KR20190035052A - 상처 치료용 저온 플라즈마 생성장치 및 상처 치료를 위해 저온 플라즈마를 처리하는 방법 - Google Patents

상처 치료용 저온 플라즈마 생성장치 및 상처 치료를 위해 저온 플라즈마를 처리하는 방법 Download PDF

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서정훈
이대훈
김준범
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한림대학교 산학협력단
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Abstract

저온 플라즈마 응용에 관한 수많은 연구는 항생 효과, 항암 효과를 포함하여 인상적인 결과들을 만들어내었다. 비록 저온 플라즈마 연구가 임상 적용을 포함하여 다양한 분야로 뻗어가고 있지만, 상처 치유에 대한 저온 플라즈마의 효과와 작용 기작에 대해서는 자세히 알려진 바가 없다. 본 발명자들은 저온 플라즈마 노출 이후 유도되는 성장인자의 긍정적 효과를 연구하였고, 일차 배양한 사람 진피 섬유아세포에서 저온 플라즈마에 의해 유도되는 HIF1α 발현에 의해 매개되는 혈관생성 성장인자의 발현이 증가함을 밝혔다. 세포 생존율 분석에서, 섬유아세포 생존율은 5분간 저온 플라즈마 처리한 다음 6시간 경과 및 24시간 경과한 시료에서만 감소하였고, 활성산소종 제거제인 NAC로 선처리한 경우에는 세포 손실이 억제되었다. 저온 플라즈마 처리 후 섬유아세포 이동은 스크래치 상처 치료 분석법에서 6시간 및 24시간에서 현저히 증가하였고, 사이토카인 발현이 현저히 변화하였으며, 조절 성장인자는 6시간 및 24시간 후 유도되었다. 이 실험은 실시간 PCR 및 ELISA를 이용하여 수행하였다. 특히, 저온 플라즈마 처리는 혈관생성 상향 조절자인 HIF1α의 발현을 현저히 유도하였다. 저해제인 CAY10585로 선처리하면 HIF1α 발현이 저해되며, 저온 플라즈마에 의해 유도되는 혈관생성 성장인자 생산이 저해되었다. 종합하면, 저온 플라즈마 처리는 혈관생성을 촉진하는 분자적 기작에 의해 상처를 치유하는 것이라고 할 수 있다.

Description

상처 치료용 저온 플라즈마 생성장치 및 상처 치료를 위해 저온 플라즈마를 처리하는 방법 {Low temperature plasma devices and low temperature plasma treating methods}
본 발명은 상처 치료용 저온 플라즈마 생성장치 및 상처 치료를 위해 저온 플라즈마를 처리하는 방법에 관한 것으로서, 저온 플라즈마를 30초 내지 5분간 상처 부위에 처리하면 섬유아세포에서 혈관생성 성장인자의 생산이 촉진되어 상처 치유가 활발해진다.
유전체 장벽 방전 (Dielectric barrier discharge; DBD) 장치는 저온 플라즈마 (low temperature plasma; LTP)를 생성하는데, 저온 플라즈마는 상온, 대기압 하에서 전기 방전에 의해 생성되는 부분적으로 이온화된 기체로 정의된다. 이와 같은 저온 플라즈마는 "차갑다"고 표현되는데, 이는 헬륨, 아르곤 및 공기와 같은 운반 기체가 부분적으로 이온화되고, 그리하여 이온이 매우 빠르게 냉각되기 때문이다 [1]. 플라즈마는 이온, 하전된 입자, 전기장 및 활성산소종과 활성질소종 (ROS/RNS)으로 구성되며, 이는 생물학적으로 활성이 있다. 직접 DBD 플라즈마는 H2O2를 생성하며, 이것은 사람 섬유아세포 증식과 분화를 감소시키지만, 독성을 유도하지는 않으며 [2], 생성된 산화질소 (nitric oxide; NO)는 TGF-b (transforming growth factor b) 및 VEGF (vascular endothelial growth factor)의 mRNA 발현을 증가시킨다 [3]. 간접 플라즈마 조사 방법은 플라즈마-활성화 무세포 배지 (plasma-activated cell-free medium; PAM)를 이용하며, 이 배지는 약 50 μM의 H2O2를 배지의 주요 활성종으로서 함유한다. 이러한 조건 하에서, HO-1 (heme oxygenase 1)과 같은 Nrf2 경로/단계 Ⅱ 효소의 활성화는 활성산소종으로부터 섬유아세포를 보호한다 [4].
저온 플라즈마의 안전성은 세포생존 분석법을 이용하고 ms-펄스 DBD 소스로 피부 섬유아세포의 DNA 재생 능력을 평가함으로써 연구되었고, 그 결과는 DBD 장치가 치료 용도에 응용하기에 안전함을 보여주었다 [5]. 저용랑 저온 플라즈마 처리는 세포에 독성을 나타내지 않으며, 대신 증식을 유도한다 [3,6,7]. 반면, 좀 더 오랜 시간 노출하면 세포의 손상을 초래하는 것으로 나타났다 [6]. 이뿐만 아니라, 저온 플라즈마 처리는 랫트 피부 급성 상처 생체 모델에서 유전자 발현 분석을 이용하여 친염증성 신호의 활성화나 유의할 만한 부작용이 없는 것으로 나타났다 [8].
피부 상처 재생은 수많은 성장인자, 사이토카인 및 케모카인에 의해서 조절된다 [9]. 실제로, 이 점에 관하여 저온 플라즈마의 적용은 상처 재생시 이들이 필요함을 뒷받침해준다. 저온 플라즈마 적용은 조직 재생 및 감염되거나 염증이 생긴 피부 질환의 개선과 같이 주로 피부과학에 초점이 맞추어져 있었다 [1,5]. 선행 연구들은 생체 내 및 시험관 내에서 상처 치료에 미치는 저온 ㅍ프플라즈마의 긍정적인 효과를 설명하고 있다. 저온 플라즈마 처리는 섬유아세포의 이동을 증대하여 스크래치 상처 치료 분석방법 (scratch wound healing assay)에서 상처의 간극을 닫히게 하는 것으로 나타났다 [7,10-12]. 나아가, 저온 플라즈마에 노출시킨 후, 섬유아세포의 FGF-2 (fibroblast growth factor-2), 타입 I 콜라겐 (12), FGF-7 (fibroblast growth factor-7) [7] 및 TGF-β (transforming growth factor-β) [3]가 증가하였으나, HaCaT 케라틴 생성세포에서는 그렇지 않았고, 상처 재생 및 변화한 조직골격 역학을 조절하는데 중요한 간극 연결 단백질 Cx 43 (connexin 43)의 발현이 감소하였다 [10]. 아주 최근에, 저온 플라즈마를 섬유아세포에 처리하면 상피간엽이행 (epithelial to mesenchymal transition; EMT)이 유도되는 것으로 나타났다. 상피간엽이행은 슬러그 및 TCF8/ZEB1 발현 증가와 에카데린 발현 감소와 함께 나타난다. 이는 세포외 기질의 다양한 요소들을 분해하는 MMP-9 및 uPA (urokinase-type plasminogen activator) 시스템의 활성화를 일으키며, 저온 플라즈마 처리가 과도한 흉터 형성과 같은 원치 않는 부작용을 초래하지 않고 잘 균형을 맞춤을 암시한다 [11]. 동물 연구 결과, 염증, 재상피화 및 수축을 촉진함으로써 가속화된 상처 치료에 대해 보고된 바 있다 [8,10,13].
섬유아세포는 통상 늦은 염증 단계에서부터 완전한 상피화가 일어날 때까지 상처에 존재한다. 상처 치료 과정에서 중요한 단계는 상처 면으로의 섬유아세포의 이동이며, 여기에서 섬유아세포는 응혈을 제거하고 콜라젠과 새로운 세포외 기질 구조를 생성하며, 효과적인 상처 치료에 관여하는 다른 세포와 교류한다 [14].
플라즈마 연구의 진보에도 불구하고, 상처가 치료되는 동안 포유류 세포 및 조직에서 저온 플라즈마의 기작과 세포 생리학에 미치는 영향에 대해서는 의문점이 많다. 따라서, 저온 플라즈마 응용에서 관찰되는 효과에 대응하는 분자의 변화와 관련 기작을 밝혀내는 것은 중요하다. 본 발명에서는 상처 치료에서 저온 플라즈마의 효과와 저온 플라즈마 처리 이후 분자의 변화를 일차 사람 진피 섬유아세포를 이용한 시험관내 실험으로 밝히고, 나아가, 저온 플라즈마 처리가 F1a에 의해 매개되는 혈관생성 성장인자의 발현을 유도함을 밝혔다.
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본 발명은 저온 플라즈마를 이용하여 상처를 치유할 수 있는 장치 및 효과적인 치료 방법을 제공하려는 것이다.
접근성, 무접촉 응용성 및 피부학 연구에서 보여준 유도 가능성으로 인해 조직 재생 목적의 저온 플라즈마와 재생 약제에 관한 관심이 날로 커지고 있다. 비록 동물 상처 모델 및 사람 환자에서 저온 플라즈마 치료의 효과에 대한 연구가 시작되었지만 [1,13], 상처 치료 효과를 발휘하는 기작은 알려진 바가 별로 없다. 본 발명에서는 일차 사람 진피 섬유아세포에서 상처 치료에 중요한 역할을 하는 세포독성, 이동 및 사이토카인과 성장인자 수준에 미치는 저온 플라즈마의 영향을 설명한다.
저온 플라즈마는 하전된 입자, 활성산소종 또는 활성질소종, 전기장 및 자외선과 같은 수많은 요소를 가지며, 이들은 저온 플라즈마의 긍정적인 효과와 관련되어 있다 [1]. 이뿐만 아니라, 본 발명자들은 선행 연구에서 비열 플라즈마 (non-thermal plasma )의 적용이 화상 후 비대흉터 동물모델에서 흉터 형성을 억제함을 밝힌 바 있으며 [15], 이는 저온 플라즈마-유도 세포 사멸 기작이 활성산소종 생성에 의한 것임을 나타내는 것이다. 그리하여 본 발명에서는 먼저 저온 플라즈마 처리 시간과 처리 후 시간을 달리하여 세포 생존율을 조사하였다. 섬유아세포를 저온 플라즈마로 처리한 후 본 발명자들은 최대 처리시간 (5분) 시험군에서 세포 생존율이 현저히 감소함을 관찰하였다. 그러나, 항산화제인 NAC를 선처리한 경우에는 세포 손실이 억제되었다 (도 1).
통상의 피부 상처 재생의 증식 단계 도중, 섬유아세포의 상처 부위로의 이동과 상처 부위에서의 증식은 상처 육아 (wound granulation)에서 필수적이며, 섬유아세포는 이후 흉터 조직 구축 및 리모델링 과정에 참여한다 [14]. 성장인자 및 케모카인에 의한 섬유아세포 이동 활성의 조절은 상처 치료를 개선한다고 보고된 바 있다 [19]. 그러나, 저온 플라즈마에 의해 유도되는 세포 이동의 기작은 현재까지 불명확하다. 저온 플라즈마에 의해 생성된 활성산소종이 세포 이동에 관여한다는 증거는 있다 [20]. 저온 플라즈마에 의해 유도된 활성산소종은 MAPK 카이네이즈를 활성화할 수 있고, MAPK 카이네이즈는 상처 치유 동안 세포 이동과 증식에 중요한 역할을 한다 [21,22]. 이뿐만 아니라, 본 발명의 결과는 저온 플라즈마 처리가 섬유아세포로 하여금 FGF-2 및 FGF-7 분비를 촉진시키고 (도 5G, 5H), 이 인자들은 자가분비 활동 모드를 통하여 이동을 촉진할 수 있다 [23]. 본 발명자들은 시험관 내 상처 모델에서 섬유아세포의 이동을 측정하였고, 최대의 세포 이동은 3분간 저온 플라즈마 처리한 다음 24시간 경과 후에 일어났으며, 이때 섬유아세포 생존율에는 영향이 없었다.
본 발명자들은 저온 플라즈마 처리 후 섬유아세포에서 사이토카인의 발현 상태를 분석하기 위하여 사이토카인 멀티어레이를 이용하였다 (표 2). 본 발명자들은 염증 세포를 모으고 활성화하여 상처 치료 반응을 개시하기 위하여 호중구, 대식세포, 케라틴 생성세포 및 섬유아세포에 의해 상처가 생긴 직후 발현되는 것으로 알려진 GM-CSF, IL-1a, IL-2, IL-6, IL-8 및 IL-17을 포함하는 몇몇 친염증성 인자와 항염증 사이토카인인 IL-10이 현저하게 유도됨을 관찰하였다. 상처 치료에서 신혈관 형성, 육아조직 생성 및 상처 재상피화에 있어서 이들 사이토카인의 중요성은 시험관 내 및 생체 내 연구에서 충분히 입증되어 왔다 [24-29].
활성산소종은 세포 내 HIF1α (hypoxia-inducible factor 1α) 축적의 강력한 유도인자이다. 활성산소종은 프롤릴 하이드록실레이즈 (PHD)와 HIF1 저해인자의 활성을 저해하는데, 이 둘은 HIF1α를 분해하는 다이옥시제네이즈 효소이기 때문이며, 이들을 저해한 결과 HIF1α가 축적된다 [30]. 일단 HIF1α가 세포질 내에 축적되면, 이것은 핵 내로 이동하여 표적 유전자의 프로모터 및 인핸서와 결합한다 [31]. 이뿐만 아니라, HIF 경로는 VEGF, Ang-1, Ang-2, PDGF 및 FGF를 포함하는 수많은 친혈관생성 유전자들을 조절하며 [32], 혈관 내피세포 증식능력, 혈관 투과성 증가능력 및 상처가 재생되는 동안 내피세포 생존과 이동을 촉진하는 능력을 나타낸다.
웨스턴 블롯팅 결과는 저온 플라즈마 처리 후 세포 내 HIF1α 단백질의 발현 증가를 보여준다 (도 3). 나아가, 저온 플라즈마 처리 후 혈관생성 성장인자 수준이 현저히 증가하였으며, 이는 실시간 PCR과 ELISA를 이용하여 세포 내 및 상층액에 분비된 단백질의 mRNA 발현 수준에 의해 증명된 바와 같다 (도 4와 도 5). 그러나, HIF1α 저해제인 CAY10585 처리는 HIF1α 축적을 차단하고 이 결과 저온 플라즈마에 의해 유도되는 혈관생성 성장인자의 상향조절을 저해하였다 (도 6-8). 이러한 결과들은 저온 플라즈마 처리가 HIF1α 발현을 증가시켜 혈관생성 성장인자의 발현을 조절함을 말해준다.
PDGFs 및 FGFs는 혈관생성에 관여할 뿐만 아니라, 상처 치료에서도 중요한 역할을 수행한다. PDGF는 피부 상처 재생에서 섬유아세포와 근섬유아세포 표현형의 증식에 중요한 역할을 담당한다. 이뿐만 아니라, 실험 및 임상연구 결과는 상처 치료 처리에서 PDGF의 유효성을 보여준다 [9].
FGFs, 특히 FGF-2 및 FGF-7은 피부 상처 치료와 관련이 있다. FGF-2는 조직 육아, 재상피화 및 리모델링에서 역할을 수행한다. 나아가, FGF-2 처리는 임상 연구에서 좀 더 빠른 상처 봉합을 향한 경향을 보여주었다 [33]. 케라틴 생성세포 성장인자로도 알려진 FGF-7에 대한 시험관 내 및 생체 내 연구는 FGF-7이 케라틴 생성세포의 증식과 이동을 촉진하여 재상피화를 증대하는 것을 보여주었다 [34].
본 발명에서는 저온 플라즈마 처리가 상처 가장자리로부터 상처 부위로 섬유아세포의 이동을 촉진할 뿐만 아니라 염증 반응 촉진에 관여하는 친염증성 사이토카인 발현도 유도함을 밝혔다. 나아가, 저온 플라즈마 처리는 상처 치료 재생에서 혈관생성 강화, 육아조직 형성 및 재상피화에 관여하는 몇몇 성장인자의 발현을 유도하였다. 특히, HIF1α는 저온 플라즈마에 의해 유도되는 혈관생성 성장인자의 발현과 관련되어 있다.
본 발명은
저온 플라즈마 생성부, 전원 공급부, 가스 공급 노즐 및 하우징을 갖추고,
저온 플라즈마 생성부는 전극, 금속 전극, 유전체와 반응부를 갖추며,
가스 공급 노즐 부위에 이차 접지 전극이 위치하며,
필요 전원은 주파수 10 내지 20kHz의 저주파이며,
필요 전력은 20 내지 50W이며,
저온 플라즈마 생성 온도는 28±2℃임을 특징으로 하는,
상처 치료용 저온 플라즈마 생성장치에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 가스 공급 노즐에서 공급되는 가스로서 공기와 헬륨의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 저온 플라즈마 생성장치에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 장치가 유전체 장벽 방전 원격 저온 플라즈마 (dielectric barrier discharge remote low temperature plasma) 생성장치임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서 상기 상처는 자상, 박피, 발진, 궤양 또는 스크래치에 의한 피부손상임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상처의 재생을 위하여 상처 부위에 저온 플라즈마를 30초 내지 3분간 처리하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 저온 플라즈마 처리 전 항산화제를 상처 부위에 선처리하는 것을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항산화제로 NAC (N-acetyl-L-cystein)를 사용함을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 저온 플라즈마 처리로 HIF1α 발현이 촉진됨을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 저온 플라즈마 처리로 섬유아세포에서 혈관생성 성장인자의 발현이 촉진됨을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 저온 플라즈마 처리로 상처의 개구부 봉합이 촉진됨을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 저온 플라즈마 처리로 섬유아세포가 상처 부위로 이동하는 것이 촉진됨을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 저온 플라즈마 처리로 상처 부위의 재상피화가 촉진됨을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법에 관한 것이다.
본 발명의 저온 플라즈마 생성장치를 이용하여 상처 부위에 일정 시간 저온 플라즈마를 처리하는 경우 섬유아세포에서 혈관생성 성장인자가 활발하게 생산되어 세포의 손실 없이 상처 치유가 가능해진다.
도 1은 저온 플라즈마 처리가 섬유아세포 생존율을 감소시킴을 나타낸다. 세포 생존율은 저온 플라즈마 30초, 1분, 3분 및 5분 처리한 다음 6시간 후 및 24시간 후 EZ-Cytox 세포 생존율 분석법으로 측정하였다. 10 mM NAC로 1시간 선처리하면 저온 플라즈마에 의해 유도되는 세포 사멸이 저해되었다. 각 시료는 세 번 분석하였고, 각 실험은 최소한 세 번 독립적으로 수행하였다. 섬유아세포 생존율은 무처리 세포의 백분율 값으로 나타내었다. 데이터는 평균 ± 표준편차이다. *p < 0.05는 무처리 대조군과 비교한 것이다. NAC, N-acetyl-L-cysteine.
도 2는 저온 플라즈마 처리가 섬유아세포 이동을 유도함을 나타낸다. 세포 내 상처 치료 분석 결과는 저온 플라즈마 처리가 섬유아세포 이동을 촉진함을 보여준다. 사진은 저온 플라즈마 처리 전 제거한 배양 삽입 (0h)과 저온 플라즈마 30초, 1분, 3분 및 5분 처리 이후 6시간 경과 (6h) 및 24시간 경과 (24h)시 배양 삽입에서 얻은 것이다 (크기 막대, 1 mm). 이동 정량 분석은 무처리 세포에 대한 백분율로 표시하였다 (대조군을 100%로 나타냄). 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *p < 0.05는 무처리 대조군과 비교한 것이다.
도 3은 저온 플라즈마 처리가 HIF1α 발현을 유도함을 나타낸다. 웨스턴 블롯 분석은 저온 플라즈마 처리가 HIF1α 단백질 발현을 현저히 유도하였음을 보여준다. 저온 플라즈마를 30초, 1분, 3분 또는 5분간 처리한 후 24시간 배양한 세포 용균액 또는 무처리 대조군 세포 용균액의 HIF1α 및 β-액틴을 웨스턴 블롯팅한 것이다. 각 밴드의 강도를 측정하고 β-액틴의 강도로 표준화하였다. 실험은 세 개의 독립적인 시료에 대하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *p < 0.05는 무처리 대조군과 비교한 것이다.
도 4는 저온 플라즈마 처리가 혈관생성 성장인자의 mRNA 발현을 유도함을 나타낸다. VEGF-A (A), Ang-1 (B), Ang-2 (C), HB-EGF (D), PDGF-A (E), PDGF-B (F), FGF-2 (G) 및 FGF-7 (H)의 mRNA 발현은 저온 플라즈마 30초, 1분, 3분 및 5분 처리 6시간 후 및 24시간 후에 Light Cycler 실시간 PCR 시스템을 이용하여 측정하였다. 각 시료는 두 번씩 분석하였고, 실험은 최소한 세 번씩 독립적으로 수행하였다. mRNA 발현은 2-△△Ct 비율로 표준화하였고, 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *p < 0.05는 무처리 대조군과 비교한 것이다.
도 5는 저온 플라즈마 처리가 혈관생성 성장인자의 단백질 발현을 유도함을 나타낸다. VEGF-A (A), Ang-1 (B), Ang-2 (C), HB-EGF (D), PDGF-A (E), PDGF-B (F), FGF-2 (G) 및 FGF-7 (H)의 섬유아세포 세포 배양 상층액 내의 단백질 농도는 저온 플라즈마 30초, 1분, 3분 및 5분 처리 6시간 후 및 24시간 후에 ELISA로 측정하였다. 각 시료는 두 번씩 분석하였고, 실험은 최소한 세 번씩 독립적으로 수행하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *p < 0.05는 무처리 대조군과 비교한 것이다.
도 6은 CAY10585가 HIF1α의 발현을 저해함을 나타낸다. CAY10585 30mM을 후처리하면 저온 플라즈마에 의해 유도되는 HIF1α 발현이 현저히 억제되었다. 저온 플라즈마 3분 및/또는 CAY10585 처리 후 24시간 배양한 세포 용균액 또는 무처리 대조군 세포 용균액의 HIF1α 및 β-액틴을 웨스턴 블롯팅하였다. 각 밴드의 강도는 β-액틴의 값으로 표준화하였다. 실험은 세 개의 독립적인 시료에 대하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *p < 0.05는 무처리 대조군 또는 CAY10585 처리군과 비교한 것이다.
도 7은 CAY10585가 HIF1α의 축적을 저해함을 나타낸다. CAY10585 30mM를 후처리하면 저온 플라즈마에 의해 유도되는 HIF1α 축적이 현저히 저해되었다. 저온 플라즈마 3분 처리 24시간 후 및 저온 플라즈마 3분 처리 후 CAY10585 처리하고 24시간 후 섬유아세포를 HIF1α 형광 면역조직화학 및 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 역염색한 결과이다. 사진은 20배 확대하여 얻었고, 크기 막대는 100㎛이다. HIF1α 발현의 형광 강도는 Image J 프로그램으로 측정하였다. 실험은 세 개의 독립적인 시료에 대하여 수행하였다. 데이터는 핵 HIF1α 강도 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *p < 0.05는 무처리 대조군 또는 CAY10585 처리군과 비교한 것이다.
도 8은 HIF1α 발현 저해가 혈관생성 성장인자의 생산을 감소시킴을 나타낸다. 저온 플라즈마 3분 처리 후 24시간 경과한 다음 섬유아세포 배양 배지의 VEGF-A (A), Ang-1 (B) 및 Ang-2 (C) 농도는 ELISA로 측정하였다. CAY10585는 저온 플라즈마 처리 후 30mM로 처리하였다. 각 시료는 두 번씩 분석하였고, 실험은 세 번씩 독립적으로 수행하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *p < 0.05는 무처리 대조군 또는 CAY10585 처리군과 비교한 것이다.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
실시예 1: 사람 진피 섬유아세포 일차 배양
모든 세포 배양 절차는 클린 벤치에서 수행하였다. 사람 피부 생검 시료는 한강성심병원 조직은행에서 입수하였다. 시료를 70% 에탄올로 세 번 세척한 다음 항생제와 항균제 (Gibco, Life Technologies, USA)가 함유된 차가운 PBS에 넣었다. 피하지방과 느슨한 결합조직은 미세한 핀셋과 메스를 이용하여 제거하였다. 조직은 약 3-4㎜ 폭으로 길이방향으로 자르고, 10 ml 디스페이즈 (dispase) Ⅱ (1 unit/ml) (Gibco, Life Technologies, USA) 용액을 함유한 50 ml 코니칼 튜브로 옮겨 4℃로 16시간 동안 유지하였다. 효소분해 후, 진피와 표피는 소독한 겸자를 이용하여 당겨서 벗겨내었다. 분리된 상피는 37℃에서 30분간 콜라게네이즈 타입 Ⅳ 용액 (Gibco, Life Technologies, USA)(500 U/ml)으로 분해하였다. 콜라게네이즈를 불활성화하기 위하여 10% FBS 함유 DMEM에 시료를 넣고, 여과한 후 300×g로 5분간 원심분리하였다. 침전은 10% FBS 함유 DMEM에 재현탁한 다음 37℃에서 5% CO2 분위기에서 배양하였다. 2-4세대의 섬유아세포를 실험에 이용하였다.
실시예 2: 저온 플라즈마 장치
저온 플라즈마 (Low Temperature Plasma; LTP) 장치는 참고문헌 15에 기재된 것과 유사하다. 본 연구를 위해 유전체 장벽 방전 원격 LTP (dielectric barrier discharge remote LTP)가 이용되었고, LTP는 두 개의 노즐 (20㎜× 1㎜)을 통해 분출되었다. 이차 접지 전극은 가능한 아킹을 방지하기 위하여 노즐 부위에 위치하도록 하였고, 튜브-유사 구조는 약 15㎝의 길이로 제조되었다. 주파수 13.0kHz의 5.99-kV 싸인파 형태의 전압이 공급되었다. 저온 플라즈마 생성용 작업 기체는 공기 (50ccm)와 헬륨 (5000ccm)의 혼합물이었다. 리사주 도형법 (Lissajous' figure method)으로 측정한 전력은 42W였다. 생성 온도는 28±2℃였다.
실시예 3: 저온 플라즈마 처리
섬유아세포는 35㎜ 페트리 디쉬 (Corning, NY. USA)에 1×104 cells의 밀도로 시드하였다. 저온 플라즈마 노출 직전에 DMEM을 제거하고, 세포를 1.2 ml DPBS로 덮었다. 저온 플라즈마 토치를 페트리 디쉬로부터 3cm 거리에 두었다. 세포를 30초, 1분, 3분 또는 5분간 저온 플라즈마에 노출시킨 후, 2.0ml의 배지를 가하였다. 분석은 저온 플라즈마 처리 후 6시간 및/또는 24시간에 수행하였다.
실시예 4: 세포 생존율 분석
섬유아세포 생존율은 EZ-Cytox 세포 생존율 분석 킷트 (Dogen, Seoul. Korea)를 이용하여 측정하였다. 96-웰 세포배양 플레이트 (Corning, NY. USA)에 5×103 섬유아세포/웰로 시드하였다. 한 군에는 저온 플라즈마 처리 한 시간 전에 10mM NAC (N-acetyl-L-cysteine)를 가하였다. 저온 플라즈마 처리 직전 10% FBS 함유 DMEM을 제거하고, 각 웰당 100 ml DPBS를 가하였다. 세포를 30초, 1분, 3분 또는 5분간 저온 플라즈마로 처리한 후, 세포를 200 ml DMEM에서 배양하고, 6시간 또는 24시간 후, 10ml의 EZ-Cytox 시약을 배지에 가하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 마이크로플레이트 판독기 (Beckman Coulter 880, USA)를 이용하여 450nm 흡광도를 측정하였다. 최종 값은 다음과 같이 계산하였다: (시료 흡광도 - 바탕 흡광도 = 본래 신호 → (본래 흡광도/대조군 흡광도) × 100 = 생존율%).
실시예 5: 상처 치료 분석법
섬유아세포 이동은 제조자의 지시에 따라 35 mm u-dish (Ibidi GmbH, Germany)에 배양 삽입 (culture insert)을 이용하여 상처 치료 분석법으로 평가하였다. 섬유아세포를 배양 삽입 디쉬 당 5 × 103 cells로 시드하였다. 24시간 후, 배양 삽입 디쉬를 제거하고, 무세포 갭 또는 뚜렷한 상처 500 ± 50 ㎕를 만들었다. 이동 도중 세포 증식의 효과를 제거하기 위하여 미토마이신 C (5 ㎍/ml, Sigma, USA)를 세포배양 배지에 가하였다 [16]. 상처 부위로 이동한 세포를 광학 현미경 (IX 70, Olympus, Japan)을 이용하여 저온 플라즈마 처리 6시간 후 및 24시간 후에 측정하였다. LTP 처리하지 않은 섬유아세포 대조군을 100%로 하고, LTP를 30초, 1분, 3분 또는 5분 처리한 세포와 비교하였다. 각 분석은 세 번씩 수행하였다.
실시예 6: 사이토카인 어레이
30초, 1분, 3분 또는 5분간 저온 플라즈마 처리한 섬유아세포 또는 무처리 대조군 섬유아세포를 배양하여 24시간 후 세포 상등액을 모아 사람 사이토카인 어레이 (R&D, Minneapolis, USA)를 분석하였다. 어레이는 제조자의 지시에 따라 수행하였으며, 이 어레이는 12 사이토카인의 병렬 측정을 제공한다. 형광은 Luminex 200 system (Luminex, Austin, TX, USA)으로 측정하였다. 어레이는 서로 다른 세 가지 섬유아세포 배양액으로 세 번씩 수행하였다. 결과는 대조군에 대한 LTP 처리군의 비로 나타내었다.
실시예 7: 웨스턴 블롯팅 분석
세포를 30초, 1분, 3분 또는 5분간 저온 플라즈마 처리하고 24시간 후 모았다. 세포를 차가운 PBS로 세 번 세척한 다음 완전 포스파타제 저해제 (Roche, USA)와 프로테아제 저해제 칵테일 (Sigma, Korea)을 함유한 차가운 RIPA 완충액에 현탁하고, 4℃로 30분간 일정하게 교반하며 유지하였다. 시료를 20분간 (15,000×g, 4℃) 원심분리하고, 상층액의 단백질 농도를 BCA 킷트 (Thermo Fisher, USA)를 이용하여 측정하였다. 시료를 5×시료 완충액과 혼합한 다음 5분간 끓였다. 그 후 시료를 웰당 30㎍ 단백질이 되도록 넣고 7.5% SDS-PAGE 젤로 전기영동하고, PVEF 막 (Merck Millipore, USA)에 전기이동하였다. 막을 1시간 동안 상온에서 5% BSA로 블로킹한 후 18시간 동안 폴리클론 토끼 항-HIF1α 항체 (1:500, Santacruz, USA) 및 폴리클론 토끼 항-β-액틴 항체 (1:5000, Cell Signaling Technology, USA)와 함께 배양하였다. 막은 TBST 완충액으로 세 번 (1회당 5분) 세척하고, 상온에서 2시간 동안 퍼옥시데이즈-결합된 항토끼 IgG (1:5,000, Merck Millipore, USA)와 함께 배양하였다. 그 후 세 번 세척하고 ECL 탐지 킷트 (Thermo Fisher, USA)로 현상하였다. 사진은 chemiluminescence imaging system (WSE-6100, Atto, Tokyo, Japan)을 이용하여 얻었다. 밴드의 광학 밀도는 CS Analyzer4 소프트웨어 (Atto, Tokyo, Japan)로 측정하고, β-액틴으로 표준화하였다.
실시예 8: 정량적 실시간 PCR ( qPCR )
섬유아세포를 30초, 1분, 3분 또는 5분간 저온 플라즈마 처리하고 6시간 후 또는 24시간 후 모았다. 총 세포 RNA는 제조자의 지시에 따라 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)를 이용하여 분리하였다. RNA 농도는 Nanodrop spectrophotometer (BioTek, USA)로 측정하고, 1㎍의 RNA를 이용하여 대용량 cDNA 역전사 킷트 (AB Applied Biosystems™, USA)로 cDNA를 제조하였다. 50ng cDNA, 특이적 프라이머 (표 1) 및 PCR 프리믹스 (Roche, Germany)를 이용하여 Light Cycler 480 system (Roche, Germany) 상에서 정량적 역전사효소 PCR (qPCR)을 수행하였다. 반응 조건은 다음과 같다: 95℃로 10분간 초기 변성, 95℃로 10초간, 60℃로 30초간 40회 수행하여 증폭하고 72℃로 20초간 연장. 표적 유전자의 mRNA는 2-△△Ct 비율로 표준화하였다 [17]. 각 qPCR은 적어도 세 개의 다른 섬유아세포 세포배양액으로부터 얻은 cDNA로 세 번씩 수행하였다.
실시예 9: ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
저온 플라즈마 처리는 위의 기재와 같이 수행하였다. 배양 24시간 후, 배양 상층액을 모아 8개의 선택된 분자 표적 즉, VEGF-A (vascular endothelial growth factor A), Ang-1 (angiopoietin-1), Ang-2 (angiopoietin-2), HB-EGF (heparin-binding EGF-like growth factor), PDGFA (platelet-derived growth factor subunit A), PDGF-B (platelet-derived growth factor subunit B), FGF-2 (fibroblast growth factor 2) 및 FGF-7 (fibroblast growth factor 7)의 농도를 제조자의 지시에 따라 ELISA (Cusabio Technology, China)로 측정하였다.
실시예 10: 면역형광 조직화학
섬유아세포를 VitroCol® 콜라겐 타입 Ⅳ ® 용액 (Advanced BioMatrix, San Diego, CA, USA)으로 코팅된 커버슬립 바닥으로 된 디쉬 (SPL Lifescience, Pocheon, Korea)에 시드하였다. 세포를 3분간 저온 플라즈마에 노출한 다음 HIF1α 저해제인 CAY10585 30 μM로 처리하였다 [18]. 배양 24시간 후, 세포를 차가운 아세톤으로 10분간 처리하여 고정한 다음 차가운 PBS로 두 번 세척하였다. 1% BSA로 30분간 처리하여 블로킹한 다음 일차 폴리클론 토끼 항-HIF1α 항체 (1:50, Santacruz, USA)로 밤새 4℃에서 배양하였다. 용액을 가만히 따른 다음, 세포는 PBST 완충액으로 세 번(한 번 세척시 5분간) 세척하였고, 이후 Alexa Fluor 594 당나귀 항-토끼 이차 항체 (1:200, Invitrogen, USA)와 함께 상온, 어두운 곳에서 1시간 동안 배양하였다. 이차 항체 용액을 가만히 따른 다음, 세포를 어두운 곳에서 PBS (5 min/wash)로 세 번 세척하였다. Fluoroshield with DAPI (ImmunoBioScience, Mukilteo, WA, USA)로 커버슬리핑한 다음, 표준 형광 역상 현미경 (Olympus IX81, Tokyo, Japan) 하에서 사진을 촬영하였다. 세포의 형광 강도는 추천하는 프로토콜 (NIH)에 따라 Image J 소프트웨어를 이용하여 측정하였다.
실시예 11: 통계 분석
모든 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 두 군 간의 비교는 Mann-Whitney U test를 이용하여 수행하였다. 통계 분석은 PASW statistics 18 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)로 수행하였고, p < 0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 여겨진다.
결과 1: 저온 플라즈마 처리는 섬유아세포 생존율을 감소시킨다.
섬유아세포에 저온 플라즈마 처리의 세포독성 효과를 살펴보기 위하여, 30초, 1분, 3분 및 5분간 저온 플라즈마에 노출한 다음 6시간 후 및 24시간 후 EZ-Cytox 세포 생존 분석을 수행하였다. 섬유아세포를 5분간 저온 플라즈마 처리한 경우 세포 생존율의 현저한 변화를 관찰하였다 (6시간 후 92.5%, 24시간 후 85.5%) (도 1). 그러나, 항산화제이자 활성산소종 제거제인 10 mM NAC로 1시간 선처리한 경우 저온 플라즈마에 의한 세포 손실이 억제되었다 (도 1). 대조적으로, 30초, 1분 및 3분간 저온 플라즈마 처리한 경우에는 세포 생존율의 현저한 감소는 일어나지 않았다. 이러한 결과들은 세포 생존율 감소가 저온 플라즈마에 의해 유도되는 활성산소종 생산에 의한 것임을 제시한다.
결과 2. 저온 플라즈마 처리는 시험관 내에서 상처 치료를 강화한다.
섬유아세포 이동 분석은 시험관 내 상처 치료 모델인 삽입 u-dish 배양 시스템 내에서 수행하였다. 이동 중 세포증식 효과를 제거하기 위하여 섬유아세포를 미토마이신 C (5 ㎍/ml)로 24시간 선처리하였다. 무처리 대조군과 비교하여 저온 플라즈마 30초 처리군을 제외하고는 섬유아세포의 이동은 저온 플라즈마 1분, 3분 및 5분 처리 후 6시간 경과 및 24시간 경과 후 현저히 증가하였다 (p < 0.05)(도 2).
결과 3: 저온 플라즈마 처리는 섬유아세포에서 사이토카인 생산을 증가시킨다.
저온 플라즈마 처리가 사이토카인 분비를 조절하는지를 확인하기 위하여 세포 배양 상층액의 사이토카인을 사이토카인 어레이를 이용하여 분석하였다. 표 2와 같이, 무처리군과 비교하여 GM-CSF, IL-1α 및 IL-6 수준은 1분, 3분 및 5분 저온 플라즈마 처리한 24시간 후 섬유아세포 배지에서 현저히 증가하였다. IL-8, IL-10 및 IL-17 수준은 저온 플라즈마를 3분 및 5분 처리한 24시간 후 섬유아세포 배양 배지에서 현저히 높아졌다. 이러한 결과들은 사이토카인 인자들의 조절이 저온 플라즈마 처리에 의해 유도되는 효과의 중요한 기작임을 제시한다.
결과 4: 저온 플라즈마 처리는 섬유아세포에서 혈관형성 성장인자 생산을 증가시킨다.
섬유아세포에서 저온 플라즈마의 혈관생성 효과를 알아보기 위하여 먼저 혈관생성의 중요한 조절인자인 HIF1α의 발현을 측정하였다. 웨스턴 블롯 결과는 HIF1α 단백질 발현이 무처리 대조 세포와과 비교하여 저온 플라즈마 30초, 1분, 3분 및 5분 처리 이후 24시간 후에 현저히 증가하였음을 보여준다 (p < 0.05)(도 3). 다음으로, 실시간 PCR을 이용하여 친-혈관생성 인자의 유전자 발현 프로파일을 분석하였다 (도 4). VEGF-A 및 Ang-1은 무처리 대조군과 비교하여 저온 플라즈마로 30초, 1분, 3분 및 5분 처리한 다음 6시간 후 및 24시간 후 현저히 유도되었다 (p < 0.05)(도 4A 및 4B). 대조적으로, Ang-2는 무처리 대조군에서보다 3분 저온 플라즈마 처리군에서만 6시간 후 및 24시간 후 현저히 증가하였다 (p < 0.05)(도 4C). HB-EGF는 무처리 대조군과 비교하여 저온 플라즈마 30초, 1분, 3분 및 5분 처리군에서 6시간 후 및 24시간 후 현저히 유도되었다 (p < 0.05) (도 4D). PDGF-A 및 PDGF-B는 무처리 대조군과 비교하여 저온 플라즈마 3분 및 5분 처리군에서 6시간 후 및 24시간 후에 현저히 유도되었다 (p < 0.05)(도 4E 및 4F). FGF-2 및 FGF-7은 무처리 대조군과 비교하여 저온 플라즈마 1분, 3분 및 5분 처리군에서 6시간 후 및 3분, 5분 처리군에서 24시간 후에 현저히 유도되었다 (p < 0.05)(도 4G 및 4H).
비록 이와 같은 실시간 PCR 결과가 저온 플라즈마 처리 후 유도된 mRNA 발현을 설명해주지만, mRNA가 단백질로 번역이 되었는지, 그리고 세포배양 배지에 분비되었는지를 말해주지는 않았다. 이것은 매우 중요한데, 생물학적 기능을 발휘하기 위해서 이 인자들은 표적 세포 표면의 특이적 수용체와 결합하여 신호전달 분자로서 단거리 세포대 세포 교류를 매개해야 하기 때문이다. 그리하여 우리는 ELISA를 이용하여 저온 플라즈마 처리 24시간 후 세포 상층액 내의 혈관생성인자의 단백질 수준을 확인하였다. 저온 플라즈마 30초, 1분, 3분 및 5분 처리 후 24시간 경과한 다음 세포 상층액 내의 평균 VEGF-A 농도는 각각 175, 204, 207 및 239 pg/ml였다 (p < 0.05)(도 5A). 반면 동일한 배양시간에서 무처리 세포의 상층액에서 평균 VEGF-A 농도는 126 pg/ml에 불과했다. Ang-1 농도는 저온 플라즈마 30초, 1분, 3분 및 5분 처리 후 현저히 증가하였고 (각각 3.2, 3.4, 3.3 및 3.3 ng/ml), 무처리 세포에서는 2.6 ng/ml으로 나타났다 (p < 0.05)(도 5B). Ang-1과 대조적으로, Ang-2 농도는 저온 플라즈마를 3분간 처리한 이후에만 현저히 증가하였다 (4.6 ng/ml). 무처리 세포는 3.7 ng/ml였다 (p < 0.05)(도 5C). HB-EGF 농도는 저온 플라즈마 30초, 1분, 3분 및 5분 처리 24시간 후 현저히 증가하였고 (각각 72.1, 83.2, 102.2 및 102.1 pg/ml), 무처리 세포는 56.7 pg/ml였다 (p < 0.05)(도 5D). PDGF-A 농도는 저온 플라즈마 3분 및 5분 처리 후 현저히 증가하였고 (각각 1.8 ng/ml), 무처리 세포는 1.5 ng/ml였다 (p < 0.05)(도 5E). 유사한 패턴이 PDGF-B 분비에서도 나타났다. PDGF-B 농도는 저온 플라즈마 3분 및 5분 처리 24시간 후 현저히 증가하였고 (각각 235.8 및 203.3 ng/ml), 무처리 세포는 182.5 ng/ml였다 (p < 0.05)(도 5F). FGF-2 농도는 저온 플라즈마 3분 처리 세포에서만 현저히 증가하였고 (4.1 pg/ml), 무처리 세포에서는 3.4 pg/ml였다 (p < 0.05)(도 5G). 이와 대조적으로, FGF-7 농도는 저온 플라즈마 1분 및 3분 처리 세포 배양 배지에서 현저히 증가하였고 (각각 69.2 및 81.4 pg/ml), 무처리 세포에서는 57.6 pg/ml였다 (p < 0.05)(도 5H).
결과 5: 섬유아세포에서 HIF1α 발현 저해는 저온 플라즈마에 의해 유도되는 혈관생성 성장인자의 생산을 억제한다.
혈관생성 성장인자의 발현이 HIF1α에 의해 매개되는지를 알아보기 위하여 저온 플라즈마로 3분간 처리한 섬유아세포를 HIF1α 축적 저해제로 알려진 CAY10585로 처리하였다. 웨스턴 블롯팅 결과는 무처리군과 비교하여 HIF1α 단백질 발현이 저온 플라즈마 3분 처리 24시간 후 유도됨을 보여주었다 (p < 0.05)(도 6). 그러나, CAY10585 처리는 무처리 대조군과 비교하여 저온 플라즈마로 유도되는 HIF1α 발현을 감소시켰다 (도 6). 이뿐만 아니라, 면역형광 조직화학 결과는 HIF1α의 형광 강도가 무처리 대조군 세포와 비교하여 저온 플라즈마 3분 처리 후 핵에서 현저히 높아짐을 보여주었다 (p < 0.05)(도 7). 저온 플라즈마 처리 후 CAY10585 처리는 HIF1α 축적을 감소시켰다 (도 7). 이러한 결과들은 저온 프라즈마가 HIF 발현 조절에 기여함을 분명하게 나타낸다. 유사하게, ELISA 분석은 VEGF-A, ANG-1 및 ANG-2 농도가 무처리 세포와 비교하여 저온 플라즈마 3분 처리 후 24시간 경과한 세포에서 현저히 증가하였음을 보여주었다 (각각 248.9 pg vs 170.4 pg, 3.9 ng vs 3.1 ng, 7.8 ng vs 6.0 ng, p < 0.05)(도 8). 나아가, CAY10585 처리는 섬유아세포 배양 배지에서 저온 플라즈마에 의해 유도되는 VEGF-A, ANG-1 및 ANG-2 생성을 현저히 감소시켰다 (도 8).
Gene Forward (5'→3') Reverse (3'→5')
VEGF A CGGTGCTGGAATTTGATATTCATTG CGATTCAAGTGGGGAATGGC
ANG-1 CAACCTTGTCAATCTTTGCACT TCTGCACAGTCTCTAAATGGT
ANG-2 TAAGGACCCCACTGTTGCTA TAGATGCCATTCGTGGTGTG
HB-EGF ACAGCGTGGGAACTCACTTT TCTCGGTAGCAATTGGCAGG
PDGF-A GAAGGCCTAGGGAGTCAGGT TCACATCTGGTTGGCTGCTT
PDGF-B GCCAGCGCCCATTTTTCAT GTGTGTGCGCGCAAAGTATC
FGF-2 GAGAAGAGCGACCCTCACATCA TCCTTCATAGCCAGGTAACGGT
FGF-7 GGCAAGTTTCCCTCCCTTTT CAAGTGCTGTGTGCTAGACT
HPRT GGACCCCACGAAGTGTTGGATAT TCTCATCTTAGGCTTTGTATTTTGCT
Figure pat00001

Claims (12)

  1. 저온 플라즈마 생성부, 전원 공급부, 가스 공급 노즐 및 하우징을 갖추고,
    저온 플라즈마 생성부는 전극, 금속 전극, 유전체와 반응부를 갖추며,
    가스 공급 노즐 부위에 이차 접지 전극이 위치하며,
    필요 전원은 주파수 10 내지 20kHz의 저주파이며,
    필요 전력은 20 내지 50W이며,
    저온 플라즈마 생성 온도는 28±2℃임을 특징으로 하는,
    상처 치료용 저온 플라즈마 생성장치.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 가스 공급 노즐에서 공급되는 가스는 공기와 헬륨의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 저온 플라즈마 생성장치.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 장치는 유전체 장벽 방전 원격 저온 플라즈마 (dielectric barrier discharge remote low temperature plasma) 생성장치임을 특징으로 하는 저온 플라즈마 생성장치.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 상처는 자상, 박피, 발진, 궤양 또는 스크래치에 의한 피부손상임을 특징으로 하는 저온 플라즈마 생성장치.
  5. 상처의 재생을 위하여 상처 부위에 저온 플라즈마를 30초 내지 3분간 처리한 후 6 내지 24시간 방치하는 저온 플라즈마 처리방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    저온 플라즈마 처리 전 항산화제를 상처 부위에 선처리하는 것을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 항산화제는 NAC (N-acetyl-L-cysteine)임을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법.
  8. 청구항 5에 있어서,
    저온 플라즈마 처리로 HIF1α 발현이 촉진됨을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법.
  9. 청구항 5에 있어서,
    저온 플라즈마 처리로 섬유아세포에서 혈관생성 성장인자의 발현이 촉진됨을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법.
  10. 청구항 5에 있어서,
    저온 플라즈마 처리로 상처의 개구부 봉합이 촉진됨을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법.
  11. 청구항 5에 있어서,
    저온 플라즈마 처리로 섬유아세포가 상처 부위로 이동하는 것이 촉진됨을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법.
  12. 청구항 5에 있어서,
    저온 플라즈마 처리로 상처 부위의 재상피화가 촉진됨을 특징으로 하는 저온 플라즈마 처리방법.
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