KR20190036903A

KR20190036903A - 리트세노라이드를 유효성분으로 하는 염증과 골관절염에 대한 예방 및 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20190036903A
Application number: KR1020170126377A
Authority: KR
Inventors: 조주현; 박성환; 박인재; 윤지현; 최구희
Original assignee: (주)휴럼
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2019-04-05

Abstract

본 발명은 염증과 골관절염 예방 및 치료를 위한 조성물의 유효성분으로 사용되는 단일 성분에 관한 것으로, 상세하게는 식물 열매의 정유성분에서 획득되어 염증과 골관절염 예방 및 치료에 효과를 지니는 단일 성분 리트세노라이드(Litsenolide)와, 이 단일 성분을 유효성분으로 하여 염증과 골관절염 예방 및 치료에 효능을 발휘하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

염증과 골관절염에 대한 예방 및 치료를 위한 유효성분으로 사용되는 리트세노라이드와, 이를 유효성분으로 하는 약학 조성물{Litsenolide used as an active ingredient for prevention and treatment of inflammation and osteoarthritis, and A composition comprising the same as an active ingredient}

염증이란 생체 조직이 손상을 입었을 때 체내에서 일어나는 방어적 반응이다. 즉, 염증이란 외상이나 화상, 세균 침입 따위로 몸의 한 부위에 충혈, 부종, 발열, 통증을 일으키는 증상을 말한다.

염증반응(炎症反應, Inflammatory Response)이란 상처가 난 곳이 붉게 되고 부어오르며 통증을 느끼게 되는 반응이다. 염증반응은 상처부위의 비만세포로부터 나온 히스타민을 포함하여 상처를 통해 들어온 박테리아를 포식하면서 활성화된 대식세포가 분비한 사이토카인 등에 의해 시작된다.

이러한 염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하는데, 특히 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)와 다양한 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생합성과 관련되는 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX)가 염증 반응의 중요한 매개체로 알려져 있다.

NOS는 세 가지 이성질체가 존재하는데, 칼슘이나 카모듈린 의존성인 eNOS(내피성 NOS)와 nNOS(신경성 NOS), 그리고 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 세균의 내독소나 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12과 같은 여러 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 iNOS(유도성 NOS)가 있으며, L-아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소(NO)를 생성한다.

퇴행성 관절염은 퇴행성 관절 질환, 골관절염이라고도 불려지며, 국소적인 관절에 점진적인 관절 연골의 소실 및 그와 관련된 2차적인 변화와 증상을 동반하는 질환이다.

관절을 보호하고 있는 연골의 점진적인 손상이나 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 일어나 염증과 통증이 생기는 질환으로, 관절의 염증성 질환 중 가장 높은 빈도를 보인다.

특별한 기절적 원인 없이 나이, 성별, 유전적 요소, 비만, 특정 관절 부위 등의 요인에 따라 발생하는 일차성 또는 특발성 관절염과 관절 연골에 손상을 줄 수 있는 외상, 질병 및 기형 등이 원인이 되어 발생하는 이차성 또는 속발성 관절염으로 분류하였다.

현재까지 골관절염의 치료목적은 관절의 구조적 손상을 회복시켜주는 방향이 아니고 증상완화에 초점을 맞추어 통증을 줄이고, 질병의 진행을 지연, 관절기능과 삶의 질을 유지시키는 방향으로 성장해 왔다.

하지만, 최근 골관절염의 병에 관한 연구가 깊어짐에 따라 병의 진행 자체를 차단하거나 지연시키고, 관절연골 손상을 회복시킬 수 있는 새로운 치료법들이 발표되고 있으며, 기존의 통증위주의 치료법과 더불어 새로운 치료법들이 보고되고 있다.

최근 국내의 치료제 개발에서 코오롱생명과학의 퇴행성 관절연 치료제인 티슈진-C는 동종 연골세포를 채취하여 연골세포의 재생을 돕는

유전자를 레트로바이러스를 통하여 전달한 후 환자에 주입하는 세포유전자치료제로서 현재 한국에서 임상2상, 미국에서 임상1상 시험 중이며, 그 외에 유사한 접근방법을 이용한 티슈진-B(골재생 치료제)와 티슈진-N(신경질환 치료제)이 비임상시험 단계에 있다.

최근 골관절염의 병인에 대한 연구가 진행되면서 골관절명은 이제 관절의 분해활성이 증가됨으로써 연골의 구조적 손상과 기능소실이 발생되는 활성, 진행성 질병과정이란 인식이 보편화되고 있다. 즉, 골관절염의 병인에 있어 가장 중요한 물질은 interleukin-1b로 연골세포의 prostaglandin(PG) 생성을 억제하고, matrix metalloproteinase(MMP)나 nitric oxide(NO)를 포함한 oxygen-derived free radical 등의 연골을 분해시킬 수 있는 물질의 생성을 촉진, 기질을 분해하고 연골세포의 사멸을 촉진하게 되는 것으로 알려져있다.

또한, 최근 Hyaluronic acid는 또한 골관절염의 진행과 관련된 염증성 혹은 비염증성 과정을 조절(modulate)할 수 있는 것으로 알려졌다. 즉, 토끼 관절염 연구에서 관절 내 Hyaluronic acid의 주사는 주요 염증유발요인인 interleukin 1β의활액 내 발현을 억제하였다. 또 다른 여러 실험들에서도 염증신호분자인 NO의 생산을 억제하였고, TNF-α의 발현도 억제하는 것으로 보고되었다. 그 밖에도 Hyaluronic acid는 고관절과 천장관절, 하악관절의 증상도 완화시키는 것으로 보고되어 단순히 viscosupplementation 효과 이외에 향후 SYSADOA로서의 가능성을 확인시켜주는 약제이다.

염증 및 관절염에 관련한 종래에 제공된 기술들에는 (KR) 공개특허공보 10-2016-0082496호로 제공된 관절염에 효능이 있는 가미계작지모탕 조성물, (KR) 등록특허공보 10-1070036호인 골관절염에 대한 칼시토닌의 용도, (KR) 공개특허공보 10-2005-0014615호인 오미자 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 및치료용 조성물, 및 (KR) 등록특허공보 10-1616011호인 까마귀쪽나무 미성숙과 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 이용한 항염증용 조성물 등 다양한 기술들이 제공되어 있다.

(KR) 공개특허공보 10-2016-0082496 (KR) 등록특허공보 10-1070036 (KR) 공개특허공보 10-2005-0014615 (KR) 등록특허공보 10-1616011

본 발명은 식물 추출물 성분 중 염증에 대한 효능과 골관절염에 대한 효능을 발휘하는 단일 성분을 제시하는 한편, 이 단일 성분을 이용하여 새로운 염증과 골관절염에 효능을 가지는 조성물을 제공할 수 있도록 하고자 한다.

이러한 본 발명의 목적은, 식물 추출물로부터 획득되고, 하기 화학식구조를 가지는 리트세노라이드에 의하여 해결된다.

[화학식]

상기 화학식에서 R₁ : H 이고, R₂ : (CH2)₉C = CH₂ 임을 특징으로 하는 리트세노라이드 A₁(Litsenolide A₁), 또는 R₁ : (CH2)₉C = CH₂ 이고, R₂ : H 임을 특징으로 하는 리트세노라이드 A₂(Litsenolide A₂)로 이루어질 수 있다.

상기 리트세노라이드는 염증 또는 골관절염 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 사용된다.

상기 리트세노라이드는 식물로부터 획득되며, 바람직하게는 까마귀쪽나무(Litsea japonica) 열매로부터 획득된다.

상기 리트세노라이드를 유효성분으로 하는 염증 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 골관절염 예방 및 치료용 약학 조성물이 제공된다.

이와 같은 본 발명인 식물로부터 획득되는 하기 화학식을 가지는 단일 성분인 리트세노라이드(Litsenolide)는 염증 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

[화학식]

또한, 식물로부터 획득되는 상기 화학식을 가지는 단일 성분인 리트세노라이드(Litsenolide)는 골관절염 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명인 리트세노라이드(Litsenolide)를 까마귀쪽나무 열매종자로부터 획득과정을 나타낸 모식도.
도 2는 본 발명인 리트세노라이드(Litsenolide)를 까마귀쪽나무 열매과육으로부터 획득과정을 나타낸 모식도.
도 3은 리트세노라이드(Litsenolide)의 화학구조식

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 될 것이며, 본 명세서에 기재된 실시 예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명은 식물로부터 획득되는 리트세노라이드(Litsenolide)인 단일 성분에 관한 것이다.

이 리트세노라이드(Litsenolide) 단일 성분은 염증과 골관절염에 대한 예방 및 치료에 효능을 가진다.

1. 리트세노라이드 ( Litsenolide )

1-1. 리트세노라이드의 획득

n-Hexane을 추출용매로 하여 식물로부터 Hexane 추출물을 획득하되, 중량대비 4~6(n-Hexane) : 1(식물)의 비율로 실온(15~25℃)에서 24시간 교반시켜 Hexane 추출물을 획득한다.

상기 획득된 Hexane 추출물에 에탄올(Ethanol) 100mL을 넣어 5분간 초음파(Snication) 처리시키고, 극저온(-18~ -25℃)에서 30분간 보관을 시킨다.

극저온에서 보관을 시킨 후, 원심분리기로 3000rpm에서 5분동안 원심분리을 시키고, 상층액을 감압농축하여 얻은 정제추출물을 Prep HPLC로 성분분리를 한다.

분리된 성분을 NMR을 사용하여 측정하고, LC/MS로 분자량를 확인하는 과정을 통하여 [화학식]의 리트세노라이드 A ₁ 과 [화학식]의 리트세노라이드 A ₂ 을 획득한다.

상기 Prep HPLC를 이용하여 성분분리를 하고 분리된 성분을 NMR을 사용하여 측정 후에 참고문헌[(1) Butanolides from Machilus thunbergii and their inhibitory activity on nitric oxide synthesis in activated macrophages., Kim NY et al., 2003, Phytotherapy Research, 17(4):pp.372-375, (2) Components of the Lauraceae familyI : New lactonic compounds from Litsea japoncia, Kenichi Takeda et al., 1972, Phytochemistry, 28(14):pp.3757-3766, (3) Asymmetric Synthesis of αAlkylidene-β-hydroxy-γ-butyrolactones via Enantioselective Tandem MichaelAldol Reaction, Sung il Lee et al., 2013, The Jouranl of Organic Chemistry, 78:pp.770-775, (4) Anti-inflammatory activities of the products of supercritical fluid extraction from Litsea japonica fruit in RAW 264.7 cells, Sang-Mok Song et al., 2016, Journal of Functional Foods, 22(2016):pp.44-51, (5) Chemical Constituents of Plants from the Genus Litsea, 2011, Nisha Agrawal et al., CHEMISTRY & BIODIVERSITY, 8(2011):pp.223-243]과 비교검토하고 LC/MS로 분자량 확인하였다.

compound 4는 하기 [화학식]의 리트세노라이드 A ₁ 로 확인되었고, compound 3은 하기 [화학식]의 리트세노라이드 A ₂ 로 확인되었다.

1-2. 리트세노라이드 A ₁ ( Litsenolide A ₁ )

(가) HR-0101(Litsenolide A₁)의 구조

분자량 : 280.4

R₁ : H, R₂ : (CH2)₉C = CH₂

(나) 리트세노라이드(Litsenolide) A₁의 NMR Data

¹ H-NMR spectrum of Litsenolide A ₁

¹³ C-NMR spectrum of Litsenolide A ₁

Colorless, viscous oil; 1H-NMR( 500 MHz , CDCl ₃ ) : 4.34(1H, br.d, J=4.5 Hz, H-3), 4.32(1H, qd, J= 6.0, 3.5 Hz, H-4), 1.36(3H, d, J=6.5 Hz, H-5), 6.53(1H, td, J=7.5, 1.0 Hz, H-6), 2.74(2H, m, H-7), 1.25-1.45(14H, m, H-8~H-14), 2.02(2H, q, J=7.0 Hz, H-15), 5.80(1H, ddt, J=17.0, 10.5, 6.5 Hz, H-16), 4.91(1H, dd, J=10.0, 3.5 Hz, H-17a), 4.97(1H, dd, J=15.5, 5.5 Hz, H-17b)
13C-NMR( 125 MHz , CDCl ₃ ) : 168.4(C-1), 129.0(C-2), 75.8(C-3), 81.5(C-4), 19.4(C-5), 149.6(C-6), 28.0(C-7), 29.0-29.7(C-8~C14), 34.0(C-15), 139.5(C-16), 114.3(C-17)

Dept 135°NMR ( 125 MHz , CDCl ₃ ) : 168.4(C-1, Quarternary-Carbon), 129.0(C-2, Quarternary-Carbon), 75.8(C-3, CH), 81.5(C-4, CH), 19.4(C-5, CH3), 149.6(C-6, CH), 28.0(C-7, CH2), 29.0-29.7(C-8~C14, CH2), 34.0(C-15, CH2), 139.5(C-16, CH), 114.3(C-17, CH2)

1-3. 리트세노라이드 A ₂ ( Litsenolide A ₂ )

(가) HR-0102(Litsenolide A₂)의 구조

분자량 : 280.4

R₁ : (CH2)₉C = CH_2,R₂ : H

(나) 리트세노라이드(Litsenolide) A₂의 NMR Data

¹ H-NMR spectrum of Litsenolide A ₂

¹³ C-NMR spectrum of Litsenolide A ₂

Colorless, viscous oil; 1H-NMR( 500 MHz , CDCl ₃ ) : 4.51(1H, br.d, J=3.5 Hz, H-3), 4.49(1H, qd, J=6.8, 1.8 Hz, H-4), 1.31(3H, d, J=6.5 Hz, H-5), 6.96(1H, td, J=8.0, 1.5 Hz, H-6), 2.40(2H, m, H-7), 1.25-1.52(14H, m, H-8~H-14), 2.00(2H, qt, J=6.5, 1.5 Hz, H-15), 5.79(1H, ddt, J=17.0, 10.0, 7.0 Hz, H-16), 4.91(1H, dd, J=10.0, 5.0 Hz, H-17a), 4.96(1H, dd, J=17.0, 5.5 Hz, H-17b)
13C- NMR(125 MHz, CDCl ₃ ) : 169.9(C-1), 129.5(C-2), 72.4(C-3), 82.9(C-4), 19.9(C-5), 149.0(C-6), 29.9(C-7), 28.6-29.6(C-8~C14), 34.0(C-15), 139.4(C-16), 114.4(C-17)

Dept 135°NMR ( 125 MHz , CDCl ₃ ) : 169.9(C-1, Quarternary-Carbon), 129.5(C-2, Quarternary-Carbon), 72.4(C-3, CH), 82.9(C-4, CH), 19.9(C-5, CH3), 149.0(C-6, CH), 29.9(C-7, CH2), 28.6-29.6(C-8~C14, CH2), 34.0(C-15, CH2), 139.4(C-16, CH), 114.4(C-17, CH2)

이하, 본 발명에서는 까마귀쪽나무(Litsea japonica) 열매로부터 획득한 리트세노라이드(Litsenolide)인 단일성분 소재를 가지고 실험을 하였으며, 도 1과 도 2와 같은 방법으로 까마귀쪽나무(Litsea japonica) 열매로부터 리트세노라이드(Litsenolide)를 획득하였다.

2. 단일성분 소재의 in vitro 효능평가 실험

2-1. 세포배양방법

마우스(쥐)대 대식세포주인 Raw 264.7 cells은 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받았으며, 세포 배양을 위해 10% FBS과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

2-2. 세포 생존율( MTT assay) 측정방법

세포에 대한 독성 측정은 MTT 방법으로 분석하였다.

Raw 264.7 세포 2×10⁵ cells/mL를 96 well plate에 100㎕씩 분주하고 리트세노라이드(Litsenolide) A₁ 또는 리트세노라이드(Litsenolide) A₂를 10㎍/mL로 24시간 동안 처리하였다.

MTT 시약을 이용하여 well당 10㎕을 첨가하여 37℃, 5% CO₂에서 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO를 넣고 microplate reader를 이용하여 450nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.

2-3. 세포에서 방출된 LDH의 측정방법

Raw 264.7 세포 2×10⁵ cells/mL를 96 well plate에 100㎕씩 분주하고 24시간 후 HR-0101(Litsenolide A₁) 또는 HR-0102(Litsenolide A₂)를 10㎍/mL로 처리하였다. 24시간 후에 상등액을 걷어내어 LDH assay kit를 사용하여 지지된 대로 LDH의 방출량을 측정하였다.

2-4. NO의 농도측정

배양액 내의 nitrite 농도를 NO assay kit를 이용하여 측정하였다.

Raw 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 1×10⁵ cells/mL로 조절한 후 96 well plate에 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기(incubator)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 HR-0101(Litsenolide A₁) 또는 HR-0102(Litsenolide A₂)를 10㎍/mL로 처리하였다. 24시간 후에 상등액을 취하여 Nitric oxide detection kit(Intron, Korea)를 사용하여 시약을 처리한 후 microplate reader를 이용하여 NO의 생성량을 측정하였다.

2-5. 염증성 사이토카인 (IL-6 와 TNF -α)과 PGE ₂ 의 측정

Raw 264.7 cell을 24-well plate에 2×10⁵ cells/mL로 500㎕씩 분주하고 24시간 동안 배양한 다음 각 well에 시료를 처리한 후 24시간 후 상층액을 얻었다. 마우스(Mouse) IL-6, TNF-α, PGE₂ ELISA kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 과정을 진행하고 흡광도 450nm고 각 사이토카인과 PGE₂의 농도를 측정하였다.

2-6. MAPKs의 인산화 수준과 전자 인자 NF - kB p65 translocation 확인

Raw 264.7 세포를 6-well plate에 5×10⁵ cells/well씩 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(incubator)에서 24시간 동안 배양 후 HR-0101(Litsenolide A₁) 또는 HR-0102(Litsenolide A₂)를 1시간 동안 전처리 후 LPS를 1㎍/mL의 농도로 처리 후 차가운 PBS로 3회 씻어준 후, proterse inhibitor 및 phosphotase inhibitor가 첨가된 RIPA buffer를 사용하여 cell을 lysis 시켜주었다. 30분 동안 ice에서 방지한 후, 4℃, 1,300rpm으로 centrifugation을 시켜준 후, 상등액을 취한 후 BCA assay를 사용하여 각 단백질 정량을 해준 후 각 샘플당 30㎍의 단백질을 취하여 western blot(특수 단백질 검출검사)를 시행하였다.

3. 골관절염에 대한 효능 실험

실험동물은 수컷 7주령의 Sprague-Dawley(SD) 랫트(rat, 175~200g)와 수컷 5주령 ICR생쥐(20~22g)는 샘타코바이오코리아사(Osan, Korea)에서 공급받았다.

3-1. 급성관절염 비임상효력시험

(1) 개요

실험군은 SD 흰쥐 정상군 6마리, 대조군 6마리, 양성대조군으로 indomethacin 투여군(1mg/kg) 6마리, HR-0101(Litsenolide A₁) 투여군 (10mg/kg) 6마리, 또는 HR-0102(Litsenolide A₂) 투여군 (10mg/kg) 6마리로 5그룹 30마리로 설정하였다.

약물희석은 0.5% CMC(Carboxymethyl Cellulose)로 혼탁하여 투여하고, 대조군은 0.5% CMC 용액을 동량 투여하였다.

약물투여는 경구투여용 금속제 존대(zonde)를 이용하여 위 내로 강제 경구투여하였다.

(2) 실험방법 및 시험항목

① 일반증상관찰 : 투여 전 기간에 걸쳐 1일 1회 투여 직후의 일반증상을 관찰하였다. 일반증상의 관찰은 사망여부, 증상의 종류 및 정도, 발현일의 개체별로 기록하였다.

② 체중측정 : 모든 동물에 대하여 입수시, 군분리시, 투여개시시에 절식 후 측정하였다.

③ 급성 관절염 유도 : 랫드의 발바닥 용적을 plethysmometer로 측정한 후 시험물질을 경구 투여하고 30분 후에 우측 뒷 발바닥에 기염제로 1% carrageenan/생리식염수를 0.1 mL씩 피하주사하여 급성 관절염을 유발시켰다.

④ 부종 측정 : 부종 유발 후 1시간 간격으로 5회에 걸쳐 부종의 용적을 측정한 후 시험물질 투여전 용적을 기준으로 하여 그 증가율과 억제율을 계산하였다.

3-2. 말초성 진통 억제 비임상효력시험 (Acetic acid-induced writhing test)

(1) 실험군은 ICR 생쥐 정상군 10마리, 대조군 10마리, 양성대조군으로 케타민 (0.1ml, 0.2%)투여군 10마리, HR-0101( Litsenolide A ₁ ) 투여군 (10 mg/kg) 10마리, HR-0102( Litsenolide A ₂ ) 투여군 (10 mg/kg) 10마리씩으로 5그룹 50마리로 설정하였다.

(2) 약물희석은 0.5% CMC (Carboxymethyl Cellulose)로 혼탁하여 투여하고, 대조군은 0.5% CMC 용액을 동량 투여하였다. 약물투여는 경구투여용 금속제 존대 (zonde)를 이용하여 위내로 강제 경구투여 하였다.

(3) 까마귀쪽나무열매 정유성분의 진통효과를 알아보기 위한 방법의 하나로 복부 수축 반응을 지표로 하며, 말초신경계의 진통 효력 시험에 주로 사용되는 시험방법이다.

(4) 실험동물은 5주령 ICR mouse를 1주간 습도 50%, 온도 24~26℃로 유지되는 사육장에서 순화시켰으며, 사료 및 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다. 자극물(초산 0.75% 함유 생리 식염수)을 0.1mL/10g body wt의 용량으로 실험 전 12시간 동안 절식시킨 마우스의 복강에 주사로 주입하였으며, 자극물의 주입 60분 전 HR-0101( Litsenolide A ₁ ) 투여군 (10mg/kg)과 HR-0102( Litsenolide A ₂ ) 투여군 (10mg/kg)을 경구 투여하였다.

(5) 자극물이 투입되면 복강 내에서 통증을 유발하여 몸을 뒤틀거나, 뒷다리를 쭉 뻗는 동작 등의 writhing syndrome 반응을 보이게 된다. 총 10분 동안 writhing (몸을 뒤튼 상태로 2초 이상 지속) 횟수를 측정하였다.

3-3. 모노소듐 아이도아세테이트(MIA)에 의한 골관절염 비임상효력시험

(1) 실험군은 6주령 SD rat 흰쥐 정상군 6마리, MIA 유도대조군 6마리, 양성대조군으로 indomethacin (1mg/kg)투여군 6마리, HR-0101( Litsenolide A ₁ ) 투여군 (10mg/kg) 6마리, HR-0102( Litsenolide A ₂ ) 투여군 (10 mg/kg) 6마리로 5그룹 30마리로 설정하였다.

(2) 약물희석은 0.5% CMC (Carboxymethyl Cellulose)로 혼탁하여 투여하고, 대조군은 0.5% CMC 용액을 동량 투여하였다. 약물투여는 경구투여용 금속제 존대(zonde)를 이용하여 위내로 강제 경구투여 하였다.

(3) MIA(monosodium iodoacetate)에 의한 골관절염 유발방법 : 약물 유도 모델은 실험동물에 특정 약물을 intra-articular injection 등의 방법으로 주입하여 chondrocyte의 metabolism을 저해하거나, ligament와 tendon의 손상을 유발함으로서 골관절염을 발생시키는 방법으로 MIA(monosodium iodoacetate)를 사용하여 골관절염을 유발시켰다.

랫트를 마취시킨 후 골관절염 유발물질인 MIA(Monosodium iodoacetate) 0.3mL를 오른쪽 무릎 관절강 내에 0.9% saline으로 희석하여 50㎕(60mg/mL)씩 투여하였다(도 4 참조). MIA 투여 7일 후에 관절염 유발 유무를 확인하여 관절염이 유발된 동물만을 사용하였다.

(4) 뒷다리 체중 부하 측정은 Incapacitance tester를 사용하여 오른쪽, 왼쪽 발을 각각 측정하였다. 골관절염이 유발된 Rat은 tester의 holder 안에서 MIA를 투여하지 않은 발에 의지하여 서게 되는데, Rat의 배가 기기의 센서에 닿지 않은 상태에서 양쪽의 발 무게(g)를 각각 측정하였다. 실험결과는 왼쪽 발 무게에 대한 오른쪽 발 무게를 다음과 같이 계산하여 평균(%)±표준오차로 표시하였다. 시험물질은 오전에 투여하고 측정은 오후에 하는 것을 원칙으로 하며, 뒷다리 체중 부하 측정일은 MIA 유발 후 4, 7, 11, 14일째 되는 날에 각각 시행하였다.

* 계산식(%) = 유발된 하지의 무게/정상 하지의 무게]×100

* 체중부하값(%) = 정상뒷자리의 무게/관절염이 유발된 뒷다리의 무게

* 상대적통증비율(%)= (각군의 제중부하 평균값/정상군의 체중부하 평균값) ×100

양성대조군으로 NSAID 약물로는 주로 염증의 중요한 매개자인 cyclooxygenase enzymes 활성을 억제하여 prostaglandin 합성을 저해함으로써 항염증 작용을 나타내는 항염증 약물인 indomethacin을 사용하였다.

(5) 체중 측정은 매주 동일한 요일의 시간에 측정하여 기록하였다.

(6) 식이효율 측정은 1 주일에 1 회씩 식이섭취량(g)을 측정하였다. 식이섭취량은 매주 측정일의 일정한 시간에 측정하여 일평균 섭취 식이량을 산출하였으며, 식이 효율(feed efficiency ratio, FER)은 체중증가량을 식이섭취량으로 나누어서 계산하였다.

FER = [Total weight gain / Total food intake ] x 100

(7) 혈액학적 분석 : 부검 하루 전 절식시킨 랫드를 실험 최종일에 에테르(Ethyl ether)로 마취한 후 심장천자법으로 혈액은 항응고제인 EDTA가 들어있는 채혈관을 이용하여 채혈하였다. 채혈된 혈액을 총 백혈구, 백혈구 중의 호중구, 단핵구의 분포도를 자동혈구분석기(HEMAVET, CDC Technolgy, USA)를 사용하여 분석하였다.

(8) MIA 골관절염 랫드모델의 혈장 중 간 기능 및 신장 기능 분석 : 마취된 실험동물 심장에서 혈액을 10ml 취해 혈청분리용 튜브(tube)에 담고, 3000 rpm에서 20분간 원심분리 후 혈청을 얻어 생화학적 지표 분석을 위한 시료로 이용하였다. 분리한 혈장(plasma)에서 간 기능의 지표인 ALT 및 AST를, 신장 기능의 지표인 creatine의 수준을 생화학자동 분석기를 이용하여 측정하였다.

(9) 염증 사이토카인 ELISA 측정 : 채혈한 혈액으로부터 혈청을 분리한 뒤, 혈청중 염증성 지표로서 IL-1β, TNF-α, IL-6 단백질의 발현량을 ELISA법으로 측정하였다.

(10) 혈청 내 염증매개인자 ELISA 측정 : PGE2 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), LTB4 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), Osteocalcin (MK147, TaKaRa, Japan), 그리고 Deoxypyridinoline (Kamiya biomedical, KT-59767, USA)등의 염증성 매개인자들은 각각의 assay kit를 이용하여 농도를 측정하였다.

(11) 관절조직 내 염증매개인자 COX-2, 5-LOX(->Arachidonate 5-lipoxygenase) ELISA 측정

(12) 관절조직 내 연골흡수 지표 (gelatinase A, gelatinase B) ELISA 측정

(13) 관절조직 유전자 발현 분석

실험 종료 후 각 실험동물로부터 적출한 왼쪽 관절조직(knee)에서의 유전자 발현 양상을 real-time PCR 증폭법을 사용하여 관찰하였다.

랫드 관절조직(0.1g)을 RNAzolB(Tel-Test)용액으로 RNA를 추출한 뒤 One-step SYBR Green PCR kit(AB science)를 사용하여 cDNA 및 real-time PCR 분석을 하였다. 활막조직(synovial tissue)에 RNAzol(B) 500㎕를 넣고 homogenizer로 조직을 분쇄하여 여기에 chloroform (CHCl3)50㎕를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다.

이를 얼음에 15분간 방치한 후 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 약 200㎕의 상층액을 회수하여 2-propanol 200㎕와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15분간 방치하였다. 이를 다시 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 80% EtOH로 수세하고 3분간 vaccum pump에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 처리한 20㎕의 증류수에 녹여 heating block 75℃에서 불활성화시킨 후 first strand cDNA합성에 사용하였다.

③ 역전사 (reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3㎍을 DNase I (10U/㎕) 2U/tube를 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5㎕ 10 mM dNTPs mix, 1㎕ random sequence hexanucleotides (25 pmole/ 25㎕), RNA inhibitor로서 1㎕ RNase inhibitor (20 U/㎕), 1㎕ 100 mM DTT, 4.5㎕ 5×buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15mM MgCl2)를 가한 후, 1㎕의 M-MLV RT (200 U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20㎕가 되도록 하였다. 이 20㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000rpm에서 5초간 원심침강하여 37℃ heating block에서 45분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)에 사용하였다. Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다(아래 표 참조).

Rat Probe & Oligonucleotide 배열

Gene		Primer sequence
IL-1beta	forward reverse	5'-CCCTGCAGCTGGAGAGTGTGG-3' 5'-TGTGCTCTGCTTGAGAGGTGCT-3'
IL-6	forward reverse	5'-TTCCTACCCCAACTTCCAATG-3' 5'-ATGAGTTGGATGGTCTTGGTC-3'
TNF-alpha	forward reverse	5'-GACCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3' 5'-TGCTACGACGTGGGCTACG-3'
COX-2	forward reverse	5'-TGGTGCCGGGTCTGATGATG-3' 5'-GCAATGCGGTTCTGATACTG-3'
GAPDH-VIC	Probe	The Applied Biosystems®Rat GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC®/MGB Probe, 4352338E

④ 유전자 발현은 TaqMan probe(FAM dye-labeled, ABi, USA)를, internal standard를 Mouse GAPDH probe set; Endogenous Control(VIC®/ MGB Probe, Probe limited) from Applied Biosystems(4352339E)를 사용하였고, primer의 최종 농도가 200nM이 되게 반응시켰다.

Real time quantitative PCR의 조건은: pre-denaturation은 2 min at 50℃, 10 min at 94℃, 그리고 40 cycles을 0.15 min at 95℃, 1 min at 45℃에서 수행하였다.

⑤ 실험군과 대조군은 internal standard로 G3PDH를 사용하여 target group의 Quantitative PCR y = x(1+e)n x = starting quantity y = yield n = number of cycles e = efficiency로 계산하여 RQ (relative quantitative)을 측정하였다.

(14) 조직병리학적 검사

실험종료 후 관절(knee) 부위를 절단하여 10% EDTA가 포함된 10% formalin 용액에 넣어 joint를 decalcification 시켰다.

염증반응 발생 유무나 활막세포의 증식, 염증세포의 조직침윤 여부는 H&E 염색결과에서 확인할 수 있으며, proteoglycan층을 염색하는 Safranin O 염색결과에서는 연골조직의 손상여부를 확인할 수 있다.

(15) 통계처리 : 대조군과 약물투여군의 측정치를 비교하여 투여로 인한 변화를 대조군에 대한 투여군의 백분율로 표시하거나, 평균과 표준오차등 측정된 수치 및 오차를 근거로 Student t-test (SPSS program)등 통계법을 이용하여 유의성을 검증하였다.

4. HR-0101( Litsenolide A ₁ )과 HR-0102( Litsenolide A ₂ )의 in vitro 효능 평가

4-1. Raw 264.7 세포에서 MTT assay에 의한 세포 생존율

HR-0101	HR-0102

Effects of HR-0101( Litsenolide A ₁ ), and HR-0102( Litsenolide A ₂ ) on cell viability in Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells were treated with various concentrations of extracts for 24 h, and then cell viability was measured by MTT assay. The data represent the mean ±SD of triplicate determinations. (*; p <0.05 vs. Control)

마우스 대식세포인 Raw 264.7 세포에서 HR-0101(Litsenolide A₁)과 HR-0102(Litsenolide A₂)에 의한 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과 HR-0101(Litsenolide A₁)과 HR-0102(Litsenolide A₂) 모두 0.78 ~ 25 ㎍/㎖까지는 세포의 80 ~ 100% 이상의 생존율을 보였다.

4-2. Raw 264.7 cells에서 단일성분 소재에 의한 LDH 생성

HR-0101	HR-0102

Effect of HR-0101 and HR-0102 on LDH release in Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells were treated with various concentrations of extracts for 24 hr, and then cell culture supernatant was determined by LDH assay. The data represent the mean ±SD of triplicate determinations.(*; p <0.05 vs. Control)

Raw 264.7 세포에서 HR-0101과 HR-0102에 의한 LDH의 생성율을 측정하였다.

그 결과 HR-0101과 HR-0102 모두 MTT assay 에서의 비슷한 양상으로 25 ㎍/㎖이상의 농도에서 증가하는 결과를 얻었다.

4-3. Lipopolysaccharide ( LPS )에 의해 활성화된 Raw 264.7 cells에서 HR-0101(Litsenolide A ₁ )과 HR-0102( Litsenolide A ₂ )에 의한 Nitric Oxide와 Prostaglandin E2의 억제 효과

(A)	(B)

Effect of HR-0101 and HR-0102 on NO and PGE2 production in LPS-activated Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells were treated with various concentrations of HR-0101 and HR-0102 for 1 hr followed by stimulation with LPS(1μg/ml) for 24 hr. The level of NO and PGE2 in the cell culture supernatant was measured by (A) NO and (B) PGE2 detection Kit. The data represent the mean ±SD of triplicate determinations. (; p <0.05, **; p<0.001 vs. LPS treated control)

LPS에 의해 활성화된 Raw 264.7 세포에서 HR-0101(Litsenolide A₁)과 HR-0102(Litsenolide A₂)에 의한 (A) NO 와 (B) PGE2의 생성을 측정하였다.

그 결과 HR-0101(Litsenolide A₁)과 HR-0102(Litsenolide A₂)에서 농도에 비례하여 감소하는 것을 확인하였다.

4-4. Lipopolysaccharide ( LPS )에 의해 활성화된 Raw 264. 7세포에서 IL- 6와 TNF-α의 염증성 cytokines 측정

(A)	(B)

Effect of HR-0101(Litsenolide A ₁ ) and HR-0102(Litsenolide A ₂ ) on inflammatory cytokines production in LPS-stimulated Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells were treated with various concentrations of extracts for 1 hr followed by stimulation with LPS(1 μg/ml) for 18 hr. The levels of (a) TNF-α and (b) IL-6 were determined by ELISA. The data represent the mean ±SD of triplicate determinations. (; p <0.05, **; p<0.001 vs. Control)

HR-0101(Litsenolide A₁)과 HR-0102(Litsenolide A₂)의 면역활성 능력을 평가하기 위해 LPS에 의해 활성화된 Raw 264.7세포를 활용하여 IL-6와 TNF-α의 농도를 측정하였다.

그 결과 IL-6 와 TNF-α의 생성이 HR-0101(Litsenolide A₁)과 HR-0102(Litsenolide A₂)의 농도에 비례하여 감소함을 보였다.

4-5. Lipopolysaccharide ( LPS )에 의해 활성화된 Raw 264. 7세포에서 MAPKs (ERK1/2, P38 and JNK )의 인산화에 대한 효과 검증

Effects of HR-0101(Litsenolide A ₁ ) and HR-0102(Litsenolide A ₂ ) on MAPKs phosphorylation in LPS-induced Raw 264.7 cells.
Raw 264.7cells were treated with HR-0101(Litsenolide A1) and HR-0102(Litsenolide A2) for 1 h, then treated with LPS (1 μg/ml) for 0.5 h . (A) The phosphorylation levels of ERK1/2, JNK1/2 and p38 were analyzed by Western blot.

LPS에 의해 활성화된 Raw 264.7 세포에서 HR-0101(Litsenolide A₁)과 HR-0102(Litsenolide A₂)에 의한 MAPKs(ERK1/2, p38 and JNK)에서의 인산화 수준을 웨스턴 블랏(western blot)으로 확인하였다.

HR-0101(Litsenolide A₁)과 HR-0102(Litsenolide A₂) 모두 p38의 인산화를 억제하였으며, HR-0101(Litsenolide A₁)의 5μ의 농도에서 p38의 인산화가 감소되는 것을 보였다.

4-6. Lipopolysaccharide ( LPS )에 의해 활성화된 Raw 264. 7세포에서 NF -κB p65의 translocation에 미치는 영향

Effects of HR-0101( Litsenolide A ₁ ) and HR-0102( Litsenolide A ₂ ) on the nuclear translocation of NF - κB p65 in LPS -induced Raw 264.7 cells.
Raw 264.7 cells were treated with HR-0101(Litsenolide A₁) and HR-0102(Litsenolide A₂) for 1 h before treatment with 1μLPS for 20 min. Nuclear, cytosolic proteins were separeted. Translocation of NF-κB p65 to the nucleus, as determined by Western blot analysis. β-actin and YY-1 were used as internal controls for the cytosolic and nuclear proteins.

LPS에 의해 활성화된 Raw 264.7 세포에서 염증반응에서 중요한 전사인자인 NF-κB p65의 세포질에서 핵으로의 이동(translocation)을 확인한 결과 다소 감소하는 것을 볼 수 있었다.

5. HR-0101( Litsenolide A ₁ )과 HR-0102( Litsenolide A ₂ )의 in vivo : MIA (monosodium iodoacetate )에 의한 골관절염 비임상효력시험

5-1. MIA로 유도한 골관절염 유발 동물모델에서 HR-0101( Litsenolide A ₁ ) and HR-0102( Litsenolide A ₂ )의 항골관절 효능평가

(가) MIA(monosodium iodoacetate )에 의한 골관절염 유발

연골세포(chondrocyte)의 물질대사(metabolism)를 저해하거나, 인대(ligament)와 힘줄(tendon)의 손상을 유발함으로서 골관절염을 발생시키는 방법으로 MIA (monosodium iodoacetate)를 사용하여 골관절염을 유발시켰다.

(나) 뒷다리 체중 부하 측정

Effects of HR-0101( Litsenolide A ₁ ) and HR-0102( Litsenolide A ₂ ) on changes in hindpaw weight-bearing distribution in MIA-induced OA in rats.
The weight-bearing distribution ratio was measured once a week for 21 days after the injection of MIA using an incapacitance tester, compared to that of the MIA induced group. (*; p <0.05, **; p<0.01, ***; p<0.001 vs. Control)

뒷다리 체중 부하 측정은 Incapacitance tester를 사용하여 오른쪽, 왼쪽 발을 각각 측정하였다.

상기 표에서 보듯이 뒷다리 체중 부하를 시험물질 투여 0, 7, 14, 21일에서 측정한 결과, MIA대조군에 비하여 소염진통제(indomethacin) 1mg/kg > HR-0101(Litsenolide A₁) > HR-0102(Litsenolide A₂) 순으로 통증억제율이 유의성 있게 나타남. 특히 indomethacin 1mg/kg, HR-0101(Litsenolide A₁), HR-0102(Litsenolide A₂) 투여군은 MIA 대조군에 비하여 통증억제율의 증가를 나타내었다.

(다) 관절의 조직학적 분석

Histopathological features of the knee joint tissues of rats with MIA-induced OA. Representative photographs of knee joint tissues stained with (upper) H&E or (bottom) Safranin O-fast green (magnification, 100x).

실험 종료 후 관절조직을 H&E 염색과 Safranin O 염색하여 MIA 대조군의 연골세포 주변의 염색성이 현저하게 감소하였고, 관절주변에 대식세포, 과립구세포, 단핵구 세포, 활막염증화 세포, 그리고 활막세포 hyperplasia의 침투가 일어나 연골과 뼈의 침하로 joint architecture의 손실이 일어난 것을 관찰할 수 있다. 또한, 사프라닌(Safranin) O 염색에서 거의 빨간색 염색 조직이 MIA로 연골의 파괴(distruction)가 나타나 사라진 것을 관찰할 수 있다(blue square).

그 결과, 21일 후에 부검하여 무릎관절조직을 염색하여 분석한 결과, MIA대조군에 비하여 indomethacin 1mg/kg > HR-0101(Litsenolide A₁) > HR-0102(Litsenolide A₂) 순으로, 관절주변에 대조군에서 관찰된 대식세포, 과립구세포, 단핵구 세포, 활막염증화 세포, 그리고 활막세포 hyperplasia의 침투에 의한 연골과 뼈의 침하 등이 거의 사라졌고, Safranin O 염색에서 빨간색 염색 조직이 활막주변에 많이 분포하였다(blue square).

5-2. MIA로 유도한 골관절염 유발 동물모델에서 HR- 0101(Litsenolide A ₁ )와 HR-0102( Litsenolide A ₂ )의 혈청 내 염증 싸이토카인 및 염증인자 수준 측정

가. 혈청 내 염증 싸이토카인 IL- 1β , IL- 6와 TNF -alpha 수준 변화

Quantification of pro-inflammatory cytokines in serum of monosodium iodoacetate -induced osteoarthritis rat
IL-1β serum levels (A) IL-6 serum levels (B), and TNF-α serum levels (C) were measured by a sandwich ELISA using an ELISA kit (BD, USA), and the other methods for assay were performed as described in Materials and Methods. Statistically significant value compared with MIA-CTL by T test (*p<0.05, **p<0.01. ***p<0.001)

실험 종료 후 골관절염의 혈액을 채혈하여 혈청을 분리 후 IL-1β (표. A), IL-6 (표. B), TNF-α (표 C)의 수준을 측정하였다. 혈청 내 IL-1β, IL-6 와 TNF-α는 정상군에 비하여 골관절염 유발 대조군에서 2~10배 이상 현저하게 증가하였다.

본 실험결과 HR-0101(Litsenolide A₁) 투여군에서 염증사이토카인인 IL-1β와 TNF-a 단백질 수준은 MIA 대조군에 비하여 통계학적 유의성 있게 감소하는 것 확인할 수 있었다(*p<0.05, **p<0.01). 그러나 HR-0102(Litsenolide A₂) 투여군은 MIA 대조군에 비하여 통계학적 유의성이 나타나지 않았다.

나. 혈청 내 염증성 매개인자 LTB4 , DPD와 5-LOX 단백질 수준 변화

Quantification of arachidonic acid metabolism Leukotriene B4, DPD , and 5-LOX on madiator of serum in monosodium iodoacetate -induced osteoarthritis rat
Arachidonic acid metabolism of Leukotriene B4 serum levels (A) DPD serum levels (B), and 5-LOX serum levels (C) were measured by a sandwich ELISA using an ELISA kit (Cayman, USA), and the other methods for assay were performed as described in Materials and Methods. Statistically significant value compared with MIA-CTL by T test (*p<0.05, **p<0.01. **p<0.001)

실험 종료 후 골관절염의 혈액을 채혈하여 혈청을 분리 후 Arachidonic acid 대사작용에 생산되는 염증매개인자 LTB4 (표의 A), DPD (표의 B), 5-LOX (표의 C)의 혈청 중 단백질량 수준을 측정하였다.

측정결과, 혈청내 LTB4 (표의 A), DPD (표의 B), 5-LOX (표의 C)는 정상군에 비하여 골관절염 유발 대조군에서 29% 이상 증가하였다. 본 실험결과 염증성 매개인자인 LTB4, DPD 단백질 수준은 HR-0101(Litsenolide A₁) 투여군에서 MIA대조군에 비하여 통계학적 유의성 있게 감소하는 것 확인할 수 있었다(*p<0.05, **p<0.01). 그러나 HR-0102(Litsenolide A₂) 투여군은 MIA대조군에 비하여 통계학적 유의성이 나타나지 않았다.

다. 혈청 내 염증성 매개인자 Osteocalcin 단백질 수준 변화

Quantification of Osterocalcin level on madiator of serum in monosodium iodoacetate -induced osteoarthritis rat
Osterocalcin serum levels were measured by a sandwich ELISA using an ELISA kit (AbCam, USA), and the other methods for assay were performed as described in Materials and Methods. Statistically significant value compared with MIA-CTL by T test (*p<0.05, **p<0.01. ***p<0.001)

오스테오칼신(Osteocalcin)은 골대사 회전의 지표, 특히 골형성의 생화학적 지표로서 여러가지 대사성 골질환에서 측정된다. 혈청내 Osteocalcin은 정상군에 비하여 골관절염 유발 대조군에서 2배 이상 증가하였다.

실험결과 골형성 인자인 오스테오칼신(Osteoclacin) 단백질 수준은 MIA대조군에 비하여 HR-0101(Litsenolide A₁) 투여군에서 통계학적으로 유의성 있게 감소하는 것 확인할 수 있었다(*p<0.05).

라. 관절조직 내 염증 싸이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-alpha, 그리고 COX-2 mRNA 유전자 발현 수준 변화

Quantification of Pro-inflammatory IL- 1β , IL-6, COX-2, and TNF -a mRNA expression by real-time PCR in joint tissue of MIA-induced Rat osteoarthritis.
IL-1β mRNA expression levels (A) IL-6 mRNA expression levels (B), TNF-α mRNA expression levels (C), and COX-2 mRNA expression levels (D) were measured by a real-time PCR using an ABi 7500 real-time PCR (BD, USA), and the other methods for assay were performed as described in Materials and Methods. Statistically significant value compared with MIA-CTL by T test (*p<0.05, **p<0.01. **p<0.001)

실험 종료 후 골관절염의 관절조직을 적출하여 total RNA에서 IL-1β (표의 A), IL-6 (표의 B), TNF-α (표의 C), 그리고 COX-2 (표의 D) mRNA 발현 수준을 측정하였다. 관절조직내 IL-1β, IL-6, TNF-α, 그리고 COX-2 mRNA 발현 수준은 정상군에 비하여 골관절염 유발 대조군에서 2.5배 이상 현저하게 증가하였다.

본 실험결과 관절조직 내 염증사이토카인인 IL-1β와 TNF-α, 그리고 COX-2 mRNA 발현 수준은 MIA대조군에 비하여 HR-0101(Litsenolide A₁) 투여군에서 통계학적으로 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(*p<0.05).

마. 관절조직 내 단백질분해 인자인 MMP -2, MMP -9, 그리고 COX-2 단백질 활성 수준 변화

Quantification of Gelatinase A ( MMP - 2), Gelatinase B ( MMP -9), and COX-2 of femur joint in monosodium iodoacetate -induced osteoarthritis rat
MMP-2 mRNA expression levels (A) MMP-9 mRNA expression levels (B), and COX-2 mRNA expression levels (C) were measured by a real-time PCR using an ABi 7500 real-time PCR (BD, USA), and the other methods for assay were performed as described in Materials and Methods. Statistically significant value compared with MIA-CTL by T test (*p<0.05, **p<0.01. **p<0.001)

실험 종료 후 골관절염의 관절조직을 적출하여 단백질 정량 후 MMP-2(표의 A), MMP-9(표의 B), 그리고 COX-2(표의 C) 단백질 활성 수준을 측정하였다.

관절조직 내 MMP-2, MMP-9, 그리고 COX-2 단백질 수준은 정상군에 비하여 골관절염 유발 대조군에서 4배 이상 현저하게 증가하였다.

실험결과 관절조직 내 단백질분해 인자인 MMP-2, MMP-9, 그리고 COX-2 단백질 수준은 MIA대조군에 비하여 HR-0101(Litsenolide A₁) 투여군에서 통계학적으로 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(*p<0.05, **p<0.01, **p<0.001).

5-3. MIA로 유도한 골관절염 유발 동물모델에서 체중, 사료섭취량 및 식이효율 측정

가. 체중의 변화

Body weight change in the Articular Cartilage of MIA-injected Knee Joints of Male SD Rat
Body weight in MIA solution (3mg/50 L of 0.9% saline) was directly injected into the intra-articular space of the right knee, and detected during 21 days of continuous oral treatment of three references and HR-0101(Litsenolide A₁) and HR-0102(Litsenolide A₂) in OA rat and the other methods for assay were performed as described in Materials and Methods. Statistically significant value compared with MIA-CTL by T test (*p<0.05, **p<0.01. ***p<0.001)

3주간 약물 투여를 진행하는 동안 1주일에 1회씩 대조군 및 투여군 모두 체중 변화를 관찰한 결과 MIA 대조군에 비하여 양성대조군인 indomethacin 1mg/kg과 HR-0102(Litsenolide A₂) 투여군에서 MIA 대조군에 비하여 각각 9.4%와 1.4% 체중감소가 통계학적으로 유의성 있게 나타났다(p<0.05, p<0.01).

나. 식이효율 분석

Change of Food Efficiency Ratio (FER,%) in MIA-injected Knee Joints of Male SD Rat
The food efficiency ratio (B) is calculated by (daily body weight gain/daily food intake) ×100 (A)and HR-0101(Litsenolide A₁) and HR-0102(Litsenolide A₂) in OA rat and the other methods for assay were performed as described in Materials and Methods. Statistically significant value compared with MIA-CTL by T test (*p<0.05, **p<0.01. ***p<0.001)

시험 종료 시, 사료섭취량과 체중증가량을 이용하여 각 군의 3주간 식이효율을 구해보았을 때, 인도메타신(indomethacin) 1mg/kg 투여군이 MIA 대조군에 비하여 식이 효율이 유의성 있게 감소하였고, HR-0101( Litsenolide A ₁ )과 HR-0102(Litsenolide A ₂ ) 투여군은 MIA 대조군과 통계적으로 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다. 이러한 결과는 인도메타신 투여군은 부작용인 것으로 생각되어진다.

5-4. MIA로 유도한 골관절염 유발 동물모델에서 혈액학적 변화 측정

가. MIA로 유도한 골관절염 유발 동물모델에서 혈청변화 측정

Blood chemistry change of AST & ALT and Uric acid in MIA-injected Knee Joints of Male SD Rat
Clinical Chemistry changes of AST & ALT (A) and Uric acid (B) of monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis rat after 3 weeks treatment.and three different dosages of HR-0101(Litsenolide A₁) and HR-0102(Litsenolide A₂) in OA rat and the other methods for assay were performed as described in Materials and Methods. Statistically significant value compared with MIA-CTL by T test (*p<0.05, **p<0.01. ***p<0.001)

MIA 동물실험 종료 후 전날에 diet를 제거하여 공복상태 (약 16시간)에서 ethyl ether로 마취하고, 10ml syringe로 심장에서 혈액을 채혈한 후 실온에서 1시간 방치한 후 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 혈청자동측정기로 혈청중 GOT, GPT 수준을 측정한 간기능과 대사성지표인 요산(Uric acid) 측정 결과이다.

그 결과 GOT 수준은 양성대조군인 인도메타신(indomethacin) 투여군을 포함한 HR-0101( Litsenolide A ₁ )과 HR-0102( Litsenolide A ₂ ) 투여군 모두에서 간독성이 나타나지 않았다. GPT 수준은 대조군에 비하여 양성대조군인 인도메타신 투여군을 포함한 HR-0101( Litsenolide A ₁ )과 HR-0102( Litsenolide A ₂ ) 투여군에서 통계학적으로 유의성 있게 감소를 나타내어 결과적으로 간독성은 나타나지 않았다.

그리고 대사성질환의 지표인 요산 수치도 인도메타신 투여군을 포함한 HR-0101(Litsenolide A ₁ )과 HR-0102( Litsenolide A ₂ ) 투여군에서 약간 감소하였으나 통계학적으로 유의성 있는 변화는 나타나지 않았다.

Claims

식물 추출물로부터 획득되며, 하기 화학식구조를 가지고 분자량이 280.4인 리트세노라이드.
[화학식]
제1항에 있어서,
R₁ : H 이고, R₂ : (CH2)₉C = CH₂ 임을 특징으로 하는 리트세노라이드.
제1항에 있어서,
R₁ : (CH2)₉C = CH₂ 이고, R₂ : H 임을 특징으로 하는 리트세노라이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리트세노라이드는 염증 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 사용됨을 특징으로 하는 리트세노라이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리트세노라이드는 골관절염 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 사용됨을 특징으로 하는 리트세노라이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리트세노라이드는 식물로부터 획득됨을 특징으로 하는 리트세노라이드.
제6항에 있어서,
상기 리트세노라이드는 까마귀쪽나무(Litsea japonica) 열매로부터 획득됨을 특징으로 하는 리트세노라이드.
제6항에 있어서, 상기 리트세노라이드는,
n-Hexane을 추출용매로 하여 중량대비 4~6(n-Hexane) : 1(식물의 열매)의 비율로 실온(15~25℃)에서 24시간 교반시켜 헥산(Hexane) 추출물을 획득하고,
상기 획득된 헥산 추출물에 에탄올(Ethanol) 100mL을 넣어 5분간 초음파(Sonication) 처리와, 극저온(-18~-25℃)에서 보관처리와, 원심분리를 하여 획득되는 상층액을 감압농축시켜 정제추출물로부터 획득됨을 특징으로 하는 리트세노라이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리트세노라이드를 유효성분으로 하여 제조됨을 특징으로 하는 염증 예방 및 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리트세노라이드를 유효성분으로 하여 제조됨을 특징으로 하는 골관절염 예방 및 치료용 약학 조성물.