KR20190032434A

KR20190032434A - 소 종에서의 수정능 상승

Info

Publication number: KR20190032434A
Application number: KR1020197004661A
Authority: KR
Inventors: 제이슨 니켈; 다니엘 케일; 알버트 아브라함; 워렌 툴리; 리커링크 리챠드 게라르두스 마르티누 올드; 테리 셋체; 릴랜드 비커스; 스튜어트 니벨링크
Original assignee: 바이엘 애니멀 헬스 게엠베하
Priority date: 2016-07-26
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2019-03-27
Also published as: US20190388538A1; BR112019001599A2; TWI759317B; DOP2019000018A; CL2019000185A1; AU2017301528A1; TW201817427A; US10933131B2; EP3490598A1; WO2018022583A1; UY37346A; IL264380A; AR109167A1; SG11201900710YA; CN109689095B; CA3031778A1; CR20190037A; JP2019525935A; PE20190566A1; NZ750181A

Abstract

본 발명은 암소의 수태율을 상승시키는데 효과적인 면역조절 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

소 종에서의 수정능 상승

본 발명은 암소 (cow)에서 면역조절을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암소에서 첫 서비스 수태율을 상승시키는데 효과적인 조성물 및 방법을 포함한다.

젖소에서 가장 높은 이환율 및 사망률은 분만 주위기에 발생한다. 미엘로퍼옥시다제 및 식세포작용 분석을 통해 입증된 바와 같이 백혈구 수가 감소하고 백혈구 기능이 저하되어 분만에 임박해 면역 기능이 손상되는 것으로 나타났다. 분만에 임박해 면역 기능이 향상될 수 있다면 면역 기능에 민감할 수 있는 생식 성과가 개선될 수 있다.

젖소의 출산력은 축군 두수 증가, 발정 검출 감도 및 특이성 감소, 분만시 몸 상태 점수 하락 및 산후 몸 상태 점수 손실율 증가를 비롯한 여러 요인으로 인해 국제적인 규모로 감소하고 있다. (McDougall, J. Reproduction and Development 52, 185-194 (2006) 참조). 최적의 군 단위 건강관리 및 생산성을 유지하기 위해서는 높은 수준의 번식 능력이 필수이다. 암소 및 암송아지의 번식 능력을 상승시킬 수 있는 조성물 및 방법이 당 업계에서 요구된다.

발명의 요약

본 발명은 암소 및 암송아지에서 수태율을 상승시키기 위한 면역조절 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 암소 및 암송아지에서 수태율을 상승시키기 위한 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아-유래 핵산 분자를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 면역자극 CpG 모티프 및 적어도 하나의 비면역자극 CpG 모티프를 포함한다. 추가의 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1을 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 2를 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 3을 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 4를 포함한다.

일부 구체예에서, 리포좀 전달 비히클은 멀티라멜라 소포 지질 및 압출 지질로 구성된 군으로부터 선택된 지질을 포함한다. 추가의 구체예에서, 리포좀 전달 비히클은 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤로 구성된 군으로부터 선택된 지질 쌍을 포함한다.

일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 생물학적 제제를 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 생물학적 제제는 면역 증강 단백질, 면역원, 백신, 항균제 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다.

일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 정맥 내, 근육 내, 피내, 복강 내, 피하, 분무-에어로졸, 경구, 안내, 기관 내, 자궁 내, 질 내 및 비강 내로 구성된 군으로부터 선택된 투여용이다.

일부 구체예에서, 암소의 수태율은 대조 집단의 수태율에 비해 증가한다.

일부 구체예에서, 비-사이클링 암소의 수태율은 대조 집단의 수태율에 비해 증가한다.

일부 구체예에서, 암소에서 첫 서비스 수태율은 대조 집단의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.

일부 구체예에서, 비-사이클링 암소의 첫 서비스 수태율은 대조 집단의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.

일부 구체예에서, 암소의 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.

일부 구체예에서, 비-사이클링 암소의 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단의 수태율에 비해 증가한다.

일부 구체예에서, 암소의 첫 서비스 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단에서의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.

일부 구체예에서, 비-사이클링 암소에서의 첫 서비스 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조군에서의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.

본 발명은 또한 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암소에서 수태율을 상승시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 핵산 분자를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암소에서 수태율을 상승시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아-유래 핵산 분자를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-사이클링 암소에서 수태율을 상승시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 핵산 분자를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-사이클링 암소에서 수태율을 상승시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아-유래 핵산 분자를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암소에서 첫 서비스 수태율을 상승시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 핵산 분자를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암소에서 첫 서비스 수태율을 상승시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아-유래 핵산 분자를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-사이클링 암소에서 첫 서비스 수태 비율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 핵산 분자를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-사이클링 암소에서 첫 서비스 수태 비율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아-유래 핵산 분자를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 면역자극 CpG 모티프 및 적어도 하나의 비면역자극 CpG 모티프를 포함한다. 추가의 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1을 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 2를 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 3을 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 핵산 분자는 서열 번호 4를 포함한다.

일부 구체예에서, 면역 요법 조성물은 정맥 내, 근육 내, 피내, 복강 내, 피하, 분무-에어로졸, 경구, 안내, 기관 내 및 비강 내로 구성된 군으로부터 선택된 투여용이다.

도 1은 pMB75.6 플라스미드 (서열 번호 1) 지도이다.
도 2는 pGCMB75.6 플라스미드 (서열 번호 2) 지도이다.
도 3은 pLacZMB75.6 플라스미드 (서열 번호 3) 지도이다.
도 4A는 첫 수정에 대한 수태 확률 (산정 주변 평균 및 평균 표준 오차 (SEM))의 차트를 나타내고, 도 4B는 처리군 별 사이클링 및 비-사이클링 암소에 대한 계획된 번식 프로그램의 시작 후 3주 내에 임신 확률 (산정 주변 평균 및 SEM)을 나타낸다. 별표는 비-사이클링 군 내 처리간 차이를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명에 따라, 암소의 수태율을 상승시키기 위한 면역조절 조성물 및 이의 사용 방법이 제공된다. 상기 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아-유래 핵산 분자를 포함한다. 이들 조성물 및 면역조절 조성물의 사용 방법은 하기에서 보다 상세히 논의된다.

I. 조성물

본원에 기재된 것과 같은 본 발명에 유용한 조성물은 일반적으로 감염성 질환에 대한 예방 요법, 메타예방 요법 또는 치료 요법으로 사용될 수 있다. 이 조성물은 본원에서 면역조절 조성물로서 지칭된다. 면역조절 조성물은 적어도 암소의 수태율을 상승시킬 수 있는 면역자극 플라스미드 또는 면역자극 DNA 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 면역조절 조성물은 또한 리포좀 전달 비히클을 포함할 수 있다.

A. 핵산

일부 측면에서, 본 발명은 암소의 수태율을 상승시키는데 유용한 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에 기재된 핵산 분자는 면역자극 플라스미드에 선형 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA, 아미노산 서열, 리보 핵산 (RNA) 또는 이들의 조합으로서 포함될 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명은 면역자극 플라스미드 또는 면역자극 DNA 서열을 함유하는 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포 (시험관 내, 생체 내 또는 생체 외)에 관한 것이다.

본원에 기재된 핵산 분자는 CpG 모티프가 풍부하다. 이러한 CpG 모티프는 TLR9 및 TLR21과 같은 특정 톨 (Toll)-유사 수용체를 통해 면역자극을 유도할 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 핵산 분자는 또한 비-CpG 면역자극 모티프를 함유한다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 무작위 핵산 서열에서 예상되는 CpG 모티프 빈도 대비 약 2 내지 20%의 CpG 모티프를 함유한다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 무작위 핵산 서열에서 예상되는 CpG 모티프의 빈도 대비 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40% 또는 그 이상의 CpG 모티프를 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 무작위 핵산 서열에서 예상되는 CpG 모티프의 빈도 대비 약 10%의 CpG 모티프를 함유한다. 일부 측면에서, 척추 동물 DNA와 비교하여, 10 배 이상 더 풍부한 CpG 모티프가 관찰된다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 척추 동물 DNA와 비교하여 약 2 내지 50 배 또는 그 이상의 CpG 모티프를 함유한다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 척추 동물 DNA와 비교하여 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55배 또는 그 이상의 CpG 모티프를 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명은 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 면역자극 플라스미드 또는 DNA 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 pMB75.6 플라스미드는 항생제 내성 유전자인 카나마이신을 포함한다. pMG75.6의 서열은 서열 번호 1로서 표 1에 제공되어 있다.

일부 측면에서, 본 발명은 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 면역자극 플라스미드 또는 DNA 서열에 관한 것이다. 플라스미드는 임의의 선택 또는 선별 마커 유전자가 결여되어 있을 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 pGCMB75.6 플라스미드는 임의의 전장 또는 기능성의 선택 또는 선별 마커 유전자를 포함하지 않는다. pGCMB75.6의 서열은 서열 번호 2로서 표 1에 제공되어 있다.

일부 측면에서, 본원에 기재된 면역자극 플라스미드는 바람직하게는 전장 또는 기능성의 선택 또는 선별 마커를 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 면역자극 플라스미드는 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는다. 예를 들어, 플라스미드는 카나마이신 내성 유전자를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 플라스미드는 바람직하게는 면역원을 코딩하지 않는다.

일부 측면에서, 면역자극 플라스미드는 항생제 내성 유전자가 아닌 선택 또는 선별 마커 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 pLacZMB75.6 플라스미드는 선별 마커로서 LacZ 유전자를 포함한다. pLacZMB75.6의 지도는 도 3에 제공되고, pLacZMB75.6의 뉴클레오티드 서열은 표 1에서 서열 번호 3으로 제공된다. 도 3에서 제시된 바와 같이, pLacZMB75.6은 pGCMB75.6과 유사하지만, LacZ 선별 마커를 포함한다.

pMB75.6, pGCMB75.6 또는 pLacZMB75.6 플라스미드의 뉴클레오티드 서열은 그들의 면역자극 특성에 상당한 악영향을 미치지 않으면서 어느 정도 변화될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 측면에서, 본 발명은 pMB75.6 (서열 번호 1)의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극 플라스미드는 바람직하게는 pMB75.6 (서열 번호 1)의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 면역자극 플라스미드는 보다 바람직하게는 pMB75.6 (서열 번호 1)의 서열을 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명은 pGCMB75.6 (서열 번호 2)의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극 플라스미드는 바람직하게는 pGCMB75.6 (서열 번호 2)의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 면역자극 플라스미드는 보다 바람직하게는 pGCMB75.6 (서열 번호 2)의 서열을 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명은 pMB75.6 (서열 번호 1)의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 면역자극 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극 플라스미드는 바람직하게는 pMB75.6 (서열 번호 1)의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 면역자극 플라스미드는 보다 바람직하게는 pMB75.6 (서열 번호 1)의 서열로 구성된다.

일부 측면에서, 본 발명은 pGCMB75.6 (서열 번호 2)의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 면역자극 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극 플라스미드는 바람직하게는 pGCMB75.6 (서열 번호 2)의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 면역자극 플라스미드는 보다 바람직하게는 pGCMB75.6 (서열 번호 2)의 서열로 구성된다.

본 발명의 다른 중요한 측면은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 대해 고도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 핵산 서열을 포함하는 면역 반응을 자극할 수 있는 면역자극 DNA 서열 또는 면역자극 플라스미드를 제공한다. 적합한 핵산 서열은 본 발명의 핵산과 상동성이거나, 실질적으로 유사하거나, 또는 동일하다. 일부 측면에서, 상동성 핵산 서열은 서열 번호 1 또는 각각의 상보성 서열에 대해 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 유사성을 가질 것이다. 다른 측면에서, 상동성 핵산 서열은 서열 번호 2 또는 각각의 상보성 서열에 대해 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 유사성을 가질 것이다. 서열 유사성은 당 업계에 공지된 다수의 알고리즘, 예컨대 문헌 [Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]에 기재되어 있는 BLAST를 사용하여 계산될 수 있다. 핵산은 유전 코드의 축퇴성으로 인하여 상술한 핵산과 서열이 다를 수 있다. 일반적으로, 기준 서열은 18개의 뉴클레오티드, 보다 일반적으로는 30개 이상의 뉴클레오티드일 것이며, 비교 목적을 위해 조성물의 전체 핵산 서열을 포함할 수 있다.

서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 고려된다. 엄격한 하이브리드화 조건은 0.1X SSC (15 mM 염화나트륨/1.5 mM 시트르산나트륨) 및 50 ℃ 이상에서의 하이브리드화와 같은 조건을 포함한다. 또 다른 예는 50% 포름아미드, 5X SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5X 덴하르트 (Denhardt) 용액, 10% 덱스트란 설페이트 용액, 20 μg/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA의 용액 중에서 42 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 약 65 ℃에서 0.1X SSC로 세척하는 것이다. 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 상기 특정 조건 정도의 엄격성과 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95%인 하이브리드화 조건이다. 다른 엄격한 하이브리드화 조건은 당 업계에 공지되어 있으며, 또한 본 발명의 핵산 동족체를 동정하기 위해 사용될 수도 있다 (Current Protocols in Molecular Biology, Unit 6, pub. John Wiley & Sons, N.Y. 1989).

돌연변이가 본원에 기재된 바와 같은 암소에서의 수태율을 상승시키는 능력을 유지하는 핵산 서열을 포함한다면, 본원에 기재된 DNA 분자의 돌연변이 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 그러한 돌연변이의 DNA 서열은 보통 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 상이할 것이다. 서열 변화는 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합일 수 있다. 클로닝된 유전자의 돌연변이유발 기술은 당 업계에 공지되어 있다. 부위 특이적 돌연변이유발을 위한 방법은 문헌 [Gustin et al., Biotechniques 14:22, 1993; Barany, Gene 37:111-23, 1985]; [Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. 199:537-9, 1985]; 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 15.3-15.108]에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 모두 본원에 참조로 원용된다. 요약하면, 본 발명은 대상 및 그의 변이체 또는 돌연변이에서 세포질 DNA 감시 분자를 활성화시킬 수 있는 핵산 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 기술된 핵산 서열에 의해 코딩된 중간 RNA 및 코딩된 임의의 결과 아미노산 서열을 포함한다.

일부 측면에서, 면역자극 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1 및 2에 제공된 서열과 상이한 경우, 플라스미드 내의 CpG 디뉴클레오티드는 바람직하게는 손상되지 않은 채로 남는다. 대안적으로, 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 CpG 디뉴클레오티드가 제거되도록 변경되는 경우, 플라스미드의 서열은 플라스미드 내 CpG 디뉴클레오티드의 총 수가 동일하게 유지되도록 다른 위치에서 변경될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 pGCMB75.6에 이미 존재하는 것 외에 추가의 CpG 디뉴클레오티드도 플라스미드에 도입될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기재된 면역자극 플라스미드는 바람직하게는 적어도 약 200, 적어도 약 220, 적어도 약 240, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 275, 적어도 약 280, 적어도 약 283, 적어도 약 285, 또는 적어도 약 288개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 면역자극 플라스미드는 283개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

면역자극 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 본원에 제공된 서열과 상이한 일부 측면에서, 플라스미드 내의 CpG 모티프 유형은 세포질 DNA 감시 분자의 생성된 활성화를 조절하도록 변화된다. 예를 들어, 면역자극 CpG 모티프의 수는 면역자극 플라스미드/DNA의 특정 임계값에 반응하는 특정 세포질 DNA 감시 분자의 활성화를 증가시키도록 증가될 수 있다. 추가 예로서, 비면역자극성 CpG 모티프의 수는 특정 세포질 DNA 감시 분자의 활성화를 감소시키고/거나, 다른 DNA 감시 분자의 활성화를 증가시키도록 증가될 수 있다.

특히, 본 발명은 본원에 기재된 면역자극 플라스미드 또는 DNA 서열 중 임의의 것 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제제에 관한 것이다.

B. 면역조절제

본원에 기재된 면역자극 플라스미드와 함께 사용하기에 적합한 면역조절 조성물은 미국 특허 출원 공개 제2000/0064151 A1호 및 제2013/0295167 A1호에 기재되어 있으며, 이들 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다.

면역조절 조성물은 리포좀 전달 비히클 및 본원에 기재된 면역자극 플라스미드 또는 DNA 서열 중 적어도 하나를 포함한다.

적합한 리포좀 전달 비히클은 핵산 분자를 치료 대상의 조직으로 전달할 수 있는 지질 조성물을 포함한다. 리포좀 전달 비히클은 바람직하게는 핵산 분자 및/또는 생물학적 제제를 전달하기에 충분한 시간동안 대상에서 안정하게 유지될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 전달 비히클은 수용 대상에서 적어도 약 5분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 24시간 동안 안정하다.

본 발명의 리포좀 전달 비히클은 세포로의 핵산 분자 전달을 용이하게 할 수 있는 지질 조성물을 포함한다. 핵산 분자가 하나 이상의 단백질을 코딩하는 경우, 핵산:리포좀 복합체는 바람직하게는 형질감염 효율이 전달되는 핵산 마이크로그램 (㎍) 당 전체 조직 단백질 밀리그램 (mg) 당 발현되는 단백질 적어도 약 1 피코그램 (pg)이다. 예를 들어, 핵산:리포좀 복합체의 형질감염 효율은 전달되는 핵산 ㎍ 당 전체 조직 단백질 mg 당 발현되는 단백질 적어도 약 10 pg; 또는 전달되는 핵산 ㎍ 당 전체 조직 단백질 mg 당 발현되는 단백질 적어도 약 50 pg이다. 복합체의 형질감염 효율은 전달되는 핵산 ㎍ 당 전체 조직 단백질 mg 당 발현되는 단백질 1 펨토그램 (fg) 정도로 낮을 수 있으며, 이 양이 보다 바람직하다.

본 발명의 바람직한 리포좀 전달 비히클은 직경이 약 100 내지 500 나노미터 (nm)이다. 예를 들어, 리포좀 전달 비히클은 직경이 약 150 내지 450 nm, 또는 약 200 내지 400 nm일 수 있다.

적합한 리포좀은 예를 들어, 당업자에게 공지되어 있는 유전자 전달법에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 임의의 리포좀을 포함한다. 바람직한 리포좀 전달 비히클은 멀티라멜라 소포 (multilamellar vesicle: MLV) 지질 및 압출 지질을 포함한다. MLV의 제조 방법은 당업자가 숙지하고 있다. 더욱 바람직한 리포좀 전달 비히클은 폴리양이온성 지질 조성을 갖는 리포좀 (즉, 양이온성 리포좀) 및/또는 폴리에틸렌 글리콜에 공액된 콜레스테롤 주쇄를 갖는 리포좀을 포함한다. 양이온성 리포좀 조성물의 예로는, 비제한적으로, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤, 1-[2-(올레일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)-이미다졸리늄클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤, 및 이들의 조합물이 있다. 전달 비히클로서 사용하기에 가장 바람직한 리포좀 조성물은 DOTIM 및 콜레스테롤을 포함한다.

적합한 핵산 분자는 본원에 기재된 임의의 면역조절 플라스미드를 포함한다. 코딩 핵산 서열은 단백질 또는 펩티드의 적어도 일부를 코딩하는 반면, 비-코딩 서열은 단백질 또는 펩티드의 어떠한 일부도 코딩하지 않는다. 본 발명에 따라서, "비-코딩" 핵산은 프로모터 영역과 같이, 전사 유니트의 조절 영역을 포함할 수 있다. 용어 "빈 벡터 (empty vector)"는 용어 "비-코딩"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 특히 유전자 삽입이 없는 플라스미드 벡터와 같은, 단백질 코딩 영역 부재하의 핵산 서열을 언급한다. 본원에 기재된 플라스미드에 의해 코딩된 단백질의 발현은 세포질 DNA 감시 분자 활성화를 필요로 하지 않으며; 따라서, 플라스미드는 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 어떤 코딩 서열도 함유하지 않는다. 그러나, 면역원 및/또는 사이토킨을 코딩하는 핵산 서열 (DNA 또는 RNA)을 조성물에 포함시킴으로써 추가적인 장점을 얻을 수 있다 (즉, 항원-특이적 및 면역성 증가). 면역원 및/또는 사이토킨을 코딩하는 이러한 핵산 서열은 본원에 기재된 면역자극 플라스미드에 포함될 수 있거나, 또는 조성물 내 별도의 핵산 (예: 별도의 플라스미드)에 포함될 수 있다.

리포좀을 본원에 기재된 면역자극 플라스미드와 복합체화하는 것은 당 업계에서의 표준 방법을 사용하거나 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 제6,693,086호에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 리포좀에 첨가하기에 적합한 플라스미드의 농도는 전신적인 면역 반응이 일어나도록 하기에 충분한 양의 플라스미드를 대상으로 전달하도록 하기에 효과적인 농도이다. 예를 들어, 약 0.1 ㎍ 내지 약 10 ㎍의 플라스미드가 약 8 nmol의 리포좀과 조합될 수 있거나, 약 0.5 ㎍ 내지 약 5 ㎍의 플라스미드가 약 8 nmol의 리포좀과 조합될 수 있거나, 또는 예를 들어, 약 1.0 ㎍의 핵산 분자가 약 8 nmol의 리포좀과 조합될 수 있다. 조성물 중 플라스미드 대 지질의 비 (㎍ 플라스미드:nmol 지질)는 적어도 약 1:1 플라스미드:지질 중량비 (예컨대, 1 ㎍ 핵산:1 nmol 지질)이다. 예를 들어, 플라스미드:지질의 비는 적어도 약 1:5, 적어도 약 1:10, 또는 적어도 약 1:20일 수 있다. 여기서 표현된 비는 조성물 중 양이온성 지질의 양을 기준으로 한 것이며, 조성물 중 지질의 총량을 기준으로 한 것이 아니다. 본 발명의 조성물 중 플라스미드 대 지질의 비는 적합하게는 약 1:1 내지 약 1:80 핵산:지질 중량비; 약 1:2 내지 약 1:40 플라스미드:지질 중량비; 약 1:3 내지 약 1:30 플라스미드:지질 중량비; 또는 약 1:6 내지 약 1:15 플라스미드:지질 중량비이다.

C. 생물학적 제제

본원에 기재된 임의의 면역조절 조성물은 본원에 기재된 적어도 하나의 플라스미드 및 리포좀 전달 비히클 외에 적어도 하나의 생물학적 제제를 추가로 포함할 수 있다.

적합한 생물학적 제제는 질병을 예방하거나 치료하는데 효과적인 제제이다. 이러한 생물학적 제제는 면역 증강 단백질, 면역원, 백신, 항균제 또는 이들의 임의 조합물을 포함한다. 적합한 면역 증강 단백질은 면역을 증강시키는 것으로 알려진 단백질이다. 비제한적인 예로서, 단백질 패밀리를 포함하는 사이토킨이 공지된 면역 증강 단백질 패밀리이다. 적합한 면역원은 대상으로의 면역원 투여가 대상 조직 내에서 마주치는 동일하거나 유사한 단백질에 대한 면역원 특이적 면역 반응을 일으키도록 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하는 단백질이다. 면역원은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 곰팡이에 의해 발현되는 병원성 항원을 포함할 수 있다. 바람직한 항원은 대상에서 감염성 질환을 유발하는 유기체로부터 유래된 항원을 포함한다. 본 발명에 따라, 면역원은 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하는 자연 발생 또는 합성 유도된 단백질의 임의의 부분일 수 있다. 이와 같이, 항원 또는 면역원의 크기는 약 5-12 아미노산만큼 작을 수 있으며, 그 사이의 임의의 크기를 포함하여 전장 단백질만큼 클 수 있다. 항원은 멀티머 단백질 또는 융합 단백질일 수 있다. 항원은 정제된 항원일 수 있다. 대안적으로, 면역 증강 단백질 또는 면역원은 면역자극 플라스미드에 의해 또는 면역조절 조성물에 포함된 또 다른 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 면역 증강 단백질 또는 면역원이 면역조절 조성물 중의 핵산 분자에 의해 코딩되는 경우, 면역 증강 단백질 또는 면역원을 코딩하는 핵산 서열은 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 면역원이 비특이적 면역 반응 이외에, 대상에서 면역원 특이적 면역 반응을 유도하도록 대상 저직에서 발현될 수 있다. 병원체 항원 면역원성 또는 사이토킨 활성과 같은 면역원성을 스크리닝하기 위한 기술은 당업자에게 공지되었으며 다양한 시험관 내 및 생체 내 분석을 포함한다.

생물학적 제제가 백신인 경우, 백신은 생, 감염성, 바이러스성, 박테리아성 또는 기생성 백신을 포함하거나, 또는 사멸, 비활성, 바이러스성, 박테리아성 또는 기생성 백신을 포함할 수 있다. 하나 이상의 백신, 생 또는 사멸 바이러스성 백신이 본 발명의 면역조절 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 적합한 백신은 조류 또는 소 종에 대한 당 업계에 공지된 백신을 포함한다.

생물학적 제제는 항균제일 수 있다. 적합한 항균제는 퀴놀론, 바람직하게는 플루오로퀴놀론, β-락탐 및 매크롤라이드-린코사미드스트렙토그라민 (MLS) 항생제를 포함한다.

적절한 퀴놀론으로는 베노플록사신, 빈플록사신, 시녹사신, 시프로플록사신, 클리나플록사신, 다노플록사신, 디플록사신, 에녹사신, 엔로플록사신, 플레록사신, 게미플록사신, 이바플록사신, 레보플록사신, 로메플록사신, 마르보플록사신, 목시플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 오르비플록사신, 파주플록사신, 프라도플록사신, 퍼플록사신, 사라플록사신, 스파플록사신, 테마플록사신 및 토수플록사신을 들 수 있다. 바람직한 플루오로퀴놀린은 시프로플록사신, 다노플록사신, 엔로플로사신, 목시플록사신 및 프라도플록사신을 포함한다. 적합한 나프티리돈은 날리딕스산을 포함한다. 적합한 β-락탐으로는 페니실린 (예: 아목시실린, 암피실린, 아즐로실린, 벤자틴 페니실린, 벤질페니실린, 카르베니실린, 클록사실린, 코-아목시클라브 [즉, 아목시실린/클라불란산], 디클록사신, 플루클록사신, 메티실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 페녹시메틸페니실린, 피페라실린, 프로카인 페니실린, 테모실린 및 티카실린); 세팔로스포린 (예: 세파클로르, 세팔로늄, 세파만돌, 세파프리린, 세파졸린, 세페핌, 세픽심, 세포탁심, 세폭시틴, 세프피롬, 세프포독심, 세프퀴놈, 세프타지딤, 세프티오푸르, 세프트리악손, 세푸록심, 세팔렉신, 세팔로틴 및 데포테탄); 카바페넴 및 페넴 (예: 도리페넴, 에르타페넴, 파로페넴, 이미페넴 및 메로페넴); 모노박탐 (예: 아즈트레오남, 노카디신 A, 탑톡시닌-β-락탐 및 티게모남); 및 β-락타마제 억제제 (예: 클라불란산, 술박탐 및 타조박탐)를 들 수 있다. 바람직한 β-락탐은 세팔로스포린, 특히 세파졸린을 포함한다.

적합한 MLS 항생제는 클린다마이신, 린코마이신, 피를리마이신 및 임의의 마크롤라이드 항생제를 포함한다. 바람직한 린코사미드 항생제는 피를리마이신이다.

다른 항균제로는 아미노글리코시드, 클로피돌, 디메트리다졸, 에리트로마이신, 프라마이세틴, 푸라졸리돈, 할로푸기논, 2-피리돈, 로베니딘, 설폰아미드, 테트라사이클린, 트리메토프림, 다양한 플레우로무틸린 (예: 티아물린 및 발네물린), 및 다양한 스트렙토마이신 (예: 모넨신, 나라신 및 살리노마이신)이 있다.

II. 방법

A. 면역자극법

본 발명의 일 구체예로, 암소 종의 일원에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여함으로써 상기 암소 종의 일원에서 면역 반응을 유도한다. 상기 유효량은 암소 종의 일원에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 양이다. 면역조절제는 리포좀 전달 비히클 및 핵산 분자를 포함한다.

일 구체예로, 면역조절제의 유효량은 동물당 약 1 마이크로그램 내지 약 1000 마이크로그램이다. 다른 구체예로, 면역조절제의 유효량은 동물당 약 5 마이크로그램 내지 약 500 마이크로그램이다. 또 다른 구체예로, 면역조절제의 유효량은 동물당 약 10 마이크로그램 내지 약 100 마이크로그램이다. 추가의 구체예에서, 면역조절제의 유효량은 동물당 약 10 마이크로그램 내지 약 50 마이크로그램이다.

본 발명의 다른 구체예로, 리포좀 전달 비히클, 단리된 핵산 분산, 및 생물학적 제제를 포함하는, 유효량의 면역조절제를 투여함으로써 암소 종의 일원에서 면역 반응을 유도한다. 생물학적 제제는 면역조절제와 혼합되거나 이와 함께 또는 독립적으로 투여될 수 있음이 고려된다. 독립 투여는 면역조절제의 투여 전 또는 후일 수 있다. 또한, 면역조절제 또는 생물학적 제제를 복수 회 투여하여 증가된 면역성을 연장시킬 수 있음도 고려된다. 또한, 복수 생물학적 제제를 면역조절제와 함께 투여하거나, 면역조절제의 투여 전에 투여하거나, 면역조절제의 투여 후에 투여하거나, 또는 이와 동시에 투여할 수 있다.

B. 수태율

본 발명의 방법은 암소의 수태율을 상승시키는데 유용하다. 바람직한 구체예에서, 암소의 수태율은 대조 집단의 수태율에 비해 증가한다. 일부 바람직한 구체예에서, 암소의 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조군의 수태율에 비해 증가한다.

본 발명의 방법은 암소에서 첫 서비스 수태율을 증가시키는데 유용하다. 본원에서 사용된 첫 서비스 수태율이란 첫 수정으로 수태되는 인공 수정을 받은 암소 비율을 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 암소의 첫 서비스 수태율은 대조 집단의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다. 일부 바람직한 구체예에서, 암소의 첫 서비스 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단에서의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.

본 발명의 방법은 비-사이클링 암소에서 수태율을 상승시키는데 유용하다. 본원에서 "비-사이클링 (non-cycling)"이란 번식 계획 시작 약 30일 전에 꼬리 페인트 제거 또는 관찰에 의해 암소에서 발정기가 검출되지 않음을 가리킨다. 바람직한 구체예에서, 비-사이클링 암소의 수태율은 대조 집단의 수태율에 비해 증가한다. 일부 바람직한 구체예에서, 비-사이클링 암소의 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단의 수태율에 비해 증가한다.

본 발명의 방법은 비-사이클링 암소에서 첫 서비스 수태율을 상승시키는데 유용하다. 바람직한 구체예에서, 비-사이클링 암소의 첫 서비스 수태율은 대조군의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다. 일부 바람직한 구체예에서, 비-사이클링 암소에서의 첫 서비스 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단에서의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.

C. 투여

다양한 투여 경로가 이용가능하다. 물론, 선택되는 특정 방식은 선택된 특정 생물학적 제제, 대상 연령 및 일반적인 건강 상태, 치료할 특정 질환 및 치료 효능에 요구되는 투여량에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 방법은 임상적으로 허용될 수 없는 부작용을 일으키지 않고 효과적인 수준의 면역 반응을 산출하는 임의의 투여 방식을 사용하여 실시될 수 있다. 조성물은 단위 투여형으로 편리하게 제공될 수 있으며 당업자에 숙지되어 있는 임의의 방법으로 제조될 수 있다.

소 종 동물의 예방접종은 어느 연령대에서나 수행될 수 있다. 백신은 정맥 내로, 근육 내로, 피 내로, 복강 내로, 피하로, 스프레이/에어로졸에 의해, 경구적으로, 안 내로, 기관 내로, 비강 내로, 또는 당 업계에 공지된 다른 방법에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법이 일상적인 예방접종 스케줄에 기초해 사용될 수 있음도 고려된다. 본 발명의 면역조절제는 또한 정맥 내로, 근육 내로, 피하로, 스프레이에 의해, 경구적으로, 안 내로, 기관 내로, 비강 내로, 또는 당 업계에 공지된 다른 방법에 의해 투여될 수도 있다. 일 구체예에서, 면역조절제는 피하로 투여된다. 다른 구체예에서, 면역조절제는 근육 내로 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 스프레이로 투여된다. 추가의 구체예에서, 면역조절제는 경구적으로 투여된다.

일 구체예에서, 면역조절제는 분만 전에 자체로 동물에 투여된다. 다른 구체예에서, 면역조절제는 분만 후에 자체로 동물에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 분만과 동시에 자체로 동물에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 분만 전뿐만 아니라 분만과 동시에 자체로 동물에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 분만 전 예방접종과 동시에 공동 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 분만과 동시에 예방접종과 동시에 공동 투여된다. 공동-투여 (co-administration)는 백신과 면역조절제를 동물의 동일한 일반적인 위치에서 서로 옆 두 상이한 부위에 (즉, 동물의 목에서 서로 옆에 주사), 동일한 일반적인 위치에서 동물의 반대 측 (즉, 목의 각 측에 1회씩), 또는 동일한 동물의 상이한 위치에 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 예방접종 및 분만 전에 투여된다. 추가의 구체예에서, 면역조절 조성물은 예방접종 후, 분만 전에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 분만 전에 이미 예방접종시킨 동물에게 분만 후에 투여된다. 당업자라면 투여 경로가 대상 및 대상의 건강 또는 상태에 따라 달라질 수 있음을 인식할 것이다.

일 구체예에서, 면역조절제는 번식 전에 자체로 동물에 투여된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 면역조절제는 번식 후에 자체로 동물에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 번식과 동시에 자체로 동물에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 번식 전뿐만 아니라 번식과 동시에 자체로 동물에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 번식 전 예방접종과 동시에 공동 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 번식과 동시에 예방접종과 동시에 공동 투여된다. 공동-투여는 백신과 면역조절제를 동물의 동일한 일반적인 위치에서 서로 옆 두 상이한 부위에 (즉, 동물의 목에서 서로 옆에 주사), 동일한 일반적인 위치에서 동물의 반대 측 (즉, 목의 각 측에 1회씩), 또는 동일한 동물의 상이한 위치에 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 예방접종 및 번식 전에 투여된다. 추가의 구체예에서, 면역조절 조성물은 예방접종 후, 번식 전에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 번식 전에 이미 예방접종시킨 동물에게 번식 후에 투여된다. 당업자라면 투여 경로가 대상 및 대상의 건강 또는 상태에 따라 달라질 수 있음을 인식할 것이다.

일 구체예에서, 면역조절제는 챌린지 약 1 내지 약 14일 전 또는 챌리지 약 1 내지 약 14일 후 투여한다. 다른 구체예에서, 면역조절제는 챌린지 약 1 내지 약 7일 전 또는 챌리지 약 1 내지 약 7일 후 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 챌린지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 전 또는 챌린지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 후 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 챌린지 3일 전 또는 챌린지 3일 후 투여된다.

다른 전달 시스템은 시간-방출, 지연 방출 또는 서방출 전달 시스템을 포함할 수 있다. 그러한 시스템은 조성물의 반복 투여에 따른 불편의 증가를 피할 수 있다. 여러가지 타입의 방출 전달 시스템이 이용가능하며 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 폴리머 기반 시스템, 예컨대 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리하이드록시부티르산, 및 폴리무수물을 포함한다. 전술한 약제 함유 폴리머의 미세캡슐제가 예를 들어, 미국 특허 제5,075,109호에 기재되어 있다.

전달 시스템은 또한 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 중성 지방, 예컨대 모노-, 디- 및 트리-글리세리드를 포함하는 지질인 비-폴리머 시스템; 하이드로겔 방출 시스템; 실래스틱 시스템 (sylastic system); 펩티드 기반 시스템; 왁스 코팅; 통상의 결합제와 부형제를 사용한 압축 정제; 부분적으로 융합된 이식물; 등을 포함한다. 특정 예로는, 비제한적으로, 본 발명의 약제가 미국 특허 제4,452,775호, 제4,675,189호 및 제5,736,152호에 기재된 바와 같이 매트릭스내의 형태로 함유되어 있는 침식형 시스템 (erosional systems), 및 활성 성분이 미국 특허 제3,854,480호, 제5,133,974호 및 제5,407,686호에 기재된 바와 같이 폴리머로부터 조절된 속도로 침투하는 확산형 시스템이 있다. 또한, 펌프-기반 하드웨어 전달 시스템이 사용될 수 있으며, 이들 중 일부는 이식용으로 채택된다.

본 발명의 범주로부터 벗어나지 않고 조성물, 제품 및 방법을 다양하게 변화시킬 수 있기 때문에, 상기 설명 및 이후 제시되는 실시예에 포함되는 모든 것들은 설명으로서 이해되어야 하며 제한적 의미가 아님을 이해하여야 할 것이다.

정의

용어 "유효량"은 목적하는 생물학적 효과를 실현시키기에 필수적이거나 충분한 양을 언급한다. 예를 들어, 감염성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 면역조절제의 유효량은 미생물에 노출시 면역 반응을 발달시켜, 대상내 미생물의 양을 감소, 바람직하게는 미생물을 근절시키는데 필요한 양이다. 특정 용도에 대한 유효량은 치료할 질병 또는 상태, 대상의 크기, 또는 상기 질병 또는 상태의 중증도와 같은 인자에 따라 변화될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험없이 면역조절제의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "암소"는 암컷 소, 젖소 및 어린 암소를 제한 없이 포함하는 새끼를 가질 수 있는 소 종의 임의의 구성원을 지칭한다.

용어 "사이토킨"은 면역 증강 단백질 패밀리를 지칭한다. 사이토킨 패밀리는 조혈 성장 인자, 인터류킨, 인터페론, 면역글로불린 상과 (superfamily) 분자, 종양괴사인자 패밀리 분자 및 케모킨 (즉, 세포, 특히 식세포의 이동 및 활성화를 조절하는 단백질)을 포함한다. 사이토킨의 예로는, 제한없이, 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-12 (IL-12), 인터류킨-15 (IL-15), 인터류킨-18 (IL-18), 인터페론-α (IFNα), 및 인터페론-γ (IFNγ)이 있다.

용어 "유도하다"는 용어 활성화시키다, 자극하다, 발생시키다 또는 상향조절하다와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

용어 대상에서 "면역 반응을 유도하는"이란 면역 반응의 활성을 특이적으로 조절하거나 영향을 주는 것을 언급하며, 면역 반응을 활성화, 면역 반응을 상향조절, 면역 반응을 증강 및/또는 면역 반응을 변화시키는 것 (예컨대 일정 타입의 면역 반응을 일으킨 다음 이것이, 어떤 대상에서는 유해하거나 효과가 없는 것이 다른 대상에서는 유익하거나 보호적인 것으로, 지배적인 타입의 면역 반응을 변화시키는 것)을 포함할 수 있다.

용어 "작동가능하게 결합된"이란 핵산 분자가 숙주 세포로 형질주입시 (즉, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염) 상기 분자가 발현될 수 있도록 하는 방식으로 전사 조절 서열에 결합되어 있는 것을 언급한다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 신장 (elongation), 및 종결을 조절하는 서열이다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 전사 개시를 조절하는 것들로, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및 리프레서 서열이 있다. 그러한 다양한 전사 조절 서열이 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 바람직한 전사 조절 서열은 조류, 어류, 포유류, 박테리아, 식물, 및 곤충 세포에서 작용하는 것들을 포함한다. 임의의 전사 조절 서열이 본 발명에서 사용될 수 있는데, 상기 서열은 면역원 또는 면역 자극 단백질을 코딩하는 서열과 자연적으로 관련된 천연 전사 조절 서열을 포함할 수 있다.

용어 "핵산 분자" 및 "핵산 서열"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며 DNA, RNA, 또는 DNA 또는 RNA의 유도체를 포함한다. 상기 용어는 또한 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 분자와 조절 영역, 인트론, 또는 기타 비-코딩 DNA 또는 RNA를 포함하는 핵산 분자를 둘 다 포함하는, 올리고뉴클레오티드 및 더 큰 서열을 포함한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 약 1 내지 약 500개의 뉴클레오티드의 핵산 서열을 갖고 있으며, 더욱 전형적으로는 길이가 적어도 약 5개의 뉴클레오티드인 것이다. 상기 핵산 분자는 포유류, 어류, 박테리아, 곤충, 바이러스, 식물 또는 합성 공급원을 포함한, 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 핵산 분자는 재조합 DNA 기술 (예, 폴리머라제 연쇄반응 (PCR), 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성법과 같이 당해 분야에 통상적으로 공지되어 있는 방법으로 제조될 수 있다. 핵산 분자는 비제한적으로, 천연 대립형질 변이체 및 본 발명의 방법에서 유용한 면역원 또는 면역 자극 단백질을 코딩할 수 있는 핵산 분자의 능력이 실질적으로 영향받지 않도록 하는 개질 방식으로 뉴클레오티드가 삽입, 결실, 치환, 또는 전환되어 있는 개질된 핵산 분자를 포함하는, 천연 핵산 분자와 이들의 동족체를 포함한다. 핵산 동족체는 당해 분야의 숙련가에 공지되어 있는 수많은 방법 (예를 들어, 다음 문헌을 참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989, 이는 본 명세서에서 참고로 인용됨)을 사용하여 제조할 수 있다. 병원균 항원 면역원성과 같은 면역원성 또는 사이토킨 활성에 대한 스크리닝 기술은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 다양한 시험관 내 및 생체 내 검정법을 포함한다.

"선택 마커" 및 "선택 마커 유전자"라는 용어는 유전자가 선택 약제 (예: 항생제) 또는 정상적으로 유기체를 죽일 수 있거나 그의 성장을 억제할 수 있는 상태로부터 발현되는 유기체를 보호하는 산물을 코딩하는 유전자를 지칭한다. 선별 마커 유전자는 가장 일반적으로 항생제 내성 유전자 (예: 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 등)이다. 따라서, 예를 들어, 대장균 세포를 형질전환 절차에 적용하여 카나마이신 내성 유전자를 코딩하는 플라스미드를 도입한 뒤 카나마이신을 함유하는 배지 상 또는 그에서 증식시키는 경우, 플라스미드를 성공적으로 흡수하고 카나마이신 내성 유전자를 발현하는 대장균만이 생존할 것이다. "선택 마커" 및 "선택 마커 유전자"라는 용어는 유기체의 성장에 필수적인 화합물의 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자도 포함한다. 필수 화합물을 합성할 수 없는 영양요구성 유기체에 도입된 경우, 이러한 유전자는 유기체가 필수 화합물로 보충된 배지에서 성장하도록 허용한다. 예를 들어, 라이신 생합성에 관여하는 효소의 돌연변이 또는 그 부재로 인해 아미노산 라이신에 대해 영양요구성인 박테리아 세포는 정상적으로 라이신이 보충되지 않은 배지에서 성장할 수 없다. 이러한 박테리아가 라이신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 플라스미드의 도입을 위해 형질전환 절차를 거치면, 플라스미드를 성공적으로 흡수하고 효소를 발현한 박테리아는 라이신이 보충되지 않은 배지에서 성장되는 경우 생존할 것이다. "선택 마커" 및 "선택 마커 유전자"라는 용어는 독/해독제 선택을 가능케 하는 유전자를 더 포함한다. 예를 들어, ccdB 유전자는 세포 분열에 필수 효소인 DNA 자이라제 (gyrase)에 결합하는 단백질을 코딩한다. DNA 자이라제에 결합시, ccdB 유전자 산물은 유전자 복제를 손상시키고 세포사를 유도한다. 따라서, ccdB 유전자 산물을 발현하는 박테리아는 생존할 수 없다. ccdA 유전자는 ccdB 유전자 산물의 천연 억제제 역할을 하는 단백질 (해독제)을 코딩한다. 따라서 박테리아 게놈에 ccdB 유전자를 가진 박테리아가 ccdA 유전자 산물을 코딩하는 플라스미드의 도입을 위해 형질전환 과정을 거치면 플라스미드를 성공적으로 흡수하고 ccdA 유전자를 발현하는 세포만이 생존할 것이다.

"선택 마커" 및 "선별 마커 유전자"라는 용어는 관찰자로 하여금 선별 마커 유전자를 발현하는 세포와 선별 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 구별토록 할 수 있는 산물을 코딩하는 유전자를 지칭한다. 선별 마커 유전자 시스템은 당 업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, lacZ 유전자 및 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 청색 형광 단백질 BFP) 또는 시안 형광 단백질 (CFP)과 같은 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 다양한 구체예를 설명한다.

실시예 1: 비-사이클링 암소에서 수태율을 상승시키는데 면역조절 조성물의 효능

본 연구의 목적은 분만시 면역 기능을 조절하는 것이 처리된 암소의 생식 결과에 미치는 영향을 평가하는데 있다.

면역조절제

본 연구에 사용된 면역조절제는 실시예 1에서 기술한 상술된 조성물이다.

연구 동물

뉴질랜드 와이카토 (Waikato) 지역에 있는 2곳의 상업적 젖소 농장 A 및 B에서 2년생 이상 프리지아종, 저지종 또는 교배종 암소 875 마리를 입수하였다. 이때 암소들은 새로 태어나 젖을 먹는 송아지를 기준으로 선정되었다. 분만 30일 전에 항생제, 비스테로이드계 항염증제 또는 코르티코스테로이드로 처치되었거나 분만시 질병의 징후가 있는 소는 배제했다. 남은 동물들을 연령별 (암송아지 대 암소)로 블록화하고 처리군 또는 위약군으로 사전 준비된 무작위화 목록에 제시된 일련의 동물쌍에 배정하였다.

처리

처리는 무작위적으로 하였고 처리 배정은 처리 후 샘플링 시트에 포함되지 않았으며 젖 샘플에는 후속 실험실 분석에 사용된 가입 고유 번호가 할당되었다. 분만 당일 (0일)과 신체 검사 및 등록 후 우측 둔부근에 근육 주사로 적절한 처리를 시행하였다. 주사하기 전에 주사 부위를 70% 메틸화 변성 알콜로 적신 면봉으로 닦았다. 처리는 산후 3일째 저녁 또는 4일째 아침과 7일째에 한 번 더 우측 둔부근 주사로 반복 실시하였다.

번식 관리

계획한 번식 프로그램 시작 대략 30일 전에 꼬리 페인트 (열 감지 지원)를 칠했다. 꼬리 페인트 제거 또는 관찰에 의해 발정기가 검출되지 않은 암소를 프로게스테론, GnRH 및 프로스타글란딘 F_2α의 조합으로 처리하고 설정된 인공 수정 시기까지 사육하였다. 농장 A 지구에서는 첫 37일 동안, 농장 B 지구에서는 47일 동안, 지속 발정기가 관찰된 암소를 인공 수정시켰다. 그 후 온전한 수컷을 무리와 지내게 하였다. 교미 총 기간은 농장 A 및 B에서 각각 77일 및 80일이었다. 암소를 번식 프로그램 시작 후 83일 및 113일 (농장 A), 그리고 번식 프로그램 시작 후 90일 및 120일 (농장 B)에 경직장 초음파검사로 검사하였다. 임신이 관찰된 암소들의 임신 것을 산정하였다. 임신 산정 단계가 인공 수정 또는 자연 적 교미의 기록 번식 7일 이내인 경우, 기록 날짜를 수태일로 하였다.

결과

3주 제시율 (번식 프로그램을 시작하여 3주 내에 관찰되고 수정된 암소의 비율), 첫 서비스 수태율 (첫 수정으로 수태된 인공 수정을 받은 암소의 비율), 3 및 6주 새끼 비율 (번식 프로그램의 첫 3주 및 6주 내에 임신이 확인된 암소의 비율), 및 최종 임신율을 계산하였다.

이항 생식 결과를 먼저 이변량 (카이 제곱) 분석으로 분석하였다. 처리, 집단, 연령 (2, 3 및 3년 초과령), 번식 프로그램 시작에서의 젖 일 수 (50 내지 71일 및 72일 이상으로 분류됨) 및 품종 (프리지아종 대 다른 품종)의 설명 변수를 비롯한 다변량 로지스틱 회귀 모델을 행하였다. 또한, 수태 간격에 대한 계획된 교미 시작을 각 암소에 대해 계산하고, 카플란-메이어 (Kaplan-Meier) 생존 분석을 사용하여 수태까지의 중앙 일 수를 계산하였다.

처리군을 품종 코드 및 연령에 대해 조정하고 카이 제곱 검정을 사용하여 p-값을 계산하였으며, 결과를 표 1에 나타내었다.

또한, 분만에서부터 계획된 교미 시작까지의 평균 및 중간 시간은 표 2에 나타낸 바와 같이 처리군과 대조군 간 동일하였다. 처리군 및 대조군에 대해 분만에서부터 계획된 번식 시작까지의 중간값을 비교한 p-값을 만-휘트니 (Mann-Whitney) 검정을 사용하여 계산하였다.

표 3에 나타난 바와 같이, 처리군과 대조군 간에는 이변량 수준에서 계획된 교미 시작 (planned start of mating, PSM) 후 21일 (3주 제시)에 인공 수정에 대한 제시 확률, PSM 후 첫 수정에 대한 수태 확률 (첫 서비스에 대한 수태), PSM 후 21일 및 42일 까지 임신 확률 (각각 3주에 임신 및 6주에 임신) 및 전체 임신에 차이가 없었다. 카이 제곱 검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.

품종 (홀스타인종, 저지종 및 교배종), 연령 (2, 3 및 4+년생), 무리 (1 및 2), 난소 사이클링 활동 (CIDR 장치의 삽입에 기반한 사이클링 및 비-사이클링) 및 분만에서부터 PSM까지의 시간 (50 내지 71일 및 72일 이상)을 비롯한 잠재 효과 변경 인자를 제어한 다변수 회귀 분석에서, 처리군에서 비-사이클링 암소의 첫 서비스에 대한 수태 및 3주째 임신 확률이 대조군에서의 그의 대응상대에 비해 더 높았다. 도 4A는 첫 수정에 대한 수태 확률 (산정 주변 평균 및 평균 표준 오차 (SEM))의 차트를 도시하고, 도 4B는 처리군에 의한 사이클링 및 비-사이클링 암소에 대한 계획된 번식 프로그램 시작 후 3주 내 임신 확률 (산정 주변 평균 및 SEM)을 나타낸다. 별표는 비-사이클링 군 내 처리간 차이를 나타낸다. PSM에서 임신까지의 평균 시간은 처리군과 대조군에 대해 각각 15일 및 16일이었다 (P=0.27).

첫 서비스를 받은 처리 암소가 비처리 대조군보다 수치상으로 더 많이 (69% 대 65%) 3주 (63% 대 61%) 및 6주 (80% 대 76%)까지 임신하였다. 발정기가 발견되지 않은 것으로 진단되고 이 상태에서 처리된 암소들에 비-사이클링 상태 상호작용에 의한 처리가 있었는데, 처리된 암소는 첫 서비스 수태율이 더 높았고 번식 프로그램에서 3주까지 임신율이 더 높았다.

SEQUENCE LISTING <110> <120> INCREASED FERTILITY IN BOVINE SPECIES <130> BAYR <150> Pat. Appln. Number - TBA >151> Date - <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4242 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of plasmid pGCMB75.6 <400> 1 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540 cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600 cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660 caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac 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ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 660 gccccccctc gagcaggatc tatacattga atcaatattg gcaattagcc atattagtca 720 ttggttatat agcataaatc aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc 780 ataatatgta catttatatt ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat 840 tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt 900 tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 960 cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 1020 gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 1080 tgccaagtcc gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 1140 agtacatgac cttacgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 1200 ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 1260 ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 1320 aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc 1380 gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga 1440 gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctcccct 1500 cgaagccgat ctgataacgg taccgataag ctggcggccg attaagctac agaagttggt 1560 cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga gaccaataga 1620 aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct attggtctta 1680 ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccaggttcaa ttacagctct 1740 taagcagccg caagcttgat atcgaattcc tgcagcccgg gggatccact agttctagag 1800 cggccgccac cgcggtggag ctcgaattat cagatcgatt aataactatg ctcaaaaatt 1860 gtgtaccttt agctttttaa tttgtaaagg ggttaataag gaatatttga tgtatagtgc 1920 cttgactaga gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 1980 acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 2040 tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 2100 aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 2160 atgtctggat catcagatct gccggtctcc ctatagtgag tcgtattaat ttcgataagc 2220 caggttaacc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 2280 cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 2340 gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 2400 aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 2460 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 2520 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 2580 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 2640 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 2700 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 2760 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 2820 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 2880 tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 2940 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 3000 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 3060 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 3120 ttggtcatga gcgcgcctag gcttttgcaa agatcgatca agagacagga tgaggatcgt 3180 ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc 3240 tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc 3300 tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg 3360 aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag 3420 ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg 3480 ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg 3540 caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac 3600 atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg 3660 acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc 3720 ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg 3780 aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc 3840 aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc 3900 gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc 3960 ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc 4020 caacctgcca tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg 4080 aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt 4140 cttcgcccac cctaggcgcg ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 4200 aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 4242 <210> 3 <211> 4242 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of plasmid pMB75.6_AscI <400> 3 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540 cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600 cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660 caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 720 tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 780 tcccaggttc aattacagct cttaagcagc cgcaagcttg atatcgaatt cctgcagccc 840 gggggatcca ctagttctag agcggccgcc accgcggtgg agctcgaatt atcagatcga 900 ttaataacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata 960 aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta 1020 gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1080 aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 1140 agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1200 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcatcagat ctgccggtct ccctatagtg 1260 agtcgtatta atttcgataa gccaggttaa cctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 1320 gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1380 ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1440 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1500 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1560 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1620 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1680 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1740 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1800 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1860 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1920 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1980 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2040 caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2160 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220 caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct 2280 ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 2340 tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc 2400 gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 2460 acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg 2520 ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 2580 aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 2640 ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 2700 cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 2760 gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 2820 tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 2880 ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 2940 cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 3000 cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg 3060 aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3120 tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3180 gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctaggcg cgctcatgag cggatacata 3240 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3300 ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 3360 gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 3420 ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 3480 actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540 caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600 ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 3660 agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720 ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780 tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840 aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900 gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960 ccgggccccc cctcgagcag gatctataca ttgaatcaat attggcaatt agccatatta 4020 gtcattggtt atatagcata aatcaatatt ggctattggc cattgcatac gttgtatcta 4080 tatcataata tgtacattta tattggctca tgtccaatat gaccgccatg ttgacattga 4140 ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 4200 gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gc 4242 <210> 4 <211> 4242 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucelotide sequence of plasmid pLacZMB75.6 <400> 4 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540 cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600 cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660 caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 720 tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 780 tcccaggttc aattacagct cttaagcagc cgccaaaaca aaattcctca aaaatcatca 840 tcgaatgaat ggtgaaataa tttccctgaa taactgtagt gttttcaggg cgcggcataa 900 taattaacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata 960 aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta 1020 gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1080 aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 1140 agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1200 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcatcagat ctgccggtct ccctatagtg 1260 agtcgtatta atttcgataa gccaggttaa cctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 1320 gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1380 ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1440 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1500 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1560 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1620 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1680 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1740 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1800 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1860 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1920 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1980 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2040 caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2160 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220 caagagacag gatgaggatc gtttcgcagc ttttcattct gactgcaacg ggcaataagt 2280 ctctgtgtgg attaaaaaaa gagtgtctga tagcagcttc tgaactggtt acctgccgtg 2340 agtaaattaa aattttattg acttaggtca ctaaggcgcc ttgcgctgag gttgcgtcgt 2400 gatatcatca gggcagaccg gttacatccc cctaacaagc tgtataaaga gaaatactat 2460 ctcattggcg ttgcccgcac ctgacagtgc gacgttgggc tgcgtccgtc gaccaacggt 2520 accgaggtaa cagcccaatc tatccatgat ctcggccagg ccgggtcggc cgttatgcag 2580 cccggctcgg gtatgaagcc attaaggagc cgacccagcg cgaccgggcg gccggtcacg 2640 ctgcctctgc tgaagcctgc ctgtcactcc ctgcgcggcg tacccgccgt tctcatcgag 2700 taggctccgg atcgcgaccc cggacgggcc ctgggcccag gagcggccta tgacaaatgc 2760 cgggtagcga tccggcattc agcattgact gcgcacggat ccagtccttg caggagcctt 2820 atgccgaccg tagcaaaaaa tgagcccgag ccgatcgcga gttgtgatcc ggtcccgccg 2880 attgccggtc gcgatgacgg tcctgtgtaa gcgttatcgt taccaattgt ttaagaagta 2940 tatacgctac gaggtacttg ataacttctg cgtagcatac atgaggtttt gtataaaaat 3000 ggcgggcgat atcaacgcag tgtcagaaat ccgaaacagt ctgcgggact ctggggttcg 3060 aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3120 tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3180 gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctaggcg cgctcatgag cggatacata 3240 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3300 ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 3360 gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 3420 ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 3480 actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540 caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600 ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 3660 agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720 ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780 tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840 aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900 gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960 ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttga tatcgaattc ctgcagcccg 4020 ggggatccac tagttctaga gcggccgcca ccgcggtgga gctccagctt ttgttccctt 4080 tagtgagggt taattgcgcg cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 4140 tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 4200 ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gc 4242

Claims

a. 양이온성 리포좀 전달 비히클; 및
b. 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아 유래 핵산 분자;
를 포함하는 소의 수태율을 상승시키기 위한 면역조절 조성물.
제1항에 있어서, 핵산 분자가 적어도 하나의 면역자극 CpG 모티프 및 적어도 하나의 비-면역자극 CpG 모티프를 포함하는 면역조절 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는 면역조절 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 리포좀 전달 비히클이 멀티라멜라 소포 지질 및 압출 지질로 구성된 군으로부터 선택된 지질을 포함하는 면역조절 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 리포좀 전달 비히클이 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤로 구성된 군으로부터 선택된 지질쌍을 포함하는 면역조절 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 1을 포함하는 면역조절 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 2를 포함하는 면역조절 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 제제를 추가로 포함하는 면역조절 조성물.
제8항에 있어서, 생물학적 제제가 면역 증강 단백질, 면역원, 백신, 항균제 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 면역조절 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥 내, 근육 내, 피내, 복강 내, 피하, 분무-에어로졸, 경구, 안내, 기관 내 및 비강 내로 구성된 군으로부터 선택된 투여용의 면역조절 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 면역조절 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 암소에서의 수태율이 p-값 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단에서의 수태율에 비해 증가된 면역조절 조성물.
a. 양이온성 리포좀 전달 비히클; 및
b. 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아 유래 핵산 분자;
를 포함하는 면역조절 조성물의 유효량을 암소에게 투여하는 것을 포함하는, 암소에서 수태율을 상승시키는 방법.
제13항에 있어서, 핵산 분자가 적어도 하나의 면역자극 CpG 모티프 및 적어도 하나의 비-면역자극 CpG 모티프를 포함하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는 방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 리포좀 전달 비히클이 멀티라멜라 소포 지질 및 압출 지질로 구성된 군으로부터 선택된 지질을 포함하는 방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 리포좀 전달 비히클이 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤로 구성된 군으로부터 선택된 지질쌍을 포함하는 방법.
제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 1을 포함하는 방법.
제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 2를 포함하는 방법.
제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 제제를 추가로 포함하는 방법.
제20항에 있어서, 생물학적 제제가 면역 증강 단백질, 면역원, 백신, 항균제 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 정맥 내, 근육 내, 피내, 복강 내, 피하, 분무-에어로졸, 경구, 안내, 기관 내 및 비강 내로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 방법.
제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 암소의 수태율이 p-값 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단에서의 수태율에 비해 증가된 방법.