하다. 절차가 수행되지 않았거나 질문하지 않았기 때문에 CRF 상에 공란이 있는 경우, "N/D"라고 쓴다. 항목이 개별 사례에 적용되지 않는 경우, "N/A"라고 쓴다. 모든 입력은 검정색 잉크로 읽기 쉽게 쓰여져야 한다. 임의의 입력 오류가 발생한 경우, 그러한 오류를 수정하려면, 잘못된 입력에 단일 직선을 긋고 그 위에 올바른 데이터를 입력한다. 그러한 모든 변경에는 이니셜을 표시하고 날짜를 기입하여야 한다. 오류를 지우거나 수정액으로 정정하지 마시오. 읽을 수 없거나 불확실한 입력을 명확히 하려면, 항목 위에 설명을 쓴 다음, 이니셜과 날짜를 기입한다.
기록 보존
해당 국가에서 마케팅 신청의 최종 승인을 받은 후 적어도 2년 동안 그리고 해당 국가에서 보류 중이거나 고려되는 마케팅 신청이 없거나 연구 제품의 임상 개발의 공식 중단 이후 적어도 2년이 경과할 때까지 연구에 필수적인 문서를 보관하는 것은 조사자의 책임이다. 이러한 문서는 스폰서와의 합의에 의해 요구될 경우 더 오랜 기간 동안 보관되어야 한다. 그러한 경우, 이들 문서를 더 이상 보관할 필요가 없을 때에 관해 조사자/기관에 알리는 것은 스폰서의 책임이다.
연구 모니터링, 감사, 및 검사
연구 모니터링 계획
본 연구는 모니터링 계획에 따라 모니터링된다.
조사자는 그러한 모니터링 활동에 적절한 시간을 할당한다. 조사자는 또한 모니터 또는 기타 준수 또는 품질 보증 검토자가 상기 언급된 모든 연구-관련 문서 및 연구 관련 시설(예를 들어, 약국, 진단 실험실 등)에 접근할 수 있고, 모니터링 방문을 수행하기 위한 적절한 공간이 있는지를 확인한다.
최종 방문은 마지막 대상체의 사례 보고 양식이 작성되고, 연구가 IRB/IEC 검토로 마감되고, 모든 규제 문제가 해결된 후에 발생한다. 이 방문에서 다음의 문제가 다루어진다: 모든 CRF가 완료되고 적절하게 파일링되었음, 모니터링 환자 기록부의 사본(수득됨, 연구 기록의 유지 및 보관.
요약하면, 모니터는 성공적인 연구 수행에 중요한 역할을 할 것이다. 모니터와 현장 직원 간의 관계는 참가자의 권리와 안전은 물론 데이터 품질 및 규제 당국의 모든 적용 가능한 규정의 준수를 보장하는 교육 및 지원을 제공하는 모니터와의 개방된 효과적인 의사소통을 통해 강화된다.
감사 및 검사
조사자는 모든 연구 관련 문서(예를 들어, 원본 문서, 규제 문서, 데이터 수집 장비, 연구 데이터 등)의 IRB, 스폰서, 정부 규제 기관, 및 임상 시설 준수 및 품질 보증 그룹에 의한 연구-관련 모니터링, 감사 및 검사를 허용한다. 조사자는 적용 가능한 연구-관련 시설(예를 들어, 약국, 진단 실험실 등)을 검사할 수 있는 권한을 보장한다.
본 연구에 조사자로서의 참가는 정부 규제 당국 및 적용 가능한 대학의 규정 준수 및 품질 보증 사무소에 의한 가능한 검사의 동의를 의미한다.
윤리적 고려사항
본 연구는 미국 및 Good Clinical Practice의 국제 표준(FDA Title 21 part 312 and International Conference on Harmonization guidelines), 적용 가능한 정부 규정 및 기관 연구 정책 및 절차에 따라 수행되어야 한다.
본 프로토콜 및 모든 개정안은 연구 수행의 공식 승인을 위해, 현지 법 규정에 따라, 적절하게 구성된 독립적인 Ethics Committee(EC) 또는 Institutional Review Board(IRB)에 제출된다. 연구 수행과 관련된 EC/IRB의 결정은 조사자에게 서면으로 작성되며 이 결정의 사본은 본 연구가 시작되기 전에 스폰서에게 제공된다. 조사자는 스폰서에게 EC/IRB 회원 및 그 계열사 목록을 제공하여야 한다.
이 연구의 모든 대상체에게는 본 연구를 설명하는 동의서가 제공되고 대상체가 본 연구의 참가에 대하여 정보에 입각한 결정을 내릴 수 있도록 충분한 정보를 제공한다.
본 발명은 특정 구체예를 참조하여 기술되었지만, 당업자는 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으며 다양한 변경이 이루어질 수 있고 등가물로 대체될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 특정 상황, 물질, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계를 본 발명의 객관적인 사상 및 범위로 채택하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 그러한 모든 변형은 여기에 첨부된 청구 범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (23)

  1. 순서대로:
    (1) 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병을 앓고 있는 대상체로부터 단핵 세포를 함유하는 전혈 샘플을 무균 조건 하에 획득하고;
    (2) (1)의 상기 전혈 샘플을 처리 시설로 수송하고;
    (3) 상기 전혈 샘플로부터 단핵 세포(MNC)를 무균 정제하여 단핵 세포 제조물을 형성하고;
    (4) 상기 단핵 세포 제조물을 부착성 제대혈 줄기 세포(UC-SC)의 생육가능 집단을 포함하는 생물반응기 장치에 도입하고, 이 때 상기 부착성 UC-SC는 적어도 80% 컨플루언트(confluent)이며;
    (5) 상기 단핵 세포 제조물 중의 상기 단핵 세포 및 상기 CB-SC가 적어도 0.1시간, 적어도 0.2시간, 적어도 0.3시간, 적어도 0.4시간, 적어도 0.5시간, 적어도 0.6시간, 적어도 0.7시간, 적어도 0.8시간, 적어도 0.9시간, 적어도 1.0시간, 적어도 1.5시간, 적어도 2시간, 적어도 2.5시간, 적어도 3시간, 적어도 3.5시간, 적어도 4시간, 적어도 4.5시간, 적어도 5시간, 적어도 5.5시간, 적어도 6시간, 적어도 6.5시간, 적어도 7시간, 적어도 7.5시간, 또는 적어도 8시간 동안 무균 조건 하에 상호작용할 수 있도록 상기 단핵 세포 제조물을 상기 CB-SC와 공동-배양하여 교육된 단핵 세포 생성물을 형성하고;
    (6) 상기 교육된 단핵 세포 생성물을 무균 조건 하에 상기 생물반응기 장치로부터 수확하고;
    (7) 적어도 104, 적어도 105, 적어도 106, 적어도 107, 적어도 108, 적어도 109, 또는 적어도 1010개 단핵 세포를 갖는 상기 교육된 단핵 세포 생성물의 순도, 무균성, 및 생육성 퍼센트를 확인하고;
    (8) 상기 교육된 단핵 세포 생성물을 상기 대상체로의 혈관내 주입을 위해 임상 시설로 수송하고; 그리고
    (9) 치료적 유효량의 상기 교육된 단핵 세포 생성물을 상기 대상체에 혈관내 주입하고; 그리고
    (10) 단계 (1) 내지 (9)를 순서대로, 대상체의 일생 동안 필요에 따라 복수의 주입 일에 반복하는 것을 포함하는 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병을 치료하는 방법으로서,
    여기서 치료적 유효량의 상기 교육된 단핵 세포 생성물이 상기 대상체의 T 세포 구획에서 자가반응성을 조절하고, 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병의 증상을 감소시키는데 효과적일 수 있는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 대상체가 백인인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병이 자가면역 질환인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 자가면역 질환이 당뇨병인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 자가면역 질환이 타입 1 당뇨병인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 자가면역 질환이 타입 2 당뇨병인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 제대혈 단핵 줄기 세포가 분리된 단핵 세포에 동종이계인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 순서대로:
    (a) 건강한 공여자에게서 얻은 새로운 제대혈 유닛을 수득하고;
    (b) 상기 제대혈로부터 단핵 세포 분획을 밀도 구배 원심분리에 의해 분리하고;
    (c) 적혈구를 제거하고;
    (d) 상기 UC-단핵 세포를 생리학적 완충 염수로 세척하고;
    (e) 생물반응기의 상기 UC 단핵 세포를 적어도 1x106개 세포의 시딩 밀도로 혈청-비함유 배양 배지에 시딩하고;
    (f) 혈청-비함유 배양 배지에서 상기 UC 단핵 세포를 배양하고, 비부착 세포를 제거하기 위해 2-3일마다 적어도 10일 동안 절반/배지를 변화시켜 적어도 80% 컨플루언스로 성장시키고; 그리고
    (g) (f)의 상기 컨플루언트 부착성 UC-SC의 샘플의 무균성 및 생육성을 평가하는 것을 포함하는 방법에 의해 UC-SC를 포함하는 생물의학적 장치를 제조하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  9. 치료량의 교육된 단핵 세포 생성물을 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 교육된 단핵 세포 생성물이,
    (1) 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병을 앓고 있는 대상체로부터 단핵 세포를 함유하는 전혈 샘플을 무균 조건 하에 획득하고;
    (2) (1)의 상기 전혈 샘플을 처리 시설로 수송하고;
    (3) 상기 전혈 샘플로부터 단핵 세포(MNC)를 무균 정제하여 단핵 세포 제조물을 형성하고;
    (4) 상기 단핵 세포 제조물을 부착성 제대혈 줄기 세포(UC-SC)의 생육가능 집단을 포함하는 생물반응기 장치에 도입하고, 이 때 상기 부착성 UC-SC는 적어도 80% 컨플루언트이며;
    (5) 상기 단핵 세포 제조물 중의 상기 단핵 세포 및 상기 CB-SC가 적어도 0.1시간, 적어도 0.2시간, 적어도 0.3시간, 적어도 0.4시간, 적어도 0.5시간, 적어도 0.6시간, 적어도 0.7시간, 적어도 0.8시간, 적어도 0.9시간, 적어도 1.0시간, 적어도 1.5시간, 적어도 2시간, 적어도 2.5시간, 적어도 3시간, 적어도 3.5시간, 적어도 4시간, 적어도 4.5시간, 적어도 5시간, 적어도 5.5시간, 적어도 6시간, 적어도 6.5시간, 적어도 7시간, 적어도 7.5시간, 또는 적어도 8시간 동안 무균 조건 하에 상호작용할 수 있도록 상기 단핵 세포 제조물을 상기 CB-SC와 공동-배양하여 교육된 단핵 세포 생성물을 형성하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산되고;
    여기서 치료적 유효량의 상기 교육된 단핵 세포 생성물이 상기 대상체의 T 세포 구획에서 자가반응성을 조절하고 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병의 증상을 감소시키는데 효과적이고,
    상기 교육된 단핵 세포 생성물이,
    (i) 적어도 1x108, 적어도 1x109, 또는 1x1010개 단핵 세포; 및
    (ii) TEM CD4+, TEM CD8+, TCM CD4+ CD45RA-CCR7+, TCM CD8+ CCR7+, TCM CD45RO+ CCR7+, TEM CD45RO+ CCR7-, TCM CD4+, TCM CD8+, 나이브 CD4+ CCR7+, 나이브 CD8+ CCR7+, 나이브 CD4+ CD45RA+ CCR7+, TEM CCR7+ CD4+, TEM CCR7+ CD8+, TEM CD45RO+ CD62L-, TEM CD8+ CCR7+, CD4+HLA-DR+ 및 CD8+HLA-DR+ 세포로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포의 조절된 집단을 포함하는, 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 교육된 단핵 세포 생성물이 미처리된 대조군과 비교하여 감소된 TEM CD4+ 세포의 하위집단 및 TEM CD8+ 세포의 하위집단을 포함하는 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 교육된 단핵 세포 생성물이 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 TCM CD4+ CD45RA-CCR7+ 세포의 하위집단 및 증가된 TCM CD8+ CCR7+ 세포의 하위집단을 포함하는 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 교육된 단핵 세포 생성물이 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 TCM CD45RO+ CCR7+ 세포의 하위집단을 포함하는 약학적 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 교육된 단핵 세포 생성물이 미처리된 대조군과 비교하여 감소된 TEM CD45RO+ CCR7- 세포의 하위집단을 포함하는 약학적 조성물.
  14. 제9항에 있어서, 교육된 단핵 세포 생성물이 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 TCM CD4+ 세포의 하위집단 및 TEM CD8+ 세포의 하위집단을 포함하는 약학적 조성물.
  15. 제9항에 있어서, 교육된 단핵 세포 생성물이 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 나이브 CD4+ CCR7+ T 세포의 하위집단 및 나이브 CD8+ CCR7+ T 세포의 하위집단을 포함하는 약학적 조성물.
  16. 제9항에 있어서, 교육된 단핵 세포 생성물이 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 나이브 CD4+ CD45RA+ CCR7+ T 세포의 하위집단을 포함하는 약학적 조성물.
  17. 제9항에 있어서, 교육된 단핵 세포 생성물이 미처리된 대조군과 비교하여 감소된 TEM CD4+ 세포의 하위집단 및 TEM CD8+ 세포의 하위집단을 포함하는 약학적 조성물.
  18. 제9항에 있어서, 교육된 단핵 세포 생성물이 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 TEM CCR7+ CD4+ 세포의 하위집단 및 TEM CCR7+ CD8+ 세포의 하위집단을 포함하는 약학적 조성물.
  19. 제9항에 있어서, 교육된 단핵 세포 생성물이 미처리된 대조군과 비교하여 감소된 CD4+HLA-DR+ T 세포의 하위집단 및 CD8+HLA-DR+ T 세포의 하위집단을 포함하는 약학적 조성물.
  20. 제9항에 있어서, 교육된 단핵 세포 생성물이 미처리된 대조군과 비교하여 증가된 TEM CD45RO+ CD62L- 세포의 하위집단을 포함하는 약학적 조성물.
  21. 제9항에 있어서, 림프구 자가반응성을 특징으로 하는 질병이 타입 1 당뇨병이고, 대상체의 T 세포 구획에서 조절된 자가반응성이 β-세포 기능의 개선을 포함하는 약학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, β-세포(bell) 기능의 개선이 혈청 C-펩티드 수준의 증가를 포함하는 약학적 조성물.
  23. 제9항에 있어서, 인슐린, 인슐린 유사체, 비구아니드, 티아졸리딘디온, 분비촉진제, 설포닐우레아, 비설포닐우레아 분비촉진제, 글리니드, 메트포르민, 알파-글루코시다제 억제제, 메글리티니드, 알파-글루코시다제 억제제, 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 모방체, 글루카곤-유사 펩티드1(GLP-1) 효능제, 아밀린 유사체, 디펩티딜 펩티다제-4 억제제, 인크레틴 모방체, 위장 억제 펩티드 유사체, 아밀린 유사체, 글리코수릭(glycosuric), 피나스테리드, 두타스테리드, 미녹시딜, 케토코나졸, 스피로노락톤, 플루타미드, 사이클로스포린, 클로베타솔, 항-CD3 항체, 인슐린 수용체의 소분자 활성제, 플루오시노니드 또는 이의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 치료제를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108888636A (zh) * 2018-08-14 2018-11-27 东营凤起生物科技发展有限公司 一种治疗糖尿病和动脉粥样硬化的方法
WO2020232247A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
CN111206019A (zh) * 2019-12-27 2020-05-29 广西医科大学 一种磁珠纯化高活性效应型t细胞方法
CN114740196B (zh) * 2022-04-08 2023-04-18 中南大学湘雅二医院 标志物及其在制备评价机体免疫功能的产品中的应用
CN115305234B (zh) * 2022-09-28 2023-01-17 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 一种制备间充质干细胞的方法、间充质干细胞和应用

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3262442D1 (en) 1981-10-06 1985-03-28 Univ Leland Stanford Junior Fluorescent conjugates for analysis of molecules and cells
US5055556A (en) 1981-10-06 1991-10-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. Univ. Fluorescent conjugates for analysis of molecules and cells
US4859582A (en) 1981-10-06 1989-08-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Fluorescent conjugates for analysis of molecules and cells
US4520110A (en) 1981-10-06 1985-05-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing a phycobiliprotein labeled ligand or receptor
US4965204A (en) 1984-02-06 1990-10-23 The Johns Hopkins University Human stem cells and monoclonal antibodies
US4714680B1 (en) 1984-02-06 1995-06-27 Univ Johns Hopkins Human stem cells
US5333675C1 (en) 1986-02-25 2001-05-01 Perkin Elmer Corp Apparatus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
US5656493A (en) 1985-03-28 1997-08-12 The Perkin-Elmer Corporation System for automated performance of the polymerase chain reaction
US5569587A (en) 1986-04-18 1996-10-29 Carnegie Mellon University Method for labeling and detecting materials employing luminescent arysulfonate cyanine dyes
US5268486A (en) 1986-04-18 1993-12-07 Carnegie-Mellon Unversity Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes
US5627027A (en) 1986-04-18 1997-05-06 Carnegie Mellon University Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods
US5637677A (en) 1987-07-16 1997-06-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Biologically active compounds and methods of constructing and using the same
US4876190A (en) 1987-10-21 1989-10-24 Becton Dickinson & Company Peridinin-chlorophyll complex as fluorescent label
US5723218A (en) 1990-04-16 1998-03-03 Molecular Probes, Inc. Dipyrrometheneboron difluoride labeled flourescent microparticles
US5234824A (en) 1990-11-13 1993-08-10 Specialty Laboratories, Inc. Rapid purification of DNA
US5187083A (en) 1990-11-13 1993-02-16 Specialty Laboratories, Inc. Rapid purification of DNA
US5187288A (en) 1991-05-22 1993-02-16 Molecular Probes, Inc. Ethenyl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes and their synthesis
US5776709A (en) 1991-08-28 1998-07-07 Becton Dickinson And Company Method for preparation and analysis of leukocytes in whole blood
US5262324A (en) 1991-11-06 1993-11-16 Mycogen Corporation Coleopteran-active Bacillus thuringiensis isolates and genes encoding coleopteran-active toxins
US20080299090A1 (en) * 2002-02-25 2008-12-04 Kansas State University Research Foundation Use Of Umbilical Cord Matrix Cells
US20050069546A1 (en) * 2003-09-30 2005-03-31 Yaron Ilan Educated NKT cells and their uses in the treatment of immune-related disorders
CN101326280A (zh) * 2005-10-13 2008-12-17 人类起源公司 使用胎盘干细胞的免疫调节
EP2510084B1 (en) * 2009-12-08 2020-02-05 The Board of Trustees of the University of Illionis Stem cell immune modulation methods of use and apparatus
CN104651307A (zh) * 2013-11-21 2015-05-27 孙勇 一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术
CN104721232B (zh) * 2015-02-10 2017-03-15 哈尔滨医科大学 脐带血免疫细胞在制备治疗银屑病药物中的应用
CN105154399A (zh) * 2015-02-17 2015-12-16 上海市胸科医院 一种培养***内自体cik细胞的方法及其用途

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