KR20190024129A - 암 연관 섬유아세포 표적용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 유효성분으로 포함하는, 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts) 표적용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물을 통해서, 암-미세환경을 구성하는 세포 중 암의 발생, 진행, 전이에 중요한 역할을 하는 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts, CAFs)의 증식 또는 활성 억제 효과를 구체적으로 확인하였으며, 또한, 상기 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 병용 투여시 암의 증식이 현저히 억제되는 것을 구제적으로 확인하였는바, 다양한 암세포의 성장을 저해함으로써 항암제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

암 연관 섬유아세포 표적용 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions for targeting cancer associated fibroblast}

본 발명은 암 연관 섬유아세포를 표적으로 하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 상기 조성물은 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 유효성분으로 포함하고, 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts)을 표적으로 하여 상기 암 연관 섬유아세포의 증식 또는 활성 억제능을 갖는 약학적 조성물에 관한 것이다.

암은 인류가 직면하고 있는 가장 중대한 질병 중의 하나이며, 암치료를 위해 막대한 연구가 진행되고 있다. 암 치료, 특히 암의 내과적 치료에 있어서 암세포의 증식을 억제하는 다양한 항암제가 개발되어 어느 정도의 성과를 거두고 있지만, 이러한 약제는 암세포뿐만 아니라 정상적인 세포의 증식을 억제하여 구역질, 구토, 탈모, 골수억제, 신장장애, 신경장애 등 다양한 부작용을 일으키는 문제가 있다. 이러한 부작용을 줄이는 방법으로써, 항암제를 암세포 또는 암조직에 특이적으로 전달하려는 시도가 최근 이루어지고 있다. 항암제의 특이적 전달에 의해, 항암제가 정상세포에 도달하는 것을 막고 부작용을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 항암제의 투여량을 줄일 수 있어 경제적인 이점도 얻을 수 있다.

항암제에 따른 형질 전환된 종양 세포는 섬유아세포 (fibroblast)의 모집, 면역 세포의 이동, 기질 재구성 및 혈관 네트워크 개발을 포함하는 종양 세포 주변 환경을 재구축하여 종양 세포가 자기 주변에 자신을 지지해주는 특수한 암-미세환경을 구축한다. 직접 세포 접촉 또는 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자와 같은 분비 인자를 통해 매개되는 종양세포와 그 주변 환경 사이의 지속적인 크로스 토크 (cross talk)는 종양을 그들의 환경에 보다 적응력 있게 만들었다.

암 주변환경, 예를 들면 혈관, 세포외기질, 섬유아세포 등은 암 발병 및 진행에 중요한 역할을 하고 있다는 것이 최근 연구에 의해 점차 밝혀지고 있다. 정상 섬유아세포는 종양 발달을 억제하지만, 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblast, CAF)는 단백 분해 효소의 분비, 세포외기질의 침착 및 혈관 네트워크 발달을 통한 광범위한 조직 재형성에 의한 종양 전이 및 침윤을 유발시킨다. CAFs로 구성된 종양 간질 내압은 간접적으로 약물 내성을 제공하는 암 세포로의 약물 섭취의 접근을 제한함으로써, 종양 세포에 대한 방어 환경을 제공하여 약물 내성을 발생시킨다. 또한, 인테그린을 통한 ECM에 대한 암세포의 부착은 세포 사멸을 억제하고 PI3K-AKT, ERK, 및 NF-kB 경로를 포함하는 생존 신호 전달 경로를 활성화시키는 것으로 보고되고 있다.

한편, 보르테조밉 (Bortezomib, BTZ)은 전임상 및 임상 연구에서 다중 세포 신호 전달 경로를 파괴하고 종양 세포 사멸을 유도하는 최초의 프로테아좀 억제제로서, BTZ가 종양에 현저한 효과를 나타냈지만, 다발성 골수종 환자에서 내인성 또는 후천성 내성 반응 및 말초 신경병증을 비롯한 몇 가지 제한이 있음이 보고되었다. 이에, BTZ의 한계를 극복하기 위해 BTZ 및 파노비노스태트 (panobinostat, PST)와의 병용 요법이 미국 FDA에 의해 2014 년에 다발성 골수종의 치료를 위해 승인되었다.

PST는 p21의 상향 조절을 매개하는 강력한 pan-histone deacetylase 억제제 (HDACi)로써, 세포 증식 및 유도 세포 사멸을 억제하고, 주요 종양 억제 단백질 또는 암 유전자의 아세틸화 상태를 조절함으로써 HDACis는 악성 암 세포에서 독특한 항 증식제로 사용되고 있다. PST는 백혈병, 림프종, 신경 내분비 종양, 신장 세포 암종, 비소 세포 폐암, 유방암, 전립선 암, 결장 직장암 및 갑상선암과 같은 다양한 암 치료를 위한 여러 임상 시험에 사용되어 왔으며, 전임상 및 임상 시험 모두 프로테아좀 억제제와 HDACis의 상승 작용을 뒷받침 해왔다.

암 주변환경의 중요성이 부각되기 시작하였으며, 암세포 자체가 아니라 그 주변환경을 표적으로 하는 새로운 치료법이 고려되고 있다. 특히, 다양한 생리활성물질을 분비하고 암의 발병 및 진행에 깊이 영향을 미치는 CAF가 최근 주목 받고 있으나 (한국등록특허 10-1585947), 본격적인 연구의 역사는 아직 십몇 년에 불과하고, CAF를 분비하는 생리활성물질을 표적으로 하는 암치료에는 어느 정도의 효과가 확인된 것은 있으나, CAF 자체를 표적으로 하는 암치료 방법으로 어떠한 성과가 인정된 것은 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 암-미세환경을 구성하는 세포 중 암의 발생, 진행, 전이에 중요한 역할을 하는 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts, CAFs)를 억제할 수 있는 약물을 발굴하기 위해 약물 라이브러리를 스크리닝 하였으며, 이에 유효한 CAF 성장 억제 물질을 발굴하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 유효성분으로 포함하는, 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts) 표적용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 유효성분으로 포함하는, 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts) 표적 치료를 위한 약제학적 병용제제를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 유효성분으로 포함하는, 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts) 표적용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 보르테조밉 (Bortezomib)은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 구현예로, 상기 파노비노스태트 (Panobinostat)는 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.

[화학식 2]

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 암 연관 섬유아세포의 증식 또는 활성을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts)는 식도암 연관 섬유아세포, 위암 연관 섬유아세포, 및 유방암 연관 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 카스파제-3 (caspase-3)의 분해절단 (cleavage) 및 활성을 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase)의 분해절단 (cleavage)을 유도할 수 있다.

또한, 본 발명은 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 유효성분으로 포함하는, 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts) 표적 치료를 위한 약제학적 병용제제를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)는 동시에 (simultaneous), 별도로 (separate) 또는 순차적 (sequential)으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 연관 섬유아세포의 증식 또는 활성 억제방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 암 연관 섬유아세포의 증식 또는 활성 억제용도를 제공한다.

본 발명에 따른 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts) 표적용 약학적 조성물은 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 유효성분으로 포함하며, 상기 보르테조밉 (Bortezomib) 또는 파노비노스태트 (Panobinostat)는 약제 내성의 원인이 되는 암-미세환경을 구성하는 암 연관 섬유아세포 증식 억제 활성이 있을 뿐만 아니라, 두 약물을 병용 투여할 경우 단독 투여에 비해 현저히 높은 시너지 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

따라서, 다양한 암종의 치료제로써 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 약제 내성을 극복한 신약 개발에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 암 연관 섬유아세포 (CAFs)를 표적하는 약물의 선별 및 이에 대한 세포 생존력을 확인한 결과로서, (a) 암 연관 섬유아세포 (CAFs)를 표적으로 하는 여러 약물의 HTS (High-throughput screening) 스크리닝 결과, (b) 보르테조밉 (bortezomib)의 처리에 따른 세포 생존력, (c) 파노비노스태트 (panobinostat)의 처리에 따른 세포 생존력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 암 연관 섬유아세포 (CAFs)에 대한 BTZ 및 PST의 단독 또는 병용 투여에 따른 약물 효능을 확인한 결과를 나타낸 도면으로서, (a) 인간 식도암 CAF #8, (b) 위암 CAF #14, (c) 위암 CAF #32, 및 (d) 위암 CAF #36에 대한 BTZ 단독 (좌측), PST 단독 (중간), BTZ 및 PST 병용 (우측) 처리 결과를 나타낸 것이며, (e) 병용 치료 시너지 효과를 확인하기 위한 CI 값을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 BTZ 및 PST의 단독 또는 병용 처리에 따른 세포사멸 (apoptosis)을 통한 세포사 (cell death)를 유동 세포 계측법 (flow cytometry)를 통해 확인한 결과를 나타낸 도면으로서, (a) ECAF #12, (b) SCAF #32, 및 (c) SCAF #36에서의 유동 세포를 계측한 결과, (d) ECAF #12, (e) SCAF #32, 및 (f)　SCAF #36에서 전체 세포의 초기 세포 사멸 및 후기 세포 사멸을 확인한 결과, 및 (g) SCAF #32 및 (h) SCAF #36에서 세포 주기 및 세포사에 대한 BTZ 및 PTS의 병용 처리 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 BTZ 및 PST의 단독 또는 병용 처리에 따른 caspase-3 활성 증가를 확인한 결과를 나타낸 도면으로서, BTZ 및 PST의 단독 또는 병용 처리에 따른 SCAF #14에서 (a) 웨스턴 블롯 결과, (b) caspase-3의 절단 강도, (c) PARP의 절단 강도를 확인한 결과이며, SCAF #32에서 (d) 웨스턴 블롯 결과, (e) caspase-3의 절단 강도, (f) PARP의 절단 강도를 확인한 결과이고, SACF #36에서 (g) 웨스턴 블롯 결과, (h) caspase-3의 절단 강도, (i) PARP의 절단 강도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 BTZ 및 PST의 단독 또는 병용 처리에 따른 동물 실험 결과를 나타낸 도면으로서, (a) 암세포 단독 또는 MMTV-CAF를 가진 암세포를 이용한 이종 이식 모델로부터의 육종 종양의 대표 사진, (b) 168FARN 마우스 유방암 세포 단독 또는 MMTV-CAF의 이종 이식 모델에서 1:1 비율로 종양 부피를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 대조군 PBS, BTZ, PST 및 BTZ+PST 처리 21일 후, (a) 육종 종양의 대표 사진, (b) 약물 처리 동안의 종양 부피, (c) 약물 처리에 따른 절단된 caspase-3 현미경 사진, (d) 절단된 caspase-3 양성 세포의 비율 및 (e) 종양 절편에서의 섬유아세포 평균 비율을 나타낸 것이다.
도 7은 BTZ 및 PST의 단독 또는 병용 처리에 따른 동물 실험에서 (a) 168FARN 마우스 유방암 또는 (b) 마우스 MMTV-CAF 세포에서의 약물 단독 또는 병용 처리에 따른 약물 효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

기존 항암제는 암세포 자체만을 제거하는 목적으로 하여 약제 투약 초기에는 효과가 있으나, 약제 내성이 생기는 문제점이 있었으며, 약제내성은 암세포가 자신 주변의 자신을 지지해주는 특수한 암-미세환경을 구축함에 따라 기인한 것인바, 이를 위해 본 발명자들은 암-미세환경을 구성하는 세포 중 암의 발생, 진행, 전이에 중요한 역할을 하는 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts, CAFs)를 억제할 수 있는 약물을 발굴하고자 하였다.

이에, 본 발명의 일실시예에서는 CAFs를 표적으로 하는 잠재 약물을 선별하기 위한 고속대량스크리닝 (High-throughput screening, HTS)을 수행하여 후보 물질인 보르테조밉 (Bortezomib, BTZ) 및 파노비노스태트 (Panobinostat, PST)를 발굴 하였으며 (실시예 2 참조), 상기 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)의 병용 처리에 따른 CAFs의 억제 효능에 대한 시너지 효과를 확인하였다 (실시예 3 참조).

또한, BTZ 및 PST 병용 처리가 CAF의 억제를 통한 세포사멸 (apoptosis)에 의한 것인지 확인하고, 상기 세포사멸이 caspase-3 및 PARP 절단의 매개에 의한 것임을 구체적으로 확인하였다 (실시예 4 및 5 참조).

아울러, in vivo 상에서 BTZ 및 PST의 병용투여 효능을 마우스 이종 이식 모델을 통해서 구체적으로 확인하였다 (실시예 6 참조).

상기 결과들은 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)가 암 연관 섬유아세포 억제 활성이 있을 뿐만 아니라, 두 약물을 병용 투여시 시너지 효과를 나타내는바, 다양한 암종의 치료제로써 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.

이에, 본 발명은 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 유효성분으로 포함하는, 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts) 표적용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 억제 대상인 ‘암 연관 섬유아세포 (cancer-associated fibroblast, CAF)’는 암 병변의 내부 및/또는 주변에 존재하는 α－SMA(α-평활근엑틴) 양성 섬유아세포를 의미하며, 상기 CAF는 대장암, 폐암, 전립선암, 유방암, 위암, 담관암, 기저세포암 등의 다양한 암에서 그 존재가 확인되고 있다.

본 발명의 상기 CAF와 관련된 암은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 항문암, 신암, 수뇨관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소암, 자궁암, 난소암, 외음암, 질암, 피부암 등의 고형암을 들 수 있다. 또는 CAF는 일반적으로는 암에 관련된 것이지만 비슷한 성질이 있는 한, 암 이외의 악성고형종양, 예를 들면, 섬유육종, 악성섬유성조직구종, 지방육종, 횡문근육종, 평활근육종, 혈관육종, 악성피부암, 림프혈관육종, 활막육종, 연골육종, 골육종 등의 육종에 관련된 것도 또한 본 발명의 범위에 포함되며, 보다 바람직하게는 식도암, 위암 또는 유방암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 보르테조밉 (Bortezomib)은 프로테아좀 길항체로서 암세포 안에 있는 프로테아좀을 억제함으로써 항암효과를 나타내는 물질로서, 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

본 발명의 조성물의 또 다른 유효성분인 파노비노스태트 (Panobinostat)는 세포 증식성 질환의 치료와 관련한 HDAC를 억제함으로써 항암효과를 나타내는 물질로서, 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 유효성분으로 포함하며, 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 유효성분으로 포함하는, 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts) 표적 치료를 위한 약제학적 병용제제를 제공한다.

본 발명은 상기 약제학적 병용제제의 유효성분인 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)가 병용 투여됨으로써, 보르테조밉 또는 파노비노스태트의 단독 투여에 비해 암 연관 섬유아세포의 증식 또는 활성 억제 효능을 현저히 향상시키는 것에 특징이 있으며, 이에, 치료 효과를 증진시키기 위하여, 바람직하게는 동시에(simultaneous), 별도로(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다. 이 때, 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약제학적 병용제제의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 연관 섬유아세포의 증식 또는 활성 억제방법을 제공한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 예방, 조절 또는 치료방법을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 인간 섬유아세포 배양

본 발명에 사용된 인간 섬유아세포는 성균관대학교 의과대학 삼성서울병원에서 수술을 받은 환자의 종양 표본을 정밀 검사하여 종양 조직과 원위부 정상 조직의 대표 표본을 숙련된 병리학자로부터 공지된 방법에 따라 수득하였다. 수득한 조직은 항생제가 함유된 PBS로 두 번 세척하고, 작은 조각을 잘게 썬 후, 메스로 다졌으며, 다져진 샘플을 콜라게나아제/디스파아제가 함유된 20 ㎖의 DEME/F12 (1:1) 배지 (Welgene)에서 효소적으로 해리시켰다. 이 후, 해리된 샘플을 원심 분리하고, PBS로 두 번 세척한 다음, 10 % FBS (Welgene) 및 1 % 항생제 (Life Technologies)가 보충된 DMEM/F12 (1:1) 배지에서 배양하였다.

1-2. 시약 및 항체

보르테조밉 (Bortezomib, PS-341), 카르필조밉 (Carfilzomib, PR-171) 및 파노비노스태트 (Panobinostat, LBH589)는 ApexBio에서 구입하여 사용하였으며, Ez-cytox 세포 생존능 분석 키트 (Ez-cytox cell viability assay kit)는 DaeillLab에서 구입하였고, Annexin-V 염색 키트 (Annexxin-V staining kit)는 BD Bioscience에서 구입하였으며, 세포주기 분석 키트 (Cell cycle analysis kit)는 Abcam (Cat : ab139418)으로부터 제공받았다. 본 발명에 사용되는 PARP (Cat: 9532, Cell Signaling), cleaved PARP (Cat: 9546, Cell Signaling), caspase-3 (Cat: SC-7148, Santa Cruz), cleaved caspase-3 (Cat: 9661, Cell Signaling) 및 알파-튜블린 항체 (alpha-tubulin antibody; Cat: SC-8035, Santa Cruz)는 면역블롯팅을 위해 사용되었다.

1-3. High-throughput screening

본 발명에 따른 암 연관 섬유아세포 (Cancer associated fibroblasts, CAFs)를 타겟으로 하는 약물 후보물질 선별하기 위한 고속대량스크리닝 (High-throughput screening)을 진행하기 위해서, 9 가지 유형의 CAF 세포주 (인간 식도암 관련 섬유아세포 : #4, #8, #12, 및 인간 위암 관련 섬유아세포 : #13, #14, #32, #36, #41, #42)를 사용하였다. 상기 각 CAF를 웰 (well)당 500 개를 384-웰 플레이트에 분주하여 임상 실험 또는 FDA-승인된 약물을 포함하는 약물 라이브러리에서 약물 스크리닝을 위해 6 일 동안 처리하였다.

이 때, 약물 효능은 세포 ATP 수준을 측정하는 ATPlite 분석 키트 (Cat: 6016949, Perkin Elmer) 및 EnVision (Perkin Elmer)을 이용하여 측정하였으며, IC₅₀ 및 AUCs (Areas under concentration response curves) 값은 R 프로그램을 사용하여 raw 데이터로부터 계산하였다. 또한, 약물 후보물질은 가장 낮은 AUC 값을 선택하여 선정하였다.

1-4. 섬유아세포 생존 및 증식 분석

in vitro 약물 효능을 확인하기 위해서, CAF를 96-웰 플레이트에 1 웰 당 10,000 세포를 접종하였으며, 다음날 세포를 PBS로 세척하고 무 혈청 배지에서 6 시간 동안 배양한 다음, 1 % FBS 및 1 % 항생제가 첨가된 DMEM/F12 배지에 용해된 약물 후보물질을 3 회 처리하였다. 이 때, CAF의 생존능에 대한 약물의 억제 효과는 EZ-cytox 세포 생존력 분석 키트 (Cat: EZ-100, DaeilLab)로 48 시간 동안 처리하여 평가하였다.

약물 효능은 조합 지수 (combination index, CI)에 따라 평가되었으며, 상기 조합 지수 (CI)는 Chou Talalay 방법을 기반으로 한 compusyn 소프트웨어 (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ, USA)에 의해 정량하였으며, 조합 지수 (CI) 평가는 하기와 같다.

CI = 1 : 부가 효과 (additive effect);

CI > 1 : 길항 효과 (antagonism);

CI < 1 : 상승 작용 (synergy).

1-5. 웨스턴 블랏 분석 (western blot analysis)

세포를 수득하여 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 1 % Na-Doc, 0.1 % SDS 및 프로테아제 억제제 (Roche)를 함유하는 RIPA 용해 완충액과 아이스 상에서 30 분 동안 배양하였다. 이 후, 13,000 × g에서 원심 분리한 후, 상등액은 PARP, cleaved PARP, caspase-3, cleaved caspase-3 및 알파-튜블린을 검출하기 위한 면역블로팅에 사용하였다.

1-6. 세포 주기 및 세포 사멸 분석

세포 주기 분석을 위해서, 세포를 PBS로 세척하고, 밤새 4 ℃에서 70 % 에탄올 (ethanol)로 고정시켰으며, 고정된 세포를 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide) 및 RNaseA를 포함하는 세포 주기 분석 키트 (Cell cycle analysis kit, Cat : ab139418, Abcam) 시약으로 재구성하고 37 ℃에서 30 분간 배양하였다. 이 후, 염색된 세포를 유동 세포 계측법 (flow cytometry)을 사용하여 세포의 DNA 함량을 기록하였다.

다음으로 세포 사멸 분석은 제조사의 지시에 따라 BD Annexin V-APC apoptosis detection Kit (Cat: 556547, BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 보다 구체적으로, 수득된 세포를 두 번 차가운 PBS로 세척 한 후, Annexin-V 바인딩 버퍼에서 재현탁시킨 후, 세포들을 APC와 결합된 Annexin-V로 실온에서 30 분 동안 어두운 곳에서 염색을 진행하고, 가능한 빠른 시간 (1 시간 이내)에 유동 세포 분석 (flow cytometry)을 수행하였다.

1-7. in vivo 약물 효능 평가

in vivo 약물 효능 평가는 마우스 이종 이식 모델을 이용하였으며, 보다 구체적으로, MMTV-CAF를 Tg (MMTV-PyMT) 마우스 유방암 세포 모델로부터 분리하였으며, 이 때, MMTV-CAF의 분리는 인간 섬유아세포의 경우와 동일하게 진행하였다. 이 후, 10 % 혈청 및 1 % 항생제가 첨가된 DMEM 배지에서 배양한 후, CAFs의 종양 촉진 효과를 확인하기 위해서, BALB/c-nude 마우스 (OrientBio)의 측면에 5 × 10⁵ 개의 168FARN 세포 또는 5 × 10⁵ 개의 MMTV-CAF를 피하 주사하여 종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 측정하였다.

다음으로, 이종 이식에 대한 약물의 종양 억제 효능을 확인하기 위해서, 5 × 10⁵ 개의 168FARN 세포를 5 × 10⁵ 개의 MMTV-CAF와 함께 BALB/c-nude 마우스에 피하 접종하고 이종 이식 10 일 후, 마우스를 무작위로 4 그룹 중 하나를 할당하여 약물 처리를 복강 내 경로 (0.5mg/kg의 BTZ, 12.5mg/kg의 PST, 또는 0.25mg/kg의 BTZ + 6.25mg/kg의 PST)를 통해 주당 3회 실시하였다.

이 때, 종양의 직경은 캘리퍼를 이용하여 주 3회 확인하였고, 종양의 부피는 하기 수학식 1에 따라 측정하였으며, 종양 부피의 차이는 two tailed student t-test로 평가하였다.

[수학식 1]

종양의 부피 (V)=(4/3)π x (a/2) x (b/2)²

이 후, 평균 종양 부피가 1,000 ㎜³에 도달하고 종양 조직이 파라핀화 될 때, 마우스를 희생시켰으며, 약물 효능을 검증하기 위해서, cleaved caspase-3에 대한 면역 염색을 종양 조직에 수행하였다. 이 때, 모든 동물 실험은 성균관대학교 삼성 의료원 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care)의 승인을 받아 진행하였다.

1-8. 조직학적 분석 및 면역조직화학

마우스를 해부하여 종양을 분리시켜 48 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린으로 고정시킨 후, 조직 병리학적 진단을 위해 종양 절편을 H&E로 염색하였다. 다음으로 면역염색을 진행하기 위해서, 슬라이드를 탈파라핀화 (deparaffinize)하고, Tris-EDTA 완충액 (pH 9.25)에서 15 분 동안 antigen retrieval을 수행하였다. 이 후, 퍼옥시다아제 (peroxidase) 활성 및 비특이적 결합을 차단하고, 슬라이드를 항-cleaved caspase-3 항체 (Cat: 9661, Cell Signaling)로 1 시간 동안 배양 한 후, 이어서 항-토끼 항체 (Cat: 31190, Thermoscientific)로 45 분 동안 습식 챔버 (wet chamber)에서 배양하였다. 이 후, AEC 용액 (Cat: sk-4205, Vector)으로 슬라이드를 만들고, 헤마톡실린 (hematoxylin)으로 대조 염색하여 탈수시킨 후, 충전재(mounting media, Cat: 008010, Life technology)로 봉입(mounting) 하였다.

실시예 2. 암 관련 섬유아세포 (CAF) 표적 약물 후보 선별 및 CAF 세포 생존능 억제 확인

CAFs를 표적으로 하는 잠재 약물을 선별하기 위해서, 상기 실시예 1-3에 기재된 바에 따라, 고속대량스크리닝 (High-throughput screening, HTS)을 수행하였으며, 후보물질에 대해서 세포 생존능은 ATP 수준을 측정하는 ATPlite 분석 키트를 사용하여 발광 신호를 통해 측정하고, 세포 수 및 성장의 대용물로서의 AUC 값 및 각 약물의 IC₅₀ 값을 계산하였다 (도 1a 및 표 1 참조).

[표 1]

상기 표 1 및 도 1a에 따라, 가장 낮은 AUC 값 및 IC₅₀ 값을 바탕으로 보르테조밉 (Bortezomib, BTZ), 및 카르필조밉 (Carfilzomib, CFZ)을 포함한 여러 CAF 표적 약물 후보를 선정하였다.

다음으로 HTS로부터 선택된 CAF 표적 약물 후보의 약물 효능을 확인하기 위해서, 5 종류의 CAFs (1 종의 식도암 관련 섬유아세포 ECAF #8, 및 4 종의 위암 관련 섬유아세포 SCAF #14, #32, #36, #39)에 다양한 농도의 보르테조밉 (Bortezomib, BTZ), 카르필조밉 (Carfilzomib, CFZ) 및 파노비노스태트 (Panobinostat, PST)를 48 시간 동안 처리하여 세포 생존력을 확인하였다.

그 결과, 도 1b 내지 도 1d에 나타낸 바와 같이, 후보 약물 물질인 BTZ, PST, 및 CFZ의 처리에 따라, CAF는 용량 의존적으로 세포 생존력이 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 이 때, ECAF #8, SCAF #14, SCAF #32, SCAF #36, 및 SCAF #39에서 BTZ에 대한 IC₅₀값은 각각 2.64. 037. 8.25, 1.75 및 3.75 nM이고, PST에 대한 IC₅₀값은 각각 91.11, 45.03, 136.83, 132.24, 및 70.56 nM이며, CFZ에 대한 IC₅₀값은 각각 12.33, 6.68, 7.30, 5.43, 및 3.03 nM이었다.

상기 결과에 따라, BTZ, PST, 및 CFZ가 in vitro 상에서 CAFs를 표적으로 하는 잠재 약물임을 확인할 수 있었다.

실시예 3. BTZ 및 PST 병용 처리에 따른 CAF 생존 억제 시너지 효과 확인

BTZ와 PST의 병용 처리에 따른 CAFs의 억제 효능에 대한 시너지 효과를 나타내는지 확인하기 위해서, 4 종류의 CAFs에 BTZ 및 PST를 단독 또는 병용 처리하였다.

그 결과, 도 2a 내지 도 2d에 나타낸 바와 같이, BTZ 및 PST의 병용 처리가 단일 처리에 비해 모든 세포주에서 세포 생존력을 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 보다 구체적으로, SCAF #14, SCAF #32, SCAF #36에서 BTZ 및 PST의 병용 처리에 의해 준-치사량 (sub-lethal dosage)이 단일 처리에 비해서, 50 % 이상의 개선 효과를 보였고, ECAF #8에서 준-치사량이 50 % 미만의 개선 효과를 보이는 것을 확인하였다.

다음으로 병용 처리에 따른 감소된 세포 생존력 및 IC₅₀ 감소를 평가하기 위해서, 상기 실시예 1-4에 따른 중간 약물 효과 분석을 수행하여 시너지 효과 또는 길항 작용에 대한 약물 상호 작용의 양적인 정도를 나타내는 조합 지수 (CI)를 계산하였다.

그 결과, 도 2e에 나타낸 바와 같이, 각 세포주의 CI 값은 1.0 이하를 나타내어 BTZ 및 PST의 병용이 시너지(상승) 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

이 때, BTZ 및 PST를 1 : 25의 농도 비율로 조합을 사용하여 5 가지 다른 농도로 처리하였을 때, SCAF #14 및 SCAF #32 (CI 값 0.2 내지 0.5)에서 시너지 효과, SCAF #36 (CI 값 0.5 내지 0.7)에서 시너지 효과, 및 ECAF #8에서 중등도 시너지 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 4. BTZ 및 PST 병용 처리에 따른 CAF 세포사멸 (apoptosis) 유도에 대한 시너지 효과 확인

BTZ 및 PST 병용 처리가 서로 다른 유형 CAF의 세포 생존의 억제가 세포사멸 (apoptosis)에 의한 것인지를 확인하기 위해서, 3 가지 세포주 유형인 ECAF #12, SCAF #32, 및 SCAF #36에 16 nM의 BTZ 또는 400 nM의 PST의 단독 처리 및 8 nM의 BTZ 및 200 nM의 PST 병용 처리를 24 시간 동안 진행하였다. 상기 처리된 각 셀은 Annexin V-apc/프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI)로 염색을 진행하고, 유동 세포 계측법 (flow cytometry)을 통해서, 세포사멸 (apoptosis)에 의한 세포사 (cell death)를 확인하였다.

그 결과, 도 3a 내지 도 3c에 나타낸 바와 같이, 병용 처리시에 사용된 약물 농도가 단일 처리 약물 처리시 약물 농도의 절반을 사용하였으나, CAF 세포주에 BTZ 및 PST를 병용 처리할 경우, 단독 처리에 비해서 세포사멸 유도 효과가 더 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 3d 내지 도 3f에 나타낸 바와 같이, BTZ 및 PST를 병용 처리할 경우, BTZ 단독 처리 보다 ECAF #12에서 10 % 이상, SCAF #36에서 19 %, SCAF #32에서 5 %로 세포사멸에 의한 세포사 비율이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

한편, BTZ가 몇몇 인간 암 세포주에서 G2/M 억제를 유도하는 것을 보고되고 있는데, BTZ가 CAF에서 세포주기 정지를 유발하는지를 확인하기 위해서, SCAF #32 및 SCAF #36 세포주에 2, 4, 8 nM의 BTZ 또는 50, 100, 200 nM의 PST를 단독 약물, 및 1 nM + 25 nM, 2 nM + 50 nM, 4 nM + 100 nM의 BTZ 및 PST를 병용 약물 처리를 각각 16 시간 동안 진행하였다. 이 후, 고정 및 투과성 세포를 PI로 염색하고 그들의 DNA 함량을 유동 세포 계측법으로 분석하였다.

그 결과, 도 3g 및 도 3h에 나타낸 바와 같이, 인간 암 세포주에서와는 달리 CAF 세포주에서 BTZ 또는 PST 단독 약물, 및 BTZ 및 PST 병용 약물 처리에 의한 G2/M 정지가 관찰되지 않았다. 이 때, ECAF #32에서 PST 단독 처리할 경우, 약물 농도와 독립적으로 G0/G1에서 세포의 비율을 약간 증가시키는 것으로 나타났으며, 병용 약물 처리는 SCAF #32 및 SCAF #36 모두에서 세포사멸 유도를 나타내는 sub G0/G1 단계에서 세포의 퍼센트의 증가를 유도하는 것을 확인하였다.

실시예 5. BTZ 및 PST 병용 처리에 따른 caspase-3 활성 증가 확인

상기 실시예에 따라 BTZ 또는 PST 단일 약물 처리에 비해서, BTZ 및 PST를 병용 처리할 경우에 세포사멸의 시너지 효과를 유도하는 것을 확인하였으며, 이에, 세포사멸 유도 증가 효과가 caspase 활성에 기인한 것인지 확인하기 위해서, 웨스턴 블롯 분석(western blotting analysis)을 진행하여 SCAF #14, SCAF #32, 및 SCAF #36에서 PARP (poly (ADP-ribose) polymerase)의 절단, 및 SCAF #14, SCAF #32 및 SCAF #36에서 caspase-3의 절단을 조사하였다.

그 결과, 도 4a 내지 도 4c에 나타낸 바와 같이, BTZ 또는 PST 약물을 단독으로 SCAF #14에 처리시에는 다소 고농도인 16 nM의 BTZ 또는 400 nM의 PST를 처리한다 하여도 caspase-3 및 PARP의 절단을 약간 증가시키는 정도에 그쳤다. 반면에, 전술한 약물 농도의 각각 절반의 농도인 8 nM의 BTZ 및 200 nM의 PST 병용 처리만으로도 caspase-3 및 PARP의 절단을 강하게 유도하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 4d 내지 4f에 나타낸 바와 같이, BTZ 및 PST 약물을 단독으로 SCAF #32에 처리시에는 caspase-3의 절단은 거의 검출되지 않았고, 오직 높은 용량의 BTZ (12 nM)로부터 절단된 PARP가 약간 증가되는 것을 확인할 수 있었으나, BTZ 및 PST 약물을 병용하여 SCAF #32에 처리시 저농도인 3 nM의 BTZ 및 70 nM의 PST 처리만으로도 세포에서 강력하게 절단된 caspase-3 및 PARP가 검출되는 것을 확인할 수 있었다.

더욱이, 도 4g 내지 도 4i에 나타낸 바와 같이, BTZ 및 PST 약물을 단독으로 SCAF #36에 처리시에는 caspase-3 및 PARP의 절단을 BTZ의 단독 처리만으로도 유도시키긴 하지만, BTZ 및 PST를 병용하여 처리할 경우에는 caspase-3 및 PARP의 절단이 유의적으로 강화되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과에 따라, BTZ 및 PST의 병용처리에 의한 세포사멸은 caspase-3 매개 PARP 절단을 통해 매개되는 것을 알 수 있었다.

실시예 6. BTZ 및 PST 병용투여에 따른 동물모델에서 종양 억제 시너지 효과 확인

in vivo상에서 BTZ 및 PST의 병용투여 효능을 확인하기 위해서, 마우스 이종 이식 모델을 이용한 항 종양 효능을 평가하였다.

보다 구체적으로, 먼저 종양 미세 환경의 중요성을 확인하기 위해서, 마우스 유방암 세포주 168FARN 단독 또는 168FARN + MMTV-CAF를 누드 마우스 측면에 접종하였다.

그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 168FARN 및 CAF 세포 (168FARN + CAF 평균 종양 부피: 933 ㎜³ 대 168FARN 평균 종양 부피: 116 ㎜³)를 접종했을 때, 종양 형성이 향상되는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 CAF가 종양 형성 향상에 기여하는 것을 구체적으로 확인할 수 있었다.

다음으로, CAFs를 표적으로 하는 BTZ 및 PST 병용에 따른 항 종양 효과를 마우스 CAFs를 포함하는 마우스 유방암 세포주 168FARN을 이용한 마우스 이종 이식 모델로 평가하였다. 보다 구체적으로, 마우스에 168FARN 세포를 마우스 CAF와 1:1의 비율로 주사하고, 4 그룹 중 1 그룹을 무작위로 할당하여 대조군 PBS, BTZ, PST, 또는 BTZ 및 PST 병용 약물을 복강 내 주사에 의해 주 3회 처리하였다.

그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, 약물 처리된 마우스가 대조군 PBS 처리된 마우스와 비교하여 종양 성장을 유의하게 억제하는 것을 확인하였고, 단일 약물 처리에 비해 BTZ 및 PST 병용 처리시에 종양 형성을 현저히 억제하는 것을 구체적으로 확인하였다. 이 때, 마우스에서 유의한 부피 차이는 발견되지 않았다.

또한, 도 6c 및 도 6d에 나타낸 바와 같이, 절단된 caspase-3을 면역염색으로 확인한 결과, 대조군인 PBS가 처리된 마우스에 비해서, BTZ 또는 PST 단독 처리된 마우스에서는 세포사멸이 약간 증가하였으며, BTZ 및 PST가 병용 처리된 마우스에서는 세포사멸이 강하게 증가하는 것을 구체적으로 확인하였다.

아울러, 도 6e에 나타낸 바와 같이, BTZ로 처리한 종양에서의 섬유아세포의 평균 퍼센트에 대해서는 상당한 변화는 없었으며, PST 또는 BTZ 및 PST 병용 처리가 PBS 처리된 종양보다 종양에서 섬유아세포의 퍼센트를 다소 증가시키는 것을 확인하였다.

한편, BTZ 및 PST의 단일 또는 병용 처리가 168FARN 마우스 유방암 세포와 마우스 CAF 세포에서 세포사멸을 나타내는지를 확인하기 위해서, 168FARN 세포 또는 MMTV-CAF 세포를 플레이팅하고, 2 일 동안 BTZ, PST, 및 BTZ 및 PST를 병용 처리하였다.

그 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, BTZ 및 PST의 단일 또는 병용 처리가 in vitro에서 168FARN 마우스 유방암 세포 및 마우스 CAF 세포 모두에서 세포 사멸을 유도했기 때문에, 약물 처리 중 종양에서의 섬유아세포의 예상치 못한 점유는 각 세포주의 상이한 감수성에 기인한 것으로 설명될 수 있다.

상기 결과로부터 이종 이식 종양 조직에서 세포사멸이 증가함에 따라 암세포 및 CAF와 같은 여러 유형의 종양 구획을 표적으로 하는 BTZ 및 PST가 in vivo에서 종양 성장을 약화시킬 수 있고, BTZ 및 PST의 병용 처리는 각 약물의 효능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (15)

1. 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 유효성분으로 포함하는, 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts) 표적용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 보르테조밉 (Bortezomib)은 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   
3. 제1항에 있어서, 상기 파노비노스태트 (Panobinostat)는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   [화학식 2]
   

   

   
   
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 암 연관 섬유아세포의 증식 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts)는 식도암 연관 섬유아세포, 위암 연관 섬유아세포, 및 유방암 연관 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 카스파제-3 (caspase-3)의 분해절단 (cleavage) 및 활성을 유도하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 PARP (Poly (ADP-ribose) polymerage)의 분해절단 (cleavage)을 유도하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
8. 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)를 유효성분으로 포함하는, 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts) 표적 치료를 위한 약제학적 병용제제.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 보르테조밉 (Bortezomib) 및 파노비노스태트 (Panobinostat)는 동시에 (simultaneous), 별도로 (separate) 또는 순차적 (sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 병용제제.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 보르테조밉 (Bortezomib)은 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는, 병용제제.
    [화학식 1]
    

    
11. 제8항에 있어서, 상기 파노비노스태트 (Panobinostat)는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, 병용제제.
    [화학식 2]
    

    
12. 제8항에 있어서, 상기 병용제제는 암 연관 섬유아세포의 증식 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 병용제제.
    
13. 제8항에 있어서, 상기 암 연관 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts)는 식도암 연관 섬유아세포, 위암 연관 섬유아세포, 및 유방암 연관 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 병용제제.
    
14. 제8항에 있어서, 상기 병용제제는 카스파제-3 (caspase-3)의 분해절단 (cleavage) 및 활성을 유도하는 것을 특징으로 하는, 병용제제.
    
15. 제8항에 있어서, 상기 병용제제는 PARP (Poly (ADP-ribose) polymerage)의 분해절단 (cleavage)을 유도하는 것을 특징으로 하는, 병용제제.
    

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