KR20190039696A - 뇌 전달 단백질 - Google Patents

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라스 란펠트
다그 셀린
그레타 훌트큐비스트
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바이오악틱 에이비
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Abstract

본 발명은 포유동물 뇌 속에서 표적에 결합하는 표적 결합 항체; 이의 각각이 혈액 뇌 관문(BBB) 내피 세포에서 발현된 단백질과 일가 상호작용할 수 있는, 2개의 담체 모이어티를 포함하는 뇌 전달 단백질에 관한 것이며, 여기서 각각의 상기 담체 모이어티는 표적 결합 항체의 C-말단 끝에 연결된다. 본 발명은 또한 예컨대, 신경변성 장애, 및 다른 뇌 질환의 치료요법 또는 진단 또는 연구에 있어서 이러한 뇌 전달 단백질의 용도에 관한 것이다.

Description

뇌 전달 단백질
본 발명은 혈액 뇌 관문을 가로지르는, 뇌 속에서 표적(target)에 결합하는, 항체와 같은 단백질의 수송을 가능하도록 하는, 뇌 전달 단백질에 관한 것이다.
혈액 뇌 관문(blood brain barrier: BBB)은 단단하게 연결된 내피 세포로 구성되며 뇌 밖의 작은 약물-유사 분자 및 단백질과 같은 보다 큰 분자 둘 다를 유지함으로써 뇌의 보호기관(protector)으로서 제공된다. 뇌 항상성에 필수적이지만, 이러한 관문의 존재는 뇌 속의 질환의 치료 및 진단에 대한 장애물이다. 예를 들면, BBB의 단단하게 연결된 내피 세포로 인하여 개질되지 않은 항체의 대략 0.1% 만이 뇌로 들어간다((Bard F. et al, Nat. Med. 6: 916-919 (2000)).
그러나, 혈액으로부터 BBB를 가로질러 뇌 속으로의 활성적인 수송이 일부 단백질의 경우 기술되어 왔다. 하나의 이러한 예는 BBB에 위치한 트랜스페린 수용체(TfR)를 통해 뇌로 철을 수송하는 트랜스페린이다. 트랜스페린-TfR 복합체는 BBB의 루미날 측면(luminal side)에서 형성되어 후속적으로 세포내이입(endocytosis)된다. 철은 pH가 더 낮은 엔도솜 내에서 트랜스페린으로부터 해리된다. 철이 결합되지 않은 트랜스페린인, 아포트랜스페린은 TfR에 대한 친화성이 낮으며 BBB의 앱루미날 측면(abluminal side)에서 철과 함께 방출된다. 트랜스페린뿐만 아니라 TfR에 결합하는 다른 단백질도 루미날로부터 BBB의 앱루미날 측면으로 세포내이입될 수 있으며 이러한 메카니즘을 이용하여 분자를 뇌로 활성적으로 수송할 수 있다(Boado RJ. et al, Biotechnol. Bioeng. 102: 1251-1258 (2009); Pardridge WM, Expert Opin. Drug Deliv. 12: 207-222 (2015)).
라이소좀 내에서의 분해를 피하기 위하여, TfR에 대한 단백질/항체 결합을 엔도솜 내에서 수용체로부터 해리시키는것이 필수적이다. TfR로부터의 해리는 pH 의존성 친화성을 나타내는 결합제에 대한 엔도솜내 낮은 pH 환경에 의해 촉진될 수 있는 것으로 제안되어 왔다(Sade H. et al, PLOS one 4: e96340 (2014)). 해리는 또한 TfR에 대한 전체적인 친화성이 중간이거나 낮은 경우에 더욱 더 그러하다(Yu YJ. et al, Sci. Transl. Med. 3: 84ra44 (2011)). 표적에 대한 2가 결합은 또한 불리한 것으로 밝혀졌다(Niewoehner J. et al, Neuron 81: 49-60 (2014)). 항체 해리는 2개의 에피토프(결합 부위), 즉 항원항체결합력(avidity) 효과로부터의 동시 해리를 필요로 하기 때문에 항체 2가 결합은 TfR로부터의 해리 율을 감소시킨다.
TfR 항체 8D3에 화학적으로 접합된, mAb158로 지칭된, 항-아밀로이드 β 프로토피브릴 항체로 이루어진 이특이적인 단백질은 이미 개시되어 있다(Sehlin D. et al, Nat. Commun. 7: 10759 (2016)). 이러한 단백질은 주사 후 3일째에 mAb158 보다 20배 더 높은 뇌-대-혈관 농도를 나타내었다. 증가된 비율은 mAb158과 비교하여 부분적으로 증가된 뇌 농도 및 부분적으로 혈액속의 감소된 반감기에 기인하는 것으로 밝혀졌다.
BBB 수용체에 대한 친화성이 낮은 항체는 제WO 2012/075037호에 이미 개시되어 있다. 더욱이, 이러한 공보는 추적 용량(trace dose)에서와 치료학적 용량에서의 투여 사이에서, TfR 및 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 절단 효소, 베타 세크레타제(BACE1) 둘 다를 결합시키는 이특이적인 항체(항-TfRA/BACE1)에 대한 뇌 흡수시 관찰된 차이를 개시하고 있다.
제WO 2014/033074호에는 BBB 항체 셔틀(antibody shuttle)의 다른 변이체가 개시되어 있다. BBB 셔틀은 뇌 효과기 실체(brain effector entity), 링커 및 TfR에 결합하는 하나의 1가 결합 실체를 포함하며, 여기서 링커는 효과기 실체를 TfR에 결합하는 1가 결합 실체에 커플링시킨다.
뇌 속에서 질환의 증진된 치료요법 및 진단을 제공하고, 조사 목적을 위하여, 흡수가 증진된 단백질/항체가 여전히 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 연구 목적을 위한 것 뿐만 아니라 뇌 속에서 질환을 치료 및 진단하기 위한 신규 단백질을 제공하는 것이다.
즉, 본 발명의 제1 국면은,
포유동물 뇌에서 표적에 결합하는 표적 결합 항체 또는 이의 단편;
각각이 혈액 뇌 관문(BBB) 내피 세포에서 발현된 단백질과 1가 상호작용할 수 있는, 2개의 담체 모이어티(carrier moiety)를 포함하는 뇌 전달 단백질을 제공하며,
여기서 상기 담체 모이어티 각각은 표적 결합 항체의 C-말단 끝에 연결된다.
본원에 개시된 바와 같은 뇌 전달 단백질은 2개 유형의 모이어티; 뇌 속에서 표적에 결합하는 표적 결합 항체 및 BBB를 가로질러 뇌 내로 뇌 전달 단백질의 수송을 가능하도록 하는 2개의 담체 모이어티를 포함한다. 담체 모이어티 둘 다는 BBB 내피 세포 상에서 단백질과 1가 상호작용하거나, 1가 결합할 수 있다. 1가 상호작용 또는 결합은 담체 모이어티와 BBB 내피 세포 상에서 발현된 단백질 사이의 상호작용이 하나의 단일 에피토프를 통해 일어남을 나타낸다. 뇌 전달 단백질의 구조로 인하여, 한번에 담체 모니어티 중 하나 만이 BBB 상에서 발현된 단백질에 결합할 수 있다. 이는 궁극적으로 BBB 단백질에 대한 2가의, 고 항원항체결합력을 방지하며, 보다 효율적인 BBB 이동을 생성하고, 또한 BBB 단백질의 어떠한 이량체화/구조 변화도 방지할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 2개의 담체 모이어티 중 하나는 BBB 내피 세포 상에서 발현된 상기 단백질에 동시에 결합한다. 따라서, BBB 내피 세포에서 발현된 단백질을 사용하는 것과 같이, 뇌 전달 단백질의 2가 상호작용이 가능하다.
따라서, 상기 BBB 단백질에 잠재적으로 결합할 수 있는 2개의 담체 모니어티를 가짐에도 불구하고 1가 결합을 유지함으로써, BBB를 가로지르는 수송 효율을 증가시킬 수 있다. 표적 결합 항체에 연결된 2개의 담체 모이어티를 가짐으로써, BBB 세포 상에서 발현된 단백질에 대한 이용가능한 결합 부위의 수는 하나 만의 담체 모이어티를 포함하는 뇌 전달 단백질과 비교하여 2배가 될 것이다. 더욱이, 마우스에서 수행된 용량 실험은 2개의 담체 모이어티를 포함하는 본 발명에 따른 뇌 전달 단백질이 치료 용량 및 추적 용량 둘 다에서 뇌 흡수를 증진시킴을 입증하였다(실시예 2). 실시예 2에서 연구된 구체적인 뇌 전달 단백질인, 2개의 단일 쇄 TfR 결합 항체(scFv8D3)를 지닌, RmAb158-scFv8D3은 담체 모이어티가 없는 "네이키드(naked)" 표적 결합 항체(RmAb158)의 뇌 흡수와 비교하여, 추적 용량으로 주사한 지 2시간 후 대략 80배까지 뇌 흡수를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 유사한 결과가 RmAb48-scFv8D3에 대해 수득되었다(실시예 5). 치료 용량에서 RmAb158-scFv8D3의 뇌 흡수는 상응하는 네이키드 표적 결합 항체의 뇌 흡수보다 10배 더 높은 것으로 밝혀졌다. 이러한 차이는 적어도 부분적으로, 2개의 TfR 결합 모이어티를 갖는 뇌 전달 단백질에 의존할 수 있다는 가설이 세워진다. 비교시, 선행 기술의 뇌 셔틀은 추적 용량에서 항-TfR 항체의 흡수를 대략 40배 증가시키는 것을 입증하였으나, 치료 용량에서 동일한 셔틀의 뇌 흡수는 1.4배 만이 증가된다(Yu et al, supra, (2011)). 이는 치료학적 용량에서 TfR 시스템이 포화되기 시작함에 기인할 수 있다. 그러나, 유사한 결과가 BBB 셔틀로서 CD98을 기준으로 한 뇌 셔틀의 경우 이미 발표되었다. 추적 용량에서 흡수는 CD98이 없는 항체보다 80배 더 높은 것으로 밝혀졌지만 치료 용량에서 이는 단지 3.2배가 더 높았다(Zuchero YJY. et al, Neuron 89: 70-82 (2016)).
본원에 개시된 바와 같은 뇌 전달 단백질의 담체 모이어티는 표적 결합 항체의 C-말단 끝에서 표적 결합 항체에 연결되어 있다. 담체 모이어티는 바람직하게는 표적 결합 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 끝에 위치한다. 바람직하게는, 담체 모이어티는 표적 결합 항체의 별도의 쇄, 바람직하게는 별도의 경쇄 또는 별도의 중쇄에 연결된다.
일 구현예에 따라서, 상기 담체 모이어티 각각은 링커에 의해 표적 결합 항체에 연결된다. 담체 모이어티를 표적 결합 항체에 연결시키기 위한 링커는 동일하거나 상이할 수 있는데, 즉, 이들은 동일한 길이 및/또는 아미노산 서열을 가질 수 있거나, 이들은 상이한 길이 및/또는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특히, 각각의 상기 담체 모이어티와 관련하여, 상기 링커 각각은 개별적으로 1 내지 30개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 내지 25개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 내지 19개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 3 내지 19개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 3 내지 15개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 5 내지 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다. 링커의 하나의 예는 11개의 아미노산을 갖는 링커이다. 이러한 링커 길이는 첨부된 실시예에서 사용되었다. 따라서, 상기 링커는 바람직하게는 비교적 짧은 펩타이드이다. 그러나, 링커의 길이는 표적 결합 항체 상의 링커의 구체적인 위치에 따라 상이할 수 있다. 짧은 링커는 담체 모이어티가 내피 BBB 세포 상에서 발현된, 단백질, 예컨대, 이량체성 수용체에 이가 결합하기 위해 추가로 입체적으로 장애될 수 있다는 점에서 유리할 수 있다. 이가 결합(bivalent binding)과 비교하여, BBB 내피 세포에서 발현된 단백질과의 1가 결합은 BBB를 가로질러 증진된 전달을 제공할 수 있다. 2가 결합은 해리 속도를 감소시키며, 이는 궁극적으로 결합 가능성 및 따라서 결합 시간, 즉, 감소된 BBB 수송으로 이끄는 항원항체결합력 효과를 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 상기 2개의 담체 모이어티 각각은 표적 결합 항체의 경쇄의 C-말단 끝에 연결된다. 특히, 짧은 펩타이드 링커, 예컨대, 1 내지 30개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드를 포함하는 각각의 링커에 의해 상기 표적 결합 항체에 연결된 2개의 담체 모이어티를 포함하는 뇌 전달 단백질은 여전히 BBB 내피 세포 상에서 발현된 단백질과 1가 상호작용할 수 있다. 예를 들면, 각각의 링커는 1 내지 25개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 19개의 아미노산, 보다 바람직하게는 5 내지 19개의 아미노산을 갖는 펩타이드를 포함할 수 있다. 각각의 담체 모이어티를 표적 결합 항체의 경쇄의 C-말단 끝에 연결시키기 위한 링커의 비-제한적 예는 길이가 11개 아미노산 잔기인 링커이다. 이러한 링커는 첨부된 실시예에 개시되어 있다. 담체 모이어티를 표적 결합 항체와 연결시키기 위한 링커는 동일하거나 상이할 수 있음이, 즉, 이들이 동일한 길이 및/또는 아미노산 서열을 가지거나, 이들이 상이한 길이 및/또는 아미노산 서열을 가질 수 있음은 이해되어야 한다.
일 구현예에서, 각각의 상기 2개의 담체 모이어티는 표적 결합 항체의 중쇄의 C-말단 끝에 연결된다. 특히, 짧은 펩타이드 링커, 예컨대, 1 내지 19개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드를 포함하는 각각의 링커에 의해 상기 표적 결합 항체에 연결된 2개의 담체 모이어티를 포함하는 뇌 전달 단백질은 여전히 BBB 내피 세포 상에서 발현된 단백질과 1가 상호작용할 수 있다. 예를 들면, 각각의 링커는 1 내지 19개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 15개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산을 갖는 펩타이드를 포함할 수 있다. 담체 모이어티를 표적 결합 항체와 연결시키는 링커는 동일하거나 상이할 수 있음이, 즉, 이들이 동일한 길이 및/또는 아미노산 서열을 가지거나, 이들이 상이한 길이 및/또는 아미노산 서열을 가질 수 있음은 이해되어야 한다.
일 구현예에서, 제1 담체 모이어티는 표적 결합 항체의 중쇄의 C-말단에 연결되며, 제2 담체 모이어티는 표적 결합 항체의 경쇄의 C-말단 끝에 연결된다. 담체 모이어티를 표적 결합 항체와 연결시키는 링커는 동일하거나 상이할 수 있음이, 즉, 이들이 동일한 길이 및/또는 아미노산 서열을 가지거나, 이들이 상이한 길이 및/또는 아미노산 서열을 가질 수 있음은 이해되어야 한다. 링커의 길이의 예는 본원의 관련된 구현예에 개시되어 있다.
첨부된 실시예에 개시된 바와 같이, 2개의 담체 모이어티(scFv8D3)를 표적 결합 항체(RmAb158)의 경쇄의 C-말단 끝에 연결시키는, 비교적 짧은 펩타이드 링커는 BBB(TfR 이량체)에서 발현된 단백질에 대한 이가 결합을 입체적으로 방해하는 것으로 밝혀졌다. 첨부된 실시예에서 사용된 펩타이드 링커는 굴곡성이며 친수성이고, 11개의 아미노산 잔기를 함유하였다. 따라서, 본 발명에 따른 뇌 전달 단백질에서 사용될 수 있는 링커의 하나의 비-제한적인 예는 아미노산 서열 APGSYTGSAPG(서열 번호 1)을 갖는 펩타이드를 포함하는 링커이다. 상이한 길이 및 아미노산 서열을 갖는 의 펩타이드 링커는 또한 본 개시내용에 포함된다. 기술자는 대안적인 링커 서열을 설계하는 방법, 즉, 예컨대 소수성 및 굴곡성의 측면에서 유사한 특성을 가진/제공하는 대안적인 아미노산 잔기를 선택하는 방법을 이해할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 링커는 굴곡성이다. 굴곡성 링커는 작은 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 굴곡성 펩타이드 링커의 비-제한적 예는 글리신이 풍부한 링커이다. 일 구현예에서, 상기 링커는 친수성이다. 따라서, 친수성 링커는 전형적으로 친수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 링커는 2개의 프롤린 잔기와 같은, 적어도 하나의 프롤린 잔기를 포함하는 펩타이드를 포함한다. 이러한 프롤린 잔기(들)은 바람직하게는 링커 서열의 C- 및/또는 N-말단 끝 근처에 위치한다.
용어 "항체"는 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 및 완전한 길이(full length)의 IgG 및 다른 항체 동형 및 아형과 같은 완전한 길이의 항체 둘 다를 포함하여, 이의 최광의의 의미로 본원에 사용된다. 완전한 길이의 항체는 항원-결합 가변 영역 및 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 항체로 이해되어야 한다. 용어 "항체"에는 또한 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편과 같은 항체 단편이 포함된다. scFv, Fv, sFab, VHH 또는 VNAR과 같은 이의 단일 쇄 단편이 또한 본원에 사용된 용어에 포함된다. 따라서, 일 구현예에서 표적 결합 항체는 상술한 바와 같은 항체 및 이의 단편으로부터 선택된다. 본원에 지칭된 바와 같은 항체는 바람직하게는 인간화된 항체이다.
일 구현예에서, 각각의 상기 담체 모이어티는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 상기 항체 단편은 scFv, Fv, scFab, 또는 VHH; 트랜스페린 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체, 또는 스타필로코쿠스 단백질의 도메인 B로부터 기원한 단백질 Z의 변이체로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항체 단편은 바람직하게는 인간화된다.
일 구현예에서, 각각의 상기 담체 모이어티는 scFv를 포함한다. 항체의 단일 쇄 단편을 사용함으로써, 뇌 전달 단백질의 제조는 예를 들면, 단순화될 수 있다.
BBB 내피 세포에서 발현된 몇가지 상이한 단백질이 표적 결합 항체에 대한 뇌로의 수송 경로로서 이용될 수 있음이 이해되어야 한다. 이러한 수송 경로는 예컨대, BBB를 가로지르는 항체의 전달을 위한 수용체-매개된 통과세포외배출(transcytosis)을 이용할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, BBB 내피 세포에서 발현된 상기 단백질은 트랜트페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체(InsR), 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 저 밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질 8(Lrp8), 저 밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질 1(Lrp1), CD98, 전이막 단백질 50A(TMEM50A), 글루코즈 수송인자 1(Glut1), 바시긴(BSG) 및 헤파린-결합 상피 성장 인자-유사 성장 인자로부터 선택된다. 바람직하게는, BBB 내피 세포에서 발현된 상기 단백질은 TfR, InsR, Lrp1, CD98, Glut1 및 BSG로부터 선택된다. 일 구현예에서, BBB 내피 세포에서 발현된 상기 단백질은 TfR이다. 일 구현예에서, BBB 내피 세포에서 발현된 상기 단백질은 InsR이다. 일 구현예에서, BBB 내피 세포에서 발현된 상기 단백질은 Lrp1이다. 일 구현예에서, BBB 내피 세포에서 발현된 상기 단백질은 CD98이다. 일 구현예에서, BBB 내피 세포에서 발현된 상기 단백질은 Glut1이다. 일 구현예에서, BBB 내피 세포에서 발현된 상기 단백질은 BSG이다.
따라서, 상기 2개의 담체 모이어티 각각은 상기 예시된 바와 같이, BBB 내피 세포에서 발현된 단백질과 일가 상호작용할 수 있음을 이해하여야 한다. 특히, 각각의 상기 담체 모이어티는 예를 들면, TfR, InsR, Lrp1, CD98, Glut1 또는 BSG와 상호작용할 수 있는 항체 또는 단백질일 수 있다. 일 구현예에서, 각각의 상기 담체 모이어티는 TfR에 대해 지시된 항체 단편이다. 항-TfR 결합 항체의 예는 8D3이다. 가변 도메인(scFv8D3)의 단일 쇄 단편은, 첨부된 실시예에 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 뇌 전달 단백질의 예에서 유리한 것으로 입증되었다.
일 구현예에서, 각각의 상기 담체 모이어티는 TfR에 대해 저-내지-중간 친화성을 갖는 항-TfR 항체이다. TfR에 대해 저-내지-중간 친화성을 갖는 항-TfR 항체는, 고 친화성 대응물과 비교하여, 뇌 흡수 및 뇌 전달 단백질의 분포를 증진시킬 수 있는데, 이는 TfR 시스템이 무엇보다도 외견상 치료학적 용량으로 포화되어 있기 때문이다. 반면 치료 복용량에서 항-TfR 항체의 고-친화성 변이체는 TfR 시스템을 포화시킬 수 있으며, 낮거나 중간인 친화성의 항-TfR 변이체 항체는 동일한 복용량에서 이러한 TfR 포화를 피할 수 있다. 또한, 낮거나 중간인 친화성 변이체는 고 친화성 변이체와 비교하여, 엔도솜 내에서 봉입(encapsulation) 후 보다 신속하게 방출될 수 있다. 고 친화성 변이체는 전혀 방출되지 않을 수 있으므로 이는 단백질의 분해(degradation)를 초래할 수 있다. 더욱이, TfR에 대한 친화성이 거의 없는 항체는 TfR에 대한 친화성이 보다 높은 것들과 같이 효율적으로 시스템으로부터 처리되지 않으므로 이들의 고 친화성 대응물보다 더 높은 농도에서 순환시 잔존할 수 있다. 예를 들면 항-TfR 담체 항체의 낮거나 중간인 친화성 변이체는 TfR에 대해 1 내지 10 μM 범위의 결합 친화성을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 표적 결합 항체는 완전한 길이의 항체, Fab, F(ab')2 또는 Fv이다. 일 구현예에서, 상기 표적 결합 항체는 완전한 길이의 항체이다.
상기 개시된 바와 같은 2개의 담체 모이어티를 포함하는 뇌 전달 단백질은 또한 제조 관점에서 유리한 것으로 입증될 수 있는데, 이는 2개의 동일한 경쇄를 포함하는 뇌 전달 단백질을 기반으로 한 항체의 생성이 2개의 상이한 경쇄(즉, 연결된 담체 항체를 지닌 것 및 지니지 않은 것)를 지닌 항체의 생산과 비교하여 보다 높은 수율로 생산되는 경향이 있기 때문이다.
본 발명에 따른 뇌 전달 단백질은 인간 또는 동물 뇌와 같은 포유동물의 목적한 임의의 표적에 대해 결합 친화성을 갖는 표적 결합 항체를 포함할 수 있다. 뇌 표적은 특히 조사 목적, 치료요법 또는 진단을 위한 관심있는 표적, 예를 들면, 뇌 장애, 특히 신경변성 장애와 관련된 표적일 수 있다. 일 구현예에서, 뇌 속의 상기 표적은 아밀로이드 β(Aβ) 펩타이드, 알파 시누클레인, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 헌팅틴, 트랜스씨레틴(transthyretine), P-세크레타제 1, 상피 성장 인자, 상피 성장 인자 수용체 2, Tau, 포스포릴화된 Tau, 아포지질단백질 E4, CD20, 프리온 단백질, 류신이 풍부한 반복 키나제 2, 파킨(parkin), 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, 사멸 수용체 6, 아밀로이드 전구체 단백질, p75 뉴로트로핀 수용체, 뉴레굴린 및 카스파제 6으로부터 선택된다.
알츠하이머 질환(Alzheimer's disease: AD)은 가장 일반적인 신경변성 장애 중의 하나이다. 다수의 시험이 자가-응집 단백질 아밀로이드-β(Aβ)를 표적화하는 항체로 수행되어 왔다. Aβ의 피브릴 침착물로 이루어진 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)가 AD의 특징이지만, 사후 AD 뇌 조직 및 CSF에서 측정된, 가용성 Aβ, 특히 올리고머 및 프로토피브릴은 질병 진행과 더 관련되어 있고 시냅스 및 뉴우런에 유해한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 가용성 Aβ 조립체는 Aβ 특이적인 항체를 사용한 면역치료요법에 적합한 표적이다. 따라서, 일 구현예에서, 상기 뇌 표적은 Aβ 펩타이드이다. 특수한 구현예에서, 상기 Aβ 펩타이드는 바람직하게는 올리고머 및 프로토피브릴(protofibril)로부터 선택된 가용성 Aβ 응집체이다. 프로토피브릴에 결합하는 항-Aβ 항체의 예 및 이의 생산 방법은 제WO　2002/03911호, 제WO　2005/123775호, 제WO　2007/108756호, 제WO　2011/001366호, 및 제WO　2016/005466호에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. mAb158로 지칭된 잘 연구된 마우스 모노클로날 항체, 및 Aβ 프로토피브릴에 결합하는 BAN2401로 지칭된 이의 인간화된 형태는 예컨대, 제WO　2007/108756호에 개시되어 있다. 또한, Aβ 단백질 전구체에 대해서는 친화성이 없다. BAN2401의 돌연변이된 변이체는 제WO　2016/005466호에 개시되어 있다. 첨부된 실시예에서 표적 결합 항체로서 사용된, RmAb158은 동일한 Aβ 결합 특성을 지닌 mAb158의 재조합 버젼(recombinant version)이다.
외상성 뇌 손상(TBI), 루이체 치매(Lewy body dementia: LBD), 다운 증후군(Down syndrome: DS), 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 전측두엽 치매, 타우병증(tauopathy), 전신아밀로이드증, 죽상경화증 및 파킨슨 질환 치매(Parkinson's disease dementia: PDD)와 같은 Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 장애가 존재한다. Aβ 펩타이드에 대한 친화성을 갖는 표적 결합 항체를 포함하는 뇌 전달 단백질은 예컨대, 이러한 장애의 치료요법 또는 진단시 유용한 것으로 입증될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 Aβ 결합 항체, 및 2개의 담체 모이어티를 포함한다. Aβ 결합 항체는 구체적으로 상기 언급된 선행기술의 공보 중 어느 하나에 개시된 바와 같은 mAb158/BAN2401 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체와 같은, Aβ 프로토피브릴에 대해 결합 특이성을 갖는 항체일 수 있다. 특수한 구현예에서, 이러한 뇌 전달 단백질은 2개의 담체 항체를 포함하며, 각각은 링커에 의해 Aβ 결합 항체의 (별도의) 경쇄의 C-말단 끝에 연결되어 있다. 각각의 담체 모이어티는 예를 들면, 서열 번호 1로 제시된 바와 같은 링커에 의해 표적 결합 모이어티에 임의로 연결된, scFv8D3와 같은, 본원에 정의된 바와 같은 항-TfR 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 Aβ 결합 항체는 mAb158/BAN2401 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체이며 각각의 상기 담체 모이어티는 scFv8D3이고, 여기서 각각의 상기 scFv8D3은 상기 mAb158/BAN2401 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체의 경쇄의 C-말단 끝에 연결되며, 상기 단백질은 임의로 또한 2개의 링커를 포함하고, 각각의 링커는 상기 scFv8D3를 상기 mAb158/BAN2401 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체에 연결시키기 위한, 서열 번호 1로 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 뇌 표적은 알파 시누클레인이다. 파킨슨 질환(PD) 및 루이체 치매(Lewy body dementia: LBD)는 알파 시누클레인 뇌 병리학을 지닌 신경변성 장애의 2개의 가장 우세한 예이다. 다른 예는 알츠하이머 질환의 루이체 변이체, 다계통 위축증, 정신병, 조현병, 및 크로이츠펠트 야곱병(Creutzfeldt-Jakob disease)을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 알파 시누클레인은 바람직하게는 올리고머 및 프로토피브릴로부터 선택된 가용성 알파 시누클레인이다. 알파 시누클레인에 결합하는 표적 결합 항체는 특히 인간 알파 시누클레인 프로토피브릴에 대해 고 친화성 및 알파 시누클레인 단량체의 낮은 결합을 가질 수 있다. 항-알파 시누클레인 항체의 구체적인 예는 제WO 2009/133521호, 제WO 2011/104696호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 알파 시누클레인 결합 항체, 및 2개의 담체 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 알파 시누클레인 결합 항체는 인간 알파 시누클레인 프로토피브릴에 결합하며, 바람직하게는 상기 알파 시누클레인 결합 항체는 알파 시누클레인 단량체에 결합하지 않는다. 알파 시누클레인 결합 항체는 상기 언급한 선행 분야 참고문헌 중 어느 하나에 개시된 바와 같은 항체 또는 항체 변이체일 수 있다. 알파 시누클레인 결합 항체의 하나의 예는 mAb48, 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체이다. mAb48은 제WO 2011/104696호에 개시되어 있으며 "48B11/8"로 표시되어 있고 특히 31 및 32면의 표 1 및 표 2에 기술되어 있다. 특수한 구현예에서, 이러한 뇌 전달 단백질은 2개의 담체 항체를 포함하며, 각각은 링커에 의해 알파 시누클레인 결합 항체의 C-말단 끝에 연결되어 있다. 각각의 2개의 담체 모이어티는 예를 들면, 서열 번호 1로 제시된 링커에 의해 표적 결합 모이어티에 임의로 연결된, scFv8D3와 같은, 항-TfR 항체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 알파 시누클레인 결합 항체는 mAb48 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체이고 각각의 상기 담체 모이어티는 scFv8D3이며, 여기서 각각의 상기 scFv8D3은 상기 mAb48 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체의 C-말단 끝에 연결되어 있으며, 상기 단백질은 임의로 또한 2개의 링커를 포함하고, 각각의 링커는 상기 scFv8D3를 상기 mAb48 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체에 연결시키기 위해, 서열 번호 1로 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 뇌 표적은 SOD이다. SOD 지시된 항체를 포함하는 뇌 전달 단백질은 예컨대, ALS의 치료 및 진단시 유용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 뇌 표적은 헌팅틴(huntingtin)이다. 헌팅틴에 대해 지시된 항체를 포함하는 뇌 전달 단백질은 예컨대, 헌팅틴 질환의 치료 및 진단에 유용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 뇌 표적은 트랜스씨레틴이다. 트랜스씨레틴에 대해 지시된 항체를 포함하는 뇌 전달 단백질은 예컨대, 가족성 아밀로이드 신경병(familial amyloid neuropathy)의 치료 및 진단시 유용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 표적 결합 항체는 인간화된 항체이다.
일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 재조합체이다.
일 구현예에서, 상기 단백질은 융합 단백질이다. 특히, 상기 단백질은 융합 단백질로 발현될 수 있다.
관련 국면에서, 후술된 청구범위 중 어느 하나에 따른 단백질을 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터는 예를 들면, 숙주 세포내에서의 발현에 의해 뇌 전달 단백질의 생산을 가능하도록 할 수 있다.
본 발명에 따른 뇌 전달 단백질은 치료제 또는 진단제로서 또는 조사 도구로서, 예컨대, PET 또는 SPECT 리간드로서 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 예방 또는 치료요법에 사용하기 위한 것이다. 예를 들면, 상기 뇌 전달 단백질은 신경변성 장애와 같은 뇌 장애의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 알츠하이머 질환 및, 외상성 뇌 손상(TBI), 루이체 치매(LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전측두엽 치매, 타우병증, 전신아밀로이드증, 죽상경화증 및 파킨슨 질환 치매(PDD)와 같은 Aβ 단백질 응집과 연관된 다른 장애; 알츠하이머 질환의 루이체 변이체; 다계통 위축증; 정신병; 조현병; 크로이츠펠트 야곱병; 헌팅톤 질환, 및 가족성 아밀로이드 신경병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경변성 장애의 치료 및/또는 예방시 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 알츠하이머 질환의 치료 및/또는 예방시 사용하기 위한 것이다. 특히, 이러한 뇌 전달 단백질은 Aβ 펩타이드, 바람직하게는 올리고머 및/또는 프로토피브릴과 같은 Aβ 펩타이드의 가용성 형태에 결합하는 표적 결합 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 파킨슨 질환의 치료 및/또는 예방시 사용하기 위한 것이다. 특히, 이러한 뇌 전달 단백질은 알파 시누클레인, 바람직하게는 올리고머 및/또는 프로토피브릴과 같은 알파 시누클레인의 가용성 형태에 결합하는 표적 결합 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 생체내(in vivo) 진단시 사용하기 위한 것이다. 예를 들면, 상기 뇌 전달 단백질은 신경변성 장애와 같은 뇌 장애의 생체내 진단시 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 알츠하이머 질환 및, 외상성 뇌 손상(TBI), 루이체 치매(LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전측두엽 치매, 타우병증, 전신아밀로이드증, 죽상경화증 및 파킨슨 질환 치매(PDD)와 같은 Aβ 단백질 응집과 연관된 다른 장애; 알츠하이머 질환의 루이체 변이체; 다계통 위축증; 정신병; 조현병; 크로이츠펠트 야곱병; 헌팅톤 질환, 및 가족성 아밀로이드 신경병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경변성 장애의 생체내 진단시 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 알츠하이머 질환의 생체내 진단시 사용하기 위한 것이다. 특히, 이러한 뇌 전달 단백질은 Aβ 펩타이드, 바람직하게는 올리고머 및/또는 프로토피브릴과 같은, Aβ 펩타이드의 가용성 형태에 결합하는 표적 결합 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 파킨슨 질환의 치료시 사용하기 위한 것이다. 특히, 이러한 뇌 전달 단백질은 알파 시누클레인, 바람직하게는 올리고머 및/또는 프로토피브릴과 같은, 알파 시누클레인의 가용성 형태에 결합하는 표적 결합 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 PET를 사용한 생체내 진단시 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 상기 뇌 전달 단백질은 또한 뇌에서 상기 단백질을 검출할 수 있도록 하는 표지를 추가로 포함한다. 이러한 맥락에서, 표지는 뇌 전달 단백질에 커플링되고 특히 의학적, 진단적 또는 조사 목적을 위한 검출 및/또는 영상화에 사용하도록 의도된 마커(marker)로서 이해되어야 한다. 표지는 표적 결합 항체 또는 담체 모이어티 중 하나에 커플링될 수 있다. 이러한 표지의 비-제한적 예는 방사성표지, 형광단, 발색단, 또는 친화성 태그를 포함한다. 일 구현예에서, 표지는 의학적 또는 진단적 영상화를 위해 사용된 방사선표지, 예를 들면, SPECT(단광자 방출 컴퓨터 단층촬영법) 또는 PET(양전자 컴퓨터 단층촬영법) 영상화에 사용하기 적합한 Zr89, I124, I125, I131, C11, C14, H3, F18, 또는 갈륨68이다.
본원에 개시된 바와 같은 뇌 전달 단백질은 포유동물 뇌에서 표적에 적합하게 지시된다. 따라서, 본 발명의 뇌 전달 단백질은 포유동물에서 치료 또는 진단 용도에 적합하다. 본원에 사용된 바와 같은 포유동물은 사육된 동물(예컨대, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예컨대, 인간 및 원숭이와 같은 비-인간 영장류), 토끼, 및 설치류(예컨대, 마우스 및 랫트)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정의 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
관련 국면에서, 본 발명에 따른 뇌 전달 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 치료학적 용도를 위한 구체적인 구현예에서, 조성물은 인간 및/또는 동물에게 투여하기에 적합한 생리학적 완충액 속의 본 발명에 따른 치료학적 활성량의 뇌 전달 단백질을 포함하는 생리학적으로 허용되는 제형이다. 뇌 전달 단백질은 보다 우수한 안정성을 위해 동결 건조시킬 수 있다. 동결 건조된 제형은 동결 건조 및/또는 후속적인 저장 동안 및/또는 후에 생성물을 보호하고/하거나 안정화시키기 위한, 만니톨과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 안정화제, 동결건조보호제, 완충제 등을 포함하는 어떠한 적합한 통상의 부형제도 함유할 수 있다.
관련 국면에서, 상기 포유동물에게 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 뇌 전달 단백질을 투여함을 포함하여, 상기 장애로 진행될 위험을 가지거나 위험이 있는 포유동물에서 뇌 장애의 치료 및/또는 예방 방법이 제공된다. 특히, 상기 장애는 알츠하이머 질환 및, 외상성 뇌 손상(TBI), 루이체 치매(LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전측두엽 치매, 타우병증, 전신아밀로이드증, 죽상경화증 및 파킨슨 질환 치매(PDD)와 같은 Aβ 단백질 응집과 연관된 다른 장애; 알츠하이머 질환의 루이체 변이체; 다계통 위축증; 정신병; 조현병; 크로이츠펠트 야곱병; 헌팅톤 질환, 및 가족성 아밀로이드 신경병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경변성 장애이다. 상기 개시한 바와 같이, 특수한 표적 결합 항체는 특정의 뇌 표적에 대한 이들의 결합 친화성으로 인하여 특정의 신경변성 장애의 치료시 유용할 수 있다. 본 발명의 관련 국면을 위해 개시된 바와 같은 구현예는 따라서 본 발명의 치료 국면의 방법에 또한 동등하게 관련되어 있다.
관련된 국면에서, 상기 포유동물에게 본 발명에 따른 뇌 전달 단백질을 진단 및/또는 검출을 가능하도록 하기에 충분한 양으로 투여함을 포함하여, 상기 장애를 가지거나 상기 장애로 진행될 위험이 있는 포유동물에서 뇌 장애를 진단하고/하거나 검출하는 방법이 제공된다. 특정의 구현예에서, 상기 장애는 알츠하이머 질환 및, 외상성 뇌 손상(TBI), 루이체 치매(LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전측두엽 치매, 타우병증, 전신아밀로이드증, 죽상경화증 및 파킨슨 질환 치매(PDD)와 같은 Aβ 단백질 응집과 연관된 다른 장애; 알츠하이머 질환의 루이체 변이체; 다계통 위축증; 정신병; 조현병; 크로이츠펠트 야곱병; 헌팅톤 질환, 및 가족성 아밀로이드 신경병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경변성 장애신경변성 장애이다. 상기 개시한 바와 같이, 특수한 표적 결합 항체는 특정의 뇌 표적에 대한 이들의 결합 친화성으로 인하여 특정의 장애의 진단 또는 검출에 유용할 수 있다. 진단 및/또는 검출을 위한 방법의 구체적인 구현예는 포유동물의 뇌에서 생체내 진단과 같은 또는 세포 샘플의 시험관내 진단과 같은, 생체내 또는 시험관내 방법일 수 있다. 본 발명의 관련된 국면을 위해 개시된 구현예는 따라서 상기 개시된 바와 같은 진단/검출의 국면과 동등하게 관련된다.
본 발명은 다음의 비-제한적 실시예에 의해 추가로 나열될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명에 따른 뇌 전달 단백질의 구현예를 개략적으로 나타낸다. 도 1의 A는 링커에 의해 항체로 표시된, 표적 결합 항체의 2개의 경쇄의 C-말단에 부착된, scFv로 나타낸 2개의 담체 모이어티를 포함하는 뇌 전달 단백질을 나타낸다. 도 1의 B는 BBB 내피 세포에서 발현된 수용체에 대한 뇌 전달 단백질의 추정된 1가 결합을 묘사한다.
도 2의 A 내지 C는 본 발명에 따른 뇌 전달 단백질의 예인, RmAb158-scFv8D3이 RmAb158(2의 B)와 비교하여 Aβ 프로토피브릴(PF)에 대해 단량체(M)(2의 A)보다 높은 선택적인 결합을 보유하지만, 대조군 항체 6E10은 Aβ 종(2의 C) 둘 다에 동등하게 잘 결합함을 나타내는, 억제 ELISA로부터의 결과를 나타낸다.
도 2의 D는 둘 다 TfR에 이가 결합할 수 있는, 항-TfR 항체 8D3, 및 화학적으로 접합된 융합 단백질 8D3-F(ab')2-h158(Sehlin et al, 2016, supra)가 본 발명에 따른 뇌 전달 단백질의 구체적인 예인, RmAb158-scFv8D3과 비교하여 TfR에 대해 거의 10배 더 강력한 결합을 나타냄을 입증하는 TfR 경쟁 ELISA로부터의 결과를 나타낸다. 8D3의 scFv 단편은 단지 하나의 결합 부위를 가지므로, 심지어 보다 약한 TfR 결합을 갖는다.
도 3의 A 및 도 3의 B는 생체외(ex vivo) 실험으로부터의 결과를 나타내는 도해(diagram)이다. 도 3a의 도해는 [125I]RmAb158-scFv8D3의 뇌 농도가 추적량의 주사 2시간 후 야생형 마우스에서 [125I]RmAb158의 뇌 농도보다 80배 더 높음을 나타낸다. [125I]RmAb158-scFv8D3은 본 발명에 따른 뇌 전달 단백질의 표지된 변이체이며, 이는 이러한 실험에서 추적량으로 투여되었다. 도 3의 B의 도해는 동일한 실험에서 동일한 단백질의 뇌-대-혈액 농도 비를 나타낸다.
도 4의 A 내지 C는 생체외 실험으로부터의 결과를 나타내는 도해이다. 도 4의 A는 본원에 개시된 바와 같은 뇌 전달 단백질의 구체적인 예인, [124I]RmAb158-scFv8D3의 늙은(18 내지 24개월령) 및 어린(8 내지 9개월령) 야생형 및 tg-ArcSwe 마우스에서 주사 3일 후 생체외 정량화된 뇌 농도를 나타낸다. 도 4의 B는 주사 3일 후 18개월령의 tg-ArcSwe 마우스에서 화학적으로 융합된 8D3-F(ab')2-mAb158 및 RmAb158-scFv8D3의 생체외 뇌 농도를 나타낸다. 도 4의 C는 동일한 시간에 걸쳐 혈액 농도와 비교하여 투여 3, 6 및 10일 후에 늙은(18 내지 24개월령) tg-ArcSwe 마우스에서 [124]RmAB158-scFv8D3의 생체외 정량화된 뇌 농도를 나타낸다. 뇌로부터의 제거는 혈액으로부터의 제거보다 훨씬 더 느리다.
도 5는 투여 3, 6 및 10일 후 상이한 말초 기관에서 기관 중량당 주사된 용량의 퍼센트로 정량화된, 본원에 개시된 바와 같은 뇌 전달 단백질의 구체적인 예인, [124/125I]RmAb158-scFv8D3의 생물학적 분배를 나타내는 도해이다. 도 4의 C로부터의 뇌 농도가 비교를 위해 포함된다.
도 6은 전이유전자-ArcSwe 마우스(A-D) 및 야생형 마우스(E-G)의 PET 스캐닝의 60분 동안 수득된 PET 영상을 나타낸다. (A)를 제외한 모든 영상은 동일한 색상 규모를 사용하여 나타낸다. 도 6의 A는 [124I]RmAb158-scFv8D3의 투여 0 내지 60분 후 수득된 늙은 tg-ArcSwe 마우스에서 PET 영상을 나타낸다. 방사활성 농도는 모든 뇌 영역에서와 유사하다. 방사활성은 이러한 초기 시점 동안 훨씬 더 높았으므로 다른 도에서와 동일한 규모가 사용될 수 없었다. PET 영상은 [124I]RmAb158-scFv8D3의 주사 3일(6의 B), 6일(6의 C) 및 10일(6의 D) 후 늙은 tg-ArcSwe 마우스에서 수득하였다. PET 영상은 [124I]RmAb158-scFv8D3의 주사 3일(6의 E), 6일(6의 F) 및 10일(6의 G) 후 늙은 야생형 마우스에서 수득하였다. (뇌 조직 g당 %ID = 뇌 조직 1 그램 속에서 측정된 주사된 용량의 퍼센트, 즉 [124I]RmAb158-scFv8D3의 뇌 농도의 척도).
도 7의 A 내지 도 F는 해마(A), 시상(B), 선조체(C), 피질(D) 및 전뇌(whole brain)(E)에서 뇌 영역-대-소뇌 농도 비를 기반으로 한 PET를 나타내는 도해이다. 화학적으로 접합된 융합 단백질에 대한 비교는 (F)에 나타낸다. 도에서 n.a.로 표시한 일부 동물 유형은 모든 시점에서 시험하지 않았다.
도 8의 A 및 B는 생체외 실험으로부터의 결과를 나타내는 도해이다. 도 8의 A의 도해는 주사 2시간 후 야생형 마우스에서 [125I]RmAb158-scFv8D3의 뇌 농도를 나타낸다. [125I]RmAb158-scFv8D3은 본 발명에 따른 뇌 전달 단백질의 표지된 변이체이며, 이는 이러한 실험에서 치료학적 용량으로 투여되었다. 도 3의 B의 도해는 추적량으로 투여된 동일한 단백질의 뇌-대-혈액 농도 비를 나타낸다.
도 9의 A 내지 D는 주사 6일 후 [125I]RmAb158-scFv8D3(A) 및 [125I]RmAb158(B)가 주사된 18개월령의 늙은 tg-ArcSwe 마우스에서 뇌 속의 항체의 전반적인 분포를 나타내는 영상이며, Aβ40 면역염색(우측)과 비교하여 생체외 방사능사진 촬영술(좌측)으로 가시화하였다. [125I]RmAb158-scFv8D3은 전뇌를 통해 분포되었지만, [125I]RmAb158은 뇌의 중앙 부분에 농축되었다. 비교를 위해, 야생형 동물에게 [125I]RmAb158-scFv8D3을 또한 주사시 시그널을 생성하지 않았고(C) [125I]RmAb158를 주사시, 희미한 시그널이 뇌의 중앙에서 검출되었다(D).
도 10의 A 내지 D는 다음을 나타내는 도해이다: A. 혈장 g당 주사된 용량의 %로 나타낸, 72 시간 동안 2개의 상이한 용량에서 RmAb158-scFv8D3 및 RmAb158의 혈장 약력학. B. (A)에서 혈장 곡선 하 영역으로부터 계산된 약물 노출. C. 주사 72시간 후 주사된 용량/뇌 조직의 그램의 %로서 나타낸 항체의 뇌 보유. D. 뇌 속으로 도입되어 보유되는 상대적인 효능을 나타내기 위한, 주사 72시간 후 약물 노출에 대한 항체의 뇌 보유의 비.
실시예
실시예 1: 재조합 이특이적인 Aβ-TfR 항체의 생성 및 특성화
RmAb158-scFv8D3의 클로닝(cloning)
발현된 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 N-말단에 시그널 펩타이드를 지닌 벡터 pcDNA3.4(ThermoFischer) 내로 내로 클로닝하였다. 8D3 서열(Boado et al, 상기 참고)을 N-말단 부위로서 중쇄 가변 단편 및 C-말단에 경쇄 가변 단편을 지닌 scFv로 제조하였다. 중쇄 및 경쇄를 Wu AM. et al, Protein Eng. 14: 1025-1033 (2001)에 이미 개시된 18 aa의 긴 GlySer이 풍부한 아미노산 링커(GSTSGGGSGGGSGGGGSS)에 의해 분리하였다. 이후에, scFv 8D3을 아미노산 서열 APGSYTGSAPG(서열 번호 1)을 가진 내부(in house) 설계된 펩타이드 링커를 사용하여 RmAb158(예컨대 EP　2004688에 개시된 바와 같음)의 C-말단에 연결하였다. 프롤린을 링커의 개시부 및 말단에 가하여 알파 나선형이 연장되지 않도록 보증하였는데, 이는 이들이 알파 나선에 요구되는 아미드 수소 결합을 나타낼 수 없기 때문이다. 세린 및 트레오닌과 같은 극성 아미노산을 가하여 링커가 친수성이도록 보증하고, 보다 작은 아미노산 글리신을 가하여 굴곡성을 보증하였다.
RmAb158-scFv8D3의 발현 및 정제
세포, 세포 배양용 배지 및 벡터를 다음에 언급한 것으로 교체한 것을 제외하고는 재조합 융합 단백질을 "Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols" (Baldi L. et al, Methods in Molecular Biology, 81:13-26 (2012))에 기술된 프로토콜을 사용하여 발현시켰다: Expi293 세포(ThermoFisher)를 Expi293 배지(ThermoFisher)에서 성장시키고 형질감염 시약으로서 폴리에틸렌이민(PEI) 및 세포 주기 억제제로서 발프로산(VPA)을 사용하여 중쇄 및 경쇄 pcDNA3.4 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. RmAb158-scFv8D3을 HiTrap 단백질 G 컬럼(GE Healthcare)에서 정제하고, 0.7% HAc까지의 구배로 용출시켰다.
RmAb158-scFv8D3의 시험관내 분석
RmAb158-scFv8D3의 크기 및 통합성을 확인하기 위하여, 융합 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였다. RmAb158 및 RmAb158-scFv8D3을 Bolt® LDS 샘플 완충액과 환원제의 부재하에서 혼합하고 10　% Bolt 비스-트리스 플러스 겔(Bis-Tris Plus gel)(Thermo Fisher)에 직접 로딩하고 22분 동안 200 V에서 작동시킨 후, dH2O 속에서 세척하고, 페이지 블루(Page blue)(Fermentas)로 염색하였다. 카멜레온 전-염색된 단백질 마커(Li-Cor)를 분자량 표준으로서 사용하였다.
용액 속에서 Aβ 단량체 및 프로토피브릴에 대한 특이적인 결합을 평가하기 위하여, RmAb158-scFv8D3을 앞서 기술한 바와 같이(Englund H. et al, J. Neurochem. 103: 334-345 (2007)) Aβ 항체 6E10(Covance)와 비교시 억제 ELISA로 분석하였다. 96-웰 플레이트를 2시간 동안 +4℃에서 45 ng/웰의 Aβ 프로토피브릴로 코팅한 후, 1시간 동안 BSA로 차단하였다. 일련 희석된 Aβ 단량체 또는 프로토피브릴을 1시간 동안 고정된 농도의 항체(RmAb158-scFv8D3 - 50 ng/ml; 6E10 - 400 ng/ml)와 함께 비-결합 96-웰 플레이트 속에서 예비-항온처리하였다. Aβ-항체 용액을 이후에 Aβ 코팅된 플레이트로 이전시키고 15분 동안 항온처리한 후, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합된 항-마우스-IgG-F(ab')2(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) 및 K 블루 수성 TMB 기질(Neogen Corp., 미국 켄터키주 렉싱톤 소재)로 검출하고 450 nm에서 분광광도계로 판독하였다. 모든 Aβ 및 항체 희석물을 ELISA 항온처리 완충액(0.1% BSA, 0.05% 트윈, 및 0.15% 카톤(Kathon)이 들어있는 PBS) 속에서 제조하였다. Aβ 단량체 및 프로토피브릴 제제를 앞서 기술한 바와 같이 제조하였다(Magnusson K. et al, J. Alzheimers Dis. 37: 29-40 (2013)).
경쟁 ELISA를 사용하여 앞서 생성된 화학적으로 융합된 8D3-F(ab')2-h158 (Sehlin D. et al, supra (2016)), 8D3 및 8D3의 scFv 단편에 결합하는 RmAb158-scFv8D3의 능력을 평가하였다. 96-웰 플레이트를 밤새 +4℃에서 50 ng/웰의 재조합 트랜스페린 수용체 단백질(Sinobiological, 중국 베이징 소재)로 코팅시키고 BSA로 차단시켰다. 일련 희석된 항체를 플레이트 위에서 2시간 동안 진탕기 위에서 2.5 nM의 바이오티닐화된 scFv8D3과 경쟁적으로 항온처리한 후, 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합된 스트렙타비딘(Mabtech AB, 스웨덴 나카 스트랜드 소재) 및 K 블루 수성 TMB 기질(Neogen Corp., 미국 켄터키주 렉싱톤 소재)로 검출하고 450 nm에서 분광광도계로 판독하였다. 모든 항체 희석물을 ELISA 항온처리 완충액(0.1% BSA, 0.05% 트윈, 및 0.15% 카톤이 들어있는 PBS) 속에서 제조하였다. 모든 Aβ 및 항체 희석물을 ELISA 항온처리 완충액 속에서 제조하였다. IC50 및 Kd 값을 GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, Inc, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)을 사용한 비-선형 회귀 분석으로 평가하였다.
결과
링커에 의해 서로 연결된 8D3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 짧은 펩타이드 링커를 통해 각각의 RmAb158 경쇄의 C-말단에 부착시켰다(도1의 A). 이러한 링커는 알파 나선의 형성을 방지하도록 설계하였으며, 친수성 아미노산의 수는 소수성 코어의 형성을 피하도록 선택하였다. 작은 측쇄를 지닌 아미노산을 링커 속에 도입하여 굴곡성을 보증하였다. 짧은 길이의 링커의 목적은 scFv를 RmAb158에 근접하도록 묶어서 TfR에 대한 이가 결합이 입체적으로 어려울 수 있도록 하기 위한 것이다(도 1의 B).
Expi293 세포내에서의 단백질 발현은 형질감염된 세포 배양물 리터당 대략 15 내지 30 mg의 항체를 수득하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였으며, 여기서 단일 밴드(band)가 관찰되었는데(결과는 나타내지 않음), 즉, RmAb158-scFv8D3는 순수하고 동일한 배치(batch)를 후술된 시험관내 및 생체내 연구에서 사용하였다.
생성된 융합 단백질의 기능성을 평가하기 위하여, 시험관내 결합 분석을 수행하였다. 상이한 Aβ 종에 대한 융합 단백질의 선택성을 억제 ELISA로 연구하였으며, 여기서 간접적인 Aβ ELISA에서 시그널을 억제하는 Aβ 단량체 및 프로토피브릴의 능력은 시험된 항원에 대한 친화성에 가깝다. RmAb158-scFv8D3는 단량체에 대해 1.2　nM 및 프로토피브릴에 대해 1.2 μM의 IC50을 지닌, RmAb158과 유사하게, 각각 0.85 및 400 nM의 중간(median) 억제 농도(IC50)로(도 2의 A), 단량체에 대해서 보다 프로토피브릴에 대해 거의 500배 더 강력한 결합을 나타내었다(도 2의 B). 광범위하게 사용된 Aβ 항체 6E10은 대조군으로서 제공하였으며, 상이한 Aβ 제제에 대한 결합시 차이를 나타내지 않았다(도 2의 C).
TfR 결합을 경쟁 TfR ELISA로 평가하였으며(도 2의 D), 여기서 플레이트를 고 농도의 재조합 TfR 단백질로 코팅하여 이에 대한 판독물로서 보다 높은 항원항체결합력으로, 이가 결합을 달성하는 가능성을 모사(mimic)하였다. 8D3의 바이오티닐화된 scFv를 일련 희석된 scFv8D3, RmAb158-scFv8D3, 8D3 및 화학적으로 융합된 8D3-F(ab')2-h158에 의해 경쟁에 적용시켰다. 예측한 바와 같이, RmAb158-scFv8D3은 전체 8D3 항체 및 8D3-F(ab')2-h158과 비교하여 10배 더 낮은 항원항체결합력을 나타내었으며, 평가된 Kd 값은 각각 8.0, 0.80 및 0.69 nM이었다. 정의에 의해 일가인 ScFv8D3는 15 nM의 Kd를 나타내었는데, 즉, RmAb158-scFv8D3보다 대략 2배 더 높았다. 재조합 융합 단백질은 분자당 2개의 가능한 결합 부위를 가지므로, scFv8D3과 RmAb158-scFv8D3 사이에 실제적인 차이는 없으며, TfR과의 일가 상호작용을 강력하게 제안한다.
실시예 2: 방사선표지된 RmAb158-scFv8D3을 사용한 뇌 분포 및 말초 생물학적 분배의 생체내 연구
동물
북극(AβPP E693G) 및 스웨덴(AβPP KM670/671NL) 돌연변이를 지니고, C57BL/6 배경에서 유지시킨 Tg-ArcSwe 모델(Lord, A. et al, Neurobiol Aging 27, 67-77 (2006); Philipson, O. et al, Neurobiol Aging 30, 1393-1405 (2009))은 매우 어린 연령에서 이미 상승된 수준의 가용성 Aβ 프로토피브릴 및 대략 6개월령에서 시작하는 신속하게 발달하는 플라크 병리학을 나타낸다. 수컷 및 암컷 둘 다를 사용하고 한배새끼(littermate)를 대조군 동물(wt)로 사용하였다. 동물을 업살라 대학(Uppsala University)에서의 동물 시설 내의 조절된 온도 및 습도를 갖는 실내에서 사료와 물에 자유로이 접근하도록 하면서 우리에 두었다. 본원에 기술된 모든 공정은 업살라 카운티 동물 윤리 위원회(Uppsala County Animal Ethics board)(#C17/14)에 의해 스웨덴 동물 복지국(Swedish Animal Welfare Agency)의 규율 및 규칙에 따라 승인되었으며 2010년 9월 22일자의 유럽 공동체 평의회 지시(European Communities Council Directive)(2010/63/EU)를 준수하였다.
방사화학
이특이적인 RmAb158-scFv8D3을 직접적인 방사성요오드화를 사용하여 생체외 시험을 위해 요오드-125(125I)로 및 PET 실험을 위해 요오드-124(124I)로 표지하였다(Greenwood, F. C. et al, Biochem. J. 89,114-123 (1963)). 이러한 방법은 반응계내(in situ) 산소화된 요오드에 의한 타이로신 잔기의 페놀성 환의 친전자적 공격을 기반으로 한다. 요약하면, 125I-표지화의 경우, 120 pmole의 항체 또는 융합 단백질(추정된 Mw 210 kDa), 125I 스톡 용액(Perkin-Elmer Inc., 미국 매사츄세츠주 왈탐 소재) 및 5 μg의 클로르아민-T(Sigma Aldrich, 스웨덴 스톡홀름)을 PBS 속에서 110 μl의 최종 농도로 혼합하였다. 반응을 90초 동안 진행시키고 후속적으로 2배 몰 과량의 나트륨 메타비설파이트(Sigma Aldrich)의 첨가 및 PBS 속에서 500 μl로 희석시켜 퀀칭(quenching)하였다. 124I-표지화를 위해, 60 μl의 124I 스톡 용액(Perkin-Elmer Inc.)을 15분 동안 12 μl의 50 μM NaI와 240 pmole의 융합 단백질 및 40 μg의 클로르아민-T의 첨가 전에 예비-항온처리하고, PBS 속에서 420 μl의 최종 용적으로 혼합하였다. 반응이 120초 동안 진행되도록 한 후 80 μg의 PBS중 나트륨 메타비설파이트를 첨가하여 퀀칭시켰다. 방사선표지된 단백질을 유리 요오드 및 저-분자량 성분으로부터 1회용 NAP-5 크기 배출 컬럼, Mw 컷-오프(cut-off) 5 kDa(GE Healthcare AB, 스웨덴 업살라 소재)을 사용하여, 제조업자의 지시에 따라 정제하고 1 ml의 PBS 속에 용출시켰다. 수율을 첨가된 방사활성 및 정제된 방사선리간드 용액 속에서 방사활성을 기반으로 계산하였다. 표지화를 각각의 연구 2시간 미만 전에 수행하였다.
생체외 연구
마우스에게 0.44±0.03 MBq의 [125I]RmAb158(n=3) 또는 0.89±0.26 MBq의 [125I]RmAb158-scFv8D3(n=10)을 정맥내(i.v.) 주사하였으며, 이는 0.05 mg/kg의 용량과 동일하다. 혈액 샘플(8 μl)을 꼬리 정맥으로부터 주사 후 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 24 및 48 시간째에 수득하였다. 동물(각각의 리간드에 대해 n=3)의 부분집합을 주사 후 2시간 째에 안락사시키면서 나머지는 주사 후 3일째에 안락사시켰다. 야생형 마우스의 별도의 그룹에 검출용의 1.5% 방사선표지된 단백질을 함유하는, 10 mg/kg의 RmAb158(n=5) 및 13.3 mg/kg의 RmAb158-scFv8D3(n=5)을 주사하고, 주사 2시간 후 안락사시켰다. 관류 후, 뇌를 분리하고, 소뇌를 뇌 조직 샘플을 드라이 아이스 위에서 동결시키기 전에 뇌의 나머지로부터 분리하였다. 간, 폐, 심장, 비장, 신장, 췌장, 근육 및 대퇴골을 또한 분리하였다. 혈액, 뇌, 소뇌 및 분리된 기관내 방사활성을 γ-카운터(1480 WizardTM Wallac Oy, 핀란드 투르쿠 소재)로 측정하였다. 조직 그램당 주사된 용량의 %(% ID/g)로서 정량화된 뇌, 소뇌 및 혈액 농도를 다음과 같이 계산하였다:
% ID/g = 조직(또는 혈액) 그램 당 측정된 방사활성 / 주사된 방사활성
또한, 조직-대-혈액(Kp) 농도 비를 다음과 같이 계산하였다:
K p = 조직 그램당 측정된 방사활성 / 혈액 그램당 측정된 방사활성
PET 연구
[124I]RmAb158-scFv8D3의 주사 전날에 동물에게 0.2% NaI가 보충된 물을 제공하여 124I의 갑상샘 섬취를 감소시켰다. 마우스(n=12)에게 0.5 mg/kg의 용량에 상응하는 7.2±3.4 MBq [124I]RmAb158-scFv8D3을 정맥내(i.v.) 주사하였다. 혈액 샘플(8 μl)을 주사 후 1, 3, 6, 24 및 48 시간 째에 꼬리 정맥으로부터 수득하였다. 주사 3일 후 동물을 동물 PET/CT 스캐너(Triumph Trimodality System, TriFoil Imaging, Inc., 미국 캘리포니아주 노스릿지 소재)의 지지대에 두고 60분 동안 목록 모드(list mode)로 스캐닝한 후 3분 동안 CT 실험을 수행하였다(시야(FOV)　=　8.0　cm). 동물을 심장으로부터 말단 혈액 샘플을 포함하는 생체외 연구를 위해 상술한 바와 동일한 과정에 따라 PET 스캔 후 안락사시켰다. 혈액, 뇌, 소뇌 및 분리된 기관에서의 방사활성을 웰 카운터(GE Healthcare, 스웨덴 업살라 소재)로 측정하였다. 2마리의 동물을 주사 6일 후 스캐닝하고 한 마리의 동물을 주사 10일 후 스캐닝하였다.
PET 데이타를 주문한 부분집합의 예측-최대화(ordered subsets expectation-maximization: OSEM) 3D 알고리즘(20회 반복)를 사용하여 재구축하였다. CT 미가공 파일을 필터 역 투영법(Filter Back Projection: FBP)을 사용하여 재구축하였다. PET 및 CT 영상의 모든 후속적인 공정은 영상 소프트웨어 아미드(imaging software Amide) 1.0.4(Loening AM. et al, Mol. Imaging 2: 131-137 (2003))에서 수행하였다. CT 스캔을 해마, 선조체(striatum), 시상, 피질 및 소뇌에 대한 요약된 목적한 영역을 함유하는 T2 칭량된, MRI 기반 마우스 뇌 지도책(brain atlas)을 사용하여 수동으로 정렬하였다(Ma Y, et al, Neuroscience 135: 1203-1215 (2005)). 이후에, PET 영상을 CT로 정렬되었고, 이에 따라 MRI-지도책은 또한 PET 데이타로 정렬되었다.
결과
RmAb158-scFv8D3를 마우스에서 생체내 연구를 위해 대략 70%의 수율로 125I 및 124I로 방사선표지하였다. 비활성(specific activity)은 [125I]RmAb158-scFv8D3의 경우 0.4±0.1 MBq/μg (79±19 MBq/nmol) 및 [124I]RmAb158-scFv8D3의 경우 1.2±0.7 MBq/μg (261±145 MBq/nmol)이었다.
생체내에서 TfR 매개된 통과세포외배출을 가능하도록 하기 위한 scFv8D3 모이어티의 능력을 시험하기 위하여, 야생형 마우스에게 [125I]RmAb158 또는 [125I]RmAb158-scFv8D3을 투여하고 뇌를 주사 2시간 후 분리하였다. 뇌 조직 그램 당 주사된 용량의 퍼센트(% ID/g, 식 1)로서 나타낸, 뇌 농도는 [125I]RmAb158 및 [125I]RmAb158-scFv8D3의 경우 각각 0.03±0.01 및 2.20±0.92이었다(도 3의 A). 따라서, scFv8D3 변형은 이러한 시점에서 뇌 농도에 있어 80배 증가를 가져온다. 뇌-대-혈액 농도 비(Kp, 상기 식 참고)는 2개의 리간드 각각에 대해 0.0010±0.00013 및 0.15±0.10이었다(도 3의 B). 따라서, 혈액 속의 이용가능한 리간드를 고려하는 Kp는 RmAb158의 scFv8D3 변형에 의해 140배 증가하였다.
약력학 및 뇌 분포를 추가로 시험하기 위하여, 방사선표지된 RmAb158-scFv8D3을 어린(8 내지 9개월령) 및 늙은(18 내지 24개월령) 야생형 및 tg-ArcSwe 마우스에게 투여하였다. 대부분(n=14)의 마우스를 주사 3일 후 안락사시켰지만, 2마리의 늙은 tg-ArcSwe 마우스는 주사 10일 후까지 시험 하에 유지시키고 1마리의 늙은 tg-ArcSwe는 주사 14일 후 안락사시켰다.
RmAb158-scFv8D3의 투여 후 3일째에, 야생형 마우스(%ID/g = 0.08±0.01)와 비교하여 9배 더 높은 뇌 농도의 융합 단백질이 늙은 tg-ArcSwe 마우스(%ID/g = 0.69±0.17)에서 발견되었다(도 4의 A). 이는 화학적으로 생성된 융합 단백질 8D3-F(ab')2-h158과 비교하여 5배 차이와 동등하다(도 4의 B). RmAb158-scFv8D3의 뇌 농도는 투여 후 다음 7일 동안 단지 약하게 감소하였다(도 4의 C). 3시간과 3일 사이에 수득된 샘플을 기반으로 한 혈액 속의 반감기는 18.6±1.5 시간이었다. 1일 내지 3일째에, 즉, 제거 상 동안, 반감기는 24.4±3.3 시간이었다(도 4의 C). 이식유전자와 야생형 마우스 사이의 혈액 농도 또는 반감기에 있어서 차이는 없었다.
말초 기관에서 [125/124I]RmAb158-scFv8D3의 분포는 도 5에 나타낸다. 대부분의 기관에서 조직 농도는 혈액 속의 농도보다 어느 정도 더 빠르게 감소하였다. 비장은 최고의 흡수를 나타내었으며 비장 속의 농도가 감소되었지만, 이러한 감소는 다른 기관으로부터의 [125/124I]RmAb158-scFv8D3의 제거보다 더 느렸다(그러나 혈액으로부터의 제거는 여전히 더 빨랐다).
연구된 동물의 부분집합을 주사 시기, 주사 후 3, 6 또는 10일 째에 PET-스캐닝하였다. 이러한 스캔으로부터의 PET 영상을 도 6에 나타내었으며, 이는 [124I]RmAb158-scFv8D3이 tg-ArcSwe 마우스 뇌에서 보유된 반면 야생형 마우스의 뇌로부터는 제거됨을 입증한다. 주사 후 처음 0 내지 60분 동안 획득한 PET 데이타를 뇌 용적의 3%가 혈액이라는 추정하에, 스캔 후 직접 수득한 혈액 샘플에 대해 정량화하였다. 이러한 실험은 이러한 시점에서 PET 시그널의 72%가 뇌 조직과 관련된 [124I]RmAb158-scFv8D3로부터 기원하였으며, 이는 뇌 속의 고 농도가 주사 후 거의 즉시 수득되었음을 시사한다(도 6의 A). 이는 주사 3일 후 뇌 농도에 있어서 피크인 변형되지 않은 mAb158와는 달리, 뇌로의 활성적인 수송의 지표이다(Magnusson K. et al, supra). 주사 3일 후, 재조합 융합 단백질 농도는 약 25%로 감소하였으며 이중 10%까지는 tg-ArcSwe 및 야생형 마우스의 뇌에서 주사 시기에 스캔에서 관찰되었다(도 6의 B 및 E). 이후 시점에서, PET에 의해 측정된 뇌 농도는 늙은 tg-ArcSwe 동물에서 다소만이 감소하였지만(도 6의 C 및 D) 야생형 마우스의 뇌에서는 [124I]RmAb158-scFv8D3가 거의 남지 았았다(도 6의 F 및 G). 혈액의 비교적 높은 뇌 함량으로 인하여, 뇌 속에서의 PET 시그널은 재조합 융합 단백질의 혈액 농도에 의해 영향받으며, 이는 주사 후 처음 3일 동안 유의적으로 감소하므로, 제1 스캔과 제2 스캔 사이에 PET 시그널에 있어서 큰 강하를 설명한다. 이는 뇌 속에서 Aβ에 결합하지 않는 [124I]RmAb158-scFv8D3이 혈액과 평형이며 뇌 밖으로 활성적으로 수송함을 시사한다.
예컨대, [11C]PIB를 사용하여 평가된, 뇌에서 Aβ 수준의 PET 데이타는 소뇌가 Aβ 병리학으로부터 대부분 제외되고 참고 영역으로서 작용할 수 있으므로, 흔히 뇌-대-소뇌 농도 비로서 정량화된다. PET에 의해 정량화된 전뇌, 시상, 선조체, 해마 및 피질 중, 참고로서 소뇌를 사용한, 농도 비는 도 7에 나타나 있다. 늙은 tg-ArcSwe와 다른 그룹 사이의 비에 있어서 중첩없이 주사 3일 후 이미 명확하게 구별되었다. 주사 6일 후, 어린 및 늙은 tg-ArcSwe 마우스는 뇌 속에서 프로토피브릴 축적없이 야생형 마우스와 구별될 수 있었다. 이는 뇌에서의 [124I]RmAb158-scFv8D3 결합이 실제로 화학적 융합 단백질에 대해 이미 입증된 바와 같이, Aβ 병리학에 대해 특이적임을 시사한다(Sehlin D. et al, supra (2016)).
상기 기술된 모든 2시간 뇌 흡수 실험을 추적량의 RmAb158 또는 RmAb158-scFv8D3, 즉 대략 0.05 mg/kg을 사용하여 수행하였다. 제2 세트의 실험을 앞서의 실험에서와 같이 동일한 양의 방사활성을 사용하나 표지되지 않은 RmAb158 또는 RmAb158-scFv8D3을 10 mg/kg의 용량으로 첨가하여 수행하였다. %ID/g 뇌 및 뇌-대-혈액 농도 비로 나타낸, 치료학적 용량 후 RmAb158의 뇌 농도(도 8)는 추적량의 투여 후 수득된 것과 동일하였다(도 3). 따라서, BBB를 가로지르는 수송은 용량과 선형관계이었다. 그러나, RmAb158-scFv8D3의 경우 TfR 매개된 BBB는 포화되어 용량 및 전신계 농도와 관련하여 보다 낮은 뇌 농도를 수득하는 것으로 여겨진다.
실시예 3: RmAb158-scFv8D3를 사용한 AβPP-유전자이식 마우스의 치료
동물
이러한 연구에서 또한, C57BL/6 배경이 유지된, 북극(AβPP E693G) 및 스웨덴(AβPP KM670/671NL) 돌연변이를 지닌 AβPP 이식유전자 마우스 모델 tg-ArcSwe를 사용하였다. 수컷 및 암컷 둘 다를 사용하고 한배새끼를 대조군 동물(wt)로서 사용하였다. 동물을 업살라 대학에서 동물 시설 내에 온도 및 습도가 조절된 실내에서 사료와 물을 자유로이 접급하도록 하고 우리에 넣었다. 본 논문에 기술된 모든 과정은 업살라 주 동물 윤리 위원회(Uppsala County Animal Ethics Board)(#C17/14)에 의해, 스웨덴 동물 복지국의 규율 및 규칙에 따라 승인되었으며 2010년 9월 22일자의 유럽 공동체 평의회 지시(2010/63/EU)를 준수하였다. 모든 노력은 사용된 동물의 고통을 최소화시키고 동물의 수를 줄이기 위해 이루어졌다.
항체 및 방사선표지
본 연구에서, 위에서 기술한 바와 같이 생산한 RmAb158-scFv8D3, 및 RmAb158(BioArctic AB, 스웨덴 스톡홀름)을 변형시키지 않거나 요오드-125(125I)로 방사선표지시켜 사용하였다.
항체는 실시예 2에 기술된 바와 같이 필수적으로 직접적인 방사선요오드화를 사용하여 125I로 표지하였다.
생체외 방사능사진촬영술
생체외 방사능사진촬영술을 사용하여 뇌에서 항체 분포를 가시화하기 위해, 18개월령의 늙은 tg-ArcSwe 및 야생형 마우스에게 0.20 mg IgG/kg의 체중의 용량과 동등한, 3.5 MBq [125I]RmAb158-scFv8D3 또는 2.9 MBq [125I]RmAb158을 주사하였다. 주사 6일 후, 마우스를 염수 관류시키고 뇌를 드라이아이스 위에서 즉시 동결시켰다. 50 μm 두께의 두정 동결단면을 수득하고 공지된 방사활성의 125I 표준물과 함께 X-선 카세트 속에 두었다. 양전자-민감성 인 스크린(MS, MultiSensitive, PerkinElmer, Downers grove, 미국 일리노이주 소재)을 샘플 위에 노출 5일 동안 둔 다음 Cyclone Plus Imager system(Perkin Elmer) 속에서 인치당 600개의 도트(dot)의 해상도에서 스캐닝하였다. 수득되는 디지탈 영상을 ImageJ를 사용하여 표준물에 대해 표준화하였다.
항체 치료 및 생체외 분석
14개월령의 Tg-ArcSwe 마우스를 위약(PBS), RmAb158-scFv8D3(6.6 mg/kg의 체중; PBS 중 1.32 mg/ml) 또는 RmAb158(5.0 또는 50 mg/kg의 체중; PBS 중 1 또는 10 mg/ml)의 1회 주사로 처리하였다. 치료를 위해 사용된 동일한 유형의 및 0.05 mg/kg IgG와 동등한 방사선표지된 단백질을 항체 용액내로 혼합하였다. 비활성은 [125I]RmAb158-scFv8D3의 경우 71.2±7.6 MBq/nmol이었고 [125I]RmAb158의 경우 71.9±3.6 MBq/nmol이었다. 마우스를 이소플루란(Isoflurane Baxter® Baxter Medical AB, 스웨덴 키스타 소재)으로 약하게 진정시키고, 플라스틱 홀더 속에 두고 5 μl의 항체 용액/g의 체중을 정맥내(i.v.) 투여하였다. 혈액 샘플을 꼬리로부터 1, 24, 48 시간째에 취하고 최종 혈액 샘플을 주사 72시간 후 심장으로부터 취한 다음, 염수 관류시키고 뇌를 분리하였다. 방사활성을 뇌 및 혈장 속에서 γ-카운터(1480 WizardTM, Wallac Oy, 핀란드 투르쿠)로 측정하고, 조직 g당 주사된 용량(ID)의 %로서 정량된 혈장 및 뇌 속의 항체 농도를 실시예 2에 제시된 바와 같이 계산하였다.
Aβ 병리학의 ELISA 분석
가용성 및 총 Aβ의 뇌 농도를 앞서 기술된 바와 같이 측정하였다(Syvanen, S., et al. (Neuroimage 148: 55-63 (2017)). 요약하면, 뇌 조직을 TBS 속에서 완전 프로테아제 억제제(Roche; Sigma Aldrich, 스웨덴 스톡홀름 소재)와 함께 1:5 중량:용적 비로 균질화한 후, TBS와 1:1로 혼합하고 1시간 동안 100 000 xg에서 원심분리하였다. 총 Aβ의 경우, 원래의 TBS 추출물을 농축된 포름산과 70%의 농도로 혼합한 후, 상기한 바와 같은 균질화 및 16　000 xg에서 원심분리하였다. Aβ 올리고머 및 프로토피브릴을 균질한 ELISA로 82E1(IBL International/Tecan Trading AG, 스위스)을 포획 및 검출 항체 둘 다로 사용하여 측정하였다. 82E1은 AβPP의 β-세크레타제 절단 후 생성된 N-말단 Aβ 네오에피토프(neoepitope)에 대해 특이적이다. 96-웰 반-구역(half-area) 플레이트를 밤새 웰당 12.5 ng의 82E1로 코팅한 후, PBS 중 1% BSA로 차단하였다. TBS 추출물을 1:10으로 희석시키고 밤새 +4℃에서 항온처리한 후, 바이오티닐화된 82E1(0.25 μg/ml), SA-HRP(1:2000, Mabtech AB) 및 K 블루 수성 TMB 기질(Neogen Corp., 미국 켄터키주 렉싱톤 소재)로 검출하였다. Aβ1-40 및 Aβ1-42의 경우, 96-웰 플레이트를 밤새 웰당 100 ng의 폴리클로날 토끼 항-Aβ40 또는 항-Aβ42(Agrisera, 스웨덴 우메아 소재)로 코팅하고 PBS 중 1% BSA로 차단하였다. 포름산 추출물을 2M 트리스(Tris)로 중화시키고 10000x(Aβ1-40) 또는 2000x(Aβ1-42)로 희석시키며 밤새 +4℃에서 항온처리하였다. 바이오티닐화된 82E1(0.25 μg/ml)과 함께 항온처리한 후 시그널을 전개시키고 상기와 같이 판독하였다. 모든 희석은 ELISA 항온처리 완충액 속에서 이루었다.
면역조직화학
Aβ 병리학을 생체외 방사능사진촬영술을 위해 사용된 단면에 인접한 50 μm 두께의 동결단면에서 앞서 기술한 바와 같이(Magnusson K. et al, supra) Aβ40 면역염색으로 가시화하였다. 단면을 PBS 중 4% PFA 속에서 실온으로 20분 동안 고정시키고, PBS 속에서 세척한 후 예비-가열된 시트레이트 완충액(공정 시작시 25 mM, pH 7.3, 100℃) 속에서 항원 회수(antigen retrieval)를 위해 40분 동안 항온처리하였다. 단면을 이후에 70% 포름산에 5분 동안 실온에서 이전시키고 다른 5분 동안 신선한 MQ-H2O의 일정한 흐름 하에서 세척하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 DAKO 퍼옥시다제 블록(Agilent Technologies, 스웨덴 키스타 소재)으로 15분 동안 차단하고 PBS중 0.4% 트리톤 속에서 5분 동안 투과시켰다. 비특이적인 결합을 억제하기 위해 DAKO-블록(PBS 중의 0.25% 카제인) 속에서 10분 후, 단면을 0.5 μg/ml의 폴리클로날 항-Aβ40 항체 (Agrisera, 스웨덴 우메아 소재)와 밤새 항온처리한 후, 5 μg/ml 바이오티닐화된 염소 항-랫트(Vector Laboratories Inc., 캘리포니아주 부링갬 소재)와 함께 30분 항온처리하고 스트렙타비딘-HRP(Mabtech AB)와 함께 30분 항온처리하였다. 염색을 NOVA RED 크로모겐(Vector Laboratories Inc.)으로 진탕기 위에서 10분 동안 발색시킨 후 MQ-H2O 속에서 1분 동안 세척하고 먼저 95% EtOH 속에서 그리고 다음에 99.9% EtOH 속에서 신속하게 침지시켰다. 단면을 공기-건조시키고, DPX 설치 매질(Sigma 스웨덴 알드리치 소재)과 함께 올려놓고 Nikon 현미경(DXM1200F, Nikon Instruments Inc., 미국 뉴욕주 멜빌 소재)으로 분석하였다.
통계적 분석
결과는 평균 ± 표준 편차로 나타낸다. 데이타를 일원 변량 분석(one-way analysis of variance: ANOVA)에 이어 본페로니 사후 시험(Bonferroni's post hoc test)으로 분석하였다. 통계적 분석 및 혈장 곡선 피트(1상 붕괴) 및 곡선하 영역을 GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, Inc, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)으로 계산하였다.
결과
뇌 조직 내에서 항체 분포를 평가하기 위하여, 야생형(wt) 및 풍부한 Aβ 병리학을 지닌 18개월령의 tg-ArcSwe 마우스에게 요오드-125(125I)로 표지된 RmAb158-scFv8D3 및 RmAb158을 주사하였다. 마우스를 주사 6일 후 염수 관류시키고 이의 뇌를 생체외 방사능사진촬영술 및 Aβ40 면역염색을 위해 관상 단면화하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 뇌 실질조직 속의 항체의 전반적인 분포는 근본적으로 상이하였다. 인접한 단면의 Aβ40 면역염색에 의해 가시화되는 바와 같이, 이특이적인 [125I]RmAb158-scFv8D3이 전뇌에 완전 분포하였으며 Aβ 병리학이 풍부한 뇌 부위에서 보유되었다. 대조적으로, [125I]RmAb158은 뇌의 중앙 부분으로 거의 완전하게 농축되었다. 항체 둘 다의 보유는 야생형 마우스에서 시그널이 검출되지 않았으므로 Aβ 병리학에 대해 특이적이었다.
다음에, 가용성 Aβ 프로토피브릴의 뇌 수준을 감소시키는 항체의 능력에 있어서 증진된 뇌 분포의 영향을 연구하기 위하여, 단기간 면역치료요법 연구를 14개월령의 tg-ArcSwe 마우스에서 수행하였다. 개체 10 내지 11마리의 4개 그룹으로 나누고, 마우스에게 다음의 정맥 주사를 1회 제공하였다: PBS(위약); 저 용량의 RmAb158-scFv8D3(6.6 mg/kg의 체중, 5 mg/kg IgG와 동등); 저 용량의 RmAb158(5 mg/kg의 체중) 또는 고 용량의 RmAb158(50 mg/kg의 체중). 모든 항체 용량에 추적량의 동일한 유형의 125I-표지된 항체를 보충하여 혈액 및 뇌에서 농도를 추적하였다. 이특이적인 항체는 변형되지 않은 RmAb158과 비교하여 혈액 속에서 보다 짧은 반감기를 나타내었으며(도 10의 A), 이는 도 10의 B에 나타낸, 곡선 하 영역에 의해 입증되는 바와 같이, 거의 4배의 보다 낮은 약물 노출을 생성하였다. 보다 낮은 노출은 또한 주사 2시간 후 10배 차이로 이미 관찰된 것과 비교하여 3일째에 항체의 뇌 보유에 있어서 보다 작은 차이가 관찰된 이유를 설명한다(도 10의 C). 그러나, 감소된 노출에 대해 조절하는 경우, 본 발명자들은 뇌로 10배의 보다 효율적인 수송을 여전히 발견하였다(도 10의 D).
염수 관류에 이어서, 항체 처리된 마우스의 뇌를 분리하였다. 우측 반구를 고정시키고 면역조직화학 분석을 위해 파라핀 포매한(embedded) 반면 좌측 반구는 TBS 및 포름산(FA) 속에 균질화시켜 가용성 및 총 Aβ의 추출물을 각각 수득하였다. 균질한 ELISA를 포획 및 검출 항체 둘 다로서 Aβ N-말단 특이적인 82E1(Xia, W., et al., Arch Neurol 66(2):190-199 (2009))과 함께 사용하여, 가용성 Aβ 올리고머 및 프로토피브릴의 뇌 수준이 위약과 비교하여 이특이적인 RmAb158-scFv8D3으로 처리한 마우스의 그룹에서 40% 이상까지 감소하였음을 발견하였다(도 10의 E). 대조적으로, 등몰 용량의 RmAb158은 가용성 Aβ 응집물의 수준에 있어서 효과가 없었지만, 10배 더 높은 용량은 이특이적인 항체와 유사한 감소를 나타내었다. 단일 주사 처리 패러다임으로부터 예측되는 바와 같이, 처리 그룹 중 어느 것도 FA 가용성 뇌 추출물에서 Aβ1-40 및 Aβ1-42 ELISA로 측정된 바와 같이, 총 Aβ의 수준에 있어서 어떠한 유의적인 효과도 나타내지 않았다(데이타는 나타내지 않음).
실시예 4: 재조합 이특이적인 알파-시누클레인-TfR 항체의 생성 및 특성화
RmAb48-scFv8D3의 클로닝, 발현 및 정제
재조합 이특이적인 알파시누클레인-TfR 항체 RmAb48-scFv8D3의 클로닝, 발현 및 정제를 필수적으로 실시예 1에 제시된 바와 같이 수행하였다. MAb48은 제WO 2011/104696호에 개시되어 있으며 "48B11/8"로 나타내고 특히 31 및 32면의 표 1 및 2에 기술되어 있다.
결과
재조합 이특이적인 알파시누클레인-TfR 항체를 성공적으로 생산하고 실시예 1에 따라 특성화하였다. 링커에 의해 서로 연결된 8D3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일 쇄 단편(scFv)을 짧은 펩타이드 링커를 통해 RmAb48 경쇄 각각의 C-말단에 부착하였다. 따라서, 수득되는 단백질은 도 1의 A에 나타낸 단백질 구조에 따른 구조를 가졌다.
실시예 5: 방사선표지된 RmAb48-scFv8D3을 사용한 뇌 분포 및 말초 생물학적 분배의 생체내 연구
이러한 연구에 사용된 방법 및 물질은 실시예 2에 제시된 방법 및 물질과 필수적으로 동일하였다.
동물
암컷 및 수컷 둘 다의 야생형 C57bl6 동물(wt)을 RmAb48-scFv8D3의 뇌 분포의 연구에 사용하였다. 동물을 우리에 넣고 실시예 2에 기술된 바와 같이 사료를 공급하였다.
방사화학
알파-시누클레인 결합 항체 RmAb48 및 이특이적인 RmAb48-scFv8D3을 요도드-125(125I)로 직접적인 방사성요오드화를 사용하여 표지하였다(Greenwood, F. C. et al, Biochem. J. 89,114-123 (1963)). 표지화는 필수적으로 실시예 2에 제시된 바와 같이 수행하였다.
생체외 연구
마우스에게 0.89±0.06 MBq [125I]RmAb48(n=3) 또는 0.92±0.02 MBq [125I]RmAb48-scFv8D3(n=3)을 정맥내 주사하였으며, 이는 0.05 mg/kg의 용량과 동등하다. 관류 후, 뇌를 분리하고 소뇌를 뇌 조직 샘플을 드라이아이스 위에서 동결시키기 전에 뇌의 나머지로부터 분리하였다. 혈액, 뇌 및 소뇌 속의 방사활성을 γ-카운터(1480 WizardTM, Wallac Oy, 필란드 투르쿠 소재)로 측정하였다. 뇌, 소뇌 및 혈액 농도, 및 또한 조직-대-혈액(Kp) 농도 비를 실시예 2에 기술한 바와 같이 계산하였다.
결과
RmAb48-scFv8D3 및 RmAb48를 마우스에서 생체내 연구를 위해 대략 70%의 수율로 I125로 방사선표지하였다.
생체내에서 TfR 매개된 통과세포외배출을 가능하도록 하는 scFv8D3 모이어티의 능력을 시험하기 위하여, 야생형 마우스에게 [125I]RmAb48 또는 [125I]RmAb48-scFv8D3를 투여하고 뇌를 주사 2시간 후 분리하였다. 뇌 조직 그램 당 주사된 용량의 퍼센트(% ID/g, 식 1)로 표시된, 뇌 농도는 [125I]RmAb48 및 [125I]RmAb48-scFv8D3의 경우 각각 0.04±0.01 및 1.04±0.26이었다. 따라서, scFv8D3 변형은 이러한 시점에서 뇌 농도에 있어 25배 증가를 야기한다. 뇌-대-혈액 농도 비(Kp, 상기 식 참고)는 2개의 리간드 각각에 대해 0.0020±0.0004 및 0.089±0.015이었다. 따라서, 혈액 속의 이용가능한 리간드를 고려한 Kp는 RmAb48의 scFv8D3 변형에 의해 54배 증가하였다.

Claims (30)

  1. 포유동물 뇌에서 표적(target)에 결합하는 표적 결합 항체;
    각각이 혈액 뇌 관문(BBB) 내피 세포에서 발현된 단백질과 1가 상호작용할 수 있는, 2개의 담체 모이어티(carrier moiety)를 포함하는 뇌 전달 단백질로서,
    여기서 상기 담체 모이어티 각각은 표적 결합 항체의 C-말단 끝(C-terminal end)에 연결되는 뇌 전달 단백질.
  2. 제1항에 있어서 상기 2개의 담체 모이어티 중 하나가 BBB 내피 세포에 발현된 상기 단백질에 동시에 결합하는 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 담체 모이어티 각각이 링커에 의해 표적 결합 항체에 연결되는 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 각각의 상기 링커가 1 내지 30개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 내지 25개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 내지 19개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 3 내지 19개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 3 내지 15개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 5 내지 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 개별적으로 포함하는 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 담체 모이어티가 표적 결합 항체의 경쇄의 C-말단 끝에 연결되는 단백질.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 담체 모이어티가 표적 결합 항체의 중쇄의 C-말단 끝에 연결되는 단백질.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 담체 모이어티가 표적 결합 항체의 중쇄의 C-말단에 연결되고, 제2 담체 모이어티가 표적 결합 항체의 경쇄의 C-말단 끝에 연결되는 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 담체 모이어티가 링커에 의해 표적 결합 항체에 연결되고, 상기 링커는 서열 번호 1로 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 담체 모이어티가 scFv, Fv, scFab, 또는 VHH; 트랜스페린 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체, 또는 스타필로코쿠스 단백질 A의 도메인 B로부터 기원한 단백질 Z의 변이체로부터 선택된 항체 단편을 포함하는 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 각각의 상기 담체 모이어티가 scFv를 포함하는 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, BBB 내피 세포에서 발현된 상기 단백질이 트랜트페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체(InsR), 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 저 밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질 8(Lrp8), 저 밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질 1(Lrp1), CD98, 전이막 단백질 50A(TMEM50A), 글루코즈 수송인자 1(Glut1), 바시긴(BSG) 및 헤파린-결합 상피 성장 인자-유사 성장 인자로부터 선택되는 단백질.
  12. 제11항에 있어서, BBB 내피 세포에서 발현된 상기 단백질이 TfR인 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 결합 항체가 완전한 길이의 항체(full length antibody), Fab, F(ab')2 또는 Fv인 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 표적 결합 항체가 완전한 길이의 항체인 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 뇌 속의 상기 표적이 아밀로이드 β(Aβ) 펩타이드, 알파 시누클레인, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 헌팅틴, 트랜스씨레틴(transthyretine), P-세크레타제 1, 상피 성장 인자, 상피 성장 인자 수용체 2, Tau, 포스포릴화된 Tau, 아포지질단백질 E4, CD20, 프리온 단백질, 류신이 풍부한 반복 키나제 2, 파킨(parkin), 프레세닐린 2, 감마 세크레타제, 사멸 수용체 6, 아밀로이드 전구체 단백질, p75 뉴로트로핀 수용체, 뉴레굴린 및 카스파제 6으로부터 선택되는 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 상기 뇌 표적이 Aβ 펩타이드, 바람직하게는 올리고머 및 프로토피브릴(protofibril)로부터 선택된 가용성 Aβ 응집체와 같은, 가용성 Aβ 응집체인 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 상기 단백질이 Aβ 결합 항체를 포함하고, 2개의 담체 모이어티가 항-TfR 항체의 단편인 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 상기 Aβ 결합 항체가 mAb158/BAN2401 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체이며 각각의 상기 담체 모이어티가 scFv8D3이고, 여기서 각각의 상기 scFv8D3은 상기 mAb158/BAN2401 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체의 경쇄의 C-말단 끝에 연결되며, 상기 단백질은 임의로 2개의 링커를 추가로 포함하고, 각각의 링커는 상기 scFv8D3를 상기 mAb158/BAN2401 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체에 연결시키기 위한, 서열 번호 1로 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질.
  19. 제15항에 있어서, 상기 뇌 표적이 알파 시누클레인, 바람직하게는 올리고머 및 프로토피브릴로부터 선택된 가용성 알파 시누클레인과 같은, 가용성 알파 시누클레인인 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 알파 시누클레인 결합 항체를 포함하고, 2개의 담체 모이어티가 항-TfR 항체의 단편인 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 상기 알파 시누클레인 결합 항체가 인간 알파 시누클레인 프로토피브릴에 결합하고, 바람직하게는 상기 알파 시누클레인 결합 항체가 알파 시누클레인 단량체에 결합하지 않는 단백질.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 알파 시누클레인 결합 항체가 mAb48 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체이고 각각의 상기 담체 모이어티가 scFv8D3이며, 여기서 각각의 상기 scFv8D3은 상기 mAb48 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체의 경쇄의 C-말단 끝에 연결되고, 상기 단백질은 임의로 2개의 링커를 추가로 포함하며, 각각의 링커는 상기 scFv8D3을 상기 mAb48 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체에 연결시키기 위한, 서열 번호 1로 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 융합 단백질인 단백질.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 및/또는 치료요법에 사용하기 위한 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 신경변성 질환, 바람직하게는 알츠하이머 질환 및, 외상성 뇌 손상(TBI), 루이체 치매(LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전측두엽 치매, 타우병증, 전신아밀로이드증, 죽상경화증 및 파킨슨 질환 치매(PDD)와 같은, Aβ 단백질 응집과 연관된 다른 장애; 알츠하이머 질환의 루이체 변이체; 다계통 위축증; 정신병; 조현병; 크로이츠펠트 야곱병; 헌팅톤 질환, 및 가족성 아밀로이드 신경병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경변성 장애의 치료 및/또는 예방 및/또는 생체내(in vivo) 진단에 사용하기 위한 단백질.
  26. 제25항에 있어서, 알츠하이머 질환의 치료 및/또는 예방 및/또는 생체내 진단시 사용하기 위한 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 파킨슨 질환의 치료 및/또는 예방 및/또는 생체내 진단에 사용하기 위한 단백질.
  28. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 뇌 전달 단백질을 뇌 장애를 가지거나 뇌 장애로 진행될 위험이 있는 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서의 뇌 장애의 치료 및/또는 예방 방법.
  29. 진단 및/또는 검출을 가능하게 하는 충분한 양의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 뇌 전달 단백질을 뇌 장애를 가지거나 뇌 장애로 진행될 위험이 있는 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서의 뇌 장애의 진단 및/또는 검출 방법.
  30. 제28항에 있어서, 또는 제29항에 있어서, 상기 장애가 알츠하이머 질환 및, 외상성 뇌 손상(TBI), 루이체 치매(LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전측두엽 치매, 타우병증, 전신아밀로이드증, 죽상경화증 및 파킨슨 질환 치매(PDD)와 같은, Aβ 단백질 응집과 연관된 다른 장애; 알츠하이머 질환의 루이체 변이체; 다계통 위축증; 정신병; 조현병; 크로이츠펠트 야곱병; 헌팅톤 질환, 및 가족성 아밀로이드 신경병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경변성 장애와 같은 신경변성 장애인, 치료 및/또는 예방 방법, 또는 진단 및/또는 검출 방법.
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