KR20190015335A - 신규한 지방산 탈카르복실화 효소 및 이의 용도 - Google Patents
신규한 지방산 탈카르복실화 효소 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20190015335A KR20190015335A KR1020187037068A KR20187037068A KR20190015335A KR 20190015335 A KR20190015335 A KR 20190015335A KR 1020187037068 A KR1020187037068 A KR 1020187037068A KR 20187037068 A KR20187037068 A KR 20187037068A KR 20190015335 A KR20190015335 A KR 20190015335A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- ala
- gly
- leu
- val
- ser
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C11/00—Aliphatic unsaturated hydrocarbons
- C07C11/02—Alkenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
- C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/14—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced flavin or flavoprotein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.14)
- C12Y114/14001—Unspecific monooxygenase (1.14.14.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
- C12Y101/03013—Alcohol oxidase (1.1.3.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
- C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
- C12Y101/99018—Cellobiose oxidase (1.1.99.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 새로운 종류의 탈카르복실화 효소의 동정 및 이의 용도, 특히 지방산으로부터의 알칸/알켄의 제조에 관한 것이다.
Description
본 발명은 효소학, 특히 지방산 탈카르복실화 효소에 관한 것이다.
알칸 및 알켄은 화석 연료의 주요 구성 성분이나, 식물, 곤충, 시아노박테리아 및 일부 박테리아에서도 자연적으로 발생한다. 또한, 규조류와 콜로니 클로로파이세아 보트리오코커스 브라우니(colonial Chlorophyceae Botryococcus braunii)는 21 개 이상의 탄소를 가진 알칸(켄)(alka(e)nes)을 생산하는 것으로 알려져 있다.
대부분의 알칸(켄) 생합성 경로는 활성화된 지방산(acyl-ACPs 또는 acyl-CoAs)을 알데하이드 중간체로 전환시키고 최종 탈카르보닐화(decarbonylation)하여 알칸(켄)으로 전환시키는 과정을 포함한다. 이러한 반응은 다양한 효소에 의해 촉진된다. 식물에서, 27 내지 33 개 탄소의 긴 사슬 알칸은 두 개의 상동성 추정 산화 환원 효소(homologous putative oxidoreductases) ECERIFERUM1 (CER1) 및 ECERIFERUM3 (CER3)의 작용에 의해 지방산으로부터 생산된다(Bernard et al., 2012, The Plant Cell, 24(7), 3106-18; Bourdenx et al., 2011, Plant Physiology, 156(1), 29-45). 곤충에서, 21 내지 37 개 탄소의 큐티클 알칸(켄)의 합성은 아실-에스테르 환원 효소와 시토크롬 P450을 포함한다(Qiu et al., 2012, PNAS, 109, 14858-14863). 시아노 박테리아에서, 상기 경로는 아실-ACP 환원 효소와 알데히드 탈포르밀 산소화 효소(aldehyde deformylating oxygenase)로 구성된다(Li et al., 2012, Biochemistry, 51(40), 7908-16; Rude et al., 2011, Applied and Environmental Microbiology, 77(5), 1718-27). 제오트갈리코커스 속(Jeotgalicoccus spp)과 슈도모나스 속(Pseudomonas sp)만이 유리 지방산의 직접 르복실화에 의해 탄화수소를 생산할 수 있다(Grant et al 2015, Journal of the American Chemical Society, 137(15), 4940-3; Rui et al., 2014, PNAS, 111, 18237-18242; Rude et al., 2011, Applied and Environmental Microbiology, 77(5), 1718-27). 그러나 이러한 박테리아성 지방산 탈카르복실화 효소는 알켄(말단부 불포화를 지니고 있음)을 생성할 수는 있으나, 알칸은 생산하지 못한다. 미세조류에서, 탄화수소의 합성을 촉매하는 효소는 알려져 있지 않다. 미세조류인 보트리오코커스 브라우니의 알칸 합성 시스템을 정제하기 위한 시도가 있었고, 코발트-포르피린 효소에 의한 지방 알데히드 중간체의 탈카르보닐화를 통해 합성을 진행하는 것이 제안된 바 있다(Dennis & Kolattukudy, 1992, PNAS, 89(12), 5306-10). 그러나, 단백질은 확인된 바가 없다.
따라서, 지방산으로부터 알칸/알켄을 생산하기에 적합한 효소의 필요성이 여전히 강하게 요구되고 있다.
본 발명은 미세조류에서 동정된, 알칸 및 알켄의 합성을 위한 새로운 종류의 효소의 동정에 관한 것이다. 알칸 합성 효소가 이들 미생물에서 확인된 것은 이번이 최초이다. 이 효소는 유리 지방산의 탈카르복실화에 의한 알칸 및/또는 알켄으로의 전환을 촉매한다. 이 효소는 원핵 생물 및 진핵 생물 GMC(Glucose-Methanol-Choline) 산화 환원 효소에 존재하는 FAD-의존성 단백질의 슈퍼 패밀리에 속하며 다양한 효소(주로 알코올 산화 효소)를 포함한다. 지금까지 미세조류의 GMC 산화 환원 효소는 생화학적 관점에서 특성화되지 않았으며 어떤 GMC 산화 환원 효소 슈퍼 패밀리의 다른 구성원도 알칸 합성 효소로 확인되지 않았다. 따라서, 이는 바이오 연료, 친환경 화학, 진단 및 영양학 분야에 응용할 수 있는 알칸 및 알켄의 합성을 위한 신규 효소이다.
따라서, 본 발명은 지방산으로부터 알칸 및/ 알켄을 생산하기 위한 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 용도에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드는 지방산 탈카르복실화 효소 활성을 가지며, 서열번호 1과 적어도 40%의 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 폴리펩타이드는 공통 서열(consensus sequence) G-X-L-(X)4-C-[D/E]-X-G-[A/G]-F-X-[K/R](서열번호 4)을 포함하고, X는 임의의 아미노산이다. 대안적 또는 추가적으로, 서열번호 1의 C372, R391, Y406, Q426, H512 및 N515 위치 중 1,2,3,4,5 또는 6 개의 아미노산이 보존된다. 대안적 또는 추가적으로, 388-428 번 위치 사이의 아미노산 잔기의 적어도 40%가 V, I, L, M, F, W, C A 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 소수성(hydrophobic) 잔기이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 3 및 5 내지 14 및 이들 중 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 본질적으로(essentially) 구성된다.
바람직하게는, 상기 폴리펩타이드는 조류(algae), 바람직하게는 미세조류(microalgae) 또는 시아노박테리아(cyanobacteria)로부터의 것이다.
바람직하게는, 상기 지방산 및 상응하는 탈카르복실화된 알칸 및/알켄은 8 내지 24 개의 탄소 원자, 바람직하게는 12 내지 22 개의 탄소 원자를 포함한다.
선택적으로, 상기 지방산 및 상응하는 탈카르복실화된 알칸 및/ 알켄은 하나 이상의 관능기로 치환 및/또는 단절된다. 바람직하게는, 상기 지방산 및 상응하는 탈카르복실화된 알칸 및/ 알켄은 하이드록실, C1-C3 알콜, C1-C3 아실, C1-C3 에스테르, C1-C3 아민, 아미노기, C1-C3 아미드, 카르복실, 알데히드, 에폭시, 할로겐, C1-C3 알콕시, C1-C3 티오알킬, C1-C3 이민, 니트릴, C1-C3 술폰 또는 C1-C3 술폭시드와 같은 황기, 티올, 니트로, 시아노, C1-C3 할로게노알킬과 같은 하나 이상의 기로 치환되거나, 또는 O, N 또는 S와 같은 헤테로 원자, 아세틸렌기, 디비닐에테르기와 같은 에테르, 또는 옥소기로 단절된다.
또한, 본 발명은 지방산으로부터 알칸 및/ 알켄을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 정의된 폴리펩타이드를 지방산과 접촉시키고 상기 폴리펩타이드의 FAD 보조 인자의 존재하에서 광(light)에 노출시킨다. 바람직하게는, 상기 광은 300 내지 540 nm, 보다 바람직하게는 400 내지 520 nm의 파장을 갖는다. 예컨대, 상기 광은 백색광 또는 청색 또는 UV 광자를 포함하는 임의의 광(예를 들어, 400 내지 520 nm)이다.
본 발명은 추가적으로 상기 정의된 이종(heterologous) 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 박테리아(bacterium), 미세조류(microalga), 사상 진균(filamentous fungus) 또는 효모(yeast)이다.
제1 구현예에서, 상기 이종 폴리펩타이드는 티오에스테라제(thioesterase)와 함께, 바람직하게는 미세조류 또는 시아노박테리아에서 동시-발현된다. 다른 구현예에서, 상기 이종 폴리펩타이드는 지방 분해 효소(lipase)와 함께, 바람직하게는 박테리아 또는 미세조류에서 동시-발현된다.
본 발명은 지방산으로부터 알칸 및/ 알켄을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 재조합 숙주 세포를 배양하고 알칸 및/ 알켄을 회수한다.
또한, 본 발명은 시료에서의 유리 지방산(free fatty acids)의 적량을 위한 상기 정의된 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 방법은 시료에서의 유리 지방산 적량 방법으로서, (a) 지방산을 알칸/알켄으로 전환시키는데 적합한 조건에서 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소와 시료를 접촉시키는 단계, (b) 상기 알칸/알켄 및/또는 CO2를 회수하는 단계; 및 (c) 상기 알칸/알켄 및/또는 CO2를 정량화하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 본 방법은 시료에서의 유리 지방산 적량 방법으로서, (a) 지방산을 알칸/알켄으로 전환시키는데 적합한 조건에서 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소와 시료를 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 지방산 탈카르복실화 효소에 의해 방출된 형광을 측정하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 상기 방법은 시료를 지방 분해 효소와, 특히 지방산을 유리 지방산으로 전환시키는데 적합한 조건하에서 접촉시키는 사전 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 지방산의 탈카르복실화를 위한, 상기 정의된 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명자들은 지방산 탈카르복실화의 활성에 의해 유리 지방산을 알칸 및 알켄으로 전환시킬 수 있는 새로운 종류의 효소를 동정하였다.
정의
약: 본원에서 사용되는 "약"은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하를 의미한다. 예를 들어, 약 100은 90 내지 110, 바람직하게는 95 내지 105를 의미한다.
코딩 서열: 용어 "코딩 서열"은 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 직접 특정하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 ATG, GTG 또는 TTG와 같은 개시 코돈으로 시작하여 TAA, TAG 또는 TGA와 같은 정지 코돈으로 끝나는 오픈 리딩 프레임에 의해 결정된다. 코딩 서열은 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 유전자 코드는 숙주 세포에 최적화될 수 있다.
조절 서열(Control sequences): 용어 "조절 서열"은 본 발명의 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 조절 서열은 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 고유(즉, 동일한 유전자 유래) 또는 이종(즉, 상이한 유전자 및/또는 상이한 종 유래)일 수 있다. 바람직하게는, 조절 서열은 이종이다. 잘 알려지고 현재 당업자에 의해 사용되는 조절 서열이 바람직할 것이다. 이러한 조절 서열은 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩타이드 서열, 프로모터, 시그널 펩타이드 서열 및 전사 터미네이터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 최소한, 조절 서열은 프로모터 및 전사 및 번역 종결 시그널을 포함한다. 조절 서열에는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역과 조절 서열의 연결을 용이하게 하는 특정 제한 부위를 도입하기 위한 링커가 제공될 수 있다. 조절 서열과 코딩 서열의 기능적 조합은 발현 카세트로 지칭될 수 있다.
발현: 용어 "발현"은 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 변형 및 분비를 포함하나, 이에 한정되지 않는 폴리펩타이드의 생산에 수반되는 임의의 단계를 포함한다.
발현 벡터: 용어 "발현 벡터"는 본 발명의 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 이의 발현을 제공하는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 선형 또는 원형 DNA 분자를 의미한다. 이어서, 발현 벡터는 본 발명의 효소를 발현시키기에 적합한 발현 카세트를 포함한다.
단리(isolated): 용어 "단리"는 자연계에서 발생하지 않는 형태 또는 환경의 물질을 의미한다. 단리된 물질의 비-제한적인 예는 (1) 임의의 비-자연 발생 물질, (2) 자연에서 관려된 자연 발생 성분 중 1개 이상 또는 모두로부터 적어도 부분적으로 제거된, 비제한적으로 임의의 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩타이드 또는 보조 인자를 포함하는 임의의 물질; (3) 자연에서 관찰되는 물질에 비해 인간이 손을 대어 변형된 임의의 물질; 또는 (4) 자연적으로 관련된 다른 성분에 비해 물질의 양을 증가시킴으로써 변형된 임의의 물질(예를 들어, 물질을 코딩하는 다수의 카피(copy)의 유전자; 물질을 코딩하는 유전자와 자연적으로 관련된 프로모터보다 더 강력한 프로모터의 이용)을 포함한다.
재조합체(Recombinant) : 재조합체는 유전자 공학에 의해 생산된 핵산 컨스트럭트, 벡터 및 단백질을 의미한다.
이종(Heterologous): 숙주 세포, 벡터 또는 핵산 컨스트럭트의 맥락에서, 유전자 공학에 의해 숙주 세포, 벡터 또는 핵산 컨스트럭트에 도입된 효소의 코딩 서열을 지칭한다. 숙주 세포의 맥락에서, 이는 효소에 대한 코딩 서열이 도입된 세포와 다른 출처로부터 유래하거나 효소의 코딩 서열이 그것이 도입된 세포와 동일한 종으로부터 유래한다는 것을 의미한다. 도입된 것이지만 자연적인 것이 아니기 때문에, 예를 들어 천연 프로모터가 아니거나 천연 위치와 다른 위치에 도입된 프로모터의 제어하에 있기 때문에 이질적인 것으로 간주된다.
핵산 컨스트럭트: 용어 "핵산 컨스트럭트"는 단일 또는 이중 가닥의 핵산 분자를 의미하며, 자연에서 존재하지 않거나 합성된 방식의 핵산 세그먼트를 포함하도록 변형되며, 하나 이상의 조절 서열을 포함한다.
작동 가능하게 연결된 (operably linked): 용어 "작동 가능하게 연결된"은 조절 서열이 코딩 서열에 대해 적절한 위치에 배치되어, 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하는 방식을 의미한다.
과발현: 용어 과발현은 상응하는 야생형 세포에서 정상적으로 발현되는 것보다 더 큰 농도로 세포에서 핵산 또는 폴리펩타이드를 발현시키거나 발현을 유발시키는 것을 의미한다.
서열 동일성(Sequence identity): 두 아미노산 서열 간의 서열 동일성은 파라미터 "서열 동일성"에 의해 기술된다. 본 발명의 목적을 위해, 2 개의 아미노산 서열 (A) 및 (B) 사이의 "백분율(percentage) 동일성"은 비교 방법을 통해 최적의 방식으로 정렬된 2 개의 서열을 비교함으로써 결정된다. 상기 서열의 정렬은 예를 들어, Needleman-Wunsch의 글로벌 정렬을 위한 알고리즘을 사용하는 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 단백질 분석 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 보존적 아미노산 치환을 포함하는 다른 변형에 할당된 유사성 측정을 사용하여 유사한 서열을 일치시킨다. 일단 전체 정렬이 얻어지면, 동일성의 백분율은 서열 (A)와 서열 (B) 사이에서 가장 긴 서열에 포함된 잔기의 전체 수에 의해 정렬된 동일한 아미노산 잔기의 전체 수를 나눔으로써 수득할 수 있다.
서열 동일성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 결정된다. 두 아미노산 서열을 비교하기 위해, 하나를 이용할 수 있는데, 예를 들어, EMBL-EBI가 제공하는 단백질의 페어와이즈 서열 정렬을 위한 도구 "Emboss needle" 및 www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=emboss_needle&context=protein에서 하기 기본 설정을 이용하여 이용가능하다:
기본 설정: (I) Matrix : BLOSUM62, (ii) Gap open : 10, (iii) gap extend : 0.5, (iv) output format : pair, (v) end gap penalty : false, (vi) end gap open : 10, (vii) end gap extend : 0.5.
또한, 대안적으로, 서열 동일성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어 Clustal Omega를 사용하여 HHalign 알고리즘과 기본 설정을 핵심 정렬 엔진으로 사용하여 결정할 수 있다. 알고리즘은 Soding, J. (2005) 'Protein homology detection by HMM-HMM comparison'. Bioinformatics 21, 951-960, with the default settings (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)에 설명되어있다.
아미노산: 본원에서 정의된 아미노산 서열은 하기 나타낸 바와 같은 1 문자 심볼로 표시된다: A, Ala, (알라닌); R, Arg, (아르기닌); N, Asn, (아스파라긴); D, Asp, (아스파르트 산); C, Cys, (시스테인); Q, Gln (글루타민); E, Glu (글루탐산); G, Gly, (글리신); H, His (히스티딘); 나, 일 (isoleucine); L, Leu, (류신); K, Lys, (라이신); M, Met, (메티오닌); F, Phe, (페닐알라닌); P, Pro, (프롤린); S, Ser, (세린); T, Thr (트레오닌); W, Trp, (트립토판); Y, Tyr, (티로신); 및 V, Val (발린).
"본질적으로 구성된(consist essentially)"은 폴리펩타이드가 특정 서열번호를 가지며 추가적으로, 20 개 이하의 아미노산, 바람직하게는 10 개 이하의 아미노산의 변경, 즉 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 특히, 폴리펩타이드는 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 아미노산에서 변경을 가질 수 있으며, 예를 들어, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 아미노산의 치환, 삽입, 및/또는 결실을 가질 수 있다. 치환은 위치를 점유한 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미하며; 결실은 위치를 점유한 아미노산을 제거하는 것을 의미하고; 삽입은 위치를 점유한 아미노산에 인접하고 바로 이어서 아미노산을 부가하는 것을 의미한다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 보존적 치환의 예는 염기성 아미노산 (아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산 (글루탐산 및 아스파르트 산), 극성 아미노산 (글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산 (류신, 이소류신 및 발린), 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 저아미노산 (글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)의 그룹 내에 있다. 특정 활성을 일반적으로 변화시키지 않는 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 H. Neurath 및 R.L. Hill (1979, In, The Proteins, Academic Press, New York)에 기술되어있다. 일반적인 치환은 Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, LeuA al, Ala/Glu, 및 Asp/Gly를 포함한다.
대안적으로, 아미노산 변화는 폴리펩타이드의 물리-화학적 성질이 변경되는 특성을 갖는다. 예를 들어, 아미노산 변화는 폴리펩타이드의 열 안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변화 시키며, 최적의 pH를 변화시킬 수 있다. 폴리펩타이드의 필수 아미노산은 당해 기술 분야에 공지된 절차, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발 (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085)에 따라 동정될 수있다. 후자의 기술에서, 단일 알라닌 돌연변이가 분자 내의 모든 잔기에 도입되고, 생성된 돌연변이 분자는 L-티로신으로부터 4-HBA를 생산하는 능력을 테스트하여 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 확인한다. 또한, Hilton 그룹(1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708)을 참조한다. 또한, 효소 또는 다른 생물학적 상호 작용의 활성 부위는 추정 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 관련하여 핵 자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지와 같은 기술에 의해 결정된 구조의 물리적 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64를 참조한다. 또한, 필수 아미노산의 동일성은 관련 폴리펩타이드와의 정렬로부터 유추될 수 있다.
단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625에 개시된 것과 같은, 돌연변이유발, 재조합 및/또는 셔플링에 이어 관련 스크리닝 방법의 공지된 방법을 이용하여 제작 및 실시될 수 있다. 이용될 수 있는 다른 방법은 에러-프론 PCR, 파지 디스플레이(예를 들어, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/06204), 및 부위-지정 돌연변이유발(Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner ei a/., 1988, DNA 7: 127)을 포함한다. 돌연변이 유발/셔플링 방법은 고효율, 자동화된 스크리닝 방법과 결합하여 숙주 세포에 의해 발현된 복제 돌연변이 폴리펩타이드의 활성을 검출할 수 있다(Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). 당업계의 표준 방법을 사용하여, 활성 폴리펩타이드를 코딩하는 돌연변이된 DNA 분자를 숙주로부터 회수하고 신속하게 시퀀싱할 수 있다. 이들 방법은 폴리펩타이드 내의 개별 아미노산 잔기의 중요성을 신속하게 결정할 수 있게 한다.
보존(Conserved): 보존된 아미노산은 정의된 서열이 기준 서열과 정렬되고, 기준 서열의 지정된 위치에 상응하는 정의된 서열의 잔기가 기준 서열에 존재하는 잔기와 동일하다는 것을 의미한다. 정렬은 임의의 이용 가능한 방법, 특히 상술한 동일성 결정, 보다 바람직하게는 Clustal Omega에 대해 개시된 방법에 의해 수행 될 수 있다. 잔기 위치는 기준 서열에 지정된다.
정제하다 또는 정제된: 본 명세서에 사용된 용어 "정제하다", "정제된" 또는 "정제"는 예를 들어 단리 또는 분리에 의해 그의 환경으로부터 분자를 제거 또는 단리하는 것을 의미한다. "실질적으로 정제된" 분자는 이들이 결합된 다른 성분을 포함하지 않고 적어도 약 60% 유리(free), 바람직하게는 적어도 약 75% 유리, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 유리이다. 본 명세서에서 사용된 용어는 시료로부터 오염물을 제거하는 것을 의미한다. 예를 들어, 오염물의 제거로 시료 내 알칸/알켄의 백분율이 증가할 수 있다. 예를 들어, 알칸/알켄이 숙주 세포에서 생성될 때, 알칸/알켄은 숙주 세포 단백질의 제거에 의해 정제될 수 있다. 정제 후, 시료 내의 알칸/알켄의 비율이 증가된다. 용어 "정제하다", "정제된" 및 "정제"는 절대적인 순도를 요구하지 않는다. 이들은 상대적인 용어이다. 따라서, 예를 들어, 올레핀이 숙주 세포에서 생성될 때, 정제된 알칸/알켄은 다른 세포 성분(예를 들어, 핵산, 폴리펩타이드, 지질, 탄수화물 또는 다른 탄화수소)으로부터 실질적으로 분리된 것이다. 또 다른 예에서, 정제된 알칸/알켄 제제는 알칸/알켄이 발효 후에 존재할 수 있는 오염물과 같은 것이 실질적으로 없는 것이다. 일부 구현예에서, 시료의 적어도 약 50중량%(% by weight)가 알칸/알켄으로 구성되는 경우 알칸/알켄은 정제된다. 다른 구현예에서, 시료의 적어도 약 60중량%, 70중량%, 80중량%, 85%중량, 90중량%, 92중량%, 95중량%, 98중량%, 또는 99중량%가 알칸/알켄으로 구성되는 경우 올레핀은 정제된다.
지방산 탈카르복실화 효소 활성:
"지방산 탈카르복실화 효소 활성"은 지방산으로부터 카르복실산 기의 제거, 특히 알데히드 중간체없이, 말단 불포화를 도입하지 않고 직접 제거하는 것을 말한다. 지방산 탈카르복실화 활성은 당업자가 이용할 수 있는 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 보다 바람직하게는, 활성은 이하의 방법으로 측정할 수 있다.
시험 관내 효소 분석법은 적절한 용매(에탄올 또는 디메틸 술폭 사이드)에 용해된 기질 100 nmole(일반적으로 C16:0 유리 지방산), 내부 표준 물질인 C16 알칸 2 nmol, 및 정제 효소(FAD 보조 인자 함유) 5 내지 10 μg과 함께 활성 완충액 (100 mM NaCl로 50 mM Tris-HCl pH 8.2) 500 μL 또는 총 단백질 추출물을 함유한 봉인 바이알에서 반응을 실시한다. 바이알을 2000 μmole.photon.m-2.s-1의 백색광 (또는 청색 광자를 포함하는 임의의 광)의 존재하에 250 rpm의 회전 교반기로 25 ℃에서 배양한다. 농축된 소듐 하이드록사이드(10 M에서 10 μL)를 바이알에 주입하여 반응을 멈추고 시료를 얼음에서 식힌다. 탄화수소를 헥산으로 추출하고 GC-FID-MS(gas chromatography coupled to flame ionization detector and mass spectrometry)로 정량화한다.
지방산 탈카르복실화 효소 폴리펩타이드:
본 발명은 본원에서 "지방산 탈카르복실화 효소"로 지칭되는 지방산 탈카르복실화 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드에 관한 것으로, 서열번호 1, 서열번호 5 또는 서열번호 7, 바람직하게는 서열번호 1과 적어도 40%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
예를 들어, 지방산 탈카르복실화 효소는 서열번호 1, 서열번호 5 또는 서열번호 7, 바람직하게는 서열번호 1과 적어도 42%, 45%, 50% 또는 55%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
또 다른 양태에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 서열번호 1 내지 3 및 5 내지 14 중 임의의 서열과 적어도 55, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
또 다른 양태에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 서열번호 1 내지 3 및 5 내지 14 중 임의의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 서열번호 1, 5, 7 내지 14, 보다 바람직하게는 서열번호 1, 5, 및 7 중 임의의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 공통 서열 G-X1-L-(X)4-C-[D/E]-X2-G-[A/G]-F-X3-[K/R/S/E](서열번호 4)을 포함하고, X는 임의의 아미노산(서열번호 26)이다. 바람직하게는, 지방산 탈카르복실화 효소는 공통 서열 G-X1-L-(X)4-C-[D/E]-X2-G-[A/G]-F-X3-[K/R](서열번호 4)을 포함하고, X는 임의의 아미노산이다. 바람직하게는, X1은 P, L 및 G로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, (X)4는 보다 구체적으로 [T/A]-[T/S/C]-[P/T/A]-[G/A]일 수 있다. 바람직하게는, X2는 H, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, X3은 소수성 아미노산, 특히 L, V A 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되는 소수성 아미노산일 수 있다.
특정 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 공통 서열 G-X1-L-(X)4-C-[D/E]-X2-G-[A/G]-F-X3-[K/R/S/E](서열번호 26)을 포함하고, 여기에서
- X1은 P, L 및 G로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고;
- (X)4는 보다 구체적으로 [T/A]-[T/S/C]-[P/T/A]-[G/A]일 수 있으며;
- X2는 H, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 그리고
X3은 소수성 아미노산, 특히 L, V A 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되는 소수성 아미노산일 수 있다.
매우 특정 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 공통 서열 G-X1-L-(X)4-C-[D/E]-X2-G-[A/G]-F-X3-[K/R](서열번호 4)을 포함하고, 여기에서
- X1은 P, L 및 G로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고;
- (X)4는 보다 구체적으로 [T/A]-[T/S/C]-[P/T/A]-[G/A]일 수 있으며;
- X2는 H, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 그리고
- X3은 소수성 아미노산, 특히 L, V A 및 F로 이루어진 군으로부터 선택되는 소수성 아미노산일 수 있다.
또 다른 또는 추가의 바람직한 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 서열번호 1을 참조하여 보존된 아미노산을 포함한다. 서열번호 1의 참조 서열을 기준으로 하여, 서열번호 1의 잔기 C372, R391, Y406, Q426, H512 및 N515 중 1,2,3,4,5 개 또는 모든 잔기가 보존된다. 서열번호 1에서 이들 위치에 상응하는 또 다른 지방산 탈카르복실화 효소의 위치에 상응하는 잔기에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.
또 다른 또는 추가의 바람직한 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 기질, 유리 지방산이 유입될 수 있는 소수성 터널을 형성하는 영역을 포함한다. 이 영역은 서열번호 1의 391 내지 426 위치의 잔기 사이에 위치한다. 따라서, 388-428 위치 사이의 아미노산 잔기의 적어도 40%는 소수성 잔기이고, 바람직하게는 V, I, L, M, F, W, C A 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.
지방산 탈카르복실화 효소는 박테리아 또는 조류와 같은 임의의 기원이다.
바람직하게는, 지방산 탈카르복실화 효소는 조류, 바람직하게는 미세조류 또는 시아노박테리아로부터 유래된다. 예를 들어, 지방산 탈카르복실화 효소는 클로렐라, 클라미도모나스, 패오닥틸륨, 코코믹사, 볼복스, 엑토카르푸스, 에밀리아니아, 아우레오코커스, 콘드러스, 갈디에리아 또는 난노클로롭시스의 지방산 탈카르복실화 효소 활성을 갖는 GMC 산화 환원 효소이다. 많은 미세조류 종이 알려져 있으며 예를 들어 데이터베이스 AlgaeBase (www.algaebase.org/)에서 찾을 수 있다.
특정 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 클로렐라 바리아빌리스(Chlorella variabilis), 특히 클로렐라 바리아빌리스 NC64A로부터 유래한다. 또 다른 특정 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)로부터 유래된다. 또 다른 특정 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 패오닥틸륨 트리코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum)으로부터 유래된다. 또 다른 특정 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 코코믹사 수벨립소이데아(Coccomyxa subellipsoidea), 특히 코코믹사 수벨립소이데아 C-169로부터 유래한다. 또 다른 특정 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 볼복스 카테리(Volvox carteri)로부터 유래된다. 또 다른 특정 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 엑토카르푸스 실리쿨로수스(Ectocarpus siliculosus)로부터 유래된다. 또 다른 특정 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 에밀리아니아 헉슬레이(Emiliania huxleyi)로부터 유래된다. 또 다른 특정 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 아우레오코커스 아노파게페렌스(Aureococcus anophagefferens)로부터 유래된다. 또 다른 특정 구현예에서, 지방산 탈카르복실화 효소는 난노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana)로부터 유래된다.
바람직하게는, 지방산 탈카르복실화 효소는 길이가 약 750, 700, 650 또는 600 아미노산 잔기를 초과하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 지방산 탈카르복실화 효소의 아미노산 서열이 다른 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에서 융합된 하이브리드 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 지방산 탈카르복실화 효소 활성은 하이브리드 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드에 남아있다. 바람직하게는, 다른 폴리펩타이드의 영역은 지방산 탈카르복실화 효소의 N-말단에서 융합된다. 대안적으로, 다른 폴리펩타이드의 영역은 지방산 탈카르복실화 효소의 C-말단에서 융합된다. 융합 폴리펩타이드를 생산하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 효소를 코딩하는 코딩 서열 및 또 다른 폴리펩타이드의 부가 영역의 연결을 포함하여 프레임 내에 있고 융합 폴리펩타이드의 발현이 동일한 프로모터(들) 및 터미네이터의 조절하에 있게 된다. 융합 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드가 번역 후 생성되는 인테테인(intein) 기술을 사용하여 제조될 수 있다(Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
융합 폴리펩타이드의 부가 영역을 선택하여 본 발명에 따른 효소의 안정성을 향상시키고, 세포(예를 들어, 박테리아 세포 또는 효모 세포)로부터 융합 단백질의 분비(예를 들어, N-말단 소수성 시그널 펩타이드)를 촉진시키거나, 융합 단백질의 정제를 도울 수 있다. 특히, 부가 영역은 효소의 정제 또는 고정화에 유용한 태그 일 수 있다. 이러한 태그는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 His 태그 (His6), FLAG 태그, HA 태그(인플루엔자 단백질 혈구 응집소로부터 유래된 에피토프), MPB(maltose-binding protein), MYC 태그 (인간 원종양단백질 MYC로부터 유래된 에피토프), STREP 태그 또는 GST 태그 (저글루타티온-S-전이 효소)를 포함한다. 부가 영역은 티오레독신일 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 효소와 부가 영역 사이에 절단 부위를 추가적으로 포함 할 수 있다. 융합 단백질의 분비 또는 정제시, 상기 부위는 절단되어 두 개의 폴리펩타이드를 방출한다. 절단 부위의 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; and Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; and Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48에 개시된 부위를 포함한다. 예를 들어, 절단 부위는 TEV (Tobacco Etch Virus) 절단 부위일 수 있다. 다른 절단 부위는 당업자에게 잘 알려져있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 히스티딘 태그, 티오레독신, 절단 부위 및 상기 정의된 바와 같은 지방산 탈카르복실화 효소를 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 클로렐라 지방산 탈카르복실화 효소와 같은 구조에 대한 서열번호 3 참조)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 지방산 탈카르복실화 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 컨스트럭트 또는 벡터에 관한 것이다. 특히, 핵산 컨스트럭트 또는 벡터는 상기 지방산 탈카르복실화 효소를 발현시키는데 적합하다. 또한, 재조합 핵산 컨스트럭트 또는 정의된 바와 같은 지방산 탈카르복실화 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산, 재조합 핵산 컨스트럭트 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포가 제공된다.
지방산 탈카르복실화 효소 및 핵산 컨스트럭트를 코딩하는 핵산
본 발명은 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 핵산은 DNA(cDNA 또는 gDNA), RNA 또는 이들의 혼합일 수 있다. 단일 가닥 형태 또는 이중 형태 또는 이들의 혼합일 수 있다. 이는 예를 들어 변형된 결합, 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 당을 포함하는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이는 화학적 합성, 재조합 및 돌연변이유발과 같이, 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
선택적으로, 코딩 서열을 숙주 세포 발현에 맞게 최적화할 수 있다. 특히, 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소가 조류, 특히 미세조류로부터 유래되기 때문에, 효소를 코딩하는 핵산 서열은 대장균, 효모 숙주 또는 심지어 미세조류와 같은 박테리아 숙주에 대해 최적화 될 수 있으며, 이는 효소의 기원과는 다른 것이다.
또한, 본 발명은 조절 서열과 양립할 수 있는 조건하에서 적합한 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명에 따른 지방산 탈카르복실화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 컨스트럭트에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드는 지방산 탈카르복실화 효소의 발현을 제공하기 위해 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 벡터에 삽입하기 전에 조작하는 것은 발현 벡터에 따라 바람직하거나 필요할 수있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 기술은 당업계에 널리 공지되어있다.
조절 서열은 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 숙주 세포 또는 시험 관내 발현 시스템에 의해 인식되는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 지방산 탈카르복실화 효소의 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이, 절단 및 하이브리드 프로모터를 포함하는 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 숙주 세포와 동종 또는 이종의 세포외 또는 세포내 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자로부터 수득될 수 있다. 선택적으로, 프로모터는 유도성일 수 있다. 선택적으로, 프로모터는 지방산 탈카르복실화 효소의 과발현을 허용하는 강력한 프로모터이다. 선택적으로, 프로모터는 강한 유도성 프로모터이다.
박테리아 숙주 세포에서 적합한 프로모터의 예로는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 알파-아밀라아제 유전자(amyQ), 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라아제 유전자(amyL), 바실러스 리케니포르미스 페니실리나아제 유전자(penP), 바실러스 스테아로써모필루스 말토제닉 아밀라아제 유전자(amyM), 바실러스 서브틸리스 레반수크라아제(levansucrase) 유전자(sacB), 바실러스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 바실러스 투린지엔시스 cryIIIA 유전자(Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107)로부터 획득되는 프로모터, 에스케리키아 콜라이 lac 오페론, 에스케리키아 콜라이 trc 프로모터(Egon et al, 1988, Gene 69: 301-315), 스트렙토마이세스 코엘리콜라 아가라아제(agarase) 유전자(dagA) 및 원핵 베타-락타마아제(beta-lactamase) 유전자(Villa-Kamaroff et al, 1978, Proc Natl Acad Sci USA 75: 3727-3731]) 및 tac 프로모터(DeBoer et al, 1983, Proc Natl Acad Sci USA 80: 21-25)가 있다. 추가의 프로모터는 "Useful proteins from recombinant bacteria" in Gilbert et al, 1980, Scientific American 242: 74-94; 및 상기 Sambrook et al, 1989에 설명되어있다. 탠덤 프로모터의 예는 WO 99/43835호에 개시되어 있다.
사상 진균(filamentous fungal) 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 컨스트럭트의 전사를 지시하는 적합한 프로모터의 예는 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 아세트아미다아제, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라아제, 아스페르길루스 니게르 산 안정성 알파-아밀라아제, 아스페르길루스 니게르 또는 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라아제(glaA), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, 아스페르길루스 오리자에 알칼리성 프로테아제, 아스페르길루스 오리자에 트리오스 포스페이트 아이소머라아제, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 트립신-유사 프로테아제(WO 96/00787호), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) 아밀로글루코시다아제(WO 00/56900호), 푸사리움 베네나툼 다리아(Daria)(WO 00/56900호), 푸사리움 베네나툼 퀸(Quinn)(WO 00/56900호), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 리파아제, 리조무코르 미에헤이 아스파르트산 프로테이나아제, 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei) 베타-글루코시다아제, 트리코데르마 리세이 셀로비오히드롤라아제 I, 트리코데르마 리세이 셀로비오히드롤라아제 II, 트리코데르마 리세이 엔도글루카나아제 I, 트리코데르마 리세이 엔도글루카나아제 II, 트리코데르마 리세이 엔도글루카나아제 III, 트리코데르마 리세이 엔도글루카나아제 IV, 트리코데르마 리세이 엔도글루카나아제 V, 트리코데르마 리세이 자일라나아제 I, 트리코데르마 리세이 자일라아나제 II, 트리코데르마 리세이 베타-자일로시다아제 및 NA2-tpi 프로모터(비번역 리더(leader)가 아스페르길루스 트리오스(Aspergillus triose) 포스페이트 아이소머라아제 유전자 유래의 비번역 리더에 의해 대체되는 아스페르겔루스 중성 알파-아밀라아제 유전자 유래의 변형된 프로모터)이며; 비제한적인 예에는 비번역 리더가 아스페르길루스 니둘란스 또는 아스페르길루스 오리자에 트리오스 포스페이트 아이소머라아제 유전자 유래의 비번역 리더에 의해 대체되는 아스페르길루스 니게르 중성 알파-아밀라아제 유전자 유래의 변형된 프로모터; 및 이의 돌연변이형, 절단형 및 하이브리드 프로모터가 포함된다.
효모 숙주에서, 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 엔올라아제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지애 갈락토키나아제(GAL1), 사카로마이세스 세레비지애 알콜 탈수소효소/글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(ADH1, ADH2/GAP), 사카로마이세스 세레비지애 트리오스 포스페이트 아이소머라아제(TPI), 사카로마이세스 세레비지애 메탈로티오네인(CUP1), 및 사카로마이세스 세레비지애 3-포르포글리세레이트 키아나제에 대한 유전자로부터 획득된다. 효모 숙주 세포에 대한 다른 유용한 프로모터는 Romanos et al, 1992, Yeast 8: 423-488에 의해 기술된다.
유도성 프로모터는 예를 들어, 광 강도 또는 고온 또는 저온에 반응할 수 있고/있거나 특정 화합물에 반응할 수 있다. 유도성 프로모터는 예를 들어, 호르몬-반응성 프로모터(예를 들어, US 6,379,945에 기재된 것과 같은 엑디 존-반응성 프로모터), 메탈로티오니엔 프로모터(US 6,410,828), 살리실산, 에틸렌, 티아민 및/또는 BTH(US 5,689,044) 등과 같은 화학 물질, 또는 이들의 조합에 반응할 수 있는 PR(pathogenesis-related) 프로모터일 수 있다. 또한, 유도성 프로모터는 광 또는 암(US 8,318,482; US 5,750,385; US 5,639,952), 금속(Eukaryotic Cell 2:995-1002 (2003)) 또는 온도(US 5,447,858; Abe et al. Plant Cell Physiol. 49: 625-632 (2008); Shroda et al. Plant J. 21: 121-131 (2000)에 반응할 수 있다. 상술한 실시예들은 이용될 수 있는 프로모터의 유형 또는 특정 프로모터를 제한하지 않는다. 프로모터 서열은 숙주 생물에서 기능적이면 모든 유기체로부터 제공될 수 있다. 특정 구현예에서, 유도성 프로모터는, 공지된 유도성 프로모터로부터의 하나 이상의 부분 또는 도메인을, 숙주 세포에서 작동할 수 있는 상이한 프로모터의 적어도 일부에 융합시킴으로써 형성되며, 예를 들어 숙주 종에서 작동하는 프로모터에 유도성을 부여하는 것이다.
당업계의 숙련자는 다양한 공지된 프로모터 서열이 미세조류 종에 대해 유용하게 배치될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다. 예를 들어, 미세조류에서 도입 유전자 발현을 유도하기 위해 통상적으로 사용되는 프로모터는 와편모조류 및 녹조류 모두에서 사용된 CaMV35S(cauliflower mosaic virus promoter 35S)의 다양한 버전을 포함한다(Chow et al, Plant Cell Rep., 18:778-780, 1999; Jarvis and Brown, Curr. Genet., 317-321, 1991; Lohuis and Miller, Plant J., 13:427-435, 1998). 또한, 시미안 바이러스로부터의 SV40 프로모터는 몇몇 조류에서 활성이 있다고 보고되어있다(Gan et al., J. Appl. Phycol., 151 345-349, 2003; Qin et al, Hydrobiologia 398-399, 469-472, 1999). 또한, 클라미도모나스의 RBCS2(ribulose bisphosphate carboxylase, small subunit)(Fuhrmann et al, Plant J., 19:353-361, 1999) 및 PsaD(abundant protein of photosystem I complex; Fischer and Rochaix, FEBS Lett. 581:5555-5560, 2001)의 프로모터가 유용할 수 있다. 또한, HSP70A/RBCS2 및 HSP70A/p2TUB(tubulin)(Schroda et al, Plant J., 21: 121-131, 2000)의 융합 프로모터는, HSP70A 프로모터가 다른 프로모터의 업스트림에 위치할 때 전사 활성화제로서 작용할 수 있어, 전이유전자(transgenes)의 개선된 발현에 유용할 수 있다. 또한, 목적 유전자의 고발현은, 예를 들어, 규조 종의 경우, 규조 푸코산틴-클로로필 a/b 결합 단백질을 코딩하는 fcp 유전자(Falciatore et al, Mar. Biotechnol, 1:239-251, 1999; Zaslavskaia et al, J. Phycol. 36:379-386, 2000) 또는 진안점조류 비올라크산틴-클로로필 a/b 결합 단백질을 코딩하는 vcp 유전자(U.S. 8,318,482 참조)의 프로코터의 존재 하에서 달성될 수 있다. 필요한 경우, 유도성 프로모터는 형질전환 미세조류에서 유전자의 신속하고 단호하게 조절된 발현을 제공할 수 있다. 예를 들어, 질산 환원 효소를 코딩하는 NR 유전자의 프로모터 영역이 이러한 유도성 프로모터로서 사용될 수 있다. NR 프로모터 활성은 전형적으로 암모늄에 의해 억제되고 암모늄이 질산염으로 대체될 때 유도되므로(Poulsen and Kroger, FEBS Lett 272 : 3413-3423, 2005), 따라서 미세조류 세포를 암모늄/질산염의 존재하에서 배양하는 경우 유전자 발현을 끄거나 켤 수 있다. 다양한 조류 프로모터가 공지되어 있으며, US 2013/0023035; US 2013-0323780, US 2014-0154806; 및 US 2014-0363892에 개시된 것들을 포함하여 이용될 수 있다.
조절 서열은 또한 전사를 종결시키는, 숙주 세포에 의해 인식되는 전사 종결자일 수 있다. 종결자는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 작동가능하게 연결된다. 본 발명에서 숙주 세포에서 기능성인 임의의 종결자가 사용될 수 있다.
박테리아 숙주 세포에 바람직한 종결자는 바실러스 클라우시이 알칼리성 프로테아제(aprH), 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라아제(amyL) 및 에스케리키아 콜라이 리보솜 RNA(rrnB)에 대한 유전자로부터 획득된다.
사상 진균 숙주 세포에 바람직한 종결자는 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신타아제, 아스페르길루스니게르 글루코아밀라아제, 아스페르길루스 니게르 알파-글루코시다아제, 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라아제 및 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제에 대한 유전자로부터 획득된다.
효모 숙주 세포에 바람직한 종결자는 사카로마이세스 세레비지애 에놀라아제, 사카로마이세스 세레비지애 사이토크롬 C(CYC1) 및 사카로마이세스 세레비지애 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소에 대한 유전자로부터 획득된다. 효모 숙주 세포에 대한 다른 유용한 종결자는 상기 Romanos et al, 1992에 의해 기술된다.
또한, 조절 서열은 프로모터의 다운스트림 및 유전자의 코딩 서열의 업스트림 mRNA 안정화 영역일 수 있으며, 이는 유전자의 발현을 증가시킨다.
적합한 mRNA 안정화 영역의 예는 바실러스 투린지엔시스 cryIIIA 유전자(WO 94/25612) 및 바실러스 서브틸리스 SP82 유전자(Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471)로부터 획득된다.
또한, 조절 서열은 리더, 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비번역 영역일 수 있다. 리더 서열은 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드의 5'-말단에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포에서 기능성인 임의의 리더가 사용될 수 있다.
사상 진균 숙주 세포에 바람직한 리더는 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라아제 및 아스페르길루스 니둘란스 트리오스 포스페이트 아이소머라아제에 대한 유전자로부터 획득된다.
효모 숙주 세포에 적합한 리더는 사카로마이세스 세레비지애 에놀라아제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지애 3-포스포글리세레이트 키나아제, 사카로마이세스 세레비지애 알파-인자, 및 사카로마이세스 세레비지애 알콜 탈수소효소/글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(ADH2/GAP)에 대한 유전자로부터 획득된다.
또한, 조절 서열은 폴리아데닐화 서열, 변이체-코딩 서열의 3'-말단에 작동가능하게 연결되고, 전사되는 경우, 전사 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 부가하기 위한 신호로서 숙주 세포에 의해 인지되는 서열일 수 있다. 숙주 세포에서 기능성인 임의의 폴리아데닐화 서열이 사용될 수 있다.
사상 진균 숙주 세포에 바람직한 폴리아데닐화 서열은 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신타아제, 아스페르길루스 니게르 글루코아밀라아제, 아스페르길루스 니게르 알파-글루코시다아제, 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라아제, 및 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제에 대한 유전자로부터 획득된다.
효모 숙주 세포에 유용한 폴리아데닐화 서열은 Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990에 의해 기술된다.
또한, 조절 서열은 지방산 탈카르복실화 효소의 N-말단에 연결되는 신호 펩타이드를 코딩하고, 지방산 탈카르복실화 효소를 세포의 분비 경로로 지시하는 시그널 펩타이드 코딩 영역일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 서열의 5'-말단은 지방산 탈카르복실화 효소를 코딩하는 코딩 서열의 세그먼트와, 번역 리딩 프레임으로 자연적으로 연결되어 있는 시그널 펩타이드 코딩 서열을 본래부터 함유할 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열의 5'-말단은 코딩 서열에 외래인 시그널 펩타이드 코딩 서열을 함유할 수 있다. 외래 시그널 펩타이드 코딩 서열은 코딩 서열이 시그널 펩타이드 코딩 서열을 자연적으로 함유하지 않는 경우에 필요할 수 있다. 대안적으로, 외래 시그널 펩타이드 코딩 서열은 폴리펩타이드의 분비를 향상시키기 위해서 자연 시그널 펩타이드 코딩 서열을 단순히 대체할 수 있다. 그러나, 발현된 폴리펩타이드를 숙주 세포의 분비 경로로 지시하는, 임의의 시그널 펩타이드 코딩 서열이 사용될 수 있다. 또한, 시그널 펩타이드는 엽록체 전이 펩타이드, 지방산 탈카르복실화 효소의 엽록체 전이 펩타이드 또는 임의의 다른 엽록체 전이 펩타이드일 수 있다.
박테리아 숙주 세포에 효과적인 시그널 펩타이드 코딩 서열은 바실러스 NCIB 11837 말토제닉 아밀라아제, 바실러스 리케니포르미스 서브틸리신, 바실러스 리케니포르미스 베타-락타마아제, 바실러스 스테아로써모필루스 알파-아밀라아제, 바실러스 스테아로써모필루스 중성 프로테아제(nprT, nprS, nprM) 및 바실러스 서브틸리스 prsA이다. 추가적인 시그널 펩타이드는 Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137에 의해 기술되어 있다.
사상 진균 숙주 세포에 효과적인 시그널 펩타이드 코딩 서열은 아스페르길루스 니게르 중성 아밀라아제, 아스페르길루스 니게르 글루코아밀라아제, 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라아제, 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 셀룰라아제, 휴미콜라 인솔렌스 엔도글루카나아제 V, 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 리파아제 및 리조무코르 미에헤이 아스파르트산 프로테이나아제에 대한 유전자로부터 획득되는 시그널 펩타이드 코딩 서열이다.
효모 숙주 세포에 유용한 신호 펩타이드는 사카로마이세스 세레비지애 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비지애 인버타아제(invertase)에 대한 유전자로부터 획득된다. 다른 유용한 시그널 펩타이드 코딩 서열은 상기 Romanos et al., 1992에 기술되어 있다.
또한, 숙주 세포의 성장에 대하여 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 조절 서열을 부가하는 것이 바람직할 수 있다. 조절 시스템의 예는 조절 화합물의 존재를 포함하는 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 유전자의 발현이 턴 온(turn on)되거나 턴 오프(turn off)되게 하는 것이다. 원핵 시스템 내 조절 시스템은 lac, tac, 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함한다. 효모에서, ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템이 사용될 수 있다. 사상 진균에서, 아스페르길루스 니게르 글루코아밀라아제 프로모터, 아스페르길루스 오리자에 TAKA 알파-아밀라아제 프로모터 및 아스페르길루스 오리자에 글루코아밀라아제 프로모터가 사용될 수 있다. 조절 서열의 다른 예는 유전자 증폭을 가능하게 하는 것이다. 진핵 시스템에서, 이들 조절 서열은 메토트렉세이트의 존재 하에서 증폭되는 디히드로폴레이트 환원효소 유전자, 및 중금속과 함께 증폭되는 메탈로티오네인 유전자를 포함한다. 이들 경우에, 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 조절 서열과 작동가능하게 연결될 것이다.
발현 벡터
또한, 본 발명은 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 다양한 뉴클레오티드 및 조절 서열은 함께 결합되어 1개 이상의 편리한 제한 부위를 포함할 수 있는 재조합 발현 벡터를 생성하여, 이러한 부위에서 지방산 탈카르복실화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입 또는 치환을 가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 컨스트럭트를 발현에 적절한 벡터에 삽입함으로써 발현될 수 있다.
발현 벡터의 생성에 있어서, 코딩 서열은 벡터에 위치되어 코딩 서열이 발현을 위한 적절한 조절 서열과 작동가능하게 연결되게 한다.
재조합 발현 벡터는 편리하게 재조합 DNA 과정으로 처리될 수 있고 폴리뉴클레오티드의 발현을 초래할 수 있는 임의의 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터와 벡터가 도입되어야 하는 숙주 세포의 양립가능성에 좌우될 것이다. 벡터는 선형 또는 폐환 플라스미드일 수 있다.
벡터는 자가 복제 벡터, 즉 그 복제가 염색체 복제에 독립적인 염색체외 엔티티(entity), 예컨대 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체로서 존재하는 벡터일 수 있다. 이 벡터는 자가-복제를 보장하기 위한 임의의 수단을 함유할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포에 도입되었을 때 게놈에 통합되어 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 또한, 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주 세포의 게놈에 도입될 전체 DNA를 함께 함유하는 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포존이 사용될 수 있다.
벡터는 바람직하게는 형질전환되거나, 트랜스펙션되거나, 형질도입된 등의 세포의 용이한 선택을 가능하게 하는 1개 이상의 선택가능한 마커를 함유한다. 선택가능한 마커는 그 산물이 살균 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 영양 요구 균주에 대한 독립영양성 등을 제공하는 유전자이다.
박테리아의 선택가능한 마커의 예는 바실러스 리케니포르미스 또는 바실러스 서브틸리스 유전자, 또는 항생제 내성, 예를 들어 앰피실린, 클로람페니콜, 카나마이신, 네오마이신, 스펙티노마이신 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 마커이다. 효모 숙주 세포에 적합한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 사상 진균 숙주 세포에서의 사용을 위한 선택가능한 마커는, 제한되는 것은 아니지만, amdS(아세트아미다아제), argB(오르니틴 카르바모일트랜스퍼라아제), bar(포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제), hph(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제) niaD(질산염 환원효소), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 데카르복실라아제), sC(술페이트 아데닐트랜스퍼라아제), 및 trpC(안트라닐레이트 신타아제) 및 그들의 동등물을 포함한다. 아스페르길루스 니둘란스 또는 아스페르길루스 오리자에 amdS 및 pyrG 유전자, 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus) bar 유전자는 아스페르길루스 세포에서 사용하기에 바람직하다.
벡터는 바람직하게는 숙주 세포의 게놈으로의 벡터의 통합 또는 세포에서의 게놈과 독립적인 벡터의 자가 복제를 가능하게 하는 요소(들)를 함유한다.
숙주 세포 게놈으로의 통합을 위해, 게놈으로의 서열의 통합은 상동성 또는 비상동성 재조합에 의존할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 염색체(들)의 정확한 위치(들)에서 숙주 세포의 게놈으로의 상동성 재조합에 의한 통합을 지시하기 위한 추가의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 정확한 위치에서의 통합 가능성을 증가시키기 위해서, 통합 요소는 상응하는 표적 서열과 높은 정도의 동일성을 가지는 충분한 개수의 핵산, 예를 들어 100 내지 10,000개 염기쌍, 바람직하게는 400 내지 10,000개 염기쌍, 800 내지 10,000개 염기쌍을 함유해야 하며, 이로써 상동성 재조합의 가능성이 증진된다. 통합 요소는 숙주 세포의 게놈에서 표적 서열과 상동성인 임의의 서열일 수 있다.
추가로, 통합 요소는 비-코딩 또는 코딩 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 반면에, 벡터는 비-상동성 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있다.
자가 복제를 위해, 벡터는 대상 숙주 세포에서 벡터가 자가 복제할 수 있도록 하는 복제 원점을 더 포함할 수 있다. 복제 원점은 세포에서 기능하는 자가 복제를 매개하는 임의의 플라스미드 레플리케이터(replicator)일 수 있다. 용어 "복제 원점" 또는 "플라스미드 레플리케이터"는 플라스미드 또는 벡터가 생체 내에서 복제되게 하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 박테리아 복제 원점의 예에는 에스케리키아 콜라이에서 복제를 가능하게 하는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177 및 pACYC184의 복제 원점, 및 바실러스에서 복제를 가능하게 하는 pUB110, pE194, pTA1060 및 pAMβ1의 복제 원점이 있다. 효모 숙주 세포에서 사용하기 위한 복제 원점의 예에는 2 미크론 복제 원점, ARS1, ARS4, ARS1 및 CEN3의 조합, 및 ARS4 및 CEN6의 조합이 있다. 사상 진균 세포에서 유용한 복제 원점의 예에는 AMA1 및 ANS1(Gems et al., 1991, Gene 98: 61 -67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883)이 있다. AMA1 유전자의 단리 및 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터의 구축은 WO 00/24883에 개시된 방법에 따라 달성될 수 있다.
1 카피 초과의 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 폴리펩타이드의 생성을 증가시키기 위해 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 카피수의 증가는 적어도 1개의 추가의 카피의 서열을 숙주 세포 게놈 내로 통합시킴으로써 또는 증폭가능한 선택가능 마커 유전자를 폴리뉴클레오티드에 포함시킴으로써 획득될 수 있으며, 여기서, 증폭된 카피의 선택가능한 마커 유전자를 함유하는 세포 및 이에 따라 추가의 카피의 폴리뉴클레오티드는 적절한 선택가능한 작용제의 존재 하에 세포를 배양함으로써 선택될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터를 구축하기 위한 상기 기술된 요소를 라이게이션시키기 위해 사용되는 절차는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 상기 Sambrook et al., 1989 참조).
숙주 세포
본 발명은 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소를 발현하는 재조합 숙주 세포, 보다 특히 알칸/알켄을 생성하도록 조작된 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 재조합 숙주 세포는 내인성 지방산 탈카르복실화 효소를 발현하거나 과발현(예를 들어 강력한 이종 프로모터에 의한 발현 조절 및/또는 세포 내의 지방산 탈카르복실화 효소를 코딩하는 유전자 수의 증가에 의해)될 수 있다. 대안적으로, 재조합 숙주 세포는 본 발명의 이종 지방산 탈카르복실화 효소를 발현할 수 있다. 추가 또는 다른 대안으로, 재조합 숙주 세포는 지방산의 생산을 증가시키거나 우선적인 지방산의 생산을 촉진하도록 유전적으로 조작된다. 예를 들어, 숙주 세포는 지방산 탈카르복실화 효소가 유래한 것과 상이한 종의 박테리아(광합성 박테리아 포함), 사상 진균, 효모 또는 미세조류일 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소의 생산을 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명에 따른 지방산 탈카르복실화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 컨스트럭트 또는 벡터는 숙주 세포에 도입되어 컨스트럭트 또는 벡터가 앞서 설명된 바와 같은 염색체 통합물로서 또는 자가-복제 염색체외 벡터로서 유지되게 한다.
용어 "숙주 세포"는 복제 동안 일어나는 돌연변이에 기인하여 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 폴리펩타이드 및 이의 공급원을 코딩하는 유전자에 크게 좌우될 것이다.
숙주 세포는 지방산 탈카르복실화 효소의 재조합 생성에 유용한 임의의 세포, 예를 들어, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
원핵 숙주 세포는 임의의 그램-양성 또는 그램-음성 박테리아일 수 있다. 그램-양성 박테리아에는 바실러스, 클로스트리듐, 엔테로코커스, 게오바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 오세아노바실러스, 스타필로코커스, 스트렙토코커스 및 스트렙토마이세스가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 그램-음성 박테리아에는 캄필로박터, 에스케리키아 콜라이, 플라보박테리움, 푸소박테리움, 헬리코박터, 일리오박터, 네이세리아, 슈도모나스, 살모넬라 및 유레아플라스마가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 박테리아 숙주 세포는 바실러스 알칼로필러스, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스, 바실러스 브레비스, 바실러스 서큘란스, 바실러스 클라우시이, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 퍼무스, 바실러스 라우투스, 바실러스 렌투스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀러스, 바실러스 스테아로써모필루스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 투린지엔시스 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 바실러스 세포일 수 있다. 또한, 박테리아 숙주 세포는 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 유베리스(Streptococcus uberis) 및 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi) 및 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(Zooepidemicus) 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 스트렙토코커스 세포일 수 있다. 박테리아 숙주 세포는 또한 스트렙토마이세스 아크로모게네스(Streptomyces achromogenes), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 코엘리콜라, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는 스트렙토마이세스 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 시아노박테리아이다. 시아노박테리애는 시네코코커스, 시네코시스티스, 아나베나, 스피룰리나 속(genera)의 종을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
바실러스 세포로의 DNA의 도입은, 원형질체 형질전환(예를 들어, Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115 참조), 컴피턴트(competent) 세포 형질전환(예를 들어, Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, 또는 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221 참조), 전기천공법(예를 들어, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751 참조), 또는 컨쥬게이션(예를 들어, Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278 참조)에 의해 달성될 수 있다. 대장균 세포로의 DNA의 도입은 원형질체 형질전환(예를 들어, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580 참조) 또는 전기천공법(예를 들어, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145 참조)에 의해 달성될 수 있다. 스트렙토마이세스 세포로의 DNA의 도입은 원형질체 형질전환, 전기천공법(예를 들어, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405 참조), 컨쥬게이션(예를 들어, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585 참조) 또는 형질도입(예를 들어, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294 참조)에 의해 달성될 수 있다. 슈도모나스 세포로의 DNA의 도입은 전기천공법(예를 들어, 문헌[Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397] 참조) 또는 컨쥬게이션(예를 들어, Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57 참조)에 의해 달성될 수 있다. 스트렙토코커스 세포로의 DNA의 도입은 자연 수용능(예를 들어, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297 참조), 원형질체 형질전환(예를 들어, Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207 참조), 전기천공법(예를 들어, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804 참조) 또는 컨쥬게이션(예를 들어, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436 참조)에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 숙주 세포로 DNA를 도입하기 위한 본 발명이 속하는 분야에 알려져 있는 임의의 방법이 사용될 수 있다.
숙주 세포는 또한 포유동물, 곤충, 식물 또는 진균 세포와 같은 진핵생물일 수 있다.
숙주 세포는 진균 세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "진균"은 자낭균문, 담자균문, 통곰팡이문 및 접합균문뿐 아니라 난균문 및 모든 불완전 진균류를 포함한다(Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK에 정의됨). 진균 숙주 세포는 효모 세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "효모"는 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes))에 속하는 효모를 포함한다. 효모의 분류는 장래에 변화할 수도 있기 때문에, 본 발명의 목적을 위해, 효모는 Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)에 설명된 바와 같이 정의될 것이다. 효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 또는 야로위아(Yarrowia) 세포, 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 도우글라시이(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포일 수 있다. 진균 숙주 세포는 사상 진균 세포일 수 있다. "사상 진균"은 진균문 및 난균문 아문의 모든 사상 형태를 포함한다(상기 Hawksworth et al., 1995에 정의된 바와 같음). 사상 진균은 일반적으로, 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난 및 그 밖의 복합 다당류로 이루어진 균사 벽을 특징으로 한다. 사상 진균 숙주 세포는 아크레모늄(Acremonium), 아스페르길루스, 아우레오바시듐(Aureobasidium), 비어칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코프리누스(Coprinus), 코리올루스(Coriolus), 크립코코커스(Cryptococcus), 필리바시듐(Filibasidium), 푸사리움, 휴미콜라, 마그나포르테(Magnaporthe), 무코르(Mucor), 마이셀리옵토라, 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움, 파네로차에테(Phanerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 플레우로투스(Pleurotus), 스키조필룸(Schizophyllum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트라메테스(Trametes) 또는 트리코데르마 세포일 수 있다. 예를 들어, 사상 진균 숙주 세포는 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 야포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 오리자에, 비어칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에나(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 서브루파(Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 서브베르미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 크리소스포리움 이놉스(Chrysosporium inops), 크리소스포리움 케라티노필룸(Chrysosporium keratinophilum), 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 크리소스포리움 메르다리움(Chrysosporium merdarium), 크리소스포리움 판니콜라(Chrysosporium pannicola), 크리소스포리움 퀸스란디쿰(Chrysosporium queenslandicum), 크리소스포리움 트로피쿰(Chrysosporium tropicum), 크리소스포리움 조나툼(Chrysosporium zonatum), 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리올루스 히르수투스(Coriolus hirsutus), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크루크웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사로크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 설푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 무코르 미에헤이, 마이셀리옵토라 써모필라, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 파네로차에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 플레비아 라디아타(Phlebia radiata), 플레우로투스 에린지이(Pleurotus eryngii), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor), 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌지이(Trichoderma koningii), 트리코데르마 론지브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 리세이 또는 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 세포일 수 있다.
진균 세포는 공지된 방식 그대로 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환, 및 세포벽의 재생을 수반하는 과정에 의해 형질전환될 수 있다. 아스페르길루스 및 트리코데르마 숙주 세포의 형질전환에 적합한 방법은 EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474 및 Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422에 기술되어 있다. 푸사리움 종의 형질전환을 위한 적합한 방법은 Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 및 WO 96/00787에 기술되어 있다. 효모는 Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; 및 Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920에 의해 기술된 절차를 사용하여 형질전환될 수 있다.
또한, 세포는 포유류 세포, 예를 들어 COS, CHO(US 4,889,803; US 5,047,335)일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 비-인간 및 비-배아이다. 또한, 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소는 인간이 아닌 형질 전환 동물, 예를 들어 동물에 의해 생산된 우유에서 생산될 수 있다.
본 발명의 방법에 적합한 조류 종은, 예를 들어, 아크난데스(Achnanthes), 암피프로라(Amphiprora), 암포라(Amphora), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus), 아스테로모나스(Asteromonas), 아우란티오키트리움(Aurantiochytrium), 보에켈로비아(Boekelovia), 볼리도모나스(Bolidomonas), 보로디넬라(Borodinella), 보트리디움(Botrydium), 보트리오코커스(Botryococcus), 브락테오코쿠스(Bracteococcus), 챠에토세로스(Chaetoceros), 카르테리아(Carteria), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 클로로코쿰(Chlorococcum), 클로로고늄(Chlorogonium), 클로넬라(Chlorella), 크로모나스(Chroomonas), 크리소스파에라(Chrysosphaera), 크리코스파에라(Cricosphaera), 크립테코디늄(Crypthecodinium), 크립토모나스(Cryptomonas), 사이클로텔라(Cyclotella), 데스모데스무스(Desmodesmus), 두날리엘라(Dunaliella), 엘립소이돈(Ellipsoidon), 에밀리아니아(Emiliania), 에레모스파에라(Eremosphaera), 에르노데스미우스(Ernodesmius), 유글레아(Euglena), 유스티그마토스(Eustigmatos), 프란세이아(Franceia), 프라길라리아(Fragilaria), 프라길라롭시스(Fragilaropsis), 글로에오탐니온(Gloeothamnion), 고니움(Gonium), 하에마토코쿠스(Haematococcus), 한츠치아(Hantzschia), 헤테로시그마(Heterosigma), 히메노모나스(Hymenomonas), 아이소크리시스(Isochrysis), 레포신클리스(Lepocinclis), 로보스파에라(Lobosphaera), 마이크락티늄(Micractinium),
마이크라스테리아스(Micrasterias), 모노두스(Monodus), 모노라피듐(Monoraphidium), 난노클로리스(Nannochloris), 난노클롭시스(Nannochloropsis),나비쿨라(Navicula), 네오클로리스(Neochloris), 네프로클로리스(Nephrochloris), 네프로셀미스(Nephroselmis), 니츠치아(Nitzschia), 오크로모나스(Ochromonas), 오에도고늄(Oedogonium), 오오시스티스(Oocystis), 오스트레오코쿠스(Ostreococcus),판도리나(Pandorina), 파라클로렐라(Parachlorella), 파리에토클로리스(Parietochloris), 파리에티키트리움(Parietichytrium), 파스케리아(Pascheria), 파블로바(Pavlova), 페라고모나스(Pelagomonas), 파이오닥틸륨(Phaiodactylum), 파구스(Phagus), 피코클로룸(Picochlorum), 플라티모나스(Platymonas), 플루로크리시스(Pleurochrysis), 플루로코코스(Pleurococcus), 프로토쎄카(Prototheca), 슈도클로렐라(Pseudochlorella), 슈도코리시스티스(Pseudochoricystis), 슈도네오클로리스(Pseudoneochloris), 슈도스타우라스트륨(Pseudostaurastrum), 피라미모나스(Pyramimonas), 피로보트리스(Pyrobotrys), 세네데스무스(Scenedesmus), 스키초클라미델라(Schizochlamydella), 스키초키트리움(Schizochytrium), 스켈레토네마(Skeletonema), 스피로기라(Spyrogyra), 스티코코쿠스(Stichococcus), 테트라클로렐라(Tetrachlorella), 테트라셀미스(Tetraselmis), 탈라시오시라(Thalassiosira), 트라우토키트리움(Thrautochytrium), 트리보네마(Tribonema), 울바(Ulva), 바우케리아(Vaucheria), 비리디엘라(Viridiella), 비스케리아(Vischeria), 또는 볼복스(Volvox) 속의 종을 포함한다. 특히 적합한 종의 비-제한적인 예는, 예를 들어, 암포라, 챠에토세로스, 사이클로텔라, 피스툴리페라(Fistulifera), 프라길라리아, 프라길라롭시스, 나비쿨라, 니츠치아(Nitzschia), 파에오닥틸륨(Phaeodactylum), 슈도-니트치아(Pseudo-nitzia), 또는 탈라시오시라, 또는 유스티그마토피테스(eustigmatophytes), 예를 들어, 유스티그마토스, 모노두스, 난노클롭시스, 또는 비스케리아 속의 임의의 종을 포함한다.
보다 구체적으로, 이용될 수 있는 미세조류는, 아크난데스 오리엔탈리스(Achnanthes orientalis), 아그메넬룸(Agmenellum), 암피프로라 하이알린(Amphiprora hyaline), 암포라 코페이포미스(Amphora coffeiformis), 암포라 코페이포미스 리네아(Amphora coffeiformis linea), 암포라 코페이포미스 펑타타(Amphora coffeiformis punctata), 암포라 코페이포미스 테일로리(Amphora coffeiformis taylori), 암포라 코페이포미스 테누스(Amphora coffeiformis tenuis), 암포라 델리카티시마(Amphora delicatissima), 암포라 델리카티시마 카피타타(Amphora delicatissima capitata), 암포라 속(Amphora sp), 아나해나(Anahaena), 아나배나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus), 안키스트로데스무스 팔카투스(Ankistrodesmus jalcatus), 보에켈로비아 후글란디(Boekelovia hooglandii), 보로디넬라 속(Borodinella sp), 보트라이오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 보트라이오코커스 스데티쿠스(Botryococcus sudeticus), 브락테오코커스 마이너(Bracteococcus minor), 브락테오코커스 데미오누클레아투스(Bracteococcus medionucleatus), 카르테리아(Carteria), 캐토세로스 그라실리스(Chaetoceros gracilis), 캐토세로스 무엘러리(Chaetoceros muelleri), 캐토세로스 무엘러리 서브살숨(Chaetoceros muelleri subsalsum), 캐토세로스 속(Chaetoceros sp), 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii), 클라미도모나스 모에우시(Chlamydomonase moewusi), 클라미도모나스 니바리스(Chlamydomonas nivalis), 클라미도모나스 코다테(Chlamydomonas caudate), 클로렐라 아니트라타(Chlorella anitrata), 클로렐라 안탁티카(Chlorella Antarctica), 클로렐라 오레오비리디스(Chlorella aureoviridis), 클로렐라 칸디다(Chlorella candida), 클로렐라 캡슐레이트(Chlorella capsulate), 클로렐라 데시케이트(Chlorella desiccate), 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 에머소니(Chlorella emersonii), 클로렐라 푸스카(Chlorella fusca), 클로렐라 푸스카 변종 바큐오라타(Chlorella fusca var. vacuolata), 클로렐라 글루코트로파(Chlorella glucotropha), 클로렐라 인퓨지오눔(Chlorella infusionum), 클로렐라 인퓨지오눔 변종 악토필라(Chlorella infusionum var. actophila), 클로렐라 인퓨지오눔 변종 악세노필라(Chlorella infusionum var auxenophila), 클로렐라 케슬러리(Chlorella kessleri), 클로렐라 로보포라(Chlorella lobophora)(균주 SAG 37.88), 클로렐라 루테오비리디스(Chlorella luteoviridis), 클로렐라 루테오비리디스 변종 아우레오비리디스(Chlorella luteoviridis var aureoviridis), 클로렐라 루테오비리디스 변종 루테센스(Chlorella luteoviridis var lutescens), 클로렐라 미니아타(Chlorella miniata), 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 무타빌리스(Chlorella mutabilis), 클로렐라 녹투나(Chlorella nocturna), 클로렐라 파바(Chlorella parva), 클로렐라 포토필라(Chlorella photophila), 클로렐라 프링세이미(Chlorella pringsheimii), 클로렐라 프로토테코이데스 변종 아시디콜라(Chlorella protothecoides var acidicola), 클로렐라 레글라리스(Chlorella regularis), 클로렐라 레글라리스 변종 미니마(Chlorella regularis var minima), 클로렐라 레글라리스 변종 엄브리카타(Chlorella regularis var umbricata), 클로렐라 레이시글라이(Chlorella reisiglii), 클로렐라 사카로필라(Chlorella saccharophila), 클로렐라 사카로필라 변종 엘립소이데아(Chlorella saccharophila var ellipsoidea), 클로렐라 살리나(Chlorella salina), 클로렐라 심플렉스(Chlorella simplex), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 속(Chlorella sp), 클로렐라 스패리카(Chlorella sphaerica), 클로렐라 스티그마토포라(Chlorella stigmatophora), 클로렐라 바리아빌리스(Chlorella variabilis), 클로렐라 반니엘리(Chlorella vanniellii), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 불가리스 품종 테르티아(Chlorella vulgaris f. tertia), 클로렐라 불가리스 변종 오토트로피카(Chlorella vulgaris var autotrophica), 클로렐라 불가리스 변종 비리디스(Chlorella vulgaris var viridis), 클로렐라 불가리스 변종 불가리스(Chlorella vulgaris var vulgaris), 클로렐라 불가리스 변종 불가리스 품종 테르티아(Chlorella vulgaris var vulgaris f tertia), 클로렐라 불가리스 변종 불가리스 품종 비리디스(Chlorella vulgaris var vulgaris f. viridis), 클로렐라 잔텔라(Chlorella xanthella), 클로렐라 조핀지엔시스(Chlorella zojingiensis), 클로렐라 트레복시오이데스(Chlorella trebouxioides), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로로코컴 인퓨시오눔(Chlorococcum infusionum), 클로로코컴 속(Chlorococcum sp), 클로로고늄(Chlorogonium), 크루모나스 속(Chroomonas sp), 크립소스패라 속(Chrysosphaera sp), 코콕믹사 수헬립소이데아(Coccomyxa suhellipsoidea) C-169, 크리코스패라 속(Cricosphaera sp), 크리피레코디니움 코니(Crypihecodinium cohnii), 크립토모나스 속(Cryptomonas sp), 사이클로텔라 크립티카(Cyclotella cryptica), 사이클로텔라 메네기니아나(Cyclotella meneghiniana), 사이클로텔라 속(Cyclotella sp), 두날리엘라 속(Dunaliella sp), 두날리엘라 바다윌(Dunaliella bardawil), 두날리엘라 하이오쿨라타(Dunaliella hioculata), 두날리엘라 그라눌레이트(Dunaliella granulate), 두날리엘라 마리티메(Dunaliella maritime), 두날리엘라 미누타(Dunaliella minuta), 두날리엘라 파바(Dunaliella parva), 두날리엘라 페이세이(Dunaliella peircei), 두날리엘라 프리몰렉타(Dunaliella primolecta), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 두날리엘라 테리콜라(Dunaliella terricola), 두날리엘라 테티올렉타(Dunaliella tertiolecta), 두날리엘라 비리디스(Dunaliella viridis), 두날리엘라 테르티올렉타(Dunaliella tertiolecta), 에레모스패라 비리디스(Eremosphaera viridis), 에레모스패라 속(Eremosphaera sp), 엘립소이돈 속(Ellipsoidon sp), 유글레나(Euglena), 프란세이아 속(Franceia sp), 프라질라리아 크로토넨시스(Fragilaria crotonensis), 프라질라리아 속(Fragilaria sp), 글레오캡사 속(Gleocapsa sp), 글로에오타미니온 속(Gloeothamnion sp), 해마토코코스 플위아리스(Haematococcus plwialis), 하이메노모나스 속(Hymenomonas sp), 아이소크리시스 아프갈바나(Isochrysis affgalbana), 아이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana), 레포신클리스(Lepocinclis), 마이크락티늄(Micractinium), 마이크락티늄(Micractinium), 마이크로모나스(Micromonas), 마이크로모나스 푸실라(Micromonas pusilla), 모노라피듐 미누툼(Monoraphidium Minutum), 모노라피둠 속(Monoraphidium sp), 나노클로리스 속(Nannochloris sp), 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina), 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp), 나비쿨라 아셉타타(Navicula acceptata), 나비쿨라 히스칸테래(Navicula hiskanterae), 나비쿨라 슈도테넬로이데스(Navicula pseudotenelloides), 나비쿨라 펠리쿨로사(Navicula pelliculosa), 나비쿨라 사프로파일라(Navicula saprophila), 나비쿨라 속(Navicula sp), 네프로클로리스 속(Nephrochloris sp.), 네프로셀미스 속(Nephroselmis sp), 니츠키아 코뮤니스(Nitschia communis), 니츠키아 알렉산드리나(Nitzschia alexandrina), 니츠키아 코뮤니스(Nitzschia communis), 니츠키아 디시파타(Nitzschia dissipata), 니츠키아 프러츨럼(Nitzschia frustulum), 니츠키아 한츠키아나(Nitzschia hantzschiana), 니츠키아 인컨스피쿠아(Nitzschia inconspicua), 니츠키아 인터메디아(Nitzschia intermedia), 니츠키아 마이크로세팔라(Nitzschia microcephala), 니츠키아 푸실라(Nitzschia pusilla), 니츠키아 퍼실라 엘립티카(Nitzschia pusilla elliptica), 니츠키아 퍼실라 모노엔시스(Nitzschia pusilla monoensis), 니츠키아 쿼드란글라(Nitzschia quadrangular), 니츠키아 속(Nitzschia sp), 노스톡 속(Nostoc sp.), 노스톡 핌크티포르메(Nostoc Pimctiforme), 오크로모나스 속(Ochromonas sp), 오시스티스 파바(Oocystis parva), 오시스티스 퍼실라(Oocystis pusilla), 오시스티스 속(Oocystis sp), 오실라토리아 림네티카(Oscillatoria limnetic), 오실락토리아 속(Oscillatoria sp), 오실라토리아 서브브레비스(Oscillatoria subbrevis), 파셰리아 아시도필라(Pascheria acidophila), 파블로바 속(Pavlova sp), 파구스(Phagus), 파파오닥틸움 트리코르누터른(Phaaodactylum tricornuturn), 포르미디움(Phormidium), 피애이모나스 속(Piaiymonas sp), 플레우로크리시스 카르테래(Pleurochrysis carterae), 플레우로크리시스 덴테이트(Pleurochrysis dentate), 플레우로크리시스 속(Pleurochrysis sp), 프로클로로코쿠스 마리누스(Prochlorococcus marinus), 프로토테카 윅케르하미(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis), 프로토테카 모리포미스(Prototheca moriformis), 프로토테카 좁피(Prototheca zopfii), 슈도클로렐라 아쿠아티카(Pseudochlorella aquatica), 파이라미모나스 속(Pyramimonas sp), 피로보트라이스(Pyrobotrys), 로도쿠쿠스 오파쿠스(Rhodococcus opacus), 사르시노이드 크리소파이트(Sarcinoid chrysophyte), 센데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus), 스시네초시스티스 속(Scynechocystis sp.), 스시네초코코스(Scynechococcus), 스키초키트림(Schizochytrim), 스피로지라(Spirogyra), 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 스티코코커스 속(Stichococcus sp), 시네코코커스 속(Synechococcus sp), 테트래드론(Tetraedron), 탈라씨오시라 슈도나나(Thalassiosira pseudonana), 테트라셀미스 속(Tetraselmis sp), 테트라셀미스 수에시카(Tetraselmis suecica), 탈라시오시라 웨이스프로기(Thalassiosira weissflogii), 비리디엘라 프리데리시아나(Viridiella fridericiana), 및 볼복스 카르테리(Volvox carteri)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 난노클롭시스 속의 구성원은 N. gaditana, N. granulata, N. limnetica, N. oceanica, N. oculata 및 N. salina 중에서 선택된다.
또한, 본 발명의 방법에 적합한 조류 종은 시아니디오쉬존(Cyanidioschyzon), 그라실라리아(Gracilaria), 카파피커스(Kappaphycus), 포르피리디움(Porphyridium) 및 포르피라(Porphyra)와 같은 홍조류(Rhodophyta); 클로스테리움(closterium) 및 페니움(Penium)과 같은 차축조류(Charophyta); 유도리나(Eudorina), 고니움(Gonium), 해마토코코스(Haematococcus), 로보스패라(Lobosphaera), 마크라스테리아스(Micrasterias), 오스트레오코코스(Ostreococcus), 판도리나(Pandorina), 파라클로렐라(Parachlorella), 플라티모나스 (Platymonas), 슈도코리시스티스(Pseudochoricystis), 센데스무스(Scenedesmus), 울바(Ulva), 및 볼복스(Volvox)와 같은 녹조류(Chlorophyta); 다시마(Laminaria)와 같은 갈조류(Phaeophyta) 속의 미세조류 종을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
숙주 세포는 암피디니움(Amphidinium) 및 심비오디니움(Symbiodinium)과 같은 와편모조류(Dinophyta); 로타렐라(Lotharella)와 같은 클로라라크니오피타(Chlorarachniophyta); 유글레나(Euglena)와 같은 유글레노조아(Euglenozoa) 속의 종 중에서 선택할 수 있다.
본 발명에 따르면, 특정 분지 패턴, 포화 수준 및 탄소 사슬 길이를 갖는 알칸/알켄은 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소와 함께 이러한 특정 특징을 갖는 지방산 기질로부터 제조될 수 있다.
따라서, 지방산 생합성 경로 내의 각 단계는 목적의 지방산 기질을 생산 또는 과생산하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 지방산 생합성 경로에 관여하는 공지된 유전자는 숙주 세포에서 발현, 과발현 또는 감작되어 목적의 지방산 기질을 생성할 수 있다(예를 들어, WO08/119082, US8,183,028 참조). 예시적인 유전자가 WO08/119082의 도 1 또는 US 8,183,028의 표 1 및 컬럼 25-30에 제공된다(이의 개시는 본원에 참고로 인용됨).
그 다음, 숙주 세포는 지질 생산 및/또는 지방산 생산을 증가시키거나 지시하도록 변형될 수 있다. 변형된 숙주 세포는 예를 들어 무작위 돌연변이유발 이후 유리 지방산 또는 유리 지방산의 특정 프로필을 생산할 수 있는 능력을 위해 선택되거나 새로운 유전자를 도입하거나 일부 유전자(유리 지방산 대사에 관여하는 유전자)의 발현을 증가 및/또는 다른 유전자를 제거하거나 이의 발현(유리 지방산 이화 작용에 관여하는 유전자)을 감소시키는 유전 공학에 의해 제조될 수 있다. 또한, 숙주 세포는 선호하는 지방산의 생산을 증가시키고 불필요한 지방산의 생성을 감소시키기 위해 변형될 수 있다.
예를 들어, 지질 생산을 위해, 숙주 세포(예를 들어, 조류 또는 부등편모조류 숙주 세포로 제한되지는 않음)는 지질 생합성에서 기능을 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 비-천연 유전자를 선택적으로 포함할 수 있으며, 상기 폴리펩타이드는 지방산, 지방산 유도체 및/또는 글리세롤지질을 생산하는 효소를 코딩하는 폴리펩타이드를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이는 DGAT(diacylglycerol acyltransferase) 유전자, GPAT(glycerolphosphate acyltransferase) 유전자, LPAAT(lysophosphatidic acid acyltransferase) (dehydrogenase) 유전자, PAP(phosphatidic acid phosphatase) 유전자, 및/또는 MGAT(monoacylglycerol acyltransferase) 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 지방 분해 효소(lipase)를 발현 또는 과발현시키기 위해 변형되었다. 지방 분해 효소는 유리 지방산 및 글리세롤을 생성하기 위해 아실-지질(예를 들어 트리글리세라이드 또는 글리세로포스포리피드 또는 글리세로갈락토리피드)을 가수 분해한다. 바람직하게는, 지방 분해 효소는 광범위한 트리아실글리세롤, 포스포리파아제 및 갈락토리파아제 활성을 갖는 지방 분해성 효소일 것이다. 그 예로는 기니 피그 췌장 리파아제 관련 단백질 유형 2, 푸사리움 큐티나제(Fusarium cutinase) 또는 스타필로코커스 하이쿠스 리파아제(Staphylococcus hyicus lipase)를 포함한다 (Liu et al., 2011, PNAS 108:6905). 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 박테리아이며, 지방 분해 효소를 발현, 바람직하게는 과발현한다. 따라서, 본 발명의 일 목적은 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소 및 지방 분해 효소를 발현, 바람직하게는 과발현시키는 재조합 숙주 세포이며, 이들 중 하나 또는 둘 모두는 숙주 세포에 이종이다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 박테리아이다.
바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 지방산 생성을 증가시키거나 우선적인 지방산의 생산을 촉진하기 위해 티오에스테라제(thioesterase)를 발현, 과발현 또는 감쇠하도록 조작되었다. 바람직하게는, 숙주 세포는 티오에스테라제를 발현 또는 과발현시키기 위해 변형된 것이다. 따라서, 본 발명의 일 목적은 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소 및 티오에스테라제를 발현, 바람직하게는 과발현시키는 재조합 숙주 세포이며, 이들 중 하나 또는 둘 모두는 숙주 세포에 이종이다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 미세조류 또는 시아노박테리아이다.
지방산 생합성을 종결함으로써, ACP(acyl-acyl carrier protein) 티오에스테라제는 기능적으로 지방산 최종 산물의 길이 및 동일성을 결정한다 (Salas et al., (2002) Archives of Biochemistry and Biophysics 403: 25-34). 아미노산 서열 정렬을 기반으로 하여, 식물 티오에스테라제는 18:0- 및 16:0-ACPs에 대한 소량의 활성을 갖는 18:1-ACP에 대해 현저한 선호도를 나타내는 FatAs; 및 8-16 탄소 사이의 다양한 사슬 길이를 갖는 주로 포화된 아실-ACPs를 가수 분해하는 FatBs의 2 개의 패밀리로 클러스터링되는 것으로 나타났다(Voelker, In Genetic Engineering Volume 18. Edited by: Setlow JK. New York, Plenum Press; 1996: 111-133; Ginalski, et al., Nucl Acids Res (2003) 31:3291-3292; and Jones, et al, (1995) Plant Cell 7: 359-371).
티오에스테라제는 EC 3.1.2, 보다 특히 EC 3.1.2.2 (Palmitoyl-CoA hydrolase), EC 3.1.2.14 (Oleoyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase), EC 3.1.2.18 (ADP-dependent short-chain-acyl-CoA hydrolase), EC 3.1.2.19 (ADP-dependent medium-chain-acyl-CoA hydrolase), EC 3.1.2.20, EC 3.1.2.21 (Dodecanoyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase), EC 3.1.2.22 (Palmitoyl-protein hydrolase)의 효소에 속한다.
티오에스테라제의 예는 WO14120829 및 WO16044779에 개시되어있다. 또한 tesB(GenBank Accession No. AAA24665.1 참조), 락토바실러스 브레비스 티오에스테라제(Lactobacillus brevis thioesterase)(GenBank Accession No. ABJ63754.1) 및 락토바실러스 플란타룸 에스테라제((Lactobacillus plantarum esterase)(GenBank Accession No. CCC78182.1)에 의해 코딩되는 대장균 티오에스테라제를 포함한다. 중간 사슬 지방산을 제조하기에 적합한 식물로부터의 티오에스테라제의 다른 예는 Radakovits et al., 2011, Metabolic Engineering 13(1):89-95에 개시되어있다.
바람직한 구현예에서, 티오에스테라제는 짧은 및 중간 사슬 지방산을 선호하기 위해 선택된다.
또한, 본 발명의 특정 양태에서, 본 발명은 상기 숙주 세포를 상기 지방산 탈카르복실화 효소의 생산에 도움이 되는 조건하에 배양하는 단계, 및 회수하는 단계 및/또는 지방산 탈카르복실화 효소를 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 지방산 탈카르복실화 효소의 제조 방법을 제공한다. 또는, 대안적으로, 상기 정의된 바와 같은 지방산 탈카르복실화 효소를 코딩하는 핵산으로 지방산 탈카르복실화 효소의 시험관 내 발현을 포함하는, 본 발명에 따른 지방산 탈카르복실화 효소의 제조 방법이 제공된다. 선택적으로, 상기 방법은 고체 지지체 상에 지방산 탈카르복실화 효소를 고정화시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
효소는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 효소는 수집, 원심 분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하나 이에 한정되지 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.
크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제), 전기 영동 방법(예를 들어, 예비 등전점 전기 영동), 구별되는 용해성(예를 들어, 황산 암모늄 침전), SDS-PAGE 또는 추출(예를 들어, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 효소를 정제하여 실질적으로 순수한 폴리펩타이드를 얻을 수 있다. 또 다른 양태에서, 효소는 회수되지 않고 오히려 효소를 발현하는 본 발명의 숙주 세포가 효소의 공급원으로 사용된다.
알칸/알켄의 제조에의 이용
또한, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 지방산 탈카르복실화 효소, 또는 지방산 탈카르복실화 효소를 포함하는 고체 지지체, 또는 지방산으로부터 알칸/알켄을 생산하기 위한 상기 정의된 바와 같은 지방산 탈카르복실화 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산, 재조합 핵산 컨스트럭트 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
지방산 기질:
알칸/알켄은 지방산으로부터 본 발명에 따른 효소에 의해 생성된다. 특히, 지방산은 지방족 사슬 또는 분지형 사슬 및 카르복실산 기를 포함하는 유리 지방산이다. 이들은 포화되거나 불포화될 수 있다. 이들은 단일불포화 또는 다중 불포화될 수 있다. 이들은 2 내지 36 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 일반적으로 지방산은 지방족 사슬의 길이에 따라 4 개의 그룹으로 분류된다: (1) 단쇄 지방산(Short-chain fatty acids, SCFA)은 탄소 6 개 미만의 지방족 꼬리(aliphatic tails)를 가진 지방산(예를 들어,부티르산)이다: (2) 중쇄 지방산 (medium-chain fatty acids, MCFA)은 중쇄 트리글리세리드에서 발견되는 6-12 탄소의 지방족 꼬리를 가진 지방산이다; (3) 장쇄 지방산(Long-chain fatty acids, LCFA)은 13 내지 21 탄소의 지방족 꼬리를 가진 지방산이다; (4) 매우 장쇄 지방산(Very long chain fatty acids , VLCFA)은 22 탄소보다 긴 지방족 꼬리를 가진 지방산이다. 본 발명은 MCFA 및 LCFA, 보다 구체적으로 LCFA와 관련이 높다. 바람직한 구현예에서, 지방산은 8 또는 10 내지 24 개의 탄소 원자, 바람직하게는 12 내지 22 개의 탄소 원자를 포함한다. 특정 구현예에서, 지방산 기질은 C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21 또는 C22 지방산, 바람직하게는 C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21 또는 C22 지방산, 보다 바람직하게는 C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21 또는 C22 지방산이다. 보다 바람직하게는, 지방산은 8 내지 20 개의 탄소 원자, 바람직하게는 12 내지 18 개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 14 내지 18 개의 탄소 원자, 보다 더욱 바람직하게는 16 또는 17 개의 탄소 원자를 포함한다. 특정 양태에서, 지방산 기질은 C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, 또는 C21 지방산, 바람직하게는 C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, 또는 C19 지방산, 보다 바람직하게는 C12, C14, C16, C17, 또는 C18 지방산이다. 지방족 사슬은 직쇄, 측쇄일 수 있거나 심지어 환 모이어티를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 지방산은 측쇄(branched chain)를 포함한다. 측쇄는 C1-C3 알킬기, 바람직하게는 메틸에 의해 치환된 주쇄를 포함할 수 있다. 특히, 지방산은 피탄산(phytanic acid) 및 프리스탄산 (pristanic acid)과 같은 테르페노이드 지방산일 수 있다.
또한, 지방산의 지방족 사슬은 히드록실, C1-C3 알콜, C1-C3 아실, C1-C3 에스테르, C1-C3 아민, 아미노기, C1-C3 아미드, 카르복실, 알데히드, 에폭시, 할로겐, C1-C3 알콕시, C1-C3 티오알킬, C1-C3 이민, 니트릴, C1-C3 술폰 또는 C1-C3 술폭시드와 같은 황기, 티올, 니트로, 시아노, C1-C3 할로게노알킬과 같은 하나 이상의 기에 의해 치환될 수 있거나 또는 O, N 또는 S와 같은 헤테로 원자, 아세틸렌기, 디비닐 에테르기와 같은 에테르 또는 옥소기에 의해 단절될 수 있다. 바람직하게는, 지방산의 지방족 사슬은 히드록실, 카르복실, 에폭시, 할로겐, 티올 또는 니트릴과 같은 하나 이상의 기에 의해 치환될 수 있거나, 또는 S 원자, 아세틸렌기, 또는 디비닐 에테르기와 같은 에테르에 의해 단절될 수 있다. 바람직하게는, 지방족 사슬은 하나의 기에 의해, 특히 지방족 사슬의 말단에서 치환된다. 매우 특정 구현예에서, 지방산의 지방족 사슬은 히드록실에 의해, 특히 지방족 사슬의 말단에서 치환된다.
또 다른 구현예에서, 지방산의 지방족 사슬은 비치환된다.
지방산 기질은 상술한 바와 같은 단리 또는 정제된 지방산 또는 지방산의 혼합물일 수 있다.
"유리 지방산"은 지방산이 카르복실기를 갖는 형태, 즉, 에스테르화된 형태 또는 다른 지방산 유도체 형태가 아닌 형태를 의미한다.
알칸/알켄:
본 발명의 알칸/알켄은 상응하는 지방산의 탈카르복실화에 의해 수득된다. 따라서, 알칸은 포화 지방산으로부터 수득되고 알켄은 불포화 지방산으로부터 수득된다. 본 발명의 효소는 말단 불포화를 도입하지 않는다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 수득된 알켄은 말단 불포화를 나타내지 않는다.
본 발명의 용도 및 방법에 의해 수득된 알칸/알켄은 8 또는 10 내지 24 개의 탄소원자, 바람직하게는 12 내지 22 개의 탄소 원자를 포함한다. 특정 구현예에서, 알칸/알켄은 C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21 또는 C22 알칸/알켄, 바람직하게는 C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21 또는 C22 알칸/알켄, 보다 바람직하게는 C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21 또는 C22 알칸/알켄이다. 보다 바람직하게는 알칸/알켄은 8 내지 20 개의 탄소 원자, 바람직하게는 12 내지 18 개의 탄소 원자, 보다 더욱 바람직하게는 14 내지 18 개의 탄소 원자, 보다 더욱 더 바람직하게는 16 내지 17 개의 탄소 원자를 포함한다. 특정 구현예에서, 알칸/알켄은 C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, 또는 C21 알칸/알켄, 바람직하게는 C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, 또는 C19 알칸/알켄, 보다 바람직하게는 C12, C14, C16, C17, 또는 C18, 알칸/알켄이다. 지방족/탄화수소 사슬은 직쇄, 측쇄일 수 있거나 심지어 환 모이어티를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 알칸/알켄은 측쇄를 포함한다. 측쇄는 C1-C3 알킬기, 바람직하게는 메틸에 의해 치환된 주쇄를 포함할 수 있다. 특히, 지방산은 피탄 (phytane) 및 프리스탄(pristane)과 같은 테르페노이드(terpenoid) 알칸일 수 있다.
또한, 지방산의 지방족 사슬은 상기에서 설명한 바와 같이 하나 또는 수 개의 기로 치환되거나 또는 단절될 수 있기 때문에, 탈카르복실화 후의 상응하는 알칸/알켄은 또한 하나 또는 수 개의 기로 치환되거나 단절된다.
따라서, 알칸/알켄은 히드록실, C1-C3 알콜, C1-C3 아실, C1-C3 에스테르, C1-C3 아민, 아미노기, C1-C3 아미드, 카르복실, 알데히드, 에폭시, 할로겐, C1-C3 알콕시, C1-C3 티오알킬, C1-C3 이민, 니트릴, C1-C3 술폰 또는 C1-C3 술폭시드와 같은 황기, 티올, 니트로, 시아노, C1-C3 할로게노알킬과 같은 하나 이상의 기에 의해 치환될 수 있거나 또는 O, N 또는 S와 같은 헤테로 원자, 아세틸렌기, 디비닐 에테르기와 같은 에테르 또는 옥소기에 의해 단절될 수 있다. 바람직하게는, 알칸/알켄은 히드록실, 카르복실, 에폭시, 할로겐, 티올 또는 니트릴과 같은 하나 이상의 기에 의해 치환될 수 있거나, 또는 S 원자, 아세틸렌기, 또는 디비닐 에테르기와 같은 에테르에 의해 단절될 수 있다. 바람직하게는, 알칸/알켄은 하나의 기에 의해, 특히 지방족 사슬의 말단에서 치환된다. 매우 특정 구현예에서, 알칸/알켄은 히드록실에 의해, 특히 지방족 사슬의 말단에서 치환되고, 알코올이다.
알칸/알켄은 상술한 바와 같은 단리 또는 정제된 알칸/알켄 또는 알칸/알켄의 혼합물일 수 있다. 매우 특정 구현예에서, 효소는 특히 대장균과 같은 박테리아에서 발현되는 경우 C13-C17 알칸 및 알켄을 생성할 수 있다.
무세포 시스템(cell free system)에서 알칸/알켄 생산
제1 양태에서, 본 발명은 지방산, 특히 유리 지방산으로부터 알칸/알켄을 제조하기 위한 상기 정의된 지방산 탈카르복실화 효소의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 지방산 탈카르복실화 효소를 지방산 또는 지방산 혼합물과 접촉시키고 빛에 노출시켜서 지방산 또는 지방산 혼합물을 상응하는 알칸/알켄으로 전환시키는 알칸/알켄의 제조 방법에 관한 것이다. 지방산 또는 지방산의 혼합물은 정제된 형태이거나 또는 원료 조성물/생성물에 존재할 수있다. 지방산 탈카르복실화 효소는 단백질 추출물, 특히 총 단백질 추출물에서 정제, 단리 또는 존재할 수 있다. 일반적으로, FAD 보조 인자는 복합체로서 이미 지방산 탈카르복실화 효소와 함께 존재한다. 선택적으로, FAD 보조 인자는 지방산 탈카르복실화 효소와 함께 첨가될 수 있다.
효소는 그 활성을 위해 청색 광자를 포함하는 광(light)에 노출될 필요가 있다. 바람직한 구현에에서, 청색광은 400 내지 520 nm, 바람직하게는 450 nm 내지 495 nm, 특히 약 450 nm의 파장을 갖는다. 제공되는 광의 양은 예를 들어 10 내지 3000 μmole.photon.m-2.s-1, 바람직하게는 약 2000 μmole.photon.m-2.s-1일 수 있다.
그러나, 광은 300 내지 540nm 사이의 더 넓은 파장 범위를 가질 수 있다. 실제로, 본 발명자는 효소의 보조 인자인 FAD가 300 내지 540nm 파장 범위의 광을 흡수할 수 있고, 상기 효소가 이 범위의 지방산을 탈카르복실화할 수 있다는 것을 관찰하였다. 실제로, FAD 흡수 스펙트럼은 300 내지 540 nm의 파장 범위 사이에 포함된다.
또한, 효소는 보조 물질로서 FAD(flavine adenine dinucleotide)를 필요로 하는데, 이는 보통 미세조류 추출물 또는 이종성 발현으로부터 정제된 효소에 결합한다.
상기 방법은 알칸/알켄을 회수하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 알칸/알켄은 당업자에게 이용가능한 임의의 방법에 의해 추출되거나 정제될 수 있다. 알칸/알켄은 유기상에서 회수될 수 있다. 예를 들어, 이들은 헥산과 같은 유기 용매로 추출할 수 있다. 그러나, 또한 알칸/알켄은 응축에 의해 배양물의 기체상으로부터 회수될 수 있다.
재조합 숙주 세포 시스템에서 알칸/알켄 생산
본 발명은 지방산, 특히 유리 지방산으로부터 알칸/알켄을 제조하기 위한 상술한 재조합 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상술한 바와 같은 재조합 숙주 세포가 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소를 발현시키는데 효과적인 조건하에 배양되는, 지방산으로부터 알칸/알켄을 제조하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소를 발현시키는데 효과적인 조건하에 배양된 상술한 재조합 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물에 관한 것이다.
선택적으로, 재조합 숙주 세포는 지방산을 포함하는 배지에서 배양될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 재조합 숙주 세포는 지방산을 생성하거나 포함한다.
상기 방법에서, 재조합 숙주 세포는 바람직하게는 바이오매스, 바람직하게는 지질이 풍부한 바이오매스, 특히 지방산을 얻기 위한 조건하에서 배양된다. 그런 다음 제2 단계에서 지방산의 알칸/알켄으로의 전환이 개시된다. 예를 들어, 지방산 탈카르복실화 효소가 재조합 숙주 세포에서 이미 발현되는 경우, 제2 단계는 지방산 탈카르복실화 효소를 활성화하기 위해 재조합 숙주 세포에 청색 광자를 포함하는 빛을 적용함으로써 개시될 수 있다. 실제로, 본 발명자들은 알칸 생성이 빛, 특히 그의 파장에 의해 조절될 수 있음을 보여주었다. 청색광(> 400 nm 및 <530 nm)은 알칸이 생성되도록 하는 반면, 적색광(> 600 nm 및 <700 nm)은 아니다. 그 다음, 본 발명의 방법에서, 알칸 생성은 빛에 의해 생체 내에서 조절될 수 있다. 대안적으로, 지방산 탈카르복실화 효소의 발현이 유도성 프로모터에 의해 조절되는 경우, 지방산 탈카르복실화 효소의 발현을 유도하고 세포를 광자(300-540 nm)에 노출시킴으로써 제2 단계를 개시할 수 있다. 또한, 광 강도(광자 플럭스)는 효소 활성을 조절한다. 높은 광자 플럭스는 효소 활성을 증가시키나, 낮은 광자 플럭스는 효소 활성을 감소시킨다.
대안적으로, 상기 방법은 바람직하게는 지질이 풍부한 바이오매스, 특히 지방산의 생산 및 지방산의 알칸/알켄으로의 전환을 공동으로 촉진시키는 조건에서 재조합 숙주 세포의 배양을 포함할 수 있다.
"풍부"는 바이오매스가 건조 바이오매스에 비해 적어도 20, 30, 40, 50, 60 또는 70% 중량의 지질, 특히 지방산을 포함하는 것으로 의도된다.
이 방법은 재조합 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 알칸/알켄을 단리 또는 회수하는 추가 단계를 포함 할 수 있다.
알칸/알켄은 당업자에게 이용가능한 임의의 방법에 의해 추출되거나 정제될 수 있다. 예를 들어, 이들은 헥산과 같은 유기 용매로 추출 할 수 있다. 알칸/알켄은 유기상에서 회수될 수 있다.
하나의 예시적인 분리 방법은 2 상(bi-phasic) 분리 방법이다. 이 방법은 알칸/알켄을 생성하기에 충분한 조건 하에 유전적으로 조작된 숙주 세포를 발효시키는 단계, 알칸/알켄을 유기 상에서 수집하는 단계, 및 상기 유기 상을 수성 발효액으로부터 분리시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 배치 및 연속 발효 설정 모두에서 실행될 수 있다.
알칸/알켄을 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법 및 용도는 화학, 특히 화장품 및 플라스틱, 수지, 섬유, 엘라스토머, 약제, 윤활제 또는 겔과 같은 다른 분야에 유용한 바이오 연료, 물질의 제조에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 알켄은 연료로서 사용되거나 연료로 전환될 수 있다. 연료의 의도된 목적에 따라, 상이한 알켄이 생성되고 사용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 분지된 알켄은 추운 기후에서 사용되도록 의도된 자동차 연료에 바람직할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 알켄이 연료 제조용 공급 원료로서 사용되는 경우, 올레핀 공급 원료의 특성이 생성된 연료의 특성에 영향을 미칠 것이라는 것을 당업자는 인식할 것이다. 따라서, 연료 생성물의 특성은 공급 원료로서 사용하기 위한 특정 알켄을 생성함으로써 선택될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법을 사용하여, 원하는 연료 품질을 갖는 바이오 연료를 알켄으로부터 제조할 수 있다. 생물학적으로 생성된 알켄은 제트 연료, 디젤 또는 가솔린으로 사용할 수 있는 바이오 연료의 새로운 공급원이다. 알켄을 사용하여 만든 일부 바이오 연료는 재생 가능한 자원으로부터 생산되지 않았으며 새로운 물질로 구성되어 있다.
지방산 적량(dosage)
또한, 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소는 유리 지방산의 정량화(quantification)에 유용하며, 유리 지방산의 정량화를 위한 키트에 포함될 수 있다. 특히, 본 발명은 지방산을 알칸/알켄으로 전환시키는데 적합한 조건으로 시료를 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소와 접촉시키는 단계, 알칸/알켄을 회수하는 단계, 및 알칸/알켄을 정량하는 단계를 포함하는, 시료 내 지방산을 정량화하는 방법에 관한 것이다. 시료는 식품 또는 생물학적 시료, 특히 혈액, 혈청, 혈장, 소변 등과 같은 생물학적 유체 시료일 수 있다. 생성된 알칸/알켄은 유기 용매로 추출하여, 특히 GC-FID-MS(gas chromatography coupled to flame ionization detector and mass spectrometry)로 정량할 수 있다.
또한, 특정 구현예에서, 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소는 총 지방산의 정량화에 유용하며, 총 지방산의 정량화를 위한 키트에 포함될 수 있다. 특히, 본 발명은 지방산을 유리 지방산으로 전환시키고 상술한 바와 같은 유리 지방산을 정량하기에 적합한 조건으로 시료를 지방 분해 효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료 내 지방산을 정량화하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 방법은 지방산을 유리 지방산으로 전환시키기에 적합한 조건으로 시료를 지방 분해 효소와 접촉시키는 단계, 지방산을 알칸/알켄으로 전환시키기에 적합한 조건으로 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소를 접촉시키는 단계, 알칸/알켄을 회수하는 단계 및 알칸/알켄을 정량화하는 단계를 포함한다. 생성된 알칸/알켄은 유기 용매로 추출되고 정량될 수있다.
지방산 탈카르복실화 효소가 지방산을 알칸/알켄으로 전환시키면 부산물로서 CO2를 생성한다. 다음으로, 대안적인 방법에서, 본 발명은 지방산을 알칸/알켄으로 전환시키기에 적합한 조건으로 시료를 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소와 접촉시키는 단계, CO2를 회수하는 단계 및 CO2를 정량화하는 단계를 포함하는, 시료 내 지방산을 정량화하는 방법에 관한 것이다. CO2의 양은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 GC-MC(Gas chromatography-mass spectrometry)에 의해 측정될 수 있다.
추가양태에서, 본 발명자는 지방산 탈카르복실화 효소의 형광이 기질 농도의 함수로서 변화한다는 것을 관찰하였다. 따라서, 형광 변화는 시료에서 지방산을 정량화하기 위한 추가 수단을 제공한다. 다음으로, 또 다른 대안적인 방법에서, 본 발명은 지방산을 알칸/알켄으로 전환시키기에 적합한 조건으로 시료를 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소와 접촉시키는 단계, 및 지방산 탈카르복실화 효소에 의해 방출되는 형광을 측정하는 단계를 포함하는, 시료 내 지방산을 정량화하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 형광은 500 내지 700 파장에서 측정되며, 동력학은 바람직하게는 약 540 nm에서 수행된다.
물론, 시료에서 지방산을 정량화하는 방법은 상술한 바와 같은 여러 방법, 예컨대, 알칸/알켄 및 CO2를 정량화하는 단계, 알칸/알켄을 정량화하는 단계 및 효소 형광을 측정하는 단계, CO2를 정량화하는 단계 및 효소 형광을 측정하거나, 또는 3 개의 파라미터의 조합을 측정하는 단계를 조합할 수 있다.
지방산 적량은 질환, 예를 들어 간 질환(WO15089102), 당뇨병 및 자간전증 (WO13170369)의 진단에 유용하다.
지방산 제거
또한, 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소는 조성물, 예를 들어, 소화(alimentary) 오일, 특히 정제된 소화 오일로부터 유리 지방산을 제거하는데 유용할 수 있다. 실제로, 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소의 사용은 임의의 화학적 과정없이 지방산이 탈카르복실화되도록 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 지방산의 탈카르복실화, 이에 의한 지방산의 제거를 위한 상기 정의된 폴리펩티드의 용도, 또는 조성물의 유리 지방산을 탈카르복실화시키기에 적합한 조건으로 본 발명의 지방산 탈카르복실화 효소를 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 조성물로부터 유리 지방산을 제거하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 양태 및 이점은 하기 실시예에 개시되어 있으며, 이는 예시로서 간주되어야하며 본원의 범위를 제한하지 않는다.
도 1. 클로렐라 균질액에서의 알칸 합성 효소 활성의 검출. 클로렐라 바리아빌리스 NC64A의 세포 균질액을 듀테로화한(periduterated)(D31) 팔미트 산과 함께 밀봉된 바이얼에서 밤새 인큐베이션하였다. 기체 상의 탄화수소는 고체상 마이크로 추출(SPME)로 추출하여 질량 분석기(GC-MS)에 결합된 가스 크로마토그래피로 분석하였다. m/z = 243,5 ± 0.5에 해당하는 이온을 추출하였다.
상부 패널: 표지된 펜타데칸 산물에 상응하는 크로마토그램의 부분; 대조군: 95℃에서 30 분간 예열된 균질액. 하부 패널: 표지된 펜타데칸의 질량 스펙트럼.
도 2. 알칸 합성효소의 부분 정제 방법 요약 및 정제의 다양한 단계에서의 단백질 프로파일 분석 세포 균질액의 경우 도 1에서 설명한 바와 같이 세포 분획 및 용출 분획에 대해 알칸 합성효소 활성 분석을 실시하였다. 단백질 전기 영동은 변성 조건 하에서 10% 겔 아크릴아미드상에서 수행하였다. 1: 겔 여과 후; 2: 패스트 플로우 Q 후; 3 및 4 : Mono Q(프로테옴 분석을 위해 분획) 후.
도 3. 각각의 3 번 정제 후 프로테옴 분석에 의해 검출된 단백질의 수 및 공통 10 가지 단백질 목록. 세 번의 독립적인 정제(A, B, C)가 수행되었다.
도 4. 클로렐라 알칸 합성효소는 엽록체-예측 GMC 산화 환원 효소이다. 데이터는 PFAM 및 Protparam에서 검색되었다. 아미노산: 654; 분자량: 69070 Da 이론적 피크: 9.075. Predalgo에 의해 엽록체에 위치할 것으로 예상된다.
도 5. 클로렐라 GMC 산화 환원 효소를 발현하는 E. coli 세포에서의 단백질 분석. 클로렐라 효소는 C-말단 His-태그 단백질로 발현되었다. 왼쪽: SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 나타낸 총 단백질 프로파일. 오른쪽: 항-His 항체를 이용한 웨스턴 블롯. C: 공벡터를 이용한 대조군; GMC: 클로렐라 GMC 산화 환원 효소를 발현하는 균주.
도 6. 클로렐라 GMC 산화 환원 효소를 발현하는 E. coli 세포의 탄화수소 함량 분석. 세포를 감화하고 탄화수소 함량을 SPME 및 GCMS로 분석하였다. 어떠한 지방산 기질도 첨가되지 않았음을 주목해야 한다. 상부 패널: 탄화수소에 해당하는 크로마토그램의 영역. 하부 패널: 검출된 알칸의 질량 스펙트럼. 대조군: 공벡터를 이용한 균주; GMC: 클로렐라 GMC 산화 환원 효소를 발현하는 균주. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3).
도 7. GMC 산화 환원 효소를 발현하는 형질전환 미세조류의 탄화수소 분석. 탄화수소는 GMC 산화 환원 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티아이의 균주에서 GC-MS로 분석하였다. 상부 패널: 탄화수소 피크를 보여주는 GC 크로마토그램의 부분. 하부 패널: 탄화수소의 정량. WT: 야생형 균주. GMC OE: 클로렐라 GMC 산화 환원 효소를 발현하는 균주.
도 8. GMC 산화 환원 효소 패밀리의 다중 정렬 (A) 및 계통 발생 수 (B). 클로렐라(서열번호 1); 클라미도모나스(서열번호 5); 코코믹사(서열번호 9); 볼복스(서열번호 10); 엑토카르푸스(서열번호 11); 에밀리아니아(서열번호 12); 아우레오코커스(서열번호 13); 패오닥틸륨(서열번호 7); 난노클로롭시스(서열번호 14)로부터의 서열을 사용하여 Clustal O (1.2.1)로 다중 정렬을 구축하였다. 도출되지 않은 계통 발생 수는 다양한 원산지의 56 개 GMC 산화 환원 효소 단백질 서열 세트를 사용하여 구축되었다(인접-접합 방법). 클로렐라 GMC 산화 환원 효소는 박스형이다.
도 9. 재조합 클로렐라 GMC 산화 환원 효소의 정제된 분획. 효소는 N-말단 His-태그 단백질로서 대장균에서 발현되고 Ni 칼럼상에서 정제되었다. F1 내지 F4는 용출 분획이다. L: 분자량 래더(ladder).
도 10. 다양한 지방산에 대한 클로렐라 GMC 산화 환원 효소의 상대적 활성. 정제된 재조합 효소를 백색광 하에서 다양한 사슬 길이의 지방산과 함께 인큐베이션하고 산물을 GC-MS로 분석하였다. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3)
도 11: 알칸 합성효소에 의해 촉매된 탈카르복실화의 부산물인 CO 2 . 정제된 재조합 효소와 함께 1-13C-팔미틴산염의 인큐베이션시 방출되는 13CO2의 상대적 정량. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3).
도 12: 클로렐라 GMC 산화 환원 효소는 테르펜산을 메틸 알칸(켄)으로 전환시킨다. 정제된 재조합 효소를 백색광 하에서 피탄산과 함께 인큐베이션하고 산물을 GC-MS로 분석하였다.
도 13: 클로렐라 GMC 산화 환원 효소는 수산화 지방산(hydroxy fatty acids를 알칸올(alkanols)로 전환시킨다.
정제된 재조합 효소를 백색광 하에서 히드록시팔미트산염(hydroxypalmitate)과 함께 인큐베이션하고 산물을 GC-MS로 분석하였다.
도 14. 지방 분해 효소와 함께 GMC 산화 환원 효소를 사용하여 지방산으로부터 알칸을 시험 관내에서 생산. 정제된 클로렐라 GMC 환원 효소와 리조푸스(Rhizopus) 지방 분해 효소를 글리세릴 트리헵타데카노에이트(glyceryl triheptadecanoate)와 함께 인큐베이션하고 산물을 GC-MS로 분석하였다. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3).
도 15: 클로렐라 GMC 산화 환원 효소의 흡수 스펙트럼.
도 16: 조류 GMC 산화 환원 효소의 광(Light) 의존성. a, 클로렐라 GMC 산화 환원 효소의 흡광도 스펙트럼 및 작용 스펙트럼. b, 클로렐라 효소와 함께 1-13C-팔미트산염(palmitate)의 인큐베이션시 멤브레인 입구 질량 분광법(Membrane Inlet Mass Spectrometry)에 의한 13CO2 방출의 모니터링. 반응 혼합물을 850 μmoles photons m-2 s-1에서 연속적인 광(청색 또는 적색) 조건에 노출시켰다. c, 클로렐라 GMC 산화 환원 효소 활성의 광 강도 의존성. d, 30 μmoles photons m-2 s-1의 청색 및 적색 광으로 배양되는 동안 클라미도모나스 세포에서 총 탄화수소의 변화. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3).
도 17: 암(dark) 또는 명(light)(400 내지 800 nm의 광자를 포함하는 백색 광 1000 μmol photons m-2 s-1) 하에서 배양된, 클로렐라 알칸 합성효소를 발현하는 대장균에서의 탄화수소의 정량화. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3). Nd(not detected), 검출되지 않음.
도 18. 기질의 존재 하에서 GMC 산화 환원 효소의 동력학. 여기 (excitation)는 450 nm ± 5이고 방출은 540 nm이다. 다양한 농도의 팔미트 산이 사용되었다.
도 19: 클라미도모나스 또는 패오닥틸륨 GMC 산화 환원 효소를 발현하는 E. coli 세포에서의 탄화수소의 정량화. 세포를 트랜스메틸화시키고 탄화수소 함량을 용매 추출 및 GCMS로 분석하였다. 어떠한 지방산 기질도 첨가되지 않았음을 주목해야한다. 공벡터로 형질전환된 대장균 세포에서 알칸은 검출되지 않았다. Tr, (traces) 트레이스. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3).
도 20: 조류 GMC 산화 환원 효소 및 지방 분해 효소를 동시-발현하는 대장균에서 탄화수소의 정량화. 세포를 트랜스메틸화시키고 탄화수소 함량을 용매 추출 및 GCMS로 분석하였다. 어떠한 지방산 기질도 첨가되지 않았음을 주목해야한다. 음성 대조군: 공벡터로 형질전환된 대장균 세포. Nd(not detected), 검출되지 않음. Cr(Chlamydomonas reinhardtii): 클라미도모나스 레인하드티아이; Cv(Chlorella variabilis): 클로렐라 바리아빌리스. 지방 분해 효소는 박테리아인 스타필로코쿠스 하이쿠스(Staphylococcus hyicus)(Uniprot P04635)에서 유래한 것이다. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3).
[서열 목록의 간단한 설명]
상부 패널: 표지된 펜타데칸 산물에 상응하는 크로마토그램의 부분; 대조군: 95℃에서 30 분간 예열된 균질액. 하부 패널: 표지된 펜타데칸의 질량 스펙트럼.
도 2. 알칸 합성효소의 부분 정제 방법 요약 및 정제의 다양한 단계에서의 단백질 프로파일 분석 세포 균질액의 경우 도 1에서 설명한 바와 같이 세포 분획 및 용출 분획에 대해 알칸 합성효소 활성 분석을 실시하였다. 단백질 전기 영동은 변성 조건 하에서 10% 겔 아크릴아미드상에서 수행하였다. 1: 겔 여과 후; 2: 패스트 플로우 Q 후; 3 및 4 : Mono Q(프로테옴 분석을 위해 분획) 후.
도 3. 각각의 3 번 정제 후 프로테옴 분석에 의해 검출된 단백질의 수 및 공통 10 가지 단백질 목록. 세 번의 독립적인 정제(A, B, C)가 수행되었다.
도 4. 클로렐라 알칸 합성효소는 엽록체-예측 GMC 산화 환원 효소이다. 데이터는 PFAM 및 Protparam에서 검색되었다. 아미노산: 654; 분자량: 69070 Da 이론적 피크: 9.075. Predalgo에 의해 엽록체에 위치할 것으로 예상된다.
도 5. 클로렐라 GMC 산화 환원 효소를 발현하는 E. coli 세포에서의 단백질 분석. 클로렐라 효소는 C-말단 His-태그 단백질로 발현되었다. 왼쪽: SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 나타낸 총 단백질 프로파일. 오른쪽: 항-His 항체를 이용한 웨스턴 블롯. C: 공벡터를 이용한 대조군; GMC: 클로렐라 GMC 산화 환원 효소를 발현하는 균주.
도 6. 클로렐라 GMC 산화 환원 효소를 발현하는 E. coli 세포의 탄화수소 함량 분석. 세포를 감화하고 탄화수소 함량을 SPME 및 GCMS로 분석하였다. 어떠한 지방산 기질도 첨가되지 않았음을 주목해야 한다. 상부 패널: 탄화수소에 해당하는 크로마토그램의 영역. 하부 패널: 검출된 알칸의 질량 스펙트럼. 대조군: 공벡터를 이용한 균주; GMC: 클로렐라 GMC 산화 환원 효소를 발현하는 균주. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3).
도 7. GMC 산화 환원 효소를 발현하는 형질전환 미세조류의 탄화수소 분석. 탄화수소는 GMC 산화 환원 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티아이의 균주에서 GC-MS로 분석하였다. 상부 패널: 탄화수소 피크를 보여주는 GC 크로마토그램의 부분. 하부 패널: 탄화수소의 정량. WT: 야생형 균주. GMC OE: 클로렐라 GMC 산화 환원 효소를 발현하는 균주.
도 8. GMC 산화 환원 효소 패밀리의 다중 정렬 (A) 및 계통 발생 수 (B). 클로렐라(서열번호 1); 클라미도모나스(서열번호 5); 코코믹사(서열번호 9); 볼복스(서열번호 10); 엑토카르푸스(서열번호 11); 에밀리아니아(서열번호 12); 아우레오코커스(서열번호 13); 패오닥틸륨(서열번호 7); 난노클로롭시스(서열번호 14)로부터의 서열을 사용하여 Clustal O (1.2.1)로 다중 정렬을 구축하였다. 도출되지 않은 계통 발생 수는 다양한 원산지의 56 개 GMC 산화 환원 효소 단백질 서열 세트를 사용하여 구축되었다(인접-접합 방법). 클로렐라 GMC 산화 환원 효소는 박스형이다.
도 9. 재조합 클로렐라 GMC 산화 환원 효소의 정제된 분획. 효소는 N-말단 His-태그 단백질로서 대장균에서 발현되고 Ni 칼럼상에서 정제되었다. F1 내지 F4는 용출 분획이다. L: 분자량 래더(ladder).
도 10. 다양한 지방산에 대한 클로렐라 GMC 산화 환원 효소의 상대적 활성. 정제된 재조합 효소를 백색광 하에서 다양한 사슬 길이의 지방산과 함께 인큐베이션하고 산물을 GC-MS로 분석하였다. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3)
도 11: 알칸 합성효소에 의해 촉매된 탈카르복실화의 부산물인 CO 2 . 정제된 재조합 효소와 함께 1-13C-팔미틴산염의 인큐베이션시 방출되는 13CO2의 상대적 정량. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3).
도 12: 클로렐라 GMC 산화 환원 효소는 테르펜산을 메틸 알칸(켄)으로 전환시킨다. 정제된 재조합 효소를 백색광 하에서 피탄산과 함께 인큐베이션하고 산물을 GC-MS로 분석하였다.
도 13: 클로렐라 GMC 산화 환원 효소는 수산화 지방산(hydroxy fatty acids를 알칸올(alkanols)로 전환시킨다.
정제된 재조합 효소를 백색광 하에서 히드록시팔미트산염(hydroxypalmitate)과 함께 인큐베이션하고 산물을 GC-MS로 분석하였다.
도 14. 지방 분해 효소와 함께 GMC 산화 환원 효소를 사용하여 지방산으로부터 알칸을 시험 관내에서 생산. 정제된 클로렐라 GMC 환원 효소와 리조푸스(Rhizopus) 지방 분해 효소를 글리세릴 트리헵타데카노에이트(glyceryl triheptadecanoate)와 함께 인큐베이션하고 산물을 GC-MS로 분석하였다. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3).
도 15: 클로렐라 GMC 산화 환원 효소의 흡수 스펙트럼.
도 16: 조류 GMC 산화 환원 효소의 광(Light) 의존성. a, 클로렐라 GMC 산화 환원 효소의 흡광도 스펙트럼 및 작용 스펙트럼. b, 클로렐라 효소와 함께 1-13C-팔미트산염(palmitate)의 인큐베이션시 멤브레인 입구 질량 분광법(Membrane Inlet Mass Spectrometry)에 의한 13CO2 방출의 모니터링. 반응 혼합물을 850 μmoles photons m-2 s-1에서 연속적인 광(청색 또는 적색) 조건에 노출시켰다. c, 클로렐라 GMC 산화 환원 효소 활성의 광 강도 의존성. d, 30 μmoles photons m-2 s-1의 청색 및 적색 광으로 배양되는 동안 클라미도모나스 세포에서 총 탄화수소의 변화. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3).
도 17: 암(dark) 또는 명(light)(400 내지 800 nm의 광자를 포함하는 백색 광 1000 μmol photons m-2 s-1) 하에서 배양된, 클로렐라 알칸 합성효소를 발현하는 대장균에서의 탄화수소의 정량화. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3). Nd(not detected), 검출되지 않음.
도 18. 기질의 존재 하에서 GMC 산화 환원 효소의 동력학. 여기 (excitation)는 450 nm ± 5이고 방출은 540 nm이다. 다양한 농도의 팔미트 산이 사용되었다.
도 19: 클라미도모나스 또는 패오닥틸륨 GMC 산화 환원 효소를 발현하는 E. coli 세포에서의 탄화수소의 정량화. 세포를 트랜스메틸화시키고 탄화수소 함량을 용매 추출 및 GCMS로 분석하였다. 어떠한 지방산 기질도 첨가되지 않았음을 주목해야한다. 공벡터로 형질전환된 대장균 세포에서 알칸은 검출되지 않았다. Tr, (traces) 트레이스. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3).
도 20: 조류 GMC 산화 환원 효소 및 지방 분해 효소를 동시-발현하는 대장균에서 탄화수소의 정량화. 세포를 트랜스메틸화시키고 탄화수소 함량을 용매 추출 및 GCMS로 분석하였다. 어떠한 지방산 기질도 첨가되지 않았음을 주목해야한다. 음성 대조군: 공벡터로 형질전환된 대장균 세포. Nd(not detected), 검출되지 않음. Cr(Chlamydomonas reinhardtii): 클라미도모나스 레인하드티아이; Cv(Chlorella variabilis): 클로렐라 바리아빌리스. 지방 분해 효소는 박테리아인 스타필로코쿠스 하이쿠스(Staphylococcus hyicus)(Uniprot P04635)에서 유래한 것이다. 정량화된 데이터는 평균 ± s.d.를 나타낸다. (n = 3).
[서열 목록의 간단한 설명]
실시예
본 명세서에서, 본 발명자들은 알칸(켄)의 합성을 촉매하는 효소인 미세조류 클로렐라 바리아비리스(Chlorella variabilis) NC64A 모델을 확인하였다. 상기 효소는 기질로서 듀테륨-표지 팔미트산 및 펜타데칸 산물을 포획하기 위해 고체상 미세 추출을 사용하여 부분적으로 정제하였다. 글루코오스-메탄올-콜린 산화 환원 효소 군에 속하는 후보 단백질은 3 가지 독립적인 부분 정제의 프로테옴 분석에 의해 동정되었다. 대장균(Escherichia coli)에서 상기 클로렐라 후보 유전자의 이종 발현(heterologous expression)은 13 내지 17 개의 탄소로 된 선형 탄화수소의 생산을 초래하였으며, 이는 단일 효소가 연료-유사 알칸(켄)을 생산하기에 충분하다는 것을 보여 주었다. 클로렐라 알칸 합성효소(synthase)는 보조 인자로서 FAD를 사용하는 69 kDa 엽록체-예측 단백질이다. 시험관 분석은 C12 내지 C22 지방산을 이용하여 알칸(켄)을 형성할 수 있음을 보여준다. 이 효소의 활성은 엄격하게 400 내지 540 nm의 광자(photons)의 존재에 의존적이나, 300 내지 400 nm에서도 작용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 글루코오스-메탄올-콜린 산화 환원 효소 군의 촉매 레퍼토리에 대한 현재의 지식을 확대하고 미생물에서 알칸(켄)의 재생 가능하고 광-구동(light-driven) 생산을 위한 신규한 길을 열어준다.
결과
클로렐라 바리아비리스 NC64A로부터의 알칸 합성효소 활성의 부분 정제
본 발명자들은 클로렐라 바리아빌리스 NC64A를 비롯한 다양한 미세조류가 C15-C17 알칸 및 알켄을 합성할 수 있는 능력을 가지고 있음을 보여주었다. 또한, 본 발명자들은 동일한 연구에서 클로렐라 배양물에 외인성으로 첨가된 듀테로화한 팔미트산이 알칸과 알켄으로 전환될 수 있음을 보여주었다. 미세조류에서 알칸 합성의 효소 경로를 확인하기 위해, 본 발명자들은 듀테륨-표지(deuterium-labeled) 팔미트산을 기질로 이용하는 전통적인 정제 방법을 선택하였다.
첫 번째 단계는 클로렐라 세포 균질액에서 효소 활성을 측정할 수 있는지 확인하는 것이었다. 듀테로화한 팔미트산(Deuterated palmitic acid)을 세포 균질액(homogenate)에 첨가하고 밀봉된 바이알에서 밤새 인큐베이션하였다. 예상되는 펜타데칸(pentadecane) 산물을 고체상 마이크로 추출(SPME)로 추출하여 질량 분석기(GC-MS)와 결합된 가스 크로마토그래피로 분석하였다. 표지된 펜타데칸에 상응하는 12.03 분에서의 피크가 손상되지 않은 세포에서 검출되었으나 예열된 대조군 균질액에서는 검출되지 않았다(도 1).
따라서, 본 실시예는 클로렐라 균질액이 알칸 합성 효소 활성을 갖는다는 것을 나타냈다. 대부분의 유기체에서 확인된 알칸 합성 경로는 알데하이드 중간체를 가지므로, 본 발명자들은 표지된 C16 알데하이드를 사용하여 동일한 실험을 수행하였으나, 표지된 펜타데칸을 검출할 수 없었다.
따라서, 표지된 팔미트산을 모든 정제 과정에서 활성을 분석하는데 이용하였다(도 2). 세포를 50000 g에서 원심분리했을 때, 대부분의 활성은 상등액 분획물에서 발견되었다. 그러나, 105000g에서 두 번째 원심 분리 후, 활성은 대부분 펠렛 (마이크로솜 분획)에서 발견되었다. 다른 세척제를 사용하여 활성을 가용화시켰고 가장 효율적인 것은 Triton X100으로 밝혀졌다.
활성을 추가적으로 정제하기 전에 일부 사전 테스트를 실시하였다. 페레독신, 페레독신 환원 효소, NADP, NADPH 및 ATP와 같은 몇몇 보조 인자를 가용화된 마이크로솜 분획에 상이한 조합으로 첨가하였다. 이들 중 어느 것도 활성을 증가시키지 않는 것으로 밝혀졌고 정제된 분획에 대한 분석에 추가하지 않았다. 또한, 본 발명자들은, 3 일 동안 4℃에서 보관된 가용화된 마이크로솜 분획 활성이 90% 감소함을 관찰하였고, 이는 전체 정제 과정을 수 일 이내에 실시해야 함을 나타낸다.
가용화된 활성의 부분 정제는 예비 컬럼 Superdex 200에 이어 2 개의 음이온 교환 컬럼인 패스트 플로우(fast flow) Q 및 최종적으로 보다 해상도가 높은 모노 Q를 이용하는 겔 여과의 제1 단계를 포함한다. 상술한 분석법을 이용하여 알칸 합성 효소 활성에 대해 대부분의 분획을 분석하였다. 가장 활성이 높은 분획의 단백질 함량을 변성 조건 하에서 아크릴아마이드 젤에서 전기 영동으로 분석하였다(도 2).
세 가지 독립적인 부분 정제가 수행되었다. 최종 정제 단계 후 가장 높은 활성을 갖는 분획을 프로테옴 분석을 위해 보냈다. 최소 2 개의 펩타이드들을 컷오프함으로써, 세 가지 정제 과정에서 10 개의 단백질만 공통적으로 존재하였다(도 3). 이러한 단백질들 중 9 개는 특성이 잘 규명된 효소의 명확한 동족체였다. 다양한 활성 범위를 가진 효소 그룹에 속한 유일한 후보는 글루코오스-메탄올-콜린(GMC) 산화 환원 효소 군으로 추정되는 효소였다. 또한, 이 후보는 가장 높은 펩타이드 수를 가진 후보였다. 따라서, 이는 이종 발현을 위해 선택되었다.
클로렐라 알칸 합성효소는 GMC 산화 환원 효소 군의 구성원이다
클로렐라 GMC 산화 환원 효소를 코딩하는 유전자는 공개적으로 이용가능한 EST에 완전히 포함되지 않았다. 클로렐라의 총 RNA 추출물을 사용하여 약 2kb의 cDNA를 클로닝하였다. 이것은 69 kDa 단백질을 코딩하였고(도 4) 미세조류 시퀀스-적용 소프트웨어 Predalgo에 의해 엽록체에 국한될 것으로 예측되었다. N-말단 엽록체 표적화 신호는 50 잔기 길이로 예측된다. TMHMM 소프트웨어는 트랜스멤브래인도메인이 없는 것으로 하였다. 이 cDNA는 대장균에서 C-말단 His-태그 단백질로 발현되었다(도 5). 재조합 단백질의 존재는 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. GMC 산화 환원 효소를 발현하는 E. coli 세포의 휘발성 산물에 대한 SPME 및 GC-MS 분석 결과는 공벡터로 형질전환된 E.coli 세포에는 존재하지 않는 13 내지 17 탄소의 장쇄 알칸이 존재함을 확인하였다(도 6). 따라서, 이러한 결과는 클로렐라 GMC 산화 환원 효소의 발현이 대장균에서 알칸 및 알켄을 생산하기에 충분하다는 것을 입증하였다. 또한, 엽록체 게놈이 클로렐라 효소를 코딩하는 cDNA로 형질전환된 클라미도모나스(Chlamydomonas) 균주에서는, 헵타데센(heptadecene) 함량이 증가되고 또한 헵타데칸도 나타났다(도 7). 따라서, 이러한 결과는 클로렐라 효소가 엽록체 내에서 기능적임을 나타낸다.
클로렐라 GMC 산화 환원 효소 또는 다른 종으로부터의 다른 생화학적으로 특성화된 GMC 산화 환원 효소를 사용하여 BlastP 검색을 공개 데이터베이스에서 실시하여 다양한 GMC 산화 환원 효소 단백질 서열을 검색하였다. 조류 서열의 다중 정렬은, C372, R391, Y406, Q426, H512 및 N515와 같은 일부 클로렐라 잔기가 다른 조류에서 고도로 보존되었고(도 8A) 언루티드 계통수(unrooted phylogenetic tree)가 수행되었음을 나타내었다(도 8B). Blast 검색은 대부분의 유기체에서 GMC 산화 환원 효소가 단일 유전자 군임을 나타냈다. 클로렐라 바리아빌리스 NC64A에서 클로렐라 알칸 합성 효소는 유일한 GMC 산화 환원 효소이다. 계통수는 GMC 산화 환원 효소 군이 적어도 7 개의 그룹으로 이루어졌으며, 그 중 하나는 아직 생화학적 특징이 밝혀지지 않은 구성원임을 보여준다. 흥미롭게도, 갈색 거대조류(macroalgae)(Ectocarpus), 붉은 거대조류(Chondrus) 및 다양한 기원의 미세조류(Trebouxiophyceae Chlorella, Chlorophyceae Chlamydomonas 및 Volvox, Coccomyxaceae Coccomyxa, Eustigmatophycae Nannochloropsis, Coccolithophyceae Emiliana, Diatom Phaeodactylum)의 염기 서열이 함께 분류되었다. 클로렐라 효소는 GMC 산화 환원 효소의 조류(algal) 그룹에서 최초로 기능적으로 특성화되었다.
클로렐라 알칸 합성 효소는 다양한 지방산에 작용하는 광-구동(light-driven) 광효소(photoenzyme)이다
활성을 더욱 특성화하기 위해 클로렐라 GMC 산화 환원 효소를 His-태그 단백질로 대장균에서 발현시키고 니켈 컬럼에서 정제하였다(도 9). 정제된 재조합체는 C12 내지 C22 탄소(도 10)의 범위의 다양한 포화 지방산에서 활성인 것으로 나타났고, 이는 대장균에서 형성된 지방산의 넓은 프로필을 설명한다(도 6).
상기 반응의 부산물을 결정하기 위해, 본 발명자들은 카르복실기가 13C로 표지된 팔미트산을 이용하였다. 본 발명자들은 효소가 부산물로서 CO2, 즉, 지방산 카르복실화 효소를 방출한다는 것을 나타내는 13CO2의 생산을 관찰하였다(도 11).
추가적으로 알칸 합성 효소 활성을 특성화하기 위해, 치환된 지방산을 기질로 이용하였다. 피탄산(Phytanic acid)(3,7,11,15-tetramethylhexadecanoic acid)은, 알칸 합성 효소가 테르펜산(terpenoic acid)에서 활성이 있음을 나타내는 분지 된 알칸으로 전환되는 것으로 밝혀졌다(도 12). 기질로서 16-OH 팔미트산의 이용은, 클로렐라 GMC 산화 환원 효소가 지방 알콜을 생성하는데 사용될 수 있음을 보여주는 펜타데카놀의 생산을 초래한다(도 13).
시험관내에서, 알칸 합성 효소는 기질로 TAG(triacylglycerol)를 직접 사용할 수 없다(도 14). 그러나, 지방산을 방출하는 TAG(triacylglycerol) 지방 분해 효소의 존재 하에서 탄화수소의 생산이 관찰된다. 이러한 관찰은 GMC 산화 환원 효소를 이용하여 지질이 풍부한 기름 및 폐기물로부터 탄화수소를 생산할 수 있음을 보여준다. 도 15는 FAD가 320 내지 540 nm까지 광자를 흡수할 수 있음을 보여준다. 이것은 효소의 작용 스펙트럼과 일치한다(도 16A).
알칸 합성 효소가 광-구동 효소(photoenzyme) 또는 광-활성화 효소인지를 결정하기 위해, 반응 동안 CO2 생산을 모니터링하였다. 효소의 활성은 광자의 존재에 의해 구동되고 빛이 꺼지면 즉시 정지한다(도 16B). 펜타데칸의 생산은 빛의 강도에 따라 선형적으로 증가하고 이는 클로렐라 GMC 산화 환원 효소가 광효소(photoenzyme)라는 사실을 확인시켜준다(도 16C). 조류 알칸 합성 효소의 광-의존성은 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)에서 관찰된 바와 같이 광질(청색 또는 적색)을 이용하여 조류 세포의 탄화수소 생산을 조절하는데 사용될 수 있다 (도 16D). 미세조류는 청색 광자의 존재 하에서 탄화수소를 생산하나, 적색에서는 생산을 멈추고 알칸 함량이 감소한다. 또한, 알칸 광합성효소탄화수소를 발현하는 E. coli 세포에서, 빛은 알칸과 알켄을 최적 생산하는 시간을 선택하기 위한 유도 물질로서 사용될 수 있다(도 17).
기질 농도는 효소 형광을 변화시킨다.
효소의 광 의존성을 기반으로 하여, 본 발명자들은 효소 형광이 기질의 유무에 따라 효소의 활성 동안 변화할 수 있다고 의심하였다. 이러한 목적을 위해, 본 발명자들은 형광 스펙트럼 및 동역학을 만들었다(도 18). 본 발명자들은 기질 농도에 따라 형광 및 운동이 현저하게 변화함을 관찰하였다. 지방산 농도를 결정하기 위해 형광 파라미터를 이용하는 것이 유용할 수 있다.
클라미도모나스 및 패오닥틸륨으로부터의 GMC 산화 환원 효소 또한 알칸 합성 효소
이다
다른 조류 GMC 산화 환원 효소 또한 지방산 탈카르복실화 효소 활성을 가지고 있으며 따라서 알칸 합성 효소일 가능성을 조사하기 위해, 다른 녹조류(Chlamydomonas reinhardtii) 및 규조류(Phaeodactylum tricornutum)의 GMC 산화 환원 효소를 대장균에서 발현시켰고, 상기 박테리아 세포의 총 지방산 및 탄화수소를 GC-MS-FID로 분석하였다. 클라미도모나스 효소는 대장균 세포에서 펜타데칸과 헵타데칸 뿐만 아니라 이들의 단일불포화 유사체(monounsaturated analogs)의 형성을 일으켰다(도 19). 동일한 화합물이 패오닥틸륨 효소에 의해 형성되었으나, 더 적은 양으로 생성되었다.
지방 분해 효소 및 GMC 산화 환원 효소의 동시-발현은 대장균에서 알칸 합성을 촉진시킨다.
유리 지방산은 막 구조에 해롭기 때문에 유리 지방산 풀(Free fatty acid pools)은 살아있는 세포에서 보통 작다. 이용가능한 유리 지방산의 양을 증가시킴으로써 알칸 및 알켄의 생산이 대장균에서 증가될 수 있는지를 확인하기 위해, 박테리아 지방 분해 효소(Uniprot P04635)를 클로렐라 또는 클라미도모나스 알칸 합성 효소와 동시 발현시켰다(도 20). 이는 GMC 산화 환원 효소를 단독으로 발현하는 대장균 균주와 비교하여 대부분의 탄화수소가 2-3 배 증가하는 결과를 초래하였다.
논의
알칸과 알켄은 바이오 연료 생산을 위한 흥미로운 화합물이며 알켄은 특히 화학 산업에서 흥미롭다. 부분 정제 및 프로테옴 분석을 이용하는 이러한 작업에서, 본 발명자들은 클로렐라로부터 미세조류 알칸 합성 효소를 동정할 수 있었다. 그것은 GMC 산화 환원 효소 계통의 일원이다. 대장균에서 발현될 때, 이 단백질 단독으로 알칸과 알켄을 얻을 수 있다. 이 효소의 주요 관심사는 포화 탄화수소를 형성하기 위한 유리 지방산의 공식적인 탈카르복실화를 촉매하는 명백한 능력과 이것이 광 효소라는 사실이다. 메커니즘 및 가능한 보조 인자 요구 조건은 박테리아 시토크롬 P450 알칸 합성 효소와 상이할 것으로 예상된다. 따라서, 클로렐라 GMC 산화 환원 효소는 알칸-합성 효소의 풀을 확장시키고 생물 공학 응용 분야에 새로운 가능성을 제시한다.
GMC 산화 환원 효소의 조류 그룹
GMC 산화 환원 효소 계열은 1992년에 처음 발표되었다. 다양한 유기체(각각 Drosophila melanogaster, Escherichia coli, Aspergillus niger, 및 Hansenula polymorpha)의 글루코오스 탈수소효소, 콜린 탈수소효소, 글루코오스 산화 효소 및 메탄올 산화 효소의 단백질 서열 비교는 낮은 유사성을 보였으나, 모티프들은 보존된 것으로 나타났다. 이러한 효소들은 플라보효소(flavoenzyme) 부위와 이의 아미노 말단에 근접한 기본형 ADP-결합 βαβ 폴드를 함유한다. 구조적 연구는 이들 단백질이 N-말단 FAD 결합 도메인, 및 C-말단 기질-결합 도메인으로 구성되어 있음을 확인하였다. FAD-결합 도메인은 디뉴클레오타이드 결합 단백질의 전형적인 알파 베타 폴드를 형성하는 반면, 기질-결합 도메인은 알파 나선에 의해 둘러싸인 베타 시트로 구성된다. 삽입된 구조적 요소가 콜린 탈수소효소 및 알코올 탈수소 효소 모두에서 발생하였으나, 이러한 단백질의 일반적인 위상은 보존된다.
GMC 산화 환원 효소 계열의 구성원은 다양한 반응, 주로 알콜의 알데히드로의 산화를 촉매한다. 이 계열에는 글루코오스 및 메탄올 산화 효소, 지방 알코올 산화 효소, 콜린 탈수소 효소가 포함된다. 그러나, 상기 계열 역시 히드록시만델로 니트릴(hydroxymandelonitrile)에 작용하는 아몬드(almond)의 리아제(lyase)를 포함하고 있어 상기 계열이 매우 다양한 촉매 메커니즘을 가지고 있음을 보여준다. 빛에 대한 활성의 엄격한 의존성은 재조합 효소와 관련된 것으로 밝혀진 FAD 보조 인자에 의해 매개될 가능성이 있다. FAD의 존재는 클로렐라 효소가 모든 GMC 산화 환원 효소처럼 FAD 결합 도메인을 갖는다는 사실과 일치한다(도 15).
흥미롭게도, 길거나 매우 긴 사슬 알칸(켄)을 생산하는 것으로 나타난 모든 미세조류 종은 클로렐라 GMC 산화 환원 효소에 대한 상동체를 가지고 있으나, 검출가능한 알칸(켄)이 없는 유일한 종(Ostreococcus tauri)은 GMC 동족체도 가지고 있지 않다. 따라서 GMC 산화 환원 효소의 조류 그룹의 구성원은 모두 알칸 합성 효소일 가능성이 높다. 이러한 아이디어는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) 및 패오닥틸륨 트리코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum)의 GMC 산화 효소가 지방산 탈카르복실화 효소 활성을 지니고 있음을 입증한다(도 19).
미세조류 알칸 합성 효소의 생물 공학 응용 가능성
미세조류가 지질을 생산하는 데 유망한 플랫폼이긴 하나, 바이오 매스의 채취, 오일 추출 및 바이오 디젤 전환은 비용이 많이 들기 때문에, 알칸 합성을 위한 미세조류 경로의 발견은 생물 공학적으로 중요하다. 배양 배지로부터 쉽게 회수 될 수 있는 연료-유사 휘발성 알칸의 미세조류에서의 생산은 이러한 문제점을 회피할 수 있다.
시험관 내에서 클로렐라 효소는 중쇄를 포함한 다양한 지방산에 작용할 수 있다 (도 10). 효소가 유리 지방산에 작용한다는 사실은, 이러한 중간체들이 많은 내인성 환원 효소에 의해 분해될 수 있기 때문에 지방 알데히드에 작용하는 식물, 시아노 박테리아 또는 곤충 효소에 비해 분명한 이점이다(Rodriguez & Atsumi, 2014, Metabolic Engineering, 25, 227-37). 또한, 유리 지방산은 다양한 유형의 지방 분해 효소에 의해 생성될 수 있는데, 그 중 일부는 활성이 높고 다양한 지질 기질을 사용할 수 있다(Andersson, 1996, Biochim Biophys Acta, 1302, 236-240). 지방 분해 효소의 동시 발현에 의해 증가되는 유리 지방산의 가용성은 알칸 생산을 향상시킨다(도 20). E.coli에서는 클로렐라 GMC 산화 환원 효소가 발현될 때 일부 트리데칸(tridecane)이 생성된다(도 6). 이 알칸은 조류에서 관찰된 것보다 짧으며 효소에 대한 새로운 기질(myristic acid)이 대장균에 존재하기 때문이다. 따라서, 미세조류 GMC 산화 환원 효소는 특히 단쇄 내지 중쇄 지방산을 축적하는 미생물에서 리파아제와 함께 사용되는 경우 다량의 중쇄 내지 단쇄 알칸을 생성시키는 데 이용될 수 있다.
알칸 합성 효소는 광효소이기 때문에 빛을 사용하여 인비트로 및 인비보에서 알칸 생성을 미세하게 조절할 수 있다. 첫째, 320-540의 광자의 존재 유무는 알칸 생산의 순간을 선택하는 데 사용될 수 있다. 둘째, 광 강도는 알칸 합성 속도를 증가 또는 감소시키는 데 사용될 수 있다. 실험은 연속 조명 하에서 수행되었으나 플래시와 같은 다른 조건이 탄화수소 합성에 흥미있을 수 있다.
마지막으로, 산물(알칸 및 알켄), 부산물(CO2) 및 효소 형광을 이용하여 시료에서 유리 지방산의 농도(또는 지방 분해 효소와 함께 조합하여 이용하는 경우 총 지방산)를 추정할 수 있다.
재료 및 방법
균주 및 배양 조건
클라미도모나스 레인하드티아이 야생형 균주 CC124 (nit1 nit2; mt-) 및 CC125 (nit1 nit2; 415 mt +)를 이용하였다. 클로렐라 바리아비리스 NC64A는 J.L. Van Etten (University of Nebraska)의 실험실로부터 제공받았다. 모든 균주는 2% (v/v) CO2가 풍부한 대기 하에서 140 rpm의 25℃ (Infors HT) 항온 교반기에서, 클라미도모나스는 120 μmol photons m-2s-1에서의 광 강도, 클로렐라는 70 μmol photons m-2s-1에서의 광 강도로 원뿔 플라스크에서 일반적으로 배양되었다. 클라미도모나스 및 클로렐라는 TAP(Tris-Acetate-Phosphate) 배지와 최소 배지에서 배양하였다. 세포는 MultisizerTM 3 (Coulter)를 사용하여 일반적으로 계수되었다.
천연 알칸 합성 효소의 정제
Fast Protein Liquid Chromatography 시스템 (AKTApurifier 900, GE Healthcare)을 사용하였다. 알칸 합성 효소 활성 분석은 다음 섹션에서 설명된다. 클로렐라 세포 (200.109)를 6000g에서 1 시간 동안 원심 분리하고 세포 펠렛을 액체 질소에서 동결시켜서 -80℃에서 1 시간 동안 보관하였다. 20 mM Tris (pH 8.0), 100 mM NaCl 및 1 mM EDTA (완충액 A)를 함유하는 용해 완충액에, 세포를 재현탁시키고 2 kbar 압력에서 세포 파괴 (Constant)를 사용하여 파괴시켰다. 균질액을 50,000 g에서 40 분 동안 두 번 원심 분리하였다. 상등액을 획득하고 105000g에서 90 분간 원심분리하였다. 생성된 마이크로솜 펠렛을 2.7 mM Triton X100이 첨가된 완충액 A에서 교반하면서 4℃에서 밤새 재현탁하였다. 초원심분리를 105,000g에서 90 분 동안 수행하고, 상등액을 겔 여과 컬럼에 로딩하였다. 대부분의 활성 분획을 풀링하여, 30 kDa Amicon® 초원심 필터를 이용하여 농축시키고, 완충액을 20 mM Tris (pH 8.0), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% (w/v) Triton X100 완충액(완충액 완충액 B)으로 바꿨다. 두 번째 정제 단계는 음이온 교환 컬럼 (HiTrap Q FF, GE Healthcare)을 포함한다. 20 mM Tris (pH 8.0), 1 M NaCl, 1 mM EDTA 및 0.05% (w/v) Triton X100 (완충액 C) 완충액의 구배(0-100 %)를 이용하여 단백질을 용출하였다. 대부분의 활성 분획을 풀링하여 30 kDa의 Amicon® 초원심 분리 필터를 이용하여 농축하고 완충액을 희석하여 완충액 B로 바꿨다. 세 번째 정제 단계는 강력한 음이온 교환 컬럼 (Mono Q GI, GE Healthcare)을 사용하였다. 완충액 C의 농도 구배를 이용하여 단백질을 용출하였다. 대부분의 활성 분획은 프로테옴 분석을 위해 보관되었다.
단백질 정제를 위한 활성 분석
효소 분석은 중격이 있는 뚜껑을 사용하여 봉인된 투명 유리 바이알에서 수행되었다. 반응 혼합물은 500μL의 각 정제 분획, 200μM의 과중수소화(perdeuterated)된 팔미트산(에탄올에서의 10mM 스톡 용액) 및 내부 표준 물질로서 45 nmol 헥사데칸(클로로포름에서의 4.5mM 스톡 용액)을 함유하였다. 바이알을 백색광(강도 120 μmol photons m-2s-1)하에서 25℃에서 밤새 120 rpm으로 교반하였다. 주사기를 사용하여 중격을 통해 10 ㎕ NaOH 10 ㎖를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 바이알의 헤드 스페이스에서 홀더 상에 장착된 고체상 마이크로추출(SPME) 섬유(DVB PDMS fused silica, 65 μm double-polar, Supelco)를 인큐베이션하여 생성된 탄화수소를 분석하였다. 실온에서 15 분 인큐베이션 후, SPME 섬유를 GC-MS의 인젝터에 즉시 삽입하고 250℃에서 탈착시켰다. GC-MS 분석은 하기 기술된 바와 같이 수행되었다.
프로테옴 분석
단백질 준비, in-gel 분해 및 nanoLC-MS/MS 분석은 종래 개시된 바와 같이 수행되었다. 간단히 말해, Laemmli 완충액에서 가용화된 단백질을 4-12%(w/v) NuPAGE 겔 (Invitrogen) 위에 스태킹하고 R-250 코마시 블루(BioRad)로 염색하였다. 겔 밴드를 절제하고 단백질을 트립신(Promega)을 이용하여 겔 내에서 분해시켰다. 생성된 펩타이드는 120 분 구배를 이용하는 탠덤 질량 분석기(Ultimate 3000 coupled to LTQ-Orbitrap Velos Pro, Thermo Scientific)에 결합된 나노액체 크로마토그래피로 분석하였다. Uniprot (Chlorella variabilis taxonomy, September 2016 version), 고전적인 오염물(수제) 및 Mascot(version 2.5.1)을 이용하는 해당 역전된 데이터베이스에 대해 수반되는 검색을 통해 펩타이드 및 단백질을 동정하였다. 다른 시료에서 단백질 그룹의 편집, 그룹화 및 비교를 수행하기 전에 프롤린 소프트웨어를 이용하여 결과를 필터링하였다(랭크 1 펩타이드의 보존, 역데이터 분석 전략을 이용한 펩타이드 점수에서 계산한 펩타이드 동정 FDR <1%, 펩타이드 길이 ≥ 7, 동정된 단백질 그룹 당 최소 1 개의 특정 펩타이드). 추가적인 비교를 위해 최소한 2 개의 특정 스펙트럼 카운트로 동정된 단백질만이 고려되었다.
단백질 분석 및 웨스턴 블롯
단백질 추출물에 LDS NuPAGE 로딩 다이 1X 최종을 첨가하여, 95℃에서 10 분간 가열시키고, MOPS 러닝 완충액으로 10%(w/v) SDS-PAGE를 이용하여 환원함으로써 분해한 후 질산은으로 염색하였다. His-태그 단백질을 검출하기 위해, SDS-PAGE로 분해한 폴리펩타이드를 반-건조 블롯팅 시스템을 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 상으로 트랜스퍼한 후, 래빗 항-His 항체, 서양고추냉이 퍼옥시다제-결합 항-래빗 항체 및 ECL 기질(Amersham Biosciences)을 이용하여 His-태그를 노출시켰다.
알칸 합성 효소 cDNA의 클로닝 및 재조합 알칸 합성 효소의 정제
클로렐라 세포로부터 페놀-클로로포름 방법으로 총 RNA를 추출하고 SuperScript III 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 추정 5 '및 3'UTRs 정방향 프라이머(ATGGCGTCAATTACATCGCG 서열번호 24); 역방향 프라이머(TCATGCTGCCACTGTCGC 서열번호 25)로 설계된 프라이머들을 이용하여 GMC 산화 환원 효소를 코딩하는 cDNA를 증폭하고, TOPO XL 플라스미드에 클로닝한 후 시퀀싱하였다. 정방향 프라이머 5'-CTG TAC TTC CAA TCA GCC AGC GCA GTT GAA GAT ATT C-3' (서열번호 27) 및 역방향 프라이머 5'-TAT CCA CCT TTA CTG TTA TCA TGC TGC AAC GGT TGC CGG TG-3' (서열번호 28)를 이용하여, 대장균 발현에 코돈-최적화된 합성 유전자로부터 알칸 합성 효소의 잔기 62-654에 상응하는 서열을 증폭시킨 후, ATG 개시 코돈의 다운스트림에 6 His-태그 티오레독신 및 TEV(tobacco etch virus) 프로테아제-절단 부위를 코딩하는 카세트를 도입한 pLIC07 벡터에 클로닝하였다. 재조합 알칸 합성 효소는 37℃에서 OD 0.9까지 TB 배지에서 배양된 BL21-CodonPlus (DE3)-RIL E. coli 세포에서 생산되었다. 이 단계에서 온도를 17℃로 낮추고 세포를 18 시간 더 배양하였다. 세포를 원심분리(4000g, 10 분)에 의해 수확하고, 펠렛을 동결시켰다. 세포 펠렛을 4℃에서 30 분 동안 용해 완충액에 재현탁하였다(OD = 1에서 세포의 1 리터에 대해 용해 완충액 10 mL). 용해 완충액은 300mM NaCl, 50mM Tris pH 8.0, 10mM 이미다졸, 5%(w/v) 글리세롤, 0.25mg mL-1 리소자임, 20mM MgSO4, 10㎍ mL-1 DNase 및 항프로테아제를 함유하였다. 재현탁후, 세포를 초음파 처리에 의해 용해시키고 8000g에서 30 분 동안 원심분리하였다. 상등액을 수집하고 효소를 FPLC로 정제하였다. 제1 정제를 니켈 컬럼상에서 수행하고 300mM NaCl, 50mM Tris pH 8.0, 500mM 이미다졸 5%(w/v) 글리세롤을 함유한 50%(v/v) 제2 완충액을 사용하여 단계 구배로 단백질을 용출시켰다. 타바코 에칭 바이러스 프로테아제(총 단백질 10mg 당 1mg)를 사용하여 His 태그 및 티오레독신을 컷오프하였다. TEV의 존재하에서 하룻밤 동안 투석을 실시하여 상기 완충액을 300mM NaCl, 50mM Tris pH 8.0, 10mM 이미다졸, 5%(w/v) 글리세롤을 함유하는 완충액으로 바꿨다. 니켈 컬럼을 사용하여 제2 FPLC 크로마토그래피를 수행하여 단백질을 His-태그 티오레독신으로부터 분리하였다. 마지막 정제 단계는 겔 여과 컬럼 (Superdex200 26/600mm GE Healthcare)이었다. 이 단계에 사용된 완충액은 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8.0, 5%(w/v) 글리세롤을 함유하였다. 단백질을 50 kDa Amicon ® 초원심 필터를 사용하여 농축하고 20%(w/v) 글리세롤을 첨가한 후 -80℃에서 보관하였다.
대장균에서 클로렐라 바리아빌리스, 클라미도모나스 레인하드티아이 및 패오닥틸륨 트리코르뉴튬 GMC 산화 환원 효소의 발현
클라미도모나스 레인하드티아이의 경우 정방향 프라이머 5'-TAC TTC CAA TCA ATG ATG CTG GGT CCG AAA ACC-3' (서열번호 29) 및 역방향 프라이머 5'-TAT CCA CCT TTA CTG TTC TAC TAA ACT GCA ACC GGC TGA CG-3' (서열번호 30), 패오닥틸륨 트리코르뉴튬의 경우 정방향 프라이머 5'-TAC TTC CAA TCA ATG AAA AAA AGC CTG CGT AGC-3' (서열번호 31) 및 역방향 프라이머 5'-TAT CCA CCT TTA CTG TTC TAC TAT GCG CTT GCG GTG-3' (서열번호 32)를 이용하여, 클라미도모나스 레인하드티아이 및 패오닥틸륨 트리코르뉴튬 알칸 합성 효소를 대장균에 코돈-최적화된 합성 유전자로부터 증폭시켰다. ATG 개시 코돈의 다운스트림에 6 His-태그 티오레독신 및 TEV(tobacco etch virus) 프로테아제-절단 부위를 코딩하는 카세트를 도입한 pLIC07 벡터에 유전자들을 클로닝하였다. 클로렐라 바리아빌리스 NC64A, 클라미도모나스 레인하드티아이 또는 패오닥틸륨 트리코르뉴튬의 GMC 산화 효소를 발현하는 E. coli 균주를 37℃에서 180 rpm으로 교반하고 100 μmole.photon.m-2.s-1의 광으로 배양하였다. OD가 0.6에 도달하면, 500μM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드를 첨가하였다. 이어서 세포를 37℃에서 24 시간 동안 배양하여, 수확하고, 5% 황산을 첨가한 메탄올을 이용하여 트랜스메틸화시키고, 탄화수소를 헥산으로 추출하고 상술한 바와 같이 GC-MS로 분석하였다.
GMC 산화 환원 효소 및 지방 분해 효소의 대장균에서의 동시 발현
클로렐라 바리아빌리스 NC64A(또는 클라미도모나스 레인하드티아이)의 GMC 산화 효소를 발현하는 벡터 및/또는 박테리아인 스타필로코쿠스 하이쿠스 (Staphylococcus hyicus)의 지방 분해 효소를 발현하는 벡터로 형질전환된 대장균 균주를 37℃의 TB 배지에서 배양하였다. 1 mM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(동시 발현을 위해 0.2% 아라비노즈 첨가)로 발현을 유도시켰다. 그런 다음 세포를 25℃에서 100 μmole.photon.m-2.s-1로 밤새 및 2000 μmole.photon.m-2.s-1로 6 시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하고 (OD = 5에서 4 ml), 5% 황산을 첨가한 메탄올을 이용하여 트랜스메틸화시키고 탄화수소를 SPME 및 GC-MS로 상술한 바와 같이 분석하였다.
정제 효소를 이용한 효소 분석
모든 분석은 중격이 있는 뚜껑을 사용하여 봉인된 투명 유리 바이알에서 수행되었다. Teorell Stenhagen 유니버셜 완충액(33 mM 구연산 일수화물, 33 mM 인산, 100 mM NaOH, 16.7 mM 붕산, 1N HCl로 조정한 pH 8.5)을 사용하여 최적 pH를 결정하였다. 다른 분석은 100 mM Tris HCl pH 8.5, 100 mM NaCl에서 수행되었다. 반응 혼합물(500 μL)은 전형적으로 160 nM의 정제 효소(스톡 용액 2.5 mg ml-1) 및 400 μM 기질 (에탄올에서 10 mM 스톡 용액)을 함유하였다. 일부 분석에서, 지방 분해 효소가 알칸 합성 효소와 함께 사용되었다. 이 경우, 기질은 트리아실글리세롤이었다. 일반적으로, LED로 만들어진 2000 μmol photons m-2s-1의 백색광 하에서 15 분 동안 200 rpm으로 시료를 진탕하였다. 인큐베이션 후, 시료를 95℃에서 15 분 동안 가열하여 효소 반응을 정지시켰다. 시료를 냉각시키고 내부 표준 물질(헥사데칸)을 첨가하였다(클로로포름에서 4.5 mM 스톡 용액으로부터 45 nmol). 이어서, NaOH를 반응 혼합물에 첨가하고(10 M의 스톡 용액으로부터 10 μL) 시료를 5 분 동안 교반하였다. 그런 다음 250 μL 헥산을 첨가하고 시료를 5 분 동안 교반시켜 알칸과 알켄을 추출하였다. 헥산 상을 원심분리에 의해 수집하고 GC-MS-FID로 분석하였다. 헤드스페이스 100 μl를 GC-MS에 직접 주입하여 분석을 수행하였다. 도 11에서, 1-13C-팔미트산염에 대한 활성은 멤브레인 유입 질량 분광법을 사용하여 13CO2 방출로 모니터링하였다. 일루미네이션은 850 μmol photons m-2 s-1의 강도에서 파란색 (460 nm, 25 nm FWHM에서의 피크) 또는 적색(635 nm, 15 nm FWHM에서의 피크) CBT-120 LED (Luminous, Billerica)에 의해 제공되었다.
알칸 합성 효소의 형광
효소를 UV-Vis 분광기(Uvikon XS spectrophotometer from Secomam)로 분석 하였다. 100 mM Tris pH 8.5 및 100 mM NaCl을 함유하는 완충액에서 정제된 효소에 대해 흡광도 스펙트럼을 측정하였다. 10 nm 슬릿을 갖는 450 nm에서의 여기 플럭스를 사용하여 Varian Cary Eclipse에서 형광 스펙트럼 (500 내지 700 nm)을 측정하였다. 운동학을 위해, 10 nm 슬릿을 갖는 450 nm에서의 여기 플럭스를 사용하여 540 nm에서 형광을 측정하였다.
MIMS(Membrane Inlet Mass Spectrometry)
질량 분석기(model Prima B, Thermo Scientific)를 사용하여 12CO2 (m/z = 44) 및 13CO2 (m/z = 45)의 온라인 측정을 모니터링하였다. 멤브레인 주입 시스템은 가스-투과성의 얇은 테플론 멤브레인(0.001 인치 두께, YSI Inc.)을 통해 질량 분석기의 진공 라인에 연결된 열-조절 산소 전극 챔버(Hansa Tech)로 구성되며, 이 멤브레인은 챔버의 바닥을 봉인한다. 분석을 위해, 2.5 mg mL-1의 정제 효소 20 μL및 디메틸설폭시드(13C-팔미트 산)에서의 10 mM의 30 μL 기질을, NaCl 100 mM을 함유하는 1.45 mL의 Tris/Acetate/Borate 완충액 100 mM, pH 6.5에 첨가하고, 측정 챔버에 넣어서, 25℃에서 열-조절시킨 후 연속적으로 교반시켰다. 배지에 용해된 가스는 테프론 막을 통해 질량 분석기의 이온 소스로 확산된다.
광생물반응기(photobioreactors)에서의 배양
클라미도모나스 레인하드티아이 CC124 (nit1 nit2; mt-)와 알칸 합성 효소 유전자를 과발현하는 클라미도모나스 레인하드티아이를 터비도스탯(turbidostat)으로 작동되는 1 리터 광생물반응기(BIOSTAT Aplus, Sartorius Stedim Biotech)에서 최소 배지 (Harris, 1989)로 배양하였다. A880은 바이오매스 프로브(Excellprobe, Exner)를 사용하여 연속적으로 측정하였고, 신선한 배지를 주입함으로써 일정한 A880에서 배양액을 유지하였다. KOH(0.2 N) 또는 HCl(0.2 N)를 주입함으로써 7의 일정한 값으로 pH를 유지하였다. 배양물을 금속 프로펠러 (250 rpm)를 사용하여 교반하였다. 가스 유속은 0.5 L min-1로 조정되었다. 질량 유량계(EL flow, Bronkhorst)를 사용하여 2%(v/v) CO2로 농축된 공기를 생성하였다. 백색광은 광생물반응기 주위에 방사형으로 배치된 8 개의 형광 튜브 (Osram Dulux L 18W)에 의해 공급되었다. 본 발명자들은 청색 필터(363 special medium blue, Lee filters, USA) 및 적색 필터(113 magenta, Lee filters, USA)를 사용하여 청색과 적색을 각각 제공하였다. 두 광원 모두 동일한 강도(35 μmol photons m-2s-1)였다.
트랜스메틸화(Transmethylation)
지방산과 함께 탄화수소를 정량하기 위해, 전체 세포의 트랜스메틸화를 이용하였다. 간단히, 세포 펠렛(클라미도모나스의 경우 1 억개의 세포, 클로렐라 바리아빌리스 NC64A의 경우 2 억개의 세포 및 E.coli의 OD-1 단위 20 mL)에 5%(v/v) 황산 및 메탄올을 함유하는 2 mL 용액을 첨가하고 25 μg의 트리헵타데카노에이트(triheptadecanoate)(클로로포름에서 2.5 mg mL-1의 스톡 용액으로부터)와 5 μg의 16:0-알칸(클로로포름에서 스톡 용액 1 mg mL-1)을 내부 표준으로 포함시켰다. 시료를 밀봉된 유리관에서 85℃에서 90 분간 배양하였다. 냉각 후, 250 μL 헥산 및 500 μL NaCl 0.9%(w/v)를 첨가하여 FAMEs 및 탄화수소를 추출하였다. 시료를 10 분 동안 볼텍싱하고 3000g에서 2 분간 원심 분리하여 유기 상을 수성 상으로부터 분리하였다. 헥산 상을 회수하고 1 μl를 GC-MS/FID에 주입하였다.
GC-MS 분석
고체상 마이크로 추출(SPME) 후 수행된 질량 분석기(GC-MS)에 연결된 가스 크로마토그래피에 의한 분석은 다음의 설정을 사용하여 수행되었다. Thermo-Fischer DSQII 질량 분석기(simple quadrupole)에 연결된 Thermo-Fischer 기체 크로마토그래피 포커스 시리즈를 DB-5HT(Agilent) 무극성 모세관 컬럼(길이 30m, 내부 직경 0.25mm, 필름 두께 0.1㎛)과 함께 사용하였다. 헬륨 캐리어 가스는 1 mL min-1이었다. 오븐 온도는 50℃에서 초기 2 분 유지 시간에 이어 50℃ 내지 300℃로 10℃ min-1로 증가시키고 300℃에서 마지막 3 분간 유지시간으로 프로그래밍하였다. 시료를 250℃에서 비분할(splitless) 모드(2 분)로 주입하였다. MS는 40-500 amu (전자 임팩트 이온화, 70 eV) 이상의 전체 스캔에서 실행되었으며 내부 표준을 사용하여 총 이온 전류를 기준으로 피크를 정량화하였다. 동시-기질 측정을 위해, 컬럼 HP-PLOT Q(직경 0.32 mm X 30 m)을 사용하고 40℃의 오븐 온도와 단일 이온 모니터링(m/z 40, 44, 45)을 사용하여 CO2, 13CO2 및 아르곤을 분석하였다.
GC-MS/FID 분석
지방산과 탄화수소를 함께 정량하기 위해, 트랜스메틸화 반응 후에만 GC-MS/FID(gas chromatography coupled to mass spectrometry and flame ionization detection)에 의한 분석을 실시하였다. 분석은 Agilent 5975C 질량 분석기 (simple quadrupole)에 연결된 Agilent 7890A 가스 크로마토그래피에서 수행되었다. Zebron 7HG-G007-11(Phenomenex) 극성 모세관 컬럼(길이 30m, 내부 직경 0.25mm, 필름 두께 0.25㎛)을 사용하였다. 수소 캐리어 가스는 1 mL min-1이었다. 오븐 온도는 60℃에서 초기 2 분 유지 시간, 150℃에서 5 분 유지 시간을 갖는 20℃ min-1로 60℃ 내지 150℃의 제1 램프에 이어, 6℃ min-1로 150℃ 내지 240℃의 제2 램프 및 240℃에서 마지막 3 분간 유지시간으로 프로그래밍하였다. 시료를 250℃에서 비분할(splitless) 모드(12 분)로 주입하였다. MS는 40-500 amu (70 eV에서의 전자 임팩트 이온화) 이상의 전체 스캔에서 실행되었으며 내부 표준을 사용하여 FID 신호를 기준으로 피크를 정량화하였다.
계통 발생
계통수를 구축하기 위해, Cyanobase (http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase/), NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Phytozome (https://phytozome.Jgi.doe.gov) 또는 Cyanidioschyzon merolae (http://merolae.biol.s. u-tokyo.ac.jp/)에서 원핵 생물과 진핵 생물의 GMC 산화 환원 효소의 56 개 아미노산 서열을 검색하였다. MAFFT 버전 7 프로그램으로 서열을 정렬하였다. 결과물인 정렬은 SeaView 버전 4를 사용하여 수동으로 개선하였으며 상동성이 의심스러운 영역은 추가 분석에서 제거되었다. 총 266 개의 아미노산 위치가 계통발생 분석을 위해 보관되었다. 게통수는 Phighogenetic Inference Package Phylip 버전 3.69에서 NJ(Neighbor-Joining)을 사용하여 얻었다. PROTDIST 프로그램은 거리 매트릭스를 만드는 데 사용되었다. NEIGHBOR 프로그램을 NJ 분석에 사용하고 서열 입력 순서는 무작위로 정하였다(20 회 혼합). SEQBOOT 및 CONSENSE 프로그램은 100 복제 및 일치 트리 재구성에 대한 부트 스트랩 값 계산에 각각 사용되었다. 계통 발생수는 Dendroscope 버전 3으로 그려졌다.
SEQUENCE LISTING
<110> CEA
CNRS
<120> NEW FATTY ACID DECARBOXYLASE AND ITS USES
<130> B2241PC
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 594
<212> PRT
<213> Chlorella variabilis
<400> 1
Arg Ala Ser Ala Val Glu Asp Ile Arg Lys Val Leu Ser Asp Ser Ser
1 5 10 15
Ser Pro Val Ala Gly Gln Lys Tyr Asp Tyr Ile Leu Val Gly Gly Gly
20 25 30
Thr Ala Ala Cys Val Leu Ala Asn Arg Leu Ser Ala Asp Gly Ser Lys
35 40 45
Arg Val Leu Val Leu Glu Ala Gly Pro Asp Asn Thr Ser Arg Asp Val
50 55 60
Lys Ile Pro Ala Ala Ile Thr Arg Leu Phe Arg Ser Pro Leu Asp Trp
65 70 75 80
Asn Leu Phe Ser Glu Leu Gln Glu Gln Leu Ala Glu Arg Gln Ile Tyr
85 90 95
Met Ala Arg Gly Arg Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Asn Ala Thr
100 105 110
Leu Tyr His Arg Gly Ala Ala Gly Asp Tyr Asp Ala Trp Gly Val Glu
115 120 125
Gly Trp Ser Ser Glu Asp Val Leu Ser Trp Phe Val Gln Ala Glu Thr
130 135 140
Asn Ala Asp Phe Gly Pro Gly Ala Tyr His Gly Ser Gly Gly Pro Met
145 150 155 160
Arg Val Glu Asn Pro Arg Tyr Thr Asn Lys Gln Leu His Thr Ala Phe
165 170 175
Phe Lys Ala Ala Glu Glu Val Gly Leu Thr Pro Asn Ser Asp Phe Asn
180 185 190
Asp Trp Ser His Asp His Ala Gly Tyr Gly Thr Phe Gln Val Met Gln
195 200 205
Asp Lys Gly Thr Arg Ala Asp Met Tyr Arg Gln Tyr Leu Lys Pro Val
210 215 220
Leu Gly Arg Arg Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Ala Ala Val Thr Lys
225 230 235 240
Val Asn Ile Asp Gln Ala Ala Gly Lys Ala Gln Ala Leu Gly Val Glu
245 250 255
Phe Ser Thr Asp Gly Pro Thr Gly Glu Arg Leu Ser Ala Glu Leu Ala
260 265 270
Pro Gly Gly Glu Val Ile Met Cys Ala Gly Ala Val His Thr Pro Phe
275 280 285
Leu Leu Lys His Ser Gly Val Gly Pro Ser Ala Glu Leu Lys Glu Phe
290 295 300
Gly Ile Pro Val Val Ser Asn Leu Ala Gly Val Gly Gln Asn Leu Gln
305 310 315 320
Asp Gln Pro Ala Cys Leu Thr Ala Ala Pro Val Lys Glu Lys Tyr Asp
325 330 335
Gly Ile Ala Ile Ser Asp His Ile Tyr Asn Glu Lys Gly Gln Ile Arg
340 345 350
Lys Arg Ala Ile Ala Ser Tyr Leu Leu Gly Gly Arg Gly Gly Leu Thr
355 360 365
Ser Thr Gly Cys Asp Arg Gly Ala Phe Val Arg Thr Ala Gly Gln Ala
370 375 380
Leu Pro Asp Leu Gln Val Arg Phe Val Pro Gly Met Ala Leu Asp Pro
385 390 395 400
Asp Gly Val Ser Thr Tyr Val Arg Phe Ala Lys Phe Gln Ser Gln Gly
405 410 415
Leu Lys Trp Pro Ser Gly Ile Thr Met Gln Leu Ile Ala Cys Arg Pro
420 425 430
Gln Ser Thr Gly Ser Val Gly Leu Lys Ser Ala Asp Pro Phe Ala Pro
435 440 445
Pro Lys Leu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Asp Lys Asp Gly Ala Asp Leu
450 455 460
Ala Thr Leu Arg Lys Gly Ile His Trp Ala Arg Asp Val Ala Arg Ser
465 470 475 480
Ser Ala Leu Ser Glu Tyr Leu Asp Gly Glu Leu Phe Pro Gly Ser Gly
485 490 495
Val Val Ser Asp Asp Gln Ile Asp Glu Tyr Ile Arg Arg Ser Ile His
500 505 510
Ser Ser Asn Ala Ile Thr Gly Thr Cys Lys Met Gly Asn Ala Gly Asp
515 520 525
Ser Ser Ser Val Val Asp Asn Gln Leu Arg Val His Gly Val Glu Gly
530 535 540
Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Val Val Pro Lys Ile Pro Gly Gly Gln
545 550 555 560
Thr Gly Ala Pro Val Val Met Ile Ala Glu Arg Ala Ala Ala Leu Leu
565 570 575
Thr Gly Lys Ala Thr Ile Gly Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Val
580 585 590
Ala Ala
<210> 2
<211> 654
<212> PRT
<213> Chlorella variabilis
<400> 2
Met Ala Ser Ile Thr Ser Arg Ala Ser Ala Arg Ala Ser Cys Ser Gln
1 5 10 15
Ala Asn Thr Arg Ala Gly Arg Val Ala Leu Ser Gly Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Arg Pro Ala Arg Pro Ala Arg Ser Phe Val Pro Ala Arg Lys Gln Gln
35 40 45
Gln Gly Ala Val Arg Arg Gly Gly Ala Leu Ser Ala Arg Ala Ser Ala
50 55 60
Val Glu Asp Ile Arg Lys Val Leu Ser Asp Ser Ser Ser Pro Val Ala
65 70 75 80
Gly Gln Lys Tyr Asp Tyr Ile Leu Val Gly Gly Gly Thr Ala Ala Cys
85 90 95
Val Leu Ala Asn Arg Leu Ser Ala Asp Gly Ser Lys Arg Val Leu Val
100 105 110
Leu Glu Ala Gly Pro Asp Asn Thr Ser Arg Asp Val Lys Ile Pro Ala
115 120 125
Ala Ile Thr Arg Leu Phe Arg Ser Pro Leu Asp Trp Asn Leu Phe Ser
130 135 140
Glu Leu Gln Glu Gln Leu Ala Glu Arg Gln Ile Tyr Met Ala Arg Gly
145 150 155 160
Arg Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Asn Ala Thr Leu Tyr His Arg
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Asp Tyr Asp Ala Trp Gly Val Glu Gly Trp Ser Ser
180 185 190
Glu Asp Val Leu Ser Trp Phe Val Gln Ala Glu Thr Asn Ala Asp Phe
195 200 205
Gly Pro Gly Ala Tyr His Gly Ser Gly Gly Pro Met Arg Val Glu Asn
210 215 220
Pro Arg Tyr Thr Asn Lys Gln Leu His Thr Ala Phe Phe Lys Ala Ala
225 230 235 240
Glu Glu Val Gly Leu Thr Pro Asn Ser Asp Phe Asn Asp Trp Ser His
245 250 255
Asp His Ala Gly Tyr Gly Thr Phe Gln Val Met Gln Asp Lys Gly Thr
260 265 270
Arg Ala Asp Met Tyr Arg Gln Tyr Leu Lys Pro Val Leu Gly Arg Arg
275 280 285
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Ala Ala Val Thr Lys Val Asn Ile Asp
290 295 300
Gln Ala Ala Gly Lys Ala Gln Ala Leu Gly Val Glu Phe Ser Thr Asp
305 310 315 320
Gly Pro Thr Gly Glu Arg Leu Ser Ala Glu Leu Ala Pro Gly Gly Glu
325 330 335
Val Ile Met Cys Ala Gly Ala Val His Thr Pro Phe Leu Leu Lys His
340 345 350
Ser Gly Val Gly Pro Ser Ala Glu Leu Lys Glu Phe Gly Ile Pro Val
355 360 365
Val Ser Asn Leu Ala Gly Val Gly Gln Asn Leu Gln Asp Gln Pro Ala
370 375 380
Cys Leu Thr Ala Ala Pro Val Lys Glu Lys Tyr Asp Gly Ile Ala Ile
385 390 395 400
Ser Asp His Ile Tyr Asn Glu Lys Gly Gln Ile Arg Lys Arg Ala Ile
405 410 415
Ala Ser Tyr Leu Leu Gly Gly Arg Gly Gly Leu Thr Ser Thr Gly Cys
420 425 430
Asp Arg Gly Ala Phe Val Arg Thr Ala Gly Gln Ala Leu Pro Asp Leu
435 440 445
Gln Val Arg Phe Val Pro Gly Met Ala Leu Asp Pro Asp Gly Val Ser
450 455 460
Thr Tyr Val Arg Phe Ala Lys Phe Gln Ser Gln Gly Leu Lys Trp Pro
465 470 475 480
Ser Gly Ile Thr Met Gln Leu Ile Ala Cys Arg Pro Gln Ser Thr Gly
485 490 495
Ser Val Gly Leu Lys Ser Ala Asp Pro Phe Ala Pro Pro Lys Leu Ser
500 505 510
Pro Gly Tyr Leu Thr Asp Lys Asp Gly Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg
515 520 525
Lys Gly Ile His Trp Ala Arg Asp Val Ala Arg Ser Ser Ala Leu Ser
530 535 540
Glu Tyr Leu Asp Gly Glu Leu Phe Pro Gly Ser Gly Val Val Ser Asp
545 550 555 560
Asp Gln Ile Asp Glu Tyr Ile Arg Arg Ser Ile His Ser Ser Asn Ala
565 570 575
Ile Thr Gly Thr Cys Lys Met Gly Asn Ala Gly Asp Ser Ser Ser Val
580 585 590
Val Asp Asn Gln Leu Arg Val His Gly Val Glu Gly Leu Arg Val Val
595 600 605
Asp Ala Ser Val Val Pro Lys Ile Pro Gly Gly Gln Thr Gly Ala Pro
610 615 620
Val Val Met Ile Ala Glu Arg Ala Ala Ala Leu Leu Thr Gly Lys Ala
625 630 635 640
Thr Ile Gly Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Val Ala Ala
645 650
<210> 3
<211> 729
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> shGMC
<400> 3
Met Gly His His His His His His Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr
1 5 10 15
Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu
20 25 30
Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro
35 40 45
Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala
50 55 60
Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile
65 70 75 80
Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala
85 90 95
Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp
100 105 110
Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Val Ser Gly Val Asp Leu Gly
115 120 125
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Ala Ser Ala Val Glu Asp Ile Arg
130 135 140
Lys Val Leu Ser Asp Ser Ser Ser Pro Val Ala Gly Gln Lys Tyr Asp
145 150 155 160
Tyr Ile Leu Val Gly Gly Gly Thr Ala Ala Cys Val Leu Ala Asn Arg
165 170 175
Leu Ser Ala Asp Gly Ser Lys Arg Val Leu Val Leu Glu Ala Gly Pro
180 185 190
Asp Asn Thr Ser Arg Asp Val Lys Ile Pro Ala Ala Ile Thr Arg Leu
195 200 205
Phe Arg Ser Pro Leu Asp Trp Asn Leu Phe Ser Glu Leu Gln Glu Gln
210 215 220
Leu Ala Glu Arg Gln Ile Tyr Met Ala Arg Gly Arg Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Ser Ser Ala Thr Asn Ala Thr Leu Tyr His Arg Gly Ala Ala Gly Asp
245 250 255
Tyr Asp Ala Trp Gly Val Glu Gly Trp Ser Ser Glu Asp Val Leu Ser
260 265 270
Trp Phe Val Gln Ala Glu Thr Asn Ala Asp Phe Gly Pro Gly Ala Tyr
275 280 285
His Gly Ser Gly Gly Pro Met Arg Val Glu Asn Pro Arg Tyr Thr Asn
290 295 300
Lys Gln Leu His Thr Ala Phe Phe Lys Ala Ala Glu Glu Val Gly Leu
305 310 315 320
Thr Pro Asn Ser Asp Phe Asn Asp Trp Ser His Asp His Ala Gly Tyr
325 330 335
Gly Thr Phe Gln Val Met Gln Asp Lys Gly Thr Arg Ala Asp Met Tyr
340 345 350
Arg Gln Tyr Leu Lys Pro Val Leu Gly Arg Arg Asn Leu Gln Val Leu
355 360 365
Thr Gly Ala Ala Val Thr Lys Val Asn Ile Asp Gln Ala Ala Gly Lys
370 375 380
Ala Gln Ala Leu Gly Val Glu Phe Ser Thr Asp Gly Pro Thr Gly Glu
385 390 395 400
Arg Leu Ser Ala Glu Leu Ala Pro Gly Gly Glu Val Ile Met Cys Ala
405 410 415
Gly Ala Val His Thr Pro Phe Leu Leu Lys His Ser Gly Val Gly Pro
420 425 430
Ser Ala Glu Leu Lys Glu Phe Gly Ile Pro Val Val Ser Asn Leu Ala
435 440 445
Gly Val Gly Gln Asn Leu Gln Asp Gln Pro Ala Cys Leu Thr Ala Ala
450 455 460
Pro Val Lys Glu Lys Tyr Asp Gly Ile Ala Ile Ser Asp His Ile Tyr
465 470 475 480
Asn Glu Lys Gly Gln Ile Arg Lys Arg Ala Ile Ala Ser Tyr Leu Leu
485 490 495
Gly Gly Arg Gly Gly Leu Thr Ser Thr Gly Cys Asp Arg Gly Ala Phe
500 505 510
Val Arg Thr Ala Gly Gln Ala Leu Pro Asp Leu Gln Val Arg Phe Val
515 520 525
Pro Gly Met Ala Leu Asp Pro Asp Gly Val Ser Thr Tyr Val Arg Phe
530 535 540
Ala Lys Phe Gln Ser Gln Gly Leu Lys Trp Pro Ser Gly Ile Thr Met
545 550 555 560
Gln Leu Ile Ala Cys Arg Pro Gln Ser Thr Gly Ser Val Gly Leu Lys
565 570 575
Ser Ala Asp Pro Phe Ala Pro Pro Lys Leu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr
580 585 590
Asp Lys Asp Gly Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Lys Gly Ile His Trp
595 600 605
Ala Arg Asp Val Ala Arg Ser Ser Ala Leu Ser Glu Tyr Leu Asp Gly
610 615 620
Glu Leu Phe Pro Gly Ser Gly Val Val Ser Asp Asp Gln Ile Asp Glu
625 630 635 640
Tyr Ile Arg Arg Ser Ile His Ser Ser Asn Ala Ile Thr Gly Thr Cys
645 650 655
Lys Met Gly Asn Ala Gly Asp Ser Ser Ser Val Val Asp Asn Gln Leu
660 665 670
Arg Val His Gly Val Glu Gly Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Val Val
675 680 685
Pro Lys Ile Pro Gly Gly Gln Thr Gly Ala Pro Val Val Met Ile Ala
690 695 700
Glu Arg Ala Ala Ala Leu Leu Thr Gly Lys Ala Thr Ile Gly Ala Ser
705 710 715 720
Ala Ala Ala Pro Ala Thr Val Ala Ala
725
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Consensus sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(7)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X is D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X is A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X is K or R
<400> 4
Gly Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Gly Xaa Phe Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 5
<211> 580
<212> PRT
<213> Chlamydomonas reinhardtii
<400> 5
Leu Ser Val Arg Ala Ala Ala Gly Pro Ala Gly Ser Glu Lys Phe Asp
1 5 10 15
Tyr Val Leu Val Gly Gly Gly Thr Ala Ser Cys Val Leu Ala Asn Lys
20 25 30
Leu Ser Ala Asp Gly Asn Lys Lys Val Leu Val Leu Glu Ala Gly Pro
35 40 45
Thr Gly Asp Ala Met Glu Val Ala Val Pro Ala Gly Ile Thr Arg Leu
50 55 60
Phe Ala His Pro Val Met Asp Trp Gly Met Ser Ser Leu Thr Gln Lys
65 70 75 80
Gln Leu Val Ala Arg Glu Ile Tyr Leu Ala Arg Gly Arg Met Leu Gly
85 90 95
Gly Ser Ser Gly Ser Asn Ala Thr Leu Tyr His Arg Gly Ser Ala Ala
100 105 110
Asp Tyr Asp Ala Trp Gly Leu Glu Gly Trp Ser Ser Lys Asp Val Leu
115 120 125
Asp Trp Phe Val Lys Ala Glu Cys Tyr Ala Asp Gly Pro Lys Pro Tyr
130 135 140
His Gly Thr Gly Gly Ser Met Asn Thr Glu Gln Pro Arg Tyr Glu Asn
145 150 155 160
Val Leu His Asp Glu Phe Phe Lys Ala Ala Ala Ala Thr Gly Leu Pro
165 170 175
Ala Asn Pro Asp Phe Asn Asp Trp Ser His Pro Gln Asp Gly Phe Gly
180 185 190
Glu Phe Gln Val Ser Gln Lys Lys Gly Gln Arg Ala Asp Thr Tyr Arg
195 200 205
Thr Tyr Leu Lys Pro Ala Met Ala Arg Gly Asn Leu Lys Val Val Ile
210 215 220
Gly Ala Arg Ala Thr Lys Val Asn Ile Glu Lys Gly Ser Ser Gly Ala
225 230 235 240
Arg Thr Thr Gly Val Glu Tyr Ala Met Gln Gln Phe Gly Asp Arg Phe
245 250 255
Thr Ala Glu Leu Ala Pro Gly Gly Glu Val Leu Met Cys Ser Gly Ala
260 265 270
Val His Thr Pro His Leu Leu Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Ala Ala
275 280 285
Thr Leu Lys Glu His Gly Ile Asp Val Val Ser Asp Leu Ser Gly Val
290 295 300
Gly Gln Asn Leu Gln Asp His Pro Ala Ala Val Leu Ala Ala Arg Ala
305 310 315 320
Lys Pro Glu Phe Glu Lys Leu Ser Val Thr Ser Glu Val Tyr Asp Asp
325 330 335
Lys Cys Asn Ile Lys Leu Gly Ala Val Ala Gln Tyr Leu Phe Gln Arg
340 345 350
Arg Gly Pro Leu Ala Thr Thr Gly Cys Asp His Gly Ala Phe Val Arg
355 360 365
Thr Ser Ser Ser Leu Ser Gln Pro Asp Leu Gln Met Arg Phe Val Pro
370 375 380
Gly Cys Ala Leu Asp Pro Asp Gly Val Lys Ser Tyr Ile Val Phe Gly
385 390 395 400
Glu Leu Lys Lys Gln Gly Arg Ala Trp Pro Gly Gly Ile Thr Leu Gln
405 410 415
Leu Leu Ala Ile Arg Ala Lys Ser Lys Gly Ser Ile Gly Leu Lys Ala
420 425 430
Ala Asp Pro Phe Ile Asn Pro Ala Ile Asn Ile Asn Tyr Phe Ser Asp
435 440 445
Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Val Asn Ala Val Lys Met Ala Arg Lys
450 455 460
Ile Ala Ala Gln Glu Pro Leu Lys Lys Tyr Leu Gln Glu Glu Thr Phe
465 470 475 480
Pro Gly Glu Arg Ala Ser Ser Asp Lys Asp Leu Glu Glu Tyr Ile Arg
485 490 495
Arg Thr Val His Ser Gly Asn Ala Leu Val Gly Thr Ala Ala Met Gly
500 505 510
Ala Ser Pro Ala Ala Gly Ala Val Val Ser Ser Ala Asp Leu Lys Val
515 520 525
Phe Gly Val Glu Gly Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Val Leu Pro Arg
530 535 540
Ile Pro Gly Gly Gln Thr Gly Ala Ala Thr Val Met Val Ala Glu Arg
545 550 555 560
Ala Ala Ala Leu Leu Arg Gly Gln Ala Thr Ile Ala Pro Ser Arg Gln
565 570 575
Pro Val Ala Val
580
<210> 6
<211> 611
<212> PRT
<213> Chlamydomonas reinhardtii
<400> 6
Met Met Leu Gly Pro Lys Thr Val Thr Arg Gly Ala Thr Lys Gly Ala
1 5 10 15
Ala Pro Arg Ser Met Ala Ala Arg Arg Val Gly Gly Ala Arg Arg Leu
20 25 30
Ser Val Arg Ala Ala Ala Gly Pro Ala Gly Ser Glu Lys Phe Asp Tyr
35 40 45
Val Leu Val Gly Gly Gly Thr Ala Ser Cys Val Leu Ala Asn Lys Leu
50 55 60
Ser Ala Asp Gly Asn Lys Lys Val Leu Val Leu Glu Ala Gly Pro Thr
65 70 75 80
Gly Asp Ala Met Glu Val Ala Val Pro Ala Gly Ile Thr Arg Leu Phe
85 90 95
Ala His Pro Val Met Asp Trp Gly Met Ser Ser Leu Thr Gln Lys Gln
100 105 110
Leu Val Ala Arg Glu Ile Tyr Leu Ala Arg Gly Arg Met Leu Gly Gly
115 120 125
Ser Ser Gly Ser Asn Ala Thr Leu Tyr His Arg Gly Ser Ala Ala Asp
130 135 140
Tyr Asp Ala Trp Gly Leu Glu Gly Trp Ser Ser Lys Asp Val Leu Asp
145 150 155 160
Trp Phe Val Lys Ala Glu Cys Tyr Ala Asp Gly Pro Lys Pro Tyr His
165 170 175
Gly Thr Gly Gly Ser Met Asn Thr Glu Gln Pro Arg Tyr Glu Asn Val
180 185 190
Leu His Asp Glu Phe Phe Lys Ala Ala Ala Ala Thr Gly Leu Pro Ala
195 200 205
Asn Pro Asp Phe Asn Asp Trp Ser His Pro Gln Asp Gly Phe Gly Glu
210 215 220
Phe Gln Val Ser Gln Lys Lys Gly Gln Arg Ala Asp Thr Tyr Arg Thr
225 230 235 240
Tyr Leu Lys Pro Ala Met Ala Arg Gly Asn Leu Lys Val Val Ile Gly
245 250 255
Ala Arg Ala Thr Lys Val Asn Ile Glu Lys Gly Ser Ser Gly Ala Arg
260 265 270
Thr Thr Gly Val Glu Tyr Ala Met Gln Gln Phe Gly Asp Arg Phe Thr
275 280 285
Ala Glu Leu Ala Pro Gly Gly Glu Val Leu Met Cys Ser Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Pro His Leu Leu Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Ala Ala Thr
305 310 315 320
Leu Lys Glu His Gly Ile Asp Val Val Ser Asp Leu Ser Gly Val Gly
325 330 335
Gln Asn Leu Gln Asp His Pro Ala Ala Val Leu Ala Ala Arg Ala Lys
340 345 350
Pro Glu Phe Glu Lys Leu Ser Val Thr Ser Glu Val Tyr Asp Asp Lys
355 360 365
Cys Asn Ile Lys Leu Gly Ala Val Ala Gln Tyr Leu Phe Gln Arg Arg
370 375 380
Gly Pro Leu Ala Thr Thr Gly Cys Asp His Gly Ala Phe Val Arg Thr
385 390 395 400
Ser Ser Ser Leu Ser Gln Pro Asp Leu Gln Met Arg Phe Val Pro Gly
405 410 415
Cys Ala Leu Asp Pro Asp Gly Val Lys Ser Tyr Ile Val Phe Gly Glu
420 425 430
Leu Lys Lys Gln Gly Arg Ala Trp Pro Gly Gly Ile Thr Leu Gln Leu
435 440 445
Leu Ala Ile Arg Ala Lys Ser Lys Gly Ser Ile Gly Leu Lys Ala Ala
450 455 460
Asp Pro Phe Ile Asn Pro Ala Ile Asn Ile Asn Tyr Phe Ser Asp Pro
465 470 475 480
Ala Asp Leu Ala Thr Leu Val Asn Ala Val Lys Met Ala Arg Lys Ile
485 490 495
Ala Ala Gln Glu Pro Leu Lys Lys Tyr Leu Gln Glu Glu Thr Phe Pro
500 505 510
Gly Glu Arg Ala Ser Ser Asp Lys Asp Leu Glu Glu Tyr Ile Arg Arg
515 520 525
Thr Val His Ser Gly Asn Ala Leu Val Gly Thr Ala Ala Met Gly Ala
530 535 540
Ser Pro Ala Ala Gly Ala Val Val Ser Ser Ala Asp Leu Lys Val Phe
545 550 555 560
Gly Val Glu Gly Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Val Leu Pro Arg Ile
565 570 575
Pro Gly Gly Gln Thr Gly Ala Ala Thr Val Met Val Ala Glu Arg Ala
580 585 590
Ala Ala Leu Leu Arg Gly Gln Ala Thr Ile Ala Pro Ser Arg Gln Pro
595 600 605
Val Ala Val
610
<210> 7
<211> 568
<212> PRT
<213> Phaeodactylum tricornutum
<400> 7
Tyr Asp Tyr Ile Ile Cys Gly Gly Gly Leu Ala Gly Cys Val Leu Ala
1 5 10 15
Glu Arg Leu Ser Gln Asp Glu Ser Lys Arg Val Leu Val Leu Glu Ala
20 25 30
Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Ser Leu Phe Ile Arg Ile Pro Ala Gly Val
35 40 45
Leu Arg Leu Phe Arg Ser Lys Tyr Asp Trp Gln His Glu Thr Gly Gly
50 55 60
Glu Lys Gly Cys Asn Gly Arg Asn Val Phe Leu Gln Arg Gly Lys Ile
65 70 75 80
Leu Gly Gly Ser Ser Cys Thr Asn Val Cys Leu His His Arg Gly Ser
85 90 95
Ala Glu Asp Tyr Asn Ser Trp Asn Ile Pro Gly Trp Thr Ala Thr Asp
100 105 110
Val Leu Pro Phe Phe Lys Gln Ser Gln Lys Asp Glu Thr Gly Arg Asp
115 120 125
Ala Thr Phe His Gly Ala Asp Gly Glu Trp Val Met Asp Glu Val Arg
130 135 140
Tyr Gln Asn Pro Leu Ser Lys Leu Phe Leu Glu Val Gly Glu Ala Ala
145 150 155 160
Gly Leu Gly Thr Asn Asp Asp Phe Asn Asn Trp Ser His Pro Gln Asp
165 170 175
Gly Val Gly Arg Phe Gln Val Ser Glu Val Asn Gly Glu Arg Cys Ser
180 185 190
Gly Ala Thr Ala Phe Leu Ser Lys Ala Ala Lys Arg Ser Asn Val Ile
195 200 205
Val Arg Thr Gly Thr Met Val Arg Arg Ile Asp Phe Asp Glu Thr Lys
210 215 220
Thr Ala Lys Gly Ile Thr Tyr Asp Leu Met Gly Asp Asp Thr Cys Thr
225 230 235 240
Thr Phe Gln Ala Cys Leu Lys Glu Gly Gly Glu Val Leu Val Thr Gly
245 250 255
Gly Ala Ile Ala Ser Pro Gln Leu Leu Met Cys Ser Gly Ile Gly Pro
260 265 270
Gly Lys His Leu Arg Ser Leu Gly Ile Pro Val Val His Asp Asn Ser
275 280 285
Ala Val Gly Glu Asn Leu Gln Asp His Pro Ala Ala Val Val Ser Phe
290 295 300
Lys Thr Pro Gln Lys Gly Val Ser Val Thr Ser Lys Leu Arg Leu Phe
305 310 315 320
Gly Lys Thr Asn Pro Ile Pro Val Phe Gln Trp Leu Phe Phe Lys Ser
325 330 335
Gly Leu Leu Thr Ser Thr Gly Cys Asp His Gly Ala Phe Val Arg Thr
340 345 350
Ser Asp Ser Leu Glu Gln Pro Asp Leu Gln Ile Arg Phe Leu Ala Ala
355 360 365
Arg Ala Leu Gly Pro Asp Gly Met Thr Thr Tyr Thr Lys Phe Arg Thr
370 375 380
Met Lys Thr Val Glu Asp Gly Tyr Ser Phe Gln Ser Val Ala Cys Arg
385 390 395 400
Ala Lys Ser Lys Gly Arg Ile Arg Leu Ser Ser Ser Asn Ser His Val
405 410 415
Lys Pro Met Ile Asp Gly Gly Tyr Leu Ser Asn Gln Asp Asp Leu Ala
420 425 430
Thr Leu Arg Ala Gly Ile Lys Leu Gly Arg Met Leu Gly Asn Arg Pro
435 440 445
Glu Trp Gly Glu Tyr Leu Gly Gln Glu Val Tyr Pro Gly Pro Asp Val
450 455 460
Gln Thr Asp Glu Glu Ile Asp Glu Tyr Ile Arg Asn Ser Leu His Thr
465 470 475 480
Ala Asn Ala Leu Thr Gly Thr Cys Lys Met Gly Thr Gly Arg Gly Ala
485 490 495
Val Val Gly Pro Asp Leu Arg Val Ile Gly Val Asn Gly Val Arg Val
500 505 510
Gly Asp Ser Ser Val Phe Pro Cys Ile Pro Gly Gly Gln Thr Ala Thr
515 520 525
Pro Thr Val Met Ile Gly Asp Arg Ala Ala Val Phe Val Arg Gln Pro
530 535 540
Val Ser Gln Leu Asn Ile Glu Ile Phe Arg Glu Lys Gly Gly Thr His
545 550 555 560
Pro Gly Ala Thr Thr Ala Ser Ala
565
<210> 8
<211> 614
<212> PRT
<213> Phaeodactylum tricornutum
<400> 8
Met Lys Lys Ser Leu Arg Ser Leu Leu Val Trp Thr Leu Ser Val Ser
1 5 10 15
Ser Ala Ser Ala Thr Thr Met Ala Gly Ala Lys Pro Leu Gly Asn Val
20 25 30
Pro Arg Ala Gln Glu Asp Glu Arg Lys Val Val Ala Glu Pro Tyr Asp
35 40 45
Tyr Ile Ile Cys Gly Gly Gly Leu Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Arg
50 55 60
Leu Ser Gln Asp Glu Ser Lys Arg Val Leu Val Leu Glu Ala Gly Gly
65 70 75 80
Ser Asp Tyr Lys Ser Leu Phe Ile Arg Ile Pro Ala Gly Val Leu Arg
85 90 95
Leu Phe Arg Ser Lys Tyr Asp Trp Gln His Glu Thr Gly Gly Glu Lys
100 105 110
Gly Cys Asn Gly Arg Asn Val Phe Leu Gln Arg Gly Lys Ile Leu Gly
115 120 125
Gly Ser Ser Cys Thr Asn Val Cys Leu His His Arg Gly Ser Ala Glu
130 135 140
Asp Tyr Asn Ser Trp Asn Ile Pro Gly Trp Thr Ala Thr Asp Val Leu
145 150 155 160
Pro Phe Phe Lys Gln Ser Gln Lys Asp Glu Thr Gly Arg Asp Ala Thr
165 170 175
Phe His Gly Ala Asp Gly Glu Trp Val Met Asp Glu Val Arg Tyr Gln
180 185 190
Asn Pro Leu Ser Lys Leu Phe Leu Glu Val Gly Glu Ala Ala Gly Leu
195 200 205
Gly Thr Asn Asp Asp Phe Asn Asn Trp Ser His Pro Gln Asp Gly Val
210 215 220
Gly Arg Phe Gln Val Ser Glu Val Asn Gly Glu Arg Cys Ser Gly Ala
225 230 235 240
Thr Ala Phe Leu Ser Lys Ala Ala Lys Arg Ser Asn Val Ile Val Arg
245 250 255
Thr Gly Thr Met Val Arg Arg Ile Asp Phe Asp Glu Thr Lys Thr Ala
260 265 270
Lys Gly Ile Thr Tyr Asp Leu Met Gly Asp Asp Thr Cys Thr Thr Phe
275 280 285
Gln Ala Cys Leu Lys Glu Gly Gly Glu Val Leu Val Thr Gly Gly Ala
290 295 300
Ile Ala Ser Pro Gln Leu Leu Met Cys Ser Gly Ile Gly Pro Gly Lys
305 310 315 320
His Leu Arg Ser Leu Gly Ile Pro Val Val His Asp Asn Ser Ala Val
325 330 335
Gly Glu Asn Leu Gln Asp His Pro Ala Ala Val Val Ser Phe Lys Thr
340 345 350
Pro Gln Lys Gly Val Ser Val Thr Ser Lys Leu Arg Leu Phe Gly Lys
355 360 365
Thr Asn Pro Ile Pro Val Phe Gln Trp Leu Phe Phe Lys Ser Gly Leu
370 375 380
Leu Thr Ser Thr Gly Cys Asp His Gly Ala Phe Val Arg Thr Ser Asp
385 390 395 400
Ser Leu Glu Gln Pro Asp Leu Gln Ile Arg Phe Leu Ala Ala Arg Ala
405 410 415
Leu Gly Pro Asp Gly Met Thr Thr Tyr Thr Lys Phe Arg Thr Met Lys
420 425 430
Thr Val Glu Asp Gly Tyr Ser Phe Gln Ser Val Ala Cys Arg Ala Lys
435 440 445
Ser Lys Gly Arg Ile Arg Leu Ser Ser Ser Asn Ser His Val Lys Pro
450 455 460
Met Ile Asp Gly Gly Tyr Leu Ser Asn Gln Asp Asp Leu Ala Thr Leu
465 470 475 480
Arg Ala Gly Ile Lys Leu Gly Arg Met Leu Gly Asn Arg Pro Glu Trp
485 490 495
Gly Glu Tyr Leu Gly Gln Glu Val Tyr Pro Gly Pro Asp Val Gln Thr
500 505 510
Asp Glu Glu Ile Asp Glu Tyr Ile Arg Asn Ser Leu His Thr Ala Asn
515 520 525
Ala Leu Thr Gly Thr Cys Lys Met Gly Thr Gly Arg Gly Ala Val Val
530 535 540
Gly Pro Asp Leu Arg Val Ile Gly Val Asn Gly Val Arg Val Gly Asp
545 550 555 560
Ser Ser Val Phe Pro Cys Ile Pro Gly Gly Gln Thr Ala Thr Pro Thr
565 570 575
Val Met Ile Gly Asp Arg Ala Ala Val Phe Val Arg Gln Pro Val Ser
580 585 590
Gln Leu Asn Ile Glu Ile Phe Arg Glu Lys Gly Gly Thr His Pro Gly
595 600 605
Ala Thr Thr Ala Ser Ala
610
<210> 9
<211> 585
<212> PRT
<213> Coccomyxa subellipsoidea
<400> 9
Ala Leu Arg Val Arg Ala Ile Ile Lys Ser Asp Asn Pro Ala Ala Asp
1 5 10 15
Lys Tyr Asp Phe Ile Leu Val Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Val Leu
20 25 30
Ala Asn Arg Leu Thr Ala Asp Gly Ser Lys Lys Val Leu Leu Leu Glu
35 40 45
Ala Gly Gly Ala Asn Lys Ala Arg Glu Val Arg Thr Pro Ala Gly Leu
50 55 60
Pro Arg Leu Phe Lys Ser Ala Leu Asp Trp Asn Leu Tyr Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Gln Ala Ala Ser Asp Arg Ser Ile Tyr Leu Ala Arg Gly Lys Leu
85 90 95
Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Asn Ala Thr Leu Tyr His Arg Gly Thr
100 105 110
Ala Ala Asp Tyr Asp Ala Trp Gly Val Pro Gly Trp Thr Ser Gln Asp
115 120 125
Ala Leu Arg Trp Phe Ile Gln Ala Glu Asn Asn Cys Arg Gly Ile Glu
130 135 140
Asp Gly Val His Gly Thr Gly Gly Leu Met Arg Val Glu Asn Pro Arg
145 150 155 160
Tyr Asn Asn Pro Leu His Glu Val Phe Phe Gln Ala Ala Lys Gln Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Glu Asn Asp Asn Phe Asn Asn Trp Gly Arg Ser Gln Ala
180 185 190
Gly Tyr Gly Glu Phe Gln Val Thr His Ser Lys Gly Glu Arg Ala Asp
195 200 205
Cys Phe Arg Met Tyr Leu Glu Pro Val Met Gly Arg Ser Asn Leu Thr
210 215 220
Val Leu Thr Gly Ala Lys Thr Leu Lys Ile Glu Thr Glu Lys Ser Gly
225 230 235 240
Gly Ala Thr Val Ser Arg Gly Val Thr Phe Gln Val Asn Gly Gln Asp
245 250 255
Gly Ser Lys His Ser Ala Glu Leu Ala Ala Gly Gly Glu Val Val Leu
260 265 270
Cys Ala Gly Ser Ile His Ser Pro Gln Ile Leu Gln Leu Ser Gly Ile
275 280 285
Gly Pro Gln Ala Glu Leu Arg Ser Lys Asp Ile Pro Val Val Ala Asp
290 295 300
Leu Pro Gly Val Gly Gln Asn Met Gln Asp His Pro Ala Cys Leu Ser
305 310 315 320
Ala Phe Tyr Leu Lys Glu Ser Ala Gly Pro Ile Ser Val Thr Asp Glu
325 330 335
Leu Leu His Thr Asn Gly Arg Ile Arg Ala Arg Ala Ile Leu Lys Tyr
340 345 350
Leu Leu Phe Lys Lys Gly Pro Leu Ala Thr Thr Gly Cys Asp His Gly
355 360 365
Ala Phe Val Lys Thr Ala Gly Gln Ser Glu Pro Asp Leu Gln Ile Arg
370 375 380
Phe Val Pro Gly Leu Ala Leu Asp Pro Asp Gly Ile Gly Ser Tyr Thr
385 390 395 400
Ala Phe Gly Lys Met Lys Asp Gln Lys Trp Pro Ser Gly Ile Thr Phe
405 410 415
Gln Leu Leu Gly Val Arg Pro Lys Ser Arg Gly Ser Val Gly Leu Arg
420 425 430
Ser Asp Asp Pro Trp Asp Ala Pro Lys Leu Asp Ile Gly Phe Leu Thr
435 440 445
Asp Lys Glu Gly Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Ser Gly Ile Lys Leu
450 455 460
Ser Arg Glu Ile Ala Ala Glu Pro Ala Phe Gly Ala Tyr Val Gly Asn
465 470 475 480
Glu Leu His Pro Gly Ala Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Ile Asp Ser
485 490 495
Phe Ile Arg Asp Thr Val His Ser Gly Asn Ala Asn Val Gly Thr Cys
500 505 510
Ser Met Gly Val Asn Gly Asn Ala Val Val Asp Pro Ser Leu Arg Val
515 520 525
Phe Gly Ile Arg Gly Leu Arg Val Ala Asp Ala Ser Val Ile Pro Val
530 535 540
Ile Pro Gly Gly Gln Thr Gly Ala Ala Thr Val Met Val Ala Glu Arg
545 550 555 560
Ala Ala Glu Ile Leu Leu Gly Ser Asn Gln Lys Gln Pro Ala Ala Ala
565 570 575
Val Pro Ala Ala Gln Pro Ala Leu Ala
580 585
<210> 10
<211> 580
<212> PRT
<213> Volvox carteri
<400> 10
Pro Val Ala Val Lys Ala Ala Ala Ser Val Gly Ser Glu Lys Phe Asp
1 5 10 15
Tyr Ile Leu Val Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Val Leu Ala Asn Lys
20 25 30
Leu Ser Ala Asn Gly Ser Lys Lys Val Leu Val Leu Glu Ala Gly Pro
35 40 45
Thr Gly Asp Ala Met Glu Val Ala Val Pro Ala Gly Ile Ala Arg Leu
50 55 60
Phe Ala His Pro Val Phe Asp Trp Gly Met Ser Ser Leu Thr Gln Gln
65 70 75 80
Gln Leu Val Ala Arg Glu Ile Tyr Leu Ala Arg Gly Arg Leu Leu Gly
85 90 95
Gly Ser Ser Gly Thr Asn Ala Thr Leu Tyr His Arg Gly Thr Pro Ala
100 105 110
Asp Tyr Asp Ser Trp Gly Leu Glu Gly Trp Thr Ser Lys Asp Leu Leu
115 120 125
Asp Trp Phe Val Lys Ala Glu Cys Tyr Gly Asp Gly Pro Arg Ala Phe
130 135 140
His Gly Gln Ser Gly Ser Met Asn Val Glu Gln Pro Arg Tyr Gln Asn
145 150 155 160
Val Leu His Asp Glu Phe Phe Arg Ala Ala Ala Ala Ala Gly Leu Pro
165 170 175
Ala Asn Glu Asp Phe Asn Asp Trp Ser Arg Pro Gln Glu Gly Tyr Gly
180 185 190
Glu Phe Gln Val Ala Gln Lys Asn Gly Glu Arg Ala Asp Thr Tyr Arg
195 200 205
Thr Tyr Leu Lys Pro Ala Met Gly Arg Asp Asn Leu Lys Val Met Thr
210 215 220
Gly Ala Arg Thr Thr Lys Val His Ile Glu Lys Ser Ser Thr Gly Pro
225 230 235 240
Arg Ala Arg Gly Val Glu Tyr Ala Thr Gln Gln Phe Gly Glu Arg Tyr
245 250 255
Thr Ala Glu Leu Thr Pro Gly Gly Glu Val Leu Met Cys Thr Gly Ala
260 265 270
Val His Thr Pro His Leu Leu Met Leu Ser Gly Ile Gly Pro Ala Pro
275 280 285
Thr Leu Leu Glu His Gly Leu Asp Val Ile Ser Ser Leu Pro Gly Val
290 295 300
Gly Ala Asn Leu Gln Asp His Pro Ala Ala Val Leu Ala Val Arg Ala
305 310 315 320
Lys Pro Glu Phe Glu Gly Leu Ser Val Thr Ser Glu Ile Tyr Asp Ser
325 330 335
Lys Cys Asn Ile Arg Leu Gly Ala Val Met Lys Tyr Leu Phe Gly Arg
340 345 350
Arg Gly Pro Leu Ala Thr Thr Gly Cys Asp His Gly Ala Phe Val Arg
355 360 365
Thr Ser Ala Ser His Ser Gln Pro Asp Leu Gln Met Arg Phe Val Pro
370 375 380
Gly Cys Ala Leu Asp Pro Asp Gly Val Lys Ser Tyr Ile Val Phe Gly
385 390 395 400
Glu Leu Lys Lys Gln Gly Arg Ala Trp Pro Gly Gly Ile Thr Leu Gln
405 410 415
Leu Leu Gly Ile Arg Ala Lys Ser Arg Gly Ser Ile Gly Leu Lys Ala
420 425 430
Ala Asp Pro Phe Ile Asn Pro Ala Ile Asn Ile Asn Tyr Phe Ser Asp
435 440 445
Pro Glu Asp Leu Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Arg Ile Ala Arg Glu
450 455 460
Ile Val Ala Gln Glu Pro Leu Arg Lys Tyr Leu Leu Glu Glu Thr Phe
465 470 475 480
Pro Gly Glu Arg Ala Asn Thr Asp Lys Asp Ile Glu Glu Tyr Val Arg
485 490 495
Arg Thr Val His Ser Gly Asn Ala Leu Val Gly Thr Cys Ala Met Gly
500 505 510
Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ala Val Val Ser Ser Ala Asp Leu Lys Val
515 520 525
Phe Gly Val Asp Gly Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Val Leu Pro Arg
530 535 540
Ile Pro Gly Gly Gln Thr Gly Ala Ala Thr Val Met Val Ala Glu Arg
545 550 555 560
Ala Ala Ala Met Leu Leu Gly Gln Ala Thr Ile Thr Ser Arg Arg Glu
565 570 575
Pro Ala Ala Val
580
<210> 11
<211> 557
<212> PRT
<213> Ectocarpus siliculosus
<400> 11
Val Pro Ala Ala Arg Tyr Ala Thr Ser Ser Val Ser Met Ser Val Ala
1 5 10 15
Glu Glu Gly His Lys Phe Ile Ile Ile Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys
20 25 30
Val Leu Ala Asn Arg Leu Ser Ala Asp Lys Asp Asn Ser Val Leu Val
35 40 45
Leu Glu Ala Gly Ser Glu Lys Phe Asn Asp Arg Asn Ile Lys Met Pro
50 55 60
Ile Ala Ile Leu Arg Leu Phe Lys Ser Val Phe Asp Trp Gly Phe Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asn Glu Lys Phe Ala Thr Gly Asp Gly Ile Tyr Leu Cys Arg
85 90 95
Gly Lys Val Leu Gly Gly Ser Ser Cys Thr Asn Val Met Leu Tyr His
100 105 110
Arg Gly Glu Glu Ala Asp Tyr Asp Ala Trp Gly Val Asp Gly Trp Lys
115 120 125
Gly Lys Asp Val Leu Pro Tyr Phe Lys Lys Ala Glu Asn Asn Arg Ser
130 135 140
Lys Lys Lys Gly Glu Phe His Gly Lys Gly Gly Leu Met Gln Val Glu
145 150 155 160
Asn Ala Arg Tyr Met Asn Pro Leu Thr Lys Leu Phe Phe Lys Ala Cys
165 170 175
Glu Gln Ala Gly Leu Ser Glu Asn Glu Asp Phe Asn Asp Trp Ser His
180 185 190
Ser Gln Glu Gly Phe Gly Arg Phe Gln Val Ala Gln Lys Arg Gly Lys
195 200 205
Arg Cys Ser Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Lys Glu Ala Met Gly Arg Lys
210 215 220
Asn Leu Asp Val Gln Thr Ser Ala Gln Ile Thr Lys Val Leu Ile Glu
225 230 235 240
Asn Gly Gly Ala Ile Gly Val Glu Tyr Val Arg Asp Gly Glu Lys Lys
245 250 255
Ile Ala Lys Leu Ala Val Gly Gly Glu Ile Leu Leu Ala Gly Gly Ala
260 265 270
Ile Ser Ser Pro Gln Val Leu Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Ala Glu
275 280 285
His Leu Arg Ser Lys Gly Ile Glu Val Lys Ser Asn Val Pro Gly Val
290 295 300
Gly Lys Asn Leu Arg Asp His Pro Ala Val Thr Val Met Ala Asp Ile
305 310 315 320
Asn Lys Pro Ile Ser Ile Thr Asp Lys Val Leu Lys Glu Gly Ser Gly
325 330 335
Asp Val Asn Lys Ile Thr Ala Leu Gln Trp Leu Leu Thr Gly Thr Gly
340 345 350
Pro Leu Thr Ser Pro Gly Cys Glu Asn Gly Ala Phe Phe Lys Thr Thr
355 360 365
Pro Asp Lys Ala Ala Ala Asp Leu Gln Leu Arg Phe Val Pro Gly Arg
370 375 380
Ser Thr Thr Pro Asp Gly Val Lys Ala Tyr Asn Thr Ile Gly Thr Lys
385 390 395 400
Gly Arg Pro Pro Ser Gly Val Thr Val Gln Val Val Gly Ile Arg Pro
405 410 415
Gln Ser Glu Gly His Val Glu Leu Arg Ser Ser Asp Pro Phe Asp Lys
420 425 430
Pro His Ile Val Thr Asn Tyr Leu Glu Ser Gly Glu Asp Met Ala Ser
435 440 445
Leu Thr Asn Gly Ile Glu Met Ala Arg Lys Leu Phe Asp Gln Glu Ala
450 455 460
Phe Gly Glu Met Val Asp Lys Glu Val Phe Pro Gly Arg Asp Asn Lys
465 470 475 480
Glu Ile Ser Glu Tyr Ile Lys Ser Thr Val His Ser Ala Asn Ala Leu
485 490 495
Val Gly Thr Cys Lys Met Gly Glu Glu Ser Asp Asn Met Ser Val Val
500 505 510
Asn Ser Ala Leu Lys Val Lys Gly Val Ala Gly Leu Arg Val Ile Asp
515 520 525
Ser Ser Val Met Pro Ser Ile Pro Gly Gly Gln Thr Ala Ala Pro Thr
530 535 540
Ile Met Ile Ala Glu Lys Ala Ala Asp Met Leu Met Ala
545 550 555
<210> 12
<211> 601
<212> PRT
<213> Emiliania huxleyi
<400> 12
Leu Arg Gly Gly Ser Gly Val Thr Gly Gly Ser Leu Gly Arg Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Pro Ala Ile Asp Gly Glu Phe Asp Tyr Ile Ile Val Gly Gly
20 25 30
Gly Ala Ala Gly Cys Val Leu Ala Asn Arg Leu Ser Ala Asp Pro Ala
35 40 45
His Arg Val Leu Leu Ile Glu Ala Gly Gly Asp Ala Ser Arg Asp Lys
50 55 60
Arg Ala Gln Val Pro Trp Ala Phe Thr Lys Leu Leu Arg Ser Glu Tyr
65 70 75 80
Asp Trp Asp Phe His Val Glu Ala Glu Ala Ala Val Asn Gln Gln Glu
85 90 95
Val Tyr Leu Cys Arg Gly Lys Ala Leu Gly Gly Ser Ser Val Thr Asn
100 105 110
Val Met Leu Tyr His Arg Gly Ser Pro Ala Asp Tyr Asp Ala Trp Glu
115 120 125
Glu Ala Gly Ala Arg Gly Trp Gly Ala Lys Asp Val Leu Pro Tyr Tyr
130 135 140
Leu Arg Val Glu Asp Tyr Gly Asp Gly Ala Ser Gln Tyr His Ala Val
145 150 155 160
Gly Gly His Val Ser Val Gln Glu Val Pro Tyr Gln Asn Gln Leu Ser
165 170 175
Ala Thr Phe Leu Arg Ala Met Gly Gln Leu Gly Phe Arg Pro Asn Gly
180 185 190
Asp Phe Asn Asp Trp Ser Ser Pro Gln Glu Gly Tyr Gly Arg Tyr Lys
195 200 205
Val Thr Gln Arg Ala Gly Arg Arg Cys Thr Ala Ala Asp Gly Tyr Leu
210 215 220
Ala Ala Ala Arg Glu Arg Ala Asn Leu Val Val Val Thr Gly Ala Gln
225 230 235 240
Ala Thr Arg Leu Ala Leu Asp Ser Ala Tyr Asp Gly Ala Gly Arg Leu
245 250 255
Gln Val Ser Gly Val Glu Phe Ala Arg Gly Asp Glu Arg Glu Pro Cys
260 265 270
Ser Val Arg Leu Ala Arg Gly Gly Glu Ala Val Leu Cys Ala Gly Ala
275 280 285
Val Gln Thr Pro His Leu Leu Leu Leu Ser Gly Ile Gly Pro Ala Glu
290 295 300
His Leu Arg Glu Val Gly Val Pro Val Arg Ala Asp Leu Pro Gly Val
305 310 315 320
Gly Ser Gly Leu Gln Asp His Pro Ala Val Val Val Ser Tyr Glu Ser
325 330 335
Lys Lys Ala Val Ala Ala Thr Asp Asp Ala Leu Leu Lys Gly Tyr Ala
340 345 350
Ser Leu Val Asn Pro Leu Ala Met Leu Arg Trp Leu Leu Phe Gly Arg
355 360 365
Gly Pro Leu Ala Cys Ala Ala Cys Asp His Gly Gly Phe Val Arg Ser
370 375 380
Ser Pro Asp Leu Asp Gln Pro Asp Val Gln Ile Arg Phe Val Pro Ala
385 390 395 400
Arg Ala Ser Ser Ala Ser Gly Met Asn Thr Leu Ile Glu Leu Gly Arg
405 410 415
Arg Ala Arg Phe Leu Pro Gly Phe Ser Thr Gln Val Val Ala Cys Arg
420 425 430
Pro Arg Ser Glu Gly Arg Val Arg Leu Arg Ser Ala Asp Pro Phe Ala
435 440 445
Lys Pro Ile Ile Glu Gly Ile His Leu Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala
450 455 460
Ser Leu Arg His Gly Ile Arg Leu Gly Arg Gln Val Cys Ala Ala Ala
465 470 475 480
Ala Phe Asp Glu Tyr Arg Gly Glu Glu Val Phe Pro Gly Ala Ala Val
485 490 495
Gln Ser Asp Glu Gln Ile Asp Glu Tyr Ile Arg Ser Ser Val His Ser
500 505 510
Ala Asn Ala Leu Thr Ser Ser Cys Arg Met Gly Asp Pro Ser Asp Pro
515 520 525
Ala Ala Val Leu Asp Ser His Leu Arg Val Arg Gly Val Gly Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ala Asp Ala Ser Ala Met Pro Arg Ile Ile Gly Gly Gln Thr
545 550 555 560
Gln Ala Pro Thr Tyr Met Leu Ala Glu Arg Ala Ala Asp Ile Leu Leu
565 570 575
His Ala Arg Leu Gln Ala His Glu Pro Ala Thr Glu Ser Val Ser Gln
580 585 590
Arg Leu Glu Val Ala Ala Ala Ala Leu
595 600
<210> 13
<211> 533
<212> PRT
<213> Aureococcus anophagefferens
<400> 13
Leu Ser Glu Asp Pro Ser Lys Lys Val Leu Val Leu Glu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Arg Gly Pro Asn Ser Pro Leu Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Leu Lys
20 25 30
Leu Phe Lys Ser Ala Tyr Asp Trp Asn Phe Ala Thr Arg Pro Ser Glu
35 40 45
Ala Val Ala Asp Arg Ser Leu Tyr Val Cys Arg Gly Lys Gly Leu Gly
50 55 60
Gly Ser Ser Leu Thr Asn Val Met Leu Tyr Asn Arg Gly Ser Ala Asn
65 70 75 80
Asp Tyr Asp Ala Trp Ala Ala Ala Cys Gly Asp Asp Ser Trp Gly Ala
85 90 95
Glu Glu Met Leu Gly Tyr Phe Lys Lys Ala Glu Asp Cys Leu Val Pro
100 105 110
Ala His Arg Ala Asn His Tyr His Gly Val Gly Gly Pro Tyr Ala Ser
115 120 125
Ser His Val Pro Tyr Thr Asn Glu Met Ser Thr Ala Phe Val Glu Ala
130 135 140
Ala Val Glu Asp Gly Gly Val Arg Asn Gly Asp Phe Asn Asp Trp Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gln Val Gly Phe Gly Arg Phe Ala Val Ser Gln Arg Lys Gly
165 170 175
Ala Arg Val Asp Ala Ala Thr Ala Tyr Leu Pro Arg Lys Val Arg Arg
180 185 190
Arg Ala Asn Leu Asp Val Val Arg Gly Ala Ala Leu Ser Gly Val Thr
195 200 205
Trp Asn Ala Asn Lys Ala Thr Gly Val Glu Phe Ala Phe Gly Gly Val
210 215 220
Ser Gly Ile Ala Cys Gly Gly Glu Val Ile Leu Ser Gly Gly Ala Val
225 230 235 240
His Ser Pro Gln Met Leu Met Leu Ser Gly Val Gly Ala Lys Ala Gln
245 250 255
Leu Glu Glu Phe Gly Ile Pro Val Val Ala Asp Arg Pro Gly Val Gly
260 265 270
Lys Asn Leu Gln Asp His Pro Ala Cys Leu Val Ser Trp Arg Gly Ser
275 280 285
Ala Lys Ala Gln Gly Lys Ser His Ser Thr Gln Leu Arg Ile Pro Gly
290 295 300
Thr Thr Lys Thr Ser Pro Lys Ala Leu Leu Gln Trp Leu Phe Leu Gly
305 310 315 320
Arg Gly Pro Leu Ala Ser Pro Gly Cys Asp His Gly Gly Phe Ala Lys
325 330 335
Val Gly Ala Gly Asp Gly Asp Cys Asp Val Gln Phe Arg Phe Leu Ala
340 345 350
Thr Lys Ser Ile Thr Pro Asp Gly Met Ser Thr Ile Ser Asp Ser Tyr
355 360 365
Glu Ala Ala Val Asp His Pro Asp Gly Leu Thr Ile Gln Thr Ile Val
370 375 380
Ala Arg Pro Lys Ser Arg Ala Gly Glu Val Lys Leu Ala Ser Arg Asp
385 390 395 400
Pro Ala Ala Lys Pro Val Ile Glu Asn Ala Tyr Leu Ser Asp Glu Ala
405 410 415
Asp Val Met Thr Met Val Lys Ala Leu Gln Lys Ala Arg Ser Ile Ala
420 425 430
Ser Arg Ala Pro Leu Ser Ala Tyr Ala Gly His Glu Glu Phe Pro Gly
435 440 445
Glu Asp Val Ala Asp Glu Arg Gln Leu Ala Ala Tyr Val Arg Asn Thr
450 455 460
Ala His Thr Ala Asn Ala Val Val Gly Thr Cys Lys Met Gly Glu Ser
465 470 475 480
Ser Asp Ala Leu Ala Val Val Asp Asn His Leu Lys Val Ile Gly Val
485 490 495
Ser Asn Leu Arg Val Val Asp Ala Ser Val Met Pro Thr Leu Pro Gly
500 505 510
Gly Gln Thr Ala Ala Ser Thr Val Ala Leu Ala Glu Lys Ala Ala Asp
515 520 525
Leu Ile Lys Gly Gly
530
<210> 14
<211> 1236
<212> PRT
<213> Nannochloropsis gaditana
<400> 14
Leu Ser Lys Thr Thr Ile Gly Leu Gln Ser Phe Val Thr Ala Asn Tyr
1 5 10 15
Gly Val Arg Arg Ala Ile Ser Leu Arg Gly Gly Leu Gln Ser Val Ser
20 25 30
Met Lys Ala Pro Ala Ala Val Ala Ser Ser Thr Tyr Asp Tyr Ile Ile
35 40 45
Val Gly Gly Gly Ile Gly Gly Cys Val Leu Ala Asn Arg Leu Thr Glu
50 55 60
Ser Gly Arg Phe Lys Val Leu Leu Leu Glu Ala Gly Lys Ser Ala Glu
65 70 75 80
Arg Asn Pro Tyr Val Asn Ile Pro Ala Gly Val Val Arg Leu Phe Lys
85 90 95
Ser Ala Leu Asp Trp Gln Phe Glu Ser Ala Pro Glu Arg His Leu Asp
100 105 110
Gly Lys Glu Val Tyr Leu Val Arg Gly Lys Ala Met Gly Gly Ser Ser
115 120 125
Ala Val Asn Val Met Leu Val His Arg Gly Ser Ala Ser Asp Tyr Ala
130 135 140
Lys Trp Glu Ala Glu Gly Ala Gln Gly Trp Gly Pro Glu Glu Ala Leu
145 150 155 160
Arg Tyr Phe Lys Lys Met Glu Asp Asn Leu Val Gly Gly Glu Gly Arg
165 170 175
Trp His Gly Gln Gly Gly Met Tyr Pro Val Asp Asp Val Lys Tyr Gln
180 185 190
Asn Pro Leu Ser Lys Arg Phe Leu Gln Ala Cys Glu Glu Tyr Gly Trp
195 200 205
Arg Ala Asn Pro Asp Phe Asn Asp Trp Ser His Pro Gln Asp Gly Tyr
210 215 220
Gly Ser Phe Lys Val Ala Gln Lys His Gly Lys Arg Val Thr Ala Ala
225 230 235 240
Ser Gly Tyr Leu Asn Lys Ala Val Arg Arg Arg Pro Asn Leu Asp Ile
245 250 255
Leu Ser Glu Ala Leu Val Thr Arg Val Leu Leu Glu Gly Glu Gly Asp
260 265 270
Val Lys Ala Val Gly Val Glu Phe Thr Gly Lys Asp Gly Lys Thr His
275 280 285
Gln Val Arg Thr Thr Gly Lys Ala Gly Glu Val Leu Leu Ala Gly Gly
290 295 300
Ala Val Asn Ser Pro Gln Leu Leu Met Leu Ser Gly Ile Gly Pro Glu
305 310 315 320
Ala Asp Leu Gln Ala Val Gly Ile Ala Thr Lys Val Asn Arg Pro Gly
325 330 335
Val Gly Glu Asn Leu Gln Asp His Pro Ala Val Thr Ile Ala His Asn
340 345 350
Ile Thr Arg Pro Ile Ser Leu Cys Asp Asp Leu Phe Leu Phe His Thr
355 360 365
Pro Val Pro Lys Pro His Gln Val Leu Arg Trp Thr Leu Thr Gly Ser
370 375 380
Gly Pro Leu Thr Thr Pro Gly Cys Asp His Gly Ala Phe Leu Lys Thr
385 390 395 400
Arg Glu Asp Leu Gln Glu Pro Asn Val Gln Phe Arg Phe Ile Ala Gly
405 410 415
Arg Gly Ser Asp Pro Asp Gly Val Arg Ser Tyr Ile Met Gly Gly Ser
420 425 430
Ala Arg Pro Leu Ser Gly Leu Thr Leu Gln Val Val Asn Ile Arg Pro
435 440 445
Lys Ser Lys Gly Lys Leu Thr Leu Ala Ser Lys Asp Pro Leu Lys Lys
450 455 460
Pro Arg Ile Glu Val Arg Tyr Leu Ser Ala Ala Glu Asp Leu Gln Ala
465 470 475 480
Leu Arg Thr Gly Met Arg Ile Gly Arg Asp Leu Ile Lys Gln Arg Ala
485 490 495
Phe Ala Asp Ile Leu Asp Glu Glu Val Phe Pro Gly Pro Ala Ala Gln
500 505 510
Thr Asp Glu Glu Leu Asp Ala Tyr Ile Arg Asp Ser Leu His Thr Ala
515 520 525
Asn Ala Leu Val Gly Thr Cys Lys Met Gly Ser Val Glu Asp Arg Asn
530 535 540
Ala Val Val Asp Pro Glu Cys Arg Val Ile Gly Val Gly Gly Leu Arg
545 550 555 560
Val Val Asp Ala Ser Val Met Pro Val Ile Pro Gly Gly Gln Thr Gly
565 570 575
Ser Gly Thr Thr Met Leu Ala Glu Lys Ala Ala Asp Leu Val Arg Ala
580 585 590
His Ala Gly Asp Leu Val Glu Met Gly Val Gln Asp Glu Glu Arg Lys
595 600 605
Gly Gly Trp Phe Asn Gly Leu Leu Gly Arg Lys Gln Lys Val Ala Thr
610 615 620
Glu Lys Glu Arg Gly Glu Arg Gly Lys Ser Glu Arg Phe Val Ser Glu
625 630 635 640
Val Ile Arg His Met Gly Arg Val Phe Val Gln Val Ser Arg Ala Arg
645 650 655
Arg Ala Gln Thr Cys Met Arg Val Gly Lys Gly Leu Asp Arg Glu Arg
660 665 670
Gln Leu Glu Cys Ala Met Arg Lys Glu Leu Thr Ile Ala Leu Phe Tyr
675 680 685
Ala Met Leu Phe Thr Met Arg His Ser Gly Phe Leu Ser Thr Thr Gly
690 695 700
Arg Ala Ser Tyr Lys Asp Leu Gly Tyr Leu Thr Gly Ser Cys Arg Ala
705 710 715 720
His Pro Cys Thr Ser Pro Ser Ser Leu Cys Leu Phe Pro Glu Lys Pro
725 730 735
Phe Met Lys Leu Ser Pro Ala Leu Ala Val Val Gly Phe Cys Phe Asn
740 745 750
Ser Ile Asn Val Gln Gly Phe Leu Leu Ser Asn Leu Ala Gly Arg Ser
755 760 765
Leu Lys His Pro Val Pro Gln Lys Gly Leu Tyr Ser Arg Ile Glu Tyr
770 775 780
Asp Ala Arg Glu Pro Arg Leu Asp Glu Phe Gly Leu Pro Leu Asp Pro
785 790 795 800
Ala Asp Leu Met Glu Lys Pro Arg Val Pro Leu Lys Asp Arg Val Tyr
805 810 815
His Ile Ile Asp Met Thr Asn Asp Trp Val Asp Ala Val Ser Arg Gly
820 825 830
Arg Arg Glu Glu Glu Thr Arg Arg Ile Ile Gln Arg Arg Arg Ala Ala
835 840 845
Ala Lys Ala Met Ala Ile Lys Asp Lys Val Leu Ile Ser Leu Asp Tyr
850 855 860
Val Phe His Pro Val Lys Ala Trp Arg Thr Phe Val Ala Asp Pro Leu
865 870 875 880
Glu Ala Arg His Gln Arg Gln Leu Arg Gln Gln Ala Glu Lys Arg Ala
885 890 895
Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Gln Arg Tyr Asn Thr Val Lys Asn Arg Phe
900 905 910
His Asp Thr Leu Asp Leu Leu Glu Ser Thr Thr Arg Thr Ser Val Lys
915 920 925
Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ala Val Val Gly Ala Pro Gly Thr Val
930 935 940
Thr Arg Thr Val Lys Glu Val Lys Ser Gln Ala Gln Gly Thr Ala Glu
945 950 955 960
Ala Val Ala Lys Val Ser Ser Ser Val Ser Ser Val Val Ser Lys Ile
965 970 975
Thr Ser Val Ile Arg Lys Glu Asp Gly Ala Leu Ala Gly Ala Lys Gly
980 985 990
Lys Lys Asp Pro Arg Ser Glu Asp Glu Gly Lys Ala Asp Pro Val Lys
995 1000 1005
Val Arg Glu Ile Trp Glu Thr Lys Glu Gln Thr Ala Ile Arg Thr
1010 1015 1020
Ile Trp Glu Ala Asp Glu Leu Val Thr Pro Val Thr Pro Pro Ala
1025 1030 1035
Thr Ala Met Ala Ser Thr Val Ser Val Ser Glu Pro Gln Asp Glu
1040 1045 1050
Asn Glu Ala Ser Ile Ser Gln Gly Ala Ala Pro Ser Pro Ser Thr
1055 1060 1065
Ser Ser Pro Ser Ser Pro Glu Pro Val Thr Arg Leu Ser Phe Arg
1070 1075 1080
Ala Arg Val Glu Ala Asp Glu Lys Glu Arg Phe Gly Ser Arg Arg
1085 1090 1095
Leu Lys Ile Ser Gly Asn Val Pro Pro Thr Ala Ser Pro Thr Arg
1100 1105 1110
Gly Ala Ser Ser Leu Pro Leu Asp Thr Leu Ser Ser Ser Ala Thr
1115 1120 1125
Gln Thr Phe Glu Arg Ser Lys Val Gly Pro Pro Ile Arg Thr Ser
1130 1135 1140
Lys Ala Arg Cys Ile Gly Lys Cys Val His Asn Gly Trp Lys Gly
1145 1150 1155
Ile Cys Glu Glu Trp Phe Val His Ile Ser Phe Pro Thr Tyr Ala
1160 1165 1170
Val Ser Ile Val Arg Pro Pro Met His Val His Asn Phe Lys Val
1175 1180 1185
Ile Cys Cys Val Leu Ala Val Arg His Ala Arg Arg Lys Lys Glu
1190 1195 1200
Met Ser Thr Ala Leu Ser Thr His Leu Ile Tyr Leu Leu Leu Lys
1205 1210 1215
Thr Val Lys Met Leu Gln Asp Leu Pro Gln Leu Arg Arg Lys Gly
1220 1225 1230
Lys Thr Asn
1235
<210> 15
<211> 1785
<212> DNA
<213> Chlorella variabilis
<400> 15
cgcgcctctg cggtggagga catccgcaag gtgctgtctg acagcagcag cccggtggcg 60
gggcagaagt acgactacat tctggtcggc ggcggcaccg cggcctgcgt gctggccaat 120
cgcctgtccg ccgacggctc caagcgtgtg ctggtgctgg aagccggccc cgacaacacc 180
tcgcgcgacg tcaagatccc cgccgccatc acccgcctct tccgcagccc cctcgactgg 240
aacctcttct ccgagctgca ggagcagctg gcggagcgcc agatctacat ggcgcgcggc 300
cggctgctgg gcggcagcag cgccaccaat gccacgctgt accaccgcgg cgcggcgggc 360
gactatgatg cctggggcgt ggagggctgg agctcggagg acgtgctcag ctggtttgtg 420
caggcggaga ccaacgccga ctttggccct ggcgcgtacc acggcagcgg cggccctatg 480
cgtgtcgaga acccacgcta caccaacaag cagctgcaca ccgccttctt caaggccgca 540
gaggaggtgg ggcttacccc aaacagcgat ttcaacgact ggagccacga tcatgctggg 600
tacggtacct tccaggtcat gcaggacaag ggcacacgtg ccgacatgta ccggcagtac 660
ctcaagcccg tgctgggccg cagaaacctg caggtgctga ccggcgcggc cgtgaccaag 720
gtcaacattg accaggctgc aggcaaggcg caggctctgg gtgtggagtt ctcaaccgac 780
gggcccacag gtgagcggct gagcgctgag ctggcgccag gcggcgaggt gatcatgtgt 840
gccggcgccg tgcacacgcc cttcctgctc aagcacagcg gcgtggggcc ctcggcggag 900
ctcaaggagt ttggcatccc ggtggtttcc aacctggcag gtgtgggtca gaacctgcag 960
gaccagcccg cctgcctgac cgcggcgccg gtcaaggaaa agtatgatgg catcgccatc 1020
agcgaccaca tctacaacga gaagggccag atccgcaagc gcgccattgc cagctacctg 1080
ctgggcggcc gcggcggcct cacatccacc ggatgcgacc gcggcgcctt tgtgcgcacg 1140
gcaggccagg cgctgccaga tctgcaggtg cgctttgtgc cgggcatggc gctggacccg 1200
gatggcgtgt ccacgtatgt gcgctttgcc aagttccagt cccaggggct caagtggccc 1260
agcggcatca ccatgcagct gatcgcctgc cgcccgcaaa gcacgggcag cgtgggcctc 1320
aagagtgccg acccctttgc gccgcccaag ctgagccccg gctatctgac ggacaaggac 1380
ggcgctgacc tggccacgct ccgcaagggc atccactggg cgcgcgacgt ggcgcgcagc 1440
agcgcgctca gcgagtacct ggatggcgag ctgttccccg gcagcggagt ggtgagcgat 1500
gatcagattg atgagtacat ccgccgcagc atccatagct ccaacgccat cacaggcaca 1560
tgcaagatgg gcaatgccgg cgacagcagc agcgtggtgg acaaccagct gcgggtgcac 1620
ggtgtggagg gcctgcgggt ggtggatgcc tcggtggtgc ccaagatccc aggtggccag 1680
acgggcgcgc cagtggtgat gattgcggag cgcgccgccg cgctgttgac tggcaaggcg 1740
acgatcgggg cgagcgctgc ggccccggcg acagtggcag catga 1785
<210> 16
<211> 1743
<212> DNA
<213> Chlamydomonas reinhardtii
<400> 16
ctgtcggtgc gtgctgctgc gggcccagct ggctcggaga agttcgacta cgtgcttgtc 60
gggggtggca ctgcctcgtg cgtgcttgct aacaagctgt cggctgatgg aaacaagaag 120
gttctggttc tggaggctgg ccctaccggt gacgccatgg aggtggctgt gcccgccggc 180
atcacccgct tgttcgcgca cccagtgatg gactggggca tgtcgtcgct gacacagaag 240
cagctggtgg cccgcgagat ctacctggcc cgcggccgca tgctgggcgg ctcctccggc 300
tctaacgcca cgctgtacca ccgcggcagc gccgccgact acgacgcttg gggcctggag 360
ggctggagca gtaaggacgt gctggactgg ttcgtcaagg cggagtgcta cgccgacggc 420
cccaagccct accacggcac tgggggcagc atgaacacgg agcagccgcg ctacgagaac 480
gtgctgcacg atgagttctt caaggccgcc gccgccaccg gcctgcccgc caaccccgat 540
ttcaacgact ggagccaccc gcaggacggc ttcggtgagt tccaggtgtc tcagaagaag 600
ggccagcgcg ccgacaccta ccgcacctac ctcaagcccg ccatggcgcg cggcaacctc 660
aaggtggtga ttggtgcccg ggccaccaag gtcaacattg agaagggctc gtcgggcgca 720
cgcacgaccg gcgtggagta cgccatgcag cagttcggcg accgcttcac cgccgagctg 780
gcccctggcg gcgaggtgct gatgtgctcg ggcgcggtgc acacgccgca cctgctcatg 840
ctgtcgggcg tgggccccgc cgccacgctg aaggagcacg gcatcgatgt ggtgtcggac 900
ctgtcgggtg tggggcagaa cctgcaggac caccccgcgg cggtgctggc ggcgcgcgcc 960
aagccagagt ttgagaagct gtcggtgacc agcgaggtgt atgacgacaa gtgcaacatc 1020
aagctgggcg ccgtggcgca gtacctgttc cagcgccgcg gcccgctggc caccaccggc 1080
tgcgaccacg gagccttcgt gcgcacctcc tcctcgctct cgcagcccga cctgcagatg 1140
cgcttcgtgc cgggctgcgc cctggacccc gatggcgtca agtcctacat cgtgtttggc 1200
gagctcaaga agcagggccg cgcatggccc ggcggcatca cgctgcagct gctggccatc 1260
cgcgccaaga gcaagggcag catcggcctg aaggcggctg acccgttcat caaccccgcc 1320
atcaacatca actacttctc cgaccccgcc gacctggcca cgctggtcaa cgccgtcaag 1380
atggcgcgca agatcgcggc gcaggagccg ctcaagaagt acctgcagga ggagacgttc 1440
cccggcgagc gcgcctccag cgacaaggac ctggaggagt acatccgccg caccgtgcac 1500
tcgggcaacg cgttggtggg caccgcggcc atgggcgcct cgcccgcggc cggcgccgtg 1560
gtgtcctccg ccgacctcaa ggtcttcggc gtggagggcc tgcgtgtggt ggacgcctcg 1620
gtgctgccgc gcatccccgg cggccagacc ggcgccgcca ctgtcatggt ggcggagcgc 1680
gcggcggcgc tgctgcgcgg ccaggccacc atcgcgccca gccgccagcc cgtggccgtg 1740
taa 1743
<210> 17
<211> 1707
<212> DNA
<213> Phaeodactylum tricornutum
<400> 17
tacgactaca ttatctgcgg gggagggttg gctgggtgcg ttttggctga acgcctttcg 60
caggacgagt ccaagcgtgt gctcgtacta gaggctggcg gctcggacta caaaagtctt 120
ttcatcagga ttccggctgg agtcttacgg ctctttcgca gtaaatacga ttggcaacat 180
gaaacgggcg gtgaaaaggg ttgcaacgga cggaatgtgt ttttgcaacg cggcaagatt 240
ctcggcggat cttcgtgcac caatgtatgt ctgcatcacc gtgggtcagc ggaagattac 300
aacagctgga acattcccgg gtggacggct actgatgtgc ttcctttctt caagcaatcg 360
caaaaggatg agacgggccg ggatgccacg ttccacggtg cggatgggga gtgggtcatg 420
gatgaggtgc gataccaaaa tccattgagc aagttattcc tggaggtagg ggaggcagct 480
ggcctcggaa ccaatgatga tttcaacaac tggtcgcatc cgcaggatgg cgttgggcgc 540
ttccaggttt cagaagtaaa cggagaacga tgttcgggag ccacagcatt tctaagtaaa 600
gcggccaagc gctcaaatgt catagttcga actggcacta tggtgagaag gatcgacttt 660
gatgagacaa aaacagcgaa agggattacc tacgatttga tgggcgatga cacatgtacg 720
acatttcaag cttgtttgaa agagggtggc gaagtgctgg tgacaggtgg agcaattgca 780
tcccctcagc ttctcatgtg ctccggaatt ggacctggca agcacttacg gtcgctgggc 840
attccagtag tccacgacaa ctcggcagtt ggtgagaacc tgcaggatca cccagctgct 900
gtcgtttcct ttaaaacccc tcaaaaggga gtttctgtta cttctaaatt gcggctcttc 960
ggtaagacaa accccattcc agtcttccag tggctatttt ttaaaagtgg tcttttgacc 1020
tccactggat gcgatcatgg cgctttcgtt cggacatcgg attcactcga acaaccggac 1080
ttgcagatta gattcttggc agctcgcgct cttggacccg acggaatgac cacgtatacc 1140
aaattccgta cgatgaaaac agttgaagat ggttattcgt tccagagtgt tgcatgtcga 1200
gcaaaaagca agggaaggat tcggttatct tcgtccaact cgcacgtaaa gcctatgatt 1260
gatggcggat acctctctaa ccaggatgat cttgccacac tacgtgctgg tatcaagctt 1320
ggacgtatgc tcggtaaccg accggaatgg ggcgagtacc ttggtcaaga ggtgtatcca 1380
gggccagatg tgcaaacgga tgaagagatt gacgaataca ttcgtaactc gctccatacc 1440
gccaatgctt taacggggac atgcaaaatg ggaacgggtc gtggggctgt tgttgggccc 1500
gatttacgtg taattggggt caatggtgta cgtgtggggg attcatctgt tttcccctgc 1560
attccagggg gacaaacggc aacaccgacc gtcatgatag gggatcgggc cgctgttttt 1620
gttcggcaac ccgtatccca gctgaacatt gaaattttca gagaaaaagg gggcacacat 1680
cctggggcaa cgaccgcctc agcctag 1707
<210> 18
<211> 1758
<212> DNA
<213> Coccomyxa subellipsoidea
<400> 18
gcactgcggg tcagggcgat aatcaaaagc gacaatccag ctgcagataa gtatgacttc 60
atcctggtcg gcggcggcac agcaggctgc gtgctggcca acaggctgac agcagatgga 120
tccaagaagg tcctgctgct cgaggcggga ggcgccaaca aggcgcggga ggtacgcaca 180
ccggccgggc tgccgcgcct gttcaagagc gccctcgact ggaacctcta ctcctccctg 240
cagcaggcag ccagcgacag atcgatctac ctggcacggg gaaagcttct gggtggcagc 300
tccgcaacta atgccacgct gtaccaccgg gggactgcgg cagactacga cgcgtggggt 360
gtgccggggt ggacctccca ggacgccctg cgctggttta ttcaggcaga gaacaactgc 420
agagggattg aggacggggt gcatgggacc gggggattga tgcgcgtgga gaaccctcgc 480
tacaacaacc ccctgcacga ggtctttttc caggcggcca agcaggccgg cctcccagag 540
aacgacaact ttaacaactg gggcagatca caggcggggt acggggagtt ccaggtgact 600
cacagcaagg gtgagcgcgc cgactgcttc cggatgtacc tggagccagt catggggcgt 660
tccaacctca cagtgctcac cggagccaaa acgctcaaaa tcgaaactga aaagtccggc 720
ggcgccacgg tctcgcgcgg cgtcaccttc caggtcaacg gccaggacgg cagcaagcac 780
tcagctgagc tggcggctgg cggcgaggtg gtgctgtgcg cggggtcaat ccactcgccc 840
cagatcctgc agctctccgg catcggcccc caggcggagc tgcgctccaa ggacatccct 900
gtcgtcgcag acctgcccgg cgtcggccag aatatgcagg accacccggc gtgcctgtca 960
gccttctacc tcaaagagag cgcgggtccc atcagtgtga ctgatgagtt gctgcacacc 1020
aatggccgaa tccgcgcgcg cgcaatccta aagtacctgc tcttcaaaaa ggggcccctc 1080
gccaccacag gatgcgacca cggcgccttt gtgaagactg caggtcagag tgagccggac 1140
ctgcagatcc gctttgtgcc gggtctggcg cttgaccctg acggcatcgg atcctacacg 1200
gcctttggca agatgaagga ccagaagtgg ccctccggaa tcaccttcca gctgctcgga 1260
gtgcggccca agagccgcgg gtcggtgggt cttcgcagcg acgacccctg ggacgcgcca 1320
aaactggaca tcggcttcct gactgacaag gagggcgctg acctggccac gctgaggagc 1380
ggcatcaagc tctcgcgcga gatcgcagcg gagccggcat tcggagcata tgtaggcaac 1440
gaacttcacc cgggcgcagc cgcctcgtcc gattctgcga tcgactcatt catccgtgac 1500
acggtgcact cgggcaatgc caacgtgggc acatgctcga tgggggtgaa tgggaacgcc 1560
gtcgtggacc cgtcactcag agtgttcggc atccgcggcc tgcgagtggc cgacgcatca 1620
gtcatccccg tcatcccagg aggccagacc ggcgctgcaa cggtgatggt ggcagagagg 1680
gccgcggaga ttctcctcgg ctcgaaccag aagcagccgg ccgccgccgt ccccgccgcg 1740
cagccggccc tggcttga 1758
<210> 19
<211> 1744
<212> DNA
<213> Volvox carteri
<400> 19
tccagttgca gtcaaagctg cggcaagcgt ggggtcggag aagttcgact acatccttgt 60
gggaggaggg acggcaggtt gcgttctggc aaacaaattg tccgctaatg gcagcaagaa 120
ggttcttgtt cttgaggctg gtccaaccgg cgatgctatg gaagtggccg taccggccgg 180
tattgcccgt ctctttgcac atccagtttt tgactggggt atgtccagtt tgacgcagca 240
gcagctggtt gcacgcgaga tctaccttgc tcgcggtcgc cttctgggcg gttcctctgg 300
gaccaacgca acgctgtatc atcgcggcac ccccgctgac tacgacagtt ggggcttgga 360
gggctggacg agcaaggatc tacttgattg gttcgttaag gccgaatgct atggagacgg 420
tccccgggcc ttccatggcc agtccggttc tatgaatgtg gagcaaccgc gttaccagaa 480
cgtcctgcac gacgagtttt tcagggctgc tgcggcagct ggattacctg ccaacgagga 540
tttcaatgac tggagccggc cgcaggaggg ctatggggag ttccaggtgg cccagaagaa 600
cggtgagcgc gcggacacgt atcggaccta cctcaagccg gctatgggcc gcgacaacct 660
gaaggtgatg accggcgcgc gtacgaccaa agtgcatatc gagaagagct cgacgggtcc 720
acgtgcccgc ggtgtcgagt atgctaccca gcaatttggg gagcgctaca ccgccgagct 780
gactcctggt ggcgaggttc tcatgtgcac cggtgccgtg cacacaccgc acctactgat 840
gctttcgggc attgggccgg cgccgaccct ccttgagcac ggactcgacg tgatatcaag 900
cctgcctggc gtgggtgcca acctgcagga tcacccagcc gcggtgcttg ctgtccgggc 960
taagcccgag ttcgagggac tgtcggtcac ttcggaaatc tatgacagca agtgcaacat 1020
ccggttgggc gccgttatga agtacctgtt cggacgccgc gggccacttg caaccacagg 1080
ctgtgatcat ggcgcttttg tgcgcacttc ggcctcgcat tcgcagccgg acctgcagat 1140
gcgattcgtg cccggttgcg cgctggaccc cgacggcgtg aagtcgtaca ttgtgttcgg 1200
cgagctgaag aagcagggcc gtgcttggcc cggcggtatc acgttgcagc tgctgggcat 1260
ccgcgccaag agcaggggca gcatcggtct caaggccgcg gatcccttca tcaaccccgc 1320
cattaacata aactatttct ccgatcctga ggaccttgcc acgcttaaga acggtgtgcg 1380
cattgcgcgc gaaatcgttg cccaggagcc attgcgcaaa taccttctgg aggagacctt 1440
ccccggggag cgggcgaaca ctgacaagga cattgaggag tatgtccggc gcacggtcca 1500
cagcggcaac gcgcttgtgg gcacctgcgc gatgggtacc acgccagcca gtggcgccgt 1560
ggtgtcttct gctgacctca aggtgttcgg tgttgacggg ctgcgtgtcg tggatgcgtc 1620
tgtgctgcca cgcattccag gcgggcaaac aggagcggcc actgtcatgg ttgcagagcg 1680
ggcggcggcc atgctgcttg gacaggcgac gattacttct cgtcgcgagc ctgcggctgt 1740
ttag 1744
<210> 20
<211> 1674
<212> DNA
<213> Ectocarpus siliculosus
<400> 20
gtgcctgcag cacgttatgc gacgtcttcg gtgagcatgt cggtggcgga agaaggccac 60
aagttcatca tcatcggcgg gggtacggct gggtgtgttc tggcgaaccg cctctctgcc 120
gacaaggaca attcagtgct ggtgttggag gccggctcgg aaaaattcaa tgacaggaat 180
atcaagatgc ccatcgcaat cctaaggttg ttcaagtctg tcttcgactg gggcttccag 240
tcggaaaacg agaagtttgc caccggcgac ggcatctacc tctgccgtgg caaggtcctc 300
ggcgggtcta gctgcaccaa cgtcatgctt taccatcgcg gagaggaggc tgactatgac 360
gcgtgggggg tggatggatg gaaaggcaag gacgtgctcc cctacttcaa gaaggcggag 420
aacaaccgat ccaagaaaaa gggggagttc cacggcaagg gaggcctgat gcaggtggaa 480
aacgcgcgtt acatgaaccc tttgacgaag ttgttcttca aggcgtgcga gcaggcaggc 540
ctgtcggaga acgaggactt caacgattgg tcccactcgc aggagggctt cggtcgcttc 600
caggttgcac agaagagagg caagcgctgt tcggcagcct cctcctacct caaggaagcc 660
atggggcgca aaaacctgga cgtgcagacc agcgcccaga tcaccaaggt cttgatcgag 720
aacggcggtg ccataggcgt tgagtacgtg cgggatggcg aaaagaagat cgccaagctt 780
gccgtgggcg gagagatcct gctagcagga ggtgccatca gctcaccgca ggtgctgatg 840
ctcagtgggg tgggtccggc cgagcacttg aggtccaagg gcatcgaggt gaagagcaat 900
gtgcctgggg tcggaaagaa cctccgcgac catcccgctg tcaccgtgat ggccgacatc 960
aacaagccta tctccatcac cgacaaggtt ctcaaggagg gctctgggga cgtgaacaaa 1020
attacggccc ttcagtggct gttgacggga actgggccgc tgacctcgcc agggtgcgag 1080
aacggcgcgt tcttcaagac cacgcctgac aaagcggcgg cagatctgca gttgcgattt 1140
gtccctggaa gatccactac cccagacggg gtgaaggcgt acaacactat tggcaccaag 1200
gggaggcctc cttcgggtgt caccgtgcag gtggtgggga tccggccgca gagtgaaggc 1260
cacgtcgagc tgcgttcttc ggacccgttc gacaagccac acatcgtcac taactacctt 1320
gagagtgggg aggacatggc gtctttgacg aacggaatcg aaatggcacg aaagctgttc 1380
gaccaggagg ccttcggaga aatggtggac aaagaagtct tccccggcag agacaacaag 1440
gagatctcgg agtacatcaa gtctaccgtg cactccgcca acgccttggt tggcacttgc 1500
aagatgggcg aagaatcaga caacatgtct gttgtgaact cggcactcaa ggtaaagggt 1560
gttgccgggc tgagggtgat cgattcttcg gtgatgcctt caatccccgg cggtcaaaca 1620
gcggcaccga cgatcatgat cgcagagaaa gcggcggaca tgctcatggc ttag 1674
<210> 21
<211> 1808
<212> DNA
<213> Emiliania huxleyi
<400> 21
gccttcgcgg cggcagcggc gtcactggcg gcagcctcgg ccgcggcggc ggctcgccgg 60
cgatcgacgg cgagtttgac tacatcatcg ttggaggcgg cgccgcgggc tgcgtgctcg 120
ccaatcggct gagcgccgac ccggcgcacc gggtgctgct gatcgaggcc ggaggcgacg 180
cgtcgcgcga caagcgtgcg caggtgccgt gggccttcac caagctgctg cgttccgagt 240
acgactggga ctttcacgtg gaggcggagg cggcggtgaa ccagcaggag gtgtacctct 300
gccgcggcaa ggcgctgggc ggctcttcgg tcacaaacgt gatgctctac caccggggca 360
gccccgcgga ctacgacgct tgggaggagg ctggcgcgcg agggtggggc gcgaaggacg 420
tgctcccgta ttacctccgc gtcgaggact acggcgacgg cgcctcgcag taccacgccg 480
tcggcgggca cgtctcggtg caggaggtgc cgtaccagaa ccaactctcg gcaaccttcc 540
tgcgggcgat ggggcagctg ggcttccggc cgaacggaga cttcaacgac tggtccagcc 600
cgcaggaggg gtacggccgc tacaaggtga cccagcgggc cggccgccgc tgcaccgctg 660
ccgacggcta cctggcggcg gcgagagagc gcgcgaacct ggtggtggtg accggcgcgc 720
aggcgacccg cctcgccctc gacagtgcgt acgacggcgc gggccggctg caggtctccg 780
gcgtcgagtt tgcacgcggc gacgagcgcg agccgtgctc cgtccggctc gcgcgcggcg 840
gagaggccgt cctctgcgcc ggcgcggtcc agacgccgca cttgctgctc ctctccggga 900
tcggcccggc ggagcacctg cgcgaggttg gcgtgccggt gcgggcggac ctgcctgggg 960
tggggtccgg cctgcaggac caccccgcgg tggtcgtctc gtacgagagc aagaaagcgg 1020
tcgccgcgac ggacgacgcg ctcctcaagg gctacgcgtc gctggtcaac ccgctcgcga 1080
tgctgcgctg gctcctgttt gggcgcgggc cgctggcgtg cgccgcgtgc gaccacggcg 1140
gcttcgtccg ctcctcgccc gacctcgacc agcccgacgt ccagatccgc ttcgtgcctg 1200
cgcgcgcctc gtccgcctcc gggatgaaca cgctgatcga gctgggcagg agagcgcgct 1260
tcctgccggg cttctcgacg caggtcgtcg cttgccgccc gcggagcgag gggcgcgtgc 1320
ggctgcggtc ggccgacccg ttcgccaagc cgatcatcga gggcatccac ttgggcgcag 1380
cggaggacgt cgcgtcgctg cgccacggca tccggctcgg ccggcaggtt tgcgccgcgg 1440
cagccttcga cgagtaccgc ggagaggagg tcttccccgg cgcggcggtg cagtccgacg 1500
agcagatcga cgagtacatc cgctcgtcgg tgcactctgc gaacgcgctc acctcgtcct 1560
gccgcatggg cgacccgtcc gacccggccg cagtcctcga ctcccacttg cgcgtgcgcg 1620
gcgtcggcgg cttgcgcgtg gccgacgcct ccgccatgcc tcgcatcatc ggagggcaga 1680
cgcaggcgcc cacgtacatg ctcgccgaac gtgccgccga catcctgctg cacgcgcgcc 1740
tgcaggcgca cgagccagcc accgagagcg tctcgcagcg gctcgaggtt gcggcggccg 1800
cactctag 1808
<210> 22
<211> 1605
<212> DNA
<213> Aureococcus anophagefferens
<400> 22
cgcctcagcg aggacccgag caagaaggtg ctcgtgctcg aggccggcga ccggggcccg 60
aactcgccgc tcgtgaagat ccccgtggcc atcctcaagc tcttcaagtc cgcgtacgat 120
tggaacttcg cgacgaggcc gtccgaggcc gtcgcggacc ggagcctcta cgtctgccgg 180
ggcaagggcc tgggcggcag ctccctgacg aacgtcatgc tctacaaccg gggctcggcc 240
aacgactacg acgcgtgggc ggccgcgtgc ggcgacgact cgtggggggc ggaagagatg 300
ctcggctact tcaagaaggc cgaggactgc ctcgtgccgg cgcaccgagc gaaccactac 360
cacggcgtcg gcgggcccta cgcgtcgagc cacgtgccct acacgaacga gatgtcgacg 420
gcgttcgtcg aggccgccgt cgaggacggc ggcgtgcgca acggcgactt caacgactgg 480
tccacgtccc aggtcggctt cggccgcttc gccgtgagcc agcgcaaggg ggcaagggtg 540
gacgcggcga cggcctacct cccgcggaag gtccggcggc gcgcgaactt ggacgtggtc 600
cgcggcgcgg cgctctccgg cgtcacgtgg aacgcgaaca aggccacggg cgtcgagttc 660
gccttcggcg gcgtctcggg catcgcctgc ggcggcgagg tgatcctctc cggcggcgcg 720
gtccactcgc cgcagatgct catgctctcc ggcgtcggcg cgaaagcgca gctcgaggag 780
ttcggcatcc ccgtcgtcgc ggaccggccg ggcgtgggca agaatttgca ggaccacccg 840
gcctgcctcg tgtcctggcg cgggtcggcc aaggcccagg gcaagagcca ctcgacgcag 900
ctccggatcc ccgggacgac gaagacctcg cccaaggcgc tcctccagtg gctcttcctc 960
ggccggggcc ccttggcctc gccgggctgc gaccacggcg gcttcgccaa ggtcggcgcc 1020
ggcgacggcg actgcgacgt ccagttccgg ttcctcgcga cgaagtcgat cacgcccgac 1080
ggcatgtcta ccatctccga ctcctacgag gccgccgtgg accaccccga cggcttgacg 1140
atccagacca tcgtcgcccg gcccaagagc cgcgcgggcg aggtgaaact cgcgtcccgg 1200
gacccggcgg cgaagcccgt catcgagaac gcgtacctct ccgacgaggc cgacgtcatg 1260
accatggtca aggcgctcca gaaggcgcgg tccatcgcga gccgggcgcc gttgagcgcc 1320
tacgcgggac acgaggagtt cccgggggag gacgtcgcgg acgagcgcca actggcggcc 1380
tacgtgcgga acaccgctca taccgcgaac gcggtcgtcg ggacctgcaa gatgggcgag 1440
tccagcgacg ccctcgccgt cgtcgacaac cacctcaagg tcatcggcgt ctcgaacctg 1500
cgggtggtgg acgcgtcggt gatgccgacg ctgccgggcg gccagacggc cgcgtcgacc 1560
gtcgcgctcg cggagaaggc cgcggacctc atcaaggggg gctga 1605
<210> 23
<211> 3711
<212> DNA
<213> Nannochloropsis gaditana
<400> 23
ctctccaaga ccaccatcgg cctccaatcc ttcgtgacag caaattatgg agtgaggaga 60
gcaatctctc tccgaggggg gctacaatct gtttcgatga aggcaccggc tgccgttgct 120
tcgtccacct acgactacat catagtcggt ggcggcatcg gcggttgtgt tctcgccaac 180
cgactgacag aaagcgggcg tttcaaggtc cttctcctgg aggccggaaa atcagcagag 240
cgaaacccgt acgtgaacat ccccgcgggc gtggtccgcc tctttaaatc ggccttggat 300
tggcagtttg agagcgcccc cgaaagacac ctggacggga aggaggtgta cttggtcagg 360
gggaaggcca tgggaggctc cagtgcggtg aatgtgatgc tcgtacaccg cggctcggcc 420
tccgactacg cgaagtggga ggcggaggga gctcagggat ggggcccgga ggaagcctta 480
cgctacttca agaaaatgga agacaacttg gtgggcgggg aagggcggtg gcacggccag 540
gggggcatgt acccggtgga cgacgtcaag taccaaaacc ctttgtccaa gcgcttttta 600
caggcgtgcg aggagtacgg gtggcgggcg aacccggatt ttaacgactg gtcccatccc 660
caggacggat acgggagctt caaagtggcg cagaagcacg gcaaacgggt gacggccgcc 720
tccgggtact tgaacaaggc cgttcgacgt cgaccaaacc tagacattct gtcagaggcc 780
cttgtgaccc gggttttgct tgagggagag ggggatgtga aggcggtcgg ggtggagttc 840
acgggcaaag atgggaagac gcaccaggtt cggaccacgg ggaaggcggg agaagttctc 900
ttggcgggcg gcgcggtcaa cagcccccaa ctcctgatgc tgagtgggat cggacccgag 960
gcagacctcc aggcagtagg catcgcgacc aaagtaaacc gtccgggcgt gggggagaac 1020
ttgcaagacc atcccgccgt cactattgcg cacaacatca cgcgccctat ctcgctctgc 1080
gacgacctct tccttttcca cacacctgtc cctaagcccc accaggtgct ccggtggacc 1140
ttgaccggat cgggcccgct gaccacccca ggctgcgacc acggcgcgtt cctgaagacc 1200
cgagaagacc tccaggaacc caacgtacag tttcgtttca tagccgggcg gggttcggac 1260
cctgacggcg tgcgctccta catcatggga ggctcagcac gccccctgtc gggattgacg 1320
cttcaagtcg tcaacatccg ccccaaaagc aaagggaagc tgaccttggc gagcaaggac 1380
ccgttgaaga agccccggat cgaagtccgg tacttgtccg cggccgaaga cttgcaggcc 1440
cttcgcacgg gcatgaggat tggccgggat ctgatcaagc aacgggcttt tgcggatatc 1500
ttggacgagg aagtgttccc ggggcccgcc gctcagacgg acgaggaact ggacgcctac 1560
atccgggata gcttgcacac ggccaacgcc ctggtaggca cctgcaagat ggggagtgtg 1620
gaggatcgga acgcagtggt ggacccggag tgccgggtca tcggcgtggg aggcctgcgg 1680
gtggtggatg caagcgtgat gcccgttatc cccggagggc aaacgggaag tggcacgacc 1740
atgctggccg aaaaagcggc cgacctggtc agggcccacg ctggggattt ggtggagatg 1800
ggagtgcaag atgaggagag gaagggagga tggtttaacg gcctgttagg gcgcaaacag 1860
aaggtggcga cagaaaagga gcgaggcgaa cgtggtaaaa gcgaacgatt tgtttctgag 1920
gtgattaggc atatgggtcg ggttttcgta caagtttcga gggcaaggcg tgcgcaaacg 1980
tgcatgaggg tagggaaggg tctcgatagg gaacggcagt tggagtgtgc catgcgcaag 2040
gaattgacga ttgcgctttt ttacgcaatg ctttttacaa tgagacatag tggatttctt 2100
tcgacgactg gtcgcgcctc atataaggac cttggatact tgacagggtc ctgtcgcgcc 2160
cacccttgta catctccatc ctccttgtgc ctgtttccag aaaaaccttt catgaagcta 2220
agccctgctt tggcggtcgt tggcttttgc tttaattcta tcaatgtcca aggtttccta 2280
ctcagcaacc ttgccggtcg gagcctgaag catccggtcc cacaaaaggg cttgtatagt 2340
cgcattgagt acgatgcacg ggagccacgt ctcgatgaat tcggcctccc tcttgatccg 2400
gcggatttga tggaaaaacc ccgagtgccc ctgaaggacc gagtttatca catcattgac 2460
atgacaaacg actgggtcga tgctgtgagc cgcggacggc gagaggagga gacgcgtcgc 2520
atcatccaac gacgtcgtgc cgctgccaag gccatggcaa tcaaggacaa ggtcttgatt 2580
tctcttgact acgtcttcca tccagtcaag gcctggagga ccttcgtggc ggaccccttg 2640
gaagcacggc atcagcgcca gctgcgtcag caggcagaaa agcgagcgag actagaacgg 2700
tatctgcaac gctataacac ggtcaagaat cgcttccatg atactctgga tcttttggag 2760
tcgacgaccc ggacatcggt gaaagtggcc aagtccgtga gttccgcagt ggtgggggcg 2820
cctgggacgg tgacgcggac cgtgaaggag gtgaaaagcc aggcacaggg cacagcggag 2880
gcagtggcga aggtgtcttc ctccgtctcc tcggtggtgt ccaagatcac gtcggtgatc 2940
aggaaggaag acggggctct ggcgggggcc aaggggaaaa aggacccgag atcagaagac 3000
gaaggaaaag ccgatccagt caaggtccgg gagatctggg aaacgaaaga gcagaccgcg 3060
attcgcacca tctgggaagc ggatgagctt gtcacgccgg taacaccgcc agccacggct 3120
atggcgtcga cggtttcggt gtcagagcct caggacgaga acgaagcttc catctctcag 3180
ggagcggcgc cttcccccag cacctcatca ccatcctccc ccgagcccgt cacacgcctc 3240
tctttccggg cacgtgtgga ggcggacgag aaggaacgct ttgggtcccg aagattgaag 3300
atatcgggga atgtcccgcc gaccgcttct cccactcggg gggcttcttc tctccctttg 3360
gacacgcttt cctcctccgc cacccaaacc tttgagcgtt ccaaagtggg gccgcccata 3420
cgaacaagta aggcgagatg cattggaaaa tgtgtacata acgggtggaa agggatatgt 3480
gaggaatggt ttgtgcacat tagttttcca acgtatgcgg tctctatcgt ccgtccaccc 3540
atgcacgtgc ataattttaa agtgatttgt tgtgttctag cggtccgaca tgcaagaagg 3600
aagaaggaga tgagcacggc tttatctaca catttaattt atttactgct gaaaacggta 3660
aaaatgttgc aagatcttcc ccagctacgg agaaagggca aaacaaacta g 3711
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
atggcgtcaa ttacatcgcg 20
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 25
tcatgctgcc actgtcgc 18
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> consensus sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(7)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X is D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X is A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X is K, R, S or E
<400> 26
Gly Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Gly Xaa Phe Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 27
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
ctgtacttcc aatcagccag cgcagttgaa gatattc 37
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
tatccacctt tactgttatc atgctgcaac ggttgccggt g 41
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
tacttccaat caatgatgct gggtccgaaa acc 33
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
tatccacctt tactgttcta ctaaactgca accggctgac g 41
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 31
tacttccaat caatgaaaaa aagcctgcgt agc 33
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 32
tatccacctt tactgttcta ctatgcgctt gcggtg 36
Claims (21)
- 지방산으로부터 알칸(alkanes) 및/ 알켄(alkenes)을 생산하기 위한 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 용도로서,
상기 폴리펩타이드는 지방산 탈카르복실화 효소(decarboxylase) 활성을 가지며 서열번호 1과 적어도 40%의 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 것인 용도.
- 제1항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 공통 서열(consensus sequence) G-X-L-(X)4-C-[D/E]-X-G-[A/G]-F-X-[K/R](서열번호 4)을 포함하고, X는 임의의 아미노산인 것인 용도.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
서열번호 1의 C372, R391, Y406, Q426, H512 및 N515 위치 중 1,2,3,4,5 또는 6 개의 아미노산이 보존되는 것인 용도.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
388-428 번 위치 사이의 아미노산 잔기의 적어도 40%가 V, I, L, M, F, W, C A 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 소수성(hydrophobic) 잔기인 것인 용도.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 3 및 5 내지 14 및 이들 중 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 본질적으로(essentially) 구성된 것인 용도.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 조류(algae), 바람직하게는 미세조류(microalgae) 또는 시아노박테리아(cyanobacteria)로부터의 것인 용도.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 지방산 및 상응하는 탈카르복실화된 알칸 및/ 알켄은 8 내지 24 개의 탄소 원자, 바람직하게는 12 내지 22 개의 탄소 원자를 포함하는 것인 용도.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 지방산 및 상응하는 탈카르복실화된 알칸 및/ 알켄은 하나 이상의 관능기로 치환 및/또는 단절되는 것인 용도.
- 제8항에 있어서,
상기 지방산 및 상응하는 탈카르복실화된 알칸 및/ 알켄은 하이드록실, C1-C3 알콜, C1-C3 아실, C1-C3 에스테르, C1-C3 아민, 아미노기, C1-C3 아미드, 카르복실, 알데히드, 에폭시, 할로겐, C1-C3 알콕시, C1-C3 티오알킬, C1-C3 이민, 니트릴, C1-C3 술폰 또는 C1-C3 술폭시드와 같은 황기, 티올, 니트로, 시아노, C1-C3 할로게노알킬과 같은 하나 이상의 기로 치환되거나, 또는 O, N 또는 S와 같은 헤테로 원자, 아세틸렌기, 디비닐에테르기와 같은 에테르, 또는 옥소기로 단절되는 것인 용도.
- 지방산으로부터 알칸 및/ 알켄을 생산하는 방법으로서,
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩타이드를 지방산과 접촉시키고 300 내지 540 nm의 파장을 갖는 광(light)에 노출시키는 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 광은 400 내지 520 nm의 파장을 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 이종(heterologous) 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포.
- 제12항에 있어서,
상기 숙주 세포는 박테리아(bacterium), 미세조류(microalga), 사상 진균(filamentous fungus) 또는 효모(yeast)인 것인 재조합 숙주 세포.
- 제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 이종 폴리펩타이드는 티오에스테라제(thioesterase)와 함께, 바람직하게는 미세조류 또는 시아노박테리아에서 동시-발현되는 것인 재조합 숙주 세포.
- 제12항 또는 제14항에 있어서,
상기 이종 폴리펩타이드는 지방 분해 효소(lipase)와 함께, 바람직하게는 박테리아에서 동시-발현되는 것인 재조합 숙주 세포.
- 지방산으로부터 알칸 및/ 알켄을 생산하는 방법으로서,
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포를 배양하고 알칸 및/ 알켄을 회수하는 방법.
- 시료에서의 유리 지방산(free fatty acids)의 적량(dosage)을 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩타이드의 용도.
- 다음 단계를 포함하는 시료에서의 유리 지방산 적량(dosing) 방법으로서,
a. 지방산을 알칸/알켄으로 전환시키는데 적합한 조건에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 지방산 탈카르복실화 효소와 시료를 접촉시키는 단계,
b. 상기 알칸/알켄 및/또는 CO2를 회수하는 단계; 및
c. 상기 알칸/알켄 및/또는 CO2를 정량화하는 단계.
- 다음 단계를 포함하는 시료에서의 유리 지방산 적량(dosing) 방법으로서,
a. 지방산을 알칸/알켄으로 전환시키는데 적합한 조건에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 지방산 탈카르복실화 효소와 시료를 접촉시키는 단계,
b. 상기 지방산 탈카르복실화 효소에 의해 방출된 형광을 측정하는 단계.
- 제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 방법은 시료를 지방 분해 효소와 접촉시키는 사전 단계를 포함하는 것인 방법.
- 지방산의 탈카르복실화를 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩타이드의 용도.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP16305583.3 | 2016-05-20 | ||
EP16305583.3A EP3246401A1 (en) | 2016-05-20 | 2016-05-20 | New fatty acid decarboxylase and its uses |
PCT/EP2017/062061 WO2017198802A1 (en) | 2016-05-20 | 2017-05-19 | New fatty acid decarboxylase and its uses |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20190015335A true KR20190015335A (ko) | 2019-02-13 |
KR102418876B1 KR102418876B1 (ko) | 2022-07-07 |
Family
ID=56092854
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020187037068A KR102418876B1 (ko) | 2016-05-20 | 2017-05-19 | 신규한 지방산 탈카르복실화 효소 및 이의 용도 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11236367B2 (ko) |
EP (2) | EP3246401A1 (ko) |
JP (1) | JP7053496B2 (ko) |
KR (1) | KR102418876B1 (ko) |
CN (1) | CN109477077A (ko) |
CA (1) | CA3025117A1 (ko) |
MX (1) | MX2018014257A (ko) |
WO (1) | WO2017198802A1 (ko) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201806483D0 (en) | 2018-04-20 | 2018-06-06 | Univ Manchester | Hydrocarbon production |
EP3798294A1 (en) | 2019-09-27 | 2021-03-31 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition |
WO2021062435A1 (en) * | 2019-09-27 | 2021-04-01 | The Procter & Gamble Company | Consumer product compositions comprising fatty acid photodecarboxyalases |
CN112063608B (zh) * | 2020-08-27 | 2022-06-17 | 浙江工业大学 | 一种脂肪酸光脱羧酶突变体及其在l-草铵膦合成中的应用 |
CN112111502B (zh) * | 2020-09-25 | 2022-09-09 | 清华大学深圳国际研究生院 | 氯霉素的新型抗性基因及其应用 |
CN112410321B (zh) * | 2020-11-26 | 2022-01-28 | 昆明理工大学 | 一种β-葡萄糖苷酶Ttbgl3及其应用 |
CN112707602B (zh) * | 2020-12-31 | 2022-04-22 | 西安交通大学 | 一种光酶耦合处理废水中挥发性脂肪酸的方法 |
CN112877347B (zh) * | 2021-01-28 | 2023-02-17 | 华南理工大学 | 一种多酶复合体及其构建方法和应用 |
CN113025369B (zh) * | 2021-04-18 | 2022-08-12 | 重庆工商大学 | 一种用餐饮废油制备烃类燃料的方法 |
CN113462575B (zh) * | 2021-06-30 | 2022-11-22 | 海南大学 | 一种雨生红球藻培养基及其制备方法和雨生红球藻培养方法 |
WO2023102629A2 (pt) * | 2021-12-06 | 2023-06-15 | Cnpem - Centro Nacional De Pesquisa Em Energia E Materiais | Enzima quimérica e processo para a produção de alcenos terminais |
CN114480358B (zh) * | 2022-03-18 | 2023-11-03 | 中山大学 | 一种光脱羧酶或其重组酶的应用及一种重组光脱羧酶 |
CN114854726B (zh) * | 2022-06-21 | 2023-09-19 | 华南理工大学 | 脂肪酸光脱羧酶McFAP的突变体及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014102201A1 (en) * | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Shell Internationale Research Maatschappij B.V. | Novel yeast strains |
Family Cites Families (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5447858A (en) | 1984-04-13 | 1995-09-05 | Mycogen Plant Sciences, Inc. | Heat shock promoter and gene |
IL71691A (en) | 1984-04-27 | 1991-04-15 | Yeda Res & Dev | Production of interferon-ypsilon |
US5753475A (en) | 1985-01-17 | 1998-05-19 | Calgene, Inc. | Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes |
DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
US5614395A (en) | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5047335A (en) | 1988-12-21 | 1991-09-10 | The Regents Of The University Of Calif. | Process for controlling intracellular glycosylation of proteins |
US5639952A (en) | 1989-01-05 | 1997-06-17 | Mycogen Plant Science, Inc. | Dark and light regulated chlorophyll A/B binding protein promoter-regulatory system |
IL99552A0 (en) | 1990-09-28 | 1992-08-18 | Ixsys Inc | Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof |
FR2704860B1 (fr) | 1993-05-05 | 1995-07-13 | Pasteur Institut | Sequences de nucleotides du locus cryiiia pour le controle de l'expression de sequences d'adn dans un hote cellulaire. |
DE4343591A1 (de) | 1993-12-21 | 1995-06-22 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
AU2705895A (en) | 1994-06-30 | 1996-01-25 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein |
HUP9802225A3 (en) | 1995-05-26 | 2000-03-28 | Zeneca Ltd | A gene switch comprising an ecdysone receptor |
US5955310A (en) | 1998-02-26 | 1999-09-21 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell |
CA2344619C (en) | 1998-10-26 | 2012-01-03 | Novozymes A/S | Constructing and screening a dna library of interest in filamentous fungal cells |
ES2293742T3 (es) | 1998-11-20 | 2008-03-16 | Dow Agrosciences Llc | Secuencias reguladoras utiles para la expresion genica en tejido embrionario vegetal. |
CN100510096C (zh) | 1999-03-22 | 2009-07-08 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 用于在真菌细胞中表达基因的启动子 |
CN101210234B (zh) * | 2006-12-27 | 2011-09-07 | 中国海洋大学 | 一种海洋微藻δ5脂肪酸去饱和酶及其应用 |
EP2594633A1 (en) | 2007-03-28 | 2013-05-22 | LS9, Inc. | Enhanced production of fatty acid derivatives |
WO2009085278A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-07-09 | Ls9, Inc. | Methods and compositions for producing olefins |
US8119859B2 (en) | 2008-06-06 | 2012-02-21 | Aurora Algae, Inc. | Transformation of algal cells |
ES2674583T3 (es) | 2011-06-30 | 2018-07-02 | Exxonmobil Research And Engineering Company | Regulación de genes de toxina y antitoxina para el confinamiento biológico |
CA2872872A1 (en) | 2012-05-17 | 2013-11-21 | Universite Laval | Early predictive markers of pre-eclampsia |
US10612034B2 (en) | 2012-06-01 | 2020-04-07 | Exxonmobil Research And Engineering Company | Promoters and terminators for use in eukaryotic cells |
US9546372B2 (en) | 2012-06-12 | 2017-01-17 | Synthetic Genomics, Inc. | Regulatory elements and uses thereof |
CA2893692C (en) | 2012-12-04 | 2019-06-25 | Exxonmobil Research And Engineering Company | Tetraselmis promoters and terminators for use in eukaryotic cells |
US9567615B2 (en) | 2013-01-29 | 2017-02-14 | Terravia Holdings, Inc. | Variant thioesterases and methods of use |
WO2015089102A1 (en) | 2013-12-10 | 2015-06-18 | The Regents Of The University Of California | Differential diagnosis of liver disease |
US10125382B2 (en) | 2014-09-18 | 2018-11-13 | Corbion Biotech, Inc. | Acyl-ACP thioesterases and mutants thereof |
-
2016
- 2016-05-20 EP EP16305583.3A patent/EP3246401A1/en not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-05-19 CA CA3025117A patent/CA3025117A1/en active Pending
- 2017-05-19 KR KR1020187037068A patent/KR102418876B1/ko active IP Right Grant
- 2017-05-19 US US16/302,112 patent/US11236367B2/en active Active
- 2017-05-19 MX MX2018014257A patent/MX2018014257A/es unknown
- 2017-05-19 CN CN201780031266.4A patent/CN109477077A/zh active Pending
- 2017-05-19 EP EP17726576.6A patent/EP3458577A1/en active Pending
- 2017-05-19 WO PCT/EP2017/062061 patent/WO2017198802A1/en unknown
- 2017-05-19 JP JP2018560882A patent/JP7053496B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014102201A1 (en) * | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Shell Internationale Research Maatschappij B.V. | Novel yeast strains |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Metab Eng.,31:53-61(2015.7.8.) * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3458577A1 (en) | 2019-03-27 |
JP7053496B2 (ja) | 2022-04-12 |
CA3025117A1 (en) | 2017-11-23 |
KR102418876B1 (ko) | 2022-07-07 |
JP2019516381A (ja) | 2019-06-20 |
US20190161771A1 (en) | 2019-05-30 |
WO2017198802A1 (en) | 2017-11-23 |
CN109477077A (zh) | 2019-03-15 |
US11236367B2 (en) | 2022-02-01 |
EP3246401A1 (en) | 2017-11-22 |
MX2018014257A (es) | 2019-04-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102418876B1 (ko) | 신규한 지방산 탈카르복실화 효소 및 이의 용도 | |
US10760106B2 (en) | Variant thioesterases and methods of use | |
KR101523255B1 (ko) | 미생물에서 오일의 생성 | |
US9538771B2 (en) | Polypeptides having phospholipase C activity and polynucleotides encoding same | |
US11180742B2 (en) | Polypeptides having phospholipase C activity and polynucleotides encoding same | |
US11618890B2 (en) | Beta-ketoacyl-ACP synthase II variants | |
US10407638B2 (en) | Production of alpha-olefins | |
JP2019068755A (ja) | 脂質の製造方法 | |
US20230143841A1 (en) | Beta-ketoacyl-acp synthase iv variants |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
E601 | Decision to refuse application | ||
AMND | Amendment | ||
X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
GRNT | Written decision to grant |