KR20190031930A - Composition for controlling pine wilt disease comprising methyl salicylate or its derivative as effective component and method for controlling pine wilt disease using the same - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a composition for controlling a pine wilt disease comprising methyl salicylate, derivatives thereof or agriculturally/pharmaceutically acceptable salts thereof as an effective component and a pine wilt control method using the same. The control effect of methyl salicylate was verified to be caused by inducible resistance in vitro. Generally, inducible resistance is effective in small quantities and exhibits medical effects by a mechanism of gene expression in plants. Therefore, inducible resistance is harmless to the human body and does not cause environmental pollution. Therefore, development of eco-friendly chemicals for the pine wilt disease is possible, and the possibility of development of a pine wilt disease control agent of a new concept using the chemicals can be increased. Also, when a conventional trunk injection method of a nematocide agent used to control the pine wilt disease is switched to a soil drench method or a foliage spray method of an inducible resistance agent, the pine wilt disease can be effectively controlled at low costs, and the spray application range of the pine wilt disease control agent can be widened.

Description

메틸살리실레이트 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물 및 이를 이용한 소나무재선충 방제 방법{Composition for controlling pine wilt disease comprising methyl salicylate or its derivative as effective component and method for controlling pine wilt disease using the same}[0001] The present invention relates to a composition for controlling pine nutrient herbicidal compositions containing methyl salicylate or a derivative thereof as an active ingredient and a method for controlling pine tree reeducation using the same. the same}

본 발명은 메틸살리실레이트(methyl salicylate), 이의 유도체 또는 이들의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물 및 이를 이용한 소나무재선충 방제 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for controlling pine wilt disease comprising methyl salicylate, a derivative thereof, or an agrochemically acceptable salt thereof as an active ingredient, and a method for controlling pine reedge using the same.

소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 의한 소나무재선충병은 국내외적으로 소나무에 심각한 피해를 유발하고 있으며, 최근 기후변화에 따른 산림생태계 환경의 변화와 함께 복잡한 양상을 보이며 급속히 확산되고 있다. 소나무재선충병의 주요 원인으로는 소나무재선충으로 알려져 왔으며, 기주, 병원체, 매개충, 환경요인간 복잡한 상호작용을 통해 소나무를 고사시키는 방제가 어려운 산림병해충으로, 일단 감염되면 치료가 되지 않고 거의 모든 소나무가 고사된다.Pine reeves ( Bursaphelenchus xylophilus caused by pine tree disease has caused serious damage to pine trees both domestically and abroad. Recently, it has been rapidly spreading with complicated patterns with changes in forest ecosystem environment due to climate change. It is known as a pine tree rehabilitation, and it is difficult to control the pine tree by complex interactions between host, pathogen, and environment. It is dead.

이러한 소나무재선충병 방제를 위하여 여러 가지 방법이 제시되고 있으나, 예방 방법으로는 수간주입에 의한 방제 방법이 거의 유일한 방법이다. 하지만 수간주입의 경우 현재 많이 사용하고 있는 아바멕틴과 에마멕틴벤조에이트는 약효 지속기간이 2년으로 짧고, 주입 시기도 제한적이며, 일본의 그린가드는 고가로 범용 적용에 한계가 있다. 수간주입의 경우 약제 가격의 문제뿐만 아니라 광범위 지역을 예방하는데 문제가 있고 높은 산악지대에 있는 소나무림의 경우 접근성이 어려워 효과적인 방법이 되지 못한다. 게다가 Kuroda와 Kenmochi(2016, Pine Wilt Disease Conference - IUFRO)는 소나무재선충병을 방제하기 위한 살선충제의 반복적인 수간주입이 오히려 감염되지 않은 소나무를 죽이는 원인을 제공한다고 경고하였다.Various methods have been proposed for the control of pine tree disease. However, as a preventive method, the method of controlling by infusion is almost the only method. However, abamectin and emamectin benzoate, which are widely used in the case of intravenous injection, have a short duration of drug efficacy of 2 years and have a limited time of injection, and the Japanese green guard is expensive and has a general application limitation. Injection does not only result in a problem of drug price but also prevention of a wide area and pine forest in a high mountain region is not effective because it is difficult to access. In addition, Kuroda and Kenmochi (2016, Pine Wilt Disease Conference - IUFRO) warned that repeated injections of a live nematode to control pine wilt disease cause the killing of uninfected pine trees.

이에 따라 토양관주 등을 통한 광범위 지역을 효과적으로 방제할 수 있는 약제의 개발이 시급한 실정이다. 소나무의 경우 Kosaka 등(2001, XXI IUFRO World Congress)과 Takeuchi 등(2006, Nematology, 8:435-442)은 비병원성 선충을 소나무에 접종한 후에 재선충을 접종하면, 발병이 늦어지는 유도저항성 현상을 발견하였다. 이러한 결과는 소나무에 저항성을 유도할 경우 소나무재선충병을 어느 정도 예방할 수 있음을 시사하였다. 최근 Hirao 등(2012 : BMC Plant Biology 12: 13)에 의하면 소나무재선충에 대한 감수성 품종과 저항성 품종의 발현 유전자 비교를 통해서 PR-9, PR-10 및 세포벽 관련 유전자(e.g. for hydroxyproline-rich glycoprotein precursor and extensin) 등이 저항성 품종에서 매우 상향조절되는 것을 확인하였고, 소나무의 경우에도 일반 작물에서와 같은 저항성 기작을 가지고 있음을 제시하였다. 또한 Chinnasri 등(2006, Journal of Nematology 38:319-325)은 파인애플에 발생하는 선충병을 BABA나 아시벤졸라-S-메틸(acibenzolar-S-methyl)과 같은 저항성 유도물질을 처리할 경우 예방할 수 있음을 보고하였다.Therefore, it is urgently necessary to develop a medicament that can effectively control a wide area through the use of soil cultivation. In the case of pine trees, Kosaka et al. (2001, XXI IUFRO World Congress) and Takeuchi et al. (2006, Nematology, 8: 435-442) found that inoculating nematodes after inoculation with pine trees resulted in inductive resistance Respectively. These results suggest that the resistance to pine trees can be prevented to some extent. Recently, Hirao et al. (2012: BMC Plant Biology 12: 13) reported that PR-9, PR-10 and cell wall related genes (eg, hydroxyproline-rich glycoprotein precursor extensin, etc. were highly upregulated in the resistant cultivars. Also, the pine trees showed the same resistance mechanism as the common crops. Chinnasri et al. (2006, Journal of Nematology 38: 319-325) have shown that nematodes occurring in pineapples can be prevented by treatment with resistance inducers such as BABA or acibenzolar-S-methyl .

따라서 이미 유도저항성을 일으키는 것으로 알려진 다양한 물질의 발굴을 통하여, 소나무재선충병을 효과적으로 방제할 수 있는 친환경 약제 개발이 가능하며, 이 제품의 경우 토양관주를 통한 광범위 지역 살포가 가능함으로서 소나무재선충병의 확산을 방제하는데 낮은 비용으로 효과적으로 할 수 있을 것이라 판단된다.Therefore, it is possible to develop eco-friendly medicines that can effectively control pine wilt disease through the discovery of a variety of substances already known to cause induction resistance. In this product, it is possible to spread in a wide area through a soil route, It can be said that it can be effectively used at low cost.

한편, 한국공개특허 제2017-0039626호에는 살리실산(salicylic acid)이 살진균 및 항진균 기능의 곰팡이 방지 조성물로서 기술하고 있으며, 한국공개특허 제2007-0059325호에는 메틸살리실레이트를 살균제 조성물로서 기술하고 있다. 그러나, 본 발명에서와 같이, '메틸살리실레이트 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물 및 이를 이용한 소나무재선충 방제 방법'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.In Korean Patent Laid-Open Publication No. 2017-0039626, salicylic acid is described as a fungicidal and antifungal fungicidal composition. In Korean Patent Publication No. 2007-0059325, methyl salicylate is described as a fungicidal composition have. However, as in the present invention, a composition for controlling pine wilt disease containing methyl salicylate or a derivative thereof as an active ingredient and a method for controlling pine tree reeducing using the same is not disclosed at all.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 유도저항성을 일으키는 것으로 알려진 다양한 물질의 발굴을 통하여, 기주에 유도저항성을 유도하여 소나무재선충병을 효과적으로 방제할 수 있는 약제를 선별하기 위하여 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 메틸살리실레이트가 소나무재선충병에 저항성을 유도하는 활성 물질임을 밝혀내고 상기 물질이 실제로 소나무에 유도저항성 활성을 나타냄을 여러가지 방법으로 확인하였다. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-described needs, and it is an object of the present invention to provide a method for selecting an agent capable of efficiently inducing resistance to pine tree disease Continuous research was conducted. As a result, it was found that methyl salicylate is an active substance inducing resistance to pine wilt disease, and it was confirmed by various methods that the substance actually exhibited induction resistance activity to pine trees.

특히, 본 발명의 메틸살리실레이트를 수간주입, 엽면살포 및 토양관주의 세가지 처리방법에 의해 소나무재선충병 방제효과를 조사한 결과, 수간주입보다 엽면살포 처리방법이 소나무재선충병 방제율이 현저히 높은 것을 확인하였다. In particular, the effect of the present invention on the control of pine reeves disease by three methods of injection of methyl salicylate, spraying on the leaf surface, and soaking of the soil was found to be remarkably higher than that of spraying on the leaves, Respectively.

상기와 같은 사실은 유도저항성 소재를 이용하여 기존 약제보다 훨씬 저렴한 경비로 소나무재선충병을 예방할 수 있을 뿐만 아니라, 소나무재선충병의 예방제제 처리 방법을 수간주입에서 다른 방식으로 선택의 폭을 넓혀 소나무재선충병의 예방약제 살포 적용범위를 넓힐 수 있어, 보다 효과적인 방제방법이 될 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.As a result of the above-mentioned facts, it is possible to prevent the pine reeves disease at a much lower expense than the conventional medicines by using the induction-resistant material, The present invention has been completed by ascertaining that it is possible to broaden the application range of the preventive medicine application of the disease and become a more effective control method.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 메틸살리실레이트(methyl salicylate), 이의 유도체 또는 이들의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물을 제공한다.In order to solve the above-described problems, the present invention provides a composition for controlling pine tree disease, comprising methyl salicylate, a derivative thereof, or a pesticidally acceptable salt thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 소나무재선충병 방제용 조성물을 소나무, 소나무 종자 또는 식재지에 처리하는 단계를 포함하는 소나무재선충병 방제 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for controlling pine wilt disease comprising the step of treating the pine tree reversion disease prevention composition with pine tree, pine seed or plant material.

또한, 본 발명은 상기 소나무재선충병 방제용 조성물을 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 재배지에 처리하는 것을 특징으로 하는 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preventing or treating a pine wilt disease characterized by treating the pine wilt disease control composition with a pine wood, a fir, a spruce or a gentian planting area.

또한, 본 발명은 메틸살리실레이트(methyl salicylate), 이의 유도체 또는 이들의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제를 위한 엽면살포 처리용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for leaf area spraying treatment for controlling pine wilt disease comprising methyl salicylate, a derivative thereof, or an agrochemically acceptable salt thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 메틸살리실레이트(methyl salicylate), 이의 유도체 또는 이들의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병에 대한 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하기 위한 조성물을 제공한다.The present invention also relates to a composition for inducing induced systemic resistance to pine tree worms containing methyl salicylate, a derivative thereof or an agrochemically acceptable salt thereof as an active ingredient to provide.

본 발명에 따르면, 메틸살리실레이트는 유도저항성으로 소나무재선충병에 대해 방제활성을 보였다. 유도저항성은 일반적으로 적은 양으로 효과가 있고 식물체에 유전자를 발현시키는 기작으로 약효를 보이므로 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않는다. 이것은 소나무재선충병에 대해 친환경 약제 개발이 가능하며, 기존의 소나무재선충병을 방제하기 위하여 사용되고 있는 살선충제제의 수간주입 방법보다 유도저항성 제제의 토양관주 또는 엽면살포의 방법으로 보다 저렴한 비용으로 효과적으로 방제할 수 있다.According to the present invention, the methyl salicylate has an inducing resistance and has a controlling activity against the pine wilt disease. Induced resistance is generally effective in small amounts, and it is harmless to the human body and does not cause environmental pollution because it shows the effect of gene expression in plants. It is possible to develop eco-friendly medicines for pine wilt disease, and it is more effective than the intravenous injection method of the nematocide preparation used for controlling the existing pine wilt disease by the method of spraying the inoculum can do.

도 1은 소나무 적송(Pinus densiflora) 2년생 유묘에 대한 메틸살리실레이트의 수간주입 20,000 ㎍/㎖(a), 수간주입 200 ㎍/㎖(b), 토양관주(c), 엽면살포(d), 무처리구(e), 무접종구(f)의 소나무재선충병 방제 시험 결과를 나타낸다.
도 2는 유도저항성 소재 처리시 소나무 유묘의 잎에서 유도저항성 관련 유전자 발현양상을 확인하기 위하여 증폭한 유도저항성 관련 유전자의 PCR 결과를 나타낸다.
도 3는 소나무 적송 2년생 유묘에 대한 살리실레이트 20%, SL(Soluble Concentrate, 액제)와 메틸살리실레이트 20%, EC(Emulsifiable Concentrate, 유제)의 처리방법에 따른 소나무재선충병 방제 활성을 결과를 나타낸 것으로 살리실레이트 엽면살포(a), 살리실레이트 토양관주(b), 메틸살리실레이트 엽면살포(c), 메틸살리실레이트 토양관주(d), 무처리구(e), 무접종구(f)의 소나무재선충병 방제 시험 결과를 나타낸다.
도 4는 10년생 소나무(적송)에서 메틸살리실레이트 제제를 엽면분무 처리하였을 때 방제효과를 나타낸 것으로, 접종 3달 후 메틸살리실레이트 제제 엽면 분무 처리구(A)와 무처리구(B) 방제시험 결과를 나타낸다.1 is a pine red pine (Pinus densiflora) 2 Born methyl Trunk infusion of salicylate on seedling 20,000 ㎍ / ㎖ (a), Trunk infusion 200 ㎍ / ㎖ (b), soil drench (c), foliar spray (d), untreated (e), no The results of the test for the control of pine wilt disease in the inoculation zone (f) are shown.
FIG. 2 shows PCR results of inducible resistance-related genes amplified in order to confirm induction resistance-related gene expression patterns in leaves of pine seedlings treated with inducible resistance material.
Fig. 3 shows the results of the treatment of pine tree wilt disease according to the treatment method of salicylate 20%, SL (Soluble Concentrate, liquid), methyl salicylate 20% and EC (Emulsifiable Concentrate) (C), methyl salicylate soil strain (d), untreated soil (e), uninoculated soil (b), and salicylate soil (a) f) shows the test results of the pine wilt disease control test.
FIG. 4 shows the effect of controlling the methyl salicylate formulation on 10-year-old pine trees (leaves) after 3 months of inoculation with the methyl salicylate formulation (A) and control (B) .

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메틸살리실레이트(methyl salicylate), 이의 유도체 또는 이들의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물을 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a composition for controlling pine wilt disease comprising methyl salicylate, a derivative thereof, or a pesticidally acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명에서는 소나무재선충병의 병방제 기작을 구명하는 연구를 진행하는 중에 특정 유도저항성 물질이 기존에 연구되지 않았던 소나무재선충병의 기주인 소나무류에 저항성을 유도하는데 매우 중요한 역할을 하며, 이를 활용하여 소나무재선충병을 방제할 수 있다는 사실을 발견하였다.In the present invention, a specific induction-resistant substance plays a very important role in inducing resistance to a pine tree that is a host of pine tree worm disease, which has not been studied in the past, in the course of research on the disease control mechanism of pine tree worm disease. And found that pine wilt disease can be controlled.

본 발명에서 유도저항성 소재 중 메틸살리실레이트는 소나무재선충병의 기주식물에 저항성을 유도하여 소나무재선충병 방제 효과를 보였으며 기존의 에마멕틴 벤조에이트 등의 아버멕틴 계열의 물질들이 전혀 활성을 보이지 않는 처리방법인 토양관주 및 엽면살포 처리 시에도 방제활성을 보였다. 이러한 사실은 세계 최초로 발견한 사실로서, 유도저항성 소재를 이용하여 기존 약제보다 훨씬 저렴한 경비로 소나무재선충병을 예방할 수 있을 뿐만 아니라, 소나무재선충병의 예방제제 처리 방법을 수간주입에서 다른 방식으로 선택의 폭을 넓혀 소나무재선충병의 예방약제 살포 적용범위를 넓힐 수 있기에 효과적으로 방제할 수 있는 처리방법을 제공한다.In the present invention, the methyl salicylate in the induction-resistant material induces resistance to the host plants of the pine wilt disease disease, thus showing the effect of controlling the pine wilt disease, and the avermectin-based substances such as the existing emamectin benzoate are not active at all The control activity was also shown in the control of soil and leaf area. This fact has been discovered for the first time in the world. In addition, it is possible to prevent pine wilt disease at a much lower expense than induction-resistant drugs by using induction-resistant materials, It is possible to broaden the application range of the preventive medicine spraying of the pine nutcracker, thereby providing a treatment method that can effectively be controlled.

본 발명의 상기 소나무재선충병 방제용 조성물은 소나무재선충병의 기주식물에서 살리실산(salicylic acid)를 축적하여 저항성을 유도하게 하는 유도저항성 소재일 수 있다.The composition of the present invention for controlling pine reattachment disease may be an induction-resistant material that induces resistance by accumulating salicylic acid in a host plant of a pine wilt disease bottle.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 메틸살리실레이트의 유도체는 에틸 살리실레이트, 이소프로필 살리실레이트, 부틸 살리실레이트 또는 이소부틸 살리실레이트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the composition according to an embodiment of the present invention, the derivative of the methyl salicylate may be ethyl salicylate, isopropyl salicylate, butyl salicylate or isobutyl salicylate, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 소나무재선충병 방제용 조성물에 있어서, 메틸살리실레이트 또는 이의 유도체의 농약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성, 또는 산성 아미노산과의 염 등이 포함될 수 있다. 적합한 금속염은, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염 등과 같은 알칼리 금속염; 칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등과 같은 알칼리 토금속염; 알루미늄염 등이 포함될 수 있다. 유기 염기와의 염은, 예를 들어, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 포함될 수 있다. 무기산과의 염은, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 포함될 수 있다. 유기산과의 염은, 예를 들어, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 포함될 수 있다. 염기성 아미노산과의 염은, 예를 들어, 알기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 포함될 수 있다. 산성 아미노산과의 염은, 예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 포함될 수 있다.In the composition for controlling pine wilt disease according to one embodiment of the present invention, the pesticidally acceptable salt of methyl salicylate or a derivative thereof is, for example, a metal salt, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, Salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like. Suitable metal salts include, for example, alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts and the like; Alkaline earth metal salts such as calcium salts, magnesium salts, barium salts and the like; Aluminum salts and the like. Salts with organic bases include, for example, salts with organic bases such as trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N , N-dibenzylethylenediamine, and the like. Salts with inorganic acids may include, for example, salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like. Salts with organic acids may include salts with formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p- toluenesulfonic acid and the like . Salts with basic amino acids may include salts with, for example, arginine, lysine, ornithine, and the like. Salts with acidic amino acids may include salts with, for example, aspartic acid, glutamic acid and the like.

본 발명의 일 구현 예에 따른 소나무재선충병 방제용 조성물은 농약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 부형제는 농업 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 것으로, 예를 들면, 규조토, 소석회 등의 산화물, 인회석 등의 인산염, 석고 등의 황산염, 클레이, 카올린, 벤토나이트, 산성백토, 석영, 실리카 등의 광물질 분말 등의 고체 담체와 충진제, 항응집제, 계면활성제, 유화제, 방부제 등을 추가하여 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 식물에 처리하여 활성성분이 신속방출, 서방출, 지연된 방출할 수 있도록 당업계에서 공지된 방법을 사용하여 제형화할 수 있다. 제형화를 위해서는 통상적으로 사용하는 계면활성제, 희석제, 분산제, 보조제 등의 첨가제를 활성성분과 배합하여 수화제, 현탁제, 유제, 유탁제, 미탁제, 액제, 분산성 액제, 입상수화제, 입제, 분제, 액상수화제, 수면부상성입제, 정제 등 각종 형태로 제제화하여 사용할 수 있다.The composition for controlling pine wilt disease according to one embodiment of the present invention may further comprise a pesticide acceptable carrier and / or excipient. The excipients included in the composition of the present invention are those conventionally used in the agricultural field and include, for example, oxides such as diatomaceous earth and slaked lime, phosphates such as apatite, sulfates such as gypsum, clay, kaolin, bentonite, Silica and the like, a filler, an anti-coagulant, a surfactant, an emulsifier, a preservative, and the like. In addition, the compositions of the present invention can be formulated into plants using methods known in the art to allow rapid release, sustained release, and delayed release of the active ingredient. For the formulation, additives such as surfactants, diluents, dispersants, and adjuvants commonly used may be blended with the active ingredient to prepare a wetting agent, a suspension, an emulsion, a emulsion, a mist, a liquid, a dispersing liquid, a granular wetting agent, A liquid wettable powder, a water-swellable granule, a tablet, and the like.

본 발명에 따른 소나무재선충병 방제용 조성물은 예를 들어 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 소나무재선충병 방제용 조성물은 분사, 분무, 살포, 흩뿌림 또는 붓기에 의해 사용될 수 있다. 사용 형태는 의도한 목적에 의존하는데, 모든 경우에 본 발명에 따른 조성물의 분포가 가능한 한 미세하고 균일하도록 해야 한다.The composition for controlling pine vetch disease according to the present invention may be in the form of, for example, directly sprayable solutions, powders and suspensions, or in the form of highly concentrated aqueous, oily or other suspensions, dispersions, emulsions, oily dispersions, pastes, dusts, But is not limited thereto. In addition, the composition for controlling pine vetch can be used by spraying, spraying, spraying, scattering or swelling. The mode of use depends on the intended purpose, and in all cases the distribution of the composition according to the invention should be as fine and uniform as possible.

본 발명의 소나무재선충병 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로서 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The composition for controlling pine wilt disease of the present invention can be formulated into various forms. The preparation may be prepared, for example, by adding a solvent and / or a carrier. Often, inert additives and surface-active materials, such as emulsifiers or dispersants, are mixed into the formulation. Suitable surface-active materials include, but are not limited to, aromatic sulfonic acids (e.g., lignosulfonic acid, phenol-sulfonic acid, naphthalene- and dibutylnaphthalenesulfonic acid), fatty acids, alkyl- and alkylarylsulfonates, alkyl lauryl ethers, A salt of a fatty alcohol glycol ether, a sulfonate naphthalene and derivatives thereof, a condensate of formaldehyde, a condensate of naphthalene or naphthalene sulfonic acid, a phenol and a formaldehyde Condensates, polyoxyethylene octylphenol ethers, ethoxylated isooctyl-, octyl- or nonylphenol, alkylphenyl or tributylphenyl polyglycol ethers, alkylaryl polyether alcohols, isotridecyl alcohol, fatty alcohol / ethylene oxide condensates , Ethoxylated castor oil, polyoxyethylene alkyl ether or polyoxypropylene, lauryl alcohol Polyglycol ether acetate, sorbitol esters, lignin-sulfite waste liquid, or may be a cellulose, are not limited.

적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.Suitable solid carrier materials are in principle all porous and comprise an agriculturally acceptable carrier such as mineral earths such as silica, silica gel, silicate, talc, kaolin, limestone, limestone, chalk, Fertilizers such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, urea, vegetable products such as cereal flour, bark powder, wood meal, And nut shell powder), or cellulose powder. The solid carrier may be used alone or in combination of two or more.

본 발명의 소나무재선충병 방제용 조성물은 식물체 흡수 및 효과를 증진시키기 위하여 확산제 및 침투제, 또는 계면활성제와도 혼용이 가능하다.The composition for controlling pine tree disease of the present invention can be mixed with a diffusing agent, a penetrating agent, or a surfactant to enhance plant absorption and effect.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 소나무는 해송 또는 적송일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the composition according to one embodiment of the present invention, the pine may be, but is not limited to, pine or grass.

또한, 본 발명은 상기 소나무재선충병 방제용 조성물을 소나무, 소나무 종자 또는 식재지에 처리하는 단계를 포함하는 소나무재선충병 방제 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for controlling pine wilt disease comprising the step of treating the pine tree reversion disease prevention composition with pine tree, pine seed or plant material.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 메틸살리실레이트(methyl salicylate)의 처리는 소나무의 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to one embodiment of the present invention, treatment of the methyl salicylate may be to induce induced systemic resistance of the pine, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 소나무는 해송 또는 적송일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to one embodiment of the present invention, the pine may be, but is not limited to, paddy or harvest.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 메틸살리실레이트의 처리는 수간주입 처리, 토양관주 처리 또는 엽면살포 처리일 수 있고, 바람직하게는 엽면살포 처리일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to an embodiment of the present invention, the treatment of the methyl salicylate may be an intravenous infusion treatment, a soil-care treatment or a leaf-surface spraying treatment, preferably, but not exclusively, a leaf-surface spraying treatment.

또한, 본 발명은 소나무재선충병 방제용 조성물을 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 재배지에 처리하는 것을 특징으로 하는 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 소나무재선충병 방제가 필요한 수목이면 제한되지 않으며, 예를 들면, 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 재배지에 본 발명의 조성물을 처리할 수 있다. 처리방법은 바람직하게는 엽면 살포 처리일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the present invention provides a method for preventing or treating a pine wilt disease characterized by treating a composition for controlling pine wilt disease to a pine wood, a fir, a spruce or a germany plantation. The method of the present invention is not limited as long as it is a tree requiring pine tree disease prevention. For example, the composition of the present invention can be applied to a pine tree, a fir tree, a spruce tree or a hawthorn plantation. The treatment method is preferably, but not limited to, a foliar spray treatment.

또한, 본 발명은 메틸살리실레이트(methyl salicylate), 이의 유도체 또는 이들의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제를 위한 엽면살포 처리용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for leaf area spraying treatment for controlling pine wilt disease comprising methyl salicylate, a derivative thereof, or an agrochemically acceptable salt thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 메틸살리실레이트(methyl salicylate), 이의 유도체 또는 이들의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병에 대한 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하기 위한 조성물을 제공한다.The present invention also relates to a composition for inducing induced systemic resistance to pine tree worms containing methyl salicylate, a derivative thereof or an agrochemically acceptable salt thereof as an active ingredient to provide.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시예 1. 소나무재선충병 방제를 위한 유도저항성 물질 선발Example 1. Selection of inducible resistance material for controlling pine tree disease

식물체에 저항성을 유도한다고 알려진 유도저항성 물질들 중 살리실레이트(살리실산, Salicylic acid: SA)과 메틸살리실레이트(메틸살리실산, methyl salicylic acid: MeSA) 2종의 물질에 대해 소나무재선충병에 대한 방제 효과를 조사하였다. 소나무 적송(Pinus densiflora)을 이용한 인 비보 테스트에서의 소나무재선충병에 대한 방제효과실험은 2년생 소나무 유묘(직경 5.5 mm 내외, 신장 약 35 cm)를 이용하여 수행하였다.Among the induction-resistant substances known to induce resistance to plants, Salicylic acid (SA) and methyl salicylic acid (MeSA) The effect was investigated. The control effect of Pinus densiflora on the pine wilt disease was investigated using 2 - year - old pine seedlings (about 5.5 mm in diameter and about 35 cm in height).

약제주입은 수간주입 방법으로 두께 1.5 mm의 드릴로 소나무의 지제부로부터 5 내지 10 cm 줄기 부위에 각도 45°로 구멍을 뚫고 구멍에 200 ㎕의 팁을 꽂아 그 안에 후보물질을 200과 20 그리고 2 ㎍/㎖ 수준으로 각각의 용매에 용해한 다음 소나무당 100 ㎕씩 주입하였다. 약제 주입 후 팁의 뒷부분은 파라필름으로 막아주고 공기가 통하도록 작은 구멍을 내주었다.Drug injections were performed by a drill with a thickness of 1.5 mm through a drill with a thickness of 5 to 10 cm from the edge of a pine tree at an angle of 45 ° and inserted into a hole with 200 μl of a tip to which 200, / Ml, and then injected with 100 μl per pine. After injection, the tip of the tip was covered with parafilm and a small hole was made to allow air to pass through.

소나무재선충은 감자 덱스트로스 한천배지(Potato dextrose agar, PDA)에서 자란 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)를 먹이로 일주일 동안 25℃에서 키운 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus, 국립산림과학원)을 Baermann funnel method를 통해 수확한 후 광학 현미경하에서 수를 조사하여 20,000 마리/㎖ 수준으로 만들었다. 소나무재선충 접종은 약제 처리 1주일 후에 수피박피접종법을 이용하여 나무당 100 ㎕씩 2,000마리 접종하였고 접종 30일 후 결과를 관찰하였다. 그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 200, 20, 및 2 ㎍/㎖의 모든 농도에서 가장 활성이 좋았던 MeSA는 매우 우수한 방제활성을 보여 이 물질을 선발하였다.The pine rehabilitation was carried out by the Baermann funnel method ( Bursaphelenchus xylophilus, National Forestry Academy), which was fed with Botrytis cinerea grown on a potato dextrose agar (PDA) for one week at 25 ℃ After harvesting, we examined the number under an optical microscope 20,000 grains / ml. After 1 week of treatment, 2,000 pine shoots were inoculated with 100 .mu.l per tree using the bark peeling method and the results were observed 30 days after inoculation. As a result, as shown in Table 1, MeSA having the highest activity at all concentrations of 200, 20, and 2 μg / ml showed excellent control activity, and this substance was selected.

유도저항성 물질 후보군의 소나무재선충병 발병도Pine wilt disease onset of inducible resistance substance candidate 물질matter 농도(㎍/㎖)Concentration (/ / ml) 200200 2020 22 SASA 0/30/3 1/31/3 2/32/3 MeSAMeSA 0/30/3 0/30/3 0/30/3 무처리구Non-treatment 3/3(2)3/3 (2) 무접종구Non-inoculation 0/30/3

a/b(c)* : (a)마름증상을 보이는 소나무 개체수, (b)실험에 사용된 소나무 개체수, (c)마름증상을 보이는 소나무 개체수(a) 중 오직 줄기의 생장점 부분만 마름증상을 보이는 소나무 개체수(b) the number of pine trees used in the experiment, (c) the number of pine trees showing a symptom of dryness (a) Visible pine populations

실시예 2. 메틸살리실레이트와 살리실레이트에 의한 인 비트로(Example 2. In vitro < RTI ID = 0.0 > (< / RTI > in vitroin vitro ) 살선충 검정) Nematode test

메틸살리실레이트와 살리실레이트의 살선충 활성여부를 조사하였다. 살선충 활성 실험을 위해 소나무재선충 현탁액을 96-웰 마이크로플레이트의 한 웰당 50 마리/99 ㎕ 수준으로 희석하여 처리했다. 메틸살리실레이트와 살리실레이트는 메탄올 용매에 처리농도의 100배의 스톡 용액을 만들어 1 ㎕씩 넣어 1000, 333, 111 ㎍/㎖이 되게 처리하였다. 각각의 처리구는 3반복 수행하였고 대조구로는 화학농약인 에이팜(에마멕틴 벤조에이트(Emamection benzoate) 2.15%)을 사용하였다. 처리 후 96-웰 마이크로플레이트는 플라스틱 상자에 물을 적신 와이프 올을 바닥에 깔아 습도 100%를 유지시키고 상자위에 검은 천을 덮어 빛을 차단한 암실 상태에서 보관하여 3일 후 관찰하였다. 그 결과, 표 2와 같이 메틸살리실레이트와 살리실레이트는 실험시료에 유도저항 활성을 보이는 농도에서 살선충 활성이 없는 것으로 나타났다.The salivary activity of methyl salicylate and salicylate was investigated. For the nematode activity experiments, the pine reweed suspension was diluted to a level of 50 beads / 99 mu l per well of a 96-well microplate. Methyl salicylate and salicylate were prepared in a methanol solvent at a concentration of 100 times as much as the treatment concentration, and then treated with 1 μl of each stock solution at 1000, 333 and 111 μg / ml. Each treatment was repeated three times and emamectin benzoate (2.15%), a chemical pesticide, was used as a control. After the treatment, the 96-well microplate was kept in a dark room in which the plastic box was wetted with water to keep the humidity at 100% and the box was covered with a black cloth. As a result, as shown in Table 2, methyl salicylate and salicylate showed no nematode activity at concentrations showing inductive resistance activity in the test sample.

메틸살리실레이트의 소나무재선충 살선충 활성Effect of Methyl Salicylate on Pine Nematode Activity 물질matter 농도(㎍/㎖)Concentration (/ / ml) 살선충률(%)Lycopene (%) 살리실레이트Salicylate 10001000 100100 333333 9494 111111 1111 메틸살리실레이트Methyl salicylate 10001000 3.533.53 333333 1.891.89 111111 0.760.76 에마멕틴 벤조에이트Emamectin benzoate 1One 100100 0.330.33 100100 0.110.11 98.7798.77 무처리구Non-treatment 메탄올 1%Methanol 1% 0.740.74 무처리구Non-treatment 물 1%Water 1% 2.152.15

실시예 3. 온실에서 메틸살리실레이트와 살리실레이트의 처리 방법에 따른 인 비보(Example 3 In vivo treatment according to the method of treating methyl salicylate and salicylate in a greenhouse in vivoin vivo ) 소나무재선충병 방제효과) Effect of pine tree disease control

메틸살리실레이트와 살리실레이트에 대하여 수간주입, 엽면살포, 토양관주의 세 가지 다른 처리방법에 대한 방제효과를 조사하였다. 소나무는 실시예 1과 같이 적송 2년생 유묘(직경 5.5 mm 내외, 신장이 약 35 cm)를 이용하여 수행하였다.The effects of methyl salicylate and salicylate on three different treatments were investigated. The pine trees were carried out using a second-year-old seedlings (diameter of 5.5 mm, height of about 35 cm) as in Example 1.

수간주입은 두께 1.5 mm의 드릴로 소나무의 지제부로부터 5 내지 10 cm 줄기 부위에 각도 45°로 구멍을 뚫고 구멍에 200 ㎕의 팁을 꽂아 그 안에 메틸살리실레이트 또는 살리실레이트를 메탄올 10%를 포함한 수용액에 0.2와 20 mg/㎖ 수준으로 용해한 다음 소나무당 100 ㎕씩 주입하였다. 처리 후 팁의 뒷부분은 파라필름으로 막아주고 공기가 통하도록 작은 구멍을 내주었다. 엽면살포는 약제가 잎에 잘 흡착될 수 있도록 250 ㎍/㎖의 Tween 20을 소나무당 5 ㎖씩 충분히 전처리 한 후 2시간 말려주었다. 그 후 메틸살리실레이트 또는 살리실레이트를 메탄올 10%와 250 ㎍/㎖의 Tween 20을 포함한 수용액에 1.6 mg/㎖ 수준으로 용해한 다음 미세분사기에 넣어 소나무당 5 ㎖씩 엽면살포하였다. 토양관주는 메틸살리실레이트 또는 살리실레이트를 메탄올 10%와 250 ㎍/㎖의 Tween 20을 포함한 수용액에 0.2 mg/㎖ 수준으로 용해한 다음 소나무가 심어진 포트에 소나무당 40 ㎖씩 토양관주하였다.The drill was pierced with a drill with a thickness of 1.5 mm at an angle of 45 ° to the stem of 5 to 10 cm from the pit of the pine tree, and 200 μl of the tip was inserted into the hole. 10% of methyl salicylate or salicylate was added thereto And then injected with 100 μl per pine tree at a concentration of 0.2 and 20 mg / ml. After the treatment, the tip of the tip was covered with parafilm and a small hole was made to allow air to pass through. Twenty (20 ㎍ / ㎖) Tween 20 was thoroughly pretreated for 5 ㎖ per pine tree and allowed to dry for 2 hours. Thereafter, methyl salicylate or salicylate was dissolved in an aqueous solution containing 10% methanol and 250 μg / ml Tween 20 at a level of 1.6 mg / ml, and then sprayed in a microinjector with 5 ml per pine. Soils were cultivated in an aqueous solution containing 10% methanol and Tween 20 at a concentration of 0.2 mg / ml in methyl salicylate or salicylate, and then cultivated in a pot with 40 ml per pine.

소나무재선충 접종은 약제처리 1주일 후 실시예 1과 같은 방법으로 접종하였고, 80일 동안 관찰하였다. 또한, 실험 종료 후 소나무의 줄기 부분을 잘게 잘라 드라이오븐에 일주일 간 말려 수분함량을 측정하였다.After 1 week of treatment with pine tree, the inoculum was inoculated in the same manner as in Example 1 and observed for 80 days. After the end of the experiment, the stem portion of the pine tree was finely cut and the moisture content was measured by drying for one week in a dry oven.

그 결과, 표 3과 같이 전체적으로 살리실레이트의 활성은 메틸살리실레이트보다 낮게 나타났다. 메틸살리실레이트는 수간주입에서는 20,000 ㎍/㎖과 200 ㎍/㎖에서 각각 72%와 80%의 방제가를 보였다. 수간주입의 경우 200 ㎍/㎖과 20,000 ㎍/㎖ 사이에 방제가에서 차이가 거의 보이지 않았다. 이 결과와 동시에 유충에 대한 살선충활성이 없다는 것은 메틸살리실레이트가 유도저항성의 기작에 의해 소나무재선충병에 효과가 있으며, 또한 농도에 의해 효과가 크게 변화하지 않는다는 사실을 나타낸다. 이에 반하여 살리실레이트의 경우 수간주입의 경우 낮은 농도에서는 75%의 높은 효과를 보인 반면에 높은 농도에서는 매우 낮은 방제가를 보임으로서 효과를 보이는 농도 범위가 메틸살리실레이트에 비하여 매우 좁다는 사실을 알 수 있었다.As a result, as shown in Table 3, the activity of salicylate as a whole was lower than that of methyl salicylate. Methyl salicylate showed 72% and 80% inhibition at 20, 000 ㎍ / ㎖ and 200 ㎍ / ㎖, respectively. In the case of intravenous infusion, there was almost no difference in the control between 200 ㎍ / ㎖ and 20,000 ㎍ / ㎖. As a result, the absence of nematode activity against larvae indicates that methyl salicylate is effective for pine wilt disease due to the mechanism of induction resistance, and that the effect does not vary greatly depending on the concentration. In contrast, salicylate showed a 75% higher efficacy at low concentrations, while a very low level of efficacy at higher concentrations indicated that the concentration range for salicylate was much narrower than that of methyl salicylate Could know.

처리방법에 따른 메틸살리실레이트와 살리실레이트의 소나무재선충병에 대한 방제효과Control Effect of Methyl Salicylate and Salicylate on Pine Wilt 물질matter 처리방법Processing method 농도(㎍/㎖)Concentration (/ / ml) 발병률(%)Incidence (%) 방제가(%)Control (%) 살리실레이트Salicylate 수간주입Intravenous infusion 20,00020,000 5858 1818 200200 1818 7575 엽면살포Foliar application 1,6001,600 4646 3535 토양관주Soils 200200 3838 4646 메틸
살리실레이트methyl
Salicylate 수간주입Intravenous infusion 20,00020,000 2020 7272 200200 1414 8080 엽면살포Foliar application 1,6001,600 88 8989 토양관주Soils 200200 1414 8080 에마멕틴
벤조에이트Emamectin
Benzoate 수간주입Intravenous infusion 20,00020,000 00 100100 200200 6666 77 엽면살포Foliar application 1,6001,600 7070 1One 토양관주Soils 200200 6464 1010 무처리구Non-treatment -- -- 7171 00 무접종구Non-inoculation -- -- 00 --

한편, 세 가지 처리방법 중 메틸살리실레이트는 엽면살포하였을 때 가장 우수한 방제효과(89%)를 보였다. 하지만 수간주입과 토양관주와 방제효과에서 큰 차리를 보이지 않기 때문에, 메틸살리실레이트는 어떠한 방법으로 처리하더라도 우수한 효과를 보임을 알 수 있었다. 한편, 대조약제로 사용한 살선충활성 약제인 에마멕틴벤조에이트의 경우 고농도의 수간주입에서만 강한 효과를 보인 반면에 낮은 농도의 수간주입과 엽면살포 및 토양관주 처리에서는 거의 효과를 나타내지 않았다. 도 1은 각 처리구의 소나무재선충병의 발병정도를 나타낸다.Among the three treatments, methyl salicylate showed the best control effect (89%) when sprayed on the leaves. However, it was found that methyl salicylate showed excellent effect regardless of the treatment method, because it showed no significant difference in water injection, soil condition and control effect. On the other hand, emamectin benzoate, a nematicide used as a control agent, showed a strong effect only at a high concentration of water injection, whereas it showed little effect at low concentration of water injection, leaf spraying and soil handling. Figure 1 shows the incidence of pine wilt disease in each treatment.

실시예 4. 메틸살리실레이트와 살리실레이트의 소나무 캘러스에서의 유도저항성 검정Example 4: Induction resistance test of methyl salicylate and salicylate in pine callus

유도저항성을 포함한 다양한 저항성 기작에서 식물방어관련 유전자인 PRs 유전자를 이용하였으며 하기 표 4와 도 2에서 나타낸 바와 같이 확보된 16개의 소나무 유도저항성 관련 유전자 후보군들과 1개의 레퍼런스 유전자(Elongation factor_1 alpha)를 선발하였다. In the various resistance mechanisms including induction resistance, the PRs gene, which is a plant defense gene, was used, and 16 pine induction resistance-related gene candidates and one reference gene (Elongation factor 1 alpha) secured as shown in Table 4 and FIG. Were selected.

유도저항성 관련 유전자Induction resistance related genes 유도저항성관련 유전자Induction resistance related genes Forward primer(서열번호)Forward primer (SEQ ID NO) Reverse primer(서열번호)Reverse primer (SEQ ID NO) SizeSize PR_1b familyPR_1b family 5'-TGCCCCTTCAGGTAAATCGT-3'(1)5'-TGCCCCTTCAGGTAAATCGT-3 '(1) 5'-GCGGGTCGTAGTTGCAGATAA-3'(2)5'-GCGGGTCGTAGTTGCAGATAA-3 '(2) 125125 PR_2_family
(beta-1,3-glucanase)PR_2_family
(beta-1,3-glucanase) 5'-CGACAACATTCGCCCCTTCT-3'(3)5'-CGACAACATTCGCCCCTTCT-3 '(3) 5'-CTGCAGCGCGGTTTGAATAT-3'(4)5'-CTGCAGCGCGGTTTGAATAT-3 '(4) 130130 PR_3_family
(class I chitinase)PR_3_family
(class I chitinase) 5'-ACCTACAGCGCTTCATTGC-3'(5)5'-ACCTACAGCGCTTCATTGC-3 '(5) 5'-TGTGGTTTCATGCGACGTTT-3'(6)5'-TGTGGTTTCATGCGACGTTT-3 '(6) 120120 PR_3_family
(class 4 chitinase)PR_3_family
(class 4 chitinase) 5'-CCATCGAAGCCCAGGTAATTT-3'(7)5'-CCATCGAAGCCCAGGTAATTT-3 '(7) 5'-AGCCGGGAAGCAATATTATGGT-3'(8)5'-AGCCGGGAAGCAATATTATGGT-3 '(8) 9090 PR_4_familyPR_4_family 5'-CCCCGTTACTGTCAATTGCAT-3'(9)5'-CCCCGTTACTGTCAATTGCAT-3 '(9) 5'-AAAGCGTGACGGTGCGTATT-3'(10)5'-AAAGCGTGACGGTGCGTATT-3 '(10) 9090 PR_5_family
(thaumatin-like)PR_5_family
(thaumatin-like) 5'-GAACCAGTGCCCATACACAGTCT-3'(11)5'-GAACCAGTGCCCATACACAGTCT-3 '(11) 5'-CCTGCGGCAACGTTAAAAGTC-3'(12)5'-CCTGCGGCAACGTTAAAAGTC-3 '(12) 9696 PR_6_family
(proteinase inhibitor)PR_6_family
(proteinase inhibitor) 5'-TGCTGGCGGCATCTATTTTA-3'(13)5'-TGCTGGCGGCATCTATTTTA-3 '(13) 5'-TAACACCTGCGCAAATGCA-3'(14)5'-TAACACCTGCGCAAATGCA-3 '(14) 9090 PR_9_family
(peroxidase)PR_9_family
(peroxidase) 5'-ACACCACCGTGCTGGACATT-3'(15)5'-ACACCACCGTGCTGGACATT-3 '(15) 5'-GTGCGGGAGTCGGTGTAGAG-3'(16)5'-GTGCGGGAGTCGGTGTAGAG-3 '(16) 118118 PR_10_family
(ribonuclease-like)PR_10_family
(ribonuclease-like) 5'-TGTCTCAAGTGGAGGCAAGGA-3'(17)5'-TGTCTCAAGTGGAGGCAAGGA-3 '(17) 5'-AAGCGACAATTTCAGGCAAAAC-3'(18)5'-AAGCGACAATTTCAGGCAAAAC-3 '(18) 9090 Antimicrobial peptideAntimicrobial peptide 5'-GCGTTGCTCATACCCGTTTT-3'(19)5'-GCGTTGCTCATACCCGTTTT-3 '(19) 5'-GCAGCACTTAGCACTGGATGAA-3'(20)5'-GCAGCACTTAGCACTGGATGAA-3 '(20) 9090 Cytochrome_P450Cytochrome_P450 5'-AACATGTCCTGCAGCACGAA-3'(21)5'-AACATGTCCTGCAGCACGAA-3 '(21) 5'-GTGCACCGCAAGTAAACCAA-3'(22)5'-GTGCACCGCAAGTAAACCAA-3 '(22) 9595 ExtensinExtensin 5'-CGAATGTAATTCCGAAGTTGCA-3'(23)5'-CGAATGTAATTCCGAAGTTGCA-3 '(23) 5'-CCATCCCAAACCACCAGTCT-3'(24)5'-CCATCCCAAACCACCAGTCT-3 '(24) 110110 Heat shock protein 70Heat shock protein 70 5'-AACACCACCATTCCCACCAA-3'(25)5'-AACACCACATTCCCACCAA-3 '(25) 5'-CGAATTTGCCGAGCAGGTTA-3'(26)5'-CGAATTTGCCGAGCAGGTTA-3 '(26) 130130 Hydroxyproline-rich
glycoprotein precursorHydroxyproline-rich
가 glycoprotein precursor 5'-GAGAAACTGGCACCGTCTTAGGA-3‘(27)5'-GAGAAACTGGCACCGTCTTAGGA-3 '(27) 5'-ACCTCCCCCTCCATCTCACA-3'(28)5'-ACCTCCCCCTCCATCTCACA-3 '(28) 140140 Metallothionein_like_proteinMetallothionein_like_protein 5'-TCAGGCTGCTGCGTTATTTG-3'(29)5'-TCAGGCTGCTGCGTTATTTG-3 '(29) 5'-TGTCAGCGCAGTCACAATTTG-3'(30)5'-TGTCAGCGCAGTCACAATTTG-3 '(30) 120120 Xyloglucan_endotransglycosylaseXyloglucan_endotransglycosylase 5'-TCTGCGCCCCTACTTTTCC-3'(31)5'-TCTGCGCCCCTACTTTTCC-3 '(31) 5'-AGCTGGGCGATTGATCATGT-3'(32)5'-AGCTGGGCGATTGATCATGT-3 '(32) 121121 Elongation factor_1 alphaElongation factor_1 alpha 5'-GGGAAGCCACCCAAAGTTTT-3'(33)5'-GGGAAGCCACCCAAAGTTTT-3 '(33) 5'-TACATGGGAAGACGCCGAAT-3'(34)5'-TACATGGGAAGACGCCGAAT-3 '(34) 130130

메틸살리실레이트와 살리실레이트를 200 ㎍/㎖으로 처리하여, 표 4의 유도저항성 관련 유전자를 이용한 인 비트로 유도저항성 검정법으로 소나무 캘러스의 유도저항성 관련 유전자의 유전자 발현을 확인하였다. 인 비트로 유도저항성 검정은 100 mg 소나무 캘러스를 12-웰 마이크로플레이트 LM 액체 배지 500 ㎕와 함께 유도저항성 후보물질이 200 ㎍/㎖이 되도록 표면에 처리한 후, 암조건의 25℃ 진탕배양기에서 교반기의 50 rpm으로 캘러스 표면과 메틸살리실레이트를 24시간동안 충분히 반응시켰다. 반응이 완료된 캘러스에서 RNAs를 추출한 후, cDNA를 합성하였고, RT-PCR 또는 qRT-PCR을 통해 특이적으로 증가되는 유도저항성 유전자의 발현을 확인하였다.Mice salicylate and salicylate were treated with 200 μg / ml, and gene expression of the induction resistance related gene of pine callus was confirmed by the in vitro induction resistance test using the induction resistance related gene shown in Table 4. In vitro induction resistance test was performed by treating 100 mg of pine callus with 500 μl of 12-well microplate LM liquid medium to a surface of 200 μg / ml of inducible resistance candidate, and then, in a 25 ° C. shaking incubator under dark condition, The callus surface and methyl salicylate were reacted sufficiently at 50 rpm for 24 hours. RNAs were extracted from the calli after the reaction was completed, cDNA was synthesized, and RT-PCR or qRT-PCR was performed to confirm the expression of the specifically induced inducible resistance gene.

그 결과, 표 5에서 보는 바와 같이 200 ㎍/㎖의 농도에서 소나무 유도저항성 관련 유전자 후보군들의 전반적으로 2배 이상의 높은 발현 유전자는 메틸살리실레이트의 경우 PR_4 family와 PR_10 family였고, 살리실레이트의 경우 metallothionein 였다. 특히 메틸살리실레이트의 경우 PR_4 family는 약 6.99배로 매우 높게 유전자를 발현시켰다.As a result, as shown in Table 5, at the concentration of 200 ㎍ / ㎖, the expression gene which is more than twice as high as that of the candidate genes for pine tree induction resistance was PR_4 family and PR_10 family for methyl salicylate and salicylate metallothionein. Especially, in the case of methyl salicylate, PR_4 family expressed genes at a high level of 6.99 times.

소나무 캘러스에서의 메틸살리실레이트와 살리실레이트에 의한 유도저항성 유전자 발현Inducible resistance gene expression by methyl salicylate and salicylate in pine callus 유도저항성 관련 유전자Induction resistance related genes 물질matter MetSAMetsa SASA PR_1b familyPR_1b family 0.340.34 0.80.8 PR_2 familyPR_2 family 0.440.44 0.70.7 PR_3 family class 1PR_3 family class 1 0.660.66 0.640.64 PR_3 family class 4PR_3 family class 4 0.590.59 0.580.58 PR_4 familyPR_4 family 6.996.99 0.630.63 PR_5 familyPR_5 family 1.361.36 0.570.57 PR_9 familyPR_9 family 1.091.09 0.750.75 PR_10 familyPR_10 family 2.432.43 0.780.78 AntipeptideAntipeptide 0.90.9 1.641.64 Cytochrome_P450Cytochrome_P450 0.720.72 0.710.71 ExtensinExtensin 1.251.25 0.750.75 Heat shock 70Heat shock 70 0.660.66 1One HydroxyprolineHydroxyproline 0.580.58 0.680.68 MetallothioneinMetallothionein 1.191.19 3.073.07 xyloglucanxyloglucan 0.850.85 0.680.68

실시예 5. 메틸살리실레이트의 처리 후 배양 시간에 따른 유전자 발현Example 5. Gene expression according to incubation time after treatment with methyl salicylate

유묘 검정과 유전자 발현에서 모두 메틸살리실레이트가 살리실레이트에 비하여 매우 크게 활성을 보였으므로, 이후 실험을 메틸살리실레이트만 이용하여 실시하였다. 약제처리 후 시간 경과에 따른 유도저항성 유전자 발현정도를 조사하였다. 소나무 캘러스를 이용하여 캘러스가 있는 LM 배지에 메틸살리실레이트를 200 ㎍/㎖의 농도로 처리 후 암조건의 25℃ 진탕배양기에서 24시간 반응시켰다. 반응시킨 캘러스에서 RNAs를 추출한 후 cDNA를 합성하였고 RT-PCR 또는 qRT-PCR을 통해 특이적으로 증가되는 유도저항성 유전자의 발현을 확인하였다. 처리 후 시간경과에 따라 1일, 7일, 그리고 14일 후의 확보된 유도저항성 유전자의 발현을 조사하였다.Since both methylation and gene expression of methyl salicylate were significantly higher than that of salicylate, the experiment was carried out using only methyl salicylate. The degree of expression of inducible resistance gene was investigated with time after drug treatment. The pine callus was treated with LM medium containing callus and methyl salicylate at a concentration of 200 μg / ml, and reacted for 24 hours in a shaking incubator at 25 ° C under dark conditions. After extracting RNAs from the calli, RT-PCR or qRT-PCR was performed to identify the expression of the specifically induced inducible resistance gene. The expression of the inducible resistance genes at 1 day, 7 days, and 14 days after treatment was investigated.

메틸살리실레이트의 처리 후 시간에 따른 캘러스의 인 비트로 유도저항성 시험 결과, 표 6과 같이 메틸살리실레이트 처리 24시간 후 유도저항성 관련 유전자의 발현이 가장 높고 시간이 지남에 따라 점차 유전자 발현이 줄어드는 경향을 보였다. 이는 메틸살리실레이트에 의해 획득된 저항성 형질이 병원균의 침입 전까지 최대로 발현된 상태를 유지하지 않고 기억하거나 최소 수준만을 유지함으로써 식물체의 에너지 소비를 효율적으로 운용하는 일환으로 사료된다.As a result of in vitro resistance test of callus induced by time after treatment with methyl salicylate, induction resistance-related gene expression was highest at 24 hours after treatment with methyl salicylate as shown in Table 6, and gene expression was gradually decreased with time Respectively. This suggests that the resistance trait obtained by methyl salicylate can be remembered or maintained at the minimum level before the invasion of the pathogens.

메틸살리실레이트의 시간경과에 따른 캘러스의 인 비트로(in vitro) 유도저항성 검정In vitro induction resistance assay of callus over time of methyl salicylate 유도저항성 관련 유전자Induction resistance related genes 유전자 발현 정도Degree of gene expression 1일 후After 1 day 7일 후After 7 days 14일 후After 14 days PR_1b familyPR_1b family 1.451.45 0.620.62 0.710.71 PR_2 familyPR_2 family 1.031.03 0.70.7 1.131.13 PR_3 family class 1PR_3 family class 1 0.720.72 0.30.3 0.990.99 PR_3 family class 4PR_3 family class 4 0.930.93 0.370.37 0.90.9 PR_4 familyPR_4 family 1.521.52 0.850.85 0.720.72 PR_5 familyPR_5 family 0.690.69 0.130.13 0.990.99 PR_9 familyPR_9 family 1One 1One 1One PR_10 familyPR_10 family 2.892.89 1.011.01 0.80.8 AntipeptideAntipeptide 4.824.82 4.294.29 0.840.84 Cytochrome_P450Cytochrome_P450 0.690.69 0.330.33 0.880.88 ExtensinExtensin 16.1116.11 1.491.49 0.880.88 Heat shock 70Heat shock 70 1.391.39 1.821.82 0.910.91 HydroxyprolineHydroxyproline 1.41.4 0.150.15 1.251.25 MetallothioneinMetallothionein 1.421.42 0.110.11 0.90.9 xyloglucanxyloglucan 11.7111.71 11.9611.96 1.431.43

실시예 6. 메틸살리실레이트의 처리 방법에 따른 저항성유전자 발현Example 6 Expression of Resistant Gene by Treatment of Methyl Salicylate

실시예 1 및 실시예 4에서 가장 효과가 우수한 것으로 나타난 살리신산의 유도체인 메틸살리실레이트에 대하여 소나무 캘러스 표면 처리방식(분무처리)과 소나무 캘러스 LM 배지에 직접 유도저항성 물질을 투입하는 방식의 두 가지 다른 처리방법에 대해 인 비트로 검정을 수행하였다.A method of surface-treating pine tree callus (spray treatment) and direct induction-resistant material into pine callus LM medium to methyl salicylate, a derivative of salicinic acid, which showed the most excellent effects in Examples 1 and 4 In-vitro assays were performed for different treatment methods.

소나무 캘러스 표면 처리방식(분무처리)은 소나무 캘러스 100 mg에 LM 액체배지를 500 ㎕로 적셔준 준 후, 400 ㎍/㎖ 메틸살리실레이트 500 ㎕를 100 ㎕씩 5번 나누어 표면에 뿌려주어 메틸살리실레이트 200 ㎍/㎖가 되도록 하였고, 암조건의 25℃ 진탕배양기에서 교반기의 50 rpm으로 24시간 반응시켰다. 24시간 반응이 완료되면, 캘러스에서 RNAs를 추출한 후, cDNA를 합성하였고, RT-PCR 또는 qRT-PCR을 통해 특이적으로 증가되는 유도저항성 유전자의 발현을 확인하였다.After pouring 500 μl of LM liquid medium into 100 mg of pine callus, 500 μl of 400 μg / ml of methyl salicylate was sprayed onto the surface of the pine callus (spray treatment) And the reaction was allowed to proceed at 50 rpm for 24 hours in a 25 ° C shaking incubator under dark condition at a rate of 200 μg / ml. Upon completion of the reaction for 24 hours, RNAs were extracted from callus, cDNA was synthesized, and RT-PCR or qRT-PCR was performed to confirm the expression of the specifically induced inducible resistance gene.

소나무 캘러스 성장배지인 LM 젤라이트 배지에 메틸살리실레이트를 처리하여 200 ㎍/㎖ 메틸살리실레이트 LM 젤라이트 배지를 만들었다. 소나무 캘러스 100 mg을 200 ㎍/㎖ 메틸살리실레이트 LM 젤라이트 배지에서 24시간동안 암조건의 25℃ 진탕배양기에서 반응시킨 후, 캘러스에서 RNAs를 추출한 후, cDNA를 합성하였고, RT-PCR 또는 qRT-PCR을 통해 특이적으로 증가되는 유도저항성 유전자의 발현을 확인하였다. LM gelate medium, a pine callus growth medium, was treated with methyl salicylate to make 200 쨉 g / ml methyl salicylate LM gelite medium. 100 mg of pine callus was reacted in 200 μg / ml methyl salicylate LM gel medium for 24 hours in a shaking incubator at 25 ° C under dark condition, RNAs were extracted from calli, cDNA was synthesized, and RT-PCR or qRT Expression of the inducible resistance gene specifically increased by PCR was confirmed.

그 결과, 표 7에서와 같이 동일한 농도를 처리하였을 경우에는 소나무 캘러스 표면 처리방식(분무처리)보다 LM 배지에 직접 주입하여, LM 배지 성분과 메틸살리실레이트가 소나무 내로 직접 흡수되어 효과적으로 소나무의 유도저항성 관련 유전자의 발현을 높였을 것으로 추정할 수 있다.As a result, when the same concentration was applied as in Table 7, the LM medium component and the methyl salicylate were directly absorbed into the pine tree by direct injection into the LM medium rather than the pine callus surface treatment method (spray treatment) It is presumed that the expression of the resistance-related gene is increased.

메틸살리실레이트 처리 방법에 따른 캘러스 인 비트로 유도저항성 검정Callus in vitro according to the method of treatment with methyl salicylate Induction resistance test 유도저항성 관련
유전자Induction resistance
gene MeSA 처리방법MeSA treatment method 유도저항상물질 처리된 배지 이용법Usage of Induced and Always Materialized Media 유도저항성물질을 분무처리 방법Method of spray treatment of inducible resistance material PR_1b familyPR_1b family 1.781.78 1.021.02 PR_2 familyPR_2 family 2.042.04 0.680.68 PR_3 family class 1PR_3 family class 1 2.792.79 0.650.65 PR_3 family class 4PR_3 family class 4 5.15.1 0.60.6 PR_4 familyPR_4 family 1.611.61 7.067.06 PR_5 familyPR_5 family 2.852.85 1.361.36 PR_9 familyPR_9 family 2.412.41 0.950.95 PR_10 familyPR_10 family 2.752.75 1.31.3 AntipeptideAntipeptide 88 0.940.94 Cytochrome_P450Cytochrome_P450 2.582.58 0.720.72 ExtensinExtensin 0.70.7 0.960.96 Heat shock 70Heat shock 70 4.264.26 0.680.68 HydroxyprolineHydroxyproline 3.13.1 0.590.59 MetallothioneinMetallothionein 7.317.31 1.191.19 xyloglucanxyloglucan 2.992.99 0.930.93

실시예 7. 온실에서 2년생 소나무 유묘에 대한 메틸살리실레이트 유도체의 소나무재선충병 인 비보(in vivo)Example 7. In vivo, a pine re-infestation of methyl salicylate derivatives against 2-year-old pine seedlings in a greenhouse, 방제효과Control effect

메틸살리실레이트와 그 유도체(에틸 살리실레이트, 이소프로필 살리실레이트, 부틸 살리실레이트 및 이소부틸 살리실레이트)의 소나무재선충병에 대한 방제효과를 조사하였다. 소나무는 실시예 1과 같이 적송 2년생 유묘(직경 5.5 mm 내외, 신장이 약 35 cm)를 이용하여 수행하였다.The effects of methyl salicylate and its derivatives (ethyl salicylate, isopropyl salicylate, butyl salicylate and isobutyl salicylate) on the pine wilt disease were investigated. The pine trees were carried out using a second-year-old seedlings (diameter of 5.5 mm, height of about 35 cm) as in Example 1.

처리방법은 엽면살포 방법으로 수행하였다. 먼저 약제가 잎에 잘 흡착될 수 있도록 250 ㎍/㎖ Tween 20을 소나무당 5 ㎖씩 충분히 전처리한 후 2시간 말려주었다. 그 후 메틸살리실레이트와 유도체를 메탄올 10%와 250 ㎍/㎖ Tween 20을 포함한 수용액에 1.6 mg/㎖ 수준으로 용해한 다음 미세분사기에 넣어 소나무당 5 ㎖씩 엽면살포하였다.The treatment method was performed by the leaf surface spraying method. First, 250 ㎍ / ㎖ Tween 20 was poured into 5 ㎖ of pine, so that the medicines could be adsorbed well on the leaves, followed by drying for 2 hours. Then, methyl salicylate and its derivatives were dissolved in an aqueous solution containing 10% methanol and 250 μg / ml Tween 20 at a level of 1.6 mg / ml, and then sprayed in a microinjector with 5 ml per pine.

소나무재선충 접종은 물질처리 1주일 후 실시예 1과 같이 수피박피접종법으로 소나무당 2,000마리씩 접종하였고, 30일 후 결과를 관찰하였다. 그 결과, 표 8과 같이 메틸살리실레이트과 마찬가지로 에틸 살리실레이트, 이소프로필 살리실레이트, 부틸 살리실레이트, 이소부틸 살리실레이트에서도 방제효과가 있었다. After 1 week of material treatment, 2,000 pine trees were inoculated with the bark peeling method, as in Example 1, and the results were observed after 30 days. As a result, as shown in Table 8, ethyl salicylate, isopropyl salicylate, butyl salicylate, and isobutyl salicylate, as well as methyl salicylate, had a controlling effect.

메틸살리실레이트 및 유도체의 소나무재선충병에 대한 방제효과Effect of methyl salicylate and its derivatives on pine wilt disease 물질matter 처리방법Processing method 농도(㎍/㎖)Concentration (/ / ml) 발병도(%)Outbreak rate (%) 방제가(%)Control (%) 메틸
살리실레이트methyl
Salicylate 엽면살포Foliar application 1,6001,600 2424 7676 에틸
살리실레이트ethyl
Salicylate 2222 7878 이소프로필
살리실레이트Isopropyl
Salicylate 3838 6262 부틸
살리실레이트Butyl
Salicylate 5050 5050 이소부틸
살리실레이트Isobutyl
Salicylate 5656 4444 무처리구Non-treatment -- -- 100100 00 무접종구Non-inoculation -- -- 00 --

실시예 8. 온실에서 2년생 소나무 유묘에 대한 살리실레이트와 메틸살리실레이트 제제의 소나무재선충병 인 비보(Example 8. Salicylate for 2-year-old pine seedlings in the greenhouse and pine creeper bottle of methyl salicylate formulation, in vivoin vivo )) 방제효과Control effect

살리실레이트와 메틸살리실레이트 제제의 소나무재선충병에 대한 효과를 조사하기 위하여 메틸살리실레이트를 제형화하였다. 살리실레이트는 원제 20%, 계면활성제로서 NaOH(50%) 11.6%, 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol) 10%, 소듐 리그닌 설포네이트(Sodium lignin sulfonate) 5%, POE(9) 모노트리데실 에테르(monotridecyl ether) 3%, 물 50.4%로 제형화하였다. 메틸살리실레이트는 원제 20%, 계면활성제로서 프로필렌 글리콜(Propylene glycol) 30%, 프로필렌글리콜 모노메틸에테르(Propyleneglycol monomethylether) 30%, CR-FL3PG(Polyethoxylated tristyrylphenyl ether, phosphate, triethanolamine salt) 20%로 제형화하였다.Methyl salicylate was formulated to investigate the effects of salicylate and methyl salicylate on pine wilt disease. The salicylate was prepared by mixing 20% of the raw material, 11.6% of NaOH (50%) as a surfactant, 10% of polyethylene glycol, 5% of sodium lignin sulfonate, 5 g of monotridecyl ether ) 3%, and water 50.4%. Methyl salicylate was formulated with 20% of the raw material, 30% of propylene glycol as surfactant, 30% of propyleneglycol monomethylether, and 20% of polyethoxylated tristyrylphenyl ether, phosphate, triethanolamine salt (CR-FL3PG) .

제제의 처리는 엽면살포와 토양관주의 방법으로 소나무는 실시예 1과 같이 적송 2년생 유묘(직경 5.5 mm 내외, 신장이 약 35 cm)를 이용하여 수행하였다. 엽면살포는 약제가 잎에 잘 흡착될 수 있도록 250 ㎍/㎖의 Tween 20을 소나무당 5 ㎖씩 충분히 전처리한 후 2시간 말려주었다. 그 후 메틸살리실레이트 또는 살리실레이트의 제제를 1.6 mg/㎖ 수준으로 용해한 다음 미세분사기에 넣어 소나무당 5 ㎖씩 엽면살포하였다. 토양관주는 메틸살리실레이트 또는 살리실레이트의 제제를 0.2 mg/㎖ 수준으로 용해한 다음 소나무가 심어진 포트에 소나무당 40 ㎖씩 토양관주하였다. 소나무재선충 접종은 제제 처리 1주일 후 실시예 1과 같이 수피박피접종법으로 소나무당 2,000 마리씩 접종하였고, 40일 후 결과를 관찰하였다.The treatment of the preparation was carried out using a leaf spreading method and a soil crossing method, and the pine trees were carried out using a 2-year-old seedling (diameter 5.5 mm, height 35 cm) as in Example 1. Twenty (20 ㎍ / ㎖) Tween 20 was thoroughly pretreated for 5 ㎖ per pine tree and allowed to dry for 2 hours. Thereafter, the formulation of methyl salicylate or salicylate was dissolved at a level of 1.6 mg / ml, and then sprayed on the leaf by 5 ml per pine in a microinjector. Soils were prepared by dissolving methyl salicylate or salicylate at a concentration of 0.2 mg / ml, and then cultivating 40 ml of pine in a pot. After 1 week of treatment, 2,000 pine trees were inoculated with the bark peeling method, as in Example 1, and the results were observed after 40 days.

살리실레이트와 메틸살리실레이트 제제의 소나무재선충병에 대한 방제효과Effect of salicylate and methyl salicylate on the pine wilt disease 물질matter 처리방법Processing method 농도(㎍/㎖)Concentration (/ / ml) 발병률(%)Incidence (%) 방제가(%)Control (%) 살리실레이트Salicylate 엽면살포Foliar application 1,6001,600 8484 00 토양관주Soils 200200 6060 2525 메틸
살리실레이트methyl
Salicylate 엽면살포Foliar application 1,6001,600 66 9393 토양관주Soils 200200 88 9090 무처리구Non-treatment -- -- 8080 00 무접종구Non-inoculation -- -- 00 --

그 결과, 표 9와 도 3과 같이 엽면살포와 토양관주 모두에서 메틸살리실레이트의 활성이 살리실레이트보다 높게 나타났다. 메틸살리실레이트는 엽면살포에서 92.5%의 가장 우수한 방제가를 보였으며 토양관주에서도 90%의 높은 방제가를 나타냈다. 이 결과는 실시예 3의 결과와도 일치하며 제형화를 했을 경우 90% 이상의 더 강한 방제효과를 보였다.As a result, as shown in Table 9 and Fig. 3, the activity of methyl salicylate was higher than that of salicylate in both the leaf spread and the soil run. Methyl salicylate showed the highest control value of 92.5% in leaf application and 90% in soil control. These results are consistent with the results of Example 3 and showed a stronger control effect of more than 90% when formulated.

실시예 9. 온실에서 5년생 소나무 유묘에 대한 메틸살리실레이트 제제의 소나무재선충병 인 비보(Example 9. Pine rewind bottle of methyl salicylate formulation for five year old pine seedlings in a greenhouse. in vivoin vivo ) 방제효과) Control effect

메틸살리실레이트 제제의 적송 5년생 유묘(직경 1.7 cm 내외, 신장이 약 1.4 m)에서 소나무재선충병에 대한 방제효과를 확인하였다. 제제의 처리는 엽면살포와 토양관주의 방법으로 수행하였다. 엽면살포는 약제가 잎에 잘 흡착될 수 있도록 250 ㎍/㎖ Tween 20을 소나무당 40 ㎖씩 충분히 전처리한 후 2시간 말려주었다. 그 후 메틸살리실레이트 제제를 1.6 mg/㎖ 수준으로 용해한 다음 미세분사기에 넣어 소나무당 40 ㎖씩 엽면살포하였다. 토양관주는 메틸살리실레이트 제제를 0.2 mg/㎖ 수준으로 용해한 다음 소나무가 심어진 포트에 소나무당 320 ㎖씩 토양관주하였다. The control effect on the pine wilt disease was confirmed in the 5 - year - old seedlings (about 1.7 cm in diameter and about 1.4 m in height) of the methyl salicylate formulation. The treatments were performed by leaf spraying and soil brushing. Twenty (20 ㎍ / ㎖) Tween 20 was thoroughly pre-treated for 40 minutes per pine, and then allowed to dry for 2 hours. Thereafter, the methyl salicylate preparation was dissolved at a level of 1.6 mg / ml, and the mixture was sprayed on the leaf by 40 ml per pine in a microinjector. Soils were cultivated at a concentration of 0.2 mg / ㎖ of methyl salicylate and then cultivated in a pot of 320 ㎖ per pine.

소나무재선충 접종은 제제 처리 1주일 후 실시예 1과 같이 수피박피접종법으로 소나무당 3,000마리씩 접종하였고, 50일 후 결과를 관찰하였다. 그 결과, 표 10에서와 같이 적송 5년생 유묘에서도 엽면살포와 토양관주의 방제가가 각각 55.56%와 41.67%를 나타내었다. 엽면살포 방법에서 토양관주보다 조금 높은 방제가를 보이며 2년생 유묘에 나타난 결과와 유사한 경향을 보였다. After 1 week of treatment with pine tree, 3,000 pine trees were inoculated with the bark peeling method as in Example 1, and the results were observed after 50 days. As a result, as shown in Table 10, the leaf spread and the control of the soil condition were 55.56% and 41.67%, respectively, in the 5th year old seedlings. In the foliar spraying method, the control was slightly higher than the soil control, showing similar tendency to the results in the 2 - year - old seedlings.

메틸살리실레이트 제제의 적송 5년생 유묘에서 소나무재선충병에 대한 방제효과Control Effect on Pine Tree Wilt Disease in Five Year Old Seedlings of Methyl Salicylate Formulation 물질matter 처리방법Processing method 농도(㎍/㎖)Concentration (/ / ml) 발병도(%)Outbreak rate (%) 방제가(%)Control (%) 메틸
살리실레이트methyl
Salicylate 엽면살포Foliar application 1,6001,600 4040 5656 토양관주Soils 200200 52.552.5 4242 무처리구Non-treatment -- -- 9090 00 무접종구Non-inoculation -- -- 00 --

실시예 10. 포장에서 10년생 소나무에 대한 메틸살리실레이트 제제의 소나무재선충병 방제효과Example 10: Effect of methyl salicylate formulation on 10-year old pine tree in pine tree

메틸살리실레이트 제제의 묘목 뿐 아니라 성목에서의 소나무재선충병에 대한 방제효과를 확인하기 위하여 10년생 적송(근원직경 8~10 cm, 높이 3~4 m)을 이용하여 포장시험을 수행하였다. 남부산림자원연구소의 포장시험장(경상남도 사천시 곤명면 성방리 402-3)에 210그루의 소나무를 식재하였고, 약제 처리는 수간주입, 엽면살포, 토양관주의 방법으로 처리하였다. 수간주입은 두께 10 mm의 드릴로 소나무 지제부로부터 30 내지 50 cm 줄기 부위에 각도 45°로 구멍을 뚫고 구멍에 메틸살리실레이트 제제를 20,000 ㎍/㎖ 수준으로 희석하여 5ml 주입하였다. 약제 주입 후 코르크마개를 이용하여 구멍을 막았다. 수간주입은 소나무 식재 한 달 후에 한차례 처리하였다. 엽면살포는 메틸살리실레이트 제제를 2,000 ㎍/㎖ 수준으로 희석하여 압축 분무기로 소나무의 모든 잎이 충분히 적셔지도록 미세분사 하였고, 나무 크기에 따라 500 내지 800 ml 씩 처리하였다. 토양관주는 200 ㎍/㎖로 희석하여 소나무 한 그루당 1 L씩 처리하였다. 엽면살포와 토양관주는 식재 한 달 후와 두 달 후에 두 차례 수행하였다. 대조구로서 에이팜(EB, 2.15%)을 수간주입 하였고 수간주입에 의한 영향을 확인하기 위해 수간주입 방법으로 물만을 처리하였다.In order to confirm the control effect against the pine wilt disease not only in the seedlings of the methyl salicylate formulations but also in the adult species, the packaging test was carried out using 10 year old seedlings (root diameter: 8 to 10 cm, height: 3 to 4 m). 210 pine trees were planted in the pavement test center of the South Forest Resources Research Institute (402-3, Kunmyeon-myeon, Sacheon-si, Gyeongsangnam-do, Korea). The pores were drilled at an angle of 45 ° to the stem of 30 to 50 cm from the pine tree with a drill with a thickness of 10 mm, and 5 ml of the methyl salicylate preparation was diluted to a level of 20,000 ㎍ / ml. After injecting the drug, the hole was closed with a cork. The number of pine trees was counted once a month after planting. Foliar spraying was performed by diluting the methyl salicylate formulation to a level of 2,000 μg / ml, finely spraying all the leaves of the pine tree with a compression sprayer, and treating the leaves with 500 to 800 ml according to the size of the tree. Soils were diluted to 200 ㎍ / ㎖ and treated with 1 L per one pine tree. Foliar application and soil control were performed twice a month after planting and two months after planting. As a control, Apem (EB, 2.15%) was injected intravenously and only water was injected by intravenous injection method to confirm the effect of intravenous injection.

소나무재선충 접종은 2차 처리 일주일 후 수간주입 방법으로 소나무당 10,000마리씩 접종하였고, 3달 후 결과를 관찰하였다. 그 결과, 표 11에서 보는 바와 같이 수간주입과 토양관주의 방법에서는 무처리구 대비 각각 18%와 27%의 낮은 방제가를 보인 반면, 엽면살포에서는 100% 방제가를 보였다. 이는 메틸살리실레이트가 엽면살포의 방법에서 10년생 성목에서도 소나무재선충병에 대해 활성이 뛰어나고 더 큰 성목에 대하여 메틸살리실레이트의 실용화 가능성이 매우 높다는 것을 나타낸다.After the second treatment, 10,000 pine trees were inoculated with pine tree inoculation method, and the results were observed after 3 months. As a result, as shown in Table 11, lower control of 18% and 27% compared to untreated control was obtained in the case of the water injection and soil control, whereas 100% control was observed in the leaf application. This indicates that the methyl salicylate is more active against the pine wilt disease than the 10-year old adult in the method of leaf application, and the possibility of commercialization of methyl salicylate is greater for larger sexes.

Figure pat00001
Figure pat00001

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation National Institute of Forest Science <120> Composition for controlling pine wilt disease comprising methyl salicylate or its derivative as effective component and method for controlling pine wilt disease using the same <130> PN17354 <160> 34 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tgccccttca ggtaaatcgt 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcgggtcgta gttgcagata a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgacaacatt cgccccttct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctgcagcgcg gtttgaatat 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acctacagcg cttcattgc 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 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16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gtgcgggagt cggtgtagag 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tgtctcaagt ggaggcaagg a 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 aagcgacaat ttcaggcaaa ac 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gcgttgctca tacccgtttt 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gcagcactta gcactggatg aa 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aacatgtcct gcagcacgaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gtgcaccgca agtaaaccaa 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cgaatgtaat tccgaagttg ca 22 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ccatcccaaa ccaccagtct 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA 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<223> primer <400> 34 tacatgggaa gacgccgaat 20 <110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY          Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation          National Institute of Forest Science <120> Composition for controlling pine wilt          methyl salicylate or its derivative as an effective component and method for          controlling pine wilt disease using the same <130> PN17354 <160> 34 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tgccccttca ggtaaatcgt 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcgggtcgta gttgcagata a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgacaacatt cgccccttct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctgcagcgcg gtttgaatat 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acctacagcg cttcattgc 19 <210> 6 <211> 20 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Claims (8)

메틸살리실레이트(methyl salicylate), 이의 유도체 또는 이들의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물.A composition for controlling pine tree disease, comprising methyl salicylate, a derivative thereof, or a pesticidally acceptable salt thereof as an active ingredient. 제1항에 있어서, 상기 메틸살리실레이트의 유도체는 에틸 살리실레이트, 이소프로필 살리실레이트, 부틸 살리실레이트 또는 이소부틸 살리실레이트인 것을 특징으로 하는 조성물.2. The composition of claim 1, wherein the derivative of the methyl salicylate is ethyl salicylate, isopropyl salicylate, butyl salicylate or isobutyl salicylate. 제1항 또는 제2항에 따른 소나무재선충병 방제용 조성물을 소나무 식재지에 처리하는 단계를 포함하는 소나무재선충병 방제 방법.A method for controlling pine tree reversion disease comprising the step of treating a pine tree planting composition according to claim 1 or 2 with a composition for controlling pine tree reversion disease. 제3항에 있어서, 상기 소나무재선충병 방제용 조성물의 처리는 소나무의 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.4. The method according to claim 3, wherein the treatment of the composition for controlling pineberry disease induces induced systemic resistance of pine trees. 제3항에 있어서, 상기 소나무재선충병 방제용 조성물의 처리는 토양관주 처리 또는 엽면살포 처리인 것을 특징으로 하는 방법.4. The method according to claim 3, wherein the treatment of the composition for controlling pine vetch is either soil-borne treatment or leaf area spraying treatment. 제1항 또는 제2항에 따른 소나무재선충병 방제용 조성물을 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 재배지에 처리하는 것을 특징으로 하는 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법.A method for preventing or treating a pine wilt disease disease characterized by treating the pine wilt disease prevention composition according to any one of claims 1 or 2 to a pine wood, a fir, a spruce or a germination plant. 메틸살리실레이트(methyl salicylate), 이의 유도체 또는 이들의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제를 위한 엽면살포 처리용 조성물.A composition for treating foliar application for the control of pine needles comprising methyl salicylate, derivatives thereof, or a pesticidally acceptable salt thereof as an active ingredient. 메틸살리실레이트(methyl salicylate), 이의 유도체 또는 이들의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병에 대한 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하기 위한 조성물.A composition for inducing induced systemic resistance to pine wilt disease comprising methyl salicylate, a derivative thereof, or an agrochemically acceptable salt thereof as an active ingredient.
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