KR20190012519A - Composition for Identifying Undifferentiation Stage of Canine Spermatogonial Stem Cells - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a composition for analyzing an undifferentiation stage of canine spermatogonial stem cells (SSCs), a composition for separating undifferentiated canine SSCs, a method for analyzing the undifferentiation stage of canine SSCs, and a method for separating undifferentiated canine SSCs. By using the same, the present invention can effectively analyze the undifferentiation stage of canine SSCs by measuring an expression of CXCR4 and PGP9.5 at an mRNA level or protein level, and separate undifferentiated canine SSCs using an antibody specific to CXCR4 and PGP9.5. The undifferentiated canine SSCs separated through the present invention can be used for studies on production of genetically modified sperms and animals as well as studies on male sterility related to germ cell differentiation and a spermatogenesis process.

Description

개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물{Composition for Identifying Undifferentiation Stage of Canine Spermatogonial Stem Cells}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition for analyzing the degree of undifferentiation of canine spermatogonial stem cells,

본 발명은 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for analyzing the degree of undifferentiation of cancellous stem cells.

정원줄기세포(spermatogonial stem cells, SSCs)는 정소에 존재하면서 정자형성(spermatogenesis)에 중요한 기능을 한다. 그 명칭에 있어 포유류 암컷에서 이들의 존재 가능성이 제기되어 이와 구분하기 위해 ‘남성생식선줄기세포’(雄性, 웅성, male germline stem cells)라고도 부른다. Spermatogonial stem cells (SSCs) are important in spermatogenesis in testes. It is also called "male germline stem cells" (male germline stem cells) in order to distinguish between them in the name of their existence in mammalian females.

이 세포는 성체줄기세포 특유의 자가재생 능력과 정자 세포로의 분화 능력을 동시에 가지고 있으나, 고환 내에 아주 극소수가 존재하기 때문에 그 분리와 임상적 이용에 어려움이 많고, 체외에서 증식, 배양하는 기술의 확립이 미흡한 문제점이 있다. Although these cells have both the ability to regenerate adult stem cells and the ability to differentiate into spermatids, very few are present in the testes, which makes them difficult to isolate and use for clinical purposes. There is a problem that the establishment is insufficient.

이에, 정원줄기세포의 새로운 마커의 발굴에 의한 효율적인 분리, 최적의 배양 조건, 충분한 양의 체외 증식과 그 유지 방법에 대한 지속적인 노력이 이어져 왔으나, 아직 체외에서의 정자 형성은 기술적인 한계가 있다. Thus, the efficient isolation of new stem cells from the spermatogonial stem cells, the optimal culture conditions, and the continuous efforts for the in vitro proliferation and maintenance of a sufficient amount of spermatogonial stem cells continue to be technically limited.

정원줄기세포는 분리가 제한적이고 배양 시에는 많은 수의 정원줄기세포가 죽기 때문에 배양이 어려우며, 특히 정원줄기세포와 분화된 정원세포간의 구별이 가능한 형태학적, 생화학적인 마커가 없는 것이 가장 큰 어려움이다(Nagano 등, 1998; van Pelt 등, 2002). It is difficult to cultivate spermatogonial stem cells because their separation is limited and a large number of spermatogonial cells die during cultivation. In particular, the absence of morphological and biochemical markers that can discriminate between spermatogonial stem cells and differentiated spermatogonial cells is the biggest difficulty (Nagano et al., 1998; van Pelt et al., 2002).

관련 선행기술로는 한국 등록특허 10-1027718(웅성 생식세포-특이 뉴클레오타이드 서열), 한국 등록특허 10-1173116(신규한 돼지 정조줄기세포 분리 및 배양 방법)이 있다.Korean prior art 10-1027718 (male reproductive cell-specific nucleotide sequence) and Korean Patent 10-1173116 (novel porcine stem cell isolation and culture method) are known prior arts.

최근 마우스 정소 내 정원줄기세포를 통한 키메라 마우스의 생산 이후 랫트, 소, 돼지, 닭 등의 정원줄기세포를 이용한 이식에 관한 연구 보고가 급증하고 있다. Recently, studies on transplantation using spermatogonial stem cells such as rats, cows, pigs, and chickens have been increasing rapidly since the production of chimeric mice through spermatogonial stem cells in mouse testis.

그러나, 개를 비롯한 중대형 동물의 정원줄기세포를 이용한 형질전환 동물의 생산에 관한 연구는 아직 미미한 수준이며, 특히 개는 크기, 수명, 유전적으로도 마우스 모델보다 인간과 밀접한 관련성이 있으므로 연구의 가치가 높음에도 불구하고 개 정원줄기세포에 관한 연구는 현재까지 많은 연구가 진행되어 있지 않은 실정이다. However, the research on the production of transgenic animals using the spermatogonial stem cells of medium-sized animals such as dogs is still insignificant. Especially, since the dogs are closely related to human than the mouse model in terms of size, Despite the high yield, studies on the spermatogonial stem cells have not been conducted so far.

따라서 개 정원줄기세포 특이 발현 표면항원 발굴을 통한 마커 시스템 개발 및 이러한 기술을 기반으로 한 유전자 조작 형질전환 및 질환모델 개의 생산기술 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.Therefore, it is urgently required to develop a marker system through the digestion of surface specific antigen (s) expressing the spermatogonial stem cell, and to develop genetic manipulation transformation and disease model production technology based on such technology.

본 발명자들은 개 정원줄기세포의 미분화 정도를 확인할 수 있는 신규한 생물학적 마커를 개발하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과 CXCR4와 PGP9.5를 동시에 발현하는 개 정원줄기세포가 CXCR4 또는 PGP9.5만을 발현하는 세포보다 미분화 성격을 갖는 세포임을 확인하고, CXCR4 및 PGP9.5의 발현을 측정하여 개 정원줄기세포의 미분화 정도를 분석할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors sought to develop a novel biological marker capable of confirming the degree of undifferentiation of canine xylem cell. As a result, it was found that the canine xylem stem cells simultaneously expressing CXCR4 and PGP9.5 express CXCR4 or PGP9.5 alone The present inventors completed the present invention by confirming that the cells are undifferentiated cells and that the expression levels of CXCR4 and PGP9.5 can be measured to analyze the degree of undifferentiation of cannulated stem cells.

따라서, 본 발명의 목적은 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물을 제공하는 데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for analyzing the degree of microdifferentiation of cancellous stem cells.

본 발명의 다른 목적은 미분화 개 정원줄기세포 분리용 조성물을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a composition for the undifferentiated cannabis stem cell separation.

본 발명의 다른 목적은 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석방법을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a method for analyzing the degree of undifferentiation of cancellous stem cells.

본 발명의 다른 목적은 미분화 개 정원줄기세포 분리방법을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide an undifferentiated cannabis stem cell separation method.

본 발명의 일 양태는 CXCR4(chemokine receptor type 4)의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제; 및 PGP9.5(protein gene product 9.5)의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물에 관한 것이다. One embodiment of the present invention is directed to an agent that measures the expression of CXCR4 (chemokine receptor type 4) at an mRNA level or a protein level; And a composition for measuring the expression of PGP9.5 (protein gene product 9.5) at an mRNA level or a protein level.

본 발명에서는 개의 정소 내에 CXCR4와 PGP9.5를 동시에 발현하는 세포 군집과 PGP9.5만을 발현하는 세포 군집이 있음을 관찰하고, 특히 CXCR4와 PGP9.5를 동시에 발현하는 세포가 PGP9.5만을 발현하는 세포보다 기저막 부위에 존재한다는 것을 확인하였다. 정자형성은 기저막 부위에서부터 시작되고 기저막 부위의 세포가 미분화 성격을 가진다는 것은 잘 알려져 있으며(Phil. Trans. R. Soc. B (2010) 365, 1663-1678), 본 발명자들은 CXCR4와 PGP9.5를 동시에 발현하는 세포가 PGP9.5만을 발현하는 세포보다 미분화 성격을 가지는 세포임을 규명하였다. In the present invention, it was observed that a cell cluster expressing both CXCR4 and PGP9.5 and a cell community expressing PGP9.5 only exist in dog testes, and in particular, cells expressing PGX9.5 alone expressing PGX9.5 alone Cells were found in the basement membrane area. It is well known that spermatogenesis starts from the basement membrane and cells in the basolateral region have undifferentiated character (Phil. Trans. R. Soc. B (2010) 365, 1663-1678), the present inventors have found that CXCR4 and PGP9.5 Were cells that had undifferentiated characteristics than those expressing PGP9.5 alone.

상기 개 정원줄기세포(canine spermatogonial stem cell)는 정소에 존재하면서 정자형성(spermatogenesis)에 중요한 기능을 하는 세포를 의미한다. The canine spermatogonial stem cell refers to a cell that functions in spermatogenesis while being present in a testis.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 개 정원줄기세포는 개의 정소 내 정원줄기세포 또는 체외 배양된 개 정원줄기세포일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the germinal stomach cell may be a gut-in spermatogonial stem cell or an in vitro cultured spermatogonial stem cell.

상기 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물은 CXCR4의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제; 및 PGP9.5의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하며, 이를 이용하여 개 정원줄기세포의 미분화 정도를 분석할 수 있다. The composition for analyzing the degree of microdifferentiation of canine xylem cell comprises a preparation for measuring the expression of CXCR4 at an mRNA level or a protein level; And PGP9.5 expression at an mRNA level or a protein level, and can be used to analyze the degree of undifferentiation of canine xylem stem cells.

상기 CXCR4의 발현을 mRNA 수준에서 측정하는 제제는 CXCR4 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브이고, 상기 PGP9.5의 발현을 mRNA 수준에서 측정하는 제제는 PGP9.5 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브일 수 있다. The agent for measuring the expression of CXCR4 at the mRNA level is a primer pair or probe specific to the CXCR4 gene. The agent for measuring the expression of PGP9.5 at the mRNA level may be a primer pair or probe specific to the PGP9.5 gene have.

상기 프라이머 및 프로브는 각각 독립적으로 CXCR4 또는 PGP9.5의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. The primers and probes each independently have a sequence complementary to the nucleotide sequence of CXCR4 or PGP9.5.

본 명세서에서 용어 "상보적(complementary)"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 "상보적"은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.The term " complementary " as used herein means having complementarity enough to selectively hybridize to the nucleotide sequences described above under any particular hybridization or annealing conditions. Thus, the term " complementary " has a different meaning from the term complementary, and the primers or probes of the present invention may include one or more mismatches mismatch < / RTI > sequence.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. As used herein, the term " primer " refers to a primer that, under suitable conditions (i.e., four different nucleoside triphosphates and polymerization enzymes) in a suitable buffer at a suitable temperature, - means strand oligonucleotide.

상기 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변형될 수 있다The appropriate length of the primer can be varied depending on various factors such as temperature and use of the primer

또한, 상기 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. In addition, the sequence of the primer does not need to have a sequence completely complementary to a partial sequence of the template, and it is sufficient that the primer has sufficient complementarity within a range capable of hybridizing with the template and acting as a primer.

따라서, 본 발명의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. Therefore, the primer of the present invention does not need to have a perfectly complementary sequence to the above-mentioned nucleotide sequence which is a template, and it is sufficient that the primer has sufficient complementarity within a range capable of hybridizing to this sequence and acting as a primer.

본 발명의 프라이머는 추가적으로 방사선 표지, 형광 표지, 효소 표지, 서열 택, 또는 바이오틴에 의해 표지될 수 있다. The primers of the present invention may additionally be labeled with a radiolabel, a fluorescent label, an enzyme label, a sequence label, or biotin.

본 명세서에서 사용된 용어 "프로브"는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것일 수 있다. As used herein, the term " probe " refers to a linear oligomer of natural or modified monomer or linkages and includes deoxyribonucleotides and ribonucleotides and can specifically hybridize to a target nucleotide sequence, Present or artificially synthesized.

상기 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화될 수 있다. 바람직한 기체는 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예를 들어, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. The probe is used as a hybridizable array element and can be immobilized on a substrate. Preferred gases include solid or semi-rigid supports including, for example, membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic beads or non-magnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries .

상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체상에 배열되고 고정화 될 수 있다. The hybridization array elements can be arranged and immobilized on the substrate.

상기 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시될 수 있고, 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있으며, 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.The immobilization may be carried out by a chemical bonding method or a covalent bonding method such as UV, for example, the hybridizing array element may be bonded to a glass surface modified to include an epoxy compound or an aldehyde group, Can be bound by UV at the surface, and can be bonded to the gas through linkers (e.g., ethylene glycol oligomers and diamines).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물은 유전자 증폭 조성물일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the composition for analyzing the degree of microdifferentiation of the spermatogonial stem cells may be a gene amplification composition.

본 명세서에 기재된 용어"증폭"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. The term " amplification " as used herein refers to a reaction that amplifies a nucleic acid molecule.

다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. A variety of amplification reactions have been reported in the art, including polymerase chain reaction (PCR) (US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,800,159), reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) (Sambrook et al., Molecular Cloning. (LCR) method, the method of Lambert, HI (WO 89/06700) and Davey, C. et al (EP 329,822) Gap-LCR (WO 90/01069), repair chain reaction (EP 439,182), transcription-mediated amplification (TMA, WO 88/10315), self- sustained sequence specific amplification of target polynucleotide sequences (U.S. Patent No. 6,410,276), consensus sequence primed polymerase chain reaction (CP-PCR) , U.S. Patent No. 4,437,975), arbitrary priming (AP-PCR), U.S. Patent Nos. 5,413,909 and 5,861,245), nucleic acid sequence based amplification (NASBA), U.S. Patent Nos. 5,130,238, 5,409,818 5,554,517, and 6,063,603), strand displacement amplification and loop-mediated isothermal amplification. LAMP), but is not limited thereto.

상기 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 CXCR4 및 PGP9.5유전자의 발현 정도를 조사할 수 있다. When the composition for analyzing the degree of undifferentiation of the spermatogonial stem cells is used with a primer, the degree of expression of the CXCR4 and PGP9.5 genes can be examined by performing a gene amplification reaction.

상기 CXCR4 및 PGP9.5유전자의 발현 정도는 분석 대상의 시료인 개 정원줄기세포에서 CXCR4 및 PGP9.5 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 결정할 수 있다.The degree of expression of the CXCR4 and PGP9.5 genes can be determined by examining the amount of mRNA of the CXCR4 and PGP9.5 nucleotide sequences in the spermatogonial stem cells of the sample to be analyzed.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물은 마이크로어레이 조성물일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the composition for analyzing the degree of microdifferentiation of the spermatogonial stem cells may be a microarray composition.

상기 마이크로어레이의 고상표면에는 프로브가 고정화 된 것일 수 있다.The probe may be immobilized on the solid-phase surface of the microarray.

상기 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 마이크로어레이 상에 고정화된 프로브와 혼성화되는 것일 수 있다.The sample DNA applied to the microarray may be hybridized with the probe immobilized on the microarray.

상기 혼성화의 조건은 다양하게 할 수 있고, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.The conditions for the hybridization can be varied, and the detection and analysis of the degree of hybridization can be variously carried out according to the labeled substance.

상기 프로브는 표지(labeling)된 것일 수 있다.The probe may be labeled.

상기 프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. The label of the probe may provide a signal for detecting hybridization, which may be linked to an oligonucleotide.

적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. Suitable labels include fluorescent moieties (e.g., fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia)), chromophores, chemiluminescent moieties, magnetic particles, (P 32 and S 35 ), mass labels, electron dense particles, enzymes (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase), joins, substrates for enzymes, heavy metals such as gold and antibodies, streptavidin , Biotin, digoxigenin, and haptens with specific binding partners such as chelating groups.

상기 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예를 들어, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. Such markings may be obtained by a variety of methods routinely practiced in the art such as the nick translation method, the Multiprime DNA labeling systems booklet (" Amersham " (1989)) and the kaination method (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65: 499 (1986)).

상기 혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. After the hybridization reaction, a hybridization signal generated through the hybridization reaction is detected.

상기 혼성화 시그널은 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있고 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. For example, when the probe is labeled with an enzyme, the hybridization signal can be confirmed by hybridizing the substrate of the enzyme with the result of the hybridization reaction .

이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. Combinations of enzymes / substrates that may be used include, but are not limited to, peroxidases (such as horseradish peroxidase) and chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis- Acetyl-3,7-dihydroxyphenox), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2) , 2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD) and naphthol / pyronine; (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate, and ECF substrate; alkaline phosphatase and bromochloroindoleyl phosphate; Glucose oxidase and t-NBT (nitroblue tetrazolium) and m-PMS (phenzaine methosulfate). When the probe is labeled with gold particles, it can be detected by a silver staining method using silver nitrate.

상기 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, CXCR4 및 PGP9.5 유전자의 발현 정도를 분석할 수 있다. By analyzing the intensity of the hybridization signal by the hybridization process, the degree of expression of CXCR4 and PGP9.5 genes can be analyzed.

상기 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물에서 상기 CXCR4의 발현을 단백질 수준에서 측정하는 제제는 CXCR4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 PGP9.5의 발현을 단백질 수준에서 측정하는 제제는 PGP9.5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있고, 예를 들어, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메릭(chimeric) 항체일 수 있다. The composition for measuring the expression level of CXCR4 at the protein level in the composition for analyzing the degree of microdifferentiation of cancellous stem cells is an antibody that specifically binds to CXCR4 protein, and the agent that measures the expression of PGP9.5 at the protein level is PGP9. 5 protein, and may be, for example, a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a chimeric antibody.

상기 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다.Such antibodies may be prepared by methods conventionally practiced in the art such as the fusion method (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (U.S. Patent No. 4,816,56 ) Or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 .

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CXCR4 단백질에 특이적인 항체는 Santa Cruz Biotechnology의 CXCR-4 Antibody(H-118)일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the antibody specific for the CXCR4 protein may be CXCR-4 Antibody (H-118) of Santa Cruz Biotechnology.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 PGP9.5 단백질에 특이적인 항체는 AbD Serotec의 MOUSE ANTI HUMAN PROTEIN GENE PRODUCT 9.5 (7863-1004)일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the antibody specific for the PGP9.5 protein may be MOUSE ANTI HUMAN PROTEIN GENE PRODUCT 9.5 (7863-1004) of AbD Serotec.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물은 면역분석(immunoassay)용 조성물일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the composition for analyzing the degree of microdifferentiation of the spermatogonial stem cells may be a composition for immunoassay.

상기 면역분석용 조성물은 항원-항체 반응 방식으로 실시할 수 있다. The composition for immunoassay can be carried out by an antigen-antibody reaction method.

상기 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. The immunoassay can be carried out according to various quantitative or qualitative immunoassay protocols developed in the past.

또한, 상기 면역분석은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the immunoassay can be performed by radioimmunoassay, radioactive immunoprecipitation, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), capture-ELISA, inhibition or hard material analysis, sandwich analysis, flow cytometry, But are not limited to, immunofluorescent staining and immunoaffinity purification.

상기 면역분석용 조성물을 방사능면역분석 방법에 따라 실시하는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 이용될 수 있다.When the composition for immunoassay is conducted according to radioactive immunoassay, an antibody labeled with a radioactive isotope (for example, C 14 , I 125 , P 32 and S 35 ) may be used.

상기 면역분석용 조성물을 ELISA 방식으로 실시하는 경우, (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; () 일차항체로서 각각 독립적으로 CXCR4 또는 PGP9.5 단백질에 특이적인 항체와 세포 분해물을 반응시키는 단계; () 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 () 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.When the immunoassay composition is subjected to ELISA, (i) a step of coating the surface of the solid substrate with an undissolved cell sample decomposition product to be analyzed; (A) reacting the cell lysate with an antibody specific for CXCR4 or PGP9.5 protein, respectively, as the primary antibody; () Enzyme with a secondary antibody bound thereto; And measuring the activity of the () enzyme.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트일 수 있다.Suitable as the solid substrate are hydrocarbon polymers (e.g., polystyrene and polypropylene), glass, metal or gel, and most preferably microtiter plates.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, ?-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함할 수 있다. The enzyme bound to the secondary antibody may include an enzyme catalyzing a chromogenic reaction, a fluorescence reaction, a luminescent reaction, or an infrared reaction, but is not limited thereto. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase,? -Galactosidase, Radish peroxidase, luciferase, and cytochrome P450.

상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.In the case where alkaline phosphatase is used as an enzyme binding to the secondary antibody, it is preferable that the substrate is selected from the group consisting of bromochloroindole phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT), naphthol-AS -Bl-phosphate and ECF (enhanced chemifluorescence) are used. When horseradish peroxidase is used, chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (n-butyllithium), tetramethylbenzidine, ABTS (2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD) and naphthol / pyronin, glucose oxidase and nitroblue tetrazolium a substrate such as phenzaine methosulfate may be used All.

상기 ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. In the ELISA method, the measurement of the final enzyme activity or the measurement of the signal can be performed according to various methods known in the art.

이러한 시그널이 검출은 CXCR4 및 PGP9.5 단백질 발현의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. This signal detection enables qualitative or quantitative analysis of CXCR4 and PGP9.5 protein expression.

예를 들어, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.For example, signals can be easily detected with streptavidin when biotin is used as a label and luciferin when luciferase is used as a label.

상술한 면역분석 과정에서 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, CXCR4 및 PGP9.5 단백질의 발현을 분석할 수 있다.The expression of CXCR4 and PGP9.5 proteins can be analyzed by analyzing the final signal intensity in the above immunoassay.

본 발명의 다른 양태는 CXCR4 및 PGP9.5의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정하여 개 정원줄기세포의 미분화 정도를 분석하는 방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method for analyzing the degree of undifferentiation of canine xylem stem cells by measuring the expression of CXCR4 and PGP9.5 at an mRNA level or a protein level.

상기 개 정원줄기세포가 CXCR4 및 PGP9.5를 동시에 발현하는 경우, 상기 개 정원줄기세포는 CXCR4 또는 PGP9.5를 각각 독립적으로 발현하는 개 정원줄기세포 보다 미분화 성격을 갖는 것으로 판단할 수 있다. When the spermatogonial stem cells simultaneously express CXCR4 and PGP9.5, the spermatogonial stem cells can be judged to have a differentiation characteristic from the spermatogonial stem cells independently expressing CXCR4 or PGP9.5.

상기 개 정원줄기세포의 미분화 정도를 분석하는 방법은 상술한 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물을 이용하여 실시할 수 있으며, 따라서 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.The method for analyzing the degree of undifferentiation of the spermatogonial stem cells can be carried out by using the composition for analyzing the degree of undifferentiation of the spermatogonial stem cells described above so that the common content between the two is used in order to avoid the excessive complexity of the present invention The description thereof is omitted.

본 발명의 다른 양태는 CXCR4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 PGP9.5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 미분화 개 정원줄기세포 분리용 조성물에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to an antibody for specifically binding to CXCR4 protein and a composition for separating undifferentiated canine stem cell comprising an antibody that specifically binds to PGP9.5 protein.

본 발명의 다른 양태는 개의 정소를 분리하는 단계 및 상기 분리된 정소에서 CXCR4 및 PGP9.5를 발현하는 세포를 분리하는 단계를 포함하는 미분화 개 정원줄기세포의 분리방법에 관한 것이다. Another aspect of the present invention relates to a method for isolating undifferentiated canine spermatogonial cells comprising the steps of isolating dog testis and isolating cells expressing CXCR4 and PGP9.5 in said isolated testis.

본 발명의 방법을 통해 분리한 미분화 개 정원줄기세포는 형질전환 정자 및 동물의 생산 연구는 물론 생식세포 분화와 관련된 남성불임, 정자형성과정 기전 연구 등의 연구에 이용될 수 있다. The undifferentiated spermatogonial stem cells isolated by the method of the present invention can be used for studies on the production of transgenic sperm and animals as well as studies on the male sterility and spermatogenesis process related to germ cell differentiation.

상기 개로부터 분리한 정소는 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 단일세포 수준으로 현탁(suspension)시킬 수 있다. The testis isolated from the dog can be suspended at a single cell level through a variety of methods known in the art.

상기 단일세포 수준으로 현탁시킨 개의 정소로부터 CXCR4 및 PGP9.5를 발현하는 세포를 분리하여 미분화 개 정원줄기세포를 얻을 수 있다. The undifferentiated spermatogonial stem cells can be obtained by separating CXCR4 and PGP9.5 expressing cells from dog testes suspended at the single cell level.

상기 CXCR4 및 PGP9.5를 발현하는 세포는 CXCR4를 발현하는 세포를 먼저 분리한 다음, 상기 분리한 세포로부터 PGP9.5를 발현하는 세포를 분리하여 얻거나, PGP9.5를 발현하는 세포를 먼저 분리한 다음, 상기 분리한 세포로부터 CXCR4를 발현하는 세포를 분리하여 얻을 수 있다. The cells expressing CXCR4 and PGP9.5 can be prepared by first separating CXCR4 expressing cells and then isolating PGP9.5 expressing cells from the separated cells or isolating PGP9.5 expressing cells And then separating the cells expressing CXCR4 from the separated cells.

예를 들어, 단일세포 수준으로 현탁시킨 개의 정소에 CXCR4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 CXCR4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 결합된 세포를 분리한 다음, 상기 분리된 세포에 PGP9.5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키고, 상기 PGP9.5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 결합된 세포를 분리하여 얻을 수 있다. For example, an antibody specifically binding to CXCR4 protein is contacted with a dog testis suspended at a single cell level to separate cells bound with antibody specifically binding to CXCR4 protein. Then, the separated cells are treated with PGP9. 5 protein, and separating the antibody-bound cells that specifically bind to the PGP9.5 protein.

상기 항체가 결합된 세포의 분리는 형광-활성세포분류기(fluorescence-activating cell sorters: FACS), 자성활성세포분류기(magnetic activated cell sorter: MACS) 또는 보체 매개성 용해(complement-mediated lysis) 방법을 이용하여 실시할 수 있다.The antibody-bound cells can be separated using fluorescence-activated cell sorters (FACS), magnetic activated cell sorters (MACS) or complement-mediated lysis .

본 발명의 미분화 개 정원줄기세포의 분리방법을 MACS를 이용하여 실시하는 경우, 직접적 표지방법 및 간접적 표지방법으로 실시할 수 있다.When the undifferentiated spermatogonial stem cell separation method of the present invention is carried out using MACS, direct labeling and indirect labeling can be carried out.

예를 들어, 직접적 표지방법에 따라 MACS를 실시하는 경우, 자성입자에 결합된 CXCR4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 단일세포 수준으로 현탁시킨 개의 정소에 접촉시키고 이어 자성을 갖는 분리기(separator)에 적용하여 CXCR4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 결합된 미분화 개 정원줄기세포를 분리할 수 있다.For example, when performing MACS according to the direct labeling method, an antibody that specifically binds to CXCR4 protein bound to magnetic particles is contacted with a dog testis suspended at a single cell level, followed by separation into a magnetic separator Can be applied to isolate undifferentiated human spermatogonial stem cells that bind to an antibody that specifically binds to CXCR4 protein.

예를 들어, 간접적 표지방법에 따라 MACS를 실시하는 경우, 적합한 중개물질이 결합된 CXCR4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 단일세포 수준으로 현탁시킨 개의 정소에 접촉시킬 수 있다. For example, when performing MACS according to the indirect labeling method, an antibody that specifically binds to the CXCR4 protein to which a suitable intermediate substance is bound can be contacted with a dog sample suspended at a single cell level.

상기 중개물질은 형광물질, 스트렙타비딘, CXCR4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 Fc 부위에 특이성을 갖는 항체 및 아비딘을 포함할 수 있다. The mediator may include antibodies and avidins having specificity for the Fc region of an antibody that specifically binds to a fluorescent substance, streptavidin, or a CXCR4 protein.

예를 들어, 상기 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), 에오신, 카르복시플루오르세인, 플루오르세인 아마이다이트, 로즈 벤갈, 다이라이트 플루오르, 메틸린 블루, 쿠마린 및 로다민을 포함하지만 이에 한정된 것은 아니다.For example, the fluorescent material may include fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), eosin, carboxyfluorescein, fluorocaine amidite, rose bengal, didefluoride, methylene blue, coumarin and rhodamine It is not limited.

상기 중개물질이 결합된 CXCR4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 단일세포 수준으로 현탁시킨 개의 정소에 접촉시킨 다음, 자성입자에 결합되어 있고 상기 중개물질에 특이성을 갖는 항체를 처리한 후, 자성을 갖는 분리기(separator)에 적용하여 CXCR4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 결합된 미분화 개 정원줄기세포를 분리할 수 있다.An antibody that specifically binds to the CXCR4 protein to which the intermediate substance is bound is brought into contact with a dog testis suspended at a single cell level and then an antibody having specificity to the intermediate substance bound to the magnetic particle is treated, To isolate undifferentiated human spermatogonial stem cells that bind to an antibody that specifically binds to CXCR4 protein.

상기 MACS는 기본적으로 면역자기 분리 과정에 따른 것으로서, 상기 과정의 일반적인 내용은 미합중국 특허 제5,385,707 호, 제 5,541,072 호, 제 5,646,001 호, 제 6,008,002 호 및 제 6,153,411 호에 개시되어 있으며, 이용되는 자성 입자 또는 마이크로비드 및 분리기는 Miltenyi Biotech(독일연방국)에서 용이하게 구입할 수 있다.The MACS is basically followed by an immunomagnetic separation process. The general contents of the above process are disclosed in U.S. Patent Nos. 5,385,707, 5,541,072, 5,646,001, 6,008,002 and 6,153,411, Microbeads and separators are readily available from Miltenyi Biotech (German Federal Service).

상기 방법에 의해 분리된 CXCR4 및 PGP9.5를 모두 발현하는 미분화 개 정원줄기세포는 CXCR4 또는 PGP9.5를 각각 독립적으로 발현하는 개 정원줄기세포 보다 미분화 성격을 갖는다. Undifferentiated human spermatogonial stem cells expressing both CXCR4 and PGP9.5 isolated by the above method have an undifferentiated nature than human spermatogonial cells independently expressing CXCR4 or PGP9.5.

본 발명은 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물, 미분화 개 정원줄기세포 분리용 조성물, 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석 방법 및 미분화 개 정원줄기세포의 분리 방법에 관한 것으로 이를 이용하여 CXCR4 및 PGP9.5의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정함으로써 개 정원줄기세포의 미분화 정도를 효과적으로 분석할 수 있으며, CXCR4 및 PGP9.5에 특이적인 항체를 이용하여 미분화 개 정원줄기세포를 분리할 수 있다. 본 발명을 통해 분리한 미분화 개 정원줄기세포는 형질전환 정자 및 동물의 생산 연구는 물론 생식세포 분화와 관련된 남성불임, 정자형성과정 기전 연구 등의 연구에 이용될 수 있다. The present invention relates to a composition for analyzing the degree of undifferentiation of cancellous stem cells, a composition for separating undifferentiated cannulated stem cells, a method for analyzing the degree of undifferentiation of cannulated trunk cells, and a method for separating undifferentiated cannulated trunk cells using CXCR4 and PGP9 Lt; 5 > at the mRNA level or the protein level, it is possible to effectively analyze the degree of undifferentiation of the myeloid stem cell, and to separate the undifferentiated human spermatogonial stem cell using an antibody specific for CXCR4 and PGP9.5. The undifferentiated spermatogonial stem cells isolated through the present invention can be used for studies on the production of transgenic sperm and animals as well as studies on the male sterility and spermatogenesis process related to germ cell differentiation.

도 1a는 1개월령 개 정소에서 발단 단계별 미분화 생식세포에 대한 마커(CXCR4)를 면역조직화학염색으로 확인한 결과이다.
도 1b는 4개월령 개 정소에서 발단 단계별 미분화 생식세포에 대한 마커(CXCR4)를 면역조직화학염색으로 확인한 결과이다.
도 1c는 7개월령 개 정소에서 발단 단계별 미분화 생식세포에 대한 마커(CXCR4)를 면역조직화학염색으로 확인한 결과이다.
각 도면에서 화살표는 CXCR4 단백질의 발현을 보여주는 세포를 나타내고, 검정색 화살표는 정자발생세포, 빨간색 화살표는 세르톨리 세포를 나타낸다.
도 2a는 1개월령 개 정소에서 발단 단계별 미분화 생식세포에 대한 마커(IBFBP3)를 면역조직화학염색으로 확인한 결과이다.
도 2b는 4개월령 개 정소에서 발단 단계별 미분화 생식세포에 대한 마커(IBFBP3)를 면역조직화학염색으로 확인한 결과이다.
도 2c는 7개월령 개 정소에서 발단 단계별 미분화 생식세포에 대한 마커(IBFBP3)를 면역조직화학염색으로 확인한 결과이다.
각 도면에서 화살표는 IBFBP3 단백질의 발현을 보여주는 세포를 나타내고, 검정색 화살표는 정자발생세포, 빨간색 화살표는 세르톨리 세포를 나타낸다.
도 3a는 1개월령 개 정소에서 발단 단계별 미분화 생식세포에 대한 마커(LIN28)를 면역조직화학염색으로 확인한 결과이다.
도 3b는 4개월령 개 정소에서 발단 단계별 미분화 생식세포에 대한 마커(LIN28)를 면역조직화학염색으로 확인한 결과이다.
도 3c는 7개월령 개 정소에서 발단 단계별 미분화 생식세포에 대한 마커(LIN28)를 면역조직화학염색으로 확인한 결과이다.
각 도면에서 화살표는 LIN28 단백질의 발현을 보여주는 세포를 나타내고, 검정색 화살표는 정자발생세포, 빨간색 화살표는 세르톨리 세포를 나타낸다.
도 4a는 1개월령 개 정소에서 발단 단계별 미분화 생식세포에 대한 마커(SALL4)를 면역조직화학염색으로 확인한 결과이다.
도 4b는 4개월령 개 정소에서 발단 단계별 미분화 생식세포에 대한 마커(SALL4)를 면역조직화학염색으로 확인한 결과이다.
도 4c는 7개월령 개 정소에서 발단 단계별 미분화 생식세포에 대한 마커(SALL4)를 면역조직화학염색으로 확인한 결과이다.
각 도면에서 화살표는 SALL4 단백질의 발현을 보여주는 세포를 나타내고, 검정색 화살표는 정자발생세포, 빨간색 화살표는 세르톨리 세포를 나타낸다.
도 5a는 성숙 후 개 정소에서 PGP9.5 및 CXCR4의 공동발현을 PGP9.5 항체를 이용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 5b는 성숙 후 개 정소에서 PGP9.5 및 CXCR4의 공동발현을 CXCR4 항체를 이용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 5c는 성숙 후 개 정소에서 PGP9.5 및 CXCR4의 공동발현을 TO-PRO 3로 세포핵을 염색한 이미지이다.
도 5d는 성숙 후 개 정소에서 PGP9.5 및 CXCR4의 공동발현을 타겟 단백질 및 핵의 병합 이미지이다.
흰색 화살표는 두 단백질을 모두 발현하는 세포를 나타내고, 노란색 화살표는 PGP9.5만을 발현하는 세포를 나타낸다.
도 6a는 성숙 후 개 정소에서 PGP9.5 및 IGFBP3의 공동발현을 PGP9.5 항체를 이용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 6b는 성숙 후 개 정소에서 PGP9.5 및 IGFBP3의 공동발현을 IGFBP3 항체를 이용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 6c는 성숙 후 개 정소에서 PGP9.5 및 IGFBP3의 공동발현을 TO-PRO 3로 세포핵을 염색한 이미지이다.
도 6d는 성숙 후 개 정소에서 PGP9.5 및 IGFBP3의 공동발현을 타겟 단백질 및 핵의 병합 이미지이다.
각 도면에서 흰색 화살표는 두 단백질을 모두 발현하는 세포를 나타낸다.
도 7a는 성숙 후 개 정소에서 PGP9.5 및 LIN28의 공동발현을 PGP9.5 항체를 이용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 7b는 성숙 후 개 정소에서 PGP9.5 및 LIN28의 공동발현을 LIN28 항체를 이용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 7c는 성숙 후 개 정소에서 PGP9.5 및 LIN28의 공동발현을 TO-PRO 3로 세포핵을 염색한 이미지이다.
도 7d는 성숙 후 개 정소에서 PGP9.5 및 LIN28의 공동발현을 타겟 단백질 및 핵의 병합 이미지이다.
흰색 화살표는 PGP9.5 및 LIN28 단백질을 발현하는 세포를 나타내고, 노란색 화살표는 LIN28을 발현하는 세포를 나타낸다.
도 8a는 성숙 후 개 정소에서 아크로신 및 LIN28의 공동발현을 아크로신 항체를 이용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 8b는 성숙 후 개 정소에서 아크로신 및 LIN28의 공동발현을 LIN28 항체를 이용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 8c는 성숙 후 개 정소에서 아크로신 및 LIN28의 공동발현을 TO-PRO 3로 세포핵을 염색한 이미지이다.
도 8d는 성숙 후 개 정소에서 아크로신 및 LIN28의 공동발현을 타겟 단백질 및 핵의 병합 이미지이다.
흰색 화살표는 아크로신 및 LIN28 단백질을 발현하는 세포를 나타내고, 노란색 화살표는 LIN28을 발현하는 세포를 나타낸다.
도 9a는 성숙 후 개 정소에서 SALL4 및 LIN28의 공동발현을 SALL4 항체를 이용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 9b는 성숙 후 개 정소에서 SALL4 및 LIN28의 공동발현을 LIN28 항체를 이용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 9c는 성숙 후 개 정소에서 SALL4 및 LIN28의 공동발현을 TO-PRO 3로 세포핵을 염색한 이미지이다.
도 9d는 성숙 후 개 정소에서 SALL4 및 LIN28의 공동발현을 타겟 단백질 및 핵의 병합 이미지이다.
흰색 화살표는 각 단백질을 발현하는 세포를 나타낸다.
도 10a는 성숙 후 개 정소에서 SALL4 및 SCP3의 공동발현을 SALL4 항체를 이용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 10b는 성숙 후 개 정소에서 SALL4 및 SCP3의 공동발현을 SCP3 항체를 이용하여 관찰한 형광 이미지이다.
도 10c는 성숙 후 개 정소에서 SALL4 및 SCP3의 공동발현을 TO-PRO 3로 세포핵을 염색한 이미지이다.
도 10d는 성숙 후 개 정소에서 SALL4 및 SCP3의 공동발현을 타겟 단백질 및 핵의 병합 이미지이다.
흰색 화살표는 각 단백질을 발현하는 세포를 나타낸다. FIG. 1A shows the result of immunohistochemical staining of a marker (CXCR4) for undifferentiated germ cells at the initiation stage at 1 month old dogs.
FIG. 1B shows the result of immunohistochemical staining of the marker (CXCR4) for undifferentiated germ cells at the 4th month of gestation.
FIG. 1C shows the result of immunohistochemical staining of the marker (CXCR4) for the undifferentiated germ cells at the initiation stage at the 7-month-old dog.
In each figure, arrows indicate cells showing the expression of CXCR4 protein, black arrows indicate spermatogenic cells, and red arrows represent Sertoli cells.
FIG. 2A shows the result of immunohistochemical staining of the marker (IBFBP3) for undifferentiated germ cells at the initiation stage at one month-old dogs.
FIG. 2B shows the result of immunohistochemical staining of the marker (IBFBP3) for the undifferentiated germ cells at the 4th month of gestation.
FIG. 2C shows the results of immunohistochemical staining of the marker (IBFBP3) for the undifferentiated germ cells at the initiation stage at the 7-month-old dog.
In each figure, arrows indicate cells showing the expression of IBFBP3 protein, black arrows indicate spermatogenic cells, and red arrows indicate Sertoli cells.
FIG. 3A shows the results of immunohistochemical staining of the marker (LIN28) for undifferentiated germ cells at the initiation stage at 1 month old dogs.
FIG. 3B shows the result of immunohistochemical staining of the marker (LIN28) for undifferentiated germ cells at the initiation stage at 4 month-old dogs.
FIG. 3C shows the result of immunohistochemical staining of the marker (LIN28) for undifferentiated germ cells at the initiation stage at the 7-month-old dog.
In each figure, arrows indicate cells showing the expression of LIN28 protein, black arrows indicate spermatogenic cells, and red arrows represent Sertoli cells.
FIG. 4A is a result of immunohistochemical staining of the marker (SALL4) for undifferentiated germ cells at the initiation stage at 1 month old dogs.
FIG. 4B is a result of immunohistochemical staining of the marker (SALL4) for undifferentiated germ cells at the 4th month of gestation.
FIG. 4C shows the result of immunohistochemical staining of the marker (SALL4) for undifferentiated germ cells at the initiation stage at 7 months old dogs.
In each figure, arrows indicate cells showing the expression of SALL4 protein, black arrows indicate spermatogenic cells, and red arrows indicate Sertoli cells.
FIG. 5A is a fluorescence image of PGP9.5 and CXCR4 coexpression observed in a dog house after maturation using a PGP9.5 antibody.
FIG. 5B is a fluorescence image obtained by observing the coexpression of PGP9.5 and CXCR4 in a rectum after maturation using a CXCR4 antibody.
FIG. 5c is an image obtained by staining nuclei with TO-PRO 3 for the coexpression of PGP9.5 and CXCR4 in the post-mature dogs.
Figure 5d is a merged image of the target protein and nucleus for the co-expression of PGP9.5 and CXCR4 in the post-mature dogs.
White arrows represent cells expressing both proteins, and yellow arrows represent cells expressing only PGP9.5.
FIG. 6A is a fluorescence image of PGP9.5 and IGFBP3 coexpression observed in a dog house after maturation using a PGP9.5 antibody. FIG.
FIG. 6B is a fluorescence image obtained by observing the coexpression of PGP9.5 and IGFBP3 in the rectum after maturation using IGFBP3 antibody.
Fig. 6C is an image obtained by staining a nucleus with TO-PRO 3 for the coexpression of PGP9.5 and IGFBP3 in a dog house after maturation.
Figure 6d is a merged image of the target protein and nucleus with the co-expression of PGP9.5 and IGFBP3 in the post-mature dogs.
White arrows in each figure represent cells expressing both proteins.
FIG. 7A is a fluorescence image observed using a PGP9.5 antibody for the coexpression of PGP9.5 and LIN28 in the post-maturation period.
FIG. 7B is a fluorescence image observed using a LIN28 antibody in the coexpression of PGP9.5 and LIN28 in the post-maturation period.
Fig. 7C is an image obtained by staining a nucleus with TO-PRO 3 for the coexpression of PGP9.5 and LIN28 in a post-maturation period.
Figure 7d is a merged image of the target protein and nucleus for the co-expression of PGP9.5 and LIN28 in the post-mature dogs.
White arrows indicate cells expressing PGP9.5 and LIN28 protein, and yellow arrows indicate cells expressing LIN28.
FIG. 8A is a fluorescence image of acrosin and LIN28 coexpression observed in a dog house after maturation using an acrocyan antibody. FIG.
FIG. 8B is a fluorescence image observed using a LIN28 antibody for the coexpression of acrosin and LIN28 in a post-matured dog house.
FIG. 8C is an image obtained by staining a nucleus with TO-PRO 3 for coexpression of acrosin and LIN28 in a doghouse after maturation.
FIG. 8D is a merged image of the target protein and nucleus for the coexpression of acrosin and LIN28 in the rectum after maturation. FIG.
The white arrows indicate cells expressing acrosin and LIN28 protein, and the yellow arrows indicate cells expressing LIN28.
FIG. 9A is a fluorescence image observed using a SALL4 antibody in the coexpression of SALL4 and LIN28 at a post-maturation period.
Fig. 9B is a fluorescence image observed using a LIN28 antibody for the co-expression of SALL4 and LIN28 in the post-maturation period.
FIG. 9C is an image obtained by staining a nucleus with TO-PRO 3 for the coexpression of SALL4 and LIN28 in a post-maturation period.
Figure 9d is a merged image of the target protein and nucleus with the co-expression of SALL4 and LIN28 in the post-matured dogs.
White arrows represent cells expressing each protein.
FIG. 10A is a fluorescence image obtained by observing the coexpression of SALL4 and SCP3 in a rectum after maturation using SALL4 antibody.
FIG. 10B is a fluorescence image obtained by observing the coexpression of SALL4 and SCP3 in the rectum after maturation using an SCP3 antibody.
FIG. 10C is an image obtained by staining a nucleus with TO-PRO 3 for the coexpression of SALL4 and SCP3 in a dog house after maturation.
Figure 10d is a merged image of the target protein and nucleus for the coexpression of SALL4 and SCP3 in the post-matured dogs.
White arrows represent cells expressing each protein.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실험방법Experimental Method

1. 실험 디자인1. Experimental Design

비글의 고환을 수술을 통해 얻은 다음, 12시간 내에 조직을 고정시켰다. 각 발단 단계(성숙 전, 1개월령; 성숙 초기, 4개월령; 및 성숙 후, 7개월령; n = 각 3마리)에 대한 실험을 위해 정소를 Bouin's 용액에 담가 4℃에서 하룻밤 동안 고정시켰다.Beagle testicles were obtained through surgery, and the tissues were fixed within 12 hours. The testes were immersed in Bouin's solution and fixed overnight at 4 ° C for each initiation step (pre-maturation, 1 month, maturation, 4 months, and maturity, 7 months, n = 3 each).

2. 면역조직화학염색(Immunohistochemistry)2. Immunohistochemistry.

개 정소에서 CXCR4(chemokine receptor type 4), IGFBP3(insulin-like growth factor-binding protein 3), LIN28, SALL4(Sal-like protein 4), PGP9.5, SCP3(synaptonemal complex protein 3) 및 아크로신(acrosin)을 발현하는 세포 위치를 확인하기 위해 정소 샘플을 70-100%(v/v) 에탄올 및 자일렌으로 세척하고, 파라핀에 포매시킨 다음, 마이크로톰(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 이용하여 5 ㎛ 두께로 절단하고, 유리 슬라이드에 마운팅하였다. (CXCR4), IGFBP3 (insulin-like growth factor-binding protein 3), LIN28, SALL4 (Sal-like protein 4), PGP9.5, SCP3 (synaptonemal complex protein 3) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass., USA) was used to determine the location of cells expressing acrosin. The samples were washed with 70-100% (v / v) ethanol and xylene, embedded in paraffin, To a thickness of 5 탆, and mounted on a glass slide.

마운팅한 개 정소 조직을 자일린 및 100-0% 에탄올로 재수화시켰다. Tris-EDTA 용액(10 mM Tris base, 1 mM EDTA, 및 0.05% Tween-20; pH 9)에서 조직을 30분 동안 끓여 항원을 복구하였다. 항원을 복구시킨 조직의 멤브레인은 0.2% Triton X-100을 포함하는 PBS로 10분간 막투과 처리를 하였다. 2% BSA(bovine serum albumin)를 포함하는 PBS에 상온에서 1시간 동안 담가 비특이적 단백질의 결합을 블로킹시켰다. Mounted dog tissues were rehydrated with xylin and 100-0% ethanol. The tissues were boiled for 30 minutes in Tris-EDTA solution (10 mM Tris base, 1 mM EDTA, and 0.05% Tween-20; pH 9) to restore the antigen. Membranes of tissues recovered from the antigen were subjected to membrane permeation treatment with PBS containing 0.2% Triton X-100 for 10 minutes. Binding of nonspecific proteins was blocked by soaking in PBS containing 2% BSA (bovine serum albumin) for 1 hour at room temperature.

조직을 다음 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다: CXCR4(1:50 희석; SC-9046; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), IGFBP3(1:50 희석; SC-6004; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), LIN28(1:50 희석; 11724-1-AP; Proteintech, Rosemont, IL, USA), SALL4(1:50 희석; Ab57577; Abcam, Cambridge, UK), PGP9.5(1:1000 희석; 7863-1004; AbD Serotec; Raleigh, NC, USA), SCP3(1:50 희석; SC-33195; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 및 acrosin(1:50 희석; SC-51504; Santa Cruz Biotechnology, Inc.). PBS로 3회 세척한 후, 2차 항체를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. The tissues were reacted with the following primary antibodies overnight at 4 ° C: IGFBP3 (1:50 dilution; SC-9046; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), LIN28 (1:50 dilution; 11724-1-AP; Proteintech, Rosemont, IL, USA), SALL4 (1:50 dilution; Ab57577; Abcam, Cambridge, UK), PGP9. SC-3 (diluted 1:50; SC-33195; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) and acrosin (diluted 1:50; SC- 51504; Santa Cruz Biotechnology, Inc.). After washing three times with PBS, the secondary antibody was reacted at room temperature for 2 hours.

페록시다아제 기질 검출 키트(SK-4100; Vector Laboratories; Burlingame, CA, USA)는 개 생식세포 마커를 검출하는데 사용하였다. 개 생식세포 마커의 공동발현을 확인하기 위해 형광이 결합된 2차 항체를 첨가하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. Peroxidase substrate detection kit (SK-4100, Vector Laboratories; Burlingame, Calif., USA) was used to detect the reproductive cell markers. To confirm the coexpression of the germ cell marker, a secondary antibody conjugated with fluorescence was added and reacted at room temperature for 2 hours.

세포 핵은 TO-PRO?-3 (1:1000 dilution; T3605; Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 염색하였다. 면역염색한 개 정소 조직을 고정시키기 위해 마운팅 용액 (Dako, Carpinteria, CA, USA; S3025)을 사용하였다. 공동-면역염색한(co-immunostained) 조직은 공초점 현미경으로 관찰하였다(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany; LSM 700).Cell nuclei were stained with TO-PRO? -3 (1: 1000 dilution; T3605; Thermo Fisher Scientific). Mounting solutions (Dako, Carpinteria, CA, USA; S3025) were used to immobilize immunostained dog tissues. Co-immunostained tissues were observed with confocal microscopy (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany; LSM 700).

실험결과Experiment result

1. 개 정소 조직에서 미분화된 정원세포 마커의 발현 및 위치1. Expression and location of undifferentiated spermatocyte markers in dog tissue

CXCR4, IGFBP3, LIN28 및 SALL4의 발현 및 발현 위치를 개 정소의 발달 단계별로 확인하였다. CXCR4, IGFBP3, LIN28 및 SALL4에 각각 특이적인 항체를 이용하여 면역조직화학법을 통해 세정관 내 생식세포에서 발현을 확인하였다. 미분화된 남성 생식세포에 대한 이 마커들은 다른 종(species)의 여러 발단 단계에서 유사한 발현 정도를 보였다. Expression and expression sites of CXCR4, IGFBP3, LIN28, and SALL4 were confirmed by developmental stages of the anthracnose. CXCR4, IGFBP3, LIN28 and SALL4, respectively, were immunohistochemically expressed in gonadal germ cells. These markers for undifferentiated male germ cells showed similar expression levels at different stages of different species.

성숙 전 단계(1개월령)에서 CXCR4, IGFBP3, 및 LIN28의 발현은 미분화 정원 세포의 세정관 내강에서 관찰되었다(도 1a, 도 2a, 도 3a). 그러나, SALL4는 1개월령 개 정소에서는 관찰되지 않았다(도 4a). Expression of CXCR4, IGFBP3, and LIN28 at pre-maturation (1 month) was observed in the lumen of the lining of undifferentiated spermatids (Fig. 1A, Fig. 2A, Fig. 3A). However, SALL4 was not observed at 1 month old dogs (Fig. 4A).

성숙 초기 단계(4개월령)에서 CXCR4, IGFBP3 및 LIN28을 발현하는 세포는 세정관의 기저막 근처에서 관찰되었고(도 5b, 도 6b, 도 3b), SALL4는 관찰되지 않았다. 4개월령 개 정소에서 SALL4는 세르톨리 세포 및 정원세포에서 관찰되었다(도 4b). 성숙 후(7개월령), CXCR4 및 IGFBP3을 발현하는 세포는 세정관의 기저막 근처에서 관찰되었고(도 1c, 도 2c), LIN28 및 SALL4를 발현하는 세포는 세정관 내강에서 관찰되었다(도 3c, 도 4c). Cells expressing CXCR4, IGFBP3, and LIN28 were observed near the basement membrane of the tubules (FIG. 5B, FIG. 6B, FIG. 3B) at the early stage of maturation (4 months), and no SALL4 was observed. SALL4 was observed in Sertoli cells and spermatogonial cells at 4-month-old dogs (Fig. 4B). Cells expressing CXCR4 and IGFBP3 were observed near the basement membrane of the tubules (Fig. 1C, Fig. 2C) after maturation (at 7 months) and cells expressing LIN28 and SALL4 were observed in the lumen of the tubules 4c).

2. 미분화 정원세포 2. undifferentiated garden cells 마커와Marker 성숙 후 개 정소에서의  After mature, CXCR4CXCR4 및  And IGFBP3IGFBP3 발현 비교 Comparison of expression

성견(adult canine) 정소에서 CXCR4 및 IGFBP3의 발현을 확인하기 위해 CXCR4, IGFBP3 및 PGP9.5에 대한 항체를 이용하여 공동-면역조직화학염색 분석을 실시하였다(도 5, 도 6). CXCR4, IGFBP3 및 PGP9.5는 개의 세정관 기저막 근처 미분화 정원세포에서 관찰되었다(도 5). IGFBP3를 발현하는 대부분의 세포들은 PGP9.5를 발현하였다(도 6). 그러나, 일부 PGP9.5 양성 세포는 CXCR4를 발현하지 않았다(도 5). CXCR4 및 PGP9.5를 동시에 발현하는 세포는 PGP9.5를 발현하는 세포보다 기저막 주위에 많이 분포하였다(도 5a, 도 5b, 도 5c 노란색 화살표). In order to confirm the expression of CXCR4 and IGFBP3 in adult canine testis, co-immunohistochemical staining analysis was performed using antibodies against CXCR4, IGFBP3 and PGP9.5 (FIGS. 5 and 6). CXCR4, IGFBP3 and PGP9.5 were observed in undifferentiated spermatogonial cells near the ductal basement membrane (Fig. 5). Most of the cells expressing IGFBP3 expressed PGP9.5 (Fig. 6). However, some PGP9.5 positive cells did not express CXCR4 (Fig. 5). CXCR4 and PGP9.5 cells were distributed around the basement membrane more than the cells expressing PGP9.5 (FIGS. 5A, 5B, and 5C yellow arrows).

3. 개 생식세포 마커와 비교하여 성숙 후 개 정소에서 LIN28의 발현3. Expression of LIN28 in mature dogs after maturation compared to canine cell markers

성견 정소에서 LIN28의 발현을 확인하기 위해 LIN28, PGP9.5 및 아크로신에 대한 항체를 이용하여 공동-면역조직화학염색 분석을 실시하였다(도 7, 도 8). 대부분의 LIN28 양성 세포는 PGP9.5 양성 세포와 비교하여 정소 내강 쪽에 분포하였다(도 7). PGP9.5, 아크로신 및 LIN28을 공동으로 발현하는 세포는 관찰되지 않았다. LIN28을 발현하는 세포는 PGP9.5를 발현하는 정원세포 및 아크로신을 발현하는 정모세포 및 정자 사이에 분포하였다(도 7, 도 8). In order to confirm the expression of LIN28 in adult dog testes, co-immunohistochemical staining analysis was performed using antibodies against LIN28, PGP9.5 and acrosin (FIGS. 7 and 8). Most LIN28-positive cells were distributed in the testis lumen compared with PGP9.5-positive cells (Fig. 7). No cells co-expressing PGP9.5, acrosin and LIN28 were observed. Cells expressing LIN28 were distributed between spermatogonial cells expressing PGP9.5 and spermatocytes expressing acrocin and sperm (Figs. 7 and 8).

4. 미분화 정모세포 마커와 비교하여 성숙 후 개 정소에서 SALL4의 발현4. Expression of SALL4 in mature dogs compared to undifferentiated chimeric cell markers

성견 정소에서 SALL4의 발현을 확인하기 위해 SALL4, LIN28 및 SCP3에 대한 항체를 이용하여 공동-면역조직화학염색 분석을 실시하였다(도 9, 도 10). 대부분의 SALL4 양성 세포는 정소 내강에 분포하였다. PGP9.5, 아크로신 및 LIN28을 공동으로 발현하는 세포는 관찰되지 않았다. LIN28을 발현하는 세포는 PGP9.5를 발현하는 정원세포 및 아크로신을 발현하는 정모세포 및 정자 사이에 분포하였다(도 7, 도 8). SALL4, LIN28 및 SCP3 발현을 비교해 본 결과, 대부분의 SALL4 양성 세포가 LIN28 및 SCP3를 발현하는 것으로 나타났다(도 9, 도 10). In order to confirm the expression of SALL4 in adult testes, co-immunohistochemical staining analysis was performed using antibodies against SALL4, LIN28 and SCP3 (FIGS. 9 and 10). Most SALL4 - positive cells were distributed in testis lumen. No cells co-expressing PGP9.5, acrosin and LIN28 were observed. Cells expressing LIN28 were distributed between spermatogonial cells expressing PGP9.5 and spermatocytes expressing acrocin and sperm (Figs. 7 and 8). Comparing SALL4, LIN28 and SCP3 expression, most SALL4-positive cells expressed LIN28 and SCP3 (FIGS. 9 and 10).

Claims (9)

CXCR4(chemokine receptor type 4)의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제; 및
PGP9.5(protein gene product 9.5)의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제;
를 포함하는 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물. Agents that measure the expression of CXCR4 (chemokine receptor type 4) at the mRNA or protein level; And
Agents that measure the expression of PGP9.5 (protein gene product 9.5) at the mRNA or protein level;
Wherein the stem cells are selected from the group consisting of: 제 1 항에 있어서, 상기 CXCR4의 발현을 mRNA 수준에서 측정하는 제제는 CXCR4 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브이고,
상기 PGP9.5의 발현을 mRNA 수준에서 측정하는 제제는 PGP9.5 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브인 것인, 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물.2. The method according to claim 1, wherein the agent for measuring the expression of CXCR4 at an mRNA level is a primer pair or a probe specific to the CXCR4 gene,
Wherein the agent for measuring the expression of PGP9.5 at an mRNA level is a primer pair or a probe specific to the PGP9.5 gene. 제 1 항에 있어서, 상기 CXCR4의 발현을 단백질 수준에서 측정하는 제제는 CXCR4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체이고,
상기 PGP9.5의 발현을 단백질 수준에서 측정하는 제제는 PGP9.5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것인, 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물.2. The method according to claim 1, wherein the agent for measuring the expression of CXCR4 at a protein level is an antibody that specifically binds to a CXCR4 protein,
Wherein the agent for measuring the expression of PGP9.5 at the protein level is an antibody that specifically binds to the PGP9.5 protein. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 유전자 증폭용 조성물, 마이크로어레이 조성물 또는 면역분석(immunoassay)용 조성물인 것인, 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석용 조성물.The composition according to claim 1, wherein the composition is a composition for gene amplification, a microarray composition, or a composition for immunoassay. CXCR4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체; 및
PGP9.5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체;
를 포함하는 미분화 개 정원줄기세포 분리용 조성물.An antibody that specifically binds to a CXCR4 protein; And
An antibody that specifically binds to a PGP9.5 protein;
Wherein the stem cell is an undifferentiated germ line stem cell. CXCR4 및 PGP9.5의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정하는 단계를 포함하는 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석 방법. Wherein the expression of CXCR4 and PGP9.5 is measured at an mRNA level or a protein level. 제 6 항에 있어서, 상기 개 정원줄기세포는 개의 정소 내 정원줄기세포 또는 체외 배양된 개 정원줄기세포인 것인, 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석 방법.The method according to claim 6, wherein the spermatogonial stem cell is a spermatic spermatogonial stem cell or an in vitro cultured spermatogonial stem cell. 제6 항에 있어서, 상기 개 정원줄기세포가 CXCR4 및 PGP9.5를 동시에 발현하는 경우, 상기 개 정원줄기세포는 CXCR4 또는 PGP9.5를 각각 독립적으로 발현하는 개 정원줄기세포 보다 미분화 성격을 갖는 것인, 개 정원줄기세포의 미분화 정도 분석 방법.[Claim 7] The method according to claim 6, wherein when the spermatogonial stem cell expresses CXCR4 and PGP9.5 simultaneously, the spermatogonial stem cell has an undifferentiated character than the spermatogonial stem cell independently expressing CXCR4 or PGP9.5 Analysis of the degree of undifferentiation of human germline stem cells. 개의 정소로부터 정원줄기세포를 분리하는 단계; 및
상기 분리된 정원줄기세포에서 CXCR4 및 PGP9.5를 발현하는 세포를 분리하는 단계;
를 포함하는 미분화 개 정원줄기세포의 분리 방법.Isolating spermatogonial stem cells from dog testes; And
Separating the cells expressing CXCR4 and PGP9.5 from the separated spermatogonial stem cells;
The method comprising the steps of:
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