KR20190029087A - A biomarker for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease comprising SOX18 and the uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 키트, 상기 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단을 위한 정보의 제공 방법, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환의 스크리닝 방법을 제공한다. The present invention relates to a composition for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease, a kit for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease comprising the composition, a method for providing information for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease, a screening method for asthma or chronic obstructive pulmonary disease ≪ / RTI >
천식(asthma)은 만성 기도 염증 및 기도과민성을 특징으로 하는 폐질환으로, 대기오염물질, 황사, 알러젠(allergen) 등에 의하여 발생한다. 특히, 천식은 호흡곤란을 야기하는 염증성 호흡기 질환으로 우리나라 인구 중 약 300만명이 천식을 앓고 있다. 천식은 색색거리는 천명, 호흡곤란, 재채기, 심한 경우 산소부족으로 인한 청색증 및 흉통을 나타내는 질환으로 최근 들어 대기오염 및 각종 화학물질에 대한 노출과 식생활의 서구화로 인하여 급격히 증가하고 있으며, 특히 소아에서 발병률이 증가하고 있고 식습관의 변화 및 서구화에 따라 증가하고 있는 추세이다. 그러나 천식 환자들에서는 질병의 원인 및 발병기전이 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다. 이러한 발병 기전 중에 Th2(T helper type 2) 타입의 면역반응이 항진되어 이에 따라 인터루킨(interluekin)-4, 5, 13 등의 분비가 증가되게 되며(Liu et al., 2006; Williams et al., 2012), 이러한 반응과 연계하여 호산구를 비롯한 많은 염증세포들이 폐조직 내로 이동 및 침윤하게 된다(Zhou et al., 2011). 또한 염증세포들은 다양한 전염증인자 및 화학주성인자들을 방출하여, 염증반응을 더욱 악화시키며, 기도 내 배상세포의 점액분비를 증가시키고, 기도 과민성을 야기하게 된다(Chibana et al., 2008). 이러한 일련의 반응으로 인하여 천식환자들은 호흡곤란, 청색증 및 흉통 등의 임상증상을 나타내게 된다.Asthma is a lung disease characterized by chronic airway inflammation and airway hyperresponsiveness. It is caused by air pollutants, dust, allergens, and the like. In particular, asthma is an inflammatory respiratory disease causing dyspnea, and about 3 million people in Korea have asthma. Asthma is a disease characterized by colorless asthma, dyspnea, sneezing, severe cyanosis due to lack of oxygen, and chest pain. Recently, it has been rapidly increasing due to exposure to air pollution and various chemical substances and westernization of diet. Especially, And it is increasing with the change of eating habit and westernization. However, in asthmatic patients, the cause and mechanism of the disease are not clear. In this pathogenesis, Th2 (T helper type 2) type of immune response is exaggerated, resulting in increased secretion of interleukin-4, 5, and 13 (Liu et al., 2006; Williams et al. 2012), many inflammatory cells including eosinophils migrate and infiltrate into lung tissue in association with this reaction (Zhou et al., 2011). In addition, inflammatory cells release a variety of proinflammatory and chemoattractant factors, further exacerbating the inflammatory response, increasing mucus secretion in intratracheal goblet cells, and causing airway hyperresponsiveness (Chibana et al., 2008). Because of this series of reactions, patients with asthma exhibit clinical symptoms such as dyspnea, cyanosis, and chest pain.
현재, 천식의 치료에 사용되고 있는 약물은 스테로이드제제, 기관지 확장제 및 항염증제가 주로 사용되고 있다. 스테로이드제제와 항염증제의 경우 면역반응 및 염증반응 억제를 통하여 천식치료에 사용되고 있으며, 기관지 확장제의 경우 호흡곤란 등의 임상증상이 발현 시에 이를 상쇄시키고자 사용되고 있다. 현재 가장 광범위하게 사용되고 있는 흡입형 코르티코스테로이드(corticosteroid) 제제는 뛰어난 치료 효과를 나타내지만 장기적으로 사용할 경우 용량과 사용시간에 비례하여 부신 억제, 골밀도 감소, 성장 장애, 눈과 피부의 합병증, 콜라겐의 합성 증가 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 살메테롤(salmeterol)과 포르메테롤(formeterol)과 같은 지속성 베타-2 길항제(beta-2 agonist)는 천식 발작에 대해 예방 효과를 나타내지만 경우에 따라서는 환자를 사망케 할 수도 있다고 경고된 바 있다. 그리고 장기 사용시 부작용이 발견되어 천식치료제로서 사용이 제한적이다.Currently, steroids, bronchodilators, and anti-inflammatory drugs are mainly used in the treatment of asthma. Steroids and antiinflammatory agents are used for the treatment of asthma through immunity and inhibition of inflammatory responses, and bronchodilators are used to counteract clinical manifestations such as dyspnea. The most widely used inhaled corticosteroids have excellent therapeutic effect, but when used for a long period of time, adrenal suppression, bone density reduction, growth disorder, eye and skin complications, collagen synthesis And the like. In addition, persistent beta-2 agonists, such as salmeterol and formeterol, have been shown to be protective against asthma attacks, . And long-term use has been found to have side effects, limited use as a treatment for asthma.
한편, 천식과 함께 대표적인 폐질환의 하나인 만성폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)은 비가역적인 기도의 폐색을 동반한다는 점에서 천식과 다르며 현재 세계 사망률 4위를 차지하고 있고, 10대 질환 중 유일하게 그 발병률이 증가하는 중요한 질환이다. COPD는 기도 및 폐실질 염증에 의한 세기관지 및 폐실질의 병리학적 변화에 의해 발생하는 병으로, 폐쇄성 세기관지염 및 폐기종(폐실질 파괴)을 특징으로 한다. 만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease)의 종류에는 만성폐쇄성기관지염(Chronic obstructive bronchitis), 만성세기관지염(Chronic bronchiolitis) 및 폐기종(Emphysema)이 있다. COPD 원인 중 흡연은 가장 중요한 원인으로 생각되고 있다. 흡연은 폐 조직내 강한 독성물질로 작용하여, 산화물질, 전염증인자 및 화학주성인자의 생성을 촉진하게 되고, 이는 호중구와 같은 염증세포들의 과도한 이주를 촉진하게 된다. 폐 조직내로 이동된 염증세포는 역시 많은 염증성 매개물질을 분비하게 되어 폐 조직내 염증을 더욱 악화시키게 된다.Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD), which is one of the most common pulmonary diseases with asthma, differs from asthma in that it is associated with irreversible airway obstruction. It currently occupies the 4th place in the global mortality rate, It is the only disease with an increased incidence. COPD is a disease caused by a pathologic change of bronchioles and lung parenchyma caused by airway and pulmonary parenchymal inflammation, characterized by obstructive bronchiolitis and emphysema (pulmonary parenchymal destruction). Types of Chronic Obstructive Pulmonary Disease include Chronic obstructive bronchitis, Chronic bronchiolitis, and Emphysema. Smoking is one of the most important causes of COPD. Smoking acts as a strong toxic substance in the lung tissue, promoting the production of oxidants, proinflammatory and chemotactic factors, which promotes excessive migration of inflammatory cells such as neutrophils. Inflammatory cells transferred into lung tissue also secrete many inflammatory mediators, further exacerbating inflammation in lung tissue.
현재 만성폐쇄성 폐질환에 사용되는 치료물질은 폐 조직내 염증을 개선하는 것을 중점적으로 개발되어 오고 있으며, 주로 스테로이드제제, 항염제 등이 사용되고 있다. 그러나 이러한 치료물질들은 면역억제 및 내성 등의 다양한 부작용을 야기하여 장기간 치료가 필요한 만성폐쇄성 폐질환 환자에게는 부적합하다.Currently, therapeutic agents used in chronic obstructive pulmonary disease have been mainly developed to improve inflammation in lung tissues, and steroid agents and anti-inflammatory agents are mainly used. However, these therapeutic substances cause various side effects such as immunosuppression and tolerance and are not suitable for patients with chronic obstructive pulmonary disease requiring long-term treatment.
현재까지 개발된 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 치료제는 여러 가지 부작용들을 가지고 있는 바, 천식과 만성폐쇄성 폐질환을 조기에 발견하여 치료하는 것이 무엇보다 중요하다. 이에, 천식과 만성폐쇄성 폐질환을 조기에 진단할 수 있는 바이오마커의 발굴이 시급한 실정이다. It is important to detect asthma and chronic obstructive pulmonary disease at an early stage and to treat it, as the therapeutic agent for asthma or chronic obstructive pulmonary disease developed so far has various side effects. Therefore, it is urgent to find a biomarker capable of early diagnosis of asthma and COPD.
본 발명의 하나의 목적은, SOX18의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a composition for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease, which comprises an agent for measuring the level of mRNA of a protein of SOX18 or its gene.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease comprising the above composition.
본 발명의 또 다른 목적은, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a method for providing information for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease.
본 발명의 또 다른 목적은, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for screening for a therapeutic agent for asthma or chronic obstructive pulmonary disease.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, SOX18의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides, as one embodiment, a composition for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease, which comprises an agent for measuring the level of mRNA of a protein of SOX18 or its gene.
본 발명에서, 상기 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 조성물은 SOX18의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 조성물일 수 있다.In the present invention, the composition for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease may be a composition for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease, which comprises an agent for measuring the level of mRNA of the protein of SOX18 or its gene.
본 발명에서 용어, “천식”은 기관, 기관지, 세기관지, 그리고 폐포로 이어지는 기도의 염증반응과 이로 인한 기도조직의 손상 및 변화를 특징으로 하는 여러 가지 질환들을 통칭하는 포괄적인 질환명이다(Wardlaw A 등, Clin Exp Allergy 2005;35:1254-62). 구체적으로, 천식은 폐 속에 있는 기관지가 아주 예민해진 상태로, 때때로 기관지가 좁아져서 숨이 차고 가랑가랑하는 숨소리가 들리면서 기침을 심하게 하는 증상을 나타내는 질환으로, 기관지의 알레르기 염증 반응 때문에 발생하는 알레르기 질환이다. 천식의 대표적인 증상은 호흡곤란, 기침, 천명(쌕쌕거리는 거친 숨소리) 등이며, 좁아진 기관지를 짧은 시간 내에 완화시키는 증상 완화제(기관지 확장제) 또는 기관지의 알레르기 염증을 억제하여 천식발작을 예방하는 질병 조절제(항염증제, 류코트리엔 조절제) 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 천식은 기관지성 천식, 알러지성 천식, 아토피형 천식, 비아토피형 천식, 운동유발 천식, 아스피린 천식, 심인성 천식 또는 폐포성 천식일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.The term " asthma " in the present invention is a comprehensive disease name collectively referred to as various diseases characterized by inflammation of the airways leading to organs, bronchi, bronchioles, and alveoli, , Clin Exp Allergy 2005; 35: 1254-62). In particular, asthma is a condition in which the bronchus in the lung is very sensitive. Sometimes the bronchus narrows and the breathing, choking, and breathing sounds can be heard, causing severe coughing. Allergy caused by bronchial allergy inflammation Disease. The most common symptoms of asthma include dyspnea, cough, wheezing (wheezy breathing), a symptom reliever (bronchodilator) that alleviates the narrowed bronchus in a short time, or a disease modifier that prevents asthma attacks by inhibiting bronchial allergic inflammation Anti-inflammatory agents, and leukotriene modulators). In the present invention, the asthma may be, but not limited to, bronchial asthma, allergic asthma, atopic asthma, non-atopic asthma, exercise induced asthma, aspirin asthma, cardiogenic asthma or alveolar asthma.
본 발명에서 용어, "만성폐쇄성 폐질환"은 유해한 입자나 가스의 흡입에 의해 폐에 비정상적인 염증 반응이 일어나면서 이로 인해 점차 기류 제한이 진행되어 폐 기능이 저하되고 호흡곤란을 유발하게 되는 호흡기 질환을 말한다. 만성폐쇄성 폐질환의 주된 증상은 만성적인 기침 또는 만성적인 가래(객담)을 비롯하여 호흡곤란 등이 있으며, 베타항진제, 항콜린제, 메틸잔틴계 등의 기관지 확장제 또는 부신피질 호르몬 흡입제 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 만성폐쇄성 폐질환은 바람직하게는 만성 기관지염(chronic bronchitis) 또는 폐기종(emphysema)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term " chronic obstructive pulmonary disease " refers to a respiratory disease caused by an abnormal inflammatory reaction caused by inhalation of harmful particles or gas, It says. The main symptoms of chronic obstructive pulmonary disease are chronic cough or chronic sputum (sputum) as well as dyspnea, and bronchodilator such as beta agonist, anticholinergic agent, methylzantine system, or corticosteroid inhalant do. In the present invention, the chronic obstructive pulmonary disease may be, but is not limited to, chronic bronchitis or emphysema.
본 발명에서 용어, "만성 기관지염(chronic bronchitis)"이란, 2년 연속, 1년에 3개월 이상 가래가 있고 기침이 지속되는 질환을 의미한다. 흡연, 대기오염, 직업적 노출 등의 자극에 의한 기관지 손상이 원인으로 추정되고 있으며, 주요 증상으로는 만성 기침, 가래, 운동시 호흡곤란 등이 있다. 또한, 만성폐쇄성 폐질환의 특징인 급성 악화가 있을 수 있으며, 이때에는 수시간에서 수일 사이 호흡곤란이 빠르게 악화되고 가래의 양이 늘어나거나 가래의 성상이 점액성에서 화농성으로 변하면서 진한 노란색이나 푸르스름한 색을 띄게 되고 점도가 높아져 뱉어내기 힘들어진다.The term " chronic bronchitis " in the present invention means a disease in which the sputum is persistent for two consecutive years, three months or more per year, and cough persists. It is presumed that bronchial damage caused by stimulation of smoking, air pollution, occupational exposure, etc., is the main symptom, such as chronic cough, sputum and dyspnea during exercise. In addition, there may be acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. In this time, the breathing difficulty rapidly deteriorates from several hours to several days, the quantity of sputum increases, or the characteristic of sputum changes from mucous to purulent, and dark yellow or bluish It becomes colored and becomes viscous, making it difficult to spit.
본 발명에서 용어, "폐기종(emphysema)"이란, 종말 세기관지(terminal bronchiole) 원위부 공기공간(airspace)의 파괴로 인하여 비정상적이며 영구적인 말초 기도 및 폐포의 확장상태를 의미한다. 유해 입자와 가스의 흡입에 의하여 발생하며, 임상적으로 가장 의미있는 위험인자는 흡연으로 알려져 있다. 주요 증상으로는 만성적인 기침과 가래, 호흡곤란 등이 있다. The term " emphysema " in the present invention means an abnormal and permanent peripheral airway and alveolar expansion due to the destruction of the distal bronchioleast airspace. It is caused by inhalation of harmful particles and gas. The most clinically significant risk factor is known as smoking. The main symptoms are chronic cough, sputum and dyspnea.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 발병 여부를 확인하는 것으로서, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 발병 여부를 조기에 확인 할 수 있다. The term " diagnosis " as used herein means to identify the presence or characteristic of a pathological condition. For the purpose of the present invention, the diagnosis is to confirm the onset of asthma or chronic obstructive pulmonary disease, and it is possible to confirm early on whether asthma or chronic obstructive pulmonary disease develops.
본 발명에서 상기 SOX18는 전사 인자로 내피 특이적 전사 인자 SRY (성 결정 영역 Y)- 박스18) (endothelial-specific transcription factor SRY (sex determining region Y)-box18)은 혈관 및 림프계의 발달 또는 기능의 발달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 SOX18와 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환과의 관련성에 대하여 최초로 규명하였다.In the present invention, the SOX18 is an endothelium-specific transcription factor SRY (sex determining region Y) -box18 (SRY (sex determining region Y) -box18) as a transcription factor and is involved in the development or function of blood vessels and lymphatic system It is known to be involved in development. In the present invention, the relationship between SOX18 and asthma or chronic obstructive pulmonary disease was first identified.
본 발명의 일실시예에서, 마우스에 OVA를 감작하여 천식 동물 모델을 제조하였으며, 상기 OVA 감작된 마우스는 대조군에 비해 기도과민성(AHR, airway hyperresponsiveness)이 증가되었고, 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 총 염증 세포의 수가 증가된 것을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, an asthma animal model was prepared by sensitizing mice with OVA. The OVA-sensitized mice had increased airway hyperresponsiveness (AHR), bronchoalveolar lavage fluid (BAL) BALF) increased the number of total inflammatory cells.
또한, OVA로 감작된 천식 모델 마우스의 폐조직에서 SOX18의 발현이 증가되는 것을 웨스턴 블럿과 면역조직화학 염색으로 확인하였으며, 먼지 진드기 (Derp1)를 처리한 기관지 상피 세포(NHBE), 인간 폐 미세혈관내피세포(HMVEC-L)에서 SOX18의 발현이 대조군에 비해 증가하는 것을 확인하였다. In addition, increased expression of SOX18 in the lung tissue of asthma model mice sensitized with OVA was confirmed by western blot and immunohistochemical staining. It was confirmed that bronchial epithelial cells (NHBE) treated with dust mites (Derp1), human lung microvasculature The expression of SOX18 in endothelial cells (HMVEC-L) was increased compared to the control.
따라서, SOX18의 발현이 증가하는 경우 천식으로 진단할 수 있음을 확인하였다. Therefore, it was confirmed that asthma can be diagnosed when the expression of SOX18 is increased.
또한, 본 발명의 일실시예에서 악화된 천식환자에서 대조군에 비해 SOX18의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였으며, 안정화된 만성폐쇄성 폐질환 환자(COPD STA), 악화된 만성폐쇄성 폐질환 환자(COPD EXA)의 혈청에서 SOX18의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, SOX18의 발현이 증가하는 경우, 천식과 만성폐쇄성 폐질환으로 진단할 수 있다. In addition, in one embodiment of the present invention, the expression of SOX18 was markedly increased in asthmatic patients who were exacerbated as compared with the control group, and the patients with stable COPD STA, COPD EXA ) Significantly increased the expression of SOX18 in serum. Therefore, when the expression of SOX18 increases, it can be diagnosed as asthma and chronic obstructive pulmonary disease.
본 발명에서 용어 "마커(marker)"란 정상군 개체와 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환을 가지는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히 본 발명에서는 본 발명의 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환을 가지는 개체에서 변화되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term " marker " in the present invention means a substance which can be distinguished from a normal group individual and individuals having asthma or chronic obstructive pulmonary disease, and it can be increased or decreased in an individual having asthma or chronic obstructive pulmonary disease of the present invention A protein, or a nucleic acid, a gene, a lipid, a glycolipid, a glycoprotein, or a sugar. In particular, the present invention is not limited thereto, but may be a protein that is altered in an individual having asthma or chronic obstructive pulmonary disease according to the present invention.
본 발명에 사용된 용어 "mRNA 수준 측정"이란 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.As used herein, the term " mRNA level measurement " refers to a method for determining the presence and expression level of mRNAs of asthma or chronic obstructive pulmonary disease diagnostic genes in a biological sample to diagnose asthma or chronic obstructive pulmonary disease do. RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection (RPA), and reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay, Northern blotting, DNA chip, and the like.
상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.The agent for measuring the mRNA level of the gene is preferably a primer pair or a probe. Since the nucleic acid information of the genes is known in GeneBank and the like, those skilled in the art will be able to use primers or probes that specifically amplify specific regions of these genes Can be designed.
상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.The agent for measuring the mRNA level of the gene may comprise a primer pair, a probe or an antisense nucleotide that specifically binds to the gene.
바람직하게 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단을 위하여, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 SOX18의 단백질의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.Preferably for the diagnosis of asthma or chronic obstructive pulmonary disease, the agent for measuring said mRNA level may comprise a primer pair, probe or antisense oligonucleotide which specifically binds to the gene of the protein of SOX18.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.As used herein, the term " primer pair " is a primer pair that contains all combinations of primer pairs consisting of forward and reverse primers that recognize the target gene sequence, but preferably provides specific and sensitive assay results . The nucleic acid sequence of the primer is inconsistent with the non-target sequence present in the sample and can be given high specificity when it is a primer that amplifies only the target gene sequence containing a complementary primer binding site and does not induce nonspecific amplification .
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다. As used herein, the term " probe " refers to a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample, and refers to a substance capable of specifically confirming the presence of a target substance in the sample through the binding do. The probe molecule may be a peptide nucleic acid (PNA), a peptide, a polypeptide, a protein, an RNA, or a DNA, and may be a peptide nucleic acid It is preferably PNA. More specifically, the probe may be a biomolecule derived from or derived from an organism, or prepared in vitro, such as an enzyme, a protein, an antibody, a microorganism, an animal or plant cell and an organ, a nerve cell, DNA, and RNA DNA includes cDNA, genomic DNA, oligonucleotides, RNA includes genomic RNA, mRNA, oligonucleotides, and examples of proteins include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다. As used herein, the term " antisense oligonucleotide " refers to DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, which binds to a complementary sequence in the mRNA and inhibits translation of the mRNA into a protein . An antisense oligonucleotide sequence refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to and capable of binding to the mRNAs of the genes. This can interfere with translation of the gene mRNA, translocation into the cytoplasm, maturation, or essential activity for all other overall biological functions. The length of the antisense oligonucleotide may be 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, more preferably 10 to 40 bases. The antisense oligonucleotides may be synthesized in vitro by conventional methods and administered in vivo or may be used to synthesize antisense oligonucleotides in vivo. One example for the synthesis of antisense oligonucleotides in vitro is the use of RNA polymerase I. One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to allow the antisense RNA to be transcribed using a vector whose origin is a multi-cloning site (MCS) in the opposite direction. It is preferred that the antisense RNA is such that translation stop codon is present in the sequence so that it is not translated into the peptide sequence.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 수준 측정"이란 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단을 위하여 생물학적 시료에서 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 바람직하게는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정한다.The term " measurement of protein level " used in the present invention is a process for confirming the presence and expression level of a marker protein for diagnosis of asthma or chronic obstructive pulmonary disease in a biological sample for diagnosis of asthma or chronic obstructive pulmonary disease. The amount of the protein can be determined using an antibody that specifically binds to the marker protein. Preferably, the protein expression level itself is measured without using an antibody.
상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.As the protein level measurement or comparative assay, protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption / Immunohistochemistry analysis, immunocytochemistry analysis, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis, immunohistochemistry, immunohistochemistry, immunohistochemistry, immunohistochemistry, immunohistochemistry, Analysis, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), liquid chromatography-mass spectrometry / mass spectrometry (LC-MS / MS), Western blotting and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) But is not limited to.
천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단을 위하여 바람직하게 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 SOX18의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.For the diagnosis of asthma or chronic obstructive pulmonary disease, the agent that preferably measures the protein level may comprise an antibody that specifically binds to the protein of SOX18.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 SOX18의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.The term " antibody " as used herein refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to the protein of SOX18, and includes both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies. The production of the antibody can be easily carried out using techniques well known in the art.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.The antibodies of the present invention also include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen binding function, and includes Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 and Fv.
본 발명은 다른 양태로서, 상기 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 조성물을 포함하는, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 키트를 제공한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for the diagnosis of asthma or chronic obstructive pulmonary disease, comprising the composition for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease.
바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다.Preferably, the kit may be a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a DNA chip kit, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit, a protein chip kit or a rapid kit.
또한, 바람직하게, 상기 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.In addition, preferably, the kit for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease may further comprise one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
바람직하게, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. RT-PCR (역전사 중합효소반응) 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.Preferably, the diagnostic kit comprises a diagnostic kit comprising essential elements necessary for performing a reverse transcription polymerase reaction. The RT-PCR kit (RT-PCR) contains each pair of primers specific for the marker gene. The primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of each of the above genes, and has a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp. It may also contain a primer specific for the nucleic acid sequence of the control gene. Other reverse transcriptase reaction kits include enzymes such as test tubes or other appropriate containers, reaction buffer (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs), Taq polymerase and reverse transcriptase, DNAse, RNAse inhibitor DEPC- Water (DEPC-water), sterile water, and the like.
바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.Preferably a diagnostic kit comprising essential elements necessary for carrying out a DNA chip. The DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and reagents, preparations, enzymes, and the like for producing a fluorescent-labeled probe. The substrate may also comprise a cDNA or oligonucleotide corresponding to a control gene or fragment thereof.
또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.Also preferably, it may be a diagnostic kit characterized by comprising essential elements necessary for performing ELISA. The ELISA kit comprises an antibody specific for the protein. Antibodies are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies or recombinant antibodies with high specificity and affinity for each marker protein and little cross reactivity to other proteins. The ELISA kit may also include antibodies specific for the control protein. Other ELISA kits can be used to detect antibodies that can bind a reagent capable of detecting the bound antibody, such as a labeled secondary antibody, chromophores, an enzyme (e. G., Conjugated to an antibody) Other materials, and the like.
또한, 바람직하게는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다.In addition, it may preferably be a rapid kit, which includes essential elements necessary for carrying out a rapid test in which an analysis result can be obtained within 5 minutes. Rapid kits contain antibodies specific for proteins. Antibodies are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies or recombinant antibodies with high specificity and affinity for each marker protein and little cross reactivity to other proteins. The rapid kit may also include antibodies specific for the control protein. Other rapid kits include reagents capable of detecting the bound antibody, such as a nitrocellulose membrane with a specific antibody and a secondary antibody immobilized thereon, a membrane bound to the bead conjugated with the antibody, Materials, and the like.
본 발명은 다른 양태로서, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for providing information for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease.
바람직하게, 본 발명의 방법은 생물학적 시료로부터 SOX18의 단백질 또는 이의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및Preferably, the method comprises measuring the level of expression of a protein of SOX18 or a gene thereof from a biological sample; And
상기 단계에서 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단을 위한 정보의 제공 방법일 수 있다.And comparing the expression level of the protein measured in the step or the expression level of the gene with a normal control sample, to provide information for diagnosing asthma or chronic obstructive pulmonary disease.
본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.The term " biological sample " used in the present invention refers to a sample such as tissue, cell, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid or urine, which shows a difference in gene expression level or protein expression level due to the onset of asthma or chronic obstructive pulmonary disease But is not limited thereto.
상기 SOX18은 모두 정상 대조군과 비교하여, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환이 있는 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 변화하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 변화하면 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환으로 진단할 수 있다.As compared with the normal control group, the SOX18 has the characteristic that the gene expression level or the expression level of the protein is changed in an individual having asthma or chronic obstructive pulmonary disease. Therefore, if the level changes, diagnosis of asthma or chronic obstructive pulmonary disease can do.
또한, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 의심 개체의 분리된 시료의 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준보다 높을 경우 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환으로 판단할 수 있다. In addition, when the expression level or the protein expression level of the gene in the isolated sample of the suspect individual of asthma or chronic obstructive pulmonary disease is higher than the expression level of the protein of the normal control sample or the expression level of the gene, it is judged as asthma or chronic obstructive pulmonary disease can do.
바람직하게, 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준은 mRNA 발현 수준을 측정하거나 비교할 수 있다.Preferably, the level of expression of the gene of the invention can be measured or compared to mRNA expression levels.
상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.The measurement or comparison of the mRNA expression level may be performed using a reverse transcription polymerase chain reaction, a competitive reverse transcription polymerase chain reaction, a real time reverse transcription polymerase chain reaction, an RNase protection assay, a Northern blotting or a DNA chip, but the present invention is not limited thereto . Through these measurement methods, it is possible to confirm the amount of mRNA expression in a normal control group and the amount of mRNA expression in a patient with asthma or chronic obstructive pulmonary disease and compare the degree of expression thereof to diagnose or predict the onset of asthma or chronic obstructive pulmonary disease.
바람직하게 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.Preferably, the protein expression level of the present invention can be measured and compared using an antibody that specifically binds to the protein. The antibody and the protein in the biological sample are allowed to form an antigen-antibody complex, and a method of detecting the antibody-antibody complex is used.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.As used herein, the term " antigen-antibody complex " refers to a conjugate of a corresponding protein antigen in a biological sample and an antibody recognizing it. The detection of the antigen-antibody complex can be detected using methods such as those known in the art, for example, spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, absorbance, chemical and other methods.
본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.For the purpose of the present invention, protein level analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI-TOF Enhanced Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry Analysis, Radiation Immunoassay, Radiation Immunodiffusion, Oucheroton Immunodiffusion, Rocket Immunoelectrophoresis, Immunohistochemistry Analysis, Immunocytochemistry Analysis, Complement Liquid chromatography-mass spectrometry (LCMS), liquid chromatography-mass spectrometry / mass spectrometry (LC-MS / MS), Western blotting and ELISA (enzyme linked immunosorbent assay ), But are not limited thereto.
본 발명의 일실시예에서는, SOX18의 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하기 위해서, 면역조직화학(immunohistochemistry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)을 사용하였다.In one embodiment of the present invention, immunohistochemistry, Western blot, and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) were used to measure and compare the protein expression level of SOX18 itself.
본 발명은 다른 양태로서 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method of screening for a therapeutic agent for asthma or chronic obstructive pulmonary disease.
본 발명의 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 치료제의 스크리닝 방법은 The screening method of the therapeutic agent for asthma or chronic obstructive pulmonary disease of the present invention comprises
분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 치료제 후보물질을 처리하는 단계; Treating the candidate asthma or chronic obstructive pulmonary disease therapeutic agent to an isolated cell, isolated tissue or an animal other than a human;
상기 후보물질 처리군에서 SOX18의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 Measuring the expression level of the protein of SOX18 in the candidate substance treatment group; And
상기 측정된 SOX18의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면 상기 후보물질을 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 치료제로 선택하는 단계를 포함한다. If the measured expression level of the protein of SOX18 is lower than that of the control not treated with the candidate substance, the candidate substance may be selected as a therapeutic agent for asthma or chronic obstructive pulmonary disease.
본 발명의 용어, "천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 치료제 후보물질"은 통상적인 선정방식에 따라 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등이 될 수 있다.The term " agent for treating asthma or chronic obstructive pulmonary disease " according to the present invention refers to a substance that is suspected of being capable of treating asthma or chronic obstructive pulmonary disease according to a conventional selection method, or may be a randomly selected individual nucleic acid, Or a natural product, a compound, or the like.
본 발명에서 발현 수준 측정은 SOX18 단백질의 발현수준을 측정하는 것일 수 있다. Expression level measurement in the present invention can be by measuring the level of expression of the SOX18 protein.
본 발명의 용어 "대조군"이란 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 치료제 후보물질을 처리하지 않은 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물로 상기 후보물질을 처리한 군과 병렬 관계에 속하는 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물을 의미한다.The term " control group " of the present invention means separated cells that are not treated with asthma or chronic obstructive pulmonary disease therapeutic agent candidate, isolated cells belonging to a parallel relationship with the group treated with the candidate substance, An isolated tissue or an animal other than a human being.
본 발명의 “천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 치료제의 스크리닝 방법”은, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환에 SOX18의 발현이 관련됨을 확인함으로써, SOX18의 발현을 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하는 방식으로 고안되었다. The "method for screening for a therapeutic agent for asthma or chronic obstructive pulmonary disease" of the present invention is a method for comparing the expression of SOX18 with a control cell not treated with a therapeutic agent candidate by confirming that expression of SOX18 is involved in asthma or chronic obstructive pulmonary disease .
천식 또는 만성폐쇄성 폐질환을 예방 또는 치료할 수 있는 후보물질의 부재 하에 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에서의 SOX18의 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보물질의 존재 하에서 SOX18단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보물질이 존재할 때의 SOX18단백질의 수준이 상기 후보물질의 부존재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다. Measuring the level of the protein of SOX18 in isolated cells, isolated tissues or animals other than humans in the absence of candidate substances capable of preventing or treating asthma or chronic obstructive pulmonary disease, and measuring the level of SOX18 protein Of the candidate substance is compared and the substance which reduces the level of the SOX18 protein when the candidate substance is present in the absence of the candidate substance is predicted as an agent for the prevention or treatment of asthma or chronic obstructive pulmonary disease have.
상기 분리된 세포로는 인체에서 분리된 primary 세포일 수 있으며, 인간 기관지 상피세포주, 인간 폐 미세혈관내피세포와 같은 확립된 세포주를 사용할 수도 있다. The isolated cell may be a primary cell isolated from a human body, and an established cell line such as a human bronchial epithelial cell line or a human lung microvascular endothelial cell may be used.
상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명은, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 조성물을 제공함으로서, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 환자에게서 발현이 변화하는 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다. As described above, the present invention provides a composition for the diagnosis of asthma or chronic obstructive pulmonary disease, whereby the expression level of a protein or its gene whose expression is changed in asthma or chronic obstructive pulmonary disease patients can be measured and compared, Early diagnosis of chronic obstructive pulmonary disease and degree of disease can be predicted or understood significantly.
아울러, 본 발명의 진단용 조성물은 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환의 초기 진단을 제공할 수 있다. In addition, the diagnostic composition of the present invention makes non-invasive diagnosis possible and can provide an initial diagnosis of simple and effective asthma or chronic obstructive pulmonary disease by blood, urine test or the like.
도 1은 마우스에 OVA(오브알부민)으로 감작 유발하여 기도과민성을 유발한 마우스 실험디자인, OVA으로 감작한 마우스에서 유도된 기도과민성(AHR, airway hyperresponsiveness), OVA로 감작된 마우스의 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 증가된 염증 세포의 수를 나타낸다.
도 2는 10 μg/ml 먼지 진드기 (Derp1)를 처리한 기관지 상피 세포(NHBE), 인간 폐 미세혈관내피세포(HMVEC-L), OVA로 자극한 천식 동물 동물의 폐 조직을 이용하여 웨스턴 블럿으로 SOX18의 단백질 수준을 확인하고, 베타-액틴으로 표준화 한 것이다. * 대조군에 비해 p <0.05.
도 3은 면역조직화학 염색법에 의해 식염수 (대조군), OVA로 감작한 OVA day 33, OVA day 45, OVA day 80 그룹의 마우스 폐 조직의 SOX18 발현을 분석한 것이다.
도 4는 대조군, 안정화된 천식 환자(Asthma STA), 악화된 천식 환자(Asthma EXA) 그리고, 대조군, 안정화된 만성폐쇄성 폐질환 환자(COPD STA), 악화된 만성폐쇄성 폐질환 환자(COPD EXA)의 혈청 SOX18의 발현 수준을 측정한 것이다. FIG. 1 shows a mouse experimental design in which mice were induced to sensitize with OVA (ovalbumin) to induce airway hyperresponsiveness, AHR (airway hyperresponsiveness) induced in OVA-sensitized mice, bronchoalveolar lavage (OVA) Bronchoalveolar lavage fluid (BALF).
FIG. 2 shows the results of Western blot analysis using lung tissue of bronchial epithelial cells (NHBE) treated with 10 μg / ml dust mite (Derp1), human pulmonary microvascular endothelial cells (HMVEC-L) Protein levels of SOX18 were identified and standardized with beta-actin. * P <0.05 compared to control.
FIG. 3 shows the expression of SOX18 in mouse lung tissues of saline (control group),
Figure 4 is a graphical representation of the results of a control, stabilized asthma patient (Asthma STA), exacerbated asthma patient (Asthma EXA) and control, stabilized chronic obstructive pulmonary disease patient (COPD STA), exacerbated chronic obstructive pulmonary disease patient (COPD EXA) Lt; RTI ID = 0.0 > SOX18. ≪ / RTI >
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings so that those skilled in the art can easily carry out the present invention. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein.
A. 실험방법 A. Experimental Method
<< 실시예Example 1> 천식 및 만성폐쇄성 폐질환 환자의 모집 1> Recruitment of patients with asthma and chronic obstructive pulmonary disease
천식과 만성폐쇄성 폐질환 환자의 생체 물질의 표본과 임상 자료는 한국 바이오뱅크 네트워크 회원인 순천향대학교 부천 병원의 바이오뱅크에서 얻었다. 모든 피험자는 다음 기준 중 하나 이상인 경우, 천식 (GINA) 지침에 따라 천식의 임상 진단을 받았다. Specimens and clinical data of patients with asthma and chronic obstructive pulmonary disease were obtained from Bio Bank of Soonchunhyang University Bucheon Hospital, a member of the Korea Bio Bank Network. All subjects underwent a clinical diagnosis of asthma according to the GINA guidelines for at least one of the following criteria:
1) 14일간을 넘어서 20% 초과하는 매일의 최대 피크 호흡 흐름의 가변성 1) maximum peak daily respiratory flow variability that exceeds 20% over 14 days
2) 알부테롤(albuterol) 200-400μg을 흡입한 후에 15% 초과의 FEV1 증가 2) FEV1 increased by more than 15% after 200-400 μg of albuterol was inhaled
3) 10mg/ml 미만의 흡입된 메타콜린(PC20 methacholine) 자극 농도에 반응한 FEV1에서의 20% 감소3) a 20% reduction in FEV1 in response to inhaled methacholine (PC20 methacholine) stimulation concentrations less than 10 mg / ml
<< 실시예Example 2> 급성 천식 동물과 만성 천식 동물모델 준비 2> Prepare acute asthma and chronic asthma animal models
암컷 생후 6주된 BALB/c 마우스에 1일과 14일에 오브알부민(OVA)를 복강내 주사하였으며, 28일 내지 30일에 마우스에 1% OVA를 비강내(intranasal) 흡입(aerosol)하였다. 또한, 32일에 5% OVA를 비강내(intranasal) 흡입(aerosol)하여 급성 천식 동물 모델을 제조한 후, 33일에 희생시켰다(OVA day 33 그룹). 또한, 33일에 희생시키지 않은 마우스에 추가적으로 44일에 5% OVA를 비강내(intranasal) 흡입(aerosol)하여 만성 천식 동물 모델을 제조한 후, 45일에 희생시켰다 (OVA day 45 그룹). 또한, 45일에 희생시키지 않은 마우스에 추가적으로 52일 내지 77일에 1% OVA를 비강내(intranasal) 흡입(aerosol)한 후, 79일에 5% OVA를 비강내(intranasal) 흡입(aerosol)하여 만성 천식 동물 모델을 제조한 후, 80일에 희생시켰다(OVA day 80 그룹). 대조군 마우스에는 식염수를 투여하였다(sham 그룹). Female, 6-week-old BALB / c mice were intraperitoneally injected with ovalbumin (OVA) on
상기 제조된 동물모델에 0, 5, 20, 또는 100 mg/ml의 메타콜린 (Sigma-Aldrich)을 투여한 후, 기도과민증 (AHR)을 평가하였다. 다음 날에, 2.5 mg/kg 틸레타민(tiletamine)과 자일라진(xylazine) (Zoletil and lumpum; Bayer Korea Co., Seoul, Korea)으로 마취하고, 기관지폐포 세척액 (BALF)을 수거하여 염증세포의 수를 평가하였다. Airway hyperreactivity (AHR) was evaluated after administering 0, 5, 20, or 100 mg / ml of methacholine (Sigma-Aldrich) to the animal model. On the following day, anesthetized with 2.5 mg / kg tiletamine and xylazine (Zolethyl and lumpum; Bayer Korea Co., Seoul, Korea), and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) Were evaluated.
<< 실시예Example 3> 세포배양 3> Cell culture
인간 폐 미세혈관내피세포(HMVEC-L, Human lung microvascular endothelial cells)는 EGM-2MV 배지를 이용하여, T75 플라스크에서 성장하였다(37℃, 5% CO2). 인간 기관지 상피 세포(Human Bronchial Epithelial Cells, NHBE, cat#. CC-2540, Lonza, Basel, Switzerland; 접종 밀도, 3000/cm2)는 BEGM BulletKit™ (기관지 상피 세포 성장 배지, cat#: CC-3170, Lonza)를 포함하는 T75 플라스크에서 성장하였다 (37℃, 5% CO2). 배지는 세포수가 90% 컨플루언스(confluence)에 이를 때까지 48 시간마다 교체되었다 (37℃, 5% CO2). 이 후, 세포는 6-웰 플레이트에 접종하였으며, 10 μg/ml 먼지 진드기 (Derp1)를 4 시간, 8시간, 24 시간 동안 처리하여 천식의 시험관(in vitro) 모델을 제조하였다. Human lung microvascular endothelial cells (HMVEC-L) were grown in T75 flasks (37 ° C, 5% CO 2) using EGM-2MV medium. Human bronchial epithelial cells (Human Bronchial Epithelial Cells, NHBE, cat # CC-2540, Lonza, Basel, Switzerland; inoculation density, 3000 / cm2) were purchased from BEGM BulletKit ™ (bronchial epithelial cell growth medium, cat # Lonza) (37 < 0 > C, 5% CO2). The medium was replaced every 48 hours (37 ° C, 5% CO 2) until the cell number reached 90% confluence. Cells were inoculated into 6-well plates and treated with 10 μg / ml dust mite (Derp1) for 4, 8, and 24 hours to produce an in vitro model of asthma.
<< 실시예Example 4> 4> 웨스턴Western 블럿Blot
마우스 폐 조직을 증류수에 50 mM Tris-HCL (pH 7.4), 50 mM NaCl, 0.1% 도데실 황산 나트륨 (SDS), 1% Triton X-100, 0.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 100 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF)를 포함하는 단백질 용해 용액에서 균질화하고, 원심 분리한 후 (20,000g x 30분, 4oC), 수용성 물질 (soluble material)을 수거하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하여 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막으로 옮겼다. 5% 소 혈청 알부민 (BSA)을 포함하는 0.1% Tween-20을 함유하는 트리스 완충 식염수 (TBS)로 막을 블로킹하였고 (21℃, 2시간), anti-SOX18 항체로 배양(4℃, 밤새)한 후에, HRP (horseradish peroxidase)-접합 이차 항체를 사용하여 배양하였다. WEST-ZOL과 웨스턴 블럿 검출 시스템 (iNtRon, SungNam, Korea)을 사용하여 검출하였다. 정량적 농도법으로 상대적인 단백질 수준을 판단하였고 데이터는, 베타-액틴 (Sigma-Aldrich)으로 표준화하였다. Mouse lung tissue was suspended in distilled water in a solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1% Triton X-100, 0.5 mM ethylenediaminetetraacetic acid Homogenized in a protein lysis solution containing methylsulfonyl fluoride (PMSF), centrifuged (20,000
<< 실시예Example 5> 면역조직화학분석 5> Immunohistochemical analysis
마우스 폐 절편의 파라핀을 제거하고, 에탄올 시리즈 (ethanol series)로 재수화(rehydrated)하였다. 절편을 1.4% 과산화수소 (H2O2)를 포함하는 메탄올로 30분간 처리하여 내재하는 과산화 효소를 저해한 후, 1.5% 말 혈청으로 비특이적 결합을 처리하고 anti-SOX18 항체로 배양하였다. 다음 날에, 절편을 아비딘과 비오틴 처리된 HRP 거대분자 복합체 (Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 배양하였다. 액상 DAB+ 기질 키트 (Golden Bridge International Inc., Mukilteo, WA, USA)로 염색하여 색 반응을 유발하였다. 면역조직화학 염색 후에, 슬라이드를 1분간 Harris 헤마톡시린으로 비교 염색하였다. ImageJ 프로그램 (National Institutes of Health, Bethesda, Md)으로 이미지를 분석하였다.The paraffin of the mouse lung slice was removed and rehydrated with an ethanol series. The sections were treated with methanol containing 1.4% hydrogen peroxide (H2O2) for 30 minutes to inhibit the endogenous peroxidase, followed by non-specific binding with 1.5% horse serum and incubation with anti-SOX18 antibody. The next day, the sections were incubated with avidin and biotin-treated HRP macromolecule complexes (Vector Laboratories, Burlingame, Calif.). The color reaction was induced by staining with a liquid DAB + substrate kit (Golden Bridge International Inc., Mukilteo, WA, USA). After immunohistochemical staining, slides were stained for comparison with Harris hematoxylin for 1 minute. Images were analyzed with the ImageJ program (National Institutes of Health, Bethesda, Md.).
<< 실시예Example 6> ELISA 6> ELISA
인간 혈청 중 SOX184의 단백질 수치를 ELISA (R&D System)로 측정하였다. 다른 플레이트와 결과를 비교하기 위해, 양성 및 음성 대조군에 대하여 시험 샘플의 광학 밀도 (OD)를 조정하였다. 두 웰의 평균 OD를 계산하였다. 각 시험 혈청의 지수값 (index value)은 하기 수학식으로 정의된다: Protein levels of SOX184 in human serum were measured by ELISA (R & D System). To compare the results with the other plates, the optical density (OD) of the test sample was adjusted for the positive and negative controls. The average OD of the two wells was calculated. The index value of each test serum is defined by the following equation:
지수 (index) = (시험 혈청의 OD - 음성 대조군의 OD) / (양성 대조군의 OD - 음성 대조군의 OD) × 100. 낮은 검출 한계는 제조사의 권고에 따라 SOX18의 경우 0.057ng/ml로 설정하였다.Index = OD of OD-negative control of test serum / OD of OD-negative control of positive control × 100. The lower detection limit was set at 0.057 ng / ml for SOX 18 according to the manufacturer's recommendation .
통계 분석Statistical analysis
데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 나타내고, Mann-Whitney U 테스트는 두 그룹 사이의 유의한 차이를 판단하는데 사용되었다. p<0.05는 통계적 유의성을 의미하는 것으로 간주되었다. Data were expressed as mean ± standard error (SEM) and Mann-Whitney U test was used to determine significant differences between the two groups. p <0.05 was considered to mean statistical significance.
B. 실험결과 B. Experimental Results
<< 실험예Experimental Example 1> 급성 및 만성 천식 동물 모델에서 기도과민성 증가 및 염증 세포 증가 1> Increased AHR and inflammatory cells in acute and chronic asthma animal models
도 1은 마우스에 OVA(오브알부민)으로 감작 유발하여 기도과민성을 유발한 마우스 실험디자인, OVA으로 감작한 마우스에서 유도된 기도과민성(AHR, airway hyperresponsiveness), OVA로 감작된 마우스의 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 증가된 염증 세포의 수를 나타낸다. FIG. 1 shows a mouse experimental design in which mice were induced to sensitize with OVA (ovalbumin) to induce airway hyperresponsiveness, AHR (airway hyperresponsiveness) induced in OVA-sensitized mice, bronchoalveolar lavage (OVA) Bronchoalveolar lavage fluid (BALF).
도 1에 나타난 바와 같이, 32일에 5% OVA를 비강내(intranasal) 흡입(aerosol)하여 급성 천식 동물 모델을 제조한 후, 33일에 희생시킨 OVA day 33 그룹, 추가적으로 44일에 5% OVA를 비강내(intranasal) 흡입(aerosol)하여 만성 천식 동물을 제조한 후, 45일에 희생시킨 OVA day 45 그룹, 추가적으로 52일 내지 77일에 1% OVA를 비강내(intranasal) 흡입(aerosol)한 후, 79일에 5% OVA를 비강내(intranasal) 흡입(aerosol)하여 만성 천식 동물 모델을 제조한 후, 80일에 희생시킨 OVA day 80 그룹의 경우, 식염수를 처리한 sham 마우스보다 기도과민성(AHR, airway hyperresponsiveness)이 증가하였다. As shown in Figure 1, an acute asthmatic animal model was prepared by intranasal inhalation of 5% OVA on
또한, 기도과민성은 급성 천식 모델인 OVA day 33 그룹에서 가장 높았으며, 만성 천식 모델인 OVA day 45 그룹과 OVA day 80 그룹의 경우 급성 천식모델인 OVA day 33 그룹에 비해 다소 감소하였다. In addition, airway hyperresponsiveness was highest in the
급성 천식 모델인 OVA day 33 그룹, 만성 천식 모델인 OVA day 45 그룹과 OVA day 80 그룹의 경우 sham 마우스와 비교하여 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)의 총염증 세포도 증가하였으며, 대식 세포, 호산구, 호중구의 수도 모두 증가하였다. 이 중에서 급성 천식 모델인 OVA day 33 그룹에서 이들 염증 세포의 수가 가장 높았다. Total inflammatory cells of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were also increased in
<< 실험예Experimental Example 2> 천식의 시험관(in 2> Test tubes for asthma (in vivovivo ) 모델과 천식 ) Model and Asthma 생체내In vivo (in (in vivovivo ) 동물 모델에서 In animal models SOX18의Of SOX18 발현 양상 Expression pattern
다음으로, 웨스턴 블럿을 이용하여, SOX18의 발현을 분석하였다. 도 2는 10 μg/ml 먼지 진드기 (Derp1)를 처리한 기관지 상피 세포(NHBE), 인간 폐 미세혈관내피세포(HMVEC-L), OVA로 자극한 천식 동물 동물의 폐 조직을 이용하여 웨스턴 블럿으로 SOX18의 단백질 수준을 확인하고, 베타-액틴으로 표준화 한 것이다. Next, expression of SOX18 was analyzed using Western blot. FIG. 2 shows the results of Western blot analysis using lung tissue of bronchial epithelial cells (NHBE) treated with 10 μg / ml dust mite (Derp1), human pulmonary microvascular endothelial cells (HMVEC-L) Protein levels of SOX18 were identified and standardized with beta-actin.
도 2에 나타난 바와 같이, 먼지 진드기 (Derp1)를 처리한 기관지 상피 세포(NHBE)와 인간 폐 미세혈관내피세포(HMVEC-L)에서 SOX18의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, OVA로 자극한 급성 천식 모델인 OVA day 33 그룹, 만성 천식 모델인 OVA day 45 그룹과 OVA day 80 그룹 모두의 폐조직에서 SOX18의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, SOX18의 발현이 증가하는 경우 천식으로 진단할 수 있음을 확인하였다.As shown in FIG. 2, the expression of SOX18 was increased in bronchial epithelial cells (NHBE) treated with dust mite (Derp1) and human lung microvascular endothelial cells (HMVEC-L). In addition, the expression of SOX18 was increased in the lung tissues of the
<< 실험예Experimental Example 3> 급성 및 만성 천식 모델에서 3> In acute and chronic asthma models SOX18의Of SOX18 면역조직화학 분석 Immunohistochemical analysis
마우스에 OVA를 감작하여 제조된 급성 천식 모델인 OVA day 33 그룹, 만성 천식 모델인 OVA day 45 그룹과 OVA day 80 그룹의 폐 조직에서 SOX18의 발현 정도를 분석하였다. The expression level of SOX18 was analyzed in the lungs of the
도 3은 면역조직화학 염색법에 의해 식염수 (대조군), OVA로 감작한 OVA day 33, OVA day 45, OVA day 80 그룹의 마우스 폐 조직의 SOX18 발현을 분석한 것이다. 도 3에 나타난 바와 같이, OVA로 감작한 OVA day 33, OVA day 45, OVA day 80 그룹의 마우스 폐 조직에서 SOX18의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 이 중에서 만성 천식 모델로 갈수록 SOX18의 발현은 더욱 증가하였다.FIG. 3 shows the expression of SOX18 in mouse lung tissues of saline (control group),
상기 결과를 통해서, SOX18의 발현이 증가하는 경우 천식으로 진단할 수 있음을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that asthma can be diagnosed when the expression of SOX18 is increased.
<< 실험예Experimental Example 4> 천식 환자와 만성폐쇄성 폐질환 환자의 혈청에서 4> Serum from patients with asthma and chronic obstructive pulmonary disease SOX18의Of SOX18 발현 증가 Increased expression
다음으로, 천식환자와 만성폐쇄성 환자의 혈청에서 SOX18의 발현이 증가하는 지를 확인하였다. 도 4는 대조군, 안정화된 천식 환자(Asthma STA), 악화된 천식 환자(Asthma EXA) 그리고, 대조군, 안정화된 만성폐쇄성 폐질환 환자(COPD STA), 악화된 만성폐쇄성 폐질환 환자(COPD EXA)의 혈청 SOX18의 발현 수준을 측정한 것이다. Next, we examined the expression of SOX18 in serum of patients with asthma and chronic obstructive uropathy. Figure 4 is a graphical representation of the results of a control, stabilized asthma patient (Asthma STA), aggravated asthma patient (Asthma EXA) and control, stabilized chronic obstructive pulmonary disease patient (COPD STA), exacerbated chronic obstructive pulmonary disease patient (COPD EXA) Lt; RTI ID = 0.0 > SOX18. ≪ / RTI >
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 악화된 천식환자에서 대조군에 비해 SOX18의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 안정화된 만성폐쇄성 폐질환 환자(COPD STA), 악화된 만성폐쇄성 폐질환 환자(COPD EXA)의 혈청에서 SOX18의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, SOX18의 발현이 증가하는 경우, 천식과 만성폐쇄성 폐질환으로 진단할 수 있다. As a result, as shown in Fig. 4, it was confirmed that the expression of SOX18 was significantly increased in the asthmatic patients who were exacerbated as compared with the control group. In addition, the expression of SOX18 was significantly increased in the serum of patients with stable COPD STA, COPD EXA, and COPD patients with chronic obstructive pulmonary disease. Therefore, when the expression of SOX18 increases, it can be diagnosed as asthma and chronic obstructive pulmonary disease.
이와 같이, 천식과 만성폐쇄성 폐질환 환자에서 대조군에 비해 SOX18의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였는 바, SOX18의 발현이 증가하는 경우, 천식과 만성폐쇄성 폐질환으로 진단할 수 있다. Thus, the expression of SOX18 is significantly increased in patients with asthma and chronic obstructive pulmonary disease as compared with the control group. As the expression of SOX18 increases, it can be diagnosed as asthma and chronic obstructive pulmonary disease.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, Of the right.
Claims (12)
상기 단계에서 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단을 위한 정보의 제공 방법.Measuring the level of expression of a protein of SOX18 or a gene thereof from a biological sample; And
Comparing the expression level of the protein measured in the step or the expression level of the gene with that of a normal control sample, for the diagnosis of asthma or chronic obstructive pulmonary disease.
상기 후보물질 처리군에서 SOX18의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 SOX18의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면 상기 후보물질을 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 치료제로 선택하는 단계를 포함하는, 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 치료제의 스크리닝 방법.Treating the candidate asthma or chronic obstructive pulmonary disease therapeutic agent to an isolated cell, isolated tissue or an animal other than a human;
Measuring the expression level of the protein of SOX18 in the candidate substance treatment group; And
Wherein the candidate substance is selected as a therapeutic agent for asthma or chronic obstructive pulmonary disease when the measured expression level of the protein of SOX18 is lower than that of the control group not treated with the candidate substance.
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| KR20220036553A (en) | 2020-09-16 | 2022-03-23 | 순천대학교 산학협력단 | Composition for diagnosis of occupational asthma and method for diagnosis of occupational asthma using the same |
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- 2017-09-11 KR KR1020170116184A patent/KR101997139B1/en active IP Right Grant
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